RU2032895C1 - Жидкокристаллический биодатчик для определения биологически активных веществ - Google Patents
Жидкокристаллический биодатчик для определения биологически активных веществ Download PDFInfo
- Publication number
- RU2032895C1 RU2032895C1 SU4745034A RU2032895C1 RU 2032895 C1 RU2032895 C1 RU 2032895C1 SU 4745034 A SU4745034 A SU 4745034A RU 2032895 C1 RU2032895 C1 RU 2032895C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- dna
- molecules
- solution
- stellin
- liquid
- Prior art date
Links
- 239000004973 liquid crystal related substance Substances 0.000 title claims description 29
- 239000013543 active substance Substances 0.000 title claims description 7
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims abstract description 13
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 35
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 5
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 abstract description 8
- 239000002245 particle Substances 0.000 abstract description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 229940088623 biologically active substance Drugs 0.000 abstract 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 30
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 23
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 18
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 18
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 18
- 238000001142 circular dichroism spectrum Methods 0.000 description 12
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 11
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 11
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 11
- APLOVDLHSFJDEJ-TWOJEVFSSA-N (2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-1-[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-aminopropanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-(1H-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]acetyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]acetyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoic acid Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](Cc1cnc[nH]1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O APLOVDLHSFJDEJ-TWOJEVFSSA-N 0.000 description 10
- 108010053629 Acipenser gueldenstaedtii protamine B Proteins 0.000 description 10
- 238000000034 method Methods 0.000 description 10
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 9
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 9
- 230000002547 anomalous effect Effects 0.000 description 8
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 8
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 8
- 238000002983 circular dichroism Methods 0.000 description 6
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 230000003098 cholesteric effect Effects 0.000 description 4
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 4
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004986 Cholesteric liquid crystals (ChLC) Substances 0.000 description 3
- 108010059712 Pronase Proteins 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 3
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 3
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 3
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108010051033 Stellin Proteins 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 108010027597 alpha-chymotrypsin Proteins 0.000 description 2
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 238000000870 ultraviolet spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 241000881711 Acipenser sturio Species 0.000 description 1
- 108020003591 B-Form DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010007568 Protamines Proteins 0.000 description 1
- 102000007327 Protamines Human genes 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 229940122618 Trypsin inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 101710162629 Trypsin inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 238000002441 X-ray diffraction Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- MUCZHBLJLSDCSD-UHFFFAOYSA-N diisopropyl fluorophosphate Chemical compound CC(C)OP(F)(=O)OC(C)C MUCZHBLJLSDCSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 229960005051 fluostigmine Drugs 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 210000002149 gonad Anatomy 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000002535 lyotropic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000399 optical microscopy Methods 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 229940048914 protamine Drugs 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 239000012085 test solution Substances 0.000 description 1
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к средствам для определения биологически активных веществ и может найти применение в области медицинской техники, а также молекулярной фармакологии. Предложен датчик, представляющий собой частицы дисперсной лиотропной жидкокристаллической фазы, сформированной из молекул комплекса ДНК - субстрат определяемого БАВ, распределенные в водно-солевом растворе полимера. 8 ил.
Description
Изобретение относится к медицинской технике, биотехнологии и фармацевтической промышленности.
Изобретение может быт использовано в области медицинской и клинической биохимии, а также молекулярной фармакологии при исследовании биологически активных веществ (БАВ) и препаратов, "мишенью", которых являются природные и синтетические соединения, образующие сшивки между двухцепочечными линейными молекулами ДНК.
Большинство существующих методов определения БАВ, в частности ферментов, основано на измерении их активности с использованием либо природных, либо синтетических субстратов. Количественная оценка продуктов расщепления, а, следовательно, и пропорциональной им концентрации фермента, производится, как правило, при помощи оптического метода (спектрофотометрия) [1]
Несмотря на свою простоту, такой подход к определению ферментов не позволяет достигнуть высокой чувствительности. При помощи оптического метода удается достоверно определить количество ферментов, не превышающее 10-6 г [2]
Другой способ определения ферментов это использование радиоактивных субстратов. Однако здесь возникает ряд трудностей, связанных с нестабильностью радиоактивной метки, радиационным расщеплением субстрата или фермента и их инактивацией, необходимостью работы высококвалифицированного персонала и отсутствием высокочувствительных счетчиков радиоактивности.
Несмотря на свою простоту, такой подход к определению ферментов не позволяет достигнуть высокой чувствительности. При помощи оптического метода удается достоверно определить количество ферментов, не превышающее 10-6 г [2]
Другой способ определения ферментов это использование радиоактивных субстратов. Однако здесь возникает ряд трудностей, связанных с нестабильностью радиоактивной метки, радиационным расщеплением субстрата или фермента и их инактивацией, необходимостью работы высококвалифицированного персонала и отсутствием высокочувствительных счетчиков радиоактивности.
Чувствительность определения ферментов можно повысить до 10-8 г, используя иммунохимический метод [3]
Однако и этот способ имеет ряд ограничений, определяемых его дороговизной и трудоемкостью, а также необходимостью в высококвалифицированном персонале. Кроме того, данные иммунохимического определения затрудняют вывод о том, имеет ли автор дело с активной формой фермента или произошла его инактивация. Это означает, что при определении наличия в среде БАВ, в частности ферментов, актуальной является задача по созданию простых и высокочувствительных методов, основанных на других принципах.
Однако и этот способ имеет ряд ограничений, определяемых его дороговизной и трудоемкостью, а также необходимостью в высококвалифицированном персонале. Кроме того, данные иммунохимического определения затрудняют вывод о том, имеет ли автор дело с активной формой фермента или произошла его инактивация. Это означает, что при определении наличия в среде БАВ, в частности ферментов, актуальной является задача по созданию простых и высокочувствительных методов, основанных на других принципах.
Известно, что двухцепочечные молекулы ДНК низкой молекулярной массы (1 х 106) образуют дисперсные жидкокристаллические фазы, представляющие собой упорядоченный ансамбль молекул ДНК, который имеет микроскопический размер (0,3-1,0 мкм) [4]
Жидкие кристаллы ДНК имеют ряд отличительных особенностей. К ним относятся: во-первых, высокая плотность упаковки и упорядоченный характер укладки молекул ДНК в жидких кристаллах, практически совпадающие с аналогичными параметрами, характерными для ДНК в составе биологических объектов; во-вторых, высокая лабильность пространственной структуры жидких кристаллов в ответ на изменение внешних условий и, наконец, аномальная оптическая активность, наблюдаемая при образовании жидких кристалллов ДНК холестерического типа, которая проявляется, в частности, в наличии интенсивной полосы в спектре кругового дихроизма (КД), расположенной в области поглощения азотистых оснований ДНК ( λ ≈260 нм). Амплитуда этой полосы может в десятки и сотни раз превышать амплитуду полосы в спектре КД, обусловленную молекулярной оптической активностью, характерной для исходных линейных молекул ДНК.
Жидкие кристаллы ДНК имеют ряд отличительных особенностей. К ним относятся: во-первых, высокая плотность упаковки и упорядоченный характер укладки молекул ДНК в жидких кристаллах, практически совпадающие с аналогичными параметрами, характерными для ДНК в составе биологических объектов; во-вторых, высокая лабильность пространственной структуры жидких кристаллов в ответ на изменение внешних условий и, наконец, аномальная оптическая активность, наблюдаемая при образовании жидких кристалллов ДНК холестерического типа, которая проявляется, в частности, в наличии интенсивной полосы в спектре кругового дихроизма (КД), расположенной в области поглощения азотистых оснований ДНК ( λ ≈260 нм). Амплитуда этой полосы может в десятки и сотни раз превышать амплитуду полосы в спектре КД, обусловленную молекулярной оптической активностью, характерной для исходных линейных молекул ДНК.
Взаимодействие некоторых природных при синтетических соединений с молекулами ДНК, сопровождающееся образованием не только комплексов с ДНК, но и сшивок между этими молекулами, не нарушает способности молекул ДНК к образованию дисперсной фазы в условиях фазового исключения [5] В составе частиц образующейся фазы молекулы ДНК по-прежнему упорядочены, однако в этом случае свойства частиц могут отличаться от свойств частиц дисперсной холестерической фазы, формируемой в этих же условиях исходными молекулами ДНК. В частности, дисперсные фазы комплексов могут не иметь аномальной оптической активности. Это означает, что гидролиз соединений, образующих сшивки между молекулами ДНК, вызываемый в контролируемых условиях ферментации или действием некоторых физических факторов, может привести к восстановлению структуры холестерического жидкого кристалла, которая характерна для исходных двухцепочечных ДНК. При этом процесс восстановления холестерической структуры жидкого кристалла будет сопровождаться появлением аномальной оптической активности. Следовательно, аномальная оптическая активность жидких кристаллов ДНК может быть использована в качестве нового критерия при определении наличия ферментов, БАВ или физических факторов, вызывающих гидролиз молекул природных или синтетических веществ, образующих сшивки между ДНК.
Предлагается новый биодатчик, обладающий высокой чувствительностью и позволяющий быстро определять БАВ, вызывающие гидролиз молекул, образующих сшивки между ДНК.
Для этого осуществляют формирование жидких кристаллов микроскопического размера из молекул комплекса ДНК-природное соединение. Отличительная особенность предлагаемого датчика состоит в том, что жидкие кристаллы сформированы из молекул комплекса ДНК-природное соединение таким образом и в таких условиях, что их аномальная оптическая активность, регистрируемая в ответ на расщепление природного соединения под действием фермента, выступает в качестве индикатора перестроения структуры жидкого кристалла.
Предлагаемый биодатчик представляет собой частицы лиотропной дисперсно жидкокристаллической фазы, сформированной из комплекса ДНК-природное или синтетическое соединение в водно-солевом растворе полимера, и помешенные в оптическую кювету.
Схема предлагаемого биодатчика показана на фиг. 1, где 1 молекулы полимера, в водно-солевом растворе которого формируются жидкие кристаллы комплексов ДНК-стеллин В; 2 молекулы ДНК, образующие жидкие кристаллы (стрелки на правой части рисунка отражают наличие макроскопической спиральной закрутки слоев из молекул ДНК, образующих холестерический жидкий кристалл); 3 молекулы стеллина В, образующие сшивки между молекулами ДНК; 4 фрагменты молекул стеллина в после их ферментативного расщепления трипсином (Е).
Принцип действия датчика, состоит в том, что сначала из молекул ДНК и природного соединения формируют комплекс, затем из комплекса ДНК-природное соединение формируют дисперсную жидкокристаллическую фазу и расщепляют молекулы природного соединения в составе комплексов ДНК-природное соединение, образующих жидкие кристаллы, при помощи протеолотического фермента. В результате действия фермента сшивки между молекулами ДНК, образованные молекулами природного соединения, разрушаются и сами жидкие кристаллы переходят из оптически неактивного в оптически активное состояние. Принцип действия датчика показан на схеме А, где приводится структура молекулярного устройства (биодатчика), сконструированного на основе жидких кpисталлов двухцепочечных молекул ДНК, сшитых стеллином В. Приведенные конкретные параметры биодатчика установлены в результате рентгенографического анализа жидких кристаллов комплекса ДНК-стеллин В.
Изменение аномальной оптической активности, в частности спектров ДНК, наблюдаемое при перестроении структуры жидкого кристалла, позволяет не только детектировать наличие фермента в исследуемом растворе, но и открывает возможность для определения его типа, класса или группы по характеру наблюдаемых изменений.
П р и м е р 1. Приготовление исходных растворов.
1.1. Навеску NaCl (17,53 г) помещают в мерную колбу (N 1000 мл); в эту же колбу помещают навески NaH2PO4 ˙ H2O (1,315 г) и Na2HPO4 ˙ 12H2O (14,51 г), добавляют дистиллированную воду, растворяя вещества, и доводят объем до 1000 мл (Раствор 1.1).
1.2. Препарат ДНК молок осетровых рыб растворяют в растворе 1.1, дополнительно очищают от примесей, деполимеризуют (УЗ-дезинтегратор УЗДН-1 У4.2, частота 35 кГц, время обработки 1 мин, 4оС) и диализуют против раствора 1.1 для удаления низкомолекулярных примесей (Раствор 1.2).
Оптическая плотность раствора 1.2 при λ= 260 нм составляет 0,8 оптич.ед.
1.3 Препарат протамина (стеллин В) из гонад (50 мг) растворяют в 25 мл раствора 1.1 (Раствор 1.3).
1.4. 1 мг препарата трипсина растворяют в 10 мл раствора 1.1 (Раствор 1.4).
1.5. 0,1 мл раствора 1.4 помещают в мерную колбу (V 100 мл) и доводят объем до метки раствором 1.1 (раствор 1.5).
1.6. Навеску синтетического инертного, нейтрального и не поглощающего в УФ-области полимера (34 г), помещают в мерную колбу на 100 мл и добавляя раствор 1.1, доводят объем до метки (раствор 1.6).
П р и м е р 2. Получение комплекса ДНК-стеллин В.
2.1. К 10 мл раствора 1.2 при постоянном перемешивании добавляют 1 мл раствора 1.3. Таким способом получают раствор комплекса ДНК-стеллин В, в котором степень нейтрализации отрицательно заряженных групп ДНК положительно заряженными боковыми радикалами стеллина В составляет ≈ 0,6. (Раствор 2.1).
2.2. Контролируют свойства полученного комплекса при помощи оптических методов (УФ-спектроскопия, круговой дихроизм, оптическое вращение).
На фиг. 2 показаны спектры кругового дихроизма (КД).
Сопоставление кривых 1 и 2 на фиг. 2 показывает, что спектр КД водно-солевого раствора комплекса ДНК-стеллин В (кривая 2, r 0,6) практически не отличается от спектра КД, характерного для водно-солевого раствора исходной, линейной В-формы ДНК (кривая 1).
П р и м е р 3. Получение жидких кристаллов комплекса ДНК-стеллин В в водно-солевом растворе полимера.
3.1. Смешивают равные объемы растворов 1.6 и 2.1, интенсивно перемешивают полученную смесь и оставляют ее на 2 часа при комнатной температуре.
3.2. Контролируют свойства полученного жидкого кристалла при помощи оптических методов (УФ-спектроскопия, круговой дихроизм или оптическое вращение).
На фиг. 3 изображены спектры, КД жидкокристаллической дисперсии, сформированной в водно-солевом растворе полимера из молекул комплексам ДНК-стеллин В (r ≈0,6) до (кривая 1) и после (кривая 2) обработки ее трипсином (концентрация полимера 170 мг/мл; ионная сила раствора 0,15. Отсутствие аномальной оптической активности в полосе поглощения азотистых оснований ДНК свидетельствует об образовании в результате наличия сшивок между молекулами ДНК оптически неактивной жидкокристаллической фазы.
П р и м е р 4. Гидролиз трипсином молекул стеллина В в составе комплексов ДНК-стеллин В, образующих частицы дисперсной жидкокристаллической фазы в водно-солевом растворе полимера (10-6 г трипсина).
4.1. Раствор 3.1 инкубируют 10 мин при 37оС и добавляют 10 мкм раствора 1.4. Гидролиз проводят при 37оС.
На фиг. 4, 5 в качестве примера приведена кинематическая кривая нарастания аномальной оптической активности при λ275 нм в спектре КД жидкокристаллической дисперсии комплекса ДНК-стеллин В (r 0,6) после добавления трипсина (10-6 г фиг. 4; 10-9 г фиг. 5). Появление аномальной оптической активности в спектре КД жидкокристаллической дисперсии, сформированной по п. 3.1, свидетельствует о гидролизе молекул стеллина В, образующих сшивки между молекулами ДНК, трипсином, сопровождающимся перестройкой ее структуры, и приводящей к образованию жидкокристаллической фазы холестерического типа (ср. кривые 1 и 2 на фиг. 3).
П р и м е р 5. Гидролиз трипсином молекул стеллина В в составе комплексов ДНК-стеллин В, образующих частицы дисперсной жидкокристаллической фазы в водно-солевом растворе полимера (10-9 г трипсина).
5.1. Раствор 3.1 инкубируют 10 мин при 37оС и добавляют 10 мкл раствора 1.5. Гидролиз проводят при 37оС.
В полном соответствии с данными, приведенными на фиг. 3 и 4, в спектре КД также появляется аномальная оптическая активность; однако в отличие от случая п. 4.1 максимальный оптический эффект достигается уже не через 2, а приблизительно через 30-40 мин (см. данные фиг. 4 и 5).
Следует отметить, что при добавлении ингибитора трипсина диизопропилфторфосфата к растворам, приготовленным по п.п. 4 и 5, интенсивная отрицательная полоса в спектре КД не появляется. Этот факт показывает, что полоса в спектре КД появляется только в тех случаях, когда молекулы стеллина В в составе комплексов ДНК-стеллин В гидролизуются трипсином.
П р и м е р 6. Оптические текстуры тонких слоев жидких кристаллов, формируемых в водно-солевом растворе полимера из исходных молекул ДНК и их комплексов со стеллином В.
6.1. Препараты тонких слоев жидких кристаллов готовили по стандартной методике [4]
Текстура тонкого слоя ( ≈20 мкм) жидкого кристалла, сформированного из молекул комплекса ДНК-стеллин В, наблюдаемая в поляризованном свете, по своему внешнему виду напоминает закристаллизованную поликристаллическую массу; такого рода текстуры жидких кристаллов полимеров искусственного и биологического происхождения относятся к "неспецифическому" типу.
Текстура тонкого слоя ( ≈20 мкм) жидкого кристалла, сформированного из молекул комплекса ДНК-стеллин В, наблюдаемая в поляризованном свете, по своему внешнему виду напоминает закристаллизованную поликристаллическую массу; такого рода текстуры жидких кристаллов полимеров искусственного и биологического происхождения относятся к "неспецифическому" типу.
Гидролиз трипсином молекул стеллина В, образующих сшивки между молекулами ДНК, сопровождается перестроением структуры жидкого кристалла. Текстура характеризуется периодическим чередованием темных и светлых полос. Эта текстура известна по названием текстуры "отпечатков пальцев"; она характерна для холестерических жидких кристаллов, образованных низкомолекулярными соединениями, а также полимерами синтетического и биологического происхождения [7] Следовательно, результаты оптической микроскопии полностью подтверждают вывод о перестройке структуры жидкого кристалла комплекса ДНК-стеллин В, сделанный на основании измерений аномальной оптической активности.
П р и м е р 7. Биодатчик, приготовленный по примеру 3 в растворе 1.1, содержащем 0,04 М трис НСl (рН 8,0) и 0,001 М СаCl2, был обработан по примеру 4 протеолитическим ферментом папаином.
Концентрация используемого фермента показана на фиг. 6.
На фиг. 7 показало изменение во времени амплитуды отрицательной полосы при λ 275 нм в спектре КД жидкокристаллической дисперсии комплекса ДНК-стеллин В (r 0,6) после добавления проназы Р (А) и α -химотрипсина (Б). Кривые нарастания аномальной полосы в спектре КД свидетельствуют о том, что по мере расщепления молекул стеллина В ферментом происходит изменение характера упаковки молекул ДНК, составляющих основу биодатчика. Этот результат означает, что биодатчик "срабатывает" при наличии папаина в среде.
П р и м е р 8. Биодатчик, приготовленный по примеру 3 в растворе 1.1, содержащем 0,04 М трис НСl (рН 8,0) и 0,001 М CaCl2, был обработан по примеру 4 протеолитическим ферментом проназой Р.
Концентрация используемого фермента указана на фиг. 7А. Объяснение наблюдаемых кривых аналогично примеру 7.
Биодатчик, приготовленный по примеру 3 в растворе 1.1, содержащем 0,04 М трис НСl (рН 8,0) и 0,001 М СаСl2, был обработан по примеру 4 протеолитическим ферментом α -химотрипсином.
Концентрация используемого фермента указана на фиг. 7Б. Объяснение наблюдаемых кривых аналогично примеру 7.
Фиг. 6 и 7 показывают, что присутствие протеолитических ферментов в среде быстро и просто определяется по "срабатыванию" биодатчика, т.е. по факту появления аномальной полосы в спектре КД. Более того, как показывает фиг. 8, приведенная в качестве примера для проназы Р, имеются простые координаты, пользуясь которыми можно определять не только факт наличия протеолитических ферментов, но и их концентрацию в анализируемой среде.
Claims (1)
- ЖИДКОКРИСТАЛЛИЧЕСКИЙ БИОДАТЧИК ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ (БАВ), предоставляющий собой дисперсную фазу из линейных двухцепочных молекул ДНК, сшитых молекулами субстрата для определяемого БАВ, распределенную в водно-полимерном матриксе.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SU4745034 RU2032895C1 (ru) | 1989-07-18 | 1989-07-18 | Жидкокристаллический биодатчик для определения биологически активных веществ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SU4745034 RU2032895C1 (ru) | 1989-07-18 | 1989-07-18 | Жидкокристаллический биодатчик для определения биологически активных веществ |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2032895C1 true RU2032895C1 (ru) | 1995-04-10 |
Family
ID=21472517
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SU4745034 RU2032895C1 (ru) | 1989-07-18 | 1989-07-18 | Жидкокристаллический биодатчик для определения биологически активных веществ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2032895C1 (ru) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998022804A1 (fr) * | 1996-11-15 | 1998-05-28 | Institut Molekulyarnoi Biologii Imeni V.A.Engelgardta Rossiiskoi Akademii Nauk | Methode et dispositif de detection d'une substance biologiquement active dans un liquide a analyser |
| RU2139933C1 (ru) * | 1998-11-26 | 1999-10-20 | Институт молекулярной биологии им.В.А.Энгельгардта РАН | Молекулярная конструкция на основе жидкокристаллической дисперсии нуклеиновой кислоты как интегральный биодатчик и способ ее создания |
| RU2440575C1 (ru) * | 2010-08-23 | 2012-01-20 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Новые Энергетические Технологии" | Способ определения физиологических концентраций гепарина в анализируемых жидких пробах |
-
1989
- 1989-07-18 RU SU4745034 patent/RU2032895C1/ru active
Non-Patent Citations (7)
| Title |
|---|
| 1. Современные методы в биохимии. Под ред. В.Н.Ореховича. М.: Медицина, 1968, с.372. * |
| 2. Методы практической биохимии. Под ред. Б.Уильямса, К.Уильсона. М.: Мир, 1978, 256 с. * |
| 3. Практическая биохимия белка Под ред. А.Дарби. М.: Мир, 1989, 624 с. * |
| 4. Yevdokimov Yu.M., Skuridin S.G., Salyanov V.J., Liguid Cryst., 1988, vol.3, n.11, p.1443-1459. * |
| 5. Скуридин С.Г., Кадыков В.А., Шашков В.С. и др. Молекулярная биология, 1978, т.12, N 2, с.413-419. * |
| 6. Евдокимов Ю.М., Скуридин С.Г., Акименко Н.М. Высокомолекулярные соединения (А), 1984, т.26, N 11, с.2408-2410. * |
| 7. livolant F. Eur. j.Cell Biol., 1984, vol.33, no.2, p.300-311. * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998022804A1 (fr) * | 1996-11-15 | 1998-05-28 | Institut Molekulyarnoi Biologii Imeni V.A.Engelgardta Rossiiskoi Akademii Nauk | Methode et dispositif de detection d'une substance biologiquement active dans un liquide a analyser |
| US6246470B1 (en) | 1996-11-15 | 2001-06-12 | Institut Molekulyarnoi Biologi Imeni V.A. Engelgardita Rossiiskoi Akademii Nauk | Method for determination of a biologically active substance in an analyzed liquid and device for its realization |
| RU2139933C1 (ru) * | 1998-11-26 | 1999-10-20 | Институт молекулярной биологии им.В.А.Энгельгардта РАН | Молекулярная конструкция на основе жидкокристаллической дисперсии нуклеиновой кислоты как интегральный биодатчик и способ ее создания |
| RU2440575C1 (ru) * | 2010-08-23 | 2012-01-20 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Новые Энергетические Технологии" | Способ определения физиологических концентраций гепарина в анализируемых жидких пробах |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Desai et al. | Microtubule polymerization dynamics | |
| Price et al. | Lysozyme aggregation and solution properties studied using PGSE NMR diffusion measurements | |
| Melki et al. | Continuous monitoring of Pi release following nucleotide hydrolysis in actin or tubulin assembly using 2-amino-6-mercapto-7-methylpurine ribonucleoside and purine-nucleoside phosphorylase as an enzyme-linked assay | |
| Foord et al. | Effect of osmolytes on the exchange rates of backbone amide protons in proteins | |
| Bettelheim | On the optical anisotropy of lens fiber cells | |
| Kim et al. | Polymerization and in vitro motility properties of yeast actin: a comparison with rabbit skeletal α-actin | |
| Kim et al. | Intrastrand cross-linked actin between Gln-41 and Cys-374. III. Inhibition of motion and force generation with myosin | |
| RU2032895C1 (ru) | Жидкокристаллический биодатчик для определения биологически активных веществ | |
| Prochniewicz et al. | Perturbations of functional interactions with myosin induce long-range allosteric and cooperative structural changes in actin | |
| Lu et al. | Dynamic Features of Prothrombin Interaction with Phospholipid Vesicles of Different Size and Composition: Implications for Protein− Membrane Contact | |
| Gotterer et al. | Angular light-scattering studies on isolated mitochondria | |
| Hingane et al. | Inhibition of crude viper venom action by silver nanoparticles: a biophysical and biochemical study | |
| Wu et al. | A slight asymmetry in the transbilayer distribution of lysophosphatidylcholine alters the surface properties and poly (ethylene glycol)-mediated fusion of dipalmitoylphosphatidylcholine large unilamellar vesicles | |
| Tuhy et al. | Decarboxylation of bovine prothrombin fragment 1 and prothrombin | |
| Kasserra et al. | Transient-phase studies of a trypsin-catalyzed reaction | |
| Han et al. | INDUCTION OF DNA–PROTEIN CROSS‐LINKING IN CHINESE HAMSTER CELLS BY MONOCHROMATIC 365 AND 405 NM ULTRAVIOLET LIGHT | |
| Luo et al. | Characterization of sol− gel-encapsulated proteins using small-angle neutron scattering | |
| Davies et al. | Enzymic activities of Trichophyton rubrum and the chemotaxis of polymorphonuclear leucocytes | |
| Falk et al. | Formamide-induced dissociation and inactivation of Escherichia coli alkaline phosphatase. Metal-dependent reassociation and restoration of activity from isolated subunits | |
| D'Albis et al. | Chemical cross-linking of myosin. Disposition of the globular heads. | |
| Spilburg et al. | The physical state dependence of carboxypeptidase Aα and Aγ kinetics | |
| Hirai et al. | Observation of protein and lipid membrane structures in a model mimicking the molecular-crowding environment of cells using neutron scattering and cell debris | |
| Gadomski | A critical discussion of the analytical approach to the normal grain growth of materials in a D-dimensional space with some possible extensions to other growth phenomena | |
| Garcia et al. | Label-free, real-time phospholipase-A Isoform assay | |
| Sopkova et al. | Conformational flexibility of domain III of annexin V at membrane/water interfaces |