RU2006137034A - Устойчивые к цианидам нитрилгидратазы - Google Patents

Claims (23)

1. Выделенный полинуклеотид, который кодирует полипептид, аминокислотная последовательность которого на 90-100% идентична аминокислотным последовательностям, представленным в последовательностях SEQ ID NO: 2, 3 и 5 или 7, 8 и 10.

2. Полинуклеотид по п.1, выбранный из группы, включающей

а) полинуклеотиды, которые содержат нуклеотидные последовательности SEQ ID NO: 1, 4, 6, 9 или комплементарные им нуклеотидные последовательности,

б) полинуклеотиды, которые содержат нуклеотидные последовательности, которые соответствуют последовательностям, указанным в подпункте а), в пределах вырожденности генетического кода,

в) полинуклеотиды, которые содержат нуклеотидные последовательности, указанные в подпункте а), несущие функционально нейтральные смысловые мутации,

г) полинуклеотиды, которые гибридизуются с комплементарными последовательностями, указанными в подпункте а), в строгих условиях, где строгие условия предусматривают отмывку в 5×SSC при температуре от 50 до 65°С,

где полинуклеотиды кодируют устойчивую к цианидам нитрилгидратазу.

3. Полипептиды, содержащие аминокислотные последовательности, которые идентичны на 90-100% последовательностям, представленным в SEQ ID NO: 2, 3 и 5 или 7, 8 и 10.

4. Полипептид, обладающий активностью устойчивых к цианидинам нитрилгидратаз по п.3, активность которых, сохранившаяся после превращения метакрилнитрила в присутствии 20 мМ (мМ = ммоль/л) ионов цианида при 20°С через 30 мин, составляет предпочтительно по меньшей мере 90% от сохранившейся активности этого фермента, при его применении для превращения в отсутствии ионов цианида в условиях, которые не отличаются по остальным параметрам.

5. Зонд или праймер, содержащие по меньшей мере 20 последовательных нуклеотидов из последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 1, 4, 6, 9.

6. Вектор, содержащий полинуклеотид по п.1.

7. Вектор, содержащий полинуклеотид по п.2.

8. Клетка-хозяин, трансформированная или трансфектированная путем интродукции полинуклеотида по п.1 или 2.

9. Клетка-хозяин, трансформированная путем интродукции вектора по п.7.

10. Способ ферментативного получения амидов из нитрилов, заключающийся в том, что

а) превращают соединение, содержащее нитрильные группы, с помощью микробного фермента (полипептида), который обладает нитрилгидратазной активностью, и

б) удаляют образовавшийся амид, применяя для превращения нитрила в амид нитрилгидратазу по п.3.

11. Способ по п.10, заключающийся в том, что

а) превращают соединение, содержащее нитрильные группы, с помощью микробного фермента (полипептида), который обладает нитрилгидратазной активностью, и

б) удаляют образовавшийся амид,

применяя для превращения нитрила в амид нитрилгидратазу, активность которых, сохранившаяся после превращения метакрилнитрила в присутствии 20 мМ (мМ = ммоль/л) ионов цианида при 20°С через 30 мин, составляет предпочтительно по меньшей мере 90% от сохранившейся активности этого фермента, при его применении для превращения в отсутствии ионов цианида в условиях, которые не отличаются по остальным параметрам.

12. Способ по п.10, отличающийся тем, что применяют продуцирующие и содержащие фермент микроорганизмы по п.8 или 9 или их лизат.

13. Способ по п.12, отличающийся тем, что применяют покоящиеся клетки микроорганизма.

14. Способ по п.10 или 11, отличающийся тем, что применяют очищенную нитрилгидратазу.

15. Способ по п.10 или 11, отличающийся тем, что фермент получают из микроорганизмов рода Pseudomonas.

16. Способ по п.15, отличающийся тем, что фермент получают из применяемых микроорганизмов видов Pseudomonas putida или Pseudomonas marginalis.

17. Способ по п.16, отличающийся тем, что применяют микроорганизмы, депонированные под номерами DSM 16275 и DSM 16276.

18. Способ по одному или нескольким п.10, отличающийся тем, что соединения общей формулы

в которых Х обозначает ОН, Н, алкил, NH₂;

R обозначает Н, насыщенный алкильный радикал с разветвленной или неразветвленной цепью, несущий от 1 до 12 атомов углерода, необязательно замещенный NH₃, ненасыщенный алкильный радикал с одной двойной связью с разветвленной или неразветвленной цепью, несущий от 1 до 12 атомов углерода, циклоалкильные группы, содержащие от 3 до 6 атомов углерода,

алкиленовые радикалы, замещенные алкилтиогруппами, где алкил в рассматриваемом случае представляет собой C₁-С₃алкильный радикал и алкилен представляет собой двухвалентный С₃-С₈алкиленовый радикал,

R' обозначает Н, алкил, несущий от 1 до 3 атомов углерода,

R" обозначает одноядерное или двухядерное ненасыщенное кольцо, которое содержит от 6 до 12 атомов углерода и которое необязательно замещено одной или двумя C₁-С₃алкильными группами, Cl, Br, F, алкилнитрил, имеющий от 1 до 6 атомов углерода,

превращают в соответствующие амиды.

19. Способ по п.18, отличающийся тем, что соединение общей формулы (I) превращают в присутствии гидроциановой кислоты или соли гидроциановой кислоты.

20. Способ по п.19, отличающийся тем, что превращение осуществляют в присутствии начальной концентрации циадина, составляющей от не более 0,5 до 3 мол.% в пересчете на применяемый нитрил.

21. Способ по одному или нескольким из пп.18-20, отличающийся тем, что в качестве нитрила применяют 2-амино-4-метилтиобутиронитрил.

22. Способ по одному или нескольким из пп.18-20, отличающийся тем, что в качестве нитрила применяют 2-гидрокси-4-метилтиобутиронитрил, который при необходимости присутствует в реакционной смеси при получении этого нитрила.

23. Способ по одному или нескольким из пп.18-20, отличающийся тем, что в качестве нитрила применяют 2-гидрокси-2-метилпропионитрил.