RU2551235C2 - Humanised monoclonal antibody specific to syndecan-1 - Google Patents
Humanised monoclonal antibody specific to syndecan-1 Download PDFInfo
- Publication number
- RU2551235C2 RU2551235C2 RU2013139743/10A RU2013139743A RU2551235C2 RU 2551235 C2 RU2551235 C2 RU 2551235C2 RU 2013139743/10 A RU2013139743/10 A RU 2013139743/10A RU 2013139743 A RU2013139743 A RU 2013139743A RU 2551235 C2 RU2551235 C2 RU 2551235C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- antibody
- syndecan
- cells
- antibodies
- amino acid
- Prior art date
Links
- 108090000058 Syndecan-1 Proteins 0.000 title claims abstract description 41
- 102000003705 Syndecan-1 Human genes 0.000 title abstract description 39
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 37
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 29
- 102100035721 Syndecan-1 Human genes 0.000 claims abstract description 26
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 22
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 14
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims abstract description 10
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 claims abstract description 10
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims abstract description 9
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims abstract description 9
- 241001529936 Murinae Species 0.000 claims abstract description 8
- 230000004540 complement-dependent cytotoxicity Effects 0.000 claims abstract description 7
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims abstract description 7
- 230000028327 secretion Effects 0.000 claims abstract description 4
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 8
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims description 6
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 abstract description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 9
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 abstract description 7
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 abstract description 4
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 2
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 abstract 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 abstract 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 18
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 14
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 14
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 14
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 13
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 12
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 10
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 10
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 9
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 8
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 7
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 238000000034 method Methods 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 5
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 5
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 5
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 4
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 4
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 210000004754 hybrid cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 4
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 4
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000011729 BALB/c nude mouse Methods 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 3
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 3
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 3
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000001028 anti-proliverative effect Effects 0.000 description 3
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 3
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 3
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 3
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 4-isocyanato-4'-methyldiphenylmethane Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1CC1=CC=C(N=C=O)C=C1 UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010032595 Antibody Binding Sites Proteins 0.000 description 2
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 2
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 2
- 239000012163 TRI reagent Substances 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 description 2
- 208000030961 allergic reaction Diseases 0.000 description 2
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 2
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 230000004154 complement system Effects 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 239000002254 cytotoxic agent Substances 0.000 description 2
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 2
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 2
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 244000144993 groups of animals Species 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 2
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 2
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 2
- 239000012514 monoclonal antibody product Substances 0.000 description 2
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 2
- 229920002704 polyhistidine Polymers 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 2
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CXNPLSGKWMLZPZ-GIFSMMMISA-N (2r,3r,6s)-3-[[(3s)-3-amino-5-[carbamimidoyl(methyl)amino]pentanoyl]amino]-6-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)-3,6-dihydro-2h-pyran-2-carboxylic acid Chemical compound O1[C@@H](C(O)=O)[C@H](NC(=O)C[C@@H](N)CCN(C)C(N)=N)C=C[C@H]1N1C(=O)N=C(N)C=C1 CXNPLSGKWMLZPZ-GIFSMMMISA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100038740 Activator of RNA decay Human genes 0.000 description 1
- 241000272522 Anas Species 0.000 description 1
- 102100022005 B-lymphocyte antigen CD20 Human genes 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 1
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000001301 EGF receptor Human genes 0.000 description 1
- 108060006698 EGF receptor Proteins 0.000 description 1
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 1
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 108010014095 Histidine decarboxylase Proteins 0.000 description 1
- 102100037095 Histidine decarboxylase Human genes 0.000 description 1
- 101000897405 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD20 Proteins 0.000 description 1
- 101100369992 Homo sapiens TNFSF10 gene Proteins 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 1
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 108010076818 TEV protease Proteins 0.000 description 1
- 102000046283 TNF-Related Apoptosis-Inducing Ligand Human genes 0.000 description 1
- 108700012411 TNFSF10 Proteins 0.000 description 1
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 1
- 108010084455 Zeocin Proteins 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000002001 anti-metastasis Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000011319 anticancer therapy Methods 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000397 bevacizumab Drugs 0.000 description 1
- CXNPLSGKWMLZPZ-UHFFFAOYSA-N blasticidin-S Natural products O1C(C(O)=O)C(NC(=O)CC(N)CCN(C)C(N)=N)C=CC1N1C(=O)N=C(N)C=C1 CXNPLSGKWMLZPZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 238000010805 cDNA synthesis kit Methods 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 1
- 229960005395 cetuximab Drugs 0.000 description 1
- 238000012710 chemistry, manufacturing and control Methods 0.000 description 1
- OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N choline Chemical compound C[N+](C)(C)CCO OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001231 choline Drugs 0.000 description 1
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 1
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- IJKVHSBPTUYDLN-UHFFFAOYSA-N dihydroxy(oxo)silane Chemical compound O[Si](O)=O IJKVHSBPTUYDLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003255 drug test Methods 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 230000029578 entry into host Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 102000052116 epidermal growth factor receptor activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108700015053 epidermal growth factor receptor activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000004761 fibrosis Effects 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000008611 intercellular interaction Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 201000005299 metal allergy Diseases 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000000302 molecular modelling Methods 0.000 description 1
- 238000002887 multiple sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N n-[3-[[6-[3-(trifluoromethyl)anilino]pyrimidin-4-yl]amino]phenyl]cyclopropanecarboxamide Chemical compound FC(F)(F)C1=CC=CC(NC=2N=CN=C(NC=3C=C(NC(=O)C4CC4)C=CC=3)C=2)=C1 YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 230000000771 oncological effect Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229960001972 panitumumab Drugs 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 1
- 210000001539 phagocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N phleomycin D1 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC[C@@H](N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCCCNC(N)=N)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 108090000589 ribonuclease E Proteins 0.000 description 1
- 229960004641 rituximab Drugs 0.000 description 1
- 101150099588 rne gene Proteins 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000013515 script Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000012430 stability testing Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000008174 sterile solution Substances 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 201000000498 stomach carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 231100000048 toxicity data Toxicity 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 229960000575 trastuzumab Drugs 0.000 description 1
- 230000005748 tumor development Effects 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 1
- -1 when using it Chemical class 0.000 description 1
- NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L zinc sulfate Chemical compound [Zn+2].[O-]S([O-])(=O)=O NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229960001763 zinc sulfate Drugs 0.000 description 1
- 229910000368 zinc sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Область техники, к которой относится изобретениеFIELD OF THE INVENTION
Данное изобретение относится к иммунологии, биотехнологии и медицине, а именно к области противоопухолевых лекарственных препаратов на основе моноклональных антител, и может быть использовано в медицине для лечения онкологических заболеваний.This invention relates to immunology, biotechnology and medicine, namely to the field of antitumor drugs based on monoclonal antibodies, and can be used in medicine for the treatment of cancer.
Предшествующий уровень техникиState of the art
Онкологические заболевания стоят на втором месте по смертности в мире после сердечно-сосудистых заболеваний [1]. За последние 10 лет число заболевших онкологическими заболеваниями, по разным данным, возросло на 15%. Ежегодно в России регистрируется более 490 тысяч новых пациентов, 2,5 миллиона находятся под наблюдением и более 290 тысяч больных ежегодно умирает от различных форм рака. Ввиду этого целесообразны разработка и создание безопасных, эффективных и доступных противоопухолевых препаратов.Oncological diseases are on the second place in mortality in the world after cardiovascular diseases [1]. Over the past 10 years, the number of patients with cancer, according to various sources, increased by 15%. More than 490 thousand new patients are registered in Russia annually, 2.5 million are under observation and more than 290 thousand patients die every year from various forms of cancer. In view of this, it is advisable to develop and create safe, effective and affordable antitumor drugs.
Одним из типов противоопухолевых препаратов являются продукты биотехнологического синтеза - моноклональные антитела (Mab). Известен ряд фармакологических решений, в их числе Mab к рецептору эпидермального фактора роста, вазоэндотелиальному фактору роста, которые имеют доказанное значение для жизнедеятельности опухолевых клеток и малозначимы для функционирования нормальных клеток различных тканей организма [2].One of the types of anticancer drugs are biotechnological synthesis products - monoclonal antibodies (Mab). A number of pharmacological solutions are known, including Mab to the epidermal growth factor receptor, vasoendothelial growth factor, which are of proven importance for the vital activity of tumor cells and are of little significance for the functioning of normal cells of various body tissues [2].
В настоящее время в мире зарегистрировано и производится около десяти противоопухолевых препаратов на основе моноклональных антител, в частности Ритуксимаб (Mab к рецептору CD20), Трастузумаб (мишенью является рецептор HER2neu), Бевацизумаб (VEGF), Цетуксимаб и Панитумумаб (EGFR). Зарегистрированных препаратов, мишенью которых является поверхностный антиген синдекан-1 (CD138), в настоящее время не существует.Currently, about ten anticancer drugs based on monoclonal antibodies are registered and produced in the world, in particular, Rituximab (Mab to the CD20 receptor), Trastuzumab (the target is the HER2neu receptor), Bevacizumab (VEGF), Cetuximab and Panitumumab (EGFR). There are currently no registered drugs targeting the syndecan-1 surface antigen (CD138).
Белок синдекан-1 (CD138) [4] является перспективной мишенью противоопухолевой терапии моноклональными антителами: доказана важная роль данной молекулы в жизнедеятельности опухолевых клеток и показана ее малая значимость для функционирования нормальных клеток различных тканей организма [5].Protein syndecan-1 (CD138) [4] is a promising target for anticancer therapy with monoclonal antibodies: the important role of this molecule in the vital activity of tumor cells has been proved and its low importance for the functioning of normal cells of various body tissues [5].
Данная молекула обеспечивает межклеточные взаимодействия и взаимодействия между клетками и матриксом, адгезию и миграцию. Гиперэкспрессия CD138 была продемонстрирована в большинстве (около 90%) клеток различных опухолей, включая рак молочной железы, толстой кишки и желудка, предстательной железы и других эпителиальных злокачественных опухолей [6, 7]. Также описано такое явление, как потеря синдекана-1 с поверхности миеломных клеток с накоплением его в строме, как правило, в участках фиброза [8]. Показано, что при потере синдекана-1 миеломные клетки вступают в TRAIL - индуцированный апоптоз [9]. Функционально Синдекан-1 связан со способностью опухолевых клеток к инвазивному росту и метастазированию. В аспекте лечения злокачественных опухолей активность CD138 сопряжена с теми свойствами опухолевых клеток, которые практически не поддаются существующей терапии.This molecule provides intercellular interactions and interactions between cells and the matrix, adhesion and migration. Overexpression of CD138 was demonstrated in most (about 90%) cells of various tumors, including cancer of the breast, colon and stomach, prostate and other epithelial malignant tumors [6, 7]. Also described is the phenomenon of loss of syndecan-1 from the surface of myeloma cells with its accumulation in the stroma, as a rule, in areas of fibrosis [8]. With the loss of syndecan-1, myeloma cells enter TRAIL-induced apoptosis [9]. Functionally, Sindecan-1 is associated with the ability of tumor cells to invasively grow and metastasize. In the aspect of the treatment of malignant tumors, the activity of CD138 is associated with those properties of tumor cells that are practically not amenable to existing therapy.
Показана локализация CD138 на поверхности опухолевых клеток в форме, доступной для узнавания антителами [10]. Более того, имеются данные об эффективности вакцинации с использованием в качестве антигена CD138 [11].Localization of CD138 on the surface of tumor cells in a form accessible for recognition by antibodies was shown [10]. Moreover, there is evidence of vaccination efficacy using CD138 as an antigen [11].
Известны мышиные антитела к синдекану-1 - В-В4 (IgG1) [13], В-В2 (IgG2b), а также химерные [8, 14] - МП5 (IgG1κ) и конъюгаты таковых с метками [12] [3]. Такие соединения используют в исследовательских или диагностических целях, причем антитело выполняет лишь функцию нацеливания [8, 14]. Цитотоксическую функцию выполняют эффекторные молекулы, как правило, конъюгированные с антителом [16, 17, 18]. Мышиные и кроличьи Mab иммунная система человека воспринимает как чужеродные, за счет различий в константной части антител (СН, CL), и запускает против них иммунный ответ. Для применения у людей разрабатывают химерные антитела, константная часть которых - человека, а вариабельная (VH, VL) - мыши. С использованием данной модификации удается получить более безопасные Mab.Known murine antibodies to syndecan-1 - B-B4 (IgG1) [13], B-B2 (IgG2b), as well as chimeric [8, 14] - MP5 (IgG1κ) and conjugates thereof with labels [12] [3]. Such compounds are used for research or diagnostic purposes, and the antibody performs only a targeting function [8, 14]. Effector molecules, usually conjugated to an antibody, perform a cytotoxic function [16, 17, 18]. The mouse and rabbit Mab perceives the human immune system as foreign, due to differences in the constant part of antibodies (C H , C L ), and triggers an immune response against them. For use in humans, chimeric antibodies are developed, the constant part of which is human, and the variable (V H , V L ) - mice. Using this modification, it is possible to obtain safer Mabs.
Известно рекомбинантное антитело к синдекану-1 (OC-46F2), созданное в результате in vitro селекции библиотеки для фагового дисплея (ETH-2-Gold) человеческих антител на клетках меланомы человека и дальнейшей экспрессии полученных генов в клетках млекопитающих [26]. Показано, что данное антитело ингибирует созревание сосудов и опухолевый рост в экспериментальной модели человеческой меланомы (на мышах), а также эффективно в терапевтическом плане в отношении экспериментальной модели человеческой карциномы рака яичника.A recombinant anti-syndecan-1 antibody (OC-46F2) is known that was created by in vitro selection of a library for phage display (ETH-2-Gold) of human antibodies on human melanoma cells and further expression of the resulting genes in mammalian cells [26]. This antibody has been shown to inhibit vascular maturation and tumor growth in an experimental model of human melanoma (in mice), and is also therapeutic in terms of an experimental model of human ovarian cancer carcinoma.
OC-46F2 представляет собой одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv) - гибридный белок из вариабельных фрагментов тяжелой (VH) и легкой (VL - лямбда) цепи иммуноглобулинов, соединенных коротким линкерным пептидом.OC-46F2 is a single chain variable fragment (scFv) - a hybrid protein of variable fragments of the heavy (V H ) and light (V L - lambda) chains of immunoglobulins connected by a short linker peptide.
Данное соединение не содержит константные фрагменты антитела, вариабельные фрагменты молекулы обеспечивают только связывание с антигеном, что обуславливает показанное авторами сдерживающее действие. Однако для элиминации опухоли необходимо использование дополнительных действующих веществ, возможно, создание конъюгатов. Наблюдаем тот же недостаток, что и при использовании химерного антитела.This compound does not contain constant antibody fragments, variable fragments of the molecule provide only binding to the antigen, which causes the inhibitory effect shown by the authors. However, to eliminate the tumor, the use of additional active substances is necessary, possibly the creation of conjugates. We observe the same drawback as when using a chimeric antibody.
Прототипом предлагаемого изобретения является химерное моноклональное антитело к CD138 подкласса IgG4 [15]. Однако данное Mab обеспечивает лишь нацеливание цитотоксического агента, конъюгированного с ним (DM4).The prototype of the invention is a chimeric monoclonal antibody to CD138 of the IgG4 subclass [15]. However, this Mab only provides targeting of the cytotoxic agent conjugated to it (DM4).
Таким образом, описанные на сегодняшний день мышиные антитела к CD138 непригодны для применения у людей ввиду высокой иммуногенности, их используют для лабораторных целей, химерные MAb не обладают самостоятельным терапевтическим действием - их используют только в качестве нацеливающего агента, а также могут быть иммуногенны. Нельзя исключать и индивидуальную реакцию пациента на то или иное Mab. Кроме того, действующий агент, который нацеливают с использованием антитела, или продукты его распада, могут являться стрессорным фактором для организма, ввиду их структуры, возможности и периода распада данного вещества, характера соединений, на которое он распадается. Точная структура природных моноклональных антител человека к синдекану-1 не установлена.Thus, the mouse antibodies against CD138 described today are unsuitable for use in humans due to their high immunogenicity, they are used for laboratory purposes, chimeric MAb do not have an independent therapeutic effect - they are used only as a targeting agent, and can also be immunogenic. We cannot exclude the individual reaction of the patient to a particular Mab. In addition, the active agent that is targeted using antibodies, or the products of its breakdown, can be a stress factor for the body, due to their structure, ability and breakdown period of this substance, the nature of the compounds into which it breaks down. The exact structure of natural human monoclonal antibodies to syndecan-1 has not been established.
Учитывая функциональную роль синдекана-1 в инвазивном росте и метастазировании опухолей, создание антител к нему, обладающих самостоятельной высокой цитотоксичностью, наряду с более высокой аффинностью и более низкой иммуногенностью, является актуальной задачей.Given the functional role of syndecan-1 in the invasive growth and metastasis of tumors, the creation of antibodies to it, which have independent high cytotoxicity, along with higher affinity and lower immunogenicity, is an urgent task.
Данная задача решена предложенным изобретением.This problem is solved by the proposed invention.
Технический результат от использования предлагаемого антитела к CD138 выражается, как минимум, в увеличении спектра MAb к CD138, используемых в терапии опухолевых заболеваний, что позволяет проводить им лечение при индивидуальной непереносимости или плохой переносимости аналогов.The technical result from the use of the proposed antibodies to CD138 is expressed, as a minimum, in an increase in the spectrum of MAb to CD138 used in the treatment of tumor diseases, which allows them to be treated for individual intolerance or poor tolerance of analogues.
Технический результат от использования предлагаемого антитела к CD138 выражается в увеличении аффинности к антигену, и, соответственно, эффективности антитела. Указанный технический результат достигается гуманизацией антитела: использование каркасных участков человеческого антитела позволяет более точно сориентировать гипервариабельные участки, что увеличивает соответствие эпитопа и паратопа и, соответственно, аффинность.The technical result from the use of the proposed antibodies to CD138 is expressed in an increase in affinity for the antigen, and, accordingly, the effectiveness of the antibody. The indicated technical result is achieved by antibody humanization: the use of frame sections of a human antibody allows more precise orientation of hypervariable regions, which increases the correspondence of the epitope and paratope and, accordingly, affinity.
Технический результат от использования предлагаемого антитела к CD138 также выражается в индукции цитотоксичности. Указанный технический результат достигается тем, что в константный фрагмент тяжелой цепи антитела типа IgG4 введены участки цепей IgG3, опосредующие антитело- и комплемент-зависимую цитотоксичность.The technical result from the use of the proposed antibodies to CD138 is also expressed in the induction of cytotoxicity. The specified technical result is achieved by the fact that sections of IgG3 chains mediating antibody- and complement-dependent cytotoxicity are introduced into the constant fragment of the heavy chain of an IgG4 type antibody.
Технический результат от использования предлагаемого антитела к CD138 также выражается в уменьшении иммуногенности за счет гуманизации антитела.The technical result from the use of the proposed antibodies to CD138 is also expressed in a decrease in immunogenicity due to the humanization of the antibody.
Технический результат от использования предлагаемого антитела к CD138 также выражается в уменьшении стрессорного воздействия на организм противоопухолевого препарата, за счет того что действующим веществом является сама молекула моноклонального антитела - по природе белок, который впоследствии деградирует до аминокислот, т.е. при его использовании исключаются какие-либо последствия возможного невыведения из организма в течение какого-либо времени действующего агента (химического вещества небелковой природы), либо продуктов его распада.The technical result from the use of the proposed anti-CD138 antibody is also expressed in the reduction of the stress effect on the body of the antitumor drug, due to the fact that the active substance is the monoclonal antibody molecule itself - by nature a protein that subsequently degrades to amino acids, i.e. when using it, any consequences of a possible non-elimination from the body of an active agent (non-protein chemical substance) or its decomposition products from the body for any time are excluded.
Технический результат от использования предлагаемого антитела к CD138 также выражается в увеличении срока полужизни антитела, что достигается введением аминокислотных замен на С-конце константной части тяжелой цепи. Это позволяет уменьшать дозировки, осуществлять меньшее количество введений антитела, что может снизить стоимость лечения.The technical result from the use of the proposed antibodies to CD138 is also expressed in increasing the half-life of the antibody, which is achieved by the introduction of amino acid substitutions at the C-end of the constant part of the heavy chain. This allows you to reduce the dosage, to implement a smaller number of introductions of antibodies, which can reduce the cost of treatment.
Также техническим результатом является получение высокого уровня экспрессии антитела в клетках млекопитающих за короткий срок за счет кодонной оптимизации кодирующих последовательностей, а также введенной сигнальной секреторной последовательности на N-конце тяжелой и легкой цепи, что позволяет удешевить и ускорить производство.Also, the technical result is to obtain a high level of antibody expression in mammalian cells in a short time due to codon optimization of coding sequences, as well as the introduced signal secretory sequence at the N-end of the heavy and light chains, which allows to reduce the cost and speed up the production.
Сущность изобретенияSUMMARY OF THE INVENTION
Задачей данного изобретения являлось создание универсального моноклонального антитела - к CD138, приемлемого для терапии опухолевых заболеваний, обладающего высокой аффинностью к антигену (к CD138), низкой иммуногенностью и высокой цитотоксичностью, а также длительным периодом полужизни, которое можно получать в больших количествах за короткий промежуток времени.The objective of the invention was the creation of a universal monoclonal antibody to CD138, suitable for the treatment of tumor diseases, with high affinity for the antigen (CD138), low immunogenicity and high cytotoxicity, as well as a long half-life that can be obtained in large quantities in a short period of time .
Данная задача решена тем, что предложено моноклональное гуманизированное антитело к синдекану-1 (CD138), на основе IgG4, с введенными в CH фрагмент антитела участками IgG3, обуславливающими формирование антитело-зависимой и комплемент-зависимой цитотоксичности, с введенной сигнальной секреторной последовательностью на N-конце тяжелой и легкой цепи, отщепляющейся после секреции белков из клеток-продуцентов, а также аминокислотными заменами, увеличивающими период полужизни данного антитела; имеющее последовательность тяжелой цепи SEQ ID ΝΟ:1 и легкой цепи SEQ ID NO:2, закодированную в нуклеотидных последовательностях SEQ ID NO:3 и SEQ ID NO:4, кодонно оптимизированных для увеличенной экспрессии в клетках млекопитающих (СНО).This problem is solved by the fact that a monoclonal humanized antibody to syndecan-1 (CD138) is proposed, based on IgG4, with IgG3 sites introduced into the C H antibody fragment, causing the formation of antibody-dependent and complement-dependent cytotoxicity, with an introduced signal secretory sequence of N -the end of the heavy and light chains, cleaved after secretion of proteins from producer cells, as well as amino acid substitutions that increase the half-life of this antibody; having the heavy chain sequence of SEQ ID NO: 1 and light chain SEQ ID NO: 2 encoded in the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4, codon optimized for increased expression in mammalian cells (CHO).
Предложенное гуманизированное антитело к CD138 высокоаффинно связывается с гиперэкспрессированным на опухолевых клетках синдеканом-1 за счет гуманизации вариабельных фрагментов. Гипервариабельные участки полученных самостоятельно в результате иммунизации синдеканом-1 моноклональных антител мыши перенесены в наиболее структурно гомологичные по ключевым позициям акцепторные антитела человека, каркасные участки которых позволяют более точно сориентировать гипервариабельные участки в пространстве, что увеличивает соответствие эпитопа и паратопа и, соответственно, обеспечивает более высокую по сравнению с химерными антителами аффинность к мишени. На N-конце тяжелой и легкой цепей введена сигнальная секреторная последовательность, отщепляющаяся после секреции белков из клеток-продуцентов.The proposed humanized anti-CD138 antibody binds highly affinely with syndecan-1 overexpressed on tumor cells due to the humanization of variable fragments. Hypervariable regions of mouse monoclonal antibodies obtained independently as a result of immunization with syndecan-1 were transferred to human acceptor antibodies that are most structurally homologous with respect to key positions; their skeleton regions allow more precise orientation of hypervariable regions in space, which increases the correspondence of the epitope and paratope and, therefore, provides a higher Compared to chimeric antibodies, affinity for the target. At the N-terminus of the heavy and light chains, a signal secretory sequence is introduced that cleaves after the secretion of proteins from producer cells.
Конструкция предлагаемого антитела способна обеспечить его самостоятельный цитотоксический эффект по антитело-зависимому и комплемент-зависимому механизмам за счет оптимизации последовательности константного фрагмента (IgG4-IgG3 shifting), что обеспечивает привлечение клеток иммунной системы. Это позволяет отказаться от использования цитотоксического агента, т.е. от процедур выбора характера его использования в совокупности с Mab (присоединения или совместного использования), процедуры его конъюгации с антителом, поддержания активности обоих компонентов и других вытекающих последствий.The design of the proposed antibody is able to provide its independent cytotoxic effect by antibody-dependent and complement-dependent mechanisms by optimizing the sequence of the constant fragment (IgG4-IgG3 shifting), which ensures the involvement of cells of the immune system. This eliminates the use of a cytotoxic agent, i.e. from procedures for choosing the nature of its use in conjunction with Mab (accession or sharing), procedures for its conjugation with an antibody, maintaining the activity of both components and other ensuing consequences.
Антитела IgG4 не активируют комплемент, в то время как IgG3 способны активировать каскад протеолитических реакций, осуществляемых системой комплемента.IgG4 antibodies do not activate complement, while IgG3 can activate a cascade of proteolytic reactions carried out by the complement system.
Предложенное моноклональное антитело к синдекану-1 (CD138) содержит участки IgG3 - введены аминокислотные замены в тяжелой цепи, что обеспечивает индукцию антитело-зависимой и комплемент-зависимой цитотоксичности, а также аминокислотные замены для увеличения периода полужизни антитела на С-конце константной части тяжелой цепи.The proposed monoclonal antibody to syndecan-1 (CD138) contains IgG3 sites - amino acid substitutions in the heavy chain are introduced, which provides the induction of antibody-dependent and complement-dependent cytotoxicity, as well as amino acid substitutions to increase the half-life of the antibody at the C-terminus of the constant part of the heavy chain .
Кодонная оптимизация нуклеотидных последовательностей (SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4), кодирующих антитело согласно изобретению (тяжелые и легкие цепи), наряду с введением сигнальной секреторной последовательности, позволила получить до 2 грамм целевого белка на литр при трех днях культивирования клеток млекопитающих - продуцентов(СНО).Codon optimization of nucleotide sequences (SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4) encoding the antibody of the invention (heavy and light chains), along with the introduction of a signal secretory sequence, allowed to obtain up to 2 grams of the target protein per liter with three days of cell cultivation mammalian producers (CHO).
Полученное гуманизированное моноклональное антитело характеризуется значением Kd: 8,0*10-9.The resulting humanized monoclonal antibody is characterized by a Kd value of 8.0 * 10 -9 .
Для испытания моноклонального антитела использовали мышей BALB/C Nude, у которых аллергическая реакция может быть более выражена, чем у стандартных лабораторных мышей. Однако аллергическая реакция не наблюдалась, что позволяет предполагать, что разработанный препарат будет достаточно безопасен с точки зрения побочных аллергических эффектов.BALB / C Nude mice were used to test the monoclonal antibody, in which the allergic reaction may be more pronounced than in standard laboratory mice. However, an allergic reaction was not observed, which suggests that the developed drug will be quite safe in terms of allergic side effects.
Результаты испытания препарата на моделях in vivo показали, что у лабораторных животных наблюдался регресс опухоли, отсутствие метастазирования; животные, получавшие препарат, имели большую продолжительность жизни.The results of testing the drug on in vivo models showed that in the laboratory animals tumor regression was observed, lack of metastasis; animals treated with the drug had a longer life span.
Результаты данных испытаний препарата можно интерпретировать как предварительные данные по токсичности.The results of these drug tests can be interpreted as preliminary toxicity data.
Способность индукции антипролиферативной и противометастазной активности показана на клетках линии А431.The ability to induce antiproliferative and antimetastatic activity is shown on cells of the A431 line.
Таким образом, предложенное гуманизированное антитело к CD138 обладает противоопухолевым эффектом за счет блокирования опосредованных синдеканом-1 функций (адгезия, миграция опухолевых клеток) и индукции цитотоксического иммунного ответа, т.е. не только сдерживает рост опухоли и миграцию клеток, но и способствует их элиминации естественным путем.Thus, the proposed humanized anti-CD138 antibody has an antitumor effect by blocking syndecan-1-mediated functions (adhesion, migration of tumor cells) and the induction of a cytotoxic immune response, i.e. not only inhibits tumor growth and cell migration, but also contributes to their elimination in a natural way.
Таким образом, появляется возможность не только диагностики, но и терапии онкологических заболеваний моноклональным антителом к CD138, заявленным в изобретении за счет индукции антитело- и комплемент-зависимой цитотоксичности в отношении опухолей, в которых гиперэкспрессирован синдекан-1, благодаря внесению соответствующих аминокислотных замен в константные участки антитела человека (IgG4-IgG3 shifting). При использовании данного изобретения достигается высокая эффективность терапии, за счет увеличения аффинности антиген-связывающего участка моноклонального антитела к синдекану-1. За счет внесения соответствующих аминокислотных замен увеличено также время полужизни антитела после введения в организм пациента. Кодонная оптимизация тяжелой и легкой цепей, а также введение сигнальной секреторной последовательности на N-конце тяжелой и легкой цепей позволяет получать антитело в больших количествах за малые сроки в клетках млекопитающих.Thus, it becomes possible not only to diagnose but also treat cancer with the monoclonal anti-CD138 antibody claimed in the invention by inducing antibody- and complement-dependent cytotoxicity against tumors in which syndecan-1 is overexpressed due to the introduction of corresponding amino acid substitutions in constant sections of human antibodies (IgG4-IgG3 shifting). When using this invention, high therapy efficiency is achieved by increasing the affinity of the antigen-binding portion of the monoclonal antibody to syndecan-1. By introducing appropriate amino acid substitutions, the half-life of the antibody is also increased after administration to the patient. Codon optimization of the heavy and light chains, as well as the introduction of a signal secretory sequence at the N-terminus of the heavy and light chains, allows the production of antibodies in large quantities for short periods in mammalian cells.
Предлагаемое Mab является безопасным для человека с точки зрения побочных аллергических эффектов благодаря гуманизации.The proposed Mab is safe for humans in terms of allergic side effects due to humanization.
Краткое описание графических материаловA brief description of the graphic materials
Фигура 1. Электрофореграмма, показывающая экспрессию гена, кодирующего синдекан-1, в используемой клеточной линии миеломы SP 2.0Figure 1. Electrophoregram showing the expression of the gene encoding syndecan-1 in the used myeloma cell line SP 2.0
1) контроль качества синтеза кДНК, результат проведения ПЦР с праймерами KG3PDH;1) quality control of cDNA synthesis, the result of PCR with KG3PDH primers;
2) положительный контроль, ПЦР с праймерами, специфическими к последовательности ДНК, кодирующей CD138, с использованием в качестве матрицы плазмидной ДНК, содержащей клонированный ген синдекана-1;2) positive control, PCR with primers specific for the DNA sequence encoding CD138, using plasmid DNA containing the cloned syndecan-1 gene as a template;
3) ПЦР на кДНК из клеток миеломы с использованием праймеров, специфических к ДНК, кодирующей синдекан-1;3) PCR for cDNA from myeloma cells using primers specific for DNA encoding syndecan-1;
4) контроль экспрессии - ПЦР с использованием праймеров, специфических к ДНК, кодирующей синдекан-1, на тотальной РНК из клеток миеломы;4) expression control - PCR using primers specific for DNA encoding syndecan-1 on total RNA from myeloma cells;
5) маркер молекулярного веса 1 кb DNA Ladder (Fermentas).5)
Фигура 2. Динамика развития миеломы SP 2.0 в мышах BALB/C в трех группах животных. Черный столбик - показатели контрольной группы, серый - группы мышей, которым вводили 1 мг препарата гуманизированного моноклонального антитела, заштрихованный - группы мышей, которым вводили 0,1 мг препарата гуманизированного моноклонального антитела.Figure 2. Dynamics of the development of SP 2.0 myeloma in BALB / C mice in three groups of animals. The black bar is the indices of the control group, the gray one is the group of mice injected with 1 mg of the preparation of a humanized monoclonal antibody, the shaded one is the group of mice injected with 0.1 mg of the preparation of a humanized monoclonal antibody.
ПРИМЕРЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯMODES FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Пример 1. Получение моноклонального гуманизированного антитела к синдекану-1.Example 1. Obtaining a monoclonal humanized antibody to syndecan-1.
1.1. Получение синдекана-11.1. Getting syndecan-1
Ген, кодирующий синдекан-1, был синтезирован посредством химико-ферментативного синтеза [20] соответствующего гена двуступенчатым методом. Полученный ген был клонирован в векторе pET151/D-TOPO, обеспечивающем высокий уровень синтеза рекомбинантного белка, сшитого с полигистидиновой последовательностью, для удобства дальнейшей очистки с помощью металлохелатной хроматографии, в результате которой можно получить белок в виде отдельной аминокислотной последовательности, без полигистидина и каких-либо других примесей, благодаря наличию сайта для TEV-протеазы, в клетках E.coli BL21(DE3)Star, которые содержат мутированный ген rne (rne131), кодирующий усеченную форму РНКазы Е, что уменьшает внутриклеточное разрушение мРНК, приводя к увеличению ее ферментативной стабильности и, соответственно, продукции белка. Получили экспрессию данного гена в клетках E.coli BL21(DE3)Star.The gene encoding syndecan-1 was synthesized by means of chemical-enzymatic synthesis [20] of the corresponding gene by the two-step method. The resulting gene was cloned in the pET151 / D-TOPO vector, which provides a high level of synthesis of a recombinant protein crosslinked with a polyhistidine sequence, for the convenience of further purification using metal chelate chromatography, as a result of which the protein can be obtained as a separate amino acid sequence, without polyhistidine and any or other impurities, due to the presence of a site for the TEV protease, in E. coli BL21 (DE3) Star cells, which contain the mutated rne gene ( rne131 ), encoding a truncated form of RNase E, which reduces the intracellular the in vivo destruction of mRNA, leading to an increase in its enzymatic stability and, accordingly, protein production. This gene was expressed in E. coli BL21 (DE3) Star cells.
Рекомбинантный белок выделяли из клеток штамма BL21[DE3]Star pET151sind-1, растворив клетки в лизирующем буфере. Проводили очистку синдекана-1 с помощью металлохелатной хроматографии.Recombinant protein was isolated from cells of strain BL21 [DE3] Star pET151sind-1 by dissolving the cells in a lysis buffer. Purification of syndecan-1 was carried out using metal chelate chromatography.
Препарат рекомбинантного белка имел чистоту 95-97% и был использован для получения гибридомы, продуцирующей моноклональные антитела мыши к синдекану-1 и тестирования полученных моноклональных антител.The recombinant protein preparation had a purity of 95-97% and was used to obtain a hybridoma producing mouse monoclonal antibodies to syndecan-1 and to test the resulting monoclonal antibodies.
1.2. Иммунизация мышей линии Balb/c синдеканом-11.2. Immunization of Balb / c Sydecan-1 Mice
Была проведена иммунизация мышей линии Balb/c, в качестве антигена использовали очищенный рекомбинантный белок синдекан-1. При первичной иммунизации мышам вводили подкожно 50 мкг антигена в полном адъюванте Фрейнда (ПАФ). Через 28 дней анализировали уровень иммунного ответа на введенный антиген, оценивая титр специфических сывороточных антител с помощью иммунноферментного анализа (ИФА). Животным с максимальным значением иммунного ответа повторно вводили подкожно 30 мкг антигена в неполном адъюванте Фрейнда (НАФ) и оценивали уровень вторичного иммунного ответа через 21 день, затем за 4-5 дней до проведения соматической гибридизации вводили 30 мкг антигена в физиологическом растворе (ФР) внутрибрюшинно.Immunization of Balb / c mice was carried out; purified recombinant syndecan-1 protein was used as antigen. During primary immunization, mice were injected subcutaneously with 50 μg of antigen in complete Freund's adjuvant (PAF). After 28 days, the level of the immune response to the introduced antigen was analyzed, evaluating the titer of specific serum antibodies using an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Animals with the maximum value of the immune response were re-injected subcutaneously with 30 μg of antigen in incomplete Freund's adjuvant (NAF) and the level of the secondary immune response was evaluated after 21 days, then 4 μg before somatic hybridization was administered 30 μg of antigen in saline (RF) intraperitoneally .
1.3. Получение гибридомы, синтезирующей моноклональные антитела, специфичные к синдекану-11.3. Obtaining a hybridoma synthesizing monoclonal antibodies specific for syndecan-1
В качестве партнеров по слиянию использовали спленоциты иммунизированных мышей с титром сывороточных антител к белку синдекан-1 примерно 1:30000 и клетки мышиной миеломы sp2/0-Ag14 (АТСС, CRL-1581) в соотношении 2:1. Гибридизацию проводили с использованием раствора полиэтиленгликоля (Sigma) в соответствии со стандартной методикой. Селекцию стабильных гибридных клеток проводили путем культивирования на среде IMDM (Iscove-s Modified Dulbecco Medium, Sigma), содержащей 10% сыворотки FCI (HyClone) и HAT (Gibco). Отбор клонов гибридных клеток, секретирующих антитела, специфичные к заданным антигенам, проводили с помощью иммуноферментного анализа (ИФА). В результате первичного скрининга было отобрано 10 клонов гибридных клеток, продуцирующих моноклональные антитела к синдекану-1. После проведения пяти клонирований было получено 4 стабильных продуцирующих клона. Из каждой из клеточных линий была выделена мРНК, кодирующая тяжелые и легкие цепи антитела к синдекану-1.Splenocytes of immunized mice with a titer of serum antibodies to the syndecan-1 protein of approximately 1: 30,000 and murine myeloma cells sp2 / 0-Ag14 (ATCC, CRL-1581) in a 2: 1 ratio were used as fusion partners. Hybridization was carried out using a solution of polyethylene glycol (Sigma) in accordance with standard methods. The selection of stable hybrid cells was performed by culturing on IMDM medium (Iscove-s Modified Dulbecco Medium, Sigma) containing 10% FCI serum (HyClone) and HAT (Gibco). Clones of hybrid cells secreting antibodies specific for specific antigens were selected using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). As a result of the initial screening, 10 clones of hybrid cells producing monoclonal antibodies to syndecan-1 were selected. After five clonings, 4 stable producing clones were obtained. An mRNA encoding the heavy and light chains of an anti-syndecan-1 antibody was isolated from each of the cell lines.
1.4. Получение нуклеотидных последовательностей тяжелых и легких цепей гуманизированного антитела к синдекану-11.4. Obtaining the nucleotide sequences of the heavy and light chains of a humanized antibody to syndecan-1
Из стабильных клонов гибридных клеток, продуцирующих мышиные моноклональные антитела к синдекану-1, была выделена РНК с использованием набора «TRI Reagent» производства фирмы «Sigma», США, по инструкции изготовителя. На 5-10х106 клеток использовали 1 мл лизирующего раствора «TRI Reagent». Синтез кДНК проводили с помощью набора Revert Aid® First Strand cDNA Synthesis Kit (производства фирмы «Fermentas», Литва).RNA was isolated from stable clones of hybrid cells producing murine monoclonal antibodies to syndecan-1 using the TRI Reagent kit manufactured by Sigma, USA, according to the manufacturer's instructions. On 5-10x10 6 cells, 1 ml of TRI Reagent lysis solution was used. CDNA synthesis was performed using the Revert Aid® First Strand cDNA Synthesis Kit (manufactured by Fermentas, Lithuania).
Амплификацию генов, кодирующих вариабельные фрагменты мышиных антител, проводили методом ПЦР с использованием специфических праймеров (5' вырожденных праймеров для отжига на неизвестных VH и VL участках) и в качестве матрицы синтезированной кДНК. Наработку фрагментов ДНК для клонирования проводили методом ПЦР с использованием высокоточной, термоустойчивой ДНК-полимеразы Pfx. Полученные ПЦР-продукты были клонированы в векторе pGMT-easy с использованием набора Fast Ligation Kit, Fermentas и секвенированы ферментативным методом по Сенгеру.Amplification of genes encoding variable fragments of murine antibodies was performed by PCR using specific primers (5 'degenerate primers for annealing at unknown VH and VL sites) and as a matrix of synthesized cDNA. The production of DNA fragments for cloning was carried out by PCR using high-precision, heat-resistant DNA polymerase Pfx. The obtained PCR products were cloned in the pGMT-easy vector using the Fast Ligation Kit, Fermentas and sequenced by the Sanger enzymatic method.
Результаты секвенирования были использованы для получения гуманизированного моноклонального антитела.Sequencing results were used to obtain a humanized monoclonal antibody.
Гуманизацию антитела проводили методом переноса выявленных (вычисленных с использованием компьютерных алгоритмов на полученных нуклеотидных последовательностях) гипервариабельных участков (CDR) вариабельного фрагмента мышиных антител, отвечающих за комплементарность антигену, на вариабельный фрагмент человека, помещали CDR между соответствующими каркасными участками, по результатам анализа баз данных и биоинформатического моделирования структурного сходства (аналогии) между антителами. Полученное гуманизированное антитело обладает специфичностью материнского мышиного антитела, но повышенной аффинностью за счет более подходящего пространственного расположения CDR, обусловленного каркасными участками.Antibodies were humanized by transferring the detected (calculated using computer algorithms on the obtained nucleotide sequences) hypervariable regions (CDRs) of the variable fragment of murine antibodies responsible for complementarity to the antigen onto the human variable fragment; CDRs were placed between the corresponding framework regions according to the results of database analysis and bioinformatic modeling of structural similarity (analogy) between antibodies. The resulting humanized antibody has the specificity of a maternal mouse antibody, but increased affinity due to the more appropriate spatial arrangement of the CDRs due to the frame regions.
Для молекулярной графики использовали программы: Insight II; Accelrys, СА. Моделирование конформационной гомологии между донорным мышиным антителом и человеческим акцепторным антителом проводили с использованием WAM (http://antibody.bath.ac.uk), SWISS-MODEL (http://www.expasy.org), INSIGHT-HOMOLOGY (Accelrys), COMPOSER (Tripos, МО) и GCG Wisconsin Package. Последовательности вариабельных фрагментов мышиных антител были аннотированы и пронумерованы с использованием баз данных Kabat и Chothia.For molecular graphics used programs: Insight II; Accelrys, CA. Conformational homology between a donor mouse antibody and a human acceptor antibody was simulated using WAM (http://antibody.bath.ac.uk), SWISS-MODEL (http://www.expasy.org), INSIGHT-HOMOLOGY (Accelrys) , COMPOSER (Tripos, MO) and the GCG Wisconsin Package. The sequences of variable fragments of murine antibodies were annotated and numbered using the Kabat and Chothia databases.
Информация о структуре вариабельных фрагментов учитывается в нумерации, разработанной Chothia [21], однако в данной нумерации не рассматриваются остатки аминокислот в вариабельных фрагментах антител. В соответствии с указанными выше данными для нумерации и аннотирования вариабельных фрагментов использовался модифицированный Kabat и Chothia алгоритм Abhinandan KR и Martin АС [22, 23]. При нумерации при этом учитывались не только исправленные данные множественных выравниваний последовательностей антител по Kabat и данные о структуре CDR по Chothia с учетом структуры FR, но и данные о VH/VL углах складывания в донорных и акцепторных антителах. Для автоматического аннотирования использовались программы с интерактивным web-интерфейсом: SeqTest (AbCheck) http://www.bioinf.org.uk/abs/seqtest.html, Abnum http://www.bioinf.org.uk/abs/abnum/, ручная корректировка и проверка проводились с использованием локальной версии базы данных Kabat http://www.kabatdatabase.com/index.html и программы KabatMan http://www.bioinf.org.uk/abs/simkab.html, средств IMGT http://imgt.cines.fr/ и данных множественного выравнивания последовательностей вариабельных фрагментов антител с использованием MUSCULE http://www.ebi.ac.uk/Tools/muscle/index.html и пакета программ FASTA http://fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_http://down.shtml, структуры которых представлены в PDB на 2012 год, а также разработанных авторами изобретения нескольких Perl скриптов для автоматизации анализа данных. VH/VL углы складывания были рассчитаны и предсказаны исходя из алгоритма, предложенного Abhinandan [22]. Все необходимые расчеты, связанные с моделированием структуры белковых молекул, проводили с использованием Modeller и Swiss-Model.Information on the structure of variable fragments is taken into account in the numbering developed by Chothia [21]; however, this numbering does not consider amino acid residues in variable fragments of antibodies. In accordance with the above data, the Abinandan KR and Martin AC algorithms modified by Kabat and Chothia were used for numbering and annotation of variable fragments [22, 23]. When numbering, this took into account not only corrected data of multiple alignments of Kabat antibody sequences and data on the Chothia CDR structure taking into account the FR structure, but also data on V H / V L folding angles in donor and acceptor antibodies. For automatic annotation, programs with an interactive web interface were used: SeqTest (AbCheck) http://www.bioinf.org.uk/abs/seqtest.html, Abnum http://www.bioinf.org.uk/abs/abnum/ , manual adjustment and verification were carried out using the local version of the Kabat database http://www.kabatdatabase.com/index.html and the KabatMan program http://www.bioinf.org.uk/abs/simkab.html, IMGT http tools : //imgt.cines.fr/ and data on multiple sequence alignment of variable antibody fragments using MUSCULE http://www.ebi.ac.uk/Tools/muscle/index.html and the FASTA software package http: //fasta.bioch .virginia.edu / fasta_www2 / fasta_http: //down.shtml, whose structures presented in the PDB for 2012, as well as several Perl scripts developed by the inventors to automate data analysis. V H / V L folding angles were calculated and predicted based on the algorithm proposed by Abhinandan [22]. All necessary calculations related to modeling the structure of protein molecules were performed using Modeller and Swiss-Model.
Следующим шагом в гуманизации антител был выбор акцепторных вариабельных фрагментов антител человека для переноса. Правильный выбор акцепторного антитела человека практически на 100% гарантирует успешную гуманизацию антител, с Kd, достаточной для высокопрочного связывания с антигеном. С использованием методов молекулярного моделирования и описанных выше подходов была построена структурная модель вариабельного фрагмента мышиного моноклонального антитела против синдекана-1. С использованием полученных трехмерных моделей были определены наиболее гомологичные (особенно по ключевым позициям) последовательности акцепторных антител человека, при этом использовались только антитела со значением коэффициента «человечности» Н>1 (что потенциально может уменьшить НАНА ответ). На основании полученной модели рассчитали аминокислотные и, соответственно, нуклеотидные последовательности вариабельных фрагментов тяжелой и легкой (каппа) цепей антитела.The next step in the humanization of antibodies was the selection of acceptor variable fragments of human antibodies for transfer. The correct choice of a human acceptor antibody almost 100% guarantees the successful humanization of antibodies, with Kd sufficient for high-strength binding to the antigen. Using molecular modeling methods and the approaches described above, a structural model of the variable fragment of the mouse monoclonal anti-syndecan-1 antibody was constructed. Using the obtained three-dimensional models, the most homologous (especially in key positions) sequences of human acceptor antibodies were determined, while only antibodies with the value of the “humanity” coefficient H> 1 were used (which could potentially reduce the ANAS response). Based on the obtained model, the amino acid and, correspondingly, nucleotide sequences of the variable fragments of the heavy and light (kappa) chains of the antibody were calculated.
1.5. Получение гуманизированных моноклональных антител к синдекану-11.5. Obtaining humanized monoclonal antibodies to syndecan-1
Для получения искомых свойств антител в константный фрагмент тяжелой цепи вводили участки IgG3, который обладает самой высокой степенью активации системы комплемента из всех изотипов, а также высокой аффинностью по отношению к связыванию с Fc рецептором фагоцитирующих клеток, в структуру константного фрагмента IgG4, что сообщило антителу способность индукции антитело-зависимой и комплемент-зависимой цитотоксичности. Также ввели аминокислотные замены 1M252Y, S254T, Т256Е, Н433К, N434F в область С-конца константного фрагмента IgG4 - для увеличения периода полужизни антитела.To obtain the desired properties of antibodies, IgG3 regions were introduced into the constant fragment of the heavy chain, which has the highest degree of activation of the complement system of all isotypes, as well as high affinity for binding to the Fc receptor of phagocytic cells, into the structure of the constant fragment of IgG4, which informed the antibody of the ability induction of antibody-dependent and complement-dependent cytotoxicity. The amino acid substitutions 1M252Y, S254T, T256E, H433K, N434F were also introduced at the C-terminus of the constant IgG4 fragment to increase the half-life of the antibody.
Соединили последовательности вычисленных вариабельного и константного фрагментов тяжелой цепи в одну аминокислотную последовательность, добавив на N-конце сигнальную секреторную последовательность (SEQ ID NO:1). Соединили последовательности вычисленных вариабельного и константного фрагментов легкой каппа цепи в одну аминокислотную последовательность, добавив на N-конце сигнальную секреторную последовательность (SEQ ID NO:2).The sequences of the calculated variable and constant fragments of the heavy chain were combined into one amino acid sequence by adding a signal secretory sequence at the N-terminus (SEQ ID NO: 1). The sequences of the calculated variable and constant fragments of the light kappa chain were combined into one amino acid sequence by adding a signal secretory sequence (SEQ ID NO: 2) at the N-terminus.
Перевели аминокислотные последовательности белка в нуклеотидные, оптимизировав последние для увеличения продукции данного антитела в клетках млекопитающих (СНО) с помощью программы на сайте http://www.encorbio.com/protocols/Codon.htm.The amino acid sequences of the protein were converted to nucleotide sequences, optimizing the latter to increase the production of this antibody in mammalian cells (CHO) using the program at http://www.encorbio.com/protocols/Codon.htm.
В результате был получен окончательный вариант нуклеотидных последовательностей (SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4), кодирующих гуманизированное моноклонального антитело к синдекану-1 (SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2), и синтезировали их с использованием химического синтеза. Синтезированные фрагменты клонировали в плазмидный вектор pUC57 для наработки, затем переклонировали в вектор pcDNA3.1+ для трансфекции клеток млекопитающих.The result was the final version of the nucleotide sequences (SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4) encoding a humanized monoclonal antibody to syndecan-1 (SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2), and synthesized using a chemical synthesis. The synthesized fragments were cloned into pUC57 plasmid vector for production, then cloned into pcDNA3.1 + vector for transfection of mammalian cells.
Трансфекцию клеток млекопитающих созданными плазмидами проводили методом кальций-фосфатного осаждения.Transfection of mammalian cells with the created plasmids was carried out by the method of calcium phosphate precipitation.
Для проведения трансформации клеток млекопитающих (СНО) плазмидными ДНК клетки высевали в 12-луночные планшеты (Costar, США) с плотностью посева 5×104 кл/см2. На следующий день для синхронизации клеточных делений культуральную среду заменяли. Через три часа к клеткам добавляли плазмидную ДНК, осажденную фосфатом кальция. Для приготовления осадка 250 мкл раствора, содержащего 50 мкг ДНК в 250 мМ CaCl2, медленно смешивали с 250 мкл раствора (1,64% NaCl, 1,13% HEPES рН 7,12 и 0,04% Na2HPO4). После 24 часов инкубации при 37°С в атмосфере 5% СО2 среду заменяли на аналогичную, но содержащую 2 антибиотика: 80 мкг/мл зеоцин и 2 мкг/мл бластицидин S для селекции клонов, содержащих обе трансформированные плазмиды и, следовательно, экспрессирующих полноразмерные гуманизированные антитела, селекцию проводили в течение 20 суток, в лунках, содержащих живые клетки, меняли среду (при этом предыдущую культуральную среду не выливали, а использовали для определения количества секретируемых антител методом ИФА), а еще через сутки клетки снимали с подложки и проводили анализ на экспрессию трансформированных генов. Анализ эффективности трансфекции проводили на проточном цитофлуориметре EPICS XL Beckman Coulter (Beckman Coulter, США).To carry out the transformation of mammalian cells (CHO) by plasmid DNA, the cells were seeded in 12-well plates (Costar, USA) with a culture density of 5 × 10 4 cells / cm 2 . The next day, to synchronize cell divisions, the culture medium was replaced. After three hours, plasmid DNA precipitated with calcium phosphate was added to the cells. To prepare a pellet, 250 μl of a solution containing 50 μg of DNA in 250 mM CaCl 2 was slowly mixed with 250 μl of a solution (1.64% NaCl, 1.13% HEPES pH 7.12 and 0.04% Na 2 HPO 4 ). After 24 hours of incubation at 37 ° C in an atmosphere of 5% CO 2, the medium was replaced with a similar but containing 2 antibiotics: 80 μg / ml zeocin and 2 μg / ml blasticidin S to select clones containing both transformed plasmids and, therefore, expressing full-sized humanized antibodies, selection was carried out for 20 days, in the wells containing living cells, the medium was changed (the previous culture medium was not poured, but was used to determine the amount of secreted antibodies by ELISA), and after another day the cells were removed from spoons and analyzed for expression of the transformed gene. The transfection efficiency analysis was carried out on an EPICS XL Beckman Coulter flow cytometer (Beckman Coulter, USA).
Уровень гуманизированных антител в культуральной среде полученных стабильных трансфектом линии СНО оценивали с использованием стандартного твердофазного ИФА.The level of humanized antibodies in the culture medium obtained by stable transfect of the CHO line was evaluated using standard solid-phase ELISA.
В результате 6 клонирований были получены стабильные трансфектомы СНО, которые накапливали для криоконсервирования и наработки опытной партии антител. Продуктивность созданных трансфектом СНО, экспрессирующих антитела к синдекану-1, составила 500 мкг/107 клеток/день.As a result of 6 clonings, stable CHO transfectomas were obtained, which were accumulated for cryopreservation and development of an experimental batch of antibodies. The productivity of the transfect SNO expressing antibodies to syndecan-1 was 500 μg / 10 7 cells / day.
1.6. Культивирование клеток-продуцентов гуманизированного моноклонального антитела к синдекану-11.6. The cultivation of producer cells of a humanized monoclonal antibody to syndecan-1
Культивирование клеток-продуцентов осуществляли с использованием биореакторов BIOSTAT® Bplus и автоклавированной среды IMDM с добавлением 45 г DFBS (0,5%) и 25,8 г (100 мМ) сульфата цинка семиводного (ZnSO4 x 7H2O) на 9 л среды. Задавали рабочий режим: температура 37ºC, pH 6,9-7,2, концентрация кислорода 50% насыщения воздуха. После достижения заданного режима производили засев биореактора, для чего в асептичных условиях в него вводили посевной материал. Время культивирования составляло 3 суток.The producer cells were cultured using BIOSTAT® Bplus bioreactors and an IMDM autoclaved medium supplemented with 45 g of DFBS (0.5%) and 25.8 g (100 mM) of zinc sulfate seven-water (ZnSO 4 x 7H 2 O) per 9 l of medium . The operating mode was set: temperature 37ºC, pH 6.9-7.2, oxygen concentration 50% air saturation. After reaching the given regime, the bioreactor was inoculated, for which, under aseptic conditions, seed was introduced into it. The cultivation time was 3 days.
По окончании культивирования культуральную жидкость фильтровали через стерильную капсулу «Sartopure» («Sartorius», Германия), с диаметром пор 1,2 мкм, со скоростью 1 л/мин. Затем осветленную жидкость концентрировали на системе Viva Flow 200 («Sartorius», Германия) с использованием фильтра на 50 кДа. Концентрирование проводили до достижения общего объема - 200 мл.At the end of cultivation, the culture fluid was filtered through a sterile capsule "Sartopure" ("Sartorius", Germany), with a pore diameter of 1.2 μm, at a speed of 1 l / min. Then, the clarified liquid was concentrated on a Viva Flow 200 system (Sartorius, Germany) using a 50 kDa filter. Concentration was carried out until a total volume of 200 ml was reached.
1.7. Очистка полученного гуманизированного моноклонального антитела к синдекану-11.7. Purification of the resulting humanized monoclonal anti-syndecan-1 antibody
Хроматографическую очистку проводили в два этапа с использованием стерильных растворов. На первом этапе использовали систему BioLogic DuoFlow Pathfinder (Bio-Rad) с автоматическим коллектором фракций BioFrac и полупрепаративную хроматографическую колонку YMC TriArt, 250х4,6 мм, сорбент С18. Перед началом работы колонку уравновешивали с помощью 200 мл буфера (1 кг воды для инъекций и 1 г кислоты трифторуксусной) в ручном режиме через насос хроматографа на скорости 2 мл/мин.Chromatographic purification was carried out in two stages using sterile solutions. At the first stage, we used the BioLogic DuoFlow Pathfinder (Bio-Rad) system with an automatic BioFrac fraction collector and a YMC TriArt semi-preparative chromatographic column, 250x4.6 mm, С18 sorbent. Before starting work, the column was balanced using 200 ml of buffer (1 kg of water for injection and 1 g of trifluoroacetic acid) in manual mode through a chromatograph pump at a speed of 2 ml / min.
Подготовленный материал в объеме 200 мл вносили в хроматограф через насос хроматографа на скорости 0,5 мл/мин. Элюцию производили буфером (2 кг ацетонитрила, 2 г кислоты трифторуксусной) со скоростью 0,5 мл в минуту. Собирали фракцию в максимуме поглощения при 260 нм. Объем фракции составил примерно 500 мл.The prepared material in a volume of 200 ml was introduced into the chromatograph through a chromatograph pump at a speed of 0.5 ml / min. Elution was performed with a buffer (2 kg of acetonitrile, 2 g of trifluoroacetic acid) at a rate of 0.5 ml per minute. The fraction was collected at the maximum absorption at 260 nm. The volume of the fraction was approximately 500 ml.
Второй этап очистки выполняли с использованием гель-хроматографической колонки BioSil SEC 125-5, 300x7,8 мм. Предварительно колонку уравновешивали 0,02 М PBS-буфером. Полученный материал вносили в хроматограф через насос хроматографа на скорости 0,5 мл/мин. Элюцию производили буфером (0,6 М раствор NaCl) с градиентом концентрации от 0,1 до 0,6 М. Собирали фракцию, имеющую поглощение при А280 нм не менее 3.4 оптических единиц. Фракцию собирали во флаконы. Объем получаемого раствора составил примерно 1 л с концентрацией антитела 2 мг на 1 мл.The second purification step was carried out using a BioSil SEC 125-5, 300x7.8 mm gel chromatography column. The column was pre-equilibrated with 0.02 M PBS buffer. The resulting material was introduced into the chromatograph through a chromatograph pump at a speed of 0.5 ml / min. Elution was performed with a buffer (0.6 M NaCl solution) with a concentration gradient from 0.1 to 0.6 M. A fraction was collected that had an absorbance at A280 nm of at least 3.4 optical units. The fraction was collected in vials. The volume of the resulting solution was approximately 1 L with an antibody concentration of 2 mg per 1 ml.
Было проведено измерение Kd полученного антитела, изучено его влияние на модельные клеточные линии (антипролиферативная активность) и ксенографтные опухолевые модели (ингибирование развития опухоли). Оказалось, что созданное антитело обладает достаточно большой аффинностью (Kd =8,0*10-9).The Kd of the obtained antibody was measured, its effect on model cell lines (antiproliferative activity) and xenograft tumor models (inhibition of tumor development) was studied. It turned out that the created antibody has a sufficiently high affinity (Kd = 8.0 * 10 -9 ).
Пример 2. Изучение противоопухолевого эффекта гуманизированного моноклонального антитела к синдекану-1 на модели миеломы Sp2.0Example 2. The study of the antitumor effect of a humanized monoclonal antibody to syndecan-1 in the myeloma model Sp2.0
В качестве модели использовали клеточную линию миеломы SP2.0, сингенную с мышами BALB/C, предварительно показав в ней экспрессию гена, кодирующего синдекан-1 (Фиг.1). Для этого из культуры клеток была выделена РНК и проведен синтез и анализ кДНК.As a model used the myeloma cell line SP2.0, syngeneic with BALB / C mice, previously showing expression of the gene encoding syndecan-1 in it (Figure 1). For this, RNA was isolated from cell culture and cDNA synthesis and analysis was performed.
Мышам линии BALB/c NUDE прививались клетки опухоли SP2.0: подкожно в нижнюю часть спины было введено 500 000 клеток опухоли SP2.0 на одно животное. Использовалось 3 группы животных: 2 опытные и 1 контрольная.SP2.0 tumor cells were grafted into BALB / c NUDE mice: 500,000 SP2.0 tumor cells per animal were injected subcutaneously into the lower back. Used 3 groups of animals: 2 experimental and 1 control.
После животным вводили моноклональное антитело 1 раз в неделю в течение 5 недель в дозе 1 мг и 0,1 мг начиная с 6 дня после введения опухолевых клеток, когда размер опухоли составил >200+/-23 мм3. Размер опухоли (шарообразной формы) определяли дважды в неделю в течение 36 дней с использованием штангенциркуля по формуле: V(опухоли)=π/6*длина*ширина2, где длина>ширина.After the animals were injected
Получили следующие результаты: при введении гуманизированного моноклонального антитела к синдекану-1 мышам с привитыми клетками миеломы Sp2.0 происходит достоверное подавление роста опухоли (Фиг.2). Использование препарата моноклонального антитела к синдекану-1 позволило снизить объем опухоли на 50% на 5 неделю эксперимента.The following results were obtained: with the introduction of a humanized monoclonal antibody to syndecan-1 in mice with Sp2.0 myeloma grafted cells, there was a significant suppression of tumor growth (Figure 2). The use of a monoclonal antibody preparation for syndecan-1 allowed to reduce the tumor volume by 50% at the 5th week of the experiment.
Пример 3. Изучение противоопухолевого эффекта гуманизированного моноклонального антитела к синдекану-1 на примере изучения цитотоксичности на клетках человека линии А431Example 3. The study of the antitumor effect of a humanized monoclonal antibody to syndecan-1 on the example of the study of cytotoxicity on human cells of the line A431
Изучали противоопухолевый эффект гуманизированного моноклонального антитела к синдекану-1. Мышам линии BALB/c NUDE подкожно в области бока было введено 107 (300 мкл) человеческих клеток линии А431. После животным было введено моноклональное антитело в дозе 50 мг/кг веса и контрольное моноклональное антитело против овальбумина в дозе 50 мг/кг веса.The anti-tumor effect of the humanized monoclonal anti-syndecan-1 antibody was studied. BALB / c NUDE mice were subcutaneously injected with 10 7 (300 μl) human A431 cells in the flank area. After the animals, a monoclonal antibody was administered at a dose of 50 mg / kg body weight and a control monoclonal antibody against ovalbumin at a dose of 50 mg / kg body weight.
Моноклональное антитело вводилось дважды в неделю внутрибрюшинно в объеме 200 мкл начиная с 6 дня после введения опухолевых клеток, когда размер опухоли составил >250+/-23 мм3. Размер опухоли (шарообразной формы) определяли дважды в неделю в течение 36 дней с использованием штангенциркуля по формуле: V(опухоли)=π/6*длина*ширина2, где длина>ширина. Также оценивалась выживаемость животных, составляющая процент выживших животных относительно изначального размера группы на данную временную точку.The monoclonal antibody was injected intraperitoneally twice a week in a volume of 200 μl starting from 6 days after the introduction of tumor cells, when the tumor size was> 250 +/- 23 mm 3 . The size of the tumor (spherical shape) was determined twice a week for 36 days using a caliper according to the formula: V (tumor) = π / 6 * length * width 2 , where length> width. The survival rate of animals was also estimated, which is the percentage of surviving animals relative to the initial group size at a given time point.
Получили следующие показатели: активация моноклональным антителом комплемент-зависимого цитолиза клеток линии А431 происходит в концентрации 0,3 мкг/мл, что является хорошим показателем, а максимальная антипролиферативная активность на клетках линии А431 осуществляется в концентрации 0,2 мкг/мл.The following indicators were obtained: monoclonal antibody activation of complement dependent cytolysis of A431 cells occurs at a concentration of 0.3 μg / ml, which is a good indicator, and the maximum antiproliferative activity on A431 cells is carried out at a concentration of 0.2 μg / ml.
ЛитератураLiterature
1. World Health Statistics 2012, http://www.who.int/healthinfo/EN_WHS2012_Full.pdf.1. World Health Statistics 2012, http://www.who.int/healthinfo/EN_WHS2012_Full.pdf.
2. Жуков Н.В., Тюляндин С.А. Целевая терапия в лечении солидных опухолей; практика противоречит теории / Биохимия 2008, Т.73, вып.5, с751-768.2. Zhukov N.V., Tyulyandin S.A. Targeted therapy in the treatment of solid tumors; practice contradicts the theory / Biochemistry 2008, T.73,
3. Gattei V, Godeas С, Degan M, Rossi FM, Aldinucci D, Pinto A. Characterization of anti-CD138 monoclonal antibodies as tools for investigating the molecular polymorphism of syndecan-1 in human lymphoma cells. Br J Haematol. 1999 Jan;104(l):152-62.3. Gattei V, Godeas C, Degan M, Rossi FM, Aldinucci D, Pinto A. Characterization of anti-CD138 monoclonal antibodies as tools for investigating the molecular polymorphism of syndecan-1 in human lymphoma cells. Br J Haematol. 1999 Jan; 104 (l): 152-62.
4. Wijdenes J, Dore JM, Clement C, Vermot-Desroches С (2003). "CD138". J. Biol. Regul. Homeost. Agents 16 (2): 152-5.4. Wijdenes J, Dore JM, Clement C, Vermot-Desroches C (2003). "CD138." J. Biol. Regul. Homeost. Agents 16 (2): 152-5.
5. W. Wu 2007.5. W. Wu 2007.
6. Rousseau et al. EJNMMI Research 2011.6. Rousseau et al. EJNMMI Research 2011.
7. Bayer-Garner I.B., Sanderson R.D., Dhodapkar M.V. et al. Syndecan-1 (CD138) immunoreactivity in bone marrow biopsies of multiple myeloma: shed syndecan-1 accumulates in fibrotic regions. Mod Pathol 2001;14:1052-8.7. Bayer-Garner I.B., Sanderson R. D., Dhodapkar M.V. et al. Syndecan-1 (CD138) immunoreactivity in bone marrow biopsies of multiple myeloma: shed syndecan-1 accumulates in fibrotic regions. Mod Pathol 2001; 14: 1052-8.
8. Байков B.B.. ТРУДНОСТИ МОРФОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ МНОЖЕСТВЕННОЙ МИЕЛОМЫ. Москва, ОНКОГЕМАТОЛОГИЯ 2'2007, стр.10-158. Baykov B.B .. DIFFICULTIES OF MORPHOLOGICAL DIAGNOSTICS OF MULTIPLE MYELOMA. Moscow, ONCOGEMATOLOGY 2'2007, pp. 10-15
9. Wu YH, Yang С Y, Chien WL, Lin KI, Lai MZ. Removal of syndecan-1 promotes TRAIL-induced apoptosis in myeloma cells. J Immunol. 2012 Mar 15;188(6):2914-21. Epub 2012 Feb 3.9. Wu YH, Yang C Y, Chien WL, Lin KI, Lai MZ. Removal of syndecan-1 promotes TRAIL-induced apoptosis in myeloma cells. J Immunol. 2012 Mar 15; 188 (6): 2914-21. Epub 2012
10. Wu W. с соавторами в 2010.10. Wu W. et al. In 2010.
11. Bae J, Tai YT, Anderson КС, Munshi NC. 2011.11. Bae J, Tai YT, Anderson KS, Munshi NC. 2011.
12. Clinical Trials. gov identifier: NCT01296204.12. Clinical Trials. gov identifier: NCT01296204.
13. Wijdenes J., Vooijs W.C., Clement C. et al. A plasmacyte selective monoclonal antibody (B-B4) recognizes syndecan-1. Br J Haematol 1996; 94:318-23.13. Wijdenes J., Vooijs W.C., Clement C. et al. A plasmacyte selective monoclonal antibody (B-B4) recognizes syndecan-1. Br J Haematol 1996; 94: 318-23.
14. Ковригина A.M., Пробатова Н.А. ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ ДИАГНОСТИКА НЕХОДЖКИНСКИХ В-КЛЕТОЧНЫХ ЛИМФОМ. Москва, ОНКОГЕМАТОЛОГИЯ 2'2007, стр.6.14. Kovrigina A.M., Probatova N.A. DIFFERENTIAL DIAGNOSTICS OF NON-HODGKIN B-CELL Lymphomas. Moscow, ONCOGEMATOLOGY 2'2007, p. 6.
15. WO 2009080829 (A1) - AGENTS TARGETING CD138 AND USES THEREOF (23.12.2008).15. WO 2009080829 (A1) - AGENTS TARGETING CD138 AND USES THEREOF (12.23.2008).
16. WO 2009080832 (A1) - METHODS AND AGENTS FOR IMPROVING TARGETING OF CD138 EXPRESSING TUMOR CELLS (23.12.2008).16. WO 2009080832 (A1) - METHODS AND AGENTS FOR IMPROVING TARGETING OF CD138 EXPRESSING TUMOR CELLS (12/23/2008).
17. WO 2009080830 (A1) - IMMUNOCONJUGATES TARGETING CD138 AND USES THEREOF (23.12.2008).17. WO 2009080830 (A1) - IMMUNOCONJUGATES TARGETING CD138 AND USES THEREOF (12.23.2008).
18. WO 2010128087 (A2) - USES OF IMMUNOCONJUGATES TARGETING CD138 (5.05.2010).18. WO 2010128087 (A2) - USES OF IMMUNOCONJUGATES TARGETING CD138 (05/05/2010).
19. Sato Ν, Kinbara M, Kuroishi Τ, Kimura К, Iwakura Y, Ohtsu H, Sugawara S, Endo Y Clin. Lipopolysaccharide promotes and augments metal allergies in mice, dependent on innate immunity and histidine decarboxylase. Exp Allergy: 2007, May; 37(5): 743-751.19. Sato Ν, Kinbara M, Kuroishi Τ, Kimura K, Iwakura Y, Ohtsu H, Sugawara S, Endo Y Clin. Lipopolysaccharide promotes and augments metal allergies in mice, dependent on innate immunity and histidine decarboxylase. Exp Allergy: 2007, May; 37 (5): 743-751.
20. Young L, Dong Q., Two step total gene synthesis method. Nucleic Acid Research: 32, e59, 2004.20. Young L, Dong Q., Two step total gene synthesis method. Nucleic Acid Research: 32, e59, 2004.
21. Chothia C, Lesk AM. Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins. J Mol Biol. 1987 Aug 20; 196(4): 901-17.21. Chothia C, Lesk AM. Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins. J Mol Biol. 1987 Aug 20; 196 (4): 901-17.
22. Abhinandan К R and Martin A C. Analysis and Prediction of VH/VL Packing in Antibodies, Protein Engineering Design and Selection. 2010.22. Abhinandan K. R and Martin A C. Analysis and Prediction of VH / VL Packing in Antibodies, Protein Engineering Design and Selection. 2010.
23. Abhinandan KR, Martin AC. Analysis and improvements to Kabat and structurally correct numbering of antibody variable domains. Mol Immunol. 2008 Aug; 45(14): 3832-9.23. Abhinandan KR, Martin AC. Analysis and improvements to Kabat and structurally correct numbering of antibody variable domains. Mol Immunol. 2008 Aug; 45 (14): 3832-9.
24. Jason et al. 2009.24. Jason et al. 2009.
25. Points to Consider in the Manufacture and Testing of Monoclonal Antibody Products for Human Use, FDA, 1997, Guidance for Industry for the Submission of Chemistry, Manufacturing and Controls Information for a Therapeutic Recombinant DNA-derived Product or a Monoclonal Antibody Product for In Vivo Use, CBER/CDER, FDA, August, 1996, International Conference on Harmonisation; Final Guideline on Stability Testing of Biotechnological/Biological Products, July 10, 1996.25. Points to Consider in the Manufacture and Testing of Monoclonal Antibody Products for Human Use, FDA, 1997, Guidance for Industry for the Submission of Chemistry, Manufacturing and Controls Information for a Therapeutic Recombinant DNA-derived Product or a Monoclonal Antibody Product for In Vivo Use, CBER / CDER, FDA, August 1996, International Conference on Harmonization; Final Guideline on Stability Testing of Biotechnological / Biological Products, July 10, 1996.
26. Orecchia P, Conte R, Balza E, Petretto A, Mauri P, Mingari MC, Carnemolla B. A novel human anti-syndecan-1 antibody inhibits vascular maturation and tumour growth in melanoma. Eur J Cancer. 2013 May; 49(8):2022-33. doi: 10.1016/j.ejca.2012.12.019. Epub 2013 Jan 24.26. Orecchia P, Conte R, Balza E, Petretto A, Mauri P, Mingari MC, Carnemolla B. A novel human anti-syndecan-1 antibody inhibits vascular maturation and tumor growth in melanoma. Eur J Cancer. 2013 May; 49 (8): 2022-33. doi: 10.1016 / j.ejca.2012.12.01.019. Epub 2013 Jan 24.
Claims (2)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2013139743/10A RU2551235C2 (en) | 2013-08-26 | 2013-08-26 | Humanised monoclonal antibody specific to syndecan-1 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2013139743/10A RU2551235C2 (en) | 2013-08-26 | 2013-08-26 | Humanised monoclonal antibody specific to syndecan-1 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2013139743A RU2013139743A (en) | 2015-03-20 |
| RU2551235C2 true RU2551235C2 (en) | 2015-05-20 |
Family
ID=53285327
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2013139743/10A RU2551235C2 (en) | 2013-08-26 | 2013-08-26 | Humanised monoclonal antibody specific to syndecan-1 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2551235C2 (en) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2647771C2 (en) * | 2016-04-26 | 2018-03-19 | Общество с ограниченной ответственностью "Орексал" (ООО "Орексал") | Method for obtaining recombinant human orexin a , plasmid dna, strain producer |
| JP2018530993A (en) * | 2015-07-20 | 2018-10-25 | ウラジーミロヴィチ ドゥホフリノフ，イリヤー | Humanized monoclonal antibody specific for syndecan-1 |
| RU2746314C2 (en) * | 2016-06-09 | 2021-04-12 | Пеликан Терапьютикс, Инк. | Anti-tnfrsf25 antibodies |
| RU2757813C2 (en) * | 2016-06-23 | 2021-10-21 | Цзянсу Хэнжуй Медицин Ко., Лтд. | Antibody against lag-3, its antigen-binding fragment and their pharmaceutical application |
-
2013
- 2013-08-26 RU RU2013139743/10A patent/RU2551235C2/en active
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ORECCHIA P. et al. "A novel human anti-syndecan-1 antibody inhibits vascular maturation and tumour growth in melanoma." European Journal of Cancer (январь 2013); 49: 2022-2033. GATTEI V et al., "Characterization of anti-CD138 monoclonal antibodies as tools for investigating the molecular polymorphism of syndecan-1 in human lymphoma cells." Br J Haematol. (1999); 104:152-62. * |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2018530993A (en) * | 2015-07-20 | 2018-10-25 | ウラジーミロヴィチ ドゥホフリノフ，イリヤー | Humanized monoclonal antibody specific for syndecan-1 |
| EP3325511A4 (en) * | 2015-07-20 | 2019-04-10 | Dukhovlinov, Ilya Vladimirovich | Humanized monoclonal antibody specific to syndecan-1 |
| RU2647771C2 (en) * | 2016-04-26 | 2018-03-19 | Общество с ограниченной ответственностью "Орексал" (ООО "Орексал") | Method for obtaining recombinant human orexin a , plasmid dna, strain producer |
| RU2746314C2 (en) * | 2016-06-09 | 2021-04-12 | Пеликан Терапьютикс, Инк. | Anti-tnfrsf25 antibodies |
| RU2757813C2 (en) * | 2016-06-23 | 2021-10-21 | Цзянсу Хэнжуй Медицин Ко., Лтд. | Antibody against lag-3, its antigen-binding fragment and their pharmaceutical application |
| US11155617B2 (en) | 2016-06-23 | 2021-10-26 | Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd. | LAG-3 antibody, antigen-binding fragment thereof, and pharmaceutical application thereof |
| US11981733B2 (en) | 2016-06-23 | 2024-05-14 | Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd. | LAG-3 antibody, antigen-binding fragment thereof, and pharmaceutical application thereof |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2013139743A (en) | 2015-03-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US12447208B2 (en) | Anti-CTLA4 monoclonal antibody or its antigen binding fragments, pharmaceutical compositions and uses | |
| RU2611685C2 (en) | Humanized monoclonal antibody specific to syndecan-1 | |
| CN108779179B (en) | CD47 antibody, antigen-binding fragment thereof, and medical use thereof | |
| US20230250168A1 (en) | Anti-human claudin 18.2 antibody and application thereof | |
| JP2022509930A (en) | Anti-CD73 antibody, its antigen-binding fragment and their use | |
| JP2018530993A6 (en) | Humanized monoclonal antibody specific for syndecan-1 | |
| JP2018529351A (en) | Antagonist antibodies that specifically bind to human CD40 and methods of use | |
| WO2019091449A1 (en) | Cd96 antibody, antigen-binding fragment and pharmaceutical use thereof | |
| US20240174760A1 (en) | Nanobody targeting bcma and application thereof | |
| CN108712908A (en) | self-crosslinking antibody | |
| CA3125120A1 (en) | Antibody fusion protein, preparation method therefor and application thereof | |
| CA3022308A1 (en) | Humanized anti-basigin antibodies and the use thereof | |
| US20230203167A1 (en) | Anti-pd-l1 and pd-l2 antibody and derivatives and use thereof | |
| RU2551235C2 (en) | Humanised monoclonal antibody specific to syndecan-1 | |
| WO2023143535A1 (en) | Antibody targeting il-18bp and use thereof | |
| JP6410711B2 (en) | Binding protein with tethered light chain | |
| JP2025015580A (en) | Radiolabeled met binding proteins for immuno-pet imaging | |
| CN109879966B (en) | Humanized design and expression verification based on murine CD19 antibody | |
| JP7466930B2 (en) | Anti-CD137 Antibodies and Uses Thereof | |
| RU2768737C1 (en) | Humanized antibody 6h8hu, binding to tumour antigen prame, dna fragments coding said antibody and antigen-binding antibody fragment | |
| RU2761876C1 (en) | Humanised 5d3hu antibody binding to the prame tumour antigen, dna fragments encoding said antibody, and antigen-binding fragment of the antibody | |
| JP2025531360A (en) | Isolated antigen-binding proteins and uses thereof | |
| HK40057046A (en) | An anti-clta4 monoclonal antibody or antigen binding fragment thereof, a pharmaceutical composition and use | |
| HK1232893B (en) | Anti-ctla4 monoclonal antibody or antigen binding fragment thereof, medicinal composition and use |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| HE4A | Notice of change of address of a patent owner |
Effective date: 20180905 |
|
| PD4A | Correction of name of patent owner | ||
| PC41 | Official registration of the transfer of exclusive right |
Effective date: 20200127 |