RU2193063C2 - Бактериолитический комплекс, способ его получения и штамм для осуществления способа - Google Patents
Бактериолитический комплекс, способ его получения и штамм для осуществления способа Download PDFInfo
- Publication number
- RU2193063C2 RU2193063C2 RU2000129650/13A RU2000129650A RU2193063C2 RU 2193063 C2 RU2193063 C2 RU 2193063C2 RU 2000129650/13 A RU2000129650/13 A RU 2000129650/13A RU 2000129650 A RU2000129650 A RU 2000129650A RU 2193063 C2 RU2193063 C2 RU 2193063C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- bacteriolytic
- complex
- xanthomonas campestris
- strain
- culture fluid
- Prior art date
Links
- 230000001420 bacteriolytic effect Effects 0.000 title claims abstract description 61
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 31
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 22
- 241000589636 Xanthomonas campestris Species 0.000 claims abstract description 21
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims abstract description 15
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 claims abstract description 15
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims abstract description 15
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 13
- 229910001868 water Inorganic materials 0.000 claims abstract description 13
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 claims abstract description 12
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims abstract description 12
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 claims abstract description 12
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 claims abstract description 11
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 claims abstract description 11
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 claims abstract description 10
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 claims abstract description 10
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 claims abstract description 10
- 108010059378 Endopeptidases Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 102000005593 Endopeptidases Human genes 0.000 claims abstract description 9
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 claims abstract description 9
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 claims abstract description 9
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims abstract description 8
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims abstract description 8
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims abstract description 8
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims abstract description 4
- 229910000358 iron sulfate Inorganic materials 0.000 claims abstract description 3
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 claims abstract 2
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 claims abstract 2
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 claims description 28
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 9
- 239000011734 sodium Substances 0.000 claims description 9
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 claims description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 5
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 4
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 claims description 3
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 claims description 3
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims description 3
- -1 muramoyalaninamidase Proteins 0.000 claims description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims description 2
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 claims description 2
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical class [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical class [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 claims 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 claims 1
- 125000002467 phosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 claims 1
- 239000011591 potassium Chemical class 0.000 claims 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 claims 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 claims 1
- 239000011593 sulfur Chemical class 0.000 claims 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 claims 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 abstract description 40
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 abstract description 40
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 abstract description 40
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 abstract description 15
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 11
- 244000005700 microbiome Species 0.000 abstract description 11
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 11
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 abstract description 8
- 229940051921 muramidase Drugs 0.000 abstract description 8
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 abstract description 4
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 abstract description 4
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 abstract description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 abstract description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K potassium phosphate Substances [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 abstract 2
- 108700023418 Amidases Proteins 0.000 abstract 1
- 102000005922 amidase Human genes 0.000 abstract 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 abstract 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 abstract 1
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 abstract 1
- 235000011008 sodium phosphates Nutrition 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 21
- 239000000306 component Substances 0.000 description 14
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 13
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 12
- 239000000047 product Substances 0.000 description 12
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 10
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 8
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 6
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 5
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 5
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 108010013286 lysoamidase Proteins 0.000 description 5
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 5
- 241001114473 Lysobacter sp. XL1 Species 0.000 description 4
- MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N Muraminsaeure Natural products OC(=O)C(C)OC1C(N)C(O)OC(CO)C1O MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 4
- 108010023063 Bacto-peptone Proteins 0.000 description 3
- 241000295644 Staphylococcaceae Species 0.000 description 3
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 3
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 3
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 3
- MSFSPUZXLOGKHJ-PGYHGBPZSA-N 2-amino-3-O-[(R)-1-carboxyethyl]-2-deoxy-D-glucopyranose Chemical compound OC(=O)[C@@H](C)O[C@@H]1[C@@H](N)C(O)O[C@H](CO)[C@H]1O MSFSPUZXLOGKHJ-PGYHGBPZSA-N 0.000 description 2
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 2
- 108090000988 Lysostaphin Proteins 0.000 description 2
- 108010013639 Peptidoglycan Proteins 0.000 description 2
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000007721 medicinal effect Effects 0.000 description 2
- 159000000001 potassium salts Chemical class 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 2-amino-2-deoxy-D-glucopyranose Chemical compound N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 0.000 description 1
- QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 5,5-dimethyl-2,4-dioxo-1,3-oxazolidine-3-carboxamide Chemical compound CC1(C)OC(=O)N(C(N)=O)C1=O QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PLXMOAALOJOTIY-FPTXNFDTSA-N Aesculin Natural products OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1Oc2cc3C=CC(=O)Oc3cc2O PLXMOAALOJOTIY-FPTXNFDTSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 1
- 102000016938 Catalase Human genes 0.000 description 1
- WNBCMONIPIJTSB-BGNCJLHMSA-N Cichoriin Natural products O([C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1)c1c(O)cc2c(OC(=O)C=C2)c1 WNBCMONIPIJTSB-BGNCJLHMSA-N 0.000 description 1
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N N-acelyl-D-glucosamine Natural products CC(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N N-acetyl-beta-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N 0.000 description 1
- MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N N-acetylglucosamine Natural products CC(=O)N[C@@H](C=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 description 1
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 241000589634 Xanthomonas Species 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 208000030961 allergic reaction Diseases 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N beta-D-galactosamine Natural products NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000001058 brown pigment Substances 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 229940079919 digestives enzyme preparation Drugs 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 235000014103 egg white Nutrition 0.000 description 1
- 210000000969 egg white Anatomy 0.000 description 1
- XHCADAYNFIFUHF-TVKJYDDYSA-N esculin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC(C(=C1)O)=CC2=C1OC(=O)C=C2 XHCADAYNFIFUHF-TVKJYDDYSA-N 0.000 description 1
- 229940093496 esculin Drugs 0.000 description 1
- AWRMZKLXZLNBBK-UHFFFAOYSA-N esculin Natural products OC1OC(COc2cc3C=CC(=O)Oc3cc2O)C(O)C(O)C1O AWRMZKLXZLNBBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011790 ferrous sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000003891 ferrous sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 210000003495 flagella Anatomy 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 229960002442 glucosamine Drugs 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910000359 iron(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 229940126601 medicinal product Drugs 0.000 description 1
- 239000012533 medium component Substances 0.000 description 1
- 239000013028 medium composition Substances 0.000 description 1
- 244000005706 microflora Species 0.000 description 1
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 229950006780 n-acetylglucosamine Drugs 0.000 description 1
- 230000001338 necrotic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- MXHCPCSDRGLRER-UHFFFAOYSA-N pentaglycine Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)NCC(O)=O MXHCPCSDRGLRER-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 150000004804 polysaccharides Polymers 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000012898 sample dilution Substances 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2462—Lysozyme (3.2.1.17)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/06—Lysis of microorganisms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/64—Xanthomonas
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
Abstract
Изобретения относятся к области биотехнологии и могут быть использованы при получении лечебного препарата для медицинских и ветеринарных целей. Бактериолитический комплекс, продуцируемый бактерией Xanthomonas campestris XL1 (штамм депонирован под номером ВКМ В-2249 Д) содержит бактериолитические ферменты (мурамидаза, мурамоилаланинамидаза, эндопептидаза, бактериолитический фермент с молекулярной массой около 22 кДа, протеазу), полисахарид и балластные компоненты. Способ получения бактериолитического комплекса включает культивирование штамма-продуцента на питательной среде, содержащей глюкозу, пептон, дрожжевой экстракт или дрожжевой автолизат, фосфорнокислые соли натрия и калия, сернокислый магний, хлористый калий, сернокислое железо и воду. Изобретение обеспечивает увеличение содержания и выхода целевого продукта, ускорение и удешевление продукта и процесса его получения. 3 с.п. ф-лы, 1 табл., 1 ил.
Description
Изобретения относятся к области биотехнологии и могут быть использованы при получении лечебного препарата для медицинских и ветеринарных целей.
Известно использование бактериолитических препаратов в качестве лекарственных средств для лечения ряда заболеваний, вызванных патогенной микрофлорой, в том числе устойчивой к антибиотикам.
Известен препарат, обладающий бактериолитическим действием - лизоцим (Егоров Н. С. Основы учения об антибиотиках, 1979, "Высшая школа", стр. 347-349). Лизоцим яичного белка активен в отношении узкого спектра микроорганизмов, который ограничен, в основном, микрококками. По специфичности действия на пептидогликан клеточной стенки микроорганизмов лизоцим является мурамидазой, то есть разрушает связь между мурамовой кислотой и глюкозамином с образованием фрагментов с мурамовой кислотой на редуцирующем конце.
Именно поэтому лизоцим лизирует узкий спектр грамположительных микроорганизмов. В частности, он не лизирует клеточные стенки стафилококков - грамположительных патогенных бактерий, отличительной чертой которых является наличие пентаглицинового межпептидного мостика, придающего дополнительную жесткость их клеточной стенке. Кроме того, как большинство ферментных препаратов лизоцим недостаточно стабилен. Все вышесказанное касается и лизоцимов из других источников, например, растительных или бактериальных.
Известен также ферментный препарат на основе бактериолитических ферментов - лизостафин (Schindler С.A., Schuchardt V.Т. Lysostaphin: a new bacteriolytic agent for the Staphylococcus. 1964, Proc. of the Nation. Acad. Sci. USA, v. 51, 3, pp. 415-421).
Однако он не стабилен и используется только в лабораторной практике.
Известен комплекс бактериолитических ферментов, лизирующий грамположительные микроорганизмы, в частности патогенные множественно устойчивые к антибиотикам стафилококки и другие микроорганизмы, полученный из культуральной жидкости бактерии Xanthomonas campestris ВКПМ В-4102 (патент RU 1549227, кл. C 12 N 9/00, 1984).
Комплекс бактериолитических ферментов из культуральной жидкости бактерии Xanthomonas campestris является основой для 2 препаратов: препарат, используемый в медицине, получил название лизоамидаза, а используемый в ветеринарии - лизомаст.
В его состав входят три бактериолитических фермента: мурамидаза, мурамоилаланинамидаза, эндопептидаза, высокополимерный полисахарид, протеаза и балластные компоненты (О.А. Степная, Л.А. Ледова, И.С. Кулаев. "Бактериолитические ферменты". - "Успехи биологической химии", т.XXXIX, ОНТИ ПНЦ РАН, Пущино, 1999, стр. 341-346).
Соотношение компонентов в комплексе, установленное авторами, составляет, мас.%:
бактериолитические ферменты (мурамидаза, мурамоилаланинамидаза эндопептидаза) - 1,0-2,0
протеаза - 0,5-1,0
балластные компоненты - 4,0-8,0
полисахарид - остальное
Три бактериолитических фермента обладают разной субстратной специфичностью по отношению к: пептадогликанам клеточных стенок микроорганизмов: а) мурамидаза - аналог лизоцима по специфичности; 6) мурамоилаланинамидаза, отщепляющая пептидную часть пептидогликана от полисахаридной; в) эндопептидаза, разрушающая связи внутри межпептидных мостиков клеточной стенки. За счет этого препарат активно разрушает клетки широкого спектра грамположительных микроорганизмов, в том числе патогенных стрептококков и стафилококков.
бактериолитические ферменты (мурамидаза, мурамоилаланинамидаза эндопептидаза) - 1,0-2,0
протеаза - 0,5-1,0
балластные компоненты - 4,0-8,0
полисахарид - остальное
Три бактериолитических фермента обладают разной субстратной специфичностью по отношению к: пептадогликанам клеточных стенок микроорганизмов: а) мурамидаза - аналог лизоцима по специфичности; 6) мурамоилаланинамидаза, отщепляющая пептидную часть пептидогликана от полисахаридной; в) эндопептидаза, разрушающая связи внутри межпептидных мостиков клеточной стенки. За счет этого препарат активно разрушает клетки широкого спектра грамположительных микроорганизмов, в том числе патогенных стрептококков и стафилококков.
Благодаря наличию в лизоамидазе протеазы и двух из бактериолитических ферментов лизоамидазы - эндопептидазы и мурамоилаланинамидазы, - обладающих одновременно и протеолитической активностью, препарат хорошо очищает раны от некротических масс.
Полисахарид в составе комплекса обеспечивает стабильность бактериолитических ферментов (О.А. Степная, Л.A. Ледова, И.С. Кулаев. Биохимия, т.58, вып. 10, 1993, стр. 1523-1528). Структура полисахарида образована повторяющейся единицей, состоящей из N-ацетилглюкозамина, N-ацетилманнуроновой и 14-ацетилгалактуроновой кислот (L.M. Lilkhosherstov, S.N. Senchenkova, Y.A. Knirel еt at. FEBS Litters, N 368, 1995, p. 113-116).
Недостатком этого комплекса является то, что из-за наличия практически половины бактериолитических ферментов в денатурированной форме и балластных компонентов недостаточно высока его бактериолитическая активность. Кроме того, балластные компоненты не обладают медицинским действием, но возможно возникновение на них аллергических реакций.
Известен способ получения комплекса литических ферментов (патент RU 1774658, кл. C 12 N 9/36, 1990), включающий культивирование штамма - продуцента Xanthomonas campestris ВКПМ В-1402 на жидкой питательной среде, содержащей глюкозу, бактопептон, белково-витаминный концентрат (БВК) в количестве 2,5-6,0 г/л и минеральные соли, в условиях аэрации и перемешивания с последующим выделением целевого продукта, при этом часть БВК вносят в исходную среду. Содержание бактериолитических ферментов в культуральной жидкости в единицах бактериолитической активности составляет 40-60 ед/мд.
Выделение проводят по способу выделения комплекса литических ферментов, описанному в патенте RU 1755581, кл. C 12 N 9/36, 1990, включающему охлаждение фильтрата культуральной жидкости, осаждение целевого продукта органическим растворителем, охлаждение и отделение осадка, диализа и лиофильную сушку, причем перед осаждением фильтрат охлаждают, подкисляют до рН 3,5-5,0, добавляют 2,5-3,5 объема охлажденного этанола, выдерживают без перемешивания на холоду.
Содержание бактериолитических ферментов в препарате в единицах бактериолитической активности не превышает 50 ед/мг препарата.
Выход готового препарата от содержания литического комплекса в культуральной жидкости 40-60%.
И содержание бактериолитических ферментов в культуральной жидкости и выход готового препарата при осуществлении этого способа недостаточно велики.
Наиболее близким к предлагаемому способу по совокупности существенных признаков и достигаемому эффекту является способ получения комплекса литических ферментов (патент RU 1549227, кл. С 12 N 9/00, 1984), который предусматривает культивирование бактерии Хanthomonas campestris ВКПМ В-4102 на питательной среде, содержащей следующие компоненты, г/л:
глюкоза - 2,0-12,0
бактопептон - 2,0-6,0
белково-витаминный концентрат - 2,5-6,0
Nа2НРO4x12Н2О - 0,5-4,0
КН2РO4 - 0,1-1,0
NaCl - 0,35-1,0
MgSO4x7Н2О - 0,2-3,0
FeSO4x7Н2О - 0,01-0,1
вода - до 1 л
Процесс прекращают после достижения стабильной литической активности культуральной жидкости. Затем биомассу отделяют центрифугированием, комплекс литических ферментов, содержащихся в растворе, выделяют дробным осаждением ацетоном с последующим фракционным осаждением сульфатом аммония, осадок растворяют, раствор диализуют, лиофильно сушат.
глюкоза - 2,0-12,0
бактопептон - 2,0-6,0
белково-витаминный концентрат - 2,5-6,0
Nа2НРO4x12Н2О - 0,5-4,0
КН2РO4 - 0,1-1,0
NaCl - 0,35-1,0
MgSO4x7Н2О - 0,2-3,0
FeSO4x7Н2О - 0,01-0,1
вода - до 1 л
Процесс прекращают после достижения стабильной литической активности культуральной жидкости. Затем биомассу отделяют центрифугированием, комплекс литических ферментов, содержащихся в растворе, выделяют дробным осаждением ацетоном с последующим фракционным осаждением сульфатом аммония, осадок растворяют, раствор диализуют, лиофильно сушат.
Содержание бактериолитических ферментов в культуральной жидкости в единицах бактериолитической активности не превышает 63 ед/мл.
Выход готового препарата недостаточно высок - он составляет от содержания литического комплекса в культуральной жидкости около 20%.
Недостатком указанного способа является то, что белково-витаминный концентрат в настоящее время не выпускается отечественной промышленностью ввиду того, что его производство является неэкологичным, использование в составе среды дорогостоящего импортного бактопептона фирмы Difco (США) нерационально, так как значительно увеличивает стоимость конечного продукта.
Кроме того, использование для осаждения ферментов из культуральной жидкости продуцента этанола (RU 1755581), как и ацетона (RU 1549227) приводит к необратимой денатурации примерно половины бактериолитических, определяющих терапевтическое действие препарата ферментов, содержащихся в культуральной жидкости (по результатам определения бактериолитической активности и электрофоретическому анализу), а следовательно, к значительному уменьшению выхода продукта (см. чертеж).
В готовых препаратах лизоамидазы, полученных по известным способам, присутствует значительное количество минорных компонентов балластных белков (см. чертеж), которые, не имея медицинского эффекта, могут вызывать аллергическую реакцию.
Известен штамм - продуцент комплекса - бактерии Xanthomonas campestris ВКПМВ-102.
Недостатком этого штамма-продуцента является то, что из-за наличия в продуцируемом комплексе минорных компонентов недостаточно высока бактериолитическая активность.
Задача, на решение которой направлены заявляемые изобретения, - получение комплекса бактериолитических ферментов.
Технический результат, который может быть получен при осуществлении изобретения, заключается в увеличении количества и содержания бактериолитических ферментов в культуральной жидкости бактерии-продуцента, увеличении выхода продукта, оптимизации состава конечного продукта (уменьшение содержания в конечном продукте балластных белков), ускорении процесса получения готового продукта.
При этом также происходят удешевление продукта и ускорение процесса его получения.
Сущность предлагаемого бактериолитического комплекса заключается в том, что он продуцируется штаммом бактерии Xanthomonas campestris XL1 (Lysobacter sp. XL1) и кроме бактериолитических ферментов - мурамидазы, мурамоилаланинамидазы, эндопептидазы, полисахарида и протеазы, он дополнительно содержит бактериолитический фермент, имеющий молекулярную массу около 22 кДа.
Эти компоненты содержатся в комплексе при следующем соотношении, мас.%:
бактериолитические ферменты (мурамидаза, мурамоилаланинамидаза, эндопептидаза), бактериолитический фермент, имеющий молекулярную массу около 22 кДа - 2-5
протеаза - 1-2
балластные компоненты - 2-4
полисахарид - остальное
Предлагаемый препарат - комплекс бактериолитических ферментов разрушает клетки грамположительных микроорганизмов, в том числе патогенных множественно устойчивых к антибиотикам (см. таблицу).
бактериолитические ферменты (мурамидаза, мурамоилаланинамидаза, эндопептидаза), бактериолитический фермент, имеющий молекулярную массу около 22 кДа - 2-5
протеаза - 1-2
балластные компоненты - 2-4
полисахарид - остальное
Предлагаемый препарат - комплекс бактериолитических ферментов разрушает клетки грамположительных микроорганизмов, в том числе патогенных множественно устойчивых к антибиотикам (см. таблицу).
Наличие дополнительного бактериолитического фермента в препарате увеличивает бактериолитическую активность последнего. Предлагаемый комплекс содержит примерно в два раза меньше балластных компонентов, что очевидно из результатов электрофоретического анализа, представленных на чертеже. Бактериолитическая активность комплекса составляет 60-90 ЛЕ/мг.
Сущность предлагаемого способа получения бактериолитического комплекса заключается в том, что штамм-продуцент Xanthomonas campestris XL1 (Lysobacter sp. XL1) культивируют на питательной среде, содержащей глюкозу, пептон, дрожжевой экстракт или дрожжевой автолизат фосфорнокислые соли натрия и калия, сернокислый магний, хлористый калий, сернокислое железо и воду при следующем содержании компонентов, г/л:
глюкоза - 2,0-6,0
пептон - 1,5-6,0
дрожжевой экстракт - 1,0-6,0
или дрожжевой автолизат с аминным азотом 440-490 мг/л - 40-300 мл
Nа2НРO4x12Н2О - 4,0-5,0
КH2PО41,0-2,0
MgSO4x7H2O - 4,0-6,0
КСl - 0,4-1,60
FеSO4x7Н2О - 0,05-0,20
вода - до 1 л
Процесс прекращают по достижении стабильной литической активности культуральной жидкости. Биомассу отделяют центрифугированием, из культуральной жидкости ферментный комплекс осаждают сульфатом аммония (70-85% насыщения), осадок растворяют, раствор диализуют, лиофильно сушат.
глюкоза - 2,0-6,0
пептон - 1,5-6,0
дрожжевой экстракт - 1,0-6,0
или дрожжевой автолизат с аминным азотом 440-490 мг/л - 40-300 мл
Nа2НРO4x12Н2О - 4,0-5,0
КH2PО41,0-2,0
MgSO4x7H2O - 4,0-6,0
КСl - 0,4-1,60
FеSO4x7Н2О - 0,05-0,20
вода - до 1 л
Процесс прекращают по достижении стабильной литической активности культуральной жидкости. Биомассу отделяют центрифугированием, из культуральной жидкости ферментный комплекс осаждают сульфатом аммония (70-85% насыщения), осадок растворяют, раствор диализуют, лиофильно сушат.
Технический эффект при использовании предлагаемого способа достигается тем, что в известном способе культивирование штамма бактерии Xanthomonas campestris XL1 проводят на питательной среде, содержащей глюкозу, пептон, дрожжевой экстракт или дрожжевой автолизат, фосфорнокислые соли натрия и калия, сернокислый магний, хлористый калий, сернокислое железо и воду при следующем содержании компонентов, г/л:
глюкоза - 2,0-6,0
пептон - 1,5-6,0
дрожжевой экстракт - 1,0-6,0
или дрожжевой автолизат с аминным азотом 440-490 мг/л - 40-300 мл
Nа2НРO4x12Н2О - 4,0-5,0
КН2РO4 - 1,0-2,0
MgSO4x7H2O - 4,0-6,0
КCl - 0,4-1,60
FeSO4x7H2O - 0,05-0,20
вода - до 1 л
а осаждение комплекса сульфатом аммония проводят непосредственно из культуральной жидкости.
глюкоза - 2,0-6,0
пептон - 1,5-6,0
дрожжевой экстракт - 1,0-6,0
или дрожжевой автолизат с аминным азотом 440-490 мг/л - 40-300 мл
Nа2НРO4x12Н2О - 4,0-5,0
КН2РO4 - 1,0-2,0
MgSO4x7H2O - 4,0-6,0
КCl - 0,4-1,60
FeSO4x7H2O - 0,05-0,20
вода - до 1 л
а осаждение комплекса сульфатом аммония проводят непосредственно из культуральной жидкости.
Предлагаемые компоненты питательной среды и их соотношения позволяют сделать среду дешевле и повысить содержание бактериолитических ферментов в культуральной жидкости продуцента с 30-60 ЛЕ/мл (в известных способах) до 70-90 ЛЕ/мл снизить содержание в ней балластных белков (см. чертеж).
Бактериолитическую активность в процессе культивирования и в ходе выделения ферментного комплекса определяют следующим образом: к 2 мл суспензии лиофилизированных клеток Staphylococcus aureus 209-Р в 0,01 М трис-НСl буфере, рН 8,4-8,5 с концентрацией 0,5-0,6 единиц оптической плотности, прогретой в течение 10 минут при 37оС, добавляют 0,1 мл пробы, смесь инкубируют 5 минут при 37оС. Активность рассчитывают по формуле
где D - оптическая плотность пробы после инкубации;
Do - оптическая плотность контроля;
t - время инкубации, минуты;
Р - разведение пробы;
0,01 - оптическая плотность, соответствующая 1 единице активности;
0,1 - объем пробы, мл (патент RU 1549227).
где D - оптическая плотность пробы после инкубации;
Do - оптическая плотность контроля;
t - время инкубации, минуты;
Р - разведение пробы;
0,01 - оптическая плотность, соответствующая 1 единице активности;
0,1 - объем пробы, мл (патент RU 1549227).
Увеличение в питательной среде содержания сульфата магния стимулирует продукцию бактериолитических ферментов.
Изменение схемы выделения - исключение из схемы очистки дробного осаждения ацетоном (патент RU 1549227) или спиртом (патент RU 1755581) - сокращает длительность процесса получения конечного продукта и увеличивает выход целевого продукта с 20-50% (в известных способах) до 80-100% от содержания в культуральной жидкости.
Для осуществления предлагаемого способа предлагается штамм бактерии Xanthomonas camрestris XL1 (Lysobacter sp. XL1) - продуцент бактериолитического комплекса.
Штамм бактерии Xanthomonas campestris XL1 (Lysobacter sp. XL1) депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов при Институте биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г. К. Скрябина РАН (г. Пущино Московской области, проспект Науки, 5) под номером ВКМ В-2249 Д.
Штамм получен путем селекции на селективных средах из штамма бактерий Xanthomonas campestris BKПM В 4102.
Культурально-морфологические признаки штамма
Неподвижные (отсутствие жгутиков) прямые палочки размером 0,6-0,7x2,0 мкм, расположенные одиночно и попарно.
Неподвижные (отсутствие жгутиков) прямые палочки размером 0,6-0,7x2,0 мкм, расположенные одиночно и попарно.
На стандартных питательных средах (МПА, BBL, Becton Dickinson) образует круглые колонии 2 мм и более в диаметре, выпуклые, гладкие, блестящие, слизистые, края ровные, желтые, непрозрачные. Выделяет в питательную среду черно-коричневый пигмент, время появления которого и интенсивность зависят от состава среды. Имеет мукоидный рост на агаризованной среде с 5% глюкозы. Окраска по Граму методом Грегерсена (Gregersen, 1978) - грамотрицительная.
Биохимические признаки
Анаэроб. Хемоорганотроф. Нуждается в факторах роста.
Анаэроб. Хемоорганотроф. Нуждается в факторах роста.
Оксидазо- и каталазоположительный.
Оптимальная температура роста: +25-30оС, растет при +4оС и слабо при +37oС.
Не обладает способностью к денитрификации. Образует кислоту в аэробных условиях из глюкозы.
Гидролизует желатин, эскулин, казеин.
Образует H2S из пептона.
Растет на средах, содержащих до 4% NaCl.
Идентификация проведена на основании: Bergey's manual of systematic bacteriology. Eds. Noel R. Krieg, John G. Holt. Baltimore; London Williams & Wilkins. 1984, v.1.
Штамм Xanthomonas campestris XL1 не патогенен для человека и животных. Штамм продуцирует бактериолитический комплекс, включающий бактериолитические ферменты (мурамидазу, мурамоилаланинамидазу, эндопептидазу, бактериолитический фермент, имеющий молекулярную массу около 22 кДа), протеазу, кислый высокомолекулярный полисахарид, и балластные компоненты.
На чертеже представлены белковые спектры бактериолитических комплексов (электрофорез в полиакриламидном теле), полученных по известным и предлагаемому способам.
Возможность осуществления способа подтверждается следующими примерами, но не ограничивается ими.
Пример 1.
В колбу емкостью 750 мл вносят 150 мл питательной среды состава, г/л:
глюкоза - 5,0
пептон - 2,0
дрожжевой экстракт - 2,5
Nа2НРO4х12Н2О - 4,0
КН2РO4 - 1,0
КСl - 0,5
MgSO4х7Н2О - 3,0
FeSO4х7Н2О - 0,1
вода - до 1 л
доводят рН среды до 7,0 10%-ным раствором NaOH. Колбу со средой стерилизуют. В стерильную колбу со средой вносят 10% инокулята бактерий Xanthomonas campestris XL1 и культивируют в течение 24 часов при 29оС на качалке (200 оборотов в минуту). Бактериальные клетки отделяют центрифугированием.
глюкоза - 5,0
пептон - 2,0
дрожжевой экстракт - 2,5
Nа2НРO4х12Н2О - 4,0
КН2РO4 - 1,0
КСl - 0,5
MgSO4х7Н2О - 3,0
FeSO4х7Н2О - 0,1
вода - до 1 л
доводят рН среды до 7,0 10%-ным раствором NaOH. Колбу со средой стерилизуют. В стерильную колбу со средой вносят 10% инокулята бактерий Xanthomonas campestris XL1 и культивируют в течение 24 часов при 29оС на качалке (200 оборотов в минуту). Бактериальные клетки отделяют центрифугированием.
К 24 часам культивирования бактериолитическая активность культуральной жидкости составляет 72 ЛЕ/мл.
Пример 2.
Культивируют штамм Xanthomonas campestris XLl, как указано в примере 1, на среде следующего состава, г/л:
глюкоза - 5,0
пептон - 2,0
дрожжевой автолизат - 100 мл
Na2HPО4х12H2О - 4,2
КН2РО4 - 1,0
КCl - 0,6
MgSО4х7Н2О - 5,0
FeSO4х7Н2О - 0,1
вода - до 1 л
К 24 часам культивирования бактериолитическая активность культуральной жидкости составляет 70 ЛЕ/мл.
глюкоза - 5,0
пептон - 2,0
дрожжевой автолизат - 100 мл
Na2HPО4х12H2О - 4,2
КН2РО4 - 1,0
КCl - 0,6
MgSО4х7Н2О - 5,0
FeSO4х7Н2О - 0,1
вода - до 1 л
К 24 часам культивирования бактериолитическая активность культуральной жидкости составляет 70 ЛЕ/мл.
Пример 3.
Культивируют штамм-продуцент, как указано в примере 1, на среде следующего состава, г/л:
глюкоза - 5,0
пептон - 2,0
дрожжевой экстракт - 2,0
Na2HPО4х12H2O - 4,2
КН2РO4 - 1,0
КСl - 0,6
MgSO4х7Н2О - 5,0
FeSO4х7Н2О - 0,1
вода - до 1 л
К 24 часам культивирования активность культуральной жидкости 90 ЛЕ/мл.
глюкоза - 5,0
пептон - 2,0
дрожжевой экстракт - 2,0
Na2HPО4х12H2O - 4,2
КН2РO4 - 1,0
КСl - 0,6
MgSO4х7Н2О - 5,0
FeSO4х7Н2О - 0,1
вода - до 1 л
К 24 часам культивирования активность культуральной жидкости 90 ЛЕ/мл.
Пример 4.
В ферментер Анкум вносят 6 л питательной среды следующего состава, г/л:
глюкоза - 5,0
пептон - 2,0
дрожжевой экстракт - 2,0
Nа2НРO4x12Н2O - 4,2
КH2PО4 - 1,0
КСl - 0,6
МgSO4х7Н2О - 5,0
FeSO4х7H2O - 0,1
вода - до 1 л
стерилизуют при 0,5 кгс/см2 30 минут.
глюкоза - 5,0
пептон - 2,0
дрожжевой экстракт - 2,0
Nа2НРO4x12Н2O - 4,2
КH2PО4 - 1,0
КСl - 0,6
МgSO4х7Н2О - 5,0
FeSO4х7H2O - 0,1
вода - до 1 л
стерилизуют при 0,5 кгс/см2 30 минут.
В ферментер вносят стерильно 300 мл посевного материала, выращенного на среде вышеуказанного состава. Культивирование ведут при 29оС, подаче воздуха 0,3 объема на 1 объем среды в минуту. чтобы парциальное давление кислорода в среде не опускалось ниже 30% от насыщения.
Поддерживают рН среды в интервале 6,2-7,5, подавая в среду соответственно 10%-ный раствор NaOH при его понижении или 10%-ный раствор НСl при повышении рН. К 24 часам культивирования активность культуральной жидкости составляет 70 ЛЕ/мл.
К охлажденной культуральной жидкости (5,6 л) добавляют сульфат аммония до 80% насыщения, выдерживают 12 часов, отделяют осадок центрифугированием. Осадок растворяют в воде, диализуют, после диализа получают 500 мл раствора, содержащего бактериолитический комплекс.
Раствор лиофильно сушат, получают около 5 г препарата с активностью 72 ЛE/мг препарата.
Суммарная бактериолитическая активность культуральной жидкости составляет 355320 ЛЕ, суммарная активность конечного продукта 360000 ЛЕ. Выход готового продукта 100% от содержания в культуральной жидкости.
Результаты электрофоретического анализа препаратов лизоамидазы, полученных по известным способам и по предлагаемому способу, представлены на чертеже.
Пример 5.
Культуру-продуцент Xanthomonas campestris XL1 выращивают в ферментере Анкум, как в примере 4, на среде, описанной в примере 2. К 24 часам активность культуральной жидкости составляет 65 ЛЕ/мл. При получении конечного продукта по схеме, приведенной в примере 4, бактериолитическая активность препарата - 60 ЛЕ/мг. Выход конечного продукта составляет 100%.
Электрофоретический анализ конечных продуктов показал, что при использовании известных способов получения комплекса конечный продукт имеет большое количество балластных белков, причем многие из них находятся в препарате в таком же количестве, что и бактериолитические ферменты.
Конечный продукт, полученный предлагаемым способом, содержит значительно меньшее количество балластных белков и обогащен бактериолитическими ферментами.
Данные таблицы показывают, что предлагаемый препарат по сравнению с известным лизирует дополнительно 10 штаммов бактерий семи видов и, кроме того, лизирует дополнительно клетки 18 клинических штаммов золотистого стафилококка, выделенных непосредственно от больных.
Таким образом, предлагаемый способ позволяет повысить содержание бактериолитических ферментов в культуральной жидкости продуцента Xanthomonas campestris XL1, увеличить выход конечного продукта, уменьшить содержание в конечном продукте балластных белков (см. чертеж).
Кроме того, способ сокращает время процесса получения конечного продукта, уменьшает стоимость конечного продукта.
Claims (3)
1. Бактериолитический комплекс, продуцируемый бактерией вида Xanthomonas campestris, включающий бактериолитические ферменты мурамидазу, мурамоилаланинамидазу, эндопептидазу, протеазу и полисахарид, отличающийся тем, что он продуцируется штаммом бактерии Xanthomonas campestris BKM В-2249 Д и дополнительно содержит бактериолитический фермент с молекулярной массой около 22 кДа.
2. Способ получения бактериолитического комплекса, включающий культивирование штамма бактерии вида Xanthomonas campestris на питательной среде, отделение биомассы от культуральной жидкости центрифугированием, осаждение комплекса сульфатом аммония, диализ растворенного осадка и лиофильную сушку целевого продукта, отличающийся тем, что культивируют штамм бактерии Xanthomonas campestris BKM В-2249 Д, а в качестве питательной среды используют среду, содержащую глюкозу, пептон, дрожжевой экстракт или дрожжевой автолизат, фосфорнокислые соли натрия и калия, сернокислый магний, хлористый калий, сернокислое железо и воду при следующем содержании компонентов, г/л:
Глюкоза - 2,0-6,0
Пептон - 1,5-6,0
Дрожжевой экстракт или дрожжевой автолизат с аминным азотом - 1,0-6,0
440-490 мг/л - 40-300 мл
Na2HPО4•12H2О - 4,0-5,0
КН2РО4 - 1,0-2,0
MgSО4•7H2О - 4,0-6,0
КСl - 0,4-1,60
FeSO4•7H2O - 0,05-0,20
Вода - До 1 л
осаждение комплекса сульфатом аммония проводят непосредственно из культуральной жидкости.
Глюкоза - 2,0-6,0
Пептон - 1,5-6,0
Дрожжевой экстракт или дрожжевой автолизат с аминным азотом - 1,0-6,0
440-490 мг/л - 40-300 мл
Na2HPО4•12H2О - 4,0-5,0
КН2РО4 - 1,0-2,0
MgSО4•7H2О - 4,0-6,0
КСl - 0,4-1,60
FeSO4•7H2O - 0,05-0,20
Вода - До 1 л
осаждение комплекса сульфатом аммония проводят непосредственно из культуральной жидкости.
3. Штамм бактерий Xanthomonas campestris ВКМ В-2249 Д - продуцент бактериолитического комплекса.
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2000129650/13A RU2193063C2 (ru) | 2000-11-29 | 2000-11-29 | Бактериолитический комплекс, способ его получения и штамм для осуществления способа |
| PCT/RU2001/000514 WO2002044352A1 (en) | 2000-11-29 | 2001-11-28 | Bacteriolytic complex, method for producing said complex and strain for carrying out said method. |
| KR1020027009664A KR20020073189A (ko) | 2000-11-29 | 2001-11-28 | 용균 복합체, 그 제조 방법 및 그 방법을 실현하기 위한균주 |
| US10/181,498 US7150985B2 (en) | 2000-11-29 | 2001-11-28 | Bacteriolytic complex, method for producing said complex and strain for carrying out said method |
| CNB018042473A CN1266271C (zh) | 2000-11-29 | 2001-11-28 | 溶菌复合物及其生产方法和实现该方法所用的菌株 |
| US11/247,553 US20060051336A1 (en) | 2000-11-29 | 2005-10-11 | Bacteriolytic complex, method of its production, and strain for realization of the method |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2000129650/13A RU2193063C2 (ru) | 2000-11-29 | 2000-11-29 | Бактериолитический комплекс, способ его получения и штамм для осуществления способа |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2000129650A RU2000129650A (ru) | 2002-11-10 |
| RU2193063C2 true RU2193063C2 (ru) | 2002-11-20 |
Family
ID=20242623
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2000129650/13A RU2193063C2 (ru) | 2000-11-29 | 2000-11-29 | Бактериолитический комплекс, способ его получения и штамм для осуществления способа |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US7150985B2 (ru) |
| KR (1) | KR20020073189A (ru) |
| CN (1) | CN1266271C (ru) |
| RU (1) | RU2193063C2 (ru) |
| WO (1) | WO2002044352A1 (ru) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006123969A3 (fr) * | 2005-05-18 | 2007-03-22 | Inst Biokhim I Fisiologii Mikr | Produit possedant une action bactericide vis-a-vis des cellules vegetatives et cryptogames de bacillus anthracis, procede de prevention et de traitement de l'anthrax |
| RU2367469C2 (ru) * | 2007-05-23 | 2009-09-20 | Закрытое акционерное общество "Биологические исследования и системы" | Фармацевтическая композиция для местного применения, обладающая антибактериальным и некролитическим действием, на основе лизоамидазы |
| RU2407782C2 (ru) * | 2009-02-20 | 2010-12-27 | Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН | ЛИТИЧЕСКАЯ ПРОТЕАЗА AlpA БАКТЕРИИ LYSOBACTER SP. XL1, ФРАГМЕНТ ДНК, КОДИРУЮЩИЙ ЛИТИЧЕСКУЮ ПРОТЕАЗУ AlpA БАКТЕРИИ LYSOBACTER SP. XL1, И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИТИЧЕСКОЙ ПРОТЕАЗЫ AlpA БАКТЕРИИ LYSOBACTER SP. XL1 |
| RU2408725C2 (ru) * | 2009-02-20 | 2011-01-10 | Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН | ЛИТИЧЕСКАЯ ПРОТЕАЗА AlpB БАКТЕРИИ Lysobacter sp. XLI, ФРАГМЕНТ ДНК, КОДИРУЮЩИЙ ЛИТИЧЕСКУЮ ПРОТЕАЗУ AlpB БАКТЕРИИ Lysobacter sp. XLI, И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИТИЧЕСКОЙ ПРОТЕАЗЫ AlpB БАКТЕРИИ Lysobacter sp. XLI |
| RU2744107C1 (ru) * | 2020-10-05 | 2021-03-02 | Общество с ограниченной ответственностью «Газпромнефть Научно-Технический Центр» | Штамм бактерий Xanthomonas fuscans - продуцент ксантановой камеди |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013087764A1 (en) * | 2011-12-14 | 2013-06-20 | Fraunhofer Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. | Process for degrading a biofilm on surfaces of objects |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU1755581A1 (ru) * | 1990-11-05 | 1995-08-20 | Институт Биохимии И Физиологии Микроорганизмов Ан Ссср | Способ выделения комплекса литических ферментов |
| SU1774658A1 (ru) * | 1990-11-05 | 1995-09-10 | Институт Биохимии И Физиологии Микроорганизмов Ан Ссср | Способ получения комплекса литических ферментов |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5612435B1 (ru) * | 1971-03-29 | 1981-03-20 | ||
| GB1353877A (en) | 1972-10-12 | 1974-05-22 | Nat Food Research Inst Directo | Lytic enzymes |
| SU519470A1 (ru) | 1973-09-28 | 1976-06-30 | Днепропетровский Ордена Трудового Красного Знамени Государственный Университет Им.300-Летия Воссоединения Украины С Россией | Способ получени литических ферментов |
| RU1549227C (ru) | 1984-10-04 | 1995-12-20 | Институт биохимии и физиологии микроорганизмов РАН | Способ получения комплекса литических ферментов |
-
2000
- 2000-11-29 RU RU2000129650/13A patent/RU2193063C2/ru active
-
2001
- 2001-11-28 US US10/181,498 patent/US7150985B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-11-28 WO PCT/RU2001/000514 patent/WO2002044352A1/ru not_active Ceased
- 2001-11-28 KR KR1020027009664A patent/KR20020073189A/ko not_active Withdrawn
- 2001-11-28 CN CNB018042473A patent/CN1266271C/zh not_active Expired - Fee Related
-
2005
- 2005-10-11 US US11/247,553 patent/US20060051336A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU1755581A1 (ru) * | 1990-11-05 | 1995-08-20 | Институт Биохимии И Физиологии Микроорганизмов Ан Ссср | Способ выделения комплекса литических ферментов |
| SU1774658A1 (ru) * | 1990-11-05 | 1995-09-10 | Институт Биохимии И Физиологии Микроорганизмов Ан Ссср | Способ получения комплекса литических ферментов |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| СТЕПНАЯ О.А. и др. Бактериолитические ферменты. Успехи биологической химии. - Пущино, ОНТИ ПНЦ РАН. 1999. T.XXXIX, с.341-346. КИСЛУХИНА О.В. и др. Ферментативный лизис микроорганизмов. - А.-А.Рауан, 1990, с.30-44. * |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006123969A3 (fr) * | 2005-05-18 | 2007-03-22 | Inst Biokhim I Fisiologii Mikr | Produit possedant une action bactericide vis-a-vis des cellules vegetatives et cryptogames de bacillus anthracis, procede de prevention et de traitement de l'anthrax |
| RU2296576C2 (ru) * | 2005-05-18 | 2007-04-10 | Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН | СРЕДСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ БАКТЕРИЦИДНЫМ ДЕЙСТВИЕМ В ОТНОШЕНИИ ВЕГЕТАТИВНЫХ И СПОРОВЫХ КЛЕТОК Bacillus anthracis, СПОСОБ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ |
| RU2367469C2 (ru) * | 2007-05-23 | 2009-09-20 | Закрытое акционерное общество "Биологические исследования и системы" | Фармацевтическая композиция для местного применения, обладающая антибактериальным и некролитическим действием, на основе лизоамидазы |
| RU2407782C2 (ru) * | 2009-02-20 | 2010-12-27 | Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН | ЛИТИЧЕСКАЯ ПРОТЕАЗА AlpA БАКТЕРИИ LYSOBACTER SP. XL1, ФРАГМЕНТ ДНК, КОДИРУЮЩИЙ ЛИТИЧЕСКУЮ ПРОТЕАЗУ AlpA БАКТЕРИИ LYSOBACTER SP. XL1, И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИТИЧЕСКОЙ ПРОТЕАЗЫ AlpA БАКТЕРИИ LYSOBACTER SP. XL1 |
| RU2408725C2 (ru) * | 2009-02-20 | 2011-01-10 | Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН | ЛИТИЧЕСКАЯ ПРОТЕАЗА AlpB БАКТЕРИИ Lysobacter sp. XLI, ФРАГМЕНТ ДНК, КОДИРУЮЩИЙ ЛИТИЧЕСКУЮ ПРОТЕАЗУ AlpB БАКТЕРИИ Lysobacter sp. XLI, И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИТИЧЕСКОЙ ПРОТЕАЗЫ AlpB БАКТЕРИИ Lysobacter sp. XLI |
| RU2744107C1 (ru) * | 2020-10-05 | 2021-03-02 | Общество с ограниченной ответственностью «Газпромнефть Научно-Технический Центр» | Штамм бактерий Xanthomonas fuscans - продуцент ксантановой камеди |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2002044352A9 (en) | 2002-10-24 |
| US20030148497A1 (en) | 2003-08-07 |
| US20060051336A1 (en) | 2006-03-09 |
| US7150985B2 (en) | 2006-12-19 |
| WO2002044352A1 (en) | 2002-06-06 |
| KR20020073189A (ko) | 2002-09-19 |
| CN1266271C (zh) | 2006-07-26 |
| CN1396952A (zh) | 2003-02-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JPH043948B2 (ru) | ||
| EP0468411B1 (en) | A mutant of bacterium Clostridium histolyticum, a process for the obtaining thereof, and its use in the production of clostripain-free collagenase | |
| Agrawal et al. | Screening and characterization of keratinase enzyme obtained from keratin degrading microorganism isolated from Sanjan poultry waste dumping soil | |
| RU2193063C2 (ru) | Бактериолитический комплекс, способ его получения и штамм для осуществления способа | |
| CZ308157B6 (cs) | Kmen bakterie Clostridium histolyticum, kolagenáza připravená s použitím tohoto kmene a její použití | |
| CN106906197A (zh) | 发酵工艺制备溶菌酶的方法 | |
| CN107058266B (zh) | 一种通过发酵工艺制备溶菌酶的方法 | |
| JPH0480675B2 (ru) | ||
| Маtseliukh et al. | Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum probiotic strains as protease producers | |
| CN1181189C (zh) | 一种分泌具有纤溶活性蛋白酶的泛温链霉菌c-3662 | |
| RU2158302C2 (ru) | Питательная среда для роста бифидо- и лактобактерий | |
| RU2835110C1 (ru) | Штамм Clostridium sporogenes B-14642 - продуцент коллагеназы | |
| JP2898022B2 (ja) | コラーゲン分解酵素の製造方法 | |
| US4264734A (en) | Process for producing antibiotic desacetyl 890A10 | |
| RU2143489C1 (ru) | Способ получения лизостафина | |
| RU2026347C1 (ru) | Штамм бактерии alteromonas haloplanktis - продуцент полиуридил-эндорибонуклеазы | |
| RU2310685C1 (ru) | Штамм бактерий serratia marcescens, продуцирующий липолитические ферменты, для получения препарата для очистки сточных вод от жиров | |
| UA145577U (uk) | Штам bacillus sp. imb b-7883 - продуцент позаклітинної протеїнази з фібриногенолітичною активністю | |
| RU2001952C1 (ru) | Штамм бактерий RHIZOBIUM LEGUMINOSARUM-продуцент рестриктазы RLE 69I | |
| RU2104014C1 (ru) | Состав питательной среды для роста бифидобактерий | |
| RU2244741C1 (ru) | Способ получения протеолитического препарата для гидролиза структурных белков | |
| RU1692144C (ru) | Способ получения вещества, обладающего литическим действием | |
| RU2157841C1 (ru) | Штамм бактерий aсetobacter pasterianus абз-2 гкм визр n 102 для окисления углеводородов нефти и нефтепродуктов | |
| JPS6344128B2 (ru) | ||
| KR880002315B1 (ko) | 히아론산과 스트렙토 키나제를 동시에 생산하기 위한 스트렙토코커스속 미생물의 배양방법 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| QZ4A | Changes in the licence of a patent |
Effective date: 20031202 |
|
| PD4A | Correction of name of patent owner | ||
| QB4A | Licence on use of patent |
Free format text: LICENCE Effective date: 20150604 |