RU2337964C2 - RECOMBINANT PLASMID DNA pAS-2 ENCODING HUMAN BEING PROINSULIN POLYPEPTIDE Aspart AND STRAIN OF BACTERIA Escherichia coli BAS2-RECOMBINANT PROINSULIN Aspart PRODUCER - Google Patents
RECOMBINANT PLASMID DNA pAS-2 ENCODING HUMAN BEING PROINSULIN POLYPEPTIDE Aspart AND STRAIN OF BACTERIA Escherichia coli BAS2-RECOMBINANT PROINSULIN Aspart PRODUCER Download PDFInfo
- Publication number
- RU2337964C2 RU2337964C2 RU2006140999/13A RU2006140999A RU2337964C2 RU 2337964 C2 RU2337964 C2 RU 2337964C2 RU 2006140999/13 A RU2006140999/13 A RU 2006140999/13A RU 2006140999 A RU2006140999 A RU 2006140999A RU 2337964 C2 RU2337964 C2 RU 2337964C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- aspart
- proinsulin
- pas
- human
- protein
- Prior art date
Links
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 title claims abstract description 46
- 108010076181 Proinsulin Proteins 0.000 title claims abstract description 41
- 229960004717 insulin aspart Drugs 0.000 title claims abstract description 41
- VOMXSOIBEJBQNF-UTTRGDHVSA-N novorapid Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1.C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 VOMXSOIBEJBQNF-UTTRGDHVSA-N 0.000 title claims abstract description 41
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 title claims abstract description 23
- 101100353517 Caenorhabditis elegans pas-2 gene Proteins 0.000 title claims abstract description 20
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 18
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 title claims abstract description 17
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title description 9
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title description 9
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 30
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 26
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 19
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 8
- 101100325773 Magnaporthe oryzae (strain 70-15 / ATCC MYA-4617 / FGSC 8958) BAS2 gene Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 101100083256 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) PHO2 gene Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 108010088160 Staphylococcal Protein A Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 claims abstract description 3
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims abstract 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 10
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 9
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 9
- YOBGUCWZPXJHTN-BQBZGAKWSA-N Gly-Ser-Arg Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N YOBGUCWZPXJHTN-BQBZGAKWSA-N 0.000 claims description 8
- 241000672609 Escherichia coli BL21 Species 0.000 claims description 6
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 5
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 5
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 claims description 4
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 4
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 abstract description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 3
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 108010073961 Insulin Aspart Proteins 0.000 abstract 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 abstract 1
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 abstract 1
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 51
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 26
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 26
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 25
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 16
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 16
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 14
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 12
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 7
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 7
- 108010065920 Insulin Lispro Proteins 0.000 description 6
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 6
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 5
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 5
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 5
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 3
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 3
- PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N insulin (human) Chemical class C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N phenol group Chemical group C1(=CC=CC=C1)O ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010093488 His-His-His-His-His-His Proteins 0.000 description 2
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 108010058966 bacteriophage T7 induced DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 2
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 2
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 230000002124 endocrine Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M lithium chloride Chemical compound [Li+].[Cl-] KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 101150093139 ompT gene Proteins 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 208000035408 type 1 diabetes mellitus 1 Diseases 0.000 description 2
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000002237 B-cell of pancreatic islet Anatomy 0.000 description 1
- 108700003860 Bacterial Genes Proteins 0.000 description 1
- 108091028026 C-DNA Proteins 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 206010018473 Glycosuria Diseases 0.000 description 1
- 101000852815 Homo sapiens Insulin receptor Proteins 0.000 description 1
- 208000013016 Hypoglycemia Diseases 0.000 description 1
- 102000038455 IGF Type 1 Receptor Human genes 0.000 description 1
- 108010031794 IGF Type 1 Receptor Proteins 0.000 description 1
- 108010042653 IgA receptor Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 206010049287 Lipodystrophy acquired Diseases 0.000 description 1
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 1
- AIXUQKMMBQJZCU-IUCAKERBSA-N Lys-Pro Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O AIXUQKMMBQJZCU-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000052651 Pancreatic hormone Human genes 0.000 description 1
- 101800001268 Pancreatic hormone Proteins 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 108010002747 Pfu DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100034014 Prolyl 3-hydroxylase 3 Human genes 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 1
- RZCIEJXAILMSQK-JXOAFFINSA-N TTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 RZCIEJXAILMSQK-JXOAFFINSA-N 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 229910001778 ammonium mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N aspartic acid group Chemical group N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 230000023852 carbohydrate metabolic process Effects 0.000 description 1
- 235000021256 carbohydrate metabolism Nutrition 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000019522 cellular metabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004153 glucose metabolism Effects 0.000 description 1
- 230000035780 glucosuria Effects 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 101150023479 hsdS gene Proteins 0.000 description 1
- 102000047882 human INSR Human genes 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 201000001421 hyperglycemia Diseases 0.000 description 1
- 230000002218 hypoglycaemic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000004026 insulin derivative Substances 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 208000006132 lipodystrophy Diseases 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 235000012054 meals Nutrition 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 description 1
- 230000002297 mitogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000004025 pancreas hormone Substances 0.000 description 1
- 229940032957 pancreatic hormone Drugs 0.000 description 1
- 235000011837 pasties Nutrition 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 239000002023 wood Substances 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генной инженерии, конкретно к получению проинсулина Aspart, и может быть использовано для создания лекарственных препаратов нового поколения для лечения инсулинозависимого сахарного диабета.The invention relates to biotechnology, in particular to genetic engineering, specifically to the production of Aspart proinsulin, and can be used to create new-generation drugs for the treatment of insulin-dependent diabetes mellitus.
К инсулинозависимому сахарному диабету (сахарному диабету первого типа, СД1) относят нарушения углеводного обмена, развитие которых обусловлено полной деструкцией или уменьшением числа β-клеток поджелудочной железы (до ~10% от нормы). Обычно это приводит к абсолютной инсулиновой недостаточности. При этом инсулин, гормон поджелудочной железы, до сих пор остается основным лекарственным средством для лечения СД1.To insulin-dependent diabetes mellitus (
Цель инсулиновой терапии - восстановление обмена глюкозы, предотвращение гипергликемии и глюкозурии после приема пищи, оптимизация диеты и поддержание нормальной массы тела, нормализация жирового обмена, повышение качества жизни больного [Vajo Z., Fawcett J., Duckworth W.C. Endocrine Reviews, 2001, v.22, p.706-717]. Инсулиновая терапия с использованием немодифицированного инсулина человека имеет ряд недостатков:The goal of insulin therapy is to restore glucose metabolism, prevent hyperglycemia and glucosuria after eating, optimize diet and maintain normal body weight, normalize fat metabolism, improve the patient’s quality of life [Vajo Z., Fawcett J., Duckworth W.C. Endocrine Reviews, 2001, v.22, p.706-717]. Insulin therapy using unmodified human insulin has several disadvantages:
1. При подкожном введении препарата инсулина максимальная концентрация устанавливается только через ~1-2 часа, поэтому больным сахарным диабетом необходимо вводить препарат за 30-60 минут перед приемом пищи, чтобы избежать развития различных осложнений.1. With subcutaneous administration of an insulin preparation, the maximum concentration is established only after ~ 1-2 hours, therefore, patients with diabetes need to enter the drug 30-60 minutes before eating to avoid the development of various complications.
2. При подкожном введении препарата действие инсулина сохраняется в течение нескольких часов после приема пищи, что может приводить к развитию гипогликемии.2. With subcutaneous administration of the drug, the action of insulin persists for several hours after a meal, which can lead to the development of hypoglycemia.
3. В местах постоянного введения инсулина, как правило, развивается липодистрофия.3. In places of continuous administration of insulin, lipodystrophy usually develops.
4. Однократное введение препарата инсулина является недостаточным для поддержания нормального уровня глюкозы в крови в течение суток [Vajo Z., Fawcett J., Duckworth W.C. Endocrine Reviews, 2001, v.22, p.706-717].4. A single administration of an insulin preparation is insufficient to maintain normal blood glucose levels during the day [Vajo Z., Fawcett J., Duckworth W.C. Endocrine Reviews, 2001, v.22, p.706-717].
Преодоление недостатков природного инсулина стало возможным после получения его генно-инженерных аналогов [Walsh G. Appl. Microbiol. Biotechnol, 2005, v.67, p.151-159].Overcoming the shortcomings of natural insulin became possible after obtaining its genetic engineering analogues [Walsh G. Appl. Microbiol. Biotechnol, 2005, v. 67, p. 151-159].
Инсулин Lyspro, первый внедренный в широкую клиническую практику быстродействующий аналог инсулина человека, у которого в аминокислотной последовательности В-цепи (фиг.1) инвертированы остатки пролина В28 (РrоВ28) и лизина В29 (LysB29). Эта модификация привела к конформационным изменениям в С-концевой последовательности В-цепи, которые сделали неэффективной димеризацию молекул белка, характерную для нативного инсулина [Wood A.J.J. N. Engl. J. Med., 1997, v.337, p.176-183]. Снижение способности к образованию агрегатов позволило увеличить скорость абсорбции инсулина Lyspro после инъекции, увеличить уровень содержания препарата в плазме и уменьшить продолжительность его действия [Howey D.C., Bowsher R.R., Brunelle R.L., Woodworth J.R. Diabetes, 1994, v.43, p.396-402]. Действие инсулина Lyspro начинается через 15 мин после подкожной инъекции, достигает максимальных значений через ~1 ч и прекращается спустя 2-4 ч [Torlone E., Fanelli С., Rambotti A.M., Kassi G., Modarelli F., Di Vincenzo A., Epifano L., Ciofetta M., Pampanelli S., Brunetti P. Diabetologia, 1994, v.37, p.713-720].Lyspro insulin, the first high-speed analogue of human insulin introduced into widespread clinical practice, in which the residues of proline B28 (ProB28) and lysine B29 (LysB29) are inverted in the amino acid sequence of the B chain (Fig. 1). This modification led to conformational changes in the C-terminal sequence of the B-chain, which rendered ineffective the dimerization of protein molecules characteristic of native insulin [Wood A.J.J. N. Engl. J. Med., 1997, v.337, p.176-183]. The decrease in the ability to form aggregates allowed to increase the rate of absorption of Lyspro insulin after injection, increase the level of the drug in plasma and reduce its duration [Howey D.C., Bowsher R.R., Brunelle R.L., Woodworth J.R. Diabetes, 1994, v. 43, p. 396-402]. The action of Lyspro insulin begins 15 minutes after subcutaneous injection, reaches its maximum value in ~ 1 hour and stops after 2-4 hours [Torlone E., Fanelli C., Rambotti AM, Kassi G., Modarelli F., Di Vincenzo A., Epifano L., Ciofetta M., Pampanelli S., Brunetti P. Diabetologia, 1994, v. 37, p. 713-720].
Инсулин Aspart - еще один используемый в клинической практике генно-инженерный аналог инсулина быстрого действия. В молекуле инсулина Aspart остаток пролина в положении В28 В-цепи заменен остатком аспарагиновой кислоты (фиг.1). Эта замена снизила тенденцию мономерных молекул инсулина к агрегации из-за нарушения взаимодействия между остатками РrоВ28 и GlyB23 [Setter S.M., Corbett C.F., Campbell P.K., White J.R. Ann. Pharmacother., 2000; v.34, p.1423-1431].Inspart Aspart is another genetically engineered analogue of fast acting insulin used in clinical practice. In the Aspart insulin molecule, the proline residue at position B28 of the B chain is replaced by an aspartic acid residue (FIG. 1). This substitution reduced the tendency of insulin monomer molecules to aggregate due to disruption of the interaction between the residues of ProB28 and GlyB23 [Setter S.M., Corbett C.F., Campbell P.K., White J.R. Ann. Pharmacother., 2000; v. 34, p. 1423-1431].
Сродство инсулинов Aspart и Lyspro к рецептору инсулина человека и их влияние на клеточный метаболизм практически одинаковы, однако инсулин Aspart проявляет меньшее, чем инсулин Lyspro, сродство к IGF-1 рецептору. При этом оба аналога обладают меньшей митогенной активностью в сравнении с немодифицированным инсулином человека [Chapman T.M., Noble S., Goa K.L. Drugs, 2002, v.62, p.1945-1981].The affinity of Aspart and Lyspro insulin for the human insulin receptor and their effect on cellular metabolism are almost the same, however, Aspart insulin exhibits less affinity for IGF-1 receptor than Lyspro insulin. In this case, both analogues have less mitogenic activity compared to unmodified human insulin [Chapman T.M., Noble S., Goa K.L. Drugs, 2002, v. 62, p. 1945-1981].
Инсулин Aspart абсорбируется из места инъекции быстрее природного инсулина. При подкожном введении инсулина Aspart максимально достигаемая концентрация препарата в крови выше, чем у природного гормона (138-518 пмоль/л и 59-288 пмоль/л соответственно), и этот уровень достигается за более короткий промежуток времени (31-71 мин по сравнению с 61-145 мин). Восстановление исходного уровня инсулина Aspart в плазме также происходит быстрее [Home P.D., Barriocanal L., Lindholm A. Eur. J. Clin. Pharmacol., 1999; v.55, p.199-203].Aspart insulin is absorbed from the injection site faster than natural insulin. With subcutaneous administration of Aspart insulin, the maximum achieved concentration of the drug in the blood is higher than that of the natural hormone (138-518 pmol / L and 59-288 pmol / L, respectively), and this level is achieved in a shorter period of time (31-71 min compared to from 61-145 minutes). Recovery of baseline plasma Aspart insulin levels is also faster [Home P.D., Barriocanal L., Lindholm A. Eur. J. Clin. Pharmacol., 1999; v.55, p. 199-203].
Известен способ получения инсулина Aspart, в котором ген модифицированного проинсулина человека общей структуры B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21) собирают из 10 предварительно синтезированных олигонуклеотидов и генно-инженерным способом вводят в челночный экспрессирующий вектор под контроль сильного промотора гена триозофосфатизомеразы Saccharomyces cerevisiae вслед за последовательностью нуклеотидов, кодирующей лидерный пептид, обеспечивающий секрецию рекомбинантного белка из дрожжевых клеток. Требуемую мутацию, приводящую к замене аминокислотного остатка РroВ28→AspB28 в молекуле проинсулина, вводили в рекомбинантный ген направленным мутагенезом с использованием соответствующего праймера. Рекомбинантный белок-предшественник, секретируемый клетками дрожжей, содержащими данную плазмиду, подвергали грубой очистке с использованием катионообменной хроматографии с последующей кристаллизацией. Инсулин Aspart получали реакцией транспептидации белка-предшественника с Thr-OMe в присутствии трипсина и последующим гидролизом образовавшегося эфира [US № 5618913, МКИ С07К 014/62, опубл. 1997].There is a known method for producing Aspart insulin, in which a gene of modified human proinsulin of the general structure B (1-29) -Ala-Ala-Lys-A (1-21) is collected from 10 pre-synthesized oligonucleotides and introduced into the shuttle expression vector under the genetic engineering method control of a strong promoter of the Saccharomyces cerevisiae triosophosphatisomerase gene following a nucleotide sequence encoding a leader peptide that secures the secretion of a recombinant protein from yeast cells. The desired mutation leading to the replacement of the amino acid residue ProB28 → AspB28 in the proinsulin molecule was introduced into the recombinant gene by targeted mutagenesis using the appropriate primer. The recombinant precursor protein secreted by yeast cells containing this plasmid was subjected to coarse purification using cation exchange chromatography followed by crystallization. Aspart insulin was prepared by the transpeptidation reaction of the precursor protein with Thr-OMe in the presence of trypsin and subsequent hydrolysis of the resulting ester [US No. 5618913, MKI C07K 014/62, publ. 1997].
Способ имеет ряд недостатков, в частности многоэтапность и связанную с этим высокую трудоемкость получения конечного продукта, необходимость использования стадий химического синтеза пептидов, а также низкий выход требуемого аналога инсулина, что затрудняет использование данного способа в технологических целях.The method has a number of disadvantages, in particular, the multi-stage nature and the associated high laboriousness of obtaining the final product, the necessity of using chemical peptide synthesis stages, and the low yield of the required insulin analogue, which makes it difficult to use this method for technological purposes.
Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому изобретению является штамм-продуцент рекомбинантного проинсулина Lyspro человека Escherichia coli pLP-3-1/TG-1, в котором рекомбинантная плазмида, кодирующая гибридный полипептид с последовательностью проинсулина Lyspro человека, соединенный через пептидный линкер с аминокислотной последовательностью домена В стафилококкового белка А, введена в клетки Escherichia coli TG-1 дикого типа. Индукция экспрессии рекомбинантного гена в этом штамме осуществляется с помощью изопропил-β-D-тиогалактопиранозида (ИПТГ) [патент РФ №2235776, МКИ C12N 15/00, опубл. 2004]. Несмотря на то, что для данного штамма-продуцента характерен высокий уровень биосинтеза рекомбинантного белка, последний в процессе синтеза и последующей очистки подвергается быстрой деградации из-за наличия в бактериальных клетках дикого типа ряда протеолитических ферментов. Это затрудняет очистку рекомбинантного проинсулина и уменьшает выход конечного продукта, что повышает стоимость препаратов рекомбинантного белка.Closest to the technical nature of the present invention is a producer strain of recombinant human Linspro proinsulin Escherichia coli pLP-3-1 / TG-1, in which a recombinant plasmid encoding a hybrid polypeptide with a human Lyspro proinsulin sequence connected via a peptide linker to the amino acid sequence of the domain In staphylococcal protein A, introduced into wild-type Escherichia coli TG-1 cells. Induction of expression of the recombinant gene in this strain is carried out using isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) [RF patent No. 2235776, MKI C12N 15/00, publ. 2004]. Despite the fact that this producer strain is characterized by a high level of biosynthesis of the recombinant protein, the latter undergoes rapid degradation during the synthesis and subsequent purification due to the presence of a number of proteolytic enzymes in the wild-type bacterial cells. This makes it difficult to purify recombinant proinsulin and reduces the yield of the final product, which increases the cost of recombinant protein preparations.
Задачей изобретения является конструирование плазмиды, экспрессирующей ген проинсулина Aspart, и создание высокопродуктивного бактериального штамма-продуцента аналога проинсулина, позволяющего получать инсулин Aspart с высоким выходом и по упрощенной технологии.The objective of the invention is the construction of a plasmid expressing the Aspart proinsulin gene, and the creation of a highly productive bacterial strain producer of the proinsulin analogue, allowing to obtain Aspart insulin in high yield and by simplified technology.
Поставленная задача решается за счет конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК pAS-2, кодирующей гибридный белок, содержащий аминокислотную последовательность проинсулина Aspart человека, в котором последовательность домена В белка A S. aureus соединена через пептидный линкер His6GlySerArg с аминокислотной последовательностью проинсулина Aspart человека с молекулярной массой 3,3 МДа (5051 п.о.), содержащей HindIII/BamHI-фрагмент плазмиды pPINS07, включающий гибридный tac-промотор, ген β-лактамазы (bla), область начала репликации (ori), терминатор транскрипции рибосомного оперона Е. coli, последовательность нуклеотидов, кодирующую аминокислотную последовательность домена В белка А S. aureus, соединенную с последовательностью нуклеотидов, кодирующей пептид His6GlySerArg, и HindIII/BamHI-фрагмент (271 п.о.), кодирующий проинсулин Aspart человека; уникальные сайты рестрикции со следующими координатами: EcoRI - 1, NcoI - 217, BamHI - 221, PstI - 342 и 417, HindIII - 492, SalGI - 4513, ClaI - 4792, а также за счет штамма Escherichia coli BAS2 - продуцента рекомбинантного белка, содержащего аминокислотную последовательность проинсулина Aspart.The problem is solved by constructing a recombinant plasmid DNA pAS-2 encoding a hybrid protein containing the amino acid sequence of human Aspart proinsulin, in which the B domain of S. aureus protein A is linked via the His 6 GlySerArg peptide linker to the amino acid sequence of human Aspart proinsulin with a molecular weight 3.3 MDa (5051 bp) containing the HindIII / BamHI fragment of pPINS07 plasmid, including the hybrid tac promoter, β-lactamase gene (bla), the region of origin of replication (ori), ribosome transcription terminator E. coli operon, a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of S. aureus Protein B domain A linked to a nucleotide sequence encoding His 6 GlySerArg peptide and a HindIII / BamHI fragment (271 bp) encoding human Aspart proinsulin; unique restriction sites with the following coordinates: EcoRI - 1, NcoI - 217, BamHI - 221, PstI - 342 and 417, HindIII - 492, SalGI - 4513, ClaI - 4792, and also due to the Escherichia coli BAS2 strain - producer of the recombinant protein, containing the amino acid sequence of proinsulin Aspart.
Исходной плазмидой для конструирования является плазмида pPINS07, кодирующая:The initial plasmid for construction is the plasmid pPINS07 encoding:
- гибридный полипептид, состоящий из одного IgG-связывающего домена белка А Staphylococcus aureus, пептидного линкера His6GlySerArg и проинсулина человека,- a hybrid polypeptide consisting of a single IgG-binding domain of protein A of Staphylococcus aureus, peptide linker His 6 GlySerArg and human proinsulin,
- гибридный tac-промотор и- hybrid tac promoter and
- терминатор транскрипции рибосомного оперона Е. coli.- terminator of transcription of the ribosomal operon E. coli.
[Патент РФ №2144957, МКИ C12N 15/00, опубл. 2000].[RF patent No. 2144957, MKI C12N 15/00, publ. 2000].
Как уже отмечалось выше, последовательность инсулина Aspart отличается от природного инсулина структурой аминокислотных остатков в положении В28. Для введения соответствующей мутации в ген проинсулина человека используют полимеразную цепную реакцию (ПЦР) с перекрывающимися праймерами. Для этого вначале на матрице исходной плазмиды синтезируют продукты А и В (ПЦР 1, фиг.2) с помощью пар праймеров 1-4 и 2-3. Праймеры 3 и 4 содержат некомплементарные матрице нуклеотиды, соответствующие последовательностям гена проинсулина Aspart человека (обозначены звездочками). Полученные ПЦР-продукты очищают на ДЭАЭ-мембране и используют в качестве матрицы во второй полимеразной реакции (ПЦР 2) в присутствии праймеров 1 и 2 (фиг.3). Синтезированный фрагмент С очищают на ДЭАЭ-мембране. Полученный в итоге фрагмент С содержат требуемую мутацию, а также уникальные сайты рестрикции BamHI и HindIII на своих концах. Далее этот фрагмент инкубируют с рестриктазами BamHI и HindIII и клонируют в предварительно подготовленном векторе, который представляет собой исходную плазмиду, содержащую рекомбинантный ген гибридного полипептида без последовательности проинсулина человека, удаленной с помощью тех же рестриктаз (фиг.2). Отбор рекомбинантных клонов проводят по элиминации сайта рестрикции Mbo II в продукте ПЦР, полученном в результате амплификации предполагаемой рекомбинантной плазмиды pAS-2 с помощью праймеров 1 и 2 (фиг.2 и 3). Удаление сайта рестрикции является следствием изменения с помощью проведенного направленного мутагенеза последовательности нуклеотидов гена проинсулина исходной плазмиды, приводящего к появлению в В-цепи инсулина измененного аминокислотного остатка AspB28 (фиг.1). Плазмиды отобранных клонов, которые обладают требуемыми свойствами, очищают щелочным методом [Maniatis Т., Fritsch E.F., Sambrook J. Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 1982, Cold Spring Harbor Laboratory Press], и последовательности нуклеотидов клонированного фрагмента ДНК определяют методом Сэнгера с использованием дидезоксирибонуклеотидных производных в качестве терминаторов синтеза ДНК термосеквеназой на автоматическом секвенаторе. Полученную последовательность сравнивают с последовательностью исходной плазмиды, определенную тем же методом. Итогом работы является получение рекомбинантной плазмиды, обладающей требуемыми свойствами.As noted above, the Aspart insulin sequence differs from natural insulin in the structure of amino acid residues at position B28. To introduce the corresponding mutation into the human proinsulin gene, a polymerase chain reaction (PCR) with overlapping primers is used. For this, first products A and B are synthesized on the matrix of the initial plasmid (
Плазмиду pAS-2 вводят в компетентные клетки Е. coli BL21 [патент РФ №2267534, МКИ C12N 15/17, опубл. 2006], что приводит к созданию рекомбинантного штамма-продуцента инсулина Aspart (Е. coli BL21/pAS-2). Исследование уровней экспрессии гибридного белка, содержащего последовательность аналога проинсулина Aspart в полученном рекомбинантном штамме, показывает, что содержание рекомбинантного полипептида в бактериальных клетках после завершения индукции с помощью ИПТГ составляет не менее 25% от суммарного клеточного белка.Plasmid pAS-2 is introduced into competent E. coli BL21 cells [RF patent No. 2267534, MKI C12N 15/17, publ. 2006], which leads to the creation of a recombinant insulin producer strain Aspart (E. coli BL21 / pAS-2). A study of the expression levels of a hybrid protein containing the Aspart proinsulin analog sequence in the obtained recombinant strain shows that the content of the recombinant polypeptide in bacterial cells after completion of induction with IPTG is at least 25% of the total cellular protein.
Рекомбинантная плазмидная ДНК pAS-2, кодирующая гибридный полипептид с последовательностью аналога проинсулина Aspart, характеризуется следующими свойствами:Recombinant plasmid DNA pAS-2 encoding a hybrid polypeptide with the Aspart proinsulin analog sequence has the following properties:
- имеет молекулярную массу 3,3 МДа (5051 п.о.);- has a molecular weight of 3.3 MDa (5051 bp);
- кодирует гибридный белок, в котором последовательность домена В стафилококкового белка А с С-концевым гексагистидиновым линкером соединена через трипептид GlySerArg с последовательностью проинсулина Aspart (плазмида pAS-2);- encodes a hybrid protein in which the sequence of domain B of staphylococcal protein A with a C-terminal hexahistidine linker is connected via the GlySerArg tripeptide to the Aspart proinsulin sequence (plasmid pAS-2);
- состоит из HindIII/BamHI-фрагмента плазмиды pPNIS07, содержащего синтетический tac-промотор транскрипции, ген β-лактамазы (bla), определяющий устойчивость клеток бактерий к ампициллину, область инициации репликации плазмидной ДНК (ori), терминатор транскрипции рибосомного оперона Е. coli, а также включающего часть искусственного гена, кодирующую IgG-связывающий домен белка А из S. aureus и гексагистидиновый домен, соединенный с трипептидом GlySerArg, а также HindIII/BamHI-фрагмента, кодирующего проинсулин Aspart (плазмида pAS-2) человека, содержащий в аминокислотной последовательности остаток AspB28; уникальные сайты рестрикции имеют следующие координаты: EcoRI - 1, NcoI - 217, BamHI - 221, PstI - 342 и 417, HindIII - 492, SalGI - 4513, ClaI - 4792.- consists of the HindIII / BamHI fragment of plasmid pPNIS07 containing a synthetic tac transcription promoter, β-lactamase gene (bla), which determines the resistance of bacterial cells to ampicillin, the region of plasmid DNA replication initiation (ori), the terminator of transcription of the E. coli ribosomal operon, and also comprising a part of the artificial gene encoding the IgG-binding domain of protein A from S. aureus and a hexahistidine domain connected to the GlySerArg tripeptide, as well as the HindIII / BamHI fragment encoding human Aspart pro-insulin (plasmid pAS-2) containing the amino acid sequence atelnosti AspB28 residue; unique restriction sites have the following coordinates: EcoRI - 1, NcoI - 217, BamHI - 221, PstI - 342 and 417, HindIII - 492, SalGI - 4513, ClaI - 4792.
Преимуществом полученной плазмиды перед известными плазмидами является то, что она кодирует полипептид проинсулина Aspart под контролем синтетического tac-промотора, индуцируемого изопропил-β-D-тиогалактопиранозидом. Это позволяет индуцировать и осуществлять синтез проинсулина при обычной для Е. coli температуре 37°С, что значительно повышает выход рекомбинантного белка и облегчает его дальнейшую очистку. Кроме того, в отличие от известных плазмид, сконструированная плазмида содержит ген β-лактамазы в качестве селектируемого маркера.The advantage of the obtained plasmid over the known plasmids is that it encodes the Aspart proinsulin polypeptide under the control of a synthetic tac promoter induced by isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside. This allows you to induce and carry out the synthesis of proinsulin at a usual temperature of E. coli at 37 ° C, which significantly increases the yield of the recombinant protein and facilitates its further purification. In addition, unlike the known plasmids, the constructed plasmid contains the β-lactamase gene as a selectable marker.
Для получения штамма-продуцента гибридного полипептида, содержащего последовательность проинсулина Aspart человека, рекомбинантную плазмиду pAS-2 вводят с помощью электропорации в компетентные клетки Е. coli BL21.To obtain a producer strain of a hybrid polypeptide containing the human Aspart proinsulin sequence, the recombinant plasmid pAS-2 is introduced by electroporation into competent E. coli BL21 cells.
Полученный штамм Е. coli BL21/pAS-2, названный Е. coli BAS2, характеризуется следующими свойствами.The resulting strain of E. coli BL21 / pAS-2, named E. coli BAS2, is characterized by the following properties.
Культурально-морфологические признаки: клетки мелкие, палочковидной формы, грамотрицательные, 1×3,5 мкм, подвижные. Штамм хорошо растет на обычных питательных средах (МПА, МПБ, LB-бульон, LB-агар, минимальная среда с глюкозой). При росте на агаризованной среде LB колонии округлые, гладкие, полупрозрачные, блестящие, серые. Край ровный, диаметр колоний 1-3 мм, консистенция пастообразная. Рост в жидких средах (LB, минимальная среда с глюкозой) характеризуется ровным помутнением, осадок легко седиментирует.Cultural and morphological characters: small, rod-shaped cells, gram-negative, 1 × 3.5 μm, motile. The strain grows well on ordinary nutrient media (MPA, MPB, LB-broth, LB-agar, minimal medium with glucose). When growing on an agarized LB medium, the colonies are rounded, smooth, translucent, shiny, gray. The edge is even, the diameter of the colonies is 1-3 mm, the consistency is pasty. Growth in liquid media (LB, minimal medium with glucose) is characterized by even turbidity, the sediment easily sedimentes.
Физиолого-биохимические признаки: клетки растут при 4-42°С, оптимум рН 6,8-7,6. В качестве источника азота используют как минеральные соли аммония, так и органические соединения: аминокислоты, пептон, триптон, дрожжевой экстракт. В качестве источника углерода при росте на минимальной среде используют глицерин, углеводы, аминокислоты.Physiological and biochemical characteristics: cells grow at 4-42 ° C, optimum pH of 6.8-7.6. As a source of nitrogen, both ammonium mineral salts and organic compounds are used: amino acids, peptone, tryptone, yeast extract. When growing on a minimal medium, glycerin, carbohydrates, amino acids are used as a carbon source.
Генетические признаки: F- ompT hsdSB(rB - mB -) gal dcm. Проявляют устойчивость к ампициллину (до 300 мкг/мл), обусловленную наличием генов устойчивости к антибиотику в ДНК рекомбинантной плазмиды pAS-2.Genetic traits: F - ompT hsdS B (r B - m B - ) gal dcm. Resistance to ampicillin (up to 300 μg / ml) is shown due to the presence of antibiotic resistance genes in the DNA of the recombinant plasmid pAS-2.
Условия хранения: штамм бактерий Е. coli BAS2 хранят на чашках и косяках при 4°С. Пересевы на свежие среды проводят один раз в месяц. Может храниться не менее одного года в среде LB, содержащей 30% глицерина, при -20-70°С.Storage conditions: the bacterial strain E. coli BAS2 is stored on plates and jambs at 4 ° C. Reseeding on fresh media is carried out once a month. It can be stored for at least one year in LB medium containing 30% glycerol at -20-70 ° C.
Устойчивость к антибиотикам: клетки штаммов-продуцентов проявляют устойчивость к ампициллину (до 300 мкг/мл), обусловленную наличием генов устойчивости в ДНК рекомбинантной плазмиды pAS-2.Antibiotic resistance: cells of producer strains show resistance to ampicillin (up to 300 μg / ml), due to the presence of resistance genes in the DNA of the recombinant plasmid pAS-2.
Преимуществом полученного бактериального штамма является обеспечение им высокой внутриклеточной стабильности гибридного полипептида проинсулина Aspart человека как следствие неактивного состояния в этих клетках бактериальных генов lon и ompT, кодирующих соответственно АТР-зависимую протеиназу и протеиназу внешней мембраны. В результате в клетках этого штамма отсутствуют продукты деградации рекомбинантных предшественников инсулина, затрудняющих их очистку, что сопровождается повышением выхода очищенного рекомбинантного белка, содержащего последовательность аналога проинсулина человека.The advantage of the obtained bacterial strain is that it ensures high intracellular stability of the human Aspart proinsulin hybrid polypeptide as a result of the inactive state of the bacterial genes lon and ompT in these cells, encoding, respectively, the ATP-dependent proteinase and outer membrane proteinase. As a result, the cells of this strain lack degradation products of recombinant insulin precursors that impede their purification, which is accompanied by an increase in the yield of purified recombinant protein containing the sequence of the human proinsulin analogue.
Изобретение иллюстрируют примеры.The invention is illustrated by examples.
Пример 1. Получение фрагментов ДНК, кодирующих аминокислотную последовательность проинсулина Aspart человека.Example 1. Obtaining DNA fragments encoding the amino acid sequence of human Aspart proinsulin.
80 нг плазмидной ДНК плазмиды pPINS07, содержащей ген природного проинсулина человека, используют в качестве матрицы для синтеза фрагмента А (фиг.3) в полимеразной цепной реакции (ПЦР), добавляя к 50 мкл реакционной смеси следующего состава: 20 мМ Трис-HCl рН 8,8, 67 мМ (NH4)2SO4, 1,5 мМ MgCl2, по 0,2 мМ dATP, dCTP, TTP и dGTP каждого, 0,5 ед. смеси Taq- и Pfu-ДНК-полимераз (в отношении 50/1 по активности), и для синтеза фрагмента ДНК, кодирующего последовательность проинсулина Aspart, по 1 мкМ каждого из праймеров CAGGATCATCACCATGGATCCCG и CACGACGGGTCTTGTCGGTGTAGAAG (праймеры 1 и 4 соответственно на фиг.3, в последовательностях праймеров подчеркнуты измененные нуклеотиды). В работе используют модифицированную моноклональными антителами (для имитации «горячего старта») термостабильную Taq-ДНК-полимеразу. Амплификацию соответствующего участка плазмиды осуществляют, проводя 20 циклов ПЦР (94°С, 20 с; 59°С, 20 с; 72°С, 20 с) на амплификаторе «Терцик» фирмы «ДНК-технология», Россия. Синтез фрагмента В (фиг.3) проводят в тех же условиях и в той же реакционной смеси, но в присутствии праймеров CCGCCAAGCTTACTAGTTGCAGTAG и ACACCGACAAGACCCGTCGTGAAGC (праймеры 2 и 3, фиг.3). Синтезированные фрагменты А и В очищают электрофоретически в 3% агарозном геле, перенося на кусочки ДЭАЭ-мембраны NA-45 (Schleicher&Schuhle), и элюируют в центрифужных микропробирках на 1,5 мл 200 мкл буфера, содержащего 1,5 М Nad, 10 мМ ЭДТА в течение 40 мин при 65°С. К буферу добавляют тРНК Е. coli до конечной концентрации 100 мкг/мл и синтезированные фрагменты осаждают 2,5 объемами 96% этилового спирта. Осадок собирают центрифугированием на микроцентрифуге «Эппендорф» при максимальных оборотах в течение 15 мин, супернатант отбрасывают, осадки промывают 1 мл холодного 70% этилового спирта, подсушивают при комнатной температуре и растворяют в 50 мкл деионизованной воды. Сборку необходимого фрагмента С (фиг.3) осуществляют с помощью ПЦР 2 в 25 мкл вышеописанной реакционной смеси, однако в отличие от нее содержащей по 1 мкл очищенных перекрывающихся фрагментов А и В в качестве матрицы, а также праймеры 1 и 2 (фиг.3, последовательности см. выше).80 ng of plasmid DNA of plasmid pPINS07 containing the natural human proinsulin gene is used as a template for the synthesis of fragment A (Fig. 3) in the polymerase chain reaction (PCR), adding to 50 μl of the reaction mixture of the following composition: 20 mM Tris-HCl pH 8 , 8, 67 mM (NH 4 ) 2 SO 4 , 1.5 mM MgCl 2 , 0.2 mM dATP, dCTP, TTP and dGTP each, 0.5 units. mixtures of Taq and Pfu DNA polymerases (with a ratio of 50/1 in activity), and for the synthesis of a DNA fragment encoding the Aspart proinsulin sequence, 1 μM of each of the primers CAGGATCATCACCATGGATCCCG and CACGACGGGTCTT GTC GGTGTAGAAG (
Пример 2. Подготовка экспрессирующего вектора для клонирования синтезированного фрагмента С.Example 2. Preparation of an expression vector for cloning a synthesized fragment C.
3 мкг плазмиды pPINS07 инкубируют с эндонуклеазами рестрикции HindIII и BamHI, как описано выше, и образовавшийся большой фрагмент векторной ДНК, взятый для получения экспрессирующей плазмиды, электрофоретически отделяют от малого фрагмента с использованием легкоплавкой агарозы (1,5%) после чего электрофоретически его переносят в лунку, заполненную легкоплавкой агарозой, откуда выделяют фенольным методом [Maniatis Т., Fritsch E.F., Sambrook J. Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 1982, Cold Spring Harbor Laboratory Press]. Перемещение фрагмента в агарозном геле контролируют в УФ-свете при 366 нм. После перехода требуемого фрагмента ДНК в легкоплавкую агарозу ее переносят в пробирку «Эппендорф» на 1,5 мл, содержащую равный объем ТЕ-буфера (10 mM Трис-HCl (рН 8,0), 1 mM ЭДТА), плавят в течение 5-10 мин при температуре 65°С, добавляют равный объем нейтрализованного фенола, перемешивают на вортексе и центрифугируют в течение 7 мин при 14000g. Супернатант переносят в чистую пробирку, содержащую 0,1 объема (от вносимого объема супернатанта) 4М LiCl, выдерживают 2 мин во льду, после чего центрифугируют в течение 3 мин. Векторную ДНК осаждают из верхней фазы 96% этанолом с тРНК в качестве носителя, промывают 70% спиртом и растворяют в 20 мкл деионизованной воды.3 μg of the plasmid pPINS07 is incubated with the restriction endonucleases HindIII and BamHI, as described above, and the resulting large fragment of vector DNA, taken to obtain an expression plasmid, is electrophoretically separated from the small fragment using low-melting agarose (1.5%) and then transferred to electrophoresis in a well filled with low-melting agarose, from which it is isolated by the phenolic method [Maniatis T., Fritsch EF, Sambrook J. Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 1982, Cold Spring Harbor Laboratory Press]. The movement of the fragment in an agarose gel is controlled in UV light at 366 nm. After the desired DNA fragment is transferred to low-melting agarose, it is transferred to an 1.5 ml Eppendorf tube containing an equal volume of TE buffer (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA), melted for 5– 10 min at a temperature of 65 ° C, add an equal volume of neutralized phenol, mix on a vortex and centrifuged for 7 min at 14000g. The supernatant is transferred to a clean tube containing 0.1 volumes (of the added volume of the supernatant) 4M LiCl, incubated for 2 minutes in ice, and then centrifuged for 3 minutes. Vector DNA is precipitated from the upper phase with 96% ethanol with tRNA as a carrier, washed with 70% alcohol and dissolved in 20 μl of deionized water.
Пример 3. Получение плазмиды pAS-2, экспрессирующей гены гибридного проинсулина Aspart, и штамма-продуцента гибридного белка, содержащего последовательность проинсулина Aspart.Example 3. Obtaining a plasmid pAS-2 expressing the Aspart hybrid proinsulin genes and a producer strain of the hybrid protein containing the Aspart proinsulin sequence.
10 мкг большого фрагмента плазмиды pPINS07, содержащего липкие концы HindIII/BamHI, лигируют с 50 мкг очищенного С-фрагмента ДНК (фиг.3) с теми же липкими концами [Maniatis Т., Fritsch E.F., Sambrook J. Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 1982, Cold Spring Harbor Laboratory Press]. Продукты реакции осаждают и промывают этиловым спиртом, как описано выше, и растворяют в 10 мкл воды; 5 мкл продуктов лигирования используют для трансформации компетентных клеток Е. coli BL21 методом электропорации в стандартных условиях. Суспензию трансформированных клеток (200 мкл) высевают на LB-агар, содержащий ампициллин (100 мкг/мл) в качестве селектирующего агента. При анализе плазмиды pAS-2 среди выросших колоний бактерий с помощью ПЦР в присутствии праймеров 1 и 2 (фиг.3) (последовательности см. выше) отбирают клоны, содержащие вставку клонируемого фрагмента С. Для этого образовавшиеся продукты ПЦР инкубируют с эндонуклеазой рестрикции MboII (Fermentas, Латвия) в условиях, рекомендуемых фирмой-производителем, и образовавшиеся фрагменты ДНК разделяют электрофорезом в 6% полиакриламидном геле. При наличии в анализируемой плазмидной ДНК мутации Aspart после рестрикции образуется только три фрагмента ДНК длиной 158, 67 и 51 п.о., так как один из трех сайтов рестрикции (центральный, фиг.3) содержащихся в этой части исходной плазмиды pPINS07, элиминируется под действием введенной мутации. Из клонов, содержащих требуемую мутацию, выделяют плазмидную ДНК стандартным фенольным методом [Maniatis Т., Fritsch E.F., Sambrook J. // Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 1982, Cold Spring Harbor Laboratory Press] и последовательность нуклеотидов гена проинсулина Aspart определяют методом Сэнгера с использованием набора реактивов для секвенирования ThermoSequenase Cycle Sequencing Kit фирмы Amersham BioSciences (США). Электрофоретическое разделение продуктов секвенирования проводят с помощью автоматического секвенатора ALF Express II фирмы Amersham BioSciences (США). Строение плазмиды pAS-2 представлено на фиг.4.10 μg of a large fragment of plasmid pPINS07 containing the sticky ends of HindIII / BamHI is ligated with 50 μg of purified C-DNA fragment (Fig. 3) with the same sticky ends [Maniatis T., Fritsch EF, Sambrook J. Molecular Cloning: a Laboratory Manual 1982, Cold Spring Harbor Laboratory Press]. The reaction products are precipitated and washed with ethyl alcohol, as described above, and dissolved in 10 μl of water; 5 μl of ligation products are used to transform competent E. coli BL21 cells by electroporation under standard conditions. A suspension of transformed cells (200 μl) was plated on LB agar containing ampicillin (100 μg / ml) as a selection agent. When analyzing the plasmid pAS-2 among the grown bacterial colonies by PCR in the presence of
Пример 4. Определение продуктивности штамма-продуцента гибридного белка, содержащего аминокислотную последовательность проинсулина Aspart человека.Example 4. The determination of the productivity of the producer strain of a hybrid protein containing the amino acid sequence of human Aspart proinsulin.
В 20 мл жидкой среды LB, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, вносят индивидуальную колонию клеток Е. coli BAS2 и выращивают при 37°С на качалке при 180 об/мин в течение 4 ч до мутности 0,8. Затем добавляют индуктор ИПТГ до конечной концентрации 0,5 мМ и продолжают инкубацию в тех же условиях в течение 6 ч. Отбирают пробу 2 мл и центрифугируют 5 мин при 6000 об/мин, после чего клетки суспендируют в 200 мкл буфера, содержащего 125 мМ Трис-HCl, рН 6,8, 20% глицерина, 3% додецилсульфата натрия, 3% меркаптоэтанола и 0,01% бромфенолового синего, нагревают 10 мин на кипящей водяной бане. Отбирают аликвоты объемом 2,5, 5, 7,5, 10 и 15 мкл и анализируют электрофорезом в 13%-ном полиакриламидном геле, содержащем 0,1% додецилсульфат натрия. Гель окрашивают Кумасси R250 и сканируют на лазерном денситометре Ultrascan XL. По данным сканирования содержание соответствующего гибридного белка составляет не менее 25% суммарного клеточного белка бактериальных клеток анализируемого штамма-продуцента.An individual colony of E. coli BAS2 cells is introduced into 20 ml of LB liquid medium containing 100 μg / ml ampicillin and grown at 37 ° C on a shaker at 180 rpm for 4 hours to a turbidity of 0.8. Then, an IPTG inducer was added to a final concentration of 0.5 mM and incubation was continued under the same conditions for 6 h. A 2 ml sample was taken and centrifuged for 5 min at 6000 rpm, after which the cells were suspended in 200 μl of buffer containing 125 mM Tris -HCl, pH 6.8, 20% glycerol, 3% sodium dodecyl sulfate, 3% mercaptoethanol and 0.01% bromophenol blue, heated for 10 min in a boiling water bath. Aliquots of 2.5, 5, 7.5, 10 and 15 μl were selected and analyzed by electrophoresis on a 13% polyacrylamide gel containing 0.1% sodium dodecyl sulfate. The gel is stained with Coomassie R250 and scanned on an Ultrascan XL laser densitometer. According to the scan, the content of the corresponding hybrid protein is at least 25% of the total cellular protein of the bacterial cells of the analyzed producer strain.
Claims (2)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2006140999/13A RU2337964C2 (en) | 2006-11-21 | 2006-11-21 | RECOMBINANT PLASMID DNA pAS-2 ENCODING HUMAN BEING PROINSULIN POLYPEPTIDE Aspart AND STRAIN OF BACTERIA Escherichia coli BAS2-RECOMBINANT PROINSULIN Aspart PRODUCER |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2006140999/13A RU2337964C2 (en) | 2006-11-21 | 2006-11-21 | RECOMBINANT PLASMID DNA pAS-2 ENCODING HUMAN BEING PROINSULIN POLYPEPTIDE Aspart AND STRAIN OF BACTERIA Escherichia coli BAS2-RECOMBINANT PROINSULIN Aspart PRODUCER |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2006140999A RU2006140999A (en) | 2008-05-27 |
| RU2337964C2 true RU2337964C2 (en) | 2008-11-10 |
Family
ID=39586244
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2006140999/13A RU2337964C2 (en) | 2006-11-21 | 2006-11-21 | RECOMBINANT PLASMID DNA pAS-2 ENCODING HUMAN BEING PROINSULIN POLYPEPTIDE Aspart AND STRAIN OF BACTERIA Escherichia coli BAS2-RECOMBINANT PROINSULIN Aspart PRODUCER |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2337964C2 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2514578C1 (en) * | 2013-04-29 | 2014-04-27 | Общество с ограниченной ответственностью "БиоКлонТек" | RECOMBINANT PLASMID DNA pHIASP03, ENCODING HYBRID PROTEIN WITH HUMAN PROINSULIN Aspart, CELL Escherichia coli TRANSFORMED BY RECOMBINANT PLASMID DNA pHIAsp03, AND STRAIN OF BACTERIA Escherichia coli JM109/pHIAsp03 - PRODUCER OF HYBRID PROTEIN WITH HUMAN PROINSULIN Aspart |
| RU2729353C1 (en) * | 2019-05-24 | 2020-08-06 | Закрытое акционерное общество "ФАРМ-ХОЛДИНГ" | Recombinant plasmid dna pf646 coding hybrid polypeptide containing proinsulin aspart, and strain of bacteria escherichia coli - producer of hybrid polypeptide containing proinsulin aspart |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0288451B1 (en) * | 1987-04-23 | 1994-08-10 | Monsanto Company | Secretion of insulin-like growth factor 1 in E. coli |
| RU2144957C1 (en) * | 1999-02-26 | 2000-01-27 | Институт биоорганической химии им.М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН | Recombinant plasmid dna ppins07 encoding fused polypeptide containing human proinsulin and strain of bacterium escherichia coli - producer of fused polypeptide containing human proinsulin |
| RU2235776C1 (en) * | 2003-03-17 | 2004-09-10 | Институт биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН | Recombinant plasmid dna plp-3-1 encoding human polypeptide of proinsulin lyspro and strain of bacterium escherichia coli plp-3-1/tg-1 as producer of recombinant proinsulin lyspro |
-
2006
- 2006-11-21 RU RU2006140999/13A patent/RU2337964C2/en active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0288451B1 (en) * | 1987-04-23 | 1994-08-10 | Monsanto Company | Secretion of insulin-like growth factor 1 in E. coli |
| RU2144957C1 (en) * | 1999-02-26 | 2000-01-27 | Институт биоорганической химии им.М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН | Recombinant plasmid dna ppins07 encoding fused polypeptide containing human proinsulin and strain of bacterium escherichia coli - producer of fused polypeptide containing human proinsulin |
| RU2235776C1 (en) * | 2003-03-17 | 2004-09-10 | Институт биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН | Recombinant plasmid dna plp-3-1 encoding human polypeptide of proinsulin lyspro and strain of bacterium escherichia coli plp-3-1/tg-1 as producer of recombinant proinsulin lyspro |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ann Pharmacother. 2000 Dec; 34(12):1423-31. TOM STRACHAN, ANDREW P. READ. Human Molecular Genetics 2. Second edition. BIOS Scientific Publishers Ltd, 1999. * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2514578C1 (en) * | 2013-04-29 | 2014-04-27 | Общество с ограниченной ответственностью "БиоКлонТек" | RECOMBINANT PLASMID DNA pHIASP03, ENCODING HYBRID PROTEIN WITH HUMAN PROINSULIN Aspart, CELL Escherichia coli TRANSFORMED BY RECOMBINANT PLASMID DNA pHIAsp03, AND STRAIN OF BACTERIA Escherichia coli JM109/pHIAsp03 - PRODUCER OF HYBRID PROTEIN WITH HUMAN PROINSULIN Aspart |
| RU2729353C1 (en) * | 2019-05-24 | 2020-08-06 | Закрытое акционерное общество "ФАРМ-ХОЛДИНГ" | Recombinant plasmid dna pf646 coding hybrid polypeptide containing proinsulin aspart, and strain of bacteria escherichia coli - producer of hybrid polypeptide containing proinsulin aspart |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2006140999A (en) | 2008-05-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7252280B2 (en) | Novel insulin analogue and use thereof | |
| KR940000756B1 (en) | Insulin analogues and process for their preparation | |
| KR102698929B1 (en) | Insulin analogs with reduced affinity to insulin receptor and use thereof | |
| SK171492A3 (en) | Polypeptide, method of its preparation its use and pharmaceutical agent | |
| JPH01501283A (en) | Novel type of colony stimulating factor-1 | |
| JPH01500483A (en) | Expression of G-CSF and its muteins | |
| US6001604A (en) | Refolding of proinsulins without addition of reducing agents | |
| RU2144957C1 (en) | Recombinant plasmid dna ppins07 encoding fused polypeptide containing human proinsulin and strain of bacterium escherichia coli - producer of fused polypeptide containing human proinsulin | |
| RU2337964C2 (en) | RECOMBINANT PLASMID DNA pAS-2 ENCODING HUMAN BEING PROINSULIN POLYPEPTIDE Aspart AND STRAIN OF BACTERIA Escherichia coli BAS2-RECOMBINANT PROINSULIN Aspart PRODUCER | |
| JP2000504561A (en) | Polypeptides having IL-16 activity, their production and use | |
| RU2235776C1 (en) | Recombinant plasmid dna plp-3-1 encoding human polypeptide of proinsulin lyspro and strain of bacterium escherichia coli plp-3-1/tg-1 as producer of recombinant proinsulin lyspro | |
| CN112851791A (en) | Novel FGF19 analogue and application thereof | |
| RU2325440C1 (en) | RECOMBINANT PLASMID DNA pGG-1 CODING POLYPEPTIDE OF HUMAN PROINSULIN GLARGIN AND STRAIN OF BACTERIA ESCHERICHIA COLI BGG18-PRODUCER OF RECOMBINANT PROINSULIN GLARGIN | |
| RU2729381C1 (en) | Recombinant plasmid dna pf644 coding hybrid polypeptide containing proinsulin glargine, and bacterial strain escherichia coli - producer of hybrid polypeptide containing proinsulin glargine | |
| EP3500284A1 (en) | Bovine fibroblast growth factor 21 and ketosis in dairy cattle | |
| JPH04502615A (en) | Recombinant fish hormone protein | |
| US7785830B2 (en) | Expression vectors, transformed host cells and fermentation process for the production of recombinant polypeptides | |
| RU2729353C1 (en) | Recombinant plasmid dna pf646 coding hybrid polypeptide containing proinsulin aspart, and strain of bacteria escherichia coli - producer of hybrid polypeptide containing proinsulin aspart | |
| RU2376368C2 (en) | STRAIN OF BACTERIA Escherichia coli JM109/pHINS21 - PRODUCER OF HYBRID PROTEIN WITH HUMAN PROINSULIN AND METHOD FOR PRODUCTION OF HUMAN PROINSULIN | |
| JPH06306100A (en) | Fused protein for preparing vip analog, production of vip analog, gene recombination plasmid therefor and transformant microorganism | |
| RU2729737C1 (en) | Recombinant plasmid dna of pf882, which codes hybrid polypeptide containing b30-desthreonine-insulin, and strain of bacteria escherichia coli - producer of hybrid polypeptide containing 30-desthreonine-insulin | |
| RU2514578C1 (en) | RECOMBINANT PLASMID DNA pHIASP03, ENCODING HYBRID PROTEIN WITH HUMAN PROINSULIN Aspart, CELL Escherichia coli TRANSFORMED BY RECOMBINANT PLASMID DNA pHIAsp03, AND STRAIN OF BACTERIA Escherichia coli JM109/pHIAsp03 - PRODUCER OF HYBRID PROTEIN WITH HUMAN PROINSULIN Aspart | |
| KR102631925B1 (en) | Development of novel fgf21 variants, production techniques and uses thereof | |
| RU2729357C1 (en) | Recombinant plasmid dna pf267 coding hybrid polypeptide containing proinsulin lisprum, and a strain of bacteria escherichia coli - producer of hybrid polypeptide containing proinsulin lispro | |
| RU2143493C1 (en) | Recombinant plasmid dna ppins16 encoding fused polypeptide containing human proinsulin, recombinant plasmid dna ppins25 encoding fused polypeptide containing human proinsulin and strain of bacterium escherichia coli - producer of fused polypeptide containing human proinsulin |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| QB4A | Licence on use of patent |
Free format text: LICENCE Effective date: 20140908 |