RU2199750C2

RU2199750C2 - Method for producing pest antigen suspension diagnosticum on the basis of fraction i

Info

Publication number: RU2199750C2
Application number: RU2001104762A
Authority: RU
Inventors: А.А. Зайцев
Original assignee: Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт
Priority date: 2001-02-20
Filing date: 2001-02-20
Publication date: 2003-02-27

Abstract

FIELD: medicine. SUBSTANCE: method involves sensitizing suspension of polyacrolein particles stained with pest microbe antigen of fraction I, stirring the mixture, heating to 70-80 C, precipitating and washing the diagnosticum. EFFECT: high sensitivity; prolonged storage time. 1 tbl

Description

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано в получении высокочувствительных и стабильных диагностикумов. The invention relates to microbiology and can be used to obtain highly sensitive and stable diagnostic kits.

Иммунологические свойства диагностикума во многом зависят от выбора носителя, на котором иммобилизованы антигены или антитела. The immunological properties of a diagnosticum largely depend on the choice of carrier on which antigens or antibodies are immobilized.

Известно, что наиболее приемлемым носителем являются полиакролеиновые (ПА) частицы. Диагностикумы, изготовленные на их основе, имеют больше преимущества перед эритроцитарными, полистироловыми и др. по специфичности и чувствительности. [Пат. РФ 2012888, G 01 N 33/537, от 15.05.94. Бюл. 9; Пат. РФ 2092852, G 01 N 33/53, от 10.10.97. Бюл. 28]. It is known that the most acceptable carrier are polyacrolein (PA) particles. Diagnostics made on their basis have more advantages over erythrocyte, polystyrene, and others in specificity and sensitivity. [Pat. RF 2012888, G 01 N 33/537, dated 05/15/94. Bull. 9; Pat. RF 2092852, G 01 N 33/53, dated 10.10.97. Bull. 28].

Наиболее близким к заявляемому является способ получения антигенного диагностикума с использованием в качестве носителя окрашенных полиакролеиновых частиц [Зайцев А.А. К вопросу об аффинности моноклональных антител к фракции 1 чумного микроба /Ставрополь, 1992.-14 с.- Библиогр.: 18 назв. - Деп. в ВИНИТИ 17.06.92, 2001-В92 //Депонированные науч. работы: (Естеств. и точные науки, техника). - М., 1992. - 10 (252). - С.15-166]. Способ осуществляется следующим образом. В фосфатно-буферную суспензию с рН 7,0-7,4 полиакролеиновых частиц с диаметром 0,3-2,0 мкм добавляют суспензию фракции I чумного микроба при соотношении 0,1-0,3 мг антигена на 100 г носителя. Смесь выдерживают 3 ч с периодическим перемешиванием, осаждают и дважды промывают осадок физиологическим раствором. Полученный диагностикум диспергируют в защитной среде и лиофильно высушивают. Closest to the claimed is a method for producing an antigenic diagnosticum using colored polyacrolein particles as a carrier [Zaitsev A.A. To the question of the affinity of monoclonal antibodies to fraction 1 of the plague microbe / Stavropol, 1992.-14 pp. - Bibliography: 18 titles. - Dep. at VINITI 06/17/92, 2001-B92 // Deposited scientific. work: (Natural and exact sciences, technology). - M., 1992 .-- 10 (252). - S.15-166]. The method is as follows. In a phosphate-buffered suspension with a pH of 7.0-7.4 polyacrolein particles with a diameter of 0.3-2.0 μm, a suspension of the plague microbe fraction I is added at a ratio of 0.1-0.3 mg of antigen per 100 g of carrier. The mixture was incubated for 3 hours with periodic stirring, precipitated and washed twice with physiological saline. The resulting diagnosticum is dispersed in a protective medium and freeze-dried.

Недостатком прототипа является низкая стабильность жидкого диагностикума, приводящая к потере чувствительности при использовании в реакции непрямой суспензионной агглютинации (РНСА) в 4-8 и более раз в течение 14-30 суток. The disadvantage of the prototype is the low stability of the liquid diagnosticum, leading to loss of sensitivity when used in the reaction of indirect suspension agglutination (RNCA) 4-8 or more times for 14-30 days.

Технический результат изобретения заключается в повышении чувствительности и срока сохранения активности диагностикума. The technical result of the invention is to increase the sensitivity and shelf life of the diagnosticum.

Указанный технический результат достигается тем, что способ включает сенсибилизацию суспензии окрашенных полиакролеиновых частиц антигеном чумного микроба, перемешивание смеси в течение 3 ч, осаждение и отмывку диагностикума, отличающийся тем, что сенсибилизацию проводят антигеном фракции 1 чумного микроба при соотношении 0,1-0,3 мг антигена на 100 мг полиакролеиновых частиц в 0,1 М фосфатно-солевом буфере рН 7,0-7,4 и смесь дополнительно подвергают нагреванию до 70-80^oС, перемешивают в течение 30-40 мин и отделяют несвязавшийся с частицами антиген фракции 1 отмывкой 0,1 М фосфатно-солевым буфером рН 7,0-7,4.The specified technical result is achieved in that the method includes sensitizing a suspension of colored polyacrolein particles with a plague microbe antigen, stirring the mixture for 3 hours, sedimenting and washing the diagnosticum, characterized in that the sensitization is carried out with a plague microbe fraction 1 antigen in a ratio of 0.1-0.3 mg of antigen per 100 mg of polyacrolein particles in 0.1 M phosphate-buffered saline pH 7.0-7.4 and the mixture is further heated to 70-80 ^o C, stirred for 30-40 minutes and the antigen unbound to the particles is separated fraction 1 by washing with 0.1 M phosphate-buffered saline pH 7.0-7.4.

По отношению к прототипу заявляемый способ имеет следующие отличительные признаки. In relation to the prototype of the claimed method has the following distinctive features.

Дополнительная термическая обработка суспензии носителя и антигена при 70-80^oС в течение 30-40 мин приводит к разрушению нестабильных биополимеров фракции I. Отколовшиеся от фиксированных на носителе молекул фракции I фрагменты антигена являются иммунологически активными и вступают в конкуренцию с самим диагностикумом за связывание с антителами, что приводит к снижению чувствительности данного диагностикума в РНСА. Чтобы избежать этого негативного явления, отколовшиеся фрагменты антигена либо ковалентно связывают с носителем, либо удаляют путем центрифугирования.Additional heat treatment of the suspension of the carrier and antigen at 70-80 ^o C for 30-40 minutes leads to the destruction of unstable biopolymers of fraction I. The antigen fragments that break off from the molecules of fraction I fixed on the carrier are immunologically active and compete with the diagnostic itself for binding to antibodies, which leads to a decrease in the sensitivity of this diagnosticum in RNCA. To avoid this negative phenomenon, the breakaway antigen fragments are either covalently bound to the carrier or removed by centrifugation.

Без предварительной термической обработки на носителе находится много нестабильных биополимеров фракции I. Поэтому в таком диагностикуме процесс накопления иммунологически активных биополимеров, не связанных с носителем, идет быстро, что соответственно ведет и к снижению его серологической активности в РНСА. Without preliminary heat treatment, there are many unstable biopolymers of fraction I on the carrier. Therefore, in this diagnostic process, the accumulation of immunologically active biopolymers not associated with the carrier proceeds quickly, which accordingly leads to a decrease in its serological activity in RNCA.

Предлагаемый способ способствует повышению стабильности и чувствительности целевого продукта. The proposed method helps to increase the stability and sensitivity of the target product.

Заявляемые температурные и временные параметры необходимы и достаточны для достижения технического результата, так как повышение температуры выше 80^oС приводит к снижению серологической активности антигена, а при снижении ниже 70^oС и обработке менее 30 мин не достигается необходимый эффект.The claimed temperature and time parameters are necessary and sufficient to achieve a technical result, since increasing the temperature above 80 ^o C leads to a decrease in the serological activity of the antigen, and when lowering below 70 ^o C and processing less than 30 minutes the desired effect is not achieved.

Возможность практического использования заявляемого способа подтверждается примерами его конкретного выполнения. The possibility of practical use of the proposed method is confirmed by examples of its specific implementation.

Пример 1. 2 мл 5%-ной суспензии ПА носителя с размерами частиц 1,2-1,8 мкм смешивают с 0,2-0,3 мг фракцией IA или IB чумного микроба в 2 мл 0,1 М фосфатно-солевого буфера (ФСБ) рН 7,2. Смесь выдерживают 3 ч при температуре (22±4)^oС и периодически помешивают, осаждают и дважды промывают в ФСБ рН 7,2. Полученный диагностикум диспергируют в 40 мл ФСБ рН 7,2, содержащего 1-2% формалина. Жидкий препарат хранят в темном месте при 4-6^oС.Example 1. 2 ml of a 5% suspension of PA carrier with particle sizes of 1.2-1.8 μm are mixed with 0.2-0.3 mg of plague microbe fraction IA or IB in 2 ml of 0.1 M phosphate-buffered saline (FSB) pH 7.2. The mixture was incubated for 3 hours at a temperature of (22 ± 4) ^o C and periodically stirred, precipitated and washed twice in FSB pH 7.2. The resulting diagnosticum is dispersed in 40 ml of FSB pH 7.2, containing 1-2% formalin. The liquid preparation is stored in a dark place at 4-6 ^o C.

Серологическую активность препарата определяют в РНСА. В лунках 96-луночных планшет с U-образными лунками готовят по 0,05 мл последовательных двукратных разведении чумной агглютинирующей сыворотки в 0,05 М ФСБ рН 7,0-7,4. Затем в лунки вносят по одной капле суспензии диагностикума. Serological activity of the drug is determined in RNA. In wells of 96-well plates with U-shaped wells, 0.05 ml of serial double dilutions of plague agglutinating serum in 0.05 M FSB pH 7.0-7.4 are prepared. Then, one drop of a suspension of the diagnosticum is added to the wells.

Микропланшету встряхивают, оставляют в покое при температуре (22±4)^oС и через 2-3 ч учитывают результат реакции по феноменам "зонтик"- "пуговка". Диагностикум выявляет антитела в титре 1:200 тыс.-1:400 тыс.The microplate is shaken, left alone at a temperature of (22 ± 4) ^o C and after 2-3 hours the result of the reaction according to the phenomena of "umbrella" - "button" is taken into account. Diagnosticum reveals antibodies in the titer of 1: 200 thousand -1: 400 thousand

С целью экспресс-диагностики ставят РНСА на стекле. For the purpose of rapid diagnosis, RNAA is placed on glass.

На обезжиренное предметное стекло наносят 1-2 капли исследуемой сыворотки и 1 каплю диагностикума. Пробу тщательно перемешивают и через 2-5 мин учитывают результат реакции. При наличии в пробе специфических антител к фракции I чумного микроба наблюдается агглютинация полиакролеиновых микросфер. В контроле суспензия диагностикума остается гомогенной. 1-2 drops of test serum and 1 drop of diagnosticum are applied to fat-free glass slide. The sample is thoroughly mixed and after 2-5 minutes the result of the reaction is taken into account. In the presence of specific antibodies to the plague microbe fraction I in the sample, agglutination of polyacrolein microspheres is observed. In the control, the suspension of the diagnosticum remains homogeneous.

Пример 2. Получение диагностикума чумного полиакролеинового антигенного жидкого, а также постановку серологических реакций с ним проводили аналогично способу, описанному в примере 1, за исключением того, что после сенсибилизации фракцией I полиакролеиновых микросфер в течение 3 ч полученную суспензию дополнительно прогревали при 70-80^oС и перемешивали в течение 30-40 мин.Example 2. Obtaining a diagnostic plague of plague polyacrolein antigenic liquid, as well as staging serological reactions with it was carried out similarly to the method described in example 1, except that after sensitization with fraction I of polyacrolein microspheres for 3 hours, the resulting suspension was additionally heated at 70-80 ^o C and stirred for 30-40 minutes.

В таблице приведены сравнительные показатели чувствительности и стабильности диагностикумов, полученных по способам прототипа и заявляемому. The table shows comparative indicators of the sensitivity and stability of the diagnostic kits obtained by the methods of the prototype and the claimed.

Таким образом, заявляемый способ имеет преимущества перед прототипом, так как обеспечивает получение чумного полиакролеинового антигенного диагностикума с более высокой чувствительностью и сроком сохранения активности. Thus, the inventive method has advantages over the prototype, as it provides plague polyacrolein antigenic diagnosticum with higher sensitivity and shelf life.

Claims

A method of obtaining a plague antigenic diagnosticum, comprising sensitizing a suspension of colored polyacrolein particles with a plague microbe antigen, stirring the mixture for 3 hours, sedimenting and washing the diagnosticum, characterized in that the sensitization is carried out with the plague microbe fraction I antigen in a ratio of 0.1-0.3 mg of antigen 100 mg poliakroleinovyh particles in 0.1M phosphate buffered saline pH 7.0-7.4 and the mixture was further subjected to heating up to 70-80 ^o C, stirred for 30-40 min and was separated from unbound antigen particles coat ii I by washing with 0.1 M phosphate-buffered saline pH 7.0-7.4.