RU2118163C1

RU2118163C1 - Drug for treatment of patients with viral disease

Info

Publication number: RU2118163C1
Application number: RU94016333A
Authority: RU
Inventors: Л.Д. Шипулина; С.А. Вичканова; О.П. Шейченко; О.Н. Толкачев
Priority date: 1994-04-27
Filing date: 1994-04-27
Publication date: 1998-08-27

Abstract

FIELD: medicine, pharmacy. SUBSTANCE: agent is a sum of polyphenolic compounds isolated from sea buckthorn leaves and obtained by extraction with an aqueous organic solvent, for example, acetone followed by removal of an organic solvent, treatment of an aqueous solution with two-component mixture of aliphatic hydrocarbon with butyl alcohol, concentrating an aqueous phase and drying an aqueous concentrate. Preparation shows antiviral activity with respect to influenza viruses B, adenoviruses of 2nd type, paramyxoviruses of 1st and 2nd type which are pathogenic for human and animals. Preparation shows interferon-inducing activity also. EFFECT: broadened pattern of antiviral agents. 5 tbl, 6 ex

Description

Изобретение относится к области медицины, в частности к средствам из лекарственных растений, обладающим противовирусной активностью. The invention relates to medicine, in particular to funds from medicinal plants with antiviral activity.

Известно биологически активное вещество против вируса СПИД из листьев облепихи крушиновидной (Пат. СССР N 1805968, приоритет 03.11.87), а также способ его получения (Пат. СССР N 1494273, приоритет 11.08.87), в котором показана противовирусная активность на вирусах гриппа A и герпеса. Других сведений о противовирусной активности экстракта из облепихи нет. A biologically active substance against the AIDS virus is known from buckthorn buckthorn leaves (Pat. USSR N 1805968, priority 03.11.87), as well as a method for its preparation (Pat. USSR N 1494273, priority 11.08.87), which shows antiviral activity on influenza viruses A and herpes. There is no other information about the antiviral activity of the extract from sea buckthorn.

Гипорамин представляет собой сумму полифенольных соединений из листьев облепихи крушиновидной, содержащую не менее 60% галлоэллаготаннинов. Биологически активными компонентами препарата являются гидролизуемые таннины, в том числе стриктинин (C₂₇H₂₂O₁₀ • 2,5H₂O), изостриктинин (C₂₇H₂₂O₁₈ • H₂O), казуаринин (C₄₁H₂₈O₂₆ • 7H₂O), гипофенин B (C₄₈H₃₂O₃₁), казуариктин (C₄₁H₂₈O₂₆ • 6H₂O).Hyporamine is the sum of polyphenolic compounds from buckthorn buckthorn leaves containing at least 60% galloellagotannins. The biologically active components of the drug are hydrolyzable tannins, including strictin (C ₂₇ H ₂₂ O ₁₀ • 2.5H ₂ O), isostrictin (C ₂₇ H ₂₂ O ₁₈ • H ₂ O), casuarinin (C ₄₁ H ₂₈ O ₂₆ • 7H ₂ O), hypophenin B (C ₄₈ H ₃₂ O ₃₁ ), casuariktin (C ₄₁ H ₂₈ O ₂₆ • 6H ₂ O).

Из анализа опубликованных данных о противовирусной активности известных лечебных средств, применяемых в медицине (ремантадин, оксолин, бонафтон), следует, что антивирусное действие препаратов зависит от структуры активных соединений. Однако этих данных недостаточно для прогнозирования противовирусной активности в отношении спектра действия. Например, ремантадин, используемый для лечения гриппа A, не активен в отношении вируса гриппа B. Таким образом, факт наличия противовирусной активности у известных соединений в отношении определенных вирусов не является достаточным критерием наличия чувствительности к этим препаратам других, даже близкородственных видов вирусов. From an analysis of published data on the antiviral activity of known therapeutic agents used in medicine (remantadine, oxolin, bonafton), it follows that the antiviral effect of the drugs depends on the structure of the active compounds. However, these data are insufficient to predict antiviral activity in relation to the spectrum of action. For example, rimantadine used to treat influenza A is not active against influenza B. Thus, the presence of antiviral activity in known compounds against certain viruses is not a sufficient criterion for the presence of sensitivity to these drugs of other, even closely related types of viruses.

Целью настоящего изобретения является расширение области применения гипорамина за счет выявления новых свойств препарата. Экспериментально установлено, что гипорамин наряду с известным ранее действием на вирус гриппа A обладает противовирусной активностью в отношении вируса гриппа B, аденовируса второго типа, парамиксовирусов 1 и 2 типов и некоторых других вирусов, патогенных для человека и животных. Выявлено также его интерферониндуцирующее свойство. The aim of the present invention is to expand the scope of hyporamine by identifying new properties of the drug. It was experimentally established that hyporamine, along with the previously known effect on influenza A virus, has antiviral activity against influenza B virus, type 2 adenovirus, paramyxoviruses of types 1 and 2 and some other viruses pathogenic for humans and animals. Its interferon-inducing property was also revealed.

Изобретательский уровень заключается в выявлении новой совокупности признаков (спектра противовирусной активности), которая в известных решениях не найдена. Аналогичный препарат из листьев облепихи крушиновидной с указанием спектра противовирусной активности в отечественной или зарубежной литературе не описан. The inventive step is to identify a new set of features (spectrum of antiviral activity), which is not found in the known solutions. A similar preparation from the leaves of buckthorn buckthorn with an indication of the spectrum of antiviral activity is not described in domestic or foreign literature.

С заявляемыми свойствами гипорамин получают из листьев облепихи крушиновидной экстракцией водным органическим растворителем, например, ацетоном, удалением органического растворителя, обработкой водного раствора двухкомпонентной смесью алифатического углеводорода с бутиловым спиртом, концентрированием водной фазы с последующим высушиванием водного концентрата. Ниже приведен конкретный пример его приготовления: 50 г измельченных листьев облепихи крушиновидной с содержанием таннинов 21,5% и влажностью 7,1% заливают 0,5 л 50%-ного водного ацетона, через 1 ч сливают экстракт, к сырью добавляют свежий растворитель, равный объему слива. Таким образом приводят еще три экстракции. Водно-ацетоновые экстракты объединяют и упаривают до объема 0,3 л. Водный кубовый остаток пятикратно обрабатывают смесью нефраса с бутиловым спиртом (2: 1) в соотношении 1:1, водную фазу упаривают до 0,1 л и сушат на лиофильной сушилке (время сушки 20 ч). Выход 16,30 г (32,5% от массы сырья) с содержанием таннинов в препарате 64,05% (с учетом влаги в образце). With the claimed properties, hyporamine is obtained from buckthorn leaves with buckthorn extraction by an aqueous organic solvent, for example, acetone, removing the organic solvent, treating the aqueous solution with a two-component mixture of aliphatic hydrocarbon with butyl alcohol, and concentrating the aqueous phase, followed by drying of the aqueous concentrate. The following is a specific example of its preparation: 50 g of crushed leaves of buckthorn with 21.5% tannins and a moisture content of 7.1% are poured into 0.5 l of 50% aqueous acetone, the extract is drained after 1 h, fresh solvent is added to the raw material, equal to the volume of the drain. Thus, three more extractions are given. Water-acetone extracts are combined and evaporated to a volume of 0.3 l. The aqueous bottoms are treated five times with a mixture of nephras with butyl alcohol (2: 1) in a ratio of 1: 1, the aqueous phase is evaporated to 0.1 L and dried on a freeze dryer (drying time 20 h). Yield 16.30 g (32.5% of the mass of raw materials) with a tannin content of 64.05% in the preparation (taking into account moisture in the sample).

Сравнительное изучение противовирусной активности гипорамина в отношении вируса гриппа человека типа A, получаемого по приведенному способу, с гипорамином, получаемым по патенту N 1805965, показало, что гипорамин, получаемый по приведенному способу, обладает высоким вируснейтрализующим действием в отношении вируса гриппа человека типа A /Aichi/2/689 (H3N2). При этом противовирусная активность препарата, получаемого приведенным способом, не уступает гипорамину, получаемому по патенту N 1805965 (см. таблицу 1). Дополнительным преимуществом гипорамина по сравнению с прототипом является его активность в отношении спектра эпидемических штаммов вируса гриппа A с различной антигенной структурой, в т. ч. вируса гриппа человека А/Англия (H1N1), А/СССР/903/77 (N1N1) А/Бангкок/1/79 (H3N2), А/Филиппины/2/82 (N2N2) , А/Сингапур/52 (N2N2) и птиц А/Чайка/Астрахань/777/89 (H13N6). A comparative study of the antiviral activity of hyporamine against human influenza virus type A, obtained by the above method, with hyporamine obtained by patent N 1805965, showed that hyporamine obtained by the above method has a high neutralizing effect against human influenza virus type A / Aichi / 2/689 (H3N2). In this case, the antiviral activity of the drug obtained by the above method is not inferior to hyporamine obtained according to the patent N 1805965 (see table 1). An additional advantage of hyporamine compared to the prototype is its activity in relation to the spectrum of epidemic strains of influenza A virus with different antigenic structures, including human influenza virus A / England (H1N1), A / USSR / 903/77 (N1N1) A / Bangkok / 1/79 (H3N2), A / Philippines / 2/82 (N2N2), A / Singapore / 52 (N2N2) and birds A / Seagull / Astrakhan / 777/89 (H13N6).

Особенностью гипорамина является широкий спектр противовирусной активности в отношении различных вирусов, патогенных для человека и животных, в том числе вируса гриппа B, парамиксовирусов 1 и 2 серотипов, аденовирусов типа 2. Отличительной чертой препарата является непосредственное воздействие на патогенный вирус на ранних стадиях взаимодействия вируса с клеткой и наличие интерферониндуцирующей активности. A characteristic of hyporamine is a wide spectrum of antiviral activity against various viruses pathogenic for humans and animals, including influenza B virus, paramyxoviruses 1 and 2 serotypes, type 2 adenoviruses. A distinctive feature of the drug is its direct effect on the pathogenic virus in the early stages of the interaction of the virus with cell and the presence of interferon-inducing activity.

По параметрам среднесмертельных доз при внутрибрюшинных инъекциях субстанция гипорамина относится к IV классу - малотоксичным веществам (ЛД₅₀ для белых мышей самцов и самок - 106,7±8,9 и 103,3±7,7 мг/кг, крыс самцов и самок 170,0±13,3 и 140,0±9,7 мг/кг соответственно; крысят 4-недельного возраста - 140,0±6,7 мг/кг, морских свинок - 128,0±6,6 мг/кг); при введении в желудок - к ряду практически нетоксичных (V класс) соединений ЛД₅₀ - для белых крыс самцов и самок - 9500,9±984,9 и 8400,0±783,3 мг/кг, соответственно; для крысят - 9900,0±554,9 мг/кг). Гипорамин не обладает аллергизирующими, мутагенными, эмбриотоксическими и тератогенными свойствами; не вызывает изменение иммунного статуса подопытных животных. Документация по доклиническому изучению гипорамина передана в Фармакологический Государственный Комитет МЗ РФ и получено разрешение на его клинические испытания: протокол N 20 и 10 декабря 1992 года (I фаза клинических испытаний) и протокол N 3 от 9 февраля 1994 гола (II фаза клинических испытаний).According to the parameters of medium lethal doses during intraperitoneal injections, the substance of hyporamine belongs to class IV - low toxic substances (LD ₅₀ for white mice of males and females - 106.7 ± 8.9 and 103.3 ± 7.7 mg / kg, rats of males and females 170 , 0 ± 13.3 and 140.0 ± 9.7 mg / kg, respectively; rats 4 weeks old - 140.0 ± 6.7 mg / kg, guinea pigs - 128.0 ± 6.6 mg / kg) ; when introduced into the stomach - to a number of practically non-toxic (V class) compounds of LD ₅₀ - for white rats of males and females - 9500.9 ± 984.9 and 8400.0 ± 783.3 mg / kg, respectively; for rat pups - 9900.0 ± 554.9 mg / kg). Hyporamine does not have allergenic, mutagenic, embryotoxic and teratogenic properties; does not cause a change in the immune status of experimental animals. The documentation for the preclinical study of hyporamine was transferred to the Pharmacological State Committee of the Ministry of Health of the Russian Federation and permission for its clinical trials was obtained: protocol N 20 and 10 December 1992 (phase I clinical trials) and protocol No. 3 dated February 9, 1994 goals (phase II clinical trials).

Ниже приведены конкретные примеры экспериментального изучения гипорамина. The following are specific examples of an experimental study of hyporamine.

Пример 1. Изучение вируснейтрализующей активности в системе куриного эмбриона проводили с использованием вируса гриппа человека A/Aichi/2/68 (H3N2). Вируснейтрализующее действие гипорамина изучали в контактных опытах in vitro и индикацией на куриных эмбрионах. Препарат растворяли в буферном растворе с pH 7,2-7,4 и смешивали с 1,10,100 и 1000 ЭИД₁₀₀ вируса гриппа, получая конечные концентрации препарата 100, 10, 5 и 2,5 мкг/мл. Смеси препарата с вирусом выдерживали в течение 1 часа при температуре 4^oC, после чего вводили в объеме 0,2 мл в аллатоисную полость 9-10 дневных интактных эмбрионов. Через 48 часов куриные эмбрионы вскрывали и в аллантоисной жидкости определяли наличие вируса методом реакции гемагглютинации (РГА). Активность выражали количеством нейтрализованных эмбриональных инфекционных доз (ЭИД) вируса гриппа. Опыты проводили в нескольких повторностях. Результаты исследований представлены в таблице 1.Example 1. The study of neutralizing activity in the chicken embryo system was carried out using human influenza virus A / Aichi / 2/68 (H3N2). The viral neutralizing effect of hyporamine was studied in in vitro contact experiments and indications on chicken embryos. The drug was dissolved in a buffer solution with a pH of 7.2-7.4 and mixed with 1,10,100 and 1000 EIDs of ₁₀₀ influenza viruses, obtaining final drug concentrations of 100, 10, 5 and 2.5 μg / ml. Mixtures of the preparation with the virus were kept for 1 hour at a temperature of 4 ^o C, after which they were injected in a volume of 0.2 ml into the allatoic cavity of 9-10 day old intact embryos. After 48 hours, the chicken embryos were opened and the presence of the virus was determined in the allantoic fluid by the hemagglutination reaction (RGA). Activity was expressed by the number of neutralized embryonic infectious doses (EIDs) of influenza virus. The experiments were carried out in several replicates. The research results are presented in table 1.

Исследование в отношении вируса гриппа штамм A/Aicha/2/68/ (H3N2) показало, что гипорамин, получаемый по приведенному способу, обладает высоким вируснейтрализующим действием в отношении вируса гриппа A. При этом противовирусная активность гипорамина, получаемого по приведенному способу, не уступает противовирусной активности гипорамина, получаемого по патенту N 1805965 и взятого в качестве прототипа. A study of influenza virus strain A / Aicha / 2/68 / (H3N2) showed that hyporamine obtained by the above method has a high neutralizing effect against influenza A. Moreover, the antiviral activity of hyporamine obtained by the above method is not inferior antiviral activity of hyporamine obtained according to patent N 1805965 and taken as a prototype.

Пример 2. Изучение вируснейтрализующей активности гипорамина в отношении вируса гриппа B проведено в системе куриного эмбриона с использованием вируса гриппа B (Сингапур) 79. Вируснейтрализующую активность гипорамина изучали в контактных опытах in vitro с индикацией на куриных эмбрионах. Препарат растворяли в буферном растворе с pH 7,2-7,4 в концентрациях 1 мкг, 10 мкг, 100 мкг, 500 и 1000 мкг/мл и смешивали с 1, 10, 100 и 1000 ЭИД₁₀₀ вируса гриппа. Смеси препарата с вирусом выдерживали в течение 1 часа при температуре 4^oC, после чего вводили в объеме 0,2 мл в аллантоисную полость 9-10-дневных интактных куриных эмбрионов. Через 48 часов куриные эмбрионы вскрывали, в аллантоисной жидкости определяли наличие вируса методом реакции гемагглютинации (РГА). Активность выражали количеством нейтрализованных эмбриональных инфекционных доз (ЭИД) вируса гриппа. Изучение вируснейтрализующей активности гипорамина в отношении вируса гриппа B показало, что гипорамин в концентрациях 100, 500 и 1000 мкг/мл практически полностью нейтрализовал репродукцию вируса гриппа B (Сингапур) 79 на 3,75 ± lg ЭИД₅₀. Изучение минимальной вирусингибирующей концентрации (МИК) показало, что для вируса гриппа B эта концентрация составила не более 10 мкг/эмбрион.Example 2. The study of the virus-neutralizing activity of hyporamine against influenza B virus was carried out in the chicken embryo system using influenza virus B (Singapore) 79. The virus-neutralizing activity of hyporamine was studied in in vitro contact experiments with indication on chicken embryos. The drug was dissolved in a buffer solution with a pH of 7.2-7.4 at concentrations of 1 μg, 10 μg, 100 μg, 500 and 1000 μg / ml and mixed with 1, 10, 100 and 1000 EIDs of ₁₀₀ influenza viruses. Mixtures of the preparation with the virus were kept for 1 hour at a temperature of 4 ^o C, after which they were injected in a volume of 0.2 ml into the allantoic cavity of 9-10-day intact chicken embryos. After 48 hours, the chicken embryos were opened, and the presence of the virus was determined in the allantoic fluid by the hemagglutination reaction (RGA). Activity was expressed by the number of neutralized embryonic infectious doses (EIDs) of influenza virus. A study of the virus-neutralizing activity of hyporamine against influenza B virus showed that hyporamine at concentrations of 100, 500 and 1000 μg / ml almost completely neutralized the reproduction of influenza B virus (Singapore) 79 by 3.75 ± log EID ₅₀ . A study of the minimum virus-inhibiting concentration (MIC) showed that for influenza B virus this concentration was not more than 10 μg / embryo.

Пример 3.Изучение химиотерапевтической эффективности гипорамина при экспериментальной гриппозной пневмонии белых мышей. Для заражения использовали вирус гриппа B (Сингапур) 222/79, 10^-1 - 100 ЛД₅₀. Изучение химиотерапевтической эффективности гипорамина при экспериментальной гриппозной пневмонии проводили на белых безлинейных мышах массой 15 г. Животных заражали интраназально вируссодержащей жидкостью в объеме 0,05 мл под легким эфирным наркозом в разведении, обеспечивающем 80-90% гибели животных. Лечение животных проводили трехкратно: за три часа до инфицирования, затем на вторые и четвертые сутки после инфицирования. В опыте использовали аэрозольный способ введения препарата. Источником аэрозоля служил ультразвуковой генератор производства ГДР. Аппарат позволял получать аэрозоли со следующим объемным фракционно-дисперсионным составом частиц и размером от 0 до 1 мкм - 2%, от 1 до 2 мкм - 10%, от 2 до 5 мкм - 80%, от 5 до 7 мкм - 8%. Для введения препарата в виде аэрозоля мышей помещали в пластиковую камеру емкостью 16 л. Объем камеры был выбран из такого расчета, чтобы по условиям предельных концентраций кислорода и углекислого газа можно было экспонировать 40 животных в аэрозольном облаке в течение 20 мин после прекращения подачи аэрозоля. Разовая доза, получаемая каждой мышью, соответствовала 40 мг на 1 кг массы животного или в пересчете на фактическую массу животного 0,6 мг/мышь (600 мкг/мышь). В группах было по 40 животных. Наблюдение за животными осуществляли в течение 30 дней. В результате исследования установлено, что при использовании аэрозольного метода введения гипорамин проявляет наиболее выраженный защитный эффект при трехкратном введении препарата: в этой группе наблюдалась наименьшая гибель мышей. И срок гибели мышей сдвигался на сутки по сравнению с контролем. Увеличение дозы препарата вдвое (до 1500 мкг/мышь) приводило к увеличению продолжительности срока жизни в опытных группах (+ сутки).Example 3. The study of the chemotherapeutic efficacy of hyporamine in experimental influenza pneumonia in white mice. Influenza B virus (Singapore) 222/79, 10 ^-1 - 100 LD _{50 was} used for infection. The chemotherapeutic efficacy of hyporamine in experimental influenza pneumonia was studied in 15 linear white non-linear mice. Animals were infected with intranasally virus-containing liquid in a volume of 0.05 ml under mild ether anesthesia in dilution, providing 80-90% of the animals' death. Animals were treated three times: three hours before infection, then on the second and fourth day after infection. An aerosol route of administration of the drug was used in the experiment. The aerosol source was an ultrasonic generator produced by the GDR. The apparatus made it possible to obtain aerosols with the following volumetric fractional-dispersive composition of particles and sizes from 0 to 1 μm - 2%, from 1 to 2 μm - 10%, from 2 to 5 μm - 80%, from 5 to 7 μm - 8%. To administer the drug in the form of an aerosol, mice were placed in a 16-liter plastic chamber. The chamber volume was chosen from such a calculation that, according to the conditions of maximum concentrations of oxygen and carbon dioxide, 40 animals could be exposed in the aerosol cloud for 20 minutes after the aerosol was shut off. A single dose received by each mouse corresponded to 40 mg per 1 kg of animal weight or in terms of the actual animal weight of 0.6 mg / mouse (600 μg / mouse). There were 40 animals in the groups. Observation of the animals was carried out for 30 days. As a result of the study, it was found that when using the aerosol method of administration, hyporamine exhibits the most pronounced protective effect when the drug is administered three times: in this group the smallest death of mice was observed. And the death period of mice was shifted by a day compared with the control. A doubling of the dose of the drug (up to 1,500 μg / mouse) led to an increase in the life expectancy in the experimental groups (+ day).

Пример 4. Изучение химиотерапевтического действия гипорамина на парамиксовирусную инфекцию. При изучении действия гипорамина на репродукцию ПМВ птиц 1 и 2 серотипов была использована культура клеток "Vero". В предварительных опытах была установлена максимально переносимая концентрация 100 мкг/мл гипорамина, не вызывающая видимых цитотоксических изменений в монослое клеток "Vero". Культуру клеток "Vero" культивировали в 24-луночных панелях в течение 48-72 ч и инфицировали ПМВ птиц 1 и 2 серотипов в дозе 5•10⁷ и 6•10 ⁷ЛД₅₀. Гипорамин вносили в дозах 50, 10, 5 и 2,5 мкг/мл. После адсорбции (1 час при температуре 37^oC) инокулят удаляли, клетки отмывали средой 199 и добавляли среду с 10 мкг/мл трипсина. Эффективность действия гипорамина оценивали по снижению гемагглютинирующих титров вирусов. Установлено, что через 48-72 ч инфекционный титр вируса в контроле составил 5,72±0,25 lg ИД₅₀ и 6,25±0,5 lg ИД₅₀ соответственно для ПМВ 1 и 2 серотипов; в концентрации 5 и 10 мкг/мл инфекционный титр вирусов снижался на 4,5-4,75 lg ИД₅₀; в концентрации 2,5 мкг/мл - на 3,75 lg ИД₅₀. Таким образом, изучение влияния гипорамина на репродукцию ПМВ птиц 1 и 2 серотипов в культуре клеток "Vero" в концентрации 2,5; 5 и 10 мкг/мл показало, что препарат оказывает вирусингибирующее и вируснейтрализующее действие на данной модели.Example 4. The study of the chemotherapeutic effect of hyporamine on paramyxovirus infection. When studying the effect of hyporamine on the reproduction of PMV in birds of serotype 1 and 2, the Vero cell culture was used. In preliminary experiments, the maximum tolerated concentration of 100 μg / ml of hyporamine was established, which does not cause visible cytotoxic changes in the mono layer of Vero cells. The Vero cell culture was cultured in 24-well panels for 48-72 hours and infected with PMV of birds of serotype 1 and 2 at a dose of 5 • 10 ⁷ and 6 • 10 ⁷ LD ₅₀ . Hyporamine was introduced in doses of 50, 10, 5 and 2.5 μg / ml. After adsorption (1 hour at 37 ^° C), the inoculum was removed, the cells were washed with medium 199, and medium with 10 μg / ml trypsin was added. The effectiveness of hyporamine was evaluated by reducing hemagglutinating virus titers. It was found that after 48-72 hours the infectious titer of the virus in the control was 5.72 ± 0.25 log ID ₅₀ and 6.25 ± 0.5 log ID _50, respectively, for PMV 1 and 2 serotypes; at a concentration of 5 and 10 μg / ml, the infectious titer of viruses decreased by 4.5-4.75 lg ID ₅₀ ; at a concentration of 2.5 μg / ml - by 3.75 lg ID ₅₀ . Thus, the study of the effect of hyporamine on the reproduction of PMV of birds of serotype 1 and 2 in the Vero cell culture at a concentration of 2.5; 5 and 10 μg / ml showed that the drug has a virus-inhibiting and virus-neutralizing effect in this model.

При изучении эффективности гипорамина на репродукцию ПМВ птиц серотипа 1 и 2 в системе куриного эмбриона для работы были использованы два штамма ПМВ птиц, имеющие наибольшую эпизоотологическую значимость; ПМВ-1 - вирус болезни Ньюкасла ("Бор") и ПМВ-2 - курица (Алма-Ата) 71/84, индюк Юкейпа/56. Вирус культивировали в 10-дневных куриных эмбрионах и на культуре клеток МДСК, "Vero", ФЭК. Вируснейтрализующее действие гипорамина на репродукцию ПМВ-1 и ПМВ-2 изучали в контактных опытах in vivo с индикацией на куриных эмбрионах. Изучение вируснейтрализующей активности гипорамина на репродукцию ПМВ-1 и ПМВ-2 показало, что препарат в концентрациях 10, 100 и 500 мкг/мл полностью нейтрализует репродукцию вируса в куриных эмбрионах (табл. 2). When studying the effectiveness of hyporamine on the reproduction of PMV of birds of serotype 1 and 2 in the chicken embryo system, two strains of PMV of birds with the highest epizootological significance were used for work; PMV-1 - Newcastle disease virus (Bor) and PMV-2 - chicken (Alma-Ata) 71/84, Ukeype turkey / 56. The virus was cultured in 10-day-old chicken embryos and on a cell culture of MDSK, "Vero", FEC. The viral neutralizing effect of hyporamine on the reproduction of PMV-1 and PMV-2 was studied in in vivo contact experiments with indication on chicken embryos. The study of the virus-neutralizing activity of hyporamine for the reproduction of PMV-1 and PMV-2 showed that the drug at concentrations of 10, 100, and 500 μg / ml completely neutralizes the reproduction of the virus in chicken embryos (Table 2).

При изучении химиотерапевтической эффективности гипорамина на модели парамиксовирусной инфекции кур для эксперимента использовали пятидневных цыплят по 10 особей для каждой группы. Препарат вводили перорально и внутрибрюшинно в дозах 50 мкг/особь и 300 мкг/особь в 0,2 мл пятикратно по схеме: за 24 ч и за 1 ч до инфицирования, а затем через 24, 48 и 72 ч после инфицирования. Для инфицирования цыплят использовали ПМВ-серотипа 1 - курица (Алма-Ата) 352/86 по 0,2 мл интраназально. Как видно из табл. 3, при введении гипорамина перорально и внутрибрюшинно наблюдалось защитное действие препарата. Падеж цыплят в опытной группе отмечался на 3-5-е сутки, а в контроле - на 2-3-е сутки. Причем введение препарата перорально предпочтительнее перед внутрибрюшинным. Проведенные эксперименты свидетельствуют, что гипорамин оказывает противовирусное действие на репродукцию ПМВ птиц серотипа 1 и 2 в культуре клеток, в системе куриного эмбриона и на модели парамиксовирусной инфекции кур. When studying the chemotherapeutic efficacy of hyporamine in a model of paramyxovirus infection of chickens, five-day-old chickens of 10 individuals for each group were used for the experiment. The drug was administered orally and intraperitoneally at doses of 50 μg / individual and 300 μg / individual in 0.2 ml five times according to the scheme: 24 hours and 1 hour before infection, and then 24, 48 and 72 hours after infection. For infection of chickens, PMV serotype 1 was used - chicken (Alma-Ata) 352/86 0.2 ml intranasally. As can be seen from the table. 3, when hyporamine was administered orally and intraperitoneally, the protective effect of the drug was observed. The death of chickens in the experimental group was observed on the 3-5th day, and in the control on the 2-3rd day. Moreover, the administration of the drug orally is preferable to intraperitoneal. Experiments have shown that hyporamine has an antiviral effect on the reproduction of PMV in birds of serotype 1 and 2 in cell culture, in the chicken embryo system and in the model of chickens paramyxovirus infection.

Пример 5. При изучении антиаденовирусной активности гипорамина в работе использовали аденовирус человека типа 2 и перевиваемую линию клеток Нер-2. Антиаденовирусную активность гипорамина изучали методом, позволяющим определять количество инфицированных в препарате клеток по наличию в них характеристик внутриядерных включений. Гипорамин изучали в концентрациях 50, 25 , 10, 5, 2, 5 и 1 мкг/мл при нескольких способах обработки препаратом клеток и вируса:
- вирус контактировал и гипорамином в течение 1 ч при температуре 37^oC и использован для заражения клеток, адсорбция 1 ч при комнатной температуре, отмывка от неадсорбированного вируса, наличие препарата в соответствующей концентрации в поддерживающей среде после заражения (1 вариант);
- гипорамин добавлен к вирусу в соответствующей концентрации и смесь сразу использована для заражения клеток (адсорбция при комнатной температуре в течение 1 ч), после заражения препарат в среде отсутствовал (2 вариант);
- гипорамин присутствовал в поддерживающей среде после заражения (3 вариант);
- клетки контактировали с гипорамином в течение 1 ч до заражения (4 вариант).Example 5. In the study of the anti-adenoviral activity of hyporamine, human type 2 adenovirus and the transplantable Hep-2 cell line were used. The anti-adenoviral activity of hyporamine was studied by a method that allows to determine the number of cells infected in the preparation by the presence of characteristics of intranuclear inclusions in them. Hyporamine was studied at concentrations of 50, 25, 10, 5, 2, 5 and 1 μg / ml with several methods of treatment with the preparation of cells and the virus:
- the virus was contacted with hyporamine for 1 h at a temperature of 37 ^o C and used to infect cells, adsorption for 1 h at room temperature, washing off the non-adsorbed virus, the presence of the drug in an appropriate concentration in a supporting medium after infection (1 option);
- hyporamine is added to the virus in the appropriate concentration and the mixture was immediately used to infect cells (adsorption at room temperature for 1 h), after infection, the drug was absent in the medium (option 2);
- hyporamine was present in the supporting medium after infection (option 3);
- cells were in contact with hyporamine for 1 h before infection (option 4).

Для определения вирусингибирующего эффекта использовали цитоморфологический метод, основанный на выявлении клеток, содержащих вирусные внутриядерные включения. Процент ингибирования гипорамином определяли по отношению к контролю. Для выявления вирулицидного действия гипорами, то есть его непосредственного деструктивного влияния на внеклеточный вирус, гипорамин в концентрации 10 мкг/мл добавляли к вируссодержащей жидкости, затем через 1, 2, 3, и 4 ч отбирали аликвоты, готовили 10-кратные разведения и заражали клетки с целью определения инфекционного титра вируса. A cytomorphological method based on the detection of cells containing viral intranuclear inclusions was used to determine the virus-inhibiting effect. The percentage inhibition of hyporamine was determined relative to the control. To detect the virucidal effect of hyporas, that is, its direct destructive effect on the extracellular virus, hyporamine at a concentration of 10 μg / ml was added to the virus-containing fluid, then aliquots were removed after 1, 2, 3, and 4 hours, 10-fold dilutions were prepared and the cells were infected. in order to determine the infectious titer of the virus.

Установлено, что при проведении адсорбции вируса в присутствии гипорамина (варианты 1 и 2) выявлен его значительный вирусингибирующий эффект (табл. 4). При первом варианте обработки ингибирующий эффект гипорамин проявлял на высокой заражающей дозе вируса (91% инфицированных клеток в контроле); в концентрации 50 и 25 мкг/мл гипорамин полностью блокировал репродукцию аденовируса (ингибирование 100%), в концентрации 10 мкг/мл (в 25 раз меньше максимально переносимой) гипорамин уменьшал количество инфицированных клеток по отношению к контролю на 95%. В случае использования меньшей заражающей дозы вируса (при 53% инфицированных клеток в контроле) гипорамин полностью блокировал репродукцию аденовируса в концентрации даже 10 мкг/мл, а в концентрациях 5 и 1 мкг/мл уменьшал количество инфицированных клеток соответственно на 87 и 47%. При проведении адсорбции в присутствии гипорамина и использовании высокой множественности инфицирования (в контроле было 95% инфицированных клеток) также выявлен значительный ингибирующий эффект препарата. В данном случае в концентрации 5 мкг/мл гипорамин подавлял количество инфицированных клеток на 90%, в более высоких концентрациях - до 98% (вариант 2). Добавление гипорамина в среду после адсорбции вируса (вариант 3) не оказывало ингибирующего влияния на его репродукцию, количество инфицированных клеток не отличалось от контроля. При предобработке клеток гипорамином до заражения вирусом (вариант 4) незначительное подавление репродукции выявлено только в концентрации 50 мкг/мл. В более низких изученных дозах (25 и 10 мкг/мл) препарат не влиял на репродукцию аденовируса. Исходя из полученных данных можно было предположить, что гипорамин блокирует репродукцию аденовируса на первых этапах взаимодействия его с клеткой, происходящего в течение первого часа контакта с клеткой или обладает вирулицидным действием. При определении влияния гипорамина на внеклеточный вирус (табл. 5) установлено, что гипорамин не оказывает деструктивного действия на внеклеточный вирус, так как инфекционный титр его практически не снижался. Таким образом, использование вирусспецифического теста для оценки антиаденовирусной активности гипорамина позволило установить в культуре клеток выраженный ингибирующий эффект препарата. Вероятнее всего, гипорамин блокирует репродукцию аденовируса на первых этапах взаимодействия его с клеткой. Эффект наблюдался при наличии гипорамина в среде во время адсорбции вируса. Гипорамин обладает ингибирующим эффектом в концентрации в 50-10 раз меньше максимально переносимой (ХТИ= 50). Полагаем, что применение гипорамина в медицинской практике будет способствовать эффективности лечения вирусных заболеваний аденовирусной этиологии. Выявленный ингибирующий эффект препарата на первых этапах взаимодействия его с клеткой, возможно, позволит использовать препарат и с профилактической целью во время подъема заболеваемости, по эпидпоказаниям во время вспышек в ограниченных коллективах. It was found that during the adsorption of the virus in the presence of hyporamine (options 1 and 2), its significant virus-inhibiting effect was revealed (Table 4). In the first treatment variant, the inhibitory effect of hyporamine was shown at a high infectious dose of the virus (91% of infected cells in the control); at a concentration of 50 and 25 μg / ml, hyporamine completely blocked the reproduction of adenovirus (100% inhibition), at a concentration of 10 μg / ml (25 times less than the maximum tolerated), hyporamine reduced the number of infected cells in relation to the control by 95%. In the case of using a lower infectious dose of the virus (at 53% of infected cells in the control), hyporamine completely blocked the reproduction of adenovirus at a concentration of even 10 μg / ml, and at concentrations of 5 and 1 μg / ml it reduced the number of infected cells by 87 and 47%, respectively. When carrying out adsorption in the presence of hyporamine and using a high multiplicity of infection (in the control there were 95% of infected cells), a significant inhibitory effect of the drug was also revealed. In this case, at a concentration of 5 μg / ml, hyporamine suppressed the number of infected cells by 90%, and at higher concentrations, up to 98% (option 2). The addition of hyporamine to the medium after the adsorption of the virus (option 3) did not inhibit its reproduction, the number of infected cells did not differ from the control. When the cells were pretreated with hyporamine before infection with the virus (option 4), a slight suppression of reproduction was detected only at a concentration of 50 μg / ml. In the lower studied doses (25 and 10 μg / ml), the drug did not affect the reproduction of adenovirus. Based on the data obtained, it could be assumed that hyporamine blocks the reproduction of adenovirus in the first stages of its interaction with the cell, occurring during the first hour of contact with the cell or has a virucidal effect. When determining the effect of hyporamine on the extracellular virus (Table 5), it was found that hyporamine does not have a destructive effect on the extracellular virus, since its infectious titer practically did not decrease. Thus, the use of a virus-specific test to evaluate the anti-adenoviral activity of hyporamine allowed us to establish a pronounced inhibitory effect of the drug in cell culture. Most likely, hyporamine blocks the reproduction of adenovirus in the first stages of its interaction with the cell. The effect was observed in the presence of hyporamine in the medium during the adsorption of the virus. Hyporamine has an inhibitory effect in a concentration of 50-10 times less than the maximum tolerated (CTI = 50). We believe that the use of hyporamine in medical practice will contribute to the effectiveness of the treatment of viral diseases of adenoviral etiology. The revealed inhibitory effect of the drug at the first stages of its interaction with the cell will probably allow the drug to be used for prophylactic purposes during the increase in the incidence, according to epidemiological indications during outbreaks in limited groups.

Пример 6. С целью изучения интерферониндуцирующей активности гипорамина использовали пробы цельной крови человека (100 мкл) и 800 мкл среды культивирования. Гипорамин вносили в дозах 10, 25, 50 и 100 мкл на миллилитр культуры клеток крови (100 мкл). Спустя сутки после культивирования отсасывали надосадочную жидкость с последующим титрованием в диплоидных клетках человека штамм М-19 с использованием плоскодонных 96-луночных плат. Время контакта надосадочной жидкости с клетками составило 24 ч при температуре 37^oC. По истечении этого срока к культурам добавляли индикаторный вирус энцефаломнокардита (ЕМС). Инфекционная доза составила 100 ТЦИД 50/0,1 мл. Титр интерферона определяли через 24 ч после инфицирования вирусом ЕМС. Активность выражали в международных единицах (МЕ). Параллельно с изучением интерферондуцирующей активности гипорамина проводилась индукция стандартными индукторами ВБН (вирус болезни Ньюкасла) и СЭА (стафилококковый энтодоксин типа A), продуцирующие α- интерферон и γ- интерферон, соответственно. В результате исследования интерферониндуцирующей активности установлено, что минимальные дозы гипорамина (10, 20 и 50 мкг/мл) способствовали синтезу более высоких титров интерферона (максимальные титры интерферона в надосадочной жидкости составили 65-80 МЕ/мл). Повышение концентрации гипорамина до 100 мкг/мл приводило к снижению продукции интерферона: при внесении высоких доз гипорамина получены минимальные титры интерферона (30 МЕ/мл).Example 6. In order to study the interferon-inducing activity of hyporamine, human whole blood samples (100 μl) and 800 μl of culture medium were used. Hyporamine was added at doses of 10, 25, 50 and 100 μl per milliliter of blood cell culture (100 μl). A day after cultivation, the supernatant was aspirated, followed by titration in human diploid cells strain M-19 using flat-bottomed 96-well plates. The contact time of the supernatant with the cells was 24 hours at a temperature of 37 ^° C. At the end of this period, the indicator encephalomonocarditis virus (EMC) was added to the cultures. The infectious dose was 100 TCID 50 / 0.1 ml. Interferon titer was determined 24 hours after infection with EMC virus. Activity was expressed in international units (IU). In parallel with the study of the interferon-inducing activity of hyporamine, induction was carried out using standard inducers of VBI (Newcastle disease virus) and CEA (staphylococcal endodoxin type A), producing α-interferon and γ-interferon, respectively. As a result of the study of interferon-inducing activity, it was found that the minimum doses of hyporamine (10, 20 and 50 μg / ml) contributed to the synthesis of higher titers of interferon (maximum titers of interferon in the supernatant were 65-80 IU / ml). An increase in the concentration of hyporamine to 100 μg / ml led to a decrease in the production of interferon: when high doses of hyporamine were introduced, minimal titers of interferon (30 IU / ml) were obtained.

При сравнительном изучении гипорамина по интерферониндуцирующей активности со стандартными индукторами интерферона ВБН и СЭА установлено, что гипорамин способствовал более высокой продукции интерферона по сравнению с использованием такого индуктора ,как СЭА (32 МЕ/мл), но уступал ВБН (256 МЕ/мл и выше). Таким образом, препарат гипорамин обладал низкой цитотоксичностью, является активным индуктором интерферона в культуре клеток периферической крови человека. A comparative study of hyporamine by interferon-inducing activity with standard interferon inducers VBN and SEA found that hyporamine contributed to higher production of interferon compared to using an inducer such as SEA (32 IU / ml), but inferior to VBN (256 IU / ml and higher) . Thus, the drug hyporamine had low cytotoxicity and is an active inducer of interferon in the culture of human peripheral blood cells.

Claims

\\\ 1 Agent for the treatment of viral diseases caused by influenza B viruses, paramyxoviruses of the first and second types, adenoviruses of the second type, which is the sum of polyphenolic compounds from buckthorn buckthorn leaves, containing at least 60% galloellagotannins obtained by extraction with an aqueous organic solvent, for example acetone by removing the organic solvent; treating the aqueous solution with a two-component mixture of aliphatic hydrocarbon with butyl alcohol; concentrating the aqueous phase, followed by by drying the aqueous concentrate.