RU2032895C1 - Liquid-crystal biosensor for finding biologically active substances - Google Patents
Liquid-crystal biosensor for finding biologically active substances Download PDFInfo
- Publication number
- RU2032895C1 RU2032895C1 SU4745034A RU2032895C1 RU 2032895 C1 RU2032895 C1 RU 2032895C1 SU 4745034 A SU4745034 A SU 4745034A RU 2032895 C1 RU2032895 C1 RU 2032895C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- dna
- molecules
- solution
- stellin
- liquid
- Prior art date
Links
- 239000004973 liquid crystal related substance Substances 0.000 title claims description 29
- 239000013543 active substance Substances 0.000 title claims description 7
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims abstract description 13
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 35
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 5
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 abstract description 8
- 239000002245 particle Substances 0.000 abstract description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 229940088623 biologically active substance Drugs 0.000 abstract 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 30
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 23
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 18
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 18
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 18
- 238000001142 circular dichroism spectrum Methods 0.000 description 12
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 11
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 11
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 11
- APLOVDLHSFJDEJ-TWOJEVFSSA-N (2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-1-[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-aminopropanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-(1H-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]acetyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]acetyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoic acid Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](Cc1cnc[nH]1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O APLOVDLHSFJDEJ-TWOJEVFSSA-N 0.000 description 10
- 108010053629 Acipenser gueldenstaedtii protamine B Proteins 0.000 description 10
- 238000000034 method Methods 0.000 description 10
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 9
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 9
- 230000002547 anomalous effect Effects 0.000 description 8
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 8
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 8
- 238000002983 circular dichroism Methods 0.000 description 6
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 230000003098 cholesteric effect Effects 0.000 description 4
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 4
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004986 Cholesteric liquid crystals (ChLC) Substances 0.000 description 3
- 108010059712 Pronase Proteins 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 3
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 3
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 3
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108010051033 Stellin Proteins 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 108010027597 alpha-chymotrypsin Proteins 0.000 description 2
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 238000000870 ultraviolet spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 241000881711 Acipenser sturio Species 0.000 description 1
- 108020003591 B-Form DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010007568 Protamines Proteins 0.000 description 1
- 102000007327 Protamines Human genes 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 229940122618 Trypsin inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 101710162629 Trypsin inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 238000002441 X-ray diffraction Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- MUCZHBLJLSDCSD-UHFFFAOYSA-N diisopropyl fluorophosphate Chemical compound CC(C)OP(F)(=O)OC(C)C MUCZHBLJLSDCSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 229960005051 fluostigmine Drugs 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 210000002149 gonad Anatomy 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000002535 lyotropic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000399 optical microscopy Methods 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 229940048914 protamine Drugs 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 239000012085 test solution Substances 0.000 description 1
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к медицинской технике, биотехнологии и фармацевтической промышленности. The invention relates to medical equipment, biotechnology and the pharmaceutical industry.
Изобретение может быт использовано в области медицинской и клинической биохимии, а также молекулярной фармакологии при исследовании биологически активных веществ (БАВ) и препаратов, "мишенью", которых являются природные и синтетические соединения, образующие сшивки между двухцепочечными линейными молекулами ДНК. The invention can be used in the field of medical and clinical biochemistry, as well as molecular pharmacology in the study of biologically active substances (BAS) and drugs, the "target" of which are natural and synthetic compounds that form cross-links between double-stranded linear DNA molecules.
Большинство существующих методов определения БАВ, в частности ферментов, основано на измерении их активности с использованием либо природных, либо синтетических субстратов. Количественная оценка продуктов расщепления, а, следовательно, и пропорциональной им концентрации фермента, производится, как правило, при помощи оптического метода (спектрофотометрия) [1]
Несмотря на свою простоту, такой подход к определению ферментов не позволяет достигнуть высокой чувствительности. При помощи оптического метода удается достоверно определить количество ферментов, не превышающее 10-6 г [2]
Другой способ определения ферментов это использование радиоактивных субстратов. Однако здесь возникает ряд трудностей, связанных с нестабильностью радиоактивной метки, радиационным расщеплением субстрата или фермента и их инактивацией, необходимостью работы высококвалифицированного персонала и отсутствием высокочувствительных счетчиков радиоактивности.Most existing methods for the determination of biologically active substances, in particular enzymes, are based on measuring their activity using either natural or synthetic substrates. A quantitative assessment of the cleavage products, and, consequently, the concentration of the enzyme proportional to them, is usually carried out using the optical method (spectrophotometry) [1]
Despite its simplicity, this approach to the determination of enzymes does not allow to achieve high sensitivity. Using the optical method, it is possible to reliably determine the number of enzymes not exceeding 10 -6 g [2]
Another method for determining enzymes is the use of radioactive substrates. However, there are a number of difficulties associated with the instability of the radioactive label, the radiation degradation of the substrate or enzyme and their inactivation, the need for highly qualified personnel and the absence of highly sensitive radioactivity counters.
Чувствительность определения ферментов можно повысить до 10-8 г, используя иммунохимический метод [3]
Однако и этот способ имеет ряд ограничений, определяемых его дороговизной и трудоемкостью, а также необходимостью в высококвалифицированном персонале. Кроме того, данные иммунохимического определения затрудняют вывод о том, имеет ли автор дело с активной формой фермента или произошла его инактивация. Это означает, что при определении наличия в среде БАВ, в частности ферментов, актуальной является задача по созданию простых и высокочувствительных методов, основанных на других принципах.The sensitivity of the determination of enzymes can be increased to 10 -8 g using the immunochemical method [3]
However, this method also has a number of limitations, determined by its high cost and laboriousness, as well as the need for highly qualified personnel. In addition, the data of immunochemical determination make it difficult to conclude whether the author is dealing with the active form of the enzyme or if it was inactivated. This means that when determining the presence of biologically active substances, in particular enzymes, the urgent task is to create simple and highly sensitive methods based on other principles.
Известно, что двухцепочечные молекулы ДНК низкой молекулярной массы (1 х 106) образуют дисперсные жидкокристаллические фазы, представляющие собой упорядоченный ансамбль молекул ДНК, который имеет микроскопический размер (0,3-1,0 мкм) [4]
Жидкие кристаллы ДНК имеют ряд отличительных особенностей. К ним относятся: во-первых, высокая плотность упаковки и упорядоченный характер укладки молекул ДНК в жидких кристаллах, практически совпадающие с аналогичными параметрами, характерными для ДНК в составе биологических объектов; во-вторых, высокая лабильность пространственной структуры жидких кристаллов в ответ на изменение внешних условий и, наконец, аномальная оптическая активность, наблюдаемая при образовании жидких кристалллов ДНК холестерического типа, которая проявляется, в частности, в наличии интенсивной полосы в спектре кругового дихроизма (КД), расположенной в области поглощения азотистых оснований ДНК ( λ ≈260 нм). Амплитуда этой полосы может в десятки и сотни раз превышать амплитуду полосы в спектре КД, обусловленную молекулярной оптической активностью, характерной для исходных линейных молекул ДНК.It is known that double-stranded DNA molecules of low molecular weight (1 x 10 6 ) form dispersed liquid crystalline phases, which are an ordered ensemble of DNA molecules that has a microscopic size (0.3-1.0 μm) [4]
Liquid DNA crystals have a number of distinctive features. These include: firstly, the high packing density and the ordered nature of the packing of DNA molecules in liquid crystals, which practically coincide with similar parameters characteristic of DNA as a part of biological objects; secondly, the high lability of the spatial structure of liquid crystals in response to changes in external conditions and, finally, the anomalous optical activity observed during the formation of liquid crystals of cholesteric type DNA, which manifests itself, in particular, in the presence of an intense band in the spectrum of circular dichroism (CD) located in the region of absorption of nitrogenous DNA bases (λ ≈260 nm). The amplitude of this band can be tens or hundreds of times greater than the amplitude of the band in the CD spectrum, due to the molecular optical activity characteristic of the initial linear DNA molecules.
Взаимодействие некоторых природных при синтетических соединений с молекулами ДНК, сопровождающееся образованием не только комплексов с ДНК, но и сшивок между этими молекулами, не нарушает способности молекул ДНК к образованию дисперсной фазы в условиях фазового исключения [5] В составе частиц образующейся фазы молекулы ДНК по-прежнему упорядочены, однако в этом случае свойства частиц могут отличаться от свойств частиц дисперсной холестерической фазы, формируемой в этих же условиях исходными молекулами ДНК. В частности, дисперсные фазы комплексов могут не иметь аномальной оптической активности. Это означает, что гидролиз соединений, образующих сшивки между молекулами ДНК, вызываемый в контролируемых условиях ферментации или действием некоторых физических факторов, может привести к восстановлению структуры холестерического жидкого кристалла, которая характерна для исходных двухцепочечных ДНК. При этом процесс восстановления холестерической структуры жидкого кристалла будет сопровождаться появлением аномальной оптической активности. Следовательно, аномальная оптическая активность жидких кристаллов ДНК может быть использована в качестве нового критерия при определении наличия ферментов, БАВ или физических факторов, вызывающих гидролиз молекул природных или синтетических веществ, образующих сшивки между ДНК. The interaction of some natural synthetic compounds with DNA molecules, accompanied by the formation of not only complexes with DNA, but also cross-linking between these molecules, does not violate the ability of DNA molecules to form a dispersed phase under phase exclusion conditions [5] As part of the particles of the formed phase of the DNA molecule still ordered, however, in this case, the properties of the particles may differ from the properties of the particles of the dispersed cholesteric phase formed under the same conditions by the original DNA molecules. In particular, the dispersed phases of the complexes may not have abnormal optical activity. This means that the hydrolysis of compounds forming cross-links between DNA molecules, caused under controlled fermentation conditions or by the action of some physical factors, can lead to the restoration of the structure of the cholesteric liquid crystal, which is typical for the original double-stranded DNA. In this case, the process of restoring the cholesteric structure of the liquid crystal will be accompanied by the appearance of anomalous optical activity. Therefore, the abnormal optical activity of liquid DNA crystals can be used as a new criterion in determining the presence of enzymes, biologically active substances or physical factors causing hydrolysis of molecules of natural or synthetic substances that form cross-links between DNA.
Предлагается новый биодатчик, обладающий высокой чувствительностью и позволяющий быстро определять БАВ, вызывающие гидролиз молекул, образующих сшивки между ДНК. A new biosensor is proposed, which is highly sensitive and allows you to quickly determine biologically active substances that cause hydrolysis of molecules that form cross-links between DNA.
Для этого осуществляют формирование жидких кристаллов микроскопического размера из молекул комплекса ДНК-природное соединение. Отличительная особенность предлагаемого датчика состоит в том, что жидкие кристаллы сформированы из молекул комплекса ДНК-природное соединение таким образом и в таких условиях, что их аномальная оптическая активность, регистрируемая в ответ на расщепление природного соединения под действием фермента, выступает в качестве индикатора перестроения структуры жидкого кристалла. For this, liquid crystals of microscopic size are formed from molecules of the DNA-natural compound complex. A distinctive feature of the proposed sensor is that liquid crystals are formed from molecules of the DNA-natural compound complex in such a way and under such conditions that their anomalous optical activity, recorded in response to the cleavage of the natural compound by the enzyme, acts as an indicator of the restructuring of the liquid structure a crystal.
Предлагаемый биодатчик представляет собой частицы лиотропной дисперсно жидкокристаллической фазы, сформированной из комплекса ДНК-природное или синтетическое соединение в водно-солевом растворе полимера, и помешенные в оптическую кювету. The proposed biosensor is a particle of a lyotropic dispersed liquid crystalline phase formed from a DNA-natural or synthetic compound in a water-salt solution of a polymer and placed in an optical cuvette.
Схема предлагаемого биодатчика показана на фиг. 1, где 1 молекулы полимера, в водно-солевом растворе которого формируются жидкие кристаллы комплексов ДНК-стеллин В; 2 молекулы ДНК, образующие жидкие кристаллы (стрелки на правой части рисунка отражают наличие макроскопической спиральной закрутки слоев из молекул ДНК, образующих холестерический жидкий кристалл); 3 молекулы стеллина В, образующие сшивки между молекулами ДНК; 4 фрагменты молекул стеллина в после их ферментативного расщепления трипсином (Е). A diagram of the proposed biosensor is shown in FIG. 1, where 1 is a polymer molecule, in the water-salt solution of which liquid crystals of DNA-stellin B complexes are formed; 2 DNA molecules forming liquid crystals (arrows on the right side of the figure reflect the presence of macroscopic spiral twisting of layers of DNA molecules forming a cholesteric liquid crystal); 3 stellin B molecules forming cross-links between DNA molecules; 4 fragments of stellin molecules in after their enzymatic cleavage with trypsin (E).
Принцип действия датчика, состоит в том, что сначала из молекул ДНК и природного соединения формируют комплекс, затем из комплекса ДНК-природное соединение формируют дисперсную жидкокристаллическую фазу и расщепляют молекулы природного соединения в составе комплексов ДНК-природное соединение, образующих жидкие кристаллы, при помощи протеолотического фермента. В результате действия фермента сшивки между молекулами ДНК, образованные молекулами природного соединения, разрушаются и сами жидкие кристаллы переходят из оптически неактивного в оптически активное состояние. Принцип действия датчика показан на схеме А, где приводится структура молекулярного устройства (биодатчика), сконструированного на основе жидких кpисталлов двухцепочечных молекул ДНК, сшитых стеллином В. Приведенные конкретные параметры биодатчика установлены в результате рентгенографического анализа жидких кристаллов комплекса ДНК-стеллин В. The principle of the sensor’s operation is that first a complex is formed from DNA molecules and a natural compound, then a dispersed liquid crystalline phase is formed from a DNA-natural compound complex and the molecules of the natural compound in DNA-natural compound complexes forming liquid crystals are cleaved using proteolotic enzyme. As a result of the action of the cross-linking enzyme between the DNA molecules formed by the molecules of the natural compound, they are destroyed and the liquid crystals themselves pass from an optically inactive to an optically active state. The principle of operation of the sensor is shown in Scheme A, which shows the structure of a molecular device (biosensor) constructed on the basis of liquid crystals of double-stranded DNA molecules crosslinked by stellin B. The specific parameters of the biosensor are determined by X-ray analysis of liquid crystals of the DNA-stellin B complex.
Изменение аномальной оптической активности, в частности спектров ДНК, наблюдаемое при перестроении структуры жидкого кристалла, позволяет не только детектировать наличие фермента в исследуемом растворе, но и открывает возможность для определения его типа, класса или группы по характеру наблюдаемых изменений. The change in the anomalous optical activity, in particular, the DNA spectra, observed when the structure of the liquid crystal is rearranged, allows not only to detect the presence of the enzyme in the test solution, but also opens up the possibility of determining its type, class, or group by the nature of the observed changes.
П р и м е р 1. Приготовление исходных растворов. PRI me
1.1. Навеску NaCl (17,53 г) помещают в мерную колбу (N 1000 мл); в эту же колбу помещают навески NaH2PO4 ˙ H2O (1,315 г) и Na2HPO4 ˙ 12H2O (14,51 г), добавляют дистиллированную воду, растворяя вещества, и доводят объем до 1000 мл (Раствор 1.1).1.1. A portion of NaCl (17.53 g) is placed in a volumetric flask (N 1000 ml); Weighed portions of NaH 2 PO 4 ˙ H 2 O (1.315 g) and Na 2 HPO 4 ˙ 12H 2 O (14.51 g) were added to the same flask, distilled water was added to dissolve the substances, and the volume was adjusted to 1000 ml (Solution 1.1 )
1.2. Препарат ДНК молок осетровых рыб растворяют в растворе 1.1, дополнительно очищают от примесей, деполимеризуют (УЗ-дезинтегратор УЗДН-1 У4.2, частота 35 кГц, время обработки 1 мин, 4оС) и диализуют против раствора 1.1 для удаления низкомолекулярных примесей (Раствор 1.2).1.2. Preparation sturgeon sperm DNA was dissolved in a solution of 1.1 and further purified by impurities depolymerize (ultrasonic disintegrator UZDN-1 U4.2, frequency 35 kHz, the
Оптическая плотность раствора 1.2 при λ= 260 нм составляет 0,8 оптич.ед. The optical density of a solution of 1.2 at λ = 260 nm is 0.8 optical units.
1.3 Препарат протамина (стеллин В) из гонад (50 мг) растворяют в 25 мл раствора 1.1 (Раствор 1.3). 1.3 A protamine preparation (stellin B) from gonads (50 mg) is dissolved in 25 ml of solution 1.1 (Solution 1.3).
1.4. 1 мг препарата трипсина растворяют в 10 мл раствора 1.1 (Раствор 1.4). 1.4. 1 mg of trypsin is dissolved in 10 ml of solution 1.1 (Solution 1.4).
1.5. 0,1 мл раствора 1.4 помещают в мерную колбу (V 100 мл) и доводят объем до метки раствором 1.1 (раствор 1.5). 1.5. 0.1 ml of solution 1.4 was placed in a volumetric flask (
1.6. Навеску синтетического инертного, нейтрального и не поглощающего в УФ-области полимера (34 г), помещают в мерную колбу на 100 мл и добавляя раствор 1.1, доводят объем до метки (раствор 1.6). 1.6. A portion of a synthetic inert, neutral and non-absorbing polymer in the UV region (34 g) is placed in a 100 ml volumetric flask and adding solution 1.1, bring the volume to the mark (solution 1.6).
П р и м е р 2. Получение комплекса ДНК-стеллин В. PRI me
2.1. К 10 мл раствора 1.2 при постоянном перемешивании добавляют 1 мл раствора 1.3. Таким способом получают раствор комплекса ДНК-стеллин В, в котором степень нейтрализации отрицательно заряженных групп ДНК положительно заряженными боковыми радикалами стеллина В составляет ≈ 0,6. (Раствор 2.1). 2.1. To 10 ml of solution 1.2, with constant stirring, add 1 ml of solution 1.3. In this way, a solution of the DNA-stellin B complex is obtained in which the degree of neutralization of negatively charged DNA groups by positively charged side radicals of stellin B is ≈ 0.6. (Solution 2.1).
2.2. Контролируют свойства полученного комплекса при помощи оптических методов (УФ-спектроскопия, круговой дихроизм, оптическое вращение). 2.2. The properties of the resulting complex are controlled using optical methods (UV spectroscopy, circular dichroism, optical rotation).
На фиг. 2 показаны спектры кругового дихроизма (КД). In FIG. 2 shows the spectra of circular dichroism (CD).
Сопоставление кривых 1 и 2 на фиг. 2 показывает, что спектр КД водно-солевого раствора комплекса ДНК-стеллин В (кривая 2, r 0,6) практически не отличается от спектра КД, характерного для водно-солевого раствора исходной, линейной В-формы ДНК (кривая 1). A comparison of
П р и м е р 3. Получение жидких кристаллов комплекса ДНК-стеллин В в водно-солевом растворе полимера. PRI me
3.1. Смешивают равные объемы растворов 1.6 и 2.1, интенсивно перемешивают полученную смесь и оставляют ее на 2 часа при комнатной температуре. 3.1. Equal volumes of solutions 1.6 and 2.1 are mixed, the resulting mixture is stirred vigorously and left for 2 hours at room temperature.
3.2. Контролируют свойства полученного жидкого кристалла при помощи оптических методов (УФ-спектроскопия, круговой дихроизм или оптическое вращение). 3.2. The properties of the obtained liquid crystal are controlled using optical methods (UV spectroscopy, circular dichroism or optical rotation).
На фиг. 3 изображены спектры, КД жидкокристаллической дисперсии, сформированной в водно-солевом растворе полимера из молекул комплексам ДНК-стеллин В (r ≈0,6) до (кривая 1) и после (кривая 2) обработки ее трипсином (концентрация полимера 170 мг/мл; ионная сила раствора 0,15. Отсутствие аномальной оптической активности в полосе поглощения азотистых оснований ДНК свидетельствует об образовании в результате наличия сшивок между молекулами ДНК оптически неактивной жидкокристаллической фазы. In FIG. Figure 3 shows the CD spectra of a liquid crystal dispersion formed in a water-salt solution of a polymer from molecules of DNA-stellin B complexes (r ≈0.6) before (curve 1) and after (curve 2) treatment with trypsin (polymer concentration 170 mg / ml ; the ionic strength of the solution is 0.15. The absence of abnormal optical activity in the absorption band of nitrogenous DNA bases indicates the formation of an optically inactive liquid crystal phase as a result of cross-linking between the DNA molecules.
П р и м е р 4. Гидролиз трипсином молекул стеллина В в составе комплексов ДНК-стеллин В, образующих частицы дисперсной жидкокристаллической фазы в водно-солевом растворе полимера (10-6 г трипсина).Example 4. Trypsin hydrolysis of stellin B molecules in DNA-stellin B complexes forming particles of a dispersed liquid crystalline phase in a water-salt polymer solution (10 -6 g of trypsin).
4.1. Раствор 3.1 инкубируют 10 мин при 37оС и добавляют 10 мкм раствора 1.4. Гидролиз проводят при 37оС.4.1. A solution of 3.1 were incubated 10 min at 37 ° C and added a solution of 1.4 10 microns. Hydrolysis is carried out at 37 about C.
На фиг. 4, 5 в качестве примера приведена кинематическая кривая нарастания аномальной оптической активности при λ275 нм в спектре КД жидкокристаллической дисперсии комплекса ДНК-стеллин В (r 0,6) после добавления трипсина (10-6 г фиг. 4; 10-9 г фиг. 5). Появление аномальной оптической активности в спектре КД жидкокристаллической дисперсии, сформированной по п. 3.1, свидетельствует о гидролизе молекул стеллина В, образующих сшивки между молекулами ДНК, трипсином, сопровождающимся перестройкой ее структуры, и приводящей к образованию жидкокристаллической фазы холестерического типа (ср. кривые 1 и 2 на фиг. 3).In FIG. Figures 4 and 5 show, as an example, the kinematic curve of the increase in anomalous optical activity at λ275 nm in the CD spectrum of a liquid crystal dispersion of the DNA-stellin B complex (r 0.6) after the addition of trypsin (10 -6 g of Fig. 4; 10 -9 g of Fig. 5). The appearance of abnormal optical activity in the CD spectrum of a liquid crystal dispersion formed according to Section 3.1 indicates the hydrolysis of stellin B molecules that form crosslinks between DNA molecules, trypsin, accompanied by a rearrangement of its structure, and leading to the formation of a cholesteric type liquid crystal phase (cf.
П р и м е р 5. Гидролиз трипсином молекул стеллина В в составе комплексов ДНК-стеллин В, образующих частицы дисперсной жидкокристаллической фазы в водно-солевом растворе полимера (10-9 г трипсина).Example 5. Trypsin hydrolysis of stellin B molecules as part of DNA-stellin B complexes, forming particles of a dispersed liquid crystalline phase in a water-salt polymer solution (10 -9 g of trypsin).
5.1. Раствор 3.1 инкубируют 10 мин при 37оС и добавляют 10 мкл раствора 1.5. Гидролиз проводят при 37оС.5.1. A solution of 3.1 were incubated 10 min at 37 ° C and 10 .mu.l of the solution 1.5. Hydrolysis is carried out at 37 about C.
В полном соответствии с данными, приведенными на фиг. 3 и 4, в спектре КД также появляется аномальная оптическая активность; однако в отличие от случая п. 4.1 максимальный оптический эффект достигается уже не через 2, а приблизительно через 30-40 мин (см. данные фиг. 4 и 5). In full accordance with the data shown in FIG. 3 and 4, an abnormal optical activity also appears in the CD spectrum; however, in contrast to the case of clause 4.1, the maximum optical effect is achieved not after 2, but after about 30-40 minutes (see data in Figs. 4 and 5).
Следует отметить, что при добавлении ингибитора трипсина диизопропилфторфосфата к растворам, приготовленным по п.п. 4 и 5, интенсивная отрицательная полоса в спектре КД не появляется. Этот факт показывает, что полоса в спектре КД появляется только в тех случаях, когда молекулы стеллина В в составе комплексов ДНК-стеллин В гидролизуются трипсином. It should be noted that with the addition of a trypsin inhibitor diisopropyl fluorophosphate to solutions prepared according to 4 and 5, an intense negative band does not appear in the CD spectrum. This fact shows that a band in the CD spectrum appears only in those cases when the stellin B molecules in the DNA-stellin B complexes are hydrolyzed by trypsin.
П р и м е р 6. Оптические текстуры тонких слоев жидких кристаллов, формируемых в водно-солевом растворе полимера из исходных молекул ДНК и их комплексов со стеллином В. PRI me
6.1. Препараты тонких слоев жидких кристаллов готовили по стандартной методике [4]
Текстура тонкого слоя ( ≈20 мкм) жидкого кристалла, сформированного из молекул комплекса ДНК-стеллин В, наблюдаемая в поляризованном свете, по своему внешнему виду напоминает закристаллизованную поликристаллическую массу; такого рода текстуры жидких кристаллов полимеров искусственного и биологического происхождения относятся к "неспецифическому" типу.6.1. Preparations of thin layers of liquid crystals were prepared according to the standard method [4]
The texture of a thin layer (≈20 μm) of a liquid crystal formed from molecules of the DNA-stellin B complex, observed in polarized light, in its appearance resembles a crystallized polycrystalline mass; such textures of liquid crystals of polymers of artificial and biological origin are of a "non-specific" type.
Гидролиз трипсином молекул стеллина В, образующих сшивки между молекулами ДНК, сопровождается перестроением структуры жидкого кристалла. Текстура характеризуется периодическим чередованием темных и светлых полос. Эта текстура известна по названием текстуры "отпечатков пальцев"; она характерна для холестерических жидких кристаллов, образованных низкомолекулярными соединениями, а также полимерами синтетического и биологического происхождения [7] Следовательно, результаты оптической микроскопии полностью подтверждают вывод о перестройке структуры жидкого кристалла комплекса ДНК-стеллин В, сделанный на основании измерений аномальной оптической активности. Trypsin hydrolysis of stellin B molecules forming cross-links between DNA molecules is accompanied by a rearrangement of the liquid crystal structure. The texture is characterized by a periodic alternation of dark and light stripes. This texture is known as the fingerprint texture; it is characteristic of cholesteric liquid crystals formed by low molecular weight compounds, as well as polymers of synthetic and biological origin [7] Therefore, the results of optical microscopy fully confirm the conclusion about the reconstruction of the liquid crystal structure of the DNA-stellin B complex based on measurements of anomalous optical activity.
П р и м е р 7. Биодатчик, приготовленный по примеру 3 в растворе 1.1, содержащем 0,04 М трис НСl (рН 8,0) и 0,001 М СаCl2, был обработан по примеру 4 протеолитическим ферментом папаином.PRI me R 7. The biosensor prepared according to example 3 in a solution 1.1 containing 0.04 M Tris Hcl (pH 8.0) and 0.001 M CaCl 2 was treated in example 4 with the proteolytic enzyme papain.
Концентрация используемого фермента показана на фиг. 6. The concentration of the enzyme used is shown in FIG. 6.
На фиг. 7 показало изменение во времени амплитуды отрицательной полосы при λ 275 нм в спектре КД жидкокристаллической дисперсии комплекса ДНК-стеллин В (r 0,6) после добавления проназы Р (А) и α -химотрипсина (Б). Кривые нарастания аномальной полосы в спектре КД свидетельствуют о том, что по мере расщепления молекул стеллина В ферментом происходит изменение характера упаковки молекул ДНК, составляющих основу биодатчика. Этот результат означает, что биодатчик "срабатывает" при наличии папаина в среде. In FIG. 7 showed the time variation of the amplitude of the negative band at
П р и м е р 8. Биодатчик, приготовленный по примеру 3 в растворе 1.1, содержащем 0,04 М трис НСl (рН 8,0) и 0,001 М CaCl2, был обработан по примеру 4 протеолитическим ферментом проназой Р.PRI me
Концентрация используемого фермента указана на фиг. 7А. Объяснение наблюдаемых кривых аналогично примеру 7. The concentration of the enzyme used is indicated in FIG. 7A. The explanation of the observed curves is analogous to example 7.
Биодатчик, приготовленный по примеру 3 в растворе 1.1, содержащем 0,04 М трис НСl (рН 8,0) и 0,001 М СаСl2, был обработан по примеру 4 протеолитическим ферментом α -химотрипсином.The biosensor prepared in accordance with Example 3 in solution 1.1 containing 0.04 M Tris HCl (pH 8.0) and 0.001 M CaCl 2 was treated in Example 4 with the proteolytic enzyme α-chymotrypsin.
Концентрация используемого фермента указана на фиг. 7Б. Объяснение наблюдаемых кривых аналогично примеру 7. The concentration of the enzyme used is indicated in FIG. 7B. The explanation of the observed curves is analogous to example 7.
Фиг. 6 и 7 показывают, что присутствие протеолитических ферментов в среде быстро и просто определяется по "срабатыванию" биодатчика, т.е. по факту появления аномальной полосы в спектре КД. Более того, как показывает фиг. 8, приведенная в качестве примера для проназы Р, имеются простые координаты, пользуясь которыми можно определять не только факт наличия протеолитических ферментов, но и их концентрацию в анализируемой среде. FIG. 6 and 7 show that the presence of proteolytic enzymes in the medium is quickly and simply determined by the “actuation” of the biosensor, i.e. upon the appearance of an anomalous band in the CD spectrum. Moreover, as shown in FIG. 8, given as an example for pronase P, there are simple coordinates, using which it is possible to determine not only the fact of the presence of proteolytic enzymes, but also their concentration in the analyzed medium.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SU4745034 RU2032895C1 (en) | 1989-07-18 | 1989-07-18 | Liquid-crystal biosensor for finding biologically active substances |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SU4745034 RU2032895C1 (en) | 1989-07-18 | 1989-07-18 | Liquid-crystal biosensor for finding biologically active substances |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2032895C1 true RU2032895C1 (en) | 1995-04-10 |
Family
ID=21472517
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SU4745034 RU2032895C1 (en) | 1989-07-18 | 1989-07-18 | Liquid-crystal biosensor for finding biologically active substances |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2032895C1 (en) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998022804A1 (en) * | 1996-11-15 | 1998-05-28 | Institut Molekulyarnoi Biologii Imeni V.A.Engelgardta Rossiiskoi Akademii Nauk | Method for detecting a biologically active substance in a liquid to be analysed and device for realising the same |
| RU2139933C1 (en) * | 1998-11-26 | 1999-10-20 | Институт молекулярной биологии им.В.А.Энгельгардта РАН | Molecular structure based on liquid-crystal dispersion of nucleic acid as integrated biosensor and method of preparation thereof |
| RU2440575C1 (en) * | 2010-08-23 | 2012-01-20 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Новые Энергетические Технологии" | Method of determining physiological concentrations of heparin in analysed liquid samples |
-
1989
- 1989-07-18 RU SU4745034 patent/RU2032895C1/en active
Non-Patent Citations (7)
| Title |
|---|
| 1. Современные методы в биохимии. Под ред. В.Н.Ореховича. М.: Медицина, 1968, с.372. * |
| 2. Методы практической биохимии. Под ред. Б.Уильямса, К.Уильсона. М.: Мир, 1978, 256 с. * |
| 3. Практическая биохимия белка Под ред. А.Дарби. М.: Мир, 1989, 624 с. * |
| 4. Yevdokimov Yu.M., Skuridin S.G., Salyanov V.J., Liguid Cryst., 1988, vol.3, n.11, p.1443-1459. * |
| 5. Скуридин С.Г., Кадыков В.А., Шашков В.С. и др. Молекулярная биология, 1978, т.12, N 2, с.413-419. * |
| 6. Евдокимов Ю.М., Скуридин С.Г., Акименко Н.М. Высокомолекулярные соединения (А), 1984, т.26, N 11, с.2408-2410. * |
| 7. livolant F. Eur. j.Cell Biol., 1984, vol.33, no.2, p.300-311. * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998022804A1 (en) * | 1996-11-15 | 1998-05-28 | Institut Molekulyarnoi Biologii Imeni V.A.Engelgardta Rossiiskoi Akademii Nauk | Method for detecting a biologically active substance in a liquid to be analysed and device for realising the same |
| US6246470B1 (en) | 1996-11-15 | 2001-06-12 | Institut Molekulyarnoi Biologi Imeni V.A. Engelgardita Rossiiskoi Akademii Nauk | Method for determination of a biologically active substance in an analyzed liquid and device for its realization |
| RU2139933C1 (en) * | 1998-11-26 | 1999-10-20 | Институт молекулярной биологии им.В.А.Энгельгардта РАН | Molecular structure based on liquid-crystal dispersion of nucleic acid as integrated biosensor and method of preparation thereof |
| RU2440575C1 (en) * | 2010-08-23 | 2012-01-20 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Новые Энергетические Технологии" | Method of determining physiological concentrations of heparin in analysed liquid samples |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Desai et al. | Microtubule polymerization dynamics | |
| Price et al. | Lysozyme aggregation and solution properties studied using PGSE NMR diffusion measurements | |
| Foord et al. | Effect of osmolytes on the exchange rates of backbone amide protons in proteins | |
| Spilburg et al. | Kinetic properties of crystalline enzymes. Carboxypeptidase A | |
| Bettelheim | On the optical anisotropy of lens fiber cells | |
| Jansen et al. | Molecular packing structure of fibrin fibers resolved by X-ray scattering and molecular modeling | |
| Kim et al. | Polymerization and in vitro motility properties of yeast actin: a comparison with rabbit skeletal α-actin | |
| Kim et al. | Intrastrand cross-linked actin between Gln-41 and Cys-374. III. Inhibition of motion and force generation with myosin | |
| RU2032895C1 (en) | Liquid-crystal biosensor for finding biologically active substances | |
| Prochniewicz et al. | Perturbations of functional interactions with myosin induce long-range allosteric and cooperative structural changes in actin | |
| Gotterer et al. | Angular light-scattering studies on isolated mitochondria | |
| Hingane et al. | Inhibition of crude viper venom action by silver nanoparticles: a biophysical and biochemical study | |
| Wu et al. | A slight asymmetry in the transbilayer distribution of lysophosphatidylcholine alters the surface properties and poly (ethylene glycol)-mediated fusion of dipalmitoylphosphatidylcholine large unilamellar vesicles | |
| Tuhy et al. | Decarboxylation of bovine prothrombin fragment 1 and prothrombin | |
| Kasserra et al. | Transient-phase studies of a trypsin-catalyzed reaction | |
| Han et al. | INDUCTION OF DNA–PROTEIN CROSS‐LINKING IN CHINESE HAMSTER CELLS BY MONOCHROMATIC 365 AND 405 NM ULTRAVIOLET LIGHT | |
| Luo et al. | Characterization of sol− gel-encapsulated proteins using small-angle neutron scattering | |
| Davies et al. | Enzymic activities of Trichophyton rubrum and the chemotaxis of polymorphonuclear leucocytes | |
| Falk et al. | Formamide-induced dissociation and inactivation of Escherichia coli alkaline phosphatase. Metal-dependent reassociation and restoration of activity from isolated subunits | |
| D'Albis et al. | Chemical cross-linking of myosin. Disposition of the globular heads. | |
| Spilburg et al. | The physical state dependence of carboxypeptidase Aα and Aγ kinetics | |
| Hirai et al. | Observation of protein and lipid membrane structures in a model mimicking the molecular-crowding environment of cells using neutron scattering and cell debris | |
| Gadomski | A critical discussion of the analytical approach to the normal grain growth of materials in a D-dimensional space with some possible extensions to other growth phenomena | |
| Garcia et al. | Label-free, real-time phospholipase-A Isoform assay | |
| Sopkova et al. | Conformational flexibility of domain III of annexin V at membrane/water interfaces |