RU2185070C2

RU2185070C2 - Полифенольные фракции чая, их применение и содержащие их композиции

Info

Publication number: RU2185070C2
Application number: RU97117083/13A
Authority: RU
Inventors: Эдзио Бомбарделли; Паоло МОРАДЗОНИ; Джузеппе МУСТИК
Original assignee: Индена С.П.А.
Priority date: 1995-03-14
Filing date: 1996-03-07
Publication date: 2002-07-20
Also published as: DK0814823T3; ITMI950493A0; US5989557A; AU696676B2; DE69622998T2; IT1275905B1; CN1138552C; ES2181873T3; JPH10512582A; WO1996028178A1; AU5004096A; PT814823E; NO326762B1; DE69622998D1; KR19980702962A; CN1178467A; JP3264934B2; NO974188D0; JP2002187848A; CA2215210A1

Abstract

Настоящее изобретение относится к получению новых полифенольных фракций Camellia sinensis (чай), их применению и к содержащим их композициям. Настоящее изобретение специфично относится к получению экстрактов, лишенных кофеина, но содержащих полифенолы, получаемые из эпигаллокатехина в их природном соотношении. Эти экстракты могут быть использованы сами по себе или в сочетании с липофильными антиоксидантами, сульфурированными аминокислотами или олигоэлементами биохимического или пищевого значения. Использование этих новых экстрактов самих по себе или в сочетании с другими активными элементами представляет интерес для пищевой, фармацевтической и косметической областей. Это позволяет получить высокоэффективный антиоксидант с дифференцированным цитотоксичным эффектом. 6 с. и 15 з.п.ф-лы, 1 табл.

Description

Изобретение относится к новым полифенольным фракциям Camellia sinensis (чай), способу их получения и их применению, а также к содержащим их композициям.

Особенно настоящее изобретение относится к экстрактам, лишенным кофеина, но содержащим в основном полифенолы, полученные из эпигаллокатехина в их природном соотношении.

Известно, что кофеин отрицательно влияет на сердечно-сосудистую систему, а также оказывает мутагенный эффект, и его обычно удаляют экстракцией двуокисью углерода в гиперкритической фазе или хлорированными растворителями; однако упомянутые процедуры не направлены на сохранение стандартизированного содержания всех полифенольных компонентов, ответственных за полезные биологические эффекты.

Эти вещества, характерные для растения чая, недавно вызывали большой интерес из-за своего сильного антиоксидантного эффекта, как это описано в литературе (1,2). Этот эффект, по-видимому, относится в некоторой степени к способности некоторых из этих полифенолов (например, эпигаллокатехин-3-0-галлата," ингибировать образование неоплазий, искусственно введенных лабораторным животным (3,4).

Кроме того, недавние эпидемиологические исследования доказали, что потребление больших количеств зеленого чая связано с более низким числом заболеваний дегенеративными хроническими болезнями, например некоторыми формами рака и атеросклероза (5-8).

До сих пор механизм действия этих веществ, содержащихся в производных зеленого чая, еще не полностью выяснен, не говоря уже об общем антиоксидантном эффекте, описанном выше. Во время широких исследований заявитель обнаружил, что полифенольный компонент зеленого чая способен оказывать дифференцированный цитотоксичный эффект, зависящий от типа исследуемой клетки, и что подобная дифференциация в особенности относится к селективному попаданию в мишень, которое некоторые из этих полифенольных молекул проявляют по отношению к таким субклеточным участкам, как митохондрия.

Поэтому важность способа экстракции, позволяющего получать экстракты Camellia sinensis, характеризуемые стандартизированным содержанием полифенольных веществ и низким содержанием кофеина, очевидна.

Эта цель была достигнута путем способа, включающего:
а) экстракцию растительной биомассы водно-спиртовыми или водно-кетонными смесями;
б) полное или частичное упаривание растворителя экстракции;
в) суспендирование остатка в водной смеси 30-60% по объему метанола;
г) экстракцию гидрометанольной суспензии хлорированными растворителями;
д) фильтрование нерастворимых остатков и концентрирование гидрометанольной фазы;
е) подкисление по выбору органическими кислотами;
ж) экстракцию концентрированной гидрометанольной фазы и произвольное подкисление растворителями, выбранными из алифатических сложных эфиров, спиртов или кетонов при условии, что они не смешиваются с гидрометанольной смесью;
з) добавление по выбору ароматического или алифатического углеводорода с последующим промыванием разбавленными водными растворами минеральных кислот;
и) концентрирование несмешивающейся водно-органической фазы и ее разбавление хлорированными растворителями;
к) при отсутствии стадий е) и з) обработка макромолекулярными сильнокислыми катионообменными смолами в сухих алифатических кетонах или спиртах, предпочтительно спиртах.

Согласно первому варианту воплощения настоящего изобретения растительную массу экстрагируют алифатическими спиртами и кетонами, разбавленными водой, или самими по себе, предпочтительно водно-ацетоновыми смесями в диапазоне от 40 до 90% по объему (в особенности 70% ацетоном). Полученные экстракты концентрируют в зависимости от используемого растворителя либо до малого объема (от около 1/5 до около 1/15 от начального объема), либо до полного удаления органического растворителя.

В первом случае водный концентрат разбавляют метанолом до 50% (объем/объем), тогда как во втором случае остаток суспендируют в гидрометанольной смеси в диапазоне от 30 до 60%, предпочтительно 50%. Гидрометанольную смесь экстрагируют обратно хлорированными растворителями, предпочтительно хлористым метиленом, до удаления таких нежелательных веществ, как хлорофилл, терпены и кофеин, не связанных в комплексы с олигомерными полифенолами, присутствующими в растительной биомассе. Хлорированные органические фазы отбрасывают, тогда как гидрометанольную фазу концентрируют до тех пор, пока не будет удален метанол, отфильтровывая любые нерастворимые осадки, состоящие из комплексов танина с кофеином. Водный раствор экстрагируют такими несмешивающимися растворителями, как алифатические кетоны и спирты или алифатические сложные эфиры. Примеры упомянутых растворителей включают метилэтилкетон в присутствии таких солей, как хлорид или сульфат аммония (которые способны разрушать комплексы с кофеином благодаря своей кислотной и солевой природе, удерживающей их в воде и производящей в то же время селективную экстракцию возможных полифенолов), бутанол в его изомерных формах, этилформиат или этилацетат. Эти растворители, предпочтительно этилацетат, позволяют селективно извлекать фенольные вещества после концентрирования и разбавления хлорированными растворителями, в особенности хлористым метиленом. Конечные экстракты все еще содержат некоторое количество остаточного кофеина, связанного в комплекс с полифенолами, превышающее 1%, которое можно удалить при абсорбции на сульфоновых смолах в безводной среде, используя такие растворители, как метанол, этанол или ацетон, получая таким образом экстракт, содержащий не более чем 0,2% кофеина.

В следующем варианте воплощения способ настоящего изобретения включает экстракцию растительной биомассы 40-50% (объем/объем) водным метанолом или ацетоном, концентрирование элюата до полного удаления органического растворителя, предпочтительно почти до той же массы, что и экстрагированный растительный материал. После фильтрования нерастворимых осадков этот концентрат экстрагируют обратно хлорированными растворителями, предпочтительно хлористым метиленом, для того, чтобы удалить свободный кофеин и терпеноподобные инертные вещества. Водный раствор подкисляют органическими кислотами, предпочтительно лимонной кислотой, в присутствии цитрата аммония и экстрагируют обратно алифатическими сложными эфирами, предпочтительно этилацетатом. К органической фазе добавляют ароматические или алифатические углеводороды в количестве от 2 до 20% по объему, предпочтительно толуол в количестве 5% по объему от общего объема органической фазы, затем промывают разбавленными минеральными кислотами, предпочтительно 1%-ной серной кислотой до тех пор, пока не будет удален кофеин.

После промывания до нейтральной реакции органический раствор концентрируют до малого объема и выливают в такое количество хлористого метилена, которого достаточно для извлечения полифенолов.

В качестве растительной биомассы используются листья Camellia sinensis, предпочтительно тонко измельченные. Экстракция проводится при комнатной температуре (приблизительно 18-25^oС). Соотношение лекарственное вещество/растворитель не является критическим, но заключено обычно между 1:1 и 1:5 масса/объем для каждой единичной экстракции.

Продукты, полученные по этому способу, имеют в среднем содержание наиболее важных производных катехина: 50-65% эпигаллокатехин-3-0-галлата, 13-20% эпикатехин-3-0-галлата, 2-4% эпикатехина и 1,5-3% эпигаллокатехина.

Полифенольные фракции, полученные по одному из приведенных выше способов, характеризуются антиоксидантной способностью, сравнимой или превышающей эту способность, наблюдаемую для известных антиоксидантов, как это очевидно из следующей таблицы.

В in vitro тесте антилипопероксидантная активность продуктов была исследована с использованием экспериментальной модели, включающей обработку ультразвуком фосфатидилхолиновых липосом в пробирке и измерение продуктов от их окислительной деградации по известным методам (9). Инкубация липосом в присутствии антиоксидантов снижает в зависимости от дозы образование сопряженных диенов, которые представляют собой предварительную стадию окислительной деградации фосфолипидов.

Антиоксидантная активность полифенольной фракции зеленого чая по отношению к обработанным ультразвуком фосфатидилхолиновым липосомам
(фаза размножения)
Сравнение с эпигаллокатехин-3-0-галлатом, витамином Е и витамином С (представлены в таблице).

Данные представлены в виде концентраций (мкМ) продукта, необходимой для снижения на 50% (CI50) образования сопряженных диенов, которое следует за обработкой ультразвуком фосфатидилхолиновых липосом.

Полагают, что антиоксидантная активность полифенолов также важна, поскольку она имеет отношение к антимутагенному эффекту, который недавно был описан для некоторых полифенолов, экстрагированных из зерен винограда (10).

Неожиданно оказалось, что полученные из зеленого чая полифенолы (несмотря на то, что они обладают высокой антиоксидантной активностью), при тех же концентрациях, что и те антимутагенные полифенолы из продуктов, экстрагированных из зерен винограда, не обладают упомянутой активностью; с другой стороны, они характеризуются дифференциальной цитотоксичностью (более высокой в линиях клеток, в которых митохондриальная мутация легальна), которая, как считают, представляет большой интерес.

Упомянутая цитотоксичность различна в зависимости от используемых линий клеток; в опухолевых клетках яичника, например, продукт настоящего изобретения проявляет цитотоксичный эффект при концентрациях около 50 мкМ, тогда как упомянутый эффект может быть измерен при значительно более высоких концентрациях (1000 мкМ) при его определении на нормальных клетках яичника.

В настоящем состоянии известной области техники для выяснения механизмов на основе самопроизвольной мутации были высказаны различные гипотезы и среди них укрепилось предположение о том, что некоторые продукты метаболизма клеточного цикла, в особенности свободные радикалы, ответственны за модулирование митохондриальной наследственности вследствие перокисления мембранной системы, от которой зависит репликация митохондриальной ДНК (11, 12).

С учетом этих предпосылок представляют большой интерес 2 класса соединений, которые, даже если они используют по меньшей мере частично схожие базовые механизмы (антиоксидантную активность на уровне митохондрии), действуют по двум различным направлениям: антимутагенному (как в случае производных зерен винограда) и дифференцированному цитотоксичному (как в случае продуктов настоящего изобретения). Поэтому оба класса продуктов могут быть использованы для профилактического лечения дегенеративных болезней, таких как неоплазии, сердечно-сосудистых заболеваний, таких как атеросклероз и артритные и артрозные формы различного происхождения.

Кроме того, продукты настоящего изобретения могут быть использованы в терапии сами по себе или в сочетании с другими веществами с тем, чтобы проявился синергетический эффект. В онкологии, например, эти продукты могут сочетаться с обычной хемотерапией с двойным преимуществом уменьшения отрицательного эффекта при окислительном процессе, который обычно возникает при некоторых лечениях (например, с некоторыми антрациклинами или платиновыми комплексами, такими как цисплатина) и разрушениях части клеток опухоли путем дифференцированного цитотоксичного механизма.

Для предупреждения опухолевого эффекта полифенольная фракция, сочетаемая с диетой, является методом для разрушения мутированных клеток в предраковом состоянии. В других состояниях, таких как атеросклероз, продукты настоящего изобретения могут преимущественно сочетаться с другими антиоксидантами, такими как каротеноиды, в особенности ликопен и зеаксантин для того, чтобы предохранить и сохранить целостность физиологического антиоксидантного пула.

В состояниях суставной дегенерации продукты настоящего изобретения могут сочетаться с сульфурированными аминокислотами, такими, как метионин, цистеин или пролин и гидропролин и вводятся по выбору в смеси с глюкозамином и жалуроновой кислотой. Роль, выполняемая полифенольной фракцией в упомянутом сочетании, является как антиоксидантной, так и антидегенеративной по отношению к хондробластям, вследствие стимуляции синтеза коллагена и протеогликанов в присутствии синергистов.

Активные дозировки этих экстрактов находятся в диапазоне от 10 до 1000 мг/день от одного до четырех раз в день, предпочтительно от 50 до 300 мг/день от одного до двух раз в день. При оральном применении DL₅₀ превышает 2000 мг/день для крысы и мыши.

Продукты могут быть включены в обычные фармацевтические формы, такие как мягкие и твердые желатиновые капсулы, таблетки, саше, сиропы, свечи и ампулы. В случае сочетания с другими активными элементами, композиции настоящего изобретения могут по выбору подходить для последовательного или отдельного введения отдельных активных элементов.

Следующие примеры далее иллюстрируют настоящее изобретение.

Пример I. Получение не содержащего кофеина экстракта зеленого чая со стандартизированным содержанием полифенола.

1 кг не ферментированных, тонко измельченных листьев Camellia sinensis экстрагируют 4 раза, каждый раз 3 л смесью ацетон/вода 7:3 (объем/объем). Объединенные экстракты концентрируют в вакууме до 1 кг при температуре, не превышающей 45^oС. Во время концентрирования образуется большое количество смолистой массы, состоящей их хлорофилла и прочих нежелательных липофильных веществ, так или иначе содержащих полифенолы. Концентрат разбавляют 1 л метанола и 0,5 л хлористого метилена. Смолистая масса растворяется в этой среде и после 30 мин перемешивания фазы разделяют; экстракцию хлористым метиленом повторяют еще три раза и затем хлористометиленовую фазу отбрасывают. Водно-метанольную фазу концентрируют в вакууме до полного удаления метанола, и концентрат экстрагируют 3 раза 0,5 л этилацетата. Водную фазу отбрасывают, тогда как органическую фазу сушат над Na₂SO₄ и концентрируют до объема 0.22 л. Концентрат выливают при сильном перемешивании в 1,2 л хлористого метилена, при этом происходит обильное выпадение коричневатого осадка, который после высушивания в вакууме весит около 0,12 кг.

Этот осадок содержит 1,6% алкалоидов и подвергается конечной очистке при растворении в 1,5 л метанола в атмосфере азота. Метанольный раствор обрабатывают сульфоновой смолой Amberlyst^® до исчезновения кофеина, что проверяется методом тонкослойной хроматографии. Метанольный раствор концентрируют досуха в вакууме при температуре, не превышающей 50^oС. По этому способу получают 0,11 кг бежевого продукта, имеющего следующий состав,%:
Эпигаллокатехин-3-0-галлат - 58.0
Эпикатехин-3-0-галлат - 16.0
Эпикатехин - 3.0
Эпигаллокатехин - 2.5
Пример II. Получение не содержащего кофеина экстракта зеленого чая со стандартизированным содержанием полифенола.

1 кг не ферментированных, тонко измельченных листьев Camellia sinensis экстрагируют 4 раза, каждый раз 3 л смесью ацетон/вода 4:6 (объем/объем). Объединенные экстракты концентрируют в вакууме до 1 кг при температуре, не превышающей 45^oС. Во время концентрирования образуется некоторое количество осадка, который отделяют и отбрасывают. Концентрат экстрагируют 3 раза 0,5 л хлористого метилена и затем отбрасывают хлористометиленовую фракцию. Водную фазу подкисляют лимонной кислотой до рН 1,5 в присутствии цитрата аммония и экстрагируют 3 раза 0,5 мл этилацетата. Водную фазу затем отбрасывают, тогда как органическую разбавляют 75 мл толуола и экстрагируют обратно 3 раза, каждый раз 150 мл 1% H₂SO₄. После промывания водой до нейтральной реакции и высушивания над Na₂SO₄ органическую фазу концентрируют до 300 мл, затем выливают этот концентрат в 1,5 мл хлористого метилена. После высушивания в вакууме в течение ночи получают 0,1 кг бежевого порошка, имеющего характеристики продукта из примера I.

Пример III. Получение не содержащего кофеина экстракта зеленого чая со стандартизированным содержанием полифенола.

1 кг не ферментированных, тонко измельченных листьев Camellia sinensis экстрагируют 4 раза, каждый раз 3 л смесью метанол/вода 1:1. Объединенные экстракты концентрируют в вакууме до 1 кг при температуре, не превышающей 45^oС. Во время концентрирования образуется некоторое количество осадка, который отделяют и отбрасывают. Концентрат экстрагируют 3 раза 0,5 л хлористого метилена и затем отбрасывают хлористометиленовую фракцию. Водную фазу подкисляют лимонной кислотой до рН 1,5 в присутствии цитрата аммония и экстрагируют 3 раза 0,5 л этилацетата. Водную фазу затем отбрасывают, тогда как органическую разбавляют 75 мл толуола и экстрагируют обратно 3 раза, каждый раз 150 мл 1% H₂SO₄. После промывания водой до нейтральной реакции и высушивания над Nа₂SO₄ органическую фазу концентрируют до 300 мл, затем выливают этот концентрат в 1,5 мл хлористого метилена. После высушивания в вакууме при 50^oС в течение ночи получают 0,1 кг бежевого порошка, имеющего характеристики продукта из примера I.

Пример IV. Желатиновые капсулы, содержащие полифенольную фракцию зеленого чая.

50 мг полифенольной фракции зеленого чая смешивают с 88 мг микрокристаллической целлюлозы (Avicel PH 102), 3 мг коллоидной двуокиси кремния (Aerosil 200), 8 мг сшитой натрийкарбоксиметилцеллюлозы (Ac-Di-Sol) и 1 мг стеарата магния. Полученную смесь инкапсулируют в твердые желатиновые капсулы (размер 3).

Пример V. Желатиновые капсулы, содержащие полифенольную фракцию зеленого чая.

150 мг полифенольной фракции зеленого чая смешивают с 264 мг микрокристаллической целлюлозы (Avicel PH 102), 9 мг коллоидной двуокиси кремния (Aerosil 200), 24 мг сшитой натрийкарбоксиметилцеллюлозы и 3 мг стеарата магния. Полученную смесь инкапсулируют в твердые желатиновые капсулы (размер 0),
Пример VI. Таблетки с покрытием, содержащие полифенольную фракцию зеленого чая.

50 мг полифенольной фракции зеленого чая смешивают с 50 мг микрокристаллической целлюлозы (Avicel PH 102), 33 мг двухосновного фосфата кальция (Encompress A), 3 мг коллоидной двуокиси кремния (Aerosil 200), 12 мг сшитой натрийкарбоксиметилцеллюлозы (Ac-Di-Sol) и 2 мг стеарата магния. Порошки перемешивают в течение 10 мин, затем таблетируют с дозировкой 150 мг/таблетку. Полученные таблетки (диаметр 7 мм) покрывают слоем пленки, содержащим 4,5 мг гидроксипропилметилцеллюлозы (Methocel E5), 0.9 мг полиэтиленгликоля 6000 (Carbowax 6000), 1.2 мг двуокиси титана и 0,9 мг талька.

Пример VII. Таблетки с покрытием, содержащие полифенольную фракцию зеленого чая.

150 мг полифенольной фракции зеленого чая смешивают с 150 мг микрокристаллической целлюлозы (Avicel PH 101), 99 мг двухосновного фосфата кальция (Encompress A), 9 мг коллоидной двуокиси кремния (Aerosil 200), 36 мг сшитой натрийкарбоксиметилцеллюлозы (Ac-Di-Sol) и 6 мг стеарата магния. Порошки перемешивают в течение 10 мин, затем таблетируют с дозировкой 450 мг/таблетку. Полученные таблетки (диаметр: 11 мм) покрывают слоем пленки, содержащим 13,5 мг гидроксипропилметилцелллозы (Methocel E5), 2,7 мг полиэтиленгликоля 6000 (Carbowax 6000), 3,6 мг двуокиси титана и 2,7 мг талька.

Пример VIII. Ампулы, содержащие полифенольные фракции зеленого чая.

10 мг полифенольной фракции зеленого чая смешивают с 200 мг глюкозы и растворяют в воде для инъекционных препаратов q.s. до 5 мл. Этот раствор (рН 4.5) можно затем использовать для приготовления инъекционных ампул, которые готовят по обычным методам.

Пример IX. Полифенольная фракция зеленого чая.

100 мл содержат, г:
Полифенольная фракция зеленого чая - 0,05
Фруктоза - 5,00
Натрия бензоат - 0,15
Калия сорбат - 0,25
Лимонная кислота - 0,20
Аскорбиновая кислота - 0,25
Апельсиновая вкусовая добавка - 0,05
Очищенная вода - До 100 мл
Пример X. Полифенольная фракция зеленого чая.

Каждое саше в 3 г содержит, мг:
Полифенольная фракция зеленого чая - 100,0
Порошкообразный ксилит (ROQUETTE) - 1000,0
Маннит (Mannitol MG-ROQUETTE) - 1762,5
Аскорбиновая кислота - 70,0
Моноаммонийглицилрицината (Glycamil-Indena) - 20,0
Аспартам (NUTRA SWEET) - 20,0
Лимонная кислота безводная - 10,0
Апельсиновая пудра, вкусовая добавка - 10,0
Малиновая пудра, вкусовая добавка - 5, 0
Неогесперидин (Neohesperidine DC-EXQUIM) - 2,5
Источники
1. Zhao В. et al.. Cell Biophys, 14, 175, 1989.

2. Huang M.T. et al., Carcinogenesis 13, 947, 1992.

3. Conney A.H. et al., Prev. Med. 21, 361, 1992.

4. Mukhtar H. et. al., J. Invest. Dermatol. 102, 3, 1994.

5. Kono S. et al. Jpn.J. Cancer Res. 79, 1067, 1988.

6. Oguni I. et al., Agric. Biol. Chem. 52, 1879, 1988.

7. Kato I. et al., Jpn. J. Cancer Res. 81, 1101, 1990.

8. Kono S. et al., Prev. Med. 21, 526, 1992.

9. Maffei-Facino R. et al., Arzneim-Forsch. /Drug Res. 44, 592, 1994
10. Liviero L. Et al., Fitoterapia LXV, 203, 1994.

11. Dujon В., in "Mitochondrial genetics and functions", Straton J. N. Et al. , (Eds. ), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1981.

12. De Flora S. et al.. Mutation Res. 214, 153, 1989.

Claims

1. Способ экстракции полифенольных фракций Camellia sinensis, содержащих не более чем 0,2% по весу кофеина, включающий в себя
а) экстракцию растительной биомассы водно-спиртовыми или водно-кетоновыми смесями;
б) полное или частичное упаривание растворителя экстракции из экстракта, полученного на стадии (а);
в) суспендирование остатка, полученного на стадии (б), в водной смеси 30-60% по объему метанола;
г) экстракцию полученной на предыдущей стадии гидрометанольной суспензии хлорированными растворителями;
д) фильтрацию образовавшихся нерастворимых остатков и концентрирование гидрометанольной фазы.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что дополнительно включает в себя, в случае необходимости, либо стадию (е) подкисления органическими кислотами и/или стадию (з) добавления ароматического или алифатического углеводорода с последующим промыванием разбавленными водными растворами минеральных кислот, либо альтернативно стадию (к) обработки сульфоновыми смолами в сухих алифатических кетонах или спиртах.

3. Способ по п. 2, отличающийся тем, что дополнительно включает в себя стадию (ж) экстракции концентрированной гидрометанольной фазы и, в случае необходимости, подкисление растворителями, выбранными из алифатических сложных эфиров, спиртов или кетонов при условии, что они смешиваются с гидрометанольной смесью.

4. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что дополнительно включает в себя стадию (и) концентрирования несмешивающейся водно-органической фазы и ее разбавления хлорированными растворителями.

5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что на стадии (а) используют 40-90% по объему водный ацетон.

6. Способ по п. 5, отличающийся тем, что используют 70% по объему водный ацетон.

7. Способ по любому из пп. 1-6, отличающийся тем, что на стадии (в) используют 50% по объему водный метанол.

8. Способ по любому из пп. 1-7, отличающийся тем, что на стадии (г) используют хлористый метилен.

9. Способ по любому из пп. 2-8, отличающийся тем, что на стадии (е) используют лимонную кислоту в присутствии цитрата аммония.

10. Способ пo любому из пп. 3-9, отличающийся тем, что на стадии (ж) растворители выбирают из этилацетата, этилформиата, метилэтилкетона, 1-бутанола, трет-бутанола, 2-бутанола.

11. Способ по п. 10, отличающийся тем, что используют растворитель, представляющий собой этилацетат.

12. Способ по любому из пп. 2-11, отличающийся тем, что на стадии (з) используют толуол в количестве 5% по объему от общего объема органической фазы и 1% по объему водной серной кислоты.

13. Способ по любому из пп. 4-12, отличающийся тем, что на стадии (и) используют хлористый метилен.

14. Полифенольные фракции Camellia sinensis, содержащие не более 0,2% кофеина, получаемые способом по пп. 1-13.

15. Полифенольные фракции зеленого чая, содержащие 50-65% эпигаллокатехин-3-О-галлата, 13-20% эпикатехин-3-О-галлата, 2-4% эпикатехина и 1,5-3% эпигаллокатехина и не более чем 0,2% кофеина.

16. Фармацевтическая композиция, обладающая антиоксидантной активностью, содержащая эффективное количество полифенольной фракции по п. 14 или 15 в смеси с фармацевтически приемлемым носителем или эксципиентом.

17. Фармацевтическая композиция по п. 16 в виде таблеток, желатиновых капсул, саше, сиропов, ампул.

18. Косметическая композиция, содержащая эффективное количество полифенольных фракций по п. 14 или 15 в смеси с приемлемыми носителями или эксципиентами.

19. Диетическая композиция, содержащая эффективное количество полифенольных фракций по п. 14 или 15 в смеси с приемлемыми носителями или эксципиентами.

20. Полифенольные фракции по любому из п. 14 или 15, обладающие дифференциальной цитотоксической и антиокислительной активностью.

21. Полифенольные фракции по любому из п. 14 или 15, используемые для получения лекарственных средств для лечения опухолевых форм, хронико-дегенеративных состояний сердечно-сосудистой системы, артрозных состояний, атеросклероза.