RU2459871C2 - Способ ферментативного получения 2-гидрокси-2-метилкарбоновых кислот - Google Patents
Способ ферментативного получения 2-гидрокси-2-метилкарбоновых кислот Download PDFInfo
- Publication number
- RU2459871C2 RU2459871C2 RU2008142188/10A RU2008142188A RU2459871C2 RU 2459871 C2 RU2459871 C2 RU 2459871C2 RU 2008142188/10 A RU2008142188/10 A RU 2008142188/10A RU 2008142188 A RU2008142188 A RU 2008142188A RU 2459871 C2 RU2459871 C2 RU 2459871C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- acid
- hydroxy
- coa
- seq
- activity
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 63
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 22
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 title claims abstract description 17
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims abstract description 73
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 41
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 40
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 40
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 36
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims abstract description 32
- ASARMUCNOOHMLO-WLORSUFZSA-L cobalt(2+);[(2r,3s,4r,5s)-5-(5,6-dimethylbenzimidazol-1-yl)-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] [(2s)-1-[3-[(1r,2r,3r,4z,7s,9z,12s,13s,14z,17s,18s,19r)-2,13,18-tris(2-amino-2-oxoethyl)-7,12,17-tris(3-amino-3-oxopropyl)-3,5,8,8,13,15,18,19-octamethyl-2 Chemical compound [Co+2].[N-]([C@@H]1[C@H](CC(N)=O)[C@@]2(C)CCC(=O)NC[C@H](C)OP([O-])(=O)O[C@H]3[C@H]([C@H](O[C@@H]3CO)N3C4=CC(C)=C(C)C=C4N=C3)O)\C2=C(C)/C([C@H](C\2(C)C)CCC(N)=O)=N/C/2=C\C([C@H]([C@@]/2(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=N\C\2=C(C)/C2=N[C@]1(C)[C@@](C)(CC(N)=O)[C@@H]2CCC(N)=O ASARMUCNOOHMLO-WLORSUFZSA-L 0.000 claims abstract description 31
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 29
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 claims abstract description 27
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims abstract description 10
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 9
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 claims abstract description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims abstract description 6
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 claims description 51
- BWLBGMIXKSTLSX-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxyisobutyric acid Chemical compound CC(C)(O)C(O)=O BWLBGMIXKSTLSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 30
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 27
- WHBMMWSBFZVSSR-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxybutyric acid Chemical compound CC(O)CC(O)=O WHBMMWSBFZVSSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 22
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 22
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 22
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 19
- DKGAVHZHDRPRBM-UHFFFAOYSA-N Tert-Butanol Chemical compound CC(C)(C)O DKGAVHZHDRPRBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 11
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 9
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 9
- 102000005385 Intramolecular Transferases Human genes 0.000 claims description 7
- 108010031311 Intramolecular Transferases Proteins 0.000 claims description 7
- 241001311561 Xanthobacter autotrophicus Py2 Species 0.000 claims description 7
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 7
- 238000006317 isomerization reaction Methods 0.000 claims description 7
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 claims description 7
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 claims description 6
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 claims description 6
- -1 for example Proteins 0.000 claims description 6
- 239000002994 raw material Substances 0.000 claims description 6
- 241000191043 Rhodobacter sphaeroides Species 0.000 claims description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 5
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 claims description 5
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 claims description 5
- 239000002699 waste material Substances 0.000 claims description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 4
- 241001495390 Nocardioides sp. Species 0.000 claims description 4
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 3
- 230000008823 permeabilization Effects 0.000 claims description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 2
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 claims description 2
- 150000007970 thio esters Chemical class 0.000 claims description 2
- 239000004215 Carbon black (E152) Substances 0.000 claims 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 2
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 claims 2
- 150000002430 hydrocarbons Chemical class 0.000 claims 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 12
- 238000011534 incubation Methods 0.000 abstract description 4
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 20
- CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-N Methacrylic acid Chemical compound CC(=C)C(O)=O CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 13
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 8
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 8
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 8
- 239000005445 natural material Substances 0.000 description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 5
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 5
- 150000002825 nitriles Chemical class 0.000 description 5
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002585 base Substances 0.000 description 4
- AFENDNXGAFYKQO-VKHMYHEASA-N (S)-2-hydroxybutyric acid Chemical compound CC[C@H](O)C(O)=O AFENDNXGAFYKQO-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-M Methacrylate Chemical compound CC(=C)C([O-])=O CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 150000001720 carbohydrates Chemical group 0.000 description 3
- 239000012295 chemical reaction liquid Substances 0.000 description 3
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- ALYNCZNDIQEVRV-UHFFFAOYSA-N 4-aminobenzoic acid Chemical compound NC1=CC=C(C(O)=O)C=C1 ALYNCZNDIQEVRV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XFXPMWWXUTWYJX-UHFFFAOYSA-N Cyanide Chemical compound N#[C-] XFXPMWWXUTWYJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001303121 Methylibium Species 0.000 description 2
- 241001305626 Methylibium petroleiphilum PM1 Species 0.000 description 2
- PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N Niacin Chemical compound OC(=O)C1=CC=CN=C1 PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N Riboflavin Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N 0.000 description 2
- 229910052783 alkali metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 150000004703 alkoxides Chemical class 0.000 description 2
- PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N aluminium oxide Inorganic materials [O-2].[O-2].[O-2].[Al+3].[Al+3] PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 238000011138 biotechnological process Methods 0.000 description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 2
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 2
- 239000012876 carrier material Substances 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000010924 continuous production Methods 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000004821 distillation Methods 0.000 description 2
- 238000005265 energy consumption Methods 0.000 description 2
- OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N folic acid Chemical compound C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 2
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 2
- 150000002576 ketones Chemical class 0.000 description 2
- 229910000000 metal hydroxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 150000004692 metal hydroxides Chemical class 0.000 description 2
- 229910044991 metal oxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 150000004706 metal oxides Chemical class 0.000 description 2
- NWVVVBRKAWDGAB-UHFFFAOYSA-N p-methoxyphenol Chemical compound COC1=CC=C(O)C=C1 NWVVVBRKAWDGAB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 2
- 150000003003 phosphines Chemical class 0.000 description 2
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 2
- 235000012239 silicon dioxide Nutrition 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- OAJLVMGLJZXSGX-SLAFOUTOSA-L (2s,3s,4r,5r)-2-(6-aminopurin-9-yl)-5-methanidyloxolane-3,4-diol;cobalt(3+);[(2r,3s,4r,5s)-5-(5,6-dimethylbenzimidazol-1-yl)-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] [(2r)-1-[3-[(1r,2r,3r,4z,7s,9z,12s,13s,14z,17s,18s,19r)-2,13,18-tris(2-amino-2-oxoethyl)-7 Chemical compound [Co+3].O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H]([CH2-])O[C@@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1.[N-]([C@@H]1[C@H](CC(N)=O)[C@@]2(C)CCC(=O)NC[C@@H](C)OP([O-])(=O)O[C@H]3[C@H]([C@H](O[C@@H]3CO)N3C4=CC(C)=C(C)C=C4N=C3)O)\C2=C(C)/C([C@H](C\2(C)C)CCC(N)=O)=N/C/2=C\C([C@H]([C@@]/2(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=N\C\2=C(C)/C2=N[C@]1(C)[C@@](C)(CC(N)=O)[C@@H]2CCC(N)=O OAJLVMGLJZXSGX-SLAFOUTOSA-L 0.000 description 1
- GHOKWGTUZJEAQD-ZETCQYMHSA-N (D)-(+)-Pantothenic acid Chemical compound OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(O)=O GHOKWGTUZJEAQD-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- DWMKNEOBPSNLIO-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxybutanoic acid;2-hydroxy-2-methylpropanoic acid Chemical compound CCC(O)C(O)=O.CC(C)(O)C(O)=O DWMKNEOBPSNLIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical class CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700023418 Amidases Proteins 0.000 description 1
- RGJOEKWQDUBAIZ-IBOSZNHHSA-N CoASH Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 RGJOEKWQDUBAIZ-IBOSZNHHSA-N 0.000 description 1
- AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N D-Lyxoflavin Natural products OCC(O)C(O)C(O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N N-Pteroyl-L-glutaminsaeure Natural products C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010033272 Nitrilase Proteins 0.000 description 1
- 241001487056 Nocardioides sp. JS614 Species 0.000 description 1
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000002067 Protein Subunits Human genes 0.000 description 1
- 108010001267 Protein Subunits Proteins 0.000 description 1
- 241000769983 Rhodobacter sphaeroides ATCC 17029 Species 0.000 description 1
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 1
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N acrylic acid group Chemical group C(C=C)(=O)O NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 1
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 1
- 102000005922 amidase Human genes 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010352 biotechnological method Methods 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001735 carboxylic acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 150000001867 cobalamins Chemical class 0.000 description 1
- RGJOEKWQDUBAIZ-UHFFFAOYSA-N coenzime A Natural products OC1C(OP(O)(O)=O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)OC1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 RGJOEKWQDUBAIZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005516 coenzyme A Substances 0.000 description 1
- 229940093530 coenzyme a Drugs 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- KDTSHFARGAKYJN-UHFFFAOYSA-N dephosphocoenzyme A Natural products OC1C(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)OC1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 KDTSHFARGAKYJN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 238000000909 electrodialysis Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 229960000304 folic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000019152 folic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011724 folic acid Substances 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 235000003869 genetically modified organism Nutrition 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000003673 groundwater Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- NTQWADDNQQUGRH-UHFFFAOYSA-N hydrogen sulfate;2-methylprop-2-enoylazanium Chemical class OS(O)(=O)=O.CC(=C)C(N)=O NTQWADDNQQUGRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000001746 injection moulding Methods 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- AGBQKNBQESQNJD-UHFFFAOYSA-N lipoic acid Chemical compound OC(=O)CCCCC1CCSS1 AGBQKNBQESQNJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000006140 methanolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 235000001968 nicotinic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960003512 nicotinic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000011664 nicotinic acid Substances 0.000 description 1
- 238000010641 nitrile hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012299 nitrogen atmosphere Substances 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000020477 pH reduction Effects 0.000 description 1
- 239000003973 paint Substances 0.000 description 1
- 229940014662 pantothenate Drugs 0.000 description 1
- 235000019161 pantothenic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011713 pantothenic acid Substances 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 229920003229 poly(methyl methacrylate) Polymers 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 239000004926 polymethyl methacrylate Substances 0.000 description 1
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 1
- 235000019422 polyvinyl alcohol Nutrition 0.000 description 1
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- LXNHXLLTXMVWPM-UHFFFAOYSA-N pyridoxine Chemical compound CC1=NC=C(CO)C(CO)=C1O LXNHXLLTXMVWPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019171 pyridoxine hydrochloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000011764 pyridoxine hydrochloride Substances 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 238000010992 reflux Methods 0.000 description 1
- 235000019192 riboflavin Nutrition 0.000 description 1
- 229960002477 riboflavin Drugs 0.000 description 1
- 239000002151 riboflavin Substances 0.000 description 1
- YTTUVWRNKSNZFE-LFZQUHGESA-N s-[2-[3-[[(2r)-4-[[[(2r,3s,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-4-hydroxy-3-phosphonooxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-hydroxyphosphoryl]oxy-2-hydroxy-3,3-dimethylbutanoyl]amino]propanoylamino]ethyl] 12-(4-azido-2-nitrophenoxy)dodecanethioate Chemical compound O=C([C@H](O)C(C)(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O1)N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1)OP(O)(O)=O)C)NCCC(=O)NCCSC(=O)CCCCCCCCCCCOC1=CC=C(N=[N+]=[N-])C=C1[N+]([O-])=O YTTUVWRNKSNZFE-LFZQUHGESA-N 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SCN1CC1=CN=C(C)N=C1N KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 1
- 150000003568 thioethers Chemical class 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000017105 transposition Effects 0.000 description 1
- 239000002966 varnish Substances 0.000 description 1
- 229940011671 vitamin b6 Drugs 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/90—Isomerases (5.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
- C12P7/42—Hydroxy-carboxylic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
- C12P7/52—Propionic acid; Butyric acids
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Настоящее изобретение касается способа ферментативного получения 2-гидрокси-2-метилкарбоновых кислот из 3-гидроксикарбоновых кислот. Представленный способ включает синтез 3-гидроксикарбоновой кислоты в водном реакционном растворе, который содержит единицу, обладающую активностью CoA-мутазы 3-гидроксикарбоновой кислоты и обладающую как активностью продукции 3-гидроксикарбонил-CoA-эфира, так и изомеризации 3-гидроксикарбонил-CoA-эфира, причем эту единицу выбирают из группы, включающей выделенную кобаламин-зависимую мутазу, фермент или систему ферментов, производящие эфиры 3-гидроксикарбонила-CoA, микроорганизм или его сырой экстракт, добавление ее к указанному реакционному раствору, инкубирование, а затем получение соответствующим образом преобразованной 2-гидрокси-2-метилкарбоновой кислоты в виде кислоты или в форме ее солей. Представленный способ является безвредным для окружающей среды и обладает невысоким энергопотреблением. 5 н. и 19 з.п. ф-лы, 2 ил., 2 табл., 3 пр.
Description
Настоящее изобретение касается способа ферментативного получения 2-гидрокси-2-метилкарбоновых кислот из 3-гидроксикарбоновых кислот, в котором 3-гидроксикарбоновую кислоту синтезируют в водном реакционном растворе и/или добавляют ее к этому реакционному раствору и инкубируют. Водный реакционный раствор содержит вещество, обладающее активностью CoA-мутазы 3-гидроксикарбоновой кислоты, которое способно как производить эфиры 3-гидроксикарбонила-CoA, так и изомеризовать эфиры 3-гидроксикарбонила-CoA, и обеспечивает превращение 3-гидроксикарбоновой кислоты в соответствующую 2-гидрокси-2-метилкарбоновую кислоту, которую получают в виде кислоты или в форме ее солей. В предпочтительной форме исполнения вещество, обладающее активностью CoA-мутазы 3-гидроксикарбоновой кислоты, включает в себя изолированную кобаламин-зависимую мутазу и, при необходимости, фермент или ферментную систему, производящую эфиры 3-гидроксикарбонила-CoA, либо же представляет собой содержащий их микроорганизм. Предпочтительно изобретение касается биотехнологического процесса для производства 2-гидрокси-2-метилкарбоновых кислот, причем микроорганизмы, обладающие желательной мутазной активностью, культивируют в водной системе с помощью простых природных веществ, а эфиры 3-гидроксикарбонила-CoA, образующиеся во внутриклеточной среде, преобразуют в соответствующие 2-гидрокси-2-метилкарбоновые кислоты. Также изобретение включает в себя производство ненасыщенных 2-метилкарбоновых кислот, причем полученные путем дегидратации 2-гидрокси-2-метилкарбоновые кислоты превращают в соответствующие ненасыщенные 2-метилкарбоновые кислоты (метакриловую кислоту и ее высшие гомологи).
В предпочтительном варианте исполнения в качестве микроорганизма, производящего 3-гидроксикарбонил-CoA-тиоэфир и изомеризующего 3-гидроксикарбонил-CoA-тиоэфир, используют штамм НСМ-10 (DSM 18028).
Метакриловая кислота, а также гомологичные ей ненасыщенные 2-метилкарбоновые кислоты широко применяют при производстве листового акрилового оргстекла, фасонных изделий, изготавливаемых методом литья под давлением, и множества других продуктов.
Известен целый ряд процессов, применимых для производства метакриловой кислоты и ее гомологов. Однако в мировом коммерческом производстве самую большую долю занимает способ для гидролиза амид-сульфатов метакриловой кислоты и их гомологов, которые производят из соответствующих 2-гидроксилнитрилов (W.Bauer, "Methacrylic acid and derivatives", в: Ullmann′s Encyclopedia of Industrial Chemistry, 5. Auflage, Herausgeber: В.Elvers, S.Hawkins, G.Schulz, VCH, New York, 1990, Bd. A16, S.441-452; A.W.Gross, J.C.Dobson, "Methacrylic acid and derivatives", in Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology, 4. Auflage, Herausgeber: J.I.Kroschwitz, M.Howe-Grant, John Wiley & Sons, New York, 1995, Bd. 16, S.474-506). В этом методе для производства 1 кг метакриловой кислоты необходимо, например, 1,6 кг серной кислоты. По этой причине были бы целесообразны альтернативные способы коммерческого производства метакриловой кислоты, которые позволяли бы обойтись без повторного извлечения серной кислоты и связанного с этим высокого расхода энергии.
Химическое превращение 2-гидроксимасляной кислоты в метакриловую кислоту стало известно из патентов США US 3,666,805 и US 5,225,594. Для этого проводят дегидратизацию 2-гидроксимасляной кислоты с использованием оксидов металлов, гидроксидов металлов, ионообменных смол, глинозема, диоксида кремния, аминов, фосфинов, алкоксидов и карбоксилатов щелочных металлов. Обычно температура реакции находится между 160°С и 250°С. Этот способ позволяет добиться выхода метакриловой кислоты до 96%.
Альтернативный способ производства метакриловой кислоты и ее гомологов состоит в гидролизе 2-гидроксинитрилов до соответствующих 2-гидрокси-2-метилкарбоновых кислот с использованием нитрил-гидролизующих ферментов. Речь при этом идет о нитрилазе или сочетании нитрил-гидролазы и амидазы (A.Banerjee, R.Sharrna, U.С.Banerjee, 2002, "The nitrile-degrading enzymes: current Status and future prospects", Appl. Microbiol. Biotechnol., 60: 33-44). Этот способ защищен рядом патентов (патент США US 6,582,943 В1). Существенный недостаток этого метода состоит в нестабильности нитрилов в нейтральном диапазоне рН, необходимом для достаточной активности нитрил-гидролизующих ферментов. Разрушение нитрилов в реакционной смеси ведет к накоплению кетонов и цианида, причем оба вещества ингибируют активность нитрил-гидролизующих ферментов.
Общим недостатком обоих способов, т.е. преобладающего в настоящее время способа на основе амид-сульфатов и ферментативного способа с гидролизом нитрилов, является потребность в 2-гидроксинитрилах. Их приходится сначала синтезировать из вредных для окружающей среды исходных компонентов, а именно кетонов и цианида.
Поэтому были бы полезны способы производства метакриловой кислоты и ее гомологов, основанные на простых исходных компонентах, безвредных для окружающей среды.
Задача изобретения, следовательно, состояла в поиске альтернативных возможностей производства 2-гидрокси-2-метилкарбоновых кислот и в том, чтобы предложить средства и способы, которые основаны на применении простых, безвредных для окружающей среды компонентов, обладают невысоким энергопотреблением и отходов также производят немного.
Задачу решают с помощью ферментативного способа получения 2-гидрокси- 2-метилкарбоновых кислот из 3-гидроксикарбоновых кислот. Согласно изобретению 3-гидроксикарбоновую кислоту синтезируют в водном реакционном растворе, который содержит вещество, обладающее активностью CoA-мутазы 3-гидроксикарбоновой кислоты, и/или добавляют ее к этому реакционному раствору. Под веществом, обладающим активностью CoA-мутазы 3-гидроксикарбоновой кислоты, в рамках изобретения подразумевают вещество (систему), включающее в себя кобаламин-зависимую мутазу и, при необходимости, фермент или систему ферментов, производящую эфиры 3-гидроксикарбонила-CoA, либо включающую или производящую эти вещества биологическую систему, которые обладают активностью CoA-мутазы 3-гидроксикарбоновой кислоты и демонстрируют как активность производства эфиров 3-гидроксикарбонила-CoA, так и активность в изомеризации эфиров 3-гидроксикарбонила-CoA. После инкубации получают соответствующим образом преобразованную 2-гидрокси-2-метилкарбоновую кислоту в виде кислоты или в форме ее солей.
Изобретение предпочтительно касается биотехнологического процесса для производства 2-гидрокси-2-метилкарбоновых кислот с использованием микроорганизмов. Эти микроорганизмы, как правило, обладают активностью синтеза эфиров 3-гидроксикарбонила-CoA, и они в состоянии производить эту кобаламин-зависимую мутазу либо же содержат такую мутазу и благодаря активности мутазы 3-гидроксикарбоновых кислот-CoA способны во внутриклеточной среде преобразовывать эфиры 3-гидроксикарбонила-CoA, образованные из простых натуральных веществ (из исходных компонентов, например, сахаров, и/или спиртов, и/или органических кислот и их производных), в соответствующие эфиры 2-гидрокси-2-метилкарбонила-CoA.
Способ согласно изобретению отличается, в частности, тем, что микроорганизмы, производящие или включающие в себя кобаламин-зависимую мутазу и обладающие активностью CoA-мутазы 3-гидроксикарбоновой кислоты, используют в водных системах для преобразования 3-гидроксикарбоновых кислот в соответствующие 2- гидрокси-2-метилкарбоновые кислоты.
В предпочтительном варианте способа микроорганизмы, включающие в себя активность CoA-мутазы 3-гидроксикарбоновой кислоты и обладающие как активностью продукции 3-гидроксикарбонил-CoA-тиоэфира, так и изомеризации 3-гидроксикарбонил-CoA-тиоэфира, культивируют в водной системе с воспроизводимым сырьем или отходами, получаемыми из воспроизводимого сырья, в качестве источника углерода и энергии. При этом тиоэфиры 3-гидроксикарбоновых кислот-CoA преобразуют в соответствующие 2-гидрокси-2-метилкарбоновые кислоты. Целесообразно, чтобы реакция шла с добавлением 3-гидроксикарбоновой кислоты извне. Затем соответствующую 2-гидрокси-2-метилкарбоновую кислоту выделяют как кислоту или в форме ее солей.
Этот новый биотехнологический способ, использующий получение 3-гидроксикарбоновых кислот из простых натуральных веществ и их изомеризацию в 2-гидрокси-2-метилкарбоновые кислоты, в состоянии решить вышеуказанную проблему.
В предпочтительном варианте изобретения способ включает в себя следующие этапы:
(a) В надлежащей биологической системе, обладающей активностью синтеза эфиров 3-гидроксикарбонила-CoA и активностью мутазы, осуществляют производство 3-гидроксикарбоновых кислот из простых натуральных веществ и последующее их преобразование в 2-гидрокси-2-метилкарбоновые кислоты и
(b) Выделение 2-гидрокси-2-метилкарбоновых кислот в виде свободных кислот или их соответствующих солей.
Полученные таким образом 2-гидрокси-2-метилкарбоновые кислоты целесообразно использовать для производства ненасыщенных изоалкеновых кислот с 2-3 атомами углерода (метакриловая кислота и гомологичные ей соединения), что можно осуществлять путем дегидратации кислот, синтезированных на этапах (а) и (b), или их соответствующих солей. Эти реакции представлены ниже:
Простые природные вещества (например, поспроизводимое сырье или отходы переработки воспроизводимого сырья, как, например, сахара, органические кислоты или спирты) → 3-гидроксикарбоновые кислоты → 2-гидрокси-2-метилкарбоновые кислоты (например, посредством штамма НСМ-10)
2-гидрокси-2-метилкарбоновые кислоты → метакриловая кислота и ее гомологи (например, в присутствии NaOH и при температуре 185°С).
Условия реакции (значение рН, концентрация ионов (ионная сила), потребность в кислороде и двуокиси углерода, микроэлементы, температуры и т.п.) выбирают, разумеется, так, чтобы микроорганизмы были способны оптимальным образом преобразовывать 3-гидроксикарбоновые кислоты в 2-гидрокси~2-метилкарбоновые кислоты. В таких условиях процесса кобаламин-зависимая мутаза обладает в естественном микроокружении, то есть в клетке, более высокой стабильностью и эффективностью, чем изолированный фермент. Кроме того, при надлежащих условиях может быть возможно размножение клеток и, следовательно, повышение концентрации мутазы. Таким образом, ферментативное преобразование с помощью микроорганизмов может означать существенное преимущество в том, что касается надежности, пригодности к автоматизации, простоты, а также качества и выхода конечного продукта процесса.
Для ферментативного преобразования 3-гидроксикарбоновых кислот в 2-гидрокси-2-метилкарбоновые кислоты согласно изобретению систему, обладающую активностью мутазы 3-гидроксикарбоновой кислоты-CoA, то есть кобаламин-зависимую мутазу, предпочтительно в сочетании с активностью синтеза CoA-эфиров, можно также вводить в реакционный раствор в очищенной, обогащенной и/или выделенной форме, причем ферменты могут быть, например, природного происхождения. Разумеется, ферменты могут представлять собой произведенные рекомбинантным способом ферменты из генетически модифицированного организма.
В способе согласно изобретению ферменты используют в рамках изобретения в качестве катализаторов как в форме интактных микробных клеток, так и в форме микробных клеток с повышенной проницаемостью. Кроме того, существуют возможности применения в форме компонентов (одного или нескольких) клеточных экстрактов, но также и в частично очищенной или очищенной форме. При необходимости, согласно изобретению применяют ферменты, синтезирующие CoA-эфиры, например, CoA-трансферазу или CoA-синтетазы. Ферментативные катализаторы могут быть иммобилизованы или же прикреплены к растворенному или нерастворенному материалу-носителю.
В предпочтительном варианте исполнения определенные клеточные компартменты или их части отделяют друг от друга или объединяют друг с другом, то есть углеводные структуры, липиды или белки и/или пептиды, а также нуклеиновые кислоты, которые в состоянии положительно или отрицательно повлиять на систему, обладающую мутазной активностью, можно сочетать между собой или разделять. Чтобы осознанно использовать такой способ воздействия, из микроорганизмов известным в отрасли способом получают, например, сырые экстракты, которые, при необходимости, центрифугируют, чтобы иметь возможность провести реакцию согласно изобретению с осадком или жидкой фракцией.
3-Гидроксикарбоновые кислоты (как, например, 3-гидроксимасляная кислота) или, точнее говоря, их внутриклеточные CoA-тиоэфиры 3-гидроксикарбонила-CoA можно легко получать из простых природных веществ посредством разнообразных бактериальных штаммов. Эти кислоты представляют собой компоненты (мономеры) для широко распространенного бактериального вещества поли-3-гидроксиалканоата, являющегося запасом углерода и энергии. Перемещения углерода в пределах «каркаса» карбоновых кислот также широко распространены как в бактериальных, так и в других биологических системах. До сих пор, однако, не удавалось обнаружить биологическую систему для преобразования эфиров 3-гидроксикарбонила-CoA в соответствующие эфиры 2-гидрокси-2-метилкарбонила-CoA. Изобретение основано на том неожиданном открытии, что система с активностью кобаламин-зависимой мутазы обладает обоими этими свойствами.
Микроорганизмы, содержащие кобаламин-зависимые мутазы, это, например, Methylibium petroleiphilum PM1, Methylibium sp. R8 (Собрание штаммов UFZ Лейпциг), β-протеобактериальный штамм НСМ-10, Xanthobacter autotrophicus Py2, Rhodobacter sphaeroides (ATCC 17029) или Nocardioides sp. JS614.
Подходящую биологическую систему, которой можно отдать предпочтение, нашли в штамме НСМ-10. Согласно Будапештскому Договору о складировании микроорганизмов для целей патентования, 13.03.2006 он был размещен в Германском собрании микроорганизмов и клеточных культур ГмбХ в Брауншнвейге, Германия, под № DSM 18028.
С использованием этой предпочтительной биологической системы удалось добиться особенно высокого выхода 2-гидрокси-2-метилкарбоновых кислот, особенно 2-гидроксиизомасляной кислоты. Тем не менее ферментативное преобразование посредством микроорганизмов ни в коем случае не ограничивается этим штаммом. Все организмы, которые в состоянии преобразовывать 3-гидроксикарбоновые кислоты в 2-гидрокси-2-метилкарбоновые кислоты, можно применять согласно изобретению.
Это могут быть микроорганизмы, которые, во-первых, обладают одним и тем же геном или генетическим продуктом, или же, с другой стороны, имеют аналогичный ген, ведущий к образованию генетических продуктов с подобной или аналогичной активностью. Т.е. активность 3-гидроксикарбонил-CoA-мутазы другого происхождения также охватывается настоящим изобретением. Равным образом, в изобретение также включены трансформированные системы, которые обладают такой же или подобной активностью 3-гидроксикарбонил-CoA-мутазы, что и штамм НСМ-10 или таковой иного происхождения.
К таковым могут относиться мутанты, генетически модифицированные и изолированные производные микроорганизмов, например, организмы, которые обладают желательной кобаламин-зависимой мутазной активностью вследствие введения нуклеотидной последовательности, кодирующей мутазу.
Предпочтительно применяемая биологическая система (Stamm НСМ-10 - DSM 18028) синтезирует эфиры 3-гидроксикарбонила-CoA в виде тиоэфиров из простых природных веществ, например сахаров, и/или органических кислот, и/или спиртов и их производных. В применяемой здесь предпочтительной системе эфиры 3-гидроксикарбонила-CoA с помощью кобаламин-зависимой мутазы, перестраивающей углеродный каркас, преобразуют в эфиры 2-гидрокси-2-метилкарбонила-CoA, как это показано в уравнении 1 на примере (R)-3-гидроксибутирила-CoA. Тиоэфир-CoA гидролизуется в системе, а кислота выделяется в среду культивации.
Для способа согласно изобретению в качестве предпочтительных ферментативных катализаторов применяют содержащие кобаламин-зависимые мутазы штаммы микроорганизмов НСМ-10 (DSM 18028), Xanthobacter autotrophicus Py2, Rhodobacter sphaeroides (ATCC 17029) или Nocardioides sp. JS614, их сырые экстракты или части. Применяемые согласно изобретению штаммы предпочтительно производят белки (кобаламин-зависимые мутазы) с последовательностями SEQ ID NO: 2 и/или SEQ ID NO: 4 либо же включают в себя последовательности нуклеиновых кислот SEQ ID NO: 1 и/или SEQ ID NO: 3 (HCM-10), производят белки с последовательностями SEQ ID NO: 5 и/или SEQ ID NO: 6 либо же включают в себя последовательности нуклеиновых SEQ ID NO: 7 и/или SEQ ID NO: 8 (Xanthobacter autotrophicus Py2), производят белки с последовательностями SEQ ID NO: 9 и/или SEQ ID NO: 10 либо же включают в себя последовательности нуклеиновых SEQ ID NO: 11 и/или SEQ ID NO: 12 (Rhodobacter sphaeroides ATCC 17029) или производят белки с последовательностями SEQ ID NO: 13 и/или SEQ ID NO: 14 либо же включают в себя последовательности нуклеиновых SEQ ID NO: 15 и/или SEQ ID NO: 16 (Nocardioides sp. JS614). В смысле изобретения указанные белки можно также применять в обогащенной, изолированной форме или изготовленные синтетическим путем.
Еще в одном предпочтительном варианте исполнения ферментативные катализаторы, в частности микроорганизмы, экстракты из них или их части и/или обогащенные или изолированные ферменты применяют в иммобилизованном виде. Путем иммобилизации ферменты, клеточные органеллы и клетки переводят в нерастворимое состояние, ограничивая их реакционным пространством. Их можно, например, иммобилизовать в полимерном матриксе (например, в гелях на основе альгинатов, поливиниловых спиртов или полиакриламида). Иммобилизацию можно также проводить на растворенных или нерастворенных материалах-носителях (например, Celit) в целях облегчения повторного извлечения и использования катализатора. Методы иммобилизации клеток в полимерном матриксе или на растворенном или нерастворенном носителе известны специалисту и были подробно описаны. Ферментативную активность также можно выделить из клеток. В этом случае ее можно непосредственно применять в иммобилизованном в полимерном матриксе или на растворенном или нерастворенном носителе виде как катализатор. Необходимые для этого методики известны специалисту и описаны, например, в Methods in Biotechnology, Bd. 1: Immobilization of enzymes and cells, Herausgeber: G.F.Bickerstaff, Humana Press, Totowa, New Jersey, 1997.
Преобразование 3-гидроксикарбоновых кислот в 2-гидрокси-2-метилкарбоновые кислоты предпочтительно проводить в рамках непрерывного процесса, который можно реализовывать в проточном реакторе, где происходит рост микробов и, следовательно, образование продукта. Под непрерывным процессом можно, однако, подразумевать и любую систему растущих клеток и катализирующих ферментов, в которую с одной стороны подают питательный раствор и из которой, с другой стороны, отделяют раствор культуры, включая синтезированную ферментативным способом 2-гидрокси-2-метилкарбоновую кислоту. Согласно изобретению способ можно также реализовывать полунепрерывным или периодическим образом.
Как уже сказано, 3-гидроксикарбоновую кислоту, которая представляет собой исходное вещество для 2-гидрокси-2-метилкарбоновой кислоты, синтезируют предпочтительно путем ферментативного преобразования углеводов, и/или органических кислот, и/или спиртов или их производных. В связи с изобретением, помимо кобаламин-зависимой мутазы при необходимости применяют прочие ферменты, синтезирующие эфиры CoA, которые наличествуют в микроорганизмах или которые туда добавляют. При этом преобразование углеводов, и/или органических кислот, и/или спиртов или их производных в 3-гидроксикарбоновую кислоту и из 3-гидроксикарбоновой кислоты в 2-гидрокси-2-метилкарбоновую кислоту в рамках одного единственного этапа способа, т.е. преобразование исходных субстратов до 3-гидроксикарбоновой кислоты и ферментативная реакция преобразования 3-гидроксикарбоновой кислоты в соответствующую 2-гидрокси-2-метилкарбоновую кислоту проходят в одном и том же реакционном растворе одновременно или с небольшим сдвигом во времени.
В крайне предпочтительном варианте исполнения способа для культивирования применяют субстрат с трет-бутиловым остатком в качестве источника углерода и энергии, предпочтительно, чтобы единственным источником углерода и энергии в базальной среде был трет-бутиловый спирт.
Способ согласно изобретению целесообразно применять для производства 2-гидрокси-2-метилпропановой кислоты (2-гидроксимасляной кислоты). Предпочтительный вариант синтеза 2-гидроксимасляной кислоты, кроме того, отличается тем, что извне добавляют 3-гидроксимасляную кислоту.
Способ можно реализовывать в аэробных условиях, предпочтительно - при использовании целых клеток, либо же в анаэробных, например, в условиях азотной атмосферы, предпочтительно - при использовании экстрактов или очищенных ферментов.
Также изобретение касается молекул нуклеиновых кислот, кодирующих фермент с активностью кобаламин-зависимой мутазы, выбранных из групп, состоящих из:
a) Молекул нуклеиновых кислот, которые кодируют белок, включающий последовательности нуклеиновых кислот, приведенные под номерами Seq №2 и/или Seq №4;
b) Молекул нуклеиновых кислот, содержащих последовательность нуклеотидов, представленную под Seq №1 и/или Seq №3.
Было продемонстрировано, что фермент согласно изобретению предпочтительно представляет собой гетеродимерный протеин, включающий в себя субъединицы, описанные Seq №2 и/или Seq №4, и обладает, таким образом, выдающейся ферментативной активностью.
Молекула нуклеиновой кислоты может представлять собой молекулу ДНК, предпочтительно - комплементарной (кДНК) или геномной ДНК и/или молекулу РНК. Как нуклеиновые кислоты, так и белки можно выделять из природных источников, предпочтительно из DSM 18028, но также, например, из Methylibium petroleiphilum PM 1, Methylibium sp. R8 (Собрание штаммов UFZ Лейпциг), Xanthobacter autotrophicus Py2, Rhodobacter sphaeroides (ATCC 17029) или Nocardioides sp. JS614, либо же их можно синтезировать известными способами.
В применяемых согласно изобретению молекулах нуклеиновых кислот с помощью известных как таковых молекулярно-биологических методик можно вызывать мутации, что дает возможность синтезировать прочие ферменты с аналогичными или подобными свойствами, которые также применяют в способе согласно изобретению. Мутации могут представлять собой делеции, ведущие к образованию укороченных ферментов. Посредством иных молекулярных механизмов, как, например, инсерций, дупликаций, транспозиций, слияния генов, замены нуклеотидов или трансфера генов между различными штаммами микроорганизмов также можно создать модифицированные ферменты с аналогичными или подобными свойствами.
Идентификацию и выделение таких молекул нуклеиновых кислот можно проводить с применением молекул нуклеиновых кислот или их частей. Молекулы, подвергаемые гибридизации с молекулами нуклеиновых кислот, включают в себя также фрагменты, производные или аллельные варианты описанных выше молекул нуклеиновых кислот, кодирующих фермент, пригодный к применению согласно изобретению. Под фрагментами при этом подразумевают части молекул нуклеиновых кислот, которые обладают достаточной длиной, чтобы кодировать описанный фермент. Под производными подразумевают последовательности этих молекул, которые отличаются от последовательностей вышеописанных молекул нуклеиновых кислот в одном или нескольких положениях, но демонстрируют высокую степень гомологичности этим последовательностям. Гомологичность при этом означает идентичность последовательностей по меньшей мере на 40%, в частности, идентичность по меньшей мере на 60%, предпочтительно, более 80%, а особо предпочтительно, более 90%, 95%, 97% или 99% на уровне нуклеиновых кислот. При этом кодируемые ферменты демонстрируют идентичность приведенным последовательностям аминокислот по меньшей мере на 60%, предпочтительно, по меньшей мере на 80%, особо предпочтительно, по меньшей мере на 95%, крайне предпочтительно, по меньшей мере на 99% на уровне аминокислот. Отклонения могут возникать по причине делеций, замещений (субституций), вставок (инсерций) или рекомбинации. При этом речь может идти о появляющихся естественным путем вариациях, например, о последовательностях из других организмов, или же о мутациях, причем эти мутации могут возникать естественным путем или посредством направленного мутагенеза (УФ-излучение, рентгеновские лучи, химические средства и т.п.). Кроме того, эти варианты могут представлять собой последовательности, созданные синтетическим путем. Эти варианты обладают определенными общими чертами, как, например, активностью фермента, активной концентрацией фермента, субъединицами, функциональными группами, иммунологической реактивностью, конформацией и/или физическими свойствами, как то: пробегом в гель-электрофорезе, хроматографическими признаками, растворимостью, коэффициентами седиментации, оптимальным значением рН, оптимальным значением температуры, спектроскопическими свойствами, стабильностью и/или иными свойствами.
Кроме того, объектом изобретения являются также новые белки с последовательностью №2 и 4, а также гетеродимерный белок, включающий последовательность №2 и последовательность №4, а также таковые, гомологичные ему по меньшей мере на 99%.
SEQ ID NO: 1 демонстрирует включающую 1644 пар оснований последовательность нуклеотидов большой субъединицы кобаламин-зависимой мутазы из штамма DSM 18028.
SEQ ID NO: 2 демонстрирует включающую 548 аминокислот последовательность аминокислот большой субъединицы кобаламин-зависимой мутазы из штамма DSM 18028.
SEQ ID NO: 3 демонстрирует 369 пар оснований частичной последовательности нуклеотидов малой субъединицы кобаламин-зависимой мутазы из штамма DSM 18028.
SEQ ID NO: 4 демонстрирует включающую 123 аминокислоты частичную последовательность [малой] субъединицы кобаламин-зависимой мутазы из штамма DSM 18028.
SEQ ID NO: 5 и 6 демонстрируют включающие 562 или 135 аминокислот, соответственно, последовательности кобаламин-зависимой мутазы из Xanthobacter autotrophicus Py2.
SEQ ID NO: 7 и 8 демонстрируют 1689 или же 408 пар оснований, соответственно, последовательности нуклеотидов кобаламин-зависимых мутаз из Xanthobacter autotrophicus Py2.
SEQ ID NO: 9 и 10 демонстрируют включающие 563 или 135 аминокислот, соответственно, последовательности кобаламин-зависимой мутазы из АТСС 17029.
SEQ ID NO: 11 и 12 демонстрируют 1692 или 408 пар оснований, соответственно, последовательности нуклеотидов кобаламин-зависимых мутаз из Rhodobacter sphaeroides ATCC 17029.
SEQ ID NO: 13 и 14 демонстрируют включающие 569 или 164 аминокислот, соответственно, последовательности кобаламин-зависимой мутазы из Nocardoides sp. JS614.
SEQ ID NO: 15 и 16 демонстрируют 1710 или 495 пар оснований, соответственно, последовательности нуклеотидов кобаламин-зависимых мутаз из Nocardoides sp. JS614.
Gjkextyyst согласно изобретению 2-гидрокси-2-метилкарбоновые кислоты можно выделять, обрабатывая среду культуры посредством известных способов (после удаления нерастворенных компонентов, как, например, микробных клеток). Такими способами являются, помимо прочего, концентрированно, ионообмен, дистилляция, электродиализ, экстракция и кристаллизация. Продукт можно выделять в виде соли или (после подкисления) в виде протонированной 2-гидрокси-2-метилкарбоновой кислоты.
2-Гидрокси-2-метилкарбоновые кислоты (или их соответствующие соли) можно дегидратировать до соответствующих ненасыщенных 2-метилкарбоновых кислот целым рядом способов. Для получения ненасыщенных изоалкеновых кислот с 2-3 атомами углерода полученные 2-гидрокси-2-метилкарбоновые кислоты дегидратируют с помощью известных из уровня техники способов. Дегидратацию 2-гидрокси-2-метилкарбоновых кислот можно проводить с использованием оксидов металлов, гидроксидов металлов, ионообменных смол, глинозема, диоксида кремния, аминов, фосфинов, алкоксидов и карбоксилатов щелочных металлов. Обычно температура реакции находится между 160°С и 250°С. Так, например, синтез метакриловой кислоты осуществляют путем дегидратации 2-гидроксиизомасляной кислоты в присутствии NaOH, при температуре ок. 185°С.
Полученная по этому процессу метакриловая кислота и ее гомологи находят целесообразное применение в различных отраслях промышленности, например, как добавки, либо же в лакокрасочных материалах. В отличие от известных до сих пор способов, в настоящем способе объединены желаемые преимущества низкотемпературного процесса, применения безвредных для окружающей среды исходных компонентов и сниженного образования отходов.
Ниже приведено более подробное описание изобретения на основании примеров исполнения, которыми оно, однако, не ограничено.
Материалы и методы
Микробный ферментативный катализатор
Микробные клетки штамма НСМ-10 (DSM 18028), обладающие активностью продукции 3-гидроксикарбонила-CoA-эфиров и изомеризации эфиров 3-гидроксикарбонила-CoA, или изолированные из них субъединицы белков с последовательностями №2 и №4.
Рост микробного ферментативного катализатора
Микробный штамм, используемый для производства 2-гидрокси-2-метилкарбоновых кислот, выделяли, как это описано ниже. Культуры штамма хранили в 20%-ном растворе глицерина в жидком азоте.
Штамм НСМ-10 из грунтовых вод обогащали трет-бутиловым спиртом в качестве единственного источника углерода и энергии на базальной среде (табл.1). Филогенетически штамм принадлежит к группе Rubrivivax-Leptothrix.
| Таблица 1 | |||
| Базальная среда (мг/л) | |||
| NH4Cl | 761,4 | Биотин | 0,02 |
| KH2PO4 | 340,25 | Фолиевая кислота | 0,02 |
| K2HPO4 | 435,45 | Пиридоксин-HCl | 0,1 |
| CaCl2×6H2O | 5,47 | Тиамин-HCl | 0,05 |
| MgSO4×7H2O | 71,2 | Рибофлавин | 0,05 |
| ZnSO4×7H2O | 0,44 | Никотиновая кислота | 0,05 |
| MnSO4×H2O | 0,615 | DL-Ca-пантотенат | 0,05 |
| CuSO4×5H2O | 0,785 | парааминобензойная кислота | 0,05 |
| CoCl2 ×6H2O | 0,2 | Липоновая кислота | 0,05 |
| Na2MoO4×2H2O | 0,252 | ||
| FeSO4×7H2O | 4,98 | pH | 7,0 |
Штамм НСМ-10 растили в аэробных условиях, подробности указаны в табл.2, для испытания на активность 3-гидроксикарбонил-CoA-мутазы.
| Таблица 2 | ||||
| Штамм | Субстрат | Среда | Температура, °С | Продолжительность, сут |
| НСМ-10 | Трет-бутиловый спирт (0,5 г/л) | Базальная среда | 25 | 7 |
Клетки высаживали непосредственно после сбора. Интактные клетки можно было применять без дальнейшей предварительной обработки, как, например, повышения проницаемости (пермеабилизации) мембраны. Кроме того, клетки можно было применять после пермеабилизации (например, посредством обработки толуолом, ПАВ или после ряда циклов замораживания-оттаивания), что имело целью повысить скорость диффузионного транспорта веществ в клетки и из них.
Концентрацию 2-гидроксиизомасляной кислоты и 3-гидроксимасляной кислоты в жидкости или в реакционной емкости определяли с помощью газовой хроматографии после кислого метанолиза, применяя колонку FFAP и детектор FID.
Пример 1
Преобразование 3-гидроксимасляной кислоты в 2-гидроксиизомасляную кислоту штаммом НСМ-10.з
Суспензию из 1 г (сухая масса) клеток штамма НСМ-10 в 100 мл базальной среды поместили во флаконы для сыворотки емкостью 120 мл. В эту суспензию добавили 50 мг 3-гидроксимасляной кислоты и инкубировали суспензию на вращающемся встряхивающем устройстве при 30°С. По прошествии 0,3 часа инкубации в аэробных условиях суспензию продули азотом и инкубировали еще 4,4 часа при 30°С со встряхиванием. В различные моменты времени проводили отбор проб и после центрифугирования суспензии определяли содержание 2-гидроксиизомасляной кислоты и 3-гидроксимасляной кислоты в не содержащем клеток супернатанте. Было обнаружено, что 2-гидроксиизомасляная кислота является единственным продуктом, выделяющимся в анаэробной фазе. В начальной аэробной фазе, напротив, была полностью израсходована 3-гидроксимасляная кислота (Фиг.1). Выход 2-гидроксиизомасляной кислоты в этом случае составлял 5,1%, ок. 80% 3-гидроксимасляной кислоты остается в реакционной жидкости.
Пример 2
Преобразование 3-гидроксимасляной кислоты в 2-гидроксиизомасляную кислоту сырым экстрактом штамма НСМ-10
Не содержащий клеток экстракт штамма НСМ-10 создали после разрушения клеток в шаровой мельнице, фрагменты клеток затем отделили центрифугированием. Не содержащий клеток экстракт с концентрацией 10 мг белка в 5 мл калиево-фосфатного буферного раствора (50 мМ, содержит 1 мМ MgCl2 при рН 7,2) поместили в закрывающиеся стеклянные сосуды емкостью 10 мл. Затем к этому экстракту добавили 0,01 мМ кофермента В12, 1 мМ коэнзима-А, 1 мМ АТФ и 4,25 мг 3-гидроксимасляной кислоты. Реакционную жидкость продули азотом, реакционный сосуд герметически закрыли и инкубировали со встряхиванием 2 часа при 30°С. Анализ продуктов реакции проводили так, как описано выше. Выход 2-гидроксиизомасляной кислоты в этом случае составлял 9%, ок. 88% 3-гидроксимасляной кислоты остается в реакционной жидкости (Фиг.2).
Пример 3
Дегидратация 2-гидроксиизомасляной кислоты до метакрилата
В раствор 2-гидроксиизомасляной кислоты (1 мг/5 мл), изготовленной согласно процедуре, описанной в примере 2, перемешивая, добавили NaOH (0.06 мг). Раствор, перемешивая и охлаждая флегмой, инкубировали при 185-195°С в вакууме (300 торр). На протяжении 5 часов ежечасно добавляли еще по одной аликвоте в размере 0,5 мг 2-гидроксиизомасляной кислоты на 5 мл, эти аликвоты дополнительно содержали 0,4% пара-метоксифенола по массе, что должно было воспрепятствовать полимеризации метакрилата. После инкубации в течение 24 часов реакцию завершили. Преобразование 2-гидроксиизомасляной кислоты в метакрилат составило 97%. Метакриловую кислоту отделяли от реакционной среды дистилляцией.
Claims (24)
1. Способ ферментативного получения 2-гидрокси-2-метилкарбоновых кислот из 3-гидроксикарбоновых кислот, отличающийся тем, что 3-гидроксикарбоновую кислоту синтезируют в водном реакционном растворе, который содержит единицу, обладающую активностью CoA-мутазы 3-гидроксикарбоновой кислоты и обладающую как активностью продукции 3-гидроксикарбонил-CoA-эфира, так и изомеризации 3-гидроксикарбонил-CoA-эфира, причем эту единицу выбирают из группы, включающей выделенную кобаламин-зависимую мутазу, фермент или систему ферментов, производящие эфиры 3-гидроксикарбонила-CoA, микроорганизм или его сырой экстракт, и/или добавляют ее к указанному реакционному раствору, инкубируют, а затем получают соответствующим образом преобразованную 2-гидрокси-2-метилкарбоновую кислоту в виде кислоты или в форме ее солей.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что микроорганизмы, производящие или включающие в себя кобаламин-зависимую мутазу, обладающие активностью CoA-мутазы 3-гидроксикарбоновой кислоты и обладающие как активностью продукции 3-гидроксикарбонил-CoA-эфира, так и изомеризации 3-гидроксикарбонил-CoA-эфира, используют в водных системах для преобразования 3-гидроксикарбоновых кислот в соответствующие 2-гидрокси-2-метилкарбоновые кислоты.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что
a) микроорганизмы, с активностью CoA-мутазы 3-гидроксикарбоновой кислоты и обладающие как активностью продукции 3-гидроксикарбонил-CoA-тиоэфира, так и активностью изомеризации 3-гидроксикарбонил-CoA-тиоэфира, культивируют в водной системе с воспроизводимым сырьем или отходами, получаемыми из воспроизводимого сырья, в качестве источника углерода и энергии, благодаря чему во внутриклеточной среде происходит синтез тиоэфиров 3-гидроксикарбоновых кислот-CoA и их преобразование в соответствующие 2-гидрокси-2-метилкарбоновые кислоты, и
b) соответствующую 2-гидрокси-2-метилкарбоновую кислоту выделяют в виде свободной кислоты или ее соответствующих солей.
a) микроорганизмы, с активностью CoA-мутазы 3-гидроксикарбоновой кислоты и обладающие как активностью продукции 3-гидроксикарбонил-CoA-тиоэфира, так и активностью изомеризации 3-гидроксикарбонил-CoA-тиоэфира, культивируют в водной системе с воспроизводимым сырьем или отходами, получаемыми из воспроизводимого сырья, в качестве источника углерода и энергии, благодаря чему во внутриклеточной среде происходит синтез тиоэфиров 3-гидроксикарбоновых кислот-CoA и их преобразование в соответствующие 2-гидрокси-2-метилкарбоновые кислоты, и
b) соответствующую 2-гидрокси-2-метилкарбоновую кислоту выделяют в виде свободной кислоты или ее соответствующих солей.
4. Способ по п.1, отличающийся тем, что реакция идет при добавлении 3-гидроксикарбоновой кислоты извне.
5. Способ по п.1 или 3, отличающийся тем, что микроорганизм выбирают из бактериального штамма НСМ-10 DSM 18028, Xanthobacter autotrophicus Py2, Rhodobacter sphaeroides (АТСС17029) или Nocardioides sp. JS614.
6. Способ по п.1 или 3, отличающийся тем, что используют цельные клетки микроорганизмов в неизменном виде, после пермеабилизации или в фиксированном на носителе виде.
7. Способ по п.1 или 3, отличающийся тем, что клеточные экстракты и/или кобаламин-зависимую мутазу и, при необходимости, прочие ферменты, как, например, ферменты, синтезирующие эфиры CoA, используют после частичного или полного выделения из микроорганизмов, при необходимости, в очищенном виде.
8. Способ по п.7, отличающийся тем, что применяют не содержащие клеток сырые экстракты микроорганизмов.
9. Способ по п.1, отличающийся тем, что применяют полученные с помощью бактериального штамма кобаламин-зависимые мутазы с последовательностями SEQ ID NO:2 и/или SEQ ID NO:4, с последовательностями SEQ ID NO:5 и/или SEQ ID NO:6, белки с последовательностями SEQ ID NO:9 и/или ID NO:10 или белки с последовательностями SEQ ID NO:13 и/или SEQ ID NO:14, а также белки, гомологичные им по меньшей мере на 80%.
10. Способ по п.3, отличающийся тем, что в качестве источника углерода и энергии для ферментативной переработки во время культивации применяют сахар, и/или спирт, и/или органическую кислоту, и/или углеводород, и/или их производные.
11. Способ по п.3, отличающийся тем, что для культивирования применяют субстрат с трет-бутиловым остатком в качестве источника углерода и энергии.
12. Способ по п.3, отличающийся тем, что трет-бутиловый спирт используют как единственный источник углерода и энергии в базальной среде для культивирования.
13. Способ по п.3, отличающийся тем, что ферментативное преобразование сахара, и/или спирта, и/или органической кислоты, и/или углеводорода, или их производных в 3-гидроксикарбоновую кислоту и из 3-гидроксикарбоновой кислоты в 2-гидрокси-2-метилкарбоновую кислоту проводят в рамках одного единственного этапа способа.
14. Способ по п.1, отличающийся тем, что с добавлением 3-гидроксимасляной кислоты в качестве 3-гидроксикарбоновой кислоты извне осуществляют производство 2-гидроксиизомасляной кислоты в качестве 2-гидрокси-2-метилкарбрновой кислоты.
15. Способ по п.1, отличающийся тем, что получаемую 2-гидрокси-2-метилкарбоновую кислоту подвергают дегидратации.
16. Способ по п.15 отличающийся тем, что в качестве 2-гидрокси-2-метилкарбоновой кислоты используют 2-гидроксиизомасляную кислоту.
17. Штамм микроорганизма НСМ-10 - DSM 18028 для получения 2-гидрокси-2-метилкарбоновых кислот.
18. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая фермент с активностью кобаламин-зависимой мутазы, выбранная из группы, состоящей из:
a) молекул нуклеиновых кислот, которые кодируют белок, включающий последовательности аминокислот, приведенные под номерами Seq №2 и/или Seq №4;
b) молекул нуклеиновых кислот, содержащих последовательность нуклеотидов, представленную под Seq №1 и/или Seq №3.
a) молекул нуклеиновых кислот, которые кодируют белок, включающий последовательности аминокислот, приведенные под номерами Seq №2 и/или Seq №4;
b) молекул нуклеиновых кислот, содержащих последовательность нуклеотидов, представленную под Seq №1 и/или Seq №3.
19. Молекула нуклеиновой кислоты по п.18, отличающаяся тем, что она кодирует белок, составленный как олигомерный фермент из двух различных субъединиц, включающий в себя последовательности аминокислот, приведенные под Seq №2 и Seq №4.
20. Молекула нуклеиновой кислоты по п.18 или 19, представляющая собой молекулу ДНК.
21. Молекула нуклеиновой кислоты по п.20, представляющая собой кДНК или геномную ДНК.
22. Молекула нуклеиновой кислоты по п.18 или 19, представляющая собой молекулу РНК.
23. Белок с активностью кобаламин-зависимой мутазы, кодируемый молекулой нуклеиновой кислоты по пп.18 и 19.
24. Белок с активностью кобаламин-зависимой мутазы с последовательностью №2 или с последовательностью №4 или гомологичные ему, по меньшей мере, на 99% или в форме гетеродимерного фермента с указанными последовательностями.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE102006014167.9 | 2006-03-24 | ||
| DE102006014167 | 2006-03-24 | ||
| DE102006017760A DE102006017760A1 (de) | 2006-03-24 | 2006-04-12 | Verfahren zur enzymatischen Herstellung von 2-Hydroxy-2-methylcarbonsäuren |
| DE102006017760.6 | 2006-04-12 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2008142188A RU2008142188A (ru) | 2010-04-27 |
| RU2459871C2 true RU2459871C2 (ru) | 2012-08-27 |
Family
ID=38438483
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2008142188/10A RU2459871C2 (ru) | 2006-03-24 | 2007-03-23 | Способ ферментативного получения 2-гидрокси-2-метилкарбоновых кислот |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US7923225B2 (ru) |
| EP (1) | EP1999264B1 (ru) |
| JP (1) | JP2009538118A (ru) |
| KR (1) | KR20090005052A (ru) |
| AT (1) | ATE467684T1 (ru) |
| AU (1) | AU2007229522A1 (ru) |
| BR (1) | BRPI0709142B1 (ru) |
| CA (1) | CA2653028C (ru) |
| DE (2) | DE102006017760A1 (ru) |
| MX (1) | MX2008012233A (ru) |
| NO (1) | NO20084416L (ru) |
| RU (1) | RU2459871C2 (ru) |
| WO (1) | WO2007110394A2 (ru) |
Families Citing this family (41)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE102006017760A1 (de) * | 2006-03-24 | 2007-09-27 | Ufz-Umweltforschungszentrum Leipzig-Halle Gmbh | Verfahren zur enzymatischen Herstellung von 2-Hydroxy-2-methylcarbonsäuren |
| DE102006025821A1 (de) | 2006-06-02 | 2007-12-06 | Degussa Gmbh | Ein Enzym zur Herstellung von Mehylmalonatsemialdehyd oder Malonatsemialdehyd |
| DE102007060705A1 (de) | 2007-12-17 | 2009-06-18 | Evonik Degussa Gmbh | ω-Aminocarbonsäuren oder ihre Lactame, herstellende, rekombinante Zellen |
| SI2262901T1 (sl) | 2008-03-05 | 2019-02-28 | Genomatica, Inc. | Primarni alkohol producirajoči organizmi |
| JP2011519561A (ja) * | 2008-05-01 | 2011-07-14 | ジェノマティカ， インコーポレイテッド | メタクリル酸の産生のための微生物 |
| DE102008002715A1 (de) * | 2008-06-27 | 2009-12-31 | Evonik Röhm Gmbh | 2-Hydroxyisobuttersäure produzierende rekombinante Zelle |
| DE102008040193A1 (de) | 2008-07-04 | 2010-01-07 | Evonik Röhm Gmbh | Verfahren zur Herstellung freier Carbonsäuren |
| WO2010022763A1 (en) * | 2008-08-25 | 2010-03-04 | Metabolic Explorer | Method for the preparation of 2-hydroxy-isobutyrate |
| DE102009029651A1 (de) | 2009-09-22 | 2011-03-24 | Evonik Röhm Gmbh | Verfahren zur Herstellung freier Carbonsäuren |
| DE102009046623A1 (de) | 2009-11-11 | 2011-05-12 | Evonik Röhm Gmbh | Verwendung eines zu einem MeaB-Protein homologen Proteins zur Erhöhung der enzymatischen Aktivität einer 3-Hydroxycarbonsäure-CoA-Mutase |
| US8445244B2 (en) * | 2010-02-23 | 2013-05-21 | Genomatica, Inc. | Methods for increasing product yields |
| DE102010015807A1 (de) | 2010-04-20 | 2011-10-20 | Evonik Degussa Gmbh | Biokatalytisches Oxidationsverfahren mit alkL-Genprodukt |
| EP2633038B1 (en) * | 2010-10-28 | 2017-04-05 | Adisseo France S.A.S. | A method of production of 2,4-dihydrobutyric acid |
| CA2842000A1 (en) | 2011-07-20 | 2013-01-24 | Evonik Degussa Gmbh | Oxidation and amination of primary alcohols |
| EP2602328A1 (de) | 2011-12-05 | 2013-06-12 | Evonik Industries AG | Verfahren zur Oxidation von Alkanen unter Verwendung einer AlkB Alkan 1-Monooxygenase |
| EP2607479A1 (en) | 2011-12-22 | 2013-06-26 | Evonik Industries AG | Biotechnological production of alcohols and derivatives thereof |
| EP2607490A1 (de) | 2011-12-22 | 2013-06-26 | Evonik Industries AG | Verfahren zur verbesserten Abtrennung einer hydrophoben organischen Lösung von einem wässrigen Kulturmedium |
| EP2631298A1 (en) | 2012-02-22 | 2013-08-28 | Evonik Industries AG | Biotechnological method for producing butanol and butyric acid |
| EP2639308A1 (de) | 2012-03-12 | 2013-09-18 | Evonik Industries AG | Enzymatische omega-Oxidation und -Aminierung von Fettsäuren |
| EP2647696A1 (de) | 2012-04-02 | 2013-10-09 | Evonik Degussa GmbH | Verfahren zur aeroben Herstellung von Alanin oder einer unter Verbrauch von Alanin entstehenden Verbindung |
| DE102012207921A1 (de) | 2012-05-11 | 2013-11-14 | Evonik Industries Ag | Mehrstufiges Syntheseverfahren mit Synthesegas |
| EP2674489A1 (en) * | 2012-06-15 | 2013-12-18 | Evonik Industries AG | Biotechnological 2-hydroxyisobutyric acid production |
| ES2531144T3 (es) | 2012-09-07 | 2015-03-11 | Evonik Industries Ag | Composiciones curables a base de resinas epoxídicas sin alcohol bencílico |
| DK2848694T3 (en) | 2012-09-10 | 2018-09-03 | Mitsubishi Chem Corp | METHOD OF PREPARING METHACRYLIC ACID ESTES |
| BR112015004355A8 (pt) | 2012-09-10 | 2018-01-02 | Mitsubishi Rayon Co | Método para produção de ácido metacrílico e/ou éster do mesmo |
| DE102012216904A1 (de) | 2012-09-20 | 2014-03-20 | Helmholtz-Zentrum Für Umweltforschung Gmbh - Ufz | Verfahren zur Isomerisierung von (R)-3-Hydroxycarbonsäuren zu 2-Hydroxy-2-methylcarbonsäuren |
| EP2746397A1 (de) | 2012-12-21 | 2014-06-25 | Evonik Industries AG | Herstellung von Omega-Aminofettsäuren |
| EP2759598A1 (de) | 2013-01-24 | 2014-07-30 | Evonik Industries AG | Verfahren zur Herstellung von alpha, omega-Alkandiol |
| DE102013202106A1 (de) | 2013-02-08 | 2014-08-14 | Evonik Industries Ag | Autotrophe Kultivierung |
| DE102014201579B4 (de) * | 2013-02-13 | 2017-06-14 | Ford Global Technologies, Llc | Brennkraftmaschine mit selektivem Katalysator zur Reduzierung der Stickoxide und Verfahren zum Betreiben einer derartigen Brennkraftmaschine |
| EP3029145B1 (en) | 2013-08-01 | 2020-05-13 | Mitsubishi Chemical Corporation | Method for producing methacrylyl-coa |
| JP6202772B2 (ja) | 2013-08-26 | 2017-09-27 | スティヒティング ディーンスト ランドバウクンディフ オンデルズーク | メタクリル酸の生成のためのプロセス |
| DE102014201384A1 (de) | 2014-01-27 | 2015-07-30 | Evonik Industries Ag | Verfahren umfassend eine Kultivierung unter niedriger Gelöstsauerstoffkonzentration |
| AU2015225348B2 (en) | 2014-03-07 | 2017-06-08 | Mitsubishi Chemical Corporation | Method for producing methacrylic acid ester, and novel methacrylic acid ester synthase |
| DE102015201531A1 (de) | 2014-04-14 | 2015-10-15 | Helmholtz-Zentrum Für Umweltforschung Gmbh - Ufz | Verfahren zur Änderung der Spezifität einer Cobalamin-abhängigen 2-Hydroxyisobutryl-CoA-Mutase |
| DE102014218121A1 (de) | 2014-09-10 | 2016-03-10 | Helmholtz-Zentrum Für Umweltforschung Gmbh - Ufz | Verfahren zur enzymatischen Herstellung von 2-Hydroxycarbonsäuren |
| WO2016210281A1 (en) * | 2015-06-25 | 2016-12-29 | Dynamic Food Ingredients Corporation | Method for the production of 2,4-dihydroxybutyric acid |
| JP6800019B2 (ja) | 2015-10-23 | 2020-12-16 | ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア | メチルメタクリレートの生物生産 |
| CN111699260A (zh) | 2018-02-01 | 2020-09-22 | 英威达纺织（英国）有限公司 | 用于生物合成β羟基脂肪酸阴离子和/或其衍生物和/或与其相关的化合物的方法和材料 |
| CN116529317A (zh) * | 2020-12-24 | 2023-08-01 | 雀巢产品有限公司 | 通过角质酶和脂肪酶的组合进行的聚氨酯的酶促再循环 |
| JP2024500686A (ja) * | 2020-12-24 | 2024-01-10 | ソシエテ・デ・プロデュイ・ネスレ・エス・アー | クチナーゼによる、酵素を使用した再生ポリエチレンテレフタレートリサイクル |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3666805A (en) * | 1965-03-12 | 1972-05-30 | Lonza Ag | Preparation of methacrylic acid |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2926354B2 (ja) * | 1990-06-08 | 1999-07-28 | 三菱レイヨン株式会社 | α―ヒドロキシイソ酪酸の生物学的製造法 |
| JP2959121B2 (ja) | 1990-11-28 | 1999-10-06 | 三菱瓦斯化学株式会社 | メタクリル酸の製造法 |
| US6582943B1 (en) * | 2002-02-05 | 2003-06-24 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Method for producing 2-hydroxyisobutyric acid and methacrylic acid from acetone cyanohydrin |
| JP4040897B2 (ja) | 2002-04-03 | 2008-01-30 | ローランドディー．ジー．株式会社 | プリント基板の分割装置における集塵機構 |
| DE102006017760A1 (de) * | 2006-03-24 | 2007-09-27 | Ufz-Umweltforschungszentrum Leipzig-Halle Gmbh | Verfahren zur enzymatischen Herstellung von 2-Hydroxy-2-methylcarbonsäuren |
| DE102006025821A1 (de) * | 2006-06-02 | 2007-12-06 | Degussa Gmbh | Ein Enzym zur Herstellung von Mehylmalonatsemialdehyd oder Malonatsemialdehyd |
| DE102007015583A1 (de) * | 2007-03-29 | 2008-10-02 | Albert-Ludwigs-Universität Freiburg | Ein Enzym zur Herstellung von Methylmalonyl-Coenzym A oder Ethylmalonyl-Coenzym A sowie dessen Verwendung |
-
2006
- 2006-04-12 DE DE102006017760A patent/DE102006017760A1/de not_active Ceased
-
2007
- 2007-03-23 AU AU2007229522A patent/AU2007229522A1/en not_active Abandoned
- 2007-03-23 DE DE502007003734T patent/DE502007003734D1/de active Active
- 2007-03-23 KR KR1020087025994A patent/KR20090005052A/ko not_active Withdrawn
- 2007-03-23 EP EP07727304A patent/EP1999264B1/de not_active Not-in-force
- 2007-03-23 CA CA2653028A patent/CA2653028C/en not_active Expired - Fee Related
- 2007-03-23 WO PCT/EP2007/052830 patent/WO2007110394A2/de not_active Ceased
- 2007-03-23 RU RU2008142188/10A patent/RU2459871C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2007-03-23 MX MX2008012233A patent/MX2008012233A/es active IP Right Grant
- 2007-03-23 JP JP2009502050A patent/JP2009538118A/ja active Pending
- 2007-03-23 BR BRPI0709142A patent/BRPI0709142B1/pt not_active IP Right Cessation
- 2007-03-23 US US12/294,308 patent/US7923225B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2007-03-23 AT AT07727304T patent/ATE467684T1/de active
-
2008
- 2008-10-21 NO NO20084416A patent/NO20084416L/no not_active Application Discontinuation
-
2010
- 2010-11-19 US US12/950,752 patent/US8349596B2/en not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3666805A (en) * | 1965-03-12 | 1972-05-30 | Lonza Ag | Preparation of methacrylic acid |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| A.BANERJEE et al., The nitrile-degrading enzymes: current Status and future prospects, Appl. Microbiol. Biotechnol., 2002, Vol.60, p.p.33-44. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| NO20084416L (no) | 2008-12-19 |
| ATE467684T1 (de) | 2010-05-15 |
| WO2007110394A2 (de) | 2007-10-04 |
| US20110165640A1 (en) | 2011-07-07 |
| EP1999264B1 (de) | 2010-05-12 |
| DE502007003734D1 (de) | 2010-06-24 |
| MX2008012233A (es) | 2008-12-10 |
| KR20090005052A (ko) | 2009-01-12 |
| RU2008142188A (ru) | 2010-04-27 |
| EP1999264A2 (de) | 2008-12-10 |
| US7923225B2 (en) | 2011-04-12 |
| AU2007229522A1 (en) | 2007-10-04 |
| WO2007110394A3 (de) | 2008-03-06 |
| DE102006017760A1 (de) | 2007-09-27 |
| US8349596B2 (en) | 2013-01-08 |
| CA2653028C (en) | 2015-05-26 |
| JP2009538118A (ja) | 2009-11-05 |
| CA2653028A1 (en) | 2007-10-04 |
| US20100035314A1 (en) | 2010-02-11 |
| BRPI0709142B1 (pt) | 2017-02-21 |
| BRPI0709142A2 (pt) | 2011-06-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2459871C2 (ru) | Способ ферментативного получения 2-гидрокси-2-метилкарбоновых кислот | |
| CN102317432B (zh) | 巴斯德氏菌科(Pasteurellaceae)的羧酸产生成员 | |
| Tenhaef et al. | Production of D-xylonic acid using a non-recombinant Corynebacterium glutamicum strain | |
| CN109666687B (zh) | 一种生物转化生产鲨肌醇的大肠埃希氏菌工程菌株及其构建方法和应用 | |
| US11760988B2 (en) | L-aspartate alpha-decarboxylase mutant and application thereof | |
| CN109852593A (zh) | 一种重组酮还原酶及在制备r-3-羟基丁酸及其盐中的应用 | |
| CN108410831A (zh) | 酮酸还原酶、基因、工程菌及在合成手性芳香2-羟酸中的应用 | |
| CN119776331A (zh) | 腈水解酶突变体及其在合成布瓦西坦手性中间体中的应用 | |
| KR20210045640A (ko) | 메탄자화균을 이용한 감마-부티르산의 생산 방법 | |
| US7510861B2 (en) | Gluconate dehydratase | |
| CN115873820B (zh) | 一种烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体 | |
| CN116814572A (zh) | 一种羰基还原酶及其突变体及其在制备手性(r)-8-氯-6-羟基辛酸乙酯中的应用 | |
| CN109517778B (zh) | 一种枯草芽孢杆菌全细胞转化苯丙氨酸生产苯乳酸的方法 | |
| CN110358804B (zh) | R-3-氨基正丁醇的酶法生产工艺 | |
| CN101448949A (zh) | 酶促制备2-羟基-2-甲基羧酸的方法 | |
| CN115093977B (zh) | 产富马酸的普鲁兰短梗霉菌株ep01及使用方法 | |
| CN118685378B (zh) | 一种羰基还原酶突变体及其在4-aa手性中间体合成中的应用 | |
| CN119530183B (zh) | 一种突变型双酶催化剂、应用及(s)-玻色因合成方法 | |
| CN111575258B (zh) | 一种羰基还原酶EbSDR8突变体及其构建方法和应用 | |
| Yu et al. | Efficient biocatalytic production of D-4-hydroxyphenylglycine by whole cells of recombinant Ralstonia pickettii | |
| CN120989023A (zh) | 一种烯酸还原酶及其在合成吲哚-3-丙酸中的应用 | |
| CN118374561A (zh) | 酶催化制备化合物的方法以及使用该方法制备n-乙酰神经氨酸、组合物、用途和筛选方法 | |
| CN116769846A (zh) | 一种工程菌株全细胞催化合成没食子酸的方法 | |
| CN115786295A (zh) | 一种l-泛解酸内酯脱氢酶、编码基因及应用 | |
| JP2021153524A (ja) | 有機酸の製造方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20160324 |