RU2323976C2 - METHOD OF OBTAINING OF GENI-ENGENIERING ECDERONIC FACTOR OF PERSON GROWTH, PLASM RECOMBINATION DNA pER-hEGF, CODING HYBRID PROTEIN CAPABLE FOR AUTO-CATALYTIC SPLITTING, CAPABLE FOR AUTO-CATALYTIC SPLITTING WITH GENERATING OF EPIDERMAL FACTOR OF PERSON GROWTH, AND STAMP Escherichia coli ER2566/pER-hEGF-PRODUCER OF MENTIONED PROTEIN - Google Patents
METHOD OF OBTAINING OF GENI-ENGENIERING ECDERONIC FACTOR OF PERSON GROWTH, PLASM RECOMBINATION DNA pER-hEGF, CODING HYBRID PROTEIN CAPABLE FOR AUTO-CATALYTIC SPLITTING, CAPABLE FOR AUTO-CATALYTIC SPLITTING WITH GENERATING OF EPIDERMAL FACTOR OF PERSON GROWTH, AND STAMP Escherichia coli ER2566/pER-hEGF-PRODUCER OF MENTIONED PROTEIN Download PDFInfo
- Publication number
- RU2323976C2 RU2323976C2 RU2006118439/13A RU2006118439A RU2323976C2 RU 2323976 C2 RU2323976 C2 RU 2323976C2 RU 2006118439/13 A RU2006118439/13 A RU 2006118439/13A RU 2006118439 A RU2006118439 A RU 2006118439A RU 2323976 C2 RU2323976 C2 RU 2323976C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- hegf
- per
- escherichia coli
- producer
- auto
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 33
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 title claims abstract description 29
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 24
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 9
- 230000012010 growth Effects 0.000 title abstract description 4
- 230000006798 recombination Effects 0.000 title abstract 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 title abstract 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims abstract description 32
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 claims abstract description 10
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 8
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 claims abstract description 7
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 claims abstract description 3
- 101500025419 Homo sapiens Epidermal growth factor Proteins 0.000 claims description 30
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 27
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 25
- 229940116978 human epidermal growth factor Drugs 0.000 claims description 24
- GVUGOAYIVIDWIO-UFWWTJHBSA-N nepidermin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(C)C)C(C)C)C1=CC=C(O)C=C1 GVUGOAYIVIDWIO-UFWWTJHBSA-N 0.000 claims description 23
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 11
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 10
- 229920002101 Chitin Polymers 0.000 claims description 9
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 8
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 claims description 8
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 8
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 7
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 7
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 claims description 7
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 claims description 6
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 claims description 6
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 claims description 4
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 claims description 4
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 claims description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 3
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 claims description 3
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 3
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 claims description 2
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 claims description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 claims description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 claims description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 2
- 101150072531 10 gene Proteins 0.000 claims 1
- 102000009024 Epidermal Growth Factor Human genes 0.000 claims 1
- 101150025323 SCLT1 gene Proteins 0.000 claims 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 claims 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 abstract description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 239000012928 buffer substance Substances 0.000 abstract 1
- 235000013877 carbamide Nutrition 0.000 abstract 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 239000012265 solid product Substances 0.000 abstract 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 6
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 102400001368 Epidermal growth factor Human genes 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- XOGTZOOQQBDUSI-UHFFFAOYSA-M Mesna Chemical compound [Na+].[O-]S(=O)(=O)CCS XOGTZOOQQBDUSI-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 4
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 229960004635 mesna Drugs 0.000 description 4
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 4
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 3
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 3
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 3
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 3
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 2
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 108010005054 Deoxyribonuclease BamHI Proteins 0.000 description 1
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 1
- 241000701533 Escherichia virus T4 Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 101800001978 Ssp dnaB intein Proteins 0.000 description 1
- 208000007107 Stomach Ulcer Diseases 0.000 description 1
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 1
- 239000008049 TAE buffer Substances 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O ammonium group Chemical group [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 239000001045 blue dye Substances 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 210000000750 endocrine system Anatomy 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004051 gastric juice Anatomy 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000017730 intein-mediated protein splicing Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000000816 matrix-assisted laser desorption--ionisation Methods 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002406 microsurgery Methods 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 150000002960 penicillins Chemical class 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000005373 porous glass Substances 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 1
- 230000030788 protein refolding Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 150000003536 tetrazoles Chemical class 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N tris acetate Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
- -1 β-cyanethyl-diisopropylamino Chemical group 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генной и белковой инженерии. Оно может быть использовано для получения рекомбинантного эпидермального фактора роста человека.The invention relates to biotechnology, in particular to genetic and protein engineering. It can be used to produce recombinant human epidermal growth factor.
Эпидермальный фактор роста человека (hEGF), или урогастрон, участвует в ряде физиологических процессов, связанных с эмбриональным ростом, регенерацией тканей, регуляцией функционирования эндокринной системы, заживлением ран, секрецией желудочного сока (Medical World News. 1986, V.13, №10, P.17, P.3589-3593). В связи с этим он представляет интерес для таких областей медицины, как микрохирургия глаза, ожоговая терапия, лечение язв желудка и т.д.Human epidermal growth factor (hEGF), or urogastron, is involved in a number of physiological processes related to embryonic growth, tissue regeneration, regulation of the endocrine system, wound healing, and secretion of gastric juice (Medical World News. 1986, V.13, No. 10, P.17, P.3589-3593). In this regard, it is of interest for such areas of medicine as eye microsurgery, burn therapy, treatment of stomach ulcers, etc.
hEGF представляет собой полипептид, содержащий 53 аминокислотных остатка, соединенных тремя дисульфидными связями. Аминокислотная последовательность hEGF и нуклеотидная последовательность его синтетического гена приведены на фиг.1.hEGF is a polypeptide containing 53 amino acid residues joined by three disulfide bonds. The amino acid sequence of hEGF and the nucleotide sequence of its synthetic gene are shown in figure 1.
Природный hEGF ранее выделяли из мочи человека (Gregory H., Preston В.М. // Int. J. Peptide and Protein Res., 1977, V.9, №2, P.107-112), но низкое (менее 0.1%) содержание его в этом источнике делало его практически недоступным для широкого применения в медицине.Natural hEGF was previously isolated from human urine (Gregory H., Preston V.M. // Int. J. Peptide and Protein Res., 1977, V.9, No. 2, P.107-112), but low (less than 0.1 %) its content in this source made it practically inaccessible for widespread use in medicine.
Более доступным является рекомбинантный hEGF, для получения которого предложены многочисленные методы. Во всех описанных способах успех микробиологического получения рекомбинантного hEGF достигается за счет использования секреции его из бактериальной клетки, что позволяет предохранять его от действия протеаз. Для того чтобы избежать деградации in vivo короткие пептиды экспрессируют в составе гибридного гена. К недостаткам использованных ранее методов получения hEGF относятся низкий выход целевого белка и трудности его выделения и очистки.More accessible is recombinant hEGF, for the preparation of which numerous methods have been proposed. In all the described methods, the success of the microbiological preparation of recombinant hEGF is achieved by using its secretion from a bacterial cell, which allows it to be protected from the action of proteases. In order to avoid degradation in vivo, short peptides are expressed as part of a hybrid gene. The disadvantages of previously used methods for producing hEGF include the low yield of the target protein and the difficulties of its isolation and purification.
Известен наиболее близкий способ получения рекомбинантного hEGF, в котором также используется секреция его из бактериальной клетки (Tong W.Y., Yao S.J. Zhu Z.Q. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2001, V.57, 674-9). К недостаткам этого способа относится трудности выделения и очистки.The closest known method for producing recombinant hEGF, which also uses its secretion from a bacterial cell (Tong W.Y., Yao S.J. Zhu Z.Q. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2001, V.57, 674-9), is known. The disadvantages of this method include the difficulty of isolation and purification.
Изобретение решает задачу получения генно-инженерного эпидермального фактора роста с помощью рекомбинантной плазмидной ДНК, кодирующей гибридный белок, высокопродуктивного рекомбинантного бактериального штамма-продуцента указанного белка и определения условий ренатурации эпидермального фактора роста в составе гибридного белка и условий неферментативного автокаталитического расщепления гибридного белка для получения рекомбинантного hEGF.The invention solves the problem of producing a genetically engineered epidermal growth factor using recombinant plasmid DNA encoding a hybrid protein, a highly productive recombinant bacterial strain producing the specified protein and determining the conditions for the renaturation of the epidermal growth factor in the composition of the hybrid protein and the conditions for non-enzymatic autocatalytic cleavage of the hybrid protein to produce recombinant h .
Поставленная задача решается за счет того, что в способе получения рекомбинантного эпидермального фактора роста человека, включающем культивирование штамма-продуцента Escherichia coli, полученного трансформацией клеток родительского штамма Escherichia coli ER2566 плазмидной ДНК, кодирующей рекомбинантный эпидермальный фактор роста, в качестве плазмидной ДНК используют сконструированную ДНК pER-hEGF, в качестве штамма-продуцента используют штамм Escherichia coli ER2566/pER-hEGF, после разрушения клеток в буферном растворе с помощью ультразвука гибридный белок отделяют в виде тел включения, тела включения растворяют в буфере, содержащем 6 М мочевину, ренатурируют гибридный белок, адсорбируют его на хитиновом сорбенте и затем индуцируют автокаталитическое расщепление сменой буфера с изменением рН с 10,0 до 7,0 с отделением целевого продукта, который элюируют с сорбента.The problem is solved due to the fact that in the method for producing recombinant human epidermal growth factor, comprising culturing the producer strain Escherichia coli obtained by transforming cells of the parent strain Escherichia coli ER2566 plasmid DNA encoding recombinant epidermal growth factor, the constructed pER DNA is used as plasmid DNA -hEGF, the strain Escherichia coli ER2566 / pER-hEGF is used as the producer strain, after the destruction of the cells in the buffer solution using ultrasound, the hybrid protein is separated in the form of inclusion bodies, inclusion bodies are dissolved in a buffer containing 6 M urea, the hybrid protein is renatured, it is adsorbed on a chitin sorbent, and then autocatalytic cleavage is induced by changing the buffer with a change in pH from 10.0 to 7.0 with separation of the target product, which is eluted from the sorbent.
Кроме того, поставленная задача решается за счет структуры рекомбинантной плазмидной ДНК pER-hEGF, кодирующей гибридный белок, содержащий эпидермальный фактор роста человека и мини-интеин Ssp DnaB, имеющей молекулярную массу 4.4 МДа и физическую карту, приведенную на фиг.2, состоящей из: SapI/BamHI-фрагмента ДНК плазмиды pTWIN-1, содержащего промотор и терминатор транскрипции Т7-РНК-полимеразы, усилитель трансляции гена 10 фага Т7, ген β-лактамазы, ген модифицированного мини-интеина Ssp DnaB, со встроенной в него последовательностью хитин-связывающего домена, и SapI/BamHI-фрагмента ДНК, содержащего последовательность гена рекомбинантного эпидермального фактора роста человека, содержащей: в качестве генетического маркера ген β-лактамазы (Ар), детерминирующей устойчивость трансформированных плазмидой pER- hEGF клеток Е.coli к пеницилл 2966 п.о., и новым антибиотикам; уникальные сайты узнавания рестрикционных эндонуклеаз, расположенные на следующем расстоянии влево от сайта BamHI: NruI - 186 п.о., NdeI - 594 п.о., XbaI - SS2 п.о., EcoRV - 2913 п.о., HpaI - 296 п.о.,In addition, the task is solved by the structure of the recombinant plasmid DNA pER-hEGF encoding a fusion protein containing human epidermal growth factor and mini-intein Ssp DnaB having a molecular weight of 4.4 MDa and a physical map shown in figure 2, consisting of: SapI / BamHI DNA fragment of the plasmid pTWIN-1, containing the promoter and terminator of transcription of T7 RNA polymerase, translational amplification gene 10 of the T7 phage, β-lactamase gene, the gene for the modified mini-intein Ssp DnaB, with a built-in chitin-binding sequence domain, and A SapI / BamHI DNA fragment containing the gene sequence of a recombinant human epidermal growth factor containing: as a genetic marker, the β-lactamase (Ap) gene, which determines the resistance of 2966 bp penicillins of E. coli transformed with the plasmid pER-hEGF, and new antibiotics; unique recognition sites for restriction endonucleases located to the left of the BamHI site: NruI - 186 bp, NdeI - 594 bp, XbaI - SS2 bp, EcoRV - 2913 bp, HpaI - 296 by.,
а также за счет штамма Escherichia coli ER2566, содержащего рекомбинантную плазмидную ДНК pER-hEGF, продуцент гибридного белка Int-hEGF, включающего, наряду со структурой рекомбинантного эпидермального фактора роста человека, структуру мини-интеина Ssp DnaB.and also due to strain Escherichia coli ER2566 containing recombinant plasmid DNA pER-hEGF, a producer of the hybrid protein Int-hEGF, including, along with the structure of recombinant epidermal human growth factor, the structure of mini-intein Ssp DnaB.
Конструкция рекомбинантной плазмидной ДНК pER-hEGF обеспечивает высокий уровень экспрессии клонированного в ней гена гибридного белка Int-hEGF, содержащего на 5′-конце ген модифицированного интеина DnaB, соединенного встык с геном hEGF (фиг.3). Для конструирования плазмиды использован химический подход, позволяющий использовать для экспрессии клонированного структурного гена оптимальные регуляторные элементы, контролирующие его экспрессию.The design of the recombinant plasmid DNA pER-hEGF provides a high level of expression of the Int-hEGF fusion protein gene cloned therein containing the modified DnaB intein gene connected end-to-end with the hEGF gene (Fig. 3). A chemical approach was used to construct the plasmid, which allows the use of optimal regulatory elements that control its expression for the expression of the cloned structural gene.
Изобретение осуществляют следующим образом:The invention is as follows:
Для конструирования экспрессионной плазмиды искусственный ген hEGF, структура которого приведена на фиг.1, получают химико-ферментативным синтезом, как это было описано ранее (Батчикова Н.В., Скапцова Н.В., Твардовская С.Е., Бесидский Е.С., Даньков Ю.В., Степанов А.И., Ажаев А.В. // Биоорган. химия., 1988, т.14, №5, 621-630). Концевые его участки, содержащие соответствующие вектору сайты рестриктаз, вводят с помощью ПЦР с синтетическими олигонуклеотидными праймерами P-int и P-ter.To construct an expression plasmid, the artificial hEGF gene, the structure of which is shown in Fig. 1, is obtained by chemical-enzymatic synthesis, as described previously (Batchikova N.V., Skaptsova N.V., Tvardovskaya S.E., Besidsky E.S. ., Dankov Yu.V., Stepanov A.I., Azhayev A.V. // Bioorgan.chemistry., 1988, v.14, No. 5, 621-630). Its end sections containing the restriction enzyme sites corresponding to the vector are introduced by PCR with the synthetic oligonucleotide primers P-int and P-ter.
SapISapi
P-int GGTGGTTGCTCTTCCAACAATTCTGACTCTGAATGCCCAP-int GGTGGTTGCTCTTCCAACAATTCTGACTCTGAATGCCCA
BamHIBamhi
P-ter GGTGGTGGATCCTCAACGCAGTTCCCACCATTTCP-ter GGTGGTGGATCCTCAACGCAGTTCCCACCATTTC
Полученный таким образом дуплекс после расщепления соответствующими эндонуклеазами рестрикции SapI и BamHI клонируют в экспрессионную плазмиду pTWIN1 (New England Biolabs) и лигазной смесью трансформируют клетки Е.coli ER2566.The duplex thus obtained, after cleavage with the appropriate restriction endonucleases SapI and BamHI, was cloned into the expression plasmid pTWIN1 (New England Biolabs) and E. coli ER2566 cells were transformed with the ligase mixture.
Предлагаемый штамм-продуцент Escherichia coli ER2566/pER-hEGF характеризуется следующими признаками:The proposed producer strain Escherichia coli ER2566 / pER-hEGF is characterized by the following features:
Морфологические признаки. Клетки палочковидной формы, грамотрицательные, неспороносные.Morphological signs. The cells are rod-shaped, gram-negative, non-spore.
Культуральные признаки. Клетки хорошо растут на простых питательных средах. При росте на агаре "Дифко" - колонии круглые, гладкие, мутные, блестящие серые, край ровный. При росте на жидких средах (на минимальной среде с глюкозой или YT-бульоне) образуют интенсивную ровную муть.Cultural signs. Cells grow well on simple nutrient media. When growing on Difco agar, the colonies are round, smooth, cloudy, shiny gray, the edge is even. When growing on liquid media (on a minimal medium with glucose or YT-broth) they form an intense smooth haze.
Физико-биологические признаки. Клетки растут при температуре от 4°С до 40°С при оптимуме рН от 6,8 до 7,5. В качестве источника азота используют как минеральные соли в аммонийной форме, так и органические соединения в виде пептона, триптона, дрожжевого экстракта, аминокислот и т.д. В качестве источника углерода используют аминокислоты, глицерин, углеводы.Physico-biological signs. Cells grow at temperatures from 4 ° C to 40 ° C with optimum pH from 6.8 to 7.5. As a source of nitrogen, both mineral salts in the ammonium form and organic compounds in the form of peptone, tryptone, yeast extract, amino acids, etc. are used. Amino acids, glycerin, carbohydrates are used as a carbon source.
Устойчивость к антибиотикам. Клетки проявляют устойчивость к пенициллиновым антибиотикам (до 500 мкг/мл).Antibiotic resistance. Cells are resistant to penicillin antibiotics (up to 500 μg / ml).
Штамм-продуцент Е.coli ER2566/pER-hEGF отличается от штамма-реципиента Е.coli ER2566 только наличием рекомбинантной плазмидной ДНК pER-hEGF, которая и придает ему устойчивость к пенициллиновым антибиотикам.The E. coli ER2566 / pER-hEGF producer strain differs from the E. coli ER2566 recipient strain only in the presence of recombinant plasmid DNA pER-hEGF, which confers resistance to penicillin antibiotics.
Штаммы-продуценты получают путем трансформации компетентных клеток Е.coli ER2566 рекомбинантной плазмидной ДНК pER-hEGF.Producer strains are obtained by transformation of competent E. coli ER2566 cells with recombinant plasmid DNA pER-hEGF.
Клетки Е.coli ER2566/pER-hEGF являются суперпродуцентом. При индукции изопропилтио-β-D-галактозидом происходит эффективный биосинтез гибридного белка Int-hEGF, который накапливается в клетках в виде тел включения.E. coli ER2566 / pER-hEGF cells are superproducers. When isopropylthio-β-D-galactoside is induced, the biosynthesis of the Int-hEGF fusion protein is effective and accumulates in cells as inclusion bodies.
В результате создан продуцент Е.coli ER2566/pER-hEGF, в котором при индукции образуется гибридный белок Int-hEGF (фиг.ЗБ), содержащий на N-конце модифицированный интеин Ssp DnaB, включающий хитин-связывающий домен, а на С-конце - hEGF.As a result, E. coli producer ER2566 / pER-hEGF was created in which, upon induction, an Int-hEGF fusion protein is formed (Fig. ZB) containing a modified Ssp DnaB intein at the N-terminus including a chitin-binding domain, and at the C-terminus - hEGF.
Штамм-продуцент Е.coli ER2566/pER-hEGF культивируют в среде YT, содержащей 50 мг/мл ампициллина при 37°С до оптического поглощения культуры А595 0.8, затем индуцируют IPTG (до концентрации 0.2 мМ) и выращивают 4 ч при 37°С. Клетки отделяют центрифугированием (5000 g, 20 мин, 4°С). Из 1 л культуры получают 3.0 г влажных клеток. Клетки ресуспендируют в буфере А (50 мМ Трис-HCl, 10 мМ EDTA, 200 мМ NaCl, рН 10.0) и затем разрушают с помощью ультразвукового дезинтегратора. Осадок после центрифугирования (15000 g, 45 мин) отделяют, ресуспендируют в буфере А, снова центрифугируют, промывают буфером В (буфер А, содержащий 1% Тритона Х-100). Осадок телец включения растворяют в буфере С (буфер А, содержащий 6 М мочевину). Образовавшийся после солюбилизации телец включения раствор (15 мл) разбавляют буфером А, до концентрации мочевины 0,5 М при концентрации 0,25 мМ MESNA. Ренатурация гибридного белка и рефолдинг эпидермального фактора роста с образованием нативных S-S связей в составе гибридного белка происходит под воздействием кислорода воздуха в течение 48 ч при 4°С. Затем гибридный белок наносят на хитиновый сорбент и индуцируют автокаталитическое расщепление за счет смены буферов А на G (75 мл) (буфер А рН 6.5, содержащий 0,25 мМ MESNA), изменяя рН буфера с 10.0 до 6,5.The E. coli producer strain ER2566 / pER-hEGF was cultured in YT medium containing 50 mg / ml ampicillin at 37 ° C until optical absorption of A 595 0.8 culture, then IPTG was induced (to a concentration of 0.2 mM) and grown for 4 hours at 37 ° FROM. Cells are separated by centrifugation (5000 g, 20 min, 4 ° C). 3.0 g of wet cells are obtained from 1 l of culture. Cells are resuspended in buffer A (50 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, 200 mM NaCl, pH 10.0) and then destroyed using an ultrasonic disintegrator. The precipitate after centrifugation (15000 g, 45 min) is separated, resuspended in buffer A, centrifuged again, washed with buffer B (buffer A containing 1% Triton X-100). The precipitate of the inclusion bodies was dissolved in buffer C (buffer A containing 6 M urea). The solution (15 ml) formed after solubilization of the inclusion bodies was diluted with buffer A to a urea concentration of 0.5 M at a concentration of 0.25 mM MESNA. Renaturation of the hybrid protein and refolding of the epidermal growth factor with the formation of native SS bonds in the composition of the hybrid protein occurs under the influence of atmospheric oxygen for 48 hours at 4 ° C. Then, the hybrid protein is applied to a chitin sorbent and autocatalytic cleavage is induced by changing buffers A to G (75 ml) (buffer A pH 6.5, containing 0.25 mM MESNA), changing the pH of the buffer from 10.0 to 6.5.
Практически чистый hEGF с окисленными дисульфидными связями элюируют с хитинового сорбента буфером G. Получают 30 мл элюата с концентрацией 0,7 мг/мл. Выход hEGF составляет 5% (относительно суммарного белка клетки). Идентификацию полипептидных продуктов, получаемых при выделении, проводят с помощью MALDI-масс-спектрометрии. Последовательность рекомбинантного hEGF была подтверждена С-концевым секвенированием.Almost pure hEGF with oxidized disulfide bonds is eluted from the chitin sorbent with buffer G. 30 ml of an eluate with a concentration of 0.7 mg / ml are obtained. The yield of hEGF is 5% (relative to the total protein of the cell). Identification of the polypeptide products obtained by isolation is carried out using MALDI mass spectrometry. The sequence of recombinant hEGF was confirmed by C-terminal sequencing.
Изобретение иллюстрируют примеры.The invention is illustrated by examples.
Пример 1.Example 1
Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК pER-hEGFConstruction of Recombinant Plasmid DNA pER-hEGF
Химический синтез олигонуклеотидов выполняют твердофазным фосфоамидитным методом на ДНК-синтезаторе ASM-102U (БИОССЕТ, Новосибирск) с наращиванием олигонуклеотидной цепи в направлении от 3′-конца к 5′-концу с помощью защищенных фосфамидитов - 5′-диметокситритил-N-ацил-2′-дезоксинуклеозид-3′-О-(β-цианэтил-диизопропиламино)-фосфитов, активированных тетразолом. Синтез проводят в масштабе 0,5-0,7 мкмоль, используя в качестве носителя пористое стекло (размер пор 500 Å), к которому через 3′-сукцинатную связь присоединяют первое нуклеозидное звено (нагрузка 20-30 мкмоль/г). Используют синтетический цикл, описанный в работе (Nichols, N.M., Benner, J.S., Martin, D.D., Evans, T.C., Jr. // Biochemistry. 2003. V.42. P.5301-5311).Chemical synthesis of oligonucleotides is carried out by the solid-state phosphoamidite method on an ASM-102U DNA synthesizer (BIOSSET, Novosibirsk) with the oligonucleotide chain being expanded from the 3′-end to the 5′-end using protected phosphamidites - 5′-dimethoxytrityl-N-acyl-2 T-deoxynucleoside-3′-O- (β-cyanethyl-diisopropylamino) -phosphites activated by tetrazole. The synthesis is carried out on a scale of 0.5-0.7 μmol, using porous glass (pore size 500 Å) as a support, to which the first nucleoside unit (load 20-30 μmol / g) is connected via a 3′-succinate bond. Use the synthetic cycle described in (Nichols, N.M., Benner, J.S., Martin, D.D., Evans, T.C., Jr. // Biochemistry. 2003. V.42. P.5301-5311).
Полимеразную цепную реакцию проводят в 50 мкл инкубационной смеси, содержащей 10 нг плазмиды с искусственным геном рекомбинантного hEGF в качестве матрицы, 70 пмоль каждого праймера (P-int и P-ter), 1×буфер для Taq-ДНК-полимеразы, ΣdNTP (каждый в концентрации 1.25 мМ), 5 ед. Taq-ДНК-полимеразы. Полимеразную цепную реакцию проводят в ДНК-амплификаторе при следующих условиях: 1) денатурация 30 сек при 92°С, отжиг 30 сек при 56°С, элонгация 30 сек при 72°С (5 циклов); 2) денатурация 30 сек при 92°С, отжиг 30 сек при 60°С, элонгация 30 сек при 72°С (25 циклов). Результаты ПЦР определяют с помощью электрофореза ДНК в 2%-агарозном геле. Выделение ДНК (плазмидной или продуктов ПЦР) из агарозного геля проводят с помощью набора "DNA Gel Extraction Kit" (Millipore). Для приготовления 1%-ного раствора агарозы использовали 1×TAE буфер (40 мМ Tris-ацетат рН 8.0, 0,1 мМ Na2EDTA). После проведения электрофореза нужные фрагменты ДНК вырезают из агарозного геля и помещают в 1,5 мл-пробирки, прилагаемые к набору. Центрифугируют 10 минут при 5 об/мин.The polymerase chain reaction is carried out in 50 μl of the incubation mixture containing 10 ng of a plasmid with the artificial recombinant hEGF gene as a template, 70 pmol of each primer (P-int and P-ter), 1 × Taq DNA polymerase buffer, ΣdNTP (each at a concentration of 1.25 mm), 5 units. Taq DNA polymerase. The polymerase chain reaction is carried out in a DNA thermocycler under the following conditions: 1) denaturation for 30 sec at 92 ° C, annealing for 30 sec at 56 ° C, elongation for 30 sec at 72 ° C (5 cycles); 2) denaturation for 30 sec at 92 ° С, annealing for 30 sec at 60 ° С, elongation for 30 sec at 72 ° С (25 cycles). PCR results are determined by DNA electrophoresis in a 2% agarose gel. Isolation of DNA (plasmid or PCR products) from an agarose gel is performed using the DNA Gel Extraction Kit (Millipore). To prepare a 1% agarose solution, 1 × TAE buffer (40 mM Tris-acetate pH 8.0, 0.1 mM Na 2 EDTA) was used. After electrophoresis, the desired DNA fragments are excised from the agarose gel and placed in 1.5 ml tubes attached to the kit. Centrifuge for 10 minutes at 5 rpm.
1 мкг плазмидной ДНК pTWIN1 и 2 мкг искусственного гена hEGF (продукт ПЦР) отдельно друг от друга обрабатывают 10 ед. эндонуклеазы рестрикции SapI в 1x-кратном буфере для рестриктазы SapI (NewEnglandBiolabs) в 20 мкл реакционной смеси. Реакцию проводят в течение 1,5 часов при 37°С. Результаты рестрикции анализируют с помощью электрофореза в 1%-агарозном геле (для плазмидной ДНК) и 2%-агарозном геле (для продуктов ПЦР). Выделение ДНК (плазмидной или продуктов ПЦР) из агарозного геля проводят с помощью набора "DNA Gel Extraction Kit" (Millipore). Выделенные фрагменты отдельно друг от друга обрабатывают 10 ед. эндонуклеазы рестрикции BamHI в 1x-кратном буфере R (10 мМ трис-HCl, рН 8,0, 5 мМ MgCl2, 100 мМ KCl, 0,1 мг/мл BSA, 0.02% Triton X-100) в 40 мкл реакционной смеси. Реакцию проводят в течение 1,5 часов при 37°С.1 μg of plasmid DNA pTWIN1 and 2 μg of the artificial hEGF gene (PCR product) are separately treated with 10 units. SapI restriction endonuclease in 1x SapI restriction enzyme buffer (NewEnglandBiolabs) in 20 μl of the reaction mixture. The reaction is carried out for 1.5 hours at 37 ° C. The restriction results are analyzed by electrophoresis in 1% agarose gel (for plasmid DNA) and 2% agarose gel (for PCR products). Isolation of DNA (plasmid or PCR products) from an agarose gel is performed using the DNA Gel Extraction Kit (Millipore). The selected fragments separately from each other process 10 units. BamHI restriction endonucleases in 1x R buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 5 mM MgCl 2 , 100 mM KCl, 0.1 mg / ml BSA, 0.02% Triton X-100) in 40 μl reaction mixture . The reaction is carried out for 1.5 hours at 37 ° C.
Полученный при этом SapI/BamHI-фрагмент с геном рекомбинантного hEGF лигируют с векторной плазмидой pTWIN-1 (New England BioLabs), расщепленной по тем же сайтам рестриктаз. Лигирование проводят в 20 мкл инкубационной смеси, содержащей: 2 мкл 10х буфера для ДНК-лигазы фага Т4, 2 мкл 5 мМ АТР, 10 ед. ДНК-лигазы фага Т4 и 15 мкл лигазной смеси (pTWIN1 и встраиваемый фрагмент в соотношении 1:3). Реакционную смесь оставляют в холодильнике на ночь при +4°С.The resulting SapI / BamHI fragment with the recombinant hEGF gene is ligated with the vector plasmid pTWIN-1 (New England BioLabs) digested at the same restriction enzyme sites. Ligation is carried out in 20 μl of incubation mixture containing: 2 μl of 10x buffer for T4 phage DNA ligase, 2 μl of 5 mM ATP, 10 units. Phage T4 DNA ligases and 15 μl of the ligase mixture (pTWIN1 and the inserted fragment in a 1: 3 ratio). The reaction mixture is left in the refrigerator overnight at + 4 ° C.
Аликвоту лигазной смеси используют для трансформации компетентных клеток Е.coli ER2566). Трансформанты высевают на чашки с YT-агаром, содержащим 50 мкг/мл ампициллина. Скрининг рекомбинантов проводят с помощью гибридизации колоний in situ с 32P-меченым олигонуклеотидом Р-ter. Из гибридизующихся клонов выделяют ДНК плазмиды pER-hEGF и анализируют с помощью эндонуклеаз BamHI и EcoRI.An aliquot of the ligase mixture is used to transform competent E. coli cells ER2566). Transformants are plated on YT agar plates containing 50 μg / ml ampicillin. Recombinant screening is performed by in situ hybridization of the colonies with 32 P-labeled P ter oligonucleotide. PER-hEGF plasmid DNA was isolated from hybridizing clones and analyzed using BamHI and EcoRI endonucleases.
Пример 2.Example 2
Получение штамма-продуцента Е.coli ER2566/pER-hEGF и определение его продуктивности.Obtaining a producer strain of E. coli ER2566 / pER-hEGF and determining its productivity.
Штамм-продуцент Е.coli ER2566/pER-hEGF получают трансформацией компетентных клеток Е.coli ER2566 плазмидой pER-hEGF, как описано в примере 1. Клетки Е.coli ER2566, несущие плазмиду pER-hEGF, являются суперпродуцентом гибридного белка Int-hEGF (фиг.3Б).The E. coli ER2566 / pER-hEGF producer strain is obtained by transforming competent E. coli ER2566 cells with the pER-hEGF plasmid as described in Example 1. The E. coli ER2566 cells carrying the pER-hEGF plasmid are superproducers of the Int-hEGF fusion protein ( figb).
Штамм продуцент Е.coli ER2566/pER-hEGF выращивают при 37°С в 100 мл YT-бульона (рН 7,0) с 50 мкг/мл ампициллина в течение 2 ч на качалке со скоростью вращения 190 об/мин до мутности А550 0,7-0,8, прибавляют изопропилтио-β-D-галактозид до концентрации 0,2 мМ и продолжают процесс еще 6 ч. Каждый час отбирают пробу по 2 мл, определяют А550 и количество культуры, соответствующее 1 мл с А550 1,0, центрифугируют 5 мин при 6000 об/мин. Осажденные клетки в 100 мкл лизирующего буфера с красителем бромфеноловым синим обрабатывают 20 сек ультразвуком (18 кГц), нагревают 3 мин при 100°С и пробы по 1 мкл используют для электрофореза в 15% SDS-ПААГ. Гель прокрашивают кумасси R-250 по стандартной методике и сканируют с помощью денситометра Shimadzu CS-930.The strain producing E. coli ER2566 / pER-hEGF is grown at 37 ° C in 100 ml of YT-broth (pH 7.0) with 50 μg / ml ampicillin for 2 hours on a shaker at a speed of 190 rpm to a turbidity of A 550 0.7-0.8, isopropylthio-β-D-galactoside is added to a concentration of 0.2 mM and the process is continued for another 6 hours. Each hour, a 2 ml sample is taken, A 550 is determined and the amount of culture corresponding to 1 ml with A 550 1.0, centrifuged for 5 minutes at 6,000 rpm. The precipitated cells in 100 μl of bromphenol blue dye lysis buffer were sonicated for 20 seconds (18 kHz), heated for 3 min at 100 ° C, and 1 μl samples were used for electrophoresis in 15% SDS-PAGE. The gel was stained with Coomassie R-250 according to a standard technique and scanned using a Shimadzu CS-930 densitometer.
Пример 3.Example 3
Получение гибридного белка Int-hEGF.Obtaining a hybrid protein Int-hEGF.
Штамм продуцента Е.coli ER2566/pER-hEGF культивируют в среде YT, содержащей 50 мг/мл ампициллина при 37°С до оптического поглощения культуры А595 0.8, затем индуцируют IPTG (до концентрации 0.2 мМ) и выращивают 4 ч при 37°С. Клетки отделяют центрифугированием (5000 g, 20 мин, 4°С). Из 1 л культуры получают 3.0 г влажных клеток. Клетки ресуспендируют в буфере А (50 мМ Трис-HCl, 10 мМ EDTA, 200 мМ NaCl, pH 10.0) и затем разрушают с помощью ультразвукового дезинтегратора (18 кГц, при 4°С). Осадок после центрифугирования (15000 g, 45 мин) отделяют, ресуспендируют в буфере А, снова центрифугируют, промывают буфером В (буфер А, содержащий 1% Тритона Х-100). Осадок телец включения растворяют в буфере С (буфер А, содержащий 6 М мочевину).The E. coli producer strain ER2566 / pER-hEGF was cultured in YT medium containing 50 mg / ml ampicillin at 37 ° C until optical absorption of A 595 0.8 culture, then IPTG was induced (to a concentration of 0.2 mM) and grown for 4 h at 37 ° C . Cells are separated by centrifugation (5000 g, 20 min, 4 ° C). 3.0 g of wet cells are obtained from 1 l of culture. Cells are resuspended in buffer A (50 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, 200 mM NaCl, pH 10.0) and then destroyed by ultrasonic disintegrator (18 kHz, at 4 ° C). The precipitate after centrifugation (15000 g, 45 min) is separated, resuspended in buffer A, centrifuged again, washed with buffer B (buffer A containing 1% Triton X-100). The precipitate of the inclusion bodies was dissolved in buffer C (buffer A containing 6 M urea).
Пример 4.Example 4
Рефолдинг гибридного белка и одновременная ренатурация hEGF в составе гибридного белка.Refolding of the fusion protein and simultaneous renaturation of hEGF in the fusion protein.
Образовавшийся после солюбилизации телец включения раствор разбавляют буфером А до концентрации мочевины 0,5 М при концентрации 0,25 мМ MESNA. Рефолдинг гибридного белка и ренатурация эпидермального фактора роста с образованием нативных S-S связей в составе гибридного белка происходит под воздействием кислорода воздуха в течение 48 ч при 4°С.The solution formed after solubilization of the inclusion bodies is diluted with buffer A to a urea concentration of 0.5 M at a concentration of 0.25 mM MESNA. Hybrid protein refolding and epidermal growth factor renaturation with the formation of native S-S bonds in the hybrid protein occurs under the influence of atmospheric oxygen for 48 h at 4 ° C.
Пример 5.Example 5
Расщепление гибридного белка Int-hEGF и выделение hEGF.Cleavage of the Int-hEGF fusion protein and hEGF isolation.
Ренатурированный гибридный белок наносят на хитиновый сорбент и индуцируют автокаталитическое расщепление за счет смены буфера А на буфер G (буфер А pH 6,5, содержащий 0,25 мМ MESNA), изменяя pH буфера с 10,0 до 6,5. Практически чистый hEGF с окисленными дисульфидными связями элюируют с хитинового сорбента буфером G. Фракции с содержанием белка hEGF не менее 95% объединяют и лиофилизуют. Выход рекомбинантного hEGF составляет 21 мг/л культуры клеток штамма-продуцента.The renatured fusion protein is applied to the chitin sorbent and autocatalytic cleavage is induced by changing buffer A to buffer G (buffer A pH 6.5, containing 0.25 mM MESNA), changing the pH of the buffer from 10.0 to 6.5. Almost pure hEGF with oxidized disulfide bonds is eluted from the chitin sorbent with buffer G. Fractions with a hEGF protein content of at least 95% are combined and lyophilized. The yield of recombinant hEGF is 21 mg / l of the cell culture of the producer strain.
Claims (3)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2006118439/13A RU2323976C2 (en) | 2006-05-30 | 2006-05-30 | METHOD OF OBTAINING OF GENI-ENGENIERING ECDERONIC FACTOR OF PERSON GROWTH, PLASM RECOMBINATION DNA pER-hEGF, CODING HYBRID PROTEIN CAPABLE FOR AUTO-CATALYTIC SPLITTING, CAPABLE FOR AUTO-CATALYTIC SPLITTING WITH GENERATING OF EPIDERMAL FACTOR OF PERSON GROWTH, AND STAMP Escherichia coli ER2566/pER-hEGF-PRODUCER OF MENTIONED PROTEIN |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2006118439/13A RU2323976C2 (en) | 2006-05-30 | 2006-05-30 | METHOD OF OBTAINING OF GENI-ENGENIERING ECDERONIC FACTOR OF PERSON GROWTH, PLASM RECOMBINATION DNA pER-hEGF, CODING HYBRID PROTEIN CAPABLE FOR AUTO-CATALYTIC SPLITTING, CAPABLE FOR AUTO-CATALYTIC SPLITTING WITH GENERATING OF EPIDERMAL FACTOR OF PERSON GROWTH, AND STAMP Escherichia coli ER2566/pER-hEGF-PRODUCER OF MENTIONED PROTEIN |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2006118439A RU2006118439A (en) | 2007-12-10 |
| RU2323976C2 true RU2323976C2 (en) | 2008-05-10 |
Family
ID=38903532
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2006118439/13A RU2323976C2 (en) | 2006-05-30 | 2006-05-30 | METHOD OF OBTAINING OF GENI-ENGENIERING ECDERONIC FACTOR OF PERSON GROWTH, PLASM RECOMBINATION DNA pER-hEGF, CODING HYBRID PROTEIN CAPABLE FOR AUTO-CATALYTIC SPLITTING, CAPABLE FOR AUTO-CATALYTIC SPLITTING WITH GENERATING OF EPIDERMAL FACTOR OF PERSON GROWTH, AND STAMP Escherichia coli ER2566/pER-hEGF-PRODUCER OF MENTIONED PROTEIN |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2323976C2 (en) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2248983C1 (en) * | 2003-08-18 | 2005-03-27 | Позмогова Галина Евгеньевна | Peptide vector, method for its preparing, nucleotide sequence, recombinant plasmid dna and strain escherichia coli b-8389 vkpm for its preparing, method for genetic modification of mammalian and human cells |
-
2006
- 2006-05-30 RU RU2006118439/13A patent/RU2323976C2/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2248983C1 (en) * | 2003-08-18 | 2005-03-27 | Позмогова Галина Евгеньевна | Peptide vector, method for its preparing, nucleotide sequence, recombinant plasmid dna and strain escherichia coli b-8389 vkpm for its preparing, method for genetic modification of mammalian and human cells |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| YU R.J. et al., Intein-mediated rapid purification of recombinant human pituitary adenylate cyclase activating polypeptide, Acta. Biochim. Biophys. Sin., 2004, v.36, n.11, p.759-766. TONG WY et al., An improved procedure for production of human epidermal growth factor from recombinant E.coli, Appl. Microbiol. Biotechnol., 2001, v.57, n.5-6, p.674-679. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2006118439A (en) | 2007-12-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5427927A (en) | Process for the enzymatic cleavage of recombinant proteins using IgA proteases | |
| JPH0231682A (en) | Production of human egf | |
| CN114381471B (en) | Application of auxiliary protein in recombinant protein production and fusion expression system | |
| KR100914525B1 (en) | Novel N-Acetylglucosamine-2-Epimerase and Method for Producing CMP-neuraminic acid Using the Same | |
| KR100961528B1 (en) | Mass production method of active human epidermal growth factor in Escherichia coli | |
| CN101172996A (en) | Connecting peptide and polypeptide amalgamation representation method for polypeptide amalgamation representation | |
| RU2323976C2 (en) | METHOD OF OBTAINING OF GENI-ENGENIERING ECDERONIC FACTOR OF PERSON GROWTH, PLASM RECOMBINATION DNA pER-hEGF, CODING HYBRID PROTEIN CAPABLE FOR AUTO-CATALYTIC SPLITTING, CAPABLE FOR AUTO-CATALYTIC SPLITTING WITH GENERATING OF EPIDERMAL FACTOR OF PERSON GROWTH, AND STAMP Escherichia coli ER2566/pER-hEGF-PRODUCER OF MENTIONED PROTEIN | |
| JPH01211490A (en) | Human nerve growth factor gene segment | |
| CN114480409B (en) | Signal peptide and method for promoting secretory expression of collagen in corynebacterium glutamicum | |
| CN110607289A (en) | A kind of amino acid dehydrogenase and its application | |
| RU2619170C2 (en) | RECOMBINANT PLASMID DNA pER-ARNS3, ENCODING FUSION PROTEIN CAPABLE OF AUTOCATALYTIC SPLITTING WITH FORMATION OF ARNS3, ESCHERICHIA COLI STRAIN C3030/pER-ARNS3 PRODUCER OF SAID PROTEINS AND METHODS FOR RECOMBINANT ARNS3 PRODUCTION | |
| RU2181771C1 (en) | Recombinant plasmid dna perpins1 encoding amino acid sequence of human recombinant proinsulin and strain escherichia coli bl21(de3)/perpins1 as producer of human recombinant proinsulin | |
| RU2302465C2 (en) | METHOD FOR PRODUCTION OF HUMAN GENE ENGINEERED GLUCAGONE, RECOMBINANT PLASMIDE DNA pER-Gl, ENCODING AUTOCATALITICALLY CLEAVABLE HYBRID PROTEIN FORMING HUMAN GLUCAGONE AND STRAIN OF Escherichia coli ER-2566/pER-Gl AS PRODUCER OF SAID PROTEIN | |
| RU2233879C1 (en) | Recombinant plasmid dna pes1-6 encoding polypeptide somatotropin and strain escherichia coli bl21(de3)/pes1-6 as producer of recombinant somatotropin | |
| KR101039596B1 (en) | New In vivo Protein Expression Methods | |
| RU2316590C1 (en) | RECOMBINANT PLASMID DNA pE-His8-TrxL-Ar2 ENCODING FUSION PROTEIN COMPRISING ANTIMICROBIAL SEA ANNELID WORM Arenicola marina PEPTIDE ARENICIN AND STRAIN Escherichia coli BL21(DE3)/pE-His8-TrxL-Ar2 AS PRODUCER OF ARENICIN-CONTAINING FUSION PROTEIN | |
| RU2700452C1 (en) | Recombinant plasmid dna of ptrx-tevrs-pth coding a hybrid protein capable of proteolytic splitting to form a fragment of endogenous human parathyroid hormone (1-34), an escherichia coli bl21(de3)/ptrx-tevrs-pth strain - producer of said protein and a method of producing recombinant pth (1-34) | |
| RU2435858C2 (en) | RECOMBINANT PLASMID DNA pER-Hir CODING HYBRID PROTEIN CAPABLE TO AUTOCATALYTIC BREAKDOWN TO FORM [LeuL, Thr2]-63-DESULPHATOHIRUDIN, Escherichia coli ER2566/pER-Hir STRAIN - PRODUCER OF SAID PROTEIN AND METHOD FOR PRODUCING GENETICALLY ENGINEERED [LeuL, Thr2]-63-DESULPHATOHIRUDIN | |
| RU2408730C1 (en) | RECOMBINANT PROTEIN Collbd-BMP-7, RECOMBINANT PLASMID pCollbd-BMP-7, STRAIN Escherichia coli-PRODUCER OF RECOMBINANT PROTEIN Collbd-BMP-7, METHOD TO PRODUCE RECOMBINANT PROTEIN Collbd-BMP-7 | |
| RU2153535C1 (en) | Recombinant plasmid dna psa v27 encoding synthesis of soluble streptavidine from streptomyces avidinii and bacterial strain escherichia coli as producer of soluble streptavidine from streptomyces avidinii | |
| RU2593172C2 (en) | RECOMBINANT PLASMID DNA pER-TA1 GyrA-AcSer CODING SERINE ACETYLTRANSFERASE CAPABLE OF in vivo ACETYLATION OF N-TERMINAL SERINE DEACETYL-THYMOSIN α1 AND HYBRID PROTEIN CAPABLE OF AUTOCATALYTIC BREAKDOWN TO FORM HUMAN THYMOSIN α1, STRAIN OF Eschrichia coli C3030/pER-TA1GyrA-AcSer PRODUCER OF SAID PROTEINS AND METHOD OF PRODUCING GENETICALLY ENGINEERED HUMAN THYMOSIN | |
| RU2179188C2 (en) | Method of producing recombinant purine nucleoside phosphory-lase, recombinant plasmid dna perpupho1 and strain escherichia coli bl21(de3)perpuho1 for its realization | |
| RU2260049C2 (en) | Recombinant plasmid dna pes3-7 encoding peptide with sequence of human granulocyte colony-stimulating factor (g-csf) and strain escherichia coli bl21(de3)/pes3-7 as producer of human recombinant g-csf | |
| RU2177998C2 (en) | Method of preparing recombinant uridine phosphorylase, recombinant plasmid dna perurph01 and strain of escherichia coli bl 21(dez)/perurph01 for its realization | |
| RU2347811C1 (en) | RECOMBINANT PLASMID DNA pET-KSI-Buf2, CODING HYBRID PROTEIN, CONTAINING ANTIMICROBIAL PEPTIDE BUFORIN-2, STRAIN OF Escherichia coli BL21(DE3)/pET-KSI-Buf2-PRODUCER OF INDICATED PROTEIN AND METHOD OF OBTAINING ANTIMICROBIAL PEPTIDE BUFORIN-2 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20110531 |
|
| NF4A | Reinstatement of patent |
Effective date: 20120610 |
|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20170531 |