Claims (7)
1. Способ обнаружения микобактерий туберкулезного комплекса с одновременным определением мутаций в ДНК микобактерий, приводящих к устойчивости возбудителя к рифампицину и изониазиду, включающий:1. A method for detecting mycobacterium tuberculosis complex with simultaneous determination of mutations in the DNA of mycobacteria, leading to the resistance of the pathogen to rifampicin and isoniazid, including:
а) - мультиплексную амплификацию фрагментов генов rpoB, katG. inhA, ahpC и мобильного элемента IS6110 с оригинальными специфичными праймерами на первой стадии ПЦР;a) - multiplex amplification of fragments of rpoB, katG genes. inhA, ahpC and the IS6110 mobile element with original specific primers in the first stage of PCR;
б) - мультиплексную амплификацию фрагментов генов rpoB, katG, inhA, ahpC, мобильного элемента IS6110 с использованием флуоресцентно меченных праймеров на второй стадии ассиметричной ПЦР;b) - multiplex amplification of gene fragments rpoB, katG, inhA, ahpC, mobile element IS6110 using fluorescently labeled primers at the second stage of asymmetric PCR;
в) - изготовление олигонуклеотидного биочипа для обнаружения микобактерий туберкулезного комплекса и определения мутаций, приводящих к устойчивости к рифампицину и изониазиду;c) - the manufacture of an oligonucleotide biochip for the detection of mycobacterium tuberculosis complex and the determination of mutations leading to resistance to rifampicin and isoniazid;
г) - гибридизацию амплифицированных флуоресцентно меченных продуктов ассиметричной ПЦР на биочипе;g) - hybridization of amplified fluorescently labeled products of asymmetric PCR on a biochip;
д) - регистрацию и,d) - registration and,
е) - интерпретацию результатов гибридизации.e) - interpretation of the results of hybridization.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что амплификацию фрагментов генов rpoB, katG, inhA, ahpC и мобильного элемента IS6110 (стадия а) проводят, используя непосредственно материал клинического образца (мокроту, экссудат, смыв, бронхо-альвеолярный лаваж).2. The method according to claim 1, characterized in that the amplification of fragments of the rpoB, katG, inhA, ahpC genes and the IS6110 mobile element (stage a) is carried out using directly the material of the clinical sample (sputum, exudate, flush, broncho-alveolar lavage).
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что при изготовлении биочипа (стадия в) используют оригинальный набор олигонуклеотидов, позволяющий однозначно определять точечные мутации в участках генов rpoB, katG. inhA, ahpC, мобильного3. The method according to claim 1, characterized in that in the manufacture of the biochip (stage c), an original set of oligonucleotides is used, which makes it possible to uniquely determine point mutations in the regions of rpoB, katG genes. inhA, ahpC, mobile
элемента IS6110, причем порядок размещения иммобилизованных олигонуклеотидов наelement IS6110, and the order of placement of immobilized oligonucleotides on
биочипе позволяет визуально определить наличие мутации и ее точную локализацию.the biochip allows you to visually determine the presence of a mutation and its exact localization.
4. Способ по п.1, отличающийся гем, что разработанные условия гибридизации (стадия г) обеспечивают высокую степень дифференциации между совершенными и несовершенными гибридизационными дуплексами, определяемую отношением флуоресцентного сигнала, регистрируемого в ячейке, в которой образовался совершенный гибридизационный дуплекс, к таковому, регистрируемому в ячейке, в которой образовался несовершенный дуплекс.4. The method according to claim 1, characterized in that the developed hybridization conditions (stage d) provide a high degree of differentiation between perfect and imperfect hybridization duplexes, determined by the ratio of the fluorescent signal recorded in the cell in which the perfect hybridization duplex was formed to that recorded in the cell in which the imperfect duplex was formed.
5. Способ по п.1, отличающийся тем, что регистрацию результатов (стадия д) проводят визуально.5. The method according to claim 1, characterized in that the registration of results (stage d) is carried out visually.
6. Способ по п.1, отличающийся тем, что регистрацию результатов (стадия д) проводят с помощью фотографирующего устройства.6. The method according to claim 1, characterized in that the registration of the results (stage d) is carried out using a photographing device.
7. Способ по п.1, отличающийся тем, что интерпретацию зарегистрированных результатов (стадия е) выполняют путем сравнения интенсивности флуоресценции сигналов, полученных при совершенной и несовершенной гибридизации.7. The method according to claim 1, characterized in that the interpretation of the recorded results (stage e) is performed by comparing the fluorescence intensity of the signals obtained with perfect and imperfect hybridization.