RU2376012C1 - Method for production of combined liposome antibacterial preparation - Google Patents
Method for production of combined liposome antibacterial preparation Download PDFInfo
- Publication number
- RU2376012C1 RU2376012C1 RU2008120060/15A RU2008120060A RU2376012C1 RU 2376012 C1 RU2376012 C1 RU 2376012C1 RU 2008120060/15 A RU2008120060/15 A RU 2008120060/15A RU 2008120060 A RU2008120060 A RU 2008120060A RU 2376012 C1 RU2376012 C1 RU 2376012C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- liposomes
- chloroform
- rifampicin
- emulsion
- solution
- Prior art date
Links
- 239000002502 liposome Substances 0.000 title claims abstract description 43
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 14
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract 4
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 title abstract 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 36
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims abstract description 25
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 22
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims abstract description 21
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 17
- JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N rifampicin Chemical compound O([C@](C1=O)(C)O/C=C/[C@@H]([C@H]([C@@H](OC(C)=O)[C@H](C)[C@H](O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)\C=C\C=C(C)/C(=O)NC=2C(O)=C3C([O-])=C4C)C)OC)C4=C1C3=C(O)C=2\C=N\N1CC[NH+](C)CC1 JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N 0.000 claims abstract description 17
- RDEIXVOBVLKYNT-VQBXQJRRSA-N (2r,3r,4r,5r)-2-[(1s,2s,3r,4s,6r)-4,6-diamino-3-[(2r,3r,6s)-3-amino-6-(1-aminoethyl)oxan-2-yl]oxy-2-hydroxycyclohexyl]oxy-5-methyl-4-(methylamino)oxane-3,5-diol;(2r,3r,4r,5r)-2-[(1s,2s,3r,4s,6r)-4,6-diamino-3-[(2r,3r,6s)-3-amino-6-(aminomethyl)oxan-2-yl]o Chemical compound OS(O)(=O)=O.O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H](CC[C@@H](CN)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N.O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H](CC[C@H](O2)C(C)N)N)[C@@H](N)C[C@H]1N.O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N RDEIXVOBVLKYNT-VQBXQJRRSA-N 0.000 claims abstract description 15
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 claims abstract description 15
- 229960001225 rifampicin Drugs 0.000 claims abstract description 15
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 14
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 claims abstract description 10
- 238000009835 boiling Methods 0.000 claims abstract description 9
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 claims abstract description 8
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 claims abstract description 7
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 claims abstract description 7
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims abstract description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 5
- 239000012071 phase Substances 0.000 claims abstract description 4
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 claims description 12
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 12
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 claims description 11
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims description 10
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims description 10
- 229940124350 antibacterial drug Drugs 0.000 claims description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 6
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 claims description 6
- WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N phosphatidylcholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCC=CCCCCCCCC WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N 0.000 claims description 6
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 claims description 4
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 claims description 4
- 229910052719 titanium Inorganic materials 0.000 abstract description 11
- 239000010936 titanium Substances 0.000 abstract description 11
- 238000011282 treatment Methods 0.000 abstract description 9
- -1 titanium ions Chemical class 0.000 abstract description 6
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 abstract description 6
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 abstract description 6
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 abstract description 5
- RTAQQCXQSZGOHL-UHFFFAOYSA-N Titanium Chemical compound [Ti] RTAQQCXQSZGOHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 5
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 abstract description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 abstract description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 abstract description 2
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 abstract 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 6
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 5
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 206010069748 Burkholderia pseudomallei infection Diseases 0.000 description 2
- RNPXCFINMKSQPQ-UHFFFAOYSA-N dicetyl hydrogen phosphate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCOP(O)(=O)OCCCCCCCCCCCCCCCC RNPXCFINMKSQPQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940093541 dicetylphosphate Drugs 0.000 description 2
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 2
- 229960003722 doxycycline Drugs 0.000 description 2
- XQTWDDCIUJNLTR-CVHRZJFOSA-N doxycycline monohydrate Chemical compound O.O=C1C2=C(O)C=CC=C2[C@H](C)[C@@H]2C1=C(O)[C@]1(O)C(=O)C(C(N)=O)=C(O)[C@@H](N(C)C)[C@@H]1[C@H]2O XQTWDDCIUJNLTR-CVHRZJFOSA-N 0.000 description 2
- VEGXETMJINRLTH-BOZYPMBZSA-N gentamycin C1a Chemical compound O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H](CC[C@@H](CN)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N VEGXETMJINRLTH-BOZYPMBZSA-N 0.000 description 2
- 201000004015 melioidosis Diseases 0.000 description 2
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 2
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 2
- 239000007762 w/o emulsion Substances 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010069747 Burkholderia mallei infection Diseases 0.000 description 1
- 208000035357 Focal Infection Diseases 0.000 description 1
- 201000003641 Glanders Diseases 0.000 description 1
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 229960001139 cefazolin Drugs 0.000 description 1
- MLYYVTUWGNIJIB-BXKDBHETSA-N cefazolin Chemical compound S1C(C)=NN=C1SCC1=C(C(O)=O)N2C(=O)[C@@H](NC(=O)CN3N=NN=C3)[C@H]2SC1 MLYYVTUWGNIJIB-BXKDBHETSA-N 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000010411 cooking Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 229910001873 dinitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 1
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 210000002557 fixed macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003712 lysosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000001868 lysosomic effect Effects 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 239000012299 nitrogen atmosphere Substances 0.000 description 1
- 210000004738 parenchymal cell Anatomy 0.000 description 1
- 150000002978 peroxides Chemical class 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000003319 supportive effect Effects 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к медицине, а более конкретно к проблеме создания новых липосомальных форм антимикробных препаратов для лечения и профилактики особо опасных инфекционных заболеваний.The invention relates to medicine, and more specifically to the problem of creating new liposomal forms of antimicrobial agents for the treatment and prevention of especially dangerous infectious diseases.
Проблемы, связанные с непосредственным использованием лекарств в фармакологии и медицине, могут быть разрешены путем использования систем переносчиков (Макаров К.А., Кибардин С.А. Иммобилизованные биопрепараты в медицине. - М.: Медицина. - 1980. - 128 С.).Problems associated with the direct use of drugs in pharmacology and medicine can be solved by using carrier systems (Makarov K.A., Kibardin S.A. Immobilized biological products in medicine. - M .: Medicine. - 1980. - 128 C.) .
На сегодняшний день липосомы представляются наиболее многообещающими по сравнению с другими возможными переносчиками не только потому, что они биодеградируемы, а также из-за уникальных свойств как носителей лекарственных веществ, позволяющих включать в их внутреннее водное пространство водорастворимые, а в липидный бислой - водонерастворимые препараты, целенаправленно доставлять их в нужные области организма, снижать их токсичность и продлевать действие, предохраняя препараты от воздействия агрессивной физиологической среды (Грегориадис Г., Аллисон Л. Липосомы в биологических системах. - М.: Медицина. - 1983. - С.36-39, Саатов Т.С., Исаев Э.И., Бурханов С.А. Аутологические липосомы // Вестник Акад. мед. наук СССР. - 1990. - №8. - С.47-50).Today, liposomes seem to be the most promising in comparison with other possible carriers, not only because they are biodegradable, but also because of their unique properties as carriers of medicinal substances, which make it possible to include water-soluble drugs in their internal water space, and water-insoluble drugs in the lipid bilayer. purposefully deliver them to the desired areas of the body, reduce their toxicity and prolong their action, protecting the drugs from the effects of aggressive physiological environment (Grego Iadis G., Allison L. Liposomes in biological systems. - M .: Medicine. - 1983. - P.36-39, Saatov TS, Isaev E.I., Burkhanov SA Autologic liposomes // Bulletin Academician of medical sciences of the USSR. - 1990. - No. 8. - S.47-50).
Особый интерес представляют липосомы как переносчики антибактериальных препаратов (Ротов К.А., Васильев В.П., Антонов Ю.В. Получение и характеристика липосом, содержащих антибиотики // Микробиол. Журн. -1989. - Т.51. - №6. - С.79-82). Антибиотик в основном концентрируется в паренхиматозных органах (печени, селезенке), легких и, кроме того, доставка препарата путем эндоцитоза непосредственно в лизосомы уменьшает его инактивацию и позволяет оптимизировать антимикробное действие. Это приобретает особо важное значение для лечения и профилактики таких инфекций, как сап и мелиоидоз, возбудители которых находятся внутри фиксированных макрофагов.Of particular interest are liposomes as carriers of antibacterial drugs (Rotov K.A., Vasiliev V.P., Antonov Yu.V. Obtaining and characterization of liposomes containing antibiotics // Mikrobiol. Zhurn. -1989. - T. 51. - No. 6 - S.79-82). The antibiotic is mainly concentrated in the parenchymal organs (liver, spleen), lungs and, in addition, the delivery of the drug by endocytosis directly to the lysosomes reduces its inactivation and allows optimizing the antimicrobial effect. This is especially important for the treatment and prevention of infections such as glanders and melioidosis, the causative agents of which are located inside fixed macrophages.
Рядом авторов (Тихонов Н.Г., Ротов К.А., Перепелкин А.И. Липосомальные антибиотики и их использование при лечении особо опасных инфекционных заболеваний // Природно-очаговые инфекции в Нижнем Поволжье: Сб. научн. трудов ВолгНИПЧИ. - Волгоград, 2000. - С.291-301., Ротов К.А., Тихонов С.Н., Храпова Н.П., Алексеев В.В., Снатенков Е.А. Оценка эффективности лечения легочной формы острого мелиоидоза липосомальным цефазолином в эксперименте // Проблемы особо опасных инфекций. - 2007. - Вып.93. - №1. - С.93-94) было отмечено, что иммобилизация антибиотиков в липосомы позволила значительно повысить эффективность лечения сапной и мелиоидозной инфекций в эксперименте в сравнении со свободными формами антимикробных препаратов. Показана возможность применения липосомального гентамицина сульфата, доксициклина для профилактики мелиоидозной и сапной инфекций в эксперименте (Ротов К.А., Снатенков Е.А., Алексеев В.В., Храпова Н.П. Возможность применения липосомального гентамицина сульфата для профилактики мелиоидозной инфекции в эксперименте // Санитарная охрана территорий государств - участников содружества независимых государств - проблемы биологической безопасности противодействия биотерроризму в современных условиях. Мат. междунар. научн.-практ. конфер. (13-14 сентября 2005). - Волгоград, 2005. - С.148-149., Рогов К.А., Снатенков Е.А., Замарин А.А., Тихонов С.Н., Храпова Н.П., Алексеев В.В. Протективность липосомального доксициклина при экспериментальной сапной инфекции // Современные аспекты эпидемиологического надзора за особо опасными инфекционными заболеваниями на юге России: Матер. Российской научн.-практ. конф. (21-22 марта 2007 г.), г.Ставрополь 2007. - С.67-68).A number of authors (Tikhonov N.G., Rotov K.A., Perepelkin A.I. Liposomal antibiotics and their use in the treatment of especially dangerous infectious diseases // Natural focal infections in the Lower Volga region: Sat scientific works of VolgNIPCHI. - Volgograd , 2000. - P.291-301., Rotov K.A., Tikhonov S.N., Khrapova N.P., Alekseev V.V., Snatenkov E.A. Evaluation of the effectiveness of treatment of pulmonary forms of acute melioidosis with liposomal cefazolin experiment // Problems of especially dangerous infections. - 2007. - Issue 93. - No. 1. - S.93-94) it was noted that the immobilization of antibiotics into liposomes allowed and significantly increase the effectiveness of the treatment of heap and melioid infections in the experiment in comparison with free forms of antimicrobial agents. The possibility of using liposomal gentamicin sulfate, doxycycline for the prevention of melioid and sap infections in the experiment is shown (Rotov K.A., Snatenkov E.A., Alekseev V.V., Khrapova N.P. Possibility of using liposomal gentamicin sulfate for the prevention of melioid infection in experiment // Sanitary protection of territories of states - participants of the Commonwealth of Independent States - problems of biological safety of counteraction to bioterrorism in modern conditions.Mat. International scientific and practical conference. (13-14 se November 2005). - Volgograd, 2005. - P.148-149., Rogov K.A., Snatenkov E.A., Zamarin A.A., Tikhonov S.N., Khrapova N.P., Alekseev V. B. The efficacy of liposomal doxycycline in experimental perennial infections // Modern aspects of the epidemiological surveillance of especially dangerous infectious diseases in southern Russia: Mater. Russian Scientific and Practical Conf. (March 21-22, 2007), Stavropol 2007. - S.67-68).
Вместе с тем проблема экстренной профилактики и лечения особо опасных инфекционных заболеваний разработана недостаточно.However, the problem of emergency prevention and treatment of especially dangerous infectious diseases is not sufficiently developed.
Приготовление липосом методом «ручного» встряхивания: 100 мг смеси липидов (фосфатидилхолин, холестерин, дицетилфосфат в соотношении 7:2:1) растворяют в 50 мл хлороформа в 200 мл круглодонной колбе для роторного испарителя и при пониженном давлении проводили выпаривание органического растворителя. Время окончания выпаривания определяли по исчезновению запаха хлороформа в колбе, при этом на ее стенках образовывалась тонкая пленка липидов. Снятую с роторного испарителя колбу продували газообразным азотом для предотвращения окисления липидов и затем вносили 5 мл, содержащих 28,5 мг гентамицина сульфата в 0,01 М фосфатном буфере рН 7,2. После 2 часовой инкубации при комнатной температуре смеси для образования гомогенной суспензии липосом в колбу помещали несколько стеклянных бусинок и энергично встряхивали в течение 5 минут. Невключившийся антибиотик удаляли центрифугированием. Мягкие условия приготовления и большие размеры липосом позволяют использовать этот метод для включения крупных биологических макромолекул без значительной потери активности. Недостатком метода является низкий процент включения материала (1-3%) (Acuto О., Pugliese О., Muler М., Tosi R. Preparation of liposomes incorporating membrane components from human lymphoid cells // Tissue Antigenes. - 1979. - V.14, №5. - P.385-397).Preparation of liposomes by “manual” shaking: 100 mg of a mixture of lipids (phosphatidylcholine, cholesterol, dicetylphosphate in a ratio of 7: 2: 1) was dissolved in 50 ml of chloroform in a 200 ml round bottom flask for a rotary evaporator and the organic solvent was evaporated under reduced pressure. The end time of evaporation was determined by the disappearance of the smell of chloroform in the flask, while a thin lipid film was formed on its walls. The flask removed from the rotary evaporator was flushed with nitrogen gas to prevent lipid oxidation and then 5 ml containing 28.5 mg of gentamicin sulfate in 0.01 M phosphate buffer pH 7.2 was added. After 2 hours of incubation at room temperature, several glass beads were placed in a flask to form a homogeneous suspension of liposomes and shaken vigorously for 5 minutes. The unincorporated antibiotic was removed by centrifugation. Mild cooking conditions and large liposome sizes allow this method to be used to incorporate large biological macromolecules without significant loss of activity. The disadvantage of this method is the low percentage inclusion of the material (1-3%) (Acuto O., Pugliese O., Muler M., Tosi R. Preparation of liposomes incorporating membrane components from human lymphoid cells // Tissue Antigenes. - 1979. - V. 14, No. 5. - P.385-397).
Приготовление мелких моноламеллярных липосом методом ультразвуковой обработкой: взвесь липосом, полученную по методу, описанному выше, переносят в сосуд для ультразвуковой обработки и производят озвучивание в атмосфере азота. Режим озвучивания: частота - 20 кГц; мощность - 200 Вт; экспозиция - 30 мин. Для предотвращения разогрева взвеси липосом применяют ледяную баню. В процессе озвучивания происходит просветление взвеси липосом. По окончанию обработки препарат представляет собой прозрачную жидкость, опалесцирующую при боковом освещении. Образуются очень мелкие, однородные по размеру 20-200 Å моноламеллярные липосомы. Включение материала не превышает 1,5%. Данным способом можно включать низкомолекулярные вещества, устойчивые к ультразвуку. В основном он применяется в биофизических исследованиях мембран (Papahadjopoulos D., Wotkins J.C. Phospholipid model membrynes. II. Permeabilyti properties of hydrated liguid crystals. - Biochim. et biophys. Acta, 1967, vol. 135, p.639-652).Preparation of small monolamellar liposomes by ultrasonic treatment: a suspension of liposomes prepared according to the method described above is transferred to a vessel for ultrasonic treatment and sonication is performed in a nitrogen atmosphere. Sound mode: frequency - 20 kHz; power - 200 W; exposition - 30 minutes To prevent the suspension of liposomes from being heated, an ice bath is used. In the process of scoring, enlightenment of a suspension of liposomes occurs. At the end of the treatment, the drug is a clear liquid, opalescent in lateral lighting. Very small, uniform in size 20-200 Å monolamellar liposomes are formed. The inclusion of the material does not exceed 1.5%. This method can include low molecular weight substances that are resistant to ultrasound. It is mainly used in biophysical studies of membranes (Papahadjopoulos D., Wotkins J.C. Phospholipid model membrynes. II. Permeabilyti properties of hydrated liguid crystals. - Biochim. Et biophys. Acta, 1967, vol. 135, p.639-652).
Наиболее близким аналогом является метод получения липосом, предложенный Szoka F., Papahandjopoulos D. Procedure for preparation of liposomes with large internal space and high capture by reverse-phase evaporation // Proc. Nat. Sci. USA. - 1978. - V.75, N 9. - P.4194-4198. Согласно методу 30 мг липидов (фосфатидилхолин, холестерин, дицетилфосфат в соотношении 7:2:1) растворяют в 3 мл смеси эфира с хлороформом 2:1 и вносят в круглодонную колбу роторного испарителя объемом 100 см3. 1 мл раствора включаемого материала (гентамицина сульфат - 28,5 мг) в 0,01 М фосфатном буфере рН 7,5 добавляют к раствору липидов в органической фазе и обработкой ультразвуком 20 кГц, мощностью 200 Вт в течение 5 минут достигают образования эмульсии типа «вода в масле». Колбу с эмульсией присоединяют к роторному испарителю, и постепенно понижая давление так, чтобы не происходило кипение, полностью удаляют органический растворитель. Об окончании выпаривания судят по образованию геля в колбе и исчезновению запаха органического растворителя. В процессе выпаривания поддерживают температуру смеси выше температуры фазового перехода фосфолипидов (20-25°С). Колбу снимают с испарителя, к образовавшемуся гелю добавляют 5 мл 0,01 М фосфатного буфера рН 7,5 и встряхивают до образования гомогенной суспензии липосом. Липосомы, полученные данным методом, характеризуются высокой эффективностью включения - до 50-60% и большими размерами - до 1,0-1,2 мкм. Невключившийся материал удаляют центрифугированием. Недостатком является малая устойчивость эмульсии и геля типа «вода в масле», вследствие чего в каждом конкретном случае требуется подбор состава липидной смеси, техники выпаривания и навыка в работе, использование смеси растворителей с разной температурой кипения, что приводит к неоднородному образованию фосфолипидных везикул (температура кипения эфира +34,5°С, температура кипения хлороформа +61,2°С), а также токсическое воздействие ионов титана на антигенный материал и фосфолипиды (Г. Грегориадис, А. Аллисон. Липосомы в биологических системах. - М.: Медицина. - 1983. - С.28-29).The closest analogue is the liposome preparation method proposed by Szoka F., Papahandjopoulos D. Procedure for preparation of liposomes with large internal space and high capture by reverse-phase evaporation // Proc. Nat. Sci. USA - 1978. - V.75, N 9. - P.4194-4198. According to the method, 30 mg of lipids (phosphatidylcholine, cholesterol, dicetylphosphate in a ratio of 7: 2: 1) are dissolved in 3 ml of a mixture of ether and chloroform 2: 1 and introduced into a round-bottom flask of a rotary evaporator with a volume of 100 cm 3 . 1 ml of a solution of the included material (gentamicin sulfate - 28.5 mg) in 0.01 M phosphate buffer, pH 7.5, is added to the lipid solution in the organic phase and sonication with 20 kHz, with a power of 200 W for 5 minutes, the formation of an emulsion of the type " water in oil. " The emulsion flask is attached to a rotary evaporator, and gradually lowering the pressure so that boiling does not occur, the organic solvent is completely removed. The end of evaporation is judged by the formation of gel in the flask and the disappearance of the smell of organic solvent. During the evaporation process, the temperature of the mixture is maintained above the phase transition temperature of phospholipids (20-25 ° C). The flask was removed from the evaporator, 5 ml of 0.01 M phosphate buffer, pH 7.5, were added to the resulting gel and shaken until a homogeneous suspension of liposomes was formed. Liposomes obtained by this method are characterized by high inclusion efficiency - up to 50-60% and large sizes - up to 1.0-1.2 microns. Unincorporated material is removed by centrifugation. The disadvantage is the low stability of the emulsion and the gel type "water in oil", as a result of which, in each case, it is necessary to select the composition of the lipid mixture, the evaporation technique and skill in use, the use of a mixture of solvents with different boiling points, which leads to an inhomogeneous formation of phospholipid vesicles (temperature boiling point of ether + 34.5 ° С, boiling point of chloroform + 61.2 ° С), as well as the toxic effect of titanium ions on antigenic material and phospholipids (G. Gregoriadis, A. Allison. Liposomes in biological systems max -. M .: Medicine -. 1983. - p.28-29).
Целью изобретения является получение комбинированного липосомального антибактериального препарата, содержащего в мембране водонерастворимый рифампицин, во внутреннем объеме - гентамицина сульфат.The aim of the invention is to obtain a combined liposomal antibacterial drug containing water-insoluble rifampicin in the membrane, and gentamicin sulfate in the internal volume.
Поставленная цель достигается тем, что вследствие увеличения липидной нагрузки происходит встраивание рифампицина в мембрану липосом, повышается ее стабильность и возрастает процент инкапсуляции гентамицина сульфата. Универсальность носителя обеспечивается нейтральным зарядом мембраны липосом. Получение эмульсии на роторном миксере позволяет исключить токсическое влияние ионов титана (титановый зонд ультразвукового дезинтегратора) на антибактериальные препараты и фосфолипиды. Для этого 63,3-50,1 мг смеси липидов (фосфатидилхолин, холестерин в соотношении 7:3) растворяли в 4,3-3,8 мл хлороформа и смешивали с 1,0-0,5 мл хлороформенного раствора рифампицина, содержащего 6,0-3,0 мг антибиотика. 28,5-7,125 мг гентамицина сульфата, растворенного в 0,01 М фосфатном буфере рН 7,2, в объеме 1,5 мл добавляли к раствору липидов в органической фазе и обработкой на роторном миксере мощностью 500 Вт при 15000 об/мин в течение 3 мин достигали образования эмульсии. При пониженном давлении в роторном испарителе полностью удаляли органический растворитель. К образовавшемуся гелю добавляли 5 мл 0,01 М фосфатного буфера рН 7,2 и тщательно перемешивали в колбе на роторном испарителе. Отделение невключившихся антибиотиков проводили центрифугированием при 40000 g в течение 1 ч на центрифуге «Ja-21» «Bechman» (США). В супернатанте определяли радиоизотопным методом по двум меткам 125I-рифампицин и 14С-гентамицина сульфат.This goal is achieved by the fact that due to an increase in lipid load, rifampicin is embedded in the liposome membrane, its stability is increased, and the percentage of encapsulation of gentamicin sulfate increases. The universality of the carrier is ensured by the neutral charge of the liposome membrane. Obtaining an emulsion on a rotary mixer eliminates the toxic effect of titanium ions (titanium probe of an ultrasonic disintegrator) on antibacterial drugs and phospholipids. For this, 63.3-50.1 mg of a mixture of lipids (phosphatidylcholine, cholesterol in a ratio of 7: 3) was dissolved in 4.3-3.8 ml of chloroform and mixed with 1.0-0.5 ml of a chloroform solution of rifampicin containing 6 0-3.0 mg of antibiotic. 28.5-7.125 mg of gentamicin sulfate, dissolved in 0.01 M phosphate buffer pH 7.2, in a volume of 1.5 ml was added to the lipid solution in the organic phase and treated with a 500 W rotary mixer at 15,000 rpm for 3 min reached the formation of an emulsion. The organic solvent was completely removed under reduced pressure on a rotary evaporator. To the resulting gel was added 5 ml of 0.01 M phosphate buffer pH 7.2 and thoroughly mixed in a flask on a rotary evaporator. Unincluded antibiotics were separated by centrifugation at 40,000 g for 1 h on a Bechman Ja-21 centrifuge (USA). In the supernatant was determined by the radioisotope method using two labels of 125 I-rifampicin and 14 C-gentamicin sulfate.
Увеличением липидной нагрузки достигнута высокая устойчивость эмульсии и геля типа «вода в масле». Универсальность носителя обеспечивается нейтральным зарядом мембраны липосом. Используемый метод позволяет применять один органический растворитель с определенной температурой кипения. Получение эмульсии на роторном миксере позволяет исключить токсическое влияние ионов титана (титановый зонд ультразвукового дезинтегратора) и сократить время обработки.By increasing the lipid load, high stability of the emulsion and water-in-oil gel was achieved. The universality of the carrier is ensured by the neutral charge of the liposome membrane. The method used allows the use of one organic solvent with a specific boiling point. Obtaining an emulsion on a rotary mixer eliminates the toxic effect of titanium ions (titanium probe of an ultrasonic disintegrator) and reduces the processing time.
Добавлением к хлороформенной смеси липидов рифампицина в органической фазе и увеличением липидной нагрузки достигнута высокая устойчивость эмульсии и геля типа «вода в масле». Это позволило встроить в мембрану антибиотик. Универсальность носителя обеспечивается нейтральным зарядом мембраны липосом. Используемый метод позволяет применять один органический растворитель с определенной температурой кипения. Получение эмульсии на роторном миксере позволяет исключить токсическое влияние ионов титана (титановый зонд ультразвукового дезинтегратора) и сократить время обработки. Данный способ позволяет встроить в мембрану 50% рифампицина и инкапсулировать внутрь липосом 70% гентамицина сульфата.By adding rifampicin lipids to the chloroform mixture in the organic phase and increasing the lipid load, high stability of the water-in-oil emulsion and gel was achieved. This made it possible to incorporate an antibiotic into the membrane. The universality of the carrier is ensured by the neutral charge of the liposome membrane. The method used allows the use of one organic solvent with a specific boiling point. Obtaining an emulsion on a rotary mixer eliminates the toxic effect of titanium ions (titanium probe of an ultrasonic disintegrator) and reduces the processing time. This method allows you to embed in the membrane of 50% rifampicin and encapsulate inside the liposomes of 70% gentamicin sulfate.
Примеры конкретного выполнения:Examples of specific performance:
Пример 1. Получение липосом с высоким содержанием в мембране рифампицина и внутри везикул гентамицина сульфатаExample 1. Obtaining liposomes with a high content in the membrane of rifampicin and inside the vesicles of gentamicin sulfate
Предлагаемая дозировка может найти применение для создания максимальных концентраций антибактериальных средств в среде макроорганизма.The proposed dosage can be used to create maximum concentrations of antibacterial agents in the environment of a macroorganism.
Для этого 63,3 мг смеси липидов (фосфатидилхолин, холестерин в соотношении 7:3) растворяли в 4,3 мл хлороформа и смешивали с 2,0 мл хлороформенного раствора рифампицина, содержащего 6 мг антибиотика. 28,5 мг гентамицина сульфата, растворенного в 0,01 М фосфатном буфере рН 7,2, в объеме 1,5 мл добавляли к раствору липидов в органической фазе и обработкой на роторном миксере мощностью 500 Вт при 15000 об/мин в течение 3 мин достигали образования эмульсии. При пониженном давлении в роторном испарителе полностью удаляли органический растворитель. К образовавшемуся гелю добавляли 5 мл 0,01 М фосфатного буфера рН 7,2 и тщательно перемешивали в колбе на роторном испарителе. Отделение невключившихся антибиотиков проводили центрифугированием при 40000 g в течение 1 ч на центрифуге «Ja-21» «Bechman» (США). Процент иммобилизации антибиотиков определяли радиоизотопным методом. Он составлял 50% для рифампицина и 70% для гентамицина сульфата. Размеры липосомального препарата при электронно-микроскопическом исследовании составляли 600-800 нм (чертеж). Степень окисления липидов мембраны липосом составляла 0,8±0,02 (перекисный индекс Клейна) (Klein R.A. The detection of oxidation in liposome preparations // Biochim. Biophys. Acta. - 1970. - N 21. - P.486-489).For this, 63.3 mg of a mixture of lipids (phosphatidylcholine, cholesterol in a ratio of 7: 3) was dissolved in 4.3 ml of chloroform and mixed with 2.0 ml of a chloroform solution of rifampicin containing 6 mg of antibiotic. 28.5 mg of gentamicin sulfate, dissolved in 0.01 M phosphate buffer pH 7.2, in a volume of 1.5 ml was added to the lipid solution in the organic phase and treated with a 500 W rotary mixer at 15,000 rpm for 3 min reached the formation of an emulsion. The organic solvent was completely removed under reduced pressure on a rotary evaporator. To the resulting gel was added 5 ml of 0.01 M phosphate buffer pH 7.2 and thoroughly mixed in a flask on a rotary evaporator. Unincluded antibiotics were separated by centrifugation at 40,000 g for 1 h on a Bechman Ja-21 centrifuge (USA). The percentage of antibiotic immobilization was determined by the radioisotope method. It was 50% for rifampicin and 70% for gentamicin sulfate. The size of the liposomal preparation during electron microscopy was 600-800 nm (drawing). The lipid oxidation state of the liposome membrane was 0.8 ± 0.02 (Klein peroxide index) (Klein RA The detection of oxidation in liposome preparations // Biochim. Biophys. Acta. - 1970. - N 21. - P.486-489) .
Пример 2. Получение липосом с низким содержанием в мембране рифампицина и внутри везикул гентамицина сульфатаExample 2. Obtaining liposomes with a low content in the membrane of rifampicin and inside the vesicles of gentamicin sulfate
Предлагаемые дозы антимикробных препаратов можно использовать в качестве последующего поддерживающего лечения.Suggested doses of antimicrobials can be used as follow-up supportive care.
Для получения липосом 50,1 мг смеси липидов (фосфатидилхолин, холестерин в соотношении 7:3) растворяли в 3,8 мл хлороформа и смешивали с 0,5 мл хлороформенного раствора рифампицина, содержащего 1,5 мг антибиотика. 7,125 мг гентамицина сульфата, растворенного в 0,01 М фосфатном буфере рН 7,2, в объеме 1,5 мл добавляли к раствору липидов в органической фазе. Далее методика приготовления препарата идентична указанной в примере 1.To obtain liposomes, 50.1 mg of a mixture of lipids (phosphatidylcholine, cholesterol in the ratio of 7: 3) was dissolved in 3.8 ml of chloroform and mixed with 0.5 ml of a chloroform solution of rifampicin containing 1.5 mg of antibiotic. 7.125 mg of gentamicin sulfate dissolved in 0.01 M phosphate buffer pH 7.2 in a volume of 1.5 ml was added to the lipid solution in the organic phase. Further, the method of preparation of the drug is identical to that specified in example 1.
Таким образом, добавлением к хлороформенной смеси липидов рифампицина в органической фазе и увеличением липидной нагрузки достигнута высокая устойчивость эмульсии и геля типа «вода в масле». Это позволило встроить в мембрану антибиотик. Универсальность носителя обеспечивается нейтральным зарядом мембраны липосом. Используемый метод позволяет применять один органический растворитель с определенной температурой кипения. Получение эмульсии на роторном миксере позволяет исключить токсическое влияние ионов титана (титановый зонд ультразвукового дезинтегратора) на мембрану липосом и антибактериальные препараты и сократить время обработки. Данный способ позволяет встроить в мембрану 50% рифампицина и инкапсулировать внутрь липосом 70% гентамицина сульфата.Thus, by adding rifampicin lipids to the chloroform mixture in the organic phase and increasing the lipid load, high stability of the water-in-oil emulsion and gel was achieved. This made it possible to incorporate an antibiotic into the membrane. The universality of the carrier is ensured by the neutral charge of the liposome membrane. The method used allows the use of one organic solvent with a specific boiling point. Obtaining an emulsion on a rotary mixer eliminates the toxic effect of titanium ions (titanium probe of an ultrasonic disintegrator) on the liposome membrane and antibacterial drugs and reduces the processing time. This method allows you to embed in the membrane of 50% rifampicin and encapsulate inside the liposomes of 70% gentamicin sulfate.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2008120060/15A RU2376012C1 (en) | 2008-05-20 | 2008-05-20 | Method for production of combined liposome antibacterial preparation |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2008120060/15A RU2376012C1 (en) | 2008-05-20 | 2008-05-20 | Method for production of combined liposome antibacterial preparation |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2376012C1 true RU2376012C1 (en) | 2009-12-20 |
Family
ID=41625545
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2008120060/15A RU2376012C1 (en) | 2008-05-20 | 2008-05-20 | Method for production of combined liposome antibacterial preparation |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2376012C1 (en) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2582969C1 (en) * | 2015-03-24 | 2016-04-27 | Федеральное казенное учреждение здравоохранения "Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Method of producing liposome with encapsulated doxycycline hydrochloride and surface localised monoclonal antibodies |
| RU2595865C2 (en) * | 2010-08-20 | 2016-08-27 | Др. Редди'З Лабораториз, Лтд. | Phospholipid depot preparation |
| CN116327703A (en) * | 2023-03-31 | 2023-06-27 | 湖北三峡职业技术学院 | Preparation method and application of liposome coated nano Bi2S3 and Gen |
| RU2805933C1 (en) * | 2023-02-09 | 2023-10-24 | федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Ставропольский государственный аграрный университет" | Method of obtaining niosomal form of gentamicin |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2063770C1 (en) * | 1992-05-22 | 1996-07-20 | Николай Сергеевич Скрипников | Method of purulent-inflammatory lung disease treatment |
-
2008
- 2008-05-20 RU RU2008120060/15A patent/RU2376012C1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2063770C1 (en) * | 1992-05-22 | 1996-07-20 | Николай Сергеевич Скрипников | Method of purulent-inflammatory lung disease treatment |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| http://www.mitht.ru/files/21212001/280607-2.pdf - автореферат. http://n-t.ru/nj/nz/1988/0601.htm. * |
| SZOKA F. PAPAHANDJOPOULOS D. Procedure for preparation of liposomes with large internal space and capture by reverse-phase evaporation. Proc. Nat. Sci. USA, 1978, v.75, #9, p.4194-4198. * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2595865C2 (en) * | 2010-08-20 | 2016-08-27 | Др. Редди'З Лабораториз, Лтд. | Phospholipid depot preparation |
| RU2582969C1 (en) * | 2015-03-24 | 2016-04-27 | Федеральное казенное учреждение здравоохранения "Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Method of producing liposome with encapsulated doxycycline hydrochloride and surface localised monoclonal antibodies |
| RU2805933C1 (en) * | 2023-02-09 | 2023-10-24 | федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Ставропольский государственный аграрный университет" | Method of obtaining niosomal form of gentamicin |
| CN116327703A (en) * | 2023-03-31 | 2023-06-27 | 湖北三峡职业技术学院 | Preparation method and application of liposome coated nano Bi2S3 and Gen |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2958774B2 (en) | Improved preparation of amphotericin B liposomes | |
| JP6751424B2 (en) | Cochleate made with soybean phosphatidylserine | |
| US11040011B2 (en) | Zinc meloxicam complex microparticle multivesicular liposome formulations and processes for making the same | |
| JP2017226691A (en) | Novel formulations of volatile anesthetics and methods of use thereof for reducing inflammation | |
| MX2011000932A (en) | Methods of administering topical antifungal formulations for the treatment of fungal infections. | |
| US20140079773A1 (en) | Encapsulating liposomes | |
| JP5616565B2 (en) | Formulations for applying anti-inflammatory agents | |
| RU2376012C1 (en) | Method for production of combined liposome antibacterial preparation | |
| Qu et al. | A rigid nanoplatform for precise and responsive treatment of intracellular multidrug-resistant bacteria | |
| WO2009052090A2 (en) | Silicate containing compositions and methods of treatment | |
| JP2018500359A (en) | Hybrid type multilayer nanostructure of epidermal growth factor and liposome and method for producing the same | |
| CA2595485A1 (en) | Liposomal compositions for parenteral delivery of statins | |
| KR101503492B1 (en) | Liposomes capsule containing lipid and lysosomal enzymes, and manufacturing method thereof | |
| RU2582969C1 (en) | Method of producing liposome with encapsulated doxycycline hydrochloride and surface localised monoclonal antibodies | |
| CN111514305A (en) | A kind of targeted drug based on carbon quantum dots, preparation method and application thereof | |
| US20230390316A1 (en) | Antimicrobial compositions and methods of use | |
| RU2844550C1 (en) | Method of producing a photosensitizer for antibacterial photodynamic therapy | |
| RU2356538C1 (en) | Antigen-containing liposome preparation process | |
| CN115054577A (en) | Nano antidote and application thereof in neutralizing MRSA (methicillin-resistant staphylococcus aureus) perforation toxin | |
| JP2017095495A (en) | Molecular mixture comprising amphiphilic molecular species A and amphiphilic molecular species B and polyphenol C exhibiting a positive total charge in the hydrophilic region, method for producing the molecular mixture, and use thereof | |
| Kumar et al. | PREPARATION AND EVALUATION OF LIPOSOMAL GEL OF LINCOMYCIN HCL | |
| JPS59500952A (en) | Stable plurilamellar vesicles | |
| JPS6137729A (en) | Increased antibacterial activity due to a mixture of antibacterial substances contained in the lipid endoplasmic reticulum | |
| Simöes et al. | Lipid-Based Nanocarriers for the Treatment of Infected Skin Lesions | |
| BR102018069645A2 (en) | liposomal pharmaceutical composition containing co-encapsulated bioactive substances with cytotoxic and anti-tumor activity |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20100521 |