RU2320993C2

RU2320993C2 - Method for evaluating blood erythrocyte membrane state

Info

Publication number: RU2320993C2
Application number: RU2006104755/15A
Authority: RU
Inventors: Вероника Петровна Терещенко (RU); Вероника Петровна Терещенко; Валерий Тимофеевич Манчук (RU); Валерий Тимофеевич Манчук; Сергей Юрьевич Терещенко (RU); Сергей Юрьевич Терещенко; жна Тать на Александровна Колод (RU); Татьяна Александровна Колодяжная; Юрий Анатольевич Терещенко (RU); Юрий Анатольевич Терещенко
Original assignee: ГУ Научно-исследовательский институт медицинских проблем Севера СО РАМН
Priority date: 2006-02-15
Filing date: 2006-02-15
Publication date: 2008-03-27
Also published as: RU2006104755A

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: method involves separating erythrocytes from heparin-treated venous blood by means of laser radiation before and after treatment course. The so produced erythrocyte suspension is diluted with physiologic saline to required concentration. Fluorescent dimethylamine chalcon probe is added and its fluorescence is measured. Blood erythrocyte membrane state is evaluated from value scale. Fluorescence value being less than 10 fl. units, light state change degree is considered to be the case. The value being equal to 10-50 fl. units, moderate (optimum) degree is the case. The value being greater than 50 fl. units, high degree of erythrocyte membrane transformation, caused by laser radiation, is considered to be the case.

EFFECT: high sensitivity and information capacity of the method.

1 tbl

Description

Изобретение относится к области медицины, а именно к лабораторным методам исследования, и может быть использовано для характеристики состояния клеточных мембран при внешних воздействиях на организм.The invention relates to medicine, namely to laboratory research methods, and can be used to characterize the state of cell membranes under external influences on the body.

Известен способ оценки изменения состояния мембран эритроцитов [1], сущность которого заключается в том, что из крови выделяют эритроциты и помещают в кювету агрегометра. В качестве индуктора агрегации используют пикриновую кислоту, которую добавляют до конечной концентрации 3-5 мМ. Об изменении состояния мембран эритроцитов судят по степени их агрегации в сравнении с контрольными.There is a method of assessing changes in the state of erythrocyte membranes [1], the essence of which is that red blood cells are isolated from the blood and placed in an aggregometer cuvette. Picric acid is used as an aggregation inducer, which is added to a final concentration of 3-5 mM. The change in the state of erythrocyte membranes is judged by the degree of their aggregation in comparison with the control.

Известный способ не является физиологичным, поскольку при оценке изменения состояния эритроцитарных мембран используется пикриновая кислота, приводящая к повреждению мембран. Между тем, в медицинской практике, например, при проведении физиолечения возникает необходимость в оценке изменений в мембранах эритроцитов у больных, подвергающихся терапевтическому воздействию излучения, например лазерного. Известный метод не позволяет сделать это физиологично и информативно, что ограничивает область его применения.The known method is not physiological, since in assessing changes in the state of red blood cell membranes picric acid is used, leading to damage to the membranes. Meanwhile, in medical practice, for example, when conducting physiotherapy, there is a need to assess changes in the membranes of red blood cells in patients exposed to therapeutic radiation, such as laser. The known method does not allow to do this physiologically and informatively, which limits the scope of its application.

Задача изобретения - создание физиологичного и информативного способа оценки изменения состояния мембран эритроцитов крови.The objective of the invention is the creation of a physiological and informative way of assessing changes in the state of the membranes of red blood cells.

Задача решается тем, что способ, согласно изобретению, заключается в спектрофлуориметрическом исследовании мембран эритроцитов крови. Оценка изменения состояния мембран эритроцитов производится по изменению флуоресценции зонда диметиламинохалкона (ДМХ), определенной до и после терапевтического воздействия на организм. Для этого из цельной гепаринизированной венозной крови выделяют эритроциты, разводят их физиологическим раствором до необходимой концентрации, и после добавления к эритроцитам флуоресцирующего зонда диметиламинохалкона (ДМХ) проводят измерение флуоресценции зонда. О степени изменения состояния мембран эритроцитов судят по оценочной шкале. При изменении величины флуоресценции менее 10 ед.фл. определяют низкую степень, при 10-50 ед.фл. - среднюю (оптимальную) степень, выше 50 ед.фл. - повышенную степень изменении состояния мембран эритроцитов.The problem is solved in that the method according to the invention consists in a spectrofluorimetric study of blood red blood cell membranes. The change in the state of erythrocyte membranes is assessed by the change in fluorescence of the dimethylaminochalcone probe (DMX), determined before and after the therapeutic effect on the body. To do this, erythrocytes are isolated from whole heparinized venous blood, diluted with physiological saline to the required concentration, and after adding a dimethylaminochalcone (DMX) fluorescence probe to the red blood cells, the probe fluorescence is measured. The degree of change in the state of red blood cell membranes is judged by a rating scale. With a change in fluorescence of less than 10 units determine a low degree, with 10-50 units of fl. - average (optimal) degree, above 50 units - an increased degree of change in the state of red blood cell membranes.

Установлено, что физиотерапевтическое воздействие на организм оказывает благоприятное действие на клеточные мембраны [2], поэтому изменение состояния мембран, определенное заявленным методом, отражает степень лечебного эффекта на уровне биомембран клеток крови и является его количественным выражением. Применяемый флуоресцирующий зонд ДМХ, соединяясь с мембранами эритроцитов, отражает биофизическое состояние мембран, а именно степень их гидрофобности [3].It has been established that the physiotherapeutic effect on the body has a beneficial effect on cell membranes [2], therefore, the change in the state of the membranes determined by the claimed method reflects the degree of therapeutic effect at the level of blood cell biomembranes and is its quantitative expression. The DMX fluorescent probe used, connecting with erythrocyte membranes, reflects the biophysical state of the membranes, namely, the degree of their hydrophobicity [3].

Способ осуществляется следующим образом.The method is as follows.

В две пробирки (1-я и 2-я пробы) набирают по 1 мл венозной крови больного. В 1-ю пробирку (1-я проба) кровь набирают до предполагаемого изменения мембран клеток крови, например, до проводимого физиолечения. Во 2-ю пробирку (2-я проба) - после возможного изменения состояния мембран (например, после курса физиолечения). Эритроциты выделяют из цельной гепаринизированной венозной крови на градиенте фиколл-верографин. Суспензию эритроцитов на физиологическом растворе разводят до оптической плотности 0,700 ед. в 0,5 см кювете при длине волны поглощения 650 нм. Для оценки изменения состояния мембран эритроцитов крови используют зонд диметиламинохалкона (ДМХ) в концентрации 5 мкМ: 50 мкМ суспензии. После добавления зонда ДМХ к эритроцитам на спектрофлуориметре определяют флуоресценцию зонда. Определение проводят при следующих параметрах: длина волны возбуждения 427 нм, длина волны флуоресценции 548 нм. Результаты выражают в единицах флуоресценции (ед.фл.). Значения флуоресценции зонда ДМХ в 1-ой и 2-ой пробах сравнивают и по вычисленному изменению с использованием разработанной оценочной шкалы определяют степень изменения состояния мембран эритроцитов (см. таблицу).In two test tubes (1st and 2nd samples) collect 1 ml of venous blood of the patient. In the 1st test tube (1st test), blood is collected until the proposed change in the membranes of blood cells, for example, before physiotherapy. In the 2nd test tube (2nd test) - after a possible change in the state of the membranes (for example, after a course of physiotherapy). Red blood cells are isolated from whole heparinized venous blood on a ficoll-verographin gradient. A suspension of red blood cells in saline is diluted to an optical density of 0.700 units. in a 0.5 cm cuvette at an absorption wavelength of 650 nm. To assess changes in the state of the membranes of red blood cells, a dimethylaminochalcone (DMX) probe is used at a concentration of 5 μM: 50 μM suspension. After adding a DMX probe to red blood cells, fluorescence of the probe is determined on a spectrofluorimeter. The determination is carried out with the following parameters: excitation wavelength of 427 nm, fluorescence wavelength of 548 nm. The results are expressed in units of fluorescence (units fl.). The fluorescence values of the DMX probe in the 1st and 2nd samples are compared and the degree of change in the state of erythrocyte membranes is determined by the calculated change using the developed evaluation scale (see table).

Оценочная шкалаGrading scale Изменение величины флуоресценции зонда ДМХ (ед.фл.)Change in the fluorescence value of the DMX probe (unit fl.) Степень изменения состояния мембранThe degree of change in the condition of the membranes Менее 10Less than 10 НизкаяLow 10-5010-50 Средняя (оптимальная)Medium (optimal) Более 50More than 50 ПовышеннаяIncreased

Способ апробирован в физиоотделении клиники Красноярского Института медицинских проблем Севера.The method was tested in the physiological department of the clinic of the Krasnoyarsk Institute of Medical Problems of the North.

Пример 1. Больной А. Проходил курс лечения лазерным излучением. Диагноз: Атопический дерматит. После 6 лечебных процедур проведена оценка степени изменения состояния мембран эритроцитов по предлагаемому способу. Результаты измерения флуоресценции зонда ДМХ на спектрофлуориметре до начала лечения (1 проба) и после лечения (2 проба): 1 проба - 43,3 ед.фл., 2 проба - 56,4 ед.фл. Изменение величины флуоресценции составляет 13,1 ед.фл. Согласно оценочной шкале, это соответствует средней (оптимальной) степени изменения состояния мембран эритроцитов на воздействие лазерного излучения. Следовательно, проведенный курс лечения следует считать достаточным.Example 1. Patient A. Underwent a course of treatment with laser radiation. Diagnosis: Atopic dermatitis. After 6 treatment procedures, an assessment of the degree of change in the state of the membranes of red blood cells by the proposed method. The results of measuring the fluorescence of the DMX probe on a spectrofluorimeter before treatment (1 sample) and after treatment (2 samples): 1 sample - 43.3 units of fl., 2 sample - 56.4 units of fl. The change in fluorescence is 13.1 units According to the rating scale, this corresponds to the average (optimal) degree of change in the state of erythrocyte membranes due to laser radiation. Therefore, the course of treatment should be considered sufficient.

Пример 2. Больной Б. Диагноз: Хронический гастрит. Проходил курс лечения лазерным излучением. После 10 лечебных процедур проведена оценка степени изменения состояния мембран эритроцитов по предлагаемому способу. Результаты измерения флуоресценции зонда ДМХ на спектрофлуориметре до начала лечения (1 проба) и после лечения (2 проба): 1 проба - 56,4 ед.фл., 2 проба - 60,4 ед.фл. Изменение величины флуоресценции составляет 4 ед.фл. Согласно оценочной шкале, это соответствует низкой степени изменения состояния мембран эритроцитов к воздействию лазерного излучения. Следовательно, проводимый курс лазеротерапии следует отменить вследствие неэффективности его для данного больного.Example 2. Patient B. Diagnosis: Chronic gastritis. He was undergoing laser treatment. After 10 treatment procedures, an assessment of the degree of change in the state of the membranes of red blood cells by the proposed method. The results of measuring the fluorescence of the DMX probe on a spectrofluorimeter before treatment (1 sample) and after treatment (2 samples): 1 sample - 56.4 units of fl., 2 sample - 60.4 units of fl. The change in fluorescence is 4 units According to the rating scale, this corresponds to a low degree of change in the state of red blood cell membranes due to laser radiation. Therefore, the ongoing course of laser therapy should be canceled due to its inefficiency for this patient.

Пример 3. Больной С. Диагноз: Трофическая язва голени. Проходил курс лечения лазеротерапией. После 6 лечебных процедур проведена оценка степени изменения состояния мембран эритроцитов по предлагаемому способу. Результаты измерения флуоресценции зонда ДМХ на спектрофлуориметре: 1 проба (до начала лечения) - 35,4 ед.фл.; 2 проба (после лечения) - 96,4 ед.фл. Изменение величины флуоресценции составляет 61 ед.фл. Согласно оценочной шкале, это соответствует повышенной степени изменения состояния мембран эритроцитов. Следовательно, дозу воздействия лазером следует снизить.Example 3. Patient C. Diagnosis: Trophic ulcer of the leg. He was undergoing laser therapy. After 6 treatment procedures, an assessment of the degree of change in the state of the membranes of red blood cells by the proposed method. The results of measuring the fluorescence of the DMX probe on a spectrofluorimeter: 1 sample (before treatment) - 35.4 units; 2 samples (after treatment) - 96.4 units The change in fluorescence is 61 units fl. According to the rating scale, this corresponds to an increased degree of change in the state of red blood cell membranes. Therefore, the dose of laser exposure should be reduced.

Таким образом, предложенный физиологичный способ оценки изменения состояния мембран эритроцитов крови обеспечивает высокую чувствительность и информативность при внешнем воздействии на организм и может быть использован в медицинской практике, например, при физиолечении.Thus, the proposed physiological method for assessing changes in the state of blood erythrocyte membranes provides high sensitivity and information when exposed to the body and can be used in medical practice, for example, with physiotherapy.

Источники информацииInformation sources

1. Шереметьев Ю.А. и др. Способ оценки изменения состояния мембран эритроцитов. RU 2238556 С2. Дата публ. 20.10.004.1. Sheremetyev Yu.A. et al. A method for assessing changes in the state of red blood cell membranes. RU 2238556 C2. Publication Date 10.20.004.

2. Боголюбов В.М., Пономаренко Г.Н. Общая физиотерапия. - Учебник. - 2-е издание. - М., СПб., 1997 - С.214.2. Bogolyubov V.M., Ponomarenko G.N. General physiotherapy. - The textbook. - 2nd edition. - M., St. Petersburg., 1997 - S. 214.

3. Владимиров Ю.А., Добрецов Г.Е. Флуоресцентные зонды в исследовании биологических мембран. М.: Наука, 1980 - С.111-113.3. Vladimirov Yu.A., Dobretsov G.E. Fluorescent probes in the study of biological membranes. M .: Nauka, 1980 - S.111-113.

Claims

A method for assessing changes in the state of blood erythrocyte membranes by spectrofluorimetric examination of cell membranes, characterized in that before and after a course of laser treatment, erythrocytes are isolated from whole heparinized venous blood, the resulting erythrocyte suspension is diluted with physiological saline to the required concentration, a fluorescence probe of dimethylaminochalk is added, measure the fluorescence of the DMX probe and the degree of change in the state of the membranes of red blood cells is judged by rating scales e: when changing the magnitude of the fluorescence of less than 10 units fl. determine a low degree, at 10-50 units. fl. - average (optimal) degree, above 50 units. fl. - an increased degree of change in the state of red blood cell membranes when exposed to laser radiation.