RU2016118518A

RU2016118518A - Противохламидийная вакцина и способ ее получения

Info

Publication number: RU2016118518A
Application number: RU2016118518A
Authority: RU
Inventors: Екатерина Андреевна Королева; Дмитрий Николаевич Щербинин; Наталья Викторовна Кобец; Максим Михайлович Шмаров; Наиля Ахатовна Зигангирова; Денис Юрьевич Логунов; Борис Савельевич Народицкий; Александр Леонидович Гинцбург
Priority date: 2016-05-12
Filing date: 2016-05-12
Publication date: 2017-11-16
Also published as: RU2676768C2

Claims

1. Комбинированная противохламидийная вакцина, состоящая из праймирующего и бустирующего компонентов, в которой в качестве праймирующего компонента используют рекомбинантный аденовирусный вектор на основе аденовируса человека пятого серотипа, экспрессирующий полноразмерный структурный белок CdsF системы секреции III типа хламидий, а в качестве бустирующего иммунный ответ компонента применяют эмульсию, содержащую рекомбинантный структурный белок rCdsF системы секреции III типа хламидий и комбинированный адъювант.

2. Вакцина по п. 1, которая основана на применении белков Chlamydia trachomatis.

3. Вакцина по п. 1, которая основана на применении белков Chlamydia trachomatis MoPn.

4. Способ создания вакцины по п. 1, включающий создание праймирующего компонента, заключающееся в получении в пермиссионной культуре клеток рекомбинантных аденовирусных частиц, сконструированных на основе аденовируса человека пятого серотипа с двумя удаленными областями ΔЕ1/ΔЕ3, и несущих под контролем индуцибельного промотора химерный ген, состоящий из N-концевого фрагмента маннозо-связывающего лектина, спейсера и гена полноразмерного антигена CdsF хламидий, которые слиты в единую рамку считывания и экспрессируются как единый белковый продукт; а также предусматривающий создание бустирующего компонента, содержащего рекомбинантный структурный белок rCdsF ССТТ хламидий и комбинированный адъювант, содержащий монофосфорил липид А - лиганд толл-подобного рецептора 4 типа и сквален.

5. Способ по п. 4, предусматривающий при создании вакцины по п. 2 конструирование экспрессионной кассеты на основе гена полноразмерного антигена СТ666 Chlamydia trachomatis.

6. Способ по п. 4, предусматривающий при создании вакцины, по п. 3 конструирование экспрессионной кассеты на основе гена полноразмерного антигена ТС_0037 Chlamydia trachomatis MoPn.

7. Способ по любому из пп. 4-6, в котором нуклеотидные последовательности химерного гена соединены между собой в следующем порядке: маннозо-связывающий лектин-спейсер-CdsF.

8. Способ по п. 7, в котором используется глицин-сериновый спейсер с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 2, при этом аминокислотная последовательность представлена SEQ ID NO: 5.

9. Способ по п. 6, в котором ген полноразмерного антигена ТС_0037 имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1, при этом аминокислотная последовательность белка представлена SEQ ID NO: 4.

10. Способ по любому из пп. 4-6, в котором маннозо-связывающий лектин имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 3, при этом аминокислотная последовательность белка представлена SEQ ID NO: 6.

11. Способ создания рекомбинантного белка хламидий для бустирующего компонента вакцины по п. 1, предусматривающий получение плазмиды путем клонирования в плазмидный вектор гена, кодирующего полноразмерный белок CdsF, содержащий метку из шести гистидинов, трансформирование полученной плазмидой клеток Е. coli с индукцией экспрессии рекомбинантного белка в них и очистку его.

12. Способ создания рекомбинантного белка СТ_666-Chlamydia trachomatis для бустирующего компонента вакцины по п. 2, предусматривающий получение плазмиды ct666-pET29b путем клонирования в плазмидный вектор pET29b гена, кодирующего полноразмерный белок СТ666, содержащий метку из шести гистидинов, транформирование полученной

плазмидой клеток Е. coli с индукцией экспрессии рекомбинантного белка в них и очистку его.

13. Способ создания рекомбинантного белка ТС_0037 Chlamydia trachomatis MoPn для бустирующего компонента вакцины по п. 3, предусматривающий получение плазмиды tc_0037-pET29b путем клонирования в плазмидный вектор pET29b гена, кодирующего полноразмерный белок ТС 0037, содержащий метку из шести гистидинов, трансформирование полученной плазмидой клеток E. coli с индукцией экспрессии рекомбинантного белка в них и очистку его.

14. Способ по п. 13, в котором ген, содержащий рекомбинантный структурный белок ТС_0037 Chlamydia trachomatis MoPn с шестью кодонами гистидина на С-конце, представлен нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 7 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 8.

15. Способ получения бустирующего компонента вакцины по п. 1, предусматривающий создание и получение рекомбинантного белка CdsF хламидий, очистку его с помощью аффинного сорбента в денатурирующих условиях, доведение фармацевтическим приемлемым буфером до нужной концентрации и приготовление наноэмульсии, состоящей из рекомбинантного структурного белка CdsF и комбинированного адьюванта.

16. Способ по п. 15, в котором в качестве комбинированного адьюванта используют монофосфорил липид А и сквален.

17. Способ получения праймирующего компонента вакцины по любому из пп. 1-3, предусматривающий создание рекомбинантного аденовируса на основе синтеза химерного гена, состоящего из N-концевой части маннозо-связывающего лектина, спейсера и гена антигена CdsF хламидий; получение плазмиды, несущей химерный ген, слитый в одну рамку считывания; ее субклонирование в челночный вектор pShuttle-CMV для получения плазмидных конструкций рекомбинантных аденовирусов человека 5 серотипа методом гомологичной рекомбинации в клетках E. coli с использованием системы AdEasy Adenovir Vector System; трансфекции клеток линии НЕК293 соответствующей плазмидной конструкцией; выращивание в культуре клеток рекомбинантных аденовирусных частиц; концентрирование и очистку этих частиц с помощью центрифугирования, ультрафильтрации и высокоэффективной жидкостной хроматографии; доведение фармацевтическим приемлемым буфером до нужной концентрации.

18. Вакцина по п. 1, содержащая на дозу:

- праймирующий компонент: рекомбинантный аденовирус Ad-MBL-CdsF в количестве 10⁸-10⁹ БОЕ, в фармацевтическим приемлемом буфере объемом 0,5 мл;

- бустирующий компонент: рекомбинантный белок rCdsF - 10-20 мкг, монофосфорил липид А - 50,0 мкг, сквален 10,0 мг, 0,5% Tween 80, в объеме 0,5-1 мл.

19. Праймирующий компонент по п. 18, содержащий в качестве фармацевтического приемлемого буфера раствор следующего состава: 10,0 mM TrisHCl, 75,0 mM MgCl₂, 5% сахароза, 0,05% полисорбат 80, 0,5% этанол, 100 мкм ЭДТА, рН=8,0.

20. Праймирующий компонент вакцины по п. 1 или 18 вводят предпочтительно интраназально, бустирующий компонент - подкожно.