RU2163022C1 - Method of diagnosing tuberculosis - Google Patents
Method of diagnosing tuberculosis Download PDFInfo
- Publication number
- RU2163022C1 RU2163022C1 RU99110682A RU99110682A RU2163022C1 RU 2163022 C1 RU2163022 C1 RU 2163022C1 RU 99110682 A RU99110682 A RU 99110682A RU 99110682 A RU99110682 A RU 99110682A RU 2163022 C1 RU2163022 C1 RU 2163022C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- tuberculosis
- amplification
- dna
- stage
- primers
- Prior art date
Links
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 title claims abstract description 19
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 16
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 26
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 26
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims abstract description 12
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 claims abstract description 7
- 238000000137 annealing Methods 0.000 claims description 11
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims description 9
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 6
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 claims description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 5
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 claims description 5
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 13
- 241000187479 Mycobacterium tuberculosis Species 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000186366 Mycobacterium bovis Species 0.000 description 5
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 5
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 3
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 3
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 3
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 2
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001302239 Mycobacterium tuberculosis complex Species 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 2
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OSBLTNPMIGYQGY-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid;boric acid Chemical compound OB(O)O.OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O OSBLTNPMIGYQGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000588779 Bordetella bronchiseptica Species 0.000 description 1
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical class ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 102100021587 Embryonic testis differentiation protein homolog A Human genes 0.000 description 1
- 241000193789 Gemella Species 0.000 description 1
- 101000898120 Homo sapiens Embryonic testis differentiation protein homolog A Proteins 0.000 description 1
- 241000588915 Klebsiella aerogenes Species 0.000 description 1
- 241000588747 Klebsiella pneumoniae Species 0.000 description 1
- PWKSKIMOESPYIA-BYPYZUCNSA-N L-N-acetyl-Cysteine Chemical compound CC(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O PWKSKIMOESPYIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 241000192041 Micrococcus Species 0.000 description 1
- 241000588621 Moraxella Species 0.000 description 1
- 241000186367 Mycobacterium avium Species 0.000 description 1
- 241001467552 Mycobacterium bovis BCG Species 0.000 description 1
- 241000186365 Mycobacterium fortuitum Species 0.000 description 1
- 241000187484 Mycobacterium gordonae Species 0.000 description 1
- 241001478320 Neisseria flava Species 0.000 description 1
- 241001464937 Neisseria perflava Species 0.000 description 1
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 description 1
- 241000589776 Pseudomonas putida Species 0.000 description 1
- 241000607715 Serratia marcescens Species 0.000 description 1
- 241000193998 Streptococcus pneumoniae Species 0.000 description 1
- 241000193996 Streptococcus pyogenes Species 0.000 description 1
- 239000008051 TBE buffer Substances 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004308 acetylcysteine Drugs 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000012568 clinical material Substances 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940092559 enterobacter aerogenes Drugs 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 210000000416 exudates and transudate Anatomy 0.000 description 1
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 1
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 235000012054 meals Nutrition 0.000 description 1
- 239000013028 medium composition Substances 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 239000003973 paint Substances 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 208000008128 pulmonary tuberculosis Diseases 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 229940031000 streptococcus pneumoniae Drugs 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Предлагаемое изобретение относится к области медицины, в частности к диагностике туберкулеза. The present invention relates to medicine, in particular to the diagnosis of tuberculosis.
Туберкулез в данное время является одним из основных инфекционных заболеваний человека. В течение последних лет отмечается рост заболевания и смертности от туберкулеза во всем мире. Tuberculosis is currently one of the main human infectious diseases. In recent years, there has been an increase in disease and mortality from tuberculosis worldwide.
Эпидемиологическая ситуация осложняется еще и тем, что в последнее время отмечается резкое увеличение частоты выявления микобактерий туберкулезного комплекса (МТБ), устойчивых к антибиотикам. В этих условиях для осуществления эффективного контроля над туберкулезной инфекцией возникает потребность в быстрых, чувствительных и специфических методах индикации возбудителя. The epidemiological situation is complicated by the fact that recently there has been a sharp increase in the frequency of detection of Mycobacterium tuberculosis complex (MTB), which are resistant to antibiotics. In these conditions, for the effective control of tuberculosis infection, there is a need for quick, sensitive and specific methods of indicating the pathogen.
Одним из общепринятых методов выявления возбудителя считается бактериоскопический, когда окраска по Циль-Нильсену позволяет выявить 10000 кл/мл. Более результативной является люминесцентная микроскопия, позволяющая выявить кислотно-устойчивые микобактерии в концентрации на порядок меньше бактериоскопического метода. Традиционная микробиологическая диагностика туберкулеза с помощью посева на твердые среды дает визуальный результат через 6-10 недель при наличии в посадочном материале не менее 100 жизнеспособных клеток. Автоматизированная система для выделения микобактерий на жидких средах дает возможность получить результаты, начиная с 4-го дня после поступления диагностического материала, в 81% случаев. Автоматизированные системы BACTEC MGIT (Becton Dickenson) и MB/BacT (Organon Teknika) импортного производства и дорогостоящие. One of the generally accepted methods for identifying the causative agent is considered to be bacterioscopic, when the Ziehl-Nielsen stain can detect 10,000 cells / ml. More effective is luminescent microscopy, which allows to identify acid-resistant mycobacteria in a concentration an order of magnitude smaller than the bacterioscopic method. The traditional microbiological diagnosis of tuberculosis by plating on solid media gives a visual result after 6-10 weeks if there are at least 100 viable cells in the planting material. An automated system for isolating mycobacteria on liquid media makes it possible to obtain results starting from the 4th day after receipt of diagnostic material in 81% of cases. Automated systems BACTEC MGIT (Becton Dickenson) and MB / BacT (Organon Teknika) are imported and expensive.
В последние годы в практику фтизиомикробиологических лабораторий все больше внедряются молекулярно-биологические методы исследования (2), в частноcти полимеразная цепная реакция (ПЦР), которая существенно снижает время детекции возбудителя и существенно повышает чувствительность анализа. Этот метод приобрел достаточно широкое распространение в диагностике инфекционных заболеваний. In recent years, molecular biological research methods (2), in particular, polymerase chain reaction (PCR), which significantly reduces the detection time of the pathogen and significantly increases the sensitivity of the analysis, have been increasingly introduced into the practice of phthiomicrobiological laboratories. This method has become quite widespread in the diagnosis of infectious diseases.
В основе этого метода лежит многократная репликация (амплификация) cпецифического участка ДНК, осуществляемая термостабильной ДНК полимеразой в присутствии соответствующего буфера, дезоксинуклеотидтрифосфатов и олигонуклеотидных затравок-праймеров, которые определяют границы амплифицируемого участка и представляют собой олигонуклеотиды (6). Полимеразная цепная реакция состоит из трех стадий (денатурация, отжиг, синтез), каждая из которых происходит при определенных температурных режимах. На стадии денатурации, протекающей при 94-95oC, происходит разделение цепей ДНК мишени. На стадии отжига, которую, как правило, проводят при 50-60oC, происходит присоединение праймеров к комплиментарным участкам денатурированной ДНК мишени, обеспечивая таким образом затравку репликации ДНК. На стадии синтеза (при 72oС) происходит синтез новых цепей ДНК путем ферментативного достраивания праймеров, связывающихся с ДНК матрицей. Циклическое воспроизведение этого процесса позволяет за 25-40 циклов наработать фрагмент ДНК мишени в количестве, достаточном для его обнаружения с помощью электрофореза. Однако в известной реакции из-за ряда факторов, связанных с особенностями анализируемого клинического материала, могут влиять на результаты определения. В этой связи стандартная техника постановки - одностадийной ПЦР не всегда обеспечивает чувствительность и надежность, необходимую при клинической диагностике. Кроме того, интерпретация результатов после одностадийной амплификации требует определенной подготовки сотрудника, поэтому применяют нестед-ПЦР (H-ПЦР) - полимеразную цепную реакцию с проведением амплификации в два этапа с использованием внешних и внутренних праймеров.This method is based on multiple replication (amplification) of a specific DNA region carried out by thermostable DNA polymerase in the presence of a suitable buffer, deoxynucleotide triphosphates and oligonucleotide primer seeds that define the boundaries of the amplified region and are oligonucleotides (6). The polymerase chain reaction consists of three stages (denaturation, annealing, synthesis), each of which occurs under certain temperature conditions. At the stage of denaturation, proceeding at 94-95 o C, there is a separation of the DNA chains of the target. At the annealing stage, which, as a rule, is carried out at 50-60 ° C, the primers are attached to complementary regions of the denatured target DNA, thus providing a seed for DNA replication. At the synthesis stage (at 72 ° C), new DNA strands are synthesized by enzymatic completion of the primers that bind to the DNA template. Cyclic reproduction of this process allows for 25-40 cycles to produce a fragment of the target DNA in an amount sufficient to detect it using electrophoresis. However, in a known reaction, due to a number of factors related to the characteristics of the analyzed clinical material, they can influence the results of the determination. In this regard, the standard formulation technique - single-stage PCR does not always provide the sensitivity and reliability required in clinical diagnosis. In addition, the interpretation of the results after a one-step amplification requires a certain preparation of the employee; therefore, non-PCR (H-PCR) is used - polymerase chain reaction with amplification in two stages using external and internal primers.
В известной реакции для выявления возбудителя подбираются определенные праймеры и отрабатываются условия амплификации для каждого из этапов. Предложенный способ отличается тем, что ДНК выделяют в TE-буфере с 1% тритоном, амплификацию проводят с использованием внутренних праймеров, представляющих собой: 5' cgt gag ggc atc gag gtg gc 3' и 5'gcg tag gcg tcg tgt aca aa 3' и внешних праймеров, представляющих собой: 5'ggt ttg cgg tgg ggt gtc g 3' и 5' gtt gga tgc ctg cct cgg 3' с использованием температуры отжига для первого цикла 60oС, 20 циклов и температуры отжига для второго этапа 72oС, 25 циклов в ТРИС-HCl буфера, с KCl, формамидом и твином и продукты амплификации разделяют электрофорезом с выявлением под ультрафиолетовой лампой ярко-оранжевой полоски ДНК образца на уровне ярко-оранжевой полоски - ДНК Mycobacterium tuberculosis и Mycobacterium bovis.In the known reaction, certain primers are selected to identify the pathogen and amplification conditions for each of the stages are worked out. The proposed method is characterized in that the DNA is isolated in a TE buffer with 1% Triton, amplification is carried out using internal primers, which are: 5 'cgt gag ggc atc gag gtg gc 3' and 5'gcg tag gcg tcg tgt aca aa 3 ' and external primers, which are: 5'ggt ttg cgg tgg ggt gtc g 3 'and 5' gtt gga tgc ctg cct cgg 3 'using the annealing temperature for the first cycle of 60 o C, 20 cycles and the annealing temperature for the
Используемые в настоящей работе внешние праймеры исключают недостатки одноэтапной полимеразной цепной реакции. Одновременно, во избежание ложноположительных результатов, в связи с возможным присутствием в клинических пробах возбудителей других инфекций была проанализирована комплементарность праймеров к геномным последовательностям следующих микроорганизмов: Pseudomonas aeruqinosa, Staphylococcus aureus, Steptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes. Кроме того, была выяснена возможность неспецифического связывания праймеров с геномом Mycobacterium tuberculosis в целом. В предложенном способе диагностики туберкулеза Mycobacterium tuberculosis и Mycobacterium bovis отработку условий амплификации проводят на музейных штаммах микобактерий и включает в себя: отработку времени денатурации при 95o 30 секунд - 1 минута, температуру отжига праймеров 60o, 63o, 66o, 69o, 72oC, концентрацию ионов Mg++ от 0,8 до 2,5 мМ, время циклов каждой стадии амплификации от 1 минуты до 30 секунд и, наконец, количество циклов для каждой стадии от 20 до 35. Критерием правильности выбранного режима для каждого этапа проводимой реакции служит показательность результата - наличие или отсутствие фрагмента ДНК определенного размера на электрофореграмме. После подбора условий амплификации с внутренними праймерами для тех же составляющих реакции подбирают условия для работы с внешними праймерами. То есть для этого последовательно снижают температуру отжига праймеров для первого этапа амплификации (с первыми праймерами с 69oC до 60oC) и затем также последовательно повышали температуру отжига для второго этапа амплификации (для второй пары праймеров от 69o до 72oC). Понизить неспецифичность реакции удалось уменьшением количества циклов до 25 на втором этапе реакции.The external primers used in this work eliminate the disadvantages of a one-stage polymerase chain reaction. At the same time, in order to avoid false positive results, due to the possible presence of other infections in the clinical samples, the complementarity of the primers to the genomic sequences of the following microorganisms was analyzed: Pseudomonas aeruqinosa, Staphylococcus aureus, Steptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes. In addition, the possibility of nonspecific binding of primers to the genome of Mycobacterium tuberculosis as a whole was clarified. In the proposed method for the diagnosis of tuberculosis Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium bovis, the amplification conditions are tested on museum strains of mycobacteria and includes: working out the denaturation time at 95 o 30 seconds - 1 minute, the annealing temperature of the primers is 60 o , 63 o , 66 o , 69 o , 72 o C, the concentration of Mg ++ ions from 0.8 to 2.5 mm, the cycle time of each stage of amplification from 1 minute to 30 seconds and, finally, the number of cycles for each stage from 20 to 35. The criterion for the correctness of the selected mode for each the stage of the reaction is indicative - presence or absence of a DNA fragment of a specific size in the electrophoregram. After selecting amplification conditions with internal primers for the same reaction components, conditions for working with external primers are selected. That is, for this, the annealing temperature of the primers for the first amplification step is successively reduced (with the first primers from 69 ° C to 60 ° C) and then the annealing temperature for the second amplification step is also subsequently increased (for the second pair of primers from 69 ° to 72 ° C) . The nonspecificity of the reaction was reduced by reducing the number of cycles to 25 in the second stage of the reaction.
Отработанные режимы амплификации представляли из себя следующее (см. табл.1). The amplification modes worked out were the following (see Table 1).
В дальнейшем выявление микобактерий туберкулезного комплекса (2 этапа амплификации) мы проводили согласно предлагаемым режимам, результаты см. в табл.2. In the future, the identification of mycobacteria of the tuberculosis complex (2 stages of amplification) was carried out according to the proposed regimes, the results are shown in Table 2.
Важным этапом в ПЦР-диагностике является подготовка образца. В качестве исходного материала для диагностики туберкулеза используют: мокроту, смывы, бронхоальвеолярный лаваж (БАЛ), эксудат, спинно-мозговую жидкость (ликвор), кровь, плазму крови, мочу, биоптаты, кал применяют реже. Для каждого типа биологических образцов есть своя специфика обработки. Для мокроты, смыва, БАЛ первый этап включает обработку мокроты 0,5% ацетилцистеином с 20% NaOH. Следующий этап - этап выделения ДНК. Сущность способа выделения ДНК состоит в следующем. Осадок отмывают в TE-буфере и прогревают 10 мин в том же буфере с 1% тритоном при 95oС. Таким образом, способ диагностики туберкулеза Mycobacterium tuberculosis и Mycobacterium bovis, включающий применение полимеразной цепной реакции (H-ПЦР) с проведением амплификации в два этапа с использованием внешних и внутренних праймеров, отличающийся тем, что ДНК выделяют в TE-буфере с 1% тритоном, амплификацию проводят с использованием внешних праймеров, представляющих собой: 5' ggt ttg cgg tgg ggt gtc g 3' и 5' gtt gga tgc ctg cct cgg 3', с использованием температуры отжига для первого этапа 60oС, 20 циклов и температуры отжига для второго этапа 72oС, 25 циклов в ТРИС-HCl буфере, с KCl, формамидом и твином и продукты амплификации разделяют электрофорезом с выявлением под ультрафиолетовой лампой ярко-оранжевой полоски - ДНК образца на уровне ярко-оранжевой полоски - ДНК Mycobacterium tuberculosis и Mycobacterium bovis.An important step in PCR diagnostics is sample preparation. The following materials are used as the starting material for the diagnosis of tuberculosis: sputum, swabs, bronchoalveolar lavage (BAL), exudate, cerebrospinal fluid (cerebrospinal fluid), blood, blood plasma, urine, biopsy specimens, and feces are used less frequently. Each type of biological sample has its own processing specificity. For sputum, flushing, BAL, the first stage involves the treatment of sputum with 0.5% acetylcysteine with 20% NaOH. The next step is the DNA extraction step. The essence of the method of DNA extraction is as follows. The precipitate is washed in TE-buffer and heated for 10 min in the same buffer with 1% Triton at 95 o C. Thus, a method for the diagnosis of tuberculosis Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium bovis, including the use of polymerase chain reaction (H-PCR) with amplification in two stage using external and internal primers, characterized in that the DNA is isolated in TE-buffer with 1% Triton, amplification is carried out using external primers, which are: 5 'ggt ttg cgg tgg ggt gtc g 3' and 5 'gtt gga tgc ctg cct cgg 3 ', using the annealing temperature for the first stage of 60 o C, 20 cycle s and annealing temperatures for the second stage of 72 ° C, 25 cycles in TRIS-HCl buffer, with KCl, formamide and tween, and the amplification products are separated by electrophoresis with a bright orange strip being detected under an ultraviolet lamp - sample DNA at the level of a bright orange strip - DNA Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium bovis.
Проверку специфичности проводили на музейных штаммах. Для этого использовали микобактерии: M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis BCG, M. fortuitum, M. kansassi, terrae, M. mycroti, M. avium, M. gordonae. Кроме того, специфичность H-ПЦР оценивалась по выявлению следующих бактерий и вирусов, многие из которых являются частью нормальной или патогенной флоры дыхательных путей: Bacillus subtilis, Gemella haemolijsans, Streptococcus pneumoniae, Neisseria flava, Moraxella locunata, Klebsiella pneumoniae, Nesseria meningitias. Neisseria perflava, Branhamella cotarrhalis, Serratia marcescens, Enterobacter aerogenes, Micrococcus leuteus, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida, Staphylococcus aureus, Bordetella bronchiseptica, Staphylococcus epidermidis, Haemophilus influenzae, Proteus vulgaris., Bordetella parapertussis, Chlamidia pneumoniae и др. Все изоляты исследовались в пределах 100 кл/в образце. Ни один из изолятов не показал реактивности в H-ПЦР. The specificity test was carried out on museum strains. Mycobacteria were used for this: M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis BCG, M. fortuitum, M. kansassi, terrae, M. mycroti, M. avium, M. gordonae. In addition, the specificity of H-PCR was evaluated by identifying the following bacteria and viruses, many of which are part of the normal or pathogenic flora of the respiratory tract: Bacillus subtilis, Gemella haemolijsans, Streptococcus pneumoniae, Neisseria flava, Moraxella locunata, Klebsiella pneumoniae, Nesseria meningitias. Neisseria perflava, Branhamella cotarrhalis, Serratia marcescens, Enterobacter aerogenes, Micrococcus leuteus, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida, Staphylococcus aureus, Bordetella bronchiseptica, isolatella bromidellidae, hemophilium strain 100 cells / sample None of the isolates showed reactivity in H-PCR.
В качестве примера своевременного выявления микобактерии приводим выписку из карты больного Матвиенко В.М.; 1945 года рождения, поступил в МНПЦ борьбы с туберкулезом в мае 1999 г. Предположительный диагноз: пневмония/туберкулез легких?
У больного из вены берут три мл крови (с 3,5% цитратом натрия), отбирают плазму и центрифугируют при 10000 об/мин, 10 мин осадок промывают TE буфером, pH 6,8 (уже готовый, хранится в холодильнике). Затем к осадку добавляют лизирующий буфер 1 мМ Трис HCl, 1 мМ ЭДТА, 1% тритон pH 8,0 (готовый, хранится в холодильнике) и прогревают при 95oC 15 мин. Затем отбирают из пробирки 3 мкл образца и добавляют в амплификационную среду собранную за время центрифугирования образца. (Состав амплификационной среды: 10 мМ Трис HCl, pH 8,8, 50 мМ KCl, 5% формамид, 0,5% твин 20, 2,5 мМ MgCl2, 200 мкм праймеров, 1-2U Taq полимеразы и 4 мкл образца. В первую пробирку добавляют 4 мкл образца от больного, а в другую вместо образца взят тот же объем дистиллированной воды. Затем образцы ставят в амплификатор, где включена нужная программа (95oС - 4 мин, 60oС - 1 мин, 72oС - 1 мин - это один цикл, 95oС - 40 с, 60oС - 1 мин - это 20 циклов и 72oС - 10 мин. Через 1 час 20 мин образцы вынимают из амплификатора, отбирают из пробирок по 4 мкл и добавляют в новые пробирки с инкубационной средой (состав амплификационной среды тот же) как исследуемый образец, так и контрольный, и ставят в амплификатор с заданной программой для второго этапа амплификации (95o - 4 мин, 72o - 1 мин, один цикл, 95o - 40 с, 72o - 1 мин - это 25 циклов, 72o - 10 мин - это один цикл. В это время расплавляют 1,5% агазору, приготовленную на ТБЕ буфере (0,045 М Трис HCl, 0,045 М борная кислота, 1 мМ ЭДТА с бромистым этидиумом (1 мг/мл) и заливают ее в электрофорезную камеру. После того как прошла 2-ая стадия амплификации (1 час 30 мин) в образцы добавляют 3 мкл краски (0,25% бромфеноловый синий, 40% глицерин, 0,5 М ЭТДА) и 30 мкл насыщенного хлороформа, встряхивают и 10 мкл каждого образца помещают в кармашки уже застывшего геля. Затем включают ток (напряжение должно составлять 25 Вт/см2). Через 25 мин гель вынимают из камеры и помещают под УФ-лампу. Если у больного есть возбудитель (Mycobacterium tuberculosis), то под УФ мы видим в определенном месте ярко-оранжевую полоску, контрольный образец (когда вместо образца была внесена вода) светиться не должен. Таким образом, через 5 часов у больного выявлена туберкулезная палочка и был поставлен диагноз - туберкулез.As an example of the timely detection of mycobacteria, we provide an extract from the patient’s card V. Matvienko; Born in 1945, he was admitted to the ISTC for the fight against tuberculosis in May 1999. Estimated diagnosis: pneumonia / pulmonary tuberculosis?
Three ml of blood are taken from a patient from a vein (with 3.5% sodium citrate), plasma is taken and centrifuged at 10,000 rpm, the precipitate is washed with TE buffer for 10 min, pH 6.8 (already ready, stored in the refrigerator). Then,
Для характеристики чувствительности предлагаемой тест-системы было проведено сравнение выявляемости микобактрий туберкулезного комплекса H-ПЦР и ПЦР на Cobas Amplicor (фирма La Roche, Швейцария). Результаты представлены в табл.2. To characterize the sensitivity of the proposed test system, a comparison was made of the detection of mycobacteria of the tuberculosis complex H-PCR and PCR using Cobas Amplicor (La Roche, Switzerland). The results are presented in table.2.
Полученные результаты говорят о том, что предлагаемый способ диагностики туберкулеза прост в исполнении, дешевле импортных тест-систем и отличается повышенной чувствительностью. The results obtained indicate that the proposed method for the diagnosis of tuberculosis is simple to implement, cheaper than imported test systems and is characterized by increased sensitivity.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU99110682A RU2163022C1 (en) | 1999-05-28 | 1999-05-28 | Method of diagnosing tuberculosis |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU99110682A RU2163022C1 (en) | 1999-05-28 | 1999-05-28 | Method of diagnosing tuberculosis |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2163022C1 true RU2163022C1 (en) | 2001-02-10 |
| RU99110682A RU99110682A (en) | 2001-04-20 |
Family
ID=20220158
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU99110682A RU2163022C1 (en) | 1999-05-28 | 1999-05-28 | Method of diagnosing tuberculosis |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2163022C1 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2231790C2 (en) * | 2002-09-23 | 2004-06-27 | Московский городской научно-практический центр борьбы с туберкулезом | Method for treatment of whole blood for isolating tuberculosis mycobacterium dna by polymerase chain reaction |
| RU2439080C2 (en) * | 2005-12-23 | 2012-01-10 | Рэпид Байосенсор Системз Лимитед | Bioanalysis and peptides used in said bioanalysis |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2000331C1 (en) * | 1991-06-04 | 1993-09-07 | Валентина Ивановна Шилова | Method for distinguishing of various species of tuberculous mycobacteria |
| RU2042134C1 (en) * | 1992-10-15 | 1995-08-20 | Научно-исследовательский ветеринарный институт Нечерноземной зоны РФ | Method for identifying mycobacteria m. tuberculosis and m. bovis |
| RU2110070C1 (en) * | 1994-10-06 | 1998-04-27 | Морозова Татьяна Ивановна | Method for differentiating diagnoses of pulmonary tuberculosis and pneumonia |
-
1999
- 1999-05-28 RU RU99110682A patent/RU2163022C1/en active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2000331C1 (en) * | 1991-06-04 | 1993-09-07 | Валентина Ивановна Шилова | Method for distinguishing of various species of tuberculous mycobacteria |
| RU2042134C1 (en) * | 1992-10-15 | 1995-08-20 | Научно-исследовательский ветеринарный институт Нечерноземной зоны РФ | Method for identifying mycobacteria m. tuberculosis and m. bovis |
| RU2110070C1 (en) * | 1994-10-06 | 1998-04-27 | Морозова Татьяна Ивановна | Method for differentiating diagnoses of pulmonary tuberculosis and pneumonia |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Дэвис К.Е. Анализ генома. Методы. - М.: Мир, 1190, с.176-190. * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2231790C2 (en) * | 2002-09-23 | 2004-06-27 | Московский городской научно-практический центр борьбы с туберкулезом | Method for treatment of whole blood for isolating tuberculosis mycobacterium dna by polymerase chain reaction |
| RU2439080C2 (en) * | 2005-12-23 | 2012-01-10 | Рэпид Байосенсор Системз Лимитед | Bioanalysis and peptides used in said bioanalysis |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2814422B2 (en) | Mycobacteria detection by multiple nucleic acid amplification | |
| CN110541022B (en) | Mycobacterium tuberculosis complex detection kit based on CRISPR-Cas12a system | |
| Cousins et al. | Use of polymerase chain reaction for rapid diagnosis of tuberculosis | |
| US11932911B2 (en) | Compositions and methods for the detection and analysis of Mycobacterium tuberculosis | |
| EP0421725B1 (en) | Nucleic acid probes for the detection of Lyme disease spirochetes | |
| Modi et al. | Multitargeted loop-mediated isothermal amplification for rapid diagnosis of tuberculous meningitis | |
| JP2006505275A (en) | One-step real-time RT-PCR kit for universal detection of microorganisms in industrial products | |
| JP4377378B2 (en) | Quantitative testing of bacterial pathogens | |
| WO2014003583A2 (en) | Detection of pathogens | |
| WO2019067252A1 (en) | Assays for detecting multiple tick-borne pathogens | |
| EP2947158A1 (en) | Diagnostic method | |
| WO2009061752A1 (en) | Methods for detecting toxigenic microbes | |
| RU2163022C1 (en) | Method of diagnosing tuberculosis | |
| De Felice et al. | Latest trends in biosensors powered by nucleic acid isothermal amplification for the diagnosis of joint infections: From sampling to identification towards the point-of-care | |
| Kahla et al. | Evaluation of a simplified IS6110 PCR for the rapid diagnosis of Mycobacterium tuberculosis in an area with high tuberculosis incidence | |
| KR101425149B1 (en) | Improved method for diagnosing Mycobacterium tuberculosis using one-tube nested real-time PCR | |
| US20070072188A1 (en) | Methods for detection of mycobacterium tuberculosis | |
| Jonas et al. | Detection of Mycobacterium tuberculosis by molecular methods | |
| RU2819101C1 (en) | Method of detecting cold shock gene csh1 in strains of vibrio cholerae o1 and neo1/neo139 by loop isothermal amplification (lamp) | |
| US20150057172A1 (en) | Real-time pcr detection of mycobacterium tuberculosis complex | |
| Abdel-Salam | Direct PCR assay for detection of Neisseria meningitidis in human cerebrospinal fluid | |
| RU2820141C1 (en) | Method of identifying and determining pathogenicity of vibrio cholerae strains by loop-mediated isothermal amplification (lamp) | |
| Lisdawati et al. | Evaluating the use of loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method for detection of Mycobacterium tuberculosis in Indonesian clinical isolates | |
| Enas et al. | Multiplex PCR test for the rapid detection of Mycobacterium tuberculosis in Pulmonary tuberculosis patients | |
| JPH0686699A (en) | Primer set for amplifying gene of microorganism |