Claims (54)
1. Вектор для генной терапии на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса (rAAV), содержащий полинуклеотид, содержащий 5’-ИКП, экспрессирующую кассету и 3’-ИКП; и капсидный белок,1. A vector for gene therapy based on recombinant adeno-associated virus (rAAV), containing a polynucleotide containing a 5'-ICP, an expression cassette and a 3'-ICP; and capsid protein,
причем экспрессирующая кассета содержит трансген, кодирующий мембранный белок 2, ассоциированный с лизосомами (LAMP-2), или его функциональный вариант,wherein the expression cassette contains a transgene encoding lysosome-associated membrane protein 2 (LAMP-2), or a functional variant thereof,
причем экспрессирующая кассета фланкирована 5’-ИКП и 3’-ИКП, иwherein the expression cassette is flanked by 5'-IKP and 3'-IKP, and
при этом капсидный белок включает капсидный белок AAVrh.74 или его функциональный вариант.wherein the capsid protein includes the AAVrh.74 capsid protein or a functional variant thereof.
2. rAAV-вектор для генной терапии по п. 1, где LAMP-2 выбран из LAMP-2A, LAMP-2B и LAMP-2C.2. rAAV vector for gene therapy according to claim 1, where LAMP-2 is selected from LAMP-2A, LAMP-2B and LAMP-2C.
3. rAAV-вектор для генной терапии по п. 1, где указанный капсидный белок характеризуется по меньшей мере 95% идентичностью последовательности по отношению к аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 2–4.3. rAAV gene therapy vector according to claim 1, wherein said capsid protein has at least 95% sequence identity to an amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 2-4.
4. rAAV-вектор для генной терапии по любому из пп. 1–3, где каждый из 5’-ИКП и 3’-ИКП представляет собой 5’-ИКП AAV2 и 3’-ИКП AAV2 соответственно или их варианты.4. rAAV vector for gene therapy according to any one of paragraphs. 1-3, where each of the 5'-ICP and 3'-ICP is an AAV2 5'-ICP and an AAV2 3'-ICP, respectively, or variants thereof.
5. rAAV-вектор для генной терапии по любому из пп. 1–4, где указанный трансген является кодон-оптимизированным для экспрессии в клетке-хозяине человека;5. rAAV vector for gene therapy according to any one of paragraphs. 1-4, wherein said transgene is codon-optimized for expression in a human host cell;
экспрессирующая кассета содержит меньше сайтов CpG, чем SEQ ID NO: 6;the expression cassette contains fewer CpG sites than SEQ ID NO: 6;
экспрессирующая кассета содержит меньше скрытых сайтов сплайсинга, чем SEQ ID NO: 6;the expression cassette contains fewer cryptic splice sites than SEQ ID NO: 6;
экспрессирующая кассета кодирует меньше альтернативных открытых рамок считывания, чем SEQ ID NO: 6;the expression cassette encodes fewer alternative open reading frames than SEQ ID NO: 6;
и/или указанный трансген характеризуется по меньшей мере 95% идентичностью по отношению к последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 7–9.and/or said transgene has at least 95% identity to a sequence selected from SEQ ID NO: 7-9.
6. rAAV-вектор для генной терапии по любому из пп. 1–5, где экспрессирующая кассета содержит:6. rAAV vector for gene therapy according to any one of paragraphs. 1–5, where the expression cassette contains:
консенсусную оптимальную последовательность Козак, функционально связанную с трансгеном, причем указанная консенсусная оптимальная последовательность Козак содержит SEQ ID NO: 20;a consensus optimal Kozak sequence operably linked to the transgene, wherein said consensus optimal Kozak sequence comprises SEQ ID NO: 20;
полноразмерную полиA-последовательность, функционально связанную с трансгеном, причем указанная полноразмерная полиA-последовательность содержит SEQ ID NO: 26; и/илиa full-length polyA sequence operably linked to the transgene, wherein said full-length polyA sequence comprises SEQ ID NO: 26; and/or
не содержит стартового кодона в 5’-направлении от стартового кодона трансгена.does not contain a start codon in the 5' direction from the start codon of the transgene.
7. rAAV-вектор для генной терапии по любому из пп. 1–6, где экспрессирующая кассета содержит следующие функционально связанные элементы в направлении от 5’-конца к 3’-концу: первый инвертированный концевой повтор, энхансерную/промоторную область, интрон, консенсусную оптимальную последовательность Козак, трансген, 3’-нетранслируемую область, содержащую полноразмерную полиА-последовательность, и второй инвертированный концевой повтор, причем экспрессирующая кассета не содержит стартового кодона в 5’-направлении от стартового кодона трансгена.7. rAAV vector for gene therapy according to any one of paragraphs. 1-6, where the expression cassette contains the following functionally linked elements in the direction from the 5' end to the 3' end: first inverted terminal repeat, enhancer/promoter region, intron, consensus optimal Kozak sequence, transgene, 3' untranslated region, containing a full-length polyA sequence, and a second inverted terminal repeat, wherein the expression cassette does not contain a start codon in the 5' direction from the start codon of the transgene.
8. rAAV-вектор для генной терапии по п. 7, где энхансерная/промоторная область содержит:8. rAAV vector for gene therapy according to claim 7, where the enhancer/promoter region contains:
в направлении от 5’-конца к 3’-концу энхансер IE CMV и промотор бета-актина курицы, причем указанная энхансерная/промоторная область необязательно дополнительно содержит первый экзон и первый интрон гена бета-актина курицы и акцептор сплайсинга гена бета-глобина кролика; и/илиin a 5' to 3' direction, a CMV IE enhancer and a chicken beta-actin promoter, wherein said enhancer/promoter region optionally further comprises a first exon and a first intron of a chicken beta-actin gene and a rabbit beta-globin gene splice acceptor; and/or
тканеспецифичный промотор, способный опосредовать повышенную экспрессию в ткани сердечной и/или скелетной мышцы по сравнению с тканью печени.a tissue-specific promoter capable of mediating increased expression in cardiac and/or skeletal muscle tissue compared to liver tissue.
9. rAAV-вектор для генной терапии по любому из пп. 1–8, где экспрессирующая кассета характеризуется по меньшей мере 95% идентичностью по отношению к последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 10–12.9. rAAV vector for gene therapy according to any one of paragraphs. 1-8, wherein the expression cassette has at least 95% identity to a sequence selected from SEQ ID NO: 10-12.
10. Фармацевтическая композиция, содержащая rAAV-вектор для генной терапии по любому из пп. 1–9.10. Pharmaceutical composition containing rAAV vector for gene therapy according to any one of paragraphs. 1–9.
11. Способ лечения или профилактики болезни Данона или другого расстройства аутофагии у субъекта, нуждающегося в этом, предусматривающий введение субъекту rAAV-вектора для генной терапии по любому из пп. 1–9 или фармацевтической композиции по п. 10.11. A method of treating or preventing Danon disease or another autophagy disorder in a subject in need thereof, comprising administering to the subject an rAAV vector for gene therapy according to any one of claims. 1–9 or the pharmaceutical composition according to claim 10.
12. Способ по п. 11, отличающийся тем, что rAAV-вектор для генной терапии или фармацевтическую композицию вводят посредством пути, выбранного из группы, состоящей из внутривенного, внутриартериального, внутрисердечного, внутрикоронарного, внутримиокардиального, внутрипочечного, интрауретрального, эпидурального и внутримышечного введения.12. The method according to claim 11, characterized in that the rAAV gene therapy vector or pharmaceutical composition is administered by a route selected from the group consisting of intravenous, intraarterial, intracardiac, intracoronary, intramyocardial, intrarenal, intraurethral, epidural and intramuscular administration.
13. Способ по п. 11 или 12, отличающийся тем, что расстройство аутофагии выбрано из группы, состоящей из терминальной стадии сердечной недостаточности, инфаркта миокарда, токсических эффектов лекарственных средств, диабета, терминальной стадии почечной недостаточности и старения.13. The method of claim 11 or 12, wherein the autophagy disorder is selected from the group consisting of end-stage heart failure, myocardial infarction, drug toxicity, diabetes, end-stage renal disease and aging.
14. Способ по любому из пп. 11–13, отличающийся тем, что субъект представляет собой человека.14. Method according to any one of paragraphs. 11–13, characterized in that the subject is a human.
15. Способ по любому из пп. 11–14, отличающийся тем, что у субъекта проявляются симптомы болезни Данона или другого расстройства аутофагии;15. Method according to any one of paragraphs. 11-14, wherein the subject exhibits symptoms of Danon disease or another autophagy disorder;
субъект идентифицирован как характеризующийся пониженной или необнаруживаемой экспрессией эндогенного LAMP-2; и/илиthe subject is identified as having reduced or undetectable expression of endogenous LAMP-2; and/or
субъект идентифицирован по наличию мутантного гена LAMP-2.subject identified by the presence of a mutant LAMP-2 gene.
16. Способ по любому из пп. 11–15, отличающийся тем, что rAAV-вектор для генной терапии вводят в дозе от приблизительно 3⋅1012 в.г./кг до приблизительно 3⋅1014 в.г./кг.16. Method according to any one of paragraphs. 11–15, characterized in that the rAAV vector for gene therapy is administered at a dose of from approximately 3⋅10 12 vg/kg to approximately 3⋅10 14 vg/kg.
17. Способ по любому из пп. 11–16, отличающийся тем, что введение rAAV-вектора для генной терапии трансдуцирует одно или более из сердца, мышцы и печени;17. Method according to any one of paragraphs. 11-16, characterized in that the introduction of an rAAV vector for gene therapy transduces one or more of the heart, muscle and liver;
введение rAAV-вектора для генной терапии вызывает экспрессию мРНК LAMP2B в одном или более из сердца, мышцы и печени;administration of the rAAV gene therapy vector causes expression of LAMP2B mRNA in one or more of the heart, muscle and liver;
введение rAAV-вектора для генной терапии вызывает экспрессию белка LAMP2B в одном или более из сердца, мышцы и печени;administration of the rAAV gene therapy vector causes expression of the LAMP2B protein in one or more of the heart, muscle and liver;
введение rAAV-вектора для генной терапии вызывает инфекцию rAAV-вектором для генной терапии по меньшей мере приблизительно 10%, по меньшей мере приблизительно 20% или по меньшей мере приблизительно 30% клеток в одном или более из сердца, мышцы и печени;administration of the rAAV gene therapy vector causes the rAAV gene therapy vector to infect at least about 10%, at least about 20%, or at least about 30% of cells in one or more of the heart, muscle, and liver;
введение rAAV-вектора для генной терапии вызывает трансдукцию rAAV-вектора для генной терапии в половых железах в количестве менее чем 0,1 генома вектора (в.г.) на диплоидный геном;administration of the rAAV gene therapy vector causes transduction of the rAAV gene therapy vector in the gonads at an amount of less than 0.1 vector genome (vg) per diploid genome;
введение rAAV-вектора для генной терапии вызывает экспрессию мРНК LAMP2B в половых железах в количестве менее 2⋅104 копий мРНК на мкг общей РНК;administration of the rAAV vector for gene therapy causes expression of LAMP2B mRNA in the gonads in an amount of less than 2⋅10 4 copies of mRNA per μg of total RNA;
введение rAAV-вектора для генной терапии не вызывает экспрессии белка LAMP2B в головном мозге и/или половых железах; и/илиadministration of the rAAV vector for gene therapy does not induce LAMP2B protein expression in the brain and/or gonads; and/or
введение rAAV-вектора для генной терапии трансдуцирует и/или вызывает экспрессию трансгена на приблизительно том же уровне, что и введение вектора для генной терапии AAV9, содержащего такую же экспрессирующую кассету.administration of an rAAV gene therapy vector transduces and/or induces transgene expression at approximately the same level as administration of an AAV9 gene therapy vector containing the same expression cassette.
18. Способ доставки полинуклеотида LAMP-2, кодирующего белок LAMP-2, субъекту и/или экспрессии белка LAMP-2 у субъекта, предусматривающий введение субъекту rAAV-вектора для генной терапии по любому из пп. 1–9 или фармацевтической композиции по п. 10.18. A method of delivering a LAMP-2 polynucleotide encoding the LAMP-2 protein to a subject and/or expressing the LAMP-2 protein in a subject, comprising administering to the subject an rAAV vector for gene therapy according to any one of claims. 1–9 or the pharmaceutical composition according to claim 10.
19. Способ по п. 18, отличающийся тем, что rAAV-вектор для генной терапии или фармацевтическую композицию вводят посредством пути, выбранного из группы, состоящей из внутривенного, внутриартериального, внутрисердечного, внутрикоронарного, внутримиокардиального, внутрипочечного, интрауретрального, эпидурального и внутримышечного введения.19. The method of claim 18, wherein the rAAV gene therapy vector or pharmaceutical composition is administered by a route selected from the group consisting of intravenous, intraarterial, intracardiac, intracoronary, intramyocardial, intrarenal, intraurethral, epidural, and intramuscular administration.
20. Способ по п. 18 или 19, отличающийся тем, что субъект страдает или подвержен риску расстройства аутофагии, выбранного из группы, состоящей из болезни Данона, терминальной стадии сердечной недостаточности, инфаркта миокарда, токсических эффектов лекарственных средств, диабета, терминальной стадии почечной недостаточности и старения.20. The method according to claim 18 or 19, characterized in that the subject suffers from or is at risk of an autophagy disorder selected from the group consisting of Danon disease, end-stage heart failure, myocardial infarction, toxic effects of drugs, diabetes, end-stage renal failure and aging.
21. Способ по любому из пп. 18–20, отличающийся тем, что субъект представляет собой человека.21. Method according to any one of paragraphs. 18–20, characterized in that the subject is a human.
22. Способ по любому из пп. 18–21, отличающийся тем, что субъект испытывает симптомы расстройства аутофагии;22. Method according to any one of paragraphs. 18-21, characterized in that the subject experiences symptoms of an autophagy disorder;
субъект идентифицирован как характеризующийся пониженной или необнаруживаемой экспрессией эндогенного LAMP-2; и/илиthe subject is identified as having reduced or undetectable expression of endogenous LAMP-2; and/or
субъект идентифицирован по наличию мутантного гена LAMP-2.subject identified by the presence of a mutant LAMP-2 gene.
23. Способ по любому из пп. 18–21, отличающийся тем, что rAAV-вектор для генной терапии вводят в дозе от приблизительно 3⋅1012 в.г./кг до приблизительно 3⋅1014 в.г./кг, необязательно в дозе, составляющей от приблизительно 3⋅1012 в.г./кг до приблизительно 1,2⋅1013 в.г./кг или приблизительно 1,0⋅1013 в.г./кг.23. Method according to any one of paragraphs. 18-21, characterized in that the rAAV vector for gene therapy is administered at a dose of from about 3⋅10 12 vg/kg to about 3⋅10 14 vg/kg, optionally at a dose of from about 3 ⋅10 12 v.g./kg to approximately 1.2⋅10 13 v.g./kg or approximately 1.0⋅10 13 v.g./kg.
24. Способ по любому из пп. 18–23, отличающийся тем, что введение rAAV-вектора для генной терапии трансдуцирует одно или более из сердца, мышцы и печени;24. Method according to any one of paragraphs. 18-23, characterized in that the introduction of an rAAV vector for gene therapy transduces one or more of the heart, muscle and liver;
введение rAAV-вектора для генной терапии вызывает экспрессию мРНК LAMP2B в одном или более из сердца, мышцы и печени;administration of the rAAV gene therapy vector causes expression of LAMP2B mRNA in one or more of the heart, muscle and liver;
введение rAAV-вектора для генной терапии вызывает экспрессию белка LAMP2B в одном или более из сердца, мышцы и печени;administration of the rAAV gene therapy vector causes expression of the LAMP2B protein in one or more of the heart, muscle and liver;
введение rAAV-вектора для генной терапии вызывает инфекцию rAAV-вектором для генной терапии по меньшей мере приблизительно 10%, по меньшей мере приблизительно 20% или по меньшей мере приблизительно 30% клеток в одном или более из сердца, мышцы и печени;administration of the rAAV gene therapy vector causes the rAAV gene therapy vector to infect at least about 10%, at least about 20%, or at least about 30% of cells in one or more of the heart, muscle, and liver;
введение rAAV-вектора для генной терапии вызывает трансдукцию rAAV-вектора для генной терапии в половых железах в количестве менее чем 0,1 генома вектора (в.г.) на диплоидный геном;administration of the rAAV gene therapy vector causes transduction of the rAAV gene therapy vector in the gonads at an amount of less than 0.1 vector genome (vg) per diploid genome;
введение rAAV-вектора для генной терапии вызывает экспрессию мРНК LAMP2B в половых железах в количестве менее чем 2⋅104 копий мРНК на мкг общей РНК;administration of the rAAV vector for gene therapy causes expression of LAMP2B mRNA in the gonads in an amount of less than 2⋅10 4 copies of mRNA per μg of total RNA;
введение rAAV-вектора для генной терапии не вызывает экспрессии белка LAMP2B в головном мозге и/или половых железах; и/илиadministration of the rAAV vector for gene therapy does not induce LAMP2B protein expression in the brain and/or gonads; and/or
введение rAAV-вектора для генной терапии трансдуцирует и/или вызывает экспрессию трансгена на приблизительно том же уровне, что и введение вектора для генной терапии AAV9, содержащего ту же экспрессирующую кассету.administration of an rAAV gene therapy vector transduces and/or induces transgene expression at approximately the same level as administration of an AAV9 gene therapy vector containing the same expression cassette.