RU2008133028A

RU2008133028A - Система экспрессии компонентов ортогональной трансляции в эубактериальной клетке-хозяине

Info

Publication number: RU2008133028A
Application number: RU2008133028/13A
Authority: RU
Inventors: Иоунга РИЮ (US); Иоунга РИЮ; Питер Г. ШУЛЬЦ (US); Питер Г. ШУЛЬЦ
Original assignee: Зе Скрипс Ресеч Инститьют (Us); Зе Скрипс Ресеч Инститьют
Priority date: 2006-03-09
Filing date: 2007-03-07
Publication date: 2010-04-20
Also published as: RU2467069C2

Abstract

1. Композиция, включающая конструкцию нуклеиновой кислоты, содержащую: ! (a) последовательности промотора и терминатора, полученные из гена пролин-тРНК Escherichia coli, и экспрессируемую нуклеотидную последовательность, причем обе указанные последовательности промотора и терминатора функционально соединены с указанной экспрессируемой последовательностью, а указанная экспрессируемая последовательность является гетерологичной по отношению к указанным последовательностям промотора и терминатора; ! (b) нуклеотидную последовательность промотора, соответствующую модифицированному промотору glnS E. coli, которая имеет нуклеотидную последовательность, соответствующую SEQ ID NO:13, и экспрессируемую нуклеотидную последовательность, причем указанная модифицированная нуклеотидная последовательность промотора glnS E. coli функционально соединена с указанной экспрессируемой последовательностью; ! (c) нуклеотидную последовательность, кодирующую ортогональную тРНК (O-тРНК), и нуклеотидную последовательность, кодирующую ортогональную аминоацил-тРНК синтетазу (O-РС), где указанная O-РС предпочтительно амин-ацилирует указанную O-тРНК путем присоединения к ней не встречающейся в природе аминокислоты; или ! (d) полицистронный оперон, содержащий множество нуклеотидных последовательностей генов тРНК, где по меньшей мере один ген тРНК отделен от по меньшей мере одного смежного с ним гена тРНК гетерологичным полинуклеотидным линкером, полученным из природного полинуклеотидного линкера от природного тРНК оперона. ! 2. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что: ! указанная конструкция содержит одновременно (а) и (b), где указанные в (а) и (b) экс�

Claims

1. Композиция, включающая конструкцию нуклеиновой кислоты, содержащую:

(a) последовательности промотора и терминатора, полученные из гена пролин-тРНК Escherichia coli, и экспрессируемую нуклеотидную последовательность, причем обе указанные последовательности промотора и терминатора функционально соединены с указанной экспрессируемой последовательностью, а указанная экспрессируемая последовательность является гетерологичной по отношению к указанным последовательностям промотора и терминатора;

(b) нуклеотидную последовательность промотора, соответствующую модифицированному промотору glnS E. coli, которая имеет нуклеотидную последовательность, соответствующую SEQ ID NO:13, и экспрессируемую нуклеотидную последовательность, причем указанная модифицированная нуклеотидная последовательность промотора glnS E. coli функционально соединена с указанной экспрессируемой последовательностью;

(c) нуклеотидную последовательность, кодирующую ортогональную тРНК (O-тРНК), и нуклеотидную последовательность, кодирующую ортогональную аминоацил-тРНК синтетазу (O-РС), где указанная O-РС предпочтительно амин-ацилирует указанную O-тРНК путем присоединения к ней не встречающейся в природе аминокислоты; или

(d) полицистронный оперон, содержащий множество нуклеотидных последовательностей генов тРНК, где по меньшей мере один ген тРНК отделен от по меньшей мере одного смежного с ним гена тРНК гетерологичным полинуклеотидным линкером, полученным из природного полинуклеотидного линкера от природного тРНК оперона.

2. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что:

указанная конструкция содержит одновременно (а) и (b), где указанные в (а) и (b) экспрессируемые нуклеотидные последовательности различаются; или

указанная конструкция содержит одновременно (а), (b) и (с), где указанная в (а) экспрессируемая нуклеотидная последовательность кодирует указанную O-тРНК и где указанная в (b) экспрессируемая нуклеотидная последовательность кодирует указанную O-РС; или

указанный ген пролин-тРНК E. coli: выбран из генов тРНК E. coli proK, proL и promM, или

указанные последовательности промотора и терминатора пролин-тРНК Е. coli получены из последовательностей промотора и терминатора proK E. coli, представленных в SEQ ID NOS: 32 (промотор) и 33 (терминатор), соответственно; или

указанная в (а) экспрессируемая нуклеотидная последовательность представляет собой полицистронный оперон, содержащий множество из одной или более нуклеотидных последовательностей; или

указанная в (а) экспрессируемая нуклеотидная последовательность кодирует тРНК.

3. Композиция по п.2, отличающаяся тем, что:

указанная тРНК получена из одной или более тРНК Архей; или

указанная тРНК закодирована в нуклеотидной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 1 (MjtRHA-Tyr(CUA)); или

указанная экспрессируемая нуклеотидная последовательность представляет собой полицистронный оперон, содержащий множество нуклеотидных последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 1 (MjtRHA-Tyr(CUA)).

4. Композиция по п.3, отличающаяся тем, что указанная экспрессируемая нуклеотидная последовательность содержит множество указанных полицистронных оперонов.

5. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что:

указанная в (b) экспрессируемая нуклеотидная последовательность кодирует полипептид; или

указанная в (b) экспрессируемая нуклеотидная последовательность кодирует аминоацил-тРНК синтетазу; или

указанная в (b) экспрессируемая нуклеотидная последовательность кодирует ортогональную аминоацил-тРНК синтетазу (O-РС), где указанная O-РС предпочтительно амин-ацилирует соответствующую O-тРНК путем присоединения к ней не встречающейся в природе аминокислоты.

6. Композиция по п.14, отличающаяся тем, что:

указанная O-РС получена из аминоацил-тРНК синтетазы Methanococcus jannaschii, или

указанная O-РС получена из тирозил-тРНК синтетазы Methanococcus jannaschii, или

в указанной O-РС имеется замена аспарагиновой кислоты на аргинин в положении 286 или в положении, аналогичном положению 286, по сравнению с аминокислотной последовательностью тирозил-тРНК синтетазы Methanococcus jannaschii дикого типа, соответствующей SEQ ID NO: 2 (Mj-tRHA-Tyr PC дикого типа).

7. Клетка-хозяин, которая содержит композицию по п.1.

8. Клетка-хозяин по п.7, отличающаяся тем, что:

указанная клетка-хозяин представляет собой эубактериальную клетку-хозяин; или

указанная клетка-хозяин представляет собой клетку E. coli.

9. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что:

указанный в (d) полицистронный оперон содержит множество идентичных гетерологичных полинуклеотидных линкеров; или

указанный в (d) полицистронный оперон содержит множество гетерологичных полинуклеотидных линкеров, где по меньшей мере два гетерологичных полинуклеотидных линкера различаются; или

указанный в (d) полицистронный оперон содержит нуклеотид тимидин на 5'-конце, нуклеотид аденозин на 3'-конце или одновременно нуклеотид тимидин на 5'-конце и нуклеотид аденозин на 3'-конце; или

указанный гетерологичный полинуклеотидный линкер получен из природного полинуклеотидного линкера, расположенного между эндогенными генами тРНК Escherichia coli, выбранными из: valU и valX; ileT и alaT; serV и argV, valV и valW, glyT и thrT, metT и leuW; glnW и metU; hisR и leuT; glnU и glnW; leuP и leuV; glnV и glnX, alaW и alaX; ileU и alaU; ileV и alaV; metU и glnV; glyW и cysT; argX и hisR; и argY и argZ; или

указанный в (d) гетерологичный полинуклеотидный линкер получен из нуклеотидной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 14 (valU/valX линкер) или 15 (ileT/alaT линкер).

10. Система трансляции для экспрессии представляющего интерес полипептида, который содержит по меньшей мере одну не встречающуюся в природе аминокислоту в заданном положении, включающая:

(a) не встречающуюся в природе аминокислоту;

(b) конструкцию нуклеиновой кислоты, которая содержит: нуклеотидную последовательность, кодирующую ортогональную тРНК (O-тРНК), и нуклеотидную последовательность, кодирующую ортогональную аминоацил-тРНК синтетазу (O-РС), где указанная O-РС предпочтительно амин-ацилирует указанную O-тРНК путем присоединения к ней не встречающейся в природе аминокислоты; и

(c) полинуклеотид, кодирующий указанный представляющий интерес полипептид, который содержит по меньшей мере один селекторный кодон, который распознается указанной O-тРНК, причем положение указанного селекторного кодона в указанном полинуклеотиде определяет заданное положение не встречающейся в природе аминокислоты в полипептиде, представляющем интерес, при экспрессии полинуклеотида с образованием полипептида.

11. Система трансляции по п.10, отличающаяся тем, что указанная конструкция нуклеиновой кислоты содержит по меньшей мере одно из следующего:

(i) нуклеотидные последовательности промотора и терминатора, полученные из гена пролин-тРНК Escherichia coli, причем обе указанные последовательности промотора и терминатора функционально соединены с указанной нуклеотидной последовательностью, содержащей или кодирующей указанную O-тРНК, а указанная O-тРНК является гетерологичной по отношению у указанным нуклеотидным последовательностям промотора и терминатора;

(ii) нуклеотидная последовательность, соответствующая модифицированному промотору glnS E. coli, имеющему нуклеотидную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 13, причем указанная нуклеотидная последовательность модифицированного glnS E. coli функционально соединена с указанной нуклеотидной последовательностью, кодирующее указанную O-РС; и

(iii) полицистронный оперон, который содержит множество указанных нуклеотидных последовательностей генов O-тРНК, причем по меньшей мере один ген O-тРНК отделен от по меньшей мере одного смежного с ним гена O-тРНК гетерологичным полинуклеотидным линкером, полученным из природного полинуклеотидного линкера из природного тРНК оперона.

12. Система трансляции по п.11, отличающаяся тем, что:

указанный ген пролин-тРНК Е. coli выбран из генов тРНК: proK, proL и proM;

или

указанные последовательности промотора и терминатора пролин-тРНК Е. coli получены из последовательностей промотора и терминатора proК Е. coli, представленных в SEQ ID NOS: 32 (промотор) и 33 (терминатор), соответственно; или

указанный полицистронный оперон содержит множество идентичных гетерологичных полинуклеотидных линкеров; или

указанный полицистронный оперон содержит множество гетерологичных полинуклеотидных линкеров, причем по меньшей мере два гетерологичных полинуклеотидных линкеров различаются; или

указанный гетерологичный полинуклеотидный линкер содержит нуклеотид тимидин на 5'-конце или нуклеотид аденозин на 3'-конце или одновременно нуклеотид тимидин на 5'-конце и нуклеотид аденозин на 3'-конце; или

указанный гетерологичный полинуклеотидный линкер получен из нуклеотидной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 14 (valU/valX линкер) или 15 (ileT/alaT линкер).

13. Система трансляции по п.11, отличающаяся тем, что:

указанная O-тРНК получена из одной или более тРНК Архей; или

указанная нуклеотидная последовательность, кодирующая O-тРНК, представляет собой полицистронный оперон, содержащий множество нуклеотидных последовательностей, кодирующих O-тРНК; или

указанная нуклеотидная последовательность, кодирующая O-тРНК, содержит нуклеотидную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 1 (MjtRNA-Tyr(CUA)); или

указанная нуклеотидная последовательность, кодирующая O-тРНК, представляет собой полицистронный оперон, содержащий множество нуклеотидных последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 1 (MjtRNA-Tyr(CUA)); или

указанная O-РС получена из аминоацил-тРНК синтетазы Methanococcus jannaschii; или

указанная O-РС получена из тирозил-тРНК синтетазы Methanococcus jannaschii; или

в указанной O-РС имеется замена аспарагиновой кислоты на аргинин в положении 286 или в положении, аналогичном положению 286, по сравнению с аминокислотной последовательностью тирозил-тРНК синтетазы Methanococcus jannaschii дикого типа, соответствующей SEQ ID NO: 2 (Mj-tRNA-Tyr PC дикого типа).

14. Система трансляции по п.11, включающая клетку-хозяина, содержащую (а), (b) и (с).

15. Система трансляции по п.14, отличающаяся тем, что:

указанная клетка-хозяин представляет собой эубактериальную клетку-хозяина; или

указанная клетка-хозяин представляет собой клетку Е. coli.

16. Способ получения в клетке-хозяине представляющего интерес полипептида, содержащего в заданном положении не встречающуюся в природе аминокислоту, включающий:

(а) обеспечение:

(i) не встречающейся в природе аминокислоты;

(ii) конструкции нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую ортогональную тРНК (O-тРНК), и нуклеотидную последовательность, кодирующую ортогональную аминоацил-тРНК синтетазу (O-РС), причем указанная O-РС предпочтительно амин-ацилирует указанную O-тРНК путем присоединения к ней не встречающейся в природе аминокислоты; и

(iii) полинуклеотида, кодирующего указанный представляющий интерес полипептид, который содержит по меньшей мере один селекторный кодон, который распознается указанной O-тРНК, причем положение селекторного кодона соответствует заданному положению не встречающейся в природе аминокислоты в представляющем интерес полипептиде;

(iv) клетки-хозяина, которая содержит (i), (ii) и (iii); и

(b) культивирование указанной клетки-хозяина; и

(c) включение указанной не встречающейся в природе аминокислоты в заданное положение указанного полипептида в ходе трансляции указанного полипептида в указанной клетке-хозяина и, таким образом, получение указанного представляющего интерес полипептида, содержащего не встречающуюся в природе аминокислоту в заданном положении.

17. Способ по п.16, отличающийся тем, что:

указанное обеспечение конструкции нуклеиновой кислоты включает обеспечение нуклеотидной последовательности, кодирующей O-тРНК, полученную из одной или более тРНК Архей; или

указанное обеспечение конструкции нуклеиновой кислоты включает обеспечение полицистронного оперона, который содержит множество нуклеотидных последовательностей, кодирующих одну или более разновидностей тРНК; или

указанное обеспечение конструкции нуклеиновой кислоты включает обеспечение нуклеотидной последовательности, кодирующей O-тРНК, содержащей нуклеотидную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 1 (MjtRNA-Tyr(CUA)); или

указанное обеспечение конструкции нуклеиновой кислоты включает обеспечение полицистронного оперона, содержащего множество нуклеотидных последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 1 (MjtRNA-Tyr(CUA)); или

указанное обеспечение конструкции нуклеиновой кислоты включает обеспечение нуклеотидной последовательности, кодирующей O-РС, полученную из аминоацил-тРНК синтетазы Methanococcus jannaschii; или

указанное обеспечение конструкции нуклеиновой кислоты включает обеспечение нуклеотидной последовательности, кодирующей O-РС, полученную из тирозил-тРНК синтетазы; или

указанное обеспечение конструкции нуклеиновой кислоты включает обеспечение нуклеотидной последовательности, кодирующей O-РС, которая содержит замену аспарагиновой кислоты на аргинин в положении 286 или в положении, аналогичном положению 286, по сравнению с аминокислотной последовательностью тирозил-тРНК синтетазы Methanococcus jannaschii дикого типа, соответствующей SEQ ID NO: 2 (Mj-tRNA-Tyr PC дикого типа); или

указанное обеспечение конструкции нуклеиновой кислоты включает обеспечение по меньшей мере одного из следующего:

(I) последовательности промотора и терминатора, полученных из гена пролин-тРНК Escherichia coli, причем обе указанные последовательности промотора и терминатора соединены с указной нуклеотидной последовательностью, кодирующей указанную O-тРНК, а указанная нуклеотидная последовательность, кодирующая указанную O-тРНК является гетерологичной по отношению к указанным последовательностям промотора и терминатора;

(II) нуклеотидной последовательности промотора, соответствующей модифицированному промотору glnS E. coli, который имеет последовательность нуклеотидов, соответствующую SEQ ID NO: 13, где указанная модифицированная нуклеотидная последовательность glnS E. coli функционально соединена с указанной нуклеотидной последовательностью, кодирующей указанную O-РС; и

(III) полицистронного оперона, содержащего множество нуклеотидных последовательностей генов O-тРНК, причем по меньшей один ген O-тРНК отделен от по меньшей мере одного смежного с ним гена O-тРНК гетерологичным полинуклеотидным линкером, полученным из природного полинуклеотидного линкера из природного тРНК оперона.

18. Способ по п.17, отличающийся тем, что:

указанное обеспечение конструкции нуклеиновой кислоты (I) включает обеспечение нуклеотидной последовательности, соответствующей последовательностям промотора и терминатора пролин-тРНК Escherichia coli, выбранной из тРНК E. coli: proK, proL and proM tRNA; или

указанное обеспечение конструкции нуклеиновой кислоты (I) включает обеспечение нуклеотидной последовательности, соответствующей последовательностям промотора и терминатора пролин-тРНК Escherichia coli, которые содержат последовательности промотора и терминатора proК Е. coli, соответствующие SEQ ID NO: 32 (промотор) и SEQ ID NO: 33 (терминатор), соответственно; или

указанное обеспечение полицистронного оперона (III) включает обеспечение множества идентичных гетерологичных полинуклеотидных линкеров; или

указанное обеспечение полицистронного оперона (III) включает обеспечение множества гетерологичных полинуклеотидных линкеров, причем по меньшей мере два гетерологичных полинуклеотидных линкера различаются; или

указанное обеспечение полицистронного оперона (III) включает обеспечение гетерологичного полинуклеотидного линкера, содержащего нуклеотид тимидин на 5'-конце, нуклеотид аденозин на 3'-конце или одновременно нуклеотид тимидин на 5'-конце и нуклеотид аденозин на 3'-конце; или

указанное обеспечение полицистронного оперона (III) включает обеспечение гетерологичного полинуклеотидного линкера, полученного из природного полинуклеотидного линкера, расположенного между эндогенными генами тРНК Escherichia coli, выбранными из: valU и valX; ileT и alaT; serV и argV, valV и valW, glyT и thrT, metT и leuW; glnW и metU; hisR и leuT; glnU и glnW; leuP и leuV; glnV и glnX, alaW и alaX; ileU и alaU; ileV и alaV; metU и glnV; glyW и cysT; argX и hisR; и argY и argZ; или

указанное обеспечение полицистронного оперона (III) включает обеспечение гетерологичного полинуклеотидного линкера, полученного из нуклеотидной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 14 (valU/valX линкер) или SEQ ID NO: 15 (ileT/alaT линкер).

19. Способ по п.16, отличающийся тем, что указанное обеспечение клетки-хозяина включает обеспечение эубактериальной клетки-хозяина; или

указанное обеспечение клетки-хозяина включает обеспечение клетки-хозяина Escherichia coli.

20. Способ получения в клетке-хозяине представляющего интерес полипептида, который содержит в заданном положении не встречающуюся в природе аминокислоту, включающий:

(а) обеспечение:

(i) не встречающейся в природе аминокислоты;

(ii) конструкции нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую ортогональную тРНК (O-тРНК);

(iii) конструкции нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую ортогональную аминоацил-тРНК синтетазу (O-РС), причем указанная O-РС предпочтительно предпочтительно амин-ацилирует указанную O-тРНК путем присоединения к ней не встречающейся в природе аминокислоты;

(iv) полинуклеотида, кодирующего указанный представляющий интерес полипептид, который содержит по меньшей мере один селекторный кодон, который распознается указанной O-тРНК причем положение селекторного положение соответствует указанному заданному положению не встречающейся в природе аминокислоты в представляющем интерес полипептиде;

(v) клетки-хозяина, содержащей (i), (ii), (iii) и (iv);

причем указанные в (ii) и (iii) конструкции нуклеиновых кислот совместно содержат по меньшей мере одно из следующего:

(I) нуклеотидные последовательности промотора и терминатора, полученные из гена пролин-тРНК Escherichia coli, причем обе указанные последовательности промотора и терминатора функционально соединены с указанной нуклеотидной последовательностью, кодирующей указанную O-тРНК, а указанная нуклеотидная последовательность, кодирующая указанную O-тРНК, является гетерологичной по отношению к указанным последовательностям промотора и терминатора;

(II) нуклеотидная последовательность промотора, соответствующая модифицированному промотору glnS E. coli, которая имеет последовательность нуклеотидов, соответствующую SEQ ID NO: 13, причем указанная модифицированная нуклеотидная последовательность glnS E. coli функционально соединена с указанной нуклеотидной последовательностью, кодирующей указанную O-РС;

(III) полицистронный оперон, который содержит множество нуклеотидных последовательностей генов O-тРНК, причем по меньшей мере один ген O-тРНК отделен от по меньшей мере одного смежного с ним гена O-тРНК гетерологичным полинуклеотидным линкером, полученным из природного полинуклеотидного линкера из природного тРНК оперона;

(b) выращивание клетки-хозяина; и

(c) включение указанной не встречающейся в природе аминокислоты в указанное заданное положение указанного полипептида в ходе трансляции указанного полипептида в указанной клетке-хозяина и, таким образом, получение указанного представляющего интерес полипептида, который содержит не встречающуюся в природе аминокислоту в указанном заданном положении.

21. Способ по п.20, отличающийся тем, что указанное обеспечение конструкции нуклеиновой кислоты включает обеспечение нуклеотидной последовательности, кодирующей O-тРНК, полученную из одной или более тРНК Архей; или

указанное обеспечение конструкции нуклеиновой кислоты включает обеспечение полицистронного оперона, содержащего множество нуклеотидных последовательностей, кодирующих одну или более разновидностей O-тРНК; или

указанное обеспечение конструкции нуклеиновой кислоты включает обеспечение полицистронного оперона, содержащего множество нуклеотидных последовательностей, соответсвующих SEQ ID NO: 1 (MjtRNA-Tyr(CUA)); или

указанное обеспечение конструкции нуклеиновой кислоты включает обеспечение нуклеотидной последовательности, кодирующей O-РС, полученную из тирозил-тРНК синтетазы Methanococcus jannaschii; или

указанное обеспечение конструкции нуклеиновой кислоты включает обеспечение нуклеотидной последовательности, кодирующей O-РС, которая содержит замену аспарагиновой кислоты на аргинин в положении 286 или в положении, аналогичном положению 286, по сравнению с аминокислотной последовательностью тирозил-тРНК синтетазы Methanococcus jannaschii дикого типа, соответствующей SEQ ID NO: 2 (wild type Mj-tRNA-Tyr PC); или

указанное обеспечение конструкции нуклеиновой кислоты (I) включает обеспечение нуклеотидной последовательности соответствующей последовательностям промотора и терминатора пролин-тРНК Eschenchia coli, выбранной из тРНК Е. coli: proK, proL and proM tRNA; или

указанное обеспечение конструкции нуклеиновой кислоты (I) включает обеспечение последовательности нуклеотидов, соответствующей последовательностям промотора и терминатора пролин-тРНК Escherichia coli, которые содержат последовательности промотора и терминатора proK E. coli, соответствующие SEQ ID NO: 32 (промотор) и SEQ ID NO: 33 (терминатор), соответственно; или

указанное обеспечение конструкции нуклеиновой кислоты (III) включает обеспечение множества идентичных гетерологичных полинуклеотидных линкеров; или

указанное обеспечение конструкции нуклеиновой кислоты (III) включает обеспечение множества гетерологичных полинуклеотидных линкеров, причем по меньшей мере два гетерологичных полинуклеотидных линкера различаются; или

указанное обеспечение полицистроного оперона (III) включает обеспечение гетерологичного полинуклеотидного линкера, содержащего нуклеотид тимидин на 5'-конце, нуклеотид аденозин на 3'-конце или одновременно нуклеотид тимидин на 5'-конце и нуклеотид аденозин на 3'-конце; или

указанное обеспечение полицистроного оперона (III) включает обеспечение гетерологичного полинуклеотидного линкера, полученного из природного полинуклеотидного линкера, расположенного между эндогенными генами тРНК Escherichia coli, выбранными из: valU и valX; ileT и alaT; serV и argV, valV и valW, glyT и thrT, metT и leuW; glnW и metU; hisR и leuT; glnU и glnW; leuP и leuV; glnV и glnX, alaW и alaX; ileU и alaU; ileV и alaV; metU и glnV; glyW и cysT; argX и hisR; и argY и argZ; или

указанное обеспечение полицистронного оперона (III) включает обеспечение гетерологичного полинуклеотидного линкера, полученного из нуклеотидной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 14 (valU/valX линкер) или SEQ ID NO: 15 (ileT/alaT линкер); или

указанное обеспечение клетки-хозяина включает обеспечение эубактериальной клетки-хозяина; или

указанное обеспечение клетки-хозяина включает обеспечение клетки-хозяина Escherichia coli; или

22. Способ получения системы трансляции для экспрессии представляющего интерес полипептида, который в заданном положении содержит по меньшей мере одну не встречающуюся в природе аминокислоту, включающий обеспечение:

(a) не встречающейся в природе аминокислоты;

(b) конструкции нуклеиновой кислоты, включающей: нуклеотидную последовательность, кодирующую ортогональную тРНК (O-тРНК), и нуклеотидную последовательность, кодирующую ортогональную аминоацил-тРНК синтетазу (O-РС), причем указанная O-РС предпочтительно предпочтительно амин-ацилирует указанную O-тРНК путем присоединения к ней не встречающейся в природе аминокислоты; и

(с) полинуклеотида, кодирующего представляющий интерес указанный полипептид, который содержит по меньшей мере один селекторный кодон, который распознается указанной O-тРНК, причем положение указанного селекторного кодона в полинуклеотиде определяет указанное заданное положение не встречающейся в природе аминокислоты в указанном представляющем интерес полипептиде при экспрессии полинуклеотида с образованием полипептида.

23. Способ по п.22, отличающийся тем, что клетка-хозяин содержит (а), (b) и (с).

24. Способ получения представляющего интерес полипептида, который в заданном положении содержит не встречающуюся в природе аминокислоту, включающий:

(a) обеспечение системы трансляции, включающей:

(i) не встречающуюся в природе аминокислоту;

(ii) конструкцию нуклеиновой кислоты, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую ортогональную тРНК (O-тРНК) и нуклеотидную последовательность, кодирующую ортогональную аминоацил-тРНК синтетазу (O-РС), причем указанная O-РС предпочтительно предпочтительно амин-ацилирует указанную O-тРНК, присоединяя к ней не встречающуюся в природе аминокислоту; и

(iii) полинуклеотид, кодирующий указанный представляющий интерес полипептид, который содержит по меньшей мере один селекторный кодон, который распознается указанной O-тРНК, причем положение указанного селекторного кодона соответствует указанному заданному положению не встречающейся в природе аминокислоты в представляющем интерес полипептиде;

(iv) клетку-хозяина, содержащую (i), (ii) и (iii); и

(c) (с) включение указанной не встречающейся в природе аминокислоты в заданное положение указанного полипептида в ходе трансляции указанного полипептида в указанной клетке-хозяина и, таким образом, получение указанного представляющего интерес полипептида, содержащего не встречающуюся в природе аминокислоту в указанном заданном положении.