RU2468371C2 - Method of detecting antibodies to mycobacterium leprae on solid carrier - Google Patents
Method of detecting antibodies to mycobacterium leprae on solid carrier Download PDFInfo
- Publication number
- RU2468371C2 RU2468371C2 RU2010147747/15A RU2010147747A RU2468371C2 RU 2468371 C2 RU2468371 C2 RU 2468371C2 RU 2010147747/15 A RU2010147747/15 A RU 2010147747/15A RU 2010147747 A RU2010147747 A RU 2010147747A RU 2468371 C2 RU2468371 C2 RU 2468371C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- leprae
- antibodies
- reaction
- solid carrier
- elisa
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 34
- 241000186362 Mycobacterium leprae Species 0.000 title claims abstract description 14
- 239000007787 solid Substances 0.000 title claims abstract description 13
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 claims abstract description 15
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 14
- 229920002313 fluoropolymer Polymers 0.000 claims abstract description 13
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims abstract description 13
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 7
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims abstract description 4
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 abstract description 28
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 abstract description 27
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 abstract description 27
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 5
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 abstract description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 238000004040 coloring Methods 0.000 abstract 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract 1
- 230000036647 reaction Effects 0.000 abstract 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 abstract 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 7
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 7
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 5
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 5
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 206010024229 Leprosy Diseases 0.000 description 3
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 3
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 3
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 3
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 3
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 3
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 3
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 239000011545 carbonate/bicarbonate buffer Substances 0.000 description 2
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 2
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GHCZTIFQWKKGSB-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid;phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O.OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O GHCZTIFQWKKGSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010059193 Acute hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 239000010755 BS 2869 Class G Substances 0.000 description 1
- 235000021538 Chard Nutrition 0.000 description 1
- YCKRFDGAMUMZLT-UHFFFAOYSA-N Fluorine atom Chemical compound [F] YCKRFDGAMUMZLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 206010024227 Lepromatous leprosy Diseases 0.000 description 1
- 240000006240 Linum usitatissimum Species 0.000 description 1
- 235000004431 Linum usitatissimum Nutrition 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 208000037628 acute hepatitis B virus infection Diseases 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000002845 discoloration Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 230000020764 fibrinolysis Effects 0.000 description 1
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011737 fluorine Substances 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 229920006158 high molecular weight polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000036732 histological change Effects 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000004435 hydrogen atom Chemical class [H]* 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- -1 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920000915 polyvinyl chloride Polymers 0.000 description 1
- 239000004800 polyvinyl chloride Substances 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области медицины, а именно к иммунологии, в частности, может быть использовано для выявления антител или антигенов в иммуноферментном анализе (ИФА) в биологических субстратах организма.The invention relates to medicine, in particular to immunology, in particular, can be used to detect antibodies or antigens in an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) in biological substrates of the body.
Из практики медицины известен способ выявления антитела или антигена в радиоиммунном анализе, состоящий в том, что при их выявлении используют поверхности полистироловых пробирок, шариков в качестве носителей иммунологически активных компонентов реакции, в том числе и радиоактивной метки (Манолов А.Д. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии, №4, 1985, с.100-107; Чард Т. Радиоиммунологические методы. - М.: 1981).From the practice of medicine, there is a known method for detecting antibodies or antigens in radioimmunoassay, which consists in using polystyrene tubes and beads as carriers of immunologically active components of the reaction, including a radioactive label (Manolov A.D. Journal of Microbiology, epidemiology and immunobiology, No. 4, 1985, p. 100-107; Chard T. Radio immunological methods. - M: 1981).
Однако известный способ имеет следующие недостатки: сложность осуществления, так как требует наличия дорогостоящего оборудования, специальной утилизации отходов реакции, защиты персонала и окружающей среды. Кроме этого, радиоактивная метка нестабильна, что обуславливает короткий срок хранения конъюгата. Известный способ не дает возможность получить конкретный технический результат - упрощение способа.However, the known method has the following disadvantages: the complexity of the implementation, as it requires expensive equipment, special disposal of reaction waste, protection of personnel and the environment. In addition, the radioactive label is unstable, which leads to a short shelf life of the conjugate. The known method does not allow to obtain a specific technical result - a simplification of the method.
Из практики медицины известен также способ выявления антитела или антигена на твердом носителе в реакции латекс-агглютинации, состоящий в том, что при их выявлении используют поверхность латексных частиц в качестве носителя компонентов реакции (Фримель Г. Иммунологические методы. - М.: Медицина, 1987. - 472 С.). Однако известный способ имеет следующие недостатки: сложность визуальной оценки результатов реакции при низком содержании антитела или антигена в исследуемом материале. Только у 30% больных положительных на наличие HBs-антигена в сыворотке крови больных выявляются гистологические изменения, ревматоидный фактор и продукты фибринолиза могут обуславливать возникновение ложноположительных результатов. Осуществление известного способа требует предварительной модификации химическими веществами поверхности латексных частиц (введение функционально активных групп), что не дает возможность получить конкретный технический результат - упрощение способа.From the practice of medicine, there is also known a method for detecting antibodies or antigens on a solid carrier in a latex-agglutination reaction, which consists in the fact that when they are detected, the surface of latex particles is used as a carrier of reaction components (Fremel G. Immunological methods. - M .: Medicine, 1987 . - 472 S.). However, the known method has the following disadvantages: the complexity of the visual assessment of the results of the reaction with a low content of antibodies or antigen in the test material. Only in 30% of patients positive for the presence of HB s antigen in the blood serum of patients, histological changes are detected, rheumatoid factor and fibrinolysis products can cause false positive results. The implementation of the known method requires preliminary chemical modification of the surface of latex particles (the introduction of functionally active groups), which does not make it possible to obtain a specific technical result - a simplification of the method.
Наиболее близким способом к предлагаемому является способ выявления антитела или антигена в ИФА с использованием различных полимерных материалов таких как полистирол, поливинилхлорид, полипропилен, полиакриламид в качестве твердых носителей иммуноактивных компонентов. Наибольшее распространение получила твердая фаза из полистирола в виде 96-луночных планшетов для иммунологических реакций. Кроме этого, промышленность выпускает такие формы как пробирки, шарики, гранулы в качестве твердых носителей гомологичных антител или антигенов (Воробьев А.А., Виха И.В. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии, №9, 1987, с.3-8).The closest way to the proposed is a method for detecting antibodies or antigens in ELISA using various polymeric materials such as polystyrene, polyvinyl chloride, polypropylene, polyacrylamide as solid carriers of immunoactive components. The most widespread solid phase from polystyrene in the form of 96-well plates for immunological reactions. In addition, the industry produces such forms as test tubes, balls, granules as solid carriers of homologous antibodies or antigens (Vorobyov A.A., Viha I.V. Journal of Microbiology, Epidemiology and Immunobiology, No. 9, 1987, p. 3-8 )
Однако известный способ имеет следующие недостатки:However, the known method has the following disadvantages:
- сложность осуществления способа;- the complexity of the method;
- десорбция иммуноактивных лигандов с поверхности лунок полистироловых планшетов в ходе проведения ИФА;- desorption of immunoactive ligands from the surface of the holes of polystyrene plates during ELISA;
- негомогенность материала полистироловых планшетов;- inhomogeneity of the material of polystyrene tablets;
- неспособность к каплеобразованию полистироловой поверхности при нанесении на нее антигенов или антител в буферных растворах (растекание капли по поверхности).- the inability to droplet formation of the polystyrene surface when applying antigens or antibodies to it in buffer solutions (droplet spreading over the surface).
Указанные недостатки не дают возможность получить технический результат - упрощение способа.These shortcomings do not allow to obtain a technical result - a simplification of the method.
Одним из негативных процессов, имеющим место в твердофазном ИФА, является десорбция сорбированных на пластике лигандов. В процессе реакции, проходящей в три этапа: последовательная инкубация на фиксированном антигене сывороток, конъюгата и субстрата, между которыми следует тщательное отмывание реагентов, происходит постепенная утечка антигена. По данным O.P. Lehtonen et al. (Lehtonen O.P., Viljanen M.K. // J. immunol. Meth. - 1980. - Vol.34. - P.61-70), такая потеря антигена с полистирола достигает 30%. Гидрофобное взаимодействие при адсорбции иммунохимического лиганда на поверхности пластика играет основную, если не главную роль при осуществлении этого процесса. Кроме этого, полимерные носители имеют низкую емкость, вследствие чего, для определения содержания антигена необходимо брать большое количество антительного иммуносорбента или иммобилизовывать на нем высокоаффинную фракцию антител. На емкость носителя оказывает влияние и неконтролируемый фактор - негомогенность материала полимерных носителей (Гаврилова Е.М. Журнал Всесоюзного химического общества им. Д.И.Менделеева, том XXVII, 4, 1982. - с.90-97).One of the negative processes taking place in solid-phase ELISA is the desorption of ligands adsorbed on plastic. In the course of the reaction, which takes place in three stages: sequential incubation of serum, conjugate and substrate on a fixed antigen, between which thorough washing of the reagents follows, a gradual leakage of antigen occurs. According to O.P. Lehtonen et al. (Lehtonen O.P., Viljanen M.K. // J. immunol. Meth. - 1980. - Vol. 34. - P.61-70), such a loss of antigen from polystyrene reaches 30%. The hydrophobic interaction during the adsorption of the immunochemical ligand on the surface of the plastic plays the main, if not the main role in the implementation of this process. In addition, polymeric carriers have a low capacity, and therefore, to determine the antigen content, it is necessary to take a large amount of antibody immunosorbent or to immobilize a high-affinity antibody fraction on it. An uncontrolled factor, the inhomogeneity of the material of polymer carriers, also influences the capacity of the carrier (Gavrilova EM, Journal of the All-Union Chemical Society named after D.I. Mendeleev, Volume XXVII, 4, 1982. - p.90-97).
На процесс адсорбции влияет наличие определенных функциональных групп, способных образовывать устойчивые химические связи различных типов, конформационная подвижность, участие молекул воды и т.д. Существенную роль в этом процессе играют нековалентные связи: координационные, водородные, ионные, Ван-дер-Ваальса.The adsorption process is affected by the presence of certain functional groups capable of forming stable chemical bonds of various types, conformational mobility, the participation of water molecules, etc. A significant role in this process is played by non-covalent bonds: coordination, hydrogen, ionic, van der Waals.
Сходство предлагаемого способа с известным состоит в том, что они оба относятся к иммунологии и основаны на использовании иммобилизованных сенситинов на носителе.The similarity of the proposed method with the known one lies in the fact that they both relate to immunology and are based on the use of immobilized sensitins on a carrier.
Предлагаемое изобретение решает основную задачу - упрощение способа.The present invention solves the main problem - the simplification of the method.
Фторопласт - высокомолекулярный полимер - обладает устойчивостью к действию неорганических и органических кислот, щелочей, органических растворителей, окислителей, газов и других агрессивных сред, сниженной поверхностной энергией (Кулезнев В.Н., Шершнев В.А. Химия и физика полимеров. - М.: Высшая школа, 1988). Сущность изобретения выражена совокупностью существенных признаков, достаточных для обеспечиваемого изобретением технического результата.Fluorine plastic - a high molecular weight polymer - is resistant to inorganic and organic acids, alkalis, organic solvents, oxidizing agents, gases and other aggressive media, and has a reduced surface energy (Kuleznev V.N., Shershnev V.A. Chemistry and physics of polymers. - M. : High School, 1988). The invention is expressed by a combination of essential features sufficient for the technical result provided by the invention.
Решение поставленной задачи заключается в том, что на предварительно обработанной гексаном в течение 10 минут при комнатной температуре фторопластовой ленте с обратной стороны отмечают места нанесения компонентов иммунологической реакции с помощью водостойкого маркера для последующей сенсибилизации при 6°С в течение 18 часов, промывают после каждого этапа трехкратно в течение 3 минут забуференным физиологическим раствором 0,1 М рН-7,0 с добавлением 0,05% Твина-20 и пятикратно этим же буфером после иммунопероксидазного конъюгата с последовательной обработкой сывороткой крови больных, иммунопероксидазным конъюгатом и по изменению окраски субстратной смеси выявляют антитела к M.leprae или HBs-антиген на твердом носителе.The solution to this problem lies in the fact that on the reverse side pre-treated with hexane for 10 minutes at room temperature, the fluoroplastic tape marks the places of application of the components of the immunological reaction using a waterproof marker for subsequent sensitization at 6 ° C for 18 hours, washed after each stage three times for 3 minutes with a buffered saline solution of 0.1 M pH-7.0 with the addition of 0.05% Tween-20 and five times with the same buffer after immunoperoxidase conjugate followed by Flax treatment serum of patients by immunoperoxidase conjugate and substrate mixture discoloration detect antibodies to M.leprae or HB s -antigen on a solid support.
Предлагаемым способом достигается его упрощение, так как фторопласт обладает исключительной гидрофобностью, что является определяющим фактором для фиксации сенситинов и сохранения формы капель нанесенных на его поверхность компонентов иммуноферментного анализа, возможность его проведения без использования специального сложного оборудования.The proposed method achieves its simplification, since fluoroplastic has exceptional hydrophobicity, which is a determining factor for fixing sensitins and preserving the shape of the droplets of the components of an enzyme-linked immunosorbent assay, the possibility of its implementation without the use of special sophisticated equipment.
Предлагаемый способ осуществляется следующим образом. Используют фторопластовую ленту марки «ПН» толщина 0,2 мм, ширина 80 мм (производства ЗАО «Фторопластовые технологии», г.Санкт-Петербург), разрезают на полосы размером 80×10 мм, предварительно их обработывают гексаном (погружение) в течение 10 минут при комнатной температуре и с обратной стороны отмечают места нанесения компонентов иммунологической реакции с помощью водостойкого маркера для последующей сенсибилизации при 6°С в течение 18 часов, промывают ее забуференным физиологическим раствором 0,1 М pH - 7,0 с добавлением 0,05% Твина-20 (ЗФРТ) трехкратно по 3 минуты, а после иммунопероксидазного конъюгата - пятикратно, инкубируют последовательно сыворотки крови больных с постановкой отрицательного и положительного контролей, иммунопероксидазный конъюгат и по изменению окраски субстратной смеси выявляют антитела к M.leprae или HBs-антиген на твердом носителе. Сенсибилизируют полосы фторопласта антигеном, полученным ультразвуковой дезинтеграцией M.leprae (патент №2082979 от 27.06.1997 г. «Способ определения группы риска рецидива лепры», Дячина М.Н., Дегтярев О.В.) или поликлональными козьими антителами к HBs-антигену производства предприятия «ИмБиО», г.Н-Новгород. Оптимально исследовать на полосе фторопласта размером 80 мм × 10 мм восемь образцов, включая контроли. Все компоненты ИФА берут с помощью пипеточного дозатора в объеме 20 мкл, кроме стоп-реагента - 10 мкл.The proposed method is as follows. Use the fluoroplastic tape of the PN brand with a thickness of 0.2 mm, a width of 80 mm (manufactured by CJSC Fluoroplastic Technologies, St. Petersburg), cut into strips 80 × 10 mm in size, pre-treated with hexane (immersion) for 10 minutes at room temperature and on the reverse side mark the places of application of the components of the immunological reaction using a waterproof marker for subsequent sensitization at 6 ° C for 18 hours, washed with a buffered saline solution of 0.1 M pH - 7.0 with the addition of 0.05% Tween-20 (ZFRT) three-circle 3 minutes each, and after the immunoperoxidase conjugate five times, the blood serum of patients with negative and positive controls is incubated sequentially, the immunoperoxidase conjugate and antibodies to M.leprae or HB s antigen on a solid support are detected by changing the color of the substrate mixture. The fluoroplastic bands are sensitized by the antigen obtained by ultrasonic disintegration of M.leprae (patent No. 2082979 dated 06/27/1997, “Method for determining the risk group for recurrence of leprosy”, Dyachina MN, Degtyarev OV) or polyclonal goat antibodies to HB s - antigen produced by the company "ImBiO", N-Novgorod. It is optimal to study eight samples, including controls, on a fluoroplastic strip measuring 80 mm × 10 mm. All ELISA components are taken with a pipette dispenser in a volume of 20 μl, except for the stop reagent - 10 μl.
Предлагаемый способ прошел успешную апробацию на базе ФГУ «НИИ по изучению лепры Минздравсоцразвития России», г.Астрахань на 28 больных лепроматозной формой лепры и 14 донорах крови, а также на базе ОГУЗ «Областная инфекционная клиническая больница», г.Астрахань на 24 больных острым вирусным гепатитом В и 18 донорах крови в течение 2009-2010 гг.The proposed method has been successfully tested on the basis of the Federal State Institution “Research Institute for the Study of Leprosy of the Ministry of Health and Social Development of Russia”, Astrakhan for 28 patients with the lepromatous form of leprosy and 14 blood donors, as well as on the basis of the OGUZ “Regional Infectious Clinical Hospital”, Astrakhan for 24 patients with acute viral hepatitis B and 18 blood donors during 2009-2010.
Пример №1. С целью выявления антител класса IgG у 28 больных лепроматозной формой лепры места нанесения компонентов иммунологической реакции на фторопластовой ленте, помещенной в чашку Петри, сенсибилизируют антигеном из ультразвукового дезинтеграта М. leprae 5 мкг/мл в объеме 20 мкл в карбонат-бикарбонатном буфере рН-9,6 для каждого образца сыворотки крови при 6°C в течение 18 часов. Несвязавшийся антиген с сенсибилизированной ленты удаляется стряхиванием и промыванием в ванночке трижды по 3 минуты в 10 мл забуференного физиологического раствора 0,1М рН-7,0 с 0,05% твина-20 (ЗФРТ). После этого наносят разведенные 1:400 в ЗФРТ сыворотки крови больных и донора (отрицательный контроль) и инкубируют в термостате при 37°C в течение 1 часа. Вновь проводят промывку как указано выше. Затем наносят на места предыдущего расположения компонентов реакции иммунопероксидазный конъюгат - анти-IgG человека 1:5000 в ЗФРТ в том же объеме - 20 мкл. Время и условия инкубации те же, что и сывороток. Несвязавшиеся молекулы конъюгата удаляют тщательной 5-кратной по 3 минуты промывкой в ЗФРТ.Example No. 1. In order to detect IgG antibodies in 28 patients with lepromatous leprosy, the sites of application of the components of the immunological reaction on a fluoroplastic tape placed in a Petri dish are sensitized with antigen from M. leprae ultrasonic disintegrate 5 μg / ml in a volume of 20 μl in pH-9 carbonate-bicarbonate buffer , 6 for each serum sample at 6 ° C for 18 hours. Unbound antigen from the sensitized tape is removed by shaking and washing in a bath three times for 3 minutes in 10 ml of buffered saline 0.1 M pH-7.0 with 0.05% Tween-20 (ZRFT). After that, diluted 1: 400 in the PBS of the blood serum of the patients and the donor (negative control) is applied and incubated in an incubator at 37 ° C for 1 hour. Rinse again as described above. Then, the immunoperoxidase conjugate, human anti-IgG 1: 5000, is applied to the sites of the previous location of the reaction components in the same volume of PFRT - 20 μl. The time and conditions of incubation are the same as the serum. Unbound conjugate molecules are removed by thorough 5-fold washing in 3 minutes in PBS.
Результаты реакции оценивают визуально по разнице окрашивания субстратной смеси 0,04% раствора ортофенилендиамина в цитратно-фосфатном буфере рН-5,0 и 0,03% перекиси водорода после 10-минутной экспозиции при комнатной температуре в темном месте и останавки ее внесением в каждый образец 10 мкл 2М H2SO4. Отрицательный контроль остается бесцветным, а в местах нанесения сывороток крови больных цвет субстратной смеси варьирует от светло-желтого до коричневого в зависимости от количественного содержания специфических иммуноглобулинов класса G к M.leprae.The reaction results are evaluated visually by the difference in the staining of the substrate mixture of a 0.04% solution of orthophenylenediamine in citrate-phosphate buffer pH-5.0 and 0.03% hydrogen peroxide after 10 minutes of exposure at room temperature in a dark place and stopping by adding it to each sample 10 μl of 2M H 2 SO 4 . The negative control remains colorless, and in the places where the blood serum of patients is applied, the color of the substrate mixture varies from light yellow to brown, depending on the quantitative content of specific class G immunoglobulins to M.leprae.
Пример №2. С целью выявления поверхностного антигена вируса гепатита В (HBs-антиген) у 24 больных острым вирусным гепатитам В (ОГВ), находившихся на лечении в ОГУЗ «Областная инфекционная клиническая больница», г.Астрахань и 18 доноров (отрицательный контроль), места нанесения компонентов иммунологической реакции фторопластовой ленты сенсибилизируют 2 мкг/мл поликлональных козьих антител к HBs-антигену в карбонат-бикарбонатном буфере рН-9,6 в объеме 20 мкл, производства предприятия «ИмБиО», г.Н-Новгород с содержанием белка 1 мг/мл, титр 1:128 в двойной иммунодиффузии по Оухтерлони. Положительным и отрицательным контролями, иммунопероксидазным конъюгатом к HBs-антигену, субстратной смесью и стоп-реагентом служат компоненты коммерческого набора «Вектогеп B-HBs-антиген-стрип» (комплект 3), производства ЗАО «Век-тор-Бест», г.Новосибирск. Диагноз острого гепатита B подтвержден клинико-лабораторными данными и в ИФА наличием в сыворотках крови больных HBs-антигена по общепринятой методике.Example No. 2. In order to detect the surface antigen of hepatitis B virus (HBs antigen) in 24 patients with acute viral hepatitis B (OGV), who were undergoing treatment at the Regional Infection Clinical Hospital, Astrakhan and 18 donors (negative control), the place of application of the components the immunological reaction of the fluoroplastic tape sensitizes 2 μg / ml of goat polyclonal antibodies to the HBs antigen in carbonate-bicarbonate buffer pH-9.6 in a volume of 20 μl, manufactured by ImBiO, N-Novgorod, with a protein content of 1 mg / ml, titer 1: 128 in dual immunode ffuzii by Ouchterlony. The positive and negative controls, the immunoperoxidase conjugate to the HBs antigen, the substrate mixture, and the stop reagent are components of the Vektohep B-HBs antigen-strip commercial kit (set 3), manufactured by Vektor-Best CJSC, Novosibirsk . The diagnosis of acute hepatitis B is confirmed by clinical and laboratory data and in ELISA by the presence in the blood serum of patients with HBs antigen according to the generally accepted method.
Постановка способа аналогична примеру №1, кроме разведения образцов сывороток и конъюгата, которые готовят согласно прилагаемой к набору инструкции.The setting of the method is similar to example No. 1, except for the dilution of serum samples and conjugate, which are prepared according to the instructions attached to the set.
Хранение сенсибилизированных лент в течение шести месяцев при 6°C в чашках Петри не снижает их эффективности (срок наблюдения).Storage of sensitized tapes for six months at 6 ° C in Petri dishes does not reduce their effectiveness (observation period).
Таким образом, авторами представлен способ, в котором используют фторопластовую ленту, никем ранее не предложенную в качестве твердого носителя сенситинов для выявления гомологичных антител и антигена в ИФА.Thus, the authors presented a method in which a fluoroplastic tape was used that was not previously proposed by anyone as a solid carrier of sensitins to detect homologous antibodies and antigen in ELISA.
Предлагаемым способом достигается положительный результат, который заключается в упрощении способа выявления антитела или антигена на твердом носителе, способность биокомпонентов, буферных растворов солей и воды сохранять форму капли при нанесении их на поверхность фторопластовой ленты. Обеспечивается эффективная фиксация сенситинов за счет исключительной гидрофобности полимера, экономичность расходования компонентов ИФА (20 мкл расходного материала на каждый этап реакции по сравнению с прототипом - 50-100 мкл), возможность проведения ИФА без использования сложной лабораторной техники. Наличие компьютерной видеоцифровой технологии позволит регистрировать количественное содержание искомых антител или антигена в биологических субстратах организма.The proposed method achieves a positive result, which consists in simplifying the method for detecting antibodies or antigens on a solid carrier, the ability of biocomponents, buffer solutions of salts and water to maintain the shape of a drop when applied to the surface of a fluoroplastic tape. EFFECT: effective fixation of sensitins due to the exceptional hydrophobicity of the polymer, economical use of ELISA components (20 μl of consumables for each reaction step compared to the prototype - 50-100 μl), the ability to conduct ELISA without the use of complex laboratory equipment. The presence of computer video-digital technology will allow to record the quantitative content of the desired antibodies or antigen in the biological substrates of the body.
Предложенный способ может быть рекомендован для использования иммунологическими лабораториями учреждений системы здравоохранения, так как прост в исполнении, не требует дорогостоящего и сложного оборудования персонала.The proposed method can be recommended for use by immunological laboratories of healthcare institutions, as it is simple to implement, does not require expensive and complex equipment of personnel.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2010147747/15A RU2468371C2 (en) | 2010-11-23 | 2010-11-23 | Method of detecting antibodies to mycobacterium leprae on solid carrier |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2010147747/15A RU2468371C2 (en) | 2010-11-23 | 2010-11-23 | Method of detecting antibodies to mycobacterium leprae on solid carrier |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2010147747A RU2010147747A (en) | 2012-05-27 |
| RU2468371C2 true RU2468371C2 (en) | 2012-11-27 |
Family
ID=46231445
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2010147747/15A RU2468371C2 (en) | 2010-11-23 | 2010-11-23 | Method of detecting antibodies to mycobacterium leprae on solid carrier |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2468371C2 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2641060C1 (en) * | 2016-08-19 | 2018-01-15 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт по изучению лепры" Минздрава Российской федерации | Method for leprosy mycobacteria dna identification by polymerase chain reaction |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2137137C1 (en) * | 1997-12-03 | 1999-09-10 | Научно-исследовательский институт по изучению лепры | Method of identification of mycobacterium leprae in patients with disease regression |
| RU2290641C1 (en) * | 2005-03-30 | 2006-12-27 | Российская Федерация в лице Федерального государственного учреждения здравоохранения - Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт Федерального агентства по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия населения | Method for carrying out immunoenzyme analysis |
| RU2376604C2 (en) * | 2007-11-02 | 2009-12-20 | Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Астраханская государственная медицинская академия" Росздрава | Method for detection of antigen or antibody in immune-enzyme analysis |
-
2010
- 2010-11-23 RU RU2010147747/15A patent/RU2468371C2/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2137137C1 (en) * | 1997-12-03 | 1999-09-10 | Научно-исследовательский институт по изучению лепры | Method of identification of mycobacterium leprae in patients with disease regression |
| RU2290641C1 (en) * | 2005-03-30 | 2006-12-27 | Российская Федерация в лице Федерального государственного учреждения здравоохранения - Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт Федерального агентства по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия населения | Method for carrying out immunoenzyme analysis |
| RU2376604C2 (en) * | 2007-11-02 | 2009-12-20 | Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Астраханская государственная медицинская академия" Росздрава | Method for detection of antigen or antibody in immune-enzyme analysis |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| РАДАЕВА Т.В. Сравнительная характеристика иммунологических параметров мышей инбредных линий с генетически детерминированной чувствительностью к туберкулезу и их сверхрезистентных гибридов: Автореф. дисс. канд. мед. наук. - М., 2002, 103 с. [Найдено 08.06.2012] [он-лайн], Найдено из Интернет: <URL:http://www.dissercat.com/content/sravnitelnaya-kharakteristika-immunologicheskikh-parametrov-myshei-inbrednykh-linii-s-geneti>. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2641060C1 (en) * | 2016-08-19 | 2018-01-15 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт по изучению лепры" Минздрава Российской федерации | Method for leprosy mycobacteria dna identification by polymerase chain reaction |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2010147747A (en) | 2012-05-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CA1268419A (en) | Immunoassay for htlv-iii antigens | |
| Ho et al. | A critical reappraisal of the use of enzyme-linked immunosorbent assays in the study of snake bite | |
| JP5890789B2 (en) | Apparatus and method for detecting an analyte | |
| JPS61247965A (en) | Enzyme immunological measurement method | |
| CN1030300A (en) | Utilize the enzyme-labeled immunity detection method to measure antigen and/or antibody in the human body simultaneously | |
| JP4286157B2 (en) | Membrane assay | |
| WO2018223151A1 (en) | Flow cytometry system and methods for the diagnosis of infectious disease | |
| EP3243076A1 (en) | Methods for detecting a marker for active tuberculosis | |
| Eng et al. | Optical immunoassay for snake venom detection | |
| RU2468371C2 (en) | Method of detecting antibodies to mycobacterium leprae on solid carrier | |
| Ravi et al. | A reverse passive haemagglutination test for detection of Japanese encephalitis virus antigens in cerebrospinal fluid | |
| CN205120720U (en) | Kit of anti medicine antibody of short -term test EGFR antibody medicine | |
| CA1106281A (en) | Detection of antigen associated with hepatitis by "sandwich" method | |
| RU2376604C2 (en) | Method for detection of antigen or antibody in immune-enzyme analysis | |
| JP2006084351A (en) | Specimen suspension composition, kit and test method | |
| Chantler et al. | Current status of specific IgM antibody assays | |
| RU2200327C2 (en) | Method for diagnostics of syphilis (variants) | |
| KR970007080B1 (en) | Self-contained multiimmunoassay diagnostic system | |
| RU2234704C2 (en) | Antibody analysis | |
| CN102360012A (en) | Immunochromatography detection reagent strip for combined detection of toxoplasmagondii IgG antibodies and total antibodies, and preparation method thereof | |
| WO2021247335A1 (en) | Viral diagnostics | |
| US20250283880A1 (en) | Sensitizer for immunochromatographic assays, and assay | |
| WO2007013401A1 (en) | Immunoassay method and immunoassay kit to be used therein | |
| RU2133622C1 (en) | Method of detection of antibody to hepatitis virus c nuclear protein | |
| CN102313811A (en) | Toxoplasma gondii IgG antibody colloidal gold immunity chromatography detection reagent strip and its preparation method |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20121124 |