RU2197945C2 - ПРИМЕНЕНИЕ ПО МЕНЬШЕЙ МЕРЕ ОДНОГО ЭКСТРАКТА РАСТЕНИЯ ИЗ РОДА Chrysanthemum ДЛЯ СТИМУЛЯЦИИ ПИГМЕНТАЦИИ КОЖИ И/ИЛИ ВОЛОС - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к средству для увеличения пигментации кожи и/или волос и к средству для стимуляции меланогенеза. Оба средства состоят из по меньшей мере одного экстракта по меньшей мере одного растения рода Chrysanthemum, а также к способу косметической обработки для увеличения пигментации кожи и/или волос. Технический результат: средство активно влияет на меланогенез кожи и/или волос и стимулирует пигментацию кожи и/или волос без вредных побочных эффектов. 3 с. и 12 з.п. ф-лы, 1 табл.

Description

Изобретение относится к применению по меньшей мере одного экстракта по меньшей мере одного растения рода Chrisanthemum в композиции, стимулирующей пигментацию кожи и/или волос.

Цвет волос и кожи человека зависит от различных факторов и, в частности, от времени года, расы, пола и возраста. В основном он определяется концентрацией в кератиноцитах меланина, производимого меланоцитами. Меланоциты - это специализированные клетки, которые через особые органеллы, меланосомы, синтезируют меланин.

Синтез меланина, или меланогенез, является сложным процессом и состоит из следующих основных этапов, представленных схематически:
Тирозин-->Дигидроксифенилаланин-->Дигидроксифенилаланинхинон-->Дигидроксифенилаланинхром-->Меланин
Тирозиназа (монофенолдигидроксилфенилаланин: кислород-оксидоредуктаза/ЕС 1, 14, 18, 1) является основным ферментом, принимающим участие в этой последовательности реакций. Именно она катализирует реакцию превращения тирозина в дигидроксифенилаланин и реакцию превращения дигидроксифенилаланина в дигидроксифенилаланинхинон.

В эпидермисе меланоцит находится в меланиновой эпидермической единице, которая содержит меланоцит, окруженный примерно 36 соседними кератиноцитами. Каждый индивидуум, независимо от фототипа, содержит приблизительно одно и то же число меланоцитов на одном определенном участке кожи. Этнические различия в плане пигментации не зависят от числа меланоцитов, а являются следствием свойств их меланосом. Меланосомы объединены в комплексы и имеют небольшой размер. Это высокоспециализированные органеллы, единственной функцией которых является продукция меланина. Они происходят из эндоплазмической сети в виде сферических вакуолей, называемых премеланосомами. Премеланосомы содержат аморфный протеиновый субстрат, но не содержат меланогенных ферментов. Во время созревания премеланосомы аморфный субстрат организуется в фибриллярную структуру, направленную вдоль продольной оси меланосомы. Различают четыре этапа развития меланосомы, соответствующие интенсивности меланизации. Меланин равномерно откладывается на внутренней фибриллярной сети меланосомы и мутность органеллы увеличивается вплоть до насыщения. По мере того как меланин синтезируется в меланосомах, они перемещаются из перинуклеарной области к окончаниям дендритов меланоцитов. Через фагоцитоз окончания дендритов захватываются кератиноцитами, мембраны разрушаются и меланосомы перераспределяются в кератиноцитах.

Хотя уровень меланина в разных популяциях неодинаков, количество тирозиназы варьирует незначительно и количество информационной РНК, кодирующей тирозиназу, одинаков в белых и черных кожах. Изменения в меланогенезе, таким образом, являются следствием различий либо активности тирозиназы, либо способности кератиноцитов фагоцитировать меланосомы.

Известно, что для большинства популяций очень важно сохранить коричневую окраску кожи и поддерживать постоянным цвет волос.

Между тем, существуют болезни пигментации, такие как, например, витилиго, которое является аутоимунным заболеванием, которое характеризуется появлением белых пятен на коже, связанных с нарушением пигментации.

Таким образом, существует реальная необходимость в продукте, упрощающем и/или улучшающем пигментацию кожи и/или волос.

Было найдено множество решений в области искусственного окрашивания, использующих экзогенные красители, придающие коже и/или волосам окраску, наиболее приближенную к натуральной или в области естественного окрашивания путем стимуляции естественных средств пигментации.

Например, в документах WO-A-9517161, WO-9511003, WO-A-9501773, WO-A-9404674, WO-A-9404122, EP-A-585018, WO-A-9310804, WO-A-9220322 или WO-A-9107945 были предложены такие разнообразные решения, как композиции, содержащие ингибитор фосфодиэстеразы, а также применение простагландинов, фрагментов ДНК и производных тирозина.

С помощью решений, предложенных в предшествующем уровне техники, были получены отличные результаты, но используемые соединения часто приводят к побочным эффектам, на которые нельзя не обращать внимания, или же они представляют собой сложные смеси, не имеющие специфичности.

Главная цель исследований - найти вещество, воздействующее на пигментацию кожи и/или волос без вредных побочных эффектов.

Заявитель обнаружил, что по меньшей мере один экстракт по меньшей мере одного растения из рода Chrysanthemum активно влияет на меланогенез.

Растения рода Chrysanthemum в предшествующем уровне техники использовались в композициях, имеющих обесцвечивающие свойства (JP 07025745, JP 07025746), в композициях, способствующих росту волос, и/или в композициях, используемых для борьбы с выпадением волос (FR 2659014, ЕР 569667, DE 4330597, DE 4312109, JP 8081336, JP 84154598, JP 02048514), в композициях для борьбы с перхотью (KR 9006824, JP 62153211) или в композициях для поддержания эластичности, влажности и блеска кожи (JP 62048611).

Объектами заявок на патент CN 1094278 и CN 1094279 являются композиции для естественной обработки волос. Эти композиции имеют разнообразные свойства (улучшение внешнего вида волос, фиксация, активирование циркуляции крови и роста волос, имеют бактерицидные, противозудные свойства, способствуют борьбе с перхотью), среди которых упоминается действие против седых волос. Эти композиции являются смесью 2 компонентов, каждый из которых состоит из экстрактов по меньшей мере 9 растений, причем ни одно из многочисленных вышеназванных свойств нельзя присвоить только одной из вышеназванных композиций и не присвоить другой.

Насколько известно заявителю, никогда не заявлялось применение в качестве активного начала экстракта растения из рода Chrysanthemum для стимуляции пигментации кожи и/или волос.

Поэтому объектом данного изобретения является применение в косметической композиции или для получения фармацевтической композиции, в качестве активного начала, достаточного количества по меньшей мере одного экстракта по меньшей мере одного растения рода Chrysanthemum, причем этот экстракт или композиция предназначены для увеличения пигментации кожи и/или волос.

Изобретение относится также к применению в косметической композиции или для получения фармацевтической композиции, в качестве активного начала, достаточного количества по меньшей мере одного экстракта по меньшей мере одного растения рода Chrysanthemum для стимуляции меланогенеза.

Экстрактом по меньшей мере одного растения рода Chrysanthemum может быть любой экстракт, полученный из любого растительного материала, взятого из растения рода Chrysanthemum.

Композиция может содержать по меньшей мере один экстракт по меньшей мере одного растения рода Chrysanthemum, полученный из материала растения, выращенного в естественных условиях (in vivo) или культуры, выращенной в лабораторных условиях (in vitro).

Под культурой in vivo понимают любую культуру классического типа, то есть выращенную на почве на открытом воздухе или в теплице, или же вне грунта.

Согласно изобретению можно использовать, например, экстракт различных частей растения: листьев, цветов, стеблей, корней, недифференцированных клеток, по отдельности или в смеси, независимо от того, выращено растение in vivo или in vitro.

Соблюдение физико-химических условий во время роста клеток растений in vitro позволяет получить стандартизованный растительный материал, имеющийся в наличии в течение всего года в отличие от растений, выращенных in vivo.

Под культурой in vitro понимают совокупность методик, известных специалисту, которые позволяют искусственным образом получить растение или часть растения.

Предпочтительно используют экстракт, полученный из растительного материала, выращенного in vivo, и еще более предпочтительно, экстракт, полученный из листьев растений рода Chrysanthemum, выращенных in vivo.

Род Chrysanthemum принадлежит к семейству Compositae, которое в свою очередь принадлежит к порядку Asteracae.

Род Chrysanthemum содержит около 200 видов, европейского и азиатского происхождения, среди которых можно назвать Chrysanthemum hortorum, Chrysanthemum morifolium, Chrysanthemum coronarium, Chrysanthemum myconis, Chrysanthemum sagitum, Chrysanthemum indicum или же Chrysanthemum segetum.

Предпочтительно, согласно изобретению используют растение из вида Chrysanthemum morifolium.

Вид Chrysanthemum morifolium насчитывает множество разновидностей, среди которых можно назвать разновидность sinense, предпочтительно используемую согласно изобретению.

Под экстрактом по меньшей мере одного растения рода Chrysanthemum понимают как необработанную смесь грубо измельченных частей растения и экстрагирующего растворителя, так и препараты, полученные из активных начал, растворяемых при экстрагировании. В частности, экстракт, используемый согласно изобретению, получают путем тонкого измельчения частей растения, с последующей мацерацией в экстрагирующем растворителе и с конечной фильтрацией. Очевидно, что экстрактом согласно изобретению может быть любой из полученных таким образом экстрактов, используемый самостоятельно или в смеси с одним или несколькими другими экстрактами.

Согласно изобретению может быть использован любой метод экстракции, известный специалисту.

Можно, в частности, назвать водные экстракты, спиртовые, например, этанольные, и водноспиртовые экстракты.

Какой бы ни была форма экстракта, который хотят использовать, способы его получения являются, в основном, способами, описанными в предыдущем уровне техники и хорошо известные специалисту.

Можно также использовать экстракт, полученный способом, описанным во французской заявке 95-02379.

На первой стадии этого способа растительный материал измельчают в водном растворе на холоде, на второй стадии суспендированные частицы удаляют из водного раствора, полученного на первой стадии, и на третьей стадии стерилизуют водный раствор, полученный на второй стадии.

Полученный водный раствор соответствует экстракту.

С другой стороны, первая стадия может быть заменена операцией простого замораживания растительных тканей (например, при - 20^oС), за которой следует водное экстрагирование, включающее вышеназванные вторую и третью стадии.

Каким бы ни был способ получения, используемый согласно изобретению, к вышеназванным стадиям могут быть добавлены последующие стадии, цель которых способствовать консервации и/или стабилизации, не изменяя при этом саму природу экстракта.

Например, полученный экстракт может быть лиофилизован любым классическим способом лиофилизации. Таким образом получают порошок, который можно использовать непосредственно или смешивать с соответствующим растворителем перед использованием.

Предпочтительно, согласно изобретению, используют водный экстракт.

Подробно описанные и используемые согласно изобретению способы получения экстракта представлены в примерах.

Количество экстракта по меньшей мере одного растения рода Chrysanthemum, содержащееся в композиции по изобретению, зависит от искомого эффекта и от формы экстракта, используемого в композиции. Поэтому, оно может меняться в широких пределах.

Какова бы ни была природа композиции, количество содержащегося в ней экстракта по меньшей мере одного растения рода Chrysanthemum может составлять от 0,01 до 15% от общего веса композиции и, предпочтительно, от 1 до 5% от общего веса композиции.

Композиции согласно изобретению главным образом предназначены для увеличения пигментации кожи и/или волос и/или для стимуляции меланогенеза. Какова бы ни была ее природа, композиция согласно изобретению наносится в основном на кожу (на всю поверхность кожи) и/или на волосы.

В зависимости от назначения композиция по изобретению может представлять собой любую обычно используемую галеновую форму.

Для топического нанесения на кожу композиция, в частности, может иметь форму водного или масляного раствора или дисперсии в виде лосьона или сыворотки, форму эмульсий с жидкой или полужидкой консистенцией типа молочка, полученных путем дисперсии жирной фазы в водной фазе (Н/Е) или наоборот (Е/Н), или форму суспензий или эмульсий мягкой консистенции типа водного или безводного крема или геля, или форму микрокапсул или микрочастиц, а также везикулярных дисперсий ионного и/или неионного типа. Эти композиции получают обычными способами.

Композиции согласно изобретению могут быть назначены для нанесения на волосы в форме водных, спиртовых или водноспиртовых растворов, в форме кремов, гелей, эмульсий, муссов или же в форме аэрозольных композиций, также содержащих пропеллент под давлением.

Количество различных компонентов в композициях согласно изобретению является традиционным для рассматриваемых областей применения.

Эти композиции составляют, в частности, очищающие, защитные кремы, кремы для обработки и ухода за лицом, кремы для рук, ног, для больших анатомических складок или для тела (например, ночные, дневные кремы, кремы для снятия макияжа, тональные кремы, солнцезащитные кремы), жидкая пудра, молочко для снятия макияжа, питающее или защитное молочко для тела, солнцезащитное молочко, лосьоны, гели или муссы для ухода за кожей, такие как очищающие лосьоны, солнцезащитные лосьоны и лосьоны для искусственного загара, композиции для ванн, дезодорирующие композиции, включающие бактерицидное вещество, гели или лосьоны, используемые после бритья, кремы для эпиляции, композиции, защищающие от укусов насекомых, болеутоляющие композиции, композиции для лечения некоторых болезней кожи, таких как экзема, розовые угри, псориаз, лишай, зуд.

Композиции согласно изобретению могут также представлять собой твердые препараты, входящие в состав мыла или чистящих средств.

Они могут быть также представлены в виде аэрозольных композиций, содержащих пропеллент под давлением.

Композиция по изобретению также может быть предназначена для ухода за волосами и иметь, в частности, форму шампуня, лосьона для укладки, лечебного лосьона, крема или геля для создания прически, она может быть красящей композицией (в частности, для окислительного окрашивания), и при необходимости, иметь форму красящих шампуней, восстановительных лосьонов для волос, и композицией для перманента, лосьонов или гелей против выпадения волос, противопаразитарного шампуня и т.п.

Если композиция представлена в виде эмульсии, жирная фаза может составлять от 5 до 80 вес.%, предпочтительно от 5 до 50 вес.% по отношению к общему весу композиции. Масла, воски, эмульгаторы и коэмульгаторы, используемые в композиции в виде эмульсий, выбирают среди обычно используемых в области косметики. Содержание в композиции эмульгатора и коэмульгатора составляет от 0,3 до 30 вес.%, предпочтительно от 0,5 до 20 вес.% относительно общего веса композиции. Кроме того, композиция может содержать липидные везикулы.

Если композиция является раствором или масляным гелем, жирная фаза может составлять более 90% общего веса композиции.

Косметическая композиция может также содержать добавки, обычно используемые в области косметики, такие как гидрофильные или липофильные гелеобразующие вещества, гидрофильные или липофильные добавки, консерванты, антиоксиданты, растворители, отдушки, наполнители, фильтры, поглотители запахов и красящие вещества. Количество этих различных добавок составляет столько, сколько обычно используют в области косметики, например, от 0,01 до 10 вес.% от общего веса композиции. Эти добавки, в зависимости от их природы, могут вводиться в жирную фазу, в водную фазу и/или в липидные сферические коллоидные частицы.

В качестве масел или восков, используемых согласно изобретению, можно назвать минеральные масла (вазелиновое масло), растительные масла (жидкая фракция масла сального дерева, масло подсолнечника), животные масла (пергидросквален), синтетические масла (масло Purcellin), силиконовые масла или воски (циклометикон), фторированные масла (перфторполиэфир), пчелиный воск, воск карнауба или парафин. Можно добавить к этим маслам жирные спирты или жирные кислоты (стеариновая кислота).

В качестве эмульгаторов, используемых согласно изобретению, можно назвать, например, стеарат глицерина, полисорбат 60 и смесь РЕG-6/РЕG-32/Гликоль Стеарат, выпускаемую под названием Tefose^R 63 фирмой Gatefosse.

В качестве растворителей, используемых в изобретении, можно назвать спирты низшего ряда, в частности, этанол и изопропанол, пропиленгликоль.

В качестве гидрофильных гелеобразователей, используемых согласно изобретению, можно назвать карбоксивиниловые полимеры (карбомеры), акриловые сополимеры, такие как сополимеры акрилатов/алкилакрилатов, полиакриламиды, полисахариды, такие как гидроксипропилцеллюлоза, натуральные смолы и глины, и, в качестве липофильных гелеобразующих веществ, можно назвать модифицированные глины, такие как бентоны, соли жирных кислот с металлами, такие как стеараты алюминия и гидрофобный кремнезем, этилцеллюлозу, полиэтилен.

Композиция может содержать другие активные гидрофильные вещества, такие как протеины или гидролизаты протеинов, аминокислоты, полиолы, мочевина, аллантоин, сахара и производные сахара, водорастворимые витамины, растительные экстракты и гидроксикислоты.

В качестве липофильных активных веществ можно использовать ретинол (витамин А) и его производные, токоферол (витамин Е) и его производные, эфирные жирные кислоты, керамиды, эфирные масла, салициловую кислоту и ее производные.

Согласно изобретению композиция может содержать другие активные вещества, предназначенные, в частности, для профилактики и/или лечения кожных заболеваний. В качестве примера активных веществ можно назвать:
- вещества, уменьшающие дифференцировку и/или пролиферацию клеток кожи, такие как ретиноевая кислота и ее изомеры, ретинол и его сложные эфиры, витамин Д и его производные, эстрогены, такие как эстрадиол;
- антибактериальные средства, такие как фосфат клиндамицина, эритромицин или антибиотики класса тетрациклинов;
- противопаразитарные средства, в частности, метронидазол, кротамитон или пиретриноиды;
- противогрибковые средства, в частности, соединения, принадлежащие к классу имидазолов, такие как эконазол, кетоконазол или миконазол или их соли, полиеновые соединения, такие как амфотерицин В, соединения ряда аллиламинов, такие как тербинафин или же остопирокс;
- антивирусные вещества, такие как ацикловир;
- противовоспалительные стероидные вещества, такие как гидрокортизон, валерат бетаметазона или пропионат клобетазола, или противовоспалительные нестероидные вещества, такие как ибупрофен и его соли, диклофенак и его соли, ацетилсалициловая кислота, ацетаминофен или глициретиновая кислота;
- анестезирующие вещества, такие как хлоргидрат лидокаина и его производные;
- противозудные вещества, такие как теналдин, тримепразин или ципрогептадин;
- кератолитические вещества, такие как α- и β-гидроксикарбоновые кислоты или β-цетокарбоновые кислоты, их соли, амиды или сложный эфиры и, в частности, гидроксикислоты, такие как гликолевая кислота, молочная кислота, салициловая кислота, лимонная кислота, а также фруктовые кислоты, и н-октаноил-5-салициловая кислота;
- вещества, препятствующие образованию свободных радикалов, такие как α-токоферол или его сложные эфиры, супероксиддисмутазы, некоторые хелатообразователи металлов или аскорбиновая кислота и ее сложные эфиры;
- противосеборейные вещества, такие как прогестерон;
- вещества, препятствующие образованию перхоти, такие как остопирокс или пиритион цинка;
- вещества для уничтожения угрей, такие как ретиноевая кислота или пероксид бензоила;
- вещества, способствующие пигментации кожи и/или волос, такие как, например, субстраты по меньшей мере одного фермента, обладающего активностью тирозиназы, как, например, тирозин или его производные или дигидрокси-3,4-фенил-α-аланин (DOPA), производные пиримидин 3-оксида, замещенные в положении 6, как, например, описанные в заявке на патент, поданной заявителем во Франции под номером 96-11316, и соответствуют общей формуле (I):

в которой
R₁ и R₂ одинаковые или разные, означают атом водорода или радикал C₁-C₁₂ алкил;
R₃ и R₄ одинаковые или разные, означают радикал C₁-C₁₂ алкил или, взятые вместе, могут образовывать гетероцикл с атомом азота, с которым они связаны,
при условии, что если R₃ и R₄, взятые вместе, образуют пиперидиновый цикл, тогда по меньшей мере один из радикалов R₁ или R₂ не означает атом водорода, среди которых можно, в частности, назвать:
2-амино-4-пропиламино-6-диметиламинопиримидин-3-оксид,
2-амино-4-метиламино-6-пиперидинопиримидин-3-оксид,
2,4-бис-пропиламино-6-диметиламинопиримидин-3-оксид,
2,4-бис-пропиламино-6-пиперидинопиримидин-3-оксид,
2,4-бис-метиламино-6-диметиламинопиримидин-3-оксид,
2,4-бис-этиламино-6-диметиламино-пиримидин-3-оксид,
экстракты бактериального происхождения, такие как, например, экстракты нитевидных нефотосинтезирующих бактерий, такие как, например, экстракты Vltreoscilla filiformis.

Композиция согласно изобретению может также содержать по меньшей мере одно вещество, выбираемое из антибактериальных веществ, антипаразитарных, противогрибковых, антивирусных, противовоспалительных, противозудных, анестетических, кератолитических, препятствующих образованию свободных радикалов, противосеборейных, препятствующих образованию перхоти или угрей, веществ, модулирующих дифференцировку и/или пролиферацию клеток и/или веществ, способствующих пигментации кожи и/или волос.

Можно также получить композицию в липосомной форме, как например, описано в заявке WO 94/22468, поданной 13 октября 1994 года фирмой Anti Cancer Inc. Соединение, инкапсулированное в липосомы, может быть селективно применено на уровне волосяной луковицы.

Объектом изобретения является также способ косметической обработки для улучшения пигментации кожи и/или волос, состоящий в нанесении на кожу и/или волосы косметической композиции, включающей по меньшей мере один экстракт по меньшей мере одного растения рода Chrysanthemum, в косметически приемлемой среде.

Под косметически приемлемой средой понимают среду, совместимую с кожей, слизистыми, ногтями, волосами.

В качестве иллюстрации ниже приводятся примеры, которые никоим образом не ограничивают объем изобретения.

Пример 1
Получение экстракта Chrysanthemum morifolium, разновидность sinense
Листья растения Chrysanthemum morifоlium, разновидность sinensе, выращенного в теплице, снимают и высушивают в течение 48 часов в вентилируемых сушильных камерах при температуре 45^oС.

Высушенные листья затем измельчают в порошок с помощью ножевого измельчителя типа Culatti.

Полученный порошок просеивают через сито, диаметр отверстий которого равен 1 мм.

Именно этот просеянный порошок используют для получения экстракта.

Протокол 1:
Порошок смешивают с водным экстрагирующим растворителем, состоящим из культуральной клеточной среды DMEM/F 12,3:1, выпускаемой фирмой Life Thecnologies, из расчета концентрации 5 г сухого порошка на 100 мл растворителя. Смесь перемешивают в течение 4 часов при комнатной температуре. Затем смесь центрифугируют со скоростью 1000 об/мин в течение 8 минут, а супернатант отбирают и подвергают 2 таким же циклам центрифугирование/отбор.

Последний отобранный супернатант фильтруют на фильтре 0,22 мкм типа Millipore в асептических условиях с целью его стерилизации и сохраняют при температуре 4^oС до момента использования.

Протокол 2:
Порошок перемешивают со стерильной деминерализованной водой, имеющей рН 6,5, из расчета концентрации 2,5 г сухого порошка на 100 мл воды. Смесь перемешивают в течение 30 минут при комнатной температуре. Затем смесь фильтруют на мембранах GFD фирмы Whatmann, размер пор которых 0,7 мкм. Затем полученный фильтрат фильтруют на фильтре 0,22 мкм типа Nalgene в асептических условиях, с целью его стерилизации и сохраняют при температуре 4^oС до момента его использования.

Протокол 3:
Выполняется предыдущий протокол с заменой воды на экстрагирующий водный раствор, состоящий из культуральной клеточной среды DMEM/F 12,3:1, выпускаемой фирмой Life Technologies.

Протокол 4:
Экстракт, полученный по протоколу 2, лиофилизуют при 30^oС после замораживания до -20^oС. Используют непосредственно полученный порошок.

Пример 2
Измерение модулирующего эффекта меланогенеза экстракта, полученного по протоколу 2 примера 1:
Модулирующий эффект на меланогенез экстракта, полученного по протоколу 2 примера 1, был испытан на со-культурах нормальных кератиноцитов/меланоцитов человека согласно методу, описанному в патенте FR 9506491. Процент синтеза меланина оценивается путем введения тиоурацила, маркированного С¹⁴. Синтез протеинов, определяемый введением третированного лейцина, взят в качестве индикатора цитотоксичности и пролиферации.

Материал и методы
Клеточные культуры
Нормальные кераноциты человека (NHK) и нормальные меланоциты человека (NHM) культивируют из кожи крайней плоти. Оба типа клеток амплифицируют и хранят в замороженном состоянии. За восемь дней перед тестированием каждый тип клеток возвращают в культуру в среде КGМ фирмы Gibco для кераноцитов (NHK) и в среде М2 по Dr. Olsson для меланоцитов (NHM) (Olsson, M. J. et al. , Lancet (1992) 340, 981). Среды меняют через каждые два дня.

За сорок восемь часов до слияния среда KGM кераноцитов (NHK) заменяется средой дифференцировки (DMEM/F 12 3:1, 10% телячья сыворотка, EGF 10 нг/мл, гидрокортизон 0,4 мкг/мл, инсулин 5 мкг/мл).

Растительный экстракт
Растительный экстракт примера 1 (протокол 2) тестируют в концентрациях 1,25•10^-4, 2,5•10^-4, 5•10^-4, 1,25•10^-3, 2,5•10^-3, 5•10^-3%.

Модуляция меланогенеза
250000 нормальных кераноцитов человека и 80000 нормальных меланоцитов человека смешивают и высеивают в каждую лунку 24-лунковой плашки (тип Costar) и выращивают 3 дня в среде дифференцировки. В течение следующих трех дней, культуральная среда заменяется ежедневно определенной тест-средой (DMEM/F12 3:1, эпидермальный фактор роста (EGF) 10 нг/мл, фактор роста фибробластов типа β(βFGF) 10 нг/мл), содержащей 0,037 МВq/мл (1 мкмCi/мл) тиоурацила, маркированного С¹⁴.

Готовят следующие контрольные образцы:
- контрольная культура: нет продукта для тестирования;
- положительный контрольный образец стимуляции меланогенеза: 1 мМ тирозин;
- положительный контрольный образец ингибирования меланогенеза: 0,5 мМ койевой кислоты.

Общая радиоактивность, введенная в протеины, оценивается введением тритированного лейцина. Накануне отбора пробы 0,037 MBq/мл (1 мкмСi/мл) тритированного лейцина добавляют в тестируемую среду.

На следующий день клетки ополаскивают в фосфатном буферном растворе (буфере). Протеины осаждают с помощью 5%-ной трихлоруксусной кислоты (ТСА) и промывают с целью удаления свободной радиоактивности. Протеины подвергают инкубации в течение одной ночи при 40^oC с помощью раствора протеиназы К 100 мкг/мл в буфере Tris HCl-triton-EDTA. 50 мкл общего экстракта отбирают и переносят на 24-лунковую плашку (Wallac) и добавляют 50 мкл сцинтиллирующей жидкости (Optiphase "Supermix").

Остаток экстракта, т. е. 950 мкл, фильтруют на фильтре DEAE Filtermat. После ополаскивания, фильтр, покрытый твердым сцинтиллирующим веществом "Meltilex", переносят на плашку. Радиоактивность подсчитывается с помощью счетчика Wallac. Результаты выражаются в процентном содержании контрольного образца согласно следующей формуле

в которой ¹⁴СР является средней величиной распадов в минуту (dpm) тиоурацила ¹⁴С на 3 одинаковых лунках, обработанных продуктом (Р);
³HP является средней величиной распадов в минуту соответствующего лейцина ³H;
¹⁴СТ является средней величиной распадов в минуту тиоурацила ¹⁴С на трех одинаковых лунках контрольного образца (Т);
³НТ является средней величиной распадов в минуту соответствующего лейцина ³Н.

Результаты см. в таблице.

Выводы:
Этот продукт является нецитотоксичным в тестируемых концентрациях (незначительное изменение встраивания ³Н лейцина) и вызывает синтез меланина, начиная с 1,25•10^-3% (увеличение встраивания ¹⁴С тиоурацила).

Пример 3
Примеры композиций, содержащих по меньшей мере один экстракт по меньшей мере одного растения рода Chrysanthemum.

Эти композиции получают обычными способами, широко используемыми в настоящее время в косметике и фармации.

Крем для кожи:
Экстракт из примера 1 по протоколу 1 - 5,000 г
Ceteareth 30 - 7,000 г
Стеарат глицерина - 2,000 г
Цетиловый спирт - 1,500 г
Полидиметилсилоксан - 1,500 г
Парафиновое масло - 15,000 г
Чистый глицерин codex - 20,000 г
Консерванты q.s.

Деминерализованная вода q.s.р. 100,000 г
Пульверизируемый лосьон для кожи:
Экстракт по примеру 1, протокол 2 - 10,000 г
Дигидрокси-3,4-фенил-α-аланин (DOPA) - 0,200 г
Этанол - 30,000 г
Деминерализованная вода q.s.р. 100,000 г
Лосьон для волос:
Экстракт по примеру 1, протокол 4 - 0,500 г
Тирозин - 1,000 г
Пропиленгликоль - 30,000 г
Этиловый спирт - 40,500 г
Вода - До 100,000 г
Этот раствор наносят на волосяной покров, один или два раза в день, из расчета 1 мл лосьона за один раз.

Густой лосьон:
Экстракт по примеру 1, протокол 3 - 15,000 г
Каваин - 2,000 г
Гидроксипропилцеллюлоза (Klucel C^® фирмы Hercules) - 3,500 г
Этиловый спирт - До 100/000 г
Этот густой лосьон наносят на волосяной покров головы один или два раза в день из расчета 1 мл за один раз.

Ниосомный лосьон:
Экстракт по примеру 1, протокол 1 - 1,000 г
Chimexane NL^® - 0,475 г
Холестерин - 0,475 г
Стеарилглутамат, мононатриевая соль - 0,475 г
Консерванты - qs
Красители - qs
Отдушка - qs
Деминерализованная вода - До 100,000 г
Этот лосьон наносят на волосяной покров, один или два раза в день, из расчета 1 мл на один раз.

Лосьон:
Экстракт по примеру 1, протокол 2 - 2,000 г
Тирозин - 1,000 г
Монометиловый эфир пропиленгликоля - 20,000 г
(Dowanol PM^® фирмы Dow Chemical) - Гидро
Этиловый спирт - 40,000 г
Миноксидил - 2,000 г
Вода - До - 100,000 г
Этот густой лосьон наносят на волосяной покров, один или два раза в день, из расчета 1 мл на один раз.

Claims (15)

1. Средство для увеличения пигментации кожи и/или волос, отличающееся тем, что оно состоит из по меньшей мере одного экстракта по меньшей мере одного растения рода Chrysanthemum.

2. Средство по п.1, отличающееся тем, что названное растение выбирают из видов Chrysanthemum hortorum, Chrysanthemum morifolium, Chrysanthemum coronarium, Chrysanthemum myconis, Chrysanthemum sagitum, Chrysanthemum indicum или Chrysanthemum segetum.

3. Средство по п.2, отличающееся тем, что названное растение происходит из вида Chrysanthemum morifolium.

4. Средство по п.3, отличающееся тем, что названное растение происходит из разновидности sinense.

5. Средство по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что экстракт по меньшей мере одного растения рода Chrysanthemum получают из растительного материала от целого растения, выращенного in vivo, или от культуры in vitro.

6. Средство по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что экстракт по меньшей мере одного растения рода Chrysanthemum получают из листьев, цветков, стеблей, корней или недифференцированных клеток.

7. Средство по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что оно используется в косметической или фармацевтической композиции в количестве 0,01-15% от общего веса композиции, предпочтительно 1-5% от общего веса композиции.

8. Средство для стимуляции меланогенеза, отличающееся тем, что оно состоит из по меньшей мере одного экстракта по меньшей мере одного растения рода Chrysanthemum.

9. Средство по п.8, отличающееся тем, что названное растение выбирают из видов Chrysanthemum hortorum, Chrysanthemum morifolium, Chrysanthemum coronarium, Chrysanthemum myconis, Chrysanthemum sagitum, Chrysanthemum indicum или же Chrysanthemum segetum.

10. Средство по п.9, отличающееся тем, что названное растение происходит из вида Chrysanthemum morifolium.

11. Средство по п.10, отличающееся тем, что названное растение происходит от разновидности sinense.

12. Средство по любому из пп.8-11, отличающееся тем, что экстракт по меньшей мере одного растения рода Chrysanthemum получают из растительного материала от целого растения, выращенного in vivo, или от культуры in vitro.

13. Средство по любому из пп.8-12, отличающееся тем, что экстракт по меньшей мере одного растения рода Chrysanthemum получают из листьев, цветков, стеблей, корней или недифференцированных клеток.

14. Средство по любому из пп.8-13, отличающееся тем, что количество экстракта по меньшей мере одного растения рода Chrysanthemum составляет 0,01-15% от общего веса композиции, предпочтительно 1-5% от общего веса композиции.

15. Способ косметической обработки для увеличения пигментации кожи и/или волос, отличающийся тем, что наносят на кожу и/или волосы косметическую композицию, содержащую по меньшей мере один экстракт по меньшей мере одного растения рода Chrysanthemum в косметически приемлемой среде.

Images