RU2197528C2 - Способ получения l-лизина (варианты) и рекомбинантная днк, используемая для его осуществления (варианты) - Google Patents
Способ получения l-лизина (варианты) и рекомбинантная днк, используемая для его осуществления (варианты) Download PDFInfo
- Publication number
- RU2197528C2 RU2197528C2 RU98100099/13A RU98100099A RU2197528C2 RU 2197528 C2 RU2197528 C2 RU 2197528C2 RU 98100099/13 A RU98100099/13 A RU 98100099/13A RU 98100099 A RU98100099 A RU 98100099A RU 2197528 C2 RU2197528 C2 RU 2197528C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- lysine
- dna
- plasmid
- seq
- nucleotide sequence
- Prior art date
Links
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 title claims abstract description 194
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 title claims abstract description 26
- 238000000034 method Methods 0.000 title abstract description 68
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims abstract description 99
- 235000019766 L-Lysine Nutrition 0.000 claims abstract description 94
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 44
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 claims abstract description 27
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 25
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 claims abstract description 17
- 108010055400 Aspartate kinase Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 13
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 claims abstract 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 64
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 64
- 241000186031 Corynebacteriaceae Species 0.000 claims description 46
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims description 15
- 229960002898 threonine Drugs 0.000 claims description 15
- 108010064711 Homoserine dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 12
- 108010014468 Dihydrodipicolinate Reductase Proteins 0.000 claims description 10
- WPLOVIFNBMNBPD-ATHMIXSHSA-N subtilin Chemical compound CC1SCC(NC2=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C(C)CC)C(=O)NC(=C)C(=O)NC(CCCCN)C(O)=O)CSC(C)C2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C1NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C1NC(=O)C(=C/C)/NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)CNC(=O)C(NC(=O)C(NC(=O)C2NC(=O)CNC(=O)C3CCCN3C(=O)C(NC(=O)C3NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(=C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(CCCCN)NC(=O)C(N)CC=4C5=CC=CC=C5NC=4)CSC3)C(C)SC2)C(C)C)C(C)SC1)CC1=CC=CC=C1 WPLOVIFNBMNBPD-ATHMIXSHSA-N 0.000 claims description 8
- 108091000044 4-hydroxy-tetrahydrodipicolinate synthase Proteins 0.000 claims description 7
- 108030003594 Diaminopimelate decarboxylases Proteins 0.000 claims description 7
- 108010056578 diaminopimelate dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 6
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 abstract description 58
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 abstract description 28
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 15
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 abstract description 15
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 abstract description 14
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 abstract description 14
- 230000012010 growth Effects 0.000 abstract description 13
- 238000012258 culturing Methods 0.000 abstract description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 133
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 109
- 101150035025 lysC gene Proteins 0.000 description 99
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 81
- 101150073654 dapB gene Proteins 0.000 description 64
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 62
- RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N Acetaminophen Chemical compound CC(=O)NC1=CC=C(O)C=C1 RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 56
- 101150011371 dapA gene Proteins 0.000 description 55
- 101100465553 Dictyostelium discoideum psmB6 gene Proteins 0.000 description 54
- 101100169519 Pyrococcus abyssi (strain GE5 / Orsay) dapAL gene Proteins 0.000 description 54
- 101150033534 lysA gene Proteins 0.000 description 50
- 241000186254 coryneform bacterium Species 0.000 description 35
- 101150057904 ddh gene Proteins 0.000 description 34
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 description 33
- 101150109073 ldhD gene Proteins 0.000 description 31
- 230000008569 process Effects 0.000 description 28
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 23
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 20
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 19
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 19
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 18
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 17
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 17
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 14
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 13
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 13
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 12
- 108020001019 DNA Primers Proteins 0.000 description 11
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 11
- 101100098219 Dictyostelium discoideum argS1 gene Proteins 0.000 description 9
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 9
- 101150024756 argS gene Proteins 0.000 description 9
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 9
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 9
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 9
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 8
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 8
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 8
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 8
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 7
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 7
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 7
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 7
- 241000186146 Brevibacterium Species 0.000 description 6
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 6
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 6
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 6
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 6
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 5
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 5
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229960003767 alanine Drugs 0.000 description 5
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 5
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 5
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 5
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 5
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 5
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 5
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 5
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 5
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102100038238 Aromatic-L-amino-acid decarboxylase Human genes 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- UKAUYVFTDYCKQA-VKHMYHEASA-N L-homoserine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCO UKAUYVFTDYCKQA-VKHMYHEASA-N 0.000 description 4
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 4
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 4
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 4
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 4
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 4
- -1 if necessary) Proteins 0.000 description 4
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 4
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 4
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 4
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 4
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- 229960004295 valine Drugs 0.000 description 4
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 3
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 3
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 3
- 239000013076 target substance Substances 0.000 description 3
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 2
- VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N Fumaric acid Chemical compound OC(=O)\C=C\C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- PYUSHNKNPOHWEZ-YFKPBYRVSA-N N-formyl-L-methionine Chemical compound CSCC[C@@H](C(O)=O)NC=O PYUSHNKNPOHWEZ-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N Nicotinamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CN=C1 DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 2
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 2
- 238000000586 desensitisation Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 239000013587 production medium Substances 0.000 description 2
- 229960002429 proline Drugs 0.000 description 2
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- GHSJKUNUIHUPDF-UHFFFAOYSA-N s-(2-aminoethyl)-l-cysteine Chemical compound NCCSCC(N)C(O)=O GHSJKUNUIHUPDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960001153 serine Drugs 0.000 description 2
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 2
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N succinic acid Chemical compound OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- FRIHGXGYWUWBED-ZLELNMGESA-N (2s)-2,6-bis(azanyl)hexanoic acid Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O.NCCCC[C@H](N)C(O)=O FRIHGXGYWUWBED-ZLELNMGESA-N 0.000 description 1
- UKAUYVFTDYCKQA-UHFFFAOYSA-N -2-Amino-4-hydroxybutanoic acid Natural products OC(=O)C(N)CCO UKAUYVFTDYCKQA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CDOCNWRWMUMCLP-UHFFFAOYSA-N 2-(dodecanoylamino)-4-methylpentanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCC(=O)NC(C(O)=O)CC(C)C CDOCNWRWMUMCLP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CXABZTLXNODUTD-UHFFFAOYSA-N 3-fluoropyruvic acid Chemical compound OC(=O)C(=O)CF CXABZTLXNODUTD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004254 Ammonium phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N D-alpha-Ala Natural products CC([NH3+])C([O-])=O QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 101150104377 Ecel1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N Hexa-Ac-myo-Inositol Natural products CC(=O)OC1C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C1OC(C)=O SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N L-Alanine Natural products C[C@@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 229930064664 L-arginine Natural products 0.000 description 1
- 235000014852 L-arginine Nutrition 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical class OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 229930182844 L-isoleucine Natural products 0.000 description 1
- 235000019454 L-leucine Nutrition 0.000 description 1
- 239000004395 L-leucine Substances 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 229930182821 L-proline Natural products 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 241000234435 Lilium Species 0.000 description 1
- WAEMQWOKJMHJLA-UHFFFAOYSA-N Manganese(2+) Chemical compound [Mn+2] WAEMQWOKJMHJLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000144155 Microbacterium ammoniaphilum Species 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- VZUNGTLZRAYYDE-UHFFFAOYSA-N N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine Chemical compound O=NN(C)C(=N)N[N+]([O-])=O VZUNGTLZRAYYDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 108091000041 Phosphoenolpyruvate Carboxylase Proteins 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 241000319304 [Brevibacterium] flavum Species 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910000148 ammonium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019289 ammonium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 239000003674 animal food additive Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 description 1
- 229960003121 arginine Drugs 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 229910052792 caesium Inorganic materials 0.000 description 1
- TVFDJXOCXUVLDH-UHFFFAOYSA-N caesium atom Chemical compound [Cs] TVFDJXOCXUVLDH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 229960002433 cysteine Drugs 0.000 description 1
- 239000003954 decarboxylase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N diammonium hydrogen phosphate Chemical compound [NH4+].[NH4+].OP([O-])([O-])=O MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 239000001530 fumaric acid Substances 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 229910001410 inorganic ion Inorganic materials 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N inositol Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N 0.000 description 1
- 229960000367 inositol Drugs 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 1
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N iron Substances [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- 229960003136 leucine Drugs 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 229910001437 manganese ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 235000013379 molasses Nutrition 0.000 description 1
- 229960003966 nicotinamide Drugs 0.000 description 1
- 235000005152 nicotinamide Nutrition 0.000 description 1
- 239000011570 nicotinamide Substances 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 125000001477 organic nitrogen group Chemical group 0.000 description 1
- KHPXUQMNIQBQEV-UHFFFAOYSA-L oxaloacetate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CC(=O)C([O-])=O KHPXUQMNIQBQEV-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005190 phenylalanine Drugs 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 description 1
- 239000003531 protein hydrolysate Substances 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N scyllo-inosotol Natural products OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000001384 succinic acid Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 235000019157 thiamine Nutrition 0.000 description 1
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 1
- 239000011721 thiamine Substances 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N trans-butenedioic acid Natural products OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000017105 transposition Effects 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004441 tyrosine Drugs 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
- C12N9/0014—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4)
- C12N9/0016—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4) with NAD or NADP as acceptor (1.4.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/77—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Corynebacterium; for Brevibacterium
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
- C12N9/1217—Phosphotransferases with a carboxyl group as acceptor (2.7.2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/88—Lyases (4.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии и касается производства L-лизина. Способ получения L-лизина предусматривает выращивание коринеформных бактерий, трансформированных рекомбинантной ДНК (варианты), представленной в описании в виде перечня последовательностей. Рекомбинантная ДНК содержит а) последовательность ДНК, кодирующую аспартокиназу, у которой ингибирование по типу обратной связи L-лизином и L-треонином по существу десенсибилизировано, и б) последовательность ДНК, кодирующую дигидродипиколинатредуктазу. Рекомбинантная ДНК автономно реплицируется в клетках коринеформных бактерий. Выращивание трансформированных бактерий осуществляют в среде, подходящей для продуцирования и накопления L-лизина в культуре бактерий, и L-лизин извлекают из культуры. Использование изобретения позволяет улучшить L-лизинпродуцирующую способность и скорость роста продуцента. 8 с.п. ф-лы, 14 ил., 1 табл.
Description
Данное изобретение относится к способу получения L-лизина культивированием микроорганизма, полученного модификацией коринеформной бактерии, используемой для ферментативного получения аминокислоты или т.п., при помощи способа, основанного на генной инженерии.
Предпосылки изобретения
L-лизин, который используется в качестве добавки к корму, обычно получают ферментативным способом с использованием L-лизин-продуцирующего мутантного штамма, принадлежащего к коринеформным бактериям. Различные известные в настоящее время L-лизин-продуцирующие бактерии являются бактериями, создаваемыми при помощи искусственной мутации из штаммов дикого типа, относящихся к коринеформным бактериям.
L-лизин, который используется в качестве добавки к корму, обычно получают ферментативным способом с использованием L-лизин-продуцирующего мутантного штамма, принадлежащего к коринеформным бактериям. Различные известные в настоящее время L-лизин-продуцирующие бактерии являются бактериями, создаваемыми при помощи искусственной мутации из штаммов дикого типа, относящихся к коринеформным бактериям.
Что касается коринеформных бактерий, описаны векторная плазмида, которая автономно реплицируется в бактериальных клетках и имеет маркерный ген устойчивости к лекарственному средству (см. United States Patent No. 4514502), и способ введения гена в бактериальные клетки (например, Japanese Patent Laid-open No. 2-207791). Также описана возможность размножения L-треонин- или L-изолейцин-продуцирующей бактерии с применением описанного выше способа (см. United States Patent No. 4452890 и 4442208). Что касается размножения L-лизин-продуцирующей бактерии, известен способ, в котором ген, участвующий в биосинтезе L-лизина, вводят в векторную плазмиду для амплификации этого гена в бактериальных клетках (например, Japanese Patent Laid-open No. 56-160997).
Известные гены для биосинтеза L-лизина включают, например, ген дигидродипиколинатредуктазы (Japanese Patent Laid-open No. 7-75578) и ген диаминопимелатдегидрогеназы (Ishino, S. et al. , Nucleic Acids Res., 15, 3917 (1987) (в этой работе клонирован ген, участвующий в биосинтезе L-лизина), а также ген фосфоенолпируваткарбоксилазы (Japanese Patent Laid-open No. 60-87788), ген дигидродипиколинатсинтазы (Japanese Patent Laid-open No. 6-55149) и ген диаминопимелатдекарбоксилазы (Japanese Patent Laid-open No. 60-62994, в котором амплификация гена влияла на продуктивность L-лизина).
Что касается ферментов, участвующих в биосинтезе L-лизина, известен случай для фермента, который подвергается ингибированию по типу обратной связи при использовании его в виде дикого типа. В этом случае продуктивность L-лизина улучшается введением гена фермента, имеющего такую мутацию, при которой ингибирование по типу обратной связи десенсибилизируется. К таким известным генам конкретно относится, например, ген аспартокиназы (International Publication Pamphlet of WO 94/25605).
Как описано выше, некоторые успешные результаты были получены путем амплификации генов для системы биосинтеза L-лизина или введением мутантных генов. Например, коринеформная бактерия, которая удерживает мутантный ген аспартокиназы с десенсибилизированным совместным ингибированием лизином и треонином, продуцирует значительное количество L-лизина (приблизительно 25 г/л). Однако эта бактерия страдает от снижения скорости роста по сравнению с бактерией, не удерживающей мутантного гена аспартокиназы. Также сообщалось, что продуктивность L-лизина улучшается дополнительно введением гена дигидродипиколинатсинтазы, кроме мутантного гена аспартокиназы (Applied and Environmental Microbiology. 57(6), 1746-1752 (1991)). Однако такая бактерия страдает от дополнительного снижения скорости роста.
Что касается гена дигидродипиколинатредуктазы, было показано, что активность дигидродипиколинатредуктазы увеличивается в коринеформной бактерии, в которую был введен этот ген, однако не сообщалось влияние на продуктивность L-лизина (Japanese Patent Laid-open No. 7-75578).
В настоящее время неизвестен ни один случай для коринеформных бактерий, когда кому-либо удалось значительное улучшение выхода L-лизина без ограничения роста путем комбинирования множества генов для биосинтеза L-лизина. Не сообщался ни один случай, в котором предусматривалось также улучшение роста путем усиления гена для биосинтеза L-лизина.
Описание изобретения
Целью данного изобретения является улучшение L-лизин-продуцирующей способности и скорости роста коринеформной бактерии посредством использования генетических материалов последовательностей ДНК, кодирующих (каждая) аспартокиназу (далее называемую "АК", при условии, что ген, кодирующий белок АК, далее называют "lysC, если необходимо), дигидродипиколинатредуктазу (далее называемую "DDPR", при условии, что ген, кодирующий белок DDPR, далее называют "dapB", если необходимо), дигидродипиколинатсинтазу (далее называемую "DDPS", при условии, что ген, кодирующий белок DDPS, далее называют "dapA", если необходимо), диаминопимелатдекарбоксилазу (далее называемую "DDC", при условии, что ген, кодирующий белок DDC, далее называют lysA, если необходимо), и диаминопимелатдегидрогеназу (далее называемую "DDH", при условии, что ген, кодирующий белок DDH, далее называют "ddh, если необходимо), которые являются важными ферментами биосинтеза L-лизина в клетках коринеформных бактерий.
Целью данного изобретения является улучшение L-лизин-продуцирующей способности и скорости роста коринеформной бактерии посредством использования генетических материалов последовательностей ДНК, кодирующих (каждая) аспартокиназу (далее называемую "АК", при условии, что ген, кодирующий белок АК, далее называют "lysC, если необходимо), дигидродипиколинатредуктазу (далее называемую "DDPR", при условии, что ген, кодирующий белок DDPR, далее называют "dapB", если необходимо), дигидродипиколинатсинтазу (далее называемую "DDPS", при условии, что ген, кодирующий белок DDPS, далее называют "dapA", если необходимо), диаминопимелатдекарбоксилазу (далее называемую "DDC", при условии, что ген, кодирующий белок DDC, далее называют lysA, если необходимо), и диаминопимелатдегидрогеназу (далее называемую "DDH", при условии, что ген, кодирующий белок DDH, далее называют "ddh, если необходимо), которые являются важными ферментами биосинтеза L-лизина в клетках коринеформных бактерий.
Когда целевое вещество получают ферментативно при помощи микроорганизма, скорость получения, а также выход целевого вещества относительно вводимого материала является крайне важным фактором. Целевое вещество можно получать очень дешево путем увеличения скорости продуцирования на единицу ферментативного оборудования. Поэтому в промышленном масштабе крайне важно, чтобы ферментативный выход и скорость продуцирования были совместимы друг с другом. Данное изобретение предлагает решение проблемы, описанной выше, для ферментативного получения L-лизина с использованием коринеформной бактерии.
Принцип данного изобретения основан на факте, что рост коринеформной бактерии может быть улучшен и скорость продуцирования L-лизина может быть улучшена посредством усиления при объединении dapB с мутантом lysC (далее называемым просто "мутантным lysC", если необходимо), кодирующим мутантную АК (далее называемую просто "АК мутантного типа", если необходимо), при котором совместное ингибирование лизином и треонином является десенсибилизированным по сравнению со случаем, когда lysC усиливается отдельно, и что скорость продуцирования L-лизина может быть дополнительно улучшена ступенчатым образом посредством усиления dapA, lysA и ddh.
А именно, данное изобретение основано на рекомбинантной ДНК, автономно реплицируемой в клетках коринеформных бактерий, содержащей последовательность ДНК, кодирующую аспартокиназу, для которой ингибирование по типу обратной связи по существу десенсибилизировано, и последовательность ДНК, кодирующую дигидродипиколинатредуктазу. Данное изобретение обеспечивает рекомбинантную ДНК, дополнительно содержащую последовательность ДНК, кодирующую дигидродипиколинатсинтазу, кроме каждой из описанных выше последовательностей ДНК. Данное изобретение обеспечивает рекомбинантную ДНК, дополнительно содержащую последовательность ДНК, кодирующую диаминопимелатдекарбоксилазу, кроме трех описанных выше последовательностей ДНК. Данное изобретение обеспечивает рекомбинантную ДНК, дополнительно содержащую последовательность ДНК, кодирующую диаминопимелатдегидрогеназу, кроме четырех описанных выше последовательностей ДНК.
В другом аспекте данное изобретение обеспечивает коринеформную бактерию, удерживающую аспартокиназу, в которой ингибирование по типу обратной связи L-лизином и L-треонином значительно десенсибилизировано, и содержащую усиленную ДНК, кодирующую дигидродипиколинатредуктазу. Данное изобретение обеспечивает коринеформную бактерию, дополнительно содержащую усиленную ДНК, кодирующую дигидропиколинатсинтазу в вышеупомянутой коринеформной бактерии. Данное изобретение обеспечивает коринеформную бактерию, дополнительно содержащую усиленную ДНК, кодирующую диаминопимелатдекарбоксилазу в вышеупомянутой коринеформной бактерии, кроме трех описанных выше ДНК. Данное изобретение обеспечивает коринеформную бактерию, дополнительно содержащую усиленную ДНК, кодирующую диаминопимелатдегидрогеназу в вышеупомянутой коринеформной бактерии, кроме четырех описанных выше ДНК.
Еще в одном варианте данное изобретение обеспечивает способ получения L-лизина, предусматривающий стадии культивирования любой из описанных выше коринеформных бактерий в подходящей среде, продуцирования и накопления L-лизина в культуре этой бактерии и сбор L-лизина из культуры.
Коринеформные бактерии, упоминаемые в данном изобретении, представляют собой группу микроорганизмов, описанных в Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8th ed. ,p. 599 (1974), которые являются аэробными грамположительными палочками, не обладающими кислотоустойчивостью и спорообразующей способностью. Эти коринеформные бактерии включают бактерии, принадлежащие к роду Corinebacterium, бактерии, принадлежащие к роду Brevibacterium, классифицируемые до настоящего времени в род Brevibacterium, но объединенные в настоящее время в род Corinebacterium, и бактерии, принадлежащие к роду Brevibacterium, близкородственные бактериям, принадлежащим к роду Corinebacterium.
Данное изобретение будет объяснено подробно ниже.
<1> Получение генов для биосинтеза L-лизина, используемых в данном изобретении
Гены для биосинтеза L-лизина, используемые в данном изобретении, получают соответственно получением хромосомной ДНК из бактерии в качестве донора ДНК, конструированием библиотеки хромосомной ДНК с применением плазмидного вектора или т.п., отбора штамма, удерживающего желаемый ген, и извлечения из выбранного штамма рекомбинантной ДНК, в которую был вставлен этот ген. Донор ДНК для гена для биосинтеза L-лизина, используемый в данном изобретении, не является специфически ограниченным, при условии, что желаемый ген для биосинтеза L-лизина экспрессирует ферментный белок, который функционирует в клетках коринеформных бактерий. Однако донор ДНК предпочтительно является коринеформной бактерией.
Гены для биосинтеза L-лизина, используемые в данном изобретении, получают соответственно получением хромосомной ДНК из бактерии в качестве донора ДНК, конструированием библиотеки хромосомной ДНК с применением плазмидного вектора или т.п., отбора штамма, удерживающего желаемый ген, и извлечения из выбранного штамма рекомбинантной ДНК, в которую был вставлен этот ген. Донор ДНК для гена для биосинтеза L-лизина, используемый в данном изобретении, не является специфически ограниченным, при условии, что желаемый ген для биосинтеза L-лизина экспрессирует ферментный белок, который функционирует в клетках коринеформных бактерий. Однако донор ДНК предпочтительно является коринеформной бактерией.
Все гены lysC, dapA и dapB, происходящие из коринеформных бактерий, имеют известные последовательности. Поэтому они могут быть получены путем проведения амплификации в соответствии со способом полимеразной цепной реакции (PCR; см. White, Т. J. et al.. Trends Genet.. 5, 185 (1989)).
Каждый из генов для биосинтеза L-лизина, используемый в данном изобретении, можно получить в соответствии с определенными способами, приведенными в качестве примеров ниже.
(1) Получение мутантного lysC
Фрагмент ДНК, содержащий мутантный lysC, может быть получен из мутантного штамма, в котором синергическое ингибирование по типу обратной связи активности АК L-лизином и L-треонином значительно десенсибилизировано (International Publication Pamphlet of WO 94/25605). Такой мутантный штамм может быть получен, например, из группы клеток, происходящих из штамма дикого типа коринеформной бактерии, подвергнутых мутационной обработке путем приложения к ним обычной мутационной обработки, такой как облучение ультрафиолетовым светом и обработка мутирующим агентом, таким как N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин. Активность АК может быть измерена при помощи способа, описанного Miyajima, R. et al. в The Journal of Biochemistry (1968), 63(2), 139-148. Наиболее предпочтительным мутантным штаммом является продуцирующая L-лизин бактерия AJ3445 (FERM Р-1944), полученная мутационной обработкой из штамма дикого типа Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 (имеющей измененное в настоящее время название Corinebacterium glutamicum).
Фрагмент ДНК, содержащий мутантный lysC, может быть получен из мутантного штамма, в котором синергическое ингибирование по типу обратной связи активности АК L-лизином и L-треонином значительно десенсибилизировано (International Publication Pamphlet of WO 94/25605). Такой мутантный штамм может быть получен, например, из группы клеток, происходящих из штамма дикого типа коринеформной бактерии, подвергнутых мутационной обработке путем приложения к ним обычной мутационной обработки, такой как облучение ультрафиолетовым светом и обработка мутирующим агентом, таким как N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин. Активность АК может быть измерена при помощи способа, описанного Miyajima, R. et al. в The Journal of Biochemistry (1968), 63(2), 139-148. Наиболее предпочтительным мутантным штаммом является продуцирующая L-лизин бактерия AJ3445 (FERM Р-1944), полученная мутационной обработкой из штамма дикого типа Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 (имеющей измененное в настоящее время название Corinebacterium glutamicum).
Альтернативно, мутантный lysC можно получить также мутационной обработкой in vitro плазмидной ДНК, содержащей lysC дикого типа. В другом аспекте известна конкретная информация о мутации для десенсибилизации синергического ингибирования по типу обратной связи АК L-лизином и L-треонином ((International Publication Pamphlet of WO 94/25605). Поэтому мутантный lysC может быть также получен из lysC дикого типа на основании этой информации, например, по способу сайт-специфического мутагенеза.
Фрагмент, содержащий lysC, может быть выделен из коринеформной бактерии путем получения хромосомной ДНК в соответствии, например, со способом Saito and Miura (H. Saito and К. Miura, Biochim. Biophys. Acta,72,619 (1963) ), и амплификации lysC в соответствии со способом полимеразной цепной реакции (PCR; см. White, T.J. et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)).
Примерами праймеров ДНК являются одноцепочечные ДНК 23-мера и 21-мера, имеющие нуклеотидные последовательности, показанные в SEQ ID 1 и SEQ ID 2 в Списке последовательностей, для амплификации, например, района приблизительно 1643 п. н., кодирующего lysC, на основе последовательности, известной для Corinebacterium glutamicum (см. Molecular Microbiology (1991), 5 (5) 1197-1204; Mol. Gen. Genet. (1990), 224, 317-324). ДНК может быть синтезирована в соответствии с обычным способом при помощи синтезатора ДНК модели 380В Applied Biosystems и при помощи фосфоамидитного способа (см. Tetrahedron Letters (1981), 22, 1859). ПЦР может быть выполнена с применением Термоциклера ДНК модели PJ2000, производимого Takara Shuzo, и с применением ДНК-полимеразы Taq согласно способу, предписанному поставщиком.
Предпочтительно, чтобы lysC, амплифицированный при помощи ПЦР, был лигирован с вектором ДНК, автономно реплицируемым в клетках Е.coli и/или коринеформных бактериях, для получения рекомбинантной ДНК, и эту рекомбинантную ДНК вводят в клетки E.coli заранее. Это облегчает последующие операции. Вектор, автономно реплицируемый в клетках Е.coli, предпочтительно является плазмидным вектором, который предпочтительно автономно реплицируется в клетках хозяина, в том числе, например, pUC19, pUC18, pBR322, pHSG299, pHSG399, pHSG398 и RSF 1010.
Когда фрагмент ДНК, способный позволять плазмиде автономно реплицироваться в коринеформной бактерии, вводят в эти векторы, их можно использовать в качестве так называемого челночного вектора, автономно реплицируемого как в Е.coli, так и в коринеформной бактерии.
Такими челночными векторами являются следующие векторы. Микроорганизмы, удерживающие каждый из векторов, и номера депозитов в международных средствах для депонирования указаны в скобках.
рНС4: Escherichia coli AJ12617 (FERM BP-3532)
pAJ655: Escherichia coii AJ11882 (FERM BP-136)
Corinebacterium glutamicum SR8201 (ATCC 39135)
pAJ 1844: Escherichia coli AJ 11883 (FERM BP-137)
Corinebacterium glutamicum SR8202 (ATCC 39136)
pAJ611: Escherichia coli AJ11884 (FERM BP-138)
pAJ3148: Corinebacterium glutamicum SR8203 (FERM 39137)
pAJ440: Bacillus subtilis AJ11901 (FERM BP-140)
Эти векторы могут быть получены из депонированных микроорганизмов следующим образом. Клетки, собранные при логарифмической фазе роста, лизировали при помощи лизозима и ДСН с последующим отделением от лизата центрифугированием при 30000 g с получением супернатанта, к которому добавляли полиэтиленгликоль и затем фракционировали и очищали центрифугированием в равновесном градиенте плотности хлорида цезия/бромида этидия.
pAJ655: Escherichia coii AJ11882 (FERM BP-136)
Corinebacterium glutamicum SR8201 (ATCC 39135)
pAJ 1844: Escherichia coli AJ 11883 (FERM BP-137)
Corinebacterium glutamicum SR8202 (ATCC 39136)
pAJ611: Escherichia coli AJ11884 (FERM BP-138)
pAJ3148: Corinebacterium glutamicum SR8203 (FERM 39137)
pAJ440: Bacillus subtilis AJ11901 (FERM BP-140)
Эти векторы могут быть получены из депонированных микроорганизмов следующим образом. Клетки, собранные при логарифмической фазе роста, лизировали при помощи лизозима и ДСН с последующим отделением от лизата центрифугированием при 30000 g с получением супернатанта, к которому добавляли полиэтиленгликоль и затем фракционировали и очищали центрифугированием в равновесном градиенте плотности хлорида цезия/бромида этидия.
Е. coli может быть трансформирована введением плазмиды согласно, например, способу D.M. Morrison (Methods in Enzymology, 68, 326 (1979)) или способу, в котором реципиентные клетки обрабатывают хлоридом кальция для увеличения проницаемости для ДНК (Mandel, M. and Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159 ( 1970)).
LysC дикого типа получают при выделении lysC из содержащего АК штамма дикого типа, тогда как lysC выделяют из содержащего АК мутантного штамма в соответствии со способом, описанным выше.
Пример нуклеотидной последовательности фрагмента ДНК, содержащего lysC, показан в SEQ ID 3 в Списке последовательностей. Аминокислотная последовательность α-субъединицы белка АК дикого типа расшифрована из нуклеотидной последовательности, показанной в SEQ ID 4 в Списке последовательностей вместе с последовательностью ДНК. Только аминокислотная последовательность показана в SEQ ID 5. Аминокислотная последовательность β-субъединицы белка АК дикого типа расшифрована из нуклеотидной последовательности ДНК, показанной в SEQ ID 6 в Списке последовательностей вместе с ДНК. Только аминокислотная последовательность показана в SEQ ID 7. В каждой из этих субъединиц GTG использован как инициирующий кодон и соответствующая аминокислота представлена метионином. Однако это представление относится к метионину, валину или формилметионину.
Мутантный lysC, используемый в данном изобретении, особо не ограничивается, при условии, что он кодирует АК, для которой синергическое ингибирование по типу обратной связи L-лизином и L-треонином является десенсибилизированным. Однако мутантный lysC представлен для примера геном, имеющим мутацию, в которой 279-ый остаток аланина при отсчете от N-конца заменен на аминокислотный остаток, отличающийся от аланина и не являющийся кислой аминокислотой, в α-субъединице, и 30-ый остаток аланина заменен на аминокислотный остаток, отличающийся от аланина и не являющийся кислой аминокислотой, в β-субъединице в аминокислотной последовательности АК дикого типа. Аминокислотная последовательность АК дикого типа включает в себя аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID 5 в Списке последовательностей, в качестве α-субъединицы и аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID 7 в Списке последовательностей, в качестве β-субъединицы.
Аминокислотными остатками, иными, чем аланин, и иными, чем кислая аминокислота, предпочтительно являются остатки треонина, аргинина, цистеина, фенилаланина, пролина, серина, тирозина и валина.
Кодон, соответствующий заменяемому аминокислотному остатку, особо не лимитирован относительно его типа, при условии, что он кодирует этот аминокислотный остаток. Предполагается, что аминокислотная последовательность имеющейся АК дикого типа может слегка отличаться в зависимости от различия в бактериальных видах и бактериальных штаммах. АК, которые имеют мутацию, основанную, например, на замене, делеции или инсерции одного или нескольких аминокислотных остатков в одном или нескольких положениях, не имеющих значения для активности фермента, описанных выше, могут также использоваться для данного изобретения. Другие АК, которые имеют мутацию, основанную, например, на замене, делеции или инсерции других одного или нескольких аминокислотных остатков, могут также использоваться при условии, что они не оказывают существенного влияния на активность АК и на десенсибилизацию синергического ингибирования по типу обратной связи L-лизином и L-треонином.
Штамм AJ12691, полученный введением плазмиды р399АК 9В с мутантным lysC в штамм AJ12036 (FERM ВР-734) в качестве штамма дикого типа Brevibacterium lactofermentum, был депонирован 10 апреля 1992 года под номером доступа FERM Р-12918 в National Institute of Bioscience and Human of Agency of Industrial Science and Technology of Ministry of International Trade and Industry (postal code: 305, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan), перенесен в международное депонирование на основе Budapest Treaty 10 февраля 1995 года и депонирован под номером доступа FERM ВР-4999.
(2) Получение dapB
Фрагмент ДНК, содержащий dapB, может быть получен из хромосомы коринеформной бактерии при помощи ПЦР. Донор ДНК специфически не ограничивается, однако в качестве примера приводится штамм Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869.
Фрагмент ДНК, содержащий dapB, может быть получен из хромосомы коринеформной бактерии при помощи ПЦР. Донор ДНК специфически не ограничивается, однако в качестве примера приводится штамм Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869.
Последовательность ДНК, кодирующая DDPR, известна для Brevibacterium lactofermentum (Journal of Bacteriology, 175 (9), 2743-2749 (1993)), на основе этой последовательности ДНК могут быть получены праймеры ДНК для ПЦР. Примерами таких праймеров ДНК являются ДНК 23-меров, соответственно имеющие нуклеотидные последовательности, изображенные в SEQ ID 8 и SEQ ID 9 в Списке последовательностей. Синтез ДНК, ПЦР и приготовление плазмиды, содержащей полученный dapB, могут быть выполнены так же, как описано выше для lysC.
Нуклеотидная последовательность фрагмента ДНК, содержащего dapB, и аминокислотная последовательность, расшифрованная из этой нуклеотидной последовательности, представлены в SEQ ID 10. Только аминокислотная последовательность показана в SEQ ID 11. Кроме фрагментов ДНК, кодирующих эту аминокислотную последовательность, данное изобретение может равноценно использовать фрагменты ДНК, кодирующие аминокислотные последовательности, в основном такие же, какие показаны в SEQ ID 11, а именно аминокислотные последовательности, имеющие мутацию, основанную, например, на замене, делеции или инсерции одной или нескольких аминокислот, при условии, что при этом нет существенного влияния на активность DDPR.
Трансформированный штамм АJ13107, полученный введением плазмиды pCRDAPB, содержащей dapB, полученный в Примере, описанном ниже, в штамм Е.coli JM109, был депонирован международно с 26 мая 1995 года под депозитным номером FERM ВР-5114 в National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology of Ministry of International Trade and Industry (postal code: 305, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan) на основе Budapest Treaty.
(3) Получение dapA
Фрагмент ДНК, содержащий dapA, может быть получен из хромосомы коринеформной бактерии при помощи ПЦР. Донор ДНК особо не ограничивается, однако в качестве примера приведен штамм Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869.
Фрагмент ДНК, содержащий dapA, может быть получен из хромосомы коринеформной бактерии при помощи ПЦР. Донор ДНК особо не ограничивается, однако в качестве примера приведен штамм Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869.
Последовательность ДНК, кодирующая DDPS, известна для Corinebacterium glutamicum (см. Nucleic Acids Research. 18 (21), 6421 (1990), EMBL accession No. X53993), на основе этой последовательности могут быть приготовлены праймеры ДНК для ПЦР. Специфическими примерами таких праймеров ДНК являются ДНК 23-меров, соответственно имеющие нуклеотидные последовательности, изображенные в SEQ ID 12 и SEQ ID 13 Списка последовательностей. Синтез ДНК, ПЦР и приготовление плазмиды, содержащей dapA, могут быть выполнены так же, как описано для lysC выше.
Нуклеотидная последовательность фрагмента ДНК, содержащего dapA, и аминокислотная последовательность, расшифрованная из этой нуклеотидной последовательности, приведены в виде примеров в SEQ ID 14. Только аминокислотная последовательность показана в SEQ ID 15. Кроме фрагментов ДНК, кодирующих эту аминокислотную последовательность, данное изобретение может равноценно использовать фрагменты ДНК, кодирующие аминокислотные последовательности, в основном такие же, что и аминокислотная последовательность, показанная в SEQ ID 15, а именно аминокислотные последовательности, имеющие мутацию, основанную, например, на замене, делении или инсерции одной или нескольких аминокислот, при условии, что при этом нет существенного влияния на активность DDPS.
Трансформированный штамм АJ13106, полученный введением плазмиды pCRDAPA, содержащей dapA, полученный в Примере, описанном ниже, в штамм Е. coli JM 109, был депонирован с 26 мая 1995 года под депозитным номером FERM BP-5113 в National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology of Ministry of International Trade and Industry (postal code: 305, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan) на основе Budapest Treaty.
(4) Получение lysA
Фрагмент ДНК, содержащий lysA, может быть получен из хромосомы коринеформной бактерии при помощи ПЦР. Донор ДНК особо не ограничивается, однако в качестве примера приведен штамм Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869.
Фрагмент ДНК, содержащий lysA, может быть получен из хромосомы коринеформной бактерии при помощи ПЦР. Донор ДНК особо не ограничивается, однако в качестве примера приведен штамм Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869.
В коринеформных бактериях lysA образует оперон вместе с argS (геном аргинил-тРНК-синтазы) и lysA находится по ходу транскрипции от argS. Экспрессия lysA регулируется промотором, расположенным против хода транскрипции от argS (см. Journal of Bacteriology, Nov., 7356-7362 (1993)). Последовательности ДНК этих генов известны для Corinebacterium glutamicum (см. Molecular Microbiology, 4(11), 1819-1830 (1990); Molecular and General Genetics, 212, 112-119 (1988)), на основе этих последовательностей могут быть приготовлены праймеры ДНК для ПЦР. Такие праймеры ДНК приведены в качестве специфических примеров в виде 23-меров ДНК, соответственно имеющих нуклеотидные последовательности, показанные в SEQ ID 16 в Списке последовательностей (соответствующей номерам нуклеотидов 11-33 в нуклеотидной последовательности, описанной в Molecular Microbiology, 4(11), 1819-1830 (1990)), и SEQ ID 17 (соответствующей номерам нуклеотидов 1370-1392 в нуклеотидной последовательности, описанной в Molecular and General Genetics, 212, 112-119 (1988)). Синтез ДНК, ПЦР и приготовление плазмиды, содержащей полученный lysA, могут быть выполнены так же, как описано выше для lysC.
В Примере, описанном позже, фрагмент ДНК, содержащий промотор, argS и lysA, использовали для усиления lysA. Однако argS не является существенным для данного изобретения. Можно использовать фрагмент ДНК, в котором lysA лигирован непосредственно по ходу транскрипции от промотора.
Нуклеотидная последовательность фрагмента ДНК, содержащего argS и lysA, и аминокислотная последовательность, расшифрованная из этой нуклеотидной последовательности, приведены в виде примеров в SEQ ID 18. Пример аминокислотной последовательности, кодируемой argS, показан в SEQ ID 19, и пример аминокислотной последовательности, кодируемой lysA, показан в SEQ ID 20. Кроме фрагментов ДНК, кодирующих эту аминокислотную последовательность, данное изобретение может равноценно использовать фрагменты ДНК, кодирующие аминокислотные последовательности, в основном такие же, что и аминокислотная последовательность, показанная в SEQ ID 20, а именно аминокислотные последовательности, имеющие мутацию, основанную, например, на замене, делении или инсерции одной или нескольких аминокислот, при условии, что при этом нет существенного влияния на активность DDC.
(5) Получение ddh
Фрагмент ДНК, содержащий ddh, может быть получен из хромосомы коринеформной бактерии при помощи ПЦР. Донор ДНК особо не ограничивается, однако в качестве примера приведен штамм Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869.
Фрагмент ДНК, содержащий ddh, может быть получен из хромосомы коринеформной бактерии при помощи ПЦР. Донор ДНК особо не ограничивается, однако в качестве примера приведен штамм Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869.
Ген DDH известен для Corinebacterium glutamicum (Ishino, S. et al., Nucleic Acids Res., 15, 3917 (1987)), на основе его последовательности могут быть приготовлены праймеры для ПЦР. Специфические примеры таких праймеров приведены в виде ДНК 20-меров, соответственно имеющих нуклеотидные последовательности, изображенные в SEQ ID 21 и SEQ ID 22 в Списке последовательностей. Синтез ДНК, ПЦР и приготовление плазмиды, содержащей полученный ddh, могут быть выполнены так же, как описано выше для lysC.
Нуклеотидная последовательность фрагмента ДНК, содержащего ddh, и аминокислотная последовательность, расшифрованная из этой нуклеотидной последовательности, приведены в виде примеров в SEQ ID 23. Только аминокислотная последовательность показана в SEQ ID 24. Кроме фрагментов ДНК, кодирующих эту аминокислотную последовательность, данное изобретение может равноценно использовать фрагменты ДНК, кодирующие аминокислотные последовательности, в основном такие же, что и аминокислотная последовательность, показанная в SEQ ID 24, а именно аминокислотные последовательности, имеющие мутацию, основанную, например, на замене, делении или инсерции одной или нескольких аминокислот, при условии, что при этом нет существенного влияния на активность DDH.
<2> Рекомбинантная ДНК и коринеформная бактерия данного изобретения
Коринеформная бактерия данного изобретения удерживает аспартокиназу (мутантную АК), у которой ингибирование по типу обратной связи L-лизином и L-треонином по существу десенсибилизировано, причем ДНК (dapB), кодирующая дигидродипиколинатредуктазу, усилена. В предпочтительном варианте коринеформная бактерия данного изобретения представляет собой коринеформную бактерию, в которой ДНК (dapA), кодирующая дигидродипиколинтасинтазу, дополнительно усилена. В более предпочтительном варианте коринеформная бактерия данного изобретения представляет собой коринеформную бактерию, в которой ДНК (lysA), кодирующая диаминопимелатдекарбоксилазу, дополнительно усилена. В более предпочтительном варианте коринеформная бактерия данного изобретения представляет собой коринеформную бактерию, в которой ДНК (ddh), кодирующая диаминопимелатдегидрогеназу, дополнительно усилена.
Коринеформная бактерия данного изобретения удерживает аспартокиназу (мутантную АК), у которой ингибирование по типу обратной связи L-лизином и L-треонином по существу десенсибилизировано, причем ДНК (dapB), кодирующая дигидродипиколинатредуктазу, усилена. В предпочтительном варианте коринеформная бактерия данного изобретения представляет собой коринеформную бактерию, в которой ДНК (dapA), кодирующая дигидродипиколинтасинтазу, дополнительно усилена. В более предпочтительном варианте коринеформная бактерия данного изобретения представляет собой коринеформную бактерию, в которой ДНК (lysA), кодирующая диаминопимелатдекарбоксилазу, дополнительно усилена. В более предпочтительном варианте коринеформная бактерия данного изобретения представляет собой коринеформную бактерию, в которой ДНК (ddh), кодирующая диаминопимелатдегидрогеназу, дополнительно усилена.
Термин "усиленная" ДНК обозначает здесь тот факт, что внутриклеточная активность фермента, кодируемого этой ДНК, повышается, например, путем увеличения числа копий гена, использованием сильного промотора, использованием гена, кодирующего фермент, имеющий высокую удельную активность, или комбинированием этих средств.
Коринеформной бактерией, удерживающей мутантную АК, могут быть коринеформные бактерии, которые продуцируют мутантную аспартокиназу как результат мутации, или коринеформные бактерии, которые трансформированы введением мутантного гена lysC.
Примеры коринеформной бактерии, используемой для введения описанной выше ДНК, включают, например, следующие продуцирующие лизин штаммы дикого типа:
Corinebacterium acetoacidophilum ANCC 13870;
Corinebacterium acetoglutamicum ATCC 15806;
Corinebacterium callunae ATCC 15991;
Corinebacterium glutamicum ATCC 13032;
(Brevibacterium divaricatum) ATCC 14020;
(Brevibacterium lactofermentum) ATCC 13869;
(Corinebacterium lilium) ATCC 15990;
(Brevibacterium flavum) ATCC 14067;
Corinebacterium melassecola ATCC 17965;
Brevibacterium saccharolyticum ATCC 14066;
Brevibacterium immariophilum ATCC 14068;
Brevibacterium roseum ATCC 13825;
Brevibacterium thiogenitalis ATCC 19240;
Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15354;
Corinebacterium thermoaminogenes AJ12340 (FERM BP-1539).
Corinebacterium acetoacidophilum ANCC 13870;
Corinebacterium acetoglutamicum ATCC 15806;
Corinebacterium callunae ATCC 15991;
Corinebacterium glutamicum ATCC 13032;
(Brevibacterium divaricatum) ATCC 14020;
(Brevibacterium lactofermentum) ATCC 13869;
(Corinebacterium lilium) ATCC 15990;
(Brevibacterium flavum) ATCC 14067;
Corinebacterium melassecola ATCC 17965;
Brevibacterium saccharolyticum ATCC 14066;
Brevibacterium immariophilum ATCC 14068;
Brevibacterium roseum ATCC 13825;
Brevibacterium thiogenitalis ATCC 19240;
Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15354;
Corinebacterium thermoaminogenes AJ12340 (FERM BP-1539).
Другими бактериальными штаммами, кроме описанных здесь, используемыми в качестве хозяина, являются, например, мутантные штаммы, способные продуцировать L-лизин, произведенные из вышеуказанных штаммов. Такие искусственные мутантные штаммы включают: S-(2-аминоэтил)-цистеин (далее сокращаемый как "АЕС")-резистентные мутантные штаммы (Brevibacterium lactofermentum AJ11082 (NRRL B-1147), Japanese Patent Publication Nos. 56-1914, 56-1915, 57-14157, 57-14158, 57-30474, 58-10075, 59-4993, 62-35840, 62-24074, 62-36673, 5-11958, 7-112437 и 7-112438); мутантные штаммы, которые требуют аминокислоты, такой как L-гомосерин, для их роста (Japanese Patent Publication Nos. 48-28078 и 56-6499), мутантные штаммы, которые проявляют устойчивость к АЕС и требуют аминокислот, таких как L-лейцин, L-гомосерин, L-пролин, L-серин, L-аргинин, L-аланин и L-валин (United States Patent Nos. 3708395 и 3825472); L-лизин-продуцирующие мутантные штаммы, которые проявляют устойчивость к DL-α-ε-капролактаму, α-аминолауриллактаму, аналогу аспартата, сульфа-лекарстенным средствам, хиноиду и N-лауроиллейцину; L-лизин-продуцирующие мутантные штаммы, которые проявляют устойчивость к ингибиторам оксалацетатдекарбоксилазы или ферментов дыхательной системы (Japanese Patent Laid-open Nos. 50-53588, 50-31093, 52-102498, 53-9394, 53-86089, 55-9783, 55-9759, 56-32995 и 56-39778, и Japanese Patent Publication Nos. 53-43591 и 53-1833); L-лизин-продуцирующие мутантные штаммы, которые требуют инозита или уксусной кислоты (Japanese Patent Laid-open Nos. 55-9784 и 56-8692); L-лизин-продуцирующие мутантные штаммы, которые проявляют чувствительность к фторпировиноградной кислоте или температуре не менее 34oС (Japanese Patent Laid-open Nos. 55-9783 и 53-86090); и L-лизин-продуцирующие мутантные штаммы, принадлежащие к роду Brevibacterium или Corinebacterium, которые проявляют устойчивость к этиленгликолю и продуцируют L-лизин (United States Patent No. 4411997).
В характерном варианте для усиления генов для биосинтеза L-лизина в хозяине, описанном выше, гены вводят в хозяина с использованием плазмидного вектора, транспозона или фагового вектора или т.п. При введении ожидается получение усиления до некоторой степени даже при использовании вектора с низкой копийностью. Однако предпочтительно использовать тип вектора с высокой копийностью. Такой вектор включает, например, плазмидные векторы pAJ655, pAJ1844, pAJ611, pAJ3148 и pAJ440, описанные выше. Кроме того, транспозоны, произведенные из коринеформных бактерий, описаны в International Publication Pamphlets of WO02/02627 и WO93/18151, European Patent Publication No. 445385, Japanese Patent Laid-open No. 6-46867, Vertes, A.A. et al., Mol. Microbiol., 11, 739-746 (1994), Bonamy, С., et al., Mol. Microbiol. , 14, 571-581 (1994), Vertes, A. A. et al., Mol. Gen. Genet,, 245, 397-405 (1994), Jagar, W. et al. , FEMS Microbiology Letters, 126, 1-6 (1995), Japanese Patent Laid-open, No. 7-107976, Japanese Patent Laid-open No. 7-327680 и т. п.
В данном изобретении не является обязательным, чтобы мутантный lysC был обязательно усиленным. Можно использовать штаммы, которые имеют мутацию на lysC на хромосомной ДНК, или в которых мутантный lysC включен в хромосомную ДНК. Альтернативно, мутантный lysC может быть введен при помощи плазмидного вектора. С другой стороны, dapA, dapB, lysA и ddh предпочтительно усиливаются для эффективного продуцирования L-лизина.
Каждый из генов lysC, dapA, dapB, lysA и ddh может быть успешно введен в хозяина при помощи соответственно различных векторов. Альтернативно, два, три, четыре или пять из видов этих генов могут вводиться вместе при помощи одного вектора. При использовании различных векторов гены могут вводиться в любом порядке, однако предпочтительно использовать векторы, которые имеют стабильный механизм обмена и улавливания в хозяине и которые способны сосуществовать с каждым другим вектором.
Коринеформную бактерию, удерживающую мутантную АК и дополнительно содержащую усиленный dapB, получают, например, введением в коринеформную бактерию-хозяина рекомбинантной ДНК, содержащей мутантный lysC и dapB, автономно реплицируемые в клетках коринеформных бактерий.
Коринеформную бактерию, дополнительно содержащую dapA, кроме мутантного lysC и dapB, получают, например, введением в коринеформную бактерию-хозяина рекомбинантной ДНК, содержащей мутантный lysC, dapB и dapA, автономно реплицируемые в клетках коринеформных бактерий.
Коринеформную бактерию, дополнительно содержащую мутантный lysC, dapB и dapA, получают, например, введением в коринеформную бактерию-хозяина рекомбинантной ДНК, содержащей lysC, dapB, dapA и lysA, автономно реплицируемые в клетках коринеформных бактерий.
Коринеформную бактерию, дополнительно содержащую усиленный ddh, кроме мутантного lysC, dapB, dapA и lysA, получают, например, введением в коринеформную бактерию-хозяина рекомбинантной ДНК, содержащей lysC, dapB, dapA, lysA и ddh, автономно реплицируемые в клетках коринеформных бактерий.
Вышеупомянутые рекомбинантные ДНК могут быть получены, например, встраиванием каждого из генов, участвующих в биосинтезе L-лизина, в вектор, такой как плазмидный вектор, транспозон или фаговый вектор, как описано выше.
В случае использования в качестве вектора плазмиды рекомбинантную ДНК можно вводить в хозяина согласно электроимпульсному способу ( Sugimoto et al. , Japanese Patent Laidopen No. 2-207791). Амплификацию гена с использованием транспозона можно выполнять введением плазмиды, несущей транспозон, в клетку-хозяина и индуцированием транспозиции транспозона.
<3> Способ получения L-лизина
L-лизин может продуцироваться эффективно путем культивирования в подходящей среде коринеформной бактерии, содержащей усиленные гены для биосинтеза L-лизина, как описано выше, продуцирования и накопления L-лизина в культуре этой бактерии и сбора L-лизина из культуры.
L-лизин может продуцироваться эффективно путем культивирования в подходящей среде коринеформной бактерии, содержащей усиленные гены для биосинтеза L-лизина, как описано выше, продуцирования и накопления L-лизина в культуре этой бактерии и сбора L-лизина из культуры.
Примером используемой среды является обычная среда, содержащая источник углерода, источник азот, неорганические ионы и необязательно другие органические компоненты.
В качестве источника углерода можно использовать сахара, такие как глюкоза, фруктоза, сахароза, мелассы и гидролизат крахмала; и органические кислоты, такие как фумаровая кислота, лимонная кислота и янтарная кислота.
В качестве источника азота можно использовать неорганические соли аммония, такие как сульфат аммония, хлорид аммония и фосфат аммония; органический азот, такой как гидролизат сои; газообразный аммиак; и водный аммиак.
В качестве питательных веществ, предоставляемых в следовых количествах, желательно использовать в соответствующих количествах требующиеся вещества, такие как витамин B1 и L-гомосерин или дрожжевой экстракт или т.п. Кроме того, добавляют, если требуется, фосфат калия, сульфат магния, ион железа, ион марганца и т.д.
Культивирование предпочтительно проводят при аэробных условиях в течение приблизительно 30-90 часов. Температура культивирования предпочтительно регулируется при 25-37oС, и рН предпочтительно регулируется от 5 до 8 во время культивирования. Для доведения рН можно использовать неорганические или органические, кислые или щелочные вещества или газообразный аммиак или т.п. L-лизин может быть собран из культуры комбинированием обычного способа с ионообменной смолой и других известных способов.
Краткое описание чертежей.
Фиг. 1 иллюстрирует процесс конструирования плазмид p399AKYB и р399АК9В, содержащих мутантный lysC.
Фиг. 2 иллюстрирует процесс конструирования плазмиды pDPRB, содержащей dapB и Brevi.-ori. (точку начала репликации, ориджин).
Фиг. 3 иллюстрирует процесс конструирования плазмиды pDPSB, содержащей dapA и Brevi.-ori.
Фиг.4 иллюстрирует процесс конструирования плазмиды p299LYSA, содержащей lysA.
Фиг. 5 иллюстрирует процесс конструирования плазмиды pLYSAB, содержащей lysA и Brevi.-ori.
Фиг. 6 иллюстрирует процесс конструирования плазмиды рРК 4D, содержащей ddh и Brevi.-ori.
Фиг. 7 иллюстрирует процесс конструирования плазмиды pCRCAB, содержащей lysC, dapB и Brevi.-ori.
Фиг. 8 иллюстрирует процесс конструирования плазмиды рСВ, содержащей мутантный lysC, dapB и Brevi.-ori.
Фиг. 9 иллюстрирует процесс конструирования плазмиды рАВ, содержащей dapA, dapB и Brevi.-ori.
Фиг. 10 иллюстрирует процесс конструирования плазмиды p399DL, содержащей ddh и lysA.
Фиг. 11 иллюстрирует процесс конструирования плазмиды pDL, содержащей ddh, lysA и Brevi.-ori.
Фиг. 12 иллюстрирует процесс конструирования плазмиды рСАВ, содержащей мутантный lysC, dapA, dapB и Brevi.-ori.
Фиг. 13 иллюстрирует процесс конструирования плазмиды pCABL, содержащей мутантный lysC, dapA, dapB, lysA и Brevi.-ori.
Фиг. 14 иллюстрирует процесс конструирования плазмиды pCABDL, содержащей мутантный lysC, dapA, dapB, ddh, lysA и Brevi.-ori.
Описание предпочтительных вариантов
Данное изобретение будет более конкретно объяснено ниже со ссылкой на Примеры.
Данное изобретение будет более конкретно объяснено ниже со ссылкой на Примеры.
Пример 1: Получение гена lysC дикого типа и мутантного гена lysC из Brevibacterium lactofermentum
<1> Получение lysC дикого типа и мутантного lysC и получение содержащих их плазмид
В качестве доноров хромосомной ДНК использовали штамм Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 и L-лизин-продуцирующий мутантный штамм AJ34445 (FERM Р-1944), полученный из штамма ATCC 13869 мутационной обработкой. Штамм AJ3445 подвергали мутации таким образом, что lysC был изменен с появлением существенной десенсибилизации от совместного ингибирования лизином и треонином (Journal of Biochemistry, 68, 701-710 (1970)).
<1> Получение lysC дикого типа и мутантного lysC и получение содержащих их плазмид
В качестве доноров хромосомной ДНК использовали штамм Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 и L-лизин-продуцирующий мутантный штамм AJ34445 (FERM Р-1944), полученный из штамма ATCC 13869 мутационной обработкой. Штамм AJ3445 подвергали мутации таким образом, что lysC был изменен с появлением существенной десенсибилизации от совместного ингибирования лизином и треонином (Journal of Biochemistry, 68, 701-710 (1970)).
Фрагмент ДНК, содержащий lysC, амплифицировали из хромосомной ДНК в соответствии со способом ПЦР (полимеразная цепная реакция; см. White, T.J. et al. Trends Genet., 5, 185 (1989)). Что касается праймеров ДНК, используемых для амплификации, одноцепочечные ДНК 23-мера и 21-мера, имеющие нуклеотидные последовательности, показанные в SEQ ID 1 и SEQ ID 2, синтезировали для амплификации района приблизительно 1643 п. н. для lysC на основе последовательности, известной для Corinebacterium glutamicum (см. Molecular Microbiology (1991), 5(5), 1197-1204; и Mol. Gen. Genet. (1990), 224, 317-324). ДНК синтезировали согласно обычному способу с применением синтезатора ДНК модели 380В, производимого Applied Biosystems, и с применением фосфоамидитного способа (см. Tetrahegron Letters (1981), 22, 1859).
Ген амплифицировали при помощи ПЦР с использованием Термоциклера ДНК модели PJ2000, производимого Takara Shuzo, и с использованием ДНК-полимеразы Taq согласно способу, рекомендуемому поставщиком. Амплифицированный фрагмент гена 1643 т. п. н. подтверждали электрофорезом в агарозном геле. После этого фрагмент, вырезанный из геля, очищали согласно обычному способу и расщепляли его рестриктазами Nrul (производимой Takara Shuzo) и EcoRI (производимой Takara Shuzo).
pHSG399 (см. Takeshita, S. et al., Gene, (1987), 62, 63-74) использовали в качестве клонирующего вектора для фрагмента гена. pHSG399 расщепляли рестриктазами Smal (производимой Takara Shuzo) и EcoRI (производимой Takara Shuzo) и лигировали с амплифицированным фрагментом lysC. ДНК лигировали при помощи набора для лигирования ДНК (производимого Takara Shuzo) в соответствии с рекомендуемым способом. Так были получены плазмиды, в которых фрагменты lysC, амплифицированные из хромосом Brevibacterium lactofermentum, были лигированы с pHSG399 соответственно. Плазмида, содержащая lysC из АТСС 13869 (штамма дикого типа), была обозначена как p399AKY, а плазмида, содержащая lysC из AJ3463 (L-лизин-продуцирующей бактерии) была обозначена как р399АК9.
Фрагмент ДНК (далее называемый "Brevi.-ori."), обладающий способностью делать плазмиду автономно реплицируемой в бактериях, принадлежащих к роду Corinebacterium, вводили в p399AKY и р399АК9 соответственно для получения плазмид, несущих lysC, автономно реплицируемый в бактериях, принадлежащих к роду Corinebacterium. Brevi.-ori. получали из плазмидного вектора рНК4, содержащего Brevi. -ori. и автономно реплицируемого в клетках как Escherichia coli, так и в бактериях, принадлежащих к роду Corinebacterium. рНК4 конструировали расщеплением рНС4 при помощи Kpnl (производимой Takara Shuzo) и Bam HI (производимой Takara Shuzo), экстракцией фрагмента Brevi.-ori. и лигированием его с pHSG298, также расщепленной Kpnl и BamHI (см. Japanese Patent Laid-open No. 5-7491). рНК4 придает хозяину устойчивость к канамицину. Escherichia coli, удерживающую рНК4, обозначили как Escherichia coli AJ13136 и депонировали как Escherichia coli AJ13136 1 августа 1995 года под депозитным номером FERM ВР-5186 в National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology of Ministry of International Trade and Industry (postal code: 305, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan).
pHK4 расщепляли рестриктазами Kpnl и BamHI и расщепленные края затупляли. Образование тупых концов выполняли с применением набора для затупления ДНК (производимого Takara Shuzo) в соответствии с предложенным способом. После образования тупых концов фосфорилированный линкер BamHI (производимый Takara Shuzo) лигировали для получения модификации так, чтобы фрагмент ДНК, соответствующий Brevi.-ori.-части, мог быть вырезан из pHK4 расщеплением только при помощи BamHI. Эту плазмиду расщепляли BamHI и образующийся фрагмент ДНК Brevi.-ori. лигировали с p399AKY и р399АК9, также уже расщепленными BamHI соответственно для получения плазмид, каждая из которых содержит ген lysC, автономно реплицируемый в бактериях, принадлежащих к роду Corinebacterium.
Плазмида, содержащая ген lysC дикого типа, происходящий из p399AKY, была обозначена как p399AKYB, а плазмида, содержащая мутантный ген lysC, происходящий из р399АК9, была обозначена как р399АК9В. Процесс конструирования р399АК9В и p399AKYB показан в фиг. 1. Штамм AJ12691, полученный введением плазмиды р399АК9В с мутантным lysC в штамм дикого типа
Brevibacterium lactofermentum (штамм AJ12036, FERM ВР-734), был депонирован 10 апреля 1992 года под депозитным номером FERM Р-12918 в National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology of Ministry of International Trade and Industry (postal code: 305, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan), перенесен в международное депонирование на основе Budapest Treaty 10 февраля 1995 года под депозитным номером FERM ВР-4999.
Brevibacterium lactofermentum (штамм AJ12036, FERM ВР-734), был депонирован 10 апреля 1992 года под депозитным номером FERM Р-12918 в National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology of Ministry of International Trade and Industry (postal code: 305, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan), перенесен в международное депонирование на основе Budapest Treaty 10 февраля 1995 года под депозитным номером FERM ВР-4999.
<2> Определение нуклеотидных последовательностей lysC дикого типа и мутантного lysC из Brevibacterium lactofermentum
Плазмиду p399AKY, содержащую lysC дикого типа, и плазмиду р399АК9, содержащую мутантный lysC, получали из соответствующих трансформантов для определения нуклеотидных последовательностей lysC дикого типа и мутантного lysC. Определение нуклеотидных последовательностей проводили по способу Sanger et al. (например, F. Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 74, 5463 (1977)).
Плазмиду p399AKY, содержащую lysC дикого типа, и плазмиду р399АК9, содержащую мутантный lysC, получали из соответствующих трансформантов для определения нуклеотидных последовательностей lysC дикого типа и мутантного lysC. Определение нуклеотидных последовательностей проводили по способу Sanger et al. (например, F. Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 74, 5463 (1977)).
Нуклеотидная последовательность lysC дикого типа, кодируемого p399AKY, показана в SEQ ID 3 в Списке последовательностей. С другой стороны, нуклеотидная последовательность мутантного lysC, кодируемого р399АК9, имела только мутацию одного нуклеотида, т. е. 1051-ый G был заменен на А в SEQ ID 3 по сравнению с lysC дикого типа. Известно, что lysC Corinebacterium glutamicum имеет две субъединицы (α,β), кодируемые в идентичной рамке считывания на идентичной цепи ДНК (см. Kalinowski, J. et al., Molecular Microbiology (1991), 5(5), 1197-1204). На основе оценки гомологии предполагается, что секвенированный здесь ген также имеет две субъединицы (α,β), кодируемые в идентичной рамке считывания на идентичной цепи ДНК.
Аминокислотная последовательность α-субъединицы белка АК дикого типа, расшифрованная из нуклеотидной последовательности ДНК, показана в SEQ ID 4 вместе с последовательностью ДНК. Только аминокислотная последовательность показана в SEQ ID 5.
Аминокислотная последовательность β-субъединицы белка АК дикого типа, расшифрованная из нуклеотидной последовательности ДНК, показана в SEQ ID 6 вместе с последовательностью ДНК. Только аминокислотная последовательность показана в SEQ ID 7. В каждой из субъединиц GTG используют в качестве инициирующего кодона, и соответствующая аминокислота представлена метионином. Однако это представление относится к метионину, валину или формилметионину.
С другой стороны, мутация на последовательности мутантного lysC означает появление замены аминокислотного остатка, так что 279-ый остаток аланина α-субъединицы заменен на остаток треонина, а 30-ый остаток аланина β-субъединицы заменен на остаток треонина в аминокислотной последовательности белка АК дикого типа (SEQ ID 5, SEQ ID 7).
Пример 2: Получение dapB из Brevibacterium lactofermentum
<1> Получение dapB и конструирование плазмиды, содержащей dapB
В качестве донора хромосомной ДНК использовали штамм дикого типа Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869. Хромосомную ДНК получали из штамма ATCC 13869 согласно обычному способу. Фрагмент ДНК, содержащий dapB, амплифицировали из хромосомной ДНК при помощи ПЦР. В качестве праймеров ДНК, используемых для амплификации, синтезировали ДНК 23-меров, имеющих нуклеотидные последовательности, изображенные в SEQ ID 8 и SEQ ID 9 в Списке последовательностей соответственно для амплификации района приблизительно 2,0 т. п. н., кодирующего DDPR, на основе последовательности, известной для Brevibacterium lactofermentum (см. Journal of Bacteriology, 157(9), 2743-2749 (1993)). Синтез ДНК, ПЦР проводили, как описано в Примере 1. pCR-Script (производимый Invitrogen) использовали в качестве клонирующего вектора для амплифицированного фрагмента гена 2001 п. н., который лигировали с амплифицированным фрагментом dapB. Таким образом конструировали плазмиду, в которой фрагмент dapB 2001 п. н. , амплифицированный из хромосомы Brevibacterium lactofermentum, лигировали с pCR-Script. Плазмида, полученная, как описано выше, которая имела dapB, происходящий из ATCC 13869, была обозначена как pCRDAPB. Трансформантный штамм AJ13107, полученный введением pCRDAPB в штамм E.coli JM109, был международно депонирован с 26 мая 1995 года под депозитным номером FERM ВР-5114 в National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology of Ministry of International Trade and Industry (postal code: 305, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan) на основе Budapest Treaty.
<1> Получение dapB и конструирование плазмиды, содержащей dapB
В качестве донора хромосомной ДНК использовали штамм дикого типа Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869. Хромосомную ДНК получали из штамма ATCC 13869 согласно обычному способу. Фрагмент ДНК, содержащий dapB, амплифицировали из хромосомной ДНК при помощи ПЦР. В качестве праймеров ДНК, используемых для амплификации, синтезировали ДНК 23-меров, имеющих нуклеотидные последовательности, изображенные в SEQ ID 8 и SEQ ID 9 в Списке последовательностей соответственно для амплификации района приблизительно 2,0 т. п. н., кодирующего DDPR, на основе последовательности, известной для Brevibacterium lactofermentum (см. Journal of Bacteriology, 157(9), 2743-2749 (1993)). Синтез ДНК, ПЦР проводили, как описано в Примере 1. pCR-Script (производимый Invitrogen) использовали в качестве клонирующего вектора для амплифицированного фрагмента гена 2001 п. н., который лигировали с амплифицированным фрагментом dapB. Таким образом конструировали плазмиду, в которой фрагмент dapB 2001 п. н. , амплифицированный из хромосомы Brevibacterium lactofermentum, лигировали с pCR-Script. Плазмида, полученная, как описано выше, которая имела dapB, происходящий из ATCC 13869, была обозначена как pCRDAPB. Трансформантный штамм AJ13107, полученный введением pCRDAPB в штамм E.coli JM109, был международно депонирован с 26 мая 1995 года под депозитным номером FERM ВР-5114 в National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology of Ministry of International Trade and Industry (postal code: 305, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan) на основе Budapest Treaty.
Фрагмент 1101 п. н., содержащий структурный ген DDPR, экстрагировали расщеплением pCRDAPB EcoRI и SphI. Этот фрагмент лигировали с pHSG399, расщепленной HincII и SphI для получения плазмиды. Полученная плазмида была обозначена как p399DPR.
Brevi. -ori. вводили в полученную p399DPR для конструирования плазмиды, несущей dapB, автономно реплицируемый в коринеформных бактериях. рНК4 расщепляли рестриктазой KpnI (производимой Takara Shuzo), и расщепленные края затупляли. Образование тупых концов выполняли с использованием набора для затупления ДНК (производимого Takara Shuzo) согласно предложенному способу. После образования тупых концов фосфорилированный линкер BamHI (производимой Takara Shuzo) лигировали для получения модификации так, чтобы фрагмент ДНК, соответствующий Brevi. -ori. -части, мог быть вырезан из рНК4 расщеплением только BamHI. Эту плазмиду расщепляли BamHI, и полученный фрагмент ДНК Brevi. -ori. лигировали с p399DPR, также расщепленной BamHI, для получения плазмиды, содержащей dapB, автономно реплицируемый в коринеформных бактериях. Полученная плазмида была обозначена как pDPRB. Процесс конструирования pDPRB показан в фиг.2.
<2> Определение нуклеотидной последовательности dapB из Brevibacterium lactofermentum
Плазмидную ДНК получали из штамма АJ13107, удерживающего p399DPR, и ее нуклеотидную последовательность определяли, как описано в Примере 1. Определенная нуклеотидная последовательность и расшифрованная из нее аминокислотная последовательность показаны в SEQ ID 10. Только аминокислотная последовательность показана в SEQ ID 11.
Плазмидную ДНК получали из штамма АJ13107, удерживающего p399DPR, и ее нуклеотидную последовательность определяли, как описано в Примере 1. Определенная нуклеотидная последовательность и расшифрованная из нее аминокислотная последовательность показаны в SEQ ID 10. Только аминокислотная последовательность показана в SEQ ID 11.
Пример 3: Получение dapA из Brevibacterium lactofermentum
<1> Получение dapA и конструирование плазмиды, содержащей dapA
Штамм дикого типа Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 использовали в качестве донора хромосомной ДНК. Хромосомную ДНК получали из штамма ATCC 13869 в соответствии с обычным способом. Фрагмент ДНК, содержащий dapA, амплифицировали из хромосомной ДНК при помощи ПЦР. В качестве праймеров ДНК, используемых для амплификации, синтезировали соответственно ДНК 20-меров, имеющих нуклеотидные последовательности, показанные в SEQ ID 12 и SEQ ID 13 в Списке последовательностей, для амплификации района приблизительно 1,5 т. п. н., кодирующего DDPS, на основе последовательности, известной для Corinebacterium. glutamicum (см. Nucleic Acids Research, 18(21), 6421 (1990); EMBL accession No. X53993). Синтез ДНК и ПЦР выполняли, как описано в Примере 1. pCR1000 (производимую Invitrogen, см. Bio/Technology, 9, 657-663 (1991)) использовали в качестве клонирующего вектора для амплифицированного фрагмента гена 1411 п. н., который лигировали с амплифицированным фрагментом dapA. Лигирование ДНК выполняли с использованием набора для лигирования ДНК (производимого Takara Shuzo) согласно рекомендуемому способу. Так была сконструирована плазмида, в которой фрагмент dapA 1411 п. н., амплифицированный из хромосомы Brevibacterium lactofermentum, был лигирован с pCR1000. Плазмида, полученная, как описано здесь, имеющая dapA, происходящий из АТСС 13869, была обозначена как pCRDAPA.
<1> Получение dapA и конструирование плазмиды, содержащей dapA
Штамм дикого типа Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 использовали в качестве донора хромосомной ДНК. Хромосомную ДНК получали из штамма ATCC 13869 в соответствии с обычным способом. Фрагмент ДНК, содержащий dapA, амплифицировали из хромосомной ДНК при помощи ПЦР. В качестве праймеров ДНК, используемых для амплификации, синтезировали соответственно ДНК 20-меров, имеющих нуклеотидные последовательности, показанные в SEQ ID 12 и SEQ ID 13 в Списке последовательностей, для амплификации района приблизительно 1,5 т. п. н., кодирующего DDPS, на основе последовательности, известной для Corinebacterium. glutamicum (см. Nucleic Acids Research, 18(21), 6421 (1990); EMBL accession No. X53993). Синтез ДНК и ПЦР выполняли, как описано в Примере 1. pCR1000 (производимую Invitrogen, см. Bio/Technology, 9, 657-663 (1991)) использовали в качестве клонирующего вектора для амплифицированного фрагмента гена 1411 п. н., который лигировали с амплифицированным фрагментом dapA. Лигирование ДНК выполняли с использованием набора для лигирования ДНК (производимого Takara Shuzo) согласно рекомендуемому способу. Так была сконструирована плазмида, в которой фрагмент dapA 1411 п. н., амплифицированный из хромосомы Brevibacterium lactofermentum, был лигирован с pCR1000. Плазмида, полученная, как описано здесь, имеющая dapA, происходящий из АТСС 13869, была обозначена как pCRDAPA.
Трансформированный штамм AJ3106, полученный введением pCRDAPA в штамм Е. coli, был международно депонирован 26 мая 1995 года под депозитным номером FERM BP-5113 в National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology of Ministry of International Trade and Industry (postal code: 305, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan) на основе Budapest Treaty.
Brevi. -ori. вводили в полученную pCRDAPA для конструирования плазмиды, несущей dapA, автономно реплицируемый в коринеформных бактериях. рНК4 расщепляли рестриктазами КpnI и BamHI (производимой Takara Shuzo) и расщепленные края затупляли. Образование тупых концов выполняли с использованием набора для затупления ДНК (производимого Takara Shuzo) согласно предложенному способу. После образования тупых концов фосфорилированный линкер Smal (производимый Takara Shuzo) лигировали для получения модификации так, чтобы фрагмент ДНК, соответствующий Brevi.-ori.-части, мог быть вырезан из рНК4 расщеплением только Smal. Эту плазмиду расщепляли Smal и полученный фрагмент ДНК Brevi.-ori. лигировали с pCRDAPA, также расщепленной Smal, для получения плазмиды, содержащей dapA, автономно реплицируемый в коринеформных бактериях. Эта плазмида была названа pDPSB. Процесс конструирования pDPSB(Кmr) показан в фиг.3.
<2> Определение нуклеотидной последовательности dapA из Brevibacterium lactofermentum
Плазмидную ДНК получали из штамма АJ13106, несущего pCRDAPA, и ее нуклеотидную последовательность определяли, как описано в Примере 1. Определенная нуклеотидная последовательность и расшифрованная из нее аминокислотная последовательность показаны в SEQ ID 14. Только аминокислотная последовательность показана в SEQ ID 15.
Плазмидную ДНК получали из штамма АJ13106, несущего pCRDAPA, и ее нуклеотидную последовательность определяли, как описано в Примере 1. Определенная нуклеотидная последовательность и расшифрованная из нее аминокислотная последовательность показаны в SEQ ID 14. Только аминокислотная последовательность показана в SEQ ID 15.
Пример 4: Получение lysA из Brevibacterium lactofermentum
<1> Получение lysA и конструирование плазмиды, содержащей lysA
Штамм дикого типа Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 использовали в качестве донора хромосомной ДНК. Хромосомную ДНК получали из штамма ATCC 13869 в соответствии с обычным способом. Фрагмент ДНК, содержащий argS, lysA и промотор оперона, содержащего их, амплифицировали из хромосомной ДНК в соответствии с ПЦР. В качестве праймеров ДНК, используемых для амплификации, применяли синтетические ДНК 23-меров, имеющие нуклеотидные последовательности, изображенные в SEQ ID 16 и SEQ ID 17 в Списке последовательностей соответственно для амплификации района приблизительно 3,6 т. п. н. для аргинил-т-РНК-синтазы и DDC, на основе последовательности, известной для Corinebacterium glutamicum (см. Molecular Microbiology, 4(11), 1819-1830 (1990); Molecular and General Genetics, 212, 112-119 (1988)). Синтез ДНК и ПЦР выполняли, как описано в Примере 1. pHSG399 использовали в качестве клонирующего вектора для амплификации фрагмента гена 3579 п. н. pHSG399 расщепляли рестриктазой Smal (производимой Takara Shuzo), которую лигировали с фрагментом ДНК, содержащим амплифицированный lysA. Плазмида, полученная, как описано выше, которая имела lysA, происходящий из ATCC 13869, была обозначена как p399LYSA.
<1> Получение lysA и конструирование плазмиды, содержащей lysA
Штамм дикого типа Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 использовали в качестве донора хромосомной ДНК. Хромосомную ДНК получали из штамма ATCC 13869 в соответствии с обычным способом. Фрагмент ДНК, содержащий argS, lysA и промотор оперона, содержащего их, амплифицировали из хромосомной ДНК в соответствии с ПЦР. В качестве праймеров ДНК, используемых для амплификации, применяли синтетические ДНК 23-меров, имеющие нуклеотидные последовательности, изображенные в SEQ ID 16 и SEQ ID 17 в Списке последовательностей соответственно для амплификации района приблизительно 3,6 т. п. н. для аргинил-т-РНК-синтазы и DDC, на основе последовательности, известной для Corinebacterium glutamicum (см. Molecular Microbiology, 4(11), 1819-1830 (1990); Molecular and General Genetics, 212, 112-119 (1988)). Синтез ДНК и ПЦР выполняли, как описано в Примере 1. pHSG399 использовали в качестве клонирующего вектора для амплификации фрагмента гена 3579 п. н. pHSG399 расщепляли рестриктазой Smal (производимой Takara Shuzo), которую лигировали с фрагментом ДНК, содержащим амплифицированный lysA. Плазмида, полученная, как описано выше, которая имела lysA, происходящий из ATCC 13869, была обозначена как p399LYSA.
Фрагмент ДНК, содержащий lysA, экстрагировали расщеплением p399LYSA при помощи KpnI (производимой Takara Shuzo) и BamHI (производимой Takara Shuzo). Этот фрагмент ДНК лигировали с pHSG299, расщепленной KpnI и BamHI. Полученная плазмида была обозначена как p299LYSA. Процесс конструирования p299LYSA показан в фиг.4.
Brevi. -ori. вводили в полученную p299LYSA для конструирования плазмиды, несущей lysA, автономно реплицируемый в коринеформных бактериях. рНК4 расщепляли рестриктазами KpnI и BamHI и расщепленные края затупляли. Образование тупых концов выполняли с использованием набора для затупления ДНК (производимого Takara Shuzo) согласно предложенному способу. После образования тупых концов фосфорилированный линкер KpnI (производимый Takara Shuzo) лигировали для получения модификации так, чтобы фрагмент ДНК, соответствующий Brevi.-ori.-части, мог быть вырезан из рНК4 расщеплением только KpnI. Эту плазмиду расщепляли KpnI и полученный фрагмент ДНК Brevi.-ori. лигировали с p299LYSA, также расщепленной KpnI, для получения плазмиды, содержащей lysA, автономно реплицируемый в коринеформных бактериях. Полученная плазмида была названа pLYSAB. Процесс конструирования pLYSAB показан в фиг. 5.
<2> Определение нуклеотидной последовательности lysA из Brevibacterium lactofermentum
Плазмидную ДНК p299LYSA получали и ее нуклеотидную последовательность определяли, как описано в Примере 1. Определенная нуклеотидная последовательность и расшифрованная из нее аминокислотная последовательность показаны в SEQ ID 18. В отношении нуклеотидной последовательности аминокислотная последовательность, кодируемая argS, и аминокислотная последовательность, кодируемая lysA, показаны в SEQ ID 19 и SEQ ID 20 соответственно.
Плазмидную ДНК p299LYSA получали и ее нуклеотидную последовательность определяли, как описано в Примере 1. Определенная нуклеотидная последовательность и расшифрованная из нее аминокислотная последовательность показаны в SEQ ID 18. В отношении нуклеотидной последовательности аминокислотная последовательность, кодируемая argS, и аминокислотная последовательность, кодируемая lysA, показаны в SEQ ID 19 и SEQ ID 20 соответственно.
Пример 5: Получение ddh из Brevibacterium lactofermentum
Ген ddh получали амплификацией гена ddh из хромосомной ДНК Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 согласно способу ПЦР с применением двух олигонуклеотидных праймеров (SEQ ID 21 и SEQ ID 22), полученных на основе известной нуклеотидной последовательности гена ddh Corinebacterium glutamicum (Ishino, S. et al., Nucleic Acids Res., 15, 3917 (1987) ). Полученный амплифицированный фрагмент ДНК расщепляли ЕсоТ221 и Aval и расщепленные края затупляли. После этого этот фрагмент встраивали в сайт Smal pMW119 с получением плазмиды pDDH.
Ген ddh получали амплификацией гена ddh из хромосомной ДНК Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 согласно способу ПЦР с применением двух олигонуклеотидных праймеров (SEQ ID 21 и SEQ ID 22), полученных на основе известной нуклеотидной последовательности гена ddh Corinebacterium glutamicum (Ishino, S. et al., Nucleic Acids Res., 15, 3917 (1987) ). Полученный амплифицированный фрагмент ДНК расщепляли ЕсоТ221 и Aval и расщепленные края затупляли. После этого этот фрагмент встраивали в сайт Smal pMW119 с получением плазмиды pDDH.
Затем pDDH расщепляли SalI и EcoRI с последующим образованием тупых концов. После этого полученный фрагмент лигировали с pUC18, расщепленной Smal. Полученная таким образом плазмида была обозначена как pUC18DDH.
Brevi. -ori. вводили в полученную pUC18DDH для конструирования плазмиды, несущей ddh, автономно реплицируемый в коринеформных бактериях. рНК4 расщепляли рестриктазами KpnI и BamHI и расщепленные края затупляли. Образование тупых концов выполняли с использованием набора для затупления ДНК (производимого Takara Shuzo) согласно предложенному способу. После образования тупых концов фосфорилированный линкер PstI (производимый Takara Shuzo) лигировали таким образом, чтобы он был вставлен в сайт PstI pHSG299. Плазмида, сконструированная таким образом, была обозначена как рРК4. Затем pUC18DDH расщепляли XbaI и KpnI и полученный фрагмент лигировали с рРК4, расщепленной KpnI и XbaI. Так была сконструирована плазмида, содержащая ddh, автономно реплицируемый в коринеформных бактериях. Эта плазмида была названа pPK4D. Процесс конструирования pPK4D показан в ф иг. 6.
Пример 6: Конструирование плазмиды, содержащей комбинацию мутантного lysC и dapA
Плазмиду, содержащую мутантный lysC, dapA и начало репликации коринеформных бактерий, конструировали из плазмиды pCRDAPA, содержащей dapA, и плазмиды р399АК9В, содержащей мутантный lysC и Brevi.-ori. p399AK9B полностью разрушали SalI и затем затупляли и лигировали с линкером EcoRI для конструирования плазмиды, в которой сайт SalI был модифицирован в сайт EcoRI. Полученная плазмида была обозначена как р399АК 9BSE. Мутантный lysC и Brevi.-ori. вырезали в виде одного фрагмента частичной деградацией p399AK9BSE при помощи EcoRI. Этот фрагмент лигировали с pCRDAPA, расщепленной EcoRI. Полученная плазмида была обозначена как pCRCAB. Эта плазмида автономно реплицировалась в Е.coli и коринеформных бактериях, и она придает устойчивость к канамицину хозяину, причем эта плазмида содержала комбинацию lysC и dapA. Процесс конструирования pCRCAB показан в фиг.7.
Плазмиду, содержащую мутантный lysC, dapA и начало репликации коринеформных бактерий, конструировали из плазмиды pCRDAPA, содержащей dapA, и плазмиды р399АК9В, содержащей мутантный lysC и Brevi.-ori. p399AK9B полностью разрушали SalI и затем затупляли и лигировали с линкером EcoRI для конструирования плазмиды, в которой сайт SalI был модифицирован в сайт EcoRI. Полученная плазмида была обозначена как р399АК 9BSE. Мутантный lysC и Brevi.-ori. вырезали в виде одного фрагмента частичной деградацией p399AK9BSE при помощи EcoRI. Этот фрагмент лигировали с pCRDAPA, расщепленной EcoRI. Полученная плазмида была обозначена как pCRCAB. Эта плазмида автономно реплицировалась в Е.coli и коринеформных бактериях, и она придает устойчивость к канамицину хозяину, причем эта плазмида содержала комбинацию lysC и dapA. Процесс конструирования pCRCAB показан в фиг.7.
Пример 7: Конструирование плазмиды, содержащей комбинацию мутантного lysC и dapB
Плазмиду, содержащую мутантный lysC и dapB, конструировали из плазмиды р399АК9, имеющей мутантный lysC, и плазмиды p399DPR, имеющей dapB. Фрагмент 1101 п. н. , содержащий структурный ген DDPR, экстрагировали расщеплением p399DPR EcoRI и SphI. Этот фрагмент лигировали с р399АК9, расщепленной SalI и затем затупленной и дополнительно расщепленной SphI, для конструирования плазмиды, содержащей комбинацию мутантного lysC и dapB. Эта плазмида была обозначена как р399АКDDPR.
Плазмиду, содержащую мутантный lysC и dapB, конструировали из плазмиды р399АК9, имеющей мутантный lysC, и плазмиды p399DPR, имеющей dapB. Фрагмент 1101 п. н. , содержащий структурный ген DDPR, экстрагировали расщеплением p399DPR EcoRI и SphI. Этот фрагмент лигировали с р399АК9, расщепленной SalI и затем затупленной и дополнительно расщепленной SphI, для конструирования плазмиды, содержащей комбинацию мутантного lysC и dapB. Эта плазмида была обозначена как р399АКDDPR.
Затем Brevi. -ori. вводили в полученную p399AKDDPR. Плазмиду рНК4, содержащую Brevi.-ori., расщепляли рестриктазой КрnI (производимой Takara Shuzo) и расщепленные края затупляли. Образование тупых концов выполняли с применением набора для затупления ДНК (производимого Takara Shuzo) в соответствии с рекомендуемым способом. После образования тупых концов фосфорилированный линкер BamHI (производимый Takara Shuzo) лигировали для получения модификации так, чтобы фрагмент ДНК, соответствующий Brevi.-ori.-части, мог быть вырезан расщеплением только BamHI. Эту плазмиду расщепляли BamHI и полученный фрагмент ДНК с Brevi.-ori. лигировали с p399AKDDPR, расщепленной BamHI, для конструирования плазмиды, содержащей мутантный lysC и dapB, автономно реплицируемые в коринеформных бактериях. Сконструированная плазмида была обозначена как рСВ. Процесс конструирования рСВ показан в фиг.8.
Пример 8: Конструирование плазмиды, содержащей комбинацию dapA и dapB
Плазмиду pCRDAPA, содержащую dapA, расщепляли KpnI и EcoRI для экстракции фрагмента ДНК, содержащего dapA, который лигировали с векторной плазмидой pHSG399, расщепленной KpnI и EcoRI. Полученная плазмида была обозначена как p399DPS.
Плазмиду pCRDAPA, содержащую dapA, расщепляли KpnI и EcoRI для экстракции фрагмента ДНК, содержащего dapA, который лигировали с векторной плазмидой pHSG399, расщепленной KpnI и EcoRI. Полученная плазмида была обозначена как p399DPS.
С другой стороны, плазмиду pCRDAPB, содержащую dapB, расщепляли SacII и EcoRI для экстракции фрагмента ДНК 2,0 т. п. н., содержащего район, кодирующий DDPR, который лигировали с p399DPS, расщепленной SacII и EcoRI, для конструирования плазмиды, содержащей комбинацию dapA и dapB. Полученную плазмиду обозначали как р399АВ.
Затем в р399АВ вводили Brevi.-ori. pHK4, содержащую Brevi.-ori., расщепляли рестриктазой BamHI (производимой Takara Shuzo), и расщепленные края затупляли. Образование тупых концов выполняли с использованием набора для затупления ДНК (производимого Takara Shuzo) согласно предложенному способу. После образования тупых концов фосфорилированный линкер KpnI (производимый Takara Shuzo) лигировали для получения модификации так, чтобы фрагмент ДНК, соответствующий Brevi. -ori. -части, мог быть вырезан из pHK4 расщеплением только KpnI. Эту плазмиду расщепляли KpnI и полученный фрагмент ДНК Brevi. -ori. лигировали с р399АВ, расщепленной KpnI, для конструирования плазмиды, содержащей dapA и dapB, автономно реплицируемые в коринеформных бактериях. Сконструированная плазмида была обозначена как рАВ. Процесс конструирования рАВ показан в фиг.9.
Пример 9: Конструирование плазмиды, содержащей комбинацию ddh и lysA
Плазмиду pUC18DDH, содержащую ddh, расщепляли EcoRI и XbaI для экстракции фрагмента ДНК, содержащего ddh. Фрагмент ddh лигировали с плазмидой p399LYSA, содержащей lysA, расщепленной BamHI и XbaI, с затуплением расщепленных краев после расщепления. Полученная плазмида была обозначена как p399DL. Процесс конструирования p399DL показан в фиг. 10.
Плазмиду pUC18DDH, содержащую ddh, расщепляли EcoRI и XbaI для экстракции фрагмента ДНК, содержащего ddh. Фрагмент ddh лигировали с плазмидой p399LYSA, содержащей lysA, расщепленной BamHI и XbaI, с затуплением расщепленных краев после расщепления. Полученная плазмида была обозначена как p399DL. Процесс конструирования p399DL показан в фиг. 10.
Затем в p399DL вводили Brevi.-ori. рНК4 расщепляли XbaI и BamHI и расщепленные края затупляли. После образования тупых концов фосфорилированный линкер XbaI лигировали для получения модификации так, чтобы фрагмент ДНК, соответствующий Brevi. -ori. -части, мог быть вырезан из рНК4 расщеплением только XbaI. Эту плазмиду расщепляли XbaI и полученный фрагмент ДНК Brevi. -ori. лигировали с p399DL, расщепленной также XbaI, для конструирования плазмиды, содержащей ddh и lysA, автономно реплицируемые в коринеформных бактериях. Сконструированная плазмида была обозначена как pDL. Процесс конструирования pDL показан в фиг. 11.
Пример 10: Конструирование плазмиды, содержащей комбинацию мутантного lysC, dapA и dapB
p399DPS разрушали EcoRI и SphI с образованием тупых концов с последующей экстракцией фрагмента гена dapA. Этот фрагмент лигировали с р399АК9, расщепленной SalI, и затупляли для конструирования плазмиды р399СА, в которой сосуществовали мутантный lysC и dapA.
p399DPS разрушали EcoRI и SphI с образованием тупых концов с последующей экстракцией фрагмента гена dapA. Этот фрагмент лигировали с р399АК9, расщепленной SalI, и затупляли для конструирования плазмиды р399СА, в которой сосуществовали мутантный lysC и dapA.
Плазмиду pCRDAPB, содержащую dapB, расщепляли EcoRI и концы затупляли с последующим расщеплением SacI для экстракции фрагмента ДНК 2,0 т. п. н., содержащего dapB. Плазмиду р399СА, содержащую dapA и мутантный lysC, расщепляли SpeI и концы затупляли, а затем расщепляли SacI и лигировали с экстрагированным фрагментом dapB для получения плазмиды, содержащей мутантный lysC, dapA и dapB. Эта плазмида была обозначена как р399САВ.
Затем в р399САВ вводили Brevi.-ori. Плазмиду рНК4, содержащую Brevi.-ori. , расщепляли рестриктазой BamHI (производимой Takara Shuzo) и расщепленные края затупляли. Образование тупых концов выполняли с использованием набора для затупления ДНК (производимого Takara Shuzo) согласно предложенному способу. После образования тупых концов фосфорилированный линкер KpnI (производимый Takara Shuzo) лигировали для получения модификации так, чтобы фрагмент ДНК, соответствующий Brevi.-ori.-части, мог быть вырезан из рНК4 расщеплением только KpnI. Эту плазмиду расщепляли KpnI и полученный фрагмент ДНК Brevi.-ori. лигировали с р399САВ, расщепленной также KpnI, для конструирования плазмиды, содержащей комбинацию мутантного lysC, dapA и dapB, автономно реплицируемых в коринеформных бактериях. Сконструированная плазмида была обозначена как рСАВ. Процесс конструирования рСАВ показан в фиг.12.
Пример 11: Конструирование плазмиды, содержащей комбинацию мутантного lysC, dapA, dapB и lysA
Плазмиду p299LYSA, содержащую lysA, расщепляли KpnI и BamHI и концы затупляли, а затем экстрагировали фрагмент гена lysA. Этот фрагмент лигировали с рСАВ, расщепленной HpaI (производимой Takara Shuzo), и концы затупляли для конструирования плазмиды, содержащей комбинацию мутантного lysC, dapA, dapB и lysA, автономно реплицируемых в коринеформных бактериях. Сконструированная плазмида была обозначена как pCABL. Процесс конструирования pCABL показан в фиг. 13. Следует заметить, что фрагмент гена lysA вводят в сайт HpaI во фрагменте ДНК, содержащем ген dapB в pCABL, однако сайт HpaI локализован против хода транскрипции от промотора для гена dapB (номера нуклеотидов 611-616 в SEQ ID 10), и ген dapB не является отсоединенным.
Плазмиду p299LYSA, содержащую lysA, расщепляли KpnI и BamHI и концы затупляли, а затем экстрагировали фрагмент гена lysA. Этот фрагмент лигировали с рСАВ, расщепленной HpaI (производимой Takara Shuzo), и концы затупляли для конструирования плазмиды, содержащей комбинацию мутантного lysC, dapA, dapB и lysA, автономно реплицируемых в коринеформных бактериях. Сконструированная плазмида была обозначена как pCABL. Процесс конструирования pCABL показан в фиг. 13. Следует заметить, что фрагмент гена lysA вводят в сайт HpaI во фрагменте ДНК, содержащем ген dapB в pCABL, однако сайт HpaI локализован против хода транскрипции от промотора для гена dapB (номера нуклеотидов 611-616 в SEQ ID 10), и ген dapB не является отсоединенным.
Пример 12: Конструирование плазмиды, содержащей комбинацию мутантного lysC, dapA, dapB, ddh и lysA
pHSG299 расщепляли XbaI и KpnI, лигировали с p399DL, содержащей ddh и lysA, расщепленной XbaI и KpnI. Сконструированная плазмида была обозначена как p299DL. p299DL расщепляли XbaI и KpnI и концы затупляли. После образования тупых концов экстрагировали фрагмент ДНК, содержащий ddh и lysA. Этот фрагмент ДНК лигировали с плазмидой рСАВ, содержащей комбинацию мутантного lysC, dapA и dapB, расщепленной HpaI, и концы затупляли для конструирования плазмиды, содержащей комбинацию мутантного lysC, dapA, dapB, lysA и ddh, автономно реплицируемых в коринеформных бактериях. Сконструированная плазмида была обозначена как pCABDL. Процесс конструирования pCABDL показан в фиг.14.
pHSG299 расщепляли XbaI и KpnI, лигировали с p399DL, содержащей ddh и lysA, расщепленной XbaI и KpnI. Сконструированная плазмида была обозначена как p299DL. p299DL расщепляли XbaI и KpnI и концы затупляли. После образования тупых концов экстрагировали фрагмент ДНК, содержащий ddh и lysA. Этот фрагмент ДНК лигировали с плазмидой рСАВ, содержащей комбинацию мутантного lysC, dapA и dapB, расщепленной HpaI, и концы затупляли для конструирования плазмиды, содержащей комбинацию мутантного lysC, dapA, dapB, lysA и ddh, автономно реплицируемых в коринеформных бактериях. Сконструированная плазмида была обозначена как pCABDL. Процесс конструирования pCABDL показан в фиг.14.
Пример 13: Введение плазмид, содержащих гены для биосинтеза L-лизина, в L-лизин-продуцирующую бактерию Brevibacterium lactofermentum.
Плазмиды, содержащие ген для биосинтеза L-лизина, сконструированные, как описано выше, а именно p399KK9B(Cmr), pDPSB(Kmr), pDPRB (Cmr), pLYSAB(Cmr), pPK4D(Cmr), pCRCAB(Kmr), pAB(Cmr), pCB(Cmr), pDL(Cmr), pCAB(Cmr), pCABL(Cmr) и pCABDL (Cmr), вводили в L-лизин-продуцирующую бактерию AJ11082 (NRRL B-11470) Brevibacterium lactofermentum соответственно. Штамм AJ11082 обладает устойчивостью к АЕС. Плазмиды вводили согласно электроимпульсному способу (Sugimoto et al. , Japanese Patent Laid-open No.2-207791). Трансформанты отбирали на основе маркеров устойчивости к лекарственному средству, которым обладают соответствующие плазмиды. Трансформанты отбирали на полной среде, содержащей 5 мкг/мл хлорамфеникола, при введении плазмиды, содержащей ген устойчивости к хлорамфениколу, или трансформанты отбирали на полной среде, содержащей 25 мкг/мл канамицина, при введении плазмиды, содержащей ген устойчивости к канамицину.
Пример 14: Получение L-лизина
Каждый из трансформантов, полученных в Примере 13, культивировали в среде для продуцирования L-лизина для оценки продуктивности L-лизина трансформантом. Среда для продуцирования L-лизина имела следующий состав.
Каждый из трансформантов, полученных в Примере 13, культивировали в среде для продуцирования L-лизина для оценки продуктивности L-лизина трансформантом. Среда для продуцирования L-лизина имела следующий состав.
[Среда для продуцирования L-лизина]
Следующие компоненты, кроме карбоната кальция, (на 1 л) растворяли с доведением рН 8,0 при помощи КОН. Среду стерилизовали при 115oС в течение 15 минут, после чего к ней добавляли карбонат кальция, стерилизованный отдельно в горячем воздухе в сухом состоянии.
Следующие компоненты, кроме карбоната кальция, (на 1 л) растворяли с доведением рН 8,0 при помощи КОН. Среду стерилизовали при 115oС в течение 15 минут, после чего к ней добавляли карбонат кальция, стерилизованный отдельно в горячем воздухе в сухом состоянии.
Глюкоза - 100 г
(NH4)SO4 - 55 г
КН2РO4 - 1 г
МgSO4•7Н2О - 1 г
Биотин - 500 мкг
Тиамин - 2000 мкг
FeSO4•7H2O - 0,01 г
MnSO4•7H2O - 0,01 г
Никотинамид - 5 мг
Гидролизат белка(Маmеnоu) - 30 мл
Карбонат кальция - 50 г
Каждый из различных типов трансформантов и родительский штамм инокулировали в среду, имеющую состав, описанный выше, для проведения культивирования при 31,5oС с возвратно-поступательным качанием. Количество продуцируемого L-лизина после 40 и 72 часов культивирования и рост после 72 часов (OD562) показаны в таблице. В этой таблице lysC* обозначает мутантный lysC. Рост определяли количественно путем измерения OD при 560 нм после 101-кратного разведения.
(NH4)SO4 - 55 г
КН2РO4 - 1 г
МgSO4•7Н2О - 1 г
Биотин - 500 мкг
Тиамин - 2000 мкг
FeSO4•7H2O - 0,01 г
MnSO4•7H2O - 0,01 г
Никотинамид - 5 мг
Гидролизат белка(Маmеnоu) - 30 мл
Карбонат кальция - 50 г
Каждый из различных типов трансформантов и родительский штамм инокулировали в среду, имеющую состав, описанный выше, для проведения культивирования при 31,5oС с возвратно-поступательным качанием. Количество продуцируемого L-лизина после 40 и 72 часов культивирования и рост после 72 часов (OD562) показаны в таблице. В этой таблице lysC* обозначает мутантный lysC. Рост определяли количественно путем измерения OD при 560 нм после 101-кратного разведения.
Как показано в таблице, при отдельном усилении мутантного lysC, dapA или dapB количество продуцируемого L-лизина было больше количества, продуцируемого родительским штаммом после 72 часов культивирования, или равноценно этому количеству, однако количество продуцируемого L-лизина было ниже количества, продуцируемого родительским штаммом после 40 часов культивирования. То есть скорость продуцирования L-лизина снижалась при культивировании в течение короткого периода. Подобным образом при усилении мутантного lysC и dapA или dapA и dapB в сочетании количество продуцируемого L-лизина было больше, чем количество, продуцируемое родительским штаммом, после 72 часов культивирования, однако количество продуцируемого L-лизина было меньше количества, продуцируемого родительским штаммом, после 40 часов культивирования. Таким образом, скорость продуцирования L-лизина снижается.
С другой стороны, при отдельном усилении lysC или ddh или при совместном усилении lysC и ddh количество продуцируемого L-лизина было больше, чем количество, продуцируемое родительским штаммом после 40 часов культивирования, однако количество продуцируемого L-лизина было в результате меньше, чем количество, продуцируемое родительским штаммом после длительного периода культивирования вследствие уменьшения в росте.
Напротив, в случае штамма, в котором dapB был усилен вместе с мутантным lysC, рост был улучшенным, скорость продуцирования L-лизина успешно восстанавливалась в коротком периоде культивирования, и накопленное количество L-лизина улучшалось в длительном периоде культивирования. В случае штамма, в котором одновременно усиливались три гена, мутантный lysC, dapA и dapB, продуктивность L-лизина дополнительно улучшалась. Как скорость продуцирования L-лизина, так и количество накапливаемого L-лизина улучшались ступенчатым образом путем успешного усиления lysA и ddh.
Промышленная применимость
Согласно данному изобретению способность продуцирования L-лизина коринеформными бактериями может быть улучшена и может быть также улучшена скорость роста.
Согласно данному изобретению способность продуцирования L-лизина коринеформными бактериями может быть улучшена и может быть также улучшена скорость роста.
Скорость продуцирования L-лизина может быть улучшена и продуктивность может быть также улучшена в коринеформных продуцирующих L-лизин бактериях путем усиления dapB вместе с мутантным lysC. Скорость продуцирования L-лизина и продуктивность могут быть дополнительно улучшены путем успешного усиления dapA, lysA и ddh в дополнение к вышеуказанным генам.
Список последовательностей приведен в конце описания.
Claims (8)
1. Рекомбинантная ДНК, автономно реплицируемая в клетках коринеформных бактерий, содержащая: (а) последовательность ДНК, кодирующую аспартокиназу, у которой ингибирование по типу обратной связи L-лизином и L-треонином по существу десенсибилизировано, и включающую последовательность нуклеотидов 217-1479 в нуклеотидной последовательности, представленной на SEQ ID NO: 3, в которой нуклеотид G в положении 1051 изменен на А; и (b) последовательность ДНК, кодирующую дигидродипиколинатредуктазу и включающую последовательность нуклеотидов 311-1213 в нуклеотидной последовательности, представленной на SEQ ID NO: 14.
2. Рекомбинантная ДНК, автономно реплицируемая в клетках коринеформных бактерий, содержащая: (а) последовательность ДНК, кодирующую аспартокиназу, у которой ингибирование по типу обратной связи L-лизином и L-треонином по существу десенсибилизировано, и включающую последовательность нуклеотидов 217-1479 в нуклеотидной последовательности, представленной на SEQ ID NO: 3, в которой нуклеотид G в положении 1051 изменен на А; и (b) последовательность ДНК, кодирующую дигидродипиколинатредуктазу и включающую последовательность нуклеотидов 311-1213 в нуклеотидной последовательности, представленной на SEQ ID NO: 14; и (с) последовательность ДНК, кодирующую дигидродипиколинатсинтазу и включающую последовательность нуклеотидов 730-1473 в нуклеотидной последовательности, представленной на SEQ ID NO: 10.
3. Рекомбинантная ДНК, автономно реплицируемая в клетках коринеформных бактерий, содержащая: (а) последовательность ДНК, кодирующую аспартокиназу, у которой ингибирование по типу обратной связи L-лизином и L-треонином по существу десенсибилизировано, и включающую последовательность нуклеотидов 217-1479 в нуклеотидной последовательности, представленной на SEQ ID NO: 3, в которой нуклеотид G в положении 1051 изменен на А; (b) последовательность ДНК, кодирующую дигидродипиколинатредуктазу и включающую последовательность нуклеотидов 311-1213 в нуклеотидной последовательности, представленной на SEQ ID NO: 14; (с) последовательность ДНК, кодирующую дигидродипиколинатсинтазу и включающую последовательность нуклеотидов 730-1473 в нуклеотидной последовательности, представленной на SEQ ID NO: 10; и (d) последовательность ДНК, кодирующую диаминопимелатдекарбоксилазу и включающую последовательность нуклеотидов 533-2182 в нуклеотидной последовательности, представленной на SEQ ID NO: 18.
4. Рекомбинантная ДНК, автономно реплицируемая в клетках коринеформных бактерий, содержащая: (а) последовательность ДНК, кодирующую аспартокиназу, у которой ингибирование по типу обратной связи L-лизином и L-треонином по существу десенсибилизировано, и включающую последовательность нуклеотидов 217-1479 в нуклеотидной последовательности, представленной на SEQ ID NO: 3, в которой нуклеотид G в положении 1051 изменен на А; (b) последовательность ДНК, кодирующую дигидродипиколинатредуктазу и включающую последовательность нуклеотидов 311-1213 в нуклеотидной последовательности, представленной на SEQ ID NO: 14; (с) последовательность ДНК, кодирующую дигидродипиколинатсинтазу и включающую последовательность нуклеотидов 730-1473 в нуклеотидной последовательности, представленной на SEQ ID NO: 10; (d) последовательность ДНК, кодирующую диаминопимелатдекарбоксилазу и включающую последовательность нуклеотидов 533-2182 в нуклеотидной последовательности, представленной на SEQ ID NO: 18; и (е) последовательность ДНК, кодирующую диаминопимелатдегидрогеназу и включающую последовательность нуклеотидов 61-1020 в нуклеотидной последовательности, представленной на SEQ ID NO: 23.
5. Способ получения L-лизина, отличающийся тем, что коринеформные бактерии, трансформированные рекомбинантной ДНК, охарактеризованной в п. 1, культивируют в среде, подходящей для продуцирования и накопления L-лизина в культуре бактерии, и L-лизин извлекают из культуры.
6. Способ получения L-лизина, отличающийся тем, что коринеформные бактерии, трансформированные рекомбинантной ДНК, охарактеризованной в п. 2, культивируют в среде, подходящей для продуцирования и накопления L-лизина в культуре бактерий, и L-лизин извлекают из культуры.
7. Способ получения L-лизина, отличающийся тем, что коринеформные бактерии, трансформированные рекомбинантной ДНК, охарактеризованной в п. 3, культивируют в среде, подходящей для продуцирования и накопления L-лизина в культуре бактерий, и L-лизин извлекают из культуры.
8. Способ получения L-лизина, отличающийся тем, что коринеформные бактерии, трансформированные рекомбинантной ДНК, охарактеризованной в п. 4, культивируют в среде, подходящей для продуцирования и накопления L-лизина в культуре бактерий, и L-лизин извлекают из культуры.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14061495 | 1995-06-07 | ||
| JP7/140614 | 1995-06-07 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU98100099A RU98100099A (ru) | 2000-07-20 |
| RU2197528C2 true RU2197528C2 (ru) | 2003-01-27 |
Family
ID=15272810
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU98100099/13A RU2197528C2 (ru) | 1995-06-07 | 1996-06-05 | Способ получения l-лизина (варианты) и рекомбинантная днк, используемая для его осуществления (варианты) |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US20020086370A1 (ru) |
| EP (1) | EP0841395B1 (ru) |
| JP (1) | JP3106501B2 (ru) |
| KR (1) | KR100268324B1 (ru) |
| CN (1) | CN1165619C (ru) |
| AU (1) | AU705550B2 (ru) |
| BR (1) | BR9606379A (ru) |
| CA (1) | CA2224058C (ru) |
| CZ (1) | CZ293268B6 (ru) |
| DK (1) | DK0841395T3 (ru) |
| ES (1) | ES2373863T3 (ru) |
| HU (1) | HU222503B1 (ru) |
| MX (1) | MX9709923A (ru) |
| RU (1) | RU2197528C2 (ru) |
| SK (1) | SK285013B6 (ru) |
| WO (1) | WO1996040934A1 (ru) |
| ZA (1) | ZA964665B (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2588665C2 (ru) * | 2011-12-21 | 2016-07-10 | СиДжей ЧеилДжеданг Корпорейшн | Способ получения l-лизина с использованием микроорганизмов, обладающих способностью продуцировать l-лизин |
Families Citing this family (60)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3106501B2 (ja) | 1995-06-07 | 2000-11-06 | 味の素株式会社 | Ｌ−リジンの製造法 |
| JP4035855B2 (ja) * | 1996-06-05 | 2008-01-23 | 味の素株式会社 | Ｌ−リジンの製造法 |
| JP4075087B2 (ja) * | 1996-12-05 | 2008-04-16 | 味の素株式会社 | Ｌ−リジンの製造法 |
| SK285201B6 (sk) * | 1996-12-05 | 2006-08-03 | Ajinomoto Co., Inc. | Rekombinantná DNA, autonómne reprodukovaná v bunkách koryneformnej baktérie, koryneformná baktéria a spôsob výroby L-lyzínu, vektor pVK7 |
| US6114145A (en) * | 1997-12-05 | 2000-09-05 | Human Genome Sciences, Inc. | Synferon, a synthetic interferon |
| DE19931317A1 (de) * | 1999-07-07 | 2001-01-11 | Degussa | L-Lysin produzierende coryneforme Bakterien und Verfahren zur Herstellung von L-Lysin |
| JP3965821B2 (ja) * | 1999-03-09 | 2007-08-29 | 味の素株式会社 | Ｌ−リジンの製造法 |
| DE19912384A1 (de) * | 1999-03-19 | 2000-09-21 | Degussa | Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung coryneformer Bakterien |
| WO2000056859A1 (en) * | 1999-03-19 | 2000-09-28 | Ajinomoto Co., Inc. | Process for producing l-amino acid |
| JP2003135066A (ja) * | 1999-03-19 | 2003-05-13 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−リジンの製造法 |
| JP2003180348A (ja) * | 1999-07-02 | 2003-07-02 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸の製造法 |
| JP2003180355A (ja) * | 1999-07-02 | 2003-07-02 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸の製造法 |
| JP2003169674A (ja) * | 1999-07-02 | 2003-06-17 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−リジンの製造法 |
| JP2003144161A (ja) * | 1999-07-02 | 2003-05-20 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸の製造法 |
| JP2003144160A (ja) * | 1999-07-02 | 2003-05-20 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸の製造法 |
| DE19931314A1 (de) * | 1999-07-07 | 2001-01-11 | Degussa | L-Lysin produzierende coryneforme Bakterien und Verfahren zur Herstellung von Lysin |
| JP2001046067A (ja) | 1999-08-04 | 2001-02-20 | Ajinomoto Co Inc | 好熱性バチルス属細菌由来のｌ−リジン生合成系遺伝子 |
| PL341895A1 (en) * | 1999-08-12 | 2001-02-26 | Ajinomoto Kk | Plasmide autonomously replicable in corynebacter bacteria |
| US6927046B1 (en) | 1999-12-30 | 2005-08-09 | Archer-Daniels-Midland Company | Increased lysine production by gene amplification using coryneform bacteria |
| NZ527129A (en) | 2001-02-08 | 2005-05-27 | Archer Daniels Midland Co | Polynucleotide constructs for increased lysine production |
| CN101126075B (zh) * | 2001-08-06 | 2012-05-09 | 赢创德固赛有限公司 | 生产化合物ⅱ的棒状细菌 |
| DE60335774D1 (de) | 2002-11-26 | 2011-03-03 | Ajinomoto Kk | Methode für die Produktion von L-Glutamin und L-Glutamin-produzierendes Bakterium |
| JP4655539B2 (ja) * | 2004-08-06 | 2011-03-23 | 味の素株式会社 | アシラーゼを用いたβアミノ酸の製造方法 |
| RU2350655C2 (ru) | 2004-10-07 | 2009-03-27 | Адзиномото Ко., Инк. | Способ получения основного вещества |
| JP2009089603A (ja) * | 2006-02-02 | 2009-04-30 | Ajinomoto Co Inc | メタノール資化性細菌を用いたｌ−リジンの製造法 |
| HUE030521T2 (en) | 2006-03-30 | 2017-05-29 | Basf Se | A method for producing cadaverine |
| JP2010041920A (ja) | 2006-12-19 | 2010-02-25 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸の製造法 |
| JP2010088301A (ja) | 2007-02-01 | 2010-04-22 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸の製造法 |
| JP2011067095A (ja) | 2008-01-10 | 2011-04-07 | Ajinomoto Co Inc | 発酵法による目的物質の製造法 |
| CN102348806A (zh) | 2008-01-23 | 2012-02-08 | 味之素株式会社 | L-氨基酸的生产方法 |
| CN101939440A (zh) * | 2008-02-04 | 2011-01-05 | 巴斯夫欧洲公司 | 吡啶二羧酸/盐的生产方法 |
| RU2451748C1 (ru) | 2008-03-03 | 2012-05-27 | Глобал Био-Чем Текнолоджи Груп Компани Лимитед | Рекомбинантная днк и способ получения l-лизина |
| JP2012029565A (ja) | 2008-11-27 | 2012-02-16 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸の製造法 |
| JP2010142200A (ja) | 2008-12-22 | 2010-07-01 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−リジンの製造法 |
| CN102471790B (zh) | 2009-07-29 | 2014-10-29 | 味之素株式会社 | 产生l-氨基酸的方法 |
| JP2012196144A (ja) | 2009-08-03 | 2012-10-18 | Ajinomoto Co Inc | ビブリオ属細菌を用いたｌ−リジンの製造法 |
| JP2012223091A (ja) | 2009-08-25 | 2012-11-15 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸の製造法 |
| KR101226384B1 (ko) * | 2010-03-05 | 2013-01-25 | 씨제이제일제당 (주) | 개량된 프로모터 및 이를 이용한 ｌ-라이신의 생산 방법 |
| EP2374873A1 (en) * | 2010-04-08 | 2011-10-12 | Technische Universität Hamburg-Harburg | Modified aspartate kinase from corynebacterium and its application for amino acid production |
| RU2011134436A (ru) | 2011-08-18 | 2013-10-27 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") | Способ получения l-аминокислоты с использованием бактерии семейства enterobacteriaceae, обладающей повышенной экспрессией генов каскада образования флагелл и клеточной подвижности |
| CN103667165B (zh) * | 2012-09-12 | 2017-05-31 | 中国科学院上海生命科学研究院 | 高产l‑赖氨酸的生产菌株及其应用 |
| JP2016192903A (ja) | 2013-09-17 | 2016-11-17 | 味の素株式会社 | 海藻由来バイオマスからのｌ−アミノ酸の製造方法 |
| BR112016007286B1 (pt) | 2013-10-02 | 2021-07-20 | Ajinomoto Co., Inc | Métodos de controle de amônia e para produção de uma substância alvo, e, aparelho para controle de amônia |
| KR101518860B1 (ko) * | 2013-10-11 | 2015-05-12 | 씨제이제일제당 (주) | L-아미노산의 생산 방법 |
| CN105821090B (zh) * | 2015-01-08 | 2019-12-13 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 嗜热共生杆菌meso-二氨基庚二酸脱氢酶突变体应用 |
| EP3415622A1 (en) | 2017-06-14 | 2018-12-19 | Evonik Degussa GmbH | Method for production of fine chemicals using a corynebacterium secreting modified alpha-1,6-glucosidases |
| EP3456833A1 (en) | 2017-09-18 | 2019-03-20 | Evonik Degussa GmbH | Method for the fermentative production of l-amino acids |
| EP3467099A1 (en) | 2017-10-05 | 2019-04-10 | Evonik Degussa GmbH | Method for the fermentative production of l-amino acids |
| EP3498853A1 (en) | 2017-12-14 | 2019-06-19 | Evonik Degussa GmbH | Method for the fermentative production of l-lysine |
| EP3594355A1 (en) | 2018-07-12 | 2020-01-15 | Evonik Operations GmbH | Method for the fermentative production of l-lysine |
| EP3599282B1 (en) | 2018-07-24 | 2021-03-17 | Evonik Operations GmbH | Method for the fermentative production of l-lysine |
| RU2019128538A (ru) | 2018-09-26 | 2021-03-11 | Эвоник Оперейшенс ГмбХ | Способ ферментативного получения l-лизина |
| EP3660158A1 (en) | 2018-11-29 | 2020-06-03 | Evonik Operations GmbH | Method for the fermentative production of l-lysine |
| EP3670525A1 (en) | 2018-12-18 | 2020-06-24 | Evonik Operations GmbH | Method for the fermentative production of l-lysine using c. glutamicum strains with a mutated kup transporter |
| US10829746B2 (en) | 2019-01-23 | 2020-11-10 | Evonik Operations Gmbh | Method for the fermentative production of L-lysine |
| WO2023041425A1 (en) | 2021-09-20 | 2023-03-23 | Evonik Operations Gmbh | Method for the fermentative production of l-lysine using c. glutamicum strains expressing modified gluconate repressor proteins gntr1 and gntr2 |
| WO2023222515A1 (en) | 2022-05-18 | 2023-11-23 | Evonik Operations Gmbh | Biotechnological production of bisucaberins, desferrioxamines and analogs thereof |
| US20250340893A1 (en) | 2022-05-18 | 2025-11-06 | Evonik Operations Gmbh | Biotechnological production of desferrioxamines and analogs thereof |
| CN119212692A (zh) | 2022-05-18 | 2024-12-27 | 赢创运营有限公司 | 比苏卡林、去铁胺及其类似物的单体的生物技术生产 |
| EP4613854A1 (en) | 2024-03-05 | 2025-09-10 | Evonik Operations GmbH | Method for the fermentative production of l-lysine using c. glutamicum strains expressing a heterologous nicotinamide nucleotide transhydrogenase pntab and having an increased activity of a myo-inositol permease |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB2103617A (en) * | 1981-08-10 | 1983-02-23 | Kyowa Hakko Kogyo Kk | Production of L-lysine by fermentation and new microorganisms obtained by protoplast fusion |
| US4861722A (en) * | 1983-08-24 | 1989-08-29 | Ajinomoto Company, Inc. | Coryneform bacteria carrying recombinant plasmids and their use in the fermentative production of L-lysine |
| EP0387527B1 (de) * | 1989-03-14 | 1994-06-22 | Degussa Aktiengesellschaft | Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Lysin |
Family Cites Families (20)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH07112431B2 (ja) * | 1985-09-06 | 1995-12-06 | 味の素株式会社 | 遺伝子発現調節法 |
| JPH03147792A (ja) * | 1989-11-01 | 1991-06-24 | Mitsubishi Petrochem Co Ltd | 新規ｄｎａ及び該ｄｎａを含有するプラスミド |
| JPH03147791A (ja) * | 1989-11-01 | 1991-06-24 | Mitsubishi Petrochem Co Ltd | 新規ｄｎａ及び該ｄｎａを含有するプラスミド |
| DE3943117A1 (de) * | 1989-12-27 | 1991-07-04 | Forschungszentrum Juelich Gmbh | Verfahren zur fermentativen herstellung von aminosaeure, insbesondere l-lysin, dafuer geeignete mikroorganismen und rekombinante dna |
| WO1992003546A1 (en) * | 1990-08-23 | 1992-03-05 | Exogene Corporation | Enhancement of production of native products in corynebacterium by expression of cloned bacterial hemoglobin |
| US5693781A (en) * | 1991-06-03 | 1997-12-02 | Mitsubishi Chemical Corporation | Promoter DNA fragment from coryneform bacteria |
| JP3473042B2 (ja) * | 1992-04-28 | 2003-12-02 | 味の素株式会社 | 変異型アスパルトキナーゼ遺伝子 |
| JPH0775578A (ja) * | 1993-09-08 | 1995-03-20 | Mitsubishi Chem Corp | ジヒドロジピコリン酸レダクターゼをコードする遺伝子を含むｄｎａ断片およびその利用 |
| JPH07155184A (ja) * | 1993-12-08 | 1995-06-20 | Ajinomoto Co Inc | 発酵法によるｌ−リジンの製造法 |
| JP3106501B2 (ja) | 1995-06-07 | 2000-11-06 | 味の素株式会社 | Ｌ−リジンの製造法 |
| EP0756007A3 (en) * | 1995-06-30 | 1997-10-29 | Ajinomoto Kk | Gene-marking process with artificial transposon |
| JP4035855B2 (ja) * | 1996-06-05 | 2008-01-23 | 味の素株式会社 | Ｌ−リジンの製造法 |
| SK285201B6 (sk) * | 1996-12-05 | 2006-08-03 | Ajinomoto Co., Inc. | Rekombinantná DNA, autonómne reprodukovaná v bunkách koryneformnej baktérie, koryneformná baktéria a spôsob výroby L-lyzínu, vektor pVK7 |
| CN1170938C (zh) | 1998-09-25 | 2004-10-13 | 味之素株式会社 | 构建产生氨基酸的细菌的方法及通过发酵该经构建的产生氨基酸的细菌以制备氨基酸的方法 |
| HK1042321B (en) * | 1999-04-19 | 2012-02-24 | 协和发酵工业株式会社 | Novel desensitized aspartokinase |
| AU781091B2 (en) | 1999-07-02 | 2005-05-05 | Ajinomoto Co., Inc. | DNA encoding sucrose PTS enzyme II |
| PL341895A1 (en) | 1999-08-12 | 2001-02-26 | Ajinomoto Kk | Plasmide autonomously replicable in corynebacter bacteria |
| CN1230525C (zh) | 1999-12-24 | 2005-12-07 | 味之素株式会社 | 生产l－氨基酸的方法和新型基因 |
| JP4655539B2 (ja) | 2004-08-06 | 2011-03-23 | 味の素株式会社 | アシラーゼを用いたβアミノ酸の製造方法 |
| EP1882740B1 (en) | 2006-07-26 | 2010-04-14 | Ajinomoto Co., Inc. | N-acetyl-(R,S)-B-amino acid acylase gene |
-
1996
- 1996-06-05 JP JP09500307A patent/JP3106501B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1996-06-05 US US08/952,976 patent/US20020086370A1/en not_active Abandoned
- 1996-06-05 BR BR9606379A patent/BR9606379A/pt unknown
- 1996-06-05 AU AU59107/96A patent/AU705550B2/en not_active Expired
- 1996-06-05 EP EP96916305A patent/EP0841395B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-06-05 ZA ZA964665A patent/ZA964665B/xx unknown
- 1996-06-05 ES ES96916305T patent/ES2373863T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-06-05 MX MX9709923A patent/MX9709923A/es active IP Right Grant
- 1996-06-05 WO PCT/JP1996/001511 patent/WO1996040934A1/ja not_active Ceased
- 1996-06-05 KR KR1019970709002A patent/KR100268324B1/ko not_active Expired - Lifetime
- 1996-06-05 CA CA2224058A patent/CA2224058C/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-06-05 CN CNB961959525A patent/CN1165619C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1996-06-05 DK DK96916305.4T patent/DK0841395T3/da active
- 1996-06-05 SK SK1640-97A patent/SK285013B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1996-06-05 CZ CZ19973903A patent/CZ293268B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1996-06-05 HU HU9802666A patent/HU222503B1/hu active IP Right Grant
- 1996-06-05 RU RU98100099/13A patent/RU2197528C2/ru active
-
2002
- 2002-08-23 US US10/226,136 patent/US7846698B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2010
- 2010-10-29 US US12/915,793 patent/US8183017B2/en not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB2103617A (en) * | 1981-08-10 | 1983-02-23 | Kyowa Hakko Kogyo Kk | Production of L-lysine by fermentation and new microorganisms obtained by protoplast fusion |
| US4861722A (en) * | 1983-08-24 | 1989-08-29 | Ajinomoto Company, Inc. | Coryneform bacteria carrying recombinant plasmids and their use in the fermentative production of L-lysine |
| EP0387527B1 (de) * | 1989-03-14 | 1994-06-22 | Degussa Aktiengesellschaft | Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Lysin |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2588665C2 (ru) * | 2011-12-21 | 2016-07-10 | СиДжей ЧеилДжеданг Корпорейшн | Способ получения l-лизина с использованием микроорганизмов, обладающих способностью продуцировать l-лизин |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ZA964665B (en) | 1997-01-07 |
| CZ390397A3 (cs) | 1998-06-17 |
| JP3106501B2 (ja) | 2000-11-06 |
| BR9606379A (pt) | 1997-08-12 |
| CN1192242A (zh) | 1998-09-02 |
| KR19990022521A (ko) | 1999-03-25 |
| US20020086370A1 (en) | 2002-07-04 |
| DK0841395T3 (da) | 2012-01-09 |
| SK285013B6 (sk) | 2006-04-06 |
| CA2224058A1 (en) | 1996-12-19 |
| US20110065153A1 (en) | 2011-03-17 |
| CN1165619C (zh) | 2004-09-08 |
| CA2224058C (en) | 2011-09-13 |
| SK164097A3 (en) | 1998-07-08 |
| EP0841395A1 (en) | 1998-05-13 |
| HUP9802666A2 (hu) | 1999-02-01 |
| CZ293268B6 (cs) | 2004-03-17 |
| US20030054506A1 (en) | 2003-03-20 |
| US7846698B2 (en) | 2010-12-07 |
| AU5910796A (en) | 1996-12-30 |
| MX9709923A (es) | 1998-03-31 |
| WO1996040934A1 (en) | 1996-12-19 |
| US8183017B2 (en) | 2012-05-22 |
| EP0841395B1 (en) | 2011-11-02 |
| ES2373863T3 (es) | 2012-02-09 |
| EP0841395A4 (en) | 2005-07-27 |
| AU705550B2 (en) | 1999-05-27 |
| KR100268324B1 (ko) | 2000-10-16 |
| HU222503B1 (hu) | 2003-07-28 |
| HUP9802666A3 (en) | 2001-08-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2197528C2 (ru) | Способ получения l-лизина (варианты) и рекомбинантная днк, используемая для его осуществления (варианты) | |
| JP4035855B2 (ja) | Ｌ−リジンの製造法 | |
| JP4075087B2 (ja) | Ｌ−リジンの製造法 | |
| JP4168463B2 (ja) | Ｌ−リジンの製造法 | |
| EP0854189B1 (en) | Method for producing L-lysine | |
| JPWO1996040934A1 (ja) | Ｌ−リジンの製造法 | |
| WO2000056858A1 (fr) | Procede de production de l-lysine | |
| JP2000253879A (ja) | Ｌ−リジンの製造法 |