RU2161199C1 - Рекомбинантная плазмидная днк pyai 960, предназначенная для маркирования 18-й хромосомы человека - Google Patents
Рекомбинантная плазмидная днк pyai 960, предназначенная для маркирования 18-й хромосомы человека Download PDFInfo
- Publication number
- RU2161199C1 RU2161199C1 RU2000107200A RU2000107200A RU2161199C1 RU 2161199 C1 RU2161199 C1 RU 2161199C1 RU 2000107200 A RU2000107200 A RU 2000107200A RU 2000107200 A RU2000107200 A RU 2000107200A RU 2161199 C1 RU2161199 C1 RU 2161199C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- dna
- chromosome
- human
- chromosomes
- pyai
- Prior art date
Links
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 title claims abstract description 77
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 title claims abstract description 22
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 16
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 11
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 11
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 claims abstract description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims abstract description 6
- 210000002230 centromere Anatomy 0.000 claims abstract description 5
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 4
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 17
- 230000016507 interphase Effects 0.000 abstract description 14
- 230000031864 metaphase Effects 0.000 abstract description 14
- 230000002559 cytogenic effect Effects 0.000 abstract description 10
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 abstract description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 6
- 239000003550 marker Substances 0.000 abstract description 5
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 abstract description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 abstract description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 abstract description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract description 2
- 238000003793 prenatal diagnosis Methods 0.000 abstract description 2
- 230000007170 pathology Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 51
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 30
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 25
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 23
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 18
- 210000003917 human chromosome Anatomy 0.000 description 18
- 238000000034 method Methods 0.000 description 18
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 12
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 11
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 10
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 9
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 9
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 8
- 239000003147 molecular marker Substances 0.000 description 8
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 8
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 7
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 6
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 5
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 5
- 230000000155 isotopic effect Effects 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- IAKHMKGGTNLKSZ-INIZCTEOSA-N (S)-colchicine Chemical compound C1([C@@H](NC(C)=O)CC2)=CC(=O)C(OC)=CC=C1C1=C2C=C(OC)C(OC)=C1OC IAKHMKGGTNLKSZ-INIZCTEOSA-N 0.000 description 4
- 208000031404 Chromosome Aberrations Diseases 0.000 description 4
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 3
- 108050009160 DNA polymerase 1 Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 3
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 3
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 3
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 3
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 3
- 241000576133 Alphasatellites Species 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 2
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 2
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 108010047620 Phytohemagglutinins Proteins 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 108020004487 Satellite DNA Proteins 0.000 description 2
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- 210000001766 X chromosome Anatomy 0.000 description 2
- XIWMTQIUUWJNRP-UHFFFAOYSA-N amidol Chemical compound NC1=CC=C(O)C(N)=C1 XIWMTQIUUWJNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000036878 aneuploidy Diseases 0.000 description 2
- 231100001075 aneuploidy Toxicity 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 2
- 231100000005 chromosome aberration Toxicity 0.000 description 2
- 230000014107 chromosome localization Effects 0.000 description 2
- 229960001338 colchicine Drugs 0.000 description 2
- 238000009223 counseling Methods 0.000 description 2
- 230000002380 cytological effect Effects 0.000 description 2
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 2
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 239000000834 fixative Substances 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 239000000815 hypotonic solution Substances 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 2
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 2
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 230000001885 phytohemagglutinin Effects 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 2
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- IACFXVUNKCXYJM-AKSHDPDZSA-N 2-(chloromethyl)oxirane (2R,3R,4S,5S,6R)-2-[(2S,3S,4S,5R)-3,4-dihydroxy-2,5-bis(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]oxy-6-(hydroxymethyl)oxane-3,4,5-triol Chemical compound ClCC1CO1.O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 IACFXVUNKCXYJM-AKSHDPDZSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 1
- 206010008805 Chromosomal abnormalities Diseases 0.000 description 1
- 230000007064 DNA hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241001131785 Escherichia coli HB101 Species 0.000 description 1
- 108010034791 Heterochromatin Proteins 0.000 description 1
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 1
- 208000036626 Mental retardation Diseases 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- RZCIEJXAILMSQK-JXOAFFINSA-N TTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 RZCIEJXAILMSQK-JXOAFFINSA-N 0.000 description 1
- 208000037280 Trisomy Diseases 0.000 description 1
- 210000002593 Y chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- QKSKPIVNLNLAAV-UHFFFAOYSA-N bis(2-chloroethyl) sulfide Chemical compound ClCCSCCCl QKSKPIVNLNLAAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 1
- 208000004664 chromosome 18p deletion syndrome Diseases 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000003544 deproteinization Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 229960002086 dextran Drugs 0.000 description 1
- 229960000633 dextran sulfate Drugs 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 238000011043 electrofiltration Methods 0.000 description 1
- 238000001652 electrophoretic deposition Methods 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 210000004458 heterochromatin Anatomy 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004754 hybrid cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000000527 lymphocytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000007431 microscopic evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000011278 mitosis Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N phenol group Chemical group C1(=CC=CC=C1)O ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 230000011514 reflex Effects 0.000 description 1
- 238000001226 reprecipitation Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 239000000052 vinegar Substances 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к генетической инженерии и медицинской генетике. Создан новый молекулярно-генетический маркер 18-й хромосомы человека, специфичный для центромерного района, представляющий рекомбинантную плазмидную ДНК pYAI 960. ДНК содержит - PstI - PstI - фрагмент ДНК вектора pUC 19 размером 2700 пар нуклеотидов, - PstI - PstI - фрагмент альфоидной ДНК лимфоцитов человека, высокоспецифичный для центромерного района 18-й хромосомы человека, размером 1400 пар нуклеотидов с двумя внутренними уникальными сайтами рестрикции EcoRI, генетические маркеры: Ampr - ген устойчивости к ампициллину. Изобретение позволяет эффективно идентифицировать хромосомы 18 в интерфазных и метафазных клетках в пренатальной диагностике и клинической цитогенетике, а также уточнять диагноз (определять точки разрыва на аномальных хромосомах) у больных с хромосомной патологией.
Description
Изобретение относится к области генетической инженерии, в частности, к области конструирования молекулярно-генетических маркеров, и может быть использовано в медицинской генетике для достоверной идентификации 18-й хромосомы человека в норме и патологии, включая пренатальную и постнатальную диагностику хромосомных аномалий, анеуплоидий при различных формах рака, а также для цитогенетического картирования генома человека.
Известно, что к настоящему моменту клонированы и охарактеризованы ДНК зонды для различных хромосом человека. Однако в качестве ДНК зондов чаще всего используют уникальные (однокопийные или малокопийные последовательности ДНК), которые не позволяют проводить эффективную молекулярно-цитогенетическую диагностику из-за низкой разрешающей способности современных цитогенетических методов. Исключением являются хромосомоспецифичные ДНК зонды, содержащие повторяющиеся (многокопийные) последовательности ДНК. К ним относятся сателлитные (альфа- и "классические" сателлиты) ДНК, которые представляют собой многократно повторяющиеся от нескольких сотен до несколько тысяч раз относительно короткие (длиной до 170 пар нуклеотидов) фрагменты ДНК, формирующие центромерные районы всех хромосом человека. На их основе созданы и защищены авторскими свидетельствами ДНК зонды альфоидной ДНК со спецификой для хромосом 1, 3, 11, 13, 21 и X человека (Гиндилис и др., 1985, N 1203108; Юров и др., 1989, N 1494724; Юров и др., 1993, N 1792429; Юров и др., 1997, N 2087533; Соловьев и др. , 1997, N 2087534). Остается актуальной задача получения высокоэффективных ДНК зондов для маркирования остальных хромосом человека.
В настоящее время описан ряд клонированных альфа-сателлитных и классических сателлитных ДНК, которые характеризуются спецификой для разных хромосом человека. Эти последовательности можно рассматривать в качестве прототипа предлагаемой в данном изобретении рекомбинантной плазмиды. Однако возможность их использования для маркирования и идентификации хромосом человека остается открытой. В частности, обнаружены варианты альфоидной ДНК человека, которые имеются в хромосоме 18 (С. Van Broeckhoven et al. "Report of the Chromosome 18 Workshop", 1998, Psychiat. Genet., 8, 97- 108; С. Van Broeckhoven et al. "Report of the Chromosome 18 Workshop", 1999, Amer. J. Hum. Genet. , 88, 263-270; Catalog "AneuVision" /for Detection of Trisomy 13,18,21 and Chromosome X and Y Aneusomies/, 1999, Vysis Inc. 3100 Woodcreek Drive, Downers Grove, IL 60515-5400). Эти ДНК зонды не исследованы достаточно подробно с точки зрения их конструирования для маркирования хромосомы 18 человека в прикладных работах. При этом все описанные в литературе рекомбинантные плазмиды, содержащие альфа-сателлитную ДНК человека со спецификой для хромосомы 18, не обладают достаточно высокой специфичностью для центромерных районов данной хромосомы. Поэтому их нельзя использовать для эффективной молекулярно-цитогенетической диагностики в медицинской практике, когда требуется корректная идентификация аномалий хромосом и последующее медико-генетическое консультирование или пренатальная диагностика с возможным прерыванием беременности вследствие аберраций хромосомы 18. Актуальным для молекулярно-цитогенетической диагностики остается конструирование маркеров для центромерного района хромосомы 18 человека, которые позволили бы проводить маркирование и идентификацию центромерного района хромосомы 18 в интерфазных и метафазных клетках.
Изобретение не имеет аналогов, так как подобная рекомбинантная плазмида для высокоспецифичного маркирования центромерного района хромосомы 18 человека разработана впервые. Полученная рекомбинантная плазмида pYAI 960 отличается от известных по литературе клонированных сателлитных ДНК по способу получения, по рестриктной карте и размерам вставки альфоидной ДНК человека, по особенностям хромосомной локализации и по высокой специфичности для хромосомы 18 человека. Предлагаемое техническое решение не имеет общих признаков ни с одним из приведенных выше аналогов, т.к. для молекулярно-цитогенетического маркирования и идентификации центромерного района хромосомы 18 человека данное техническое решение разработано впервые.
Целью изобретения является создание нового эффективного молекулярно-генетического маркера 18-й хромосомы человека, а именно, специфичного для центромерных районов, включая гетерохроматин обоих плеч, который в отличие от описанных в литературе рекомбинантных плазмид обладал следующими преимуществами:
1. Строго маркировал околоцентромерный район хромосомы 18 без перекрестной гибридизации с другими хромосомами;
2. Эффективно маркировал центромерный район хромосомы 18 в интерфазных ядрах для идентификации численных хромосомных аберраций, что необходимо для кариологического анализа неделящихся клеток, например, клеток опухолей.
1. Строго маркировал околоцентромерный район хромосомы 18 без перекрестной гибридизации с другими хромосомами;
2. Эффективно маркировал центромерный район хромосомы 18 в интерфазных ядрах для идентификации численных хромосомных аберраций, что необходимо для кариологического анализа неделящихся клеток, например, клеток опухолей.
Сущность изобретения заключается в том, что клонированный в плазмиде pUC 19 (2700 пар нуклеотидов) по Pst-сайтам фрагмент ДНК человека pYAI 960 размером 1400 пар нуклеотидов, представляющий собой последовательность альфоидной ДНК человека, используется в качестве специфического молекулярного маркера 18-й хромосомы человека. Данный фрагмент имеет длину 1400 пар нуклеотидов и относится к классу альфоидной ДНК, что доказано при проведении рестрикционного картирования ДНК зонда, опытов по блотгибридизации и по гибридизации на хромосомах in situ.
Новый ДНК зонд отличается от известных геномным фрагментом ДНК человека размером 1400 пар нуклеотидов, имеющего 2 внутренних уникальных сайта рестрикции EcoRI и ограниченного PstI-сайтами с разных концов геномного фрагмента. Кроме того, этот ДНК зонд отличается минорными сайтами гибридизации на хромосомах человека в условиях in situ, которые включают хромосомы 2, 4, 8, 9, 20. В специальных условиях, описанных в примерах и способе использования, этот ДНК зонд гибридизуется только с центромерными районами хромосом 18 человека.
Конкретная цель исследования достигалась следующим образом.
Источником выделения маркерного фрагмента pYAI 960 служит ДНК лимфоцитов человека, очищенная методом электрофильтрации на ультрафильтрующей мембране типа ХМ-300 "Amicon". Препарат очищенной лимфоцитарной ДНК человека (полученный от индивида мужского пола) обрабатывают рестриктазой PstI до полного гидролиза. Полученные рестриктные фрагменты "вшивают" с помощью лигирования по "липким" концам в PstI-сайт бактериального плазмидного вектора pUC19 (2700 пар нуклеотидов). Данная плазмида несет ген устойчивости к ампициллину. Наличие гена устойчивости к ампициллину в плазмиде позволяет на среде с этим антибиотиком отбирать только трансформированные клетки. Таким образом, данный вектор позволяет создать рекомбинантную клонотеку (по типу "short-gun") при автоматической селекции на среде с ампициллином.
На следующем этапе в созданной клонотеке идентифицируют клоны, обладающие гомологией с альфа-ДНК. Для этого рекомбинантные клоны на нитроцеллюлозных фильтрах вводят в реакцию гибридизации с меченной радиоактивным фосфором (32P) ДНК тотальной фракции АRI-ДНК человека, которая представлена, в основном, альфоидной ДНК. Колонии, ДНК которых дает позитивные рефлексы на радиоавтографах в результате гибридизации отбирают и используют для определения хромосомной локализации клонированных в них рестриктных фрагментов ДНК человека, непосредственно в цитологических препаратах хромосом in situ.
Для этого препараты хромосом готовят из делящихся клеток в культуре лимфоцитов периферической крови по известному методу. Стимулированные к делению с помощью фитогемагглютинина (фирма "Дифко", США) лимфоциты крови культивируют в пенициллиновых флаконах при 37oC в среде Игла с добавлением до 20% бычьей сыворотки в течение 72 ч. За 1,5 ч до конца культивирования вводят колхицин в концентрации 0,5 мкг/мл. Клетки в среде культивирования переносят в центрифужные пробирки и центрифугируют 5 мин при 1000 об/мин. Осадок ресуспендируют в гипотоническом растворе 0,07 М KCl и инкубируют 10 мин при 37oC. Фиксацию проводят метанол-уксусным фиксатором в отношении 3 : 1 трижды по 20 мин. Препараты хромосом хранят при 37oC и используют в 4 опытах не позднее 2-3 недель после приготовления.
Образцы ДНК для гибридизации на хромосомах in situ метят изотопной меткой известным методом замещения; в 100 мкл деионизированной воды растворяют последовательно 15 мкл десятикратного буферного раствора (0,8 М трис-HCl, pH 7,4; 0,1 М MgCl2; 0,05 М дитиотреитол), 5 мкл нерадиоактивных дезоксинуклеозидтрифосфатов в эквимолярной смеси (по 0,01 ммоль каждого за исключением тимидинтрифосфата), 5 мкл ДНК-азы-1 (концентрация 1 мкг/мл), 10 мкл 3H-тимидинтрифосфата (удельная активность 114 Ки/моль, концентрация 5 мКи/мл, 10 мкл ДНК-полимеразы-1 (концентрация 2 ед/мкл). Объем реакционной смеси составляет 150 мкл. Реакцию проводят 20-40 мин при 20oC. Средняя удельная радиоактивность меченых препаратов ДНК составляет около 25•10 импульсов в минуту в расчете на 1 мкг ДНК.
Гибридизацию меченой радиоактивными предшественниками рекомбинантной ДНК pYAI 960 с метафазными хромосомами in situ проводят по следующей методике: препараты метафазных хромосом денатурируют в течение 30 с в 0,07 N NaOH с последующей промывкой по 10 мин в растворах 70o и 96,6o спирта; препараты радиоактивных образцов ДНК денатурируют в гибридизационной смеси, содержащей 50% формамида, 10 % декстрансульфата-500 и стандартный солевой раствор (2 х SSC), в течение 10 мин при 100oC в течение 17-18 ч. Препараты после проведения гибридизации промывают в двух сменах 2 х SSC при комнатной температуре, в растворах 70o и 96,6o этилового спирта по 15 мин в каждой смене. После высушивания на воздухе препараты покрывают фотоэмульсией типа М и экспонируют в темноте до 10 дней. После проявления стандартным амидоловым проявителем препараты в течение 2 мин тщательно промывают проточной водой и окрашивают 3%-ным раствором красителя Романовского-Гимза в 0,02 М фосфатном буфере (pH 6,8) в течение 10-15 мин. Радиоавтографы анализируют и фотографируют под микроскопом при увеличении х1000 или х1125.
Гибридизация in situ на метафазных хромосомах человека показывает, что клонированный фрагмент pYAI 960 локализован в прицентромерном районе 18-й пары гомологичных хромосом человека и является таким образом специфическим молекулярным маркером данной пары хромосом.
Способы использования полученной рекомбинантной плазмиды pYAI 960 для идентификации хромосомы 18 человека в метафазных и интерфазных клетках с целью проведения молекулярно-цитогенетической диагностики поясняются следующими примерами.
Пример 1. Цельную гепаринизированную кровь здорового донора разводят 0,015 M NaCl в объемном соотношении 1:3. Для осаждения эритроцитов разведенную кровь смешивают с 6%-ным декстрансульфатом - 500 в соотношении 5:1; смесь отстаивают 30 минут при комнатной температуре; все последующие процедуры проводят при температуре 0-4oC. Лейкоциты из надосадочной жидкости осаждают центрифугированием при 450 g в течение 20 мин и отмывают трехкратным центрифугированием в 0,15 М NaCl (450 g, 10 минут). Отмытые клетки ресуспендируют в буфере СТМ, содержащем 0,5 М сахарозу, 50 мМ трис-HCl (pH 8,0)5 мМ MgCl2, 0,02 мМ EDTA с тритоном Х-100 в конечной концентрации 0,05%. Фракцию ядер отмывают трехкратным центрифугированием в том же буфере без тритона Х-100 (450 g, 10 мин).
Ядра ресуспендируют в буфере ТЕ (50 мМ трис HCl, pH 8,0; 5 мМ EDTA) из расчета: 100 мл буфера на 1 мл ядерного осадка и лизируют добавлением саркозила до концентрации 1%. Лизат инкубируют при 65oC не менее 1 ч до полного просветления и центрифугируют 60 мин при 2000 об/мин для удаления механических примесей. Супернатант переносят в цилиндр, снизу закрытый ультрафильтром ХМ-300 ("Amicon"). На супернатант наслаивают равный объем буфера ТЕ + 1%-ный саркозил. Жидкость, находящуюся в цилиндре, отделяют от анодной камеры диализной мембраной. Нижний край цилиндра с фильтром опускают в катодную камеру; обе электродные камеры заполняют буфером, содержащим 89 мМ трис HCl, 89 мМ HBO и 5 мМ EDTA (pH 8,3). Электрофильтрацию раствора производят при 5 мМ/см2 в течение 6-8 ч.
После электрофоретического осаждения ДНК на фильтре жидкость удаляют из цилиндра, а желеобразный слой ДНК растворяют в нужном объеме 0,1 М ТЕ.
Для препаративного выделения плазмидной ДНК со вставкой ДНК человека E. coli, несущую плазмиду, выращивают в 100 мл среды LB (10 г/л пептона, 5 г/л дрожжевого экстракта, 10 г/л NaCl) с добавками необходимых антибиотиков (100 мкг/мл ампициллина) при 37oC на качалке в течение 12 ч. Клетки осаждают центрифугированием (5000 об/мин, 10 мин) и ресуспендируют в 10 мл раствора 50 мМ глюкозы, 50 трис-HCl (pH 8,0), 50 мМ EDTA и 5% раствор тритона Х-100. К суспензии добавляют свежеприготовленный раствор лизоцима до 5 мг/мл и оставляют при комнатной температуре на 10-15 мин. Затем объем пробы доводят до 50 мл буфером без лизоцима и помещают на ночь в термостат при 65oC. ДНК-мембранный комплекс и денатурированные белки клеток осаждают центрифугированием при 12000 об/мин в течение 10 мин. К супернатанту добавляют 100 мкг/мл РНК-азы А и после 2 ч инкубации при 65oC проводят фенольную, а затем хлороформную депротеинизацию. ДНК из раствора осаждают равным объемом изопропилового спирта (-18oC, 20 мин), осадок растворяют в ТЕ. Раствор ДНК диализуют на сефадексе G-50 против 0,1 x SSC (1 x SSC г/л хлористого натрия и 4,8 г/л цитрата натрия). Этот раствор прогревают при 81oC в течение 10 мин и быстро охлаждают добавлением объема 1 М KCl + 20 мМ трис-HCl pH 7,1 при 0oC. Полученную смесь пропускают через колонку с нитроцеллюлозой Nitro-Cell-S (Serva) из расчета 1 мг ДНК на 10 см3 объема колонки. Фракции, содержащие кольцевые формы плазмидной ДНК, объединяют, ДНК из них осаждают равным объемом изопропилового спирта; осадок промывают в растворах 50o изопропилового или 70o этилового спиртов, высушивают под вакуумом и растворяют в буфере ТЕ до нужной концентрации.
ДНК рекомбинантных плазмид для скрининга бактериальных клонов выделяют из 5 мл ночной культуры, осаждая центрифугированием при 5000 об/мин в течение 10 мин, осадок ресуспендируют в 1 мл 25 мМ трис-HCl (pH 8,0); 20 мМ EDTA, 50 мМ глюкозы и 2 мг/мл лизоцима с последующей инкубацией в течение 30 мин при 0o. К клеткам добавляют 2 мл раствора 0,2 N NaOH с 1% SDS для лизиса клеток и после тщательного перемешивания продолжают инкубацию 5 мин. К лизату добавляют 1,5 мл 3 М ацетата натрия, осторожно перемешивают раствор и оставляют на 1 ч при 0oC. Образующийся осадок удаляют центрифугированием (1200 об/мин), нуклеиновые кислоты из супернатанта осаждают 2,5 объемами этилового спирта (-18oC, 30 мин). Осадок растворяют в 1 мл 50 мМ трис-HCl (pH 8,0) + 0,1 М ацетата натрия и переосаждают этанолом. Процедуру переосаждения повторяют дважды, конечный осадок после высушивания растворяют в 100 мкл ТЕ.
Эндонуклеазную обработку ДНК человека и бактериальных плазмид проводят в буфере REB, содержащем 10 мМ трис-HCl (pH 7,4), 10 мМ MgCl2, 10 мМ NaCl и 1 мМ дитиотреитола (DTT). Полный эндонуклеазный гидролиз ДНК получается при относительной концентрации рестриктаз 5-8 ед/мкг ДНК после проведения реакции в течение 2 ч при 37oC. Реакцию останавливают прогреванием пробы при 70oC в течение 10 мин.
Для получения геномной клонотеки ДНК человека в качестве вектора используют бактериальную плазмиду pUC 19, несущую ген устойчивости к ампициллину. Наличие гена устойчивости к ампициллину в плазмиде позволяет на среде с этим антибиотиком отбирать только трансформированные клетки, несущие плазмиды с ДНК человека.
Компетентную культуру бактерий для трансформации готовят следующим образом: в 25 мл питательной среды LB инокулируют 1 мл свежей ночной культуры E. coli HB 101, выращивают на качалке при 37oC до мутности А=0,4-0,5. Деление клеток останавливают, помещая культуру на лед на 10-15 минут, с последующим центрифугированием при 5000 об/мин в течение 10 мин на холоде. Осадок промывают равным объемом охлажденного до 0oC раствора 100 мМ CaCl2 клетки осаждают и ресуспендируют в 12 мл 100 мМ CaCl2. Клеточную суспензию выдерживают на холоде 20-30 мин, центрифугируют, а осадок ресуспендируют в 2,5 мл 0,1 М CaCl2 с 15%-ным глицерином. После инкубации полученной суспензии при 0oC по крайней мере в течение 30 минут культуру можно трансформировать. Она хранится в малых порциях при -80oC, при этом ее компетентность сохраняется в течение 4-5 месяцев.
К 200 мкл компетентной культуры бактерий при 0oC добавляют 0,1-0,2 мкг лигированной плазмидной ДНК и инкубируют при этой температуре в течение 45-60 мин. Затем смесь переносят в водяную баню (42oC) на 1-1,5 мин и помещают на лед. К трансформированной культуре добавляют питательный бульон LB и подращивают ее на качалке 2-3 ч при 37oC. Трансформанты высевают на плотную среду с 1,5% агара (по 0,1 мл культуры на чашку Петри) с добавлением необходимых антибиотиков, как правило ампициллина, обуславливающих селекцию трансформированных клонов.
30 мкл раствора, содержащего 0,1-0,2 мкг плазмидной ДНК или 0,1 мкг препаративно выделенного из геля фрагмента и 1 мкл ДНК-азы-1 в 0,015 М NaCl, 5 мМ CaCl2, инкубируют 10 мин при комнатной температуре, ДНК-азу-1 инактивируют при 70oC 10 мин, после чего к смеси добавляют буферный раствор 0,4 М трис-HCl (pH 7,4); 50 мМ MgCl2, 25 мМ DTT (до 1/5 конечного объема), по 1 нмолю каждого из немеченых предшественников ДНК, 20-40 мкКи одного из 32P- дезоксинуклеозидтрифосфатов с удельной активностью 110 ТВ/ммоль (3000 Ки/ммоль) (Amersham) и 1 ед ДНК-полимеразы-1. Объем реакционной смеси, как правило, составляет 100 мкл, реакцию ведут в течение 1 ч при 37oC. Радиоактивность кислотонерастворимой фракции ДНК измеряют на счетчике LRB 1215 по специальной программе. Средняя удельная активность меченых препаратов составляет 2-5 • 108 имп/мин/мкг ДНК.
Для идентификации вставок ДНК человека в составе гибридных клонов бактериальные колонии, предварительно тестированные по фенотипу как рекомбинантные, репликой наносят на нитроцеллюлозные фильтры (Millipore, HAWP), находящиеся непосредственно на поверхности твердой питательной среды в чашках Петри, и выращивают их в течение суток при 37oC. Выросшие колонии вместе с фильтром переносят на поверхность раствора 0,5 M NaOH и оставляют на 5-10 мин. Подсушив фильтр с нижней стороны фильтровальной бумагой дважды по 10 мин обрабатывают раствором 1 М трис-HCl (pH 7,5), а затем 1,5 M NaCl с 1 М трис HCl (pH 7,5). Высушенный на воздухе фильтр помещают в раствор 2 х SSC с протеиназой К в концентрации 50 мкг/мл и инкубируют в нем 30 мин при 137oC. Далее подсушенный фильтр промывают в 0,3 М NaCl, а затем сушат под вакуумом при 80oC в течение 1-2 ч.
Перед гибридизацией фильтр вымачивают при 68oC в растворе 2 х SSC, 0,5% SDS, 0,1% фикол-400 и 0,1% поливинилпирролидон-350 в течение 60-90 мин. Вслед за этим фильтр насухо промокают фильтровальной бумагой и помещают в 4- 5 мл гибридизационной смеси, содержащей 6 х SSC; 0,1% SDS; 10% декстрансульфата-500, 50 мкг/мл поли (А) и денатурированную пробу 32P-меченой ДНК с суммарной активностью 1-5 • 106 имп/мин. Гибридизацию проводят при 68oC в течение 18-24 ч. Фильтры промывают в нескольких сменах раствора 0,5 х SSC с 0,5% SDS при 68oC в течение нескольких часов. Отмытые фильтры окончательно высушивают и помещают в кассету с рентгеновской пленкой РМ-1. Через 2-24 ч экспозиции проявляют радиоавтографически и по наличию положительных сигналов (участков почернения округлой формы) идентифицируют гибридные клоны.
Описанным способом ставят опыт на трех фильтрах-репликах с клонотекой PstI фрагментов ДНК человека. При этом в качестве зонда для гибридизации с колониями на фильтрах берется проба альфоидной ДНК человека, выделенной препаративно из агарозного геля после электрофоретического разделения гидролизата геномной ДНК человека эндонуклеазой EcoRI и идентификации полосы 680 пар нуклеотидов. В указанный образец ДНК вводится изотопная метка описанным ранее методом замещения. После гибридизации на колониях положительный сигнал обнаруживается особенно четко на нескольких колониях, одна из которых получила название альфа pYAI 960.
Препараты хромосом готовят в культуре лимфоцитов периферической крови, стимулированных к делению с помощью фитогемагглютинина (фирма "Difco" США) в пенициллиновых флаконах при температуре 37oC в среде Игла с добавлением до 20% бычьей сыворотки в течение 74 ч. За 1 ч до конца культивирования вводят колхицин в концентрации 0,5 мкг/мл. Клетки в среде культивирования переносят в центрифужные пробирки и центрифугируют в течение 5 мин при 1000 об/мин. Осадок ресуспендируют в гипотоническом растворе 0,07 М KCl и инкубируют в течение 10 мин при 37oC. Фиксацию проводят метанол-уксусным фиксатором (в соотношении 3:1) трижды по 20 мин. Препараты хромосом хранят при 37oC и используют в опытах не позднее 2-3-х недель после приготовления.
Образцы ДНК для гибридизации на хромосомах in situ метят изотопной меткой методом замещения: в 100 мкл деионизированной воды растворяют последовательно 15 мкл десятикратного буферного раствора (0,8 М трис-HCl, pH 7,4; 0,1 М MgCl2); 0,05 М дитиотреитол, 5 мкл нерадиоактивных дезоксинуклеозидтрифосфатов в эквимолярной смеси (по 0,1 мМ каждого за исключением H3 - тимидинтрифосфата), 5 мкл ДНК-азы-1 (концентрация 1 мкг/мл), 10 мкл H3-тимидинтрифосфата (удельная активность 114 Ки/моль, концентрация 5 мКи/мл), 5 мкл ДНК-полимеразы 1 (концентрация 2 ед/мкл) и 5 мкл ДНК (1 мкг) пробы альфа pYAI 960. Объем реакционной смеси составляет 150 мкл. Реакцию ведут в течение 20-40 мин при 20oC. Средняя удельная радиоактивность меченых препаратов ДНК составляет около 25•106 импульсов в минуту в расчете на 1 мкг ДНК.
Гибридизацию меченной радиоактивными предшественниками рекомбинантной ДНК pYAI 960 с метафазными хромосомами in situ проводят с предварительной денатурацией в течение 30 с в 0,07 H NaOH с последующей промывкой по 10 мин в растворах 70o и 96,6o этилового спирта. Препараты радиоактивных образцов ДНК денатурируют в гибридизационной смеси, содержащей 50% формамида, 10% декстрансульфата-500 и стандартный солевой раствор (2 х SSC), в течение 10 мин при 100oC. Гибридизацию проводят при 37o в течение 17-18 ч. Препараты после проведения гибридизации промывают в двух сменах 2 х SSC при 37oC, в двух сменах 2 х SSC при комнатной температуре, в растворах 70o и 96,6o этилового спирта по 15 мин в каждой смене. После высушивания на воздухе препараты покрывают фотоэмульсией типа М и экспонируют в темноте до 10 дней. После проявления стандартным амидоловым проявителем в течение 2 мин препараты тщательно промывают проточной водой и окрашивают 3%-ным раствором красителя Романовского-Гимза в 0,02 М фосфатном буфере (pH 6,8) в течение 10-15 мин. Радиоавтографы анализируют и фотографируют под микроскопом при увеличении х1000 или х1125.
Гибридизация in situ на метафазных хромосомах человека показывает, что клонированный фрагмент pYAI 960 локализуется только в прицентромерном районе 18-й пары гомологичных хромосом человека и является таким образом молекулярным маркером данной пары хромосом, специфически маркирующим околоцентромерный район.
Пример 2. Особенно важным является применение предлагаемого молекулярного маркера для распознавания 18-й хромосомы в тех случаях, когда эта хромосома (один из ее гомологов) затронута перестройкой, т.е. имеет потерю или добавку какого-либо участка хромосомного материала, что сказывается на размере 18-й хромосомы и ее форме.
Все процедуры по выделению образца ДНК pYAI 960 и его обработки с изотопной меткой для гибридизации на метафазных хромосомах in situ, а также все процедуры по приготовлению препаратов метафазных хромосом и проведению гибридизации на хромосомах повторяются аналогично примеру 1. Отличие состоит только в том, что в примере 1 используются препараты нормального хромосомного набора от здорового донора мужского пола, тогда как в примере 2 используются препараты хромосомного набора носителей транслокации (переноса) 18-й хромосомы на конец короткого плеча 15-й хромосомы. Так, при цитогенетическом анализе пробанда и его матери были обнаружены дицентрические транслокации (15; 18). При этом мать фенотипически здорова, а у ребенка отмечались олигофрения и множество микроаномалий развития. Традиционные цитогенетические методы с применением дифференциального окрашивания хромосом оказались малоэффективны. Однако после проведения гибридизации на метафазных хромосомах in situ с помощью молекулярного маркера pYAI 960 для 18-й хромосомы, установить кариотипы не составило труда, так как укорочение короткого плеча в 18 хромосоме и потеря хромосомного материала в ней легко распознается непосредственно под микроскопом. В результате исследования у пробанда обнаружена делеция (потеря хромосомного материала) короткого плеча хромосомы 18, т.е. 18p-синдром. У матери подтвердилось наличие сбалансированной транслокации, т. е. без потери хромосомного материала. Таким образом, с помощью молекулярного маркера pYAI 960 для 18-й хромосомы гомологичный партнер, затронутый перестройкой, распознается легко при анализе под микроскопом.
Пример 3. Важной иллюстрацией практического применения молекулярного маркера pYAI 960 для 18-й пары хромосом является опыт по идентификации присутствия этой хромосомы в клеточном ядре непосредственно по картине интерфазных (неделящихся) ядер. Как известно, хромосомы человека анализируются только в метафазе митоза после специальных обработок, облегчающих подсчет и анализ морфологии хромосом. Исключением являются половая X-хромосома, наличие которой в норме у женщин можно установить по определению в интерфазном ядре компактного тельца хроматина X, образованного одной из двух X-хромосом в женском наборе, а также половая Y-хромосома, которую определяют как ярко флюоресцирующее тельце, окрашенное акрихин ипритом, в интерфазном ядре мужчин с нормальным хромосомным набором. Однако с помощью молекулярного маркера pYAI 960, специфически маркирующего только 18-е хромосомы человека, наличие данных хромосом в клеточном ядре можно устанавливать без приготовления препаратов метафазных хромосом, лишь по анализу изображения интерфазных ядер. Это обусловлено тем, что образец ДНК pYAI 960 гибридизуется с ДНК прицентромерной области 18-й пары хромосом и в том случае, когда эти хромосомы находятся в расплетенном состоянии на стадии интерфазы. В этом случае в каждом интерфазном ядре можно видеть (после гибридизации и приготовления радиоавтографов) два практически одинаковых по размеру скопления /кластеров/ зерен серебра (сигналов изотопной метки), соответствующих двум хромосомам 18.
Все процедуры по выделению образца pYAI 960 и его обработки с изотопной меткой для гибридизации на интерфазных ядрах, а также все процедуры по приготовлению препаратов метафазных хромосом периферической крови и проведению гибридизации на хромосомах повторяются аналогично таким же процедурам, описанным в примерах 1 и 2. В каждом интерфазном ядре обнаруживаются два скопления гранул метки /два кластера/, соответствующих гомологичным хромосомам 18-й пары. В разных ядрах расстояния между кластерами различны. Итак, появляется реальная возможность непосредственно в интерфазных ядрах анализировать расположение гомологичных партнеров конкретных пар хромосом в клетках человека, что представляет большой научный интерес с точки зрения функциональной организации наследственных структур человека.
Таким образом, клонированная последовательность ДНК pYAI 960 из генома человека является эффективным инструментом для распознавания 18-й хромосомы как на стандартных (после культивирования клеток) препаратах нормальных хромосом человека, так и в случаях перестроенных 18-х хромосом, а также на цитологических (без культивирования клеток) препаратах интерфазных ядер. Указанные возможности расширяют область применения хромосомного анализа в практике клинической генетики, медико- генетического консультирования и пренатальной диагностики в случаях перестроек 18-й хромосомы человека, а также при анализе анеуплоидий по хромосомам 18 и при различных формах рака. Возможно эффективное применение предлагаемого способа в анализе гибридных клеточных линий, широко используемых для цитогенетического картирования нормальных и мутантных генов человека.
Claims (1)
- Рекомбинатная плазмидная ДНК pYAI 960, предназначенная для маркирования 18-й хромосомы человека, содержащая - PstI - PstI - фрагмент ДНК вектора pUC 19 размером 2700 пар нуклеотидов, - PstI - PstI - фрагмент альфоидной ДНК лимфоцитов человека, высокоспецифичный для центромерного района 18-й хромосомы человека, размером 1400 пар нуклеотидов с двумя внутренними уникальными сайтами рестрикции EcoRI, генетические маркеры: Ampr - ген устойчивости к ампициллину.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2000107200A RU2161199C1 (ru) | 2000-03-24 | 2000-03-24 | Рекомбинантная плазмидная днк pyai 960, предназначенная для маркирования 18-й хромосомы человека |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2000107200A RU2161199C1 (ru) | 2000-03-24 | 2000-03-24 | Рекомбинантная плазмидная днк pyai 960, предназначенная для маркирования 18-й хромосомы человека |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2161199C1 true RU2161199C1 (ru) | 2000-12-27 |
Family
ID=20232263
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2000107200A RU2161199C1 (ru) | 2000-03-24 | 2000-03-24 | Рекомбинантная плазмидная днк pyai 960, предназначенная для маркирования 18-й хромосомы человека |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2161199C1 (ru) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003000839A3 (en) * | 2001-06-21 | 2003-03-13 | Inst Belka Of The Russian Fede | Clinical assay for nucleic acids amplified in solid matrices to produce colonies of the progeny of individual target molecules |
| RU2200761C1 (ru) * | 2002-04-01 | 2003-03-20 | Московский НИИ педиатрии и детской хирургии | Набор рекомбинантных плазмидных днк рyai 11-19, рyai 2-45, рys 37 и рyai 7-29 для определения происхождения добавочных или маркерных (мини-) хромосом человека |
| RU2263313C1 (ru) * | 2004-09-29 | 2005-10-27 | Рогаев Евгений Иванович | Способ определения пола человека, способ получения молекулярного маркера для определения пола человека, молекулярный маркер |
| RU2265060C1 (ru) * | 2004-02-05 | 2005-11-27 | Московский научно-исследовательский институт педиатрии и детской хирургии Министерства здравоохранения Российской Федерации (Государственное учреждение науки) | Рекомбинантная плазмидная днк альфа r-12, предназначенная для маркирования 6-й хромосомы человека в метафазных и интерфазных клетках |
| RU2325441C1 (ru) * | 2006-07-28 | 2008-05-27 | Федеральное государственное учреждение Московский научно-исследовательский институт педиатрии и детской хирургии Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию (ФГУ МНИИ педиатрии и детской хирургии Росздрава) | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК рYA11-39, ПРЕДНАЗНАЧЕННАЯ ДЛЯ МАРКИРОВАНИЯ 4-Й И 9-Й ХРОМОСОМ ЧЕЛОВЕКА В МЕТАФАЗНЫХ И ИНТЕРФАЗНЫХ КЛЕТКАХ |
-
2000
- 2000-03-24 RU RU2000107200A patent/RU2161199C1/ru not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| C.VAN BROECKHOVEN et al. REPORT OF THE CHROMOSOME 18 WORKSHOP. - 1998, PSYCHIAT. GENET., 8, 97 - 108. C.VAN BROECKHOVEN et al. REPORT OF THE CHROMOSOME 18 WORKSHOP. - 1999, AME R.J. HUM. GENET., 88, 263 - 270. * |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003000839A3 (en) * | 2001-06-21 | 2003-03-13 | Inst Belka Of The Russian Fede | Clinical assay for nucleic acids amplified in solid matrices to produce colonies of the progeny of individual target molecules |
| RU2200761C1 (ru) * | 2002-04-01 | 2003-03-20 | Московский НИИ педиатрии и детской хирургии | Набор рекомбинантных плазмидных днк рyai 11-19, рyai 2-45, рys 37 и рyai 7-29 для определения происхождения добавочных или маркерных (мини-) хромосом человека |
| RU2265060C1 (ru) * | 2004-02-05 | 2005-11-27 | Московский научно-исследовательский институт педиатрии и детской хирургии Министерства здравоохранения Российской Федерации (Государственное учреждение науки) | Рекомбинантная плазмидная днк альфа r-12, предназначенная для маркирования 6-й хромосомы человека в метафазных и интерфазных клетках |
| RU2263313C1 (ru) * | 2004-09-29 | 2005-10-27 | Рогаев Евгений Иванович | Способ определения пола человека, способ получения молекулярного маркера для определения пола человека, молекулярный маркер |
| RU2325441C1 (ru) * | 2006-07-28 | 2008-05-27 | Федеральное государственное учреждение Московский научно-исследовательский институт педиатрии и детской хирургии Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию (ФГУ МНИИ педиатрии и детской хирургии Росздрава) | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК рYA11-39, ПРЕДНАЗНАЧЕННАЯ ДЛЯ МАРКИРОВАНИЯ 4-Й И 9-Й ХРОМОСОМ ЧЕЛОВЕКА В МЕТАФАЗНЫХ И ИНТЕРФАЗНЫХ КЛЕТКАХ |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Flaman et al. | A simple p53 functional assay for screening cell lines, blood, and tumors. | |
| US4912039A (en) | Multidrug resistance in mammalian cell lines and isolation of determinant glycoprotein DNA | |
| Woolford et al. | Isolation of cloned DNA sequences containing ribosomal protein genes from Saccharomyces cerevisiae | |
| Zimmer et al. | Construction and characterization of a large-fragment chicken bacterial artificial chromosome library | |
| US4652517A (en) | Methods for the in vitro detection and identification of unknown pathogens or genetic entities | |
| Burch et al. | Human gene expression in rodent cells after uptake of isolated metaphase chromosomes. | |
| Hirota et al. | A mutant of Escherichia coli defective in DNA polymerase II activity | |
| US5801021A (en) | Amplifications of chromosomal region 20q13 as a prognostic indicator in breast cancer | |
| Crosby et al. | Molecular analysis of formaldehyde‐induced mutations in human lymphoblasts and e. coli | |
| JPH03224499A (ja) | 染色体―特異的染色の方法および組成物 | |
| JPH03244400A (ja) | 癌評価方法 | |
| Sekido et al. | Molecular analysis of the HuD gene encoding a paraneoplastic encephalomyelitis antigen in human lung cancer cell lines | |
| Jaskunas et al. | Isolation of polar insertion mutants and the direction of transcription of ribosomal protein genes in E. coli | |
| Nishimura et al. | Synthetic ColE1 plasmids carrying genes for cell division in Escherichia coli | |
| RU2161199C1 (ru) | Рекомбинантная плазмидная днк pyai 960, предназначенная для маркирования 18-й хромосомы человека | |
| RU2087534C1 (ru) | Рекомбинантная плазмидная днк альфа r 1 - 6, предназначенная для маркирования 13-й и 21-й хромосом человека | |
| RU2087533C1 (ru) | Рекомбинатная плазмидная днк pyа1а 05 для маркирования и индентификации третьей хромосомы человека | |
| RU2200761C1 (ru) | Набор рекомбинантных плазмидных днк рyai 11-19, рyai 2-45, рys 37 и рyai 7-29 для определения происхождения добавочных или маркерных (мини-) хромосом человека | |
| RU2265060C1 (ru) | Рекомбинантная плазмидная днк альфа r-12, предназначенная для маркирования 6-й хромосомы человека в метафазных и интерфазных клетках | |
| RU1792429C (ru) | Рекомбинантна плазмидна ДНК альфа RI-7, предназначенна дл маркировани 1-ой хромосомы человека | |
| RU2325441C1 (ru) | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК рYA11-39, ПРЕДНАЗНАЧЕННАЯ ДЛЯ МАРКИРОВАНИЯ 4-Й И 9-Й ХРОМОСОМ ЧЕЛОВЕКА В МЕТАФАЗНЫХ И ИНТЕРФАЗНЫХ КЛЕТКАХ | |
| RU2425890C2 (ru) | Способ маркирования 7-й хромосомы человека в метафазных и интерфазных клетках | |
| SU1203108A1 (ru) | Способ маркировани 11-й хромосомы человека,рекомбинантна плазмидна ДНК @ 53 дл маркировани ,фрагмент геномной ДНК @ 53 дл маркировани и способ получени фрагмента ДНК @ 53 | |
| Fisher et al. | Molecular hybridization under conditions of high stringency permits cloned DNA segments containing reiterated DNA sequences to be assigned to specific chromosomal locations. | |
| EP0300923A2 (en) | DNA probes for assaying B-lactamase production in gram-negative bacteria |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD4A | Correction of name of patent owner | ||
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20140325 |