RU2111492C1 - Method of diagnosis of infectious disease in animals - Google Patents
Method of diagnosis of infectious disease in animals Download PDFInfo
- Publication number
- RU2111492C1 RU2111492C1 RU96117140A RU96117140A RU2111492C1 RU 2111492 C1 RU2111492 C1 RU 2111492C1 RU 96117140 A RU96117140 A RU 96117140A RU 96117140 A RU96117140 A RU 96117140A RU 2111492 C1 RU2111492 C1 RU 2111492C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- antigen
- reaction
- blood
- animal
- antigens
- Prior art date
Links
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 title claims abstract description 46
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 27
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 title claims description 10
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 title claims description 8
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 title abstract description 11
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 84
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 83
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 83
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 52
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 48
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims abstract description 47
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims abstract description 45
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims abstract description 25
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims abstract description 21
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 19
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 claims abstract description 18
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims abstract description 10
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 claims abstract description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 18
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 6
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 abstract description 14
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 abstract 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 244000052613 viral pathogen Species 0.000 abstract 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 12
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 12
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 10
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 9
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 9
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 8
- 206010035148 Plague Diseases 0.000 description 7
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 7
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 7
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 7
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 6
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 6
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 6
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 5
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 5
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- OQUFOZNPBIIJTN-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid;sodium Chemical compound [Na].OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O OQUFOZNPBIIJTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 description 3
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 3
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 3
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 3
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 239000010755 BS 2869 Class G Substances 0.000 description 2
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 2
- 208000004232 Enteritis Diseases 0.000 description 2
- 206010049190 Red blood cell agglutination Diseases 0.000 description 2
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 2
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 2
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 2
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 2
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 2
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- 208000007212 Foot-and-Mouth Disease Diseases 0.000 description 1
- 241000710198 Foot-and-mouth disease virus Species 0.000 description 1
- 208000005577 Gastroenteritis Diseases 0.000 description 1
- 241000606860 Pasteurella Species 0.000 description 1
- 206010034107 Pasteurella infections Diseases 0.000 description 1
- 241000125945 Protoparvovirus Species 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000000925 erythroid effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000777 hematopoietic system Anatomy 0.000 description 1
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000000521 hyperimmunizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000003771 laboratory diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 244000005706 microflora Species 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 229940043515 other immunoglobulins in atc Drugs 0.000 description 1
- 201000005115 pasteurellosis Diseases 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000009993 protective function Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к ветеринарной иммунологии и может быть использовано при экспресс-диагностике заболеваний как вирусной, так и бактериальной этиологии, а также для оценки эпизоотического состояния хозяйств по различным инфекциям. The invention relates to veterinary immunology and can be used for rapid diagnosis of diseases of both viral and bacterial etiology, as well as for assessing the epizootic state of farms for various infections.
Известен ряд способов диагностики инфекционных заболеваний сельскохозяйственных животных путем постановки серологических реакций и анализа иммунного статуса животных. A number of methods are known for diagnosing infectious diseases of farm animals by staging serological reactions and analyzing the immune status of animals.
Известен способ диагностики вирусных инфекций путем постановки реакции непрямой гемагглютинации - РНГА (см. авт. св. СССР N 1780008, кл. G 01 N 33/556, опубл. 07.12.92), предусматривающий разведение исследуемого материала стабилизирующим раствором, добавление сенсибилизированных антителами эритроцитов, инкубацию и учет результатов. При этом в качестве стабилизирующего раствора используют раствор крахмала. Способ позволяет осуществлять выявление вирусного антигена в инфицированном материале. A known method for the diagnosis of viral infections by setting the reaction of indirect hemagglutination - RNGA (see ed. St. USSR N 1780008, class G 01 N 33/556, publ. 07.12.92), involving the dilution of the test material with a stabilizing solution, the addition of erythrocytes sensitized by antibodies incubation and recording of results. In this case, a starch solution is used as a stabilizing solution. The method allows for the detection of viral antigen in infected material.
Однако постановка РНГА трудоемка, требует длительного времени, обусловленного необходимостью многократного введения вируса в организм лабораторного животного для получения специфической гипериммунной сыворотки. Кроме этого, применение специальных антительных эритроцитарных диагностикумов снижает эффективность способа из-за возможной их спонтанной самоагглютинации. However, the production of RNGA is time-consuming, requires a long time, due to the need for repeated introduction of the virus into the body of a laboratory animal to obtain specific hyperimmune serum. In addition, the use of special antibody erythrocyte diagnostics reduces the effectiveness of the method due to their possible spontaneous self-agglutination.
Известен также способ диагностики инфекционных заболеваний вирусной этиологии путем постановки реакции нейтрализации (см. В.Н. Сюрин и соавт. Методы лабораторной диагностики вирусных болезней животных. М.: Агропромиздат, 1986, с. 207), заключающийся в отборе крови, приготовлении сыворотки, смешивании ее в различных разведениях с вирусом, инкубировании смеси, внесении смеси в многослойную культуру клеток с последующим инкубированием. Учет результатов реакции проводит по количеству редуцированных бляшек. При этом тип вируса соответствует типу иммунной сыворотки. There is also a method of diagnosing infectious diseases of viral etiology by staging a neutralization reaction (see V.N. Syurin et al. Methods of laboratory diagnosis of animal viral diseases. M: Agropromizdat, 1986, p. 207), which consists in the selection of blood, preparation of serum, mixing it in various dilutions with the virus, incubating the mixture, introducing the mixture into a multilayer cell culture, followed by incubation. The reaction results are taken into account by the number of reduced plaques. Moreover, the type of virus corresponds to the type of immune serum.
Существенными недостатками способа являются длительность идентификации возбудителя и увеличение сроков постановки диагноза. Significant disadvantages of the method are the duration of identification of the pathogen and the increase in the timing of diagnosis.
Наиболее близким к заявляемому способу является способ диагностики инфекционных заболеваний животных путем постановки реакции нейтрализации (см. авт. св. СССР N 1797709, кл. G 01 N 33/53, опубл. 23.02.93), включающий отбор антителосодержащего материала от испытуемых животных, смешивание его с эталонным вирусом, инкубирование смеси, внесение ее в многослойную культуру клеток, инкубирование инфицированной культуры и учет результатов реакции, при этом в качестве антителосодержащего материала используют лимфоциты. Способ позволяет сократить время определения возбудителя в реакции нейтрализации на 4-11 дней и тем самым выявить возбудителя на 3-й день после заражения. Closest to the claimed method is a method for the diagnosis of infectious diseases of animals by setting the neutralization reaction (see ed. St. USSR N 1797709, class G 01 N 33/53, publ. 23.02.93), including the selection of antibody-containing material from the tested animals, mixing it with a reference virus, incubating the mixture, introducing it into a multilayer cell culture, incubating the infected culture and taking into account the results of the reaction, while lymphocytes are used as the antibody-containing material. The method allows to reduce the time of determination of the pathogen in the neutralization reaction by 4-11 days and thereby identify the pathogen on the 3rd day after infection.
Однако недостатком способа, как и предыдущих, является длительность идентификации возбудителя (на 3-й день), что на практике приводит к значительным потерям молодняка особенно в первые дни жизни. However, the disadvantage of the method, as well as the previous ones, is the length of identification of the pathogen (on the 3rd day), which in practice leads to significant losses of young animals, especially in the first days of life.
Кроме этого, эффективность способа незначительна ввиду ограниченного спектра используемых эталонных антигенов. Способ позволяет идентифицировать только вирус ящура крупного рогатого скота. In addition, the effectiveness of the method is insignificant due to the limited range of reference antigens used. The method allows to identify only the virus of foot and mouth disease in cattle.
Изобретение направлено на решение задачи повышения эффективности способа диагностики инфекционных заболеваний животных за счет ускорения идентификации возбудителя как вирусной, так и бактериальной этиологии, а также за счет возможности оценки иммунного статуса организма животных при упрощении технологии диагностики. The invention is aimed at solving the problem of increasing the efficiency of the method for diagnosing infectious diseases of animals by accelerating the identification of the pathogen of both viral and bacterial etiology, as well as by assessing the immune status of the animal organism while simplifying the diagnostic technology.
Задача решается путем отбора крови от испытуемого животного, приготовления исследуемого материала, смешивания его с эталонными антигенами и учета результатов. При этом в качестве исследуемого материала используют одновременно цитратную кровь и эритроциты одного и того же испытуемого животного, смешивание эритроцитов и цитратной крови осуществляют с каждым из эталонных антигенов, в качестве которых используют как растворимые бактериальные, так и вирусные. Определяют характер реакции цитратной крови и отдельно характер агглютинации эритроцитов с одними и теми же эталонными антигенами и по соотношению показателей судят о наличии инфекционного заболевания. По отрицательной реакции цитратной крови с каким-либо антигеном и положительной агглютинации эритроцитов с этим же антигеном судят о наличии носительства данного антигена в организме испытуемого животного. По положительной реакции цитратной крови с каким-либо антигеном и положительной агглютинации эритроцитов или отсутствии ее с этим же антигеном судят о наличии иммунного статуса в отношении данного антигена в организме испытуемого животного. The problem is solved by taking blood from the test animal, preparing the test material, mixing it with reference antigens and taking into account the results. Moreover, citrate blood and erythrocytes of the same test animal are used simultaneously as the test material, and erythrocytes and citrate blood are mixed with each of the reference antigens, which use both soluble bacterial and viral antigens. The nature of the reaction of citrated blood is determined and the nature of the agglutination of red blood cells with the same reference antigens is separately determined and the presence of an infectious disease is judged by the ratio of the indicators. By the negative reaction of citrated blood with any antigen and positive agglutination of red blood cells with the same antigen, the presence of the carrier of this antigen in the body of the test animal is judged. The positive reaction of citrated blood with any antigen and the positive agglutination of red blood cells or the absence of it with the same antigen is used to determine the presence of an immune status with respect to this antigen in the body of the test animal.
В известных источниках патентной и научно-технической информации не описано способа ускоренной диагностики инфекционных заболеваний животных, основанного на одновременном учете характера реакции цитратной крови испытуемого животного с каким-либо эталонным антигеном и характера агглютинации эритроцитов этого же животного с этим же эталонным антигеном. При этом при определении характера агглютинации эритроцитов последние выступают в роли исследуемого материала. Обычно при постановке реакции гемагглютинации используются эритроцитарные диагностикумы, в которых на эритроцитах адсорбированы либо антигены, либо антитела. В изобретении эритроциты выступают не в роли диагностикума, а являются антител- или антител-антигеносодержащим материалом. Кроме этого, обычно в стандартных серологических реакциях, в том числе и при постановке реакции гемагглютинации, используют сыворотку крови, а в заявляемом способе - непосредственно кровь животных (цитратную), что значительно ускоряет процесс идентификации возбудителя заболевания. Known sources of patent and scientific and technical information do not describe a method for the accelerated diagnosis of animal infectious diseases, based on the simultaneous consideration of the nature of the reaction of citrated blood of the test animal with any reference antigen and the nature of agglutination of red blood cells of the same animal with the same reference antigen. In this case, when determining the nature of agglutination of red blood cells, the latter act as the studied material. Typically, when setting up the hemagglutination reaction, red blood cell diagnostics are used in which either antigens or antibodies are adsorbed on red blood cells. In the invention, red blood cells do not act as a diagnosticum, but are antibody- or antibody-antigen-containing material. In addition, usually in standard serological reactions, including the formulation of the hemagglutination reaction, blood serum is used, and in the claimed method, animal blood (citrate) is used directly, which significantly accelerates the identification of the pathogen.
Таким образом, неизвестность ускоренного способа диагностики с одновременной оценкой иммунного статуса организма животного и идентификацией возбудителя при вирусных или бактериальных инфекциях за счет учета характера реакции цитратной крови и характера агглютинации эритроцитов с одними и теми же антигенами позволяет сделать вывод о наличии в изобретении критерия "изобретательский уровень". Thus, the unknown accelerated diagnostic method while assessing the immune status of the animal’s organism and identifying the causative agent for viral or bacterial infections by taking into account the nature of the reaction of citrated blood and the nature of the agglutination of red blood cells with the same antigens allows us to conclude that the invention contains the criterion of “inventive step "
Известно, что иммунная система организма - это специализированная самостоятельная система клеток, тканей и органов, выполняющая защитную функцию. Как и всякая самостоятельная система, иммунная обладает способностью к саморегуляции. К регуляторам иммунного ответа относятся T- и B-лимфоциты, осуществляющие стимулирующее ("хелперное") или тормозящее ("супрессорное") действие, а также клетки нелимфоидной природы - элементы моноцито-макрофагального происхождения и тучные клетки, которые влияют на системный и клеточный иммунитет. It is known that the body’s immune system is a specialized independent system of cells, tissues and organs that performs a protective function. Like any independent system, the immune system has the ability to self-regulation. Regulators of the immune response include T- and B-lymphocytes, which have a stimulating ("helper") or inhibitory ("suppressor") effect, as well as non-lymphoid cells, elements of monocyte-macrophage origin and mast cells that affect systemic and cellular immunity .
В то же время в 1985 г группой авторов Института клинической иммунологии Сибирского отделения АМН СССР - В.А. Козловым, И.Г. Цырловой, В.В. Чегляковой было установлено неизвестное ранее явление регуляции иммунного ответа. Явление зарегистрировано в качестве открытия (N 385 по заявке N ОТ-111137 от 28.06.85 г) и заключается в том, что в системе саморегуляции иммунитета организма, кроме вышеназванных регуляторов, участвуют и красные клетки крови. В частности показано, что иммунокомпетентные клетки, развиваясь как часть кроветворной системы, способны взаимодействовать с другими звеньями кроветворения (в частности, эритроидными) и испытывать регуляторные воздействия со стороны последних. At the same time, in 1985, a group of authors of the Institute of Clinical Immunology of the Siberian Branch of the Academy of Medical Sciences of the USSR - V.A. Kozlov, I.G. Tsyrlova, V.V. Cheglyakova was found previously unknown phenomenon of regulation of the immune response. The phenomenon was registered as an opening (N 385 according to the application N OT-111137 dated 06/28/85 g) and consists in the fact that in addition to the above-mentioned regulators, red blood cells also participate in the system of self-regulation of the body's immunity. In particular, it was shown that immunocompetent cells, developing as part of the hematopoietic system, are able to interact with other hematopoietic units (in particular, erythroid) and experience regulatory effects from the latter.
Заявляемый способ диагностики инфекционных заболеваний животных основан на использовании вышеописанного явления регуляции иммунного ответа. The inventive method for the diagnosis of infectious diseases of animals is based on the use of the above-described phenomenon of regulation of the immune response.
Механизм реакции как цитратной крови, так и эритроцитов с эталонными антигенами основан в заявляемом способе на естественном взаимодействии эритроцитов, содержащих на своей поверхности иммуноглобулины или комплексы иммуноглобулинов, с бактериальными или вирусными антигенами. The reaction mechanism of both citrated blood and red blood cells with reference antigens is based in the claimed method on the natural interaction of red blood cells containing immunoglobulins or complexes of immunoglobulins on their surface with bacterial or viral antigens.
Общеизвестно, что на поверхности эритроцитов могут адсорбироваться различные классы иммуноглобулинов. Установлено, что один из иммуноглобулинов (Ig M и Ig G) прочно связаны с поверхностью эритроцитов и их наличие определяет уровень системного иммунитета. При механическом воздействии эти связи сохраняются, что и свидетельствует о наличии определенного уровня системного иммунитета. It is well known that various classes of immunoglobulins can be adsorbed on the surface of red blood cells. It was established that one of the immunoglobulins (Ig M and Ig G) is firmly bound to the surface of red blood cells and their presence determines the level of systemic immunity. With mechanical action, these bonds are preserved, which indicates the presence of a certain level of systemic immunity.
Другие иммуноглобулины, такие как Ig A и Ig Ac, определяющие уровень клеточного иммунитета, слабо связаны с поверхностью эритроцитов. При механическом воздействии эти связи нарушаются, что свидетельствует о наличии клеточного иммунитета.Other immunoglobulins, such as Ig A and Ig A c , which determine the level of cellular immunity, are weakly bound to the surface of red blood cells. With mechanical action, these bonds are broken, which indicates the presence of cellular immunity.
Положительный характер реакции цитратной крови с антигеном и положительная агглютинация эритроцитов свидетельствует о наличии на эритроцитах иммуноглобулина, которые прочно связаны с поверхностью эритроцитов (Ig G и Ig M), и при механическом воздействии эти связи сохраняются. Это свидетельствует о наличии системного фактора иммунитета. The positive nature of the reaction of citrated blood with an antigen and positive agglutination of red blood cells indicates the presence of immunoglobulin on red blood cells, which are firmly bound to the surface of red blood cells (Ig G and Ig M), and upon mechanical action, these bonds remain. This indicates the presence of a systemic factor of immunity.
Положительный характер реакции цитратной крови с антигеном и отсутствие агглютинации эритроцитов с этим же антигеном свидетельствуют о наличии на поверхности эритроцитов цитратной крови тяжелых иммуноглобулинов. Поскольку они слабо связаны с поверхностью эритроцитов, то при механическом воздействии прочность этих связей нарушается и агглютинации с эталонным антигеном не происходит. Поэтому данное соотношение показателей свидетельствует о наличии клеточного фактора иммунитета. The positive nature of the reaction of citrated blood with an antigen and the absence of red blood cell agglutination with the same antigen indicate the presence of heavy immunoglobulins on the surface of red blood cells of citrated blood. Since they are weakly bound to the surface of red blood cells, the mechanical strength of these bonds breaks and mechanical agglutination does not occur with the reference antigen. Therefore, this ratio of indicators indicates the presence of a cellular factor of immunity.
Отрицательный характер реакции цитратной крови с антигеном и положительная агглютинация эритроцитов с этим же антигеном свидетельствуют о том, что на поверхности эритроцитов исследуемого животного присутствуют как иммуноглобулины, так и специфические антигены, которые образуют на поверхности эритроцитов цитратной крови комплексы антиген-антитело. В результате этого реакция цитратной крови с эталонным антигеном отрицательна, но при отмывании эритроцитов прочность комплекса нарушается, специфический антиген отмывается, связи с иммуноглобулинами освобождаются и происходит агглютинация с эталонным антигеном. Это свидетельствует о наличии специфических антигенов в организме животного. The negative nature of the reaction of citrated blood with an antigen and the positive agglutination of red blood cells with the same antigen indicate that both the immunoglobulins and specific antigens that form antigen-antibody complexes on the surface of red blood cells of the test animal are present. As a result of this, the reaction of citrate blood with a reference antigen is negative, but when washing red blood cells, the strength of the complex is violated, the specific antigen is washed off, bonds with immunoglobulins are released and agglutination with the reference antigen occurs. This indicates the presence of specific antigens in the body of the animal.
Случай одновременной положительной реакции цитратной крови и агглютинации отмытых эритроцитов с исходными антигенами, когда отмытые эритроциты дают положительную реакцию с антигеном в меньшем разведении, а цитратная кровь дает положительную реакцию с этим же антигеном в большем разведении, рассматривается как наличие клеточного-гуморального иммунитета. The case of a simultaneous positive reaction of citrated blood and agglutination of washed red blood cells with the original antigens, when washed red blood cells give a positive reaction with an antigen in a smaller dilution, and citrated blood gives a positive reaction with the same antigen in a larger dilution, is considered as the presence of cellular-humoral immunity.
Отсутствие реакции цитратной крови и отсутствие агглютинации эритроцитов свидетельствуют либо об отсутствии заболевания, бактерио- или вирусоносительства, либо об отсутствии клеточного иммунитета к данному возбудителю. The absence of a reaction of citrated blood and the absence of red blood cell agglutination indicate either the absence of a disease, bacterial or virus carrier, or the absence of cellular immunity to this pathogen.
Способ осуществляется следующим образом. Готовят исследуемый материал, приготавливают растворимые антигены бактериального или/и вирусного происхождения либо используют вакцинные вирусные препараты. Осуществляют раститровку полученных эталонных растворимых антигенов, смешивают антигены с исследуемым материалом, и производят учет и сравнение результатов реакции цитратной крови с агглютинацией отмытых эритроцитов к одним и тем же эталонным антигенам. The method is as follows. The test material is prepared, soluble antigens of bacterial and / or viral origin are prepared, or vaccine viral preparations are used. The obtained soluble reference antigens are triturated, the antigens are mixed with the test material, and the results of citrate blood reaction with agglutination of washed red blood cells to the same reference antigens are recorded and compared.
В пробирки с лимонно-кислым натрием отбирают по 0,501 мл крови от исследуемых животных путем прокола иглой ушной вены. 0.501 ml of blood from the test animals was taken into test tubes with citric acid sodium by piercing the ear vein with a needle.
Готовят исследуемый материал. Для этого из части объема полученной цитратной крови готовят 2,5%-ную взвесь на физиологическом растворе. Из оставшегося объема цитратной крови готовят 2,5%-ную взвесь отмытых эритроцитов следующим образом. Добавляют к цитратной крови в соотношении 1:10 физраствор, полученную смесь центрифугируют в течение 10 мин со скоростью 3000 об/мин. Надосадочную жидкость отбирают пастеровской пипеткой, после чего к оставшемуся осадку снова добавляют физраствор в соотношении 1:10 и повторно центрифугируют при описанных выше условиях. Prepare the test material. For this, a 2.5% suspension in physiological saline is prepared from a portion of the volume of citrated blood obtained. From the remaining volume of citrated blood, a 2.5% suspension of washed red blood cells is prepared as follows. Saline solution was added to citrate blood at a ratio of 1:10, the resulting mixture was centrifuged for 10 min at a speed of 3000 rpm. The supernatant was taken with a Pasteur pipette, after which saline was again added to the remaining precipitate in a ratio of 1:10 and centrifuged again under the conditions described above.
После трехкратного отмывания смеси получают осадок в виде отмытых эритроцитов, из которого путем добавления физиологического раствора готовят 2,5%-ную взвесь. After washing the mixture three times, a precipitate is obtained in the form of washed red blood cells, from which a 2.5% suspension is prepared by adding physiological saline.
В зависимости от целей исследования приготавливают различные растворимые антигены бактериального и/или вирусного происхождения. Бактериальные растворимые антигены готовят с использованием штаммов различных микроорганизмов: стрептококков, пастерелл, сальмонелл, эшерихий и других. Для этого соответствующие культуры засевают на твердые питательные среды. Суточную культуру смывают физиологическим раствором и доводят до стандарта мутности 10 млрд. м. т. /мл. Культуру различают по флаконам и подвергают многократному замораживанию-оттаиванию (10-20 раз в зависимости от штаммов). Содержимое флаконов проверяют на стерильность путем посева на питательные среды. По отсутствию роста культур на средах судят о стерильности культуры. После этого культуру центрифугируют в течение 15 мин со скоростью 3000 об/мин. Полученная надосадочная жидкость будет растворимым бактериальным антигеном. Depending on the purpose of the study, various soluble antigens of bacterial and / or viral origin are prepared. Bacterial soluble antigens are prepared using strains of various microorganisms: streptococci, pasteurellas, salmonella, Escherichia and others. To do this, appropriate cultures are seeded on solid nutrient media. The daily culture is washed off with physiological saline and adjusted to a turbidity standard of 10 billion mt / ml. The culture is distinguished by vials and subjected to repeated freezing-thawing (10-20 times depending on the strains). The contents of the vials are checked for sterility by plating on culture media. By the lack of crop growth on media, sterility of the culture is judged. After that, the culture is centrifuged for 15 min at a speed of 3000 rpm The resulting supernatant will be a soluble bacterial antigen.
Вирусные растворимые антигены получают путем посева соответствующего вируса на культуру ткани СПЭВ. При наличии цитопатического эффекта культуру подвергают замораживанию-оттаиванию (не менее 3 раз), центрифугируют в течение 30 мин со скоростью 3000 об/мин. Полученная надосадочная жидкость будет растворимым вирусным антигеном. При этом концентрацию вируса определяют путем титрования на культуре ткани СПЭВ по ЦПД. Viral soluble antigens are obtained by plating the corresponding virus on an SPEV tissue culture. In the presence of a cytopathic effect, the culture is subjected to freezing and thawing (at least 3 times), centrifuged for 30 minutes at a speed of 3000 rpm. The resulting supernatant will be a soluble viral antigen. In this case, the concentration of the virus is determined by titration on tissue culture SPEV according to the CPD.
Поскольку реакция антиген-антитело идет при определенном соотношении, проводят раститровку полученных эталонных бактериальных и вирусных растворимых антигенов, что, в конечном итоге, повышает эффективность данного способа. Since the antigen-antibody reaction takes place at a certain ratio, the obtained reference bacterial and viral soluble antigens are triturated, which ultimately increases the effectiveness of this method.
Раститровку осуществляют на специальных планшетках с лунками. Вначале все лунки заполняют физиологическим раствором в количестве 0,05 мл в каждой. Затем первый ряд лунок заполняют различными эталонными антигенами как бактериальными, так и вирусными (в зависимости от целей исследования) также в количестве по 0,05 мл в каждой лунке. Проводят титрование антигенов, получая кратные разведения 1: 2; 1:4; 1:8; 1:16; 1:32; 1:64; 1:128, путем последовательного перенесения взвеси в объеме 0,05 мл в каждую последующую лунку, оставляя последний ряд лунок с физраствором в качестве контроля. Заполнение лунок одними и теми же антигенами и раститровку антигенов проводят дважды для осуществления одновременного учета реакции как с цитратной кровью, так и с отмытыми эритроцитами. Rastitration is carried out on special plates with holes. Initially, all wells are filled with physiological saline in an amount of 0.05 ml each. Then the first row of wells is filled with various reference antigens, both bacterial and viral (depending on the objectives of the study), also in an amount of 0.05 ml in each well. Antigens are titrated to obtain 1: 2 multiple dilutions; 1: 4; 1: 8; 1:16; 1:32; 1:64; 1: 128, by sequentially transferring a suspension of 0.05 ml to each subsequent well, leaving the last row of wells with saline as a control. The wells are filled with the same antigens and the antigens are grown twice to simultaneously record the reaction with both citrated blood and washed red blood cells.
Осуществляют смешивание антигенов с исследуемым материалом. Для этого в первый набор раститрованных эталонных антигенов добавляют в каждую лунку по 0,05 мл 2,5%-ной взвеси цитратной крови исследуемого животного, а во второй набор тех же эталонных антигенов добавляют по 0,05 мл 2,5%-ной взвеси отмытых эритроцитов этого же животного. При этом контролем будет являться смесь исследуемого материала (2,5%-ная взвесь отмытых эритроцитов и 2,5%-ная взвесь цитратной крови) с физраствором в последних рядах лунок. Mixing antigens with the test material. For this purpose, 0.05 ml of a 2.5% suspension of the citrated blood of the test animal is added to each well of the first set of cultivated reference antigens, and 0.05 ml of a 2.5% suspension is added to the second set of the same reference antigens washed red blood cells of the same animal. In this case, the control will be a mixture of the test material (2.5% suspension of washed red blood cells and 2.5% suspension of citrate blood) with saline in the last rows of holes.
За положительный результат реакции принимают наличие осадка в виде зонтика с неровными краями по всей поверхности лунки. For the positive result of the reaction, the presence of a precipitate in the form of an umbrella with uneven edges over the entire surface of the hole is taken.
За отрицательный результат реакции принимают наличие осадка в виде пуговки или точки на две лунки. For a negative reaction result, the presence of a precipitate in the form of a button or a point in two holes is taken.
При этом реакция в контроле должна быть всегда отрицательна. In this case, the reaction in the control should always be negative.
Пример 1. Осуществляют отбор крови в количестве по 0,5 мл в пробирки с лимонно-кислым натрием от 10 безмолозивных поросят сразу после рождения. Example 1. A blood sample is taken in an amount of 0.5 ml per tube with citric acid sodium from 10 frost-free piglets immediately after birth.
Для приготовления 2,5%-ной взвеси цитратной крови к 0,1 мл крови каждого животного добавляют по 4 мл физраствора. К оставшемуся объему цитратной крови каждого животного добавляют физраствор в объеме 1:10 и осуществляют отмывание эритроцитов путем трехкратного центрифугирования каждой пробы в течение 10 мин со скоростью 3000 об/мин. Затем из полученного осадка готовят 2,5 %-ную взвесь путем добавления к 0,1 мл осадка каждой пробы 4 мл физраствора. To prepare a 2.5% suspension of citrated blood, 0.1 ml of saline is added to 0.1 ml of blood of each animal. Saline is added to the remaining citrate blood volume of each animal in a volume of 1:10 and erythrocytes are washed by three times centrifugation of each sample for 10 min at a speed of 3000 rpm. Then, from the obtained precipitate, a 2.5% suspension is prepared by adding 4 ml of saline to 0.1 ml of the precipitate of each sample.
Используют заранее приготовленный растворимые бактериальные антигены: стрептококковый, пастереллезный, сальмонеллезный, колибактериозный, а также вирусные антигены - вакцинный штамм чумы ("ЛК - ВНИИВВ и М") и вакцину против трансмиссивного гастроэнтерита свиней (ТГЭС) из штамма ВГНКИ, инактивированную при 37oC в течение 7 дней.Use a pre-prepared soluble bacterial antigens: strep, pasteurellosis, Salmonella, kolibakteriozno, as well as viral antigens - the vaccine strain Plague ( "LC - VNIIVV and M"), and a vaccine against transmissible gastroenteritis of pigs (TGES) from strain VGNKI inactivated at 37 o C within 7 days.
Проводят дважды для одного животного раститровку указанных шести антигенов в разведении 1:2; 1:4; 1:8; 1:16; 1:32; 1:64; 1:128 на планшетках с лунками путем добавления к 0,05 мл физраствора по 0,05 мл каждого из антигенов. В первый набор раститрованных антигенов добавляют по 0,05 мл 2,5%-ной взвеси цитратной крови исследуемого поросенка, а во второй набор раститрованных антигенов добавляют по 0,05 мл 2,5%-ной взвеси отмытых эритроцитов этого же поросенка. Через 1-1,5 ч производят учет результатов реакции. Twice, for one animal, the recitation of the indicated six antigens in a dilution of 1: 2; 1: 4; 1: 8; 1:16; 1:32; 1:64; 1: 128 on plates with wells by adding to 0.05 ml of saline, 0.05 ml of each of the antigens. In the first set of cultivated antigens, 0.05 ml of a 2.5% suspension of citrate blood of the test piglet is added, and in the second set of cultivated antigens, 0.05 ml of a 2.5% suspension of washed red blood cells of the same piglet is added. After 1-1.5 hours, the reaction results are recorded.
Результаты реакции у всех 10 поросят как с бактериальными, так и с вирусными антигенами в обоих случаях был отрицателен. Это свидетельствует об отсутствии иммуноглобулинов на поверхности эритроцитов в организме безмолозивных поросят. The reaction results for all 10 piglets with both bacterial and viral antigens were negative in both cases. This indicates the absence of immunoglobulins on the surface of erythrocytes in the body of non-colostered piglets.
Пример 2. Осуществляют отбор крови по 0,5-1 мл от 10 поросят 10-дневного возраста в пробирки с лимонно-кислым натрием. Подготовку исследуемого материала и его смешивание с растворимыми антигенами осуществляют в соответствии с описанным в примере 1. При этом в качестве антигенов используют те же, что и в примере 1. Example 2. A blood sampling of 0.5-1 ml from 10 piglets of 10 days of age is carried out in test tubes with citric acid sodium. Preparation of the test material and its mixing with soluble antigens is carried out as described in example 1. In this case, the same antigens as in example 1 are used.
Результат исследования поросят 10-дневного возраста, приведенный в табл. 1, свидетельствует о происходящей передаче от организма матери к поросенку колострального иммунитета к бактериальным и вирусным антигенам, а также о носительстве возбудителей инфекционных заболеваний в организме животного. В таблице в числителе указан результат реакции с отмытыми эритроцитами, а в знаменателе - с цитратной кровью. При этом положительные результаты реакции, указанные в табл. 1, представлены вне зависимости от разведения антигенов. The result of the study of piglets of 10 days of age, are given in table. 1, indicates the ongoing transmission from the mother’s body to the piglet of colostral immunity to bacterial and viral antigens, as well as the carriage of infectious pathogens in the animal’s body. The table in the numerator indicates the result of the reaction with washed red blood cells, and in the denominator - with citrate blood. In this case, the positive reaction results indicated in the table. 1 are presented regardless of the dilution of antigens.
Например, результат реакции цитратной крови со стафилококкозным антигеном у двух поросят положителен (см. пробы 1 и 8 табл. 1), а результат реакции отмытых эритроцитов с этим же антигеном отрицателен, что может свидетельствовать о наличии клеточного иммунитета к данному возбудителю. У этих же поросят результат реакции отмытых эритроцитов с вакцинным штаммом чумы положителен, а цитратной крови с этим же штаммом отрицателен, что может свидетельствовать о носительстве вируса чумы в организме животных. For example, the result of the reaction of citrate blood with a staphylococcal antigen in two piglets is positive (see
Пример 3. Осуществляют отбор крови по 0,5-1 мл от поросят 10-, 20-, 45- и 65-дневного возраста по 10 проб в каждой группе. Подготовку исследуемого материала, его смешивание с антигенами и учет результатов реакции ведут в соответствии с описанным в примерах 1 и 2. Example 3. A blood sampling of 0.5-1 ml from piglets of 10-, 20-, 45- and 65-day-olds of 10 samples in each group is carried out. Preparation of the test material, its mixing with antigens and consideration of the results of the reaction are carried out in accordance with those described in examples 1 and 2.
Результат исследований представлен в табл. 2, где произведены систематизация иммунного статуса животных и динамика его измельчения в зависимости от возрастных групп и инфицирования животных. При этом в числах указан процент положительно реагирующих животных либо не соответствующий фактор иммунитета, либо на носительство того или иного вида возбудителя. The research result is presented in table. 2, where systematization of the immune status of animals and the dynamics of its grinding, depending on age groups and infection of animals, were made. Moreover, the numbers indicate the percentage of positively reacting animals, either an inappropriate immunity factor or the carriage of one or another type of pathogen.
Исследования показали, что реакции у животных к бактериальным и вирусным антигенам в одних и тех же хозяйствах могут отличаться от этих же реакций в других хозяйствах, поскольку они являются отражением конкретной эпизоотической ситуации отдельных свиноводческих хозяйств. Studies have shown that reactions in animals to bacterial and viral antigens in the same farms may differ from the same reactions in other farms, since they are a reflection of the specific epizootic situation of individual pig farms.
Пример 4. Исследовались индивидуально 254 собаки. Так, в группе из 10 собак с различными клиническими признаками диареи проведено обследование на наличие вируса энтерита, чумы и гепатита. В опыте использованы собаки, невакцинированные в отношении данных возбудителей заболеваний. Example 4. We studied individually 254 dogs. So, in a group of 10 dogs with various clinical signs of diarrhea, an examination was performed for the presence of enteritis virus, plague and hepatitis. In the experiment, dogs unvaccinated with respect to these pathogens were used.
Подготовку исследуемого материала, его смешивание с вирусными антигенами и учет результатов реакции осуществляли в соответствии с примером 1. При этом в качестве вирусных антигенов использовали три: вакцину против чумы плотоядных, парвовирусный энтеритный антиген, гепатитный антиген. Результат исследований представлен в табл. 3. Preparation of the test material, its mixing with viral antigens and taking into account the results of the reaction was carried out in accordance with Example 1. In this case, three were used as viral antigens: a vaccine against carnivorous plague, parvovirus enteric antigen, and hepatitis antigen. The research result is presented in table. 3.
В таблице так же, как в примере 2, в числителе указан результат реакции с отмытыми эритроцитами, а в знаменателе - с цитратной кровью. In the table, as in example 2, the numerator shows the result of the reaction with washed red blood cells, and the denominator shows the result of citrate blood.
Из табл. 3 следует, что диагноз чумы подтвержден у четырех собак (см. пробы 1, 2, 3, 10 таблицы), поскольку выявлена активизация клеточного и системного иммунитета к возбудителю чумы. Диагноз энтерита подтвержден в одном случае (см. пробу 6 табл. 3), а диагноз гепатита подтвержден у пяти собак (см. пробы 4, 5, 7, 8, 9 таблицы). From the table. 3 it follows that the diagnosis of plague was confirmed in four dogs (see
Таким образом, в зависимости от физиологического состояния организма соотношение реакции цитратной крови с агглютинацией эритроцитов может характеризовать индивидуальное течение заболевания у отдельных видов животных. Thus, depending on the physiological state of the organism, the ratio of the reaction of citrated blood with agglutination of red blood cells can characterize the individual course of the disease in individual animal species.
Таким образом, заявляемый способ позволяет быстро и точно определять эпизоотическое состояние хозяйств по различным бактериальным и вирусным инфекциям. Кроме этого, с помощью данного метода возможно определение периода инфицирования животных, который позволяет своевременно осуществлять вакцинацию животных против соответствующего возбудителя. Thus, the claimed method allows you to quickly and accurately determine the epizootic condition of farms for various bacterial and viral infections. In addition, using this method, it is possible to determine the period of infection of animals, which allows timely vaccination of animals against the corresponding pathogen.
Заявляемый способ позволяет определять фон бактерио-и вирусоносительства, связь вирусоносительства с секундарной микрофлорой, а также напряженность и длительность пассивного и активного системного и клеточного иммунитета. The inventive method allows to determine the background of bacteriocarrier and virus carriers, the relationship of virus carrier with second microflora, as well as the intensity and duration of passive and active systemic and cellular immunity.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU96117140A RU2111492C1 (en) | 1996-08-23 | 1996-08-23 | Method of diagnosis of infectious disease in animals |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU96117140A RU2111492C1 (en) | 1996-08-23 | 1996-08-23 | Method of diagnosis of infectious disease in animals |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2111492C1 true RU2111492C1 (en) | 1998-05-20 |
| RU96117140A RU96117140A (en) | 1999-03-10 |
Family
ID=20184802
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU96117140A RU2111492C1 (en) | 1996-08-23 | 1996-08-23 | Method of diagnosis of infectious disease in animals |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2111492C1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010008315A1 (en) | 2008-07-17 | 2010-01-21 | Laskavy Vladislav Nikolaevich | Method for carrying out a qualitative preliminary instant diagnosis of oncological diseases |
-
1996
- 1996-08-23 RU RU96117140A patent/RU2111492C1/en active
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010008315A1 (en) | 2008-07-17 | 2010-01-21 | Laskavy Vladislav Nikolaevich | Method for carrying out a qualitative preliminary instant diagnosis of oncological diseases |
| EP2302384A4 (en) * | 2008-07-17 | 2011-09-14 | Vladislav Nikolaevich Laskavy | Method for carrying out a qualitative preliminary instant diagnosis of oncological diseases |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Klontz et al. | A study by the agar diffusion technique of precipitating antibody directed against blue tongue virus and its relation to homotypic neutralizing antibody | |
| Bale et al. | Serological and bacteriological study of bovine brucellae from livestock investigation and breeding centres in Nigeria | |
| RU2111492C1 (en) | Method of diagnosis of infectious disease in animals | |
| US4126671A (en) | Method for detecting bovine leukemia viral infection | |
| Maheswaran et al. | Pasteurclla multocida antigen-induced in vitro lymphocyte immunostimulation, using whole blood from cattle and turkeys | |
| RU2377962C1 (en) | Method for diagnostics of cattle leucosis | |
| RU2080061C1 (en) | Method of cattle selection for resistance to tuberculosis | |
| RU2490647C2 (en) | Differential diagnostic technique for brucellosis | |
| EP0366673A1 (en) | Immunoassay method. | |
| RU2810589C1 (en) | Method of performing an immunofluorescence reaction for diagnosing bovine leukemia | |
| RU2167673C1 (en) | Set for determining antibodies to egg yield drop syndrome-76 hen virus | |
| RU2263142C2 (en) | Method for preparing l-subcultures of brucella abortus, strain i-206 | |
| RU2625031C1 (en) | Immunoenzymometric test system for animals anaerobic enterotoxemia serum diagnostics and postvaccinal immunity stress control | |
| Newsome | Species-specific serological tests for bilharzia | |
| RU2257581C2 (en) | Method for obtaining erythrocytic diagnostic kit for reverse passive hemagglutination (rpg) at salmonellosis in animals | |
| RU2812350C1 (en) | Method of obtaining diagnostic serum against brucella in r-form | |
| RU2188036C1 (en) | Method for obtaining erythrocytic antigenic glanderous diagnostic kit | |
| RU2339038C2 (en) | Method of intravital diagnostics of trichinosis at carnivorous and omnivores | |
| SU1091908A1 (en) | Method of serologic diagnosis of brucellosis of horned cattle | |
| RU2110801C1 (en) | Pasteurellosis antibody erythrocyte diagnosticum and a method of its preparing | |
| RU2008919C1 (en) | Method for diagnostics of anthrax | |
| RU2741239C1 (en) | Diagnostic technique for cattle leukemia | |
| RU2749026C1 (en) | Method for diagnosis of isoimmunization in animals | |
| Spiridonov et al. | Results of studies on the development of an immuno-enzymed test system for diagnosing infectious enterotoxemia in animals | |
| SU1750687A1 (en) | Method for determining serologic diagnosis of brucellosis of cattle |