RU2458134C1 - Method of producing chondroitin sulphate from sea hydrobiont tissue - Google Patents
Method of producing chondroitin sulphate from sea hydrobiont tissue Download PDFInfo
- Publication number
- RU2458134C1 RU2458134C1 RU2010153884/10A RU2010153884A RU2458134C1 RU 2458134 C1 RU2458134 C1 RU 2458134C1 RU 2010153884/10 A RU2010153884/10 A RU 2010153884/10A RU 2010153884 A RU2010153884 A RU 2010153884A RU 2458134 C1 RU2458134 C1 RU 2458134C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- membrane
- chondroitin sulfate
- solution
- molecular weight
- hydrolysis
- Prior art date
Links
- 229920001287 Chondroitin sulfate Polymers 0.000 title claims abstract description 60
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 15
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims abstract description 25
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 21
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 16
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims abstract description 16
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 claims abstract description 15
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims abstract description 15
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 12
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims abstract description 11
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims abstract description 9
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 claims abstract description 8
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 claims abstract description 8
- 239000012535 impurity Substances 0.000 claims abstract description 5
- 238000005904 alkaline hydrolysis reaction Methods 0.000 claims abstract description 4
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims abstract description 3
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 claims abstract description 3
- 229940079919 digestives enzyme preparation Drugs 0.000 claims abstract description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims abstract 3
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 claims abstract 2
- SQDAZGGFXASXDW-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-2-(trifluoromethoxy)pyridine Chemical compound FC(F)(F)OC1=CC=C(Br)C=N1 SQDAZGGFXASXDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 55
- 229940059329 chondroitin sulfate Drugs 0.000 claims description 55
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 13
- 239000002994 raw material Substances 0.000 claims description 11
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 10
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 claims description 4
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 claims description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 2
- 230000006920 protein precipitation Effects 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 abstract description 2
- 239000000413 hydrolysate Substances 0.000 abstract 1
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 33
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 26
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 15
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 13
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 7
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 7
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 6
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 6
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 6
- 241001529572 Chaceon affinis Species 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 210000000514 hepatopancreas Anatomy 0.000 description 5
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000251730 Chondrichthyes Species 0.000 description 3
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- UJOBWOGCFQCDNV-UHFFFAOYSA-N 9H-carbazole Chemical compound C1=CC=C2C3=CC=CC=C3NC2=C1 UJOBWOGCFQCDNV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000011632 Caseins Human genes 0.000 description 2
- 108010076119 Caseins Proteins 0.000 description 2
- 229920002567 Chondroitin Polymers 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- DLGJWSVWTWEWBJ-HGGSSLSASA-N chondroitin Chemical compound CC(O)=N[C@@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1OC1[C@H](O)[C@H](O)C=C(C(O)=O)O1 DLGJWSVWTWEWBJ-HGGSSLSASA-N 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 2
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 2
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 2
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 2
- 230000007065 protein hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 2
- 108010027350 protosubtilin Proteins 0.000 description 2
- 229940080237 sodium caseinate Drugs 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- ABHQVWCLVQDEKE-UHFFFAOYSA-H 3-[3-acetamido-4-[5-[3-acetamido-4-[5-[3-acetamido-4,5-dihydroxy-6-(sulfonatooxymethyl)oxan-2-yl]oxy-6-carboxylato-3,4-dihydroxyoxan-2-yl]oxy-5-hydroxy-6-(sulfonatooxymethyl)oxan-2-yl]oxy-6-carboxylato-3,4-dihydroxyoxan-2-yl]oxy-5-hydroxy-6-(sulfonatooxym Chemical compound CC(=O)NC1C(O)C(O)C(COS([O-])(=O)=O)OC1OC1C(C([O-])=O)OC(OC2C(C(OC3C(OC(OC4C(C(OC5C(OC(O)C(O)C5O)C([O-])=O)OC(COS([O-])(=O)=O)C4O)NC(C)=O)C(O)C3O)C([O-])=O)OC(COS([O-])(=O)=O)C2O)NC(C)=O)C(O)C1O ABHQVWCLVQDEKE-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000283153 Cetacea Species 0.000 description 1
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 1
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 1
- AEMOLEFTQBMNLQ-AQKNRBDQSA-N D-glucopyranuronic acid Chemical compound OC1O[C@H](C(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-AQKNRBDQSA-N 0.000 description 1
- 108010028690 Fish Proteins Proteins 0.000 description 1
- IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N Galacturonsaeure Natural products O=CC(O)C(O)C(O)C(O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004566 IR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 241000237852 Mollusca Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 241000238124 Paralithodes camtschaticus Species 0.000 description 1
- 238000005903 acid hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 229910001860 alkaline earth metal hydroxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 238000006065 biodegradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 238000005238 degreasing Methods 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 235000021186 dishes Nutrition 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 235000019688 fish Nutrition 0.000 description 1
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 229940097043 glucuronic acid Drugs 0.000 description 1
- 210000003128 head Anatomy 0.000 description 1
- 235000015243 ice cream Nutrition 0.000 description 1
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 210000002184 nasal cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000009965 odorless effect Effects 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000012466 permeate Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 238000001694 spray drying Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 238000000859 sublimation Methods 0.000 description 1
- 230000008022 sublimation Effects 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 230000019635 sulfation Effects 0.000 description 1
- 238000005670 sulfation reaction Methods 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к рыбной промышленности, в частности к способам получения хондроитина сульфата из тканей морских гидробионтов, таких как хрящевая ткань рыб, мышечно-мускульный мешок моллюсков и др., и может быть использовано в пищевой, косметической отраслях промышленности, в медицине.The invention relates to the fishing industry, in particular to methods for producing chondroitin sulfate from tissues of marine aquatic organisms, such as cartilage of fish, muscle and muscle bag of mollusks, etc., and can be used in food, cosmetic industries, in medicine.
Основные свойства хондроитина сульфата, имеющие определяющее значение для его успешного применения в различных областях, - высокая биодоступность, биологическая совместимость, низкая токсичность, способность к избирательному накоплению в ткани хряща (Kofuji К., Ito Т., Murata Y., Kawashima S. Effect of chondroitin sulfate on the biodegradation and drug release of chitosan gel beads in subcutaneous air pouches of mice // Biological and Pharmaceutical Bulletin. - 2002. - Vol.25, No. 2. - P. 268-271). Перечисленные свойства определяются химическим строением молекул хондроитина сульфата, а именно молекулярной массой, степенью и местом сульфатирования. (Michelacci Y. M., Dietrich С.Р. Structure of chondroitin sulphate from whale cartilage: distribution of 6- and 4-sulphated oligosaccharides in the polymer chains // International Journal of Biological Macromolecules. -1986. - Vol.8, No. 2. - P. 108-113. Toida Т., Amornrut C., Linhardt R. J. Structure and bioactivity of sulfated polysaccharides // Trends in Glycoscience and Glycotechnology.-2003.-Vol.15, No. 81.-P. 29-46).The main properties of chondroitin sulfate, which are crucial for its successful application in various fields, are high bioavailability, biological compatibility, low toxicity, and the ability to selectively accumulate in the cartilage tissue (Kofuji K., Ito T., Murata Y., Kawashima S. Effect of chondroitin sulfate on the biodegradation and drug release of chitosan gel beads in subcutaneous air pouches of mice // Biological and Pharmaceutical Bulletin. - 2002. - Vol.25, No. 2. - P. 268-271). The listed properties are determined by the chemical structure of chondroitin sulfate molecules, namely, the molecular weight, degree and place of sulfation. (Michelacci YM, Dietrich C.P. Structure of chondroitin sulphate from whale cartilage: distribution of 6- and 4-sulphated oligosaccharides in the polymer chains // International Journal of Biological Macromolecules. -1986. - Vol.8, No. 2. - P. 108-113. Toida T., Amornrut C., Linhardt RJ Structure and bioactivity of sulfated polysaccharides // Trends in Glycoscience and Glycotechnology.-2003.-Vol.15, No. 81.-P. 29-46) .
Для получения хондроитина сульфата наиболее широко применяется известный способ, предусматривающий растворение хондроитина сульфата в щелочной среде, ферментативный гидролиз белков, отделение высокомолекулярной углеводной фракции осаждением от низкомолекулярных продуктов гидролиза белка, остающихся в растворе, промывку полученного осадка и сушку готового продукта (Takai М., Kono Н. Salmon-origin chondroitin sulfate: European Patent EP 1270599, МПК A61K 31/737. Заявл. 15.12.2000; № EP 20000981747; опубл. 02.01.2003).The most widely used known method for producing chondroitin sulfate is the dissolution of chondroitin sulfate in an alkaline medium, enzymatic hydrolysis of proteins, separation of the high molecular weight carbohydrate fraction by precipitation from low molecular weight protein hydrolysis products remaining in solution, washing the precipitate obtained and drying the finished product (Takai M., Kono H. Salmon-origin chondroitin sulfate: European Patent EP 1270599, IPC A61K 31/737. Declaration 15.12.2000; No. EP 20000981747; publ. 02.01.2003).
Эта общепринятая технология реализуется различными авторами по-разному: изменяется последовательность, количество операций, температурные режимы, природа и концентрации используемых реагентов.This generally accepted technology is implemented by various authors in different ways: the sequence, number of operations, temperature conditions, nature and concentration of the reagents used change.
Наиболее близким техническим решением является способ получения хондроитина сульфата с применением ультрафильтрации (Khare А. В., Houliston S. A., Black Т. J. Isolating chondroitin sulfate: USPTO Application 20070166798. - Заявл. 14.02.2007; №11/674695; опубл. 07/19/2007).The closest technical solution is a method of producing chondroitin sulfate using ultrafiltration (Khare A. B., Houliston SA, Black T. J. Isolating chondroitin sulfate: USPTO Application 20070166798. - Claim. 02.14.2007; No. 11/674695; publ. 07 / 19/2007).
Этот способ получения хондроитина сульфата включает сбор (подготовку) исходного сырья, включающего соединительную ткань, гидролиз исходного сырья протеолитическими ферментными препаратами для получения раствора гидролизата и нерастворенного вещества, обработку жидкого гидролизата реактивом, включающим гидроокись двухвалентного щелочноземельного металла с рН больше 10 для осаждения примеси белка из гидролизата, отделение, по крайней мере, части осадка от раствора гидролизата и обработку жидкого гидролизата с использованием мембраны с образованием фильтрата (пермеата) низкомолекулярных веществ и «задержанного» концентрата, в котором содержится высокомолекулярная фракция - хондроитина сульфат. В патенте предложено использовать мембраны с молекулярно-массовым пределом задерживания от 5 до 15 кДа (лучше от 8 до 10 кДа).This method of producing chondroitin sulfate includes collecting (preparing) the feedstock, including connective tissue, hydrolysis of the feedstock with proteolytic enzyme preparations to obtain a solution of the hydrolyzate and undissolved substance, treating the liquid hydrolyzate with a reagent comprising a divalent alkaline earth metal hydroxide with a pH of greater than 10 to precipitate protein impurities from hydrolyzate, separating at least part of the precipitate from the hydrolyzate solution and treating the liquid hydrolyzate using membranes to form a filtrate (permeate) of low molecular weight substances and the "delayed" concentrate which contains high molecular weight fraction - chondroitin sulphate. The patent proposes the use of membranes with a molecular weight retention limit of 5 to 15 kDa (preferably from 8 to 10 kDa).
Продукт, полученный таким способом, является концентратом, который в числе прочих веществ содержит хондроитин сульфат. Таким образом, степень очистки целевого продукта недостаточно высока.The product obtained in this way is a concentrate which, among other substances, contains chondroitin sulfate. Thus, the degree of purification of the target product is not high enough.
Заявляемый способ также основан на ультрафильтрационном разделении фракций гидролизата с различными молекулярными массами и использует свойство высокомолекулярных молекул хондроитина сульфата отделяться от низкомолекулярных продуктов гидролиза белков на ультрафильтрационных мембранах.The inventive method is also based on ultrafiltration separation of fractions of hydrolyzate with different molecular weights and uses the property of high molecular weight molecules of chondroitin sulfate to separate from low molecular weight products of protein hydrolysis on ultrafiltration membranes.
Технический результат настоящего способа заключается в повышении степени очистки целевого продукта путем использования способности молекул хондроитина сульфата сильно изменять гидродинамический радиус при изменении ионной силы раствора (концентрации электролита, например, NaCl), что позволяет достичь более высокой по сравнению с прототипом очистки целевого продукта путем последовательной ультрафильтрации полученного гидролизата на мембранах с разным порогом задерживания.The technical result of this method is to increase the degree of purification of the target product by using the ability of chondroitin sulfate molecules to strongly change the hydrodynamic radius when the ionic strength of the solution changes (electrolyte concentration, for example, NaCl), which allows to achieve higher purification of the target product by sequential ultrafiltration the resulting hydrolyzate on membranes with different retention thresholds.
В качестве сырья для получения хондроитина сульфата может быть использовано содержащее хрящевые ткани сырье, полученное в результате переработки различных морских гидробионтов. При использовании мороженого сырья предварительно проводят его дефростацию.As a raw material for the production of chondroitin sulfate, cartilage-containing raw materials obtained by processing various marine hydrobionts can be used. When using ice cream raw materials, it is first defrosted.
Подготовленное сырье измельчают и загружают в реакционную емкость, в которой проводят щелочной, а затем и ферментативный гидролиз.Prepared raw materials are crushed and loaded into a reaction vessel, in which alkaline and then enzymatic hydrolysis is carried out.
Гидролизат хрящевой ткани содержит различные продукты расщепления белков, соли, высокомолекулярные полисахариды (хондроитина сульфат).Cartilage hydrolyzate contains various protein breakdown products, salts, high molecular weight polysaccharides (chondroitin sulfate).
Растворение щелочерастворимых веществ, включая белки и хондроитина сульфат, проводят при температуре от 25 до 50°С в течение 3 ч при постоянном перемешивании.Dissolution of alkali-soluble substances, including proteins and chondroitin sulfate, is carried out at a temperature of from 25 to 50 ° C for 3 hours with constant stirring.
После окончания щелочного гидролиза смесь нейтрализуют до рН 7 и отделяют нерастворившийся осадок фильтрованием или центрифугированием.After alkaline hydrolysis is complete, the mixture is neutralized to pH 7 and the insoluble precipitate is separated by filtration or centrifugation.
Проведение щелочного гидролиза обеспечивает предварительное отделение нерастворившихся примесей и, как следствие, способствует увеличению выхода целевого продукта, повышению его чистоты.Carrying out alkaline hydrolysis provides preliminary separation of insoluble impurities and, as a result, helps to increase the yield of the target product, increasing its purity.
В полученный раствор добавляют ферментный препарат (ФП) или предварительно приготовленный раствор ФП с протеолитической активностью, например ферментный препарат, полученный из гепатопанкреаса камчатского краба.An enzyme preparation (AF) or a pre-prepared AF solution with proteolytic activity, for example, an enzyme preparation derived from king crab hepatopancreas, is added to the resulting solution.
Ферментативный гидролиз белков проводят при оптимальных для данного ФП температуре инкубационной смеси и продолжительности обработки (при использовании ФП из гепатопанкреаса камчатского - температура от 45 до 55°С и продолжительность гидролиза от 4 до 8 ч), отделяют твердый осадок.Enzymatic hydrolysis of proteins is carried out at the temperature of the incubation mixture that is optimal for this AF and the duration of the treatment (when using AF from Kamchatka hepatopancreas, the temperature is from 45 to 55 ° C and the duration of hydrolysis is from 4 to 8 hours), a solid precipitate is separated.
В полученный раствор добавляют соль, например хлорид натрия, доводя концентрацию соли до 0,1 моль.A salt, for example sodium chloride, is added to the resulting solution, adjusting the salt concentration to 0.1 mol.
Затем проводят ультрафильтрацию раствора через мембрану с молекулярно-массовым пределом задерживания менее 50 кДа для отделения оставшихся после гидролиза высокомолекулярных белков и взвешенных частиц.Then, the solution is ultrafiltered through a membrane with a molecular weight retention limit of less than 50 kDa to separate high molecular weight proteins and suspended particles remaining after hydrolysis.
Сконцентрированный раствор, содержащий хондроитина сульфат, промывают раствором соли, например хлорида натрия или другой соли с концентрацией 0,1 моль/л.A concentrated solution containing chondroitin sulfate is washed with a salt solution, for example sodium chloride or another salt with a concentration of 0.1 mol / L.
Для этого в полученный раствор добавляют хлорид натрия или другую соль для поддерживания ее концентрации в растворе до значения не менее 0,1 моль/л. Если после нейтрализации щелочи концентрация NaCl выше указанной, то дополнительное количество хлористого натрия не добавляют.For this, sodium chloride or another salt is added to the resulting solution to maintain its concentration in the solution to a value of at least 0.1 mol / L. If, after neutralizing the alkali, the concentration of NaCl is higher than indicated, then no additional amount of sodium chloride is added.
При концентрации NaCl в растворе выше 0,1 моль/л молекулы хондроитина сульфата сильно глобулированы, что не позволяет разделить компоненты гидролизата.When the NaCl concentration in the solution is above 0.1 mol / L, the chondroitin sulfate molecules are highly globular, which does not allow separation of the hydrolyzate components.
Используемая концентрация соли обеспечивает уменьшение гидродинамического радиуса молекул хондроитина сульфата и возможность их прохождения через мембрану с молекулярно-массовым пределом задерживания меньше 50 кДа, при этом на мембране задерживаются не гидролизованные белки, например коллаген.The salt concentration used ensures a decrease in the hydrodynamic radius of chondroitin sulfate molecules and the possibility of their passage through a membrane with a molecular weight retention limit of less than 50 kDa, while non-hydrolyzed proteins, such as collagen, are retained on the membrane.
Полученный раствор хондроитина сульфата, низкомолекулярных пептидов, аминокислот и солей подвергают ультрафильтрационному разделению на мембране с молекулярно-массовым пределом задерживания 5 кДа, обеспечивающей задержание молекул хондроитина сульфата и отделение молекул солей, аминокислот и низкомолекулярных пептидов.The resulting solution of chondroitin sulfate, low molecular weight peptides, amino acids and salts is subjected to ultrafiltration separation on a membrane with a molecular weight retention limit of 5 kDa, which ensures the retention of chondroitin sulfate molecules and the separation of molecules of salts, amino acids and low molecular weight peptides.
Известно, что при снижении концентрации соли в растворе менее 0,001 моль/л, например NaCl, молекулы хондроитина сульфата разворачиваются, что приводит к увеличению их гидродинамического радиуса. Максимальный радиус наблюдается в дистиллированной воде.It is known that when the salt concentration in the solution is reduced to less than 0.001 mol / L, for example, NaCl, chondroitin sulfate molecules unfold, which leads to an increase in their hydrodynamic radius. The maximum radius is observed in distilled water.
Удержанный на мембране хондроитина сульфат промывают дистиллированной водой, в результате концентрация соли снижается и молекулы хондроитина сульфата, гидродинамический радиус которых при этом значительно увеличился, могут быть сконцентрированы на мембранах с молекулярно-массовым пределом задерживания 50 кДа.The sulfate retained on the chondroitin membrane is washed with distilled water, as a result, the salt concentration decreases and chondroitin sulfate molecules, the hydrodynamic radius of which increased significantly, can be concentrated on membranes with a molecular weight retention limit of 50 kDa.
На мембране с пределом задержания 50 кДа хондроитина сульфат окончательно промывают дистиллированной водой от оставшихся пептидов средней молекулярной массы и осуществляют концентрирование его раствора путем ультрафильтрации.On a membrane with a retention limit of 50 kDa, chondroitin sulfate is finally washed with distilled water from the remaining medium molecular weight peptides and its solution is concentrated by ultrafiltration.
Высокомолекулярная фракция хондроитина сульфата концентрируется на мембране, а низкомолекулярные пептиды и аминокислоты проходят через нее.The high molecular weight fraction of chondroitin sulfate is concentrated on the membrane, and the low molecular weight peptides and amino acids pass through it.
Полученный концентрированный раствор хондроитина сульфата далее используется для выделения сухого препарата или в качестве раствора при приготовлении препаратов с хондроитина сульфатом.The obtained concentrated solution of chondroitin sulfate is then used to isolate a dry preparation or as a solution in the preparation of preparations with chondroitin sulfate.
Выделение сухого ходроитина сульфата осуществляется осаждением при добавлении избытка осадителя (например, этилового спирта) или высушиванием (сублимирование, распылительная сушка и др.).Isolation of dry hodroitin sulfate is carried out by precipitation by adding an excess of precipitant (for example, ethyl alcohol) or by drying (sublimation, spray drying, etc.).
Например, полученный раствор осаждают добавлением спирта в соотношении 1:2, выдерживают до полного осаждения хондроитина сульфата, отделяют осадок фильтрованием или центрифугированием, промывают спиртом, ацетоном, сушат в сублимационной сушилке, вакуумной или иной сушилке.For example, the resulting solution is precipitated by adding alcohol in a ratio of 1: 2, kept until complete precipitation of chondroitin sulfate, the precipitate is separated by filtration or centrifugation, washed with alcohol, acetone, dried in a freeze dryer, vacuum or other dryer.
Получают препарат очищенного хондроитина сульфата с массовой долей основного вещества не менее 90%.Get the preparation of purified chondroitin sulfate with a mass fraction of the main substance of at least 90%.
Целевой продукт - хондроитина сульфат представляет собой белый аморфный порошок без запаха, гигроскопичный, массовая доля воды не более 10%, массовая доля хондроитина сульфата составляет 90-95%The target product, chondroitin sulfate, is an odorless white amorphous powder, hygroscopic, the mass fraction of water is not more than 10%, the mass fraction of chondroitin sulfate is 90-95%
Определение массовой доли основного вещества проводили методом кислотного гидролиза в соляной кислоте (26% НСl, 100°С, 1 ч) и определения образовавшейся глюкуроновой кислоты методом Дише.The mass fraction of the main substance was determined by acid hydrolysis in hydrochloric acid (26% Hcl, 100 ° C, 1 h) and the formation of glucuronic acid formed by the Dische method.
Идентификацию проводили методом инфракрасной спектроскопии. В качестве стандарта использовали препарат хондроитина 6-сульфат натриевую соль из хряща акулы (Каталог «Fluka», кат. №27043-1G-F).Identification was carried out by infrared spectroscopy. A chondroitin 6-sulfate sodium salt from shark cartilage was used as a standard (Fluka Catalog, Cat. No. 27043-1G-F).
Результаты сравнения показали, что образцы хондроитина сульфата, полученные по заявляемому способу, имеют практически схожие показатели с показателями стандартного образца, что подтверждает высокую степень очистки целевого продукта.The comparison results showed that the samples of chondroitin sulfate obtained by the present method have practically similar indicators with the standard sample, which confirms the high degree of purification of the target product.
Использование ультрафильтрации возможно сразу при выделении препарата хондроитина сульфата после ферментативного гидролиза сырья или при очистке осажденного этанолом препарата, после его растворения в воде.The use of ultrafiltration is possible immediately upon isolation of the preparation of chondroitin sulfate after enzymatic hydrolysis of the feedstock or during purification of the preparation precipitated with ethanol after its dissolution in water.
Примеры осуществления способаExamples of the method
Пример 1Example 1
Получение хондроитина сульфата из хрящей семгиGetting chondroitin sulfate from cartilage salmon
1) Сырье - носовой хрящ семги извлекли из голов, очистили от остатков окружающих тканей, измельчили.1) Raw materials - nasal cartilage of salmon was removed from the heads, cleaned of residues of surrounding tissues, crushed.
2) 400 г измельченного сырья загрузили в колбу с 1600 г раствора NaOH (0.2 моль/дм3), нагрели на кипящей водяной бане до 37°С и при этой температуре в течение 3 ч при постоянном перемешивании провели растворение щелочерастворимых веществ.2) 400 g of the crushed raw material was loaded into a flask with 1600 g of NaOH solution (0.2 mol / dm 3 ), heated in a boiling water bath to 37 ° С, and at this temperature, alkali-soluble substances were dissolved with constant stirring for 3 hours.
3) После окончания процесса смесь нейтрализовали до рН 7 при помощи 0.1 н. уксусной кислоты.3) After the end of the process, the mixture was neutralized to pH 7 using 0.1 N. acetic acid.
4) Отделили не растворившийся осадок на центрифуге при 5000 об-1.4) does not dissolve the precipitate was separated by centrifugation at 5000 rpm -1.
5) В гидролизат загрузили ферментный препарат гепатопанкреаса камчатского краба из расчета 3 г на 1 кг сырья. Ферментативный гидролиз проводили при температуре 50°С в течение 5 часов. Осадок отделили на центрифуге при 5000 об-1.5) The enzyme preparation of king crab hepatopancreas was loaded into the hydrolyzate at the rate of 3 g per 1 kg of raw material. Enzymatic hydrolysis was carried out at a temperature of 50 ° C for 5 hours. The precipitate was separated by centrifugation at 5000 rpm -1.
Используемый ферментный препарат был получен из гепатопанкреса камчатского краба Paralithodes Camtschaticus по известной технологии (Сахаров, И.Ю. Способ получения коллагеназы. /И.Ю.Сахаров А.В.Джунковская, А.А.Артюков, В.В.Сова, О.Г.Саканделидзе, Э.П.Козловская. Институт иммунологии и Тихоокеанский институт биоорганической химии: а.с. SU 1343591 А1, МКИ4 А61К 35/56. - Заявл. 13.12.85; №3992368 /28-14. - 2 с.) и имел протеолитическую активность по казеинату натрия А=280 мкмоль тирозина*г-1*мин-1. (Субстрат: 1%-ный раствор казеината натрия. Фермент: 1 мг/мл раствор ФП. Условия инкубирования: 37°С, 10 мин.)Enzyme preparation used was obtained from gepatopankresa king crab Paralithodes Camtschaticus known technology (sugars, IY method of producing collagenase. /I.Yu.Saharov A.V.Dzhunkovskaya, A.A.Artyukov, V.V.Sova, O .G.Sakandelidze, E.P.Kozlovskaya Institute of Immunology and Pacific Institute of Bioorganic chemistry: AS SU 1343591 A1, MKI4 A61K 35/56 - declaring 13.12.85; №3992368 / 28-14 - 2.... .) and had proteolytic activity on sodium caseinate A = 280 μmol tyrosine * g -1 * min -1 . (Substrate: 1% sodium caseinate solution. Enzyme: 1 mg / ml AF solution. Incubation conditions: 37 ° C, 10 min.)
6) Провели ультрафильтрацию раствора через мембрану 50 кДа. Промыли сконцентрированный раствор раствором хлорида натрия с концентрацией 0,1 моль/л. (Для увеличения ионной силы в гидролизат добавили 9.36 г хлорида натрия.)6) The solution was ultrafiltered through a 50 kDa membrane. The concentrated solution was washed with a solution of sodium chloride with a concentration of 0.1 mol / L. (To increase the ionic strength, 9.36 g of sodium chloride was added to the hydrolyzate.)
7) Затем полученный раствор хондроитина сульфата, низкомолекулярных пептидов, аминокислот и солей подвергли ультрафильтрационному разделению на мембране 5 кДа, обеспечивающей задерживание молекул хондроитина сульфата.7) Then, the resulting solution of chondroitin sulfate, low molecular weight peptides, amino acids and salts was subjected to ultrafiltration separation on a 5 kDa membrane, which ensures the retention of chondroitin sulfate molecules.
8) Промывка дистиллированной водой. Раствор хондроитина окончательно промыли на мембране 50 кДа от оставшихся пептидов средней молекулярной массы.8) Flushing with distilled water. The chondroitin solution was finally washed on a 50 kDa membrane from the remaining medium molecular weight peptides.
9) Окончательно раствор хондроитина сульфата сконцентрировали ультрафильтрацией.9) Finally, a solution of chondroitin sulfate was concentrated by ultrafiltration.
10) Полученный раствор осадили добавлением спирта в соотношении 1:2, выдержали раствор в течение 20 часов.10) The resulting solution was precipitated by the addition of alcohol in a ratio of 1: 2, the solution was kept for 20 hours.
11) Отделили осадок центрифугированием при 5000 об-1, промыли 100 мл спирта.11) The precipitate was separated by centrifugation at 5000 rpm -1, washed with 100 ml of alcohol.
12) Полученное вещество высушили в сублимационной сушилке.12) The resulting substance was dried in a freeze dryer.
Получили 6,15 г сухого хондроитина сульфата, массовая доля основного вещества, определенная по реакции с карбазолом (метод Дише), 91%.Received 6.15 g of dry chondroitin sulfate, the mass fraction of the basic substance, determined by reaction with carbazole (Dishe method), 91%.
Пример 2Example 2
Получение хондроитина сульфата из хрящей акулыObtaining chondroitin sulfate from shark cartilage
То же, что в примере 1, но в качестве сырья использовали хрящи акулы.The same as in example 1, but shark cartilage was used as raw material.
Получили 6,15 г сухого хондроитина сульфата, массовая доля основного вещества 93%.Received 6.15 g of dry chondroitin sulfate, mass fraction of the main substance 93%.
Пример 3Example 3
Получение хондроитина сульфата из хрящей северного скатаObtaining chondroitin sulfate from cartilage of the northern slope
То же, что в примере 1, но в качестве сырья использовали хрящи северного ската. Проводили предварительное обезжиривание сырья ацетоном. В пункте 5 ферментативный гидролиз проводили в две стадии по 3 часа с дополнительным введением ферментного препарата соответственной концентрации.The same as in example 1, but the cartilage of the northern slope was used as raw material. A preliminary degreasing of the feed with acetone was carried out. In paragraph 5, enzymatic hydrolysis was carried out in two stages for 3 hours with an additional introduction of the enzyme preparation of the corresponding concentration.
Получили 5,43 г сухого хондроитина сульфата, массовая доля основного вещества 92%.Received 5.43 g of dry chondroitin sulfate, mass fraction of the main substance of 92%.
Пример 4Example 4
Очистка хондроитина сульфата из хрящей семгиPurification of Chondroitin Sulfate from Cartilage Salmon
Хондроитина сульфат, полученный способом из примера 1, за исключением пунктов 6-9, снова растворили в 500 мл дистиллированной воды, добавили 2,93 г хлористого натрия, раствор перемешали в течение 60 мин. Затем провели ультрафильтрационную обработку раствора, как описано в примере 1 в п.6-9 и далее 10-12.Chondroitin sulfate obtained by the method of Example 1, with the exception of items 6-9, was again dissolved in 500 ml of distilled water, 2.93 g of sodium chloride was added, the solution was stirred for 60 minutes. Then, an ultrafiltration treatment of the solution was carried out, as described in example 1 in p. 6-9 and further 10-12.
Получили 5,85 г сухого хондроитина сульфата, массовая доля основного вещества 94%.Received 5.85 g of dry chondroitin sulfate, mass fraction of the main substance 94%.
Пример 5Example 5
Получение хондроитина сульфата из хрящей семгиGetting chondroitin sulfate from cartilage salmon
То же, что в примере 1, но в качестве щелочи для проведения операции по п.2) вместо NaOH использовали гидроксид калия КОН (0,2 моль/дм3). При ультрафильтрации по п.6) вместо NaCl использовали 0,1 моль/дм3 раствор хлористого калия КСl.The same as in example 1, but potassium hydroxide KOH (0.2 mol / dm 3 ) was used instead of NaOH as the alkali for the operation according to claim 2). When ultrafiltration according to claim 6), instead of NaCl, a 0.1 mol / dm 3 potassium chloride solution KCl was used.
Получили 6,10 г сухого хондроитина сульфата, массовая доля основного вещества 92%.Received 6.10 g of dry chondroitin sulfate, mass fraction of the main substance 92%.
Пример 6Example 6
Получение хондроитина сульфата из хрящей семгиGetting chondroitin sulfate from cartilage salmon
То же, что в примере 1, но вместо NaCl при ультрафильтрации по п.6) использовали 0,05 моль/дм3 раствор хлористого кальция.The same as in example 1, but instead of NaCl during ultrafiltration according to claim 6), a 0.05 mol / dm 3 calcium chloride solution was used.
Получили 6,15 г сухого хондроитина сульфата, массовая доля основного вещества 91%.Received 6.15 g of dry chondroitin sulfate, mass fraction of the main substance 91%.
Пример 7Example 7
Получение хондроитина сульфата из хрящей семгиGetting chondroitin sulfate from cartilage salmon
То же, что в примере 1, но вместо ферментного препарата из гепатопанкреаса камчатского краба использовали протосубтилин Г3Х из расчета 4,5 г на 1 кг сырья (активность протосубтилина Г3Х по отношению к рыбному белку была в 1,5 раза ниже, чем активность ФП из гепатопанкреаса камчатского краба).The same as in example 1, but instead of the enzyme preparation from hepatopancreas of king crab, protosubtilin G3X was used at the rate of 4.5 g per 1 kg of raw material (the activity of protosubtilin G3X in relation to fish protein was 1.5 times lower than the activity of AF from king crab hepatopancreas).
Получили 6,35 г сухого хондроитина сульфата, массовая доля основного вещества 89%.Received 6.35 g of dry chondroitin sulfate, mass fraction of the main substance 89%.
Изобретение позволяет получать препарат хондроитина сульфата с массовой долей основного вещества не менее 90% (90-95%), а также увеличить выход целевого продукта.The invention allows to obtain a preparation of chondroitin sulfate with a mass fraction of the main substance of at least 90% (90-95%), and also to increase the yield of the target product.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2010153884/10A RU2458134C1 (en) | 2010-12-27 | 2010-12-27 | Method of producing chondroitin sulphate from sea hydrobiont tissue |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2010153884/10A RU2458134C1 (en) | 2010-12-27 | 2010-12-27 | Method of producing chondroitin sulphate from sea hydrobiont tissue |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2010153884A RU2010153884A (en) | 2012-07-10 |
| RU2458134C1 true RU2458134C1 (en) | 2012-08-10 |
Family
ID=46848120
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2010153884/10A RU2458134C1 (en) | 2010-12-27 | 2010-12-27 | Method of producing chondroitin sulphate from sea hydrobiont tissue |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2458134C1 (en) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107082829A (en) * | 2017-06-08 | 2017-08-22 | 福州大学 | A kind of preparation method of chondroitin sulfate and its application in vascular protection |
| US10221252B2 (en) | 2014-03-21 | 2019-03-05 | Altergon S.A. | Chondroitin sulphate purification method |
| RU2759517C1 (en) * | 2021-04-02 | 2021-11-15 | Общество с ограниченной ответственностью "АВЕО" | Method for obtaining pharmaceutical sulfated glycoaminoglycans from biological tissues |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2089557C1 (en) * | 1993-08-23 | 1997-09-10 | Научно-производственная фирма "Нарт" | Method of chondroitin sulfate a preparing |
| RU2250047C1 (en) * | 2003-11-18 | 2005-04-20 | Федеральное государственное унитарное предприятие Тихоокеанский научно-исследовательский рыбохозяйственный центр | Food restorative prophylactic product out of cartilaginous tissue of hydrobionts and method for its obtaining |
| RU2280076C1 (en) * | 2004-12-06 | 2006-07-20 | Тихоокеанский Институт Биоорганической Химии Дальневосточного Отделения Российской Академии Наук | Enzyme preparation from hepatopancreas of commercial crab species and method for production of the same |
-
2010
- 2010-12-27 RU RU2010153884/10A patent/RU2458134C1/en active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2089557C1 (en) * | 1993-08-23 | 1997-09-10 | Научно-производственная фирма "Нарт" | Method of chondroitin sulfate a preparing |
| RU2250047C1 (en) * | 2003-11-18 | 2005-04-20 | Федеральное государственное унитарное предприятие Тихоокеанский научно-исследовательский рыбохозяйственный центр | Food restorative prophylactic product out of cartilaginous tissue of hydrobionts and method for its obtaining |
| RU2280076C1 (en) * | 2004-12-06 | 2006-07-20 | Тихоокеанский Институт Биоорганической Химии Дальневосточного Отделения Российской Академии Наук | Enzyme preparation from hepatopancreas of commercial crab species and method for production of the same |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| СОРОКОУМОВ И.М. и др. Хондроитинсульфат из хрящей рыб. Рыбпром, №3, 2007, с.18-22. * |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US10221252B2 (en) | 2014-03-21 | 2019-03-05 | Altergon S.A. | Chondroitin sulphate purification method |
| RU2693262C2 (en) * | 2014-03-21 | 2019-07-01 | Альтергон С.А. | Method for purifying chondroitin sulphate |
| CN107082829A (en) * | 2017-06-08 | 2017-08-22 | 福州大学 | A kind of preparation method of chondroitin sulfate and its application in vascular protection |
| RU2759517C1 (en) * | 2021-04-02 | 2021-11-15 | Общество с ограниченной ответственностью "АВЕО" | Method for obtaining pharmaceutical sulfated glycoaminoglycans from biological tissues |
| RU2759517C9 (en) * | 2021-04-02 | 2022-01-20 | Общество с ограниченной ответственностью "АВЕО" | Method for obtaining pharmaceutical sulfated glycosaminoglycans from biological tissues |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2010153884A (en) | 2012-07-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Broquá et al. | Methods of chitin production a short review | |
| Struszczyk | Chitin and chitosan. Part I. Properties and production | |
| Nessa et al. | A process for the preparation of chitin and chitosan from prawn shell waste | |
| Arnesen et al. | Extraction of muscle proteins and gelatine from cod head | |
| JP3731150B2 (en) | Purification method of cartilage-type proteoglycan | |
| JP5057383B2 (en) | Novel mucin-type glycoprotein and its use | |
| US20110257381A1 (en) | Pharmaceutical composition comprising chito-oligomers | |
| US20220356272A1 (en) | Processes for extracting and purifying chitin by using green solvents | |
| Biplajit et al. | A Review on Bio-Polymers Derived from Animal Sources with Special Reference to their Potential Applications. | |
| RU2458134C1 (en) | Method of producing chondroitin sulphate from sea hydrobiont tissue | |
| KR102153079B1 (en) | refining method for mass production of marine collagen | |
| Carvalho et al. | Extraction and Purification of Biopolymers from Marine Origin Sources Envisaging Their Use for Biotechnological Applications | |
| Konovalova et al. | Technology and properties of chondroitin sulfate from marine hydrobionts | |
| Ibram et al. | Comparison of extraction methods of chitin and chitosan from different sources | |
| KR100532153B1 (en) | producing method of protein hydrolysates from fish scale | |
| Van Luyen et al. | Chitin and derivatives | |
| RS54854B1 (en) | CHONDROITINE SULPHATE LIKE THEM IN THE SHARK AND THE PROCESS FOR ITS RECEIVING | |
| JPH03139291A (en) | Method for treating shell of crustacea using enzyme | |
| KR100661125B1 (en) | Chitosan fine particles and its manufacturing method | |
| Broquá et al. | Different aspects of chemical and biochemical methods for chitin production a short review | |
| Tonégawa | Isolation and characterization of a particulate cell‐aggregation factor from sea urchin embryos | |
| Asrahwi et al. | Chitin and chitosan: Isolation, deacetylation, and prospective biomedical, cosmetic, and food applications | |
| RU2082416C1 (en) | Method of preparing the complex preparation containing mucopolysaccharides and collagen from animal raw | |
| US10420858B2 (en) | Cell carrier for skin tissue regeneration containing chitooligosaccharide and method for producing the same | |
| CN1486993A (en) | Prepn process of chondroitin sulfate with medium molecule weight |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PC43 | Official registration of the transfer of the exclusive right without contract for inventions |
Effective date: 20160725 |