RU2380405C2 - Method for making recombinant human alpha 16-interferon and pharmaceutical composition for treating viral diseases based on recombinant human alpha 16-interferon - Google Patents
Method for making recombinant human alpha 16-interferon and pharmaceutical composition for treating viral diseases based on recombinant human alpha 16-interferon Download PDFInfo
- Publication number
- RU2380405C2 RU2380405C2 RU2007143928/13A RU2007143928A RU2380405C2 RU 2380405 C2 RU2380405 C2 RU 2380405C2 RU 2007143928/13 A RU2007143928/13 A RU 2007143928/13A RU 2007143928 A RU2007143928 A RU 2007143928A RU 2380405 C2 RU2380405 C2 RU 2380405C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- interferon
- alpha
- recombinant
- human
- ethylenediaminetetraacetic acid
- Prior art date
Links
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 title claims abstract description 75
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 16
- 201000010099 disease Diseases 0.000 title claims description 7
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 title claims description 7
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 title claims description 5
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 title claims 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 29
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 29
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 claims abstract description 24
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 24
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 claims abstract description 24
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 claims abstract description 24
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims abstract description 13
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 claims abstract description 10
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 9
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 claims abstract description 8
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 8
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 claims abstract description 8
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 claims abstract description 8
- JVIPLYCGEZUBIO-UHFFFAOYSA-N 2-(4-fluorophenyl)-1,3-dioxoisoindole-5-carboxylic acid Chemical compound O=C1C2=CC(C(=O)O)=CC=C2C(=O)N1C1=CC=C(F)C=C1 JVIPLYCGEZUBIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 4
- 229920001425 Diethylaminoethyl cellulose Polymers 0.000 claims abstract description 4
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 claims description 33
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 claims description 33
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 30
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 14
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 claims description 13
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 13
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 claims description 13
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 claims description 13
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 8
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 7
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 7
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 claims description 6
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 claims description 6
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 claims description 5
- 239000012535 impurity Substances 0.000 claims description 5
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 claims description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 5
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 4
- 239000002775 capsule Substances 0.000 claims description 3
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 claims description 3
- 239000008187 granular material Substances 0.000 claims description 3
- 239000002502 liposome Substances 0.000 claims description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 3
- 239000000829 suppository Substances 0.000 claims description 3
- 239000006188 syrup Substances 0.000 claims description 3
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000003826 tablet Substances 0.000 claims description 3
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims description 2
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 claims description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 2
- 239000006196 drop Substances 0.000 claims 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 claims 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 47
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 13
- 238000000746 purification Methods 0.000 abstract description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 4
- 244000005700 microbiome Species 0.000 abstract description 4
- 239000003599 detergent Substances 0.000 abstract description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 abstract description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 abstract description 3
- 239000001166 ammonium sulphate Substances 0.000 abstract 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 46
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 28
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 25
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 14
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 13
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 13
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 11
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 9
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 101000959794 Homo sapiens Interferon alpha-2 Proteins 0.000 description 7
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 7
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 7
- 102000051099 human IFNA2 Human genes 0.000 description 7
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 7
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 7
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 7
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 5
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 5
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N Nitric oxide Chemical compound O=[N] MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 230000007665 chronic toxicity Effects 0.000 description 4
- 231100000160 chronic toxicity Toxicity 0.000 description 4
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 4
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 4
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 4
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 4
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 4
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 4
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 4
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 4
- GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N DEAE-cellulose Chemical compound OC1C(O)C(O)C(CO)O[C@H]1O[C@@H]1C(CO)OC(O)C(O)C1O GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 description 3
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 3
- 241000710959 Venezuelan equine encephalitis virus Species 0.000 description 3
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 3
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 3
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 3
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 3
- 238000010562 histological examination Methods 0.000 description 3
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 3
- 229940065638 intron a Drugs 0.000 description 3
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 3
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 3
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 3
- 229940127557 pharmaceutical product Drugs 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 3
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010078049 Interferon alpha-2 Proteins 0.000 description 2
- 208000037386 Typhoid Diseases 0.000 description 2
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 210000004100 adrenal gland Anatomy 0.000 description 2
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 2
- 235000019846 buffering salt Nutrition 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000001647 drug administration Methods 0.000 description 2
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 2
- 231100000915 pathological change Toxicity 0.000 description 2
- 230000036285 pathological change Effects 0.000 description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 201000008297 typhoid fever Diseases 0.000 description 2
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 2
- 206010027654 Allergic conditions Diseases 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000012619 Butyl Sepharose® Substances 0.000 description 1
- 102000013392 Carboxylesterase Human genes 0.000 description 1
- 108010051152 Carboxylesterase Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 229920002271 DEAE-Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000712431 Influenza A virus Species 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 102000003896 Myeloperoxidases Human genes 0.000 description 1
- 108090000235 Myeloperoxidases Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 208000006265 Renal cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 241000555745 Sciuridae Species 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- CCBJETYDMFCKJZ-UHFFFAOYSA-L [OH-].[OH-].[Na+].[Cl+] Chemical compound [OH-].[OH-].[Na+].[Cl+] CCBJETYDMFCKJZ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 1
- 230000002927 anti-mitotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 210000001198 duodenum Anatomy 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- -1 elixirs Substances 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 230000002124 endocrine Effects 0.000 description 1
- 210000000750 endocrine system Anatomy 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 1
- 210000000777 hematopoietic system Anatomy 0.000 description 1
- 102000051101 human IFNA1 Human genes 0.000 description 1
- 108700028467 human IFNA1 Proteins 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 231100000566 intoxication Toxicity 0.000 description 1
- 230000035987 intoxication Effects 0.000 description 1
- 206010023332 keratitis Diseases 0.000 description 1
- 238000009533 lab test Methods 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 231100000682 maximum tolerated dose Toxicity 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 1
- 230000000771 oncological effect Effects 0.000 description 1
- 230000001936 parietal effect Effects 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 210000001539 phagocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006920 protein precipitation Effects 0.000 description 1
- 230000004223 radioprotective effect Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000029058 respiratory gaseous exchange Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000013112 stability test Methods 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 235000000891 standard diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 208000003265 stomatitis Diseases 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000011287 therapeutic dose Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 description 1
- 230000002110 toxicologic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000027 toxicology Toxicity 0.000 description 1
- 231100000041 toxicology testing Toxicity 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 208000005925 vesicular stomatitis Diseases 0.000 description 1
- 210000001835 viscera Anatomy 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019786 weight gain Nutrition 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области биотехнологии, медицины и фармакологии, касается фармацевтического препарата на основе альфа 16-интерферона человека и способа его получения. Интерфероны вырабатываются клетками в ответ на вирусную инфекцию. Они обеспечивают противовирусную защиту организма, оказывают антимикробное, противовоспалительное, иммуномодулирующее, противоопухолевое, радиопротективное и антимитотическое действие (Ершов Ф.И. Система интерферона в норме и патологии. 1996; Pestka S. Biopolymers. 2000. V.55. P.254-287).The invention relates to the field of biotechnology, medicine and pharmacology, relates to a pharmaceutical preparation based on human alpha 16-interferon and a method for its preparation. Interferons are produced by cells in response to a viral infection. They provide antiviral protection for the body, have antimicrobial, anti-inflammatory, immunomodulatory, antitumor, radioprotective and antimitotic effects (Ershov F.I. The system of interferon is normal and pathological. 1996; Pestka S. Biopolymers. 2000. V.55. P.254-287 )
Препараты на основе альфа-интерферона человека используются для лечения вирусных заболеваний: гепатитов В и С (Chin R., Locarnini S. Curr. Opin. Infect. Dis. 1998. V.11. P. 719-726; Guo J.T. et al. J. Virol. 2001. V.75. P.8516-8523), герпетической инфекции (Siebeck N. et al. Am. J. Vet. Res. 2006. V.67. P.1406-1411), кератитов, гриппа (Brassard D.L. et al. J. Leukoc. Biol. 2002. V.7. P.565-581), атипичной пневмонии (Cinatl J. et al. Lancet. 2003. V.362. P.293-294), онкологических заболеваний: рака простаты, почечноклеточного рака, рака молочной железы, лейкемии, меланомы (Volberding P.A. et al. Cancer. 1987. V.59. Р.620-625; Borden B.C. Oncologist. 1998. V.3. P.198-203; Bukowski R.M. Semin. Oncol. 2000. V.27. P.204-212; Kramer G. et al. J. Interferon Cytokine Res. 2001. V.21. P.475-484; Молчанов О.Е. и др. Современные тенденции иммунотерапии злокачественных опухолей. 2001) и аутоиммунных заболеваний человека (Piskova J. et al. Invest. Ophtalmol. Vis. Sci. 2006. V.47. P.3946-3950).Human alpha-interferon-based drugs are used to treat viral diseases: hepatitis B and C (Chin R., Locarnini S. Curr. Opin. Infect. Dis. 1998. V.11. P. 719-726; Guo JT et al. J. Virol. 2001. V.75. P.8516-8523), herpetic infection (Siebeck N. et al. Am. J. Vet. Res. 2006. V.67. P.1406-1411), keratitis, influenza (Brassard DL et al. J. Leukoc. Biol. 2002. V.7. P.565-581), SARS (Cinatl J. et al. Lancet. 2003. V.362. P.293-294), oncological diseases: prostate cancer, renal cell carcinoma, breast cancer, leukemia, melanoma (Volberding PA et al. Cancer. 1987. V.59. P.620-625; Borden BC Oncologist. 1998. V.3. P.198-203 ; Bukowski RM Semin. Oncol. 2000. V.27. P.204-212; Kramer G. et al. J. Interfero n Cytokine Res. 2001. V.21. P.475-484; Molchanov O.E. et al. Current Trends in Immunotherapy of Malignant Tumors. 2001) and Human Autoimmune Diseases (Piskova J. et al. Invest. Ophtalmol. Vis. Sci . 2006. V.47. P.3946-3950).
Интерфероны вырабатываются в организме в малых дозах, что делает невозможным получение в нужных количествах препаратов этих белков из донорской крови или культуры специализированных клеток. Известен препарат, содержащий в качестве действующего начала природный альфа2-интерферон, полученный из донорской крови (производства «Биомед», Россия). Однако существует опасность заражения конечного продукта вирусами гепатита В, С и ВИЧ, что ограничивает применение данного препарата.Interferons are produced in the body in small doses, which makes it impossible to obtain the right amount of preparations of these proteins from donated blood or a specialized cell culture. A known preparation containing as active principle natural alpha2-interferon obtained from donated blood (produced by Biomed, Russia). However, there is a risk of infection of the final product with hepatitis B, C and HIV viruses, which limits the use of this drug.
С развитием технологий рекомбинантных ДНК стало возможным создавать микроорганизмы - продуценты биологически-активных веществ, в том числе и интерферонов. В настоящее время иммунотерапия рекомбинантными интерферонами является одним из наиболее перспективных и постоянно расширяющихся направлений иммунофармакологии.With the development of recombinant DNA technologies, it has become possible to create microorganisms - producers of biologically active substances, including interferons. Currently, immunotherapy with recombinant interferons is one of the most promising and constantly expanding areas of immunopharmacology.
Известны способы получения рекомбинантного альфа2-интерферона человека из клеток бактерий Е. coli (патент RU 2242516, опубликованный 18.12.2003, и патент RU 2294372, опубликованный 16.06.2005). При использовании бактериальной системы экспрессии рекомбинантные белки накапливаются в нерастворимом состоянии в виде «телец включения», что требует дополнительных усилий по ренатурации целевых белков.Known methods for producing recombinant human alpha2-interferon from bacteria cells of E. coli (patent RU 2242516, published December 18, 2003, and patent RU 2294372, published June 16, 2005). When using a bacterial expression system, recombinant proteins accumulate in an insoluble state in the form of “inclusion bodies”, which requires additional efforts to renature target proteins.
Этих недостатков лишены системы экспрессии дрожжей. Использование в качестве продуцентов метилотрофных дрожжей Pichia pastoris дает возможность существенно повысить выход рекомбинантных белков и избежать гипергликозилирования секретируемых гетерологичных белков (Cereghino J.L., Cregg J.M. FEMS Microbiol.Rev. 2000. V.24. P.45-66). Однако выход конечного продукта в виде целевого рекомбинантного белка во многом зависит от используемой технологии его выделения и очистки.These deficiencies lack the yeast expression system. The use of methylotrophic yeast Pichia pastoris as producers makes it possible to significantly increase the yield of recombinant proteins and to avoid hyperglycosylation of secreted heterologous proteins (Cereghino J.L., Cregg J.M. FEMS Microbiol.Rev. 2000. V.24. P.45-66). However, the yield of the final product in the form of the target recombinant protein largely depends on the technology used for its isolation and purification.
В настоящее время выделено и охарактеризовано 23 альфа-интерферона человека, которые на 80% идентичны между собой и обладают общими функциональными признаками (Pestka S. Biopolymers. 2000. V.55. Р.254-287). Спектр активностей и соотношение альфа-интерферонов разных подтипов зависит от типа клеток и может меняться при некоторых заболеваниях (Hiscott J. et al. Philos. Trans. R. Soc. (Biol. Sci). 1984. V.307. P.217-226; Hu R. et al. J. Biol. Chem. 1993. V.268. P.12591-12595; Sperber S.J. et al. J. Interferon Res. 1992. V.12. P.363-368). Для выявления индивидуальных особенностей действия необходимо изучать различные альфа-интерфероны человека.At present, 23 human alpha-interferon are isolated and characterized, which are 80% identical to each other and share common functional features (Pestka S. Biopolymers. 2000. V.55. P.254-287). The spectrum of activities and the ratio of alpha-interferons of different subtypes depends on the type of cells and can vary with certain diseases (Hiscott J. et al. Philos. Trans. R. Soc. (Biol. Sci). 1984. V.307. P.217- 226; Hu R. et al. J. Biol. Chem. 1993. V.268. P.12591-12595; Sperber SJ et al. J. Interferon Res. 1992. V.12. P.363-368). To identify the individual characteristics of the action, it is necessary to study various alpha interferons of a person.
Известны штаммы дрожжей Pichia pastoris - продуценты альфа1-интерферона человека (патент US 20030065148, опубликованный 03.04.2003), альфа 16-интерферона человека, ранее полученный авторами заявляемого изобретения (патент RU 2203950, опубликованный 10.05.2003) и альфа2-интерферона человека (международная заявка WO 4039996, опубликованная 13.05.2004).Known yeast strains of Pichia pastoris - producers of human alpha1-interferon (patent US 20030065148, published 03.04.2003), human alpha 16-interferon, previously obtained by the authors of the claimed invention (patent RU 2203950, published 10.05.2003) and human alpha2-interferon (international application WO 4039996 published May 13, 2004).
Штамм дрожжей Pichia pastoris депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под номером Y-2949.The strain of Pichia pastoris yeast is deposited in the All-Russian collection of industrial microorganisms under the number Y-2949.
Известен способ выделения и очистки альфа2b -интерферона из культуральной жидкости дрожжей Pichia pastoris KM71 (международная заявка WO 4039996, опубликованная 13.05.2004), который является наиболее близким аналогом к заявляемому способу и выбран в качестве прототипа. Способ заключается в культивировании рекомбинантного штамма Pichia pastoris в питательной среде, обеспечивающей рост клеток и синтез целевого белка, удалении клеток, двухстадийной ионообменной хроматографии на сорбентах типа CM Sepharose FF и DEAE Sepharose FF, осаждении целевого белка сульфатом аммония, гидрофобной хроматографии на Butyl Sepharose FF, ультрафильтрации с мембраной YM 10 (10000 MWCO), гель-фильтрации на сорбенте типа Sephacryl HR 200.A known method for the isolation and purification of alpha-2b-interferon from the culture fluid of the yeast Pichia pastoris KM71 (international application WO 4039996, published May 13, 2004), which is the closest analogue to the claimed method and is selected as a prototype. The method consists in cultivating a recombinant strain of Pichia pastoris in a nutrient medium providing cell growth and synthesis of the target protein, removing cells, two-stage ion-exchange chromatography on sorbents such as CM Sepharose FF and DEAE Sepharose FF, precipitating the target protein with ammonium sulfate, hydrophobic chromatography on Butyl Sepharose F ultrafiltration with a membrane YM 10 (10000 MWCO), gel filtration on a sorbent type Sephacryl HR 200.
Недостатком известного способа является его многостадийность и низкая технологичность, что существенно ограничивает возможность использования известной технологии для промышленного производства интерферона.The disadvantage of this method is its multi-stage and low manufacturability, which significantly limits the possibility of using the known technology for the industrial production of interferon.
Техническим результатом заявляемого изобретения является упрощение технологии, повышение эффективности очистки целевого белка и получение на его основе стабильного фармацевтического препарата в жидкой и сухой лиофилизованной формах, а также возможность использования заявленной технологии в промышленном производстве.The technical result of the claimed invention is to simplify the technology, increase the efficiency of purification of the target protein and obtain on its basis a stable pharmaceutical preparation in liquid and dry lyophilized forms, as well as the possibility of using the claimed technology in industrial production.
Указанный технический результат достигается тем, что в известном способе получения фармацевтического препарата из культуральной среды дрожжей, который включает концентрирование культуральной среды, осаждение целевого белка и его хроматографическую очистку с использованием гель-фильтрации и ионообменной хроматографии, в соответствии с заявляемым изобретением культивируют штамм дрожжей Pichia pastoris, который депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под номером Y-2949 и является продуцентом альфа 16-интерферона человека, а хроматографическую очистку проводят последовательно на Сефакриле HR 100 и диэтиламиноэтил-целлюлозе. Концентрирование культуральной среды может быть проведено с использованием мембраны АР-0,2-15ПА.The specified technical result is achieved by the fact that in the known method for producing a pharmaceutical preparation from a yeast culture medium, which involves concentration of the culture medium, precipitation of the target protein and its chromatographic purification using gel filtration and ion exchange chromatography, a strain of Pichia pastoris yeast is cultivated in accordance with the claimed invention , which is deposited in the All-Russian collection of industrial microorganisms under the number Y-2949 and is a producer of alpha 16 interferon h man, and chromatographic purification is carried out sequentially on Sephacryl HR 100 and diethylaminoethyl cellulose. Concentration of the culture medium can be carried out using an AP-0.2-15PA membrane.
Кроме того, указанный технический результат достигается тем, что осаждение целевого белка проводят при 60% насыщения сульфата аммония.In addition, the specified technical result is achieved in that the precipitation of the target protein is carried out at 60% saturation of ammonium sulfate.
При этом указанный технический результат достигается тем, что гель-фильтрацию на Сефакриле HR 100 проводят с использованием в качестве уравновешивающего и элюирующего раствора 50 мМ аммоний-ацетатного буфера (рН 5,5), содержащего 2 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты и 0,5% Твин-20.Moreover, the technical result is achieved in that gel filtration on Sephacryl HR 100 is carried out using 50 mM ammonium acetate buffer (pH 5.5) containing 2 mM ethylenediaminetetraacetic acid and 0.5% Tween- as a balancing and eluting solution. twenty.
Помимо этого, указанный технический результат достигается тем, что ионообменную хроматографию белков, полученных на диэтиламиноэтил-целлюлозе, проводят с использованием в качестве уравновешивающего раствора 50 мМ аммоний-ацетатный буфер (рН 7,0), содержащий 2 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты, 0,5% Твин-20, а отмывку примесных белков осуществляют последовательным использованием уравновешивающего буферного раствора и уравновешивающего буферного раствора, содержащего 0,1 М хлористого натрия, элюцию проводят градиентом концентрации хлористого натрия 0,1-1,0 М в 50 мМ аммоний-ацетатном буфере (рН 5,5), содержащем 2 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты, 0,5% Твин-20.In addition, this technical result is achieved in that ion-exchange chromatography of proteins obtained on diethylaminoethyl cellulose is carried out using 50 mM ammonium acetate buffer (pH 7.0) containing 2 mM ethylenediaminetetraacetic acid as a balancing solution. Tween-20, and the washing of impurity proteins is carried out by sequential use of a balancing buffer solution and a balancing buffer solution containing 0.1 M sodium chloride, the elution is carried out by a concentration gradient of chlorine sodium hydroxide 0.1-1.0 M in 50 mM ammonium acetate buffer (pH 5.5) containing 2 mM ethylenediaminetetraacetic acid, 0.5% Tween-20.
Известны фармацевтические препараты, содержащие в качестве действующего начала рекомбинантный альфа2-интерферон человека бактериального происхождения: «Роферон» (Hoffman-La Roche AG, Швейцария), «Интрон-А» (Schering-Plough, США), «Реальдирон» (Biotechna, Литва), «Реаферон» ("Вектор-Медика", Россия), «Интераль», (НИИ ОЧБ, Россия). Препараты «Реаферон», «Интераль» и «Интрон-А» содержат в качестве стабилизатора альбумин человека, что требует дополнительной проверки лекарственных форм на отсутствие вирусов гепатита В, С и ВИЧ. Препарат «Интрон-А» дополнительно содержит в качестве стабилизирующего вещества глицин. Использование указанных добавок эффективно только для стабилизации препарата в сухом виде и малоэффективно в отношении жидких форм интерферона. Кроме того, длительное применение лекарственных препаратов бактериального происхождения сопровождается нежелательными побочными эффектами, обусловленными условной патогенностью прокариотических штаммов-продуцентов и возможными примесями эндотоксинов в конечном продукте (Primrose S.B. J. Appl. Bacteriol. 1986. V.61. P.99-116; Ершов Ф.И. Система интерферона в норме и патологии. 1996).Known pharmaceutical preparations containing recombinant human alpha-2 interferon of bacterial origin as an active ingredient: “Roferon” (Hoffman-La Roche AG, Switzerland), “Intron-A” (Schering-Plow, USA), “Realdiron” (Biotechna, Lithuania ), “Reaferon” (“Vector-Medica”, Russia), “Interal”, (Scientific Research Institute of General Medicine, Russia). Reaferon, Interal and Intron-A preparations contain human albumin as a stabilizer, which requires additional verification of dosage forms for the absence of hepatitis B, C and HIV viruses. The Intron-A preparation additionally contains glycine as a stabilizing substance. The use of these additives is effective only for stabilization of the drug in a dry form and ineffective against liquid forms of interferon. In addition, prolonged use of drugs of bacterial origin is accompanied by undesirable side effects due to the conditional pathogenicity of prokaryotic producer strains and possible impurities of endotoxins in the final product (Primrose SBJ Appl. Bacteriol. 1986. V.61. P.99-116; Ershov F. I. The system of interferon is normal and pathological. 1996).
Известен фармацевтический препарат на основе рекомбинантного альфа2-интерферона человека и способ его получения из клеток бактерий Е. coli (патент RU 2294372, опубликованный 16.06.2005), сущность которого состоит в культивировании бактерий Е.coli-продуцентов рекомбинантного белка, разрушении клеток, удалении примесных белков, переводе рекомбинантного белка в растворимую форму, последующей хроматографической очистке рекомбинантного альфа2-интерферона человека и приготовлении фармацевтического препарата на основе рекомбинантного белка. Фармацевтический препарат, который описан в этом патенте, имеет в качестве компонентов рекомбинантный альфа2-интерферон человека, этилендиаминтетрауксусную кислоту, солевую буферную систему, обеспечивающую рН от 6,0 до 7,5, является наиболее близким аналогом и выбран в качестве прототипа для заявляемых вариантов нового препарата.A known pharmaceutical preparation based on recombinant human alpha2-interferon and a method for its preparation from bacterial cells of E. coli (patent RU 2294372, published June 16, 2005), the essence of which is to cultivate bacteria of E. coli producers of the recombinant protein, destroy cells, remove impurities proteins, converting the recombinant protein into a soluble form, subsequent chromatographic purification of recombinant human alpha2-interferon, and preparation of a pharmaceutical preparation based on the recombinant protein. The pharmaceutical preparation described in this patent has recombinant human alpha2-interferon, ethylenediaminetetraacetic acid, and a salt buffering system providing a pH of from 6.0 to 7.5, is the closest analogue and is selected as a prototype for the claimed variants of the new the drug.
Недостатками известного фармацевтического препарата является бактериальное происхождение альфа2-интерферона человека, что потенциально приводит к побочным эффектам при его применении и ухудшает качество жизни пациента.The disadvantages of the known pharmaceutical product is the bacterial origin of human alpha2-interferon, which potentially leads to side effects when used and worsens the patient's quality of life.
Технический результат для группы изобретений является единым и состоит для заявляемых вариантов нового фармацевтического препарата в снижении рисков возникновения побочных эффектов при применении препарата на основе интерферона человека и получении препарата, лишенного этих недостатков за счет использования системы экспрессии дрожжей для продукции альфа 16-интерферон человека и применения в качестве стабилизатора, предотвращающего агрегацию рекомбинатного белка, Твин-20, а также в возможности его производства промышленным способом.The technical result for the group of inventions is uniform and consists for the claimed variants of a new pharmaceutical preparation in reducing the risks of side effects when using a drug based on human interferon and obtaining a drug devoid of these disadvantages through the use of a yeast expression system for the production of human alpha 16-interferon and use as a stabilizer that prevents the aggregation of recombinant protein, Tween-20, as well as the possibility of its industrial production .
Указанный технический результат достигается новым фармацевтическим препаратом на основе альфа интерферона человека, содержащим этилендиаминтетрауксусную кислоту и солевую буферную систему, который, в соответствии с заявляемым по первому варианту препаратом, содержит альфа 16-интерферон человека, солевую буферную систему, которая имеет рН от 5,5 до не более 6,0, и дополнительно содержит Твин-20 при следующем соотношении ингредиентов:The specified technical result is achieved by a new pharmaceutical preparation based on human alpha interferon containing ethylenediaminetetraacetic acid and a salt buffering system, which, in accordance with the preparation claimed in the first embodiment, contains human alpha 16-interferon, a salt buffering system, which has a pH of 5.5 to no more than 6.0, and additionally contains tween-20 in the following ratio of ingredients:
Кроме этого, указанный технический результат достигается тем, что фармацевтический препарат содержит модифицированный рекомбинантный альфа 16-интерферон человека.In addition, the specified technical result is achieved in that the pharmaceutical preparation contains a modified recombinant human alpha 16-interferon.
Помимо этого, указанный технический результат достигается тем, что фармацевтический препарат имеет жидкую форму, например, в виде эмульсии, и/или сиропа, и/или капель, и/или липосомной формы.In addition, this technical result is achieved in that the pharmaceutical preparation has a liquid form, for example, in the form of an emulsion, and / or syrup, and / or drops, and / or liposome form.
Указанный технический результат достигается новым фармацевтическим препаратом на основе альфа интерферона человека, содержащим этилендиаминтетрауксусную кислоту и солевую буферную систему, который, в соответствии с заявляемым по второму варианту препаратом, содержит альфа 16 интерферон человека, буферообразующие соли, которые обеспечивают рН от 5,5 до не более 6,0, а также дополнительно содержит Твин-20 при следующем соотношении ингредиентов до начала лиофильной сушки:The specified technical result is achieved by a new pharmaceutical preparation based on human alpha interferon containing ethylenediaminetetraacetic acid and a salt buffering system, which, in accordance with the claimed preparation according to the second embodiment, contains human alpha 16 interferon, buffering salts that provide a pH from 5.5 to not more than 6.0, and also additionally contains tween-20 in the following ratio of ingredients before freeze drying:
Кроме этого, указанный технический результат достигается тем, что фармацевтический препарат содержит модифицированный рекомбинантный альфа 16-интерферон человека.In addition, the specified technical result is achieved in that the pharmaceutical preparation contains a modified recombinant human alpha 16-interferon.
Помимо этого, указанный технический результат достигается тем, что фармацевтический препарат имеет сухую лиофилизованную форму как основу лекарственных форм в виде таблетки, и/или капсулы, и/или порошка, и/или гранул, и/или суппозитория.In addition, this technical result is achieved in that the pharmaceutical preparation has a dry lyophilized form as the basis for dosage forms in the form of tablets, and / or capsules, and / or powder, and / or granules, and / or suppositories.
Указанный для заявленной группы изобретений единый технический результат, таким образом, достигается комплексно путем использования рекомбинантного штамма дрожжей Pichia pastoris ВКПМ Y-2949 (RU 2203950, опубликованный 10.05.2003), культивирования его в питательной среде и индукции синтеза целевого белка, удаления клеток, концентрирования культуральной среды, осаждения целевого белка сульфатом аммония, гель-фильтрации на сорбентах типа Сефакрил HR 100 в присутствии 0,5% неионного детергента Твин-20, ионообменной хроматографии на сорбентах типа ДЭАЭ-целлюлоза в присутствии 0,5% неионного детергента Твин-20, а также новым составом препарата, заявленного по первому и второму вариантамThe unified technical result indicated for the claimed group of inventions is thus achieved in a comprehensive manner by using the recombinant strain of yeast Pichia pastoris VKPM Y-2949 (RU 2203950, published May 10, 2003), culturing it in a nutrient medium and inducing the synthesis of the target protein, removing cells, concentration culture medium, target protein precipitation with ammonium sulfate, gel filtration on Sephacryl HR 100 sorbents in the presence of 0.5% Tween-20 nonionic detergent, ion-exchange chromatography on DEAE-cellulose sorbents in the presence of 0.5% nonionic detergent Tween-20, as well as new drug composition claimed in the first and second embodiments
Оптимальными условиями проведения отдельных стадий получения альфа 16-интерферона человека являются следующие:The optimal conditions for the individual stages of obtaining alpha 16 human interferon are as follows:
- концентрированно культуральной среды осуществляют с использованием мембраны АР-0,2-15ПА;- concentrated culture medium is carried out using an AP-0.2-15PA membrane;
- осаждение целевого белка проводят при 60% насыщения сульфатом аммония;- precipitation of the target protein is carried out at 60% saturation with ammonium sulfate;
- растворение полученного осадка, содержащего альфа 16-интерферон в 50 мМ аммоний-ацетатном буфере (рН 5,5), содержащем 2 мМ ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота), 0,5% Твин-20;- dissolution of the obtained precipitate containing alpha 16-interferon in 50 mm ammonium acetate buffer (pH 5.5) containing 2 mm EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid), 0.5% Tween-20;
- проведение гель-фильтрации на Сефакриле HR 100 в 50 мМ аммоний-ацетатном буфере (рН 5,5), содержащем 2 мМ ЭДТА, 0,5% Твин-20;- gel filtration on Sephacryl HR 100 in 50 mM ammonium acetate buffer (pH 5.5) containing 2 mM EDTA, 0.5% Tween-20;
- проведение ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе с использованием в качестве уравновешивающего раствора 50 мМ аммоний-ацетатного буфера (рН 7,0), содержащего 2 мМ ЭДТА, 0,5% Твин-20; проведение элюции целевого белка градиентом концентрации хлористого натрия 0,1-1,0 М в 50 мМ аммоний-ацетатном буфере (рН 5,5), содержащем 2 мМ ЭДТА, 0,5% Твин-20.- carrying out ion-exchange chromatography on DEAE-cellulose using 50 mM ammonium acetate buffer (pH 7.0) containing 2 mM EDTA, 0.5% Tween-20 as a balancing solution; elution of the target protein with a concentration gradient of 0.1-1.0 M sodium chloride in 50 mM ammonium acetate buffer (pH 5.5) containing 2 mM EDTA, 0.5% Tween-20.
Полученный в результате использования указанной технологии препарат альфа 16-интерферона содержит следующие ингредиенты:The preparation of alpha 16-interferon obtained as a result of using this technology contains the following ingredients:
1. Для препарата в сухой лиофилизованной форме, как было показано выше:1. For the drug in dry lyophilized form, as shown above:
Частными случаями реализации фармацевтического препарата на основе альфа 16-интерферона в твердой форме являются фармацевтические препараты, содержащие в качестве действующего начала или рекомбинантный альфа 16-интерферон человека, или модифицированный рекомбинантный альфа 16-интерферон человека.Particular cases of the implementation of a pharmaceutical preparation based on alpha 16-interferon in solid form are pharmaceutical preparations containing either recombinant human alpha 16-interferon or modified recombinant human alpha 16-interferon as an active principle.
Частными случаями реализации фармацевтического препарата на основе альфа 16-интерферона в твердой форме являются таблетки, капсулы, порошки, гранулы, суппозитории, формы, пригодные для наружного применения, например мази, гели или жидкие препараты, полученные растворением твердой формы в фармацевтически приемлемом растворителе, полученные стандартными технологическими способами (Валевко С.А. и др. Фармацевтическая технология: Технология лекарственных форм. 2007).Particular cases of the implementation of a pharmaceutical preparation based on alpha 16-interferon in solid form are tablets, capsules, powders, granules, suppositories, forms suitable for external use, for example, ointments, gels or liquid preparations obtained by dissolving the solid form in a pharmaceutically acceptable solvent, obtained standard technological methods (Valevko S.A. et al. Pharmaceutical technology: Technology of dosage forms. 2007).
2. Для препарата в жидкой и сухой лиофилизованной форме, как было показано выше:2. For the drug in liquid and dry lyophilized form, as shown above:
Частными случаями реализации фармацевтического препарата на основе альфа 16-интерферона в жидкой форме являются фармацевтические препараты, содержащие в качестве действующего начала или рекомбинантный альфа 16-интерферон человека, или модифицированный рекомбинантный альфа 16-интерферон человека.Particular cases of the implementation of a pharmaceutical preparation based on alpha 16-interferon in liquid form are pharmaceutical preparations containing either recombinant human alpha 16-interferon or modified recombinant human alpha 16-interferon as an active principle.
Частными случаями реализации фармацевтического препарата на основе альфа 16-интерферона в жидкой форме являются эмульсии, сиропы, эликсиры, капли, липосомные формы, формы, пригодные для наружного применения, например гели, увлажненные салфетки, полученные стандартными технологическими способами (Валевко С.А. и др. Фармацевтическая технология: Технология лекарственных форм. 2007).Particular cases of the implementation of a pharmaceutical preparation based on alpha 16-interferon in liquid form are emulsions, syrups, elixirs, drops, liposome forms, forms suitable for external use, for example, gels, moistened wipes obtained by standard technological methods (Valevko S.A. and Dr. Pharmaceutical Technology: Technology of dosage forms. 2007).
Существенными отличиями заявляемого способа от прототипа являются:Significant differences of the proposed method from the prototype are:
- последовательное использование стадий ультрафильтрации и осаждения целевого белка сульфатом аммония, приводящее к значительному уменьшению объема обрабатываемой культуральной среды на первых стадиях очистки, что имеет большое значение при масштабировании процесса производства интерферона;- the consistent use of the stages of ultrafiltration and precipitation of the target protein with ammonium sulfate, leading to a significant reduction in the volume of the treated culture medium in the first stages of purification, which is of great importance when scaling up the production of interferon;
- двухстадийная хроматографическая очистка альфа 16-интерферона в присутствии 0,5% Твин-20, предотвращающая аггрегацию мономеров целевого белка, что повышает выход биологически активного альфа 16-интерферона;- two-step chromatographic purification of alpha 16-interferon in the presence of 0.5% Tween-20, preventing the aggregation of the monomers of the target protein, which increases the yield of biologically active alpha 16-interferon;
- введение в состав композиции препарата на основе альфа 16-интерферона человека 0,05% Твин-20 в качестве стабилизатора.- the introduction of the composition of the composition of the drug based on alpha 16 human interferon 0.05% Tween-20 as a stabilizer.
Сущность и преимущества заявляемой группы изобретений иллюстрируются следующими примерами.The essence and advantages of the claimed group of inventions are illustrated by the following examples.
Пример 1. Очистка рекомбинантного альфа 16-интерферона человека. Штамм дрожжей Pichia pastoris ВКПМ Y-2949 - продуцент альфа 16-интерферона человека культивировали ранее описанным способом (RU 2203950, опубликованный 10.05.2003). По окончании процесса культивирования удаляли клетки дрожжей центрифугированиеем при 6-7 тыс. об/мин в течение 15 минут, при +4°С. Все последующие операции проводили при температуре +4°С. Надосадочную жидкость пропускали через нитроцеллюлозный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм (Millpore Inc.). Полученный таким образом фильтрат концентрировали на ультрафильтрационной установке УПЛ-0,6 с использованием мембраны АР-0,2-15ПА (НПК «Биотест», Кириши), отсекающей соединения с молекулярной массой менее 15 кДа, на этой стадии происходило удаление низкомолекулярных компонентов среды и уменьшение исходного объема до 100-200 мл. Затем проводили солевое осаждение целевого белка, доводя насыщение сульфата аммония до 60%. Осадок целевого белка собирали центрифугированием при 12-14 тыс. об/мин в течение 20 минут. Полученный осадок растворяли в 50 мМ аммоний-ацетатного буфера (рН 5,5), содержащего 2 мМ ЭДТА, 0,05% Твин-20, и наносили на колонку, содержащую 1000 мл Сефакрила HR 100, уравновешенного этим же буфером. Первые 350 мл отбрасывали, фракции, содержащие целевой белок, объединяли. Полученный таким образом элюат титровывали 10% аммиаком до рН 7,0 и наносили на колонку, содержащую 50 мл ДЕАЕ-целлюлозы, уравновешенной 50 мМ аммоний-ацетатным буфером (рН 7,0), содержащим 2 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), 0,05% Твин-20. Отмывали колонку последовательно 100 мл уравновешивающего буфера и 100 мл уравновешивающего буфера, содержащего 0,1 М хлористого натрия. Элюцию проводили градиентом концентрации хлористого натрия от 0,1 М до 1,0 М в 50 мМ аммоний-ацетатном буфере (рН 5,5), содержащем 2 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), 0,05% Твин-20.Example 1. Purification of recombinant alpha 16 human interferon. The yeast strain Pichia pastoris VKPM Y-2949, the producer of human alpha 16-interferon, was cultured in the previously described manner (RU 2203950, published May 10, 2003). At the end of the cultivation process, yeast cells were removed by centrifugation at 6-7 thousand rpm for 15 minutes, at + 4 ° C. All subsequent operations were carried out at a temperature of + 4 ° C. The supernatant was passed through a nitrocellulose filter with a pore diameter of 0.45 μm (Millpore Inc.). The filtrate thus obtained was concentrated on an UPL-0.6 ultrafiltration unit using an AP-0.2-15PA membrane (NPK Biotest, Kirishi), cutting off compounds with a molecular weight of less than 15 kDa, at this stage low molecular weight components were removed and decrease in initial volume to 100-200 ml. Then, salt precipitation of the target protein was carried out, bringing the saturation of ammonium sulfate to 60%. The precipitate of the target protein was collected by centrifugation at 12-14 thousand rpm for 20 minutes. The resulting precipitate was dissolved in 50 mM ammonium acetate buffer (pH 5.5) containing 2 mM EDTA, 0.05% Tween-20, and applied to a column containing 1000 ml Sephacryl HR 100 equilibrated with the same buffer. The first 350 ml was discarded, the fractions containing the target protein were combined. The eluate thus obtained was titrated with 10% ammonia to pH 7.0 and applied to a column containing 50 ml of DEAE cellulose balanced with 50 mM ammonium acetate buffer (pH 7.0) containing 2 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), 0, 05% Tween-20. The column was washed sequentially with 100 ml of equilibration buffer and 100 ml of equilibration buffer containing 0.1 M sodium chloride. The elution was performed with a concentration gradient of sodium chloride from 0.1 M to 1.0 M in 50 mM ammonium acetate buffer (pH 5.5) containing 2 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), 0.05% Tween-20.
Электрофорез в редуцирующих условиях показал, что молекулярная масса полученного белка составляет примерно 20 кДа. Использование данной схемы очистки позволило получить препарат альфа 16-интерферона человека, содержание примесей в котором не более 5%. Удельная активность составила 0,3-1,0×108 МЕ/мг. Средний выход из литра культуральной среды составлял 7-9 мг.Electrophoresis under reducing conditions showed that the molecular weight of the obtained protein is approximately 20 kDa. Using this purification scheme, it was possible to obtain a preparation of human alpha 16-interferon, the content of impurities in which is not more than 5%. The specific activity was 0.3-1.0 × 10 8 IU / mg. The average yield from a liter of culture medium was 7–9 mg.
Пример 2. Исследование биологической активности и стабильности фармацевтических препаратов на основе альфа 16-интерферона человека, выполненных в жидкой и в сухой лиофилизованной формах.Example 2. The study of the biological activity and stability of pharmaceutical preparations based on alpha 16 human interferon, made in liquid and in dry lyophilized forms.
Заявленный фармацевтический препарат для его испытаний на стабильность готовили следующим образом. Рекомбинантный альфа 16-интерферона человека, полученный по примеру 1, разводили до заданного значения биологической активности (от 5×106 МЕ/мл до 2×107 МЕ/мл), забуферивали до заданного значения рН, смешивали с заданным количеством Твин-20 и ЭДТА. Полученную смесь стерилизовали холодной стерилизацией (Валевко С.А. и др. Фармацевтическая технология: Технология лекарственных форм. 2007), переносили в ампулы и запаивали. При необходимости полученную жидкую смесь замораживали в незапаянных ампулах, лиофильно высушивали. Биологическую активность определяли до и после 6 месяцев хранения препарата (табл.1) по подавлению цитопатической активности вируса везикулярного стоматита в первичной культуре L-41 кожно-мышечной ткани эмбрионов человека, чувствительной к интерферонам альфа-типа (Liu Р.Т. et al. // Protein Expres. Purif. 2001. V.22. P.381-387). В качестве стандарта использовали человеческий лейкоцитарный интерферон ОСО 42-28-90-87 (ГИСК, Москва). Содержимое ампул с препаратом на основе альфа 16-интерферона человека в твердой форме растворяли в 1 мл воды, содержимое ампул с жидкой формой использовали без дополнительной обработки.The claimed pharmaceutical preparation for its stability tests was prepared as follows. The recombinant human alpha 16-interferon obtained in Example 1 was diluted to a predetermined biological activity value (from 5 × 10 6 IU / ml to 2 × 10 7 IU / ml), buffered to a predetermined pH value, mixed with a predetermined amount of Tween-20 and EDTA. The resulting mixture was sterilized by cold sterilization (Valevko S.A. et al. Pharmaceutical Technology: Dosage Form Technology. 2007), transferred to ampoules and sealed. If necessary, the resulting liquid mixture was frozen in unsealed ampoules, freeze-dried. Biological activity was determined before and after 6 months of storage of the drug (Table 1) by suppressing the cytopathic activity of the virus of vesicular stomatitis in the primary culture of L-41 skin-muscle tissue of human embryos sensitive to alpha-type interferons (Liu R.T. et al. // Protein Expres. Purif. 2001. V.22. P.381-387). Human leukocyte interferon OSO 42-28-90-87 (GISK, Moscow) was used as a standard. The contents of ampoules with a preparation based on human alpha 16-interferon in solid form were dissolved in 1 ml of water, the contents of ampoules with a liquid form were used without further processing.
Приведенные результаты показали, что предлагаемый состав фармацевтического препарата по первому и второму вариантам способен сохранять активность альфа 16-интерферона человека в сухой лиофилизованной и жидкой формах.The above results showed that the proposed composition of the pharmaceutical preparation according to the first and second options is able to maintain the activity of human alpha-16 interferon in dry lyophilized and liquid forms.
Пример 3. Изучение побочных эффектов фармацевтического препарата на основе альфа 16-интерферона человека, выполненного в жидкой форме.Example 3. The study of the side effects of a pharmaceutical preparation based on human alpha 16-interferon, made in liquid form.
Исследование включало в себя токсикологическое изучение однократного воздействия препарата в дозе 2,5×l05 ME/кг, что превышает терапевтическую дозу в 50 раз, и хронический токсикологический эксперимент.The study included a toxicological study of a single exposure of the drug at a dose of 2.5 × l0 5 ME / kg, which exceeds the therapeutic dose by 50 times, and a chronic toxicological experiment.
3.1. Изучение токсического действия препарата на основе альфа 16-интерферона человека проводили на 60 половозрелых рандомбредных белых мышах-самцах и 60 половозрелых рандомбредных мышах-самках массой 16-18 г, а также на 60 морских свинках массой 200-250 г. Препарат вводили однократно подкожно. При введении препарата животным подкожно в этой дозе у них отмечено некоторое кратковременное учащение дыхания. Половые различия у мышей к токсическому действию препарата не наблюдали. Гистологическое исследование тканей и органов оставшихся по окончании срока наблюдения живых животных видимых патологических изменений со стороны обследованных органов не показало.3.1. The study of the toxic effect of the drug based on human alpha 16-interferon was carried out on 60 sexually mature white male random mice and 60 male sexually mature random male mice weighing 16-18 g, and also on 60 guinea pigs weighing 200-250 g. The drug was administered once subcutaneously. When the drug was administered to animals subcutaneously at this dose, they experienced a certain short-term increase in respiration. Sexual differences in mice to the toxic effect of the drug were not observed. A histological examination of tissues and organs of the remaining at the end of the observation period of live animals showed no visible pathological changes from the examined organs.
Таким образом, однократное введение максимально-переносимой дозы препарата экспериментальным животным не сопровождалось токсическими эффектами.Thus, a single administration of the maximum tolerated dose of the drug to experimental animals was not accompanied by toxic effects.
3.2. Исследование хронической токсичности препарата на основе альфа 16-интерферона человека проводили на 90 белых беспородных мышах-самцах массой 18-20 г, которым в течение 90 суток однократно ежедневно вводили этот препарат подкожно. В течение трех месяцев хронического эксперимента у подопытных животных не наблюдали признаков выраженной интоксикации и существенных изменений в поведении. Динамика прироста массы тела экспериментальных животных статистически достоверно не отличалась от аналогичного показателя в контроле.3.2. The study of the chronic toxicity of the drug based on human alpha 16-interferon was carried out on 90 white outbred male mice weighing 18-20 g, which were injected subcutaneously once daily for 90 days. During the three months of the chronic experiment, experimental animals did not show signs of severe intoxication and significant changes in behavior. The dynamics of the body weight gain of the experimental animals did not statistically significantly differ from that in the control.
У животных, длительное время получавших препарат, оценивали в динамике состояние неспецифической резистентности. Для этого исследовали поглотительную и переваривающую активность фагоцитов периферической крови, а также уровни лизоцима, неспецифических эстераз и миелопероксидазы в сыворотке крови. Величины исследованных параметров в большинстве случаев либо не отличались от контрольных значений, либо незначительно их превышали.In animals that received the drug for a long time, the state of nonspecific resistance was evaluated in dynamics. To do this, we studied the absorption and digestion activity of peripheral blood phagocytes, as well as the levels of lysozyme, nonspecific esterases, and myeloperoxidase in blood serum. The values of the studied parameters in most cases either did not differ from the control values, or slightly exceeded them.
Состояние иммунокомпетентных клеток у подопытных животных оценивали по выраженности антителогенеза на специфический антиген (химическая сорбированная брюшнотифозная вакцина) и уровню оксида азота в иммунокомпетентных органах и сыворотке крови. Длительное введение препарата на основе альфа 16-интерферона человека не оказывало статистически значимого отрицательного влияния на функциональное состояние В-системы иммуногенеза. Более того, наблюдалось незначительное повышение выработки специфических антител к брюшному тифу у иммунизированных животных. В тканях иммунокомпетентных органов и сыворотке крови мышей повышается содержание оксида азота по сравнению с аналогичными показателями в контроле, что свидетельствует о стимулирующем влиянии препарата на клеточный компонент иммуногенеза.The condition of immunocompetent cells in experimental animals was assessed by the severity of the antibody to specific antigen (chemical sorbed typhoid vaccine) and the level of nitric oxide in immunocompetent organs and blood serum. Long-term administration of a drug based on human alpha 16-interferon did not have a statistically significant negative effect on the functional state of the B-system of immunogenesis. Moreover, there was a slight increase in the production of specific antibodies to typhoid fever in immunized animals. In the tissues of the immunocompetent organs and in the blood serum of mice, the content of nitric oxide increases compared with the same parameters in the control, which indicates the stimulating effect of the drug on the cellular component of immunogenesis.
Суммируя результаты, характеризующие хроническую токсичность препарата на основе альфа 16-интерферона человека при длительном подкожном применении у белых беспородных мышей, следует отметить, что препарат не оказывает сколько-нибудь выраженного отрицательного влияния на общее состояние экспериментальных животных и не обладает при столь напряженной схеме введения иммунодепрессивным действием. Можно отметить стимулирующее действие препарата на клеточные и гуморальные компоненты иммунной системы.Summarizing the results characterizing the chronic toxicity of the drug based on human alpha 16-interferon with prolonged subcutaneous use in white outbred mice, it should be noted that the drug does not have any pronounced negative effect on the general condition of experimental animals and does not have immunosuppressive administration under such a tense schedule action. The stimulating effect of the drug on the cellular and humoral components of the immune system can be noted.
Хроническую токсичность препарата изучали также в опытах на 100 белых крысах массой 240-250 г, которым в течение 10 дней ежедневно однократно вводили препарат подкожно. Влияние препарата на основе альфа 16-интерферона человека оценивали по изменению общего состояния, массы тела, функционального состояния печени и почек, некоторых органов эндокринной системы (надпочечники, поджелудочная железа) и периферической крови. По окончании эксперимента у всех животных проводили патогистологическое исследование внутренних органов.Chronic toxicity of the drug was also studied in experiments on 100 white rats weighing 240-250 g, which were injected subcutaneously once daily for 10 days. The effect of the drug based on human alpha 16-interferon was evaluated by changes in the general condition, body weight, functional state of the liver and kidneys, some organs of the endocrine system (adrenal glands, pancreas) and peripheral blood. At the end of the experiment, a histological examination of the internal organs was performed in all animals.
Проведенные эксперименты показали, что применение препарата на основе альфа 16-интерферона не вызывает у подопытных животных изменений, выходящих за пределы физиологических колебаний нормы. Масса тела экспериментальных животных статистически достоверно не отличалась от контроля. Функциональное состояние печени и поджелудочной железы у подопытных животных на протяжении хронического эксперимента не отличалось значимо от нормы.The experiments showed that the use of a drug based on alpha 16-interferon does not cause changes in experimental animals that go beyond the physiological fluctuations of the norm. The body weight of the experimental animals did not statistically significantly differ from the control. The functional state of the liver and pancreas in experimental animals during the chronic experiment did not differ significantly from the norm.
Макроскопическое и гистологическое исследование внутренних и эндокринных органов (теменная область головного мозга, сердце, легкие, печень, почки, селезенка, желудок, двенадцатиперстная кишка, надпочечники, щитовидная и поджелудочная железы) не выявило патологических изменений у подопытных животных.Macroscopic and histological examination of the internal and endocrine organs (parietal region of the brain, heart, lungs, liver, kidneys, spleen, stomach, duodenum, adrenal glands, thyroid and pancreas) did not reveal pathological changes in experimental animals.
Влияние препарата на основе альфа 16-интерферона на периферическую кровь изучали на 30 белых крысах массой 310-340 г. Результаты проведенных исследований показали, что наиболее значимые изменения происходили в количественном составе лейкоцитов, которое достоверно возрастало на 3, 5, 7 и 10 сутки после первого введения препарата. При детальном исследовании лейкоцитарного состава периферической крови подопытных животных оказалось, что увеличение общего количества лейкоцитов под влиянием исследуемого препарата было обусловлено достоверным увеличением количества нейтрофилов и моноцитов по сравнению с аналогичными показателями в контроле. Эти данные могут свидетельствовать о том, что препарат на основе альфа 16-интерферона оказывает стимулирующий эффект на кроветворение и повышает неспецифическую резистентность организма.The effect of the drug based on alpha-16 interferon on peripheral blood was studied in 30 white rats weighing 310-340 g. The results of the studies showed that the most significant changes occurred in the quantitative composition of leukocytes, which significantly increased on the 3rd, 5th, 7th and 10th days after the first injection of the drug. In a detailed study of the leukocyte composition of the peripheral blood of experimental animals, it turned out that the increase in the total number of leukocytes under the influence of the studied drug was due to a significant increase in the number of neutrophils and monocytes in comparison with similar indicators in the control. These data may indicate that the drug based on alpha 16-interferon has a stimulating effect on blood formation and increases the nonspecific resistance of the body.
Суммируя результаты, характеризующие хроническую токсичность препарат на основе альфа 16-интерферона при подкожном применении у белых крыс, следует отметить, что препарат не оказывает отрицательного влияния на общее состояние экспериментальных животных и токсического действия на функциональное состояние их жизненно важных органов и систем. Более того, в отношении системы кроветворения установлено стимулирующее действие препарата на компоненты белой крови, прежде всего на нейтрофилы и моноциты - основные клеточные компоненты неспецифической резистентности организма.Summarizing the results characterizing the chronic toxicity of a drug based on alpha 16-interferon for subcutaneous use in white rats, it should be noted that the drug does not adversely affect the general condition of experimental animals and toxic effects on the functional state of their vital organs and systems. Moreover, with regard to the hematopoietic system, the stimulating effect of the drug on the components of white blood, primarily on neutrophils and monocytes, the main cellular components of the nonspecific resistance of the body, was established.
3.3. Аллергизирующие свойства препарат на основе альфа 16-интерферона определяли в экспериментах на морских свинках-самцах массой 250-300 г. Перед постановкой конкретного эксперимента животных не кормили в течение суток. Все животные получали стандартную диету, представленную в виде гранулированного корма. Проведенные исследования свидетельствуют о том, введение в организм препарата не приводит к активации процессов, ответственных за развитие аллергического состояния.3.3. Allergic properties of the drug based on alpha-16 interferon were determined in experiments on male guinea pigs weighing 250-300 g. Before staging a specific experiment, the animals were not fed for a day. All animals received a standard diet, presented as a granular feed. Studies have shown that the introduction of the drug into the body does not lead to the activation of the processes responsible for the development of an allergic condition.
3.4. Изучение специфической активности препарата на основе альфа 16-интерферона проводили на моделях вирусных инфекций.3.4. The study of the specific activity of the drug based on alpha 16-interferon was carried out on models of viral infections.
Для оценки эффективности препарата использовали белых беспородных мышей массой от 16 до 18 г.To evaluate the effectiveness of the drug used white outbred mice weighing from 16 to 18 g.
Вирус венесуэльского энцефаломиелита лошадей (ВЭЛ) штамм «Тринидад» вводили животным подкожно в объеме 0,3 мл/мышь. Альфа 16-интерферон вводили подкожно однократно, за 4 часа до заражения в дозе 25000 МЕ/мышь. Результаты проведенных исследований показали, что испытуемый препарат обладает специфической противовирусной активностью в отношении экспериментальной инфекции ВЭЛ и, в зависимости от заражающей дозы возбудителя, повышает выживаемость инфицированных животных на 12-50% (Р<0,05).Venezuelan equine encephalomyelitis virus (VEL) strain Trinidad was injected subcutaneously in animals in a volume of 0.3 ml / mouse. Alpha 16-interferon was administered subcutaneously once, 4 hours before infection at a dose of 25,000 IU / mouse. The results of the studies showed that the test drug has specific antiviral activity against experimental VEL infection and, depending on the infectious dose of the pathogen, increases the survival rate of infected animals by 12-50% (P <0.05).
Для моделирования экспериментальной гриппозной инфекции использовали вирус гриппа А (ВГА) штамм Виктория/72 (H3N2), полученный из музея вирусных штаммов НИИ микробиологии и эпидемиологии им. Пастера МЗ РФ, Санкт-Петербург, в заражающей дозе 3-4 ЛД50. Заражение животных проводили однократно интраназально, в объеме 0,1 мл. Эффективность альфа 16-интерферона оценивали по сопоставлению величин показателей выживаемости животных в опытных и контрольных группах (по 20 мышей). Наблюдение и учет гибели животных осуществляли в течение 15 суток после заражения.To simulate an experimental influenza infection, we used the influenza A virus (HAV) strain Victoria / 72 (H3N2), obtained from the Museum of Viral Strains of the Research Institute of Microbiology and Epidemiology named after Pasteur of the Ministry of Health of the Russian Federation, St. Petersburg, at an infectious dose of 3-4 LD50. Infection of animals was carried out once intranasally, in a volume of 0.1 ml. The effectiveness of alpha 16-interferon was evaluated by comparing the values of the survival rates of animals in the experimental and control groups (20 mice). Observation and accounting of the death of animals was carried out within 15 days after infection.
Результаты проведенных экспериментов (табл.2) свидетельствовали, что испытуемый препарат в дозах 5000,0 и 15000,0 МЕ/мышь оказывал защитное действие в отношении экспериментальной гриппозной инфекции при его применении как до, так и после заражения животных ВГА. В случае профилактического назначения препарата предпочтительнее его вводить за 24 часа до заражения, а с терапевтической целью - многократно после заражения. Использование альфа 16-интерферона по таким схемам позволяет добиться максимального протективного эффекта, составившего 100% и превысившего контрольный уровень на 80%.The results of the experiments (Table 2) showed that the test drug at doses of 5000.0 and 15000.0 IU / mouse had a protective effect against experimental influenza infection when it was used both before and after infection of the animals with HAV. In the case of prophylactic administration of the drug, it is preferable to administer it 24 hours before infection, and for the therapeutic purpose, many times after infection. The use of alpha 16-interferon according to such schemes allows to achieve the maximum protective effect, which amounted to 100% and exceeded the control level by 80%.
Совокупность данных, полученных в ходе изучения побочных эффектов фармацевтического препарата на основе альфа 16-интерферона человека, позволяет сделать заключение о том, что препарат на основе альфа 16-интерферона человека можно рассматривать как безвредный и высокоактивный противовирусный иммунобиологический препарат, не обладающий побочными эффектами.The combination of data obtained during the study of the side effects of a pharmaceutical preparation based on human alpha 16-interferon allows us to conclude that the drug based on human alpha 16-interferon can be considered as a harmless and highly active antiviral immunobiological preparation that does not have side effects.
Как показали многочисленные лабораторные испытания, преимущество заявленной группы изобретений по сравнению с мировыми аналогами состоит в том, что подтверждена экспериментальная возможность получения фармацевтического препарата медицинского назначения на основе альфа 16-интерферона человека, обладающего противовирусной активностью, а также, что особенно важно, не выявившей побочных и опасных для потенциальных пациентов эффектов.As shown by numerous laboratory tests, the advantage of the claimed group of inventions in comparison with world analogues is that the experimental possibility of obtaining a pharmaceutical drug for medical use based on human alpha-16 interferon, which has antiviral activity, and also, which is especially important, has not revealed and dangerous effects for potential patients.
Таким образом, заявляемая группа изобретений позволяет, как показали результаты испытаний, существенно снизить риски возникновения побочных эффектов при применении нового фармацевтического препарата на основе интерферона человека за счет использования системы экспрессии дрожжей для продукции альфа 16-интерферона человека и применения в качестве стабилизатора, предотвращающего агрегацию рекомбинатного белка, Твин-20. Кроме того, достоинством и преимуществом заявленного фармацевтического препарата является то, что он может быть использован как в жидкой форме, так и в твердой и сухой лиофилизованной формах, а также и для наружного применения, что позволяет существенно расширить спектр применения заявленного препарата при лечении заболеваний различной этиологии.Thus, the claimed group of inventions allows, as shown by the test results, to significantly reduce the risk of side effects when using a new pharmaceutical product based on human interferon by using a yeast expression system for the production of human alpha 16-interferon and using recombinant aggregation as a stabilizer Squirrel, Tween-20. In addition, the advantage and advantage of the claimed pharmaceutical product is that it can be used both in liquid form, and in solid and dry lyophilized forms, as well as for external use, which can significantly expand the range of applications of the claimed drug in the treatment of diseases of various etiology.
Claims (5)
молярность, равную при растворении 10-20 мМ4. Freeze-dried pharmaceutical composition for the treatment of viral diseases based on recombinant human alpha 16-interferon, containing ethylenediaminetetraacetic acid and a salt buffering system, characterized in that it contains human alpha 16-interferon obtained by the method according to claim 1, and Tween-20 in the following ratio of ingredients before freeze drying:
molarity equal to 10-20 mM when dissolved
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2007143928/13A RU2380405C2 (en) | 2007-11-29 | 2007-11-29 | Method for making recombinant human alpha 16-interferon and pharmaceutical composition for treating viral diseases based on recombinant human alpha 16-interferon |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2007143928/13A RU2380405C2 (en) | 2007-11-29 | 2007-11-29 | Method for making recombinant human alpha 16-interferon and pharmaceutical composition for treating viral diseases based on recombinant human alpha 16-interferon |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2007143928A RU2007143928A (en) | 2009-06-10 |
| RU2380405C2 true RU2380405C2 (en) | 2010-01-27 |
Family
ID=41024084
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2007143928/13A RU2380405C2 (en) | 2007-11-29 | 2007-11-29 | Method for making recombinant human alpha 16-interferon and pharmaceutical composition for treating viral diseases based on recombinant human alpha 16-interferon |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2380405C2 (en) |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2129878C1 (en) * | 1996-04-24 | 1999-05-10 | Зинченко Елена Вениаминовна | Immunomodulating preparation "neoferon" showing antiviral activity |
| RU2203950C1 (en) * | 2002-01-15 | 2003-05-10 | Общество с ограниченной ответственностью "Биотех" | Strain of yeast pichia pastoris as producer of leukocyte human interferon-16, recombinant plasmid dna phin and method for its construction |
| WO2004039996A1 (en) * | 2002-11-01 | 2004-05-13 | Cadila Healthcare Limited | Mthod for producing recombinant human interferon alpha 2b polypeptide in pichia pastoris |
| RU2242516C1 (en) * | 2003-12-18 | 2004-12-20 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Фармапарк" | Method for preparing recombinant human alpha-2b-interferon, recombinant plasmid and strain-producer for its realization |
| RU2294372C1 (en) * | 2005-06-16 | 2007-02-27 | ООО "Цитокин" | METHOD FOR PREPARING RECOMBINANT INTERFERON ALPHA-2b AND INTERFERON-CONTAINING PREPARATION (VARIANTS) |
-
2007
- 2007-11-29 RU RU2007143928/13A patent/RU2380405C2/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2129878C1 (en) * | 1996-04-24 | 1999-05-10 | Зинченко Елена Вениаминовна | Immunomodulating preparation "neoferon" showing antiviral activity |
| RU2203950C1 (en) * | 2002-01-15 | 2003-05-10 | Общество с ограниченной ответственностью "Биотех" | Strain of yeast pichia pastoris as producer of leukocyte human interferon-16, recombinant plasmid dna phin and method for its construction |
| WO2004039996A1 (en) * | 2002-11-01 | 2004-05-13 | Cadila Healthcare Limited | Mthod for producing recombinant human interferon alpha 2b polypeptide in pichia pastoris |
| RU2242516C1 (en) * | 2003-12-18 | 2004-12-20 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Фармапарк" | Method for preparing recombinant human alpha-2b-interferon, recombinant plasmid and strain-producer for its realization |
| RU2294372C1 (en) * | 2005-06-16 | 2007-02-27 | ООО "Цитокин" | METHOD FOR PREPARING RECOMBINANT INTERFERON ALPHA-2b AND INTERFERON-CONTAINING PREPARATION (VARIANTS) |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2007143928A (en) | 2009-06-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN104231068A (en) | Human interleukin II mutant and application thereof | |
| CN113082049A (en) | New application of potassium iodide or composition containing potassium iodide in preventing or treating African swine fever | |
| CN101095950B (en) | Hydrophobia vaccine freezing drying preparations for stable human beings and the preparations thereof | |
| CN105535964A (en) | Double-strand polynucleotide-epsilon-polylysine-sulfuric acid glycan compound with immune regulating function and preparing and using method thereof | |
| CN101020719B (en) | Composite angelica polysaccharide and its preparation process and use | |
| JP2004502703A (en) | Acid-modified arabinogalactan protein composition | |
| RU2380405C2 (en) | Method for making recombinant human alpha 16-interferon and pharmaceutical composition for treating viral diseases based on recombinant human alpha 16-interferon | |
| CN105496972A (en) | Preparation method of chicken interferon lyophilized preparation | |
| RU2346698C1 (en) | Method of cattle leucosis prevention | |
| CN119405790A (en) | Use of pancreatic enzyme combined with ganoderma lucidum in preparing medicine for treating leukopenia | |
| CN103432569B (en) | Recombinant human serum albumin-interferon alpha fusion protein water solution and preparation method thereof | |
| US10889608B2 (en) | Ester of aminoglycan and uses thereof | |
| JPH02134325A (en) | Remedy for aids and production thereof | |
| GB2042555A (en) | Interferon inducers, methods for their preparation, pharmaceutical compositions containing them and their use as medicaments | |
| RU2526799C2 (en) | Pharmaceutical composition and method for preparing antiviral fractions (antivirus-c) | |
| CN101518645A (en) | Application of marine collagen peptide in preparing drugs, health care food or food for protecting renal function and delaying the process of chronic renal failure | |
| JP3072321B2 (en) | Anti-HIV active substance and method for producing the same | |
| CN105380911A (en) | Preparation method for lyophilized agent of swine interferon | |
| CN1727014B (en) | Method for processing blood using medicine containing enkephalin of methionine | |
| JPS63164895A (en) | Lectin-like protein originated from cultured cell, its production and antitumor agent composed mainly of said substance | |
| JPH029600B2 (en) | ||
| CN100594930C (en) | Combination medicine with pituitary anterior lobe adrenal cortex extract as main component, preparation method and application thereof | |
| CN111265594A (en) | Medicinal preparation for repairing wound and preparation method thereof | |
| CN104922144B (en) | A kind of pharmaceutical composition and application with function of increasing leukocyte | |
| CN104208681A (en) | Mixed freeze-dried powder for preventing duck viral diseases and preparation method thereof |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD4A | Correction of name of patent owner | ||
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20171130 |