CN1279175C

CN1279175C - 酰胺化合物的制造方法

Info

Publication number: CN1279175C
Application number: CNB011101725A
Authority: CN
Inventors: 阿部刚也; 伊藤洁; 佐佐木贤树; 渡边清一; 立花稔久; 浅野保
Original assignee: Mitsui Chemical Industry Co Ltd
Current assignee: Mitsui Chemicals Inc; Mitsui Chemical Industry Co Ltd
Priority date: 2000-03-29
Filing date: 2001-03-28
Publication date: 2006-10-11
Anticipated expiration: 2021-03-28
Also published as: DE60132053D1; EP1182260A4; EP1182260A1; KR20020020898A; AU767517B2; DE60132053T2; US20020160466A1; CN1320705A; AU4276901A; KR100549598B1; EP1182260B1; WO2001073101A1; TWI296652B; US6849432B2

Abstract

本发明是有关酰胺化合物的制造方法，在将含有腈水合酶的微生物的菌体或其菌体处理物在水性媒质中同腈化合物反应而连续地制造酰胺化合物的方法中，其特征在于：将该菌体或其菌体处理物在水性媒质中同腈化合物接触反应后，将所得到的反应液在具有活塞式流动性流域的条件下再进行反应。使用本发明，腈化合物的转化率极高，无需浓缩工序，可容易地制得高纯度且高浓度的酰胺化合物溶液。

Description

酰胺化合物的制造方法

技术领域

本发明是有关酰胺化合物的制造方法，更具体地说是有关酰胺化合物水溶液的制造方法。该方法是将腈化合物以高转化率进行水合作用而连续地制造高浓度酰胺化合物水溶液的方法，其反应后的残留腈化合物少而适于工业化生产。

背景技术

作为酰胺化合物的主要制造方法之一，现经常使用的是以腈化合物为原料的水合法。尤其是已知的以丙烯腈为原料，通过过去常用的以拉奈铜(Ranay铜)等金属铜催化剂或者于近年使用的以含有腈水合酶的微生物菌体和该菌体处理物等的水合催化剂制造丙烯酰胺的方法。

上述方法中，通常，产品丙烯酰胺以水溶液或其结晶的形态供给，而在使用它们时，以水性溶剂进行稀释或者溶解。因此，近年来，其几乎多以水溶液的形态供给。

就丙烯酰胺水溶液的供给而言，制品形态从输送和贮存等的成本来看，要求更高的浓度；而另一方面又必须在输送或贮存等情况下防止结晶的析出。因此，适合于常温附近的输送和贮存等的丙烯酰胺水溶液的浓度通常为40-50％左右(重量比)。

然而，在该产品的现有工业制造技术中，在反应过程中，丙烯酰胺的浓度虽随制造工艺和使用催化剂的种类的不同而不同，但通常都不足40％(重量比)。其原因是因为，在反应过程中提高丙烯腈和/或丙烯酰胺的浓度时，发现了以下一系列倾向：催化剂活性失活、反应不能进行到底而使原料丙烯腈残留、反应副产物增加等，同时出现了受反应热的除热能力限制等问题，从而要在上述反应结束时直接得到最终产品浓度的丙烯酰胺产品通常是很困难的。

因此，在现有的丙烯酰胺的工业化制造工艺中，通过将原料丙烯腈多段供给的方法(日本特许公告公报昭57-1234号)以及通过使反应液的一部分循环的原料稀释法(日本特许公告公报昭58-35077号)等方法以限制原料丙烯腈的浓度，或者通过压低丙烯腈的转化率，使反应液中丙烯酰胺的浓度不足40％(重量比)，从而抑制催化剂活性的失活及副产物的增加。因此，通常，为了达到将所得到的丙烯酰胺水溶液的浓度提高和/或将所残留的丙烯腈去除的目的，往往再进行浓缩。

然而，虽然浓缩含有丙烯酰胺的液体一般是在负压下进行，但由于丙烯酰胺是一种极易反应的聚合性单体，在浓缩中产生聚合的危险性极大。因此，虽然在浓缩时采用了种种方法，诸如通入氧气进行稳定化处理的方法，使一氧化氮与其共存的方法和使金属离子与其共存的方法等，要完全防止聚合也是困难的。

在日本特许公开公报平11-89575号中，公开了利用微生物的菌体或菌体处理物来制造丙烯酰胺的方法。在该公报中，主要记载了通过添加原料丙烯腈使得反应开始时或者反应过程中丙烯腈的浓度达到在水性媒质中丙烯腈的饱和浓度以上，从而以更少的菌体量来得到高浓度丙烯酰胺溶液。因此，即使不进行浓缩，虽可得到浓度达40％(重量比)以上的丙烯酰胺水溶液，但由于反应催化剂的使用量、反应温度和开始时或反应过程中的丙烯腈浓度的关系的不同，有时会产生不协调的问题。例如，在短时间之内就使反应结束这种情况下，由于初期的反应热很大，对反应器而言必须有比较大的热交换器，或者相反，为了使丙烯腈的转化率达到99％以上，就需要相当长的反应时间。

由于以上的原因，作为酰胺化合物的工业化制法，迫切期望能有一种方法，它能使腈化合物的转化率更高，不需要浓缩工序而且可以更高的效率得到高浓度的酰胺化合物。

发明内容

本发明就是为了解决以上各问题而提出，其目的在于提供一种制造方法，它可以高的转化率将腈化合物转化来制造高浓度的酰胺化合物，其残留的腈化合物极少而且可连续作业，适于工业化生产。

本发明的发明人为了实现上述发明目的而精心研究的结果发现，将含有腈水合酶的微生物的菌体或者菌体处理物用装有搅拌机的槽形反应器在水性媒质中使其同腈化合物接触并反应，随后将该反应液在具有活塞式流动性流域的条件下再进行反应的这种方法是为实现上述目的的极有效的手段，从而完成了本发明。

即，本发明的制造方法是：

(1)，一种酰胺化合物的制造方法，在将含有腈水合酶的微生物的菌体或者菌体处理物用装有搅拌机的槽形反应器在水性媒质中同腈化合物反应而连续地制造酰胺化合物的方法中，其特征在于：将该菌体或者菌体处理物在水性媒质中同腈化合物接触反应后所得到的反应液，在具有活塞式流动性的流域条件下再进行反应；

(2)，在上述(1)记载的制造方法中，腈化合物是丙烯腈，使其同微生物的菌体或者其菌体处理物接触时的水和丙烯腈的比例是相对于水1份(重量)，丙烯腈为0.4-1.5份(重量)；

(3)，在上述(1)或(2)记载的制造方法中，该微生物菌体是一种使腈水合酶的基因在任意宿主中表达而得到的转化体，所述腈水合酶的基因是由微生物克隆得到的。

具体实施方式

本发明的要点在于，将含有腈水合酶的微生物的菌体或者其菌体处理物用作使腈化合物的腈基酰胺化的催化剂，尤其是能够既抑制付产物的生成，又以高的转化率而且高效率地制造高浓度的酰胺化合物水溶液。

本发明中的所谓腈水合酶指的是具有加水分解腈化合物而生成相应的酰胺化合物这种能力的酶。

此处，作为含有腈水合酶的微生物没有特别地限制，只要是该微生物能产生腈水合酶而该腈水合酶具有加水分解腈化合物而生成相应的酰胺化合物的能力，而且该微生物能在30％(重量比)的丙烯酰胺水溶液中保持腈水合酶的活性即可。具体地可列举属于以下种属的微生物作为合适的例子，即：诺卡氏放线菌属、棒状杆菌属、芽胞杆菌属、假单胞细菌属、细球菌属、好热的芽胞杆菌属、代表粉红色菌(Rhodochrous)种的红球菌属、不动细菌属、黄色细菌属、链霉菌属、根瘤菌属、克雷伯氏菌属、肠细菌属、欧文氏菌属、气单胞菌属、柠檬酸细菌属、无色菌属、土壤杆菌属或者代表嗜热菌种的假诺卡氏菌属。

另外，在任意宿主中使由以上微生物克隆的腈水合酶基因表达而得到的转化体也包含在本发明所称的微生物中。再有，此处所称的任意的宿主，虽如后述的实施例那样列举了大肠菌作为代表例子，但并不特别限定于大肠菌，也包括枯草菌等芽胞杆菌属菌、酵母及放线菌等其它微生物菌株。MT-10822可列举作为这类微生物菌株的例子。(根据有关专利程序方面的微生物保藏国际间相互承认的布达佩斯条约，本菌株于1996年2月7日保藏在日本国茨城县筑波市东1丁目1番3号的通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所，保藏号为FERM BP-5785)另外，通过使用重组DNA技术，通过将该酶的结构氨基酸的1个或2个以上以别的氨基酸置换、缺失、削除或者抻入等所发现的更加提高了耐丙烯酰胺性及耐丙烯腈性，耐温性的变异型腈水合酶的转化体也包括在本发明所称的微生物中。

当使用上述各种微生物来制造酰胺化合物时，通常，使用该微生物的菌体或菌体处理物。菌体可利用在分子生物学、生物工程学、基因工程学各领域中所公知的一般方法来培制，例如，可列举如下的方法：在LB培养基或M9培养基等常用液体培养基中将该微生物植菌后，在适当的培养温度下使其繁殖(通常为20-50℃，对于好热菌，也可在50℃以上)，随后，用离心分离法将该微生物与培养液分离、回收即可。

另外，本发明中的微生物的菌体处理物是指：上述微生物菌体的提取物及磨碎物、将该提取物及磨碎物的腈水合酶活性成分分离精制而成的后分离物、用适当的载体将该微生物菌体及该菌体的提取物、磨碎物、后分离物进行固定化处理的固定化物等，这些只要具有腈水合酶的活性都属于本发明的菌体处理物。这些既可以使用单独一类，也可以同时或者交替使用二种以上不同形态的东西。

本发明中，使用含有腈水合酶的微生物菌体或该微生物菌体的处理物，由腈化合物制得酰胺化合物时的反应形式为使用二台以上的反应器，在其前段的反应器中，供给微生物菌体或菌体处理物，腈化合物和水性媒质。对于这时的反应形式没有特别限定。例如既可用悬浮床进行，也可用固定床进行；但通常，从反应热的除热容易度考虑，使用装有搅拌机的槽形反应器的悬浮床为更好。

本发明中，关于腈化合物的种类也没有特别限定，具体地说是碳原子数为2-20左右的腈化合物，包括范围广泛的腈，例如脂肪族腈、芳香族腈等。作为脂肪族腈，可以是碳原子数2-6的饱和腈或不饱和腈，例如，可列举乙腈、丙腈、丁腈、异丁腈、戍腈、异戍腈、己腈等脂肪族饱和单腈类；丙二酰腈、丁二腈、己二腈等脂肪族双腈类；丙烯腈、甲基丙烯腈、丁烯腈等脂肪族不饱和腈等。作为芳香族腈，可列举苄腈、o-(正)，m-(间)和p-(对)位的氟苄腈，o-，m-和p-位的硝基苄腈，o-，m-和p-位的甲苯基腈，苄基氰化物等。其中，丙烯腈、甲基丙烯腈和丁烯腈可列为合适的例子。

另外，本发明中所称的水性媒质是指水或者以适当浓度溶解以下物质的水溶液：磷酸盐等缓冲剂、硫酸盐及碳酸盐等无机盐、碱金属的氢氧化物、或者酰胺化合物等。

本发明中，供给前段反应器的腈化合物的浓度在反应开始时是该腈化合物饱和浓度以上的浓度。该浓度的上限没有特别限制；然而腈化合物太过量的供给，使得必须具有为完成反应所需大量催化剂和具有过大容积的反应器和为了除热所需的过大的热交换器等，从而使设备方面的经济负担加大。因此，作为腈化合物的供给浓度最好是将其完全转化为相应的酰胺化合物时其理论生成液的浓度，对丙烯酰胺来说，是在40-80％(重量比)范围内；更具体地说，相对于1份水(重量)，供给丙烯腈0.4-1.5份(重量)。另外，对于甲基丙烯酰胺来说最好供给腈化合物和水使其理论生成液浓度为10-40％(重量比)范围内，更具体地说，相对于1份水(重量)，甲基丙烯腈为0.08-0.5份(重量)。

随后，将本发明中由上述前段反应器取出的反应液在具有活塞式流动性流域的条件下再进行反应。更具体地说，将由前段反应器得到的反应液输送到具有活塞式流动性流域的后段反应器中。此处所谓具有活塞式流动性流域的反应器通常是管型反应器或者有时也被叫作管子反应器的那种反应器，通过活塞的移动使反应液在具有管道形状的管子中一边移动一边进行反应；为了除去反应热，可使用双管形式以及外壳和内管形式等。

然而，作为本发明中的具有活塞式流动性流域的反应器并不局限于上述形式，即使是别的形式的反应器，只要是难于引起反应液的短路的形式，均可使用。也就是说，根据流速等条件的情况只要反应器能具有活塞式流动性流域，而且其结构又能去除反应热，就可作为具有活塞式流动性流域的反应器使用。例如，可使用热交换器中的螺旋型及层板型或者塔型反应器等各种设备。再者，即使是在这些设备内部有为保持反应液流动状态均匀的拢流板及填充物，只要根据流速等条件的情况反应器具有活塞式流动性流域，均可作为具有活塞式流动性流域的反应器使用。

再有，上述的前段反应器和后段具有活塞式流动性流域的反应器每种都不限制为一台，它们既可单独设置，也可将多个以串连或并连的形式排列。另外，关于上述前段和后段反应的反应时间(滞留时间)，不一定按催化剂的使用量及温度等条件控制，通常分别取在0.5-40小时范围内，最好在1-20小时范围内。另外，在全部反应时间中，在前段反应器的反应时间应为全部反应时间的20-99％，最好是40-90％；而在后段反应器的反应时间应为全部反应时间的1-80％，最好是10-60％。

关于催化剂的使用量，是随反应条件、催化剂的种类及其形态的不同而变化，但通常是根据该微生物干燥菌体的重量进行换算，相对于反应液为10-50000ppm(重量)，最好是50-30000ppm(重量)。

另外，酰胺化反应通常在常压或者常压附近进行，为了提高腈化合物在水性媒质中的溶解度，也可以加压进行。另外，关于反应温度，只要是在水性媒质的冰点以上即可，没有特别限制；通常在0-50℃范围内进行为好，最好是在10-40℃范围内。再有，即使在生成物从反应液中析出结晶的粉浆状态下，反应仍可进行。

另外，上述酰胺化反应时的反应液的pH值只要能维持腈水合酶的活性即可，没有特别限制，但以pH值在6-10范围内为好，pH值最好在7-9范围内。

再有，在本发明的实施例中，保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的取得通过部位特异的变异来实现。但是，根据同实施例中所公开的变异点所置换的碱基的种类的不同，即使用部位特异的变异以外的方法来构建重组质粒并将其导入宿主细胞中，也可得到同本发明实施例相同的结果。例如，通过以下方法也可取得作为目标物的重组质粒，即：使用DNA合成器等将具有下述碱基序列的DNA断片合成，该碱基序列是将与实施例中所公开的变异点相应部位的DNA的碱基序列变成氨基酸置换后的序列，然后再置换用另外的办法同所得到的断片分离的pPT-DB1的该断片相应的部位。

以下，列举实施例对本发明作更详细的说明，但本发明并不受以下实施例的任何限制。以下内容中，反应液的高性能液体色谱分析(HPLC)使用VLTRON 80HG(8*50mm)作为HPLC柱，使用10mM磷酸水溶液作为展开液，丙烯酰胺和丙烯腈用220nm的吸光度检测并测定其浓度。

实施例1

(1)保持了腈水合酶活性的氨基酸置换体的取得

为了将α亚基第6号的Leu置换成Met，将日本特许公开公报平9-275978号所得到的pPT-DB1质粒DNA作为模板，实施用宝酒造社制的《LAPCR in vitro mutagenesis Kit》部位特异的变异导入。下文，将《LAPCR in vitro mutagenesis Kit》简称为《Kit》。在以下的实施例中，基本上沿袭<Kit>的原理和操作方法。

在30ml的试管中配制10ml的LB液体培养基，用高压锅在121℃灭菌20分钟。将氨苄青霉素添加到该培养基中使其最终浓度达到100μg/ml，然后将MT-10822菌株植菌一白金耳，在37℃、300rpm条件下培养约20小时。将该培养液1ml分装到适当的离心管中，然用离心分离法(15000rpm*5分钟)将该菌体分离。随后，用碱SDS提取法由该菌体制得pPT-DB1的质粒DNA。

将pPT-DB1的质粒DNA 1μg作为模板进行二种PCR反应。PCR反应1号是用各自含有50pmol的序列表的序列1号记载的引物(primer)及M13引物M4(在序列表的序列2号中记载的序列)总量为50μl的混合液(其组成根据《Kit》记载的条件)，在以下条件下重复进行25次循环，即：热变性(98℃)15秒，缓冷(55℃)30秒、伸长反应(72℃)120秒。PCR反应2号是用各自含有50pmol的MUT4引物(序列表的序列3号记载的序列)及M13引物RV(序列表的序列4号记载的序列)总量为50μl的混合液(其组成根据《Kit》中记载的条件)，进行同PCR反应1号同样的操作。通过使用PCR反应1号和2号反应完成后的反应液各5μl的琼脂糖电泳分析(琼脂糖的浓度为1.0％-重量比)，进行DNA增幅产物的分析，证实了增幅DNA产物的存在。使用Microcon100(宝酒造社制)由各自的PCR反应完成液除去过剩的引物和dNTP后，加入TE(三羟基甲胺基甲烷.乙二胺四醋酸缓冲液)，分别配制50μl的溶液。将含有该TE溶液的每0.5μl配制成总量为47.5μl的缓冷溶液(组成根据《Kit》记载的条件)，在进行热变性处理(98℃)10分钟后，花60分钟的时间以一定速度进行冷却直到37℃，随后在37℃保持15分钟进行保温处理。在该缓冷处理液中加入0.5μlTAKARALA Tag在72℃进行3分钟加热处理，完成了不均匀的2条链。在它们中分别加入50pmol的M13引物M4(序列表的序列2号记载的序列)及M13引物RV(序列表的序列4号中记载的序列)，使其总量为50μl，然后在以下条件下重复进行25次循环从而实现PCR反应3号：热变性(98℃)15秒、缓冷(55℃)30秒伸长反应(72℃)120秒。通过使用了PCR反应3号的反应完成液5μl的琼脂糖电泳分析(使用西格马社制的型号为VII型的低熔点琼脂糖，琼脂糖浓度为0.8％-重量比)，进行DNA增幅产物的分析，证实了约2.0kbp的增幅DNA产物的存在。随后，由琼脂糖凝胶切出约2.0Kbp的DNA断片，将该琼脂糖片(约0.1g)精细粉碎并在1ml的TE溶液中制成悬浮液后，于55℃保温1小时使琼脂糖完成溶解。对该溶液按常规实施酚/氯仿提取和乙醇沉淀来精制该DNA断片，最终将其溶解在10μl的TE溶液中。将精制而成的约2.0Kbp的增幅DNA断片用有限制的酶EcoRI及HindIII切断后，再对该有限制的酶的处理液实施酚/氯仿提取和乙醇沉淀来精制该DNA断片，最终溶解在10μl的TE溶液中，同样，对pPT-DB1唯一有限制的酶的部位用EcoRI和HindIII切断pPT-DB1，进行琼脂糖凝胶的电泳分析(使用西格马社制的型号为VII型的低熔点琼脂糖，琼脂糖的浓度为0.7％)由琼脂糖凝胶切出约2.7Kbp的DNA断片。将切出的琼脂糖片(约0.1g)精细粉碎并在1ml的TE溶液中制成悬浮液，于55℃保温1小时使琼脂糖完全溶解。对于该溶液实施酚/氯仿提取和乙醇沉淀来精制该DNA断片，最后溶解在10μl的TE溶液中。使用DNA连接试剂盒(宝酒造社制)将这样得到的增幅DNA产物和pPT-DB1断片连接后，对大肠菌HB101的感受态细胞(东洋纺织社制)进行转化，从而制得大肠菌组群。

在30ml的试管中配制含有40μg/ml的七水硫酸铁和10μg/ml的二水氯化钴的10ml的LB液体培养基(以后，称为显现活性的培养基)，在121℃用高压锅灭菌20分钟。在该培养基中添加氨苄青霉素使其最终浓度达到100μg/ml后，将由该大肠菌组任意挑选的5个无性繁殖系各植菌一白金耳，在37℃和300rpm的条件下培养约20小时。将完成培养的培养液1ml分别分装到适当的离心管中，然后用离心分离法(15000rpm×5分钟)将该菌体分离。将该菌体悬浮在200μl的磷酸钾缓冲液中(PH值为7.0)，然后往其中添加1％(重量比)的丙烯腈在10℃反应2分钟。在反应液中添加同其等量的1M磷酸水溶液使反应停止，用同前实施例中同样的HPLC分析测定所生成的丙烯酰胺浓度。其结果，在5个无性繁殖系中的4个检出了有丙烯酰胺生成，证实保持了腈水合酶的活性。由供测定腈水合酶活性的上述培养液的剩余部分1ml分别分离该4个无性繁殖系中的菌体，用碱SDS提取法制得各无性繁殖系的质粒DNA。随后，通过使用ABI社制的定序用《Kit》和自动定序装置373A的引物扩展法(Primer exten sion)确定了各无性繁殖系的腈水合酶的组成基因的碱基序列。其结果，示于表1的无性繁殖系NO：1中的腈水合酶的α亚基第6号的Leu被置换为Met。

无性繁殖系号	变异处	氨基酸序列变化		碱基序列变化
	变异处	氨基酸序列变化		碱基序列变化		α亚基内	置换前	置换后	置换前	置换后
	NO：1	α第6号	Leu	Met	CTG	α亚基内	置换前	置换后	置换前	置换后	ATG

随后，为了将α亚基内的第126号的Phe置换成Tyr，将无性繁殖系NO：1的质粒DNA作为模板，通过同上述相同的操作实现部位特异的变异导入。

也就是说，在30ml的试管中配制10ml的LB液体培养基，在121℃用高压锅灭菌20分钟。添加氨苄青霉素使该培养基的最终浓度达到100μg/ml后，将所得到的无性繁殖系NO：1菌株植菌一白金耳，在37℃，300rpm条件下培养约20小时。将该培养液1ml分装到适当的离心管中，用离心分离法(15000rpm×5分钟)分离菌体，随后用碱SDS提取法由该菌体制得无性繁殖系No：1菌株的质粒DNA。将无性繁殖系No：1菌株的质粒DNA 1μg作为模板进行两种PCR反应。PCR反应4号是用各自含有50p mol的序列表的序列5号记载的引物及M13引物M4(序列表的序列2号中记载的序列)总量为50μl的混合液(其组成根据《kit》记载的条件)，在以下的条件下重复进行25次循环，即：热变性(98℃)15秒、缓冷(55℃)30秒、伸长反应(72℃)120秒。PCR反应5号是用各自含有50pmol的MUT4引物(序列表的序列3号中记载的序列)及M13引物RV(序列表的序列4号中记载的序列)总量50μl的混合液(其组成根据《kit》记载的条件)实施同PCR反应4号相同的操作。通过用PCR反应4号和5号反应完成后的反应液各5μl的琼脂糖电泳分析(琼脂糖的浓度为1.0％--重量比)，进行DNA增幅产物的分析，证实增幅DNA产物的存在。以后，通过同无性繁殖系No：1情况完全相同的操作，制得大肠菌组群。

将由该大肠菌组任意挑选的5个无性繁殖系各殖菌一白金耳于同无性繁殖系NO：1情况相同的显示活性的培养基10ml中，在37℃、300rpm的条件下培养约20小时。将完成培养的该培养液1ml分别分装于适当的离心管中，然后测定腈水合酶的活性。其结果，在5个无性繁殖系中有4个检测出生成了丙烯酰胺，证实保持了腈水合酶的活性。

由供测定腈水合酶活性的上述培养液的剩余部分1ml分别分离出该4个无性繁殖系的菌体，用碱SDS提取法制得各无性繁殖系的质粒DNA。随后，通过同无性繁殖系NO：1情况同样的操作，决定各无性繁殖系的腈水合酶的组成基因加碱基序列。其结果，如表2所示的无性繁殖NO：2中的腈水合酶的α亚基第6号的Leu被置换成Met，α亚基的第126号的Phe被置换成Tyr。

表2

无性繁殖系号	变异处	氨基酸序列的变化		碱基序列的变化
	变异处	氨基酸序列的变化		碱基序列的变化		α-亚基内	野生型	变异体	野生型	变异体
	NO：2	α-第6号α-第126号	LeuPhe	MetTyr	CTGTTC	α-亚基内	野生型	变异体	野生型	变异体	ATGTAC

随后，为了将β亚基的第212号的Ser置换成Tyr，将无性繁殖系NO：2的质粒DNA作为模板，通过同上述相同的操作，实施部位特异的变异导入。

也就是说，在30ml的试管中配制10ml的LB液体培养基，用高压锅在121℃、300rpm的条件下灭菌约20分钟。添加安苄青霉素使该培养基的最终浓度达到100μg/ml，然后将所得到的无性繁殖第No：2的菌株植菌一白金耳，在37℃、300rpm的条件下培养约20小时。将该培养液1ml分装到适当的离心管中，用离心分离法(15000rpm×5分钟)分离菌体。随后，用碱SDS提取法由该菌体制得无性繁殖系NO：1菌株的质粒DNA。

将该无性繁殖系NO：2的质粒DNA1μg作为模板，实施二种PCR反应。PCR反应6号是分别使用含有50pmol的序列表的序列6号记载的引物及M13引物M4(序列表的序列2号中记载的序列)总量为50μl的混合液体(其组成根据《kit》记载的条件)，在以下条件下重复进行25次循环，即：热变性(98℃)15秒、缓冷(55℃)30秒、伸长反应(72℃)120秒。PCR反应7号是分别使用含有50pmol的MUT4引物(序列表的序列3号中记载的序列)及M13引物RV(序列表的序列4号中的记载的序列)总量为50μl的混合液体(其组成根据《kit》记载的条件)，实施同PCR反应6号相同的操作。通过用PCR反应6号和7号的反应完成后的反应液各5μl进行琼脂糖电泳分析(琼脂糖浓度为1.0％-重量比)进行DNA增幅产物的分析，证实了增幅DNA产物的存在。以后，进行同无性繁殖系No：1情况完全相同的操作，制得大肠菌组群。

将由该大肠菌组群任意挑选的5个无性繁殖系各植菌一白金耳于同无性繁殖系NO：1情况相同的显示活性的培养基10ml中，在37℃、300rpm条件下培养约20小时。将该培养完成后的培养液1ml分别分装到适当的离心管中，然后测定腈水合酶的活性。其结果，在5个无性繁殖系的4个中检测出丙烯酰胺的生成，从而证实保持了腈水合酶的活性。

由供测定腈水合酶活性的上述培养液的剩余部分1ml分别分离该4个无性繁殖系的菌体，用碱SDS提取法制得各无性繁殖系的质粒DNA。随后，通过同无性繁殖系NO：1情况相同的操作，决定各无性繁殖系的腈水合酶的组成基因的碱基序列。其结果，如表3所示的无性繁殖系NO：3中的腈水合酶的β亚基的第212号的Ser被置换成Tyr。

表3

无性繁殖系号	变异处	氨基酸序列的变化		碱基序列的变化
无性繁殖系号		氨基酸序列的变化		碱基序列的变化		NO：3	野生型	变异体	野生型	变异体
α-6号		Leu	Met	CTG	ATG		野生型	变异体	野生型	变异体
α-6号	α-126号	Leu	Met	CTG	ATG		Phe	Tyr	TTC	TAC
β-212号	α-126号	Ser	Tyr	TCC	TAC		Phe	Tyr	TTC	TAC

培养该无性繁殖系NO：3的菌体，得到反应中所必须的菌体。以下列出典型的培养例子。

在500ml的带有缓冲板的三角烧瓶中配制下述组成的培养基100ml，用高压锅在121℃灭菌20分钟，在该培养基中添加氨苄青霉素使其最终浓度达到50μg/ml，然后将上述无性繁殖系NO：3的菌体植菌一白金耳，在37℃、130rpm的条件下培养20小时。通过离心分离(15000rpm×5分钟)仅将该菌体与培养液分离，随后，将该菌体再次悬浮于50ml的生理食盐水中，然后再次进行离心分离从而得到湿菌体。

培养基的组成

酵母提取物 5.0克/升

细菌培养基用胨 10克/升

氯化钠 5克/升

六水氯化钴 10毫克/升

七水硫酸铁 40毫克/升

pH值为7.5

(2)由丙烯腈的水合产生的丙烯酰胺的合成反应

将用上述培养方法得到的湿菌体2份(重量)悬浮在0.3mM氢氧化钠水溶液98份(重量)中，将该悬浮液和丙烯腈分别以50克/小时、30克/小时的量边搅拌边连续地供给作为第1反应器并预先装入400克水的1升玻璃制的烧瓶中，同时以80克/小时的量连续地抽取反应液使其液面保持一定，将该液体连续地供给作为第2反应器的内径为5毫米长度为20米的聚四氟乙烯制的管子中。反应温度如下控制：将上述第1反应器和第2反应器都浸没在约10℃-20℃的水浴中，使其内部温度为15℃。

从反应开始计时在200小时后进行HPLC分析，对第2反应器出口的反应液进行分析的结果，反应液中只有丙烯酰胺存在(浓度为50％-重量比)，丙烯腈在检测误差范围以下(100ppm-重量)。

比较例1

反应时间同上述实施例的情况相同，只是反应器仅有做为第1反应器的搅拌槽。也就是说，除了将反应器变更为2升的玻璃制烧瓶而且将其中的液体量变更为800克外，其余同实施例的操作相同。从开始反应计时在200小时后进行HPLC分析，对反应器出口的反应液进行分析的结果，检测出反应液中的丙烯酰胺为48％(重量比)，丙烯腈为1.9％(重量比)。这样，证实了在本比较例中，残留着未反应的丙烯腈，反应没有完成。

比较例2

作为第二反应器，除了连续地进行抽取反应液这样的操作外，其余同实施例1同样地进行操作，即：同第一反应器同样地在预先装入400克水的一升玻璃制的烧瓶中，一边进行搅拌，一边连续地供给第一反应器出口的反应液，从而使其液面水平保持一定。

从开始反应计时在200小时后通过HPLC分析，对第二反应器出口的反应液进行分析的结果，检测出反应液中的丙烯酰胺为49.5％(重量比)，丙烯腈为3000ppm(重量)。证实了在本比较例中，残留着未反应的丙烯腈，反应没有完成。

使用本发明可以高的转化率使腈化合物进行水合反应而连续地制造高浓度的酰胺化合物水溶液，也未见到残留的腈化合物；另外，可在比较短的时间内容易地制造。本发明的方法可适合用作工业化生产酰胺化合物的方法。

序列表

<110>三井化学株式会社

<120>酰胺化合物的制造方法

<130>F-1893

<140>

<141>

<150>JP 2000-019203

<151>200-03-29

<160>6

<170>PatentIn Ver.2.1

<210>1

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：PCR引物用低核苷酸

<400>1

aacatcatgc gcaagtcg 18

<210>2

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：PCR引物用低核苷酸

<400>2

caggaaacag ctatgac 17

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：PCR引物用低核苷酸

<400>3

ggccagtgcc tagcttacat 20

<210>4

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：PCR引物用低核苷酸

<400>4

gttttcccag tcacgac 17

<210>5

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：PCR引物用低核苷酸

<400>5

aactggtaca aggagccg 18

<210>6

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：PCR引物用低核苷酸

<400>6

ccgaactaca gcgtctac 18

Claims

1、一种酰胺化合物的制造方法，在将含有腈水合酶的微生物的菌体或其菌体处理物在水性媒质中同腈化合物反应而连续地制造酰胺化合物的方法中，其特征在于：将该菌体或其菌体处理物用装有搅拌机的槽形反应器在水性媒质中同腈化合物接触反应后所得到的反应液在具有活塞式流动性流域的条件下再进行反应。

2、根据权利要求1所述的制造方法，其特征在于：腈化合物是丙烯腈，同微生物的菌体或其菌体处理物接触时的水和丙烯腈的比例是：相对于1重量份水，丙烯腈为0.4-1.5重量份。

3、根据权利要求1或2所述的制造方法，其特征在于：该微生物菌体是一种使腈水合酶的基因在任意宿主中表达而得到的转化体，所述腈水合酶的基因是由能够产生腈水合酶的基因的微生物克隆得到的。