RU2117043C1 - Strain of cultured hybrid cells of animal mus musculus - producer of monoclonal antibodies to thermostable antigen which is common for glanders and meliodosis pathogens - Google Patents
Strain of cultured hybrid cells of animal mus musculus - producer of monoclonal antibodies to thermostable antigen which is common for glanders and meliodosis pathogens Download PDFInfo
- Publication number
- RU2117043C1 RU2117043C1 RU97111846A RU97111846A RU2117043C1 RU 2117043 C1 RU2117043 C1 RU 2117043C1 RU 97111846 A RU97111846 A RU 97111846A RU 97111846 A RU97111846 A RU 97111846A RU 2117043 C1 RU2117043 C1 RU 2117043C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- glanders
- producer
- strain
- cells
- meliodosis
- Prior art date
Links
- 206010069747 Burkholderia mallei infection Diseases 0.000 title claims abstract description 7
- 201000003641 Glanders Diseases 0.000 title claims abstract description 7
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims description 5
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims description 5
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims description 5
- 210000004754 hybrid cell Anatomy 0.000 title claims description 4
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 title claims 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 title description 2
- 206010069748 Burkholderia pseudomallei infection Diseases 0.000 claims description 5
- 201000004015 melioidosis Diseases 0.000 claims description 5
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 abstract description 31
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 abstract description 24
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 abstract description 24
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 14
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 abstract description 10
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 5
- 241001494479 Pecora Species 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 19
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 15
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 12
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 9
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 241001136175 Burkholderia pseudomallei Species 0.000 description 7
- 210000003567 ascitic fluid Anatomy 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 6
- 241000722910 Burkholderia mallei Species 0.000 description 6
- 101000651298 Homo sapiens TRAF-interacting protein with FHA domain-containing protein A Proteins 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- 102100027651 TRAF-interacting protein with FHA domain-containing protein A Human genes 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 6
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 5
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 238000000034 method Methods 0.000 description 4
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 3
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- XOJVVFBFDXDTEG-UHFFFAOYSA-N pristane Chemical compound CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C XOJVVFBFDXDTEG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 2
- 230000001235 sensitizing effect Effects 0.000 description 2
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 2
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 102000006395 Globulins Human genes 0.000 description 1
- 108010044091 Globulins Proteins 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 239000011545 carbonate/bicarbonate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000000521 hyperimmunizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- KBOPZPXVLCULAV-UHFFFAOYSA-N mesalamine Chemical compound NC1=CC=C(O)C(C(O)=O)=C1 KBOPZPXVLCULAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004963 mesalazine Drugs 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 210000003024 peritoneal macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 238000007873 sieving Methods 0.000 description 1
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 1
- 229940043517 specific immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к гибридомной технологии и касается получения моноклональных антител. Штамм назван GMVd - 3(268). Он депонирован в специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Всероссийской коллекции клеточных культур под номером ВСКК(П) 650 Д. The invention relates to hybridoma technology and for the production of monoclonal antibodies. The strain is named GMVd - 3 (268). It is deposited in a specialized collection of transplantable somatic vertebrate cells of the All-Russian collection of cell cultures under the number VSCK (P) 650 D.
Одним из направлений усовершенствования иммунодиагностических препаратов является использование в качестве основы для их производства специфических моноклональных иммуноглобулинов, продуцируемых стабильными гибридными клеточными линиями. One of the directions for improving immunodiagnostic drugs is the use of specific monoclonal immunoglobulins produced by stable hybrid cell lines as the basis for their production.
Для ускоренного обнаружения возбудителей сапа и мелиоидоза с помощью экспресс-методов производимые в настоящее время коммерческие иммунодиагностические препараты изготавливают на основе иммуноглобулинов специфических сывороток различных видов животных, гетерогенных по составу антител, иммунологической структуре, активности и специфичности. To accelerate the detection of glanders and melioidosis by using express methods, currently produced commercial immunodiagnostic preparations are made on the basis of immunoglobulins of specific sera of various animal species heterogeneous in antibody composition, immunological structure, activity and specificity.
Основные трудности в производстве эритроцитарного препарата связаны с получением стандартного иммуноглобулинового сырья для его производства. Технология изготовления диагностикума эритроцитарного иммуноглобулинового сапного включает в себя продолжительный этап иммунизации различных видов животных с использованием разнообразных приемов введения антигенов. Однако получение гипериммунных специфических сывороток нередко затруднено, зависит от индивидуальных функциональных особенностей иммунной системы животного - продуцента (Волков Е.В., Рыбкин В.С. Оптимизация условий получения сапного иммуноглобулинового эритроцитарного диагностикума. Дезинфекция и стерилизация. Перспективы развития: Материалы Всесоюз. науч. конф. - Волгоград, 1983, с. 23-27). Вследствие этого полное воспроизведение всех этапов накопления сырья для производства эритроцитарного диагностикума невозможно, что приводит к получению относительно нестандартных по свойствам препаратов. The main difficulties in the production of an erythrocyte preparation are associated with obtaining a standard immunoglobulin raw material for its production. The manufacturing technology of an erythrocyte immunoglobulin sap diagnosticum includes a long stage of immunization of various animal species using a variety of antigen administration methods. However, obtaining hyperimmune specific sera is often difficult, depending on the individual functional characteristics of the animal’s immune system, the producer (Volkov E.V., Rybkin V.S. Optimization of the conditions for obtaining immunoglobulin red blood cell diagnostics. conf. - Volgograd, 1983, p. 23-27). As a result, the complete reproduction of all stages of the accumulation of raw materials for the production of erythrocyte diagnosticum is impossible, which leads to the production of drugs that are relatively non-standard in properties.
Цель изобретения - получение штамма гибридомы-продуцента специфических гомогенных по составу и свойствам моноклональных антител (МКА), обладающих высокой гемосенситивной активностью в отношении формалинизированных эритроцитов барана - сырья для производства диагностикума эритроцитарного иммуноглобулинового сапного моноклонального. The purpose of the invention is to obtain a strain of a hybridoma producer of specific monoclonal antibodies homogeneous in composition and properties, which have high hemosensitive activity against formalized ram erythrocytes, a raw material for the production of a diagnostic erythrocyte immunoglobulin monoclonal erythrocyte.
Получение гибридомы достигается иммунизацией мышей BALB/c целыми клетками Pseudomonas pseudomallei с последующей гибридизацией лимфоцитов селезенки иммунизированных мышей с миеломными клетками мыши. Концентрация иммуноглобулинов (IgM) в среде составляет в среднем 0,46-0,62 мг/мл, активность иммуноглобулинов в культуральной среде в ТИФА 1:640, в асцитической жидкости 1: 100000. Стабильность продуцирования сохраняется на протяжении 20 пассажей в культуре. Антитела обладают высокой гемосенситивной активностью в отношении формалинизированных танизированных эритроцитов барана, вследствие чего данный тип моноклональных иммуноглобулинов отобран для использования в качестве сырья для производства диагностикума эритроцитарного иммуноглобулинового сапного моноклонального. Hybridoma production is achieved by immunization of BALB / c mice with whole Pseudomonas pseudomallei cells, followed by hybridization of spleen lymphocytes of immunized mice with mouse myeloma cells. The concentration of immunoglobulins (IgM) in the medium averages 0.46-0.62 mg / ml, the activity of immunoglobulins in the culture medium in TIFA 1: 640, in ascites fluid 1: 100000. The stability of production is maintained for 20 passages in the culture. Antibodies have high hemosensitive activity against formalized, tanized sheep erythrocytes, as a result of which this type of monoclonal immunoglobulin is selected for use as a raw material for the production of a diagnostic erythrocyte immunoglobulin monoclonal sap.
Гибридома получена слиянием миеломы мышей P3-X63-Ag 8.653 и спленоцитов мыши линии BALB/c. Слияние проведено с помощью полиэтиленкликоля с последующим клонированием штамма-продуцента методом лимитирующих разведений. Полученный штамм назван GMVd-3(2G8) и характеризуется следующими признаками. The hybridoma was obtained by fusion of P3-X63-Ag 8.653 mouse myeloma and BALB / c mouse splenocytes. The merger was carried out using polyethylene glycol followed by cloning of the producer strain by the method of limiting dilutions. The resulting strain is named GMVd-3 (2G8) and is characterized by the following features.
Культурные признаки. Культивирование in vitro. Среда для культивирования - среда RPMI-1640 с добавлением 15%-ной эмбриональной телячьей сыворотки, 2мМ L-глютамина, 10 мМ ГЭПЭС, 4 мМ пирувата натрия. Cultural signs. In vitro cultivation. Cultivation medium is RPMI-1640 medium supplemented with 15% fetal calf serum, 2 mM L-glutamine, 10 mM HEPES, 4 mM sodium pyruvate.
Клетки культивируют при 37oC в атмосфере 5%-ного СО2 и 70-80%-ной влажности. Клетки пассируют один раз в 3-4 дня, контролируя микроскопически интенсивность роста. Кратность рассева 1:4-1:10. Культура суспензионная.Cells are cultured at 37 o C in an atmosphere of 5% CO 2 and 70-80% humidity. Cells are passaged once every 3-4 days, controlling microscopically the growth rate. Multiplicity of sieving 1: 4-1: 10. Suspension culture.
Культивирование в организме животного. Для накопления асцита клетки гибридомы вводят праймированным мышам линии BALB/c в дозе 1• 105 - 1• 106 клеток на мышь. Асцит образуется через 2-4 недели.Cultivation in the body of the animal. To accumulate ascites, hybridoma cells are administered to BALB / c primed mice at a dose of 1 • 10 5 - 1 • 10 6 cells per mouse. Ascites is formed after 2-4 weeks.
Продуктивность штамма. Продукция МКА в среде культивирования составляет 0,46 - 0,62 мг/мл, в асцитической жидкости 35-40 мг/мл. Продукция МКА в культуральной жидкости сохраняется на протяжении 20 пассажей. Strain productivity. MCA production in the cultivation medium is 0.46-0.62 mg / ml, in ascitic fluid 35-40 mg / ml. MCA production in the culture fluid is maintained for 20 passages.
Характеристика получаемого продукта. Антитела относятся к классу IgM. Они специфически взаимодействуют с определенным эпитопом термостабильного антигена возбудителя сапа. Специфичность взаимодействия определяется с помощью ТИФА и НМФА. Characteristics of the resulting product. Antibodies belong to the IgM class. They specifically interact with a specific epitope of the thermostable glan pathogen antigen. The specificity of the interaction is determined using TIFA and NMFA.
Криоконсервирование. 2-4•106 клеток штамма консервируют в 1 мл среды RPMI-1640 c 20%-ной эмбриональной телячьей сывороткой и 7%-ного диметилсульфоксида в пластиковых ампулах. Замораживание производят при 4oC (30 мин), а затем помещают в комплекс криоконсервирования биоматериалов, предназначенный для контролируемого замораживания клеточных культур тканей в заданном режиме: до температуры -20oC со скоростью 1,0 град/мин, до -40oC со скоростью 1,5 град/мин, до - 70oC со скоростью 5,0 град/мин. Затем ампулы погружают в жидкий азот и хранят в нем до момента использования. Размораживание производят быстро при -37oC на водяной бане. Жизнеспособность после размораживания составляет 65-75%.Cryopreservation. 2-4 • 10 6 cells of the strain are preserved in 1 ml of RPMI-1640 medium with 20% fetal calf serum and 7% dimethyl sulfoxide in plastic ampoules. Freezing is carried out at 4 o C (30 min), and then placed in a complex of cryopreservation of biomaterials designed for controlled freezing of cell tissue cultures in a given mode: to a temperature of -20 o C at a rate of 1.0 deg / min, up to -40 o C at a speed of 1.5 deg / min, up to - 70 o C at a speed of 5.0 deg / min. Then the ampoules are immersed in liquid nitrogen and stored in it until use. Defrosting is carried out quickly at -37 o C in a water bath. Viability after thawing is 65-75%.
Пример 1. Штамм получают следующим образом. Мышей линии BALB/c иммунизируют ультразвуковыми дезинтегратами клеток P. pseudomallei C-141. Первые две инъекции с интервалом в одну неделю производят подкожно в дозе 5•108 м.к. с неполным адъювантом Фрейнда (1:1) в объеме 0,3 мл и внутрибрюшинно в дозе 1•109 м. к. в объеме 0,5 мл физиологического раствора. Бустирующее введение антигена производят на 21-22-й день после начала иммунизации внутриселезеночно в дозе клеток 5•108 м.к. в 0,1 мл физиологического раствора. Через 3 дня после этого 1•108 спленоцитов иммунных мышей гибридизируют с 1•107 клеток мышиной миеломы P3-X63-Ag8.653 в присутствии 1 мл 50%-ного полиэтиленгликоля с мол.м. 4000 в течение 2 мин. Затем к этой смеси при постоянном перемешивании последовательно вносят 1,2,4 и 8 мл бессывороточной среды, каждую порцию в течение 2 мин. После этого клетки центрифугируют при 1000 об/мин в течение 10 мин. Осадок ресуспендируют в селективной среде ГАТ-среде с 15%-ной эмбриональной телячьей сывороткой, 2мМ L-глютамина, 4 мМ пирувата натрия. Клетки высевают в 96-луночную пластину с фидером по 2,5 - 5•105 клеток в лунку. Смену среды производят через 3-4 дня. Отбор гибридом-продуцентов в лунках опытной пластины определяют по наличию специфических иммуноглобулинов в культуральной среде с помощью ТИФМ. Выявленные гибридомы-продуценты клонируют не менее двух раз методом предельных разведений на среде RPMI-1640 с 15%-ной эмбриональной телячьей сывороткой с добавками в 96-луночных плато с фидером-мышиными перитонеальными макрофагами (4•104 клеток в лунке). После второго клонирования практически все 100% субклонов продуцируют МКА.Example 1. The strain is obtained as follows. BALB / c mice are immunized with ultrasonic disintegrates of P. pseudomallei C-141 cells. The first two injections with an interval of one week are performed subcutaneously at a dose of 5 • 10 8 mk. with incomplete Freund's adjuvant (1: 1) in a volume of 0.3 ml and intraperitoneally at a dose of 1 • 10 9 m. to. in a volume of 0.5 ml of physiological saline. The boosting administration of antigen is carried out on the 21-22th day after the start of immunization intrasplenicly at a dose of cells of 5 • 10 8 mk. in 0.1 ml of physiological saline. 3 days after this, 1 • 10 8 splenocytes of immune mice hybridize with 1 • 10 7 mouse P3-X63-Ag8.653 mouse myeloma cells in the presence of 1 ml of 50% polyethylene glycol per mol.m. 4000 for 2 minutes Then, 1.2.4 and 8 ml of serum-free medium are successively added to this mixture with constant stirring, each serving for 2 minutes. After that, the cells are centrifuged at 1000 rpm for 10 minutes The precipitate was resuspended in a selective medium GAT-medium with 15% fetal calf serum, 2 mm L-glutamine, 4 mm sodium pyruvate. Cells are seeded in a 96-well plate with a feeder of 2.5 - 5 • 10 5 cells per well. Change of environment is carried out after 3-4 days. The selection of producer hybridomas in the wells of the experimental plate is determined by the presence of specific immunoglobulins in the culture medium using TIFM. Identified producer hybridomas are cloned at least twice by limiting dilution on RPMI-1640 medium with 15% fetal calf serum supplemented in 96-well plateaus with feeder-mouse peritoneal macrophages (4 × 10 4 cells per well). After the second cloning, almost all 100% of the subclones produce MCA.
Среди продуктивных клонов, секретирующих МКА против антигенных детерминант возбудителей сапа и мелиоидоза, селекционирован клон-продуцент GMVd-3(2G8). Among the productive clones secreting MCAs against antigenic determinants of glanders and melioidosis, the clone producer GMVd-3 (2G8) was selected.
Пример 2. Накопление МКА. Ампулы с клетками гибридомы вынимают из сосуда с жидким азотом и быстро оттаивают на водяной бане при 37oC. Размороженные клетки переносят в центрифужную пробирку с 20 мл бессывороточной среды RPMI-1640, осторожно наслаивают взвесь клеток на среду. Клетки осаждают центрифугированием и после удаления отмывающей среды высевают на матрас 25 см2 на среду RPMI-1640 с 15%-ной эмбриональной телячьей сывороткой. Матрас инкубируют во влажной атмосфере с 5%-ным CO2 при 37oC. Когда колония клеток покрывает более трети дна матраса, осуществляют отбор проб культуральной среды с целью определения титра МКА с помощью ТИФА. При полном покрытии дна матраса гибридными клетками производят их рассев на несколько матрасов. Таким способом тиражируют клетки гибридомы in vitro.Example 2. The accumulation of MCA. Ampoules with hybridoma cells are removed from a vessel with liquid nitrogen and quickly thawed in a water bath at 37 ° C. Thawed cells are transferred to a centrifuge tube with 20 ml of serum-free RPMI-1640 medium and the cell suspension is carefully layered onto the medium. Cells are pelleted by centrifugation and, after removal of the washing medium, plated on a 25 cm 2 mattress on RPMI-1640 medium with 15% fetal calf serum. The mattress is incubated in a humid atmosphere with 5% CO 2 at 37 ° C. When the cell colony covers more than a third of the bottom of the mattress, culture medium samples are taken to determine the titer of MCA using TIFA. When the bottom of the mattress is completely covered by hybrid cells, they are sieved into several mattresses. In this way, in vitro hybridoma cells are replicated.
Для получения более концентрированного препарата антител гибридомы-продуценты накапливают в асцитической жидкости мышей BALB/c. Животных предварительно сенсибилизируют внутрибрюшинным введением пристана - 2,6,10,14-тетраметилпентадекана (0,3 мл на мышь) или неполного адъюванта Фрейнда (0,5 мл на мышь). Через неделю мышам внутрибрюшинно вводят по 1•105-1•106 клеток гибридомы, После появления у мышей асцитической жидкости и солидных опухолей собирают содержимое брюшной полости. Клетки осаждают центрифугированием, к надосадочной жидкости добавляют сульфат аммония до 50% его насыщения. Рыхлый осадок центрифугируют при 10000 об/мин в течение 20 мин, надосадочную жидкость удаляют. Плотный осадок растворяют в физиологическом растворе до исходного исходного объема, диализуют против этого же раствора в течение суток при 4oC до полного удаления сульфата аммония. Осаждение МКА сульфатом аммония до 50% его насыщения повторяют трижды как описано выше. В полученном растворе очищенных МКА определяют концентрацию белка спектрофотометрически. В качестве стандартного используют 1%-ный раствор бычьего сывороточного альбумина.To obtain a more concentrated antibody preparation, producer hybridomas accumulate BALB / c mice in the ascitic fluid. Animals are pre-sensitized by intraperitoneal administration of pristan - 2,6,10,14-tetramethylpentadecane (0.3 ml per mouse) or incomplete Freund's adjuvant (0.5 ml per mouse). After a week, mice are injected intraperitoneally with 1 • 10 5 -1 • 10 6 hybridoma cells. After the appearance of ascitic fluid and solid tumors in mice, the contents of the abdominal cavity are collected. Cells are pelleted by centrifugation, ammonium sulfate is added to the supernatant to 50% of its saturation. The loose precipitate was centrifuged at 10,000 rpm for 20 minutes, the supernatant was removed. A dense precipitate is dissolved in physiological saline to the original initial volume, dialyzed against the same solution for 24 hours at 4 ° C until ammonium sulfate is completely removed. The deposition of MCA with ammonium sulfate to 50% of its saturation is repeated three times as described above. In the resulting solution of purified MCAs, the protein concentration is determined spectrophotometrically. A 1% bovine serum albumin solution is used as standard.
Специфическую активность МКА определяют с помощью ТИФА и НМФА. При постановке ТИФА полистироловые пластины обрабатывают в течение ночи при 4oC водно-солевым экстрактом P. pseudomallei 56830 или P. mallei 10230, разделенным на 0,05 M карбонатно-бикарбонатном буфере, pH 9,5, до концентрации 1-10 мкг/мл по белку. Затем пластины трижды отмывают забуференным физраствором с 0,05% твина -20. На этом же растворе производят титрование образцов МКА в объеме 100 мкл, которые выдерживают в пластинах в течение 1 ч при 37oC. После очередного трехкратного отмывания пластин вносят антивидовой конъюгат в рабочем разведении, приготовленный на ЗФР с твином-20. Конъюгат представляет собой кроличьи антимышиные IgG, меченные пероксидазой хрена. Время инкубации 1 ч при 37oC, объем 100 мкл на лунку. Вновь повторяют отмывание. В заключение вносят смесь - перекись водорода с 5-аминосалициловой кислотой. После инкубации при комнатной температуре в течение 40 - 60 мин измеряют оптическую плотность жидкости в каждой лунке при длине волны 405 нм. МКА, выделенные из асцитической жидкости, в ТИФА активны в разделении 1: 5•103-1•104.The specific activity of MCA is determined using TIFA and NMFA. When setting TIFA, polystyrene plates are treated overnight at 4 o C with water-salt extract of
Специфическую активность МКА оценивают в непрямом методе флюоресцирующих антител с коммерческим антивидовым конъюгатом люминесцирующих иммуноглобулинов против глобулинов мыши. МКА, выделенные из асцитической жидкости мышей, в НМФА активны в разведении 1:1•104-1:105.The specific activity of the MCA is evaluated in the indirect method of fluorescent antibodies with a commercial antiviral conjugate of luminescent immunoglobulins against mouse globulins. MCA isolated from the ascitic fluid of mice in NMFAs are active at a dilution of 1: 1 • 10 4 -1: 10 5 .
Средний объем асцитической жидкости, получаемый при культивировании гибридомы GMVd-3(2G8) в организме животных, составляет 3,8 + 0,12 мл, продуцирующая активность in vivo - 35-40 мг моноклональных иммуноглобулинов на 1 мл асцитической жидкости. The average volume of ascitic fluid obtained by culturing the hybridoma GMVd-3 (2G8) in animals is 3.8 + 0.12 ml; in vivo producing activity is 35–40 mg of monoclonal immunoglobulins per ml of ascitic fluid.
Пример 3. Использование МКА GMVd-3(2G8) для конструирования диагностикума эритроцитарного иммуноглобулинового сапного моноклонального. Образцы МКА используют в качестве сырья для изготовления диагностикума эритроцитарного иммуноглобулинового сапного моноклонального. Для оценки гемосенсибилизирующей активности моноклональных иммуноглобулинов необходимый для работы объем формализированных и танизированных эритроцитов отмывают 0,9%-ным раствором NaCl, pH 6,4, центрифугируя взвесь клеток при 3000 об/мин в течение 10 мин. Осадок ресуспендируют этим же раствором до концентрация 2,5% и прогревают до 45oC. Прогретые эритроциты и приготовленные разведения МКА на 0,9%-ном NaCl, pH 6,4 c концентрацией белка от 250 до 1500 мкг/мл смешивают в равных объемах. Смесь инкубируют при 45oC и постоянном встряхивании в течение 1,5-2 ч. За 30 мин до окончания сенсибилизации эритроцитов в смесь добавляют формалин до концентрации 0,5-1,0%. Затем пробы эритроцитов трижды отмывают раствором 0,9%-ного NaCl, pH 7,2 с добавлением 0,25%-ной нормальной кроличьей сыворотки. Осадок трижды ресуспендируют этим же раствором до концентрации эритроцитов 2,5%.Example 3. The use of MCA GMVd-3 (2G8) for the construction of a diagnosticum of an erythrocyte immunoglobulin sap monoclonal. Samples of MCA are used as raw materials for the manufacture of a diagnosticum of an erythrocyte immunoglobulin sap monoclonal. To assess the hemosensitizing activity of monoclonal immunoglobulins, the required volume of formalized and tanized erythrocytes is washed with a 0.9% NaCl solution, pH 6.4, by centrifuging the cell suspension at 3000 rpm for 10 min. The precipitate is resuspended in the same solution to a concentration of 2.5% and heated to 45 o C. Heated red blood cells and prepared dilutions of MCA on 0.9% NaCl, pH 6.4 with a protein concentration of 250 to 1500 μg / ml are mixed in equal volumes. The mixture is incubated at 45 o C and shaking for 1.5-2 hours. 30 minutes before the end of sensitization of red blood cells, formalin is added to the mixture to a concentration of 0.5-1.0%. Then the samples of red blood cells are washed three times with a solution of 0.9% NaCl, pH 7.2 with the addition of 0.25% normal rabbit serum. The precipitate is resuspended three times with the same solution to a concentration of red blood cells of 2.5%.
Активность полученных образцов эритроцитов, нагруженных специфическими МКА, проверяют в РНГА со взвесью Pseudomonas mallei 10230 и P. pseudomallei 56830. Оптимальной сенсибилизирующей дозой иммуноглобулинов считают такую концентрацию МКА, которая обеспечивает получение образцов эритроцитарного диагностикума с максимальной чувствительностью (не ниже 1•106 м.к./мл). Результаты определения оптимальной гемосенсибилизирующей дозы МКА в РНГА представлены в табл.1.The activity of the obtained erythrocyte samples loaded with specific MABs is checked in RNGA with a suspension of
Данные, представленные в табл. 1, свидетельствуют о том, что оптимальная гемосенситивная доза МКА составляла 250-500 мкг/на 1 мл 2,5%-ной взвеси формалинизированных и танизированных эритроцитов. The data presented in table. 1, indicate that the optimal hemosensitive dose of MCA was 250-500 μg / 1 ml of a 2.5% suspension of formalinized and tanized red blood cells.
Опытную серию препарата готовят так, как описано выше. Танизированные эритроциты смешивают с МКА, взятыми в удвоенной концентрации по отношению к оптимальной сенсибилизирующей дозе МКА. An experimental series of the drug is prepared as described above. Tanized red blood cells are mixed with MCA taken in double concentration in relation to the optimal sensitizing dose of MCA.
После поверки эритроцитарного диагностикума в РНГА со взвесью P.mallei и P. pseudomallei ампулы с 10%-ной взвесью эритроцитов в защитной среде (15% реополиглюкина и 7,5% сахарозы) подвергают лиофилизации и хранят при +4oC.After checking the erythrocyte diagnosticum in RNGA with a suspension of P.mallei and P. pseudomallei, ampoules with 10% suspension of red blood cells in a protective medium (15% rheopolyglucin and 7.5% sucrose) are lyophilized and stored at + 4 o C.
Пример 4. Оценка активности, чувствительности и специфичности диагностикума эритроцитарного иммуноглобулинового сапного моноклонального. При постановке РНГА используют живые, обеззараженные 4%-ным нейтральным формалином, с экспозицией 1 ч или автоклавированные при 120oC в течение 30 мин взвеси бактерий различных штаммов возбудителей сапа и мелиоидоза.Example 4. Evaluation of the activity, sensitivity and specificity of the diagnosticum of erythrocyte immunoglobulin sap monoclonal. When stating RNGA, live, disinfected with 4% neutral formalin, with an exposure of 1 h or autoclaved at 120 ° C for 30 minutes, using suspended bacteria of various strains of glanders and melioidosis are used.
Установлено, что спектр специфической активности моноклонального сапного эритроцитарного диагностикума в отношении штаммов P.mallei и P.pseudomalei шире, чем у коммерческого диагностикума эритроцитарного иммуноглобулинового сапного (прототип). Данные результатов РНГА отражены в табл.2. It was found that the spectrum of specific activity of monoclonal sap erythrocyte diagnosticum in relation to P.mallei and P.pseudomalei strains is wider than in the commercial diagnosticum of erythrocytic immunoglobulin Sapnoe (prototype). RNGA results data are shown in Table 2.
В соответствии с представленными в табл. 2 результатами диагностикум эритроцитарный иммуноглобулиновый сапный моноклональный позволяет выявлять в РНГА до 93% штаммов P.mallei и 82% P.pseudomallei при концентрации бактерий 1•105-106 м.к./мл, не взаимодействуя с другими видами псевдомонад.In accordance with the table. 2, the diagnosticum erythrocyte immunoglobulin sap monoclonal allows detecting up to 93% of P.mallei and 82% P.pseudomallei strains in RNGA at a bacterial concentration of 1 • 10 5 -10 6 mk / ml without interacting with other types of pseudomonads.
В ходе испытаний отмечено, что чувствительность препарата на основе МКА с рядом штаммов P. mallei и P. pseudomallei превышала показатель чувствительности коммерческого препарата. Результаты этих исследований представлены в табл. 3. During the tests, it was noted that the sensitivity of the preparation based on MCA with a number of strains of P. mallei and P. pseudomallei exceeded the sensitivity of the commercial drug. The results of these studies are presented in table. 3.
Анализ полученных результатов экспериментов позволил сделать заключение о высокой чувствительности и специфичности диагностикума эритроцитарного иммуноглобулинового сапного моноклонального и об эффективности его использования в РНГА для обнаружения патогенных псевдомонад (возбудителей сапа и мелиоидоза). An analysis of the experimental results made it possible to draw a conclusion about the high sensitivity and specificity of the diagnosticum of erythrocyte immunoglobulin sap monoclonal and the effectiveness of its use in RNGA for the detection of pathogenic pseudomonads (glanders and melioidosis).
Преимуществом сапных моноклональных иммуноглобулинов, используемых в качестве основы для конструирования эритроцитарного диагностикума, является стабильность иммуноглобулинового сырья, практически 100%-ная воспроизводимость результатов опытов по сенсибилизации эритроцитов, что выгодно отличает данную основу от поликлональных иммуноглобулинов при производстве эритроцитарного диагностикума для РНГА. The advantage of monoclonal immunoglobulin boots used as a basis for the construction of an erythrocyte diagnosticum is the stability of the immunoglobulin raw material, almost 100% reproducibility of the results of erythrocyte sensitization experiments, which distinguishes this basis from polyclonal immunoglobulins in the production of an erythrocyte diagnosticum for RNGA.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU97111846A RU2117043C1 (en) | 1997-07-02 | 1997-07-02 | Strain of cultured hybrid cells of animal mus musculus - producer of monoclonal antibodies to thermostable antigen which is common for glanders and meliodosis pathogens |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU97111846A RU2117043C1 (en) | 1997-07-02 | 1997-07-02 | Strain of cultured hybrid cells of animal mus musculus - producer of monoclonal antibodies to thermostable antigen which is common for glanders and meliodosis pathogens |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2117043C1 true RU2117043C1 (en) | 1998-08-10 |
| RU97111846A RU97111846A (en) | 1998-12-10 |
Family
ID=20195215
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU97111846A RU2117043C1 (en) | 1997-07-02 | 1997-07-02 | Strain of cultured hybrid cells of animal mus musculus - producer of monoclonal antibodies to thermostable antigen which is common for glanders and meliodosis pathogens |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2117043C1 (en) |
-
1997
- 1997-07-02 RU RU97111846A patent/RU2117043C1/en active
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Волков Е.В., Рыбкин В.С. Оптимизация условий получения сапного иммуноглобулинового эритроцитарного диагностикума. Дезинфекция и стерилизация. Перспективы развития: Материалы всесоюзной научной конференции. - Волгоград, 1983, с.23 - 27. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2648419B2 (en) | Monoclonal antibody mixture | |
| US8815244B2 (en) | Method for production of antibody using ostrich | |
| US4455296A (en) | Hybrid cell lines producing monoclonal antibodies directed against Haemophilus influenzae | |
| CA2015246A1 (en) | Human monoclonal antibody, and its production and use | |
| JPS5845407B2 (en) | Method for producing malignant tumor antibodies | |
| JPH0634712B2 (en) | Monoclonal antibody-producing hybridoma cell line against hepatitis B virus | |
| WO1983001739A1 (en) | Monoclonal antibodies against brugia malayi | |
| US4618585A (en) | Hybridoma cell lines producing monoclonal antibodies directed against cervical cancer cells | |
| RU2117043C1 (en) | Strain of cultured hybrid cells of animal mus musculus - producer of monoclonal antibodies to thermostable antigen which is common for glanders and meliodosis pathogens | |
| RU2116344C1 (en) | Strain of cultured hybrid cells of animal mus musculus - a producer of monoclonal antibody raised to thermostable surface antigen of meliodosis pathogen | |
| RU2117042C1 (en) | Strain of cultured hybrid cells of animal mus musculus - producer of monoclonal antibodies to thermostable component of capsule-like substance of meliodosis pathogen | |
| RU2012594C1 (en) | Strain of hybrid cultured mammalian cells mus musculus l - a producer of monoclonal antibodies to 146s-component of foot and mouth disease virus asia-1 | |
| RU2092554C1 (en) | Strain of the hybrid cultured animal cell mus musculus l - a producer of monoclonal antibody raised to aujeszky's disease virus, strain uniiev-18b | |
| RU2265051C1 (en) | Strain of hybrid cultured mammalian cells mus musculus l, pkkk(p) 679d - producer of monoclonal antibody with specificity to protein-polysaccharide antigen from yersinia enterocolitica o3 and o9 serovars | |
| RU2186107C1 (en) | Strain of hybrid cells m/n-10g9 of animal mus musculus l producing monoclonal antibodies raised to marburg virus | |
| WO1989000607A1 (en) | Preparation of human monoclonal antibodies of selected specificity and isotypes | |
| RU1801117C (en) | Method of monoclonal antibody preparation to monoclonal antibody to the protein of human lymphocyte t4, culturing cell of hybridoma jti -if3 - a producer of monoclonal antibody to monoclonal antibody to the protein of human lymphocyte t4, culturing cell of hybridoma jti -if3-e5 - a producer of monoclonal antibody to monoclonal | |
| RU2117700C1 (en) | Strain of hybrid cultured cells of animal mus musculus l - a producer of monoclonal antibodies raised to pig vesicular disease virus, strain t-75 | |
| RU2008350C1 (en) | HYBRID STRAIN OF ANIMAL MUS MUSCULUS CELLS FOR PRODUCING MONOCLONAL ANTIBODIES AGAINST HUMAN IgG | |
| SU1595902A1 (en) | Strain of mus musculus l hybrid cultivable cells for producing monoclonal antibodies to atigen cd38 | |
| SU1751202A1 (en) | Strain of hybridous cultured mammalian cells mus musculus l , producing monoclonal antibodies to 146 s-component of foot-and-mouth virus a@@@ (aglie) | |
| RU2451078C1 (en) | Mus musculus cultivated hybrid cell strain 11d6 producer of monoclonal antibodies specific to lipopolysaccharide francisella tularensis | |
| Schots et al. | Production of monoclonal antibodies | |
| SU1721092A1 (en) | Strain of hydride cultured mammalian cells mus musculus l - a producer of monoclonal antibody to brain myelin glycoproteine, inhibiting activity of natural human killers | |
| SU1541254A1 (en) | Strain of hybrid cultivable mus musculus cells used for producing monoclonal antibodies to thermally stable o-antigen of cholera germ |