ES2373863T3 - Procedimiento de producción de l-lisina. - Google Patents

Abstract

LA CAPACIDAD DE PRODUCCION DE L RIA CORINEFORME PORTADORA DE UNA ASPARTOQUINASA EN LA QUE LA RETROINHIBICION POR L ANCIALMENTE DESENSIBILIZADA ESTIMULANDO SUCESIVAMENTE EL DNA QUE CODIFICA UNA DIHIDROPICOLINATO REDUCTASA, EL DNA QUE CODIFICA UNA DIHIDROPICOLINATO SINTASA, EL DNA QUE CODIFICA UNA DIAMINOPIMELATO DESCARBOXILASA Y EL DNA QUE CODIFICA UNA DIAMINOPIMELATO DESHIDROGENASA.

Description

Procedimiento de producción de L-lisina.

Campo técnico

La presente invención se refiere a un procedimiento de producción de L-lisina cultivando un microorganismo obtenido modificando una bacteria corineforme usada para producción fermentativa de aminoácidos o similares por medio de una técnica basada en ingeniería genética.

Técnica anterior

La L-lisina, que se usa como un aditivo del forraje, se produce usualmente por un procedimiento fermentativo usando una cepa mutante de producción de L-lisina que pertenece a las bacterias corineformes. Diversas bacterias que producen L-lisina conocidas en la actualidad son aquellas creadas por mutación artificial partiendo de cepas de tipo silvestre que pertenecen a las bacterias corineformes.

En cuanto a las bacterias corineformes, se ha desvelado un plásmido vector que es autónomamente replicable en células bacterianas y tiene un gen marcador de resistencia a fármacos (véase Patente de los Estados Unidos N.º 4,514,502) y un procedimiento para introducir un gen en células bacterianas (por ejemplo, Patente japonesa abierta a inspección pública N.º 2-207791). Hay también revelada una posibilidad para reproducir una bacteria que produzca L-treonina- o L-isoleucina usando las técnicas según se describen anteriormente (véanse Patentes de Estados Unidos N.ºs 4.452.890 y 4.442.208). En cuanto a la cría de una bacteria que produce L-lisina, se conoce una técnica, en la que un gen que participa en la biosíntesis de L-lisina se incorpora a un plásmido de vector para amplificar el gen en las células bacterianas (por ejemplo, Patente japonesa abierta a inspección pública N.º 56160997).

Los genes conocidos para biosíntesis de L-lisina incluyen, por ejemplo, un gen de dihidrodipicolinato reductasa (Patente japonesa abierta a inspección pública N.º 7-75578) y un gen de diaminopimelato deshidrogenasa (Ishino,

S. y cols., Nucleic Acids Res., 15, 3917 (1987)) en los que está clonado un gen biosíntesis de L-lisina, así como un gen de fosfoenolpiruvato carboxilasa (Patente japonesa abierta a inspección pública N.º 60-87788), un gen de dihidrodipicolinato sintasa (Patente japonesa abierta a inspección pública N.º 6-55149) y un gen de diaminopimelato descarboxilasa (Patente japonesa abierta a inspección pública N.º 60-62994) en los que la amplificación de un gen afecta a la productividad de L-lisina.

En cuanto a las enzimas que participan en la biosíntesis de L-lisina, se conoce un caso de una enzima que sufre inhibición de retrolimentación cuando se usa como un tipo silvestre. En este caso, la productividad de L-lisina se mejora introduciendo un gen de enzima que tenga tal mutación que la inhibición de retroalimentación esté desensibilizada. Aquellos conocidos como un gen tal incluyen específicamente, por ejemplo, un gen de aspartocinasa (Panfleto de Publicación Internacional de WO 94/25605).

Como se describe anteriormente, ciertos resultados exitosos se han obtenido por medio de amplificación de genes por el sistema de biosíntesis de L-lisina, o por introducción de genes mutantes. Por ejemplo, una bacteria corineforme, que alberga un gen de aspartocinasa mutante con inhibición concertada desensibilizada por lisina y treonina, produce una cantidad considerable de L-lisina (aproximadamente 25 g/l). Sin embargo, esta bacteria sufre disminución de la velocidad de crecimiento comparada con una bacteria que alberga gen de aspartocinasa no mutante. Se informó también que la productividad de L-lisina se mejora introduciendo adicionalmente un gen de dihidropicolinato sintasa además de un gen de aspartocinasa mutante (Applied and Environmental Microbiology, 57 (6), 1746-1752 (1991)). Sin embargo, una bacteria tal sufre la disminución adicional en velocidad de crecimiento.

En cuanto al gen de dihidropicolinato reductasa, se ha demostrado que la actividad de dihidropicolinato reductasa está incrementada en una bacteria corineforme en la que se ha introducido el gen, sin embargo, no está incluido ningún informe para la influencia en productividad de L-lisina (Patente japonesa abierta a inspección pública N.º 775578).

En las circunstancias presentes, no se conoce ningún caso para la bacteria corineforme, en la que cualquiera haya tenido éxito en mejora remarcable en rendimiento de L-lisina sin restringir crecimiento combinando una pluralidad de genes para biosíntesis de L-lisina. No se ha comunicado ningún caso en el que se desee mejorar el crecimiento potenciando un gen para biosíntesis de L-lisina también.

Revelación de la invención

Un objeto de la presente invención es mejorar la capacidad de producir L-lisina y la velocidad de crecimiento de una bacteria corineforme usando materiales genéticos de secuencias de ADN que codifican cada una para aspartocinasa (de ahora en adelante referida como "AK", con la condición de que un gen que codifica para una proteína AK se refiera de ahora en adelante como "lysC", si es necesario), dihidrodipicolinato reductasa (de ahora en adelante referida como "DDPR", con la condición de que un gen que codifica para una proteína DDPR se refiera de ahora en adelante como "dapB", si es necesario), dihidrodipicolinato sintasa (de ahora en adelante abreviada como "DDPS", con la condición de que un gen que codifica para una proteína DDPS se refiere de ahora en adelante como "dapA", si es necesario), diaminopimelato descarboxilasa (de ahora en adelante referida como "DDC", con la condición de que un gen que codifica para una proteína DDC se refiere de ahora en adelante como "lysA", si es necesario), y diaminopimelato deshidrogenasa (de ahora en adelante referida como "DDH", con la condición de que un gen que codifica para una proteína DDH se refiere de ahora en adelante como "ddh", si es necesario) que son enzimas importantes para biosíntesis de L-lisina en células de bacterias corineformes.

Cuando una sustancia objetivo se produce fermentativamente usando un microorganismo, la velocidad de producción, así como el rendimiento de la sustancia objetivo en relación a un material introducido, es un factor extremadamente importante. Una sustancia objetivo se puede producir de forma remarcablemente económica incrementando la velocidad de producción por una unidad de equipamiento de fermentación. De acuerdo con ello, es industrialmente extremadamente importante que el rendimiento fermentativo y la velocidad de producción sean compatibles el uno con la otra. La presente invención propone una solución para el problema como se describe anteriormente con el fin de producir fermentativamente L-lisina usando una bacteria corineforme.

El principio de la presente invención está basado en el hecho que el crecimiento de una bacteria corineforme puede mejorarse y la velocidad de producción de L-lisina de la misma se puede llevar a cabo realizando potenciación en tanto que combinamos dauB con lysC mutante (de ahora en adelante referido simplemente como "mutante lvsC", si es necesario) que codifica AK mutante (de ahora en adelante referida simplemente como "mutante AK", si es necesario) en la que la inhibición concertada por lisina y treonina está desensibilizada, según se compara con un caso en el que lysC está potenciada individualmente y en el que la velocidad de producción de L-lisina se puede mejorar adicionalmente en una manera por etapas potenciando sucesivamente dapA, lysA y ddh.

Concretamente, la presente invención radica en un vector autónomamente replicable en células de bacterias corineformes, que comprenden una secuencia de ADN que codifica para una aspartocinasa en la que la inhibición por retroalimentación por L-lisina y L-treonina está desensibilizada y una secuencia de ADN que codifica una dihidrodipicolinato reductasa obtenida de una bacteria corineforme. La presente invención proporciona un vector que comprende adicionalmente una secuencia de ADN que codifica para una dihidropicolinato sintasa, además de cada una de las secuencias de ADN descritas anteriormente. La presente invención proporciona un vector que comprende adicionalmente una secuencia de ADN que codifica para una diaminopimelato descarboxilasa, además de las tres secuencias de ADN descritas anteriormente. La presente invención proporciona un vector adicional que comprende una secuencia de ADN que codifica para una diaminopimelato deshidrogenasa, además de las cuatro secuencias de ADN descritas anteriormente.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una bacteria corineforme que comprende una secuencia de ADN potenciada que codifica para una aspartocinasa en la que la inhibición por retroalimentación por L-lisina y L-treonina está desensibilizada y que comprende una secuencia de ADN potenciada codificada por una dihidropicolinato reductasa, en la que el ADN está potenciado incrementando el número de copias de un gen, usando un promotor fuerte, o combinando estos medios.

La presente invención proporciona una bacteria corineforme que comprende adicionalmente ADN que codifica para una dihidropicolinato sintasa en la bacteria corineforme mencionada anteriormente. La presente invención proporciona una bacteria corineforme adicional que comprende adicionalmente ADN potenciado que codifica para una diaminopimelato descarboxilasa en la bacteria corineforme mencionada anteriormente, además de los tres ADN descritos anteriormente. La presente invención proporciona una bacteria corineforme adicional que comprende codificación de ADN para una diaminopimelato deshidrogenasa en la bacteria corineforme mencionada anteriormente, además de los cuatro ADN descritos anteriormente.

En otro aspecto más, la presente invención proporciona un procedimiento para producir L-lisina comprendiendo las etapas de cultivar una cualquiera de las bacterias corineformes descritas anteriormente en un medio apropiado, producir y acumular L-lisina en un cultivo de las bacterias y recoger L-lisina del cultivo.

Las bacterias corineformes referidas en la presente invención son un grupo de microorganismos según se definen en el Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8ª ed., p. 599 (1974), que son bacilos gram-positivos que no tienen resistencia a ácidos y que no tienen capacidad de formar esporas. Las bacterias corineformes incluyen bacterias que pertenecen al género Corynebacterium, bacterias que pertenecían al género Brevibacterium que han sido clasificadas hasta ahora dentro del género Brevibacterium pero que actualmente se han unido como bacterias que pertenecen al género Corynebacterium y las bacterias que pertenecen al género Brevibacterium estrechamente relacionadas con bacterias que pertenecen al género Corynebacterium.

La presente invención se explicará en detalle a continuación.

<1> Preparación de genes para biosíntesis de L-lisina usados para la presente invención

Los genes para biosíntesis de L-lisina usados en la presente invención se obtienen respectivamente preparando ADN cromosómico a partir de una bacteria como un donante de ADN, construyendo una biblioteca de ADN cromosómico usando un vector de plásmido o similar, seleccionando una cepa que albergue un gen deseado y recuperando, de la cepa seleccionada, ADN recombinante en el que se ha insertado el gen. El donante de ADN para el gen para biosíntesis de L-lisina usado en la presente invención no está limitado específicamente con la condición de que el gen deseado para biosíntesis de L-lisina expresa una proteína enzimática que funciona en células de bacterias corineformes. Sin embargo, el donante de ADN es preferentemente una bacteria corineforme.

Todos los genes de lysC, dapA y dapB que se originan a partir de bacterias corineformes tienen secuencias conocidas. De acuerdo con ello, pueden obtenerse llevando a cabo amplificación de acuerdo con el procedimiento de reacción en cadena de la polimerasa (PCR; véase White, T. J. y cols., Trends Genet., 5, 185 (1989))

Cada uno de los genes para biosíntesis de L-lisina usados en la presente invención es obtenible de acuerdo con ciertos procedimientos según se ejemplifican más adelante.

(1) Preparación de lysC mutante

Un fragmento de ADN que contiene lysC mutante puede prepararse a partir de una cepa mutante en la que la inhibición de retroalimentación sinérgica en la actividad de AK por L-lisina y L-treonina está sustancialmente desensibilizada (Panfleto de Publicación Internacional de WO 94/25605). Se puede obtener una cepa mutante tal, por ejemplo, a partir de un grupo de células que se originan a partir de una cepa de tipo silvestre de una bacteria corineforme sometida a un tratamiento de mutación aplicando un tratamiento de mutación normal tal como irradiación ultravioleta y tratamiento con un agente mutante tal como N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina. La actividad AK se puede medir usando un procedimiento descrito por Miyajima, R. y cols. en The Journal of Biochemistry (1968), 63 (2), 139-148. La cepa mutante más preferida como tal está representada por una bacteria AJ3445 que produce L-lisina (FERM P-1944) derivada por un tratamiento de mutación a partir de una cepa de tipo silvestre de Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 (habiendo cambiado su nombre actual de Corynebacterium glutamicum).

Alternativamente, el mutante lysC es también obtenible por un tratamiento de mutación in vitro de ADN de plásmido que contiene lysC de tipo silvestre. En otro aspecto, se conoce específicamente información sobre la mutación para desensibilizar inhibición de retroalimentación sinérgica sobre AK por L-lisina y L-treonina (Panfleto de Publicación Internacional de WO 94/25605). De acuerdo con ello, lysC mutante se puede preparar también a partir de lysC de tipo silvestre sobre la base de la información de acuerdo con, por ejemplo, el procedimiento de mutagénesis dirigida de sitio.

Un fragmento que comprende lysC se puede aislar a partir de una bacteria corineforme preparando ADN cromosómico de acuerdo con, por ejemplo, un procedimiento de Saito y Miura (H. Saito y K. Miura, Biochem. Biophys. Acta, 72, 619 (1963)) y amplificando lysC de acuerdo con el procedimiento de reacción de cadena de la polimerasa (PCR; véase White, T. J. y cols.,Trends Genet., 5, 185 (1989)).

Los cebadores de ADN se ejemplifican por ADN de cadena simple de 23-meros y 21-meros que tienen las secuencias de nucleótidos mostradas en SEC ID N.ºs: 1 y 2 en el Listado de secuencias con el fin de amplificar, por ejemplo, una región de aproximadamente 1.643 pb que codifica para lysC basada en una secuencia conocida para Corynebacterium glutamicum (véase Molecular Microbiology (1991), 5 (5), 1197-1204; Mol. Gen. Genet. (1990), 224, 317-324). El ADN se puede sintetizar de acuerdo con un procedimiento normal usando modelo 380B de sintetizador de ADN producido por Applied Biosystems y usando el procedimiento de fosforoamidita (véase Tetrahedron Letters (1981), 22, 1859). PCR se puede llevar a cabo usando un termociclador de ADN modelo PJ2000 producido por Takara Shuzo y usando ADN polimerasa Taq de ADN de acuerdo con un procedimiento designado por el proveedor.

Se prefiere que lysC amplificado por PCR esté ligado con vector de ADN autónomamente replicable en células de E. coli y/o bacterias corineformes para preparar ADN recombinante y el ADN recombinante se introduce en células de

E. coli con antelación. Tal provisión hace fácil seguir las operaciones. El vector autónomamente replicable en células de E. coli es preferentemente un vector de plásmido qué es preferentemente autónomamente replicable en células de un huésped, incluyendo, por ejemplo, pUC19, pUC18, pBR322, pHSG299, pHSG399, pHSG398 y RSF1010.

Cuándo un fragmento de ADN que tiene una capacidad para permitir que un plásmido sea autónomamente replicable en bacterias corineformes está insertado dentro de estos vectores, se puede usar como un así llamado vector de lanzadera autónomamente replicable tanto en E. coli como en bacterias corineformes.

Un vector de lanzadera incluye los siguientes. Se muestran entre paréntesis microorganismos que albergan cada uno de estos vectores y números de depósito en las instalaciones de depósito internacionales.

pHC4:

Escherichia coli AJ12617 (FERM BP-3532)

pAJ655:

Escherichia coli AJ11882 (FERM BP-136)

Corynebacterium glutamicum SR8201 (ATCC 39135)

pAJ1844:

Escherichia coli AJ11883 (FERM BP-137)

Corynebacterium glutamicum SR8202 (ATCC 39136)

pAJ611: Escherichia coli AJ11884 (FERM BP-138)

pAJ3148: Corynebacterium glutamicum SR8203 (ATCC 39137)

pAJ440: Bacillus subtilis AJ11901 (FERM BP-140)

Estos vectores son obtenibles a partir de los microorganismos depositados como sigue. Las células recogidas en una fase de crecimiento logarítmico se lisaron usando lisozima y SDS, seguidas por separación de un lisado por centrifugación a 30.000 x g para obtener un sobrenadante al que se añade polietilenoglicol, seguido por fraccionamiento y purificación por medio de centrifugación de gradiente de densidad de cloruro de cesio-bromuro de etidio.

E. coli puede transformarse introduciendo un plásmido de acuerdo con, por ejemplo, un procedimiento de D. M. Morrison (Methods in Enzymology, 68, 326 (1979)) o un procedimiento en el que las células receptoras se tratan con cloruro de calcio para incrementar permeabilidad de ADN (Mandel, M. e Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)).

El lysC de tipo silvestre se obtiene cuándo lysC está aislado de una cepa de tipo silvestre AK, mientras que lysC mutante se obtiene a partir de una cepa de AK mutante de acuerdo con el procedimiento como se describe anteriormente.

Un ejemplo de una secuencia de nucleótidos de un fragmento de ADN que contiene lysC de tipo silvestre se muestra en SEC ID N.º: 3 en el Listado de secuencias. Una secuencia de aminoácidos de subunidad a de una proteína de AK de tipo silvestre se deduce de la secuencia de nucleótidos, que se muestra en la SEC ID N.º: 4 en Listado de secuencias conjuntamente con la secuencia de ADN. Sólo la secuencia de aminoácidos se muestra en la SEC ID N.º: 5. Una secuencia de aminoácidos de subunidad 1 de la proteína AK de tipo silvestre se deduce de la secuencia de nucleótidos de ADN, que se muestra en la SEC ID N.º: 6 en Listado de secuencias conjuntamente con la secuencia de ADN. Sólo la secuencia de aminoácidos se muestra en la SEC ID N.º: 7. En cada una de las subunidades, GTG se usa como un codón de iniciación y un aminoácido correspondiente está representado por metionina. Sin embargo, esta representación se refiere a metionina, valina, o formilmetionina.

El mutante lysC usado en la presente invención no está específicamente limitado siempre que codifique para AK en la que la inhibición de retroalimentación por L-lisina y L-treonina esté desensibilizada. Sin embargo, el lysC mutante se ejemplifica por uno que incluye mutación en la que un 279 enésimo residuo de alanina contado a partir del extremo N-terminal está cambiado por un residuo de aminoácido distinto de alanina y distinto de aminoácido ácido en la subunidad a y un residuo de alanina 30 enésimo está cambiado por un residuo de aminoácido distinto de alanina y distinto de aminoácido ácido en la subunidad 1 en la secuencia de aminoácidos de la AK de tipo silvestre. La secuencia de aminoácidos de la AK de tipo silvestre incluye específicamente la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID N.º: 5 en Listado de secuencias como la subunidad a y la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID N.º: 7 en Listado de secuencias como la subunidad 1.

Aquellos preferidos como el residuo de aminoácido distinto de alanina y distinto de otros aminoácidos incluyen residuos de treonina, arginina, cisteína, fenilanalina, prolina, serina, tirosina y valina.

El codón correspondiente a un residuo de aminoácidos a sustituirse no está limitado específicamente por su tipo siempre y cuando ello codifique para el residuo de aminoácidos. Se asume que la secuencia de aminoácidos de AK de tipo silvestre poseída puede diferir ligeramente dependiendo de la diferencia en las especies bacterianas y en las cepas bacterianas. Las AK, que tienen mutación basada en, por ejemplo, sustitución, deleción o inserción de uno o más residuos aminoacídicos en una o más posiciones irrelevantes para la actividad enzimática como se describe anteriormente, puede usarse también por la presente invención. Otras AK, que tienen mutación basada en, por ejemplo, sustitución, deleción, o inserción de otros uno o más residuos de aminoácidos, se pueden usar también siempre y cuando no se ejerza influencia en la actividad AK y en la desensibilización de inhibición de retroalimentación sinérgica por L-lisina y L-treonina.

Una cepa AJ12691 obtenida introduciendo un plásmido 399AK9B de lysC mutante dentro de una cepa p399AK9B (FERM BP-734) como una cepa de tipo silvestre de Brevibacterium lactofermentum se ha depositado el 10 de abril, 1992 con un número de depósito de FERM P-12918 en National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology of Ministry of International Trade and Industry (código postal: 305, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japón), se ha transferido al depósito internacional en base al Tratado de Budapest el 10 de febrero, 1995 y se ha depositado con el número de depósito de FERM BP-4999.

(2) Preparación de dapB

Un fragmento de ADN que contiene dapB se puede preparar a partir de cromosoma de una bacteria corineforme por medio de PCR. El donante de ADN no está limitado específicamente, sin embargo, está ejemplificado por la cepa ATCC 13869 de Brevibacterium lactofermentum.

Una secuencia codificante de ADN para DDPR se conoce por Brevibacterium lactofermentum (Journal of Bacteriology, 175 (9), 2743-2749 (1993)), en la base a la que se pueden preparar cebadores de ADN para PCR. Tales cebadores de ADN están específicamente ejemplificados por ADN de 23-meros que tienen respectivamente secuencias de nucleótidos representadas en las SEC ID N.ºs: 8 y 9 en Listado de secuencias. Síntesis de ADN, PCR y preparación de un plásmido que contiene dapB obtenido se pueden llevar a cabo de la misma manera que aquellas para el lysC descritas anteriormente.

Una secuencia de nucleótidos de un fragmento de ADN que contiene dapB y una secuencia de aminoácidos deducida de la secuencia de nucleótidos se ilustran en SEC ID N.º: 10. Sólo la secuencia de aminoácidos se muestra en la SEC ID N.º: 11. Además de fragmentos de ADN que codifican para esta secuencia de aminoácidos, la presente invención puede usar equivalentemente fragmentos de ADN que codifican para secuencias de aminoácidos sustancialmente iguales a la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID N.º: 11, concretamente secuencias de aminoácidos que tienen mutación basada en, por ejemplo, sustitución, deleción, o inserción de uno o más aminoácidos siempre y cuando no haya influencia sustancial sobre la actividad DDPR.

Una cepa transformante AJ13107 obtenida introduciendo un plásmido de pCRDAPB que contiene dapB obtenido en el Ejemplo descrito más tarde en la cepa JM109 de E. coli se ha depositado desde el 26 de mayo, 1995 con un número de depósito de FERM BP-5114 en National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology of Ministry of International Trade and Industry (código postal: 305, 1-3, Higashi 1chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japón) en base al Tratado de Budapest.

(3) Preparación de dapA

Un fragmento de ADN que contiene dapA puede ser prepararse a partir de cromosoma de bacteria corineforme por medio de PCR. El donante de ADN no está limitado específicamente, sin embargo, está ejemplificado por la cepa ATCC 13869 de Brevibacterium lactofermentum.

Una secuencia de ADN codificada por DDPS se conoce por Corynebacterium glutamicum (véase Nucleic Acids Research, 18 (21), 6421 (1990); Número de acceso de EMBL X53993), sobre la base de lo que se pueden preparar cebadores de ADN para PCR. Tales cebadores de ADN están específicamente ejemplificados por ADN de 23-meros que tienen respectivamente secuencias de nucleótidos representadas en las SEC ID N.ºs: 12 y 13 en Listado de secuencia. Síntesis de ADN, PCR y preparación de un plásmido que contiene dapA obtenido se pueden llevar a cabo de la misma manera que aquellos para el lysC descrito anteriormente.

Una secuencia de nucleótidos de un fragmento de ADN que contiene dapA y una secuencia de aminoácidos deducida de la secuencia de nucleótidos se ejemplifican en SEC ID N.º: 14. Sólo la secuencia de aminoácidos se muestra en la SEC ID N.º: 15. Además de fragmentos de ADN que codifican para esta secuencia de aminoácidos, la presente invención puede usar equivalentemente fragmentos de ADN que codifican para secuencias de aminoácidos sustancialmente iguales a la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID N.º: 15, concretamente secuencias de aminoácidos que tienen mutación basada en, por ejemplo, sustitución, deleción, o inserción de uno o más aminoácidos siempre y cuando no haya influencia sustancial en la actividad DDPS.

Una cepa transformante de AJ13106 obtenida introduciendo un plásmido de pCRDAPA que contiene dapA obtenido en el Ejemplo descrito más tarde en la cepa JM109 de E. coli se ha depositado desde el 26 de mayo, 1995 con un número de depósito de FERM BP-5113 en National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology of Ministry of International Trade and Industry (código postal: 305, 1-3, Higashi 1chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japón) en base al Tratado de Budapest.

(4) Preparación de lysA

Un fragmento de ADN que contiene lysA se puede preparar a partir del cromosoma de una bacteria corineforme por medio de PCR. El donante de ADN no está limitado específicamente, sin embargo, está ejemplificado por la cepa ATCC 13869 de Brevibacterium lactofermentum.

En las bacterias corineformes, lysA forma un operón junto con argS (gen de arginil-ARNt sintasa) y lysA existe corriente abajo a partir de argS. La expresión de lysA está regulada por un promotor que existe corriente arriba de argS (véase Journal of Bacteriology, nov., 7356-7362 (1993)). Las secuencias de ADN de estos genes se conocen para Corynebacterium glutamicum (véanse Molecular Microbiology, 4 (11), 1819-1830 (1990); Molecular and General Genetics, 212, 112-119 (1988)), sobre la base de lo que los cebadores de ADN se pueden preparar por PCR. Tales cebadores de ADN están ejemplificados específicamente por 23-meros de ADN que tienen respectivamente secuencias de nucleótidos mostradas en la SEC ID N.º: 16 en Listado de secuencia (correspondiente a los nucleótidos números 11 a 33 en una secuencia de nucleótidos descrita en Molecular Microbiology, 4 (11), 1819-1830 (1990)) y en la SEC ID N.º: 17 (correspondiente a los números de nucleótidos 1370 a 1392 en una secuencia de nucleótidos descrita en Molecular and General Genetics, 212, 112-119 (1988)). Síntesis de ADN, PCR y preparación de un plásmido que contiene lysA obtenido se pueden llevar a cabo de la misma manera que aquellas para el lysC descritas anteriormente.

En el ejemplo descrito más tarde, un fragmento de ADN que contiene un promotor, argS y lysA se usó con el fin de potenciar lysA. Sin embargo, argS no es esencial para la presente invención. Es aceptable usar un fragmento de ADN en el que lysA esté ligado justo corriente abajo a partir de un promotor.

Una secuencia de nucleótidos de un fragmento de ADN que contiene args y lysA y una secuencia de aminoácidos

5 deducida que se codifica por la secuencia de nucleótidos se ejemplifican en la SEC ID N.º: 18. Un ejemplo de una secuencia de aminoácidos codificada por argS se muestra en la SEC ID N.º: 19, y un ejemplo de una secuencia de aminoácidos codificada por lysA se muestra en la SEC ID N.º: 20. Además de fragmentos de ADN que codifican para estas secuencias de aminoácidos, la presente invención puede usar equivalentemente fragmentos de ADN que codifican para secuencias de aminoácidos sustancialmente iguales a la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID N.º: 20, concretamente secuencias de aminoácidos que tienen mutación basada en, por ejemplo, sustitución, deleción, o inserción de uno o más aminoácidos siempre y cuando no haya influencia sustancial en la actividad DDC.

(5) Preparación de ddh

Un fragmento de ADN que contiene ddh se puede preparar a partir de cromosoma de una bacteria corineforme por

15 medio de PCR. El donante de ADN no está limitado específicamente, sin embargo, está ejemplificado por la cepa ATCC 13869 de Brevibacterium lactofermentum.

Un gen de DDH se conoce para Corynebacterium glutamicum (Ishino, S. y cols., Nucleic Acids Res., 15, 3917 (1987)), en base a lo que se pueden preparar cebadores para PCR. Tales cebadores de ADN están específicamente ejemplificados por ADN de 20-meros que tienen respectivamente secuencias de nucleótidos representadas en las SEC ID N.ºs: 21 y 22 en el Listado de secuencias. Síntesis de ADN, PCR y preparación de un plásmido que contiene ddh obtenido se pueden llevar a cabo de la misma manera que aquellas para el lysC descritas anteriormente.

Una secuencia de nucleótidos de un fragmento de ADN que contiene ddh y una secuencia de aminoácidos deducida de la secuencia de nucleótidos están ilustradas en SEC ID N.º: 23. Sólo la secuencia de aminoácidos se muestra en SEC ID N.º: 24. Además de fragmentos de ADN que codifican para esta secuencia de aminoácidos, la presente

25 invención puede usar equivalentemente fragmentos de ADN que codifican para secuencias de aminoácidos sustancialmente iguales a la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID N.º: 24, concretamente secuencias de aminoácidos que tengan mutación basada en, por ejemplo, sustitución, deleción, o inserción de uno o más aminoácidos siempre y cuando no haya influencia sustancial en la actividad DDH.

<2> ADN recombinante y bacteria corineforme de la presente invención

La bacteria corineforme de la presente invención alberga una aspartocinasa (AK mutante) en la que la inhibición de retroalimentación por L-lisina y L-treonina está desensibilizada, donde la codificación de ADN (dapB) para una dihidrodipicolinato reductasa está potenciada. En una realización preferida, la bacteria corineforme de la presente invención es una bacteria corineforme en la que ADN (dapA) que codifica para dihidrodipicolinato sintasa está potenciada adicionalmente. En una realización más preferida, la bacteria corineforme de la presente invención es

35 una bacteria corineforme en la que ADN (lysA) que codifica para dihidrodipicolinato descarboxilasa está potenciada adicionalmente. En una realización más preferida, la bacteria corineforme de la presente invención es una bacteria corineforme en la que el ADN (ddh) que codifica para dihidrodipicolinato deshidrogenasa está potenciado adicionalmente.

El término &quot;potencia&quot; el ADN, se refiere en el presente documento al hecho de que la actividad intracelular de una enzima codificada por el ADN se eleva incrementando el número de copias de un gen, usando un promotor fuerte, o combinando estos medios.

La bacteria corineforme que alberga la AK mutante puede ser aquella que produce la aspartocinasa mutante como resultado de mutación, o aquellas que están transformadas introduciendo lysC mutante.

Ejemplos de la bacteria corineforme usados para introducir el ADN descrito anteriormente incluyen, por ejemplo, las 45 siguientes cepas de tipo silvestre productoras de lisina:

Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870;

Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806;

Corynebacterium cellunae ATCC 15991;

Corynebacterium glutamicum ATCC 13032;

(Brevibacterium divaricatum) ATCC 14020;

(Brevibacterium lactofermentum) ATCC 13869; (Corynebacterium lilium) ATCC 15990;

(Brevibacterium flavum) ATCC 14067;

Corynebacterium melassecola ATCC 17965;

Brevibacterium saccharolyticum ATCC 14066;

5 Brevibacterium immariophilum ATCC 14068;

Brevibacterium roseum ATCC 13825;

Brevibacterium thiogenitalis ATCC 19240;

Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15354;

Corynebacterium thermoaminogenes AJ12340 (FERM BP-1539).

10 Distintas de las cepas bacterianas descritas anteriormente, aquellas usables como un anfitrión incluyen, por ejemplo, cepas mutantes que tienen una capacidad productora de L-lisina derivada de las cepas mencionadas anteriormente. Tales cepas mutantes artificiales incluyen las siguientes: cepas mutantes resistentes a S-(2aminoetil)-cisteína (de ahora en adelante abreviada como &quot;AEC&quot;) (Brevibacterium lactofermentum AJ11082 (NRRL B-1147), Publicaciones de Patentes japonesas N.ºs: 56-1914, 56-1915, 57-14157, 57-14158, 57-30474, 58-10075,

15 59-4993, 61 -35840, 62-24074, 62-36673, 5-11958, 7-112437, y 7-112438); cepas mutantes que requieren aminoácido tal como l-homoserina para su crecimiento (Publicaciones de Patente japonesa N.ºs: 48-28078 y 566499); cepas mutantes que presentan resistencia a AEC y requieren aminoácidos tales como L-leucina, Lhomoserina, L-prolina, L-serina, L-arginina, L-alanina y L-valina (Patentes de Estados Unidos N.ºs: 3.708.395 y 3.825.472); cepas mutantes que producen L-lisina que presentan a exposición a DL-a-amino-e-caprolactama, a

20 amino-laurillactama, análogo de aspartato, fármaco sulfa, quinoide y N-lauroilleucina; cepas mutantes que producen L-lisina que presentan resistencia a inhibidores de oxialoacetato descarboxilasa o de enzimas del sistema respiratorio (Patentes japonesas abiertas a inspección pública N.ºs: 50-53588, 50-31093, 52-102498, 53-9394, 5386089, 55-9783, 55-9759, 56-32995 y 56-39778 y Publicaciones de Patentes japonesas N.ºs: 53-43591 y 53-1833); cepas mutantes que producen L-lisina que requieren inositol o ácido acético (Patentes japonesas abiertas a

25 inspección pública N.ºs: 55-9784 y 56-8692); cepas mutantes que producen L-lisina que presentan sensibilidad a ácido fluoropirúvico o a temperatura no menor de 34 °C (Patentes japonesas abiertas a inspección pública N.ºs: 559783 y 53-86090); y que producen las cepas mutantes que pertenecen al género Brevibacterium o Corynebacterium que presentan resistencia a etilenoglicol y producen L-lisina (Patente de los Estados Unidos N.º: 4.411.997).

En una realización especificada, con el fin de potenciar los genes para biosíntesis de L-lisina en el huésped como se

30 describe anteriormente, los genes se introducen en el huésped usando un vector plasmídico, un transposón o un vector fágico o similar. Sobre la introducción, se espera hacer potenciación en algún grado incluso usando un vector de tipo de copia baja. Sin embargo, se prefiere usar un vector de tipo de copias múltiples. Un vector tal incluye, por ejemplo, vectores plasmídicos, pAJ655, pAJ1844, pAJ611, pAJ3148 y pAJ440 descritos anteriormente. Además, los transposones derivados de bacteria corineformes se describen en los Panfletos de Publicaciones Internacionales de

35 WO02/02627 y WO93/18151, Publicación de Patente Europea N.º: 445385, la Patente Japonesa Abierta a Inspección Pública N.º: 6-46867, Vertes, A. A. y cols., Mol. Microbiol., 11, 739-746 (1994), Bonamy, C., y col., Mol. Microbiol., 14, 571-581 (1994), Vertes, A. A. y cols., Mol. Gen. Genet., 245, 397-405 (1994), Jagar, W. y cols., FEMS Microbiology Letters, 126, 1-6 (1995), la Patente Japonesa Abierta a Inspección Pública N.º: 7-107976, la Patente Japonesa Abierta a Inspección Pública N.º: 7-327680 y similares.

40 En la presente invención, el lysC mutante en una bacteria corineforme está potenciado. Es aceptable usar aquellas que tienen mutación en lysC en ADN cromosómico, o en las que el lysC mutante está incorporado a ADN cromosómico. Alternativamente, el lysC mutante puede introducirse usando un vector plasmídico. Por otro lado, dapA, dapB, lysA y ddh están preferentemente potenciados con el fin de producir eficientemente L-lisina.

Cada uno de los genes de lysC, dapA, dapB, lysA y ddh puede estar sucesivamente introducido dentro del huésped

45 usando diferentes vectores respectivamente. Alternativamente, dos, tres, cuatro, o cinco especies de los genes pueden introducirse conjuntamente usando un vector individual. Cuando se usan los diferentes vectores, los genes se pueden introducir en cualquier orden, sin embargo, se prefiere usar vectores que tengan un mecanismo de partición y de albergamiento en el huésped y que sean capaces de coexistir el uno con el otro.

Una bacteria corineforme que alberga el AK mutante y que comprende adicionalmente dapB potenciado se obtiene,

50 por ejemplo, introduciendo, dentro de una bacteria corineforme huésped, un ADN recombinante que contiene lysC y dapB mutantes autónomamente replicable en células de bacterias corineformes.

Una bacteria corineforme que comprende adicionalmente dapA potenciado además de lysC y dapB mutantes, se obtiene, por ejemplo, introduciendo, dentro de una bacteria corineforme huésped, un ADN recombinante que contiene lysC, dapB y dapA mutantes autónomamente replicables en células de bacterias corineformes.

Una bacteria corineforme que comprende adicionalmente lysA potenciado además de lysC, dapB y dapA mutantes se obtiene, por ejemplo, introduciendo, dentro de una bacteria corineforme hospedadora, un ADN recombinante que contiene lysC, dapB, dapA y lysA mutantes replicables autónomamente en células de bacterias corineformes.

Una bacteria corineforme que comprende adicionalmente ddhpotenciado además de lysC, dapB, dapA y lysA mutantes se obtiene, por ejemplo, introduciendo, dentro de una bacteria corineforme huésped, un ADN recombinante que contiene lysC, dapB, dapA, lysA y ddh mutantes replicables autónomamente en células de bacterias corineformes.

Los ADN recombinantes anteriormente mencionados se pueden obtener, por ejemplo, insertando cada uno de los genes que participan en biosíntesis de L-lisina dentro de un vector tal como vector plasmídico, transposón o vector fágico como se describe anteriormente.

En el caso en el que un plásmido se usa como un vector, el ADN recombinante puede introducirse dentro del huésped de acuerdo con un procedimiento de pulso eléctrico (Sugimoto y cols., Patente japonesa abierta a inspección pública N.º: 2-207791). Se puede llevar a cabo la amplificación de un gen usando transposones introduciendo un plásmido que lleva un transposón dentro de la célula hospedadora e induciendo transposición del transposón.

<3> Procedimiento para producir L-lisina

L-lisina puede producirse eficientemente cultivando, en un medio apropiado, la bacteria corineforme que comprende los genes potenciados para la biosíntesis de L-lisina como se describen anteriormente, produciendo y acumulando L-lisina en un cultivo de la bacteria y recogiendo L-lisina a partir del cultivo.

El medio a usarse está ejemplificado por un medio ordinario que contiene una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, iones inorgánicos y opcionalmente otros componentes orgánicos.

Como la fuente de carbono, es posible usar azúcares tales como glucosa, fructosa, sacarosa, melaza e hidrolizado de almidón; y ácidos orgánicos como ácido fumárico, ácido cítrico y ácido succínico.

Como la fuente de nitrógeno, es posible usar sales de amonio inorgánico tales como sulfato de amonio, cloruro de amonio y fosfato de amonio; nitrógeno orgánico tal como hidrolizado de soja; gas de amoníaco; y amoníaco acuoso.

Como fuentes de nutrientes traza orgánicos, es deseable contener sustancias requeridas tales como vitamina B y lhomoserina o extracto de levaduras o similares en cantidades apropiadas. Distintos de los anteriores, fosfato de potasio, sulfato de magnesio, ión hierro, ión manganeso y así sucesivamente se añaden en cantidades pequeñas, si es necesario.

El cultivo se lleva preferentemente a cabo en una condición aeróbica durante aproximadamente 30 a 90 horas. La temperatura de cultivo se controla preferentemente a 25 °C a 37 °C y el pH se controla preferentemente a 5 a 8 durante el cultivo. Se pueden usar para el ajuste de pH sustancias ácidas o alcalinas, inorgánicas u orgánicas, o gas de amoníaco o similares. L-lisina puede recogerse a partir de un cultivo combinando un procedimiento de resina de intercambio iónico normal, un procedimiento de precipitación y otros procedimientos conocidos.

Breve descripción de los dibujos

Fig. 1 ilustra un procedimiento de construcción de plásmidos p399AKYB y p399AK9B comprendiendo lysC mutante.

Fig. 2 ilustra un procedimiento de construcción de un plásmido pDPRB comprendiendo dapB y Brevi.-o.

Fig. 3 ilustra un procedimiento de construcción de un plásmido pDPSB comprendiendo dapA y Brevi.-ori.

Fig. 4 ilustra un procedimiento de construcción de un plásmido p299LYSA comprendiendo lysA.

Fig. 5 ilustra un procedimiento de construcción de un plásmido pLYSAB comprendiendo lysA y Brevi.-ori.

Fig. 6 ilustra un procedimiento de construcción de un plásmido pPK4D comprendiendo ddh y Brevi.-ori.

Fig. 7 ilustra un procedimiento de construcción de un plásmido pCRCAB comprendiendo lysC, dapB y Brevi. -ori.

Fig. 8 ilustra un procedimiento de construcción de un plásmido pCB que comprende lysC mutante, dapB y Brevi.- ori.

Fig. 9 ilustra un procedimiento de construcción de un plásmido pAB comprendiendo dapA, dapB y Brevi.-ori.

Fig. 10 ilustra un procedimiento de construcción de un plásmido p399DL comprendiendo ddh y lysA.

Fig. 11 ilustra un procedimiento de construcción de un plásmido pDL comprendiendo ddh, lysA y Brevi.-ori.

Fig. 12 ilustra un procedimiento de construcción de un plásmido pCAB que comprende lysC mutante, dapA, dapB y Brevi.-ori.

Fig. 13 ilustra un procedimiento de construcción de un plásmido pCABL comprendiendo lysC mutante, dapA, dapB, lysA y Brevi.-ori.

Fig. 14 ilustra un procedimiento de construcción de un plásmido pCABDL que comprende lysC mutante, dapA, dapB, ddh, lysA y Brevi.-ori.

Descripción de realizaciones preferidas

La presente invención se explicará más específicamente a continuación con referencia a Ejemplos.

Ejemplo 1: Preparación de gen lysC de tipo silvestre y de gen lysC mutante a partir de Brevibacterium lactofermentum

<1> Preparación de lysC de tipo silvestre y de lysC mutantes y preparaciones de plásmidos que los contienen

Una cepa de Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 y una cepa mutante AJ3445 que produce L-lisina (FERM P-1944) obtenida de la cepa ATCC 13869 por un tratamiento de mutación se usaron como donantes de ADN cromosómico. La cepa AJ3445 se hubo sometido a mutación de tal forma que lysC se cambió implicando desensibilización sustancial de inhibición concertada por lisina y treonina (Journal of Biochemistry, 68, 701-710 (1970)).

Un fragmento de ADN que contiene lysC se amplificó a partir de ADN cromosómico de acuerdo con el procedimiento de PCR (reacción de cadena de la polimerasa; véase White, T. J. y cols., Trends Genet., 5, 185 (1989)). En cuanto a cebadores de ADN usados para amplificación, ADN de hebra simple de 23-meros y 21-meros que tienen secuencias mostradas en SEC ID N.ºs: 1 y 2 se sintetizaron con el fin de amplificar una región de aproximadamente 1.643 pares de bases que codifican para lysC en base a una secuencia conocida de Corynebacterium glutamicum (véanse Molecular Microbiology (1991), 5 (5), 1197-1204; (1991), 5(5), 1197-1204; y Mol. Gen. Genet. (1990), 224, 317-324). El ADN se sintetizó de acuerdo con un procedimiento normal usando modelo 380B de sintetizador de ADN producido por Applied Biosystems y usando el procedimiento de fosforoamidita (véase Tetrahedron Letters (1981), 22, 1859).

El gen estuvo amplificado por PCR usando termociclador de ADN Modelo PJ2000 producido por Takara Shuzo y usando ADN polimerasa Taq de acuerdo con un procedimiento designado por el proveedor. Un fragmento de gen amplificado de 1.643 kb se confirmó por electroforesis de gel de agarosa. Después de eso, el fragmento escindido del gen se purificó de acuerdo con un procedimiento ordinario y se digirió con enzimas de restricción Nrul (producidas por Takara Shuzo) y EcoRI (producidas por Takara Shuzo).

Se usó pHSG399 (véase Takeshita, S. y cols., Gen (1987), 61, 63-74) como un vector de clonación para el fragmento génico. pHSG399 se digirió con enzimas de restricción Smal (producidas por Takara Shuzo) y Eco RI y se ligó con el fragmento de lysC amplificado. ADN se ligó usando kit de ligazón de ADN (producido por Takara Shuzo) de acuerdo con un procedimiento designado. Así se prepararon plásmidos, en los que los fragmentos de lysC amplificados a partir de cromosomas de Brevibacterium lactofermentum se ligaron con pHSG399 respectivamente. Un plásmido que comprende lysC de ATCC 13869 (cepa de tipo silvestre) se designó como p399AKY y un plásmido que comprende lysC de AJ3463 (bacteria que produce L-lisina) se designó como p399AK9.

Un fragmento de ADN (de ahora en adelante referido como &quot;Brevi.- ori&quot;) que tiene una capacidad de hacer un plásmido autónomamente replicable en bacterias que pertenecen al género Corynebacterium se introdujo en p399AKY y p399AK9 respectivamente prepararando los plásmidos que llevan lysC autónomamente replicables en bacterias que pertenecen al género Corynebacterium. Brevi.-ori se preparó a partir de un vector plasmídico pHK4 conteniendo Brevi.-ori y autónomamente replicable en células tanto de Escherichia coli como en bacterias que pertenecen al género Corynebacterium. pHK4 se construyó digiriendo pHC4 con Kpn l (producido por Takara Shuzo) y BamHI (producido por Takara Shuzo), extrayendo un fragmento Brevi.-ori y ligándolo con pHSG298 habiéndose digerido también con Kpnl y BamHI (véase la Patente japonesa abierta a inspección pública N.º: 57491). pHK4 da resistencia a kanamicina a un anfitrión. Escherichia coli que alberga pHK4 se diseñó como Escherichia coli AJ13136 y se depositó el 1 de agosto, 1995 con un número de depósito de FERM BP-5186 en el National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology of Ministry of International Trade and Industry (código postal: 305, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japón).

pHK4 se digirió con enzimas de restricción KpnI y BamHI y los bordes escindidos se hicieron extremos romos. La formación de extremos romos se llevó a cabo usando kit de formación de extremos romos de ADN (producidos por Takara Shuzo) de acuerdo con un procedimiento designado. Después de la formación de extremos romos, se ligó un engarce BamHI (producido por Takara Shuzo) haciendo modificación de tal modo que el fragmento de ADN que corresponde a la parte de Brevi.-ori se pudo escindir a partir de pHK4 por digestión con sólo BamHI. Este plásmido se digirió con BamHI y el fragmento de ADN Brevi.-ori generado se ligó con pH399AKY y p399AK9 habiéndose digerido también con BamHI respectivamente preparando plásmidos conteniendo cada uno el gen lysC replicable autónomamente en bacterias que pertenecen al género Corynebacterium.

Un plásmido que contiene el gen lysC de tipo silvestre que se origina a partir de p399AKY se designó como p399AKYB y un plásmido que contiene el gen lysC mutante que se origina a partir de p399AK9 se designó como p399AK9B. El procedimiento de construcción de p399AK9B y p399AKYB se muestra en la Fig. 1. Una cepa AJ12691 obtenida introduciendo el plásmido p399AK9B de lysC mutante dentro de una cepa de tipo silvestre de Brevibacterium lactofermentum (cepa AJ12036, FERM BP-734) se depositó el 10 de abril, 1992 con un número de depósito de FERM P-12918 en el National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology of Ministry of International Trade and Industry (código postal: 305, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japón), transferida al depósito internacional en base al Tratado de Budapest el 10 de febrero, 1995 y depositada con un número de depósito de FERM BP-4999.

<2> Determinación de secuencias nucleotídicas de lysC de tipo silvestre y de lysC mutante de Brevibacterium lactofermentum

El plásmido p399AKY que contiene el lysC de tipo silvestre y el plásmido p399AK9 que contiene el lysC mutante se prepararon a partir de los transformantes respectivos determinando secuencias de nucleótidos de los lysC de tipo silvestre y mutantes. La determinación de secuencia de nucleótidos se llevó a cabo de acuerdo con un procedimiento de Sanger y cols. (por ejemplo, F. Sanger y cols., Proc. Natl. Acad. Sci., 74, 5463 (1977)).

La secuencia de nucleótidos de lysC de tipo silvestre codificada por p399AKY se muestra en la SEC ID N.º: 3 en el Listado de secuencias. Por otro lado, la secuencia de nucleótido de mutante lysC codificada por p399AK9 tuvo sólo mutación de un nucleótido de tal forma que la G 1051º se cambió a A en SEC ID N.º: 3 comparada con la lysC de tipo silvestre. Se sabe que lysC de Corynebacterium glutamicum tiene dos subunidades (a, 1) codificadas en una fase de lectura idéntica en una hebra de ADN idéntica (véase Kalinowski, J. y col., Molecular Microbiology (1991) 5 (5), 1197-1204). Juzgando a partir de homología, se asume que el gen secuenciado en el presente documento tiene dos subunidades (a, 1) codificadas en una fase de lectura en una hebra de ADN idéntica.

Una secuencia de aminoácidos de la subunidad a de la AK de tipo silvestre deducida de la secuencia de nucleótidos de ADN se muestra en la SEC ID N.º: 4 junto con la secuencia de ADN. Sólo la secuencia de aminoácidos se muestra en la SEC ID N.º: 5. Una secuencia de aminoácidos de la subunidad 1 de la AK de tipo silvestre deducida de la secuencia de nucleótidos de ADN se muestra en la SEC ID N.º: 6 conjuntamente con ADN. Sólo la secuencia de aminoácidos se muestra en la SEC ID N.º: 7. En cada una de las subunidades, GTG se usa como un codón de iniciación y un aminoácido correspondiente está representado por metionina. Sin embargo, esta representación se refiere a metionina, valina, o formilmetionina.

Por otro lado, mutación en la secuencia de lysC mutante significa aparición de sustitución de residuo aminoacídico de tal forma que un residuo de alanina 279º de la subunidad a está cambiado a un residuo de treonina, y un residuo de alanina 30º de la subunidad 1 está cambiado a un residuo de treonina en la secuencia de aminoácidos de la proteína AK de tipo silvestre (SEC ID N.ºs: 5, 7).

Ejemplo 2: preparación de dapB de Brevibacterium lactofermentum

<1> Preparación de dapB y construcción de plásmido que contiene dapB

Una cepa de tipo silvestre de Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 se usó como un donante de ADN cromosómico. El ADN cromosómico se preparó a partir de la cepa ATCC 13869 de acuerdo con un procedimiento normal. Un fragmento de ADN que contiene dapB se amplificó a partir del ADN cromosómico de acuerdo con PCR. En cuanto a cebadores de ADN usados para amplificación, los ADN de 23-meros que tienen secuencias de nucleótidos representadas en las SEC ID N.ºs: 8 y 9 en el Listado se secuencias se sintetizaron respectivamente con el fin de amplificar una región de aproximadamente 2,0 kb que codifica para DDPR en base a una secuencia conocida para Brevibacterium lactofermentum (véase Journal of Bacteriology, 157 (9), 2743-2749 (1993)). La síntesis de ADN y PCR se llevó a cabo de la misma manera que se describe en el Ejemplo 1. Se usó como un vector de clonación pCR-Script (producido por Invitrogen) para el fragmento de gen amplificado de 2.001 pb, que se ligó con el fragmento de dapB amplificado. Así se construyó un plásmido, en el que el fragmento de dapB de 2.001 pb amplificado a partir de cromosoma de Brevibacterium lactofermentum se ligó con pCR-Script. El plásmido obtenido como se describe anteriormente, que tiene dapB que se origina a partir de ATCC 13869, se designó como pCRDAPB. Una cepa AJ13107 transformante obtenida introduciendo pCRDAPB dentro de la cepa JM109 de E. coli se ha depositado internacionalmente desde el 26 de mayo, 1995 con un número de depósito de FERM BP-5114 en el National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology of Ministry of International Trade and Industry (código postal: 305, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japón) en base al Tratado de Budapest.

Se extrajo un fragmento de 1.101 pb conteniendo un gen estructural de DDPR digiriendo pCRDAPB con EcoRV y SphI. Este fragmento se ligó con pHSG399 que se ha digerido con HincII y SphI.

El plásmido preparado se designó como p399DPR.

Se introdujo Brevi.-ori dentro del p399DPR preparado construyendo un plásmido que lleva dapB autónomamente replicable en bacterias corineformes. Se digirió pHK4 con una enzima de restricción KpnI (producida por Takara Shuzo) y los bordes escindidos se hicieron extremos romos. La formación de extremos romos se llevó a cabo usando kit de formación de extremos romos de ADN (producidos por Takara Shuzo) de acuerdo con un procedimiento designado. Después de la formación de extremos romos, se ligó un engarce BamHI fosforilado (producido por Takara Shuzo) haciendo modificación de tal modo que el fragmento de ADN que corresponde a la parte de Brevi.-ori se pudo escindir a partir de pHK4 por digestión con sólo BamHI. Este plásmido se digirió con BamHI y el fragmento de ADN de Brevi.-ori se ligó con p399DPR habiéndose digerido también con BamHI preparando un plásmido que contiene dapB autónomamente replicable en bacterias corineformes. El plásmido preparado se designó como pDPRB. El procedimiento de construcción de pDPRB se muestra en la Figura 2.

<2> Determinación de secuencia de nucleótidos de dapB de Brevibacterium lactofermentum

Se preparó el ADN del plásmido a partir de la cepa AJ13107 albergando p399DPR y su secuencia de nucleótidos se determinó de la misma manera que como se describe en el Ejemplo 1. Una secuencia de nucleótidos determinada y una secuencia aminoacídica deducida de la secuencia de nucleótidos se muestran en la SEC ID N.º: 10. Sólo la secuencia de aminoácidos se muestra en la SEC ID N.º: 11.

Ejemplo 3: preparación de dapA de Brevibacterium lactofermentum

<1> Preparación de dapA y construcción del plásmido que contiene dapA

Una cepa de tipo silvestre de Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 se usó como un donante de ADN cromosómico. El ADN cromosómico se preparó a partir de la cepa ATCC 13869 de acuerdo con un procedimiento normal. Un fragmento de ADN que contiene dapA se amplificó a partir del ADN cromosómico de acuerdo con PCR. En cuanto a cebadores de ADN usados para amplificación, los ADN de 20-meros que tienen secuencias de nucleótidos mostradas en las SEC ID N.ºs: 12 y 13 en el Listado de secuencias se sintetizaron respectivamente con el fin de amplificar una región de aproximadamente 1,5 kb que codifica para DDPS en base a una secuencia conocida para Corynebacterium glutamicum (véanse Nucleic Acids Research, 18 (21), 6421 (1990); EMBL Núm. de acceso X53993). La síntesis de ADN y la PCR se llevaron a cabo de la misma manera como se describe en el Ejemplo 1. pCR1000 (producido por Invitrogen, véase Bio/Technology, 9, 657-663 (1991)) se usó como un vector de clonación para el fragmento génico amplificado de 1.411 pb, que se ligó con el fragmento de dapA amplificado. La ligazón de ADN se llevó a cabo usando kit de ligazón de ADN (producido por Takara Shuzo) de acuerdo con un procedimiento designado. Así se construyó un plásmido, en el que el fragmento de dapA de 1.411 pb amplificado a partir de cromosoma de Brevibacterium lactofermentum se ligó con pCR1000. El plásmido obtenido como se describe anteriormente, que tiene dapA que se origina a partir de ATCC 13869, se designó como pCRDAPA.

Una cepa transformante AJ13106 obtenida introduciendo pCRDAPA en cepa JM109 de E. coli se ha depositado internacionalmente desde el 26 de mayo, 1995 con un número de depósito de FERM BP-5113 en el National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology of Ministry of International Trade and Industry (código postal: 305, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japón) en base al Tratado de Budapest.

Brevi.-ori se introdujo dentro del pCRDAPA preparado construyendo un plásmido que lleva dapA autónomamente replicable en bacterias corineformes. pHK4 se digirió con enzimas de restricción KpnI y BamHI (producidas por Takara Shuzo) y los bordes escindidos se hicieron extremos romos. La formación de extremos romos se llevó a cabo usando kit de formación de extremos romos de ADN (producido por Takara Shuzo) de acuerdo con un procedimiento designado. Después de la formación de extremos romos, se ligó un engarce de SmaI fosforilada (producido por Takara Shuzo) haciendo modificación de modo que el fragmento de ADN que corresponde a la parte Brevi.-ori pueda escindirse de pHK4 por digestión con sólo SmaI. Este plásmido se digirió sólo con SmaI y el fragmento de ADN de Brevi.-ori generado se ligó con pCRDAPA que se ha digerido también con Sma I preparando un plásmido que contiene dapA replicable autónomamente en bacterias corineformes. Este plásmido se designó como pDPSB. El procedimiento de construcción de pDPSB(Kmr) se muestra en la Fig. 3.

<2> Determinación de secuencia de nucleótidos de dapA de Brevibacterium lactofermentum

Se preparó el ADN del plásmido a partir de la cepa AJ13106 albergando pCRDAPA y su secuencia de nucleótidos se determinó de la misma manera que se describe en el Ejemplo 1. Una secuencia de nucleótidos determinada y una secuencia aminoacídica deducida de la secuencia de nucleótidos se muestran en la SEC ID N.º: 14. Sólo la secuencia de aminoácidos se muestra en la SEC ID N.º: 15.

Ejemplo 4: preparación de lysA de Brevibacterium lactofermentum

<1> Preparación de lysA y construcción del plásmido que contiene lysA

Una cepa de tipo silvestre de Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 se usó como un donante de ADN cromosómico. El ADN cromosómico se preparó a partir de la cepa ATCC 13869 de acuerdo con un procedimiento normal. Un fragmento de ADN que contiene argS, lysA y un promotor de un operón que los contiene se amplificó a partir del ADN cromosómico de acuerdo con PCR. En cuanto a cebadores de ADN usados para amplificación, los ADN de 23-meros que tienen secuencias de nucleótidos representadas en las SEC ID N.ºs: 16 y 17 en el Listado de secuencias respectivamente se usaron con el fin de amplificar una región de aproximadamente 3,6 kb que codifican para arginil-ARNt sintasa y DDC en base a una secuencia conocida para Corynebacterium glutamicum (véanse Molecular Microbiology, 4 (11), 1819-1830 (1990); Molecular and General Genetics, 212, 112-119 (1988)). Síntesis de ADN y PCR se llevaron a cabo en la misma manera que se describe en el Ejemplo 1. pHSG399 se usó como un vector de clonación para el fragmento de gen amplificado de 3.579 pb. pHSG399 se digirió con una enzima de restricción Smal (producida por Takara Shuzo), que se ligó con el fragmento de ADN que contiene lysA amplificado. Un plásmido obtenido como se describe anteriormente, que tuvo lysA que se originó a partir de ATCC 13869, se designó como p399LYSA.

Un fragmento de ADN que contiene lysA se extrajo digiriendo p399LYSA con Kpnl (producido por Takara Shuzo) y BamHI (producido por Takara Shuzo). Este fragmento de ADN se ligó con pHSG299 habiéndose digerido con Kpnl y BamHI. Un plásmido obtenido se designó como p299LYSA. El procedimiento de construcción de p299LYSA se muestra en la Fig. 4.

Brevi.-ori se introdujo dentro del p299LYSA obtenido construyendo un plásmido que lleva lysA autónomamente replicable en bacterias corineformes. pHK4 se digirió con enzimas de restricción KpnI y BamHI y los bordes escindidos se hicieron extremos romos. La formación de extremos romos se llevó a cabo usando kit de formación de extremos romos de ADN (producido p o r Takara Shuzo) de acuerdo con un procedimiento designado. Después de la formación de extremos romos, se ligó un engarce de KpnI fosforilado (producido por Takara Shuzo) haciendo modificación de tal forma que el fragmento de ADN correspondiente a la parte de Brevi.-ori se pudo escindir a partir de pHK4 por digestión con sólo KpnI. Este plásmido se digirió con KpnI y el fragmento de ADN de Brevi.-ori generado se ligó con p299LYSA que se había digerido también con KpnI preparando un plásmido que contiene lysA autónomamente replicable en bacterias corineformes. El plásmido preparado se designó como pLYSAB. El procedimiento de construcción de pLYSAB se muestra en la Fig. 5.

<2> Determinación de secuencia de nucleótidos de lysA de Brevibacterium lactofermentum

Se preparó ADN de plásmido p299LYSA y su secuencia de nucleótidos se determinó de la misma manera que como se describe en el Ejemplo 1. Una secuencia de nucleótidos determinada y una secuencia de aminoácidos deducida que se codifica por la secuencia de nucleótidos se muestran en la SEC ID N.º: 18. Con respecto a la secuencia de nucleótidos, una secuencia de aminoácidos codificada por argS y una secuencia de aminoácidos codificada por lysA se muestran en SEC ID N.ºs: 19 y 20 respectivamente.

Ejemplo 5: preparación de ddh de Brevibacterium lactofermentum

Se obtuvo un gen ddh amplificando el gen ddh a partir de ADN cromosómico de Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 de acuerdo con el procedimiento de PCR usando dos cebadores oligonucleotídicos (SEC ID N.ºs: 21, 22) preparados en base a una secuencia de nucleótidos conocida de gen ddh deCorynebacterium glutamicum (Ishino, S. y col., Nucleic Acids Res., 15, 3917 (1987)). Un fragmento de ADN amplificado obtenido se digirió con EcoT22I y AvaI y los bordes escindidos se hicieron extremos romos. Después de eso, el fragmento se insertó en un sitio SmaI de pMW119 obteniendo un plásmido pDDH.

Después, pDDH se digirió con SalI y EcoRI, seguido por formación de extremos romos. Después de eso, se ligó un fragmento obtenido con pUC18 que se ha digerido con SmaI. Un plásmido así obtenido se designó como pUC18DDH.

Brevi.-ori se introdujo dentro de pUC18DDH construyendo un plásmido que lleva ddh autónomamente replicable en bacterias corineformes. pHK4 se digirió con enzimas de restricción KpnI y BamHI y los bordes escindidos se hicieron extremos romos. La formación de extremos romos se llevó a cabo usando kit de formación de extremos romos de ADN (producido por Takara Shuzo) de acuerdo con un procedimiento designado. Después de la formación de extremos romos, se ligó un engarce de PstI fosforilado (producido por Takara Shuzo) de tal forma que se insertó dentro de un sitio de PstI de pHSG299. Un plásmido construido como se describe anteriormente se designó como pPK4. A continuación, se digirió pUC18DDH con XbaI y KpnI y un fragmento generado se ligó con pPK4 habiéndose digerido con KpnI y XbaI. Así se construyó un plásmido que contiene ddh autónomamente replicable en bacterias corineformes. Este plásmido se designó como pPK4D. El procedimiento de construcción de pPK4D se muestra en la Fig. 6.

Ejemplo 6: construcción del plásmido que comprende combinación de lysC mutante y dapA

Un plásmido que comprende lysC mutante, dapA y origen de replicación de bacterias corineformes se construyó a partir del plásmido pCRDAPA comprendiendo dapA y el plásmido p399AK9B que comprende lysC mutante y Brevi.ori. p399AK9B se degradó completamente con SalI y después se sometió a procedimiento de formación de extremos romos, con lo que el engarce EcoRI se ligó construyendo un plásmido en el que el sitio de SalI se modificó en un sitio EcoRI. El plásmido obtenido se designó como p399AK9BSE. El lysC mutante y Brevi.-ori se escindieron como un fragmento degradando parcialmente p399AK9BSE con EcoRI. Este fragmento se ligó con pCRDAPA habiéndose digerido con EcoRI. Un plásmido obtenido se designó como pCRCAB. Este plásmido es autónomamente replicable en E. coli y en bacterias corineformes y da resistencia a kanamicina a un huésped, comprendiendo el plásmido una combinación de lysC y dapA mutante. El procedimiento de construcción de pCRCAB se muestra en la Figura 7.

Ejemplo 7: construcción del plásmido que comprende combinación de lysC mutante y dapB

Un plásmido que comprende lysC mutante y dapB se construyó a partir del plásmido p399AK9 que tiene lysC y el plásmido p399DPR que tiene dapB. Un fragmento de 1.101 pb que contiene un gen estructural de DDPR se extrajo digiriendo p399DPR con EcoRV y SphI. Este fragmento se ligó con p399AK9 habiéndose digerido con SalI y después habiéndose sometido a la técnica de los extremos romos y habiéndose digerido con SphI construyendo un plásmido comprendiendo una combinación de lysC mutante y dapB. Este plásmido se designó como p399AKDDPR.

Luego, Brevi.-ori se introdujo dentro del p399AKDDPR obtenido. El plásmido de pHK4 conteniendo Brevi.-ori se digirió con una enzima de restricción KpnI (producida por Takara Shuzo) y los bordes escindidos se hicieron extremos romos. La formación de extremos romos se llevó a cabo usando kit de formación de extremos romos de ADN (producido por Takara Shuzo) de acuerdo con un procedimiento designado. Después de la formación de extremos romos, se ligó un engarce BamHI (producido por Takara Shuzo) haciéndose modificación de tal modo que el fragmento de ADN que corresponde a la parte de Brevi.-ori se pudo escindir a partir de pHK4 por digestión con sólo BamHI. Este plásmido se digirió con BamHI y el fragmento de ADN de Brevi.-ori se ligó con p399AKDDPR habiéndose digerido también con BamHI construyendo un plásmido que contiene lysC mutante y dapB autónomamente replicable en bacterias corineformes. El plásmido construido se diseñó como pCB. El proceso de construcción de pCB se muestra en la Figura 8.

Ejemplo 8: construcción del plásmido que comprende combinación de dapA y dapB

El plásmido pCRDAPA que comprende dapA se digirió con KpnI y EcoRI extrayéndose un fragmento de ADN que contiene dapA que se ligó con el plásmido vector pHSG399 habiéndose digerido con KpnI y EcoRI. Un plásmido obtenido se designó como p399DPS.

Por otro lado, el plásmido pCRDAPB que comprende dapB se digirió con SacII y EcoRI extrayéndose un fragmento de ADN de 2,0 kb que contiene una región codificante para DDPR que se ligó con p399DPS habiéndose digerido con SacII y EcoRI construyendo un plásmido que comprende una combinación de dapA y dapB. El plásmido obtenido se designó como p399AB.

A continuación, se introdujo Brevi.-ori en p399AB. Se digirió pHK4 conteniendo Brevi.-ori con una enzima de restricción BamHI (producida por Takara Shuzo) y los bordes escindidos se hicieron extremos romos. La formación de extremos romos se llevó a cabo usando kit de formación de extremos romos de ADN (producido por Takara Shuzo) de acuerdo con un procedimiento designado. Después de la formación de extremos romos, se ligó un engarce de KpnI fosforilado (producido por Takara Shuzo) llevando a cabo modificación de tal forma que el fragmento de ADN correspondiente a la parte de Brevi.-ori se pudo escindir a partir de pHK4 por digestión con sólo KpnI. Este plásmido se digirió con KpnI y el fragmento de ADN de Brevi.-ori generado se ligó con p399AB que se había digerido también con KpnI construyéndose un plásmido que contiene dapA y dapB autónomamente replicable en bacterias corineformes. El plásmido construido se designó como pAB. El proceso de construcción de pAB se muestra en la Figura 9.

Ejemplo 9: construcción del plásmido que comprende combinación de ddh y lysA

El plásmido pUC18DDH que comprende ddh se digirió con EcoRI y XbaI extrayéndose un fragmento de ADN que contiene ddh. Este fragmento ddh se ligó con el plásmido p399LYSA que comprende lysA que se ha digerido con BamHI y XbaI con los bordes escindidos que se han hecho extremos romos después de la digestión. Un plásmido obtenido se diseñó como p399DL. El proceso de construcción de p399DL se muestra en la Figura 10.

A continuación, Brevi.-ori se introdujo dentro de p399DL. pHK4 se digirió con XbaI y BamHI y los extremos escindidos se hicieron romos. Después de la formación de extremos romos, se ligó un engarce de XbaI fosforilado llevando a cabo modificación de tal forma que el fragmento de ADN correspondiente a la parte de Brevi.-ori se pudo escindir a partir de pHK4 por digestión con sólo XbaI. Este plásmido se digirió con XbaI y el fragmento de ADN de Brevi.-ori generado se ligó con p399DL que se había digerido también con XbaI construyendo un plásmido que contiene ddh y lysA autónomamente replicable en bacterias corineformes. El plásmido construido se designó como pDL. El procedimiento de construcción de pDL se muestra en la Fig. 11.

Ejemplo 10: construcción del plásmido que comprende combinaci6n de lysC mutante, dapAy dapB

p399DPS se degradó con EcoRI y SphI formando extremos romos seguido por extracción de un fragmento de gen dapA.

Este fragmento se ligó con el p399AK9 que se había digerido con SalI y se sometió a un procedimiento de formación de extremos romos construyendo un plásmido p399CA en el que el lysC y dapaA coexistieron.

El plásmido pCRDAPB que comprende dapB se digirió con EcoRI y se sometió a un procedimiento de formación de extremos romos, seguido por digestión con SacI extrayendo un fragmento de ADN de 2,0 kb que comprende dapB. El plásmido p399CA que comprende dapA y lysC mutante se digirió con SpeI y se sometió a formación de extremos romos, que se digirieron más adelante con SacI y se ligaron con el fragmento de dapB extraído obteniéndose un plásmido que comprende lysC mutante, dapA y dapB. Este plásmido se designó como p399CAB.

A continuación, Brevi.-ori se introdujo dentro de p399CAB. El plásmido de pHK4 conteniendo Brevi.-ori se digirió con una enzima de restricción BamHI (producido por Takara Shuzo) y los bordes escindidos se hicieron extremos romos. La formación de extremos romos se llevó a cabo usando kit de formación de extremos romos de ADN (producidos por Takara Shuzo) de acuerdo con un procedimiento designado. Después de la formación de extremos romos, se ligó un engarce de KpnI fosforilado (producido por Takara Shuzo) llevando a cabo modificación de tal forma que el fragmento de ADN correspondiente a la parte de Brevi.-ori se pudo escindir a partir de pHK4 por digestión con sólo KpnI. Este plásmido se digirió con KpnI y el fragmento de ADN de Brevi.-ori generado se ligó con p399CAB que se había digerido también con KpnI construyéndose un plásmido que contiene lysC mutante, dapA y dapB autónomamente replicable en bacterias corineformes. El plásmido construido se designó como pCAB. El procedimiento de construcción de pCAB se muestra en la Fig. 12.

Ejemplo 11: construcci6n del plasmido que comprende combinaci6n de lysC mutante, dapA, dapB y lysA

El plásmido p299LYSA que comprende lysA se digirió con KpnI y BamHI y se sometió a procedimiento de formación de extremos romos y después se extrajo un fragmento de gen de lysA. Este fragmento se ligó con pCAB habiéndose digerido con HpaI (producido por Takara Shuzo) y se sometió a formación de extremos romos construyéndose un plásmido que comprende una combinación de lysC mutante, dapA, dapB y lysA autónomamente replicable en bacterias corineformes. El plásmido construido se diseñó como pCABL. El procedimiento de construcción de pCABL se muestra en la Figura 13. Se indica que el fragmento génico de lysA está insertado a un sitio HpaI en un fragmento de ADN que contiene el gen dapB en pCABL, sin embargo, el sitio de HpaI está localizado corriente arriba a partir de un promotor para el gen dapB (números de nucleótidos 611 a 616 en SEC ID N.º: 10), y el gen dapB no está desacoplado.

Ejemplo 12: construcci6n del plasmido que comprende combinaci6n de lysc mutante, dapa, dapb, ddh y lysa

pHSG299 se digirió con XbaI y KpnI, que se ligaron con p399DL comprendiendo ddh y lysA habiéndose digerido con XbaI y KpnI. Un plásmido construido se designó como p299DL. p299DL se digirió con XbaI y KpnI y se sometió a formación de extremos romos. Después de la formación de extremos romos, se extrajo un fragmento de ADN que comprende ddh y lysA. Este fragmento de ADN se ligó con el plásmido pCAB comprendiendo la combinación de lysC mutante, dapA y dapBhabiéndose digerido con HpaI y sometido a formación de extremos romos construyendo un plásmido que comprende una combinación de lysC mutante, dapA, dapB, lysA y ddh autónomamente replicable en bacterias corineformes. El plásmido construido se designó como pCABDL. El procedimiento de construcción de pCABDL se muestra en la Fig. 14.

Ejemplo 13: introducción de los plásmidos que comprenden genes para biosíntesis de L-lisina en bacteria que produce L-lisina de Brevibacterium lactofermentum

Los plásmidos que comprenden los genes para biosíntesis de L-lisina construidos como se describe anteriormente, concretamente p399AK9B (Cmr), pDPSB (Kmr), pDPRB (Cmr), pLYSAB (Cmr), pPK4D (Cmr), pCRCAB (Kmr), pAB (Cmr), pCB (CMr), pDL (Cmr), pCAB (Cmr), pCABL (Cmr) y pCABDL (Cmr) se introdujeron dentro de bacteria que produce L-lisina AJ11082 (NRRL B-11470) de Brevibacterium lactofermentum respectivamente. La cepa AJ11082 tiene una propiedad de resistencia a AEC. Los plásmidos se introdujeron de acuerdo con un procedimiento de pulso eléctrico (Sugimoto y col., Patente japonesa abierta a inspección pública N.º: 2-207791). Los transformantes se seleccionaron en base a marcadores de resistencia a fármaco poseídos por los respectivos plásmidos. Los transformantes se seleccionaron en un medio completo que contiene 5 !g/ml de cloranfenicol cuando se introdujo un plásmido que comprende un gen de resistencia a cloranfenicol, o los transformantes se seleccionaron en un medio completo que contiene 25 !g/ml de kanamicina cuando se introdujo un plásmido que comprende un gen de resistencia a kanamicina.

Ejemplo 14: producción de L-lisina

Cada uno de los transformantes obtenido en el Ejemplo 13 se cultivó en un medio de producción de L-lisina evaluándose su productividad de L-lisina. El medio de producción de L-lisina tenía la siguiente composición.

[Medio de producción de L-lisina]

Los siguientes componentes distintos de carbonato de calcio (por 1 l) se disolvieron haciendo ajuste a pH 8,0 con KOH. El medio se esterilizó a 115 °C durante 15 minutos, para lo que se añadió a partir de entonces carbonato de calcio (50 g) habiéndose esterilizado por separado en aire caliente en un estado seco.

Glucosa 100 g

(NH4)2SO4 55 g

KH2PO4 1 g

MgSO4 &quot; 7H2O 1 g

5 Biotina 500 !g Tiamina 2000 !g FeSO4 &quot; 7 H2O 0,01 g

MnSO4 &quot; 7H2O 0,01 g

Nicotinamida 5 mg

10 Hidrolizado de proteínas (Mamenou) 30 ml

Carbonato de calcio 50 g

Cada uno de los diversos tipos de los transformantes y la cepa parental se inoculó al medio que tiene la composición descrita anteriormente llevándose a cabo el cultivo a 31,5 °C con agitación recíproca. La cantidad de 15 L-lisina producida después de 40 ó 72 horas de cultivo y el crecimiento después de 72 horas (D.O.562) se muestran en la Tabla 1. En la tabla, lysC* representa lysC mutante. El crecimiento se determinó cuantitativamente midiendo

D.O. a 560 nm después de dilución de 101 veces.

Tabla 1

Acumulación de L-lisina después de cultivo durante 40 ó 72 horas

Cepa Gen introducido Cantidad de L-lisina producida Crecimiento bacteriana/plásmido (g/l) (D.O.562/101)

después de después de 40 horas 72 horas AJ11082 22,0 29,8 0,450 AJ11082/p399AK9B lysC* 16,8 34,5 0,398 AJ11082/pDPSB dapA 18,7 33,8 0,410 AJ11082/pDPRB dapB 19,9 29,9 0,445 AJ11082/pLYSAB lysA 19,8 32,5 0,356 AJ11082/pPK4D ddh 19,0 33,4 0,330 AJ11082/pCRCAB lysC*, dapA 19,7 36,5 0,360 AJ11082/pAB dapA, dapB 19,0 34,8 0,390 AJ11082/pCB lysC*, dapB 23,3 35,0 0,440 AJ11082/pDL ddh, lysA 23,3 31,6 0,440 AJ11082/pCAB lysC*, dapA, dapB 23,0 45,0 0,425 AJll0821pCABL lysC*, dapA, dapB, lysA 26,2 46,5 0,379 AJ11082/pCABDL lysC*, dapA, dapB, lysA, 26,5 47,0 0,409 ddh

Como se muestra en la Tabla 1, cuando lysC mutante, dapA, o dapB se potenció individualmente, la cantidad de Llisina producida era más grande que o equivalente a aquella producida por la cepa parental después de 72 horas de cultivo, sin embargo, la cantidad de L-lisina producida era más pequeña que aquella producida por la cepa parental después de 40 horas de cultivo. Concretamente, la velocidad de producción de L-lisina se disminuyó en el cultivo durante un periodo corto. De manera similar, cuando lysC mutante y dapA, o dapA y dapB se potenciaron en combinación, la cantidad de L-lisina producida era más grande que aquella producida por la cepa parental después de 72 horas de cultivo, aun así, la cantidad de L-lisina producida era más pequeña que aquella producida por la cepa parental después de 40 horas de cultivo. Así la velocidad de producción de L-lisina se disminuyó.

Por otro lado, cuándo lysA o ddh se potenciaron individualmente, o cuando lysA y ddh se potenciaron en combinación, la cantidad de L-lisina producida era más grande que aquella producida por la cepa parental después de 40 horas de cultivo, sin embargo, la cantidad de L-lisina producida era consiguientemente más pequeña que aquella producida por la cepa parental después del periodo largo de cultivo debido a disminución en crecimiento.

Por el contrario, en el caso de la cepa en la que dapB se potenció conjuntamente con lysC mutante, el crecimiento se mejoró, la velocidad de producción de L-lisina se restableció exitosamente en el periodo corto de cultivo y la cantidad de L-lisina acumulada se mejoró también en el periodo de cultivo largo. En el caso de la cepa en la que tres de lysC mutante, dapA y dapB se potenciaron simultáneamente, la productividad de L-lisina se mejoró adicionalmente. Tanto la velocidad de producción de L-lisina como la cantidad de L-lisina acumulada se mejoraron en una manera etapa a etapa potenciando sucesivamente lysA y ddh.

Aplicabilidad industrial

De acuerdo con la presente invención, se puede mejorar la capacidad de producción de L-lisina de bacterias corineformes y también puede mejorarse la velocidad de crecimiento.

La velocidad de producción de L-lisina se puede mejorar y la productividad se puede mejorar también en bacterias de producción de L-lisina potenciando dapB junto con lysC mutante. La velocidad de producción de L-lisina y la productividad se pueden potenciar adicionalmente potenciando sucesivamente dapA, lysA y ddh además de los genes anteriormente mencionados.

Listado de secuencias

(1)

INFORMACIÓN GENERAL:

(i)

SOLICITANTE: Ajinomoto Co., Inc.

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Procedimiento de producir L-lisina

(iii) NÚMERO DE SECUENCIAS: 24

(iv)

DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA

(A)

DESTINATARIO:

(B)

CALLE:

(C)

CIUDAD:

(E)

PAÍS:

(F)

CÓDIGO POSTAL:

(v)

FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

(A)

TIPO DE MEDIO: disquete

(B)

ORDENADOR: IBM PC compatible

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

(D)

SOFTWARE: PatentIn Release n.º: 1.0, versión n.º: 1.30

(vi)

FECHAS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD:

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN:

(C)

CLASIFICACIÓN:

(vii) FECHAS DE SOLICITUDES PREVIAS:

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: JP 7-14014

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 7-julio-1995

(viii) INFORMACIÓN DE ABOGADO/AGENTE: (A): NOMBRE: (B): NÚMERO DE REGISTRO:

(ix) INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES:

(A)

TELÉFONO:

(B)

TELEFAX:

(2)

INFORMACIÓN PARA SEC ID N.º: 1:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 23 bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE HEBRA: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A) DESCRIPCIÓN: /desc. = “ADN sintético”

(iv)

ANTI-SENTIDO: no

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID N.º: 1: TCGCGAAGTA GCACCTGTCA CTT 23

(2)

INFORMACIÓN PARA SEC ID N.º: 2:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 21 bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE HEBRA: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro…ADN sintético

(A) DESCRIPCIÓN: /desc. = “ADN sintético”

(iv)

ANTI-SENTIDO: sí

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID N.º: 2: AOGGAARRCA ATCTTAOGGC C

(2)

INFORMACIÓN PARA SEC ID N.º: 3:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 1643 bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE HEBRA: doble

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(iv)

ANTI-SENTIDO: No

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(A)

ORGANISMO: Brevibacterium lactofermentum

(B)

CEPA: ATCC 13869

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID N.º: 3:

(2)

INFORMACIÓN PARA SEC ID N.º: 4:

(i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 1643 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico 15 (C) TIPO DE HEBRA: doble

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(iv)

ANTI-SENTIDO: no

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(A)

ORGANISMO: Brevibacterium lactofermentum5 (B) CEPA: ATCC 13869

(ix) CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

(B)

LOCALIZACIÓN: 217..1482

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID N.º: 4: 10

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID N.º: 5:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: 5 (A) LONGITUD: 421 aminoácidos

(B)

TIPO: aminoácido

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID N.º: 5: 10

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID N.º: 6:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: 5 (A) LONGITUD: 1643 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE HEBRA: doble

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)10 (iv) ANTI-SENTIDO: No

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(A)

ORGANISMO: Brevibacterium lactofermentum

(B)

CEPA: ATCC 13869

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

(B)

LOCALIZACIÓN: 964..1482

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID N.º: 6:

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID N.º: 7:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: 5 (A) LONGITUD: 172 aminoácidos

(B)

TIPO: aminoácido

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID N.º: 7: 10

(2)

INFORMACIÓN PARA SEC ID N.º: 8:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 23 bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE HEBRA: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A) DESCRIPCIÓN: /desc. = “ADN sintético”

(iv)

ANTI-SENTIDO: no

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID N.º: 8: GGATCCCCAA TCGATACCTG GAA 23

(2)

INFORMACIÓN PARA SEC ID N.º: 9:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 23 bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE HEBRA: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A) DESCRIPCIÓN: /desc. = “ADN sintético”

(iv)

ANTI-SENTIDO: sí

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID N.º:9: CGGTTCATCG CCAAGTTTTT CTT 23

(2)

INFORMACIÓN PARA SEC ID N.º: 10:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 2001 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE HEBRA: doble

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(iv)

ANTI-SENTIDO: no

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(A)

ORGANISMO: Brevibacterium lactofermentum

(B)

CEPA: ATCC 13869

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

(B)

LOCALIZACIÓN: 730..1473

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID N.º: 10:

(2)

INFORMACIÓN PARA SEC ID N.º: 11:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: 5 (A) LONGITUD: 248 aminoácidos

(B)

TIPO: aminoácido

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID N.º: 11: 10

(2)

INFORMACIÓN PARA SEC ID N.º: 12:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 23 bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE HEBRA: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A) DESCRIPCIÓN: /desc. = “ADN sintético”

(iv)

ANTI-SENTIDO: no

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID N.º: 1: GRCGACGGAT CGCAAATGGC AAC 23

(2)

INFORMACIÓN PARA SEC ID N.º: 13:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 21 bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE HEBRA: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A) DESCRIPCIÓN: /desc. = “ADN sintético”

(iv)

ANTI-SENTIDO: sí

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID N.º: 13: GGATCCTTGA GCACCTTGCG CAG 23

(2)

INFORMACIÓN PARA SEC ID N.º: 14:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 1411 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

31

(C)

TIPO DE HEBRA: doble

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(iv)

ANTI-SENTIDO: no 5 (vi) FUENTE ORIGINAL:

(A)

ORGANISMO: Brevibacterium lactofermentum

(B)

CEPA: ATCC 13869

(ix) CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS10 (B) LOCALIZACIÓN: 311..1213

(xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID N.º: 14:

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID N.º: 15:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: 5 (A) LONGITUD: 301 aminoácidos

(B)

TIPO: aminoácido

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID N.º: 15: 10

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID N.º: 16:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: 5 (A) LONGITUD: 23 bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE HEBRA: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico 10 (A) DESCRIPCIÓN: /desc. = “ADN sintético”

(iv)

ANTI-SENTIDO: no

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID N.º: 16: GTGGAGCCGA CCATTCCGCG AGG 23

(2)

INFORMACIÓN PARA SEC ID N.º: 17: 15 (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 23 bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE HEBRA: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A) DESCRIPCIÓN: /desc. = “ADN sintético”

(iv)

ANTI-SENTIDO: sí

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID N.º: 17: CCAAAACCGC CCTCCACGGC GAA 23

(2)

INFORMACIÓN PARA SEC ID N.º: 18:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 3579 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE HEBRA: doble

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(iv)

ANTI-SENTIDO: no

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(A)

ORGANISMO: Brevibacterium lactofermentum

(B)

CEPA: ATCC 13869

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

(B)

LOCALIZACIÓN: 533..2182

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

(B)

LOCALIZACIÓN: 2188..3522

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID N.º: 18:

(2)

INFORMACIÓN PARA SEC ID N.º: 19:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: 41

(A)

LONGITUD: 550 aminoácidos

(B)

TIPO: aminoácido

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID N.º: 19:

(2)

INFORMACIÓN PARA SEC ID N.º: 20:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: 5 (A) LONGITUD: 445 aminoácidos

(B)

TIPO: aminoácido

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID N.º: 20: 10

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID N.º: 21:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 20 bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE HEBRA: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A) DESCRIPCIÓN: /desc. = “ADN sintético”

(iv)

ANTI-SENTIDO: no

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID N.º: 21: CATCTAAGTA TGMTCTCGG 20

(2)

INFORMACIÓN PARA SEC ID N.º: 22:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 20 bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE HEBRA: simple

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A) DESCRIPCIÓN: /desc. = “ADN sintético”

(iv)

ANTI-SENTIDO: sí

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID N.º: 22: TGCCCCTCGA GCTAAATTAG 20

(2)

INFORMACIÓN PARA SEC ID N.º: 23:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 1034 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE HEBRA: doble

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(iv)

ANTI-SENTIDO: no

(vi)

FUENTE ORIGINAL: 5 (A) ORGANISMO: Brevibacterium lactofermentum

(B) CEPA: ATCC 13869

(ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOMBRE/CLAVE: CDS

(B)

LOCALIZACIÓN: 61..1020 10 (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID N.º: 23:

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID N.º: 24:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: 5 (A) LONGITUD: 320 aminoácidos

(B)

TIPO: aminoácido

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína 10 (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID N.º: 24:

Claims (17)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Un vector replicable autónomamente en células de bacterias corineformes, que comprende una secuencia de ADN que codifica para una aspartocinasa en la que la inhibición por retroalimentación por L-lisina y L-treonina está desensibilizada y una secuencia de ADN que codifica para una dihidrodipicolinato reductasa obtenida de una bacteria corineforme.

2. 2.

   El vector de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende adicionalmente una secuencia de ADN que codifica para una dihidropicolinato sintasa.

3. 3.

   El vector de acuerdo con la reivindicación 2, que comprende adicionalmente una secuencia de ADN que codifica para una diaminopimelato descarboxilasa.

4. 4.

   El vector de acuerdo con la reivindicación 3, que comprende adicionalmente una secuencia de ADN que codifica para una diaminopimelato deshidrogenasa.

5. 5.

   El vector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicha aspartocinasa en la que la inhibición por retroalimentación por L-lisina y L-treonina está desensibilizada es una aspartocinasa que se origina de bacterias corineformes y en el que dicha aspartocinasa está proporcionada como aspartocinasa mutante en la que un 279 enésimo residuo de alanina según se cuenta a partir de su extremo N-terminal en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID N.º: 5 está cambiado por un residuo de aminoácido distinto de alanina y distinto de aminoácido ácido en su subunidada y un 30 enésimo residuo de alanina según se cuenta a partir de su extremo N-terminal en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID N.º: 7 está cambiado por un residuo de

   aminoácido distinto de alanina y distinto de aminoácido ácido en su subunidad 1.

6. 6.

   El vector de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicha secuencia de ADN que codifica para la dihidrodipicolinato reductasa codifica para una secuencia de aminoácidos representada en la SEC ID N.º: 11 en el Listado de secuencias, o para una secuencia de aminoácidos sustancialmente igual que la secuencia de aminoácidos representada en la SEC ID N.º: 11.

7. 7.

   El vector de acuerdo con la reivindicación 2, en el que la secuencia de ADN que codifica para la dihidrodipicolinato sintasa codifica para una secuencia de aminoácidos representada en la SEC ID N.º: 15 en el Listado de secuencias, o para una secuencia de aminoácidos sustancialmente igual que la secuencia de aminoácidos representada en la SEC ID N.º: 15.

8. 8.

   El vector de acuerdo con la reivindicación 3, en el que la secuencia de ADN que codifica para la diaminopimelato descarboxilasa codifica para una secuencia de aminoácidos representada en la SEC ID N.º: 20 en el Listado de secuencias, o para una secuencia de aminoácidos sustancialmente igual a la secuencia de aminoácidos representada en la SEC ID N.º: 20.

9. 9.

   El vector de acuerdo con la reivindicación 4, en el que dicha secuencia de ADN que codifica para la diaminopimelato deshidrogenasa codifica para una secuencia de aminoácidos representada en la SEC ID N.º: 24 en el Listado de secuencias, o para una secuencia de aminoácidos sustancialmente igual a la secuencia de aminoácidos representada en la SEC ID N.º: 24.

10. 10.

    Una bacteria corineforme que comprende una secuencia de ADN potenciada que codifica para una aspartocinasa en la que la inhibición de retroalimentación por L-lisina y L-treonina está desensibilizada y que comprende una secuencia de ADN potenciada que codifica para una dihidrodipicolinato reductasa, en la que el ADN se potencia incrementando el número de copias de un gen, usando un promotor fuerte, o combinando estos medios.

11. 11.

    La bacteria corineforme de acuerdo con la reivindicación 10, en la que dichos resultados de secuencia de ADN potenciada dan como resultado un incremento en la actividad intracelular de una enzima codificada por dicha secuencia de ADN incrementando el número de copias de un gen, usando un promotor fuerte, o combinando estos medios.

12. 12.

    La bacteria corineforme de acuerdo con la reivindicación 10, en la que dicha secuencia de ADN potenciada da como resultado un incremento en la actividad intracelular de una enzima codificada por dicha secuencia de ADN incrementando el número de copias de un gen.

13. 13.

    La bacteria corineforme de acuerdo con cualesquiera reivindicaciones 10-12, que comprenden adicionalmente una secuencia de ADN potenciada que codifica para una dihidrodipicolinato sintasa.

14. 14.

    Las bacterias corineformes de acuerdo con la reivindicación 13, que comprenden adicionalmente una secuencia de ADN potenciada que codifica para una diaminopimelato descarboxilasa.

15. 15.

    Las bacterias corineformes de acuerdo con la reivindicación 14, que comprenden adicionalmente una secuencia de ADN potenciada que codifica para una diaminopimelato deshidrogenasa.

16. 16.

    Una bacteria corineforme transformada por introducción del vector según se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1-4.

17. 17.

    Un procedimiento para producir L-lisina que comprende las etapas de cultivar dicha bacteria corineforme según se define en una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 16 en un medio apropiado, producir y acumular Llisina en un cultivo de la bacteria y recoger L-lisina del cultivo.

    Figura 1

    Figura 2

    Figura 3

    Figura 4

    Figura 5

    Figura 6

    Figura 7

    Figura 8

    Figura 9

    Figura 10

    Figura 11

    Figura 12

    Figura 13

    Figura 14