RU2550965C1 - Method for prediction of pregnancy rate through in vitro fertilisation with selective embryo transfer by real-time pcr evaluation of molecular genetic gamete profile - Google Patents
Method for prediction of pregnancy rate through in vitro fertilisation with selective embryo transfer by real-time pcr evaluation of molecular genetic gamete profile Download PDFInfo
- Publication number
- RU2550965C1 RU2550965C1 RU2014125185/15A RU2014125185A RU2550965C1 RU 2550965 C1 RU2550965 C1 RU 2550965C1 RU 2014125185/15 A RU2014125185/15 A RU 2014125185/15A RU 2014125185 A RU2014125185 A RU 2014125185A RU 2550965 C1 RU2550965 C1 RU 2550965C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- embryo
- pregnancy
- mrna expression
- pcr
- selective
- Prior art date
Links
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 title claims abstract description 21
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 title claims abstract description 17
- 238000012546 transfer Methods 0.000 title claims abstract description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 18
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 title claims description 12
- 238000003744 In vitro fertilisation Methods 0.000 title abstract 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 title description 3
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 title description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 25
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims abstract description 17
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 15
- 210000001733 follicular fluid Anatomy 0.000 claims abstract description 14
- 108010007568 Protamines Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 102000007327 Protamines Human genes 0.000 claims abstract description 9
- 101001064774 Homo sapiens Peroxidasin-like protein Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 101001090148 Homo sapiens Protamine-2 Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 101001038163 Homo sapiens Sperm protamine P1 Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 102100034750 Protamine-2 Human genes 0.000 claims abstract description 7
- 101000599951 Homo sapiens Insulin-like growth factor I Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 101001056707 Homo sapiens Proepiregulin Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 102100037852 Insulin-like growth factor I Human genes 0.000 claims abstract description 5
- 102100025498 Proepiregulin Human genes 0.000 claims abstract description 5
- 102000000763 Survivin Human genes 0.000 claims abstract description 5
- 108010002687 Survivin Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 102100038778 Amphiregulin Human genes 0.000 claims abstract description 4
- 101000809450 Homo sapiens Amphiregulin Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 claims abstract description 4
- 229940088872 Apoptosis inhibitor Drugs 0.000 claims abstract description 3
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 claims abstract description 3
- 239000000158 apoptosis inhibitor Substances 0.000 claims abstract description 3
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 claims abstract description 3
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims abstract 2
- 102100040435 Sperm protamine P1 Human genes 0.000 claims abstract 2
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 claims abstract 2
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 claims description 9
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 claims description 7
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 claims description 7
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 5
- 229940070353 protamines Drugs 0.000 claims description 5
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 claims description 4
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 claims description 2
- 102000004369 Insulin-like growth factor-binding protein 4 Human genes 0.000 claims 1
- 108090000969 Insulin-like growth factor-binding protein 4 Proteins 0.000 claims 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 abstract description 6
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 abstract description 5
- 101000840572 Homo sapiens Insulin-like growth factor-binding protein 4 Proteins 0.000 abstract description 4
- 102100029224 Insulin-like growth factor-binding protein 4 Human genes 0.000 abstract description 4
- 229940048914 protamine Drugs 0.000 abstract description 4
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 abstract description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 238000002513 implantation Methods 0.000 abstract description 2
- 208000034702 Multiple pregnancies Diseases 0.000 abstract 1
- 230000003466 anti-cipated effect Effects 0.000 abstract 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 13
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 8
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 description 8
- 208000000509 infertility Diseases 0.000 description 6
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 6
- 231100000535 infertility Toxicity 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- 102100031894 Peroxidasin-like protein Human genes 0.000 description 4
- 210000001771 cumulus cell Anatomy 0.000 description 4
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 4
- 208000007466 Male Infertility Diseases 0.000 description 3
- 102000006467 TATA-Box Binding Protein Human genes 0.000 description 3
- 108010044281 TATA-Box Binding Protein Proteins 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 3
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 101000933465 Homo sapiens Beta-glucuronidase Proteins 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101150049281 PRM1 gene Proteins 0.000 description 2
- 206010042573 Superovulation Diseases 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- GAQNUGISBQJMKO-YFKPBYRVSA-N beta-citrylglutamic acid Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)C(O)(CC(O)=O)CC(O)=O GAQNUGISBQJMKO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 2
- 230000035558 fertility Effects 0.000 description 2
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 230000008775 paternal effect Effects 0.000 description 2
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- 206010000234 Abortion spontaneous Diseases 0.000 description 1
- 102100026031 Beta-glucuronidase Human genes 0.000 description 1
- 102000011022 Chorionic Gonadotropin Human genes 0.000 description 1
- 108010062540 Chorionic Gonadotropin Proteins 0.000 description 1
- 230000003682 DNA packaging effect Effects 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 201000009273 Endometriosis Diseases 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000006947 Histones Human genes 0.000 description 1
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000035002 Pregnancy of unknown location Diseases 0.000 description 1
- 108010090931 Proto-Oncogene Proteins c-bcl-2 Proteins 0.000 description 1
- 102000013535 Proto-Oncogene Proteins c-bcl-2 Human genes 0.000 description 1
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 210000002459 blastocyst Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 229940015047 chorionic gonadotropin Drugs 0.000 description 1
- 208000030373 chronic endometritis Diseases 0.000 description 1
- 238000005056 compaction Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003544 deproteinization Effects 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 210000004392 genitalia Anatomy 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N guanidinium thiocyanate Chemical compound SC#N.NC(N)=N ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 208000021267 infertility disease Diseases 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000012886 linear function Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 1
- 238000013178 mathematical model Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000002705 metabolomic analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001431 metabolomic effect Effects 0.000 description 1
- IZXGZAJMDLJLMF-UHFFFAOYSA-N methylaminomethanol Chemical compound CNCO IZXGZAJMDLJLMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 210000004508 polar body Anatomy 0.000 description 1
- 201000010065 polycystic ovary syndrome Diseases 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000002271 resection Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000021595 spermatogenesis Effects 0.000 description 1
- 208000000995 spontaneous abortion Diseases 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
1. Область техники1. The technical field
Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству и гинекологии, репродуктологии, и может быть использовано для оптимизации программы экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) при селективном переносе эмбрионов (ПЭ), основываясь на данных о молекулярно-генетических характеристиках гамет.The invention relates to medicine, namely to obstetrics and gynecology, reproductology, and can be used to optimize the in vitro fertilization (IVF) program for selective transfer of embryos (PE), based on data on the molecular genetic characteristics of gametes.
2. Уровень техники2. The level of technology
Внедрение в клиническую репродуктологию стратегии селективного переноса одного эмбриона (elective single embryo transfer, eSET) в сочетании с современными методами выбора эмбриона является одним из ведущих факторов успешного проведения лечения бесплодия методом ЭКО и ПЭ [2, 3, 5, 16, 20].The introduction of an elective single embryo transfer (eSET) strategy into clinical reproductology in combination with modern embryo selection methods is one of the leading factors in the successful treatment of infertility by IVF and PE [2, 3, 5, 16, 20].
Задачей настоящего изобретения является оценка транскриптомного профиля гамет с целью оптимизации выбора эмбриона для селективного переноса и прогнозирования наступления беременности в программе экстракорпорального оплодотворения.The objective of the present invention is to evaluate the transcriptome profile of gametes in order to optimize the choice of embryo for selective transfer and prediction of pregnancy in the in vitro fertilization program.
Эта задача решается путем дополнения морфологической оценки гамет и эмбрионов данными молекулярно-генетического исследования уровня экспрессии мРНК генов факторов роста (AREG, EREG, IGF1, IGFBP4), ингибитора апоптоза (BIRC5) в клетках фолликулярной жидкости, соотношения уровня экспрессии мРНК протаминов (PRM2:PRM1) в сперме, полученной в день трансвагинальной пункции яичников и использованной для оплодотворения, с применением метода полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ПЦР-ОТ), что позволяет неинвазивно и комплексно подходить к выбору эмбриона, имеющего максимальный шанс к имплантации в программе ЭКО и ПЭ, принимая во внимание исходный статус гамет и клинико-анамнестические данные супружеских пар с бесплодием.This problem is solved by supplementing the morphological assessment of gametes and embryos with data from a molecular genetic study of the level of growth factor gene mRNA expression (AREG, EREG, IGF1, IGFBP4), apoptosis inhibitor (BIRC5) in follicular fluid cells, and the ratio of the level of protamine mRNA expression (PRM2: PRM1 ) in semen obtained on the day of transvaginal ovarian puncture and used for fertilization using the reverse transcription polymerase chain reaction (PCR-RT), which allows a non-invasive and comprehensive approach to the choice an embryo that has the highest chance of implantation in the IVF and PE program, taking into account the initial status of gametes and the clinical and anamnestic data of couples with infertility.
Общепринятым способом определения качества гамет и эмбрионов в условиях in vitro является морфологическая оценка, которая, однако, не всегда позволяет объективно судить об их полноценности и прогнозе наступления беременности [1, 10, 11, 13]. С целью селективного переноса эмбрионов применяются следующие методы оценки качества эмбрионов: инвазивные (преимплантационная генетическая диагностика, скрининг); неинвазивные (системы непрерывного наблюдения за развитием эмбрионов (time-lapse embryo selection), протеомный и секретомный анализ сред культивирования эмбрионов [3, 4, 8, 12, 15, 21, 23].A generally accepted method for determining the quality of gametes and embryos in vitro is a morphological assessment, which, however, does not always allow an objective assessment of their usefulness and prognosis of pregnancy [1, 10, 11, 13]. In order to selectively transfer embryos, the following methods for assessing the quality of embryos are used: invasive (preimplantation genetic diagnosis, screening); non-invasive (systems of continuous monitoring of embryo development (time-lapse embryo selection), proteomic and secretion analysis of embryo culture media [3, 4, 8, 12, 15, 21, 23].
Комплексная оценка женских и мужских гамет с целью селективного переноса эмбрионов ранее не выполнялась.A comprehensive assessment of female and male gametes for the purpose of selective embryo transfer has not previously been performed.
Ранее оценка ооцита проводилась только по морфологическим характеристикам или применялся инвазивный метод косвенной оценки по генетической диагностике полярных телец [1, 10].Previously, the oocyte was evaluated only by morphological characteristics or the invasive method of indirect assessment was used for the genetic diagnosis of polar bodies [1, 10].
Принимая во внимание актуальность описанной проблемы, необходимость выявления объективных маркеров качества эмбриона и гамет, в литературе имеются предшествующие данному исследованию аналоги. Так, в патенте группы авторов N.M. Orsi, N. Gopichandran, S. Barber, V. Sharma, J. J. Walker Британского Университета и Образовательного Госпиталя (Leeds (University of Leeds, The Leeds Teaching Hospitals NHSTrust) «Маркеры полноценности ооцита» (Markers of oocyte viability, №PCT/GB2009/050339, 07.04.2009) задекларировано использование иммуноферментного анализа для определения концентрации панели 50 цитокинов, вовлеченных в созревание ооцита, в индивидуальных образцах фолликулярной жидкости в программе ЭКО. Учитывая трудоемкость, большой объем необходимых исследований, высокую стоимость расходных материалов, предложенный нами метод имеет ряд преимуществ по сравнению с описанным аналогом.Considering the relevance of the described problem, the need to identify objective quality markers of the embryo and gametes, in the literature there are analogues prior to this study. So, in the patent of the group of authors N.M. Orsi, N. Gopichandran, S. Barber, V. Sharma, JJ Walker of the British University and the Educational Hospital (Leeds (University of Leeds, The Leeds Teaching Hospitals NHSTrust) “Markers of oocyte viability” (PCT / GB2009 / 050339, 04/07/2009) the use of an enzyme-linked immunosorbent assay has been declared to determine the concentration of a panel of 50 cytokines involved in oocyte maturation in individual follicular fluid samples in an IVF program. uschestv compared with the described analog.
В аналоге изобретения группы авторов М.-А. Sirard, A.-L. Nivet, A. Bunel, R. Labrecque Канадского Университета Laval (Universite Laval) «Яичниковые маркеры зрелости фолликула и их использование» (Ovarian markers of follicular maturity and uses thereof, №PCT/CA2012/000697, 24.07.2012) использовалась оценка уровня транскрипции нескольких, отличных от предложенных нами, молекул, связанных с процессом фолликулогенеза на разных стадиях созревания в программе IVM (in vitro maturation).In an analogue of the invention of the group of authors M.-A. Sirard, A.-L. Nivet, A. Bunel, R. Labrecque of the University of Canada Laval (Universite Laval) “Ovarian markers of follicular maturity and their use” (Ovarian markers of follicular maturity and uses thereof, No. PCT / CA2012 / 000697, 24.07.2012) several molecules that are different from our proposed ones associated with the process of folliculogenesis at different stages of maturation in the IVM program (in vitro maturation).
В запатентованном исследовании группы авторов S. Hammamah, S. Assou Французского Университета NSERM (Institute National De La Sante et De La Recherche Madicale) «Методы выбора полноценных ооцитов и эмбрионов с высоким имплантационным потенциалом» (Methods for selecting competent oocytes and competent embryos with high potential for pregnancy outcome, №PCT/EP2011/070990, 24.11.2011), использовалась оценка уровня экспрессии микро-РНК в кумулюсных клетках ооцита и эмбриона.In a patented study by a team of authors S. Hammamah, S. Assou, French University of NSERM (Institute National De La Sante et De La Recherche Madicale), “Methods for selecting oocytes and competent embryos with high” potential for pregnancy outcome, No.PCT / EP2011 / 070990, 11.24.2011), an assessment was made of the level of expression of micro-RNA in cumulus oocyte and embryo cells.
В исследовании соавторов М. Conti, A.M. Zamah, J.Chen Калифорнийского Университета (The Regents of the University of California) «Неинвазивные методы для оценки качества ооцита в программе ЭКО» (Noninvasive methods for assessing oocyte quality for in vitro fertilization, №PCT/US2012/071417, 21.12.2012) производилась оценка уровня экспрессии продуктов трансляции в средах для культивирования ооцита на моделях мышей с использованием методов оценки микроокружения, иммуноферментного анализа, что отличается от предлагаемого нами способа используемым методом протеомного анализа.In a study by M. Conti, A.M. Zamah, J.Chen, University of California, The Regents of the University of California, Noninvasive methods for assessing oocyte quality for in vitro fertilization, No.PCT / US2012 / 071417, 12/21/2012 the expression level of translation products was evaluated in oocyte culturing media in mouse models using microenvironment assessment methods, enzyme-linked immunosorbent assay, which differs from our proposed method using the proteomic analysis method.
Во всех представленных аналогах не производился учет отцовского фактора (paternal contribution) [7, 14].In all the presented analogues, the paternal contribution was not taken into account [7, 14].
Диагностика качества сперматозоидов по критериям ВОЗ (2010 г.) или строгим критериям Крюгера, рекомендованным в 1999 г, не позволяет выявить ультраструктурные нарушения компактизации спермального хроматина, приводящие к нарушению оплодотворения или остановке развития эмбрионов на ранних этапах дробления или прерыванию беременности на ранних сроках [6, 17, 18, 19, 22].Diagnosis of sperm quality according to WHO criteria (2010) or the strict Krueger criteria recommended in 1999 does not reveal ultrastructural disorders of sperm chromatin compaction, leading to impaired fertilization or halt embryo development in the early stages of crushing or early termination of pregnancy [6 , 17, 18, 19, 22].
Поиск предикторов качества спермы активно ведется в течение последних десятилетий. В 2006 г. исследователями D.D.J. Krawets, A. Stephen, D. Miller из Университета США Wayne State запатентован метод «Генетического тестирования для определения мужского фактора бесплодия» (Genetic testing for male factor infertility, №11357423, 21.02. 2006), в котором путем анализа микроокружения исследуются спермальные гены, ответственные за мужское бесплодие.The search for predictors of sperm quality has been actively pursued over the past decades. In 2006, researchers D.D.J. Krawets, A. Stephen, D. Miller from US University of Wayne State patented the method of “Genetic testing for male factor infertility” (Genetic testing for male factor infertility, No. 11357423, 02.21.2006), in which sperm genes are studied by microenvironment analysis, responsible for male infertility.
В качестве наиболее близкого аналога части нашего изобретения может быть представлено исследование группы авторов K. Steger, A. Paradowska, В. Barmann из Германского Университета Justus-Liebig-Universitat Gieben «Метод и быстрый тест для определния фертильности спермы» (Method and rapid test for determining the fertility of sperm, №PCT/EP2011/057942, 17.05.2011), в котором путем оценки концентрации протаминов и их соотношения оценивается качество спермы, при этом отсутствуют указания на прогнозирование наступления беременности, качество эмбриона, используется трудоемкий, длительный, дорогостоящий метод по сравнению с предлагаемым нами способом.As the closest analogue to part of our invention, a study by a group of authors K. Steger, A. Paradowska, B. Barmann from the German University Justus-Liebig-Universitat Gieben “Method and rapid test for determining sperm fertility” (Method and rapid test for determining the fertility of sperm, No.PCT / EP2011 / 057942, 05/17/2011), in which by assessing the concentration of protamines and their ratio, the quality of sperm is estimated, while there is no indication of the prediction of pregnancy, the quality of the embryo, a laborious, lengthy, expensive method is usedin comparison with the method we offer.
3. Описание изобретения3. Description of the invention
Предложен способ прогнозирования наступления беременности в программе ЭКО и селективном переносе эмбрионов путем комплексной оценки транскриптомного профиля гамет с помощью ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ) путем оценки уровня представленности транскриптов ряда генов в клетках фолликулярной жидкости и спермы: в частности генов ростовых факторов (AREG, EREG, IGF1, IGFBP4), маркера апоптоза (BIRC5) в клетках фолликулярной жидкости, полученных в день трансвагинальной пункции яичников, а также соотношения уровня экспрессии мРНК протаминов (PRM2:PRM1) в сперме, использованной для оплодотворения.A method is proposed for predicting pregnancy in the IVF program and selective embryo transfer by means of a comprehensive assessment of gametrans transcriptome profile using real-time PCR (PCR-RV) by assessing the level of transcript representation of a number of genes in follicular fluid and sperm cells: in particular, growth factor genes ( AREG, EREG, IGF1, IGFBP4), apoptosis marker (BIRC5) in follicular fluid cells obtained on the day of transvaginal ovarian puncture, as well as the ratio of the level of expression of protamine mRNA (PRM2: PRM1) in semen used for fertilization.
Для оценки уровня представленности транскриптов (мРНК) исследуемых генов в мазках используются методы обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) с регистрацией накопления продуктов реакции в режиме «реального времени».To assess the level of representation of transcripts (mRNA) of the studied genes in smears, reverse transcription and polymerase chain reaction (RT-PCR) methods are used to record the accumulation of reaction products in real-time mode.
Изобретение получено на основании результатов лечения и статистического анализа 104 супружеских пар с трубно-перитонеальным и/или мужским фактором бесплодия, имеющих не более двух неэффективных циклов ЭКО и ПЭ в анамнезе, в которых возраст пациенток не превышал 35 лет, женщины имели нормальный овариальный резерв, фертильную и/или субфертильную сперму супруга.The invention was obtained on the basis of the results of treatment and statistical analysis of 104 married couples with tubal-peritoneal and / or male infertility factor, having no more than two ineffective IVF and PE cycles in the anamnesis, in which the patients age did not exceed 35 years, women had normal ovarian reserve, spouse fertile and / or subfertile sperm.
В зависимости от исхода программы ЭКО все пациентки были разделены на 2 группы. К I группе, составившей группу контроля, были отнесены пациенты с благополучным результатом лечения бесплодия - рождением здорового ребенка (n=24). Среди II группы неуспешного завершения ЭКО и ПЭ было выделено три подгруппы. У пациентов IIа группы в результате применения ВРТ наступила беременность, но закончилась самопроизвольным прерыванием беременности ранних сроков (до 11 недель) (n=13). Группу IIb составили пациенты с биохимической беременностью, не подтвержденной далее ультразвуковыми данными, при которой на 14 день после переноса эмбрионов уровень β-субъединицы хорионического гонадотропина (β-ХГ) составлял не менее 30 мМЕ/мл, т.н. «преэмбрионические потери» (n=24). В IIс группу вошли женщины с отрицательным результатом, у которых уровень β-ХГ был менее 20 мМЕ/мл (n=43).Depending on the outcome of the IVF program, all patients were divided into 2 groups. Patients with a successful outcome of infertility treatment — the birth of a healthy child (n = 24) were assigned to group I, which made up the control group. Among the II group of unsuccessful completion of IVF and PE, three subgroups were identified. In patients of group IIa, as a result of the use of ART, pregnancy occurred, but ended in spontaneous abortion of early pregnancy (up to 11 weeks) (n = 13). Group IIb consisted of patients with a biochemical pregnancy, not further confirmed by ultrasound data, in which, on
Представленные данные (фиг. 1) демонстрируют отличия между группами по уровню экспрессии мРНК генов изучаемых факторов в фолликулярной жидкости и сперме при различных исходах программы ЭКО и ПЭ.The presented data (Fig. 1) demonstrate differences between groups in terms of the level of mRNA expression of the genes of the studied factors in follicular fluid and semen at different outcomes of the IVF and PE program.
На основании экспериментальных данных при сравнении групп женщин с наступившей беременностью и неблагоприятным завершением программы ЭКО и ПЭ были получены и проанализированы результаты с применением методов многофакторного статистического анализа (дискриминантный анализ), выбрана линейная функция, позволяющая прогнозировать наступление беременности для каждой супружеской пары.Based on the experimental data, when comparing the groups of women with a pregnancy and the unfavorable completion of the IVF and PE program, the results were obtained and analyzed using multivariate statistical analysis methods (discriminant analysis), a linear function was selected that allows predicting the onset of pregnancy for each couple.
Уравнение канонической линейной дискриминантной функции имеет вид:The equation of the canonical linear discriminant function has the form:
где [IGF1], [IGFBP4], [EREG], [BIRC5], [AREG] - относительный уровень представленности мРНК соответствующих генов в клетках фолликулярной жидкости,where [IGF1], [IGFBP4], [EREG], [BIRC5], [AREG] is the relative level of mRNA representation of the corresponding genes in the cells of follicular fluid,
[PRM2:PRM1] - отношение уровней экспрессии мРНК соответствующих генов в сперме.[PRM2: PRM1] is the ratio of the mRNA expression levels of the corresponding genes in semen.
Относительный уровень экспрессии мРНК исследуемых генов вычисляется по формуле 2:The relative level of mRNA expression of the studied genes is calculated by the formula 2:
[I]=2^(NF-Cpi) (формула 2), где[I] = 2 ^ (NF-Cpi) (formula 2), where
где [1] - относительный уровень представленности мРНК исследуемого гена,where [1] is the relative level of mRNA representation of the studied gene,
Cpi - значение порогового цикла соответствующего исследуемого гена в образце, определяемого автоматически программным обеспечением прибора;Cpi is the value of the threshold cycle of the corresponding studied gene in the sample, determined automatically by the instrument software;
NF - фактор нормировки, который вычисляется по формуле 3:NF - normalization factor, which is calculated by the formula 3:
где Cp - значения пороговых циклов соответствующих референсных генов в образце, определяемых автоматически программным обеспечением прибора.where Cp are the threshold cycle values of the corresponding reference genes in the sample, which are automatically determined by the instrument software.
Отношение уровней экспрессии мРНК генов PRM2 и PRM1 в сперме вычисляется по формуле 4:The ratio of the levels of mRNA expression of the PRM2 and PRM1 genes in semen is calculated by the formula 4:
[PRM2:PRM1]=2^(Cp(prm1)-Cp(prm2) (формула 4), где[PRM2: PRM1] = 2 ^ (Cp (prm1) -Cp (prm2) (formula 4), where
где Cp - значения пороговых циклов соответствующего протамина в образце.where Cp are the threshold cycle values of the corresponding protamine in the sample.
Диагностическая возможность предложенной модели оценивалась с использованием ROC-анализа. Согласно фиг. 2, площадь под кривой (AUC) составила AUC=0,853±0,051 (95% ДИ 0,752-0,953, p<0,0001), что позволило характеризовать данную модель согласно экспертной оценке как очень хорошую. В качестве порога отсечения (точка cut off) выбрано значение функции, соответствующее максимальной сумме чувствительности и специфичности. В результате апостериорной классификации 80,6% (КЛДФ) исходных сгруппированных наблюдений классифицировано правильно. Получены значения точки cut off для КЛДФ1 - 0,22 для разделения супружеских пар с положительным и отрицательным исходом ЭКО и ПЭ.The diagnostic ability of the proposed model was evaluated using ROC analysis. According to FIG. 2, the area under the curve (AUC) was AUC = 0.853 ± 0.051 (95% CI 0.752-0.953, p <0.0001), which allowed us to characterize this model according to expert assessment as very good. As a cutoff threshold (cut off point), a function value corresponding to the maximum sum of sensitivity and specificity is selected. As a result of the posterior classification, 80.6% (KLDF) of the initial grouped observations were classified correctly. The values of the cut off point for KLDF1 - 0.22 were obtained for the separation of married couples with a positive and negative outcome of IVF and PE.
Превышение значения канонической линейной дискриминантной функции относительно точки cut off классифицировалось как наступление беременности в результате ЭКО и ПЭ. Чувствительность предложенной модели в области порогового значения составила 83,3%, специфичность 81,4%, положительная прогностическая ценность 80,0%, отрицательная прогностическая ценность 87,5%.The excess of the value of the canonical linear discriminant function relative to the cut off point was classified as pregnancy due to IVF and PE. The sensitivity of the proposed model in the region of the threshold value was 83.3%, specificity 81.4%, positive predictive value 80.0%, negative predictive value 87.5%.
Ограничение методаMethod limitation
Из исследования были исключены женщины с противопоказаниями для проведения программы ЭКО и вынашивания беременности, наличием распространенных форм наружного генитального эндометриоза, синдрома поликистозных яичников, резекции яичников в анамнезе, хронического эндометрита, пациенты с выраженными изменениями спермограммы.Women with contraindications for conducting an IVF program and bearing a pregnancy, the presence of common forms of external genital endometriosis, polycystic ovary syndrome, history of ovarian resection, chronic endometritis, patients with severe changes in the spermogram were excluded from the study.
4. Реализация изобретения4. The implementation of the invention
В программе ЭКО у супружеских пар, сопоставимых между собой по клинико-анамнестическим, лабораторным параметрам после стимуляции суперовуляции в день трансвагинальной пункции яичников проводили аспирацию фолликулярной жидкости (n=104) индивидуально с промывкой иглы после каждого фолликула, в маркированные пробирки без гепарина. После идентификации и извлечения ооцит-кумулюсных комплексов образцов фолликулярной жидкости проводили выделение клеток путем центрифугирования при 6000 об/мин в течение 10 минут с последующим применением промывочных буферных растворов, что позволило снизить контаминацию клетками крови образцов фолликулярной жидкости. Далее в асептических условиях производилось ресуспендирование полученных клеток в 300 мкл 3 мМ раствора гуанидинтиацианата для сохранения рибонуклеиновой кислоты (РНК), выполнялось выделение РНК методом фенольной депротеинизации с последующим осаждением РНК изопропанолом и отмывками промывочными растворами. Объем образцов после выделения составлял 50 мкл. Реакцию обратной транскрипции (ОТ) ставили в объеме 40 мкл (для реакции брали 33 мкл образца РНК) в течение 30 минут при температуре 40°C с последующей инактивацией обратной транскриптазы при 95°C в течение 5 минут. Для увеличения объемов образцов после ОТ и с целью предотвращения деградации ДНК копии ДНК разводили в 5 раз в ТЕ-буфере (Tris (гидрокиметиламинометан) и Этилендиаминтетрауксусная кислота). Праймеры и зонды для полимеразной цепной реакции (ПЦР) были подобраны с учетом структуры генов таким образом, чтобы исключить отжиг на матрице геномной ДНК исследуемых и референсных генов. Реакции амплификации целевых и референсных генов ставили в разных пробирках в двух повторах. В качестве референсных генов использовались: ген гипоксантилфосфорибозилтрансферазы-1 (HPRT1), ген ТАТА-бокс-связывающего протеина (ТВР), ген глюкуронидазы бета (GUSB) и ген β-2 микроглобулина (В2М). Для повышения чувствительности и специфичности ПЦР был применен «горячий старт» с применением парафина. Амплификацию осуществляли в режиме «реального времени» в объеме 35 мкл по следующей программе: 1 цикл - 80°C 30 сек, 94°C 1 мин; 50 циклов - 94°C 10 сек, 64°C 20 сек, использовали прибор «ДТ-964» производства ООО «НПО ДНК-Технология». Измерение уровня флуоресценции проводили на каждом цикле при температуре 64°C. Уровень экспрессии мРНК измеряли в относительных единицах, определяемых методом сравнения индикаторных циклов (ΔΔCq) с нормировкой на экспрессию референсных генов и значение медианы (Me) в группе успешного исхода программы ВРТ. Аналогично описанной методике при помощи ОТ-ПЦР проводилось изучение уровня экспрессии мРНК генов протаминов {PRM-1, PRM-2) в 79 образцах спермы, полученных в день ТВП и использованных для оплодотворения.In the IVF program, couples comparable in clinical, medical, and laboratory parameters after stimulation of superovulation on the day of transvaginal ovarian puncture performed aspiration of follicular fluid (n = 104) individually with washing the needle after each follicle into labeled tubes without heparin. After identification and extraction of the oocyte-cumulus complexes of follicular fluid samples, the cells were isolated by centrifugation at 6000 rpm for 10 minutes, followed by the use of washing buffer solutions, which reduced the contamination of blood follicular fluid samples. Then, under aseptic conditions, the obtained cells were resuspended in 300 μl of a 3 mM guanidine thiocyanate solution to preserve ribonucleic acid (RNA), RNA was isolated by phenol deproteinization, followed by precipitation of RNA with isopropanol and washing with washing solutions. The volume of samples after isolation was 50 μl. The reverse transcription reaction (RT) was set in a volume of 40 μl (33 μl of an RNA sample was taken for the reaction) for 30 minutes at 40 ° C, followed by inactivation of reverse transcriptase at 95 ° C for 5 minutes. To increase the volumes of samples after RT and to prevent DNA degradation, DNA copies were diluted 5-fold in TE buffer (Tris (hydroxymethylaminomethane) and Ethylenediaminetetraacetic acid). Primers and probes for polymerase chain reaction (PCR) were selected taking into account the structure of genes in such a way as to exclude annealing of the studied and reference genes on the genomic DNA matrix. Amplification reactions of target and reference genes were performed in different tubes in duplicate. The following reference genes were used: the hypoxanthylphosphoribosyltransferase-1 (HPRT1) gene, the TATA-box-binding protein (TBP) gene, the glucuronidase beta gene (GUSB) and the microglobulin β-2 gene (B2M). To increase the sensitivity and specificity of PCR, a “hot start” with paraffin was used. Amplification was carried out in real-time mode in a volume of 35 μl according to the following program: 1 cycle - 80 ° C for 30 sec, 94 ° C for 1 min; 50 cycles - 94 ° C for 10 sec, 64 ° C for 20 sec, used the DT-964 device manufactured by NPO DNA-Technology LLC. The fluorescence level was measured on each cycle at a temperature of 64 ° C. The level of mRNA expression was measured in relative units, determined by comparing indicator cycles (ΔΔCq) with normalization to the expression of reference genes and the median value (Me) in the successful outcome of the ART program. Similarly to the described technique, RT-PCR was used to study the level of protamine gene mRNA expression (PRM-1, PRM-2) in 79 sperm samples obtained on the day of TBP and used for fertilization.
Проводилась программа ЭКО и ПЭ со стимуляцией суперовуляции по стандартным протоколам. Оплодотворение проводилось методами стандартного ЭКО или с помощью ИКСИ (при наличии субфертильных отклонений спермограммы в день ТВП от нормы по критериям ВОЗ, 2010 г.) в равной доле (p=0,833) [22]. Культивирование эмбрионов осуществлялось в индивидуальных лунках четырехлуночного планшета в соответствии с номером образца фолликулярной жидкости. Выбор эмбриона осуществлялся на основании морфологической оценки. Большинство полученных эмбрионов имело хорошую морфологическую оценку (по D.K. Gardner, W.B. Schoolcraft, 1999), что позволило в половине случаев произвести селективный перенос одного или двух эмбрионов на стадии бластоцисты [9].An IVF and PE program was conducted with stimulation of superovulation according to standard protocols. Fertilization was carried out using standard IVF methods or using ICSI (in the presence of subfertile abnormalities of the spermogram on TVP day from normal according to WHO criteria, 2010) in equal proportion (p = 0.833) [22]. Embryos were cultured in individual wells of a four-well plate in accordance with the sample number of the follicular fluid. The choice of the embryo was carried out on the basis of morphological evaluation. Most of the obtained embryos had a good morphological assessment (according to D.K. Gardner, W.B. Schoolcraft, 1999), which made it possible in half the cases to selectively transfer one or two embryos at the blastocyst stage [9].
Пример использования изобретенияAn example of using the invention
Производилась оценка транскриптомного профиля мужских и женских гамет, сформировавших в результате проведения оплодотворения in vitro 21 эмбрион. Выполнялась общепринятая морфологическая оценка полученных эмбрионов. Перенос эмбрионов производился на основании комплексной морфологической и предлагаемой нами молекулярно-генетической оценки гамет. Оценена эффективность программы ЭКО (фиг. 3).The transcriptome profile of male and female gametes was evaluated, which formed 21 embryos as a result of in vitro fertilization. A generally accepted morphological evaluation of the resulting embryos was performed. Embryo transfer was carried out on the basis of a comprehensive morphological and our proposed molecular genetic assessment of gametes. The effectiveness of the IVF program was evaluated (Fig. 3).
Разработанная нами математическая модель позволяет с диагностической эффективностью выше 80,0% классифицировать супружеские пары по исходам ЭКО и ПЭ в зависимости от совокупных данных по молекулярно-генетическому профилю фолликулярной жидкости и спермы в день трансвагинальной пункции яичников (ТВП) и может быть использована в качестве дополнительного критерия объективной оценки качества гамет, что особенно важно при проведении селективного переноса одного эмбриона.Our mathematical model allows us to classify couples with IVF and PE outcomes with diagnostic efficacy above 80.0% depending on the combined data on the molecular genetic profile of follicular fluid and sperm on the day of transvaginal ovarian puncture (TVP) and can be used as an additional criterion of objective assessment of gamete quality, which is especially important when conducting selective transfer of one embryo.
В данной работе была продемонстрирована важность комбинации не только морфологической и молекулярно-генетической оценки качества гамет и эмбрионов, но и сочетанного анализа «материнского» и «отцовского вклада» в развитие эмбриона. Нами произведена попытка объяснения дифференцировки качества ооцитов и сперматозоидов, реализующихся в изменении потенциала развития эмбрионов, с позиции функционирования системы ростовых факторов в ооцит-кумулюсном комплексе (для ооцита) и структурной целостности спермального хроматина за счет протаминов на основании оценки профиля мРНК генов, вовлеченных в эти механизмы.In this work, the importance of combining not only the morphological and molecular genetic assessment of the quality of gametes and embryos, but also the combined analysis of the “maternal” and “paternal contributions” to the development of the embryo was demonstrated. We made an attempt to explain the differentiation of the quality of oocytes and spermatozoa, which are realized in changing the development potential of embryos, from the standpoint of the functioning of the system of growth factors in the oocyte-cumulus complex (for an oocyte) and the structural integrity of sperm chromatin due to protamines based on an assessment of the mRNA profile of the genes involved in these mechanisms.
Список литературыBibliography
1. Назаренко Т.А. Стимуляция функции яичников. - М.: Медпресс - информ, 2008. - 272 с.1. Nazarenko T.A. Stimulation of ovarian function. - M .: Medpress - inform, 2008 .-- 272 p.
2. Тишкевич О.Л. Эффективность ЭКО и частота многоплодной беременности в зависимости от числа и качества переносимых эмбрионов у женщин разного возраста. // Проблемы репродукции. - 2008. - Т. 2, N. 2. - С. 8-12.2. Tishkevich O.L. The effectiveness of IVF and the frequency of multiple pregnancies depending on the number and quality of transferred embryos in women of different ages. // Problems of reproduction. - 2008. - T. 2, N. 2. - S. 8-12.
3. Ярилин А.А. Система цитокинов и принципы ее функционирования в норме и при патологии // Иммунология. - 1997. - N 5. - с. 7-14.3. Yarilin A.A. The system of cytokines and the principles of its functioning in normal and pathological conditions // Immunology. - 1997. -
4. Assou S. А non - invasive test for assessing embryo by gene expression profiles of human cells: a proof of concept study. // Molecular Hum. Reprod. 2008. - Vol. 14, N. 12. - P. 711-719.4. Assou S. And non - invasive test for assessing embryo by gene expression profiles of human cells: a proof of concept study. // Molecular Hum. Reprod. 2008. - Vol. 14, N. 12. - P. 711-719.
5. Assisted reproductive technology in Europe, 2006: results generated fron European registers by ESHRE / J. de Mouzon [et al.] // Hum. Reprod. - 2010. - Vol. 25 - P. 1851-1862.5. Assisted reproductive technology in Europe, 2006: results generated fron European registers by ESHRE / J. de Mouzon [et al.] // Hum. Reprod. - 2010 .-- Vol. 25 - P. 1851-1862.
6. Dadoune J. - P. Spermatozoal RNAs: What About Their Functions? // Microscopy research and technique. - 2009. - Vol.72. - P. 536 -551.6. Dadoune J. - P. Spermatozoal RNAs: What About Their Functions? // Microscopy research and technique. - 2009. - Vol. 72. - P. 536 -551.
7. Douglas Т. C, Hammoud S. S. The human sperm epigenome and its potential role in embryonic development // Molecular Hum. Reprod. - 2010. - Vol. 16, N. 1. - P. 37-47.7. Douglas T. C, Hammoud S. S. The human sperm epigenome and its potential role in embryonic development // Molecular Hum. Reprod. - 2010 .-- Vol. 16, N. 1. - P. 37-47.
8. Follicular fluid content and oocyte quality: from single biochemical markers to metabolomics / A. Revelli [et al.] // Reproductive Biology and Endocrinology. - 2009. - Vol. 7, N. 40. - P. 1-13.8. Follicular fluid content and oocyte quality: from single biochemical markers to metabolomics / A. Revelli [et al.] // Reproductive Biology and Endocrinology. - 2009. - Vol. 7, N. 40. - P. 1-13.
9. Gardner D.K., Schoolcraft W.B. In vitro culture of human blastocysts. - Jansen R., Mortimer D. (eds.) Towards Reproductive Certainty: Infertility and Genetics Beyond. - Carnforth: Parthenon Press, 1999. - P. 378-388.9. Gardner D.K., Schoolcraft W.B. In vitro culture of human blastocysts. - Jansen R., Mortimer D. (eds.) Towards Reproductive Certainty: Infertility and Genetics Beyond. - Carnforth: Parthenon Press, 1999 .-- P. 378-388.
10. Single embryo transfer / J.M.R. Gerris [et al.]. - Cambridge University Press, 2009. - 305p.10. Single embryo transfer / J.M.R. Gerris [et al.]. - Cambridge University Press, 2009 .-- 305p.
11. Huang Z., Wells D. The human oocyte and cumulus cells relationship: new insights from the cumulus cell transcriptome // Molecular Hum. Reprod. - 2010. -Vol. 16, N. 10. - P. 715-725.11. Huang Z., Wells D. The human oocyte and cumulus cells relationship: new insights from the cumulus cell transcriptome // Molecular Hum. Reprod. - 2010. -Vol. 16, N. 10. - P. 715-725.
12. Human cumulus cells as biomarkers for embryo and pregnancy outcomes / S. Assou [et al.] // Molecular Hum. Reprod. - 2010. - Vol. 16, N. 8. - P. 531-538.12. Human cumulus cells as biomarkers for embryo and pregnancy outcomes / S. Assou [et al.] // Molecular Hum. Reprod. - 2010 .-- Vol. 16, N. 8. - P. 531-538.
13. Kempisty В., Jedrzejczak P., Jagodzinski P.P. Structure and role of protamines 1 and 2 in spermatogenesis and male infertility // Ginekol Pol. - 2006. - Vol. 77. - P. 238-24513. Kempisty B., Jedrzejczak P., Jagodzinski P.P. Structure and role of
14. Krawetz S.A. Paternal contribution: new insights and future challenges // Nature Reviews: Genetics. - 2005. - Vol. 6. - P. 633-642.14. Krawetz S.A. Paternal contribution: new insights and future challenges // Nature Reviews: Genetics. - 2005. - Vol. 6. - P. 633-642.
15. Lindeberg M. Molecular and morphological studies of folliculogenesis, oocyte maturation and embryogenesis in humans: thesis for doctoral degree (PhD). - KarolinskaInstitutet. - 2008. - P. 69.15. Lindeberg M. Molecular and morphological studies of folliculogenesis, oocyte maturation and embryogenesis in humans: thesis for doctoral degree (PhD). - KarolinskaInstitutet. - 2008 .-- P. 69.
16.Maheshwari A., Griffiths S., Bhattacharya S. Global variations in the uptake of single embryo transfer // Hum. Reprod. Update. - 2011. - Vol. 17, N. 1. - P. 107-120.16. Maheshwari A., Griffiths S., Bhattacharya S. Global variations in the uptake of single embryo transfer // Hum. Reprod. Update - 2011 .-- Vol. 17, N. 1. - P. 107-120.
17. Miller D., Brinkworth M., lies D. Paternal DNA packaging in spermatozoa: more than the sum of its parts? // DNA, histones, protamines and epigenetics Reproduction. - 2010. - Vol. 139. -P. 287-301.17. Miller D., Brinkworth M., lies D. Paternal DNA packaging in spermatozoa: more than the sum of its parts? // DNA, histones, protamines and epigenetics Reproduction. - 2010 .-- Vol. 139. -P. 287-301.
18. O′Flynn K.L., O′Brien B.A., Varghese A.C., and Agarwal A. The genetic causes of male factor infertility: A review // Fertil. Steril. - 2010. - Vol. 93, N. 1. - P. 1-12.18. O′Flynn K.L., O′Brien B.A., Varghese A.C., and Agarwal A. The genetic causes of male factor infertility: A review // Fertil. Steril. - 2010 .-- Vol. 93, N. 1. - P. 1-12.
19. Carreau S. RNA dynamics of fertile and infertile spermatozoa. // Molecular Reproduction & Development. - 2010. - Vol. 77. - P.158-166.19. Carreau S. RNA dynamics of fertile and infertile spermatozoa. // Molecular Reproduction & Development. - 2010 .-- Vol. 77. - P.158-166.
20. Scott L. The biological basis of non - invasive strategies for selection of human oocytes and embryos / [et al.] // Hum. Reprod Update. - 2003. - Vol.9? N. 3. - P. 237-249.20. Scott L. The biological basis of non - invasive strategies for selection of human oocytes and embryos / [et al.] // Hum. Reprod Update. - 2003. - Vol. 9? N. 3. - P. 237-249.
21. The differential transcriptome and ontology profiles of floating and cumulus granulosa cells in stimulated human antral follicles / S. Koks [et al.] // Molecular Hum. Reprod. - 2010. - Vol. 16, N. 4. - P. 229-240.21. The differential transcriptome and ontology profiles of floating and cumulus granulosa cells in stimulated human antral follicles / S. Koks [et al.] // Molecular Hum. Reprod. - 2010 .-- Vol. 16, N. 4. - P. 229-240.
22. World Health Organization reference values for human semen characteristics / T.G. Cooper [et al.] // Hum. Reprod. Update. - 2010. - Vol. 14, N. 5. - P. 431-446.22. World Health Organization reference values for human semen characteristics / T.G. Cooper [et al.] // Hum. Reprod. Update - 2010 .-- Vol. 14, N. 5. - P. 431-446.
23. Youle R.J., Strasser A. The BCL-2 protein family: opposing activities that mediate cell death // Nat Rev Mol Cell Biol. - 2008. - Vol. 9, N. 1. - P.47-59.23. Youle R.J., Strasser A. The BCL-2 protein family: opposing activities that mediate cell death // Nat Rev Mol Cell Biol. - 2008. - Vol. 9, N. 1. - P. 47-59.
Claims (1)
если значение КЛДФ>0,22, делают заключение о благоприятном прогнозе наступления беременности. A method for predicting pregnancy in the program of in vitro fertilization during selective embryo transfer by evaluating the molecular genetic profile of gametes using PCR-RV, characterized in that, based on the PCR amplification of the studied and reference genes obtained on the day of transvaginal ovarian puncture (TVP) method reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), the level of mRNA expression of growth factor genes (AREG, EREG, IGF1, IGFBP-4), an apoptosis inhibitor (BIRC5) in follicular fluid cells spine, the level of mRNA expression ratio protamines (PRM2: PRM1) in semen obtained threshold cycle values (Cp) of accumulation of reaction products was calculated value linear canonical discriminant functions (KLDF) by the formula
if the value of KLDF> 0.22, make a conclusion about a favorable prognosis of pregnancy.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2014125185/15A RU2550965C1 (en) | 2014-06-23 | 2014-06-23 | Method for prediction of pregnancy rate through in vitro fertilisation with selective embryo transfer by real-time pcr evaluation of molecular genetic gamete profile |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2014125185/15A RU2550965C1 (en) | 2014-06-23 | 2014-06-23 | Method for prediction of pregnancy rate through in vitro fertilisation with selective embryo transfer by real-time pcr evaluation of molecular genetic gamete profile |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2550965C1 true RU2550965C1 (en) | 2015-05-20 |
Family
ID=53294217
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2014125185/15A RU2550965C1 (en) | 2014-06-23 | 2014-06-23 | Method for prediction of pregnancy rate through in vitro fertilisation with selective embryo transfer by real-time pcr evaluation of molecular genetic gamete profile |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2550965C1 (en) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2614725C1 (en) * | 2016-02-10 | 2017-03-28 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Method for clinical pregnancy probability prediction for women with a body mass index of 18,5 to 28,49 in vitro fertilization programme based on assessment of leptin level in blood plasma and mitochondria transmembrane potential in peripheral blood mononuclear cells |
| RU2618421C1 (en) * | 2016-12-02 | 2017-05-03 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Method for gamete quality prediction in women infertility treatment for auxiliary reproductive technologies programs, based on patient's genotype |
| RU2670450C1 (en) * | 2017-12-25 | 2018-10-23 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБОУ ВО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России) | Method for predicting success of implantation in the standard long protocol of stimulation of superovulation |
| RU2773798C1 (en) * | 2021-10-12 | 2022-06-09 | Анна Александровна Кончакова | Method for predicting the degree of risk of negative results of in vitro fertilization |
| CN114761581A (en) * | 2019-10-04 | 2022-07-15 | 维特尔有限责任公司 | Compositions, methods and kits for selecting donors and recipients for in vitro fertilization |
| CN116561627A (en) * | 2023-05-11 | 2023-08-08 | 中南大学 | Method, apparatus, processor and storage medium for determining embryo transfer type |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2345715C2 (en) * | 2006-11-02 | 2009-02-10 | Федеральное государственное учреждение "Уральский научно-исследовательский институт охраны материнства и младенчества Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию" | Method of predicting results of extracorporal fertilisation (ecf) in patients with autoimmune diseases |
| RU2430379C1 (en) * | 2010-01-27 | 2011-09-27 | Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию" (ГОУ ВПО РГМУ Росздрава) | Method of predicting pregnancy in programme of extracorporal fertilisation and transfer of embryos in standard long protocol of superovulation stimulation |
| EP2388588A1 (en) * | 2010-05-18 | 2011-11-23 | Justus-Liebig-Universität Gießen | Method and quick test for determining the fertility of sperms |
| RU2476142C1 (en) * | 2011-07-12 | 2013-02-27 | Федеральное государственное учреждение "Уральский научно-исследовательский институт охраны материнства и младенчества" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (ФГУ "НИИ ОММ" Минздравсоцразвития России) | Method of predicting result of extracorporal fertilisation and embryo transfer (ecf and et) |
-
2014
- 2014-06-23 RU RU2014125185/15A patent/RU2550965C1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2345715C2 (en) * | 2006-11-02 | 2009-02-10 | Федеральное государственное учреждение "Уральский научно-исследовательский институт охраны материнства и младенчества Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию" | Method of predicting results of extracorporal fertilisation (ecf) in patients with autoimmune diseases |
| RU2430379C1 (en) * | 2010-01-27 | 2011-09-27 | Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию" (ГОУ ВПО РГМУ Росздрава) | Method of predicting pregnancy in programme of extracorporal fertilisation and transfer of embryos in standard long protocol of superovulation stimulation |
| EP2388588A1 (en) * | 2010-05-18 | 2011-11-23 | Justus-Liebig-Universität Gießen | Method and quick test for determining the fertility of sperms |
| RU2476142C1 (en) * | 2011-07-12 | 2013-02-27 | Федеральное государственное учреждение "Уральский научно-исследовательский институт охраны материнства и младенчества" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (ФГУ "НИИ ОММ" Минздравсоцразвития России) | Method of predicting result of extracorporal fertilisation and embryo transfer (ecf and et) |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2614725C1 (en) * | 2016-02-10 | 2017-03-28 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Method for clinical pregnancy probability prediction for women with a body mass index of 18,5 to 28,49 in vitro fertilization programme based on assessment of leptin level in blood plasma and mitochondria transmembrane potential in peripheral blood mononuclear cells |
| RU2618421C1 (en) * | 2016-12-02 | 2017-05-03 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Method for gamete quality prediction in women infertility treatment for auxiliary reproductive technologies programs, based on patient's genotype |
| RU2670450C1 (en) * | 2017-12-25 | 2018-10-23 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБОУ ВО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России) | Method for predicting success of implantation in the standard long protocol of stimulation of superovulation |
| CN114761581A (en) * | 2019-10-04 | 2022-07-15 | 维特尔有限责任公司 | Compositions, methods and kits for selecting donors and recipients for in vitro fertilization |
| RU2773798C1 (en) * | 2021-10-12 | 2022-06-09 | Анна Александровна Кончакова | Method for predicting the degree of risk of negative results of in vitro fertilization |
| RU2776977C1 (en) * | 2022-02-22 | 2022-07-29 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Пермский государственный медицинский университет имени академика Е.А. Вагнера" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Method for predicting outcomes of in vitro fertilization |
| CN116561627A (en) * | 2023-05-11 | 2023-08-08 | 中南大学 | Method, apparatus, processor and storage medium for determining embryo transfer type |
| CN116561627B (en) * | 2023-05-11 | 2024-04-16 | 中南大学 | Method, device, processor and storage medium for determining embryo transfer type |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ESHRE Add-Ons Working Group et al. | Good practice recommendations on add-ons in reproductive medicine | |
| Greco et al. | Preimplantation genetic testing: where we are today | |
| Yeung et al. | A prospective study of non-invasive preimplantation genetic testing for aneuploidies (NiPGT-A) using next-generation sequencing (NGS) on spent culture media (SCM) | |
| Mazzilli et al. | Effect of the male factor on the clinical outcome of intracytoplasmic sperm injection combined with preimplantation aneuploidy testing: observational longitudinal cohort study of 1,219 consecutive cycles | |
| Shamonki et al. | Proof of concept: preimplantation genetic screening without embryo biopsy through analysis of cell-free DNA in spent embryo culture media | |
| Yang et al. | Selection of competent blastocysts for transfer by combining time-lapse monitoring and array CGH testing for patients undergoing preimplantation genetic screening: a prospective study with sibling oocytes | |
| Founds et al. | Altered global gene expression in first trimester placentas of women destined to develop preeclampsia | |
| US8754014B2 (en) | Methods for selecting oocytes and competent embryos with high potential for pregnancy outcome | |
| Tiegs et al. | Discrepant diagnosis rate of array comparative genomic hybridization in thawed euploid blastocysts | |
| RU2550965C1 (en) | Method for prediction of pregnancy rate through in vitro fertilisation with selective embryo transfer by real-time pcr evaluation of molecular genetic gamete profile | |
| US20110244464A1 (en) | Identification of genes or polypeptides the expression of which correlates to fertility, ovarian function and/or fetal/newborn viability | |
| US9090938B2 (en) | Methods for selecting competent oocytes and competent embryos with high potential for pregnancy outcome | |
| Gat et al. | Sperm DNA fragmentation index does not correlate with blastocyst euploidy rate in egg donor cycles | |
| Keskin et al. | Does microfluidic sperm sorting affect embryo euploidy rates in couples with high sperm DNA fragmentation? | |
| Lopes et al. | Discordance between human sperm quality and telomere length following differential gradient separation/swim-up | |
| Natali et al. | An assessment of new sperm tests for male infertility | |
| Van Vaerenbergh et al. | Improved clinical outcomes after non-invasive oocyte selection and Day 3 eSET in ICSI patients | |
| Kordus et al. | Cumulus cell pappalysin-1, luteinizing hormone/choriogonadotropin receptor, amphiregulin and hydroxy-delta-5-steroid dehydrogenase, 3 beta-and steroid delta-isomerase 1 mRNA levels associate with oocyte developmental competence and embryo outcomes | |
| Allegra et al. | Endometrial expression of selected genes in patients achieving pregnancy spontaneously or after ICSI and patients failing at least two ICSI cycles | |
| Morin et al. | A greater number of euploid blastocysts in a given cohort predicts excellent outcomes in single embryo transfer cycles | |
| Ocampo et al. | Assessment of Prostaglandin-Endoperoxide Synthase 2 and Versican gene expression profile from the cumulus cells: association with better in vitro fertilization outcomes | |
| Elkhatib et al. | The influence of male age and sperm parameters on blastulation and euploidy rates | |
| Ebner et al. | Viability of cumulus cells is associated with basal AMH levels in assisted reproduction | |
| Mortimer et al. | Preimplantation genetic testing for aneuploidy: has the controversy settled? A Review | |
| Mbaye et al. | Determination of free DNA (cfDNA) by RT-qPCR in individuals in sperm alterations |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20160624 |