RU2142508C1 - Method of industrial producing polypeptide showing biological activity of human leukocyte interferon alpha-2 - Google Patents
Method of industrial producing polypeptide showing biological activity of human leukocyte interferon alpha-2 Download PDFInfo
- Publication number
- RU2142508C1 RU2142508C1 RU97112593A RU97112593A RU2142508C1 RU 2142508 C1 RU2142508 C1 RU 2142508C1 RU 97112593 A RU97112593 A RU 97112593A RU 97112593 A RU97112593 A RU 97112593A RU 2142508 C1 RU2142508 C1 RU 2142508C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- nutrient medium
- interferon alpha
- glucose
- temperature
- cultivation
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 38
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 title claims description 7
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 title claims description 7
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title abstract description 5
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title abstract description 5
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title abstract description 5
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 title description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims abstract description 35
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims abstract description 25
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims abstract description 23
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 claims abstract description 12
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 claims abstract description 6
- 238000005273 aeration Methods 0.000 claims abstract description 6
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 claims abstract description 6
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 claims abstract description 6
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 claims abstract description 6
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 claims abstract description 6
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 claims abstract description 6
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 claims abstract description 4
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 3
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 abstract description 6
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 abstract description 6
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 abstract description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 5
- 108010078049 Interferon alpha-2 Proteins 0.000 abstract description 3
- 102100039350 Interferon alpha-7 Human genes 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 abstract 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 abstract 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 abstract 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 38
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 18
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 12
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 10
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 9
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 9
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 7
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 6
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 6
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 6
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 5
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 5
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 4
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 4
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 4
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 4
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 4
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 4
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 4
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 4
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 4
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 4
- WRUGWIBCXHJTDG-UHFFFAOYSA-L magnesium sulfate heptahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.[Mg+2].[O-]S([O-])(=O)=O WRUGWIBCXHJTDG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- -1 monosubstituted potassium phosphate Chemical class 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 4
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 4
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 4
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 4
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 4
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 101000959794 Homo sapiens Interferon alpha-2 Proteins 0.000 description 3
- GZCGUPFRVQAUEE-SLPGGIOYSA-N aldehydo-D-glucose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O GZCGUPFRVQAUEE-SLPGGIOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 3
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 3
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 3
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 3
- WEEMDRWIKYCTQM-UHFFFAOYSA-N 2,6-dimethoxybenzenecarbothioamide Chemical compound COC1=CC=CC(OC)=C1C(N)=S WEEMDRWIKYCTQM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000589776 Pseudomonas putida Species 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- XMEVHPAGJVLHIG-FMZCEJRJSA-N chembl454950 Chemical compound [Cl-].C1=CC=C2[C@](O)(C)[C@H]3C[C@H]4[C@H]([NH+](C)C)C(O)=C(C(N)=O)C(=O)[C@@]4(O)C(O)=C3C(=O)C2=C1O XMEVHPAGJVLHIG-FMZCEJRJSA-N 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 229940061634 magnesium sulfate heptahydrate Drugs 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 2
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 2
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 229960002385 streptomycin sulfate Drugs 0.000 description 2
- 229960004989 tetracycline hydrochloride Drugs 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000450599 DNA viruses Species 0.000 description 1
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 1
- 108010015776 Glucose oxidase Proteins 0.000 description 1
- 239000004366 Glucose oxidase Substances 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010019799 Hepatitis viral Diseases 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 235000019420 glucose oxidase Nutrition 0.000 description 1
- 229940116332 glucose oxidase Drugs 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 201000009277 hairy cell leukemia Diseases 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
- 201000001862 viral hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к биотехнологии, конкретно к производству рекомбинантного интерферона человека в промышленном масштабе. The invention relates to biotechnology, specifically to the production of recombinant human interferon on an industrial scale.
Интерферон - белок с молекулярной массой около 18000 Да, продуцируемый в организме человека активированными лейкоцитами, обладает ярко выраженной противовирусной активностью по отношению к ряду ДНК- и РНК- содержащих вирусов. Клинические исследования показали перспективность использования рекомбинантного интерферона альфа-2 человека при лечении ряда вирусных инфекций (вирусные гепатиты, вирусы гриппа, вирус герпеса и др.), а также при некоторых видах опухолевых заболеваний (волосатоклеточный лейкоз и др.). Interferon, a protein with a molecular weight of about 18,000 Da, produced in the human body by activated leukocytes, has a pronounced antiviral activity against a number of DNA and RNA viruses. Clinical studies have shown the promise of using recombinant human interferon alpha-2 in the treatment of a number of viral infections (viral hepatitis, influenza viruses, herpes virus, etc.), as well as in some types of tumor diseases (hairy cell leukemia, etc.).
Известны способы получения человеческого лейкоцитарного интерферона альфа-2 [1-3] . В частности, предложен способ [1], который заключается в том, что в лабораторном ферментере (объем не указан) культивируют штамм-продуцент Pseudomonas species VG-84, несущий плазмиду pVG3, в условиях аэрации и перемешивания. Known methods for producing human leukocyte interferon alpha-2 [1-3]. In particular, the proposed method [1], which consists in the fact that a producer strain Pseudomonas species VG-84 carrying the pVG3 plasmid is cultured in a laboratory fermenter (volume not specified) under aeration and mixing.
Состав питательной среды, г/л: триптон - 10; дрожжевой экстракт - 5; аденин - 80 мл/л; глюкоза - 10; стрептомицин - 0,15; тетрациклин - 0,05; вода дистиллированная до 1 л. The composition of the nutrient medium, g / l: tryptone - 10; yeast extract - 5; adenine - 80 ml / l; glucose - 10; streptomycin - 0.15; tetracycline - 0.05; distilled water up to 1 liter.
Процесс ведут при температуре 28±0,5oC; pH 6,7-6,9; режим аэрации и перемешивания подбирают таким, чтобы поддерживать парциальное давление кислорода на уровне 5-10% от насыщения. Для стабилизации водородного показателя используют аммиачную воду.The process is carried out at a temperature of 28 ± 0.5 o C; pH 6.7-6.9; the mode of aeration and mixing is selected so as to maintain the partial pressure of oxygen at the level of 5-10% of saturation. To stabilize the hydrogen indicator, ammonia water is used.
Ферментацию прекращают при величине оптической плотности 5 ед. Оптическую плотность измеряют при длине волны 540 нм. Fermentation is terminated at an optical density of 5 units. The optical density is measured at a wavelength of 540 nm.
Одной из модификаций описанного выше способа является следующий способ [2] . Состав питательной среды, г/л: раствор гидролизата казеина - 120 мл/л; гидролизат пекарских дрожжей - 5,0; Д - глюкоза - 10,0; сернокислый аммоний - 3,0; фосфорнокислый двузамещенный трехводный калий - 1,5; фосфорнокислый однозамещенный калий - 0,6; хлористый натрий - 0,5; сернокислый семиводный магний - 0,25; дистиллированная вода до 1 л. Ферментацию проводят при 30oC, pH среды 7, каждые 30 мин берут пробы для измерения оптической плотности, pO2 изменяют по динамике роста:
после засева pO2 поддерживают 40% от насыщения, при достижении 2,5-3 опт. ед. - 50%, при 4,5 - 5 опт. ед. - 60%, при 6,5-7 опт. ед. - 70% от насыщения. Оптическую плотность измеряют при длине волны 540 нм. Спустя 1 ч после достижения максимальной скорости роста процесс биосинтеза завершают.One of the modifications of the method described above is the following method [2]. The composition of the nutrient medium, g / l: casein hydrolyzate solution - 120 ml / l; baker's yeast hydrolyzate - 5.0; D - glucose - 10.0; ammonium sulfate - 3.0; phosphate disubstituted three-water potassium - 1.5; monosubstituted potassium phosphate - 0.6; sodium chloride - 0.5; magnesium sulfate heptahydrate - 0.25; distilled water up to 1 liter. Fermentation is carried out at 30 o C, the pH of the medium is 7, samples are taken every 30 min to measure the optical density, pO 2 is changed according to the dynamics of growth:
after seeding, pO 2 maintain 40% of saturation, when reaching 2.5-3 opt. units - 50%, at 4.5 - 5 opt. units - 60%, at 6.5-7 opt. units - 70% of saturation. The optical density is measured at a wavelength of 540 nm. After 1 h after reaching the maximum growth rate, the biosynthesis process is completed.
Модификацией способа [2] является способ [3], который заключается в том, что в лабораторном ферментере, с рабочим объемом 10 л, выращивают биомассу Ps. species VG-84. Состав питательной среды, г/л: гидролизат казеина - 120 мл/л; гидролизат пекарских дрожжей - 5; Д - глюкоза - 10; сернокислый аммоний - 3; фосфорнокислый однозамещенный калий - 0,6; фосфорнокислый двузамещенный трехводный калий - 1,5; хлористый натрий - 0,5; сернокислый семиводный магний - 0,25; хлористый кальций - 0,011; тетрациклин - 0,05; стрептомицин - 0,15; вода дистиллированная до 1 л. Ферментацию начинают при 30±0,5oC, pH среды поддерживают на уровне 7, каждые 30 мин берут пробу культуральной жидкости для измерения оптической плотности. При засеве pO2 поддерживают на уровне 40% от насыщения, при достижении 2,5-3 опт. ед. - 50%, при 4,5-5 опт. ед. - 60%, при 6,5-7 опт. ед. - 70% от насыщения. Через 15-30 мин после достижения максимальной скорости роста бактерий температуру понижают от 30±0,5oC до 20±0,5oC и процесс завершают в начале стационарной фазы или через 2,5±0,5 ч после снижения температуры. Оптическую плотность измеряют при длине волны 540 нм.A modification of the method [2] is the method [3], which consists in the fact that in a laboratory fermenter, with a working volume of 10 l, biomass Ps is grown. species VG-84. The composition of the nutrient medium, g / l: casein hydrolyzate - 120 ml / l; hydrolyzate of baker's yeast - 5; D - glucose - 10; ammonium sulfate - 3; monosubstituted potassium phosphate - 0.6; phosphate disubstituted three-water potassium - 1.5; sodium chloride - 0.5; magnesium sulfate heptahydrate - 0.25; calcium chloride - 0.011; tetracycline - 0.05; streptomycin - 0.15; distilled water up to 1 liter. Fermentation is started at 30 ± 0.5 ° C, the pH of the medium is maintained at 7, and a culture fluid sample is taken every 30 minutes to measure the optical density. When sowing pO 2 support at a level of 40% of saturation, upon reaching 2.5-3 opt. units - 50%, at 4.5-5 opt. units - 60%, at 6.5-7 opt. units - 70% of saturation. After 15-30 minutes after reaching the maximum growth rate of bacteria, the temperature is lowered from 30 ± 0.5 o C to 20 ± 0.5 o C and the process is completed at the beginning of the stationary phase or 2.5 ± 0.5 hours after the temperature decreases. The optical density is measured at a wavelength of 540 nm.
Описанный способ позволяет получить 1,5•106 ME/мл культуральной жидкости альфа-2 интерферона, является наиболее близким к заявленному техническим решением и выбран в качестве прототипа.The described method allows to obtain 1.5 • 10 6 ME / ml of a culture fluid of alpha-2 interferon, is the closest to the claimed technical solution and is selected as a prototype.
Недостатками способа-прототипа являются:
- описанная технология получения интерферона альфа-2 человека микробиологическим синтезом осуществлена на лабораторном оборудовании; прямой перенос результатов от лабораторной установки к промышленному аппарату невозможен, так как методы теории подобия, позволяющие получать критерии масштабирования, в биотехнологии так же, как и в химической технологии, непригодны [4];
- невысокий выход целевого продукта (табл. 2,3), что может быть объяснено неоптимальным составом питательной среды и резким снижением температуры в конце процесса.The disadvantages of the prototype method are:
- the described technology for producing human interferon alpha-2 by microbiological synthesis was carried out on laboratory equipment; direct transfer of results from a laboratory setup to an industrial apparatus is impossible, since the methods of the theory of similarity, which allow obtaining scaling criteria, are not suitable in biotechnology as well as in chemical technology [4];
- low yield of the target product (table. 2,3), which can be explained by the non-optimal composition of the nutrient medium and a sharp decrease in temperature at the end of the process.
Анализ используемой в способе-прототипе питательной среды показал, что в ее состав входят практически все аминокислоты. Наиболее потребляемыми из них при накоплении биомассы рекомбинантных бактерий Ps. putida VG-84 являются следующие: треонин, серин, глютаминовая кислота, гистидин, триптофан и аспарагин. Утилизация глюкозы происходит раньше утилизации аминокислот и к моменту полного потребления глюкозы содержание аминокислот составляет примерно 70% от исходного значения, даже в том случае, если используется питательная среда с исходной концентрацией глюкозы 25 г/л (табл.1). Дополнительное однократное внесение глюкозы до исходной концентрации в процессе роста бактерий ведет к более глубокому потреблению аминокислот и к моменту полной утилизации глюкозы в культуральной жидкости остается около 35% вышеперечисленных аминокислот. При этом, как видно из табл.1, возрастает выход по целевому белку в 4,67 раз. Результаты, приведенные в табл. 1, получены на лабораторном ферментере с рабочим объемом 7 л. Analysis of the nutrient medium used in the prototype method showed that it contains almost all amino acids. The most consumed of them during the accumulation of biomass of recombinant bacteria Ps. putida VG-84 are as follows: threonine, serine, glutamic acid, histidine, tryptophan and asparagine. Glucose utilization occurs before the utilization of amino acids and by the time glucose is fully consumed, the amino acid content is approximately 70% of the initial value, even if a nutrient medium with an initial glucose concentration of 25 g / l is used (Table 1). An additional single application of glucose to the initial concentration during the growth of bacteria leads to a deeper consumption of amino acids and by the time of complete utilization of glucose in the culture fluid remains about 35% of the above amino acids. In this case, as can be seen from table 1, the yield of the target protein increases by 4.67 times. The results are shown in table. 1, obtained on a laboratory fermenter with a working volume of 7 liters.
Экспериментально было изучено влияние концентрации глюкозы в питательной среде на выход целевого продукта. С этой целью провели ряд экспериментов на средах с различным содержанием глюкозы, содержание остальных компонентов питательной среды оставалось неизменным и соответствовало питательной среде способа-прототипа. Эксперименты проводились на промышленном ферментере вместимостью 100 л. Полученные результаты приведены в табл. 2. Из данных табл.2 видно, что максимальное накопление целевого белка идет при содержании глюкозы 40 г/л питательной среды, при этом выход целевого белка в 3,3 раза выше, чем на среде, указанной в способе-прототипе. The effect of glucose concentration in the nutrient medium on the yield of the target product was experimentally studied. To this end, we conducted a series of experiments on media with different glucose contents, the content of the remaining components of the nutrient medium remained unchanged and corresponded to the nutrient medium of the prototype method. The experiments were carried out on an industrial fermenter with a capacity of 100 liters. The results are shown in table. 2. From the data of table 2 it is seen that the maximum accumulation of the target protein occurs at a glucose content of 40 g / l of nutrient medium, while the yield of the target protein is 3.3 times higher than on the medium specified in the prototype method.
Задачей предлагаемого изобретения является разработка технологии крупномасштабного культивирования рекомбинантного штамма Pseudomonas putida VG-84 и оптимизация состава питательной среды с целью увеличения выхода по целевому белку. The task of the invention is the development of technology for large-scale cultivation of the recombinant strain of Pseudomonas putida VG-84 and the optimization of the composition of the nutrient medium in order to increase the yield of the target protein.
Поставленная задача решается тем, что в способе промышленного получения полипептида с биологической активностью альфа-2 интерферона человека рекомбинантными бактериями Ps. putida VG-84, культивирование ведут глубинным методом, при pH 6,8-7,0, температуре 28-29oC и концентрации растворенного кислорода не менее 20%, в присутствии стрептомицина и тетрациклина на питательной среде, содержащей 25-60 г/л глюкозы. Для сохранения указанной концентрации глюкозы длительное время ведут дробную подачу питательной среды с удвоенным содержанием глюкозы. Снижение температуры в конце процесса ведут ступенчато.The problem is solved in that in a method for the industrial production of a polypeptide with the biological activity of alpha-2 human interferon by recombinant bacteria Ps. putida VG-84, cultivation is carried out by the deep method, at a pH of 6.8-7.0, a temperature of 28-29 o C and a dissolved oxygen concentration of at least 20%, in the presence of streptomycin and tetracycline on a nutrient medium containing 25-60 g / l glucose. To maintain the indicated glucose concentration, a fractional supply of a nutrient medium with doubled glucose content is conducted for a long time. A decrease in temperature at the end of the process is carried out stepwise.
Сущность предлагаемого способа заключается в том, что культивирование ведут в промышленном ферментере с рабочим объемом 100 л, на питательной среде, содержащей, г/л; экстракт пекарских дрожжей - 5,0; гидролизат казеина сернокислотный - 10,0: Д - глюкоза -25 - 60; сернокислый аммоний - 3,0; натрий хлористый - 0,5; магний сернокислый семиводный - 0,25; кальций хлористый - 0,011; калий фосфорнокислый двузамещенный трехводный - 1,5; калий фосфорнокислый однозамещенный - 0,6; стрептомицина сульфат - 0,15; тетрациклина гидрохлорид - 0,05; вода водопроводная до 1 л, при следующих условиях: объем питательной среды - 100 л; температура ~ 28,5±0,5oC; водородный показатель - 6,8-7,0 pH; концентрация растворенного кислорода не менее 20%; скорость вращения перемешивающего устройства - 700 об/мин.The essence of the proposed method lies in the fact that the cultivation is carried out in an industrial fermenter with a working volume of 100 l, in a nutrient medium containing, g / l; baker's yeast extract - 5.0; hydrolyzate of casein sulfuric acid - 10.0: D - glucose -25 - 60; ammonium sulfate - 3.0; sodium chloride - 0.5; magnesium sulphate heptahydrate - 0.25; calcium chloride - 0.011; potassium phosphate disubstituted three-water - 1.5; monosubstituted potassium phosphate - 0.6; streptomycin sulfate - 0.15; tetracycline hydrochloride - 0.05; tap water up to 1 l, under the following conditions: the volume of the nutrient medium is 100 l; temperature ~ 28.5 ± 0.5 o C; pH value - 6.8-7.0 pH; the concentration of dissolved oxygen is not less than 20%; the rotation speed of the mixing device is 700 rpm
Значение водородного показателя регулируют подачей аммиачной воды. Сразу после засева и далее каждый час берут пробу культуральной жидкости для определения водородного показателя, оптической плотности, удельной скорости роста и микроскопии. Оптическую плотность измеряют при длине волны 540 нм. The value of the hydrogen index is regulated by the supply of ammonia water. Immediately after seeding and further, a culture fluid sample is taken every hour to determine the hydrogen index, optical density, specific growth rate, and microscopy. The optical density is measured at a wavelength of 540 nm.
Через час после достижения максимальной скорости роста при температуре 28,5±0,5oC температуру культуральной жидкости снижают до 25oC, после достижения максимальной скорости роста при Т=25oC температуру культуральной жидкости снижают до 20oC. Процесс заканчивают через 15-2O мин после стабилизации водородного показателя.One hour after reaching the maximum growth rate at a temperature of 28.5 ± 0.5 o C, the temperature of the culture fluid is reduced to 25 o C, after reaching the maximum growth rate at T = 25 o C, the temperature of the culture fluid is reduced to 20 o C. The process ends 15-2O min after stabilization of the hydrogen index.
Для длительного поддержания высокой концентрации глюкозы, по результатам анализа, ведут дробную подачу питательной среды с содержанием глюкозы 80 г/л (далее - среда ПС-80). To maintain a high glucose concentration for a long time, according to the analysis results, a fractional supply of a nutrient medium with a glucose content of 80 g / l is carried out (hereinafter - PS-80 medium).
Новыми признаками способа по сравнению с прототипом являются:
- повышение содержания глюкозы до 25-60 г/л, позволяющее более полно утилизировать аминокислоты питательной среды и увеличить выход белка со свойствами лейкоцитарного интерферона человека альфа-2 в 3,3 раза по сравнению с прототипом (табл.2);
- дробная подача питательной среды с содержанием глюкозы 80 г/л, позволяющая длительное время удерживать высокую удельную скорость роста биомассы и увеличить выход целевого белка в 5,9 раза по сравнению с прототипом (табл. 3);
- ступенчатое снижение температуры, позволяющее увеличить выход биомассы (фиг. 1, 2), и, следовательно, целевого продукта.New features of the method compared to the prototype are:
- increase in glucose up to 25-60 g / l, allowing more fully utilize the amino acids of the nutrient medium and increase the yield of protein with the properties of human leukocyte interferon alpha-2 by 3.3 times compared with the prototype (table 2);
- fractional supply of a nutrient medium with a glucose content of 80 g / l, which allows for a long time to maintain a high specific growth rate of biomass and increase the yield of the target protein 5.9 times in comparison with the prototype (table. 3);
- stepwise decrease in temperature, which allows to increase the yield of biomass (Fig. 1, 2), and, therefore, the target product.
Техническим результатом использования новых признаков является повышение выхода и стабилизация интерферона альфа-2. The technical result of the use of new features is to increase the output and stabilization of interferon alpha-2.
Указанная совокупность признаков экспериментально установлена авторами, неизвестна из литературных источников и, следовательно, предлагаемое техническое решение соответствует критериям изобретения "новизна" и "изобретательский уровень". The specified set of features is experimentally established by the authors, is unknown from the literature and, therefore, the proposed technical solution meets the criteria of the invention of "novelty" and "inventive step".
Перечень приведенных графиков:
Фиг. 1 - влияние снижения температуры культуральной жидкости в конце процесса на удельную скорость роста биомассы бактерий Ps.putida: а - изменение удельной скорости роста биомассы во времени;
б - изменение температуры культуральной жидкости во времени.List of charts:
FIG. 1 - the effect of lowering the temperature of the culture fluid at the end of the process on the specific growth rate of the biomass of bacteria Ps.putida: a - change in the specific growth rate of the biomass over time;
b - the change in temperature of the culture fluid over time.
Фиг. 2 - влияние снижения температуры культуральной жидкости в конце процесса на удельную скорость роста биомассы бактерий Ps.putida: а - изменение удельной скорости роста биомассы во времени;
б - изменение температуры культуральной жидкости во времени.FIG. 2 - the effect of reducing the temperature of the culture fluid at the end of the process on the specific growth rate of the biomass of bacteria Ps.putida: a - change in the specific growth rate of the biomass over time;
b - the change in temperature of the culture fluid over time.
Фиг. 3 - влияние дробной подачи питательной среды ПС-80 на удельную скорость роста биомассы бактерий Рs, putida. Стрелками указаны моменты подачи ПС-80. FIG. 3 - the effect of fractional supply of PS-80 nutrient medium on the specific growth rate of the biomass of bacteria Ps, putida. The arrows indicate the moments of submission PS-80.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами. The invention is illustrated by the following examples.
Пример 1. Посевной материал для промышленного ферментера выращивают в лабораторном ферментере вместимостью 5 л. Готовят LB -среду с антибиотиками: 150 мг/л стрептомицина и 50 мг/л тетрациклина. Для приготовления питательной среды используют водопроводную воду, очищенную от механических и органических примесей методом ультрафильтрации на аппаратах разделительных с диаметром пор 5 микрон (например, ультрафильтрационный волоконный аппарат НПО "Химволокно"). Стерилизуют питательную среду известным методом стерилизующей фильтрации (например, используя фильтры фирмы "Millipor"). Example 1. Seed for an industrial fermenter is grown in a laboratory fermenter with a capacity of 5 l. Prepare an LB medium with antibiotics: 150 mg / L streptomycin and 50 mg / L tetracycline. To prepare the nutrient medium, tap water is used, purified from mechanical and organic impurities by ultrafiltration on separation devices with a pore diameter of 5 microns (for example, the ultrafiltration fiber apparatus of NPO Khimvolokno). The medium is sterilized using a known sterilizing filtration method (for example, using Millipor filters).
Лабораторный ферментер со стерильной питательной средой засевают рекомбинантными бактериями Pseudomonas putida, выращенными на агаризованной LB-среде. Объем питательной среды 3 л. Культивирование ведут при перемешивании и аэрации в течение 15-17 ч. Воздух подают из расчета 1±0,1 л/мин на литр питательной среды, скорость вращения перемешивающего устройства 250 об/мин, начальное значение водородного показателя среды 7,0-7,2 pH и далее не регулируют. A laboratory fermenter with a sterile growth medium is seeded with recombinant bacteria Pseudomonas putida grown on agarized LB medium. The volume of the nutrient medium 3 l. The cultivation is carried out with stirring and aeration for 15-17 hours. Air is supplied at a rate of 1 ± 0.1 l / min per liter of nutrient medium, the rotation speed of the mixing device is 250 rpm, the initial value of the pH of the medium is 7.0-7, 2 pH and further do not regulate.
Питательную среду для промышленного ферментера готовят на водопроводной воде, очищенной от механических и органических примесей методом ультрафильтрации на аппаратах разделительных с диаметром пор 5 мкм и стерилизуют методом стерилизующей ультрафильтрации. Состав питательной среды (ПС-40), г/л: экстракт пекарских дрожжей - 5,0; гидролизат казеина сернокислотный - 10,0; Д-глюкоза - 40,0; сернокислый аммоний - 3,0; натрий хлористый - 0,5; магний сернокислый семиводный - 0,25; кальций хлористый - 0,011; калий фосфорнокислый двузамещенный трехводный - 1,5; калий фосфорнокислый однозамещенный - 0,6; стрептомицина сульфат - 0,15; тетрациклина гидрохлорид - 0,05; вода водопроводная до 1 л. Выращенный инокулят вводят в промышленный ферментер со стерильной питательной средой. Культивирование ведут при следующих условиях: объем питательной среды - 100 л; температура - 28,5±0,5oC; водородный показатель - 6,8-7,0 pH; концентрация растворенного кислорода не менее 20%.: скорость вращения перемешивающего устройства - 700 об/мин. Значение водородного показателя регулируют подачей аммиачной воды. Сразу после засева и далее каждый час берут пробу культуральной жидкости для определения водородного показателя, оптической плотности, удельной скорости роста и микроскопии. Оптическую плотность измеряют при длине волны 540 нм.The nutrient medium for an industrial fermenter is prepared on tap water purified from mechanical and organic impurities by ultrafiltration on separation apparatus with a pore diameter of 5 μm and sterilized by sterilizing ultrafiltration. The composition of the nutrient medium (PS-40), g / l: baker's yeast extract - 5.0; hydrolyzate of casein sulfuric acid - 10.0; D-glucose - 40.0; ammonium sulfate - 3.0; sodium chloride - 0.5; magnesium sulphate heptahydrate - 0.25; calcium chloride - 0.011; potassium phosphate disubstituted three-water - 1.5; monosubstituted potassium phosphate - 0.6; streptomycin sulfate - 0.15; tetracycline hydrochloride - 0.05; tap water up to 1 liter. The grown inoculum is introduced into a commercial fermenter with a sterile growth medium. Cultivation is carried out under the following conditions: the volume of the nutrient medium is 100 l; temperature - 28.5 ± 0.5 o C; pH value - 6.8-7.0 pH; the concentration of dissolved oxygen is not less than 20% .: the rotation speed of the mixing device is 700 rpm. The value of the hydrogen index is regulated by the supply of ammonia water. Immediately after seeding and further, a culture fluid sample is taken every hour to determine the pH, optical density, specific growth rate, and microscopy. The optical density is measured at a wavelength of 540 nm.
Через час после достижения максимальной скорости роста при температуре 28±0,5oC температуру культуральной жидкости снижают до 25oC. При этом повышается, либо остается на прежнем уровне удельная скорость роста (фиг. 1,2). Через час после достижения максимальной скорости роста при T=25oC температуру культуральной жидкости до 20oC. Процесс заканчивают через 15-20 мин после стабилизации водородного показателя.One hour after reaching the maximum growth rate at a temperature of 28 ± 0.5 o C, the temperature of the culture fluid is reduced to 25 o C. At the same time, the specific growth rate rises or remains at the same level (Fig. 1.2). One hour after reaching the maximum growth rate at T = 25 o C, the temperature of the culture fluid to 20 o C. The process is completed 15-20 minutes after stabilization of the hydrogen index.
Накопление полипептида со свойствами интерферона альфа-2 человека при этом составляет 8,12•106 ME/мл культуральной жидкости с сохранением стабильности целевого белка. Приведено среднее значение по результатам 32 ферментаций.The accumulation of a polypeptide with the properties of human interferon alpha-2 is 8.12 • 10 6 ME / ml of culture fluid while maintaining the stability of the target protein. The average value for the results of 32 fermentations is given.
Пример 2. Дальнейшего увеличения выхода по целевому белку достигают культивированием в промышленном ферментере с дробной подачей питательной среды. Способ осуществляют следующим образом. Готовят питательную среду ПС-40, питательную среду ПС-80, отличающуюся от ПС-40 удвоенным содержанием Д-глюкозы и готовят посевной материал, как описано в примере 1. Посевной материал вводят в промышленный ферментер с 30 л питательной среды ПС-40 и культивируют при следующих условиях: температура 28,5±0,5oC; водородный показатель 6,8-7,0 pH; концентрация растворенного кислорода не менее 20%; скорость вращения перемешивающего устройства 700 об/мин.Example 2. A further increase in the yield of the target protein is achieved by cultivation in an industrial fermenter with a fractional supply of a nutrient medium. The method is as follows. Prepare PS-40 nutrient medium, PS-80 nutrient medium different from PS-40 in doubled D-glucose content and prepare seed material as described in Example 1. The seed material is introduced into an industrial fermenter with 30 l of PS-40 nutrient medium and cultivated under the following conditions: temperature 28.5 ± 0.5 o C; pH 6.8-7.0; the concentration of dissolved oxygen is not less than 20%; stirring device rotation speed of 700 rpm
Значение водородного показателя регулируют подачей аммиачной воды. Сразу после внесения посевного материала и далее каждый час берут пробу культуральной жидкости для определения водородного показателя, оптической плотности, удельной скорости роста, концентрации глюкозы и микроскопии. Оптическую плотность измеряют при длине волны 540 нм. The value of the hydrogen index is regulated by the supply of ammonia water. Immediately after making the seed, and then every hour, a sample of the culture fluid is taken to determine the hydrogen index, optical density, specific growth rate, glucose concentration and microscopy. The optical density is measured at a wavelength of 540 nm.
Концентрацию глюкозы определяют глюкозооксидазным методом (Тест-система "Новоглюк", производство "Вектор-Бест"). По результатам анализа добавляют питательную среду ПС-80 из расчета 30-45 г/л глюкозы в конечном объеме. Культивирование в таких условиях обеспечивает сохранение высокой удельной скорости роста в течение длительного времени (фиг. 3). Конечный объем культуральной жидкости - 100 л. The glucose concentration is determined by the glucose oxidase method (Test system "Novoglyuk", production "Vector-Best"). According to the analysis results, PS-80 nutrient medium is added at the rate of 30-45 g / l glucose in the final volume. Cultivation under such conditions ensures the preservation of a high specific growth rate for a long time (Fig. 3). The final volume of the culture fluid is 100 l.
После снижения удельной скорости роста при температуре 28,5±0,5oC температуру культуральной жидкости снижают до 25oC. При этом увеличивается либо сохраняется на прежнем уровне удельная скорость роста. Через час после достижения максимальной скорости роста при температуре 25oC, температуру культуральной жидкости снижают до 20oC. Процесс заканчивают через 15-20 мин после стабилизации водородного показателя.After reducing the specific growth rate at a temperature of 28.5 ± 0.5 o C, the temperature of the culture fluid is reduced to 25 o C. At the same time, the specific growth rate increases or remains at the same level. One hour after reaching the maximum growth rate at a temperature of 25 o C, the temperature of the culture fluid is reduced to 20 o C. The process is completed 15-20 minutes after stabilization of the hydrogen index.
Накопление полипептида со свойствами альфа-2 интерферона человека при этом составляет 1,45•107МЕ/мл с сохранением стабильности целевого белка. Сравнительный анализ результатов, полученных при культивировании по способу-прототипу и предлагаемому способу, приведен в табл. 3.The accumulation of a polypeptide with the properties of alpha-2 human interferon is 1.45 • 10 7 IU / ml while maintaining the stability of the target protein. A comparative analysis of the results obtained during cultivation by the prototype method and the proposed method are given in table. 3.
Таким образом, видно, что промышленное культивирование по предлагаемому способу позволяет при несущественных дополнительных затратах повысить выход человеческого рекомбинантного интерферона альфа-2 в 3,3-5,9 раза по сравнению с культивированием по способу-прототипу. Thus, it is seen that industrial cultivation according to the proposed method allows for an insignificant additional cost to increase the yield of human recombinant interferon alpha-2 in 3.3-5.9 times compared with cultivation according to the prototype method.
Используемая литература. Used Books.
1. Авторское свидетельство СССР N 1364343, кл. C 12 N 15/00. Способ получения человеческого лейкоцитарного интерферона альфа-2. 1. Copyright certificate of the USSR N 1364343, cl. C 12 N 15/00. The method of obtaining human leukocyte interferon alpha-2.
2. Патент Российской Федерации N 1616143, кл. C 12 N 15/21. Способ получения человеческого лейкоцитарного интерферона альфа-2. 2. Patent of the Russian Federation N 1616143, cl. C 12 N 15/21. The method of obtaining human leukocyte interferon alpha-2.
3. Авторское свидетельство СССР N 1712416, кл. C 12 N 15/00. Способ получения человеческого лейкоцитарного интерферона альфа-2 рекомбинантными бактериями Pseudomonas species. 3. Copyright certificate of the USSR N 1712416, cl. C 12 N 15/00. A method for producing human leukocyte interferon alpha-2 by recombinant bacteria Pseudomonas species.
4. Аэрация и перемешивание в процессах культивирования микроорганизмов. Обзор. Бирюков В.В., Кузьмина Л.М. 1984, ВНИИСЭНТИ. 4. Aeration and mixing in the processes of cultivation of microorganisms. Overview. Biryukov V.V., Kuzmina L.M. 1984, VNIISENTI.
Claims (2)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU97112593A RU2142508C1 (en) | 1997-07-23 | 1997-07-23 | Method of industrial producing polypeptide showing biological activity of human leukocyte interferon alpha-2 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU97112593A RU2142508C1 (en) | 1997-07-23 | 1997-07-23 | Method of industrial producing polypeptide showing biological activity of human leukocyte interferon alpha-2 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU97112593A RU97112593A (en) | 1999-06-20 |
| RU2142508C1 true RU2142508C1 (en) | 1999-12-10 |
Family
ID=20195586
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU97112593A RU2142508C1 (en) | 1997-07-23 | 1997-07-23 | Method of industrial producing polypeptide showing biological activity of human leukocyte interferon alpha-2 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2142508C1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2225722C1 (en) * | 2002-07-11 | 2004-03-20 | Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов | Method for preparing human interferon |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2213240B2 (en) * | 1972-03-18 | 1977-07-14 | Behnngwerke AG, 3550 Marburg | MEDIUM FOR THE PREPARATION OF MYCOPLASMS |
| SU1364343A1 (en) * | 1984-07-13 | 1988-01-07 | Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов | Method of producing manъs leukocytic interferon alfa-2 |
| SU1712416A1 (en) * | 1989-02-08 | 1992-02-15 | Всесоюзный научно-исследовательский институт прикладной энзимологии | Method for preparation of human leukocyte interferon alpha-1 by recombinant bacteria pseudomonas species |
-
1997
- 1997-07-23 RU RU97112593A patent/RU2142508C1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2213240B2 (en) * | 1972-03-18 | 1977-07-14 | Behnngwerke AG, 3550 Marburg | MEDIUM FOR THE PREPARATION OF MYCOPLASMS |
| SU1364343A1 (en) * | 1984-07-13 | 1988-01-07 | Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов | Method of producing manъs leukocytic interferon alfa-2 |
| SU1712416A1 (en) * | 1989-02-08 | 1992-02-15 | Всесоюзный научно-исследовательский институт прикладной энзимологии | Method for preparation of human leukocyte interferon alpha-1 by recombinant bacteria pseudomonas species |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2225722C1 (en) * | 2002-07-11 | 2004-03-20 | Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов | Method for preparing human interferon |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Fuchs et al. | Scale-up of dialysis fermentation for high cell density cultivation of Escherichia coli | |
| SU943282A1 (en) | Process for producing l-treonine | |
| GB1567899A (en) | Ev method of in vitro biosynthesis of hormones particularly insulin | |
| JPS6394984A (en) | High yield production of methane by culture of methanobacterium thermoautotrophycum or methane producing bacteria having similar physiological growth characteristics | |
| Sato et al. | Animal cell cultivation for production of biological substances with a novel perfusion culture apparatus | |
| RU2142508C1 (en) | Method of industrial producing polypeptide showing biological activity of human leukocyte interferon alpha-2 | |
| RU2118366C1 (en) | Method of industrial producing the human leukocyte interferon-alpha-2 | |
| RU2085212C1 (en) | Method of preparing the common brucellosis antigen for pa, pck and pdck | |
| Nilsson et al. | [35] Entrapment of animal cells | |
| Li et al. | A single-use, scalable perfusion bioreactor system | |
| RU2053294C1 (en) | Method of cultivation of bifidobacteria | |
| JP2001521760A (en) | Method for producing L-carnitine | |
| SU671738A3 (en) | Method of obtaining biomass of microorganisms | |
| SU904325A1 (en) | Method of producing l-treonin | |
| RU2053292C1 (en) | Strain of bacterium alcaligenes eutrophus - a producer of protein biomass | |
| JPS5944036B2 (en) | Microbial culture method | |
| RU2088258C1 (en) | Method of preparing vaccine for leptospirosis control in animals | |
| JPS62111693A (en) | Production of l-amino acid from alpha-ketocarboxilic acid byfermentation | |
| SU1449579A1 (en) | Nutrient medium for growing arthrobacter luteus as producer of restrictase alu1 | |
| SU1555359A1 (en) | Strain of cultivated cells of china hamster - producer of erythropoetyn of man | |
| RU2215033C2 (en) | Method for preparing concentrate of bacterial cells in production of anti-plague vaccines | |
| GB2104914A (en) | Process for manufacturing alcohol by fermentation | |
| RU2052502C1 (en) | Method of diphtheria toxin preparing | |
| SU1206306A1 (en) | Pseudomonas species m 35 strain - producer of l-tryptophan on ethanol | |
| RU2107098C1 (en) | Method of preparing high-deuterated nucleosides and nucleotides |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PC43 | Official registration of the transfer of the exclusive right without contract for inventions |
Effective date: 20120320 |
|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20160724 |