RU2010123981A - Новый способ отделения и определения вирусной нагрузки в образце панкреатина - Google Patents

Abstract

1. Способ отделения вирусной нагрузки от образца панкреатина, заключающийся в том, что осуществляют следующие стадии, на которых: ! а) приготавливают жидкий опытный образец панкреатина, пригодный для центрифугирования, из образца панкреатина, не изменяя его вирусной нагрузки; ! б) подвергают по меньшей мере одну определенную часть опытного образца панкреатина, полученного на стадии а) способа, по меньшей мере одному низкоскоростному центрифугированию в условиях, в которых вирусы, характеризующиеся константами седиментации ≥120 S, не образуют дебрис; ! в) отбрасывают все твердые отложения, которые необязательно образуются на стадии б) способа во время низкоскоростного центрифугирования, и сохраняют супернатант опытного образца панкреатина; ! г) подвергают по меньшей мере одну определенную часть супернатанта опытного образца панкреатина, полученного на стадии в) способа, первому ультрацентрифугированию в среде со ступенчатым градиентом, где продолжительность первого ультрацентрифугирования и относительную центробежную силу для первого центрифугирования выбирают таким образом, чтобы вирусная нагрузка количественно транспортировалась из супернатанта опытного образца панкреатина в первую целевую фракцию, находящуюся выше пограничного слоя или в пограничном слое между расположенным сверху компонентом градиента с наименьшей концентрацией и расположенным снизу компонентом градиента со следующей более высокой концентрацией, и количественно выделяют первую целевую фракцию, необязательно включающую любой дебрис, присутствующий после центрифугирования, которая содержит вирусную нагрузку, из супернат�

Claims (21)

1. Способ отделения вирусной нагрузки от образца панкреатина, заключающийся в том, что осуществляют следующие стадии, на которых:

а) приготавливают жидкий опытный образец панкреатина, пригодный для центрифугирования, из образца панкреатина, не изменяя его вирусной нагрузки;

б) подвергают по меньшей мере одну определенную часть опытного образца панкреатина, полученного на стадии а) способа, по меньшей мере одному низкоскоростному центрифугированию в условиях, в которых вирусы, характеризующиеся константами седиментации ≥120 S, не образуют дебрис;

в) отбрасывают все твердые отложения, которые необязательно образуются на стадии б) способа во время низкоскоростного центрифугирования, и сохраняют супернатант опытного образца панкреатина;

г) подвергают по меньшей мере одну определенную часть супернатанта опытного образца панкреатина, полученного на стадии в) способа, первому ультрацентрифугированию в среде со ступенчатым градиентом, где продолжительность первого ультрацентрифугирования и относительную центробежную силу для первого центрифугирования выбирают таким образом, чтобы вирусная нагрузка количественно транспортировалась из супернатанта опытного образца панкреатина в первую целевую фракцию, находящуюся выше пограничного слоя или в пограничном слое между расположенным сверху компонентом градиента с наименьшей концентрацией и расположенным снизу компонентом градиента со следующей более высокой концентрацией, и количественно выделяют первую целевую фракцию, необязательно включающую любой дебрис, присутствующий после центрифугирования, которая содержит вирусную нагрузку, из супернатанта опытного образца панкреатина;

д) подвергают первую целевую фракцию, полученную на стадии г) способа, второму ультрацентрифугированию, где второе ультрацентрифугирование осуществляют при относительной центробежной силе, превышающей относительную центробежную силу при первом ультрацентрифугировании, в градиентной среде того же типа, который используют для первого ультрацентрифугирования, где градиентная среда представляет собой градиентную среду с более высокой концентрацией по сравнению с концентрацией компонента градиента с наименьшей концентрацией в первой целевой фракции, и

е) получают вторую целевую фракцию, содержащую вирусную нагрузку, в результате отбрасывания верхних 75 об.% или более жидкости верхнего слоя, соответствующего первой целевой фракции, и получают нижнюю фракцию, соответствующую нижним 25 об.% или менее жидкости верхнего слоя, и полный слой градиентной среды с более высокой концентрацией за исключением любого дебриса, который необязательно присутствует после центрифугирования.

2. Способ по п.1, в котором после осуществления стадии е) способа дополнительно осуществляют стадию ж) способа, на которой количественно определяют вирусную нагрузку в образце панкреатина путем определения титра вирусной инфекции во второй целевой фракции, содержащей вирусную нагрузку.

3. Способ по п.2, в котором перед осуществлением количественного определения вирусной нагрузки разведенную или неразведенную вторую целевую фракцию фильтруют через микрофильтр.

4. Способ по п.1, в котором на стадии а) способа приготавливают суспензию опытного образца панкреатина путем объединения образца панкреатина со средой для клеточной культуры, пригодной для линии клеток, которую применяют для культивирования подлежащего исследованию типа вируса, или с соляным раствором и с одним или несколькими антибиотиками.

5. Способ по п.4, в котором по меньшей мере одну из стадий а)-е) осуществляют при охлаждении до температуры 0-15°С.

6. Способ по п.1, в котором низкоскоростное центрифугирование на стадии б) способа в каждом случае осуществляют при относительной центробежной силе менее 15000×g.

7. Способ по п.1, в котором низкоскоростное центрифугирование на стадии б) способа в каждом случае осуществляют при относительной центробежной силе, составляющей 8000-15000×g.

8. Способ по п.1, в котором низкоскоростное центрифугирование на стадии б) способа осуществляют в течение по меньшей мере 5 мин.

9. Способ по п.1, в котором первое ультрацентрифугирование на стадии г) способа осуществляют в течение по меньшей мере 9 ч.

10. Способ по п.1, в котором первое ультрацентрифугирование на стадии г) способа осуществляют при относительной центробежной силе менее 150000×g.

11. Способ по п.1, в котором второе ультрацентрифугирование на стадии д) способа осуществляют в течение по меньшей мере 2 ч.

12. Способ по п.11, в котором второе ультрацентрифугирование на стадии г) способа осуществляют при относительной центробежной силе более 150000×g.

13. Способ по п.1, в котором среда со ступенчатым градиентом, которую применяют на стадии г) способа, представляет собой ступенчатый двухфазный градиент сахарозы.

14. Способ по п.13, в котором среда со ступенчатым градиентом представляет собой градиент, состоящий из 50% (мас./об.) забуференного раствора сахарозы и 20% (мас./об.) забуференного раствора сахарозы.

15. Способ по п.1, в котором градиентная среда с более высокой концентрацией, применяемая на стадии д) способа, представляет собой градиентную среду, содержащую 50% (мас./об.) забуференного раствора сахарозы.

16. Способ по п.1, в котором образец панкреатина представляет собой образец свиного панкреатина.

17. Способ по п.1, в котором вирусная нагрузка в опытном образце панкреатина представляет собой ротавирус А коров, вирус энцефаломиокардита, цирковирус свиней, парвовирус свиней, ротавирус А свиней, тешовирус свиней, вирус гепатита Е свиней и/или вирус заболевания свиней с везикулярным синдромом.

18. Способ по одному из предыдущих пунктов, в котором образец панкреатина, применяемый в качестве исходного продукта, содержит по меньшей мере 5 г панкреатина.

19. Выделенная вторая целевая фракция, полученная способом по п.1.

20. Выделенная вторая целевая фракция по п.19, где на стадии а) способа по п.1 получают опытный образец панкреатина в виде суспензии опытного образца панкреатина путем объединения образца панкреатина со средой для культуры клеток, пригодной для линии клеток которую применяют для культивирования предназначенного для исследования типа вируса, или с соляным раствором и с одним или несколькими антибиотиками.

21. Выделенная вторая целевая фракция по п.20, в которой физиологический раствор представляет собой забуференный фосфатом физиологический раствор.