RU2250781C2

RU2250781C2 - Method for manufacturing viral antirabic vaccine for oral immunization i wild carnivores

Info

Publication number: RU2250781C2
Application number: RU2003120727/15A
Authority: RU
Inventors: Е.М. Хрипунов (RU); Е.М. Хрипунов; С.Д. Евсеева (RU); С.Д. Евсеева; В.И. Жестерев (RU); В.И. Жестерев; Т.Ф. Горшкова (RU); Т.Ф. Горшкова; Д.О. Баньковский (RU); Д.О. Баньковский; С.А. Пархомцев (RU); С.А. Пархомцев
Original assignee: ВНИИ ветеринарной вирусологии и микробиологии
Priority date: 2003-07-10
Filing date: 2003-07-10
Publication date: 2005-04-27
Also published as: RU2003120727A

Abstract

FIELD: biotechnology, veterinary science.

SUBSTANCE: he present innovation deals with manufacturing biopreparations for oral immunization in animals. One should grow vaccinia rabic virus, TC-80 strain in a certain passage cell culture to mix it with protective components (peptone, lactose, pectin). Mixing should be carried out at 14 : 5 : 1 ratio (viral suspension : stabilizing medium, consisting of 40% peptone solution with 8% lactose solution : 4% pectin solution, correspondingly), a semifinished product obtained after mixing should be applied onto a bait (a porous briquette) to be frozen and freeze dried for 24-30 h. The method includes decreased number of stages for manufacturing necessary vaccine being more efficient and economical. The vaccine keeps immunogenic properties for 5 d, not less at environmental temperature being up to 20 C and during storage period for 6 mo at 6-8 C.

EFFECT: higher efficiency of manufacturing.

2 ex, 1 tbl

Description

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к производству биопрепаратов для оральной иммунизации животных.The invention relates to the field of biotechnology, namely the production of biological products for oral immunization of animals.

Имеется способ изготовления вакцины против бешенства для орального применения (W.Winkler et al., Vaccination of foxes against rabies using ingested bait. - J. Wildlife Disease, 1978, 11, 3, р.382-388), заключающийся во введении в приманку (коммерческий бисквит) суспензии вируса бешенства штамм ERA, выращенный в клетках ВНК-21, и дальнейшем замораживании приманки с вирусом при минус 70°С. Замороженные приманки покрывали жидкой смесью (49% парафина, 49% говяжьего жира и 2% сардинного масла).There is a method of manufacturing a rabies vaccine for oral administration (W. Winkler et al., Vaccination of foxes against rabies using ingested bait. - J. Wildlife Disease, 1978, 11, 3, p. 382-388), which consists in the introduction of the bait (commercial biscuit) suspension of rabies virus strain ERA grown in BHK-21 cells, and further freezing the bait with the virus at minus 70 ° C. Frozen lures were coated with a liquid mixture (49% paraffin, 49% beef fat and 2% sardine oil).

Недостаток этого способа в том, что он позволяет получить приманки, хранящиеся и применяющиеся только при низких отрицательных температурах.The disadvantage of this method is that it allows you to get bait, stored and used only at low freezing temperatures.

Известен также способ изготовления вакцины (K.F.Lawson, R. Hertler, K. M.Carlton, J.B.Campbell and A.J.Rhodes. Safety and Immunogenicity of ERA Strain of Rabies virus Propagated in BHK-21 Cell Line. - Can. J. Vet. Res. 1989, 53, p.438-444) для оральной иммунизации плотоядных против бешенства, состоящий в том, что суспензию штамма ERA вируса бешенства, размноженного в ВНК-21/С 13 клетках, вносят в пористую полиуретановую губку размером 31/31/38 мм, замораживают при минус 70°С, покрывают смесью жира/воска и применяют как при низких отрицательных, так и низких положительных температурах.There is also known a method of manufacturing a vaccine (KFLawson, R. Hertler, KMCarlton, JBCampbell and AJRhodes. Safety and Immunogenicity of ERA Strain of Rabies virus Propagated in BHK-21 Cell Line. - Can. J. Vet. Res. 1989, 53, p.438-444) for oral immunization of carnivores against rabies, consisting in the fact that a suspension of the rabies virus ERA strain propagated in BHC-21 / C 13 cells is introduced into a porous polyurethane sponge of 31/31/38 mm in size, frozen at minus 70 ° C, cover with a mixture of fat / wax and apply both at low negative and low positive temperatures.

Недостаток этого способа состоит в том, что для сохранения устойчивости вакцины применяются дорогостоящие коммерческий стабилизатор и 10% суспензия яичного желтка, а также низкие отрицательные температуры минус 20°С хранения. При применении вакцины в осенне-зимний и весенне-зимний периоды она изменяет агрегатное состояние при суточных колебаниях температуры, что инактивирует ее биологическую активность и тем самым снижает иммуногенность.The disadvantage of this method is that to maintain the stability of the vaccine, an expensive commercial stabilizer and a 10% suspension of egg yolk are used, as well as low negative temperatures minus 20 ° C storage. When using the vaccine in the autumn-winter and spring-winter periods, it changes the state of aggregation during diurnal temperature fluctuations, which inactivates its biological activity and thereby reduces immunogenicity.

Известен способ получения вирусвакцины (Патент РФ 2157700, 10.20.2000) против бешенства для оральной иммунизации диких плотоядных, при котором выращенную в перевиваемой культуре клеток почки сайги суспензию вируса бешенства, штамм ТС-80, смешанную со стабилизирующими компонентами в соотношении 1:1:2, подвергают сублимационному высушиванию в течение 48-72 часов, размалывают в шаровой мельнице и заполняют полученной массой полые брикеты-приманки.There is a method of producing a virus vaccine (RF Patent 2157700, 10.20.2000) against rabies for oral immunization of wild carnivores, in which a rabies virus suspension grown in transplanted saiga kidney cell culture, strain TS-80, mixed with stabilizing components in a ratio of 1: 1: 2 , subjected to freeze-drying for 48-72 hours, grind in a ball mill and fill the resulting mass of hollow briquette bait.

Недостатки этого метода состоят в многостадийности (высушивание, измельчение, заполнение приманок), длительности и трудоемкости процесса, а также высокой себестоимости.The disadvantages of this method are multi-stage (drying, grinding, filling the bait), the duration and complexity of the process, as well as the high cost.

Целью настоящего изобретения является способ изготовления вирусвакцины против бешенства для оральной иммунизации диких плотоядных животных, при котором высушивание вакцины происходит в приманке. Указанная цель достигается тем, что суспензию вакцинного штамма ТС-80 вируса бешенства, выращенную в перевиваемой культуре клеток почки сайги, смешивают с защитными добавками, полученный полуфабрикат наносят на приманку (пористый брикет), замораживают и высушивают сублимацией в течение 24-30 часов.The aim of the present invention is a method of manufacturing a rabies virus vaccine for oral immunization of wild carnivores, in which the vaccine is dried in bait. This goal is achieved by the fact that the suspension of the vaccine strain TS-80 of rabies virus, grown in an inoculated culture of saiga kidney cells, is mixed with protective additives, the resulting semi-finished product is applied to the bait (porous briquette), frozen and freeze-dried for 24-30 hours.

Положительный эффект получают при смешивании суспензии вируса с растворами пептона с лактозой и раствором пектина, замораживании при минус 40°С последующим сублимационном высушивании.A positive effect is obtained by mixing a suspension of the virus with solutions of peptone with lactose and a solution of pectin, freezing at minus 40 ° C, followed by freeze-drying.

Таблица
Технологическая схема изготовления вирусвакцины против бешенства для оральной иммунизации диких плотоядных животныхTable
Technological scheme for the manufacture of rabies virus vaccine for oral immunization of wild carnivores № п/пNo. p / p Технологический этапTechnological stage Предлагаемый способThe proposed method ПрототипPrototype 1.1. Получение вирусного сырьяGetting viral raw materials Штамм ТС-80, выращенный в культуре клеток ПСStrain TS-80 grown in a culture of PS cells Штамм ТС-80, выращенный в культуре клеток ПСStrain TS-80 grown in a culture of PS cells 2.2. Приготовление стабилизаторовCooking Stabilizers 40% пептон + 8% лактоза, 4% пектин40% peptone + 8% lactose, 4% pectin 40% пептон+8% лактоза, 4% пектин40% peptone + 8% lactose, 4% pectin 3.3. Приготовление технической жидкости (ТЖ)Preparation of technical fluid (TJ) Вирусное сырье + пептонлактозный стабилизатор + пектин 14+5+1 соответственноViral raw materials + peptone-lactose stabilizer + pectin 14 + 5 + 1, respectively Вирусное сырье+пептонлактозный стабилизатор+пектин 1+1+2 соответственноViral raw materials + peptone-lactose stabilizer + pectin 1 + 1 + 2, respectively 4.4. Изготовление приманокLure making Пористые брикеты из мукиPorous flour briquettes Печеные брикеты из рыбно-мясного фарша и мукиBaked briquettes of minced meat and flour 5.5. Фасовка вакциныVaccine packaging Нанесение ТЖ на пористые брикетыApplication of TJ on porous briquettes Разлив ТЖ во флаконы или кассетыSpilling TJ into vials or cassettes 6.6. ЗамораживаниеFreezing ЗамораживаниеFreezing ЗамораживаниеFreezing Продолжение таблицыTable continuation 1.1. ЛиофилизацияLyophilization Лиофилизация брикетов-приманок одновременно и совместно в течение 24-30 часовLyophilization of briquette baits simultaneously and jointly for 24-30 hours Лиофилизация ТЖ в течение 72-74 часовLyophilization of TJ within 72-74 hours 8.8. нетnot Сбор сухого продукта в герметичную таруCollection of dry product in sealed containers 9.9. нетnot Измельчение сухой вакцины до однородного порошкаGrinding a dry vaccine to a homogeneous powder 10.10. нетnot Заполнение полых приманок сухой вакцинойFilling hollow baits with dry vaccine 11.eleven. КонтрольThe control Вакцина готова к применению (7 этапов)The vaccine is ready for use (7 steps) Вакцина готова к применению (10 этапов)The vaccine is ready for use (10 steps)

Примеры конкретного выполнения.Examples of specific performance.

Пример 1.Example 1

1,4±0,1 дм³ вируссодержащего материала, штамм ТС-80 вируса бешенства с инфекционной активностью 7,2±0,15 lg МЛД₅₀/см³, выращенного в перевиваемой культуре клеток почки сайги, смешивают с 0,5 дм³ стабилизирующей среды, содержащей 40±2% пептона и 8±0,4% лактозы, и с 0,1 дм³ 4±0,1% раствора пектина в соотношении 14:5:1 (вирусная суспензия стабилизатор пектин соответственно). Полученный полуфабрикат наносят на пористый брикет-приманку (изготовленный из муки) размером 5,5/3,5/1,5 см, массой 10-12 г с помощью дозатора “Контур”, нанося последовательно 2, а затем 3 см³ материала. Брикеты-приманки замораживают при минус 40°С и высушивают в аппарате для сублимационного высушивания в течение 24-30 часов. Готовые брикеты-приманки оценивают на контаминацию грибной и бактериальной микрофлорой, безвредность, инфекционную активность и иммуногенность. Вакцина была стерильной, безвредной, с инфекционной активностью 6,5±0,3 lg МЛД₅₀/приманку. Для определения иммуногенности вакцину, ароматизированную рыбьим жиром, скармливали 5-месячным щенкам из расчета одна приманка (одна доза) на голову двукратно с интервалом 12 суток. В сыворотках крови вакцинированных щенков титры вируснейтрализующих антител составили от 1:8 до 1:32 через 30 суток после вакцинации, что свидетельствует об иммуногенности вакцины. Вакцина сохраняла иммуногенные свойства не менее 5 суток при температуре окружающей среды до 20°С и при хранении в течение 6 месяцев при температуре 6-8°С.1.4 ± 0.1 dm ^{3 of} virus-containing material, strain TS-80 of rabies virus with infectious activity of 7.2 ± 0.15 lg MLD ₅₀ / cm ³ grown in a transplanted culture of saiga kidney cells, mixed with 0.5 dm ³ stabilizing medium containing 40 ± 2% peptone and 8 ± 0.4% lactose, and with 0.1 dm ³ 4 ± 0.1% pectin solution in a ratio of 14: 5: 1 (viral suspension stabilizer pectin, respectively). The resulting semi-finished product is applied to a porous briquette bait (made from flour) measuring 5.5 / 3.5 / 1.5 cm, weighing 10-12 g using a “Contour” batcher, applying successively 2 and then 3 cm ^{3 of} material. Briquettes-bait freeze at minus 40 ° C and dried in the apparatus for freeze-drying for 24-30 hours. Ready briquette baits are evaluated for contamination with fungal and bacterial microflora, harmlessness, infectious activity and immunogenicity. The vaccine was sterile, harmless, with an infectious activity of 6.5 ± 0.3 lg MLD ₅₀ / bait. To determine the immunogenicity, the vaccine flavored with fish oil was fed to 5-month-old puppies at the rate of one bait (one dose) per head twice with an interval of 12 days. In the blood serum of vaccinated puppies, the titers of neutralizing antibodies ranged from 1: 8 to 1:32 30 days after vaccination, which indicates the immunogenicity of the vaccine. The vaccine retained immunogenic properties for at least 5 days at an ambient temperature of up to 20 ° C and when stored for 6 months at a temperature of 6-8 ° C.

Пример 2.Example 2

14±0,2 дм³ вируссодержащего материала, штамм ТС-80 вируса бешенства с инфекционной активностью 7,3±0,10 lg МЛД₅₀/см³, выращенного в перевиваемой культуре клеток почки сайги, смешивают с 5±0,1 дм³ защитной среды, содержащей 40±2% пептона и 8±0,4% лактозы и с 1±0,1 дм³ 4±0,5% пектина, сохраняя соотношение, указанное в примере 1.14 ± 0.2 dm ^{3 of} virus-containing material, strain TS-80 of rabies virus with infectious activity of 7.3 ± 0.10 lg MLD ₅₀ / cm ³ grown in a transplanted culture of saiga kidney cells, mixed with 5 ± 0.1 dm ³ a protective medium containing 40 ± 2% peptone and 8 ± 0.4% lactose and with 1 ± 0.1 dm ³ 4 ± 0.5% pectin, while maintaining the ratio specified in example 1.

Полученный полуфабрикат наносят на пористый брикет-приманку по 4,0 см³ размером 5,9/3,8/1,8 см, массой 12-14 г с помощью дозатора “Контур”. Брикеты замораживают при минус 40°С и высушивают в аппарате для сублимационной сушки в течение 24-30 часов. Готовые брикеты-приманки оценивают по контаминации грибной и бактериальной микрофлорой, безвредности, инфекционной активности и иммуногенности. Вакцина была стерильной, безвредной, с инфекционной активностью 6,4±0,2 lg МЛД₅₀/приманку. Для использования в полевых условиях брикет-приманку ароматизировали рыбьим жиром и покрывали пищевой пленкой. Готовые приманки из расчета одна доза на голову раскладывали двукратно с интервалом 14 суток в феврале-марте вблизи лисьих нор. Через 3 месяца после вакцинации лис выборочно отстреливали и определяли титры вируснейтрализующих антител в пробах сывороток крови. У 6 из 10 отстреленных животных были обнаружены вируснейтрализующие антитела в титрах от 1:8 до 1:32, что доказывает иммуногенность испытанной вакцины. Вакцина сохраняла иммуногенные свойства не менее 5 суток при температуре окружающей среды до 20°С и при хранении в течение 6 месяцев при температуре 6-8°С.The resulting semi-finished product is applied to a porous briquette bait of 4.0 cm ³ measuring 5.9 / 3.8 / 1.8 cm, weighing 12-14 g using a “Contour” batcher. Briquettes are frozen at minus 40 ° C and dried in the apparatus for freeze-drying for 24-30 hours. Ready briquette baits are evaluated by contamination with fungal and bacterial microflora, harmlessness, infectious activity and immunogenicity. The vaccine was sterile, harmless, with an infectious activity of 6.4 ± 0.2 lg MLD ₅₀ / bait. For use in the field, the briquette bait was flavored with fish oil and covered with cling film. Ready baits at the rate of one dose per head were laid out twice with an interval of 14 days in February-March near the fox holes. 3 months after vaccination, the foxes were selectively shot and virus-neutralizing antibody titers were determined in blood serum samples. In 6 out of 10 animals shot, neutralizing antibodies were detected in titers from 1: 8 to 1:32, which proves the immunogenicity of the tested vaccine. The vaccine retained immunogenic properties for at least 5 days at an ambient temperature of up to 20 ° C and when stored for 6 months at a temperature of 6-8 ° C.

Полученные данные свидетельствуют, что предлагаемый способ включает меньшее число этапов изготовления вакцины, более экономичен и производителен, менее трудоемок и позволяет получить иммунологически эффективную вирусвакцину против бешенства для оральной иммунизации диких плотоядных животных. Колебания температуры окружающей среды от положительных до отрицательных значений не оказывают влияния на иммуногенные характеристики вакцины.The data obtained indicate that the proposed method includes fewer stages of vaccine manufacturing, is more economical and productive, less time consuming and allows to obtain an immunologically effective rabies virus vaccine for oral immunization of wild carnivores. Fluctuations in ambient temperature from positive to negative do not affect the immunogenic characteristics of the vaccine.

Claims

A method of manufacturing a rabies virus vaccine for oral immunization of wild carnivores, comprising the cultivation of a vaccine strain TS-80 of rabies virus with an infectious activity of at least 7.0 lg MLD ₅₀ / cm ³ in a transplanted cell culture and mixing it with protective components, characterized in that a suspension of the rabies virus vaccine strain is mixed with a stabilizing medium, the resulting technical fluid in a volume of 3.0-5.0 cm ³ is applied to the bait (porous briquette), frozen and lyophilized for 24-30 hours