[go: up one dir, main page]

RS67250B1 - Metode i kompozicije za lečenje poremećaja povezanog sa serpinc1 - Google Patents

Metode i kompozicije za lečenje poremećaja povezanog sa serpinc1

Info

Publication number
RS67250B1
RS67250B1 RS20250930A RSP20250930A RS67250B1 RS 67250 B1 RS67250 B1 RS 67250B1 RS 20250930 A RS20250930 A RS 20250930A RS P20250930 A RSP20250930 A RS P20250930A RS 67250 B1 RS67250 B1 RS 67250B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
double
rnai agent
subject
nucleotides
stranded rnai
Prior art date
Application number
RS20250930A
Other languages
English (en)
Inventor
Akin Akinc
Benny Sorensen
Pushkal Garg
Gabriel Robbie
Original Assignee
Genzyme Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Genzyme Corp filed Critical Genzyme Corp
Publication of RS67250B1 publication Critical patent/RS67250B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/549—Sugars, nucleosides, nucleotides or nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering nucleic acids [NA]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/321—2'-O-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/322—2'-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/33—Chemical structure of the base
    • C12N2310/335—Modified T or U
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/346—Spatial arrangement of the modifications having a combination of backbone and sugar modifications
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/352—Nature of the modification linked to the nucleic acid via a carbon atom
    • C12N2310/3521—Methyl
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/353—Nature of the modification linked to the nucleic acid via an atom other than carbon
    • C12N2310/3533—Halogen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/35—Special therapeutic applications based on a specific dosage / administration regimen

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Opis
Lista sekvenci
[0001] Ova prijava sadrži Listu sekvenci koja je elektronski podneta u ASCII formatu. Navedena ASCII kopija, kreirana 6. decembra 2016. godine, nazvana je 121301-05220_SL.TXT i njena veličina je 21.140 bajtova.
Osnova pronalaska
[0002] Serpinc1 je član superfamilije inhibitora serinske proteinaze (serpina). Serpinc1 je inhibitor plazma proteaze koji inhibira trombin, kao i druge aktivirane serinske proteaze koagulacionog sistema, kao što su faktori X, IX, XI, XII i VII, i na taj način reguliše kaskadu koagulacije krvi. Antikoagulantna aktivnost Serpinc1 je pojačana prisustvom heparina i drugih srodnih glikozaminoglikana, koji katalizuju stvaranje kompleksa trombin:antitrombin (TAT).
[0003] Poremećaji krvarenja, bilo nasledni ili stečeni, su stanja u kojima je zgrušavanje krvi neadekvatno. Na primer, hemofilija je grupa naslednih genetskih poremećaja krvarenja koji narušavaju sposobnost tela da kontroliše zgrušavanje ili koagulaciju krvi. Hemofilija A je recesivni genetski poremećaj vezan za X hromozom koji uključuje nedostatak funkcionalnog faktora zgrušavanja VIII i predstavlja 80% slučajeva hemofilije. Hemofilija B je recesivni genetski poremećaj vezan za X hromozom koji uključuje nedostatak funkcionalnog faktora zgrušavanja IX. Ona čini približno 20% slučajeva hemofilije. Hemofilija C je autosomni genetski poremećaj koji uključuje nedostatak funkcionalnog faktora zgrušavanja XI. Hemofilija C nije u potpunosti recesivna, jer i heterozigotne osobe pokazuju pojačano krvarenje.
[0004] Iako trenutno ne postoji lek za hemofiliju, ona se može kontrolisati redovnim infuzijama faktora zgrušavanja koji nedostaje, npr. faktora VIII kod hemofilije A. Međutim, neki hemofiličari razvijaju antitela (inhibitore) protiv zamenskih faktora koji im se daju i, stoga, postaju otporni na zamenski faktor koagulacije. Shodno tome, krvarenja kod takvih subjekata ne mogu se pravilno kontrolisati.
[0005] Razvoj inhibitora visokih titara na, na primer, faktor VIII i druge faktore koagulacije je najozbiljnija komplikacija terapije hemofilije i čini lečenje krvarenja veoma izazovnim. Trenutno, jedine strategije za zaustavljanje krvarenja kod takvih subjekata su upotreba „sredstava za premošćavanje“, kao što su aktivnost za premošćavanje inhibitora faktora osam (FEIBA) i aktivirani rekombinantni faktor VII (rFVIIa), plazmafereza, kontinuirana zamena faktora i terapija imunološke tolerancije, od kojih nijedna nije potpuno delotvorna. Shodno tome, postoji potreba u struci za alternativnim tretmanima za subjekte sa poremećajem krvarenja, kao što je hemofilija.
Sažetak pronalaska
[0006] Predmetni pronalazak je definisan patentnim zahtevima. Ovde su generalno opisane metode za lečenje subjekta koji ima poremećaj kod koga bi bila korisna inhibicija ili smanjenje ekspresije gena Serpinc1, npr. poremećaj krvarenja, kao što je hemofilija, koristeći iRNK kompozicije koje vrše cepanje RNK transkripata gena Serpinc1 posredovano kompleksom za utišavanje izazvano RNK (RISC) u cilju inhibicije ekspresije gena Serpinc1. Raniji pristupi koji koriste agense bazirane na RNK interferenciji (RNKi) za inhibiciju ekspresije Serpinc1 i lečenje subjekata sa bolešću povezanom sa Serpinc1 opisani su u WO2015/175510 i WO2013/163430, koje su podnete od strane istog podnosioca kao i ova prijava.
[0007] Predmetni pronalazak je zasnovan, barem delimično, na iznenađujućem otkriću da veoma niske doze (npr. doze najmanje oko 30 puta niže od doza opisanih u struci) dvolančanog RNKi agensa povezanog sa GalNAc, koji sadrži posebne hemijske modifikacije, pokazuju izuzetnu potentnost da inhibiraju ekspresiju Serpinc1, kao i izuzetno trajanje inhibicije ekspresije Serpinc1. Konkretno, pokazano je da su niske doze RNKi agenasa koji sadrže GalNAc ligand i sens lanac i antisens lanac kod kojih su suštinski svi nukleotidi modifikovani, kao što su RNKi agensi koji sadrže jedan ili više motiva od tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida, uključujući jedan takav motiv na mestu cepanja agenasa ili blizu njega, šest fosforotioatnih veza i GalNAc ligand, izuzetno delotvorni i trajni u utišavanju aktivnosti gena Serpinc1.
[0008] Predmetni pronalazak je definisan patentnim zahtevima. Shodno tome, u prvom aspektu, pronalazak se odnosi na dvolančani RNKi agens za upotrebu u sprečavanju najmanje jednog simptoma kod, ili u lečenju, ljudskog subjekta koji ima poremećaj kod koga bi bila korisna redukcija ekspresije Serpinc1, pri čemu se dvolančani RNKi agens primenjuje subjektu kao fiksna doza od oko 40 mg do oko 90 mg, pri čemu dvolančani RNKi agens sadrži sens lanac i antisens lanac, pri čemu antisens lanac sadrži region komplementarnosti koji se sastoji od najmanje 15 uzastopnih nukleotida koji se ne razlikuju za više od 3 nukleotida od nukleotidne sekvence 5'-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3' (SEQ ID NO: 15), pri čemu su suštinski svi nukleotidi sens lanca i suštinski svi nukleotidi antisens lanca modifikovani nukleotidi, i pri čemu je sens lanac konjugovan sa ligandom pričvršćenim na 3' kraju. U drugom aspektu, pronalazak se odnosi na komplet za upotrebu u sprečavanju najmanje jednog simptoma kod, ili lečenju, subjekta koji ima poremećaj kod koga bi bila korisna redukcija ekspresije Serpinc1, koji sadrži: a) dvolančani RNKi agens u skladu sa prvim aspektom pronalaska, pri čemu se dvolančani RNKi agens primenjuje subjektu u fiksnoj dozi od oko 40 mg do oko 90 mg, i b)
uputstva za upotrebu, i c) opciono, sredstva za primenu dvolančanog RNKi agensa subjektu.
[0009] Takođe, ovde su opisane metode za sprečavanje najmanje jednog simptoma kod subjekta koji ima poremećaj kod koga bi bila korisna redukcija ekspresije Serpinc1. Metode uključuju primenu na subjektu doze od oko 0,200 mg/kg do oko 1,825 mg/kg dvolančanog RNKi agensa koji sadrži sens lanac i antisens lanac koji formiraju dvolančani region, pri čemu sens lanac sadrži najmanje 15 uzastopnih nukleotida koji se ne razlikuju za više od 3 nukleotida od nukleotidne sekvence SEQ ID NO: 1 i antisens lanac sadrži najmanje 15 uzastopnih nukleotida koji se ne razlikuju za više od 3 nukleotida od nukleotidne sekvence SEQ ID NO:5, pri čemu su suštinski svi nukleotidi sens lanca i suštinski svi nukleotidi antisens lanca modifikovani nukleotidi, i pri čemu dvolančani RNKi agens sadrži ligand, npr. sens lanac dvolančanog RNKi agensa je konjugovan sa ligandom, npr. ligand je pričvršćen na 3'-kraj sens lanca.
[0010] Takođe, ovde su opisane metode lečenja subjekta koji ima poremećaj kod koga bi bila korisna redukcija ekspresije Serpinc1. Metode uključuju primenu na subjektu doze od oko 0,200 mg/kg do oko 1,825 mg/kg dvolančanog RNKi agensa koji sadrži sens lanac i antisens lanac koji formiraju dvolančani region, pri čemu sens lanac sadrži najmanje 15 uzastopnih nukleotida koji se ne razlikuju za više od 3 nukleotida od nukleotidne sekvence SEQ ID NO: 1 i antisens lanac sadrži najmanje 15 uzastopnih nukleotida koji se ne razlikuju za više od 3 nukleotida od nukleotidne sekvence SEQ ID NO:5, pri čemu su suštinski svi nukleotidi sens lanca i suštinski svi nukleotidi antisens lanca modifikovani nukleotidi, i pri čemu dvolančani RNKi agens sadrži ligand, npr. sens lanac dvolančanog RNKi agensa je konjugovan sa ligandom, npr. ligand je pričvršćen na 3'-kraj sens lanca.
[0011] U jednom otelotvorenju, svi nukleotidi sens lanca i svi nukleotidi antisens lanca su modifikovani nukleotidi.
[0012] U drugom slučaju, sens lanac i antisens lanac sadrže region komplementarnosti koji se sastoji od najmanje 15 uzastopnih nukleotida koji se ne razlikuju za više od 3 nukleotida od bilo koje od sekvenci navedenih u bilo kojoj od tabela 2 i 3.
[0013] U nekim slučajevima, modifikovani nukleotidi su nezavisno odabrani iz grupe koja se sastoji od 2'-O-metil modifikovanog nukleotida, 2'-fluoro modifikovanog nukleotida, nukleotida koji sadrži 5'-fosforotioatnu grupu, i terminalnog nukleotida povezanog sa holesterilnim derivatom ili dodekanskom kiselinom bisdecilamid grupom. U daljim slučajevima, modifikovani nukleotid je odabran iz grupe koja se sastoji od 2'-deoksi-2'-fluoro modifikovanog nukleotida, 2'-deoksi-modifikovanog nukleotida, zaključanog nukleotida, otključanog nukleotida, konformaciono ograničenog nukleotida, kontrainiranog etil nukleotida, abazičnog nukleotida, 2'-amino-modifikovanog nukleotida, 2'-alkil-modifikovanog nukleotida, 2'-O-alil modifikovanog nukleotida, 2'-C-alil modifikovanog nukleotida, 2'-hidroksil modifikovanog nukleotida, morfolino nukleotida, fosforamidata, i nukleotida koji sadrži nenaturalnu bazu.
[0014] U drugom slučaju dvolančanog RNKi agensa, najmanje jedan lanac sadrži 3' izbočinu od najmanje 1 nukleotida. U drugom slučaju, najmanje jedan lanac sadrži 3' izbočinu od najmanje 2 nukleotida, npr. 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14, ili 15 nukleotida. U drugim slučajevima, najmanje jedan lanac RNKi agensa sadrži 5' izbočinu od najmanje 1 nukleotida. U određenim slučajevima, najmanje jedan lanac sadrži 5' izbočinu od najmanje 2 nukleotida, npr. 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14, ili 15 nukleotida. U drugim slučajevima, i 3' i 5' kraj jednog lanca RNKi agensa sadrže izbočinu od najmanje 1 nukleotida.
[0015] U određenim otelotvorenjima, ligand je N-acetilgalaktozamin (GalNAc). Ligand može biti jedan ili više GalNAc pričvršćenih na RNKi agens preko monovalentnog, bivalentnog ili trivalentnog razgranatog linkera. Ligand može biti konjugovan sa 3' krajem sens lanca dvolančanog RNKi agensa, 5' krajem sens lanca dvolančanog RNKi agensa, 3' krajem antisens lanca dvolančanog RNKi agensa, ili 5' krajem antisens lanca dvolančanog RNKi agensa.
[0016] Dvolančani RNKi agensi mogu da sadrže više, npr. 2, 3, 4, 5, ili 6, GalNAc, svaki nezavisno pričvršćen na više nukleotida dvolančanog RNKi agensa preko više monovalentnih linkera.
[0017] U određenim otelotvorenjima, ligand je
[0018] Takođe, ovde su opisane metode za sprečavanje najmanje jednog simptoma kod subjekta koji ima poremećaj kod koga bi bila korisna redukcija ekspresije Serpinc1. Metode uključuju primenu na subjektu doze od oko 0,200 mg/kg do oko 1,825 mg/kg dvolančanog RNKi agensa, pri čemu dvolančani RNKi agens sadrži sens lanac komplementaran antisens lancu, pri čemu antisens lanac sadrži region komplementarnosti delu iRNK koja kodira Serpinc1, pri čemu je svaki lanac dugačak oko 14 do oko 30 nukleotida, pri čemu je dvolančani RNKi agens predstavljen formulom (IIIe):
sens:
antisens:
gde je:
np' izbočina od 2 nukleotida i svaki nukleotid unutar np' je povezan sa susednim nukleotidom putem fosforotioatne veze;
svaki Nai Na' nezavisno predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja sadrži 0-25 nukleotida koji su ili modifikovani ili nemodifikovani ili njihove kombinacije, pri čemu svaka sekvenca sadrži najmanje dva različito modifikovana nukleotida;
YYY i Y'Y'Y' svaki nezavisno predstavlja jedan motiv od tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida, i pri čemu su modifikacije 2'-O-metil ili 2'-fluoro modifikacije; pri čemu sens lanac i antisens lanac svaki nezavisno sadrže dve fosforotioatne veze na 5'-kraju; i
pri čemu je sens lanac konjugovan sa najmanje jednim ligandom, pri čemu je ligand jedan ili više GalNAc derivata pričvršćenih preko monovalentnog, bivalentnog ili trivalentnog razgranatog linkera,
čime se sprečava najmanje jedan simptom kod subjekta koji ima poremećaj kod koga bi bila korisna redukcija ekspresije Serpinc1.
[0019] Ova objava takođe pruža metode lečenja subjekta koji ima poremećaj kod koga bi bila korisna redukcija ekspresije Serpinc1. Metode uključuju primenu na subjektu doze od oko 0,200 mg/kg do oko 1,825 mg/kg dvolančanog RNKi agensa, pri čemu dvolančani RNKi agens sadrži sens lanac komplementaran antisens lancu, pri čemu antisens lanac sadrži region komplementarnosti delu iRNK koja kodira Serpinc1, pri čemu je svaki lanac dugačak oko 14 do oko 30 nukleotida, pri čemu je dvolančani RNKi agens predstavljen formulom (IIIe): sens:
antisens:
gde je:
np' izbočina od 2 nukleotida i svaki nukleotid unutar np' je povezan sa susednim nukleotidom putem fosforotioatne veze;
svaki Nai Na' nezavisno predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja sadrži 0-25 nukleotida koji su ili modifikovani ili nemodifikovani ili njihove kombinacije, pri čemu svaka sekvenca sadrži najmanje dva različito modifikovana nukleotida;
YYY i Y'Y'Y' svaki nezavisno predstavlja jedan motiv od tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida, i pri čemu su modifikacije 2'-O-metil ili 2'-fluoro modifikacije; pri čemu sens lanac i antisens lanac svaki nezavisno sadrže dve fosforotioatne veze na 5'-kraju; i
pri čemu je sens lanac konjugovan sa najmanje jednim ligandom, pri čemu je ligand jedan ili više GalNAc derivata pričvršćenih preko monovalentnog, bivalentnog ili trivalentnog razgranatog linkera,
čime se sprečava najmanje jedan simptom kod subjekta koji ima poremećaj kod koga bi bila korisna redukcija ekspresije Serpinc1.
[0020] U jednom slučaju, dvolančani RNKi agens se primenjuje subjektu u jednoj dozi ili u dve ili više doza, npr. u 3, 4, 5, ili 6 doza.
[0021] U jednom slučaju, dvolančani RNKi agens se primenjuje subjektu jednom mesečno, jednom u šest nedelja, jednom u 2 meseca, jednom u kvartalu, ili po potrebi.
[0022] Dvolančani RNKi agens može da se primenjuje subjektu kao, npr. mesečna doza od oko 0,200 do oko 1,825 mg/kg, 0,200 do oko 1,800 mg/kg, oko 0,200 do oko 1,700 mg/kg, oko 0,200 do oko 1,600 mg/kg, oko 0,200 do oko 1,500 mg/kg, oko 0,200 do oko 1,400 mg/kg, oko 0,200 do oko 1,400 mg/kg, oko 0,200 do oko 1,200 mg/kg, oko 0,200 do oko 1,100 mg/kg, oko 0,200 do oko 1,000 mg/kg, oko 0,200 do oko 0,900 mg/kg, oko 0,200 do oko 0,800 mg/kg, oko 0,200 do oko 0,700 mg/kg, oko 0,200 do oko 0,600 mg/kg, oko 0,200 do oko 0,500 mg/kg, oko 0,200 do oko 0,400 mg/kg, oko 0,225 do oko 1,825 mg/kg, oko 0,225 do oko 1,800 mg/kg, oko 0,225 do oko 1,700 mg/kg, oko 0,225 do oko 1,600 mg/kg, oko 0,225 do oko 1,500 mg/kg, oko 0,225 do oko 1,400 mg/kg, oko 0,225 do oko 1,400 mg/kg, oko 0,225 do oko 1,200 mg/kg, oko 0,225 do oko 1,100 mg/kg, oko 0,225 do oko 1,000 mg/kg, oko 0,225 do oko 0,900 mg/kg, oko 0,225 do oko 0,800 mg/kg, oko 0,225 do oko 0,700 mg/kg, oko 0,225 do oko 0,600 mg/kg, oko 0,225 do oko 0,500 mg/kg, oko 0,225 do oko 0,400 mg/kg, oko 0,250 do oko 1,825 mg/kg, oko 0,250 do oko 1,800 mg/kg, oko 0,250 do oko 1,700 mg/kg, oko 0,250 do oko 1,600 mg/kg, oko 0,250 do oko 1,500 mg/kg, oko 0,250 do oko 1,400 mg/kg, oko 0,250 do oko 1,400 mg/kg, oko 0,250 do oko 1,200 mg/kg, oko 0,250 do oko 1,100 mg/kg, oko 0,250 do oko 1,000 mg/kg, oko 0,250 do oko 0,900 mg/kg, oko 0,250 do oko 0,800 mg/kg, oko 0,250 do oko 0,700 mg/kg, oko 0,250 do oko 0,600 mg/kg, oko 0,250 do oko 0,500 mg/kg, oko 0,250 do oko 0,400 mg/kg, oko 0,425 do oko 1,825 mg/kg, oko 0,425 do oko 1,800 mg/kg, oko 0,425 do oko 1,700 mg/kg, oko 0,425 do oko 1,600 mg/kg, oko 0,425 do oko 1,500 mg/kg, oko 0,425 do oko 1,400 mg/kg, oko 0,425 do oko 1,400 mg/kg, oko 0,425 do oko 1,200 mg/kg, oko 0,425 do oko 1,100 mg/kg, oko 0,425 do oko 1,000 mg/kg, oko 0,425 do oko 0,900 mg/kg, oko 0,425 do oko 0,800 mg/kg, oko 0,425 do oko 0,700 mg/kg, oko 0,425 do oko 0,600 mg/kg, oko 0,425 do oko 0,500 mg/kg, oko 0,450 do oko 1,825 mg/kg, oko 0,450 do oko 1,800 mg/kg, oko 0,450 do oko 1,700 mg/kg, oko 0,450 do oko 1,600 mg/kg, oko 0,450 do oko 1,500 mg/kg, oko 0,450 do oko 1,400 mg/kg, oko 0,450 do oko 1,400 mg/kg, oko 0,450 do oko 1,200 mg/kg, oko 0,450 do oko 1,100 mg/kg, oko 0,450 do oko 1,000 mg/kg, oko 0,450 do oko 0,900 mg/kg, oko 0,450 do oko 0,800 mg/kg, oko 0,450 do oko 0,700 mg/kg, oko 0,450 do oko 0,600 mg/kg, oko 0,450 do oko 0,500 mg/kg, oko 0,475 do oko 1,825 mg/kg, oko 0,475 do oko 1,800 mg/kg, oko 0,475 do oko 1,700 mg/kg, oko 0,475 do oko 1,600 mg/kg, oko 0,475 do oko 1,500 mg/kg, oko 0,475 do oko 1,400 mg/kg, oko 0,475 do oko 1,400 mg/kg, oko 0,475 do oko 1,200 mg/kg, oko 0,475 do oko 1,100 mg/kg, oko 0,475 do oko 1,000 mg/kg, oko 0,475 do oko 0,900 mg/kg, oko 0,475 do oko 0,800 mg/kg, oko 0,475 do oko 0,700 mg/kg, oko 0,475 do oko 0,600 mg/kg, oko 0,475 do oko 0,500 mg/kg, oko 0,875 do oko 1,825 mg/kg, oko 0,875 do oko 1,800 mg/kg, oko 0,875 do oko 1,700 mg/kg, oko 0,875 do oko 1,600 mg/kg, oko 0,875 do oko 1,500 mg/kg, oko 0,875 do oko 1,400 mg/kg, oko 0,875 do oko 1,400 mg/kg, oko 0,875 do oko 1,200 mg/kg, oko 0,875 do oko 1,100 mg/kg, oko 0,875 do oko 1,000 mg/kg, oko 0,875 do oko 0,900 mg/kg, oko 0,900 do oko 1,825 mg/kg, oko 0,900 do oko 1,800 mg/kg, oko 0,900 do oko 1,700 mg/kg, oko 0,900 do oko 1,600 mg/kg, oko 0,900 do oko 1,500 mg/kg, oko 0,900 do oko 1,400 mg/kg, oko 0,900 do oko 1,400 mg/kg, oko 0,900 do oko 1,200 mg/kg, oko 0,900 do oko 1,100 mg/kg, oko 0,900 do oko 1,000 mg/kg, oko 0,925 do oko 1,825 mg/kg, oko 0,925 do oko 1,800 mg/kg, oko 0,925 do oko 1,700 mg/kg, oko 0,925 do oko 1,600 mg/kg, oko 0,925 do oko 1,500 mg/kg, oko 0,925 do oko 1,400 mg/kg, oko 0,925 do oko 1,400 mg/kg, oko 0,925 do oko 1,200 mg/kg, oko 0,925 do oko 1,100 mg/kg, ili oko 0,925 do oko 1,000 mg/kg, kao npr. mesečna doza tokom jednog, dva, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam meseci ili više.
[0023] Subjekt može biti čovek, na primer čovek sa poremećajem krvarenja, kao što je stečeni poremećaj krvarenja ili nasledni poremećaj krvarenja, npr. hemofilija, npr. hemofilija A ili hemofilija B.
[0024] U jednom otelotvorenju, subjekt ima hemofiliju A i subjekt je sa inhibitorom. U drugom otelotvorenju, subjekt ima hemofiliju B i subjekt je sa inhibitorom.
[0025] U jednom slučaju, primena dvolančanog RNKi agensa subjektu uzrokuje povećanje zgrušavanja krvi i/ili smanjenje akumulacije Serpinc1 proteina.
[0026] U jednom slučaju, metode dalje obuhvataju merenje nivoa trombina u subjektu.
[0027] Dvolančani RNKi agens može se primeniti supkutano ili intravenozno.
[0028] U jednom slučaju, suštinski svi nukleotidi antisens lanca i suštinski svi nukleotidi sens lanca RNKi agensa sadrže modifikaciju izabranu iz grupe koja se sastoji od 2'-O-metil modifikacije i 2'-fluoro modifikacije. U jednom otelotvorenju, svi nukleotidi sens lanca i svi nukleotidi antisens lanca RNKi agensa su modifikovani nukleotidi.
[0029] U jednom slučaju, motiv YYY se javlja na mestu cepanja sens lanca ili blizu njega.
[0030] U jednom slučaju, motiv Y'Y'Y' se javlja na 11, 12 i 13. poziciji antisens lanca od 5'-kraja.
[0031] dvolančani region može biti dugačak 15-30 parova nukleotida, 17-23 para nukleotida, 17-25 parova nukleotida, 23-27 parova nukleotida, 19-21 par nukleotida, ili 21-23 para nukleotida.
[0032] Svaki lanac može imati 15-30 nukleotida, ili 19-30 nukleotida.
[0033] U jednom slučaju, sens lanac ima ukupno 21 nukleotid, a antisens lanac ima ukupno 23 nukleotida.
[0034] U jednom otelotvorenju, ligand je
[0035] U skladu sa pronalaskom, ligand je pričvršćen na 3' kraj sens lanca.
[0036] U jednom otelotvorenju, RNKi agens je konjugovan sa ligandom kao što je prikazano na sledećoj šemi
gde je X O ili S.
[0037] U jednom slučaju, par baza na 1. poziciji 5'-kraja antisens lanca dupleksa je AU par baza.
[0038] U jednom otelotvorenju, RNKi agens je AD-57213 ((sens lanac (5' do 3'): GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf (SEQ ID NO: 13); antisens lanac (5' do 3'): usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg (SEQ ID NO:14), gde su A, C, G i U riboza A, C, G ili U; a, c, g i u su 2'-O-metil (2'-OMe) A, C, G ili U; Af, Cf, Gf ili Uf su 2'-fluoro A, C, G ili U; i s je fosforotioatna veza)).
[0039] U jednom otelotvorenju, agens treba da se primeni kao farmaceutska kompozicija. U jednom otelotvorenju, RNKi agens treba da se primeni u nepuferovanom rastvoru, kao što je fiziološki rastvor ili voda.
[0040] U drugom otelotvorenju, siRNK treba da se primeni sa puferovanim rastvorom, kao što je puferovani rastvor koji sadrži acetat, citrat, prolamin, karbonat ili fosfat ili bilo koju njihovu kombinaciju. U jednom otelotvorenju, puferovani rastvor je fosfatno puferovani fiziološki rastvor (PBS).
[0041] Ova objava takođe pruža metode za sprečavanje najmanje jednog simptoma kod subjekta koji ima poremećaj kod koga bi bila korisna redukcija ekspresije Serpinc1. Metode uključuju primenu na subjektu doze od oko 0,200 mg/kg do oko 1,825 mg/kg dvolančanog agensa ribonukleinske kiseline (RNKi), pri čemu dvolančani RNKi agens sadrži sens lanac i antisens lanac, pri čemu antisens lanac sadrži region komplementarnosti koji se sastoji od najmanje 15 uzastopnih nukleotida koji se ne razlikuju za više od 3 nukleotida od nukleotidne sekvence 5' - UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG - 3' (SEQ ID NO: 15), pri čemu su suštinski svi nukleotidi sens lanca i suštinski svi nukleotidi antisens lanca modifikovani nukleotidi, i pri čemu dvolančani RNKi agens sadrži ligand, npr. sens lanac dvolančanog RNKi agensa je konjugovan sa ligandom pričvršćenim na 3'-kraj sens lanca.
[0042] Ova objava takođe pruža metode lečenja subjekta koji ima poremećaj kod koga bi bila korisna redukcija ekspresije Serpinc1. Metode uključuju primenu na subjektu doze od oko 0,200 mg/kg do oko 1,825 mg/kg dvolančanog agensa ribonukleinske kiseline (RNKi), pri čemu dvolančani RNKi agens sadrži sens lanac i antisens lanac, pri čemu antisens lanac sadrži region komplementarnosti koji se sastoji od najmanje 15 uzastopnih nukleotida koji se ne razlikuju za više od 3 nukleotida od nukleotidne sekvence 5' -UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG - 3' (SEQ ID NO: 15), pri čemu su suštinski svi nukleotidi sens lanca i suštinski svi nukleotidi antisens lanca modifikovani nukleotidi, i pri čemu dvolančani RNKi agens sadrži ligand, npr. sens lanac dvolančanog RNKi agensa je konjugovan sa ligandom pričvršćenim na 3'-kraj sens lanca.
[0043] Dvolančani RNKi agens može da se primeni subjektu u dve ili više doza.
[0044] U jednom otelotvorenju, dvolančani RNKi agens treba da se primeni subjektu jednom mesečno. U drugom otelotvorenju, dvolančani RNKi agens treba da se primeni subjektu jednom u šest nedelja. U jednom otelotvorenju, dvolančani RNKi agens treba da se primeni subjektu jednom u 2 meseca. U drugom otelotvorenju, dvolančani RNKi agens treba da se primenjuje subjektu jednom u kvartalu.
[0045] Dvolančani RNKi agens može da se primenjuje subjektu kao, npr. mesečna doza od oko 0,200 do oko 1,825 mg/kg, 0,200 do oko 1,800 mg/kg, oko 0,200 do oko 1,700 mg/kg, oko 0,200 do oko 1,600 mg/kg, oko 0,200 do oko 1,500 mg/kg, oko 0,200 do oko 1,400 mg/kg, oko 0,200 do oko 1,400 mg/kg, oko 0,200 do oko 1,200 mg/kg, oko 0,200 do oko 1,100 mg/kg, oko 0,200 do oko 1,000 mg/kg, oko 0,200 do oko 0,900 mg/kg, oko 0,200 do oko 0,800 mg/kg, oko ,200 do oko 0,700 mg/kg, oko 0,200 do oko 0,600 mg/kg, oko 0,200 do oko 0,500 mg/kg, oko ,200 do oko 0,400 mg/kg, oko 0,225 do oko 1,825 mg/kg, oko 0,225 do oko 1,800 mg/kg, oko ,225 do oko 1,700 mg/kg, oko 0,225 do oko 1,600 mg/kg, oko 0,225 do oko 1,500 mg/kg, oko ,225 do oko 1,400 mg/kg, oko 0,225 do oko 1,400 mg/kg, oko 0,225 do oko 1,200 mg/kg, oko ,225 do oko 1,100 mg/kg, oko 0,225 do oko 1,000 mg/kg, oko 0,225 do oko 0,900 mg/kg, oko ,225 do oko 0,800 mg/kg, oko 0,225 do oko 0,700 mg/kg, oko 0,225 do oko 0,600 mg/kg, oko ,225 do oko 0,500 mg/kg, oko 0,225 do oko 0,400 mg/kg, oko 0,250 do oko 1,825 mg/kg, oko ,250 do oko 1,800 mg/kg, oko 0,250 do oko 1,700 mg/kg, oko 0,250 do oko 1,600 mg/kg, oko ,250 do oko 1,500 mg/kg, oko 0,250 do oko 1,400 mg/kg, oko 0,250 do oko 1,400 mg/kg, oko ,250 do oko 1,200 mg/kg, oko 0,250 do oko 1,100 mg/kg, oko 0,250 do oko 1,000 mg/kg, oko ,250 do oko 0,900 mg/kg, oko 0,250 do oko 0,800 mg/kg, oko 0,250 do oko 0,700 mg/kg, oko ,250 do oko 0,600 mg/kg, oko 0,250 do oko 0,500 mg/kg, oko 0,250 do oko 0,400 mg/kg, oko ,425 do oko 1,825 mg/kg, oko 0,425 do oko 1,800 mg/kg, oko 0,425 do oko 1,700 mg/kg, oko ,425 do oko 1,600 mg/kg, oko 0,425 do oko 1,500 mg/kg, oko 0,425 do oko 1,400 mg/kg, oko ,425 do oko 1,400 mg/kg, oko 0,425 do oko 1,200 mg/kg, oko 0,425 do oko 1,100 mg/kg, oko ,425 do oko 1,000 mg/kg, oko 0,425 do oko 0,900 mg/kg, oko 0,425 do oko 0,800 mg/kg, oko ,425 do oko 0,700 mg/kg, oko 0,425 do oko 0,600 mg/kg, oko 0,425 do oko 0,500 mg/kg, oko ,450 do oko 1,825 mg/kg, oko 0,450 do oko 1,800 mg/kg, oko 0,450 do oko 1,700 mg/kg, oko ,450 do oko 1,600 mg/kg, oko 0,450 do oko 1,500 mg/kg, oko 0,450 do oko 1,400 mg/kg, oko ,450 do oko 1,400 mg/kg, oko 0,450 do oko 1,200 mg/kg, oko 0,450 do oko 1,100 mg/kg, oko ,450 do oko 1,000 mg/kg, oko 0,450 do oko 0,900 mg/kg, oko 0,450 do oko 0,800 mg/kg, oko ,450 do oko 0,700 mg/kg, oko 0,450 do oko 0,600 mg/kg, oko 0,450 do oko 0,500 mg/kg, oko ,475 do oko 1,825 mg/kg, oko 0,475 do oko 1,800 mg/kg, oko 0,475 do oko 1,700 mg/kg, oko ,475 do oko 1,600 mg/kg, oko 0,475 do oko 1,500 mg/kg, oko 0,475 do oko 1,400 mg/kg, oko ,475 do oko 1,400 mg/kg, oko 0,475 do oko 1,200 mg/kg, oko 0,475 do oko 1,100 mg/kg, oko ,475 do oko 1,000 mg/kg, oko 0,475 do oko 0,900 mg/kg, oko 0,475 do oko 0,800 mg/kg, oko ,475 do oko 0,700 mg/kg, oko 0,475 do oko 0,600 mg/kg, oko 0,475 do oko 0,500 mg/kg, oko ,875 do oko 1,825 mg/kg, oko 0,875 do oko 1,800 mg/kg, oko 0,875 do oko 1,700 mg/kg, oko ,875 do oko 1,600 mg/kg, oko 0,875 do oko 1,500 mg/kg, oko 0,875 do oko 1,400 mg/kg, oko ,875 do oko 1,400 mg/kg, oko 0,875 do oko 1,200 mg/kg, oko 0,875 do oko 1,100 mg/kg, oko ,875 do oko 1,000 mg/kg, oko 0,875 do oko 0,900 mg/kg, oko 0,900 do oko 1,825 mg/kg, oko ,900 do oko 1,800 mg/kg, oko 0,900 do oko 1,700 mg/kg, oko 0,900 do oko 1,600 mg/kg, oko ,900 do oko 1,500 mg/kg, oko 0,900 do oko 1,400 mg/kg, oko 0,900 do oko 1,400 mg/kg, oko 0,900 do oko 1,200 mg/kg, oko 0,900 do oko 1,100 mg/kg, oko 0,900 do oko 1,000 mg/kg, oko 0,925 do oko 1,825 mg/kg, oko 0,925 do oko 1,800 mg/kg, oko 0,925 do oko 1,700 mg/kg, oko 0,925 do oko 1,600 mg/kg, oko 0,925 do oko 1,500 mg/kg, oko 0,925 do oko 1,400 mg/kg, oko 0,925 do oko 1,400 mg/kg, oko 0,925 do oko 1,200 mg/kg, oko 0,925 do oko 1,100 mg/kg, ili oko 0,925 do oko 1,000 mg/kg.
[0046] U nekim slučajevima, doza dvolančanog RNKi agensa se primenjuje subjektu kao mesečna doza od oko 0,200 mg/kg do oko 0,250 mg/kg; ili kao mesečna doza od oko 0,425 mg/kg do oko 0,475 mg/kg; ili kao mesečna doza od oko 0,875 mg/kg do oko 0,925 mg/kg; ili kao mesečna doza od oko 1,775 mg/kg do oko 1,825 mg/kg.
[0047] U jednom slučaju, dvolančani RNKi agens se primenjuje subjektu kao mesečna doza od 0,225 mg/kg.
[0048] U drugom slučaju, dvolančani RNKi agens se primenjuje subjektu kao mesečna doza od 0,450 mg/kg.
[0049] U drugom slučaju, dvolančani RNKi agens se primenjuje subjektu kao mesečna doza od 0,900 mg/kg.
[0050] U jednom slučaju, dvolančani RNKi agens se primenjuje subjektu kao mesečna doza od 1,800 mg/kg.
[0051] U jednom otelotvorenju, dvolančani RNKi agens treba da se primenjuje subjektu supkutano.
[0052] U jednom otelotvorenju, primena doze dvolančanog RNKi agensa subjektu smanjuje aktivnost Serpinc1 u subjektu za oko 70% do oko 95%.
[0053] U drugom otelotvorenju, primena doze dvolančanog RNKi agensa subjektu povećava maksimalne nivoe trombina u subjektu u rasponu maksimalnih nivoa trombina kod subjekta koji nema poremećaj kod koga bi bila korisna redukcija ekspresije Serpinc1.
[0054] U jednom otelotvorenju, primena doze dvolančanog RNKi agensa subjektu je dovoljna da se postignu maksimalni nivoi generisanja trombina u subjektu na približno istom nivou kao onom postignutom primenom faktora VIII subjektu.
[0055] U drugom otelotvorenju, primena doze dvolančanog RNKi agensa subjektu je dovoljna da se postignu maksimalni nivoi generisanja trombina veći od oko 40% u subjektu.
[0056] U drugom otelotvorenju, primena doze dvolančanog RNKi agensa subjektu smanjuje godišnju stopu krvarenja (ABR) subjekta za oko 80 do oko 95% u poređenju sa prosečnom istorijskom ABR za terapiju po potrebi kod subjekata koji imaju poremećaj kod koga bi bila korisna redukcija ekspresije Serpinc1, a kojima se ne primenjuje dvolančani RNKi agens.
[0057] U jednom otelotvorenju, dvolančani RNKi agens treba da se primenjuje sa puferovanim rastvorom, kao što je puferovani rastvor koji sadrži acetat, citrat, prolamin, karbonat ili fosfat ili bilo koju njihovu kombinaciju. U jednom otelotvorenju, puferovani rastvor je fosfatno puferovani fiziološki rastvor (PBS).
[0058] U skladu sa prvim aspektom pronalaska, subjekt je čovek.
[0059] Poremećaj može biti poremećaj krvarenja, kao što je stečeni poremećaj krvarenja ili nasledni poremećaj krvarenja, npr. hemofilija, npr. hemofilija A ili hemofilija B.
[0060] U jednom otelotvorenju, subjekt ima hemofiliju A i subjekt je sa inhibitorom. U drugom otelotvorenju, subjekt ima hemofiliju B i subjekt je sa inhibitorom.
[0061] U jednom otelotvorenju, dvolančani RNKi agens se primenjuje subjektu supkutano.
[0062] U jednom otelotvorenju, svi nukleotidi sens lanca i svi nukleotidi antisens lanca su modifikovani nukleotidi.
[0063] U jednom otelotvorenju, modifikovani nukleotidi su nezavisno odabrani iz grupe koja se sastoji od 2'-deoksi-2'-fluoro modifikovanog nukleotida, 2'-deoksi-modifikovanog nukleotida, zaključanog nukleotida, abazičnog nukleotida, 2'-amino-modifikovanog nukleotida, 2'-alkil-modifikovanog nukleotida, morfolino nukleotida, fosforamidata i nukleotida koji sadrži nenaturalnu bazu.
[0064] Region komplementarnosti može biti dugačak najmanje 17 nukleotida ili 19 nukleotida.
[0065] U jednom otelotvorenju, region komplementarnosti je dugačak između 19 i 21 nukleotida i poželjno je 21 nukleotid. U drugom slučaju, region komplementarnosti je dugačak između 21 i 23 nukleotida.
[0066] U jednom otelotvorenju, svaki lanac nije duži od 30 nukleotida.
[0067] Najmanje jedan lanac dvolančanog RNKi agensa može da sadrži 3' izbočinu od najmanje 1 nukleotida ili 3' izbočinu od najmanje 2 nukleotida, npr.2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14, ili 15 nukleotida. U drugim slučajevima, najmanje jedan lanac RNKi agensa sadrži 5' izbočinu od najmanje 1 nukleotida. U određenim slučajevima, najmanje jedan lanac sadrži 5' izbočinu od najmanje 2 nukleotida, npr.2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14, ili 15 nukleotida. U drugim slučajevima, i 3' i 5' kraj jednog lanca RNKi agensa sadrže izbočinu od najmanje 1 nukleotida.
[0068] U određenim otelotvorenjima, ligand je N-acetilgalaktozamin (GalNAc). Ligand može biti jedan ili više GalNAc pričvršćenih na RNKi agens preko monovalentnog, bivalentnog ili trivalentnog razgranatog linkera. Ligand može biti konjugovan sa 3' krajem sens lanca dvolančanog RNKi agensa, 5' krajem sens lanca dvolančanog RNKi agensa, 3' krajem antisens lanca dvolančanog RNKi agensa, ili 5' krajem antisens lanca dvolančanog RNKi agensa.
[0069] Dvolančani RNKi agensi mogu da sadrže više, npr. 2, 3, 4, 5, ili 6, GalNAc, svaki nezavisno pričvršćen na više nukleotida dvolančanog RNKi agensa preko više monovalentnih linkera.
[0070] U određenim otelotvorenjima, ligand je
[0071] U jednom otelotvorenju, RNKi agens je konjugovan sa ligandom kao što je prikazano na sledećoj šemi
i, gde je X O ili S.
[0072] U jednom otelotvorenju, X je O.
[0073] U jednom otelotvorenju, region komplementarnosti se sastoji od nukleotidne sekvence 5'-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3' (SEQ ID NO: 15).
[0074] U jednom otelotvorenju, dvolančani RNKi agens sadrži sens lanac koji se sastoji od nukleotidne sekvence 5'- GGUUAACACCAUUUACUUCAA -3'(SEQ ID NO: 16), i antisens lanac koji se sastoji od nukleotidne sekvence 5'-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3' (SEQ ID NO: 15).
[0075] U jednom otelotvorenju, sens lanac se sastoji od 5'-GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf - 3' (SEQ ID NO: 13), a antisens lanac se sastoji od 5' - usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg - 3' (SEQ ID NO: 14), gde su A, C, G i U riboza A, C, G ili U; a, c, g i u su 2'-O-metil (2'-OMe) A, C, G ili U; Af, Cf, Gf ili Uf su 2'-fluoro A, C, G ili U; i s je fosforotioatna veza.
[0076] Ova objava takođe pruža metode za sprečavanje najmanje jednog simptoma kod subjekta koji ima poremećaj kod koga bi bila korisna redukcija ekspresije Serpinc1. Metode uključuju primenu na subjektu fiksne doze od oko 25 mg do oko 100 mg dvolančanog RNKi agensa koji sadrži sens lanac i antisens lanac koji formiraju dvolančani region, pri čemu sens lanac sadrži najmanje 15 uzastopnih nukleotida koji se ne razlikuju za više od 3 nukleotida od nukleotidne sekvence SEQ ID NO:1 i antisens lanac sadrži najmanje 15 uzastopnih nukleotida koji se ne razlikuju za više od 3 nukleotida od nukleotidne sekvence SEQ ID NO:5, pri čemu su suštinski svi nukleotidi sens lanca i suštinski svi nukleotidi antisens lanca modifikovani nukleotidi, i pri čemu dvolančani RNKi agens sadrži ligand, npr. sens lanac dvolančanog RNKi agensa je konjugovan sa ligandom pričvršćenim na 3'-kraj sens lanca.
[0077] Ova objava takođe pruža metode lečenja subjekta koji ima poremećaj kod koga bi bila korisna redukcija ekspresije Serpinc1. Metode uključuju primenu na subjektu fiksne doze od oko 25 mg do oko 100 mg dvolančanog RNKi agensa, pri čemu dvolančani RNKi agens sadrži sens lanac i antisens lanac koji formiraju dvolančani region, pri čemu sens lanac sadrži najmanje 15 uzastopnih nukleotida koji se ne razlikuju za više od 3 nukleotida od nukleotidne sekvence SEQ ID NO:1 i antisens lanac sadrži najmanje 15 uzastopnih nukleotida koji se ne razlikuju za više od 3 nukleotida od nukleotidne sekvence SEQ ID NO:5, pri čemu su suštinski svi nukleotidi sens lanca i suštinski svi nukleotidi antisens lanca modifikovani nukleotidi, i pri čemu dvolančani RNKi agens sadrži ligand, npr. sens lanac dvolančanog RNKi agensa je konjugovan sa ligandom pričvršćenim na 3'-kraj sens lanca.
[0078] U jednom otelotvorenju, svi nukleotidi sens lanca i svi nukleotidi antisens lanca su modifikovani nukleotidi.
[0079] U drugom slučaju, sens lanac i antisens lanac sadrže region komplementarnosti koji se sastoji od najmanje 15 uzastopnih nukleotida koji se ne razlikuju za više od 3 nukleotida od bilo koje od sekvenci navedenih u bilo kojoj od tabela 2 i 3.
[0080] U nekim slučajevima, modifikovani nukleotidi su nezavisno odabrani iz grupe koja se sastoji od 2'-O-metil modifikovanog nukleotida, 2'-fluoro modifikovanog nukleotida, nukleotida koji sadrži 5'-fosforotioatnu grupu, i terminalnog nukleotida povezanog sa holesterilnim derivatom ili dodekanskom kiselinom bisdecilamid grupom. U daljim slučajevima, modifikovani nukleotid je odabran iz grupe koja se sastoji od 2'-deoksi-2'-fluoro modifikovanog nukleotida, 2'-deoksi-modifikovanog nukleotida, zaključanog nukleotida, otključanog nukleotida, konformaciono ograničenog nukleotida, kontrainiranog etil nukleotida, abazičnog nukleotida, 2'-amino-modifikovanog nukleotida, 2'-alkil-modifikovanog nukleotida, 2'-O-alil modifikovanog nukleotida, 2'-C-alil modifikovanog nukleotida, 2'-hidroksil modifikovanog nukleotida, morfolino nukleotida, fosforamidata, i nukleotida koji sadrži nenaturalnu bazu.
[0081] U drugom otelotvorenju dvolančanog RNKi agensa, najmanje jedan lanac sadrži 3' izbočinu od najmanje 1 nukleotida. U drugom otelotvorenju, najmanje jedan lanac sadrži 3' izbočinu od najmanje 2 nukleotida, npr.2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14, ili 15 nukleotida. U drugim slučajevima, najmanje jedan lanac RNKi agensa sadrži 5' izbočinu od najmanje 1 nukleotida. U određenim slučajevima, najmanje jedan lanac sadrži 5' izbočinu od najmanje 2 nukleotida, npr.2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14, ili 15 nukleotida. U drugim slučajevima, i 3' i 5' kraj jednog lanca RNKi agensa sadrže izbočinu od najmanje 1 nukleotida.
[0082] Ova objava takođe pruža metode za sprečavanje najmanje jednog simptoma kod subjekta koji ima poremećaj kod koga bi bila korisna redukcija ekspresije Serpinc1. Metode uključuju primenu na subjektu fiksne doze od oko 25 mg do oko 100 mg dvolančanog RNKi agensa, pri čemu dvolančani RNKi agens sadrži sens lanac komplementaran antisens lancu, pri čemu antisens lanac sadrži region komplementarnosti delu iRNK koja kodira Serpinc1, pri čemu je svaki lanac dugačak oko 14 do oko 30 nukleotida, pri čemu je dvolančani RNKi agens predstavljen formulom (IIIe):
sens:
antisens:
gde je:
np' izbočina od 2 nukleotida i svaki nukleotid unutar np' je povezan sa susednim nukleotidom putem fosforotioatne veze;
svaki Nai Na' nezavisno predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja sadrži 0-25 nukleotida koji su ili modifikovani ili nemodifikovani ili njihove kombinacije, pri čemu svaka sekvenca sadrži najmanje dva različito modifikovana nukleotida;
YYY i Y'Y'Y' svaki nezavisno predstavlja jedan motiv od tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida, i pri čemu su modifikacije 2'-O-metil ili 2'-fluoro modifikacije; pri čemu sens lanac i antisens lanac svaki nezavisno sadrže dve fosforotioatne veze na 5'-kraju; i
pri čemu je sens lanac konjugovan sa najmanje jednim ligandom, pri čemu je ligand jedan ili više GalNAc derivata pričvršćenih preko monovalentnog, bivalentnog ili trivalentnog razgranatog linkera,
čime se sprečava najmanje jedan simptom kod subjekta koji ima poremećaj kod koga bi bila korisna redukcija ekspresije Serpinc1.
[0083] Ova objava takođe pruža metode lečenja subjekta koji ima poremećaj kod koga bi bila korisna redukcija ekspresije Serpinc1. Metode uključuju primenu na subjektu fiksne doze od oko 25 mg do oko 100 mg dvolanačanog RNKi agensa, pri čemu dvolančani RNKi agens sadrži sens lanac komplementaran antisens lancu, pri čemu antisens lanac sadrži region komplementarnosti delu iRNK koja kodira Serpinc1, pri čemu je svaki lanac dugačak oko 14 do oko 30 nukleotida, pri čemu je dvolančani RNKi agens predstavljen formulom (IIIe): sens:
antisens:
gde je:
np' izbočina od 2 nukleotida i svaki nukleotid unutar np' je povezan sa susednim nukleotidom putem fosforotioatne veze;
svaki Nai Na' nezavisno predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja sadrži 0-25 nukleotida koji su ili modifikovani ili nemodifikovani ili njihove kombinacije, pri čemu svaka sekvenca sadrži najmanje dva različito modifikovana nukleotida;
YYY i Y'Y'Y' svaki nezavisno predstavlja jedan motiv od tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida, i pri čemu su modifikacije 2'-O-metil ili 2'-fluoro modifikacije; pri čemu sens lanac i antisens lanac svaki nezavisno sadrže dve fosforotioatne veze na 5'-kraju; i
pri čemu je sens lanac konjugovan sa najmanje jednim ligandom, pri čemu je ligand jedan ili više GalNAc derivata pričvršćenih preko monovalentnog, bivalentnog ili trivalentnog razgranatog linkera,
čime se sprečava najmanje jedan simptom kod subjekta koji ima poremećaj kod koga bi bila korisna redukcija ekspresije Serpinc1.
[0084] U jednom slučaju, dvolančani RNKi agens se primenjuje subjektu u jednoj dozi ili u dve ili više doza, npr. u 3, 4, 5, ili 6 doza.
[0085] U jednom slučaju, dvolančani RNKi agens se primenjuje subjektu jednom mesečno, jednom u pet nedelja, jednom u šest nedelja, jednom u sedam nedelja, jednom u 2 meseca, jednom u kvartalu, ili po potrebi.
[0086] Dvolančani RNKi agens može da se primenjuje subjektu kao, npr. fiksna doza od oko 25 mg do oko 100 mg, npr. između oko 25 mg do oko 95 mg, između oko 25 mg do oko 90 mg, između oko 25 mg do oko 85 mg, između oko 25 mg do oko 80 mg, između oko 25 mg do oko 75 mg, između oko 25 mg do oko 70 mg, između oko 25 mg do oko 65 mg, između oko 25 mg do oko 60 mg, između oko 25 mg do oko 50 mg, između oko 50 mg do oko 100 mg, između oko 50 mg do oko 95 mg, između oko 50 mg do oko 90 mg, između oko 50 mg do oko 85 mg, između oko 50 mg do oko 80 mg, između oko 30 mg do oko 100 mg, između oko 30 mg do oko 90 mg, između oko 30 mg do oko 80 mg, između oko 40 mg do oko 100 mg, između oko 40 mg do oko 90 mg, između oko 40 mg do oko 80 mg, između oko 60 mg do oko 100 mg, između oko 60 mg do oko 90 mg, između oko 25 mg do oko 55 mg, između oko 25 mg do oko 65 mg, između oko 30 mg do oko 95 mg, između oko 30 mg do oko 85 mg, između oko 30 mg do oko 75 mg, između oko 30 mg do oko 65 mg, između oko 30 mg do oko 55 mg, između oko 40 mg do oko 95 mg, između oko 40 mg do oko 85 mg, između oko 40 mg do oko 75 mg, između oko 40 mg do oko 65 mg, između oko 40 mg do oko 55 mg, ili između oko 45 mg do oko 95 mg kao npr. fiksna doza tokom jednog, dva, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam meseci ili više.
[0087] U nekim slučajevima, dvolančani RNKi agens može da se primenjuje subjektu kao fiksna doza od oko 25 mg, oko 30 mg, oko 35 mg, oko 40 mg, oko 45 mg, oko 50 mg, oko 55 mg, oko 60 mg, oko 65 mg, oko 70 mg, oko 75 mg, oko 80 mg, oko 85 mg, oko 90 mg, oko 95 mg, ili oko 100 mg.
[0088] Subjekt može biti čovek, na primer čovek sa poremećajem krvarenja, kao što je stečeni poremećaj krvarenja ili nasledni poremećaj krvarenja, npr. hemofilija, npr. hemofilija A ili hemofilija B.
[0089] U jednom otelotvorenju, subjekt ima hemofiliju A i subjekt je sa inhibitorom. U drugom otelotvorenju, subjekt ima hemofiliju B i subjekt je sa inhibitorom.
[0090] U jednom slučaju, primena dvolančanog RNKi agensa subjektu uzrokuje povećanje zgrušavanja krvi i/ili smanjenje akumulacije Serpinc1 proteina.
[0091] U jednom slučaju, metode dalje obuhvataju merenje nivoa trombina u subjektu.
[0092] Dvolančani RNKi agens može se primeniti supkutano ili intravenozno.
[0093] U jednom slučaju, suštinski svi nukleotidi antisens lanca i suštinski svi nukleotidi sens lanca RNKi agensa sadrže modifikaciju izabranu iz grupe koja se sastoji od 2'-O-metil modifikacije i 2'-fluoro modifikacije. U jednom otelotvorenju, svi nukleotidi sens lanca i svi nukleotidi antisens lanca RNKi agensa su modifikovani nukleotidi.
[0094] U jednom slučaju, motiv YYY se javlja na mestu cepanja sens lanca ili blizu njega.
[0095] U jednom slučaju, motiv Y'Y'Y' se javlja na 11, 12 i 13. poziciji antisens lanca od 5'-kraja.
[0096] dvolančani region može biti dugačak 15-30 parova nukleotida, 17-23 para nukleotida, 17-25 parova nukleotida, 23-27 parova nukleotida, 19-21 par nukleotida, ili 21-23 para nukleotida.
[0097] Svaki lanac može imati 15-30 nukleotida, ili 19-30 nukleotida.
[0098] U jednom slučaju, sens lanac ima ukupno 21 nukleotid, a antisens lanac ima ukupno 23 nukleotida.
[0099] U jednom otelotvorenju, ligand je
[0100] U skladu sa pronalaskom, ligand je pričvršćen na 3' kraj sens lanca.
[0101] U jednom otelotvorenju, RNKi agens je konjugovan sa ligandom kao što je prikazano na sledećoj šemi
gde je X O ili S.
[0102] U jednom slučaju, par baza na 1. poziciji 5'-kraja antisens lanca dupleksa je AU par baza.
[0103] U jednom slučaju, RNKi agens je AD-57213 ((sens lanac (5' do 3'):
GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf (SEQ ID NO: 13); antisens lanac (5' do 3'): usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg (SEQ ID NO:14), gde su A, C, G i U riboza A, C, G ili U; a, c, g i u su 2'-O-metil (2'-OMe) A, C, G ili U; Af, Cf, Gf ili Uf su 2'-fluoro A, C, G ili U; i s je fosforotioatna veza)).
[0104] U jednom otelotvorenju, agens treba da se primeni kao farmaceutska kompozicija. U jednom otelotvorenju, RNKi agens treba da se primeni u nepuferovanom rastvoru, kao što je fiziološki rastvor ili voda.
[0105] U drugom otelotvorenju, siRNK treba da se primeni sa puferovanim rastvorom, kao što je puferovani rastvor koji sadrži acetat, citrat, prolamin, karbonat ili fosfat ili bilo koju njihovu kombinaciju. U jednom otelotvorenju, puferovani rastvor je fosfatno puferovani fiziološki rastvor (PBS).
[0106] U jednom slučaju, ova objava pruža metode za sprečavanje najmanje jednog simptoma kod subjekta koji ima poremećaj kod koga bi bila korisna redukcija ekspresije Serpinc1. Metode uključuju primenu na subjektu fiksne doze od oko 25 mg do oko 100 mg dvolančanog agensa ribonukleinske kiseline (RNKi), pri čemu dvolančani RNKi agens sadrži sens lanac i antisens lanac, pri čemu antisens lanac sadrži region komplementarnosti koji se sastoji od najmanje 15 uzastopnih nukleotida koji se ne razlikuju za više od 3 nukleotida od nukleotidne sekvence 5' - UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG - 3' (SEQ ID NO: 15), pri čemu su suštinski svi nukleotidi sens lanca i suštinski svi nukleotidi antisens lanca modifikovani nukleotidi, i pri čemu dvolančani RNKi agens sadrži ligand, npr. sens lanac dvolančanog RNKi agensa je konjugovan sa ligandom pričvršćenim na 3'-kraj sens lanca.
[0107] Ova objava takođe pruža metode lečenja subjekta koji ima poremećaj kod koga bi bila korisna redukcija ekspresije Serpinc1. Metode uključuju primenu na subjektu fiksne doze od oko 25 mg do oko 100 mg dvolančanog agensa ribonukleinske kiseline (RNKi), pri čemu dvolančani RNKi agens sadrži sens lanac i antisens lanac, pri čemu antisens lanac sadrži region komplementarnosti koji se sastoji od najmanje 15 uzastopnih nukleotida koji se ne razlikuju za više od 3 nukleotida od nukleotidne sekvence 5' - UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG -3' (SEQ ID NO: 15), pri čemu su suštinski svi nukleotidi sens lanca i suštinski svi nukleotidi antisens lanca modifikovani nukleotidi, i pri čemu dvolančani RNKi agens sadrži ligand, npr. sens lanac dvolančanog RNKi agensa je konjugovan sa ligandom pričvršćenim na 3'-kraj sens lanca.
[0108] Dvolančani RNKi agens može da se primeni subjektu u dve ili više doza.
[0109] U nekim slučajevima, dvolančani RNKi agens treba da se primenjuje subjektu jednom mesečno, jednom u pet nedelja, jednom u šest nedelja, jednom u sedam nedelja, jednom u 2 meseca, jednom u kvartalu, ili po potrebi.
[0110] U jednom otelotvorenju, dvolančani RNKi agens treba da se primeni subjektu jednom mesečno. U drugom otelotvorenju, dvolančani RNKi agens treba da se primeni subjektu jednom u šest nedelja. U jednom otelotvorenju, dvolančani RNKi agens treba da se primeni subjektu jednom u 2 meseca. U drugom otelotvorenju, dvolančani RNKi agens treba da se primenjuje subjektu jednom u kvartalu.
[0111] Dvolančani RNKi agens može da se primenjuje subjektu kao, npr. fiksna doza od oko 25 mg do oko 100 mg, npr. između oko 25 mg do oko 95 mg, između oko 25 mg do oko 90 mg, između oko 25 mg do oko 85 mg, između oko 25 mg do oko 80 mg, između oko 25 mg do oko 75 mg, između oko 25 mg do oko 70 mg, između oko 25 mg do oko 65 mg, između oko 25 mg do oko 60 mg, između oko 25 mg do oko 50 mg, između oko 50 mg do oko 100 mg, između oko 50 mg do oko 95 mg, između oko 50 mg do oko 90 mg, između oko 50 mg do oko 85 mg, između oko 50 mg do oko 80 mg, između oko 30 mg do oko 100 mg, između oko 30 mg do oko 90 mg, između oko 30 mg do oko 80 mg, između oko 40 mg do oko 100 mg, između oko 40 mg do oko 90 mg, između oko 40 mg do oko 80 mg, između oko 60 mg do oko 100 mg, između oko 60 mg do oko 90 mg, između oko 25 mg do oko 55 mg, između oko 25 mg do oko 65 mg, između oko 30 mg do oko 95 mg, između oko 30 mg do oko 85 mg, između oko 30 mg do oko 75 mg, između oko 30 mg do oko 65 mg, između oko 30 mg do oko 55 mg, između oko 40 mg do oko 95 mg, između oko 40 mg do oko 85 mg, između oko 40 mg do oko 75 mg, između oko 40 mg do oko 65 mg, između oko 40 mg do oko 55 mg, ili između oko 45 mg do oko 95 mg.
[0112] U nekim slučajevima, dvolančani RNKi agens može da se primenjuje kao fiksna doza od oko 25 mg, oko 30 mg, oko 35 mg, oko 40 mg, oko 45 mg, oko 50 mg, oko 55 mg, oko 60 mg, oko 65 mg, oko 70 mg, oko 75 mg, oko 80 mg, oko 85 mg, oko 90 mg, oko 95 mg, ili oko 100 mg.
[0113] U nekim slučajevima, dvolančani RNKi agens se primenjuje subjektu kao fiksna doza od oko 25 mg; ili kao fiksna doza od oko 50 mg; ili kao fiksna doza od oko 80 mg; ili kao fiksna doza od oko 100 mg.
[0114] U jednom otelotvorenju, dvolančani RNKi agens se primenjuje subjektu supkutano.
[0115] U jednom slučaju, primena doze dvolančanog RNKi agensa subjektu smanjuje aktivnost Serpinc1 u subjektu za oko 70% do oko 95%, oko 70% do oko 80%, oko 80% do oko 90%, oko 90% do oko 95%, ili za više od 95%.
[0116] U drugom slučaju, primena doze dvolančanog RNKi agensa subjektu povećava maksimalne nivoe trombina u subjektu u rasponu maksimalnih nivoa trombina kod subjekta koji nema poremećaj kod koga bi bila korisna redukcija ekspresije Serpinc1.
[0117] U jednom slučaju, primena doze dvolančanog RNKi agensa subjektu je dovoljna da se postignu maksimalni nivoi generisanja trombina u subjektu na približno istom nivou kao onom postignutom primenom faktora VIII subjektu.
[0118] U drugom slučaju, primena doze dvolančanog RNKi agensa subjektu je dovoljna da se postignu maksimalni nivoi generisanja trombina veći od oko 40%, 45%, 50%, 55%, ili veći od oko 60% u subjektu.
[0119] U drugom slučaju, primena doze dvolančanog RNKi agensa subjektu smanjuje godišnju stopu krvarenja (ABR) subjekta za oko 80% do oko 95%, oko 80% do oko 85%, oko 85% do oko 90%, ili oko 90% do oko 95%, u poređenju sa prosečnom istorijskom ABR za terapiju po potrebi kod subjekata koji imaju poremećaj kod koga bi bila korisna redukcija ekspresije Serpinc1, a kojima se ne primenjuje dvolančani RNKi agens.
[0120] U jednom otelotvorenju, dvolančani RNKi agens treba da se primenjuje sa puferovanim rastvorom, kao što je puferovani rastvor koji sadrži acetat, citrat, prolamin, karbonat ili fosfat ili bilo koju njihovu kombinaciju. U jednom otelotvorenju, puferovani rastvor je fosfatno puferovani fiziološki rastvor (PBS).
[0121] U jednom otelotvorenju, subjekt je čovek.
[0122] Poremećaj može biti poremećaj krvarenja, kao što je stečeni poremećaj krvarenja ili nasledni poremećaj krvarenja, npr. hemofilija, npr. hemofilija A ili hemofilija B.
[0123] U jednom otelotvorenju, subjekt ima hemofiliju A i subjekt je sa inhibitorom. U drugom otelotvorenju, subjekt ima hemofiliju B i subjekt je sa inhibitorom.
[0124] U jednom otelotvorenju, dvolančani RNKi agens treba da se primenjuje subjektu supkutano.
[0125] U jednom otelotvorenju, svi nukleotidi sens lanca i svi nukleotidi antisens lanca su modifikovani nukleotidi.
[0126] U jednom otelotvorenju, modifikovani nukleotidi su nezavisno odabrani iz grupe koja se sastoji od 2'-deoksi-2'-fluoro modifikovanog nukleotida, 2'-deoksi-modifikovanog nukleotida, zaključanog nukleotida, abazičnog nukleotida, 2'-amino-modifikovanog nukleotida, 2'-alkil-modifikovanog nukleotida, morfolino nukleotida, fosforamidata i nukleotida koji sadrži nenaturalnu bazu.
[0127] Region komplementarnosti može biti dugačak najmanje 17 nukleotida ili 19 nukleotida.
[0128] U jednom otelotvorenju, region komplementarnosti je dugačak između 19 i 21 nukleotida. U drugom slučaju, region komplementarnosti je dugačak između 21 i 23 nukleotida.
[0129] U jednom slučaju, svaki lanac nije duži od 30 nukleotida.
[0130] Najmanje jedan lanac dvolančanog RNKi agensa može da sadrži 3' izbočinu od najmanje 1 nukleotida ili 3' izbočinu od najmanje 2 nukleotida, npr.2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14, ili 15 nukleotida. U drugim slučajevima, najmanje jedan lanac RNKi agensa sadrži 5' izbočinu od najmanje 1 nukleotida. U određenim slučajevima, najmanje jedan lanac sadrži 5' izbočinu od najmanje 2 nukleotida, npr.2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14, ili 15 nukleotida.
U drugim slučajevima, i 3' i 5' kraj jednog lanca RNKi agensa sadrže izbočinu od najmanje 1 nukleotida.
[0131] U određenim otelotvorenjima, ligand je N-acetilgalaktozamin (GalNAc). Ligand može biti jedan ili više GalNAc pričvršćenih na RNKi agens preko monovalentnog, bivalentnog ili trivalentnog razgranatog linkera. Ligand može biti konjugovan sa 3' krajem sens lanca dvolančanog RNKi agensa, 5' krajem sens lanca dvolančanog RNKi agensa, 3' krajem antisens lanca dvolančanog RNKi agensa, ili 5' krajem antisens lanca dvolančanog RNKi agensa.
[0132] Dvolančani RNKi agensi mogu da sadrže više, npr. 2, 3, 4, 5, ili 6, GalNAc, svaki nezavisno pričvršćen na više nukleotida dvolančanog RNKi agensa preko više monovalentnih linkera.
[0133] U određenim otelotvorenjima, ligand je
[0134] U jednom otelotvorenju, RNKi agens je konjugovan sa ligandom kao što je prikazano na sledećoj šemi
i, gde je X O ili S.
[0135] U jednom otelotvorenju, X je O.
[0136] U jednom otelotvorenju, region komplementarnosti se sastoji od nukleotidne sekvence 5'-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3' (SEQ ID NO: 15).
[0137] U jednom otelotvorenju, dvolančani RNKi agens sadrži sens lanac koji se sastoji od nukleotidne sekvence 5'- GGUUAACACCAUUUACUUCAA -3'(SEQ ID NO: 16), i antisens lanac koji se sastoji od nukleotidne sekvence 5'-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3'(SEQ ID NO: 15).
[0138] U jednom otelotvorenju, sens lanac se sastoji od 5'-GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf - 3' (SEQ ID NO: 13), a antisens lanac se sastoji od 5' - usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg - 3' (SEQ ID NO: 14), gde su A, C, G i U riboza A, C, G ili U; a, c, g i u su 2'-O-metil (2'-OMe) A, C, G ili U; Af, Cf, Gf ili Uf su 2'-fluoro A, C, G ili U; i s je fosforotioatna veza.
[0139] U jednom otelotvorenju, sens lanac se sastoji od 5'-GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf - 3' (SEQ ID NO: 13), a antisens lanac se sastoji od 5' - usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg - 3' (SEQ ID NO: 14), gde su A, C, G i U riboza A, C, G ili U; a, c, g i u su 2'-O-metil (2'-OMe) A, C, G ili U; Af, Cf, Gf ili Uf su 2'-fluoro A, C, G ili U; i s je fosforotioatna veza; i gde je sens lanac konjugovan sa ligandom kao što je prikazano na sledećoj šemi
gde je X O ili S.
[0140] U jednom otelotvorenju, agens treba da se primeni kao farmaceutska kompozicija. U jednom otelotvorenju, RNKi agens treba da se primeni u nepuferovanom rastvoru, kao što je fiziološki rastvor ili voda.
[0141] U drugom otelotvorenju, siRNK treba da se primeni sa puferovanim rastvorom, kao što je puferovani rastvor koji sadrži acetat, citrat, prolamin, karbonat ili fosfat ili bilo koju njihovu kombinaciju. U jednom otelotvorenju, puferovani rastvor je fosfatno puferovani fiziološki rastvor (PBS).
[0142] U jednom daljem aspektu, predmetni pronalazak pruža komplete za primene definisane patentnim zahtevima. Kompleti mogu da sadrže RNKi agens ove objave, i uputstva za upotrebu, i opciono, sredstva za primenu RNKi agensa subjektu.
[0143] Ova objava takođe pruža metode za sprečavanje najmanje jednog simptoma kod subjekta koji ima poremećaj kod koga bi bila korisna redukcija ekspresije Serpinc1. Metode obuhvataju primenu na subjektu fiksne doze od oko 50 mg dvolančanog agensa ribonukleinske kiseline (RNKi), pri čemu se fiksna doza dvolančanog RNKi agensa primenjuje subjektu približno jednom mesečno, pri čemu dvolančani RNKi agens sadrži sens lanac i antisens lanac, pri čemu antisens lanac sadrži region komplementarnosti koji se sastoji od najmanje 15 uzastopnih nukleotida koji se ne razlikuju za više od 3 nukleotida od nukleotidne sekvence 5' -UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG - 3' (SEQ ID NO: 15), pri čemu su suštinski svi nukleotidi sens lanca i suštinski svi nukleotidi antisens lanca modifikovani nukleotidi, i pri čemu je sens lanac konjugovan sa ligandom pričvršćenim na 3'-kraju, čime se sprečava najmanje jedan simptom kod subjekta koji ima poremećaj kod koga bi bila korisna redukcija ekspresije Serpinc1.
[0144] Ova objava takođe pruža metode lečenja subjekta koji ima poremećaj kod koga bi bila korisna redukcija ekspresije Serpinc1. Metode obuhvataju primenu na subjektu fiksne doze od oko 50 mg dvolančanog agensa ribonukleinske kiseline (RNKi), pri čemu se fiksna doza dvolančanog RNKi agensa primenjuje subjektu približno jednom mesečno, pri čemu dvolančani RNKi agens sadrži sens lanac i antisens lanac. Antisens lanac sadrži region komplementarnosti koji se sastoji od najmanje 15 uzastopnih nukleotida koji se ne razlikuju za više od 3 nukleotida od nukleotidne sekvence 5' - UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG 3' (SEQ ID NO: 15). Suštinski svi nukleotidi sens lanca i suštinski svi nukleotidi antisens lanca su modifikovani nukleotidi, a sens lanac je konjugovan sa ligandom pričvršćenim na 3'-kraju, čime se leči subjekt koji ima poremećaj kod koga bi bila korisna redukcija ekspresije Serpinc1.
[0145] Ova objava takođe pruža metode za sprečavanje najmanje jednog simptoma kod subjekta koji ima poremećaj kod koga bi bila korisna redukcija ekspresije Serpinc1. Metode obuhvataju primenu na subjektu fiksne doze od oko 80 mg dvolančanog agensa ribonukleinske kiseline (RNKi), pri čemu se fiksna doza dvolančanog RNKi agensa primenjuje subjektu približno jednom mesečno, pri čemu dvolančani RNKi agens sadrži sens lanac i antisens lanac, pri čemu antisens lanac sadrži region komplementarnosti koji se sastoji od najmanje 15 uzastopnih nukleotida koji se ne razlikuju za više od 3 nukleotida od nukleotidne sekvence 5' -UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG - 3' (SEQ ID NO: 15), pri čemu su suštinski svi nukleotidi sens lanca i suštinski svi nukleotidi antisens lanca modifikovani nukleotidi, i pri čemu je sens lanac konjugovan sa ligandom pričvršćenim na 3'-kraju, čime se sprečava najmanje jedan simptom kod subjekta koji ima poremećaj kod koga bi bila korisna redukcija ekspresije Serpinc1.
[0146] Ova objava takođe pruža metode lečenja subjekta koji ima poremećaj kod koga bi bila korisna redukcija ekspresije Serpinc1. Metode obuhvataju primenu na subjektu fiksne doze od oko 80 mg dvolančanog agensa ribonukleinske kiseline (RNKi), pri čemu se fiksna doza dvolančanog RNKi agensa primenjuje subjektu približno jednom mesečno, pri čemu dvolančani RNKi agens sadrži sens lanac i antisens lanac. Antisens lanac sadrži region komplementarnosti koji se sastoji od najmanje 15 uzastopnih nukleotida koji se ne razlikuju za više od 3 nukleotida od nukleotidne sekvence 5' - UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG -3' (SEQ ID NO: 15). Suštinski svi nukleotidi sens lanca i suštinski svi nukleotidi antisens lanca su modifikovani nukleotidi, a sens lanac je konjugovan sa ligandom pričvršćenim na 3'-kraju, čime se leči subjekt koji ima poremećaj kod koga bi bila korisna redukcija ekspresije Serpinc1.
[0147] U jednom slučaju, primena doze dvolančanog RNKi agensa subjektu smanjuje aktivnost Serpinc1 u subjektu za oko 70% do oko 95%, oko 70% do oko 80%, oko 80% do oko 90%, oko 90% do oko 95%, ili za više od 95%.
[0148] U drugom slučaju, primena doze dvolančanog RNKi agensa subjektu povećava maksimalne nivoe trombina u subjektu u rasponu maksimalnih nivoa trombina kod subjekta koji nema poremećaj kod koga bi bila korisna redukcija ekspresije Serpinc1.
[0149] U jednom slučaju, primena doze dvolančanog RNKi agensa subjektu je dovoljna da se postignu maksimalni nivoi generisanja trombina u subjektu na približno istom nivou kao onom postignutom primenom faktora VIII subjektu.
[0150] U drugom slučaju, primena doze dvolančanog RNKi agensa subjektu je dovoljna da se postignu maksimalni nivoi generisanja trombina veći od oko 40%, 45%, 50%, 55%, ili veći od oko 60% u subjektu.
[0151] U drugom slučaju, primena doze dvolančanog RNKi agensa subjektu smanjuje godišnju stopu krvarenja (ABR) subjekta za oko 80% do oko 95%, oko 80% do oko 85%, oko 85% do oko 90%, ili oko 90% do oko 95%, u poređenju sa prosečnom istorijskom ABR za terapiju po potrebi kod subjekata koji imaju poremećaj kod koga bi bila korisna redukcija ekspresije Serpinc1, a kojima se ne primenjuje dvolančani RNKi agens.
[0152] U jednom otelotvorenju, dvolančani RNKi agens treba da se primenjuje sa puferovanim rastvorom, kao što je puferovani rastvor koji sadrži acetat, citrat, prolamin, karbonat ili fosfat ili bilo koju njihovu kombinaciju. U jednom otelotvorenju, puferovani rastvor je fosfatno puferovani fiziološki rastvor (PBS).
[0153] U jednom otelotvorenju, subjekt je čovek.
[0154] Poremećaj može biti poremećaj krvarenja, kao što je stečeni poremećaj krvarenja ili nasledni poremećaj krvarenja, npr. hemofilija, npr. hemofilija A ili hemofilija B.
[0155] U jednom otelotvorenju, subjekt ima hemofiliju A i subjekt je sa inhibitorom. U drugom otelotvorenju, subjekt ima hemofiliju B i subjekt je sa inhibitorom.
[0156] U jednom otelotvorenju, dvolančani RNKi agens treba da se primenjuje subjektu supkutano.
[0157] U jednom slučaju, dvolančani RNKi agens se primenjuje subjektu hronično.
[0158] U jednom otelotvorenju, svi nukleotidi sens lanca i svi nukleotidi antisens lanca su modifikovani nukleotidi.
[0159] U jednom otelotvorenju, modifikovani nukleotidi su nezavisno odabrani iz grupe koja se sastoji od 2'-deoksi-2'-fluoro modifikovanog nukleotida, 2'-deoksi-modifikovanog nukleotida, zaključanog nukleotida, abazičnog nukleotida, 2'-amino-modifikovanog nukleotida, 2'-alkil-modifikovanog nukleotida, morfolino nukleotida, fosforamidata i nukleotida koji sadrži nenaturalnu bazu.
[0160] Region komplementarnosti može biti dugačak najmanje 17 nukleotida ili 19 nukleotida.
[0161] U jednom otelotvorenju, region komplementarnosti je dugačak između 19 i 21 nukleotida. U drugom slučaju, region komplementarnosti je dugačak između 21 i 23 nukleotida.
[0162] U jednom slučaju, svaki lanac nije duži od 30 nukleotida.
[0163] Najmanje jedan lanac dvolančanog RNKi agensa može da sadrži 3' izbočinu od najmanje 1 nukleotida ili 3' izbočinu od najmanje 2 nukleotida, npr.2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14, ili 15 nukleotida. U drugim slučajevima, najmanje jedan lanac RNKi agensa sadrži 5' izbočinu od najmanje 1 nukleotida. U određenim slučajevima, najmanje jedan lanac sadrži 5' izbočinu od najmanje 2 nukleotida, npr.2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14, ili 15 nukleotida. U drugim slučajevima, i 3' i 5' kraj jednog lanca RNKi agensa sadrže izbočinu od najmanje 1 nukleotida.
[0164] U određenim otelotvorenjima, ligand je N-acetilgalaktozamin (GalNAc). Ligand može biti jedan ili više GalNAc pričvršćenih na RNKi agens preko monovalentnog, bivalentnog ili trivalentnog razgranatog linkera. Ligand može biti konjugovan sa 3' krajem sens lanca dvolančanog RNKi agensa, 5' krajem sens lanca dvolančanog RNKi agensa, 3' krajem antisens lanca dvolančanog RNKi agensa, ili 5' krajem antisens lanca dvolančanog RNKi agensa.
[0165] Dvolančani RNKi agensi mogu da sadrže više, npr. 2, 3, 4, 5, ili 6, GalNAc, svaki nezavisno pričvršćen na više nukleotida dvolančanog RNKi agensa preko više monovalentnih linkera.
[0166] U određenim otelotvorenjima, ligand je
[0167] U jednom otelotvorenju, RNKi agens je konjugovan sa ligandom kao što je prikazano na sledećoj šemi
i, gde je X O ili S.
[0168] U jednom otelotvorenju, X je O.
[0169] U jednom otelotvorenju, region komplementarnosti se sastoji od nukleotidne sekvence 5'-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3' (SEQ ID NO: 15).
[0170] U jednom otelotvorenju, dvolančani RNKi agens sadrži sens lanac koji se sastoji od nukleotidne sekvence 5'- GGUUAACACCAUUUACUUCAA -3'(SEQ ID NO: 16), i antisens lanac koji se sastoji od nukleotidne sekvence 5'-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3' (SEQ ID NO: 15).
[0171] U jednom otelotvorenju, sens lanac se sastoji od 5'-GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf - 3' (SEQ ID NO: 13), a antisens lanac se sastoji od 5' - usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg - 3' (SEQ ID NO: 14), gde su A, C, G i U riboza A, C, G ili U; a, c, g i u su 2'-O-metil (2'-OMe) A, C, G ili U; Af, Cf, Gf ili Uf su 2'-fluoro A, C, G ili U; i s je fosforotioatna veza.
[0172] U jednom otelotvorenju, sens lanac se sastoji od 5'-GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf - 3' (SEQ ID NO: 13), a antisens lanac se sastoji od 5' - usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg - 3' (SEQ ID NO: 14), gde su A, C, G i U riboza A, C, G ili U; a, c, g i u su 2'-O-metil (2'-OMe) A, C, G ili U; Af, Cf, Gf ili Uf su 2'-fluoro A, C, G ili U; i s je fosforotioatna veza; i gde je sens lanac konjugovan sa ligandom kao što je prikazano na sledećoj šemi
, gde je X O ili S.
[0173] U jednom otelotvorenju, agens treba da se primeni kao farmaceutska kompozicija. U jednom otelotvorenju, RNKi agens treba da se primeni u nepuferovanom rastvoru, kao što je fiziološki rastvor ili voda.
[0174] U drugom otelotvorenju, siRNK treba da se primeni sa puferovanim rastvorom, kao što je puferovani rastvor koji sadrži acetat, citrat, prolamin, karbonat ili fosfat ili bilo koju njihovu kombinaciju. U jednom otelotvorenju, puferovani rastvor je fosfatno puferovani fiziološki rastvor (PBS).
[0175] Ova objava takođe pruža komplete za izvođenje metoda ove objave. Kompleti mogu da sadrže RNKi agens ove objave, i uputstva za upotrebu, i opciono, sredstva za primenu RNKi agensa subjektu.
[0176] Ova objava takođe pruža metode za sprečavanje najmanje jednog simptoma kod subjekta koji ima poremećaj kod koga bi bila korisna redukcija ekspresije Serpinc1. Metode obuhvataju primenu na subjektu fiksne doze od oko 50 mg dvolančanog agensa ribonukleinske kiseline (RNKi). Fiksna doza dvolančanog RNKi agensa primenjuje se subjektu približno jednom mesečno. Pri tome, dvolančani RNKi agens sadrži sens lanac koji se sastoji od nukleotidne sekvence 5'-GGUUAACACCAUUUACUUCAA-3' (SEQ ID NO: 16) i antisens lanac koji se sastoji od nukleotidne sekvence 5'-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3' (SEQ ID NO: 15). Suštinski svi nukleotidi sens lanca i suštinski svi nukleotidi antisens lanca su modifikovani nukleotidi, a sens lanac je konjugovan sa ligandom pričvršćenim na 3'-kraju, čime se sprečava najmanje jedan simptom kod subjekta koji ima poremećaj kod koga bi bila korisna redukcija ekspresije Serpinc1.
[0177] Ova objava takođe pruža metode lečenja subjekta koji ima poremećaj kod koga bi bila korisna redukcija ekspresije Serpinc1. Metode obuhvataju primenu na subjektu fiksne doze od oko 50 mg dvolančanog agensa ribonukleinske kiseline (RNKi). Fiksna doza dvolančanog RNKi agensa primenjuje se subjektu približno jednom mesečno. Pri tome, dvolančani RNKi agens sadrži sens lanac koji se sastoji od nukleotidne sekvence 5'-GGUUAACACCAUUUACUUCAA -3' (SEQ ID NO: 16) i antisens lanac koji se sastoji od nukleotidne sekvence 5'-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3' (SEQ ID NO: 15). Suštinski svi nukleotidi sens lanca i suštinski svi nukleotidi antisens lanca su modifikovani nukleotidi, a sens lanac je konjugovan sa ligandom pričvršćenim na 3'-kraju, čime se leči subjekt koji ima poremećaj kod koga bi bila korisna redukcija ekspresije Serpinc1.
[0178] Ova objava takođe pruža metode za sprečavanje najmanje jednog simptoma kod subjekta koji ima poremećaj kod koga bi bila korisna redukcija ekspresije Serpinc1. Metode obuhvataju primenu na subjektu fiksne doze od oko 80 mg dvolančanog agensa ribonukleinske kiseline (RNKi). Fiksna doza dvolančanog RNKi agensa primenjuje se subjektu približno jednom mesečno. Pri tome, dvolančani RNKi agens sadrži sens lanac koji se sastoji od nukleotidne sekvence 5'-GGUUAACACCAUUUACUUCAA-3' (SEQ ID NO: 16) i antisens lanac koji se sastoji od nukleotidne sekvence 5'-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3' (SEQ ID NO: 15). Suštinski svi nukleotidi sens lanca i suštinski svi nukleotidi antisens lanca su modifikovani nukleotidi, a sens lanac je konjugovan sa ligandom pričvršćenim na 3'-kraju, čime se sprečava najmanje jedan simptom kod subjekta koji ima poremećaj kod koga bi bila korisna redukcija ekspresije Serpinc1.
[0179] Ova objava takođe pruža metode lečenja subjekta koji ima poremećaj kod koga bi bila korisna redukcija ekspresije Serpinc1. Metode obuhvataju primenu na subjektu fiksne doze od oko 80 mg dvolančanog agensa ribonukleinske kiseline (RNKi). Fiksna doza dvolančanog RNKi agensa primenjuje se subjektu približno jednom mesečno. Pri tome, dvolančani RNKi agens sadrži sens lanac koji se sastoji od nukleotidne sekvence 5'-GGUUAACACCAUUUACUUCAA -3' (SEQ ID NO: 16) i antisens lanac koji se sastoji od nukleotidne sekvence 5'-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3' (SEQ ID NO: 15). Suštinski svi nukleotidi sens lanca i suštinski svi nukleotidi antisens lanca su modifikovani nukleotidi, a sens lanac je konjugovan sa ligandom pričvršćenim na 3'-kraju, čime se leči subjekt koji ima poremećaj kod koga bi bila korisna redukcija ekspresije Serpinc1.
[0180] U jednom slučaju, primena doze dvolančanog RNKi agensa subjektu smanjuje aktivnost Serpinc1 u subjektu za oko 70% do oko 95%, oko 70% do oko 80%, oko 80% do oko 90%, oko 90% do oko 95%, ili za više od 95%.
[0181] U drugom slučaju, primena doze dvolančanog RNKi agensa subjektu povećava maksimalne nivoe trombina u subjektu u rasponu maksimalnih nivoa trombina kod subjekta koji nema poremećaj kod koga bi bila korisna redukcija ekspresije Serpinc1.
[0182] U jednom slučaju, primena doze dvolančanog RNKi agensa subjektu je dovoljna da se postignu maksimalni nivoi generisanja trombina u subjektu na približno istom nivou kao onom postignutom primenom faktora VIII subjektu.
[0183] U drugom slučaju, primena doze dvolančanog RNKi agensa subjektu je dovoljna da se postignu maksimalni nivoi generisanja trombina veći od oko 40%, 45%, 50%, 55%, ili veći od oko 60% u subjektu.
[0184] U drugom slučaju, primena doze dvolančanog RNKi agensa subjektu smanjuje godišnju stopu krvarenja (ABR) subjekta za oko 80% do oko 95%, oko 80% do oko 85%, oko 85% do oko 90%, ili oko 90% do oko 95%, u poređenju sa prosečnom istorijskom ABR za terapiju po potrebi kod subjekata koji imaju poremećaj kod koga bi bila korisna redukcija ekspresije Serpinc1, a kojima se ne primenjuje dvolančani RNKi agens.
[0185] U jednom otelotvorenju, dvolančani RNKi agens treba da se primenjuje sa puferovanim rastvorom, kao što je puferovani rastvor koji sadrži acetat, citrat, prolamin, karbonat ili fosfat ili bilo koju njihovu kombinaciju. U jednom otelotvorenju, puferovani rastvor je fosfatno puferovani fiziološki rastvor (PBS).
[0186] U jednom otelotvorenju, subjekt je čovek.
[0187] Poremećaj može biti poremećaj krvarenja, kao što je stečeni poremećaj krvarenja ili nasledni poremećaj krvarenja, npr. hemofilija, npr. hemofilija A ili hemofilija B.
[0188] U jednom otelotvorenju, subjekt ima hemofiliju A i subjekt je sa inhibitorom. U drugom otelotvorenju, subjekt ima hemofiliju B i subjekt je sa inhibitorom.
[0189] U jednom otelotvorenju, dvolančani RNKi agens treba da se primenjuje subjektu supkutano.
[0190] U jednom slučaju, dvolančani RNKi agens se primenjuje subjektu hronično.
[0191] U jednom otelotvorenju, svi nukleotidi sens lanca i svi nukleotidi antisens lanca su modifikovani nukleotidi.
[0192] U jednom otelotvorenju, modifikovani nukleotidi su nezavisno odabrani iz grupe koja se sastoji od 2'-deoksi-2'-fluoro modifikovanog nukleotida, 2'-deoksi-modifikovanog nukleotida, zaključanog nukleotida, abazičnog nukleotida, 2'-amino-modifikovanog nukleotida, 2'-alkil-modifikovanog nukleotida, morfolino nukleotida, fosforamidata i nukleotida koji sadrži nenaturalnu bazu.
[0193] U jednom slučaju, svaki lanac nije duži od 30 nukleotida.
[0194] Najmanje jedan lanac dvolančanog RNKi agensa može da sadrži 3' izbočinu od najmanje 1 nukleotida ili 3' izbočinu od najmanje 2 nukleotida, npr.2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14, ili 15 nukleotida. U drugim slučajevima, najmanje jedan lanac RNKi agensa sadrži 5' izbočinu od najmanje 1 nukleotida. U određenim slučajevima, najmanje jedan lanac sadrži 5' izbočinu od najmanje 2 nukleotida, npr.2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14, ili 15 nukleotida. U drugim slučajevima, i 3' i 5' kraj jednog lanca RNKi agensa sadrže izbočinu od najmanje 1 nukleotida.
[0195] U određenim otelotvorenjima, ligand je N-acetilgalaktozamin (GalNAc). Ligand može biti jedan ili više GalNAc pričvršćenih na RNKi agens preko monovalentnog, bivalentnog ili trivalentnog razgranatog linkera. Ligand može biti konjugovan sa 3' krajem sens lanca dvolančanog RNKi agensa, 5' krajem sens lanca dvolančanog RNKi agensa, 3' krajem antisens lanca dvolančanog RNKi agensa, ili 5' krajem antisens lanca dvolančanog RNKi agensa.
[0196] Dvolančani RNKi agensi mogu da sadrže više, npr. 2, 3, 4, 5, ili 6, GalNAc, svaki nezavisno pričvršćen na više nukleotida dvolančanog RNKi agensa preko više monovalentnih linkera.
[0197] U određenim otelotvorenjima, ligand je
[0198] U jednom otelotvorenju, RNKi agens je konjugovan sa ligandom kao što je prikazano na sledećoj šemi
i, gde je X O ili S.
[0199] U jednom otelotvorenju, X je O.
[0200] U jednom otelotvorenju, sens lanac se sastoji od 5'-GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf - 3' (SEQ ID NO: 13), a antisens lanac se sastoji od 5' - usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg - 3' (SEQ ID NO: 14), gde su A, C, G i U riboza A, C, G ili U; a, c, g i u su 2'-O-metil (2'-OMe) A, C, G ili U; Af, Cf, Gf ili Uf su 2'-fluoro A, C, G ili U; i s je fosforotioatna veza.
[0201] U jednom otelotvorenju, sens lanac se sastoji od 5'-GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf - 3' (SEQ ID NO: 13), a antisens lanac se sastoji od 5' - usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg - 3' (SEQ ID NO: 14), gde su A, C, G i U riboza A, C, G ili U; a, c, g i u su 2'-O-metil (2'-OMe) A, C, G ili U; Af, Cf, Gf ili Uf su 2'-fluoro A, C, G ili U; i s je fosforotioatna veza; i gde je sens lanac konjugovan sa ligandom kao što je prikazano na sledećoj šemi
, gde je X O ili S.
[0202] U drugom otelotvorenju, siRNK treba da se primenjuje sa puferovanim rastvorom, kao što je puferovani rastvor koji sadrži acetat, citrat, prolamin, karbonat ili fosfat, ili bilo koju njihovu kombinaciju. U jednom otelotvorenju, puferovani rastvor je fosfatno puferovani fiziološki rastvor (PBS).
[0203] Ova objava takođe pruža komplete za izvođenje metoda ove objave. Kompleti mogu da sadrže RNKi agens ove objave, i uputstva za upotrebu, i opciono, sredstva za primenu RNKi agensa subjektu.
[0204] Ova objava takođe pruža metode za sprečavanje najmanje jednog simptoma kod subjekta koji ima hemofiliju, npr. hemofiliju A (sa ili bez inhibitora), ili hemofiliju B (sa ili bez inhibitora). Metode obuhvataju primenu na subjektu fiksne doze od oko 50 mg dvolančanog agensa ribonukleinske kiseline (RNKi), pri čemu se fiksna doza dvolančanog RNKi agensa primenjuje subjektu približno jednom mesečno, pri čemu dvolančani RNKi agens sadrži sens lanac koji se sastoji od nukleotidne sekvence 5'- GGUUAACACCAUUUACUUCAA -3' (SEQ ID NO: 16), i antisens lanac koji se sastoji od nukleotidne sekvence 5'-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3' (SEQ ID NO: 15), pri čemu su suštinski svi nukleotidi sens lanca i suštinski svi nukleotidi antisens lanca modifikovani nukleotidi, i pri čemu je sens lanac konjugovan sa ligandom pričvršćenim na 3'-kraju, čime se sprečava najmanje jedan simptom kod subjekta koji ima poremećaj kod koga bi bila korisna redukcija ekspresije Serpinc1.
[0205] Ova objava takođe pruža metode lečenja subjekta koji ima hemofiliju, npr. hemofiliju A (sa ili bez inhibitora), ili hemofiliju B (sa ili bez inhibitora). Metode obuhvataju primenu na subjektu fiksne doze od oko 50 mg dvolančanog agensa ribonukleinske kiseline (RNKi), pri čemu se fiksna doza dvolančanog RNKi agensa primenjuje subjektu približno jednom mesečno, pri čemu dvolančani RNKi agens sadrži sens lanac koji se sastoji od nukleotidne sekvence 5'-GGUUAACACCAUUUACUUCAA -3' (SEQ ID NO: 16), i antisens lanac koji se sastoji od nukleotidne sekvence 5'-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3' (SEQ ID NO: 15), pri čemu su suštinski svi nukleotidi sens lanca i suštinski svi nukleotidi antisens lanca modifikovani nukleotidi, i pri čemu je sens lanac konjugovan sa ligandom pričvršćenim na 3'-kraju, čime se leči subjekt koji ima poremećaj kod koga bi bila korisna redukcija ekspresije Serpinc1.
[0206] Ova objava takođe pruža metode za sprečavanje najmanje jednog simptoma kod subjekta koji ima hemofiliju, npr. hemofiliju A (sa ili bez inhibitora), ili hemofiliju B (sa ili bez inhibitora). Metode obuhvataju primenu na subjektu fiksne doze od oko 80 mg dvolančanog agensa ribonukleinske kiseline (RNKi), pri čemu se fiksna doza dvolančanog RNKi agensa primenjuje subjektu približno jednom mesečno, pri čemu dvolančani RNKi agens sadrži sens lanac koji se sastoji od nukleotidne sekvence 5'- GGUUAACACCAUUUACUUCAA -3' (SEQ ID NO: 16), i antisens lanac koji se sastoji od nukleotidne sekvence 5'-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3' (SEQ ID NO: 15), pri čemu su suštinski svi nukleotidi sens lanca i suštinski svi nukleotidi antisens lanca modifikovani nukleotidi, i pri čemu je sens lanac konjugovan sa ligandom pričvršćenim na 3'-kraju, čime se sprečava najmanje jedan simptom kod subjekta koji ima poremećaj kod koga bi bila korisna redukcija ekspresije Serpinc1.
[0207] Ova objava takođe pruža metode lečenja subjekta koji ima hemofiliju, npr. hemofiliju A (sa ili bez inhibitora), ili hemofiliju B (sa ili bez inhibitora). Metode obuhvataju primenu na subjektu fiksne doze od oko 80 mg dvolančanog agensa ribonukleinske kiseline (RNKi), pri čemu se fiksna doza dvolančanog RNKi agensa primenjuje subjektu približno jednom mesečno, pri čemu dvolančani RNKi agens sadrži sens lanac koji se sastoji od nukleotidne sekvence 5'-GGUUAACACCAUUUACUUCAA -3' (SEQ ID NO: 16), i antisens lanac koji se sastoji od nukleotidne sekvence 5'-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3' (SEQ ID NO: 15), pri čemu su suštinski svi nukleotidi sens lanca i suštinski svi nukleotidi antisens lanca modifikovani nukleotidi, i pri čemu je sens lanac konjugovan sa ligandom pričvršćenim na 3'-kraju, čime se leči subjekt koji ima poremećaj kod koga bi bila korisna redukcija ekspresije Serpinc1.
[0208] Ova objava takođe pruža metode za sprečavanje najmanje jednog simptoma kod subjekta koji ima hemofiliju, npr. hemofiliju A (sa ili bez inhibitora), ili hemofiliju B (sa ili bez inhibitora). Metode obuhvataju primenu na subjektu fiksne doze od oko 50 mg dvolančanog agensa ribonukleinske kiseline (RNKi), pri čemu se fiksna doza dvolančanog RNKi agensa primenjuje subjektu približno jednom mesečno, pri čemu dvolančani RNKi agens sadrži sens lanac koji se sastoji od nukleotidne sekvence 5'- GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf -3' (SEQ ID NO: 13) i antisens lanac koji se sastoji od nukleotidne sekvence 5'usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg - 3' (SEQ ID NO:14), gde su A, C, G i U riboza A, C, G ili U; a, c, g i u su 2'-O-metil (2'-OMe) A, C, G ili U; Af, Cf, Gf ili Uf su 2'-fluoro A, C, G ili U; i s je fosforotioatna veza, i pri čemu je sens lanac konjugovan sa ligandom pričvršćenim na 3'-kraju, čime se sprečava najmanje jedan simptom kod subjekta koji ima poremećaj kod koga bi bila korisna redukcija ekspresije Serpinc1.
[0209] Ova objava takođe pruža metode lečenja subjekta koji ima hemofiliju, npr. hemofiliju A (sa ili bez inhibitora), ili hemofiliju B (sa ili bez inhibitora). Metode obuhvataju primenu na subjektu fiksne doze od oko 50 mg dvolančanog agensa ribonukleinske kiseline (RNKi), pri čemu se fiksna doza dvolančanog RNKi agensa primenjuje subjektu približno jednom mesečno, pri čemu dvolančani RNKi agens sadrži sens lanac koji se sastoji od nukleotidne sekvence 5'-GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf - 3' (SEQ ID NO: 13) i antisens lanac koji se sastoji od nukleotidne sekvence 5'- usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg - 3' (SEQ ID NO: 14), gde su A, C, G i U riboza A, C, G ili U; a, c, g i u su 2'-O-metil (2'-OMe) A, C, G ili U; Af, Cf, Gf ili Uf su 2'-fluoro A, C, G ili U; i s je fosforotioatna veza, i pri čemu je sens lanac konjugovan sa ligandom pričvršćenim na 3'-kraju, čime se leči subjekt koji ima poremećaj kod koga bi bila korisna redukcija ekspresije Serpinc1.
[0210] Ova objava takođe pruža metode za sprečavanje najmanje jednog simptoma kod subjekta koji ima hemofiliju, npr. hemofiliju A (sa ili bez inhibitora), ili hemofiliju B (sa ili bez inhibitora). Metode obuhvataju primenu na subjektu fiksne doze od oko 80 mg dvolančanog agensa ribonukleinske kiseline (RNKi), pri čemu se fiksna doza dvolančanog RNKi agensa primenjuje subjektu približno jednom mesečno, pri čemu dvolančani RNKi agens sadrži sens lanac koji se sastoji od nukleotidne sekvence 5'-GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf -3' (SEQ ID NO: 13) i antisens lanac koji se sastoji od nukleotidne sekvence 5'-usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg - 3' (SEQ ID NO: 14), gde su A, C, G i U riboza A, C, G ili U; a, c, g i u su 2'-O-metil (2'-OMe) A, C, G ili U; Af, Cf, Gf ili Uf su 2'-fluoro A, C, G ili U; i s je fosforotioatna veza, i pri čemu je sens lanac konjugovan sa ligandom pričvršćenim na 3'-kraju, čime se leči subjekt koji ima poremećaj kod koga bi bila korisna redukcija ekspresije Serpinc1.
[0211] Ova objava takođe pruža metode lečenja subjekta koji ima hemofiliju, npr. hemofiliju A (sa ili bez inhibitora), ili hemofiliju B (sa ili bez inhibitora). Metode obuhvataju primenu na subjektu fiksne doze od oko 80 mg dvolančanog agensa ribonukleinske kiseline (RNKi), pri čemu se fiksna doza dvolančanog RNKi agensa primenjuje subjektu približno jednom mesečno, pri čemu dvolančani RNKi agens sadrži sens lanac koji se sastoji od nukleotidne sekvence 5'-GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf - 3' (SEQ ID NO: 13) i antisens lanac koji se sastoji od nukleotidne sekvence 5'- usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg - 3' (SEQ ID NO: 14), gde su A, C, G i U riboza A, C, G ili U; a, c, g i u su 2'-O-metil (2'-OMe) A, C, G ili U; Af, Cf, Gf ili Uf su 2'-fluoro A, C, G ili U; i s je fosforotioatna veza, i pri čemu je sens lanac konjugovan sa ligandom pričvršćenim na 3'-kraju, čime se leči subjekt koji ima poremećaj kod koga bi bila korisna redukcija ekspresije Serpinc1.
[0212] U jednom slučaju, primena doze dvolančanog RNKi agensa subjektu smanjuje aktivnost Serpinc1 u subjektu za oko 70% do oko 95%, oko 70% do oko 80%, oko 80% do oko 90%, oko 90% do oko 95%, ili za više od 95%.
[0213] U drugom slučaju, primena doze dvolančanog RNKi agensa subjektu povećava maksimalne nivoe trombina u subjektu u rasponu maksimalnih nivoa trombina kod subjekta koji nema poremećaj kod koga bi bila korisna redukcija ekspresije Serpinc1.
[0214] U jednom slučaju, primena doze dvolančanog RNKi agensa subjektu je dovoljna da se postignu maksimalni nivoi generisanja trombina u subjektu na približno istom nivou kao onom postignutom primenom faktora VIII subjektu.
[0215] U drugom slučaju, primena doze dvolančanog RNKi agensa subjektu je dovoljna da se postignu maksimalni nivoi generisanja trombina veći od oko 40%, 45%, 50%, 55%, ili veći od oko 60% u subjektu.
[0216] U drugom slučaju, primena doze dvolančanog RNKi agensa subjektu smanjuje godišnju stopu krvarenja (ABR) subjekta za oko 80% do oko 95%, oko 80% do oko 85%, oko 85% do oko 90%, ili oko 90% do oko 95%, u poređenju sa prosečnom istorijskom ABR za terapiju po potrebi kod subjekata koji imaju poremećaj kod koga bi bila korisna redukcija ekspresije Serpinc1, a kojima se ne primenjuje dvolančani RNKi agens.
[0217] U jednom otelotvorenju, dvolančani RNKi agens treba da se primenjuje sa puferovanim rastvorom, kao što je puferovani rastvor koji sadrži acetat, citrat, prolamin, karbonat ili fosfat ili bilo koju njihovu kombinaciju. U jednom otelotvorenju, puferovani rastvor je fosfatno puferovani fiziološki rastvor (PBS).
[0218] U jednom otelotvorenju, subjekt je čovek.
[0219] U jednom otelotvorenju, dvolančani RNKi agens treba da se primenjuje subjektu supkutano.
[0220] U jednom otelotvorenju, dvolančani RNKi agens treba da se primenjuje subjektu hronično.
[0221] U određenim otelotvorenjima, ligand je
[0222] U jednom otelotvorenju, RNKi agens je konjugovan sa ligandom kao što je prikazano na sledećoj šemi
i, gde je X O ili S.
[0223] U jednom otelotvorenju, X je O.
[0224] U jednom otelotvorenju, sens lanac se sastoji od 5'-GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf - 3' (SEQ ID NO: 13), a antisens lanac se sastoji od 5' - usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg - 3' (SEQ ID NO: 14), gde su A, C, G i U riboza A, C, G ili U; a, c, g i u su 2'-O-metil (2'-OMe) A, C, G ili U; Af, Cf, Gf ili Uf su 2'-fluoro A, C, G ili U; i s je fosforotioatna veza; i gde je sens lanac konjugovan sa ligandom kao što je prikazano na sledećoj šemi
, gde je X O ili S.
[0225] U drugom otelotvorenju, siRNK treba da se primeni sa puferovanim rastvorom, kao što je puferovani rastvor koji sadrži acetat, citrat, prolamin, karbonat ili fosfat ili bilo koju njihovu kombinaciju. U jednom otelotvorenju, puferovani rastvor je fosfatno puferovani fiziološki rastvor (PBS).
[0226] Ova objava takođe pruža komplete za izvođenje metoda ove objave. Kompleti mogu da sadrže RNKi agens ove objave, i uputstva za upotrebu, i opciono, sredstva za primenu RNKi agensa subjektu.
[0227] Ova objava takođe pruža metode za sprečavanje najmanje jednog simptoma kod subjekta koji ima poremećaj kod koga bi bila korisna redukcija ekspresije Serpinc1. Metode obuhvataju primenu na subjektu fiksne doze od oko 40 mg do oko 90 mg dvolančanog agensa ribonukleinske kiseline (RNKi), pri čemu dvolančani RNKi agens sadrži sens lanac i antisens lanac, pri čemu antisens lanac sadrži region komplementarnosti koji se sastoji od najmanje 15 uzastopnih nukleotida koji se ne razlikuju za više od 3 nukleotida od nukleotidne sekvence 5' -UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG - 3' (SEQ ID NO: 15), pri čemu su suštinski svi nukleotidi sens lanca i suštinski svi nukleotidi antisens lanca modifikovani nukleotidi, i pri čemu dvolančani RNKi agens sadrži ligand, npr. sens lanac dvolančanog RNKi agensa je konjugovan sa ligandom pričvršćenim na 3'-kraju sens lanca.
[0228] Ova objava takođe pruža metode lečenja subjekta koji ima poremećaj kod koga bi bila korisna redukcija ekspresije Serpinc1. Metode obuhvataju primenu na subjektu fiksne doze od oko 40 mg do oko 90 mg dvolančanog agensa ribonukleinske kiseline (RNKi), pri čemu dvolančani RNKi agens sadrži sens lanac i antisens lanac, pri čemu antisens lanac sadrži region komplementarnosti koji se sastoji od najmanje 15 uzastopnih nukleotida koji se ne razlikuju za više od 3 nukleotida od nukleotidne sekvence 5' - UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG -3' (SEQ ID NO: 15), pri čemu su suštinski svi nukleotidi sens lanca i suštinski svi nukleotidi antisens lanca modifikovani nukleotidi, i pri čemu dvolančani RNKi agens sadrži ligand, npr. sens lanac dvolančanog RNKi agensa je konjugovan sa ligandom pričvršćenim na 3'-kraju sens lanca.
[0229] Dvolančani RNKi agens može da se primeni subjektu u dve ili više doza.
[0230] U nekim slučajevima, dvolančani RNKi agens se primenjuje na subjekt jednom mesečno, jednom u pet nedelja, jednom u šest nedelja, jednom u sedam nedelja, jednom u 2 meseca, jednom kvartalno ili po potrebi.
[0231] U jednom otelotvorenju, dvolančani RNKi agens treba da se primeni subjektu jednom mesečno. U drugom otelotvorenju, dvolančani RNKi agens treba da se primeni subjektu jednom u šest nedelja. U jednom otelotvorenju, dvolančani RNKi agens treba da se primeni subjektu jednom u 2 meseca. U drugom otelotvorenju, dvolančani RNKi agens treba da se primenjuje subjektu jednom u kvartalu.
[0232] Dvolančani RNKi agens se može primeniti na subjektu kao, npr. fiksna doza od oko 50 mg do oko 90 mg, između oko 50 mg do oko 85 mg, između oko 50 mg do oko 80 mg, između oko 40 mg do oko 80 mg, između oko 60 mg do oko 90 mg, između oko 25 mg do oko 55 mg, između oko 25 mg do oko 65 mg, između oko 40 mg do oko 85 mg, između oko 40 mg do oko 75 mg, između oko 40 mg do oko 65 mg, ili između oko 40 mg do oko 55 mg.
[0233] U nekim slučajevima, dvolančani RNKi agens može da se primenjuje kao fiksna doza od oko 40 mg, oko 45 mg, oko 50 mg, oko 55 mg, oko 60 mg, oko 65 mg, oko 70 mg, oko 75 mg, oko 80 mg, oko 85 mg, ili oko 90 mg.
[0234] U nekim slučajevima, dvolančani RNKi agens se primenjuje subjektu kao fiksna doza od oko 40 mg; ili kao fiksna doza od oko 50 mg; ili kao fiksna doza od oko 80 mg; ili kao fiksna doza od oko 90 mg.
[0235] U jednom otelotvorenju, dvolančani RNKi agens treba da se primenjuje subjektu supkutano.
[0236] U jednom otelotvorenju, primena doze dvolančanog RNKi agensa subjektu smanjuje aktivnost Serpinc1 u subjektu za oko 70% do oko 95%.
[0237] U drugom otelotvorenju, primena doze dvolančanog RNKi agensa subjektu povećava maksimalne nivoe trombina u subjektu u rasponu maksimalnih nivoa trombina kod subjekta koji nema poremećaj kod koga bi bila korisna redukcija ekspresije Serpinc1.
[0238] U jednom otelotvorenju, primena doze dvolančanog RNKi agensa subjektu je dovoljna da se postignu maksimalni nivoi generisanja trombina u subjektu na približno istom nivou kao onom postignutom primenom faktora VIII subjektu.
[0239] U drugom otelotvorenju, primena doze dvolančanog RNKi agensa subjektu je dovoljna da se postignu maksimalni nivoi generisanja trombina veći od oko 40% u subjektu.
[0240] U drugom otelotvorenju, primena doze dvolančanog RNKi agensa subjektu smanjuje godišnju stopu krvarenja (ABR) subjekta za oko 80 do oko 95% u poređenju sa prosečnom istorijskom ABR za terapiju po potrebi kod subjekata koji imaju poremećaj kod koga bi bila korisna redukcija ekspresije Serpinc1, a kojima se ne primenjuje dvolančani RNKi agens.
[0241] U jednom otelotvorenju, dvolančani RNKi agens treba da se primenjuje sa puferovanim rastvorom, kao što je puferovani rastvor koji sadrži acetat, citrat, prolamin, karbonat ili fosfat ili bilo koju njihovu kombinaciju. U jednom otelotvorenju, puferovani rastvor je fosfatno puferovani fiziološki rastvor (PBS).
[0242] U jednom otelotvorenju, subjekt je čovek.
[0243] Poremećaj može biti poremećaj krvarenja, kao što je stečeni poremećaj krvarenja ili nasledni poremećaj krvarenja, npr. hemofilija, npr. hemofilija A ili hemofilija B.
[0244] U jednom otelotvorenju, subjekt ima hemofiliju A i subjekt je sa inhibitorom. U drugom otelotvorenju, subjekt ima hemofiliju B i subjekt je sa inhibitorom.
[0245] U jednom otelotvorenju, dvolančani RNKi agens treba da se primenjuje subjektu supkutano.
[0246] U jednom otelotvorenju, svi nukleotidi sens lanca i svi nukleotidi antisens lanca su modifikovani nukleotidi.
[0247] U jednom otelotvorenju, modifikovani nukleotidi su nezavisno odabrani iz grupe koja se sastoji od 2'-deoksi-2'-fluoro modifikovanog nukleotida, 2'-deoksi-modifikovanog nukleotida, zaključanog nukleotida, abazičnog nukleotida, 2'-amino-modifikovanog nukleotida, 2'-alkil-modifikovanog nukleotida, morfolino nukleotida, fosforamidata i nukleotida koji sadrži nenaturalnu bazu.
[0248] Region komplementarnosti može biti dugačak najmanje 17 nukleotida ili 19 nukleotida.
[0249] U jednom otelotvorenju, region komplementarnosti je dugačak između 19 i 21 nukleotida. U drugom slučaju, region komplementarnosti je dugačak između 21 i 23 nukleotida.
[0250] U jednom slučaju, svaki lanac nije duži od 30 nukleotida.
[0251] Najmanje jedan lanac dvolančanog RNKi agensa može da sadrži 3' izbočinu od najmanje 1 nukleotida ili 3' izbočinu od najmanje 2 nukleotida, npr.2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14, ili 15 nukleotida. U drugim slučajevima, najmanje jedan lanac RNKi agensa sadrži 5' izbočinu od najmanje 1 nukleotida. U određenim slučajevima, najmanje jedan lanac sadrži 5' izbočinu od najmanje 2 nukleotida, npr.2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14, ili 15 nukleotida. U drugim slučajevima, i 3' i 5' kraj jednog lanca RNKi agensa sadrže izbočinu od najmanje 1 nukleotida.
[0252] U određenim otelotvorenjima, ligand je N-acetilgalaktozamin (GalNAc). Ligand može biti jedan ili više GalNAc pričvršćenih na RNKi agens preko monovalentnog, bivalentnog ili trivalentnog razgranatog linkera. Ligand može biti konjugovan sa 3' krajem sens lanca dvolančanog RNKi agensa, 5' krajem sens lanca dvolančanog RNKi agensa, 3' krajem antisens lanca dvolančanog RNKi agensa, ili 5' krajem antisens lanca dvolančanog RNKi agensa.
[0253] Dvolančani RNKi agensi mogu da sadrže više, npr. 2, 3, 4, 5, ili 6, GalNAc, svaki nezavisno pričvršćen na više nukleotida dvolančanog RNKi agensa preko više monovalentnih linkera.
[0254] U određenim otelotvorenjima, ligand je
[0255] U jednom otelotvorenju, RNKi agens je konjugovan sa ligandom kao što je prikazano na sledećoj šemi
i, gde je X O ili S.
[0256] U jednom otelotvorenju, X je O.
[0257] U jednom otelotvorenju, region komplementarnosti se sastoji od nukleotidne sekvence 5'-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3' (SEQ ID NO: 15).
[0258] U jednom otelotvorenju, dvolančani RNKi agens sadrži sens lanac koji se sastoji od nukleotidne sekvence 5'- GGUUAACACCAUUUACUUCAA -3' (SEQ ID NO: 16), i antisens lanac koji se sastoji od nukleotidne sekvence 5'-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3' (SEQ ID NO: 15).
[0259] U jednom otelotvorenju, sens lanac se sastoji od 5'-GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf - 3' (SEQ ID NO: 13), a antisens lanac se sastoji od 5' - usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg - 3' (SEQ ID NO: 14), gde su A, C, G i U riboza A, C, G ili U; a, c, g i u su 2'-O-metil (2'-OMe) A, C, G ili U; Af, Cf, Gf ili Uf su 2'-fluoro A, C, G ili U; i s je fosforotioatna veza.
[0260] U jednom otelotvorenju, sens lanac se sastoji od 5'-GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf - 3' (SEQ ID NO: 13), a antisens lanac se sastoji od 5' - usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg - 3' (SEQ ID NO: 14), gde su A, C, G i U riboza A, C, G ili U; a, c, g i u su 2'-O-metil (2'-OMe) A, C, G ili U; Af, Cf, Gf ili Uf su 2'-fluoro A, C, G ili U; i s je fosforotioatna veza; i gde je sens lanac konjugovan sa ligandom kao što je prikazano na sledećoj šemi
, gde je X O ili S.
[0261] U jednom otelotvorenju, RNKi agens treba da se primenjuje kao farmaceutska kompozicija. U jednom otelotvorenju, RNKi agens treba da se primeni u nepuferovanom rastvoru, kao što je fiziološki rastvor ili voda.
[0262] U drugom otelotvorenju, siRNK treba da se primeni sa puferovanim rastvorom, kao što je puferovani rastvor koji sadrži acetat, citrat, prolamin, karbonat ili fosfat ili bilo koju njihovu kombinaciju. U jednom otelotvorenju, puferovani rastvor je fosfatno puferovani fiziološki rastvor (PBS).
[0263] Ova objava takođe pruža komplete za izvođenje metoda pronalaska. Kompleti mogu da sadrže RNKi agens ove objave, i uputstva za upotrebu, i opciono, sredstva za primenu RNKi agensa subjektu.
[0264] Ova objava takođe pruža metode za inhibiciju ekspresije Serpinc1 kod subjekta. Metode obuhvataju primenu na subjektu fiksne doze od oko 40 mg do oko 90 mg dvolančanog agensa ribonukleinske kiseline (RNKi), pri čemu dvolančani RNKi agens sadrži sens lanac i antisens lanac, pri čemu antisens lanac sadrži region komplementarnosti koji se sastoji od najmanje 15 uzastopnih nukleotida koji se ne razlikuju za više od 3 nukleotida od nukleotidne sekvence 5' -UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG - 3' (SEQ ID NO: 15), pri čemu su suštinski svi nukleotidi sens lanca i suštinski svi nukleotidi antisens lanca modifikovani nukleotidi, i pri čemu dvolančani RNKi agens sadrži ligand, npr. sens lanac dvolančanog RNKi agensa je konjugovan sa ligandom pričvršćenim na 3'-kraju sens lanca.
[0265] Ova objava takođe pruža metode za inhibiciju ekspresije Serpinc1 kod subjekta. Metode obuhvataju primenu na subjektu fiksne doze od oko 40 mg do oko 90 mg dvolančanog agensa ribonukleinske kiseline (RNKi), pri čemu dvolančani RNKi agens sadrži sens lanac i antisens lanac, pri čemu antisens lanac sadrži region komplementarnosti koji se sastoji od najmanje 15 uzastopnih nukleotida koji se ne razlikuju za više od 3 nukleotida od nukleotidne sekvence 5' -UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG - 3' (SEQ ID NO: 15), pri čemu su suštinski svi nukleotidi sens lanca i suštinski svi nukleotidi antisens lanca modifikovani nukleotidi, i pri čemu dvolančani RNKi agens sadrži ligand, npr. sens lanac dvolančanog RNKi agensa je konjugovan sa ligandom pričvršćenim na 3'-kraju sens lanca.
[0266] Dvolančani RNKi agens može da se primeni subjektu u dve ili više doza.
[0267] U nekim slučajevima, dvolančani RNKi agens treba da se primenjuje subjektu jednom mesečno, jednom u pet nedelja, jednom u šest nedelja, jednom u sedam nedelja, jednom u 2 meseca, jednom u kvartalu, ili po potrebi.
[0268] U jednom otelotvorenju, dvolančani RNKi agens treba da se primeni subjektu jednom mesečno. U drugom otelotvorenju, dvolančani RNKi agens treba da se primeni subjektu jednom u šest nedelja. U jednom otelotvorenju, dvolančani RNKi agens treba da se primeni subjektu jednom u 2 meseca. U drugom otelotvorenju, dvolančani RNKi agens treba da se primenjuje subjektu jednom u kvartalu.
[0269] Dvolančani RNKi agens se može primeniti na subjektu kao, npr. fiksna doza od oko 50 mg do oko 90 mg, između oko 50 mg do oko 85 mg, između oko 50 mg do oko 80 mg, između oko 40 mg do oko 80 mg, između oko 60 mg do oko 90 mg, između oko 25 mg do oko 55 mg, između oko 25 mg do oko 65 mg, između oko 40 mg do oko 85 mg, između oko 40 mg do oko 75 mg, između oko 40 mg do oko 65 mg, ili između oko 40 mg do oko 55 mg.
[0270] U nekim slučajevima, dvolančani RNKi agens može da se primenjuje kao fiksna doza od oko 40 mg, oko 45 mg, oko 50 mg, oko 55 mg, oko 60 mg, oko 65 mg, oko 70 mg, oko 75 mg, oko 80 mg, oko 85 mg, ili oko 90 mg.
[0271] U nekim slučajevima, dvolančani RNKi agens se primenjuje subjektu kao fiksna doza od oko 40 mg; ili kao fiksna doza od oko 50 mg; ili kao fiksna doza od oko 80 mg; ili kao fiksna doza od oko 90 mg.
[0272] U jednom otelotvorenju, dvolančani RNKi agens treba da se primenjuje subjektu supkutano.
[0273] U jednom otelotvorenju, primena doze dvolančanog RNKi agensa subjektu smanjuje aktivnost Serpinc1 u subjektu za oko 70% do oko 95%.
[0274] U jednom otelotvorenju, subjekt je čovek.
[0275] U skladu sa pronalaskom, subjekt ima poremećaj kod koga bi bila korisna redukcija ekspresije Serpinc1. Poremećaj može biti poremećaj krvarenja, kao što je stečeni poremećaj krvarenja ili nasledni poremećaj krvarenja, npr. hemofilija, npr. hemofilija A ili hemofilija B.
[0276] U jednom otelotvorenju, subjekt ima hemofiliju A i subjekt je sa inhibitorom. U drugom otelotvorenju, subjekt ima hemofiliju B i subjekt je sa inhibitorom.
[0277] U drugom otelotvorenju, primena doze dvolančanog RNKi agensa subjektu povećava maksimalne nivoe trombina u subjektu u rasponu maksimalnih nivoa trombina kod subjekta koji nema poremećaj kod koga bi bila korisna redukcija ekspresije Serpinc1.
[0278] U jednom otelotvorenju, primena doze dvolančanog RNKi agensa subjektu je dovoljna da se postignu maksimalni nivoi generisanja trombina u subjektu na približno istom nivou kao onom postignutom primenom faktora VIII subjektu.
[0279] U drugom otelotvorenju, primena doze dvolančanog RNKi agensa subjektu je dovoljna da se postignu maksimalni nivoi generisanja trombina veći od oko 40% u subjektu.
[0280] U drugom otelotvorenju, primena doze dvolančanog RNKi agensa subjektu smanjuje godišnju stopu krvarenja (ABR) subjekta za oko 80 do oko 95% u poređenju sa prosečnom istorijskom ABR za terapiju po potrebi kod subjekata koji imaju poremećaj kod koga bi bila korisna redukcija ekspresije Serpinc1, a kojima se ne primenjuje dvolančani RNKi agens.
[0281] U jednom otelotvorenju, dvolančani RNKi agens treba da se primenjuje sa puferovanim rastvorom, kao što je puferovani rastvor koji sadrži acetat, citrat, prolamin, karbonat ili fosfat ili bilo koju njihovu kombinaciju. U jednom otelotvorenju, puferovani rastvor je fosfatno puferovani fiziološki rastvor (PBS).
[0282] U jednom otelotvorenju, dvolančani RNKi agens treba da se primenjuje subjektu supkutano.
[0283] U jednom otelotvorenju, svi nukleotidi sens lanca i svi nukleotidi antisens lanca su modifikovani nukleotidi.
[0284] U jednom otelotvorenju, modifikovani nukleotidi su nezavisno odabrani iz grupe koja se sastoji od 2'-deoksi-2'-fluoro modifikovanog nukleotida, 2'-deoksi-modifikovanog nukleotida, zaključanog nukleotida, abazičnog nukleotida, 2'-amino-modifikovanog nukleotida, 2'-alkil-modifikovanog nukleotida, morfolino nukleotida, fosforamidata i nukleotida koji sadrži nenaturalnu bazu.
[0285] Region komplementarnosti može biti dugačak najmanje 17 nukleotida ili 19 nukleotida.
[0286] U jednom otelotvorenju, region komplementarnosti je dugačak između 19 i 21 nukleotida. U drugom slučaju, region komplementarnosti je dugačak između 21 i 23 nukleotida.
[0287] U jednom slučaju, svaki lanac nije duži od 30 nukleotida.
[0288] Najmanje jedan lanac dvolančanog RNKi agensa može da sadrži 3' izbočinu od najmanje 1 nukleotida ili 3' izbočinu od najmanje 2 nukleotida, npr.2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14, ili 15 nukleotida. U drugim slučajevima, najmanje jedan lanac RNKi agensa sadrži 5' izbočinu od najmanje 1 nukleotida. U određenim slučajevima, najmanje jedan lanac sadrži 5' izbočinu od najmanje 2 nukleotida, npr.2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14, ili 15 nukleotida.
U drugim slučajevima, i 3' i 5' kraj jednog lanca RNKi agensa sadrže izbočinu od najmanje 1 nukleotida.
[0289] U određenim otelotvorenjima, ligand je N-acetilgalaktozamin (GalNAc). Ligand može biti jedan ili više GalNAc pričvršćenih na RNKi agens preko monovalentnog, bivalentnog ili trivalentnog razgranatog linkera. Ligand može biti konjugovan sa 3' krajem sens lanca dvolančanog RNKi agensa, 5' krajem sens lanca dvolančanog RNKi agensa, 3' krajem antisens lanca dvolančanog RNKi agensa, ili 5' krajem antisens lanca dvolančanog RNKi agensa.
[0290] Dvolančani RNKi agensi mogu da sadrže više, npr. 2, 3, 4, 5, ili 6, GalNAc, svaki nezavisno pričvršćen na više nukleotida dvolančanog RNKi agensa preko više monovalentnih linkera.
[0291] U određenim otelotvorenjima, ligand je
[0292] U jednom otelotvorenju, RNKi agens je konjugovan sa ligandom kao što je prikazano na sledećoj šemi
i, gde je X O ili S.
[0293] U jednom otelotvorenju, X je O.
[0294] U jednom otelotvorenju, region komplementarnosti se sastoji od nukleotidne sekvence 5'-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3' (SEQ ID NO: 15).
[0295] U jednom otelotvorenju, dvolančani RNKi agens sadrži sens lanac koji se sastoji od nukleotidne sekvence 5'- GGUUAACACCAUUUACUUCAA -3' (SEQ ID NO: 16), i antisens lanac koji se sastoji od nukleotidne sekvence 5'-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3' (SEQ ID NO: 15).
[0296] U jednom otelotvorenju, sens lanac se sastoji od 5'-GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf - 3' (SEQ ID NO: 13), a antisens lanac se sastoji od 5' - usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg - 3' (SEQ ID NO: 14), gde su A, C, G i U riboza A, C, G ili U; a, c, g i u su 2'-O-metil (2'-OMe) A, C, G ili U; Af, Cf, Gf ili Uf su 2'-fluoro A, C, G ili U; i s je fosforotioatna veza.
[0297] U jednom otelotvorenju, sens lanac se sastoji od 5'-GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf - 3' (SEQ ID NO: 13), a antisens lanac se sastoji od 5' - usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg - 3' (SEQ ID NO: 14), gde su A, C, G i U riboza A, C, G ili U; a, c, g i u su 2'-O-metil (2'-OMe) A, C, G ili U; Af, Cf, Gf ili Uf su 2'-fluoro A, C, G ili U; i s je fosforotioatna veza; i gde je sens lanac konjugovan sa ligandom kao što je prikazano na sledećoj šemi
, gde je X O ili S.
[0298] U jednom slučaju, agens se primenjuje kao farmaceutska kompozicija. U jednom otelotvorenju, RNKi agens treba da se primeni u nepuferovanom rastvoru, kao što je fiziološki rastvor ili voda.
[0299] U drugom slučaju, siRNK se primenjuje sa puferovanim rastvorom, kao što je puferovani rastvor koji sadrži acetat, citrat, prolamin, karbonat ili fosfat ili bilo koju njihovu kombinaciju. U jednom slučaju, puferovani rastvor je fosfatno puferovani fiziološki rastvor (PBS).
[0300] Ova objava takođe pruža komplete za izvođenje metoda ove objave. Kompleti mogu da sadrže RNKi agens ove objave, i uputstva za upotrebu, i opciono, sredstva za primenu RNKi agensa subjektu.
Kratak opis slika
[0301]
Slika 1A je grafikon koji prikazuje efekte jednokratne supkutane doze od 0,03 mg/kg AD-57213 na nivoe generisanja trombina u plazmi kod jednog zdravog ljudskog subjekta.
Slika 1B je grafikon koji prikazuje efekte jednokratne supkutane doze od 0,03 mg/kg AD-57213 na nivoe generisanja trombina u plazmi kod jednog zdravog ljudskog subjekta.
Slika 1C je grafikon koji prikazuje efekte jednokratne supkutane doze od 0,03 mg/kg AD-57213 na nivoe generisanja trombina u plazmi kod jednog zdravog ljudskog subjekta.
Slika 1D je grafikon koji prikazuje efekte jednokratne supkutane doze od 0,03 mg/kg AD-57213 na nivoe generisanja trombina u plazmi kod jednog zdravog ljudskog subjekta.
Slika 2A je grafikon koji prikazuje efekte jednokratne supkutane doze od 0,03 mg/kg AD-57213 na nivoe AT (Serpinc1) proteina u plazmi kod jednog zdravog ljudskog subjekta.
Slika 2B je grafikon koji prikazuje efekte jednokratne supkutane doze od 0,03 mg/kg AD-57213 na nivoe AT (Serpinc1) proteina u plazmi kod jednog zdravog ljudskog subjekta.
Slika 3 je grafikon koji prikazuje povezanost između procenta smanjenja AT (Serpinc1) i procenta povećanja u maksimalnoj generaciji trombina kod zdravih subjekata kojima je primenjena jednokratna supkutana doza od 0,03 mg/kg AD-57213.
Slika 4 je grafikon koji prikazuje efekat višestrukih doza od 0,015 mg/kg, 0,045 mg/kg, ili 0,075 mg/kg AD-57213 na nivoe AT (Serpinc1) proteina u plazmi kod ljudskih subjekata sa hemofilijom A ili B.
Slika 5A je grafikon koji prikazuje efekat višestrukih doza od 0,225 mg/kg, 0,450 mg/kg, 0,900 mg/kg, 1,800 mg/kg, ili 80 mg doza AD-57213 na nivoe AT (Serpinc1) proteina u plazmi kod ljudskih subjekata sa hemofilijom A ili B.
Slika 5B je grafikon koji prikazuje efekat AD-57213 zavisan od doze na nivoe AT (Serpinc1) proteina u plazmi kod ljudskih subjekata.
Slika 6A je grafikon koji prikazuje efekat višestrukih doza od 0,015 mg/kg ili 0,045 mg/kg AD-57213 na maksimalne nivoe trombina kod ljudskih subjekata sa hemofilijom A ili B.
Slika 6B je grafikon koji prikazuje efekat višestrukih doza od 0,015 mg/kg ili 0,045 mg/kg AD-57213 na generisanje trombina kao procenat promene u odnosu na početnu vrednost grupe kod ljudskih subjekata sa hemofilijom A ili B.
Slika 7 je grafikon koji prikazuje efekat višestrukih doza od 0,045 mg/kg AD-57213 na vreme formiranja ugruška i vreme zgrušavanja kod jednog subjekta sa hemofilijom A (subjekt 101-009).
Slika 8 je grafikon koji prikazuje srednje maksimalno smanjenje AT po mesečnoj ekvivalentnoj dozi.
Slika 9 je grafikon koji prikazuje efekat višestrukih doza AD-57213 na generisanje trombina po kvartilima smanjenja AT.
Slika 10A je grafikon koji prikazuje relativnu AT aktivnost u odnosu na procenat maksimalne generacije trombina postignut sa faktorom VIII, kako je utvrđeno kod subjekta kojem je primenjeno 225 mcg/kg qM AD-57213.
Slika 10B je grafikon koji prikazuje relativnu AT aktivnost u odnosu na procenat maksimalne generacije trombina postignut sa faktorom VIII, kako je utvrđeno kod subjekta kojem je primenjeno 1800 mcg/kg qM AD-57213.
Slika 10C je grafikon koji prikazuje relativnu AT aktivnost u odnosu na procenat maksimalne generacije trombina postignut sa faktorom VIII, kako je utvrđeno kod subjekta kojem je primenjeno 80 mg qM AD-57213.
Slika 11 je grafikon koji prikazuje efekat višestrukih doza AD-57213 na događaje krvarenja po kvartilima smanjenja AT.
Slika 12 je tabela koja prikazuje podatke o događajima krvarenja za subjekte uključene u deo C kliničkog ispitivanja faze I AD-57213.
Slika 13A je grafikon koji prikazuje medijanu godišnje stope krvarenja (ABR) pre početka studije, u delu studije na početku i tokom dela studije posmatranja za sve kohorte doziranja u delu C kliničkog ispitivanja faze I AD-57213.
Slika 13B je grafikon koji prikazuje medijanu godišnje stope krvarenja (ABR) pre početka studije, u delu studije na početku i tokom dela studije posmatranja za kohortu od 80 mg mesečno (80 mg qM x3) u delu C kliničkog ispitivanja faze I AD-57213.
Slika 14A je grafikon koji prikazuje relativnu AT aktivnost u odnosu na procenat maksimalne generacije trombina postignut sa faktorom VIII, kako je utvrđeno kod subjekta sa inhibitorom kojem je primenjena fiksna mesečna doza od 50 mg AD-57213.
Slika 14B je grafikon koji prikazuje relativnu AT aktivnost u odnosu na procenat maksimalne generacije trombina postignut sa faktorom VIII, kako je utvrđeno kod subjekta sa inhibitorom kojem je primenjena fiksna mesečna doza od 50 mg AD-57213.
Slika 14C je grafikon koji prikazuje relativnu AT aktivnost u odnosu na procenat maksimalne generacije trombina postignut sa faktorom VIII, kako je utvrđeno kod subjekta sa inhibitorom kojem je primenjena fiksna mesečna doza od 50 mg AD-57213.
Slika 14D je grafikon koji prikazuje relativnu AT aktivnost u odnosu na procenat maksimalne generacije trombina postignut sa faktorom VIII, kako je utvrđeno kod subjekta sa inhibitorom kojem je primenjena fiksna mesečna doza od 50 mg AD-57213.
Slika 14E je grafikon koji prikazuje relativnu AT aktivnost u odnosu na procenat maksimalne generacije trombina postignut sa faktorom VIII, kako je utvrđeno kod subjekta sa inhibitorom kojem je primenjena fiksna mesečna doza od 50 mg AD-57213.
Slika 14F je grafikon koji prikazuje relativnu AT aktivnost u odnosu na procenat maksimalne generacije trombina postignut sa faktorom VIII, kako je utvrđeno kod subjekta sa inhibitorom kojem je primenjena fiksna mesečna doza od 50 mg AD-57213.
Slika 15 je grafikon koji prikazuje efekat višestrukih doza od 50 mg ili 80 mg AD-57213 na prosečnu AT (Serpinc1) aktivnost u odnosu na početnu vrednost u ljudskim subjektima sa hemofilijom A ili B sa inhibitorima.
Slika 16 je grafikon koji prikazuje da efekat smanjenja AT višestrukim dozama od 50 mg AD-57213 korelira sa povećanom generacijom trombina kod subjekta sa hemofilijom A.
Slika 17A je tabela koja prikazuje podatke o događajima krvarenja za subjekte uključene u deo D kliničkog ispitivanja faze I AD-57213.
Slika 17B je grafikon koji prikazuje medijanu godišnje stope krvarenja (ABR) pre početka studije, u delu studije na početku i tokom dela studije posmatranja za sve subjekte u delu D kliničkog ispitivanja faze I AD-57213.
Slika 18 je grafikon koji prikazuje efekat višestrukih doza od 80 mg AD-57213 na prosečnu AT (Serpinc1) aktivnost u odnosu na početnu vrednost kod ljudskog subjekta sa hemofilijom bez inhibitora u kliničkom ispitivanju faze II sa otvorenim etiketiranjem (OLE) AD-57213.
Slika 19A je grafikon koji prikazuje efekat višestrukih doza od 50 mg ili 80 mg AD-57213 na prosečnu AT (Serpinc1) aktivnost u odnosu na početnu vrednost kod ljudskih subjekata sa hemofilijom A ili B bez inhibitora u kliničkom ispitivanju faze II sa otvorenim etiketiranjem (OLE) AD-57213.
Slika 19B je grafikon koji prikazuje efekat višestrukih doza od 50 mg ili 80 mg AD-57213 na maksimalnu generaciju trombina kod ljudskih subjekata sa hemofilijom A ili B bez inhibitora u kliničkom ispitivanju faze II sa otvorenim etiketiranjem (OLE) AD-57213. Zasenčeni deo grafikona predstavlja raspon maksimalnih nivoa trombina uočenih kod zdravih ljudskih dobrovoljaca (HV) kojima je primenjen AD-57213 i sa manje od 25% smanjenja AT u ispitivanju faze I AD-57213 opisanom u primeru 1. Isprekidana linija kroz raspon HV predstavlja medijanu maksimalnog nivoa trombina uočenog kod zdravih ljudskih dobrovoljaca (HV) i sa manje od 25% smanjenja AT kojima je primenjen AD-57213 u ispitivanju faze I AD-57213 opisanom u primeru 1.
Slika 20A je tabela koja prikazuje podatke o događajima krvarenja za subjekte uključene u kliničko ispitivanje faze II OLE AD-57213.
Slika 20B je grafikon koji prikazuje medijanu godišnje stope krvarenja (ABR) pre početka studije, u delu studije na početku i tokom dela studije posmatranja za sve subjekte u kliničkom ispitivanju faze II OLE AD-57213.
Detaljan opis pronalaska
[0302] Ova objava je zasnovana, barem delimično, na iznenađujućem otkriću da veoma niske doze (npr. doze najmanje oko 30 puta niže od doza opisanih u struci) dvolančanog RNKi agensa povezanog sa GalNAc, koji sadrži posebne hemijske modifikacije, pokazuju izuzetnu potentnost da inhibiraju ekspresiju Serpinc1, kao i izuzetno trajanje inhibicije ekspresije Serpinc1. Konkretno, ovde je pokazano da su niske doze RNKi agenasa koji uključuju GalNAc ligand, pri čemu su suštinski svi nukleotidi modifikovani, kao što je RNKi agens koji uključuje jedan ili više motiva od tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida, uključujući jedan takav motiv na mestu cepanja agenasa ili blizu njega, šest fosforotioatnih veza, i GalNAc ligand, izuzetno efikasni i trajni u utišavanju aktivnosti gena Serpinc1.
[0303] Shodno tome, ova objava pruža metode za sprečavanje najmanje jednog simptoma, npr. krvarenja, kod subjekta koji ima poremećaj kod koga bi bila korisna inhibicija ili smanjenje ekspresije gena Serpinc1, npr. bolest povezana sa Serpinc1, kao što je hemofilija (npr. hemofilija A ili hemofilija B), korišćenjem iRNK kompozicija koje vrše cepanje RNK transkripata gena Serpinc1 posredovano kompleksom za utišavanje izazvanim RNK (RISC). Ova objava pruža dalje metode lečenja subjekta sa poremećajem za koji bi bilo od koristi inhibiranje ili smanjenje ekspresije Serpinc1 gena, na primer, poremećajem krvarenja kao što je hemofilija (npr. hemofilija A, ili hemofilija B), koristeći iRNK kompozicije koje dovode do cepanja transkripata RNK Serpinc1 gena, posredovanog kompleksom za utišavanje izazvanim RNK (RISC).
[0304] iRNK agensi za upotrebu u metodama ove objave generalno uključuju RNK lanac (antisens lanac) sa regionom dužine oko 30 nukleotida ili manje, npr.15-30, 15-29, 15-28, 15-27, 15-26, 15-25, 15-24, 15-23, 15-22, 15-21, 15-20, 15-19, 15-18, 15-17, 18-30, 18-29, 18-28, 18-27, 18-26, 18-25, 18-24, 18-23, 18-22, 18-21, 18-20, 19-30, 19-29, 19-28, 19-27, 19-26, 19-25, 19-24, 19-23, 19-22, 19-21, 19-20, 20-30, 20-29, 20-28, 20-27, 20-26, 20-25, 20-24, 20-23, 20-22, 20-21, 21-30, 21-29, 21-28, 21-27, 21-26, 21-25, 21-24, 21-23, ili 21-22 nukleotida, pri čemu je taj region suštinski komplementaran barem delu iRNK transkripta gena Serpinc1.
[0305] U drugim slučajevima, jedan ili oba lanca dvolančanog RNKi agensa iz ove objave su dužine do 66 nukleotida, npr.36-66, 26-36, 25-36, 31-60, 22-43, 27-53 nukleotida, sa regionom od najmanje 19 uzastopnih nukleotida koji je suštinski komplementaran barem delu iRNK transkripta gena Serpinc1. U nekim slučajevima, sens i antisens lanci formiraju dupleks od 18-30 uzastopnih nukleotida.
[0306] U nekim slučajevima, iRNK agensi za upotrebu u metodama ove objave uključuju RNK lanac (antisens lanac) koji može biti dužine do 66 nukleotida, npr.36-66, 26-36, 25-36, 31-60, 22-43, 27-53 nukleotida, sa regionom od najmanje 19 uzastopnih nukleotida koji je suštinski komplementaran barem delu iRNK transkripta gena Serpinc1. U nekim slučajevima, takvi iRNK agensi sa dužim antisens lancima mogu da uključuju drugi RNK lanac (sens lanac) dužine 20-60 nukleotida, pri čemu sens i antisens lanci formiraju dupleks od 18-30 uzastopnih nukleotida.
[0307] Sledeći detaljan opis obelodanjuje kako se prave i koriste kompozicije koje sadrže iRNK za inhibiciju ekspresije gena Serpinc1, kao i kompozicije, upotrebe i metode za lečenje subjekata sa bolestima i poremećajima kod kojih bi inhibicija i/ili redukcija ekspresije ovog gena bila korisna.
I. Definicije
[0308] Kako bi se predmetni pronalazak lakše razumeo, prvo se definišu određeni pojmovi. Pored toga, treba napomenuti da kad god se navede vrednost ili raspon vrednosti nekog parametra, podrazumeva se da su i vrednosti i rasponi između navedenih vrednosti takođe deo ovog pronalaska.
[0309] Upotreba oblika u jednini i množini podrazumeva isto značenje i označava (najmanje jedan) gramatički objekat. Na primer, „element“ znači jedan element ili više od jednog elementa, npr. mnoštvo elemenata.
[0310] Termin „uključujući“ se ovde koristi u značenju, i naizmenično sa, frazom „uključujući, ali ne ograničavajući se na“.
[0311] Termin „ili“ se ovde koristi u značenju, i naizmenično sa, terminom „i/ili“, osim ako kontekst jasno ne ukazuje drugačije.
[0312] Kako se ovde koristi, „Serpinc1“ se odnosi na određeni polipeptid izražen u ćeliji. Serpinc1 je takođe poznat kao serpin peptidazni inhibitor, klada C (antitrombin; AT), član 1; antitrombin III; AT3; antitrombin; i heparin kofaktor 1. Sekvenca humanog Serpinc1 mRNK transkripta može se naći, na primer, pod GenBank pristupnim brojem GI:254588059 (NM_000488; SEQ ID NO:1). Sekvenca rezus Serpinc1 mRNK može se naći, na primer, pod GenBank pristupnim brojem GI:157167169 (NM_001104583; SEQ ID NO:2). Sekvenca mišjeg Serpinc1 mRNK može se naći, na primer, pod GenBank pristupnim brojem GI:237874216 (NM_080844; SEQ ID NO:3). Sekvenca pacovskog Serpinc1 mRNK može se naći, na primer, pod GenBank pristupnim brojem GI:58865629 (NM_001012027; SEQ ID NO:4).
[0313] Termin „Serpinc1“ kako se ovde koristi, takođe se odnosi na određeni polipeptid izražen u ćeliji putem prirodnih varijacija DNK sekvence gena Serpinc1, kao što je polimorfizam pojedinačnog nukleotida u genu Serpinc1. Brojni SNP unutar gena Serpinc1 su identifikovani i mogu se naći, na primer, na NCBI dbSNP (videti npr. www.ncbi.nlm.nih.gov/snp). Neograničavajući primeri SNP unutar gena Serpinc1 mogu se naći pod NCBI dbSNP pristupnim brojevima rs677; rs5877; rs5878; rs5879; rs941988; rs941989; rs1799876; rs19637711; rs2008946; i rs2227586.
[0314] Kako se ovde koristi, subjekt je životinja, kao što je sisar, uključujući primate (kao što je čovek, nehumani primat, npr. majmun, i šimpanza), neprimate (kao što je krava, svinja, kamila, lama, konj, koza, zec, ovca, hrčak, morsko prase, mačka, pas, pacov, miš, konj i kit) ili ptice (npr. patka ili guska). U jednom otelotvorenju, subjekt je čovek, kao što je čovek koji se leči ili procenjuje za bolest, poremećaj ili stanje kod koga bi bila korisna redukcija ekspresije Serpinc1; čovek koji je pod rizikom od bolesti, poremećaja ili stanja kod koga bi bila korisna redukcija ekspresije Serpinc1; čovek koji ima bolest, poremećaj ili stanje kod koga bi bila korisna redukcija ekspresije Serpinc1; i/ili čovek koji se leči od bolesti, poremećaja ili stanja kod koga bi bila korisna redukcija ekspresije Serpinc1, kao što je ovde opisano.
[0315] Kako se ovde koriste, termini „lečiti“ ili „lečenje“ se odnose na koristan ili željeni rezultat uključujući, ali ne ograničavajući se na, ublažavanje ili poboljšanje jednog ili više simptoma, smanjenje obima krvarenja, stabilizovano (tj. ne pogoršavajuće) stanje krvarenja, ublažavanje ili palijaciju krvarenja, bilo da je to detektovano ili nedetektovano. „Lečenje“ takođe može značiti produženje preživljavanja u poređenju sa očekivanim preživljavanjem u odsustvu tretmana. U metodama ove objave, lečenje uključuje lečenje na zahtev i kontrolu epizoda kvarenja, perioperativno upravljanje krvarenjem i rutinsku profilaksu za smanjenje učestalosti epizoda krvarenja.
[0316] Termin „smanjenje“ u kontekstu nivoa Serpinc1 kod subjekta ili markera bolesti ili simptoma odnosi se na statistički značajno smanjenje tog nivoa. Smanjenje može biti, na primer, najmanje 10%, najmanje 15%, najmanje 20%, najmanje 25%, najmanje 30%, najmanje 35%, najmanje 40%, najmanje 45%, najmanje 50%, najmanje 55%, najmanje 60%, najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95% ili više, i poželjno je da bude do nivoa koji je prihvaćen kao normalan za pojedinca bez tog poremećaja.
[0317] Kako se ovde koristi, prevencija ili sprečavanje, kada se koriste u odnosu na bolest, poremećaj ili stanje koje bi imalo koristi od smanjenja ekspresije gena Serpinc1, odnosi se na smanjenje verovatnoće da će subjekt razviti simptom povezan sa takvom bolešću, poremećajem ili stanjem, npr. simptom kao što je krvarenje. Verovatnoća razvoja krvarenja je smanjena, na primer, kada pojedinac koji ima jedan ili više faktora rizika za krvarenje ili ne razvije krvarenje ili razvije krvarenje sa manjom ozbiljnošću u odnosu na populaciju sa istim faktorima rizika koja ne prima tretman opisan ovde. Nerazvijanje bolesti, poremećaja ili stanja, ili smanjenje razvoja simptoma povezanog sa takvom bolešću, poremećajem ili stanjem (npr. za najmanje oko 10% na klinički prihvaćenoj skali za tu bolest ili poremećaj), ili pokazivanje odloženih simptoma (npr. za dane, nedelje, mesece ili godine) smatra se efikasnom prevencijom.
[0318] Kako se ovde koristi, termin „poremećaj krvarenja“ je bolest ili poremećaj koji dovodi do lošeg zgrušavanja krvi i/ili prekomernog krvarenja. Poremećaj krvarenja može biti nasledni poremećaj, kao što je hemofilija ili fon Vilebrandova bolest, ili stečeni poremećaj, povezan sa, na primer, diseminovanom intravaskularnom koagulacijom, eklampsijom povezanom sa trudnoćom, nedostatkom vitamina K, autoimunim poremećajem, inflamatornom bolešću creva, ulceroznim kolitisom, dermatološkim poremećajem (npr. psorijaza, pemfigus), respiratornom bolešću (npr. astma, hronična opstruktivna plućna bolest), alergijskom reakcijom na lek, npr. kao rezultat lekova, kao što su aspirin, heparin i varfarin, dijabetesom, akutnom infekcijom hepatitisa B, akutnom infekcijom hepatitisa C, malignitetom ili čvrstim tumorom (npr. prostata, pluća, debelo crevo, pankreas, želudac, žučni kanali, glava i vrat, grlić materice, dojke, melanom, bubreg, i/ili hematološkim malignitetom). U jednom otelotvorenju, nasledni poremećaj krvarenja je hemofilija, npr. hemofilija A ili B. U jednom otelotvorenju, subjekt sa naslednim poremećajem krvarenja, npr. hemofilijom, razvio je inhibitore, npr. aloantitela inhibitore, na zamenske terapije koagulacijom i ovde se naziva „subjektom sa inhibitorom“. U jednom otelotvorenju, subjekt sa inhibitorom ima hemofiliju A. U drugom otelotvorenju, subjekt sa inhibitorom ima hemofiliju B
[0319] „Terapijski efikasna količina“, kako se ovde koristi, ima za cilj da obuhvati količinu RNKi agensa koja je, kada se primeni subjektu sa poremećajem krvarenja i krvarenjem, dovoljna da deluje na lečenje bolesti (npr. smanjenjem, ublažavanjem ili održavanjem postojeće bolesti ili jednog ili više simptoma bolesti). „Terapijski efikasna količina“ može varirati u zavisnosti od RNKi agensa, načina primene agenasa, bolesti i njene ozbiljnosti i istorije, starosti, težine, porodične istorije, genetskog sastava, vrste prethodnih ili pratećih tretmana, ako ih ima, i drugih individualnih karakteristika subjekta koji se leči.
[0320] „Profilaktički efikasna količina“, kako se ovde koristi, ima za cilj da obuhvati količinu iRNK koja je, kada se primeni subjektu sa poremećajem krvarenja ali bez krvarenja, npr. subjektu sa poremećajem krvarenja koji je zakazan za operaciju (npr. perioperativni tretman), dovoljna da spreči ili ublaži bolest ili jedan ili više simptoma bolesti. Ublažavanje bolesti uključuje usporavanje toka bolesti ili smanjenje ozbiljnosti bolesti koja se kasnije razvija. „Profilaktički efikasna količina“ može da varira u zavisnosti od iRNK, načina primene agenasa, stepena rizika od bolesti, i istorije, starosti, težine, porodične istorije, genetskog sastava, vrste prethodnih ili pratećih tretmana, ako ih ima, i drugih individualnih karakteristika pacijenta koji se leči.
[0321] „Terapijski efikasna količina“ ili „profilaktički efikasna količina“ takođe uključuje količinu RNKi agensa koja proizvodi neki željeni lokalni ili sistemski efekat sa razumnim odnosom koristi/rizika primenljivim na bilo koje lečenje. iRNK primenjena u metodama predmetnog pronalaska može se primeniti u dovoljnoj količini da proizvede razuman odnos koristi/rizika primenljiv na takvo lečenje.
[0322] Fraza „farmaceutski prihvatljivo“ se ovde koristi da se odnosi na ona jedinjenja, materijale, kompozicije, i/ili oblike doziranja koji su, u okviru zdravog medicinskog rasuđivanja, pogodni za upotrebu u kontaktu sa tkivima ljudskih subjekata i životinjskih subjekata bez prekomerne toksičnosti, iritacije, alergijskog odziva, ili drugog problema ili komplikacije, srazmerno razumnom odnosu koristi/rizika.
[0323] Fraza „farmaceutski prihvatljiv nosač“, kako se ovde koristi, znači farmaceutski prihvatljiv materijal, kompoziciju ili vehikulum, kao što je tečni ili čvrsti filar, diluent, ekscipijens, pomoćno sredstvo za proizvodnju (npr. lubrikant, magnezijum talata, natrijum lauril sulfat, ili talk), ili materijal za inkapsulaciju rastvarača, uključen u prenošenje predmetnog jedinjenja iz jednog organa, ili dela tela, u drugi organ, ili deo tela. Svaki nosač mora biti „prihvatljiv“ u smislu da je kompatibilan sa drugim sastojcima formulacije i da nije štetan za subjekta koji se leči. Neki primeri materijala koji mogu služiti kao farmaceutski prihvatljivi nosači uključuju: (1) šećere, kao što su laktoza, glukoza i saharoza; (2) skrob, kao što su kukuruzni skrob i krompirov skrob; (3) celulozu, i njene derivate, kao što su natrijum karboksimetil celuloza, etil celuloza i celuloza acetat; (4) tragakant u prahu; (5) slad; (6) želatin; (7) lubrikante, kao što su magnezijum stearat, natrijum lauril sulfat i talk; (8) ekscipijense, kao što su kakao puter i supozitorijski voskovi; (9) ulja, kao što su ulje kikirikija, pamučno ulje, ulje šafranike, susamovo ulje, maslinovo ulje, kukuruzno ulje i sojino ulje; (10) glikole, kao što je propilen glikol; (11) poliole, kao što su glicerin, sorbitol, manitol i polietilen glikol; (12) estre, kao što su etil oleat i etil laurat; (13) agar; (14) puferujuće agense, kao što su magnezijum hidroksid i aluminijum hidroksid; (15) alginsku kiselinu; (16) vodu bez pirogena; (17) izotonični fiziološki rastvor; (18) Ringerov rastvor; (19) etil alkohol; (20) pH puferovane rastvore; (21) poliestre, polikarbonate i/ili polianhidride; (22) agense za povećanje zapremine, kao što su polipeptidi i aminokiseline (23) komponentu seruma, kao što su serumski albumin, HDL i LDL; i (22) druge netoksične kompatibilne supstance korišćene u farmaceutskim formulacijama.
[0324] „Ciljna sekvenca“ se, kako se ovde koristi, odnosi na uzastopni deo nukleotidne sekvence mRNK molekula formiranog tokom transkripcije gena Serpinc1, uključujući mRNK koja je proizvod obrade RNK primarnog transkripcionog proizvoda. U jednom slučaju, ciljni deo sekvence će biti dovoljno dug da služi kao supstrat za cepanje usmereno iRNK na ili blizu tog dela nukleotidne sekvence mRNK molekula formiranog tokom transkripcije gena Serpinc1.
[0325] Ciljna sekvenca može biti dužine od oko 9-36 nukleotida, npr. dužine oko 15-30 nukleotida. Na primer, ciljna sekvenca može biti dužine od oko 15-30 nukleotida, 15-29, 15-28, 15-27, 15-26, 15-25, 15-24, 15-23, 15-22, 15-21, 15-20, 15-19, 15-18, 15-17, 18-30, 18-29, 18-28, 18-27, 18-26, 18-25, 18-24, 18-23, 18-22, 18-21, 18-20, 19-30, 19-29, 19-28, 19-27, 19-26, 19-25, 19-24, 19-23, 19-22, 19-21, 19-20, 20-30, 20-29, 20-28, 20-27, 20-26, 20-25, 20-24,20-23, 20-22, 20-21, 21-30, 21-29, 21-28, 21-27, 21-26, 21-25, 21-24, 21-23, ili 21-22 nukleotida. Rasponi i dužine između gore navedenih raspona i dužina takođe se smatraju delom ove objave.
[0326] Kako se ovde koristi, termin „lanac koji sadrži sekvencu“ odnosi se na oligonukleotid koji se sastoji od lanca nukleotida koji je opisan sekvencom navedenom korišćenjem standardne nukleotidne nomenklature.
[0327] „G“, „C“, „A“, „T“ i „U“ generalno označavaju nukleotid koji sadrži guanin, citozin, adenin, timidin i uracil kao bazu, respektivno. Međutim, podrazumeva se da se termin „ribonukleotid“ ili „nukleotid“ takođe može odnositi na modifikovani nukleotid, kao što je dalje detaljno opisano, ili surogat zamensku grupu (videti npr. tabelu 1). Stručnjak u ovoj oblasti je dobro svestan da se guanin, citozin, adenin i uracil mogu zameniti drugim grupama bez suštinske promene svojstava baznog uparivanja oligonukleotida koji se sastoji od nukleotida koji nosi takvu zamensku grupu. Na primer, bez ograničenja, nukleotid koji se sastoji od inozina kao svoje baze može se bazno upariti sa nukleotidima koji sadrže adenin, citozin ili uracil. Stoga, nukleotidi koji sadrže uracil, guanin ili adenin mogu se zameniti u nukleotidnim sekvencama dsRNK navedenim u ovoj objavi nukleotidom koji sadrži, na primer, inozin. U drugom primeru, adenin i citozin bilo gde u oligonukleotidu mogu se zameniti gvaninom i uracilom, respektivno, da bi se formiralo G-U Wobble bazno uparivanje sa ciljnom mRNK. Sekvence koje sadrže takve zamenske grupe pogodne su za kompozicije i metode predstavljene u ovoj objavi.
[0328] Termini „iRNK“, „RNKi agens,“ „iRNK agens“ i „agens RNK interferencije“, kako se naizmenično koriste, odnose se na agens koji sadrži RNK, kako je taj termin definisan ovde, i koji posreduje ciljano cepanje RNK transkripta putem RNK-izazvanog kompleksa za utišavanje (RISC) puta. iRNK usmerava sekvencno-specifičnu degradaciju mRNK kroz proces poznat kao RNK interferencija (RNKi). iRNK modulira, npr. inhibira, ekspresiju Serpinc1 u ćeliji, npr. ćeliji unutar subjekta, kao što je sisar.
[0329] U jednom slučaju, RNKi agens ove objave uključuje jednolančanu RNK koja interaguje sa ciljnom RNK sekvencom, npr. ciljnom mRNK sekvencom Serpinc1, kako bi usmerila cepanje ciljne RNK. Ne vezujući se za teoriju, veruje se da se duga dvolančana RNK uneta u ćelije razlaže na siRNK pomoću endonukleaze tipa III poznate kao Dicer (Sharp et al. (2001) Genes Dev. 15:485). Dicer, enzim sličan ribonukleazi-III, obrađuje dsRNK u kratke interferirajuće RNK duplekse od 19-23 baznih parova sa karakterističnim dvobaznim 3' izbočinama (Bernstein, et al., (2001) Nature 409:363). siRNK se zatim ugrađuju u RNK-izazvani kompleks za utišavanje (RISC) gde jedna ili više helikaza odmotava siRNK dupleks, omogućavajući komplementarnom antisens lancu da usmerava prepoznavanje mete (Nykanen, et al., (2001) Cell 107:309). Nakon vezivanja za odgovarajuću ciljnu mRNK, jedna ili više endonukleaza unutar RISC cepa metu kako bi izazvala utišavanje (Elbashir, et al., (2001) Genes Dev. 15:188). Dakle, u jednom slučaju, objava se odnosi na jednolančanu RNK (siRNK) generisanu unutar ćelije koja promoviše formiranje RISC kompleksa kako bi se postiglo utišavanje ciljnog gena, tj. gena Serpinc1. Prema tome, termin „siRNK“ se takođe koristi ovde da se odnosi na RNKi, kako je gore opisano.
[0330] U drugom slučaju, RNKi agens može biti jednolančana siRNK koja se uvodi u ćeliju ili organizam kako bi inhibirala ciljnu mRNK. Jednolančani RNKi agensi se vezuju za RISC endonukleazu, Argonaute 2, koja zatim cepa ciljnu mRNK. Jednolančane siRNK su generalno duge 15-30 nukleotida i hemijski su modifikovane. Dizajn i testiranje jednolančanih siRNK su opisani u američkom patentu br.8,101,348 i u Lima et al., (2012) Cell 150: 883-894. Bilo koja od antisens nukleotidnih sekvenci opisanih ovde može se koristiti kao jednolančana siRNK kako je ovde opisano ili hemijski modifikovana metodama opisanim u Lima et al., (2012) Cell 150:883-894.
[0331] „iRNK“ za upotrebu u kompozicijama, upotrebama i metodama ove objave je dvolančana RNK i ovde se naziva „dvolančani RNKi agens,“ „dvolančani RNK (dsRNK) molekul,“ „dsRNK agens“ ili „dsRNK“. Termin „dsRNK“ odnosi se na kompleks molekula ribonukleinske kiseline, koji ima dupleks strukturu koja se sastoji od dva antiparalelna i suštinski komplementarna lanca nukleinske kiseline, koji se nazivaju „sens“ i „antisens“ orijentacije u odnosu na ciljnu RNK, tj. gen Serpinc1. Dvolančana RNK (dsRNK) može pokrenuti degradaciju ciljne RNK, npr. mRNK, kroz mehanizam utišavanja gena nakon transkripcije koji se ovde naziva RNK interferencija ili RNKi.
[0332] Uopšteno, većina nukleotida svakog lanca dsRNK molekula su ribonukleotidi, ali kao što je ovde detaljno opisano, svaki ili oba lanca mogu takođe uključivati jedan ili više neribonukleotida, npr. deoksiribonukleotid i/ili modifikovani nukleotid. Pored toga, kako se koristi u ovoj specifikaciji, „RNKi agens“ može uključivati ribonukleotide sa hemijskim modifikacijama; RNKi agens može uključivati značajne modifikacije na više nukleotida.
[0333] Kako se ovde koristi, termin „modifikovani nukleotid“ odnosi se na nukleotid koji ima, nezavisno, modifikovanu šećernu grupu, modifikovanu internukleotidnu vezu i/ili modifikovanu nukleobazu. Dakle, termin modifikovani nukleotid obuhvata supstitucije, dodatke ili uklanjanje, npr. funkcionalne grupe ili atoma, na internukleozidnim vezama, šećernim grupama ili nukleobazama. Modifikacije pogodne za upotrebu u agensima iz ove objave uključuju sve vrste modifikacija obelodanjenih ovde ili poznatih u struci. Bilo koje takve modifikacije, kako se koriste u siRNK tipu molekula, obuhvaćene su „RNKi agensom“ za potrebe ove specifikacije.
[0334] Dupleks region može biti bilo koje dužine koja omogućava specifičnu degradaciju željene ciljne RNK putem RISC puta i može se kretati od oko 9 do 36 baznih parova, npr. oko 15-30 baznih parova, na primer, oko 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, ili 36 baznih parova, kao što je oko 15-30, 15-29, 15-28, 15-27, 15-26, 15-25, 15-24, 15-23, 15-22, 15-21, 15-20, 15-19, 15-18, 15-17, 18-30, 18-29, 18-28, 18-27, 18-26, 18-25, 18-24, 18-23, 18-22, 18-21, 18-20, 19-30, 19-29, 19-28, 19-27, 19-26, 19-25, 19-24, 19-23, 19-22, 19-21, 19-20, 20-30, 20-29, 20-28, 20-27, 20-26, 20-25, 20-24,20-23, 20-22, 20-21, 21-30, 21-29, 21-28, 21-27, 21-26, 21-25, 21-24, 21-23, ili 21-22 baznih parova. Rasponi i dužine između gore navedenih raspona i dužina takođe se smatraju delom ove objave.
[0335] Dva lanca koja formiraju dupleks strukturu mogu biti različiti delovi jednog većeg RNK molekula, ili mogu biti zasebni RNK molekuli. Tamo gde su dva lanca deo jednog većeg molekula, i stoga su povezani neprekinutim lancem nukleotida između 3'-kraja jednog lanca i 5'-kraja odgovarajućeg drugog lanca koji formira dupleks strukturu, povezujući RNK lanac se naziva „ukosnička petlja“. Ukosnička petlja može da sadrži najmanje jedan nespareni nukleotid. U nekim slučajevima, ukosnička petlja može da sadrži najmanje 2, najmanje 3, najmanje 4, najmanje 5, najmanje 6, najmanje 7, najmanje 8, najmanje 9, najmanje 10, najmanje 20, najmanje 23 ili više nesparenih nukleotida.
[0336] Tamo gde su dva suštinski komplementarna lanca dsRNK sastavljena od zasebnih RNK molekula, ti molekuli ne moraju, ali mogu biti kovalentno povezani. Tamo gde su dva lanca kovalentno povezana drugim sredstvima osim neprekinutog lanca nukleotida između 3'-kraja jednog lanca i 5'-kraja odgovarajućeg drugog lanca koji formira dupleks strukturu, povezujuća struktura se naziva „linker“. RNK lanci mogu imati isti ili različit broj nukleotida. Maksimalan broj baznih parova je broj nukleotida u najkraćem lancu dsRNK minus bilo koje izbočine koje su prisutne u dupleksu. Pored dupleks strukture, RNKi može da sadrži jednu ili više nukleotidnih izbočina.
[0337] U jednom slučaju, RNKi agens ove objave je dsRNK od 24-30 nukleotida koja interaguje sa ciljnom RNK sekvencom, npr. ciljnom mRNK sekvencom Serpinc1, kako bi usmerila cepanje ciljne RNK. Ne želeći da se vežemo za teoriju, duga dvolančana RNK uneta u ćelije razlaže se na siRNK pomoću endonukleaze tipa III poznate kao Dicer (Sharp et al. (2001) Genes Dev. 15:485). Dicer, enzim sličan ribonukleazi-III, obrađuje dsRNK u kratke interferirajuće RNK duplekse od 19-23 baznih parova sa karakterističnim dvobaznim 3' izbočinama (Bernstein, et al., (2001) Nature 409:363). siRNK se zatim ugrađuju u RNK-izazvani kompleks za utišavanje (RISC) gde jedna ili više helikaza odmotava siRNK dupleks, omogućavajući komplementarnom antisens lancu da usmerava prepoznavanje mete (Nykanen, et al., (2001) Cell 107:309). Nakon vezivanja za odgovarajuću ciljnu mRNK, jedna ili više endonukleaza unutar RISC cepa metu kako bi izazvala utišavanje (Elbashir, et al., (2001) Genes Dev. 15:188).
[0338] Kako se ovde koristi, termin „nukleotidna izbočina“ odnosi se na najmanje jedan nespareni nukleotid koji štrči iz dupleks strukture iRNK, npr. dsRNK. Na primer, kada se 3'-kraj jednog lanca dsRNK proteže izvan 5'-kraja drugog lanca, ili obrnuto, postoji nukleotidna izbočina. dsRNK može da sadrži izbočinu od najmanje jednog nukleotida; alternativno, izbočina može da sadrži najmanje dva nukleotida, najmanje tri nukleotida, najmanje četiri nukleotida, najmanje pet nukleotida ili više. Nukleotidna izbočina može da sadrži ili se sastoji od analoga nukleotida/nukleozida, uključujući deoksinukleotid/nukleozid. Izbočina(e) mogu biti na sens lancu, antisens lancu ili bilo kojoj njihovoj kombinaciji. Nadalje, nukleotid(i) izbočine mogu biti prisutni na 5'-kraju, 3'-kraju ili na oba kraja bilo antisens ili sens lanca dsRNK.
[0339] U jednom slučaju, antisens lanac dsRNK ima izbočinu od 1-10 nukleotida, npr.1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10 nukleotida, na 3'-kraju i/ili 5'-kraju. U jednom slučaju, sens lanac dsRNK ima izbočinu od 1-10 nukleotida, npr.1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10 nukleotida, na 3'-kraju i/ili 5'-kraju. U drugom slučaju, jedan ili više nukleotida u izbočini je zamenjen nukleozidnim tiofosfatom.
[0340] U određenim slučajevima, izbočina na sens lancu ili antisens lancu, ili na oba, može da uključuje produžene dužine duže od 10 nukleotida, npr. 10-30 nukleotida, 10-25 nukleotida, 10-20 nukleotida ili 10-15 nukleotida dužine. U određenim slučajevima, produžena izbočina je na sens lancu dupleksa. U određenim slučajevima, produžena izbočina je prisutna na 3' kraju sens lanca dupleksa. U određenim slučajevima, produžena izbočina je prisutna na 5' kraju sens lanca dupleksa. U određenim slučajevima, produžena izbočina je na antisens lancu dupleksa. U određenim slučajevima, produžena izbočina je prisutna na 3' kraju antisens lanca dupleksa. U određenim slučajevima, produžena izbočina je prisutna na 5' kraju antisens lanca dupleksa. U određenim slučajevima, jedan ili više nukleotida u produženoj izbočini je zamenjen nukleozidnim tiofosfatom.
[0341] „Tupi“ ili „tupi kraj“ znači da nema nesparenih nukleotida na tom kraju dvolančanog RNKi agensa, tj. nema nukleotidne izbočine. RNKi agens sa „tupim krajem“ je dsRNK koja je dvolančana duž cele svoje dužine, tj. nema nukleotidne izbočine ni na jednom kraju molekula. RNKi agensi ove objave uključuju RNKi agense sa nukleotidnim izbočinama na jednom kraju (tj. agense sa jednom izbočinom i jednim tupim krajem) ili sa nukleotidnim izbočinama na oba kraja.
[0342] Termin „antisens lanac“ ili „vodeći lanac“ odnosi se na lanac iRNK, npr. dsRNK, koji uključuje region koji je suštinski komplementaran ciljnoj sekvenci, npr. Serpinc1 mRNK. Kako se ovde koristi, termin „region komplementarnosti“ odnosi se na region na antisens lancu koji je suštinski komplementaran sekvenci, na primer ciljnoj sekvenci, npr. nukleotidnoj sekvenci Serpinc1, kako je ovde definisano. Tamo gde region komplementarnosti nije u potpunosti komplementaran ciljnoj sekvenci, nepodudarnosti mogu biti u unutrašnjim ili terminalnim regionima molekula. Generalno, najtolerisanije nepodudarnosti su u terminalnim regionima, npr. u okviru 5, 4, 3, ili 2 nukleotida od 5'- i/ili 3'- kraja iRNK.
[0343] Termin „sens lanac“, ili „pasivan lanac“, kako se ovde koristi, odnosi se na lanac iRNK koji uključuje region koji je suštinski komplementaran regionu antisens lanca, kako je taj termin ovde definisan.
[0344] Kako se ovde koristi, termin „region cepanja“ odnosi se na region koji se nalazi neposredno pored mesta cepanja. Mesto cepanja je mesto na meti na kome dolazi do cepanja. U nekim slučajevima, region cepanja se sastoji od tri baze na bilo kom kraju, i neposredno pored, mesta cepanja. U nekim slučajevima, region cepanja se sastoji od dve baze na bilo kom kraju, i neposredno pored, mesta cepanja. U nekim slučajevima, mesto cepanja se specifično javlja na mestu vezanom nukleotidima 10 i 11 antisens lanca, a region cepanja se sastoji od nukleotida 11, 12 i 13.
[0345] Kako se ovde koristi, i osim ako nije drugačije naznačeno, termin „komplementaran“, kada se koristi za opis prve nukleotidne sekvence u odnosu na drugu nukleotidnu sekvencu, odnosi se na sposobnost oligonukleotida ili polinukleotida koji se sastoji od prve nukleotidne sekvence da hibridizuje i formira dupleks strukturu pod određenim uslovima sa oligonukleotidom ili polinukleotidom koji se sastoji od druge nukleotidne sekvence, kako će razumeti stručnjak. Takvi uslovi mogu, na primer, biti striktni uslovi, gde striktni uslovi mogu uključivati: 400 mM NaCl, 40 mM PIPES pH 6.4, 1 mM EDTA, 50°C ili 70°C za 12-16 sati, nakon čega sledi ispiranje (videti npr. „Molecular Cloning: A Laboratory Manual“, Sambrook, et al. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press). Drugi uslovi, kao što su fiziološki relevantni uslovi koji se mogu sresti unutar organizma, mogu se primeniti. Stručnjak u ovoj oblasti će moći da odredi skup uslova koji je najprikladniji za test komplementarnosti dve sekvence u skladu sa krajnjom primenom hibridizovanih nukleotida.
[0346] Komplementarne sekvence unutar iRNK, npr. unutar dsRNK kako je ovde opisano, uključuju bazno uparivanje oligonukleotida ili polinukleotida koji se sastoji od prve nukleotidne sekvence sa oligonukleotidom ili polinukleotidom koji se sastoji od druge nukleotidne sekvence duž cele dužine jedne ili obe nukleotidne sekvence. Takve sekvence se mogu nazvati „potpuno komplementarnim“ jedna drugoj ovde. Međutim, tamo gde se prva sekvenca naziva „suštinski komplementarnom“ u odnosu na drugu sekvencu ovde, dve sekvence mogu biti potpuno komplementarne, ili mogu formirati jedan ili više, ali generalno ne više od 5, 4, 3 ili 2 nepodudarnih baznih parova prilikom hibridizacije za dupleks do 30 baznih parova, zadržavajući pri tome sposobnost hibridizacije pod uslovima najrelevantnijim za njihovu krajnju primenu, npr. inhibiciju ekspresije gena putem RISC puta. Međutim, tamo gde su dva oligonukleotida dizajnirana da formiraju, pri hibridizaciji, jednu ili više jednolančanih izbočina, takve izbočine se ne smeju smatrati nepodudarnostima u pogledu određivanja komplementarnosti. Na primer, dsRNK koja se sastoji od jednog oligonukleotida dužine 21 nukleotid i drugog oligonukleotida dužine 23 nukleotida, pri čemu duži oligonukleotid obuhvata sekvencu od 21 nukleotida koja je potpuno komplementarna kraćem oligonukleotidu, i dalje se može nazvati „potpuno komplementarnom“ za ovde opisane svrhe.
[0347] „Komplementarne“ sekvence, kako se ovde koriste, takođe mogu uključivati, ili biti u potpunosti formirane od, ne-Vatson-Krik baznih parova i/ili baznih parova formiranih od neprirodnih i modifikovanih nukleotida, ukoliko su ispunjeni gore navedeni zahtevi u pogledu njihove sposobnosti hibridizacije. Takvi ne-Vatson-Krik bazni parovi uključuju, ali nisu ograničeni na, G:U Wobble ili Hoogstein bazno uparivanje.
[0348] Termini „komplementaran“, „potpuno komplementaran“ i „suštinski komplementaran“ ovde se mogu koristiti u odnosu na podudarnost baza između sens lanca i antisens lanca dsRNK, ili između antisens lanca iRNK agensa i ciljne sekvence, što će biti razumljivo iz konteksta njihove upotrebe.
[0349] Kao što je ovde upotrebljeno, polinukleotid koji je „suštinski komplementaran sa bar delom“ informacione RNK (mRNK) odnosi se na polinukleotid koji je u suštini komplementaran sa neprekidnim delom iRNK od interesa (npr. mRNK koja kodira Serpinc1). Na primer, polinukleotid je komplementaran barem delu Serpinc1 mRNK ako je sekvenca suštinski komplementarna neprekinutom delu mRNK koja kodira Serpinc1.
[0350] Prema tome, u nekim slučajevima, antisens lanac polinukleotida obelodanjenih ovde je potpuno komplementaran ciljnoj Serpinc1 sekvenci. U drugim slučajevima, antisens lanac polinukleotida obelodanjenih ovde je suštinski komplementaran ciljnoj Serpinc1 sekvenci i sastoji se od uzastopne nukleotidne sekvence koja je najmanje oko 80% komplementarna duž cele svoje dužine ekvivalentnom regionu nukleotidne sekvence SEQ ID NO: 1, ili fragmentu SEQ ID NO: 1, kao što je oko 85%, oko 86%, oko 87%, oko 88%, oko 89%, oko 90%, oko 91%, oko 92%, oko 93%, oko 94%, oko 95%, oko 96%, oko 97%, oko 98%, ili oko 99% komplementarna.
[0351] U jednom slučaju, RNKi agens ove objave uključuje sens lanac koji je suštinski komplementaran antisens polinukleotidu koji je, zauzvrat, komplementaran ciljnoj Serpinc1 sekvenci, i pri čemu se sens lanac polinukleotida sastoji od uzastopne nukleotidne sekvence koja je najmanje oko 80% komplementarna duž cele svoje dužine ekvivalentnom regionu nukleotidne sekvence SEQ ID NO:5, ili fragmentu bilo koje od SEQ ID NO:5, kao što je oko 85%, oko 86%, oko 87%, oko 88%, oko 89%, oko 90%, oko 91%, oko 92%, oko 93%, oko 94%, oko 95%, oko 96%, oko 97%, oko 98%, ili oko 99% komplementarna.
[0352] U jednom slučaju ove objave, agens za upotrebu u metodama i kompozicijama ove objave je jednolančani antisens RNK molekul koji inhibira ciljnu mRNK putem mehanizma antisens inhibicije. Jednolančani antisens RNK molekul je komplementaran sekvenci unutar ciljne mRNK. Jednolančani antisens oligonukleotidi mogu inhibirati translaciju na stoihiometrijski način uparivanjem baza sa mRNK i fizičkim ometanjem mašinerije za translaciju, videti Dias, N. et al., (2002) Mol Cancer Ther 1:347-355. Jednolančani antisens RNK molekul može biti dužine od oko 15 do oko 30 nukleotida i imati sekvencu koja je komplementarna ciljnoj sekvenci. Na primer, jednolančani antisens RNK molekul može se sastojati od sekvence koja je najmanje oko 15, 16, 17, 18, 19, 20, ili više uzastopnih nukleotida iz bilo koje od antisens sekvenci opisanih ovde.
[0353] Termin „inhibiranje“, kako se ovde koristi, upotrebljava se naizmenično sa „smanjivanje“, „utišavanje“, „smanjenje regulacije“, „potiskivanje“ i drugim sličnim terminima, i uključuje bilo koji nivo inhibicije.
[0354] Fraza „inhibiranje ekspresije Serpinc1,“ kako se ovde koristi, uključuje inhibiciju ekspresije bilo kog Serpinc1 gena (kao što je npr. mišji Serpinc1 gen, pacovski Serpinc1 gen, majmunski Serpinc1 gen, ili humani Serpinc1 gen) kao i varijanti ili mutanata gena Serpinc1 koji kodiraju Serpinc1 protein.
[0355] „Inhibiranje ekspresije Serpinc1 gena“ uključuje bilo koji nivo inhibicije Serpinc1 gena, npr. barem delimičnu supresiju ekspresije Serpinc1 gena, kao što je inhibicija za najmanje oko 5%, najmanje oko 10%, najmanje oko 15%, najmanje oko 20%, najmanje oko 25%, najmanje oko 30%, najmanje oko 35%, najmanje oko 40%, najmanje oko 45%, najmanje oko 50%, najmanje oko 55%, najmanje oko 60%, najmanje oko 65%, najmanje oko 70%, najmanje oko 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 91%, najmanje oko 92%, najmanje oko 93%, najmanje oko 94%, najmanje oko 95%, najmanje oko 96%, najmanje oko 97%, najmanje oko 98%, ili najmanje oko 99%.
[0356] Ekspresija Serpinc1 gena može se proceniti na osnovu nivoa bilo koje varijable povezane sa ekspresijom Serpinc1 gena, npr. nivoa Serpinc1 mRNK, nivoa Serpinc1 proteina, ili, na primer, nivoa kompleksa trombin:antitrombin kao mere potencijala generisanja trombina, vremena krvarenja, protrombinskog vremena (PT), broja trombocita i/ili aktiviranog parcijalnog protrombinskog vremena (aPTT). Inhibicija se može proceniti smanjenjem apsolutnog ili relativnog nivoa jedne ili više ovih varijabli u poređenju sa kontrolnim nivoom. Kontrolni nivo može biti bilo koji tip kontrolnog nivoa koji se koristi u struci, npr. početni nivo pre doze, ili nivo određen iz sličnog subjekta, ćelije ili uzorka koji nije tretiran ili je tretiran kontrolom (kao što je npr. kontrola samo sa puferom ili kontrola neaktivnog agensa).
[0357] U jednom slučaju, barem delimična supresija ekspresije Serpinc1 gena, procenjuje se smanjenjem količine Serpinc1 mRNK koja se može izolovati iz ili detektovati u prvoj ćeliji ili grupi ćelija u kojoj se Serpinc1 gen transkribuje i koja je tretirana tako da je ekspresija Serpinc1 gena inhibirana, u poređenju sa drugom ćelijom ili grupom ćelija koja je suštinski identična prvoj ćeliji ili grupi ćelija, ali koja nije tako tretirana (kontrolne ćelije). Stepen inhibicije može se izraziti u smislu
[0358] Fraza „kontaktiranje ćelije sa RNKi agensom“, kao što je dsRNK, kako se ovde koristi, uključuje kontaktiranje ćelije bilo kojim mogućim sredstvom. Kontaktiranje ćelije sa RNKi agensom uključuje kontaktiranje ćelije in vitro sa iRNK ili kontaktiranje ćelije in vivo sa iRNK. Kontaktiranje se može izvršiti direktno ili indirektno. Na primer, RNKi agens može se dovesti u fizički kontakt sa ćelijom od strane pojedinca koji sprovodi metodu, ili alternativno, RNKi agens može se staviti u situaciju koja će mu omogućiti ili uzrokovati da naknadno dođe u kontakt sa ćelijom.
[0359] Kontaktiranje ćelije in vitro može se izvršiti, na primer, inkubiranjem ćelije sa RNKi agensom. Kontaktiranje ćelije in vivo može se izvršiti, na primer, injektiranjem RNKi agensa u tkivo gde se ćelija nalazi ili blizu njega, ili injektiranjem RNKi agensa u drugu oblast, npr. krvotok ili supkutani prostor, tako da će agens naknadno stići do tkiva gde se nalazi ćelija koja se kontaktira. Na primer, RNKi agens može sadržati i/ili biti vezan za ligand, npr. GalNAc3, koji usmerava RNKi agens na mesto od interesa, npr. jetru. Moguće su i kombinacije in vitro i in vivo metoda kontaktiranja. Na primer, ćelija se takođe može kontaktirati in vitro sa RNKi agensom i naknadno transplantirati u subjekta.
[0360] U jednom slučaju, kontaktiranje ćelije sa iRNK uključuje „uvođenje“ ili „isporučivanje iRNK u ćeliju“ omogućavanjem ili uzrokovanjem apsorpcije ili preuzimanja u ćeliju. Aporpcija ili preuzimanje iRNK može se javiti putem neusmerenih difuzivnih ili aktivnih ćelijskih procesa, ili putem pomoćnih agenasa ili uređaja. Uvođenje iRNK u ćeliju može biti in vitro i/ili in vivo. Na primer, za in vivo uvođenje, iRNK se može injektirati u mesto tkiva ili primeniti sistemski. In vivo isporučivanje se takođe može izvršiti putem beta-glukan sistema isporuke, kao što su oni opisani u američkim patentima br.5,032,401 i 5,607,677, i američkoj objavljenoj patentnoj prijavi br.2005/0281781. In vitro uvođenje u ćeliju uključuje metode poznate u struci kao što su elektroporacija i lipofekcija. Dalji pristupi su opisani u nastavku i/ili su poznati u struci.
II. Metode pronalaska
[0361] Ova objava pruža terapeutske i profilaktičke metode koje uključuju primenu na subjektu sa bolešću povezanom sa Serpinc1, npr. poremećajem krvarenja, npr. hemofilijom (npr. hemofilijom A, ili hemofilijom B), iRNK agensa ili farmaceutske kompozicije koja se sastoji od iRNK agensa iz ove objave. U nekim slučajevima ove objave, metode dalje uključuju primenu na subjektu dodatnog terapeutskog agensa.
[0362] U određenim slučajevima ove objave, na primer, kada dvolančani RNKi agens uključuje jedan ili više motiva od tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida, uključujući jedan takav motiv na mestu cepanja agensa ili blizu njega, šest fosforotioatnih veza i GalNAc ligand, takav agens se primenjuje u dozi od oko 0,200 do oko 1,825 mg/kg, 0,200 do oko 1,800 mg/kg, oko 0,200 do oko 1,700 mg/kg, oko 0,200 do oko 1,600 mg/kg, oko 0,200 do oko 1,500 mg/kg, oko 0,200 do oko 1,400 mg/kg, oko 0,200 do oko 1,400 mg/kg, oko 0,200 do oko 1,200 mg/kg, oko 0,200 do oko 1,100 mg/kg, oko 0,200 do oko 1,000 mg/kg, oko 0,200 do oko 0,900 mg/kg, oko 0,200 do oko 0,800 mg/kg, oko 0,200 do oko 0,700 mg/kg, oko 0,200 do oko 0,600 mg/kg, oko 0,200 do oko 0,500 mg/kg, oko 0,200 do oko 0,400 mg/kg, oko 0,225 do oko 1,825 mg/kg, oko 0,225 do oko 1,800 mg/kg, oko 0,225 do oko 1,700 mg/kg, oko 0,225 do oko 1,600 mg/kg, oko 0,225 do oko 1,500 mg/kg, oko 0,225 do oko 1,400 mg/kg, oko 0,225 do oko 1,400 mg/kg, oko 0,225 do oko 1,200 mg/kg, oko 0,225 do oko 1,100 mg/kg, oko 0,225 do oko 1,000 mg/kg, oko 0,225 do oko 0,900 mg/kg, oko 0,225 do oko 0,800 mg/kg, oko 0,225 do oko 0,700 mg/kg, oko 0,225 do oko 0,600 mg/kg, oko 0,225 do oko 0,500 mg/kg, oko 0,225 do oko 0,400 mg/kg, oko 0,250 do oko 1,825 mg/kg, oko 0,250 do oko 1,800 mg/kg, oko 0,250 do oko 1,700 mg/kg, od oko 0,250 do oko 1,600 mg/kg, od oko 0,250 do oko 1,500 mg/kg, od oko 0,250 do oko 1,400 mg/kg, od oko 0,250 do oko 1,400 mg/kg, od oko 0,250 do oko 1,200 mg/kg, od oko 0,250 do oko 1,100 mg/kg, od oko 0,250 do oko 1,000 mg/kg, od oko 0,250 do oko 0,900 mg/kg, od oko 0,250 do oko 0,800 mg/kg, od oko 0,250 do oko 0,700 mg/kg, od oko 0,250 do oko 0,600 mg/kg, od oko 0,250 do oko 0,500 mg/kg, od oko 0,250 do oko 0,400 mg/kg, od oko 0,425 do oko 1,825 mg/kg, od oko 0,425 do oko 1,800 mg/kg, od oko 0,425 do oko 1,700 mg/kg, od oko 0,425 do oko 1,600 mg/kg, od oko 0,425 do oko 1,500 mg/kg, od oko 0,425 do oko 1,400 mg/kg, od oko 0,425 do oko 1,400 mg/kg, od oko 0,425 do oko 1,200 mg/kg, od oko 0,425 do oko 1,100 mg/kg, od oko 0,425 do oko 1,000 mg/kg, od oko 0,425 do oko 0,900 mg/kg, od oko 0,425 do oko 0,800 mg/kg, od oko 0,425 do oko 0,700 mg/kg, od oko 0,425 do oko 0,600 mg/kg, od oko 0,425 do oko 0,500 mg/kg, od oko 0,450 do oko 1,825 mg/kg, od oko 0,450 do oko 1,800 mg/kg, od oko 0,450 do oko 1,700 mg/kg, od oko 0,450 do oko 1,600 mg/kg, od oko 0,450 do oko 1,500 mg/kg, od oko 0,450 do oko 1,400 mg/kg, od oko 0,450 do oko 1,400 mg/kg, od oko 0,450 do oko 1,200 mg/kg, od oko 0,450 do oko 1,100 mg/kg, od oko 0,450 do oko 1,000 mg/kg, od oko 0,450 do oko 0,900 mg/kg, od oko 0,450 do oko 0,800 mg/kg, od oko 0,450 do oko 0,700 mg/kg, od oko 0,450 do oko 0,600 mg/kg, od oko 0,450 do oko 0,500 mg/kg, od oko 0,475 do oko 1,825 mg/kg, od oko 0,475 do oko 1,800 mg/kg, od oko 0,475 do oko 1,700 mg/kg, od oko 0,475 do oko 1,600 mg/kg, od oko 0,475 do oko 1,500 mg/kg, od oko 0,475 do oko 1,400 mg/kg, od oko 0,475 do oko 1,400 mg/kg, od oko 0,475 do oko 1,200 mg/kg, od oko 0,475 do oko 1,100 mg/kg, od oko 0,475 do oko 1,000 mg/kg, od oko 0,475 do oko 0,900 mg/kg, od oko 0,475 do oko 0,800 mg/kg, od oko 0,475 do oko 0,700 mg/kg, od oko 0,475 do oko 0,600 mg/kg, od oko 0,475 do oko 0,500 mg/kg, od oko 0,875 do oko 1,825 mg/kg, od oko 0,875 do oko 1,800 mg/kg, od oko 0,875 do oko 1,700 mg/kg, od oko 0,875 do oko 1,600 mg/kg, od oko 0,875 do oko 1,500 mg/kg, od oko 0,875 do oko 1,400 mg/kg, od oko 0,875 do oko 1,400 mg/kg, od oko 0,875 do oko 1,200 mg/kg, od oko 0,875 do oko 1,100 mg/kg, od oko 0,875 do oko 1,000 mg/kg, od oko 0,875 do oko 0,900 mg/kg, od oko 0,900 do oko 1,825 mg/kg, od oko 0,900 do oko 1,800 mg/kg, od oko 0,900 do oko 1,700 mg/kg, od oko 0,900 do oko 1,600 mg/kg, od oko 0,900 do oko 1,500 mg/kg, od oko 0,900 do oko 1,400 mg/kg, od oko 0,900 do oko 1,400 mg/kg, od oko 0,900 do oko 1,200 mg/kg, od oko 0,900 do oko 1,100 mg/kg, od oko 0,900 do oko 1,000 mg/kg, od oko 0,925 do oko 1,825 mg/kg, od oko 0,925 do oko 1,800 mg/kg, od oko 0,925 do oko 1,700 mg/kg, od oko 0,925 do oko 1,600 mg/kg, od oko 0,925 do oko 1,500 mg/kg, od oko 0,925 do oko 1,400 mg/kg, od oko 0,925 do oko 1,400 mg/kg, od oko 0,925 do oko 1,200 mg/kg, od oko 0,925 do oko 1,100 mg/kg, ili od oko 0,925 do oko 1,000 mg/kg. Vrednosti i rasponi između prethodno navedenih vrednosti takođe se smatraju delom ove objave, npr. RNKi agens se može primeniti na subjektu u dozi od oko 0,015 mg/kg do oko 0,45 mg/mg.
[0363] Na primer, RNKi agens, npr. RNKi agens u farmaceutskoj kompoziciji, može se primeniti u dozi od oko 0,2 mg/kg, 0,225 mg/kg, 0,25 mg/kg, 0,275 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0,325 mg/kg, 0,35 mg/kg, 0,375 mg/kg, 0,4 mg/kg, 0,425 mg/kg, 0,45 mg/kg, 0,475 mg/kg, oko 0,5 mg/kg, 0,525 mg/kg, 0,55 mg/kg, 0,575 mg/kg, oko 0,6 mg/kg, 0,625 mg/kg, 0,65 mg/kg, 0,675 mg/kg, oko 0,7 mg/kg, 0,725 mg/kg, 0,75 mg/kg, 0,775 mg/kg, oko 0,8 mg/kg, 0,925 mg/kg, 0,95 mg/kg, 0,975 mg/kg, oko 1,0 mg/kg, 1,025 mg/kg, 1,05 mg/kg, 1,075 mg/kg, oko 1,1 mg/kg, 1,125 mg/kg, 1,15 mg/kg, 1,175 mg/kg, oko 1,2 mg/kg, 1,225 mg/kg, 1,25 mg/kg, 1,275 mg/kg, oko 1,3 mg/kg, 1,325 mg/kg, 1,35 mg/kg, 1,375 mg/kg, oko 1,4 mg/kg, 1,425 mg/kg, 1,45 mg/kg, 1,475 mg/kg, oko 1,5 mg/kg, 1,525 mg/kg, 1,55 mg/kg, 1,575 mg/kg, oko 1,6 mg/kg, 1,625 mg/kg, 1,65 mg/kg, 1,675 mg/kg, oko 1,7 mg/kg, 1,725 mg/kg, 1,75 mg/kg, 1,775 mg/kg, ili oko 1,8 mg/kg. Vrednosti između prethodno navedenih vrednosti takođe se smatraju delom ove objave.
[0364] Shodno tome, u jednom slučaju, objava pruža metode za sprečavanje najmanje jednog simptoma kod subjekta koji ima poremećaj kod koga bi bila korisna redukcija ekspresije Serpinc1, npr. poremećaj krvarenja, npr. hemofiliju. Metode uključuju primenu na subjektu profilaktički efikasne doze, npr. doze od oko 0,200 mg/kg do oko 1,825 mg/kg, iRNK agensa, npr. dsRNK, iz ove objave, (npr. farmaceutske kompozicije koja se sastoji od dsRNK iz ove objave), čime se sprečava najmanje jedan simptom kod subjekta koji ima poremećaj kod koga bi bila korisna redukcija ekspresije Serpinc1.
[0365] U drugom slučaju, ova objava pruža metode za lečenje subjekta koji ima poremećaj kod koga bi bila korisna redukcija ekspresije Serpinc1, npr. poremećaj krvarenja, npr. hemofiliju, koje uključuju primenu na subjektu, npr. čoveku, terapeutski efikasne doze, npr. doze od oko 0,200 mg/kg do oko 1,800 mg/kg, iRNK agensa koji cilja Serpinc1 gen ili farmaceutske kompozicije koja sadrži iRNK agens koji cilja Serpinc1 gen, čime se leči subjekt koji ima poremećaj kod koga bi bila korisna redukcija ekspresije Serpinc1.
[0366] U drugom slučaju, objava pruža upotrebe profilaktički efikasne doze, npr. doze od oko 0,200 mg/kg do oko 1,825 mg/kg, iRNK, npr. dsRNK, iz ove objave za sprečavanje najmanje jednog simptoma kod subjekta koji pati od poremećaja kod koga bi bila korisna redukcija i/ili inhibicija ekspresije Serpinc1, kao što je poremećaj krvarenja, npr. hemofilija.
[0367] U daljem slučaju, ova objava pruža upotrebe profilaktički efikasne doze, npr. doze od oko 0,200 mg/kg do oko 1,825 mg/kg iRNK agensa iz ove objave u proizvodnji medikamenta za sprečavanje najmanje jednog simptoma kod subjekta koji pati od poremećaja kod koga bi bila korisna redukcija i/ili inhibicija ekspresije Serpinc1, kao što je poremećaj krvarenja, npr. hemofilija.
[0368] U drugom slučaju, ova objava pruža upotrebe terapeutski efikasne doze, npr. doze od oko 0,200 mg/kg do oko 1,825 mg/kg, iRNK agensa iz ove objave za lečenje subjekta, npr. subjekta koji bi imao koristi od redukcije i/ili inhibicije ekspresije Serpinc1.
[0369] U još jednom slučaju, ova objava pruža upotrebu iRNK agensa, npr. dsRNK, iz ove objave koji cilja Serpinc1 gen ili farmaceutske kompozicije koja sadrži terapeutski efikasnu dozu, npr. dozu od oko 0,200 mg/kg do oko 1,825 mg/kg, iRNK agensa koji cilja Serpinc1 gen, u proizvodnji medikamenta za lečenje subjekta, npr. subjekta koji bi imao koristi od redukcije i/ili inhibicije ekspresije Serpinc1, kao što je subjekat sa poremećajem krvarenja, npr. hemofilijom.
[0370] U nekim slučajevima ove objave, na primer, kada dvolančani RNKi agens sadrži sens lanac i antisens lanac, pri čemu antisens lanac sadrži region komplementarnosti koji se sastoji od najmanje 15 uzastopnih nukleotida koji se ne razlikuju za više od 3 nukleotida od nukleotidne sekvence 5' - UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG - 3' (SEQ ID NO: 15), pri čemu su suštinski svi nukleotidi sens lanca i suštinski svi nukleotidi antisens lanca modifikovani nukleotidi, i pri čemu je sens lanac konjugovan sa ligandom pričvršćenim na 3'-kraju, takav agens se primenjuje u dozi od oko 0,200 do oko 1,825 mg/kg, npr. u dozi od oko 0,200 mg/kg do oko 0,250 mg/kg; ili u dozi od oko 0,425 mg/kg do oko 0,475 mg/kg; ili u dozi od oko 0,875 mg/kg do oko 0,925 mg/kg; ili u dozi od oko 1,775 mg/kg do oko 1,825 mg/kg.
[0371] Shodno tome, u jednom slučaju, objava pruža metode za sprečavanje najmanje jednog simptoma kod subjekta koji ima poremećaj kod koga bi bila korisna redukcija ekspresije Serpinc1, npr. poremećaj krvarenja, npr. hemofiliju. Metode uključuju primenu na subjektu profilaktički efikasne doze, npr. doze od oko 0,200 mg/kg do oko 1,825 mg/kg, dvolančanog agensa ribonukleinske kiseline (RNKi), koji se sastoji od sens lanca i antisens lanca, pri čemu antisens lanac sadrži region komplementarnosti koji se sastoji od najmanje 15 uzastopnih nukleotida koji se ne razlikuju za više od 3 nukleotida od nukleotidne sekvence 5' -UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG - 3' (SEQ ID NO: 15). Suštinski svi nukleotidi sens lanca i suštinski svi nukleotidi antisens lanca su modifikovani nukleotidi, a sens lanac je konjugovan sa ligandom pričvršćenim na 3'-kraju (npr. farmaceutske kompozicije koja sadrži RNKi agens), čime se sprečava najmanje jedan simptom kod subjekta koji ima poremećaj kod koga bi bila korisna redukcija ekspresije Serpinc1.
[0372] U drugom slučaju, ova objava pruža metode za lečenje subjekta koji ima poremećaj kod koga bi bila korisna redukcija ekspresije Serpinc1, npr. poremećaj krvarenja, npr. hemofiliju, koje uključuju primenu na subjektu, npr. čoveku, terapeutski efikasne doze, npr. doze od oko 0,200 mg/kg do oko 1,825 mg/kg, dvolančanog agensa ribonukleinske kiseline (RNKi), koji se sastoji od sens lanca i antisens lanca, pri čemu antisens lanac sadrži region komplementarnosti koji se sastoji od najmanje 15 uzastopnih nukleotida koji se ne razlikuju za više od 3 nukleotida od nukleotidne sekvence 5' - UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG - 3' (SEQ ID NO: 15), pri čemu su suštinski svi nukleotidi sens lanca i suštinski svi nukleotidi antisens lanca modifikovani nukleotidi, i pri čemu je sens lanac konjugovan sa ligandom pričvršćenim na 3'-kraju ili farmaceutske kompozicije koja sadrži iRNK agens koji cilja Serpinc1 gen, čime se leči subjekt koji ima poremećaj kod koga bi bila korisna redukcija ekspresije Serpinc1.
[0373] U drugom slučaju, objava pruža upotrebe profilaktički efikasne doze, npr. doze od oko 0,200 mg/kg do oko 1,825 mg/kg, dvolančanog agensa ribonukleinske kiseline (RNKi), koji se sastoji od sens lanca i antisens lanca, pri čemu antisens lanac sadrži region komplementarnosti koji se sastoji od najmanje 15 uzastopnih nukleotida koji se ne razlikuju za više od 3 nukleotida od nukleotidne sekvence 5' - UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG - 3' (SEQ ID NO: 15), pri čemu su suštinski svi nukleotidi sens lanca i suštinski svi nukleotidi antisens lanca modifikovani nukleotidi, i pri čemu je sens lanac konjugovan sa ligandom pričvršćenim na 3'-kraju za sprečavanje najmanje jednog simptoma kod subjekta koji pati od poremećaja kod koga bi bila korisna redukcija i/ili inhibicija ekspresije Serpinc1, kao što je poremećaj krvarenja, npr. hemofilija.
[0374] U daljem slučaju, ova objava pruža upotrebe profilaktički efikasne doze, npr. doze od oko 0,200 mg/kg do oko 1,825 mg/kg dvolančanog agensa ribonukleinske kiseline (RNKi), koji se sastoji od sens lanca i antisens lanca, pri čemu antisens lanac sadrži region komplementarnosti koji se sastoji od najmanje 15 uzastopnih nukleotida koji se ne razlikuju za više od 3 nukleotida od nukleotidne sekvence 5' - UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG -3' (SEQ ID NO: 15), pri čemu su suštinski svi nukleotidi sens lanca i suštinski svi nukleotidi antisens lanca modifikovani nukleotidi, i pri čemu je sens lanac konjugovan sa ligandom pričvršćenim na 3'-kraju u proizvodnji medikamenta za sprečavanje najmanje jednog simptoma kod subjekta koji pati od poremećaja kod koga bi bila korisna redukcija i/ili inhibicija ekspresije Serpinc1, kao što je poremećaj krvarenja, npr. hemofilija.
[0375] U drugom slučaju, ova objava pruža upotrebe terapeutski efikasne doze, npr. doze od oko 0,200 mg/kg do oko 1,825 mg/kg, dvolančanog agensa ribonukleinske kiseline (RNKi), koji se sastoji od sens lanca i antisens lanca, pri čemu antisens lanac sadrži region komplementarnosti koji se sastoji od najmanje 15 uzastopnih nukleotida koji se ne razlikuju za više od 3 nukleotida od nukleotidne sekvence 5' - UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG -3' (SEQ ID NO: 15), pri čemu su suštinski svi nukleotidi sens lanca i suštinski svi nukleotidi antisens lanca modifikovani nukleotidi, i pri čemu je sens lanac konjugovan sa ligandom pričvršćenim na 3'-kraju za lečenje subjekta, npr. subjekta koji bi imao koristi od redukcije i/ili inhibicije ekspresije Serpinc1.
[0376] U još jednom slučaju, ova objava pruža upotrebu iRNK agensa, npr. dsRNK, iz ove objave koji cilja Serpinc1 gen ili farmaceutske kompozicije koja sadrži terapeutski efikasnu dozu, npr. doze od oko 0,200 mg/kg do oko 1,825 mg/kg, dvolančanog agensa ribonukleinske kiseline (RNKi), koji se sastoji od sens lanca i antisens lanca, pri čemu antisens lanac sadrži region komplementarnosti koji se sastoji od najmanje 15 uzastopnih nukleotida koji se ne razlikuju za više od 3 nukleotida od nukleotidne sekvence 5' -UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG - 3' (SEQ ID NO: 15), pri čemu su suštinski svi nukleotidi sens lanca i suštinski svi nukleotidi antisens lanca modifikovani nukleotidi, i pri čemu je sens lanac konjugovan sa ligandom pričvršćenim na 3'-kraju u proizvodnji medikamenta za lečenje subjekta, npr. subjekta koji bi imao koristi od redukcije i/ili inhibicije ekspresije Serpinc1, kao što je subjekt sa poremećajem krvarenja, npr. hemofilijom.
[0377] RNKi agens pronalaska primenjuje se subjektu kao fiksna doza. „Fiksna doza“ (npr. doza u mg) znači da se jedna doza iRNK agensa koristi za sve subjekte bez obzira na bilo kakve specifične faktore vezane za subjekta, kao što je težina. Fiksna doza iRNK agensa može biti zasnovana na unapred određenoj težini ili starosti.
[0378] U nekim slučajevima, RNKi agens se primenjuje kao fiksna doza od oko 25 mg do oko 100 mg, npr. između oko 25 mg do oko 95 mg, između oko 25 mg do oko 90 mg, između oko 25 mg do oko 85 mg, između oko 25 mg do oko 80 mg, između oko 25 mg do oko 75 mg, između oko 25 mg do oko 70 mg, između oko 25 mg do oko 65 mg, između oko 25 mg do oko 60 mg, između oko 25 mg do oko 50 mg, između oko 50 mg do oko 100 mg, između oko 50 mg do oko 95 mg, između oko 50 mg do oko 90 mg, između oko 50 mg do oko 85 mg, između oko 50 mg do oko 80 mg, između oko 30 mg do oko 100 mg, između oko 30 mg do oko 90 mg, između oko 30 mg do oko 80 mg, između oko 40 mg do oko 100 mg, između oko 40 mg do oko 90 mg, između oko 40 mg do oko 80 mg, između oko 60 mg do oko 100 mg, između oko 60 mg do oko 90 mg, između oko 25 mg do oko 55 mg, između oko 25 mg do oko 65 mg, između oko 30 mg do oko 95 mg, između oko 30 mg do oko 85 mg, između oko 30 mg do oko 75 mg, između oko 30 mg do oko 65 mg, između oko 30 mg do oko 55 mg, između oko 40 mg do oko 95 mg, između oko 40 mg do oko 85 mg, između oko 40 mg do oko 75 mg, između oko 40 mg do oko 65 mg, između oko 40 mg do oko 55 mg, ili između oko 45 mg do oko 95 mg.
[0379] U nekim slučajevima, RNKi agens se primenjuje kao fiksna doza od oko 25 mg, oko 30 mg, oko 35 mg, oko 40 mg, oko 45 mg, oko 50 mg, oko 55 mg, oko 60 mg, oko 65 mg, oko 70 mg, oko 75 mg, oko 80 mg, oko 85 mg, oko 90 mg, oko 95 mg, ili oko 100 mg.
[0380] Shodno tome, u jednom slučaju, objava pruža metode za sprečavanje najmanje jednog simptoma kod subjekta koji ima poremećaj kod koga bi bila korisna redukcija ekspresije Serpinc1, npr. poremećaj krvarenja, npr. hemofiliju. Metode uključuju primenu na subjektu profilaktički efikasne doze, npr. fiksne doze od oko 25 mg do oko 100 mg, iRNK agensa, npr. dsRNK, iz ove objave (npr. farmaceutske kompozicije koja se sastoji od dsRNK iz ove objave), čime se sprečava najmanje jedan simptom kod subjekta koji ima poremećaj kod koga bi bila korisna redukcija ekspresije Serpinc1. U jednom slučaju, metode uključuju primenu na subjektu profilaktički efikasne doze, npr. fiksne doze od oko 50 mg, iRNK agensa, npr. dsRNK, iz ove objave (npr. farmaceutske kompozicije koja se sastoji od dsRNK iz ove objave), čime se sprečava najmanje jedan simptom kod subjekta koji ima poremećaj kod koga bi bila korisna redukcija ekspresije Serpinc1. U drugom slučaju, metode uključuju primenu na subjektu profilaktički efikasne doze, npr. fiksne doze od oko 80 mg, iRNK agensa, npr. dsRNK, iz ove objave (npr. farmaceutske kompozicije koja se sastoji od dsRNK iz ove objave), čime se sprečava najmanje jedan simptom kod subjekta koji ima poremećaj kod koga bi bila korisna redukcija ekspresije Serpinc1.
[0381] U drugom slučaju, ova objava pruža metode za lečenje subjekta koji ima poremećaj kod koga bi bila korisna redukcija ekspresije Serpinc1, npr. poremećaj krvarenja, npr. hemofiliju, koje uključuju primenu na subjektu, npr. čoveku, terapeutski efikasne doze, npr. fiksne doze od oko 25 mg do oko 100 mg, iRNK agensa koji cilja Serpinc1 gen ili farmaceutske kompozicije koja se sastoji od iRNK agensa koji cilja Serpinc1 gen, čime se leči subjekat koji ima poremećaj kod koga bi bila korisna redukcija ekspresije Serpinc1. U jednom slučaju, metode uključuju primenu na subjektu terapeutski efikasne doze, npr. fiksne doze od oko 50 mg, iRNK agensa, npr. dsRNK, iz ove objave (npr. farmaceutske kompozicije koja se sastoji od dsRNK iz ove objave), čime se leči subjekat koji ima poremećaj kod koga bi bila korisna redukcija ekspresije Serpinc1. U drugom slučaju, metode uključuju primenu na subjektu terapeutski efikasne doze, npr. fiksne doze od oko 80 mg, iRNK agensa, npr. dsRNK, iz ove objave (npr. farmaceutske kompozicije koja se sastoji od dsRNK iz ove objave), čime se leči subjekat koji ima poremećaj kod koga bi bila korisna redukcija ekspresije Serpinc1.
[0382] Objava takođe pruža upotrebe profilaktički efikasne doze, npr. fiksne doze od oko 25 mg do oko 100 mg, iRNK, npr. dsRNK, iz ove objave, za sprečavanje najmanje jednog simptoma kod subjekta koji pati od poremećaja kod koga bi bila korisna redukcija i/ili inhibicija ekspresije Serpinc1, kao što je poremećaj krvarenja, npr. hemofilija. U jednom slučaju, objava pruža upotrebe profilaktički efikasne doze, npr. fiksne doze od oko 50 mg, iRNK, npr. dsRNK, iz ove objave, za sprečavanje najmanje jednog simptoma kod subjekta koji pati od poremećaja kod koga bi bila korisna redukcija i/ili inhibicija ekspresije Serpinc1, kao što je poremećaj krvarenja, npr. hemofilija. U drugom slučaju, objava pruža upotrebe profilaktički efikasne doze, npr. fiksne doze od oko 80 mg, iRNK, npr. dsRNK, iz ove objave, za sprečavanje najmanje jednog simptoma kod subjekta koji pati od poremećaja kod koga bi bila korisna redukcija i/ili inhibicija ekspresije Serpinc1, kao što je poremećaj krvarenja, npr. hemofilija.
[0383] Predmetni pronalazak takođe pruža upotrebe profilaktički efikasne doze, npr. fiksne doze od oko 25 mg do oko 100 mg iRNK agensa iz ovog pronalaska u proizvodnji medikamenta za sprečavanje najmanje jednog simptoma kod subjekta koji pati od poremećaja kod koga bi bila korisna redukcija i/ili inhibicija ekspresije Serpinc1, kao što je poremećaj krvarenja, npr. hemofilija. U jednom slučaju, predmetni pronalazak pruža upotrebe profilaktički efikasne doze, npr. fiksne doze od oko 50 mg iRNK agensa iz ove objave u proizvodnji medikamenta za sprečavanje najmanje jednog simptoma kod subjekta koji pati od poremećaja kod koga bi bila korisna redukcija i/ili inhibicija ekspresije Serpinc1, kao što je poremećaj krvarenja, npr. hemofilija. U drugom slučaju, objava pruža upotrebe profilaktički efikasne doze, npr. fiksne doze od oko 80 mg iRNK agensa iz ove objave u proizvodnji medikamenta za sprečavanje najmanje jednog simptoma kod subjekta koji pati od poremećaja kod koga bi bila korisna redukcija i/ili inhibicija ekspresije Serpinc1, kao što je poremećaj krvarenja, npr. hemofilija.
[0384] U drugom slučaju, objava pruža upotrebe terapeutski efikasne doze, npr. fiksne doze od oko 25 mg do oko 100 mg, iRNK agensa iz ove objave za lečenje subjekta, npr. subjekta koji bi imao koristi od redukcije i/ili inhibicije ekspresije Serpinc1. U drugom slučaju, ova objava pruža upotrebe terapeutski efikasne doze, npr. fiksne doze od oko 50 mg, iRNK agensa iz ove objave za lečenje subjekta, npr. subjekta koji bi imao koristi od redukcije i/ili inhibicije ekspresije Serpinc1. U drugom slučaju, ova objava pruža upotrebe terapeutski efikasne doze, npr. fiksne doze od oko 80 mg, iRNK agensa iz ove objave za lečenje subjekta, npr. subjekta koji bi imao koristi od redukcije i/ili inhibicije ekspresije Serpinc1.
[0385] U još jednom slučaju, ova objava pruža upotrebu iRNK agensa, npr. dsRNK, iz ove objave koji cilja Serpinc1 gen ili farmaceutske kompozicije koja sadrži terapeutski efikasnu dozu, npr. fiksnu dozu od oko 25 mg do oko 100 mg, iRNK agensa koji cilja Serpinc1 gen, u proizvodnji medikamenta za lečenje subjekta, npr. subjekta koji bi imao koristi od redukcije i/ili inhibicije ekspresije Serpinc1, kao što je subjekat sa poremećajem krvarenja, npr. hemofilijom. U jednom slučaju, ova objava pruža upotrebu iRNK agensa, npr. dsRNK, iz ove objave koji cilja Serpinc1 gen ili farmaceutske kompozicije koja sadrži terapeutski efikasnu dozu, npr. fiksne doze od oko 50 mg, iRNK agensa koji cilja Serpinc1 gen, u proizvodnji medikamenta za lečenje subjekta, npr. subjekta koji bi imao koristi od redukcije i/ili inhibicije ekspresije Serpinc1, kao što je subjekat sa poremećajem krvarenja, npr. hemofilijom. U drugom slučaju, ova objava pruža upotrebu iRNK agensa, npr. dsRNK, iz ove objave koji cilja Serpinc1 gen ili farmaceutske kompozicije koja sadrži terapeutski efikasnu dozu, npr. fiksne doze od oko 80 mg, iRNK agensa koji cilja Serpinc1 gen, u proizvodnji medikamenta za lečenje subjekta, npr. subjekta koji bi imao koristi od redukcije i/ili inhibicije ekspresije Serpinc1, kao što je subjekat sa poremećajem krvarenja, npr. hemofilijom.
[0386] U nekim slučajevima ove objave, na primer, kada dvolančani RNKi agens sadrži sens lanac i antisens lanac, pri čemu antisens lanac sadrži region komplementarnosti koji se sastoji od najmanje 15 uzastopnih nukleotida koji se ne razlikuju za više od 3 nukleotida od nukleotidne sekvence 5' - UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG - 3' (SEQ ID NO: 15), pri čemu su suštinski svi nukleotidi sens lanca i suštinski svi nukleotidi antisens lanca modifikovani nukleotidi, i pri čemu je sens lanac konjugovan sa ligandom pričvršćenim na 3'-kraju, takav agens se primenjuje u fiksnoj dozi od oko 25 mg do oko 100 mg, npr. kao fiksna doza od oko 25 mg; ili kao fiksna doza od oko 50 mg; ili kao fiksna doza od oko 80 mg; ili kao fiksna doza od oko 100 mg. U jednom slučaju, fiksna doza je 50 mg. U drugom otelotvorenju, fiksna doza je 80 mg.
[0387] Shodno tome, u jednom slučaju, objava pruža metode za sprečavanje najmanje jednog simptoma kod subjekta koji ima poremećaj kod koga bi bila korisna redukcija ekspresije Serpinc1, npr. poremećaj krvarenja, npr. hemofiliju. Metode uključuju primenu na subjektu profilaktički efikasne doze, npr. fiksne doze od oko 25 mg do oko 100 mg, dvolančanog agensa ribonukleinske kiseline (RNKi), koji se sastoji od sens lanca i antisens lanca, pri čemu antisens lanac sadrži region komplementarnosti koji se sastoji od najmanje 15 uzastopnih nukleotida koji se ne razlikuju za više od 3 nukleotida od nukleotidne sekvence 5' -UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG - 3' (SEQ ID NO: 15), pri čemu su suštinski svi nukleotidi sens lanca i suštinski svi nukleotidi antisens lanca modifikovani nukleotidi, i pri čemu je sens lanac konjugovan sa ligandom pričvršćenim na 3'-kraju (npr. farmaceutske kompozicije koja se sastoji od RNKi agensa), čime se sprečava najmanje jedan simptom kod subjekta koji ima poremećaj kod koga bi bila korisna redukcija ekspresije Serpinc1. U jednom slučaju, fiksna doza je 50 mg. U drugom otelotvorenju, fiksna doza je 80 mg.
[0388] U drugom slučaju, ova objava pruža metode za lečenje subjekta koji ima poremećaj kod koga bi bila korisna redukcija ekspresije Serpinc1, npr. poremećaj krvarenja, npr. hemofiliju, koje uključuju primenu na subjektu, npr. čoveku, terapeutski efikasne doze, npr. fiksne doze od oko 25 mg do oko 100 mg, dvolančanog agensa ribonukleinske kiseline (RNKi), koji se sastoji od sens lanca i antisens lanca, pri čemu antisens lanac sadrži region komplementarnosti koji se sastoji od najmanje 15 uzastopnih nukleotida koji se ne razlikuju za više od 3 nukleotida od nukleotidne sekvence 5' - UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG - 3' (SEQ ID NO: 15), pri čemu su suštinski svi nukleotidi sens lanca i suštinski svi nukleotidi antisens lanca modifikovani nukleotidi, i pri čemu je sens lanac konjugovan sa ligandom pričvršćenim na 3'-kraju ili farmaceutske kompozicije koja sadrži iRNK agens koji cilja Serpinc1 gen, čime se leči subjekat koji ima poremećaj kod koga bi bila korisna redukcija ekspresije Serpinc1. U jednom slučaju, fiksna doza je 50 mg. U drugom otelotvorenju, fiksna doza je 80 mg.
[0389] U drugom slučaju, objava pruža upotrebe profilaktički efikasne doze, npr. fiksne doze od oko 25 mg do oko 100 mg, dvolančanog agensa ribonukleinske kiseline (RNKi), koji se sastoji od sens lanca i antisens lanca, pri čemu antisens lanac sadrži region komplementarnosti koji se sastoji od najmanje 15 uzastopnih nukleotida koji se ne razlikuju za više od 3 nukleotida od nukleotidne sekvence 5' - UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG - 3' (SEQ ID NO: 15), pri čemu su suštinski svi nukleotidi sens lanca i suštinski svi nukleotidi antisens lanca modifikovani nukleotidi, i pri čemu je sens lanac konjugovan sa ligandom pričvršćenim na 3'-kraju za sprečavanje najmanje jednog simptoma kod subjekta koji pati od poremećaja kod koga bi bila korisna redukcija i/ili inhibicija ekspresije Serpinc1, kao što je poremećaj krvarenja, npr. hemofilija. U jednom slučaju, fiksna doza je 50 mg. U drugom otelotvorenju, fiksna doza je 80 mg.
[0390] U daljem slučaju, ova objava pruža upotrebe profilaktički efikasne doze, npr. fiksne doze od oko 25 mg do oko 100 mg, dvolančanog agensa ribonukleinske kiseline (RNKi), koji se sastoji od sens lanca i antisens lanca, pri čemu antisens lanac sadrži region komplementarnosti koji se sastoji od najmanje 15 uzastopnih nukleotida koji se ne razlikuju za više od 3 nukleotida od nukleotidne sekvence 5' - UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG -3' (SEQ ID NO: 15), pri čemu su suštinski svi nukleotidi sens lanca i suštinski svi nukleotidi antisens lanca modifikovani nukleotidi, i pri čemu je sens lanac konjugovan sa ligandom pričvršćenim na 3'-kraju, u proizvodnji medikamenta za sprečavanje najmanje jednog simptoma kod subjekta koji pati od poremećaja kod koga bi bila korisna redukcija i/ili inhibicija ekspresije Serpinc1, kao što je poremećaj krvarenja, npr. hemofilija. U jednom slučaju, fiksna doza je 50 mg. U drugom otelotvorenju, fiksna doza je 80 mg.
[0391] U drugom slučaju, ova objava pruža upotrebe terapeutski efikasne doze, npr. fiksne doze od oko 25 mg do oko 100 mg, dvolančanog agensa ribonukleinske kiseline (RNKi), koji se sastoji od sens lanca i antisens lanca, pri čemu antisens lanac sadrži region komplementarnosti koji se sastoji od najmanje 15 uzastopnih nukleotida koji se ne razlikuju za više od 3 nukleotida od nukleotidne sekvence 5' - UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG -3' (SEQ ID NO: 15), pri čemu su suštinski svi nukleotidi sens lanca i suštinski svi nukleotidi antisens lanca modifikovani nukleotidi, i pri čemu je sens lanac konjugovan sa ligandom pričvršćenim na 3'-kraju, za lečenje subjekta, npr. subjekta koji bi imao koristi od redukcije i/ili inhibicije ekspresije Serpinc1. U jednom slučaju, fiksna doza je 50 mg. U drugom otelotvorenju, fiksna doza je 80 mg.
[0392] U još jednom slučaju, ova objava pruža upotrebu iRNK agensa, npr. dsRNK, iz ove objave koji cilja Serpinc1 gen ili farmaceutske kompozicije koja sadrži terapeutski efikasnu dozu, npr. fiksne doze od oko 25 mg do oko 100 mg, dvolančanog agensa ribonukleinske kiseline (RNKi), koji se sastoji od sens lanca i antisens lanca, pri čemu antisens lanac sadrži region komplementarnosti koji se sastoji od najmanje 15 uzastopnih nukleotida koji se ne razlikuju za više od 3 nukleotida od nukleotidne sekvence 5' -UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG - 3' (SEQ ID NO: 15), pri čemu su suštinski svi nukleotidi sens lanca i suštinski svi nukleotidi antisens lanca modifikovani nukleotidi, i pri čemu je sens lanac konjugovan sa ligandom pričvršćenim na 3'-kraju, u proizvodnji medikamenta za lečenje subjekta, npr. subjekta koji bi imao koristi od redukcije i/ili inhibicije ekspresije Serpinc1, kao što je subjekt sa poremećajem krvarenja, npr. hemofilijom. U jednom slučaju, fiksna doza je 50 mg. U drugom otelotvorenju, fiksna doza je 80 mg.
[0393] Metode i upotrebe iz ove objave uključuju primenu kompozicije opisane ovde, tako da se ekspresija ciljanog Serpinc1 gena smanjuje, npr. na oko 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, ili oko 80 dana. U jednom slučaju, ekspresija ciljanog Serpinc1 gena smanjuje se tokom produženog trajanja, npr. najmanje oko sedam dana ili više, npr. oko jedne nedelje, dve nedelje, tri nedelje, oko četiri nedelje, oko 5 nedelja, oko 6 nedelja, oko 2 meseca, oko jednog kvartala, ili duže.
[0394] Smanjenje ekspresije gena može se proceniti bilo kojom metodom poznatom u struci. Na primer, smanjenje u ekspresiji Serpinc1 može se odrediti određivanjem nivoa ekspresije Serpinc1 mRNK korišćenjem metoda rutinskih za stručnjaka u ovoj oblasti, npr. Northern blotting, qRT-PCR, određivanjem nivoa Serpinc1 proteina korišćenjem metoda rutinskih za stručnjaka u ovoj oblasti, kao što je Western blotting, imunološke tehnike, i/ili određivanjem biološke aktivnosti Serpinc1, kao što je uticanje na jedan ili više molekula povezanih sa ćelijskim mehanizmom zgrušavanja krvi (ili u in vivo okruženju, samo zgrušavanje krvi). U jednom slučaju, vreme generisanja trombina, vreme formiranja ugruška i/ili vreme zgrušavanja se određuju radi procene ekspresije Serpinc1 korišćenjem, npr. ROTEM<®>analizu tromboelastometrije pune krvi.
[0395] Primena dsRNK prema metodama i upotrebama ove objave može rezultirati smanjenjem ozbiljnosti, znakova, simptoma i/ili markera takvih bolesti ili poremećaja kod pacijenta sa bolešću povezanom sa Serpinc1. Pod „smanjenjem“ u ovom kontekstu podrazumeva se statistički značajan pad takvog nivoa. Smanjenje može biti, na primer, najmanje oko 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ili oko 100%.
[0396] Efikasnost lečenja ili prevencije bolesti može se proceniti, na primer, merenjem progresije bolesti, remisije bolesti, ozbiljnosti simptoma, učestalosti krvarenja, smanjenja bola, kvaliteta života, doze leka potrebne za održavanje terapijskog efekta, nivoa markera bolesti ili bilo kog drugog merljivog parametra prikladnog za datu bolest koja se leči ili za koju se cilja prevencija. U potpunosti je u mogućnosti stručnjaka u ovoj oblasti da prati efikasnost lečenja ili prevencije merenjem bilo kog od takvih parametara, ili bilo koje kombinacije parametara. Na primer, efikasnost lečenja poremećaja krvarenja može se proceniti, na primer, periodičnim praćenjem nivoa trombin:anti-trombin. Poređenja kasnijih očitavanja sa početnim očitavanjima pružaju lekaru indikaciju da li je lečenje efikasno. U potpunosti je u mogućnosti stručnjaka u ovoj oblasti da prati efikasnost lečenja ili prevencije merenjem bilo kog od takvih parametara, ili bilo koje kombinacije parametara. U vezi sa primenom iRNK koja cilja Serpinc1 ili farmaceutske kompozicije, „efikasno protiv“ poremećaja krvarenja ukazuje da primena na klinički odgovarajući način rezultira korisnim efektom za najmanje statistički značajnu frakciju pacijenata, kao što je poboljšanje simptoma, izlečenje, smanjenje bolesti, produženje života, poboljšanje kvaliteta života ili drugi efekat koji generalno prepoznaju kao pozitivan lekari koji su upoznati sa lečenjem poremećaja krvarenja i srodnih uzroka.
[0397] Efekat lečenja ili prevencije je očigledan kada postoji statistički značajno poboljšanje u jednom ili više parametara statusa bolesti, ili neuspehom da se stanje pogorša ili da se razviju simptomi gde bi se inače očekivali. Kao primer, povoljna promena od najmanje 10% u merljivom parametru bolesti, a po mogućnosti najmanje 20%, 30%, 40%, 50% ili više, može biti indikacija efikasnog lečenja. Efikasnost za dati iRNK lek ili formulaciju tog leka takođe se može proceniti korišćenjem eksperimentalnog životinjskog modela za datu bolest, kako je poznato u struci. Pri korišćenju eksperimentalnog životinjskog modela, efikasnost lečenja se dokazuje kada se uoči statistički značajno smanjenje markera ili simptoma.
[0398] Alternativno, efikasnost se može meriti smanjenjem ozbiljnosti bolesti, kako je utvrđeno od strane stručnjaka u oblasti dijagnoze na osnovu klinički prihvaćene skale za ocenjivanje ozbiljnosti bolesti. Bilo koja pozitivna promena koja rezultira, npr. smanjenjem ozbiljnosti bolesti mereno korišćenjem odgovarajuće skale, predstavlja adekvatno lečenje korišćenjem iRNK ili iRNK formulacije kako je ovde opisano.
[0399] iRNK (ili farmaceutske kompozicije koje sadrže iRNK) mogu se primenjivati subjektu otprilike jednom nedeljno, otprilike dva puta mesečno, otprilike jednom u šest nedelja, otprilike jednom u 2 meseca, ili jednom u kvartalu.
[0400] Dvolančani iRNK agens može se primeniti na subjektu u jednoj ili više doza. Na primer, dvolančani iRNK agens može se primeniti na subjektu kao mesečna doza od oko 0,200 mg/kg do oko 1,825 mg/kg. Alternativno, dvolančani iRNK agens može se primeniti na subjektu kao fiksna doza od oko 25 mg do oko 100 mg.
[0401] U jednom slučaju, dvolančani RNKi agens, koji se sastoji od sens lanca i antisens lanca, pri čemu antisens lanac sadrži region komplementarnosti koji se sastoji od najmanje 15 uzastopnih nukleotida koji se ne razlikuju za više od 3 nukleotida od nukleotidne sekvence 5' -UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG - 3' (SEQ ID NO: 15), pri čemu su suštinski svi nukleotidi sens lanca i suštinski svi nukleotidi antisens lanca modifikovani nukleotidi, i pri čemu je sens lanac konjugovan sa ligandom pričvršćenim na 3'-kraju, primenjuje se subjektu kao mesečna doza od oko 0,200 mg/kg do oko 0,250 mg/kg, npr. oko 0,225 mg/kg.
[0402] U drugom slučaju, dvolančani RNKi agens, koji se sastoji od sens lanca i antisens lanca, pri čemu antisens lanac sadrži region komplementarnosti koji se sastoji od najmanje 15 uzastopnih nukleotida koji se ne razlikuju za više od 3 nukleotida od nukleotidne sekvence 5' -UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG - 3' (SEQ ID NO: 15), pri čemu su suštinski svi nukleotidi sens lanca i suštinski svi nukleotidi antisens lanca modifikovani nukleotidi, i pri čemu je sens lanac konjugovan sa ligandom pričvršćenim na 3'-kraju, primenjuje se subjektu kao mesečna doza od oko 0,425 mg/kg do oko 0,475 mg/kg, npr. oko 0,450 mg/kg.
[0403] U još jednom slučaju, dvolančani RNKi agens, koji se sastoji od sens lanca i antisens lanca, pri čemu antisens lanac sadrži region komplementarnosti koji se sastoji od najmanje 15 uzastopnih nukleotida koji se ne razlikuju za više od 3 nukleotida od nukleotidne sekvence 5' -UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG - 3' (SEQ ID NO: 15), pri čemu su suštinski svi nukleotidi sens lanca i suštinski svi nukleotidi antisens lanca modifikovani nukleotidi, i pri čemu je sens lanac konjugovan sa ligandom pričvršćenim na 3'-kraju, primenjuje se subjektu kao mesečna doza od oko 0,875 mg/kg do oko 0,925 mg/kg, npr. oko 0,900 mg/kg.
[0404] U jednom slučaju, dvolančani RNKi agens, koji se sastoji od sens lanca i antisens lanca, pri čemu antisens lanac sadrži region komplementarnosti koji se sastoji od najmanje 15 uzastopnih nukleotida koji se ne razlikuju za više od 3 nukleotida od nukleotidne sekvence 5' -UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG - 3' (SEQ ID NO: 15), pri čemu su suštinski svi nukleotidi sens lanca i suštinski svi nukleotidi antisens lanca modifikovani nukleotidi, i pri čemu je sens lanac konjugovan sa ligandom pričvršćenim na 3'-kraju, primenjuje se subjektu kao mesečna doza od oko 1,775 mg/kg do oko 1,825 mg/kg, npr. oko 1,800 mg/kg.
[0405] U jednom slučaju, dvolančani RNKi agens, koji se sastoji od sens lanca i antisens lanca, pri čemu antisens lanac sadrži region komplementarnosti koji se sastoji od najmanje 15 uzastopnih nukleotida koji se ne razlikuju za više od 3 nukleotida od nukleotidne sekvence 5' -UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG - 3' (SEQ ID NO: 15), pri čemu su suštinski svi nukleotidi sens lanca i suštinski svi nukleotidi antisens lanca modifikovani nukleotidi, i pri čemu je sens lanac konjugovan sa ligandom pričvršćenim na 3'-kraju, primenjuje se subjektu kao fiksna doza od oko 25 do oko 100 mg, npr. oko 25 mg, 50 mg, 80 mg, ili 100 mg. U jednom slučaju, fiksna doza je 50 mg. U drugom slučaju, fiksna doza je 80 mg.
[0406] Primena se može ponoviti, na primer, na redovnoj osnovi, kao što je mesečno, tokom jednog meseca, dva meseca, tri meseca, četiri meseca ili duže. Nakon početnog režima lečenja, tretmani se mogu primenjivati sa manjom učestalošću. Na primer, nakon mesečne primene tokom tri meseca, primena se može ponoviti jednom kvartalno, tokom godinu dana ili duže.
[0407] Skladno tome, u nekim slučajevima, RNKi agens se primenjuje u režimu doziranja koji uključuje „inicijalnu fazu“ sa primenama u kraćim intervalima, nakon čega može slediti „faza održavanja“, u kojoj se RNKi agens primenjuje u dužim intervalima.
[0408] Raspored doziranja za inicijalnu fazu i/ili raspored doziranja za fazu održavanja može se, opciono, ponoviti jedan ili više puta. Broj ponavljanja može zavisiti od postizanja željenog efekta, npr. supresije Serpinc1 gena, i/ili postizanja terapeutski ili profilaktički efekt, npr. povećanja zgrušavanja krvi, smanjenja vremena formiranja ugruška i/ili smanjenja vremena zgrušavanja.
[0409] Primena iRNK može smanjiti nivoe Serpinc1, npr. u ćeliji, tkivu, krvi, urinu ili drugom odeljku pacijenta za najmanje oko 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili najmanje oko 99% ili više.
[0410] iRNK se može primeniti intravenskom infuzijom tokom određenog vremenskog perioda, kao što je period od 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, ili oko 25 minuta.
[0411] Pre primene pune doze iRNK, pacijentima se može primeniti manja doza, kao što je 5% infuzije, i pratiti neželjeni efekti, kao što je alergijska reakcija. U drugom primeru, pacijent se može pratiti zbog neželjenih imunostimulatornih efekata, kao što su povećani nivoi citokina (npr. TNF-alfa ili INF-alfa).
[0412] Zbog inhibitornih efekata na ekspresiju Serpinc1, kompozicija prema ovoj objavi ili farmaceutska kompozicija pripremljena iz nje može poboljšati kvalitet života.
[0413] iRNK agens iz ove objave može se primeniti u „golom“ obliku, ili kao „slobodna iRNK“. Gola iRNK se primenjuje u odsustvu farmaceutske kompozicije. Gola iRNK može biti u odgovarajućem puferovanom rastvoru. Puferovani rastvor može da sadrži acetat, citrat, prolamin, karbonat ili fosfat, ili bilo koju njihovu kombinaciju. U jednom otelotvorenju, puferovani rastvor je fosfatno puferovani fiziološki rastvor (PBS). pH vrednost i osmolaritet puferovanog rastvora koji sadrži iRNK mogu se podesiti tako da budu pogodni za primenu na subjektu.
[0414] Alternativno, iRNK iz ove objave može se primeniti kao farmaceutska kompozicija, kao što je lipozomalna formulacija dsRNK.
[0415] Subjekti koji bi imali koristi od redukcije i/ili inhibicije ekspresije Serpinc1 gena su oni koji imaju poremećaj krvarenja, npr. nasledni poremećaj krvarenja ili stečeni poremećaj krvarenja, kao što je ovde opisano. U jednom otelotvorenju, subjekt sa naslednim poremećajem krvarenja ima hemofiliju, npr. hemofiliju A ili B. U jednom otelotvorenju, subjekt sa naslednim poremećajem krvarenja, npr. hemofilijom, je subjekt sa inhibitorom (koji je postao otporan na zamenske faktore koagulacije). U jednom otelotvorenju, subjekt sa inhibitorom ima hemofiliju A. U drugom otelotvorenju, subjekt sa inhibitorom ima hemofiliju B. Lečenje subjekta koji bi imao koristi od redukcije i/ili inhibicije ekspresije Serpinc1 gena uključuje terapeutsko (npr. na zahtev, kada subjekt krvari (spontano krvarenje ili krvarenje kao rezultat traume) i ne dolazi do zgrušavanja) i profilaktičko (npr. subjekt ne krvari i/ili treba da bude podvrgnut operaciji) lečenje.
[0416] Objava dalje pruža metode i upotrebe za upotrebu iRNK ili farmaceutske kompozicije iste, npr. za lečenje subjekta koji bi imao koristi od redukcije i/ili inhibicije ekspresije Serpinc1, npr. subjekta sa poremećajem krvarenja, u kombinaciji sa drugim farmaceutskim preparatima i/ili drugim terapeutskim metodama, npr. sa poznatim farmaceutskim preparatima i/ili poznatim terapeutskim metodama, kao što su, na primer, oni koji se trenutno koriste za lečenje ovih poremećaja.
[0417] Na primer, u određenim slučajevima, iRNK koja cilja Serpinc1 primenjuje se u kombinaciji sa, npr. agensom korisnim za lečenje poremećaja krvarenja, kao što je opisano drugde u ovom tekstu. Na primer, dodatni terapeutici i terapeutske metode pogodne za lečenje subjekta koji bi imao koristi od redukcije ekspresije Serpinc1, npr. subjekta sa poremećajem krvarenja, uključuju sveže smrznutu plazmu (FFP); rekombinantni FVIIa; rekombinantni FIX; FXI koncentrate; viruse-inaktivirane, FVIII koncentrate koji sadrže vWF; desenzibilizacionu terapiju koja može uključivati velike doze FVIII ili FIX, zajedno sa steroidima ili intravenskim imunoglobulinom (IVIG) i ciklofosfamidom; plazmaferezu u kombinaciji sa imunosupresijom i infuzijom FVIII ili FIX, sa ili bez antifibrinolitičke terapije; indukciju imune tolerancije (ITI), sa ili bez imunosupresivne terapije (npr. ciklofosfamid, prednizon i/ili anti-CD20); desmopresin acetat [DDAVP]; antifibrinolitike, kao što su aminokaproinska kiselina i traneksaminska kiselina; aktivirani koncentrat protrombinskog kompleksa (PCC); antihemofilične agense; kortikosteroide; imunosupresivne agense; i estrogene.
[0418] iRNK i dodatni terapeutski agens i/ili tretman mogu se primenjivati u isto vreme i/ili u istoj kombinaciji, npr. parenteralno, ili se dodatni terapeutski agens može primeniti kao deo zasebne kompozicije ili u zasebnim terminima i/ili drugom metodom poznatom u struci ili opisanom ovde.
[0419] U jednom slučaju, ova objava pruža metode za lečenje subjekta koji pati od poremećaja krvarenja, npr. hemofilije, supkutanom primenom subjektu jedinjenja AD-57213 (sens lanac: 5'- GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf - 3' (SEQ ID NO:13) i antisens lanac: 5'-usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg - 3' (SEQ ID NO: 14), gde su A, C, G i U riboza A, C, G ili U; a, c, g i u su 2'-O-metil (2'-OMe) A, C, G ili U; Af, Cf, Gf ili Uf su 2'-fluoro A, C, G ili U; i s je fosforotioatna veza) u dozi od oko 0,200 mg/kg do oko 1,800 mg/kg, npr. mesečna doza od oko 0,200 mg/kg do oko 0,250 mg/kg; oko 0,425 mg/kg do oko 0,475 mg/kg; oko 0,875 mg/kg do oko 0,925 mg/kg; ili oko 1,775 mg/kg do oko 1,825 mg/kg.
[0420] U drugom slučaju, ova objava pruža metode za lečenje subjekta koji pati od poremećaja krvarenja, npr. hemofilije, supkutanom primenom subjektu jedinjenja AD-57213 (sens lanac: 5'- GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf - 3' (SEQ ID NO: 13) i antisens lanac: 5'-usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg - 3' (SEQ ID NO:14), gde su A, C, G i U riboza A, C, G ili U; a, c, g i u su 2'-O-metil (2'-OMe) A, C, G ili U; Af, Cf, Gf ili Uf su 2'-fluoro A, C, G ili U; i s je fosforotioatna veza) u fiksnoj dozi od oko 25 mg do oko 100 mg, npr. fiksne doze od oko 25 mg, oko 50 mg, oko 80 mg ili oko 100 mg. U jednom slučaju, fiksna doza je 50 mg. U drugom otelotvorenju, fiksna doza je 80 mg.
III. iRNK za upotrebu u metodama objave
[0421] Ovde su opisane metode za upotrebu poboljšanih dvolančanih RNKi agenasa koji inhibiraju ekspresiju Serpinc1 gena u ćeliji, kao što je ćelija unutar subjekta, npr. sisara, kao što je čovek sa poremećajem povezanim sa Serpinc1, npr. poremećajem krvarenja, npr. hemofilijom.
[0422] Shodno tome, objava pruža dvolančane RNKi agense sa hemijskim modifikacijama sposobne da inhibiraju ekspresiju ciljnog gena (tj. Serpinc1 gena) in vivo. U određenim slučajevima objave, suštinski svi nukleotidi iRNK iz ove objave su modifikovani. U drugim otelotvorenjima pronalaska, svi nukleotidi iRNK iz pronalaska su modifikovani. iRNK iz pronalaska u kojima su „suštinski svi nukleotidi modifikovani“ su u velikoj meri, ali ne u potpunosti, modifikovani i mogu da sadrže ne više od 5, 4, 3, 2 ili 1 nemodifikovanog nukleotida.
[0423] RNKi agens se sastoji od sens lanca i antisens lanca. Svaki lanac RNKi agensa može da bude dužine od 12 do 30 nukleotida. Na primer, svaki lanac može biti dužine između 14-30 nukleotida, 17-30 nukleotida, 19-30 nukleotida, 25-30 nukleotida, 27-30 nukleotida, 17-23 nukleotida, 17-21 nukleotida, 17-19 nukleotida, 19-25 nukleotida, 19-23 nukleotida, 19-21 nukleotida, 21-25 nukleotida, ili 21-23 nukleotida.
[0424] Sens lanac i antisens lanac obično formiraju dupleks dvolančanu RNK („dsRNK“), koja se ovde takođe naziva „RNKi agens“. Dupleks region RNKi agensa može biti dužine 12-30 nukleotidnih parova. Na primer, dupleks region može biti dužine između 14-30 nukleotidnih parova, 17-30 nukleotidnih parova, 27-30 nukleotidnih parova, 17-23 nukleotidnih parova, 17-21 nukleotidnog para, 17-19 nukleotidnih parova, 19-25 nukleotidnih parova, 19-23 nukleotidnih parova, 19-21 nukleotidnog para, 21-25 nukleotidnih parova, ili 21-23 nukleotidna para. U drugom primeru, dupleks region je odabran od 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, i 27 nukleotida dužine.
[0425] U jednom slučaju, RNKi agens može da sadrži jedan ili više regiona izbočine i/ili kapirajućih grupa na 3'-kraju, 5'-kraju, ili na oba kraja jednog ili oba lanca. Izbočina može biti dužine 1-6 nukleotida, na primer dužine 2-6 nukleotida, 1-5 nukleotida, 2-5 nukleotida, 1-4 nukleotida, 2-4 nukleotida, 1-3 nukleotida, 2-3 nukleotida, ili 1-2 nukleotida. Izbočine mogu biti rezultat toga da je jedan lanac duži od drugog, ili rezultat toga da su dva lanca iste dužine neusklađena. Izbočina može da formira nepodudarnost sa ciljnim mRNK ili može da bude komplementarna sekvencama gena koje se ciljaju, ili može biti druga sekvenca. Prvi i drugi lanac takođe mogu biti spojeni, npr. dodatnim bazama da bi se formirala ukosnička petlja, ili drugim nebaznim linkerima.
[0426] U jednom slučaju, nukleotidi u regionu izbočine RNKi agensa mogu biti svaki nezavisno modifikovani ili nemodifikovani nukleotid, uključujući, ali ne ograničavajući se na 2'-šećerno modifikovani, kao što su 2-F, 2'-O-metil, timidin (T), 2'-O-metoksietil-5-metiluridin (Teo), 2'-O-metoksietiladenozin (Aeo), 2'-O-metoksietil-5-metilcitidin (m5Ceo), i bilo koje njihove kombinacije. Na primer, TT može biti sekvenca izbočine za bilo koji kraj na bilo kom lancu. Izbočina može da formira nepodudarnost sa ciljnim mRNK ili može da bude komplementarna sekvencama gena koje se ciljaju, ili može biti druga sekvenca.
[0427] 5'- ili 3'- izbočine na sens lancu, antisens lancu ili oba lanca RNKi agensa mogu biti fosforilisane. U nekim slučajevima, region(i) izbočine sadrže dva nukleotida koji imaju fosforotioat između dva nukleotida, gde dva nukleotida mogu biti isti ili različiti. U jednom slučaju, izbočina je prisutna na 3'-kraju sens lanca, antisens lanca, ili na oba lanca. U jednom slučaju, ova 3'-izbočina je prisutna u antisens lancu. U jednom slučaju, ova 3'-izbočina je prisutna u sens lancu.
[0428] RNKi agens može da sadrži samo jednu izbočinu, što može ojačati interferentnu aktivnost RNKi, bez uticaja na njegovu ukupnu stabilnost. Na primer, jednolančana izbočina može biti smeštena na 3'-terminalnom kraju sens lanca ili, alternativno, na 3'-terminalnom kraju antisens lanca. RNKi takođe može imati tupi kraj, smešten na 5'-kraju antisens lanca (ili 3'-kraju sens lanca) ili obrnuto. Generalno, antisens lanac RNKi ima nukleotidnu izbočinu na 3'-kraju, a 5'-kraj je tup. Iako ne želimo da se vežemo za teoriju, asimetrični tupi kraj na 5'-kraju antisens lanca i 3'-kraj izbočine antisens lanca favorizuju proces učitavanja vodećeg lanca u RISC.
[0429] Bilo koja od nukleinskih kiselina opisanih u ovoj objavi može biti sintetisana i/ili modifikovana metodama dobro utvrđenim u struci, kao što su one opisane u "Current protocols in nucleic acid chemistry," Beaucage, S.L. et al. (Edrs.), John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, USA. Modifikacije uključuju, na primer, modifikacije krajeva, npr. modifikacije 5'-kraja (fosforilacija, konjugacija, invertne veze) ili modifikacije 3'-kraja (konjugacija, DNK nukleotidi, invertne veze, itd.); modifikacije baza, npr. zamenu sa stabilizujućim bazama, destabilizujućim bazama, ili bazama koje se bazno uparuju sa proširenim repertoarom partnera, uklanjanje baza (abazični nukleotidi), ili konjugovane baze; modifikacije šećera (npr. na 2'-poziciji ili 4'-poziciji) ili zamenu šećera; i/ili modifikacije kičme, uključujući modifikaciju ili zamenu fosfodiesterskih veza. Specifični primeri iRNK jedinjenja korisnih u ovde opisanim slučajevima uključuju, ali nisu ograničeni na RNK koje sadrže modifikovane kičme ili bez prirodnih internukleozidnih veza. RNK koje imaju modifikovane kičme uključuju, između ostalog, one koje nemaju atom fosfora u kičmi. Za potrebe ove specifikacije, i kako se ponekad navodi u struci, modifikovane RNK koje nemaju atom fosfora u svojoj internukleozidnoj kičmi takođe se mogu smatrati oligonukleozidima. U nekim slučajevima, modifikovana iRNK će imati atom fosfora u svojoj internukleozidnoj kičmi.
[0430] Modifikovane RNK kičme uključuju, na primer, fosforotioate, hiralne fosforotioate, fosforoditioate, fosfotriestre, aminoalkilfosfotriestre, metil i druge alkil fosfonate uključujući 3'-alkilen fosfonate i hiralne fosfonate, fosfinati, fosforamidati uključujući 3'-amino fosforamidate i aminoalkilfosforamidate, tionofosforamidate, tionoalkilfosfonate, tionoalkilfosfotriestre, i boranofosfate sa normalnim 3'-5' vezama, 2'-5' povezanim analogima ovih, i one sa invertovanom polarnošću gde su susedni parovi nukleozidnih jedinica povezani 3'-5' na 5'-3' ili 2'-5' na 5'-2'. Takođe su uključene razne soli, mešane soli i forme slobodne kiseline.
[0431] Reprezentativni američki patenti koji podučavaju pripremu gore navedenih veza koje sadrže fosfor uključuju, ali nisu ograničeni na, američki patent br. 3,687,808; 4,469,863; 4,476,301; 5,023,243; 5,177,195; 5,188,897; 5,264,423; 5,276,019; 5,278,302; 5,286,717; 5,321,131; 5,399,676; 5,405,939; 5,453,496; 5,455,233; 5,466,677; 5,476,925; 5,519,126; 5,536,821; 5,541,316; 5,550,111; 5,563,253; 5,571,799; 5,587,361; 5,625,050; 6,028,188; 6,124,445; 6,160,109; 6,169,170; 6,172,209; 6, 239,265; 6,277,603; 6,326,199; 6,346,614; 6,444,423; 6,531,590; 6,534,639; 6,608,035; 6,683,167; 6,858,715; 6,867,294; 6,878,805; 7,015,315; 7,041,816; 7,273,933; 7,321,029; i američki patent RE39464.
[0432] Modifikovane RNK kičme koje ne uključuju atom fosfora u sebi imaju kičme koje su formirane kratkim alkilnim lancem ili cikloalkil internukleozidnim vezama, mešanim heteroatomima i alkilnim ili cikloalkil internukleozidnim vezama, ili jednom ili više kratkih heteroatomskih ili heterocikličnih internukleozidnih veza. To uključuje one sa morfolino vezama (formirane delimično od šećernog dela nukleozida); siloksanske kičme; sulfidne, sulfoksidne i sulfon kičme; formacetil i tioformacetil kičme; metilen formacetil i tioformacetil kičme; kičme koje sadrže alken; sulfamat kičme; metilenimino i metilenhidrazino kičme; sulfonatne i sulfonamidne kičme; amidne kičme; i druge koje imaju mešane N, O, S i CH2komponentne delove.
[0433] Reprezentativni američki patenti koji podučavaju pripremu gore navedenih oligonukleozida uključuju, ali nisu ograničeni na, američke patente br.5,034,506; 5,166,315; 5,185,444; 5,214,134; 5,216,141; 5,235,033; 5,64,562; 5,264,564; 5,405,938; 5,434,257; 5,466,677; 5,470,967; 5,489,677; 5,541,307; 5,561,225; 5,596,086; 5,602,240; 5,608,046; 5,610,289; 5,618,704; 5,623,070; 5,663,312; 5,633,360; 5,677,437; i 5,677,439.
[0434] U drugim slučajevima, za upotrebu u iRNK predviđeni su pogodni mimetici RNK, kod kojih su i šećerna grupa i internukleozidna veza, tj. kičma, nukleotidnih jedinica zamenjene novim grupama. Bazne jedinice se zadržavaju radi hibridizacije sa odgovarajućim ciljnim jedinjenjem nukleinske kiseline. Jedno takvo oligomerno jedinjenje, mimetik RNK za koji je pokazano da ima odlična svojstva hibridizacije, naziva se peptidna nukleinska kiselina (PNK). U PNK jedinjenjima, šećerna kičma RNK je zamenjena kičmom koja sadrži amid, posebno aminoetilglicinskom kičmom. Nukleobaze se zadržavaju i vezane su direktno ili indirektno za aza atome azota amidnog dela kičme. Reprezentativni američki patenti koji podučavaju pripremu PNK jedinjenja uključuju, ali nisu ograničeni na, američki patent br. 5,539,082; 5,714,331; i 5,719,262. Dodatna PNK jedinjenja pogodna za upotrebu u iRNK iz ove objave opisana su u, na primer, Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497-1500.
[0435] Neki slučajevi predstavljeni u ovoj objavi uključuju RNK sa fosforotioatnim kičmama i oligonukleozide sa kičmama heteroatoma, a posebno --CH2--NH--CH2-, --CH2- -N(CH3)--O--CH2--[poznata kao metilen (metilimino) ili MMI kičma], ---CH2--O-N(CH3)--CH2--, --CH2--N(CH3)--N(CH3)--CH2-- i --N(CH3)--CH2--CH2--[gde je prirodna fosfodiesterska kičma predstavljena kao --O--P--O--CH2--] iz gore navedenog američkog patenta br. 5,489,677, i amidne kičme iz gore navedenog američkog patenta br.5,602,240. U nekim slučajevima, RNK opisane ovde imaju morfolino strukture kičme iz gore navedenog američkog patenta br.
5,034,506.
[0436] Modifikovane RNK takođe mogu da sadrže jednu ili više supstituisanih šećernih grupa. iRNK, npr. dsRNK, opisane ovde mogu da uključuju jednu od sledećih na 2'-poziciji: OH; F; O-, S- ili N-alkil; O-, S- ili N-alkenil; O-, S- ili N-alkinil; ili O-alkil-O-alkil, gde alkil, alkenil i alkinil mogu biti supstituisani ili nesupstituisani C1do C10alkil ili C2do C10alkenil i alkinil. Primerne pogodne modifikacije uključuju O[(CH2)nO]mCH3, O(CH2).nOCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2i O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2, gde su n i m od 1 do oko 10. U drugim slučajevima, dsRNK uključuju jednu od sledećih na 2' poziciji: C1do C10niži alkil, supstituisani niži alkil, alkaril, aralkil, O-alkaril ili O-aralkil, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, heterocikloalkil, heterocikloalkaril, aminoalkilamino, polialkilamino, supstituisani silil, grupu za cepanje RNK, reportersku grupu, interkalator, grupu za poboljšanje farmakokinetičkih svojstava iRNK, ili grupu za poboljšanje farmakodinamičkih svojstava iRNK, i druge supstituente sa sličnim svojstvima. U nekim slučajevima, modifikacija uključuje 2'-metoksietoksi (2'-O--CH2CH2OCH3, takođe poznatu kao 2'-O-(2-metoksietil) ili 2'-MOE) (Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78:486-504) tj. alkoksi-alkoksi grupu. Još jedna primerena modifikacija je 2'-dimetilaminooksietoksi, tj. O(CH2)2ON(CH3)2grupa, takođe poznata kao 2'-DMAOE, kao što je opisano u primerima u nastavku, i 2'-dimetilaminoetoksietoksi (takođe poznata u struci kao 2'-O-dimetilaminoetiletil ili 2'-DMAEOE), tj.2'-O--CH2--O--CH2--N(CH2)2.
[0437] Druge modifikacije uključuju 2'-metoksi (2'-OCH3), 2'-aminopropoksi (2'-OCH2CH2CH2NH2) i 2'-fluoro (2'-F). Slične modifikacije takođe se mogu izvršiti na drugim pozicijama na RNK iRNK, posebno na 3' poziciji šećera na 3' terminalnom nukleotidu ili u 2'-5' povezanim dsRNK i 5' poziciji 5' terminalnog nukleotida. iRNK takođe mogu imati mimetike šećera kao što su ciklobutilne grupe umesto pentofuranoznog šećera. Reprezentativni američki patenti koji podučavaju pripremu takvih modifikovanih šećernih struktura uključuju, ali nisu ograničeni na, američke patente br. 4,981,957; 5,118,800; 5,319,080; 5,359,044; 5,393,878; 5,446,137; 5,466,786; 5,514,785; 5,519,134; 5,567,811; 5,576,427; 5,591,722; 5,597,909; 5,610,300; 5,627,053; 5,639,873; 5,646,265; 5,658,873; 5,670,633; i 5,700,920, od kojih su neki u zajedničkom vlasništvu sa ovom prijavom.
[0438] iRNK takođe može da uključuje modifikacije ili supstitucije nukleobaza (koje se u struci često nazivaju jednostavno „bazama“). Kako se ovde koristi, „nemodifikovane“ ili „prirodne“ nukleobaze uključuju purinske baze adenin (A) i guanin (G), i pirimidinske baze timin (T), citozin (C) i uracil (U). Modifikovane nukleobaze uključuju druge sintetičke i prirodne nukleobaze kao što su deoksi-timin (dT), 5-metilcitozin (5-me-C), 5-hidroksimetil citozin, ksantin, hipoksantin, 2-aminoadenin, 6-metil i drugi alkil derivati adenina i gvanina, 2-propil i drugi alkil derivati adenina i gvanina, 2-tiouracil, 2-tiotimin i 2-tiocitozin, 5-halo-uracil i citozin, 5-propinil uracil i citozin, 6-azo uracil, citozin i timin, 5-uracil (pseudouracil), 4-tiouracil, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalkil, 8-hidroksil anal i drugi 8-supstituisani adenini i gvanini, 5-halo, posebno 5-bromo, 5-trifluorometil i drugi 5-supstituisani uracili i citozini, 7-metilgvanin i 7-metiladenin, 8-azaguanin i 8-azaadenin, 7-deazagvanin i 7-daazaadenin i 3-deazagvanin i 3-deazaadenin. Dalje nukleobaze uključuju one obelodanjene u američkom patentu br. 3,687,808, one obelodanjene u Modified Nucleosides in Biochemistry, Biotechnology and Medicine, Herdewijn, P. ed. Wiley-VCH, 2008; one obelodanjene u The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pages 858-859, Kroschwitz, J. L, ed. John Wiley & Sons, 1990, ove obelodanjene od strane Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613, i one obelodanjene od strane Sanghvi, Y S., Chapter 15, dsRNA Research and Applications, pages 289-302, Crooke, S. T. and Lebleu, B., Ed., CRC Press, 1993. Neke od ovih nukleobaza su posebno korisne za povećanje afiniteta vezivanja oligomernih jedinjenja prikazanih u ovoj objavi. Oni uključuju 5-supstituisane pirimidine, 6-azapirimidine i N-2, N-6 i O-6 supstituisane purine, uključujući 2-aminopropiladenin, 5-propiniluracil i 5-propinilcitozin. Pokazano je da supstitucije 5-metilcitozina povećavaju stabilnost dupleksa nukleinske kiseline za 0.6-1.2°C (Sanghvi, Y. S., Crooke, S. T. and Lebleu, B., Eds., dsRNA Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278) i predstavljaju primerne supstitucije baza, još posebnije kada su kombinovane sa 2'-O-metoksietil modifikacijama šećera.
[0439] Reprezentativni američki patenti koji podučavaju pripremu određenih gore navedenih modifikovanih nukleobaza, kao i drugih modifikovanih nukleobaza, uključuju, ali nisu ograničeni na, gore navedene američkom patentu br. 3,687,808, 4,845,205; 5,130,30; 5,134,066; 5,175,273; 5,367,066; 5,432,272; 5,457,187; 5,459,255; 5,484,908; 5,502,177; 5,525,711; 5,552,540; 5,587,469; 5,594,121, 5,596,091; 5,614,617; 5,681,941; 5,750,692; 6,015,886; 6,147,200; 6,166,197; 6,222,025; 6,235,887; 6,380,368; 6,528,640; 6,639,062; 6,617,438; 7,045,610; 7,427,672; i 7,495,088.
[0440] RNK iRNK takođe može biti modifikovana da uključuje jednu ili više bicikličnih šećernih grupa. „Biciklični šećer“ je furanozni prsten modifikovan premošćavanjem dva atoma. „Biciklični nukleozid“ („BNK“) je nukleozid koji ima šećernu grupu koja se sastoji od mosta koji povezuje dva atoma ugljenika šećernog prstena, čime se formira biciklični prstenasti sistem. U određenim slučajevima, most povezuje 4'-ugljenik i 2'-ugljenik šećernog prstena. Dakle, u nekim slučajevima agens iz ove objave može uključivati RNK iRNK koja takođe može biti modifikovana da uključuje jednu ili više zaključanih nukleinskih kiselina (LNA). Zaključana nukleinska kiselina je nukleotid sa modifikovanom riboznom grupom u kojoj se ribozna grupa sastoji od dodatnog mosta koji povezuje 2' i 4' ugljenik. Drugim rečima, LNA je nukleotid koji se sastoji od biciklične šećerne grupe koja se sastoji od 4'-CH2-O-2' mosta. Ova struktura efektivno „zaključava“ ribozu u 3'-endo strukturnu konformaciju. Pokazano je da dodavanje zaključanih nukleinskih kiselina siRNK povećava stabilnost siRNK u serumu i smanjuje neželjene efekte (Elmen, J. et al., (2005) Nucleic Acids Research 33(1):439-447; Mook, OR. et al., (2007) Mol Canc Ther 6(3):833-843; Grunweller, A. et al., (2003) Nucleic Acids Research 31(12):3185-3193).
[0441] Primeri bicikličnih nukleozida za upotrebu u polinukleotidima iz ove objave uključuju, bez ograničenja, nukleozide koji se sastoje od mosta između 4' i 2' atoma riboznog prstena. U određenim slučajevima, antisens polinukleotidni agensi iz ove objave uključuju jedan ili više bicikličnih nukleozida koji se sastoje od 4' do 2' mosta. Primeri takvih 4' do 2' premošćenih bicikličnih nukleozida uključuju, ali nisu ograničeni na 4'-(CH2)-O-2' (LNA); 4'-(CH2)-S-2'; 4'-(CH2)2-O-2' (ENA); 4'-CH(CH3)-O-2' (takođe nazvan „ograničeni etil“ ili „cEt“) i 4'-CH(CH2OCH3)-O-2' (i analoge istog; videti npr. američki patent br. 7,399,845); 4'-C(CH3)(CH3)-O-2' (i analoge istog; videti npr. američki patent br. 8,278,283); 4'-CH2-N(OCH3)-2' (i analoge istog; videti npr. američki patent br.8,278,425); 4'-CH2-O-N(CH3)-2' (videti npr. američku objavljenu patentnu prijavu br. 2004/0171570); 4'-CH2-N(R)-O-2', gde je R H, C1-C12 alkil, ili zaštitna grupa (videti npr. američki patent br. 7,427,672); 4'-CH2-C(H)(CH3)-2' (videti npr. Chattopadhyaya et al., J. Org. Chem., 2009, 74, 118-134); i 4'-CH2-C(=CH2)-2' (i analoge istog; videti npr. američki patent br.8,278,426).
[0442] Dodatni reprezentativni američki patenti i američke objavljene patentne prijave koje podučavaju pripremu zaključanih nukleinske kiseline nukleotida uključuju, ali nisu ograničeni na, sledeće: Američki patenti br. 6,268,490; 6,525,191; 6,670,461; 6,770,748; 6,794,499; 6,998,484; 7,053,207; 7,034,133;7,084,125; 7,399,845; 7,427,672; 7,569,686; 7,741,457; 8,022,193; 8,030,467; 8,278,425; 8,278,426; 8,278,283; US 2008/0039618; i US 2009/0012281.
[0443] Bilo koji od gore navedenih bicikličnih nukleozida može biti pripremljen sa jednom ili više stereohemijskih šećernih konfiguracija uključujući, na primer, α-L-ribofuranozu i β-D-ribofuranozu (videti WO 99/14226).
[0444] RNK iRNK takođe može biti modifikovana da uključuje jedan ili više ograničenih etil nukleotida. Kako se ovde koristi, „ograničeni etil nukleotid“ ili „cEt“ je zaključana nukleinska kiselina koja se sastoji od biciklične šećerne grupe koja se sastoji od 4'-CH(CH3)-O-2' mosta. U jednom slučaju, ograničeni etil nukleotid je u S konformaciji koja se ovde naziva „S-cEt“.
[0445] iRNK iz ove objave takođe može da uključuje jedan ili više „konformaciono ograničenih nukleotida“ („CRN“). CRN su analozi nukleotida sa linkerom koji povezuje C2' i C4' ugljenik riboze ili C3 i -C5' ugljenik riboze. CRN zaključavaju ribozni prsten u stabilnu konformaciju i povećavaju afinitet hibridizacije prema mRNK. Linker je dovoljne dužine da postavi kiseonik u optimalnu poziciju za stabilnost i afinitet, što rezultira manjim nabiranjem riboznog prstena.
[0446] Reprezentativne publikacije koje podučavaju pripremu određenih gore navedenih CRN uključuju, ali nisu ograničene na, američka objavljena patentna prijava br. 2013/0190383; i PCT publikaciju WO 2013/036868.
[0447] Jedan ili više nukleotida iRNK iz ove objave takođe mogu da uključuju supstituisani nukleotid hidroksimetila. „Supstituisani nukleotid hidroksimetila“ je aciklični 2'-3'-sekonukleotid, takođe nazvan „otključana nukleinska kiselina“ („UNA“) modifikacija
[0448] Reprezentativne američke objavljene patentne prijave koje podučavaju pripremu UNA uključuju, ali nisu ograničene na, američki patent br.8,314,227; i američka objavljena patentna prijava br.2013/0096289; 2013/0011922; i 2011/0313020.
[0449] Potencijalno stabilizujuće modifikacije na krajevima RNK molekula mogu uključivati N-(acetilaminokaproil)-4-hidroksiprolinol (Hyp-C6-NHAc), N-(kaproil-4-hidroksiprolinol (Hyp-C6), N-(acetil-4-hidroksiprolinol (Hyp-NHAc), timid-in-2'-O-deoksitimidin (etar), N-(aminokaproil)-4-hidroksiprolinol (Hyp-C6-amino), 2-dokosanoil-uridin-3"-fosfat, invertna baza dT(idT) i druge. Objava ove modifikacije može se naći u PCT objavi br. WO 2011/005861.
A. Modifikovane iRNK koje sadrže motive pronalaska
[0450] U određenim slučajevima objave, dvolančani RNKi agensi iz ove objave uključuju agense sa hemijskim modifikacijama, kao što je objavljeno, na primer, u američkoj privremenoj prijavi br.61/561,710, podnetoj 18. novembra 2011, ili u PCT/US2012/065691, podnetoj 16. novembra 2012.
[0451] Kako je ovde prikazano, u američkoj privremenoj prijavi br. 61/561,710 i u PCT/US2012/065691, superiorni rezultat se može dobiti uvođenjem jednog ili više motiva od tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida u sens lanac i/ili antisens lanac RNKi agensa, posebno na mestu cepanja ili blizu njega. U nekim slučajevima, sens lanac i antisens lanac RNKi agensa mogu inače biti potpuno modifikovani. Uvođenje ovih motiva prekida šemu modifikacije, ako je prisutna, na sens lancu i/ili antisens lancu. RNKi agens može biti opciono konjugovan sa GalNAc derivatnim ligandom, na primer na sens lancu. Dobijeni RNKi agensi pokazuju superiornu aktivnost utišavanja gena.
[0452] Konkretnije, iznenađujuće je otkriveno da kada su sens lanac i antisens lanac dvolančanog RNKi agensa modifikovani da imaju jedan ili više motiva od tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida na mestu cepanja ili blizu njega na najmanje jednom lancu RNKi agensa, aktivnost utišavanja gena RNKi agensa bila je značajno poboljšana.
[0453] U jednom slučaju, RNKi agens je dvostruko završen ravnokraki dupleks dužine 19 nukleotida, pri čemu sens lanac sadrži najmanje jedan motiv od tri 2'-F modifikacije na tri uzastopna nukleotida na pozicijama 7, 8, 9 od 5'-kraja. Antisens lanac sadrži najmanje jedan motiv od tri 2'-O-metil modifikacije na tri uzastopna nukleotida na pozicijama 11, 12, 13 od 5'-kraja.
[0454] U drugom slučaju, RNKi agens je dvostruko završen ravnokraki dupleks dužine 20 nukleotida, pri čemu sens lanac sadrži najmanje jedan motiv od tri 2'-F modifikacije na tri uzastopna nukleotida na pozicijama 8, 9, 10 od 5'-kraja. Antisens lanac sadrži najmanje jedan motiv od tri 2'-O-metil modifikacije na tri uzastopna nukleotida na pozicijama 11, 12, 13 od 5'-kraja.
[0455] U još jednom slučaju, RNKi agens je dvostruko završen ravnokraki dupleks dužine 21 nukleotid, pri čemu sens lanac sadrži najmanje jedan motiv od tri 2'-F modifikacije na tri uzastopna nukleotida na pozicijama 9, 10, 11 od 5'-kraja. Antisens lanac sadrži najmanje jedan motiv od tri 2'-O-metil modifikacije na tri uzastopna nukleotida na pozicijama 11, 12, 13 od 5'-kraja.
[0456] U jednom slučaju, RNKi agens se sastoji od sens lanca od 21 nukleotid i antisens lanca od 23 nukleotida, pri čemu sens lanac sadrži najmanje jedan motiv od tri 2'-F modifikacije na tri uzastopna nukleotida na pozicijama 9, 10, 11 od 5'-kraja; antisens lanac sadrži najmanje jedan motiv od tri 2'-O-metil modifikacije na tri uzastopna nukleotida na pozicijama 11, 12, 13 od 5'-kraja, pri čemu je jedan kraj RNKi agensa ravan, dok drugi kraj sadrži izbočinu od 2 nukleotida. Poželjno je da izbočina od 2 nukleotida bude na 3'-kraju antisens lanca. Kada je izbočina od 2 nukleotida na 3'-kraju antisens lanca, mogu postojati dve fosforotioatne internukleotidne veze između terminalnih tri nukleotida, pri čemu su dva od tri nukleotida nukleotidi izbočine, a treći nukleotid je upareni nukleotid pored nukleotida izbočine. U jednom slučaju, RNKi agens dodatno ima dve fosforotioatne internukleotidne veze između terminalnih tri nukleotida i na 5'-kraju sens lanca i na 5'-kraju antisens lanca. U jednom slučaju, svaki nukleotid u sens lancu i antisens lancu RNKi agensa, uključujući nukleotide koji su deo motiva, su modifikovani nukleotidi. U jednom slučaju, svaki ostatak je nezavisno modifikovan sa 2'-O-metil ili 3'-fluoro, npr. u naizmeničnom motivu. Opciono, RNKi agens dalje sadrži ligand (poželjno GalNAc3).
[0457] U jednom slučaju, RNKi agens se sastoji od sens i antisens lanaca, pri čemu RNKi agens sadrži prvi lanac dužine od najmanje 25 do najviše 29 nukleotida i drugi lanac dužine od najviše 30 nukleotida sa najmanje jednim motivom od tri 2'-O-metil modifikacije na tri uzastopna nukleotida na pozicijama 11, 12, 13 od 5'-kraja; pri čemu 3'-kraj prvog lanca i 5'-kraj drugog lanca formiraju ravan kraj, a drugi lanac je 1-4 nukleotida duži na svom 3'-kraju od prvog lanca, pri čemu je dupleks region dužine najmanje 25 nukleotida, i drugi lanac je dovoljno komplementaran ciljnoj mRNK duž najmanje 19 nukleotida dužine drugog lanca da smanji ekspresiju ciljnog gena kada se RNKi agens unese u ćeliju sisara, i pri čemu dicer cepanje RNKi agensa preferencijalno rezultira siRNK koja se sastoji od 3'-kraja drugog lanca, čime se smanjuje ekspresija ciljnog gena kod sisara. Opciono, RNKi agens dalje sadrži ligand.
[0458] U jednom slučaju, sens lanac RNKi agensa sadrži najmanje jedan motiv od tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida, gde se jedan od motiva javlja na mestu cepanja u sens lancu.
[0459] U jednom slučaju, antisens lanac RNKi agensa takođe može da sadrži najmanje jedan motiv od tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida, gde se jedan od motiva javlja na mestu cepanja ili blizu njega u antisens lancu
[0460] Za RNKi agens koji ima dupleks region dužine 17-23 nukleotida, mesto cepanja antisens lanca je tipično oko pozicija 10, 11 i 12 od 5'-kraja. Dakle, motivi od tri identične modifikacije mogu se javiti na pozicijama 9, 10, 11; pozicijama 10, 11, 12; pozicijama 11, 12, 13; pozicijama 12, 13, 14; ili pozicijama 13, 14, 15 antisens lanca, brojanje počinje od 1. nukleotida od 5'-kraja antisens lanca, ili, brojanje počinje od 1. uparenog nukleotida unutar dupleks regiona od 5'-kraja antisens lanca. Mesto cepanja u antisens lancu takođe se može promeniti u zavisnosti od dužine dupleks regiona RNKi od 5'-kraja.
[0461] Sens lanac RNKi agensa može da sadrži najmanje jedan motiv od tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida na mestu cepanja lanca; a antisens lanac može imati najmanje jedan motiv od tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida na mestu cepanja ili blizu njega u lancu. Kada sens lanac i antisens lanac formiraju dsRNK dupleks, sens lanac i antisens lanac mogu biti poravnati tako da jedan motiv od tri nukleotida na sens lancu i jedan motiv od tri nukleotida na antisens lancu imaju preklapanje od najmanje jednog nukleotida, tj. najmanje jedan od tri nukleotida motiva u sens lancu formira bazni par sa najmanje jednim od tri nukleotida motiva u antisens lancu. Alternativno, najmanje dva nukleotida mogu se preklapati, ili sva tri nukleotida mogu se preklapati.
[0462] U jednom slučaju, sens lanac RNKi agensa može da sadrži više od jednog motiva od tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida. Prvi motiv se može javiti na mestu cepanja lanca ili blizu njega, a drugi motivi mogu biti periferna modifikacija. Termin „periferna modifikacija“ ovde se odnosi na motiv koji se javlja na drugom delu lanca koji je odvojen od motiva na mestu cepanja ili blizu njega u istom lancu. Periferna modifikacija je bilo susedna prvom motivu ili je odvojena najmanje jednim ili više nukleotida. Kada su motivi neposredno jedan pored drugog, hemija motiva je različita jedna od druge, a kada su motivi odvojeni jednim ili više nukleotida, hemije mogu biti iste ili različite. Mogu biti prisutne dve ili više perifernih modifikacija. Na primer, kada su prisutne dve periferne modifikacije, svaka periferna modifikacija se može javiti na jednom kraju u odnosu na prvi motiv koji je na mestu cepanja ili blizu njega ili na bilo kojoj strani vodećeg motiva.
[0463] Kao i sens lanac, antisens lanac RNKi agensa može da sadrži više od jednog motiva od tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida, pri čemu se najmanje jedan od motiva javlja na mestu cepanja lanca ili blizu njega. Ovaj antisens lanac takođe može da sadrži jednu ili više perifernih modifikacija u poravnanju sličnom perifernim modifikacijama koje mogu biti prisutne na sens lancu.
[0464] U jednom slučaju, periferna modifikacija na sens lancu ili antisens lancu RNKi agensa tipično ne uključuje prvi jedan ili dva terminalna nukleotida na 3'-kraju, 5'-kraju ili oba kraja lanca.
[0465] U drugom slučaju, periferna modifikacija na sens lancu ili antisens lancu RNKi agensa tipično ne uključuje prvi jedan ili dva uparena nukleotida unutar dupleks regiona na 3'-kraju, 5'-kraju ili oba kraja lanca.
[0466] Kada sens lanac i antisens lanac RNKi agensa svaki sadrže najmanje jednu perifernu modifikaciju, periferne modifikacije mogu pasti na isti kraj dupleks regiona i imati preklapanje od jednog, dva ili tri nukleotida.
[0467] Kada sens lanac i antisens lanac RNKi agensa svaki sadrže najmanje dve periferne modifikacije, sens lanac i antisens lanac mogu biti poravnati tako da dve modifikacije sa svakog lanca padnu na jedan kraj dupleks regiona, imajući preklapanje od jednog, dva ili tri nukleotida; dve modifikacije sa svakog lanca padnu na drugi kraj dupleks regiona, imajući preklapanje od jednog, dva ili tri nukleotida; dve modifikacije sa jednog lanca padnu na svaku stranu vodećeg motiva, imajući preklapanje od jednog, dva ili tri nukleotida u dupleks regionu.
[0468] U jednom slučaju, svaki nukleotid u sens lancu i antisens lancu RNKi agensa, uključujući nukleotide koji su deo motiva, može biti modifikovan. Svaki nukleotid može biti modifikovan istom ili različitom modifikacijom koja može da uključuje jednu ili više promena jednog ili oba nevezujuća kiseonika fosfata i/ili jednog ili više povezujućih kiseonika fosfata; promenu komponente riboznog šećera, npr. 2' hidroksila na riboznom šećeru; veleprodajnu zamenu fosfatne grupe sa „defosfo“ linkerima; modifikaciju ili zamenu prirodne baze; i zamenu ili modifikaciju riboza-fosfatne kičme.
[0469] Kako su nukleinske kiseline polimeri podjedinica, mnoge modifikacije se javljaju na poziciji koja se ponavlja unutar nukleinske kiseline, npr. modifikacija baze, ili fosfatne grupe, ili nevezujuće O pozicije fosfatne grupe. U nekim slučajevima, modifikacija će se dogoditi na svim predmetnim pozicijama u nukleinskoj kiselini, ali u mnogim slučajevima neće. Na primer, modifikacija se može dogoditi samo na 3' ili 5' terminalnoj poziciji, može se dogoditi samo u terminalnom regionu, npr. na poziciji na terminalnom nukleotidu ili u poslednjih 2, 3, 4, 5, ili 10 nukleotida lanca. Modifikacija se može dogoditi u regionu dvolančanog lanca, u regionu jednog lanca, ili u oba. Modifikacija se može dogoditi samo u regionu dvolančanog lanca RNK ili se može dogoditi samo u regionu jednog lanca RNK. Na primer, fosforotioatna modifikacija na nevezujućoj O poziciji može se dogoditi samo na jednom ili oba terminalna kraja, može se dogoditi samo u terminalnom regionu, npr. na poziciji na terminalnom nukleotidu ili u poslednjih 2, 3, 4, 5, ili 10 nukleotida lanca, ili se može dogoditi u regionima dvolančanog i jednog lanca, posebno na terminusima. 5' kraj ili krajevi mogu biti fosforilisani.
[0470] Može biti moguće, npr. da se poboljša stabilnost, uključiti određene baze u izbočine, ili uključiti modifikovane nukleotide ili surogate nukleotida, u jednolančane izbočine, npr. u 5' ili 3' izbočinu, ili u obe. Na primer, može biti poželjno uključiti purinske nukleotide u izbočine. U nekim slučajevima, sve ili neke od baza u 3' ili 5' izbočini mogu biti modifikovane, npr. modifikacijom opisanim ovde. Modifikacije mogu uključivati, npr. upotrebu modifikacija na 2' poziciji riboznog šećera sa modifikacijama koje su poznate u struci, npr. upotrebu deoksiribonukleotida, 2'-deoksi-2'-fluoro (2'-F) ili 2'-O-metil modifikovanih umesto ribošećera nukleobaze, i modifikacije u fosfatnoj grupi, npr.fosforotioatne modifikacije. Izbočine ne moraju biti homologne sa ciljnom sekvencom.
[0471] U jednom slučaju, svaki ostatak sens lanca i antisens lanca je nezavisno modifikovan sa LNA, HNA, CeNA, 2'-metoksietil, 2'-O-metil, 2'-O-alil, 2'-C-alil, 2'-deoksi, 2'-hidroksil, ili 2'-fluoro. Lanci mogu da sadrže više od jedne modifikacije. U jednom slučaju, svaki ostatak sens lanca i antisens lanca je nezavisno modifikovan sa 2'-O-metil ili 2'-fluoro.
[0472] Najmanje dve različite modifikacije su tipično prisutne na sens lancu i antisens lancu. Te dve modifikacije mogu biti 2'-O-metil ili 2'-fluoro modifikacije, ili druge.
[0473] U jednom slučaju, Nai/ili Nbse sastoje od modifikacija naizmeničnog obrasca. Termin „naizmenični motiv“ kako se ovde koristi, odnosi se na motiv koji ima jednu ili više modifikacija, pri čemu se svaka modifikacija javlja naizmenično na nukleotidima jednog lanca. Naizmenični nukleotid može se odnositi na jedan nukleotid na svakom drugom nukleotidu ili jedan na svaka tri nukleotida, ili sličan obrazac. Na primer, ako A, B i C svaki predstavljaju jedan tip modifikacije nukleotida, naizmenični motiv može biti „ABABABABABAB…“, „AABBAABBAABB…“, „AABAABAABAAB…“, „AAABAAABAAAB…“, „AAABBBAAABBB…“, ili „ABCABCABCABC…“, itd.
[0474] Tip modifikacija sadržanih u naizmeničnom motivu može biti isti ili različit. Na primer, ako A, B, C, D svaki predstavlja jedan tip modifikacije na nukleotidu, naizmenični obrazac, tj. modifikacije na svakom drugom nukleotidu, mogu biti isti, ali svaki od sens lanca ili antisens lanca može biti odabran iz nekoliko mogućnosti modifikacija unutar naizmeničnog motiva kao što su „ABABAB…“, „ACACAC…“ „BDBDBD…“ ili „CDCDCD…“, itd.
[0475] U jednom slučaju, RNKi agens iz ove objave se sastoji od obrasca modifikacije za naizmenični motiv na sens lancu u odnosu na obrazac modifikacije za naizmenični motiv na antisens lancu koji je pomeren. Pomak može biti takav da modifikovana grupa nukleotida sens lanca odgovara različito modifikovanoj grupi nukleotida antisens lanca i obrnuto. Na primer, sens lanac kada je uparen sa antisens lancem u dsRNK dupleksu, naizmenični motiv u sens lancu može početi sa „ABABAB“ od 5'-3' lanca, a naizmenični motiv u antisens lancu može početi sa „BABABA“ od 5'-3' lanca unutar dupleks regiona. Kao drugi primer, naizmenični motiv u sens lancu može početi sa „AABBAABB“ od 5'-3' lanca, a naizmenični motiv u antisens lancu može početi sa „BBAABBAA“ od 5'-3' lanca unutar dupleks regiona, tako da postoji potpuno ili delimično pomeranje obrazaca modifikacija između sens lanca i antisens lanca.
[0476] U jednom slučaju, RNKi agens se sastoji od obrasca naizmeničnog motiva 2'-O-metil modifikacije i 2'-F modifikacije na sens lancu u početku ima pomak u odnosu na obrazac naizmeničnog motiva 2'-O-metil modifikacije i 2'-F modifikacije na antisens lancu u početku, tj. 2'-O-metil modifikovani nukleotid na sens lancu se bazno uparuje sa 2'-F modifikovanim nukleotidom na antisens lancu i obrnuto. Prva pozicija sens lanca može početi sa 2'-F modifikacijom, a prva pozicija antisens lanca može početi sa 2'-O-metil modifikacijom.
[0477] Uvođenje jednog ili više motiva od tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida u sens lanac i/ili antisens lanac prekida početni obrazac modifikacije prisutan u sens lancu i/ili antisens lancu. Ovo prekidanje obrasca modifikacije sens lanca i/ili antisens lanca uvođenjem jednog ili više motiva od tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida u sens i/ili antisens lanac iznenađujuće pojačava aktivnost utišavanja gena ciljnog gena.
[0478] U jednom slučaju, kada se motiv od tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida uvede u bilo koji od lanaca, modifikacija nukleotida pored motiva je drugačija modifikacija od modifikacije motiva. Na primer, deo sekvence koji sadrži motiv je „...NaYYYNb...“, gde „Y“ predstavlja modifikaciju motiva od tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida, a „Na“ i „Nb“ predstavljaju modifikaciju nukleotida pored motiva „YYY“ koja se razlikuje od modifikacije Y, i gde Nai Nbmogu biti iste ili različite modifikacije. Alternativno, Nai/ili Nbmogu biti prisutni ili odsutni kada je prisutna periferna modifikacija.
[0479] RNKi agens može dalje da sadrži najmanje jednu fosforotioatnu ili metilfosfonatnu internukleotidnu vezu. Modifikacija fosforotioatne ili metilfosfonatne internukleotidne veze može se javiti na bilo kom nukleotidu sens lanca ili antisens lanca ili na oba lanca na bilo kojoj poziciji lanca. Na primer, modifikacija internukleotidne veze može se javiti na svakom nukleotidu na sens lancu i/ili antisens lancu; svaka modifikacija internukleotidne veze može se javiti u naizmeničnom obrascu na sens lancu i/ili antisens lancu; ili sens lanac ili antisens lanac mogu sadržati obe modifikacije internukleotidne veze u naizmeničnom obrascu. Naizmenični obrazac modifikacije internukleotidne veze na sens lancu može biti isti ili različit od antisens lanca, a naizmenični obrazac modifikacije internukleotidne veze na sens lancu može imati pomak u odnosu na naizmenični obrazac modifikacije internukleotidne veze na antisens lancu.
[0480] U jednom slučaju, RNKi se sastoji od fosforotioatne ili metilfosfonatne modifikacije internukleotidne veze u regionu izbočine. Na primer, region izbočine može da sadrži dva nukleotida koji imaju fosforotioatnu ili metilfosfonatnu internukleotidnu vezu između dva nukleotida. Modifikacije internukleotidne veze takođe se mogu napraviti da povežu nukleotide izbočine sa terminalnim uparenim nukleotidima unutar dupleks regiona. Na primer, najmanje 2, 3, 4, ili svi nukleotidi izbočine mogu biti povezani fosforotioatnom ili metilfosfonatnom internukleotidnom vezom, i opciono, mogu postojati dodatne fosforotioatne ili metilfosfonatne internukleotidne veze koje povezuju nukleotid izbočine sa uparenim nukleotidom koji se nalazi pored nukleotida izbočine. Na primer, može postojati najmanje dve fosforotioatne internukleotidne veze između terminalnih tri nukleotida, u kojima su dva od tri nukleotida nukleotidi izbočine, a treći je upareni nukleotid pored nukleotida izbočine. Ova tri terminalna nukleotida mogu biti na 3'-kraju antisens lanca, 3'-kraju sens lanca, 5'-kraju antisens lanca, i/ili 5'-kraju antisens lanca.
[0481] U jednom slučaju, izbočina od 2 nukleotida je na 3'-kraju antisens lanca, i postoje dve fosforotioatne internukleotidne veze između terminalnih tri nukleotida, pri čemu su dva od tri nukleotida nukleotidi izbočine, a treći nukleotid je upareni nukleotid pored nukleotida izbočine. Opciono, RNKi agens može dodatno imati dve fosforotioatne internukleotidne veze između terminalnih tri nukleotida i na 5'-kraju sens lanca i na 5'-kraju antisens lanca.
[0482] U jednom slučaju, RNKi agens sadrži nepodudarnost(i) sa metom, unutar dupleksa, ili kombinacije istih. „Nepodudarnost“ može biti nekanonsko bazno uparivanje ili drugačije od kanonskog uparivanja nukleotida. Nepodudarnost se može javiti u regionu izbočine ili u dupleks regionu. Bazni par se može rangirati na osnovu njihove sklonosti da promovišu disocijaciju ili topljenje (npr. na osnovu slobodne energije asocijacije ili disocijacije određenog uparivanja, najjednostavniji pristup je ispitivanje parova na individualnoj osnovi, iako se može koristiti i analiza sledećeg suseda ili slična analiza). U pogledu promovisanja disocijacije: A:U je poželjno u odnosu na G:C; G:U je poželjno u odnosu na G:C; i I:C je poželjno u odnosu na G:C (I=inozin). Nepodudarnosti, npr. nekanonska ili drugačija uparivanja od kanonskih (kao što je opisano drugde u ovom tekstu) su poželjnije od kanonskih (A:T, A:U, G:C) uparivanja; a uparivanja koja uključuju univerzalnu bazu su poželjnija od kanonskih uparivanja. „Univerzalna baza“ je baza koja pokazuje sposobnost da zameni bilo koju od četiri normalne baze (G, C, A i U) bez značajne destabilizacije interakcija susednih baznih parova ili narušavanja očekivane funkcionalne biohemijske korisnosti modifikovanog oligonukleotida. Neograničavajući primeri univerzalnih baza uključuju 2'-deoksiinozin (hipoksantin deoksinukleotid) ili njegove derivate, nitroazolne analoge i hidrofobne aromatične baze koje ne formiraju vodonične veze.
[0483] U jednom slučaju, RNKi agens sadrži najmanje jedan od prvih 1, 2, 3, 4 ili 5 baznih parova unutar dupleks regiona od 5'-kraja antisens lanca nezavisno odabranih iz grupe: A:U, G:U, I:C, i nepodudarnih parova, npr. nekanonskih ili drugačijih uparivanja od kanonskih ili uparivanja koja uključuju univerzalnu bazu, da bi se promovisala disocijacija antisens lanca na 5'-kraju dupleksa.
[0484] U jednom slučaju, nukleotid na 1. poziciji unutar dupleks regiona od 5'-kraja u antisens lancu je odabran iz grupe koja se sastoji od A, dA, dU, U i dT. Alternativno, najmanje jedan od prvih 1, 2 ili 3 bazna para unutar dupleks regiona od 5'-kraja antisens lanca je AU bazni par. Na primer, prvi bazni par unutar dupleks regiona od 5'-kraja antisens lanca je AU bazni par.
[0485] U drugom slučaju, nukleotid na 3'-kraju sens lanca je deoksi-timin (dT). U drugom slučaju, nukleotid na 3'-kraju antisens lanca je deoksi-timin (dT). U jednom slučaju, postoji kratka sekvenca deoksi-timin nukleotida, na primer, dva dT nukleotida na 3'-kraju sens lanca i/ili antisens lanca.
[0486] U jednom slučaju, sekvenca sens lanca se može predstaviti formulom (I):
5' np-Na-(X X X )i-Nb-Y Y Y -Nb-(Z Z Z )j-Na-nq3' (I)
gde je:
i i j svaki nezavisno 0 ili 1;
p i q svaki nezavisno 0-6;
svaki Nanezavisno predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja se sastoji od 0-25 modifikovanih nukleotida, pri čemu svaka sekvenca sadrži najmanje dva različito modifikovana nukleotida;
svaki Nbnezavisno predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja se sastoji od 0-10 modifikovanih nukleotida;
svaki npi nqnezavisno predstavlja nukleotid izbočine;
pri čemu Nb i Y nemaju istu modifikaciju; i
XXX, YYY i ZZZ svaki nezavisno predstavljaju jedan motiv od tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida. Poželjno je da YYY budu svi 2'-F modifikovani nukleotidi.
[0487] U jednom slučaju, Nai/ili Nbsastoje se od modifikacija naizmeničnog obrasca.
[0488] U jednom slučaju, motiv YYY se javlja na mestu cepanja sens lanca ili blizu njega. Na primer, kada RNKi agens ima dupleks region dužine 17-23 nukleotida, motiv YYY može se javiti na mestu cepanja ili u blizini (npr.: može se javiti na pozicijama 6, 7, 8, 7, 8, 9, 8, 9, 10, 9, 10, 11, 10, 11, 12 ili 11, 12, 13) sens lanca, brojanje počinje od 1. nukleotida od 5'-kraja; ili opcionalno, brojanje počinje od 1. uparenog nukleotida unutar dupleks regiona, od 5'-kraja.
[0489] U jednom slučaju, i je 1 i j je 0, ili i je 0 i j je 1, ili su i i j 1. Sens lanac se stoga može predstaviti sledećim formulama:
5' np-Na-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq3' (Ib);
5' np-Na-XXX-Nb-YYY-Na-nq3' (Ic);
ili
5' np-Na-XXX-Nb-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq3' (Id).
[0490] Kada je sens lanac predstavljen formulom (Ib), Nbpredstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja se sastoji od 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 ili 0 modifikovanih nukleotida. Svaki Nanezavisno može da predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja se sastoji od 2-20, 2-15, ili 2-10 modifikovanih nukleotida.
[0491] Kada je sens lanac predstavljen kao formula (Ic), Nbpredstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja se sastoji od 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 ili 0 modifikovanih nukleotida. Svaki Nanezavisno može da predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja se sastoji od 2-20, 2-15, ili 2-10 modifikovanih nukleotida.
[0492] Kada je sens lanac predstavljen kao formula (Id), svaki Nbnezavisno predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja se sastoji od 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 ili 0 modifikovanih nukleotida. Poželjno je da Nbbude 0, 1, 2, 3, 4, 5 ili 6. Svaki Nanezavisno može da predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja se sastoji od 2-20, 2-15, ili 2-10 modifikovanih nukleotida.
[0493] Svaki od X, Y i Z može biti isti ili različit jedan od drugog.
[0494] U drugim slučajevima, i je 0 i j je 0, a sens lanac može biti predstavljen formulom:
5' np-Na-YYY- Na-nq3' (Ia).
[0495] Kada je sens lanac predstavljen formulom (Ia), svaki Nanezavisno može da predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja se sastoji od 2-20, 2-15, ili 2-10 modifikovanih nukleotida.
[0496] U jednom slučaju, sekvenca antisens lanca RNKi može biti predstavljena formulom (II):
5' nq'-Na'-(Z'Z'Z')k-Nd'-Y'Y''Y'-Nd'-(X'X'X')l-N'a-np' 3' (II)
gde je:
k i l svaki nezavisno 0 ili 1;
p' i q' svaki nezavisno 0-6;
svaki Na' nezavisno predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja se sastoji od 0-25 modifikovanih nukleotida, pri čemu svaka sekvenca sadrži najmanje dva različito modifikovana nukleotida;
svaki Nb' nezavisno predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja se sastoji od 0-10 modifikovanih nukleotida;
svaki np' i ng' nezavisno predstavljaju nukleotid izbočine;
pri čemu Nb' i Y' nemaju istu modifikaciju;
i
X'X'X', Y'Y'Y' i Z'Z'Z' svaki nezavisno predstavljaju jedan motiv od tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida.
[0497] U jednom slučaju, Na' i/ili Nb' sastoje se od modifikacija naizmeničnog obrasca.
[0498] Motiv Y'Y'Y' javlja se na mestu cepanja ili blizu njega u antisens lancu. Na primer, kada RNKi agens ima dupleks region dužine 17-23 nukleotida, motiv Y'Y'Y' može se javiti na pozicijama 9, 10, 11; 10, 11, 12; 11, 12, 13; 12, 13, 14; ili 13, 14, 15 antisens lanca, brojanje počinje od 1. nukleotida, od 5'-kraja; ili opcionalno, brojanje počinje od 1. uparenog nukleotida unutar dupleks regiona, od 5'-kraja. Poželjno je da se motiv Y'Y'Y' javlja na pozicijama 11, 12, 13.
[0499] U jednom slučaju, motiv Y'Y'Y' su svi 2'-OMe modifikovani nukleotidi.
[0500] U jednom slučaju, k je 1 i l je 0, ili k je 0 i l je 1, ili su i k i l 1.
[0501] Antisens lanac se stoga može predstaviti sledećim formulama:
5' nq'-Na'-Z'Z'Z'-Nb'-Y'Y'Y'-Na'-np'3' (IIb);
5' nq'-Na'-Y'Y'Y'-Nb'-X'X'X'-np'3' (IIc);
ili
5' nq'-Na'- Z'Z'Z'-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'- X'X'X'-Na'-np'3' (IId).
[0502] Kada je antisens lanac predstavljen formulom (IIb), Nb' predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja se sastoji od 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 ili 0 modifikovanih nukleotida. Svaki Na' nezavisno predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja se sastoji od 2-20, 2-15, ili 2-10 modifikovanih nukleotida.
[0503] Kada je antisens lanac predstavljen kao formula (IIc), Nb' predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja se sastoji od 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 ili 0 modifikovanih nukleotida. Svaki Na' nezavisno predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja se sastoji od 2-20, 2-15, ili 2-10 modifikovanih nukleotida.
[0504] Kada je antisens lanac predstavljen kao formula (IId), svaki Nb' nezavisno predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja se sastoji od 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 ili 0 modifikovanih nukleotida. Svaki Na' nezavisno predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja se sastoji od 2-20, 2-15, ili 2-10 modifikovanih nukleotida. Poželjno je da Nbbude 0, 1, 2, 3, 4, 5 ili 6.
[0505] U drugim slučajevima, k je 0 i l je 0, a antisens lanac može biti predstavljen formulom:
5' np'-Na'-Y'Y'Y'-Na'-nq'3' (Ia).
[0506] Kada je antisens lanac predstavljen kao formula (IIa), svaki Na' nezavisno predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja se sastoji od 2-20, 2-15, ili 2-10 modifikovanih nukleotida.
[0507] Svaki od X', Y' i Z' može biti isti ili različit jedan od drugog.
[0508] Svaki nukleotid sens lanca i antisens lanca može biti nezavisno modifikovan sa LNA, HNA, CeNA, 2'-metoksietil, 2'-O-metil, 2'-O-alil, 2'-C-alil, 2'-hidroksil, ili 2'-fluoro. Na primer, svaki nukleotid sens lanca i antisens lanca je nezavisno modifikovan sa 2'-O-metil ili 2'-fluoro. Svaki X, Y, Z, X', Y' i Z', posebno, mogu predstavljati 2'-O-metil modifikaciju ili 2'-fluoro modifikaciju.
[0509] U jednom slučaju, sens lanac RNKi agensa može da sadrži motiv YYY koji se javlja na pozicijama 9, 10 i 11 lanca kada je dupleks region 21 nt, pri čemu brojanje počinje od 1. nukleotida od 5'-kraja, ili opcionalno, brojanje počinje od 1. uparenog nukleotida unutar dupleks regiona, od 5'-kraja; a Y predstavlja 2'-F modifikaciju. Sens lanac može dodatno da sadrži motiv XXX ili motiv ZZZ kao periferne modifikacije na suprotnom kraju dupleks regiona; a XXX i ZZZ svaki nezavisno predstavljaju 2'-OMe modifikaciju ili 2'-F modifikaciju.
[0510] U jednom slučaju, antisens lanac može da sadrži motiv Y'Y'Y' koji se javlja na pozicijama 11, 12, 13 lanca, pri čemu brojanje počinje od 1. nukleotida od 5'-kraja, ili opcionalno, brojanje počinje od 1. uparenog nukleotida unutar dupleks regiona, od 5'-kraja; a Y' predstavlja 2'-O-metil modifikaciju. Antisens lanac može dodatno da sadrži motiv X'X'X' ili motiv Z'Z'Z' kao periferne modifikacije na suprotnom kraju dupleks regiona; a X'X'X' i Z'Z'Z' svaki nezavisno predstavljaju 2'-OMe modifikaciju ili 2'-F modifikaciju.
[0511] Sens lanac predstavljen bilo kojom od gore navedenih formula (Ia), (Ib), (Ic) i (Id) formira dupleks sa antisens lancem koji je predstavljen bilo kojom od formula (IIa), (IIb), (IIc) i (IId), respektivno.
[0512] Shodno tome, RNKi agensi za upotrebu u metodama objave mogu da sadrže sens lanac i antisens lanac, pri čemu svaki lanac ima 14 do 30 nukleotida, a RNKi dupleks je predstavljen formulom (III):
gde je:
i, j, k i l svaki nezavisno 0 ili 1;
p, p', q i q' svaki nezavisno 0-6;
svaki Nai Na<'>nezavisno predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja se sastoji od 0-25 modifikovanih nukleotida, pri čemu svaka sekvenca sadrži najmanje dva različito modifikovana nukleotida;
svaki Nbi Nb<'>nezavisno predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja se sastoji od 0-10 modifikovanih nukleotida;
pri čemu
svaki np', np, nq' i nq, od kojih svaki može biti prisutan ili ne, nezavisno predstavljaju nukleotid izbočine; i
XXX, YYY, ZZZ, X'X'X', Y'Y'Y' i Z'Z'Z' svaki nezavisno predstavljaju jedan motiv od tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida.
[0513] U jednom slučaju, i je 0 i j je 0; ili i je 1 i j je 0; ili i je 0 i j je 1; ili su i i j 0; ili su i i j 1. U drugom slučaju, k je 0 i l je 0; ili k je 1 i l je 0; k je 0 i l je 1; ili su i k i l 0; ili su i k i l 1.
[0514] Primerne kombinacije sens lanca i antisens lanca koje formiraju RNKi dupleks uključuju formule ispod:
5'np- Na-Y Y Y -Na-nq3' 3'np<'>-Na<'>-Y'Y'Y'-Na<'>nq<'>5' (IIIa)
5'np-Na-YY Y -Nb-Z Z Z -Na-nq3' 3' np<'>-Na<'>-Y''Y'Y'-Nb<'>-Z'Z'Z'-Na<'>nq<'>5' (IIIb)
5' np-Na- X X X -Nb-Y Y Y - Na-nq3' 3' np<'>-Na<'>-X'X'X'-Nb<'>-Y''YY'-Na<'>-nq<'>5' (IIIc)
5'np-Na-X X X -Nb-Y Y Y -Nb- Z Z Z -Na-nq3' 3' np<'>-Na<'>-X'X'X'-Nb<'>-Y''Y''Y'-Nb<'>-Z'Z'Z'-Na-nq<'>5' (IIId)
5' - Na-Y Y Y -Na- 3' 3' np<'>-Na<'>-Y'Y'Y' -Na<'>5' (IIIe)
[0515] Kada je RNKi agens predstavljen formulom (IIIa), svaki Nanezavisno predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja se sastoji od 2-20, 2-15, ili 2-10 modifikovanih nukleotida.
[0516] Kada je RNKi agens predstavljen formulom (IIIb), svaki Nbnezavisno predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja se sastoji od 1-10, 1-7, 1-5 ili 1-4 modifikovanih nukleotida. Svaki Nanezavisno predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja se sastoji od 2-20, 2-15, ili 2-10 modifikovanih nukleotida.
[0517] Kada je RNKi agens predstavljen kao formula (IIIc), svaki Nb, Nb' nezavisno predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja se sastoji od 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 ili 0 modifikovanih nukleotida. Svaki Nanezavisno predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja se sastoji od 2-20, 2-15, ili 2-10 modifikovanih nukleotida.
[0518] Kada je RNKi agens predstavljen kao formula (IIId), svaki Nb, Nb' nezavisno predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja se sastoji od 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 ili 0 modifikovanih nukleotida. Svaki Na, Na<'>nezavisno predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja se sastoji od 2-20, 2-15, ili 2-10 modifikovanih nukleotida. Svaki od Na, Na', Nbi Nb<'>nezavisno sadrži modifikacije naizmeničnog obrasca.
[0519] Kada je RNKi agens predstavljen kao formula (IIId), svaki Nb, Nb' nezavisno predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja se sastoji od 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 ili 0 modifikovanih nukleotida. Svaki Na, Na<'>nezavisno predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja se sastoji od 2-20, 2-15, ili 2-10 modifikovanih nukleotida. Svaki od Na, Na', Nbi Nb<'>nezavisno sadrži modifikacije naizmeničnog obrasca.
[0520] Kada je RNKi agens predstavljen kao formula (IIIe), svaki Nai Na' nezavisno predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja se sastoji od 0-25 nukleotida koji su ili modifikovani ili nemodifikovani ili kombinacije istih, pri čemu svaka sekvenca sadrži najmanje dva različito modifikovana nukleotida.
[0521] Svaki od X, Y i Z u formulama (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc), (IIId) i (IIIe) može biti isti ili različit od drugih.
[0522] Kada je RNKi agens predstavljen formulom (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc), (IIId) i (IIIe) najmanje jedan od Y nukleotida može formirati bazni par sa jednim od Y' nukleotida. Alternativno, najmanje dva od Y nukleotida formiraju bazne parove sa odgovarajućim Y' nukleotidima; ili sva tri Y nukleotida formiraju bazne parove sa odgovarajućim Y' nukleotidima.
[0523] Kada je RNKi agens predstavljen formulom (IIIb) ili (IIId), najmanje jedan od Z nukleotida može da formira bazni par sa jednim od Z' nukleotida. Alternativno, najmanje dva Z nukleotida formiraju bazne parove sa odgovarajućim Z' nukleotidima; ili sva tri Z nukleotida formiraju bazne parove sa odgovarajućim Z' nukleotidima.
[0524] Kada je RNKi agens predstavljen kao formula (IIIc) ili (IIId), najmanje jedan od X nukleotida može da formira bazni par sa jednim od X' nukleotida. Alternativno, najmanje dva X nukleotida formiraju bazne parove sa odgovarajućim X' nukleotidima; ili sva tri X nukleotida formiraju bazne parove sa odgovarajućim X' nukleotidima.
[0525] U jednom slučaju, modifikacija na Y nukleotidu je različita od modifikacije na Y' nukleotidu, modifikacija na Z nukleotidu je različita od modifikacije na Z' nukleotidu, i/ili modifikacija na X nukleotidu je različita od modifikacije na X' nukleotidu.
[0526] U jednom slučaju, kada je RNKi agens predstavljen formulom (IIId), Namodifikacije su 2'-O-metil ili 2'-fluoro modifikacije. U drugom slučaju, kada je RNKi agens predstavljen formulom (IIId), Namodifikacije su 2'-O-metil ili 2'-fluoro modifikacije i np' >0 i najmanje jedan np' je povezan sa susednim nukleotidom a preko fosforotioatne veze. U još jednom slučaju, kada je RNKi agens predstavljen formulom (IIId), Namodifikacije su 2'-O-metil ili 2'-fluoro modifikacije, np' >0 i najmanje jedan np' je povezan sa susednim nukleotidom preko fosforotioatne veze, i sens lanac je konjugovan sa jednim ili više GalNAc derivata pričvršćenih preko monovalentnog, bivalentnog ili trivalentnog razgranatog linkera. U drugom slučaju, kada je RNKi agens predstavljen formulom (IIId), modifikacije su 2'-O-metil ili 2'-fluoro modifikacije, np' > 0 i najmanje jedan np' je povezan sa susednim nukleotidom preko fosforotioatne veze, sens lanac sadrži najmanje jednu fosforotioatnu vezu, i sens lanac je konjugovan sa jednim ili više GalNAc derivata pričvršćenih preko monovalentnog, bivalentnog ili trivalentnog razgranatog linkera.
[0527] U jednom slučaju, kada je RNKi agens predstavljen formulom (IIIa), Namodifikacije su 2'-O-metil ili 2'-fluoro modifikacije, np' >0 i najmanje jedan np' je povezan sa susednim nukleotidom preko fosforotioatne veze, sens lanac sadrži najmanje jednu fosforotioatnu vezu, i sens lanac je konjugovan sa jednim ili više GalNAc derivata pričvršćenih preko monovalentnog, bivalentnog ili trivalentnog razgranatog linkera.
[0528] U jednom slučaju, RNKi agens je multimer koji sadrži najmanje dva dupleksa predstavljena formulom (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc), (IIId) i (IIIe), pri čemu su dupleksi povezani linkerom. Linker može biti cepljiv ili necepljiv. Opciono, multimer dalje sadrži ligand. Svaki od dupleksa može ciljati isti gen ili dva različita gena; ili svaki od dupleksa može ciljati isti gen na dva različita ciljna mesta.
[0529] U jednom slučaju, RNKi agens je multimer koji sadrži tri, četiri, pet, šest ili više dupleksa predstavljenih formulom (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc), (IIId) i (IIIe), pri čemu su dupleksi povezani linkerom. Linker može biti cepljiv ili necepljiv. Opciono, multimer dalje sadrži ligand. Svaki od dupleksa može ciljati isti gen ili dva različita gena; ili svaki od dupleksa može ciljati isti gen na dva različita ciljna mesta.
[0530] U jednom slučaju, dva RNKi agensa predstavljena formulom (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc), (IIId) i (IIIe) povezani su jedan sa drugim na 5' kraju, i na jednom ili na oba 3' kraja i opcionalno su konjugovani sa ligandom. Svaki od agensa može ciljati isti gen ili dva različita gena; ili svaki od agensa može ciljati isti gen na dva različita ciljna mesta.
[0531] Razne publikacije opisuju multimerne RNKi agense koji se mogu koristiti u metodama ove objave. Takve publikacije uključuju WO2007/091269, američki patent br. 7858769, WO2010/141511, WO2007/117686, WO2009/014887 i WO2011/031520.
[0532] RNKi agens koji sadrži konjugacije jedne ili više ugljenohidratnih grupa sa RNKi agensom može optimizovati jedno ili više svojstava RNKi agensa. U mnogim slučajevima, ugljenohidratna grupa će biti pričvršćena na modifikovanu podjedinicu RNKi agensa. Na primer, ribozni šećer jedne ili više ribonukleotidnih podjedinica dsRNK agensa može se zameniti drugom grupom, npr. neugljenohidratnim (poželjno cikličnim) nosačem na koji je prikopčan ugljenohidratni ligand. Podjedinica ribonukleotida u kojoj je ribozni šećer podjedinice tako zamenjen ovde se naziva riboznom zamenskom modifikacionom podjedinicom (RRMS). Ciklični nosač može biti karbociklični prstenasti sistem, tj. svi atomi prstena su atomi ugljenika, ili heterociklični prstenasti sistem, tj. jedan ili više atoma prstena mogu biti heteroatom, npr. azot, kiseonik, sumpor. Ciklični nosač može biti monociklični prstenasti sistem, ili može sadržati dva ili više prstena, npr. spojene prstenove. Ciklični nosač može biti potpuno zasićeni prstenasti sistem, ili može da sadrži jednu ili više dvolančanih veza.
[0533] Ligand može biti prikopčan na polinukleotid preko nosača. Nosači uključuju (i) najmanje jednu „tačku pričvršćivanja na kičmu“, poželjno dve „tačke pričvršćivanja na kičmu“ i (ii) najmanje jednu „tačku pričvršćivanja za povesku“. „Tačka pričvršćivanja na kičmu“, kako se ovde koristi, odnosi se na funkcionalnu grupu, npr. hidroksilnu grupu, ili generalno, vezu dostupnu za, i koja je pogodna za ugradnju nosača u kičmu, npr. fosfatnu, ili modifikovanu fosfatnu, npr. kičmu koja sadrži sumpor, ribonukleinske kiseline. „Tačka pričvršćivanja za povesku“ (TAP) u nekim slučajevima se odnosi na sastavni atom prstena cikličnog nosača, npr. atom ugljenika ili heteroatom (različit od atoma koji obezbeđuje tačku pričvršćivanja na kičmu), koji povezuje odabranu grupu. Grupa može biti, npr. ugljeni hidrat, npr. monosaharid, disaharid, trisaharid, tetrasaharid, oligosaharid i polisaharid. Opciono, odabrana grupa je povezana pomoću posredne poveske sa cikličnim nosačem. Dakle, ciklični nosač će često uključivati funkcionalnu grupu, npr. amino grupu, ili generalno, obezbediti vezu, koja je pogodna za ugradnju ili pričvršćivanje drugog hemijskog entiteta, npr. liganda, na sastavni prsten.
[0534] RNKi agensi mogu biti konjugovani sa ligandom preko nosača, pri čemu nosač može biti ciklična grupa ili aciklična grupa; poželjno, ciklična grupa je odabrana iz pirolidinila, pirazolinila, pirazolidinila, imidazolinila, imidazolidinila, piperidinila, piperazinila, [1,3]dioksolana, oksazolidinila, izoksazolidinila, morfolinila, tiazolidinila, izotiazolidinila, hinoksalinila, piridazinonila, tetrahidrofurila i dekalina; poželjno, aciklična grupa je odabrana iz serinolne kičme ili dietanolaminske kičme.
[0535] U određenim specifičnim slučajevima, RNKi agens za upotrebu u metodama objave je AD-57213 (sens lanac: 5'- GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf - 3' (SEQ ID NO: 13) i antisens lanac: 5'- usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg - 3' (SEQ ID NO:14), gde su A, C, G i U riboza A, C, G ili U; a, c, g i u su 2'-O-metil (2'-OMe) A, C, G, ili U; Af, Cf, Gf ili Uf su 2'-fluoro A, C, G ili U; i s je fosforotioatna veza.
[0536] Ovi agensi mogu dalje da sadrže ligand.
Ligandi
[0537] dvolančani RNK (dsRNK) agensi ove objave mogu opcionalno biti konjugovani sa jednim ili više liganda. Ligand se može pričvrstiti na sens lanac, antisens lanac ili oba lanca, na 3'-kraju, 5'-kraju ili na oba kraja. Na primer, ligand može biti konjugovan sa sens lancem. U skladu sa predmetnim pronalaskom, ligand je konjugovan sa 3'-krajem sens lanca.
[0538] U jednom slučaju, ligand je konjugat ugljenog hidrata, kao što je monosaharid. Ligand može biti N-acetilgalaktozamin (GalNAc) ili GalNAc derivat. GalNAc ili GalNAc derivat se može pričvrstiti na iRNK agens putem monovalentnog linkera. U nekim slučajevima, GalNAc ili GalNAc derivat je pričvršćen na iRNK agens predmetnog pronalaska putem bivalentnog linkera. U drugim slučajevima, GalNAc ili GalNAc derivat je pričvršćen na iRNK agens putem trivalentnog linkera.
[0539] U jednom slučaju, konjugat ugljenog hidrata za upotrebu u kompozicijama i metodama ove objave odabran je iz grupe koja se sastoji od:
[0540] U jednom otelotvorenju, GalNAc ili GalNAc derivat je GalNAc3:
[0541] U nekim slučajevima, ligand, npr. GalNAc ligand, pričvršćen je na 3' kraj RNKi agensa. U jednom otelotvorenju, RNKi agens je konjugovan sa ligandom, npr. GalNAc ligandom, kao što je prikazano na sledećoj šemi
u kojoj je X O ili S. U jednom otelotvorenju, X je O.
[0542] Širok spektar entiteta može biti spojen sa RNKi agensima ove objave. Preferirane grupe su ligandi, koji su spojeni, po mogućnosti kovalentno, direktno ili indirektno preko posredne poveske.
[0543] U preferiranim slučajevima, ligand menja distribuciju, ciljanje ili životni vek molekula u koji je ugrađen. U preferiranim slučajevima, ligand pruža poboljšani afinitet za odabranu metu, npr. molekul, ćeliju ili tip ćelije, odeljak, receptor, npr. ćelijski ili organ odeljak, tkivo, organ ili region tela, u poređenju sa vrstom kojoj takav ligand nedostaje. Ligandi koji pružaju poboljšan afinitet za odabranu metu takođe se nazivaju ciljnim ligandima.
[0544] Neki ligandi mogu imati endosomolitička svojstva. Endosomolitički ligandi promovišu lizu endosoma i/ili transport kompozicije objave, ili njenih komponenti, iz endosoma u citoplazmu ćelije. Endosomolitički ligand može biti polianjonski peptid ili peptidomimetik koji pokazuje membransku aktivnost i fuzogenost zavisnu od pH. U jednom slučaju, endosomolitički ligand poprima svoju aktivnu konformaciju pri endosomalnom pH. „Aktivna“ konformacija je ona konformacija u kojoj endosomolitički ligand promoviše lizu endosoma i/ili transport kompozicije objave, ili njenih komponenti, iz endosoma u citoplazmu ćelije. Primereni endosomolitički ligandi uključuju GALA peptid (Subbarao et al., Biochemistry, 1987, 26: 2964-2972), EALA peptid (Vogel et al., J. Am. Chem. Soc., 1996, 118: 1581-1586), i njihove derivate (Turk et al., Biochem. Biophys. Acta, 2002, 1559: 56-68). U jednom slučaju, endosomolitička komponenta može da sadrži hemijsku grupu (npr. aminokiselinu) koja će pretrpeti promenu naelektrisanja ili protonacije kao odgovor na promenu pH. Endosomolitička komponenta može biti linearna ili razgranata.
[0545] Ligandi mogu poboljšati transport, hibridizaciju i svojstva specifičnosti, a mogu takođe poboljšati otpornost na nukleazu rezultujućeg prirodnog ili modifikovanog oligoribonukleotida, ili polimernog molekula koji sadrži bilo koju kombinaciju monomera opisanih ovde i/ili prirodnih ili modifikovanih ribonukleotida.
[0546] Ligandi generalno mogu uključivati terapeutske modifikatore, npr. za pojačavanje preuzimanja; dijagnostička jedinjenja ili reporterske grupe, npr. za praćenje distribucije; agense za umrežavanje; i grupe koje daju otpornost na nukleazu. Opšti primeri uključuju lipide, steroide, vitamine, šećere, proteine, peptide, poliamine i peptidne mimike.
[0547] Ligandi mogu uključivati supstancu koja se prirodno javlja, kao što je protein (npr. humani serumski albumin (HSA), lipoprotein niske gustine (LDL), lipoprotein visoke gustine (HDL), ili globulin); ugljeni hidrat (npr. dekstran, pululan, hitin, hitozan, inulin, ciklodekstrin ili hijaluronska kiselina); ili lipid. Ligand takođe može biti rekombinantni ili sintetički molekul, kao što je sintetički polimer, npr. sintetička poliaminokiselina, oligonukleotid (npr. aptamer). Primeri poliaminokiselina uključuju polilizin (PLL), poli L-asparaginsku kiselinu, poli L-glutaminsku kiselinu, kopolimer stiren-maleinskog anhidrida, kopolimer poli(L-laktid-koglikolid), kopolimer divinil etar-maleinskog anhidrida, kopolimer N-(2-hidroksipropil)metakrilamida (HMPA), polietilen glikol (PEG), polivinil alkohol (PVA), poliuretan, poli(2-etilakrilnu kiselinu), N-izopropilakrilamidne polimere, ili polifosfazin. Primeri poliamina uključuju: polietilenimin, polilizin (PLL), spermin, spermidin, poliamin, pseudopeptid-poliamin, peptidomimetički poliamin, dendrimer poliamin, arginin, amidin, protamin, katjonski lipid, katjonski porfirin, kvartarnu so poliamina ili alfa helikoidni peptid.
[0548] Ligandi mogu da uključe i ciljne grupe, npr. agens za ciljanje ćelija ili tkiva, npr. lektin, glikoprotein, lipid ili protein, npr. antitelo, koje se vezuje za specifični tip ćelije kao što je ćelija bubrega. Ciljna grupa može biti tirotropin, melanotropin, lektin, glikoprotein, protein surfaktanta A, ugljeni hidrat mucina, multivalentna laktoza, multivalentna galaktoza, N-acetilgalaktozamin, N-acetil-gulukozamin multivalentna manoza, multivalentna fukoza, glikozilovane poliaminokiseline, multivalentna galaktoza, transferin, bisfosfonat, poliglutamat, poliaspartat, lipid, holesterol, steroid, žučna kiselina, folat, vitamin B12, biotin, RGD peptid, RGD peptid mimetik ili aptamer.
[0549] Drugi primeri liganda uključuju boje, interkalacione agense (npr. akridine), umreživače (npr. psoralen, mitomicin C), porfirine (TPPC4, teksafirin, safirin), policiklične aromatične ugljovodonike (npr. fenazin, dihidrofenazin), veštačke endonukleaze ili helator (npr. EDTA), lipofilne molekule, npr. holesterol, holna kiselina, adamantinska sirćetna kiselina, 1-piren buterna kiselina, dihidrotestosteron, 1,3-Bis-O(heksadecil)glicerol, geraniloksiheksil grupa, heksadecilglicerol, borneol, mentol, 1,3-propanediol, heptadecil grupa, palmitinska kiselina, miristinska kiselina, O3-(oleoil)litoholna kiselina, O3-(oleoil)holenska kiselina, dimetoksitritil, ili fenoksazin) i peptidne konjugate (npr. antennapedia peptid, Tat peptid), alkilirajuće agense, fosfat, amino, merkapto, PEG (npr. PEG-40K), MPEG, [MPEG]2, poliamino, alkil, supstituisani alkil, radioobeležene markere, enzime, haptene (npr. biotin), facilitatore transporta/apsorpcije (npr. aspirin, vitamin E, folna kiselina), sintetičke ribonukleaze (npr. imidazol, bisimidazol, histamin, klasteri imidazola, akridin-imidazol konjugati, Eu3+ kompleksi tetraazamakrocikla), dinitrofenil, HRP, ili AP.
[0550] Ligandi mogu biti proteini, npr. glikoproteini, ili peptidi, npr. molekuli koji imaju specifičan afinitet za ko-ligand, ili antitela, npr. antitelo, koje se vezuje za specifični tip ćelije kao što je ćelija raka, endotelna ćelija, ili ćelija kosti. Ligandi mogu da uključe i hormone i hormonske receptore. Oni takođe mogu da uključe nepeptidne vrste, kao što su lipidi, lektini, ugljeni hidrati, vitamini, kofaktori, multivalentna laktoza, multivalentna galaktoza, N-acetilgalaktozamin, N-acetil-gulukozamin multivalentna manoza, multivalentna fukoza, ili aptameri. Ligand može biti, na primer, lipopolisaharid, aktivator p38 MAP kinaze, ili aktivator NF-κB.
[0551] Ligand može biti supstanca, npr. lek, koji može povećati preuzimanje iRNK agensa u ćeliju, na primer, remećenjem ćelijskog citoskeleta, npr. remećenjem ćelijskih mikrotubula, mikrofilamenata i/ili intermedijarnih filamenata. Lek može biti, na primer, takson, vinkristin, vinblastin, citošalazin, nokodazol, japlakinolid, latrunkulin A, faloidin, svinholid A, indanocin, ili mioservin.
[0552] Ligand može da poveća preuzimanje oligonukleotida u ćeliju, na primer, aktiviranjem inflamatornog odgovora. Primerni ligandi koji bi imali takav efekat uključuju faktor nekroze tumora alfa (TNF-alfa), interleukin-1 beta, ili gama interferon.
[0553] U jednom slučaju, ligand je lipid ili molekul na bazi lipida. Takav lipid ili molekul na bazi lipida se poželjno vezuje za protein seruma, npr. humani serumski albumin (HSA). HSA vezujući ligand omogućava distribuciju konjugata na ciljano tkivo, npr. ciljano tkivo u telu koje nije bubreg. Na primer, ciljano tkivo može biti jetra, uključujući parenhimske ćelije jetre. Drugi molekuli koji se mogu vezati za HSA takođe se mogu koristiti kao ligandi. Na primer, mogu se koristiti naproksen ili aspirin. Lipidni ili ligand na bazi lipida može (a) povećati otpornost konjugata na degradaciju, (b) povećati ciljanje ili transport u ciljnu ćeliju ili ćelijsku membranu, i/ili (c) može se koristiti za podešavanje vezivanja za protein seruma, npr. HSA.
[0554] Ligand na bazi lipida može se koristiti za modulaciju, npr. kontrolu vezivanja konjugata za ciljano tkivo. Na primer, lipid ili ligand na bazi lipida koji se jače vezuje za HSA će imati manju verovatnoću da bude ciljan na bubreg i stoga manju verovatnoću da bude očišćen iz tela. Lipid ili ligand na bazi lipida koji se slabije vezuje za HSA može se koristiti za ciljanje konjugata na bubreg.
[0555] U preferiranom slučaju, ligand na bazi lipida vezuje HSA. Poželjno, vezuje HSA sa dovoljnim afinitetom tako da će konjugat biti poželjno distribuiran u tkivo koje nije bubreg. Međutim, poželjno je da afinitet nije toliko jak da vezivanje HSA-liganda ne može biti reverzibilno.
[0556] U drugom preferiranom slučaju, ligand na bazi lipida vezuje HSA slabo ili uopšte ne, tako da će konjugat biti poželjno distribuiran u bubreg. Druge grupe koje ciljaju ćelije bubrega takođe se mogu koristiti umesto ili pored liganda na bazi lipida.
[0557] U drugom slučaju, ligand je grupa, npr. vitamin, koji preuzima ciljna ćelija, npr. proliferirajuća ćelija. Ovo je posebno korisno za lečenje poremećaja karakterisanih neželjenom proliferacijom ćelija, npr. malignim ili nemalignim tipom, npr. ćelijama raka. Primerni vitamini uključuju vitamin A, E i K. Drugi primerni vitamini uključuju B vitamine, npr. folnu kiselinu, B12, riboflavin, biotin, piridoksal ili druge vitamine ili nutrijente koje preuzimaju ćelije raka. Takođe su uključeni HSA, lipoprotein niske gustine (LDL) i lipoprotein visoke gustine (HDL).
[0558] U drugom slučaju, ligand je agens za permeaciju ćelija, po mogućnosti helikoidni agens za permeaciju ćelija. Po mogućnosti, agens je amfipatičan. Primereni agens je peptid kao što je tat ili antennapedia. Ako je agens peptid, može biti modifikovan, uključujući peptidomimetik, invertomere, nepeptidne ili pseudo-peptidne veze, i upotrebu D-aminokiselina. Helikoidni agens je po mogućnosti alfa-helikoidni agens, koji po mogućnosti ima lipofilnu i lipofobnu fazu.
[0559] Ligand može biti peptid ili peptidomimetik. Peptidomimetik (takođe nazvan oligopeptidomimetik) je molekul sposoban da se savije u definisanu trodimenzionalnu strukturu sličnu prirodnom peptidu. Peptidna ili peptidomimetička grupa može biti dugačka oko 5-50 aminokiselina, npr. oko 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, ili 50 aminokiselina. Peptid ili peptidomimetik može biti, na primer, peptid za permeaciju ćelija, katjonski peptid, amfipatični peptid, ili hidrofobni peptid (npr. koji se sastoji prvenstveno od Tyr, Trp ili Phe). Peptidna grupa može biti dendrimer peptid, ograničeni peptid ili umreženi peptid. U drugoj alternativi, peptidna grupa može da uključuje hidrofobnu sekvencu translokacije membrane (MTS). Primereni hidrofobni MTS-sadržeći peptid je RFGF koji ima sekvencu aminokiselina AAVALLPAVLLALLAP(SEQ ID NO: 9). RFGF analog (npr. sekvenca aminokiselina AALLPVLLAAP (SEQ ID NO: 10)) koji sadrži hidrofobnu MTS takođe može biti ciljna grupa. Peptidna grupa može biti „isporučujući“ peptid, koji može da prenosi velike polarne molekule uključujući peptide, oligonukleotide i protein preko ćelijskih membrana. Na primer, sekvence iz HIV Tat proteina (GRKKRRQRRRPPQ (SEQ ID NO: 11)) i Drosophila Antennapedia proteina (RQIKIWFQNRRMKWKK (SEQ ID NO: 12)) su, kako je utvrđeno, sposobne da funkcionišu kao isporučivački peptidi. Peptid ili peptidomimetik može biti kodiran slučajnom sekvencom DNK, kao što je peptid identifikovan iz fag-displej biblioteke, ili kombinatorne biblioteke jedna-kuglica-jedno-jedinjenje (OBOC) (Lam et al., Nature, 354:82-84, 1991). Poželjno je da peptid ili peptidomimetik pričvršćen na iRNK agens preko ugrađene monomerne jedinice bude peptid za ciljanje ćelija kao što je peptid arginin-glicin-asparaginska kiselina (RGD)-peptid, ili RGD mimik. Dužina peptidne grupe može da varira od oko 5 aminokiselina do oko 40 aminokiselina. Peptidne grupe mogu da imaju strukturnu modifikaciju, na primer da bi se povećala stabilnost ili usmerila konformaciona svojstva. Bilo koja od strukturnih modifikacija opisanih u nastavku može se koristiti. RGD peptidna grupa može da se koristi za ciljanje tumorske ćelije, kao što je endotelna tumorska ćelija ili tumorska ćelija raka dojke (Zitzmann et al., Cancer Res., 62:5139-43, 2002). RGD peptid može olakšati ciljanje iRNK agensa na tumore raznih drugih tkiva, uključujući pluća, bubreg, slezinu ili jetru (Aoki et al., Cancer Gene Therapy 8:783-787, 2001). Poželjno, RGD peptid će olakšati ciljanje iRNK agensa na bubreg. RGD peptid može biti linearan ili cikličan, i može biti modifikovan, npr. glikozilovan ili metilovan kako bi se olakšalo ciljanje na specifična tkiva. Na primer, glikozilovani RGD peptid može isporučiti iRNK agens tumorskoj ćeliji koja eksprimira αVß3 (Haubner et al., Jour. Nucl. Med., 42:326-336, 2001). Mogu se koristiti peptidi koji ciljaju markere obogaćene u proliferirajućim ćelijama. Na primer, peptidi koji sadrže RGD i peptidomimetici mogu ciljati ćelije raka, posebno ćelije koje pokazuju integrin. Dakle, može se koristiti RGD peptidi, ciklični peptidi koji sadrže RGD, RGD peptidi koji uključuju D-aminokiseline, kao i sintetički RGD mimici. Pored RGD, mogu se koristiti i druge grupe koje ciljaju ligand integrina. Generalno, takvi ligandi se mogu koristiti za kontrolu proliferirajućih ćelija i angiogeneze. Preferirani konjugati ovog tipa liganda ciljaju PECAM-1, VEGF, ili drugi gen raka, npr. gen raka opisan ovde.
[0560] „Peptid za permeaciju ćelija“ je sposoban da permeira ćeliju, npr. mikrobiološku ćeliju, kao što je bakterijska ili gljivična ćelija, ili ćeliju sisara, kao što je ljudska ćelija. Mikrobiološki peptid za permeaciju ćelija može biti, na primer, α-helikoidni linearni peptid (npr. LL-37 ili Ceropin P1), peptid koji sadrži disulfidnu vezu (npr. α-defensin, β-defensin ili baktenecin), ili peptid koji sadrži samo jednu ili dve dominantne aminokiseline (npr. PR-39 ili indolicidin). Peptid za permeaciju ćelija takođe može uključivati signal nuklearne lokalizacije (NLS). Na primer, peptid za permeaciju ćelija može biti bipartitni amfipatični peptid, kao što je MPG, koji je izveden iz fuzionog peptidnog domena HIV-1 gp41 i NLS SV40 velikog T antigena (Simeoni et al., Nucl. Acids Res.31:2717-2724, 2003).
[0561] U jednom slučaju, ciljni peptid može biti amfipatični α-helikoidni peptid. Primereni amfipatični α-helikoidni peptidi uključuju, ali nisu ograničeni na, cekropine, likotoksine, paradaksine, buforin, CPF, peptid sličan bombininu (BLP), katelicidine, ceratotoksine, S. clava peptide, antimikrobne peptide crevnog trakta morske jegulje (HFIAPs), magainine, brevinine-2, dermaseptine, melitine, pleurocidin, H2A peptide, Xenopus peptide, eskulentinis-1 i kaerine. Određeni broj faktora će se po mogućnosti uzeti u obzir da bi se održao integritet stabilnosti heliksa. Na primer, koristiće se maksimalan broj ostataka za stabilizaciju heliksa (npr. leu, ala, ili lys), i minimalan broj ostataka za destabilizaciju heliksa (npr. prolin, ili ciklične monomerne jedinice. Razmotriće se kapirajući ostatak (na primer, Gly je primereni N-kapirajući ostatak i/ili C-terminalna amidacija može se koristiti da obezbedi dodatnu H-vezu za stabilizaciju heliksa. Formiranje slanih mostova između ostataka sa suprotnim naelektrisanjima, razdvojenih pozicijama i ± 3, ili i ± 4, može pružiti stabilnost. Na primer, katjonski ostaci kao što su lizin, arginin, homo-arginin, ornitin ili histidin mogu formirati slane mostove sa anjonskim ostacima glutamatom ili aspartatom.
[0562] Peptidni i peptidomimetički ligandi uključuju one sa prirodno nastalim ili modifikovanim peptidima, npr. D ili L peptidi; α, β, ili γ peptidi; N-metil peptidi; azapeptidi; peptidi koji imaju jednu ili više amidnih, tj. peptidnih veza zamenjenih sa jednom ili više urea, tiourea, karbamatnih ili sulfonil urea veza; ili ciklični peptidi.
[0563] Ciljni ligand može biti bilo koji ligand koji je sposoban da cilja specifični receptor. Primeri su: folat, GalNAc, galaktoza, manoza, manoza-6P, klasteri šećera kao što su GalNAc klaster, manoza klaster, galaktoza klaster, ili aptamer. Klaster je kombinacija dve ili više šećernih jedinica. Ciljni ligandi takođe uključuju ligande integrinskog receptora, ligande hemokinskog receptora, transferin, biotin, ligande serotoninskog receptora, PSMA, endotelin, GCPII, somatostatin, LDL i HDL ligande. Ligandi takođe mogu biti zasnovani na nukleinskoj kiselini, npr. aptameru. Aptamer može biti nemodifikovan ili imati bilo koju kombinaciju modifikacija obelodanjenih ovde.
[0564] Agensi za oslobađanje endosoma uključuju imidazole, poli ili oligoimidazole, PEI, peptide, fuzogene peptide, polikarboksilate, polikacione, maskirane oligo ili poli katione ili anjone, acetale, poliacetale, ketale/poliketale, ortoestre, polimere sa maskiranim ili nemaskiranim katjonskim ili anjonskim naelektrisanjima, dendrimere sa maskiranim ili nemaskiranim katjonskim ili anjonskim naelektrisanjima.
[0565] PK modulator označava farmakokinetički modulator. PK modulatori uključuju lipofile, žučne kiseline, steroide, analoge fosfolipida, peptide, agense koji se vezuju za proteine, PEG, vitamine, itd. Primereni PK modulatori uključuju, ali nisu ograničeni na, holesterol, masne kiseline, holnu kiselinu, litoholnu kiselinu, dialkilgliceride, diacilglicerid, fosfolipide, sfingolipide, naproksen, ibuprofen, vitamin E, biotin, itd. Oligonukleotidi koji se sastoje od niza fosforotioatnih veza takođe su poznati po tome da se vezuju za serumski protein, pa su kratki oligonukleotidi, npr. oligonukleotidi od oko 5 baza, 10 baza, 15 baza ili 20 baza, koji sadrže višestruke fosforotioatne veze u kičmi, takođe pogodni za objavu kao ligandi (npr. kao PK modulišući ligandi).
[0566] Pored toga, aptameri koji se vezuju za komponente seruma (npr. proteine seruma) takođe su pogodni za objavu kao PK modulišući ligandi.
[0567] Drugi konjugati liganda pogodni za objavu opisani su u američkim patentnim prijavama USSN: 10/916,185, podnetoj 10. avgusta 2004; USSN: 10/946,873, podnetoj 21. septembra 2004; USSN: 10/833,934, podnetoj 3. avgusta 2007; USSN: 11/115,989 podnetoj 27. aprila 2005 i USSN: 11/944,227 podnetoj 21. novembra 2007.
[0568] Kada su prisutna dva ili više liganda, svi ligandi mogu imati ista svojstva, svi mogu imati različita svojstva ili neki ligandi imaju ista svojstva dok drugi imaju različita. Na primer, ligand može imati ciljna svojstva, endosomolitičku aktivnost ili svojstva PK modulacije. U preferiranom slučaju, svi ligandi imaju različita svojstva.
[0569] Ligandi se mogu spajati sa oligonukleotidima na različitim mestima, na primer, na 3'-kraju, 5'-kraju, i/ili na unutrašnjoj poziciji. U preferiranim slučajevima, ligand je pričvršćen na oligonukleotide preko posredne poveske, npr. nosača opisanog ovde. Ligand ili ligand sa poveskom može biti prisutan na monomeru kada je monomer ugrađen u rastući lanac. U nekim slučajevima, ligand može biti ugrađen preko vezivanja za „prekursor“ monomer nakon što je „prekursor“ monomer ugrađen u rastući lanac. Na primer, monomer koji ima, npr. aminozavršenu povesku (tj. koja nema pridruženi ligand), npr. TAP-(CH2)nNH2može biti ugrađen u rastući oligonukleotidni lanac. U naknadnoj operaciji, tj. nakon ugradnje prekursor monomera u lanac, ligand koji ima elektrofilnu grupu, npr. pentafluorofenil estar ili aldehidnu grupu, može naknadno biti pričvršćen na prekursor monomer spajanjem elektrofilne grupe liganda sa terminalnom nukleofilnom grupom poveske prekursor monomera.
[0570] U drugom primeru, monomer koji ima hemijsku grupu pogodnu za učešće u reakciji klik hemije može biti ugrađen, npr. poveska/linker završen azidom ili alkinom. U naknadnoj operaciji, tj. nakon ugradnje prekursor monomera u lanac, ligand koji ima komplementarnu hemijsku grupu, npr. alkin ili azid, može biti pričvršćen na prekursor monomer spajanjem alkina i azida zajedno.
[0571] Za dvolančane oligonukleotide, ligandi se mogu pričvrstiti na jedan ili oba lanca. U nekim otelotvorenjima, dvolančani iRNK agens sadrži ligand konjugovan sa sens lancem. U drugim slučajevima, dvolančani iRNK agens sadrži ligand konjugovan sa antisens lancem.
[0572] U nekim slučajevima, ligand se može konjugovati sa nukleobazama, šećernim grupama ili internukleozidnim vezama molekula nukleinske kiseline. Konjugacija sa purinskim nukleobazama ili njihovim derivatima može se javiti na bilo kojoj poziciji, uključujući endociklične i egzociklične atome. U nekim slučajevima, 2-, 6-, 7- ili 8-pozicije purinske nukleobaze su pričvršćene na konjugatnu grupu. Konjugacija sa pirimidinskim nukleobazama ili njihovim derivatima takođe se može javiti na bilo kojoj poziciji. U nekim slučajevima, 2-, 5- i 6-pozicije pirimidinske nukleobaze mogu biti supstituisane konjugatnom grupom. Konjugacija sa šećernim grupama nukleozida može se javiti na bilo kom atomu ugljenika. Primeri atoma ugljenika šećerne grupe koji mogu biti pričvršćeni na konjugatnu grupu uključuju 2', 3' i 5' atome ugljenika. 1' pozicija takođe može biti pričvršćena na konjugatnu grupu, kao što je u abazičnom ostatku. Internukleozidne veze takođe mogu nositi konjugatne grupe. Za veze koje sadrže fosfor (npr. fosfodiester, fosforotioat, fosforoditiotat, fosforoamidat, i slično), konjugatna grupa može biti pričvršćena direktno na atom fosfora ili na O, N, ili S atom vezan za atom fosfora. Za internukleozidne veze koje sadrže amin ili amid (npr. PNK), konjugatna grupa može biti pričvršćena na atom azota amina ili amida ili na susedni atom ugljenika.
[0573] Može se koristiti bilo koji pogodan ligand u polju RNK interferencije, iako je ligand obično ugljeni hidrat, npr. monosaharid (kao što je GalNAc), disaharid, trisaharid, tetrasaharid, polisaharid.
[0574] Linkeri koji konjuguju ligand sa nukleinskom kiselinom uključuju one o kojima je bilo reči gore. Na primer, ligand može biti jedan ili više GalNAc (N-acetilglukozamin) derivata pričvršćenih preko monovalentnog, bivalentnog ili trivalentnog razgranatog linkera.
[0575] U jednom slučaju, dsRNK iz ove objave je konjugovana sa bivalentnim i trivalentnim razgranatim linkerima koji uključuju strukture prikazane u bilo kojoj od formula (IV) - (VII):
<Formula (V)>, Formula (VI)
ili
Formula (VII)
gde je:
q<2A>, q<2B>, q<3A>, q<3B>, q4<A>, q<4B>, q<5A>, q<5B>i q<5C>predstavljaju nezavisno za svako pojavljivanje 0-20, i gde ponavljajuća jedinica može biti ista ili različita;
P<2A>P<2B>, P<3A>, P<3B>, P<4A>, P<4B>, P<5A>, P<5B>, P<5C>, T<2A>, T<2B>, T<3A>, T<3B>, T<4A>, T<4B>, T<4A>, T<5B>, T<5C>su svaki nezavisno za svako pojavljivanje odsutni, CO, NH, O, S, OC(O), NHC(O), CH2, CH2NH ili CH2O;
Q<2A>, Q<2B>, Q<3A>, Q<3B>, Q<4A>, Q<4B>, Q<5A>, Q<5B>, Q<5C>su nezavisno za svako pojavljivanje odsutni, alkilen, supstituisani alkilen, pri čemu jedan ili više metilena mogu biti prekinuti ili završeni sa jednim ili više O, S, S(O), SO2, N(R<N>), C(R')=C(R"), C≡C ili C(O);
R<2A>, R<2B>, R<3A>, R<3B>, R<4A>, R<4B>, R<5A>, R<5B>, R<5C>su svaki nezavisno za svako pojavljivanje odsutni,
ili heterociklil;
L<2A>, L<2B>, L<3A>, L<3B>, L<4A>, L<4B>, L<5A>, L<5B>i L<5C>predstavljaju ligand; tj. svaki nezavisno za svako pojavljivanje monosaharid (kao što je GalNAc), disaharid, trisaharid, tetrasaharid, oligosaharid, ili polisaharid; i
R<a>H ili bočni lanac aminokiseline.
[0576] Trivalentni konjugujući GalNAc derivati su posebno korisni za upotrebu sa RNKi agensima za inhibiciju ekspresije ciljnog gena, kao što su oni iz formule (VII):
Formula (VII)
pri čemu L<5A>, L<5B>i L<5C>predstavljaju monosaharid, kao što je GalNAc derivat. Primeri pogodnih bivalentnih i trivalentnih razgranatih grupa linkera koji konjuguju GalNAc derivate uključuju, ali nisu ograničeni na, sledeća jedinjenja:
[0577] Reprezentativni američki patenti koji podučavaju pripremu konjugata RNK uključuju, ali nisu ograničeni na, američke patente br. 4,828,979; 4,948,882; 5,218,105; 5,525,465; 5,541,313; 5,545,730; 5,552,538; 5,578,717, 5,580,731; 5,591,584; 5,109,124; 5,118,802; 5,138,045; 5,414,077; 5,486,603; 5,512,439; 5,578,718; 5,608,046; 4,587,044; 4,605,735; 4,667,025; 4,762,779; 4,789,737; 4,824,941; 4,835,263; 4,876,335; 4,904,582; 4,958,013; 5,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5,245,022; 5,254,469; 5,258,506; 5,262,536; 5,272,250; 5,292,873; 5,317,098; 5,371,241, 5,391,723; 5,416,203, 5,451,463; 5,510,475; 5,512,667; 5,514,785; 5,565,552; 5,567,810; 5,574,142; 5,585,481; 5,587,371; 5,595,726; 5,597,696; 5,599,923; 5,599,928 i 5,688,941; 6,294,664; 6,320,017; 6,576,752; 6,783,931; 6,900,297; 7,037,646; 8,106,022.
[0578] Nije neophodno da sve pozicije u datom jedinjenju budu uniformno modifikovane, i zapravo više od jedne od gore navedenih modifikacija može biti ugrađeno u jedno jedinjenje ili čak na jedan nukleozid unutar iRNK. Ova objava takođe uključuje iRNK jedinjenja koja su himerna jedinjenja.
[0579] „Himerna“ iRNK jedinjenja ili „himere“, u kontekstu ove objave, su iRNK jedinjenja, po mogućstvu dsRNK, koja sadrže dva ili više hemijski različitih regiona, od kojih se svaki sastoji od najmanje jedne monomerne jedinice, tj. nukleotida u slučaju dsRNK jedinjenja. Ove iRNK tipično sadrže najmanje jedan region u kome je RNK modifikovana tako da iRNK dobija povećanu otpornost na degradaciju nukleaze, povećano ćelijsko preuzimanje, i/ili povećan afinitet vezivanja za ciljnu nukleinsku kiselinu. Dodatni region iRNK može služiti kao supstrat za enzime sposobne da cepaju hibride RNK:DNK ili RNK:RNK. Na primer, RNase H je jedna ćelijska endonukleaza koja cepa RNK lanac RNK:DNK dupleksa. Aktivacija RNase H, stoga, rezultira cepanjem RNK mete, čime se u velikoj meri pojačava efikasnost iRNK inhibicije ekspresije gena. Konsekventno, uporedivi rezultati se često mogu dobiti sa kraćim iRNK kada se koriste himerne dsRNK, u poređenju sa fosforotioatnim deoksi dsRNK koje hibridizuju sa istim ciljnim regionom. Cepanje RNK mete se rutinski može detektovati gel elektroforezom i, ako je potrebno, srodnim tehnikama hibridizacije nukleinske kiseline poznatim u struci.
[0580] U određenim slučajevima, RNK iRNK može biti modifikovana neligandnom grupom. Jedan broj neligandnih molekula je konjugovan sa iRNK kako bi se pojačala aktivnost, ćelijska distribucija ili ćelijsko preuzimanje iRNK, a procedure za izvođenje takvih konjugacija su dostupne u naučnoj literaturi. Takve neligandne grupe uključivale su lipidne grupe, kao što su holesterol (Kubo, T. et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 2007, 365(1):54-61; Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86:6553), holnu kiselinu (Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1994, 4:1053), tioetar, npr. heksil-S-tritiltiol (Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660:306; Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3:2765), tioholesterol (Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20:533), alifatični lanac, npr. dodekandiol ili undecil ostaci (Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10:111; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259:327; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75:49), fosfolipid, npr. di-heksadecil-rac-glicerol ili trietilamonijum 1,2-di-O-heksadecil-rac-glicero-3-H-fosfonat (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18:3777), poliamin ili polietilen glikol lanac (Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14:969), ili adamantansku sirćetnu kiselinu (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651), palmitil grupu (Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264:229), ili oktadecilamin ili heksilamino-karbonil-oksi-holesterol grupu (Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277:923). Reprezentativni patenti Sjedinjenih Država koji podučavaju pripremu takvih RNK konjugata navedeni su gore. Tipični protokoli konjugacije uključuju sintezu RNK koja nosi aminolinker na jednoj ili više pozicija sekvence. Amino grupa se zatim reaguje sa molekulom koji se konjuguje koristeći odgovarajuće agense za spajanje ili aktivaciju. Reakcija konjugacije može se izvesti dok je RNK još uvek vezana za čvrstu podlogu ili nakon cepanja RNK, u fazi rastvora. Prečišćavanje RNK konjugata pomoću HPLC tipično daje čisti konjugat.
[0581] U nekim slučajevima, dvolančani RNKi agens iz ove objave je AD-57213.
VI. Isporuka iRNK iz pronalaska
[0582] Isporuka iRNK iz objave ćeliji, npr. ćeliji unutar subjekta, kao što je ljudski subjekt (npr. subjektu kojem je potrebna, kao što je subjekt sa poremećajem krvarenja), može se postići na više različitih načina. Na primer, isporuka se može izvršiti kontaktiranjem ćelije sa iRNK iz ove objave bilo in vitro ili in vivo. In vivo isporuka se može izvršiti direktno primenom kompozicije koja sadrži iRNK, npr. dsRNK, na subjektu. Alternativno, in vivo isporuka se može izvršiti indirektno primenom jednog ili više vektora koji kodiraju i usmeravaju ekspresiju iRNK. O ovim alternativama se dalje diskutuje u nastavku.
[0583] Generalno, bilo koja metoda isporuke molekula nukleinske kiseline (in vitro ili in vivo) može se prilagoditi za upotrebu sa iRNK iz ove objave (videti npr. Akhtar S. i Julian RL. (1992) Trends Cell. Biol.2(5):139-144 i WO94/02595). Za in vivo isporuku, faktori koje treba uzeti u obzir za isporuku iRNK molekula uključuju, na primer, biološku stabilnost isporučenog molekula, sprečavanje nespecifičnih efekata i akumulaciju isporučenog molekula u ciljanom tkivu. Nespecifični efekti iRNK mogu se svesti na minimum lokalnom primenom, na primer, direktnim injektiranjem ili implantacijom u tkivo ili topikalnom primenom preparata. Lokalna primena na mestu lečenja maksimizira lokalnu koncentraciju agensa, ograničava izloženost agensa sistemskim tkivima koja inače mogu biti oštećena agensom ili koja mogu degradirati agens, i omogućava primenu niže ukupne doze iRNK molekula. Nekoliko studija je pokazalo uspešno utišavanje gena kada je iRNK primenjena lokalno. Na primer, intraokularna isporuka VEGF dsRNK intravitrealnom injekcijom kod makaki majmuna (Tolentino, MJ., et al (2004) Retina 24:132-138) i subretinalne injekcije kod miševa (Reich, SJ., et al (2003) Mol. Vis.
9:210-216) su obe pokazale da sprečavaju neovaskularizaciju u eksperimentalnom modelu starosno povezane makularne degeneracije. Pored toga, direktno intratumoralno injektiranje dsRNK kod miševa smanjuje zapreminu tumora (Pille, J., et al (2005) Mol. Ther.11:267-274) i može produžiti preživljavanje miševa sa tumorom (Kim, WJ., et al (2006) Mol. Ther.14:343-350; Li, S., et al (2007) Mol. Ther.15:515-523). RNK interferencija je takođe pokazala uspeh sa lokalnom isporukom u CNS putem direktnog injektiranja (Dorn, G., et al. (2004) Nucleic Acids 32:e49; Tan, PH., et al (2005) Gene Ther. 12:59-66; Makimura, H., et al (2002) BMC Neurosci. 3:18; Shishkina, GT., et al (2004) Neuroscience 129:521-528; Thakker, ER., et al (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101:17270-17275; Akaneya,Y., et al (2005) J. Neurophysiol. 93:594-602) i u pluća putem intranazalne primene (Howard, KA., et al (2006) Mol. Ther.14:476-484; Zhang, X., et al (2004) J. Biol. Chem.279:10677-10684; Bitko, V., et al (2005) Nat. Med.11:50-55). Za sistemsku primenu iRNK za lečenje bolesti, RNK može biti modifikovana ili alternativno isporučena korišćenjem sistema za isporuku lekova; obe metode deluju na sprečavanju brze degradacije dsRNK endo- i ekso-nukleazama in vivo. Modifikacija RNK ili farmaceutskog nosača takođe može omogućiti ciljanje iRNK kompozicije na ciljno tkivo i izbeći nepoželjne vanciljne efekte. iRNK molekuli mogu biti modifikovani hemijskom konjugacijom sa lipofilnim grupama kao što je holesterol da bi se pojačalo ćelijsko preuzimanje i sprečila degradacija. Na primer, iRNK usmerena protiv ApoB konjugovana sa lipofilnom holesterolskom grupom je injektirana sistemski u miševe i rezultirala je utišavanjem ApoB mRNK i u jetri i u jejunumu (Soutschek, J., et al (2004) Nature 432:173-178). Pokazano je da konjugacija iRNK sa aptamerom inhibira rast tumora i posreduje regresiju tumora u mišjem modelu raka prostate (McNamara, JO., et al (2006) Nat. Biotechnol. 24:1005-1015). U alternativnom slučaju, iRNK se može isporučiti korišćenjem sistema za isporuku lekova kao što su nanočestice, dendrimeri, polimeri, lipozomi ili katjonski sistem isporuke. Pozitivno naelektrisani katjonski sistemi isporuke olakšavaju vezivanje iRNK molekula (negativno naelektrisanog) i takođe pojačavaju interakcije na negativno naelektrisanoj ćelijskoj membrani kako bi se omogućilo efikasno preuzimanje iRNK od strane ćelije. Katjonski lipidi, dendrimeri ili polimeri mogu se ili vezati za iRNK ili se mogu podstaknuti da formiraju vezikulu ili micelu (videti npr. Kim SH., et al (2008) Journal of Controlled Release 129(2):107-116) koja oblaže iRNK. Formiranje vezikula ili micela dalje sprečava degradaciju iRNK kada se primenjuje sistemski. Metode za pravljenje i primenu katjonskih-iRNK kompleksa su u potpunosti u mogućnostima stručnjaka u ovoj oblasti (videti npr. Sorensen, DR., et al (2003) J. Mol. Biol 327:761-766; Verma, UN., et al (2003) Clin. Cancer Res.9:1291-1300; Arnold, AS et al (2007) J. Hypertens.25:197-205). Neki neograničavajući primeri sistema za isporuku lekova korisnih za sistemsku isporuku iRNK uključuju DOTAP (Sorensen, DR., et al (2003), supra; Verma, UN., et al (2003), supra), Oligofectamine, „čvrste nukleinske kiseline lipidne čestice“ (Zimmermann, TS., et al (2006) Nature 441:111-114), kardiolipin (Chien, PY., et al (2005) Cancer Gene Ther.12:321-328; Pal, A., et al (2005) Int J. Oncol.26:1087-1091), polietilenimin (Bonnet ME., et al (2008) Pharm. Res. Aug 16 Epub ahead of print; Aigner, A. (2006) J. Biomed. Biotechnol. 71659), Arg-Gly-Asp (RGD) peptide (Liu, S. (2006) Mol. Pharm.3:472-487), i poliamidoamine (Tomalia, DA., et al (2007) Biochem. Soc. Trans.35:61-67; Yoo, H., et al (1999) Pharm. Res. 16:1799-1804). U nekim slučajevima, iRNK formira kompleks sa ciklodestrinom za sistemsku primenu. Metode za primenu i farmaceutske kompozicije iRNK i ciklodestrina mogu se naći u američkom patentu br.7,427,605.
A. Vektori koji kodiraju iRNK pronalaska
[0584] iRNK koja cilja Serpinc1 gen može se izraziti iz transkripcionih jedinica ubačenih u DNK ili RNK vektore (videti npr. Couture, A, et al., TIG. (1996), 12:5-10; Skillern, A., et al., Međunarodna PCT publikacija br. WO 00/22113, Conrad, Međunarodna PCT publikacija br. WO 00/22114, i Conrad, američki patent br. 6,054,299). Ekspresija može biti prolazna (reda veličine sati do nedelja) ili održana (nedelje do meseci ili duže), u zavisnosti od specifičnog konstrukta koji se koristi i ciljanog tkiva ili tipa ćelije. Ovi transgeni mogu se uneti kao linearni konstrukt, kružni plazmid, ili viralni vektor, koji može biti integrisani ili neintegrisani vektor. Transgen se takođe može konstruisati da mu se omogući da bude nasleđen kao ekstra hromozomski plazmid (Gassmann, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92:1292).
[0585] Pojedinačni lanac ili lanci iRNK mogu biti transkribovani sa promotera na ekspresionom vektoru. Tamo gde treba da se ekspresiraju dva odvojena lanca da bi se, na primer, generisala dsRNK, dva odvojena ekspresiona vektora mogu biti zajednički uneta (npr. transfekcijom ili infekcijom) u ciljanu ćeliju. Alternativno, svaki pojedinačni lanac dsRNK može biti transkribovan promoterima, od kojih su oba smeštena na istom ekspresionom plazmidu. U jednom slučaju, dsRNK je ekspresirana kao invertovani ponovljeni polinukleotidi spojeni linker polinukleotidnom sekvencom, tako da dsRNK ima strukturu stabla i petlje.
[0586] Vektori za ekspresiju iRNK su generalno DNK plazmidi ili viralni vektori. Ekspresioni vektori kompatibilni sa eukariotskim ćelijama, po mogućnosti oni kompatibilni sa kičmenjačkim ćelijama, mogu se koristiti za proizvodnju rekombinantnih konstrukata za ekspresiju iRNK kao što je ovde opisano. Ekspresioni vektori za eukariotske ćelije su dobro poznati u struci i dostupni su iz niza komercijalnih izvora. Tipično, takvi vektori su obezbeđeni sa pogodnim restrikcionim mestima za umetanje željenog segmenta nukleinske kiseline. Isporuka vektora koji ekspresiraju iRNK može biti sistemska, na primer intravenskom ili intramuskularnom primenom, primenom na ciljane ćelije eksplantirane iz pacijenta nakon čega sledi ponovno uvođenje u pacijenta, ili bilo kojim drugim sredstvom koje omogućava uvođenje u željenu ciljanu ćeliju.
[0587] iRNK ekspresioni plazmidi mogu se transfektovati u ciljane ćelije kao kompleks sa katjonskim lipidnim nosačima (npr. Oligofectamine) ili nekatjonskim nosačima na bazi lipida (npr. Transit-TKO<™>). Višestruke lipidne transfekcije za utišavanje posredovano iRNK koje ciljaju različite regione ciljane RNK tokom perioda od nedelju dana ili duže takođe su ovde predviđene. Uspešno uvođenje vektora u ćelije domaćina može se pratiti korišćenjem različitih poznatih metoda. Na primer, prolazna transfekcija može biti signalizirana reporterom, kao što je fluorescentni marker, kao što je zeleni fluorescentni protein (GFP). Stabilna transfekcija ćelija ex vivo može se osigurati korišćenjem markera koji pružaju transfektovanoj ćeliji otpornost na specifične faktore okoline (npr. antibiotike i lekove), kao što je rezistencija na higromicin B.
[0588] Sistemi viralnih vektora koji se mogu koristiti sa metodama i kompozicijama opisanim ovde uključuju, ali nisu ograničeni na, (a) adenovirusne vektore; (b) retrovirusne vektore, uključujući, ali ne ograničavajući se na, lentiviralne vektore, Moloney mišji virus leukemije, itd.; (c) adeno-povezane virusne vektore; (d) vektore virusa herpes simpleks; (e) SV 40 vektore; (f) polioma virusne vektore; (g) papiloma virusne vektore; (h) pikornavirusne vektore; (i) vektore virusa boginja kao što je ortopoks, npr. vektori virusa vakcinije, ili ptičje boginje, npr. boginje kanarinca ili boginje živine; i (j) adenovirus zavisan od pomoćnog virusa ili adenovirus bez gena. Virusi sa defektom u replikaciji takođe mogu biti prednost. Različiti vektori će se ili neće ugraditi u genom ćelija. Konstrukti mogu uključivati viralne sekvence za transfekciju, ako je to potrebno. Alternativno, konstrukt se može ugraditi u vektore sposobne za epizomalnu replikaciju, npr. EPV i EBV vektore. Konstrukti za rekombinantnu ekspresiju iRNK će generalno zahtevati regulatorne elemente, npr. promotere, pojačivače, itd., kako bi se osigurala ekspresija iRNK u ciljanim ćelijama. Druge slučajeve koje treba razmotriti za vektore i konstrukte su dalje opisane u nastavku.
[0589] Vektori korisni za isporuku iRNK će uključivati regulatorne elemente (promoter, pojačivač, itd.) dovoljne za ekspresiju iRNK u željenoj ciljanoj ćeliji ili tkivu. Regulatorni elementi mogu biti izabrani da obezbede ili konstitutivnu ili regulisanu/inducibilnu ekspresiju.
[0590] Ekspresija iRNK može se precizno regulisati, na primer, korišćenjem induktivne regulatorne sekvence koja je osetljiva na određene fiziološke regulatore, npr. nivoe glukoze u cirkulaciji, ili hormone (Docherty et al., 1994, FASEB J.8:20-24). Takvi induktivni ekspresioni sistemi, pogodni za kontrolu ekspresije dsRNK u ćelijama ili kod sisara, uključuju, na primer, regulaciju pomoću ekdizona, estrogena, progesterona, tetraciklina, hemijskih induktora dimerizacije i izopropil-beta-D-1-tiogalaktopiranozida (IPTG). Stručnjak u ovoj oblasti bi bio u mogućnosti da izabere odgovarajuću regulatornu/promotorsku sekvencu na osnovu nameravane upotrebe iRNK transgena.
[0591] Mogu se koristiti viralni vektori koji sadrže sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju iRNK. Na primer, može se koristiti retroviralni vektor (videti Miller et al., Meth. Enzymol.
217:581-599 (1993)). Ovi retroviralni vektori sadrže komponente neophodne za pravilno pakovanje viralnog genoma i integraciju u DNK ćelije domaćina. Sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju iRNK se kloniraju u jedan ili više vektora, koji olakšavaju isporuku nukleinske kiseline pacijentu. Više detalja o retroviralnim vektorima može se naći, na primer, u Boesen et al., Biotherapy 6:291-302 (1994), koji opisuje upotrebu retroviralnog vektora za isporuku mdr1 gena u hematopoetske matične ćelije kako bi se matične ćelije učinile otpornijim na hemioterapiju. Druge reference koje ilustruju upotrebu retroviralnih vektora u genskoj terapiji su: Clowes et al., J. Clin. Invest.93:644-651 (1994); Kiem et al., Blood 83:1467-1473 (1994); Salmons and Gunzberg, Human Gene Therapy 4:129-141 (1993); i Grossman and Wilson, Curr. Opin. in Genetics and Devel. 3:110-114 (1993). Lentiviralni vektori predviđeni za upotrebu uključuju, na primer, vektore zasnovane na HIV opisane u američkom patentu br.
6,143,520; 5,665,557; i 5,981,276.
[0592] Adenovirusi su takođe predviđeni za upotrebu u isporuci iRNK iz ove objave. Adenovirusi su posebno atraktivni vehikulumi, npr. za isporuku gena respiratornom epitelu. Adenovirusi prirodno inficiraju respiratorni epitel gde izazivaju blagu bolest. Druge mete za sisteme isporuke zasnovane na adenovirusima su jetra, centralni nervni sistem, endotelne ćelije i mišići. Adenovirusi imaju prednost da su sposobni da inficiraju ćelije koje se ne dele. Kozarsky i Wilson, Current Opinion in Genetics and Development 3:499-503 (1993) predstavljaju pregled genske terapije zasnovane na adenovirusima. Bout et al., Human Gene Therapy 5:3-10 (1994) demonstrirali su upotrebu adenovirusnih vektora za prenos gena na respiratorni epitel rezus majmuna. Druge instance upotrebe adenovirusa u genskoj terapiji mogu se naći u Rosenfeld et al., Science 252:431-434 (1991); Rosenfeld et al., Cell 68:143-155 (1992); Mastrangeli et al., J. Clin. Invest. 91:225-234 (1993); PCT Publikaciji WO94/12649; i Wang, et al., Gene Therapy 2:775-783 (1995). Pogodan AV vektor za ekspresiju iRNK iz ove objave, metoda za konstruisanje rekombinantnog AV vektora i metoda za isporuku vektora u ciljane ćelije, opisani su u Xia H et al. (2002), Nat. Biotech.20: 1006-1010.
[0593] Adeno-povezani virusni (AAV) vektori takođe se mogu koristiti za isporuku iRNK iz pronalaska (Walsh et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med.204:289-300 (1993); američki patent br.
5,436,146). U jednom slučaju, iRNK može biti ekspresirana kao dva odvojena, komplementarna jednolančana RNK molekula iz rekombinantnog AAV vektora koji ima, na primer, ili U6 ili H1 RNK promotere, ili citomegalovirusni (CMV) promoter. Pogodni AAV vektori za ekspresiju dsRNK iz ove objave, metode za konstruisanje rekombinantnog AV vektora i metode za isporuku vektora u ciljane ćelije opisani su u Samulski R et al. (1987), J. Virol. 61: 3096-3101; Fisher K J et al. (1996), J. Virol, 70: 520-532; Samulski R et al. (1989), J. Virol.63: 3822-3826; američkom patentu br.5,252,479; američkom patentu br. 5,139,941; Međunarodnoj patentnoj prijavi br. WO 94/13788; i Međunarodnoj patentnoj prijavi br. WO 93/24641.
[0594] Drugi viralni vektor pogodan za isporuku iRNK pronalaska je virus boginja, kao što je vakcinija virus, na primer atenuirana vakcinija kao što je modifikovani virus Ankara (MVA) ili NYVAC, ptičje boginje kao što su boginje živine ili boginje kanarinca.
[0595] Tropizam viralnih vektora može se modifikovati pseudotipizovanjem vektora sa proteinima omotača ili drugim površinskim antigenima iz drugih virusa, ili zamenom različitih viralnih proteina kapsida, po potrebi. Na primer, lentivirusni vektori mogu biti pseudotipizovani sa površinskim proteinima iz virusa vezikularnog stomatitisa (VSV), besnila, Ebole, Mokola, i slično. AAV vektori se mogu napraviti da ciljaju različite ćelije inženjerstvom vektora da ekspresiraju različite serotipove proteina kapsida; videti npr. Rabinowitz J E et al. (2002), J Virol 76:791-801.
[0596] Farmaceutska priprema vektora može uključivati vektor u prihvatljivom diluentu, ili može uključivati matricu sporog oslobađanja u koju je vehikulum za isporuku gena ugrađen. Alternativno, tamo gde se kompletan vektor za isporuku gena može proizvesti intaktan iz rekombinantnih ćelija, npr. retroviralnih vektora, farmaceutska priprema može uključivati jednu ili više ćelija koje proizvode sistem za isporuku gena.
V. Farmaceutske kompozicije pronalaska
[0597] Ova objava takođe pruža farmaceutske kompozicije i formulacije koje uključuju iRNK iz ove objave. U jednom slučaju, ovde su pružene farmaceutske kompozicije koje sadrže iRNK, kao što je ovde opisano, i farmaceutski prihvatljiv nosač. Farmaceutske kompozicije koje sadrže iRNK su korisne za lečenje bolesti ili poremećaja povezanih sa ekspresijom ili aktivnošću Serpinc1 gena, npr. bolesti povezane sa Serpinc1. Takve farmaceutske kompozicije su formulisane na osnovu načina isporuke. Jedan primer su kompozicije koje su formulisane za sistemsku primenu putem parenteralne isporuke, npr. supkutanom (SC) ili intravenoznom (IV) isporukom. Drugi primer su kompozicije koje su formulisane za direktnu isporuku u parenhim mozga, npr. infuzijom u mozak, kao što je kontinuiranom infuzijom pomoću pumpe. Farmaceutske kompozicije iz objave mogu se primeniti u dozama dovoljnim da inhibiraju ekspresiju Serpinc1 gena.
[0598] U određenim slučajevima objave, na primer, kada se farmaceutska kompozicija sastoji od dvolančanog RNKi agensa koji uključuje jedan ili više motiva od tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida, uključujući jedan takav motiv na mestu cepanja agensa ili blizu njega, šest fosforotioatnih veza i GalNAc ligand, takva kompozicija se primenjuje u dozi od 0,200 do oko 1,825 mg/kg, 0,200 do oko 1,800 mg/kg, oko 0,200 do oko 1,700 mg/kg, oko ,200 do oko 1,600 mg/kg, oko 0,200 do oko 1,500 mg/kg, oko 0,200 do oko 1,400 mg/kg, oko ,200 do oko 1,400 mg/kg, oko 0,200 do oko 1,200 mg/kg, oko 0,200 do oko 1,100 mg/kg, oko ,200 do oko 1,000 mg/kg, oko 0,200 do oko 0,900 mg/kg, oko 0,200 do oko 0,800 mg/kg, oko ,200 do oko 0,700 mg/kg, oko 0,200 do oko 0,600 mg/kg, oko 0,200 do oko 0,500 mg/kg, oko ,200 do oko 0,400 mg/kg, oko 0,225 do oko 1,825 mg/kg, oko 0,225 do oko 1,800 mg/kg, oko ,225 do oko 1,700 mg/kg, oko 0,225 do oko 1,600 mg/kg, oko 0,225 do oko 1,500 mg/kg, oko ,225 do oko 1,400 mg/kg, oko 0,225 do oko 1,400 mg/kg, oko 0,225 do oko 1,200 mg/kg, oko ,225 do oko 1,100 mg/kg, oko 0,225 do oko 1,000 mg/kg, oko 0,225 do oko 0,900 mg/kg, oko ,225 do oko 0,800 mg/kg, oko 0,225 do oko 0,700 mg/kg, oko 0,225 do oko 0,600 mg/kg, oko ,225 do oko 0,500 mg/kg, oko 0,225 do oko 0,400 mg/kg, oko 0,250 do oko 1,825 mg/kg, oko ,250 do oko 1,800 mg/kg, oko 0,250 do oko 1,700 mg/kg, oko 0,250 do oko 1,600 mg/kg, oko ,250 do oko 1,500 mg/kg, oko 0,250 do oko 1,400 mg/kg, oko 0,250 do oko 1,400 mg/kg, oko ,250 do oko 1,200 mg/kg, oko 0,250 do oko 1,100 mg/kg, oko 0,250 do oko 1,000 mg/kg, oko ,250 do oko 0,900 mg/kg, oko 0,250 do oko 0,800 mg/kg, oko 0,250 do oko 0,700 mg/kg, oko ,250 do oko 0,600 mg/kg, oko 0,250 do oko 0,500 mg/kg, oko 0,250 do oko 0,400 mg/kg, oko ,425 do oko 1,825 mg/kg, oko 0,425 do oko 1,800 mg/kg, oko 0,425 do oko 1,700 mg/kg, oko ,425 do oko 1,600 mg/kg, oko 0,425 do oko 1,500 mg/kg, oko 0,425 do oko 1,400 mg/kg, oko ,425 do oko 1,400 mg/kg, oko 0,425 do oko 1,200 mg/kg, oko 0,425 do oko 1,100 mg/kg, oko ,425 do oko 1,000 mg/kg, oko 0,425 do oko 0,900 mg/kg, oko 0,425 do oko 0,800 mg/kg, oko ,425 do oko 0,700 mg/kg, oko 0,425 do oko 0,600 mg/kg, oko 0,425 do oko 0,500 mg/kg, oko ,450 do oko 1,825 mg/kg, oko 0,450 do oko 1,800 mg/kg, oko 0,450 do oko 1,700 mg/kg, oko ,450 do oko 1,600 mg/kg, oko 0,450 do oko 1,500 mg/kg, oko 0,450 do oko 1,400 mg/kg, oko ,450 do oko 1,400 mg/kg, oko 0,450 do oko 1,200 mg/kg, oko 0,450 do oko 1,100 mg/kg, oko ,450 do oko 1,000 mg/kg, oko 0,450 do oko 0,900 mg/kg, oko 0,450 do oko 0,800 mg/kg, oko ,450 do oko 0,700 mg/kg, oko 0,450 do oko 0,600 mg/kg, oko 0,450 do oko 0,500 mg/kg, oko ,475 do oko 1,825 mg/kg, oko 0,475 do oko 1,800 mg/kg, oko 0,475 do oko 1,700 mg/kg, oko ,475 do oko 1,600 mg/kg, oko 0,475 do oko 1,500 mg/kg, oko 0,475 do oko 1,400 mg/kg, oko ,475 do oko 1,400 mg/kg, oko 0,475 do oko 1,200 mg/kg, oko 0,475 do oko 1,100 mg/kg, oko ,475 do oko 1,000 mg/kg, oko 0,475 do oko 0,900 mg/kg, oko 0,475 do oko 0,800 mg/kg, oko ,475 do oko 0,700 mg/kg, oko 0,475 do oko 0,600 mg/kg, oko 0,475 do oko 0,500 mg/kg, oko ,875 do oko 1,825 mg/kg, oko 0,875 do oko 1,800 mg/kg, oko 0,875 do oko 1,700 mg/kg, oko ,875 do oko 1,600 mg/kg, oko 0,875 do oko 1,500 mg/kg, oko 0,875 do oko 1,400 mg/kg, oko ,875 do oko 1,400 mg/kg, oko 0,875 do oko 1,200 mg/kg, oko 0,875 do oko 1,100 mg/kg, oko 0,875 do oko 1,000 mg/kg, oko 0,875 do oko 0,900 mg/kg, oko 0,900 do oko 1,825 mg/kg, oko 0,900 do oko 1,800 mg/kg, oko 0,900 do oko 1,700 mg/kg, oko 0,900 do oko 1,600 mg/kg, oko 0,900 do oko 1,500 mg/kg, oko 0,900 do oko 1,400 mg/kg, oko 0,900 do oko 1,400 mg/kg, oko 0,900 do oko 1,200 mg/kg, oko 0,900 do oko 1,100 mg/kg, oko 0,900 do oko 1,000 mg/kg, oko 0,925 do oko 1,825 mg/kg, oko 0,925 do oko 1,800 mg/kg, oko 0,925 do oko 1,700 mg/kg, oko 0,925 do oko 1,600 mg/kg, oko 0,925 do oko 1,500 mg/kg, oko 0,925 do oko 1,400 mg/kg, oko 0,925 do oko 1,400 mg/kg, oko 0,925 do oko 1,200 mg/kg, oko 0,925 do oko 1,100 mg/kg, ili oko 0,925 do oko 1,000 mg/kg. Vrednosti i rasponi između prethodno navedenih vrednosti takođe se smatraju delom ove objave, npr. RNKi agens se može primeniti na subjektu u dozi od oko 0,015 mg/kg do oko 0,45 mg/mg.
[0599] Na primer, RNKi agens, npr. RNKi agens u farmaceutskoj kompoziciji, može se primeniti u dozi od oko 0,2 mg/kg, 0,225 mg/kg, 0,25 mg/kg, 0,275 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0,325 mg/kg, 0,35 mg/kg, 0,375 mg/kg, 0,4 mg/kg, 0,425 mg/kg, 0,45 mg/kg, 0,475 mg/kg, oko 0,5 mg/kg, 0,525 mg/kg, 0,55 mg/kg, 0,575 mg/kg, oko 0,6 mg/kg, 0,625 mg/kg, 0,65 mg/kg, 0,675 mg/kg, oko 0,7 mg/kg, 0,725 mg/kg, 0,75 mg/kg, 0,775 mg/kg, oko 0,8 mg/kg, 0,925 mg/kg, 0,95 mg/kg, 0,975 mg/kg, oko 1,0 mg/kg, 1,025 mg/kg, 1,05 mg/kg, 1,075 mg/kg, oko 1,1 mg/kg, 1,125 mg/kg, 1,15 mg/kg, 1,175 mg/kg, oko 1,2 mg/kg, 1,225 mg/kg, 1,25 mg/kg, 1,275 mg/kg, oko 1,3 mg/kg, 1,325 mg/kg, 1,35 mg/kg, 1,375 mg/kg, oko 1,4 mg/kg, 1,425 mg/kg, 1,45 mg/kg, 1,475 mg/kg, oko 1,5 mg/kg, 1,525 mg/kg, 1,55 mg/kg, 1,575 mg/kg, oko 1,6 mg/kg, 1,625 mg/kg, 1,65 mg/kg, 1,675 mg/kg, oko 1,7 mg/kg, 1,725 mg/kg, 1,75 mg/kg, 1,775 mg/kg, ili oko 1,8 mg/kg. Vrednosti između prethodno navedenih vrednosti takođe se smatraju delom ove objave.
[0600] U nekim slučajevima objave, na primer, kada dvolančani RNKi agens sadrži sens lanac i antisens lanac, pri čemu antisens lanac sadrži region komplementarnosti koji se sastoji od najmanje 15 uzastopnih nukleotida koji se ne razlikuju za više od 3 nukleotida od nukleotidne sekvence 5' - UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG - 3' (SEQ ID NO: 15), pri čemu su suštinski svi nukleotidi sens lanca i suštinski svi nukleotidi antisens lanca modifikovani nukleotidi, i pri čemu je sens lanac konjugovan sa ligandom pričvršćenim na 3'-kraju, takav agens u farmaceutskoj kompoziciji primenjuje se u dozi od oko 0,200 do oko 1,825 mg/kg, 0,200 do oko 1,800 mg/kg, oko 0,200 do oko 1,700 mg/kg, oko 0,200 do oko 1,600 mg/kg, oko 0,200 do oko 1,500 mg/kg, oko 0,200 do oko 1,400 mg/kg, oko 0,200 do oko 1,400 mg/kg, oko ,200 do oko 1,200 mg/kg, oko 0,200 do oko 1,100 mg/kg, oko 0,200 do oko 1,000 mg/kg, oko ,200 do oko 0,900 mg/kg, oko 0,200 do oko 0,800 mg/kg, oko 0,200 do oko 0,700 mg/kg, oko ,200 do oko 0,600 mg/kg, oko 0,200 do oko 0,500 mg/kg, oko 0,200 do oko 0,400 mg/kg, oko ,225 do oko 1,825 mg/kg, oko 0,225 do oko 1,800 mg/kg, oko 0,225 do oko 1,700 mg/kg, oko ,225 do oko 1,600 mg/kg, oko 0,225 do oko 1,500 mg/kg, oko 0,225 do oko 1,400 mg/kg, oko ,225 do oko 1,400 mg/kg, oko 0,225 do oko 1,200 mg/kg, oko 0,225 do oko 1,100 mg/kg, oko ,225 do oko 1,000 mg/kg, oko 0,225 do oko 0,900 mg/kg, oko 0,225 do oko 0,800 mg/kg, oko ,225 do oko 0,700 mg/kg, oko 0,225 do oko 0,600 mg/kg, oko 0,225 do oko 0,500 mg/kg, oko ,225 do oko 0,400 mg/kg, oko 0,250 do oko 1,825 mg/kg, oko 0,250 do oko 1,800 mg/kg, oko ,250 do oko 1,700 mg/kg, oko 0,250 do oko 1,600 mg/kg, oko 0,250 do oko 1,500 mg/kg, oko ,250 do oko 1,400 mg/kg, oko 0,250 do oko 1,400 mg/kg, oko 0,250 do oko 1,200 mg/kg, oko ,250 do oko 1,100 mg/kg, oko 0,250 do oko 1,000 mg/kg, oko 0,250 do oko 0,900 mg/kg, oko ,250 do oko 0,800 mg/kg, oko 0,250 do oko 0,700 mg/kg, oko 0,250 do oko 0,600 mg/kg, oko ,250 do oko 0,500 mg/kg, oko 0,250 do oko 0,400 mg/kg, oko 0,425 do oko 1,825 mg/kg, oko ,425 do oko 1,800 mg/kg, oko 0,425 do oko 1,700 mg/kg, oko 0,425 do oko 1,600 mg/kg, oko ,425 do oko 1,500 mg/kg, oko 0,425 do oko 1,400 mg/kg, oko 0,425 do oko 1,400 mg/kg, oko ,425 do oko 1,200 mg/kg, oko 0,425 do oko 1,100 mg/kg, oko 0,425 do oko 1,000 mg/kg, oko ,425 do oko 0,900 mg/kg, oko 0,425 do oko 0,800 mg/kg, oko 0,425 do oko 0,700 mg/kg, oko ,425 do oko 0,600 mg/kg, oko 0,425 do oko 0,500 mg/kg, oko 0,450 do oko 1,825 mg/kg, oko ,450 do oko 1,800 mg/kg, oko 0,450 do oko 1,700 mg/kg, oko 0,450 do oko 1,600 mg/kg, oko ,450 do oko 1,500 mg/kg, oko 0,450 do oko 1,400 mg/kg, oko 0,450 do oko 1,200 mg/kg, oko ,450 do oko 1,100 mg/kg, oko 0,450 do oko 1,000 mg/kg, oko 0,450 do oko 0,900 mg/kg, oko ,450 do oko 0,800 mg/kg, oko 0,450 do oko 0,700 mg/kg, oko 0,450 do oko 0,600 mg/kg, oko ,450 do oko 0,500 mg/kg, oko 0,475 do oko 1,825 mg/kg, oko 0,475 do oko 1,800 mg/kg, oko ,475 do oko 1,700 mg/kg, oko 0,475 do oko 1,600 mg/kg, oko 0,475 do oko 1,500 mg/kg, oko ,475 do oko 1,400 mg/kg, oko 0,475 do oko 1,400 mg/kg, oko 0,475 do oko 1,200 mg/kg, oko ,475 do oko 1,100 mg/kg, oko 0,475 do oko 1,000 mg/kg, oko 0,475 do oko 0,900 mg/kg, oko ,475 do oko 0,800 mg/kg, oko 0,475 do oko 0,700 mg/kg, oko 0,475 do oko 0,600 mg/kg, oko ,475 do oko 0,500 mg/kg, oko 0,875 do oko 1,825 mg/kg, oko 0,875 do oko 1,800 mg/kg, oko ,875 do oko 1,700 mg/kg, oko 0,875 do oko 1,600 mg/kg, oko 0,875 do oko 1,500 mg/kg, oko ,875 do oko 1,400 mg/kg, oko 0,875 do oko 1,400 mg/kg, oko 0,875 do oko 1,200 mg/kg, oko ,875 do oko 1,100 mg/kg, oko 0,875 do oko 1,000 mg/kg, oko 0,875 do oko 0,900 mg/kg, oko ,900 do oko 1,825 mg/kg, oko 0,900 do oko 1,800 mg/kg, oko 0,900 do oko 1,700 mg/kg, oko 0,900 do oko 1,600 mg/kg, oko 0,900 do oko 1,500 mg/kg, oko 0,900 do oko 1,400 mg/kg, oko 0,900 do oko 1,400 mg/kg, oko 0,900 do oko 1,200 mg/kg, oko 0,900 do oko 1,100 mg/kg, oko 0,900 do oko 1,000 mg/kg, oko 0,925 do oko 1,825 mg/kg, oko 0,925 do oko 1,800 mg/kg, oko 0,925 do oko 1,700 mg/kg, oko 0,925 do oko 1,600 mg/kg, oko 0,925 do oko 1,500 mg/kg, oko 0,925 do oko 1,400 mg/kg, oko 0,925 do oko 1,400 mg/kg, oko 0,925 do oko 1,200 mg/kg, oko 0,925 do oko 1,100 mg/kg, ili oko 0,925 do oko 1,000 mg/kg. Vrednosti i rasponi između prethodno navedenih vrednosti takođe se smatraju delom ove objave, npr. RNKi agens se može primeniti na subjektu u dozi od oko 0,015 mg/kg do oko 0,45 mg/mg.
[0601] Na primer, RNKi agens, npr. RNKi agens u farmaceutskoj kompoziciji, može se primeniti u dozi od oko 0,2 mg/kg, 0,225 mg/kg, 0,25 mg/kg, 0,275 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0,325 mg/kg, 0,35 mg/kg, 0,375 mg/kg, 0,4 mg/kg, 0,425 mg/kg, 0,45 mg/kg, 0,475 mg/kg, oko 0,5 mg/kg, 0,525 mg/kg, 0,55 mg/kg, 0,575 mg/kg, oko 0,6 mg/kg, 0,625 mg/kg, 0,65 mg/kg, 0,675 mg/kg, oko 0,7 mg/kg, 0,725 mg/kg, 0,75 mg/kg, 0,775 mg/kg, oko 0,8 mg/kg, 0,925 mg/kg, 0,95 mg/kg, 0,975 mg/kg, oko 1,0 mg/kg, 1,025 mg/kg, 1,05 mg/kg, 1,075 mg/kg, oko 1,1 mg/kg, 1,125 mg/kg, 1,15 mg/kg, 1,175 mg/kg, oko 1,2 mg/kg, 1,225 mg/kg, 1,25 mg/kg, 1,275 mg/kg, oko 1,3 mg/kg, 1,325 mg/kg, 1,35 mg/kg, 1,375 mg/kg, oko 1,4 mg/kg, 1,425 mg/kg, 1,45 mg/kg, 1,475 mg/kg, oko 1,5 mg/kg, 1,525 mg/kg, 1,55 mg/kg, 1,575 mg/kg, oko 1,6 mg/kg, 1,625 mg/kg, 1,65 mg/kg, 1,675 mg/kg, oko 1,7 mg/kg, 1,725 mg/kg, 1,75 mg/kg, 1,775 mg/kg, ili oko 1,8 mg/kg. Vrednosti između prethodno navedenih vrednosti takođe se smatraju delom ove objave.
[0602] Farmaceutska kompozicija koja se sastoji od iRNK agensa treba da se primeni na subjektu kao fiksna doza. „Fiksna doza“ (npr. doza u mg) znači da se jedna doza iRNK agensa koristi za sve subjekte bez obzira na bilo kakve specifične faktore vezane za subjekta, kao što je težina. Fiksna doza iRNK agensa iz objave može biti zasnovana na unapred određenoj težini ili starosti.
[0603] U nekim slučajevima, farmaceutska kompozicija koja se sastoji od iRNK agensa primenjuje se kao fiksna doza od oko 25 mg do oko 100 mg, npr. između oko 25 mg do oko 95 mg, između oko 25 mg do oko 90 mg, između oko 25 mg do oko 85 mg, između oko 25 mg do oko 80 mg, između oko 25 mg do oko 75 mg, između oko 25 mg do oko 70 mg, između oko 25 mg do oko 65 mg, između oko 25 mg do oko 60 mg, između oko 25 mg do oko 50 mg, između oko 50 mg do oko 100 mg, između oko 50 mg do oko 95 mg, između oko 50 mg do oko 90 mg, između oko 50 mg do oko 85 mg, između oko 50 mg do oko 80 mg, između oko 30 mg do oko 100 mg, između oko 30 mg do oko 90 mg, između oko 30 mg do oko 80 mg, između oko 40 mg do oko 100 mg, između oko 40 mg do oko 90 mg, između oko 40 mg do oko 80 mg, između oko 60 mg do oko 100 mg, između oko 60 mg do oko 90 mg, između oko 25 mg do oko 55 mg, između oko 30 mg do oko 95 mg, između oko 30 mg do oko 85 mg, između oko 30 mg do oko 75 mg, između oko 30 mg do oko 65 mg, između oko 30 mg do oko 55 mg, između oko 40 mg do oko 95 mg, između oko 40 mg do oko 85 mg, između oko 40 mg do oko 75 mg, između oko 40 mg do oko 65 mg, između oko 40 mg do oko 55 mg, ili između oko 45 mg do oko 95 mg.
[0604] U nekim slučajevima, farmaceutska kompozicija koja se sastoji od iRNK agensa primenjuje se kao fiksna doza od oko 25 mg, oko 30 mg, oko 35 mg, oko 40 mg, oko 45 mg, oko 50 mg, oko 55 mg, oko 60 mg, oko 65 mg, oko 70 mg, oko 75 mg, oko 80 mg, oko 85 mg, oko 90 mg, oko 95 mg, ili oko 100 mg.
[0605] Farmaceutska kompozicija koja sadrži iRNK može se primeniti na subjektu otprilike jednom mesečno, otprilike jednom svakih pet nedelja, otprilike jednom svakih šest nedelja, otprilike jednom svaka 2 meseca, ili jednom kvartalno.
[0606] Farmaceutska kompozicija koja sadrži iRNK agens može se primeniti na subjektu u jednoj ili više doza. U nekim slučajevima, farmaceutske kompozicije koje se sastoje od dvolančanog iRNK agensa mogu se primeniti na subjektu kao mesečna doza od oko 0,200 mg/kg do oko 0,250 mg/kg, mesečna doza od oko 0,425 mg/kg do oko 0,475 mg/kg, mesečna doza od oko 0,875 mg/kg do oko 0,925 mg/kg, ili kao mesečna doza od oko 1,775 mg/kg do oko 1,825 mg/kg. U nekim slučajevima, farmaceutske kompozicije koje se sastoje od dvolančanog iRNK agensa mogu se primeniti na subjektu kao fiksna doza od oko 25 mg do oko 100 mg, npr. oko 25 mg, oko 50 mg, oko 80 mg, ili oko 100 mg.
[0607] Farmaceutska kompozicija se može primeniti intravenskom infuzijom tokom određenog vremenskog perioda, kao što je period od 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, ili oko 25 minuta. Primena se može ponoviti, na primer, na redovnoj osnovi, kao što je sedmično, dvonedeljno (tj. svake dve nedelje), mesečno, svaka dva meseca, svaka tri meseca, svaka četiri meseca ili duže. Nakon početnog režima lečenja, tretmani se mogu primenjivati sa manjom učestalošću. Na primer, nakon primene sedmično ili dvonedeljno tokom tri meseca, primena se može ponoviti jednom mesečno, tokom šest meseci ili godinu dana ili duže.
[0608] Farmaceutska kompozicija može se primeniti jednom dnevno, ili iRNK može biti primenjena kao dve, tri, ili više subdoza u odgovarajućim intervalima tokom dana ili čak korišćenjem kontinuirane infuzije ili isporuke kroz formulaciju sa kontrolisanim oslobađanjem. U tom slučaju, iRNK sadržana u svakoj subdozi mora biti odgovarajuće manja kako bi se postigla ukupna dnevna doza. Dozna jedinica se takođe može komponovati za isporuku tokom nekoliko dana, npr. korišćenjem konvencionalne formulacije sa produženim oslobađanjem koja pruža produženo oslobađanje iRNK tokom perioda od nekoliko dana. Formulacije sa produženim oslobađanjem su dobro poznate u struci i posebno su korisne za isporuku agensa na određeno mesto, kao što bi se moglo koristiti sa agensima ove objave. U ovom slučaju, dozna jedinica sadrži odgovarajući višestruki iznos dnevne doze.
[0609] U drugim slučajevima, jedna doza farmaceutskih kompozicija može biti dugotrajna, tako da se naknadne doze primenjuju u intervalima koji nisu duži od 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, ili 8 nedelja. U nekim slučajevima objave, jedna doza farmaceutskih kompozicija iz ove objave primenjuje se jednom mesečno.
[0610] Stručnjak će razumeti da određeni faktori mogu uticati na doziranje i vreme potrebno za efikasno lečenje subjekta, uključujući, ali ne ograničavajući se na, ozbiljnost bolesti ili poremećaja, prethodne tretmane, opšte zdravlje i/ili starost subjekta, i druge prisutne bolesti. Štaviše, lečenje subjekta terapeutski efikasnom količinom kompozicije može uključivati jedan tretman ili seriju tretmana. Procene efikasnih doza i in vivo poluvremena eliminacije za pojedinačne iRNK obuhvaćene objavom mogu se izvršiti korišćenjem konvencionalnih metodologija ili na osnovu in vivo testiranja korišćenjem odgovarajućeg životinjskog modela, kao što je drugde opisano ovde.
[0611] Napredak u genetici miševa generisao je niz modela miša za proučavanje raznih ljudskih bolesti, kao što je poremećaj krvarenja koji bi imao koristi od redukcije ekspresije Serpinc1. Takvi modeli mogu se koristiti za in vivo testiranje iRNK, kao i za određivanje terapeutski efikasne doze. Odgovarajući modeli miša su poznati u struci i uključuju, na primer, modele miša sa hemofilijom A i modele miša sa hemofilijom B, npr. miševe koji sadrže isključenje gena za faktor zgrušavanja, kao što su oni opisani u Bolliger, et al. (2010) Thromb Haemost 103:1233-1238, Bi L, et al. (1995) Nat Genet 10: 119-21, Lin et al. (1997) Blood 90: 3962-6, Kundu et al. (1998) Blood 92: 168-74, Wang et al. (1997) Proc Natl Acad Sci U S A 94: 11563-6, and Jin, et al. (2004) Blood 104:1733.
[0612] Farmaceutske kompozicije iz ove objave mogu se primeniti na više načina, zavisno od toga da li se želi lokalno ili sistemsko lečenje i od oblasti koja se leči. Primena može biti topikalna (npr. putem transdermalnog flastera), plućna, npr. inhalacijom ili insuflacijom praha ili aerosola, uključujući i putem nebulizatora; intratrahealna, intranazalna, epidermalna i transdermalna, oralna ili parenteralna. Parenteralna primena uključuje intravenoznu, intraarterijsku, supkutanu, intraperitonealnu ili intramuskularnu injekciju ili infuziju; subdermalnu, npr. putem implantiranog uređaja; ili intrakranijalnu, npr. intraparenhimalnom, intratekalnom ili intraventrikularnom, primenom.
[0613] iRNK se može isporučiti na način da cilja određeno tkivo, kao što je jetra (npr. hepatociti jetre).
[0614] Farmaceutske kompozicije i formulacije za topikalnu primenu mogu uključivati transdermalne flastere, masti, losione, kreme, gelove, kapi, supozitorije, sprejeve, tečnosti i prahove. Konvencionalni farmaceutski nosači, vodene, praškaste ili uljane baze, zgušnjivači i slično mogu biti neophodni ili poželjni. Obloženi kondomi, rukavice i slično takođe mogu biti korisni. Pogodne topikalne formulacije uključuju one u kojima su iRNK iz ove objave u smeši sa topikalnim agensom za isporuku kao što su lipidi, lipozomi, masne kiseline, estri masnih kiselina, steroidi, helatni agensi i surfaktanti. Topikalne formulacije su detaljno opisane u američkom patentu br.6,747,014.
A. Dodatne formulacije
I. Emulzije
[0615] Kompozicije ove objave mogu biti pripremljene i formulisane kao emulzije. Emulzije su tipično heterogeni sistemi jedne tečnosti dispergovane u drugoj u obliku kapljica koje obično premašuju 0,1 µm u prečniku (videti npr. Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p.199; Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Volume 1, p.245; Block in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 2, p. 335; Higuchi et al., in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, p. 301). Emulzije su često dvofazni sistemi koji se sastoje od dve tečnosti koje se ne mešaju, intimno pomešane i dispergovane jedna sa drugom. Uopšteno, emulzije mogu biti bilo tipa voda u ulju (w/o) ili ulje u vodi (o/w). Kada se vodena faza fino podeli na sitne kapljice i disperguje u glavnu uljanu fazu, dobijena kompozicija se naziva emulzija voda u ulju (w/o). Alternativno, kada se uljana faza fino podeli na sitne kapljice i disperguje u glavnu vodenu fazu, dobijena kompozicija se naziva emulzija ulje u vodi (o/w). Emulzije mogu da sadrže dodatne komponente pored dispergovanih faza, kao i aktivni lek koji može biti prisutan kao rastvor u bilo vodene faze, uljanoj fazi ili sam kao zasebna faza. Farmaceutski ekscipijensi, kao što su emulgatori, stabilizatori, boje i antioksidansi, takođe mogu biti prisutni u emulzijama po potrebi. Farmaceutske emulzije takođe mogu biti višestruke emulzije koje se sastoje od više od dve faze, kao što je, na primer, u slučaju emulzija ulje-u-vodi-u-ulju (o/w/o) i voda-u-ulju-uvodi (w/o/w). Takve složene formulacije često pružaju određene prednosti koje jednostavne binarne emulzije ne pružaju. Višestruke emulzije u kojima pojedinačne uljane kapljice o/w emulzije obuhvataju male vodene kapljice čine w/o/w emulziju. Isto tako, sistem uljanih kapljica obuhvaćenih u kapljicama vode stabilizovanim u uljanoj kontinuiranoj fazi obezbeđuje o/w/o emulziju.
[0616] Emulzije se karakterišu malom ili nikakvom termodinamičkom stabilnošću. Često, dispergovana ili diskontinuirana faza emulzije je dobro dispergovana u spoljnju ili kontinuiranu fazu i održava se u ovom obliku pomoću emulgatora ili viskoziteta formulacije. Bilo koja od faza emulzije može biti polučvrsta ili čvrsta, kao što je slučaj sa masnim bazama i kremama u stilu emulzije. Drugi načini stabilizacije emulzija uključuju upotrebu emulgatora koji se mogu ugraditi u bilo koju fazu emulzije. Emulgatori se mogu široko klasifikovati u četiri kategorije: sintetički surfaktanti, prirodni emulgatori, apsorpcione baze i fino dispergovane čvrste materije (videti npr. Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., i Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p.199).
[0617] Sintetički surfaktanti, takođe poznati kao površinski aktivni agensi, našli su široku primenu u formulisanja emulzija i pregledani su u literaturi (videti npr. Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., i Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 285; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, volume 1, p. 199). Surfaktanti su tipično amfifilni i sastoje se od hidrofilnog i hidrofobnog dela. Odnos hidrofilne prema hidrofobnoj prirodi surfaktanta nazvan je hidrofilno/lipofilna ravnoteža (HLB) i vredan je alat za kategorizaciju i odabir surfaktanata u pripremi formulacija. Surfaktanti se mogu klasifikovati u različite klase na osnovu prirode hidrofilne grupe: nejonski, anjonski, katjonski i amfoterni (videti npr. Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., i Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p.285).
[0618] Prirodni emulgatori koji se koriste u emulzionim formulacijama uključuju lanolin, pčelinji vosak, fosfatide, lecitin i akaciju. Apsorpcone baze poseduju hidrofilna svojstva tako da mogu upijati vodu i formirati w/o emulzije, ali i dalje zadržati svoju polučvrstu konzistenciju, kao što su bezvodni lanolin i hidrofilni petrolatum. Fino podeljene čvrste materije takođe su korišćene kao dobri emulgatori, posebno u kombinaciji sa surfaktantima i u viskoznim preparatima. To uključuje polarne anorganske čvrste materije, kao što su hidroksidi teških metala, gline koje ne bubre kao što su bentonit, atapulgit, hektorit, kaolin, montmorilonit, koloidni aluminijum silikat i koloidni magnezijum aluminijum silikat, pigmenti i nepolarne čvrste materije kao što su ugljenik ili gliceril tristearat.
[0619] Veliki broj neemulgujućih materijala takođe je uključen u emulzione formulacije i doprinosi svojstvima emulzija. To uključuje masti, ulja, voskove, masne kiseline, masne alkohole, masne estre, humektante, hidrofilne koloide, konzervanse i antioksidanse (Block, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p.335; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p.199).
[0620] Hidrofilni koloidi ili hidrokoloidi uključuju prirodne gume i sintetičke polimere kao što su polisaharidi (na primer, akacija, agar, alginska kiselina, karagenan, guar guma, karaja guma i tragakant), derivati celuloze (na primer, karboksimetilceluloza i karboksipropilceluloza), i sintetičke polimere (na primer, karbomeri, celulozni etri i karboksivinil polimeri). Oni se disperguju ili nabubre u vodi da formiraju koloidne rastvore koji stabilizuju emulzije formiranjem jakih međufaznih filmova oko kapljica dispergovane faze i povećanjem viskozita spoljašnje faze.
[0621] Pošto emulzije često sadrže niz sastojaka kao što su ugljeni hidrati, proteini, steroli i fosfatidi koji mogu lako podržati rast mikroba, ove formulacije često uključuju konzervanse. Često korišćeni konzervansi uključeni u emulzione formulacije uključuju metil paraben, propil paraben, kvaterarne amonijum soli, benzalkonijum hlorid, estre p-hidroksibenzoeve kiseline, i bornu kiselinu. Antioksidansi se takođe često dodaju emulzionim formulacijama da bi se sprečilo propadanje formulacije. Korišćeni antioksidansi mogu biti hvatači slobodnih radikala kao što su tokoferoli, alkil galati, butilisani hidroksianizol, butilisani hidroksitoluol, ili redukciona sredstva kao što su askorbinska kiselina i natrijum metabisulfit, i sinergisti antioksidansa kao što su limunska kiselina, vinska kiselina i lecitin.
[0622] Primena emulzionih formulacija putem dermatoloških, oralnih i parenteralnih ruta i metode za njihovu proizvodnju pregledani su u literaturi (videti npr. Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., i Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p.199). Emulzione formulacije za oralnu primenu su veoma široko korišćene zbog lakoće formulisanja, kao i efikasnosti sa stanovišta apsorpcije i biodostupnosti (videti npr. Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., i Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p.245; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199). Laksativi na bazi mineralnog ulja, vitamini rastvorljivi u ulju i hranljivi preparati sa visokim sadržajem masti spadaju među materijale koji su se obično primenjivali oralno kao o/w emulzije.
ii. Mikroemulzije
[0623] U jednom slučaju ove objave, kompozicije iRNK i nukleinskih kiselina su formulisane kao mikroemulzije. Mikroemulzija se može definisati kao sistem vode, ulja i amfifila koji je jedan optički izotropan i termodinamički stabilan tečni rastvor (videti npr. Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p.245). Tipično, mikroemulzije su sistemi koji se pripremaju prvo dispergovanjem ulja u vodeni rastvor surfaktanta, a zatim dodavanjem dovoljne količine četvrte komponente, generalno alkohola srednje dužine lanca, da bi se formirao proziran sistem. Stoga, mikroemulzije su takođe opisane kao termodinamički stabilne, izotropno čiste disperzije dve tečnosti koje se ne mešaju, a koje su stabilizovane međufaznim filmovima površinski aktivnih molekula (Leung and Shah, in: Controlled Release of Drugs: Polymers and Aggregate Systems, Rosoff, M., Ed., 1989, VCH Publishers, New York, pages 185-215). Mikroemulzije se obično pripremaju kombinacijom tri do pet komponenti koje uključuju ulje, vodu, surfaktant, kosurfaktant i elektrolit. Da li je mikroemulzija tipa voda u ulju (w/o) ili ulje u vodi (o/w) zavisi od svojstava ulja i surfaktanta koji se koriste, kao i od strukture i geometrijskog pakovanja polarnih glava i ugljovodonikovih repova molekula surfaktanta (Schott, in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, p.
271).
[0624] Fenomenološki pristup koji koristi fazne dijagrame je opsežno proučavan i stručnjaku u ovoj oblasti pružio je sveobuhvatno znanje o tome kako formulisati mikroemulzije (videti npr. Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p.245; Block, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 335). U poređenju sa konvencionalnim emulzijama, mikroemulzije nude prednost rastvaranja lekova nerastvorljivih u vodi u formulaciji termodinamički stabilnih kapljica koje se spontano formiraju.
[0625] Surfaktanti koji se koriste u pripremi mikroemulzija uključuju, ali nisu ograničeni na, jonske surfaktante, nejonske surfaktante, Brij 96, polioxietilen oleil etre, poliglicerol estre masnih kiselina, tetraglicerol monolaurat (ML310), tetraglicerol monooleat (MO310), heksaglicerol monooleat (PO310), heksaglicerol pentaoleat (PO500), dekaglicerol monokaprat (MCA750), dekaglicerol monooleat (MO750), dekaglicerol seskvioleat (SO750), dekaglicerol dekaoleat (DAO750), sami ili u kombinaciji sa kosurfaktantima. Kosurfaktant, obično alkohol kratkog lanca kao što je etanol, 1-propanol ili 1-butanol, služi za povećanje međufazne fluidnosti prodiranjem u film surfaktanta i posledičnim stvaranjem neuređenog filma zbog praznog prostora generisanog između molekula surfaktanta. Međutim, mikroemulzije se mogu pripremiti i bez upotrebe kosurfaktanata, a sistemi samoemulgujućih mikroemulzija bez alkohola su poznati u struci. Vodena faza može biti, ali nije ograničena na, voda, vodeni rastvor leka, glicerol, PEG300, PEG400, poligliceroli, propilen glikoli i derivati etilen glikola. Uljana faza može uključivati, ali nije ograničena na, materijale kao što su Captex 300, Captex 355, Capmul MCM, estri masnih kiselina, mono, di i trigliceridi srednjeg lanca (C8-C12), polioxietilovani gliceril estri masnih kiselina, masni alkoholi, poliglikolizovani gliceridi, zasićeni poliglikolizovani C8-C10 gliceridi, biljna ulja i silikonsko ulje.
[0626] Mikroemulzije su posebno interesantne sa stanovišta rastvaranja lekova i pojačane apsorpcije lekova. Mikroemulzije na bazi lipida (i o/w i w/o) su predložene da poboljšaju oralnu biodostupnost lekova, uključujući peptide (videti npr. američki patent br. 6,191,105; 7,063,860; 7,070,802; 7,157,099; Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385-1390; Ritschel, Meth. Find. Exp. Clin. Pharmacol., 1993, 13, 205). Mikroemulzije pružaju prednosti poboljšanog rastvaranja leka, zaštite leka od enzimske hidrolize, mogućeg pojačanja apsorpcije leka usled promena u fluidnosti i propustljivosti membrane izazvanih surfaktantom, lakoće pripreme, lakoće oralne primene u odnosu na čvrste dozne oblike, poboljšane kliničke moći i smanjene toksičnosti (videti npr. američki patent br. 6,191,105; 7,063,860; 7,070,802; 7,157,099; Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385; Ho et al., J. Pharm. Sci., 1996, 85, 138-143). Često se mikroemulzije mogu spontano formirati kada se njihove komponente spoje na sobnoj temperaturi. Ovo može biti posebno korisno prilikom formulisanja termolabilnih lekova, peptida ili iRNK. Mikroemulzije su takođe bile efikasne u transdermalnoj isporuci aktivnih komponenti kako u kozmetičkim tako i u farmaceutskim primenama. Očekuje se da će mikroemulzione kompozicije i formulacije iz ove objave olakšati povećanu sistemsku apsorpciju iRNK i nukleinskih kiselina iz gastrointestinalnog trakta, kao i poboljšati lokalno ćelijsko preuzimanje iRNK i nukleinskih kiselina.
[0627] Mikroemulzije iz ove objave takođe mogu da sadrže dodatne komponente i aditive kao što su sorbitan monostearat (Grill 3), Labrasol, i pojačivače penetracije da bi se poboljšala svojstva formulacije i pojačala apsorpcija iRNK i nukleinskih kiselina iz ove objave. Pojačivači penetracije koji se koriste u mikroemulzijama iz ove objave mogu se klasifikovati kao pripadnici jedne od pet širokih kategorija: surfaktanti, masne kiseline, žučne soli, helatni agensi i nehelatni nesurfaktanti (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92). Svaka od ovih klasa je razmatrana iznad.
iii. Mikročestice
[0628] RNKi agens iz ove objave može se ugraditi u česticu, npr. mikročesticu. Mikročestice se mogu proizvesti sušenjem raspršivanjem, ali se mogu proizvesti i drugim metodama, uključujući liofilizaciju, isparavanje, sušenje u fluidizovanom sloju, sušenje u vakuumu ili kombinaciju ovih tehnika.
iv. Pojačivači penetracije
[0629] U jednom slučaju, ova objava koristi različite pojačivače penetracije kako bi omogućila efikasnu isporuku nukleinskih kiselina, posebno iRNK, na kožu životinja. Većina lekova je u rastvoru prisutna i u jonizovanoj i u nejonizovanoj formi. Međutim, obično samo lekovi rastvorljivi u mastima, odnosno lipofilni lekovi, lako prolaze kroz ćelijske membrane. Otkriveno je da čak i nelipofilni lekovi mogu da prođu kroz ćelijske membrane ako se membrana koja treba da se pređe tretira pojačivačem penetracije. Pored toga što pomažu difuziji nelipofilnih lekova kroz ćelijske membrane, pojačivači penetracije takođe pojačavaju propustljivost lipofilnih lekova.
[0630] Pojačivači penetracije mogu se klasifikovati u jednu od pet širokih kategorija: surfaktanti, masne kiseline, žučne soli, helatni agensi i nehelatni nesurfaktanti (videti npr. Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92). Svaka od gore navedenih klasa pojačivača penetracije opisana je u nastavku detaljnije.
[0631] Surfaktanti (ili „površinski aktivni agensi“) su hemijski entiteti koji, kada se rastvore u vodenom rastvoru, smanjuju površinski napon rastvora ili međufazni napon između vodenog rastvora i druge tečnosti, sa rezultatom da je apsorpcija iRNK kroz sluznicu pojačana. Pored žučnih soli i masnih kiselina, ovi pojačivači penetracije uključuju, na primer, natrijum lauril sulfat, polioksietilen-9-lauril etar i polioksietilen-20-cetil etar) (videti npr. Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p. 92); i perfluor-hemijske emulzije, kao što je FC-43. Takahashi et al., J. Pharm. Pharmacol., 1988, 40, 252).
[0632] Različite masne kiseline i njihovi derivati koji deluju kao pojačivači penetracije uključuju, na primer, oleinsku kiselinu, laurinsku kiselinu, kaprinsku kiselinu (n-dekanoinsku kiselinu), miristinsku kiselinu, palmitinsku kiselinu, stearinsku kiselinu, linoleinsku kiselinu, linolensku kiselinu, dikaprat, trikaprat, monoolein (1-monooleoil-rac-glicerol), dilaurin, kaprilnu kiselinu, arahidonsku kiselinu, glicerol 1-monokaprat, 1-dodecilazicloheptan-2-on, acilkarnitine, acilholine, njihove C1-20alkil estre (npr. metil, izopropil i t-butil), i njihove monoi di-gliceride (npr. oleat, laurat, kaprat, miristat, palmitat, stearat, linoleat itd.) (videti npr. Touitou, E., et al. Enhancement in Drug Delivery, CRC Press, Danvers, MA, 2006; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; El Hariri et al., J. Pharm. Pharmacol., 1992, 44, 651-654).
[0633] Fiziološka uloga žuči uključuje olakšavanje disperzije i apsorpcije lipida i vitamina rastvorljivih u mastima (videti npr. Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Brunton, Chapter 38 in: Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9th Ed., Hardman et al. Eds., McGraw-Hill, New York, 1996, pp. 934-935). Različite prirodne žučne soli i njihovi sintetički derivati deluju kao pojačivači penetracije. Termin „žučne soli“ stoga uključuje bilo koju od prirodno prisutnih komponenti žuči, kao i bilo koji od njihovih sintetičkih derivata. Pogodne žučne soli uključuju, na primer, holnu kiselinu (ili njenu farmaceutski prihvatljivu natrijumovu so, natrijum holat) , dehidroholnu kiselinu (natrijum dehidroholat) , dezoksiholnu kiselinu (natrijum dezoksiholat) , glukoholnu kiselinu (natrijum glukohlat) , glikoholnu kiselinu (natrijum glikoholat) , glikodezoksiholnu kiselinu (natrijum glikodezoksiholat) , tauroholnu kiselinu (natrijum tauroholat) , taurodezoksiholnu kiselinu (natrijum taurodezoksiholat) , henodezoksiholnu kiselinu (natrijum henodezoksiholat) , ursodezoksiholnu kiselinu (UDCA) , natrijum tauro-24,25-dihidro-fusidat (STDHF) , natrijum glikodihidrofusidat i polioksietilen-9-lauril etar (POE) (videti npr. Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92; Swinyard, Chapter 39 In: Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990, pages 782-783; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Yamamoto et al., J. Pharm. Exp. Ther., 1992, 263, 25; Yamashita et al., J. Pharm. Sci., 1990, 79, 579-583).
[0634] Helatni agensi, kako se koriste u vezi sa ovom objavom, mogu se definisati kao jedinjenja koja uklanjaju metalne jone iz rastvora formiranjem kompleksa sa njima, sa rezultatom da je apsorpcija iRNK kroz sluznicu pojačana. Kada je reč o njihovoj upotrebi kao pojačivača penetracije u ovom tekstu, helatni agensi imaju dodatnu prednost jer služe i kao DNase inhibitori, pošto većina karakterisanih DNK nukleaza zahteva dvovalentni metalni jon za katalizu i stoga su inhibirane helatnim agensima (Jarrett, J. Chromatogr., 1993, 618, 315-339). Pogodni helatni agensi uključuju, ali nisu ograničeni na: dinatrijum etilendiamintetraacetat (EDTA), limunsku kiselinu, salicilate (npr. natrijum salicilat, 5-metoksisalicilat i homovanilat), N-acil derivate kolagena, laureth-9 i N-amino acil derivate beta-diketona (enamini). (videti npr. Katdare, A. et al., Excipient development for pharmaceutical, biotechnology, and drug delivery, CRC Press, Danvers, MA, 2006; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Buur et al., J. Control Rel., 1990, 14, 43-51).
[0635] Kako se ovde koristi, pojačivači penetracije koji nisu helatni i nisu surfaktanti mogu se definisati kao jedinjenja koja pokazuju beznačajnu aktivnost kao helatni agensi ili kao surfaktanti, ali ipak pojačavaju apsorpciju iRNK kroz sluznicu digestivnog trakta (videti npr. Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33). Ova klasa pojačivača penetracije uključuje, na primer, nezasićene ciklične uree, 1-alkil- i 1-alkenilazaciklo-alkanonske derivate (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92); i nesteroidne antiinflamatorne agense kao što su diklofenak natrijum, indometacin i fenilbutazon (Yamashita et al., J. Pharm. Pharmacol., 1987, 39, 621-626).
[0636] Agensi koji pojačavaju preuzimanje iRNK na ćelijskom nivou takođe se mogu dodati farmaceutskim i drugim kompozicijama iz ove objave. Na primer, katjonski lipidi, kao što je lipofektin (Junichi et al, američki patent br. 5,705,188), katjonski glicerol derivati, i polikatjonski molekuli, kao što je polilizin (Lollo et al., PCT prijava WO 97/30731), takođe su poznati da pojačavaju ćelijsko preuzimanje dsRNK. Primeri komercijalno dostupnih reagenasa za transfekciju uključuju, na primer Lipofectamine<™>(Invitrogen; Carlsbad, CA), Lipofectamine 2000<™>(Invitrogen; Carlsbad, CA), 293fectin<™>(Invitrogen; Carlsbad, CA), Cellfectin<™>(Invitrogen; Carlsbad, CA), DMRIE-C<™>(Invitrogen; Carlsbad, CA), FreeStyle<™>MAX (Invitrogen; Carlsbad, CA), Lipofectamine<™>2000 CD (Invitrogen; Carlsbad, CA), Lipofectamine<™>(Invitrogen; Carlsbad, CA), RNAiMAX (Invitrogen; Carlsbad, CA), Oligofectamine<™>(Invitrogen; Carlsbad, CA), Optifect<™>(Invitrogen; Carlsbad, CA), X-tremeGENE Q2 Transfection Reagent (Roche; Grenzacherstrasse, Švajcarska), DOTAP Liposomal Transfection Reagent (Grenzacherstrasse, Švajcarska), DOSPER Liposomal Transfection Reagent (Grenzacherstrasse, Švajcarska), or Fugene (Grenzacherstrasse, Švajcarska), Transfectam<®>Reagent (Promega; Madison, WI), TransFast<™>Transfection Reagent (Promega; Madison, WI), Tfx<™>-20 Reagent (Promega; Madison, WI), Tfx<™>-50 Reagent (Promega; Madison, WI), DreamFect<™>(OZ Biosciences; Marseille, Francuska), EcoTransfect (OZ Biosciences; Marseille, Francuska), TransPass<a>D1 Transfection Reagent (New England Biolabs; Ipswich, MA, SAD), LyoVec<™>/LipoGen<™>(Invitrogen; San Diego, CA, SAD), PerFectin Transfection Reagent (Genlantis; San Diego, CA, SAD), NeuroPORTER Transfection Reagent (Genlantis; San Diego, CA, SAD), GenePORTER Transfection reagent (Genlantis; San Diego, CA, SAD), GenePORTER 2 Transfection reagent (Genlantis; San Diego, CA, SAD), Cytofectin Transfection Reagent (Genlantis; San Diego, CA, SAD), BaculoPORTER Transfection Reagent (Genlantis; San Diego, CA, SAD), TroganPORTER<™>transfection Reagent (Genlantis; San Diego, CA, SAD), RiboFect (Bioline; Taunton, MA, SAD), PlasFect (Bioline; Taunton, MA, SAD), UniFECTOR (B-Bridge International; Mountain View, CA, SAD), SureFECTOR (B-Bridge International; Mountain View, CA, SAD), ili HiFect<™>(B-Bridge International, Mountain View, CA, SAD), , između ostalih.
[0637] Drugi agensi mogu biti korišćeni za pojačavanje penetracije primenjenih nukleinskih kiselina, uključujući glikole kao što su etilen glikol i propilen glikol, pirole kao što je 2-pirol, azoni i terpeni kao što su limonen i menton.
v. Nosači
[0638] Određene kompozicije iz ove objave takođe uključuju nosače u formulaciji. Kako se ovde koristi, „jedinjenje nosača“ ili „nosač“ može se odnositi na nukleinsku kiselinu, ili njen analog, koja je inertna (tj. sama po sebi ne poseduje biološku aktivnost), ali je prepoznata kao nukleinska kiselina u procesima in vivo koji smanjuju bioraspoloživost nukleinske kiseline sa biološkom aktivnošću, na primer, degradacijom biološki aktivne nukleinske kiseline ili promovisanjem njenog uklanjanja iz cirkulacije. Istovremena primena nukleinske kiseline i jedinjenja nosača, obično sa viškom ove druge supstance, može rezultirati značajnim smanjenjem količine nukleinske kiseline oporavljene u jetri, bubregu ili drugim ekstracirkulatornim rezervoarima, verovatno zbog konkurencije između jedinjenja nosača i nukleinske kiseline za zajednički receptor. Na primer, oporavak delimično fosforotioatne dsRNK u tkivu jetre može se smanjiti kada se primenjuje istovremeno sa polinozinskom kiselinom, dekstran sulfatom, policitidnom kiselinom ili 4-acetamido-4'izotiocijano-stilben-2,2'-disulfonskom kiselinom (Miyao et al., DsRNA Res. Dev., 1995, 5, 115-121; Takakura et al., DsRNA & Nucl. Acid Drug Dev., 1996, 6, 177-183.
vi. Ekscipijensi
[0639] Za razliku od nosača, „farmaceutski nosač“ ili „ekscipijens“ je farmaceutski prihvatljiv rastvarač, agens za suspenziju ili bilo koje drugo farmakološki inertno vehikulum za isporuku jedne ili više nukleinskih kiselina životinji. Ekscipijent može biti tečan ili čvrst i bira se, imajući na umu planirani način primene, kako bi se obezbedila željena masa, konzistencija, itd. kada se kombinuje sa nukleinskom kiselinom i drugim komponentama date farmaceutske kompozicije. Tipični farmaceutski nosači uključuju, ali nisu ograničeni na vezivne agense (npr. preželatinizovani kukuruzni skrob, polivinilpirolidon ili hidroksipropil metilceluloza itd.); punioce (npr. laktoza i drugi šećeri, mikrokristalna celuloza, pektin, želatin, kalcijum sulfat, etil celuloza, poliakrilati ili kalcijum hidrogen fosfat, itd.); lubrikante (npr. magnezijum stearat, talk, silicijum dioksid, koloidni silicijum dioksid, stearinska kiselina, metalni stearati, hidrogenizovana biljna ulja, kukuruzni skrob, polietilen glikoli, natrijum benzoat, natrijum acetat, itd.); dezintegratore (npr. skrob, natrijum skrob glikolat, itd.); i agense za vlaženje (npr. natrijum lauril sulfat, itd.).
[0640] Farmaceutski prihvatljivi organski ili neorganski ekscipijensi pogodni za neparenteralnu primenu, koji ne reaguju štetno sa nukleinskim kiselinama, takođe se mogu koristiti za formulisanje kompozicija ove objave. Odgovarajući farmaceutski prihvatljivi nosači uključuju, ali nisu ograničeni na vodu, rastvore soli, alkohole, polietilen glikole, želatin, laktozu, amilozu, magnezijum stearat, talk, silicijumsku kiselinu, viskozni parafin, hidroksimetilcelulozu, polivinilpirolidon i slično.
[0641] Formulacije za topikalnu primenu nukleinskih kiselina mogu uključivati sterilne i nesterilne vodene rastvore, nevodene rastvore u uobičajenim rastvaračima kao što su alkoholi, ili rastvore nukleinskih kiselina u tečnim ili čvrstim uljnim bazama. Rastvori takođe mogu da sadrže pufere, diluente i druge pogodne aditive. Farmaceutski prihvatljivi organski ili neorganski ekscipijensi pogodni za neparenteralnu primenu, koji ne reaguju štetno sa nukleinskim kiselinama, mogu se koristiti za formulisanje kompozicija ove objave.
[0642] Odgovarajući farmaceutski prihvatljivi ekscipijensi uključuju, ali nisu ograničeni na vodu, rastvore soli, alkohol, polietilen glikole, želatin, laktozu, amilozu, magnezijum stearat, talk, silicijumsku kiselinu, viskozni parafin, hidroksimetilcelulozu, polivinilpirolidon i slično.
vii. Druge komponente
[0643] Kompozicije iz ove objave mogu dodatno da sadrže i druge pomoćne komponente, koje se konvencionalno nalaze u farmaceutskim kompozicijama, u nivou upotrebe utvrđenom u struci. Tako, na primer, kompozicije mogu da sadrže dodatne, kompatibilne, farmaceutski aktivne materijale kao što su, na primer, antipruritici, adstringenti, lokalni anestetici ili antiinflamatorni agensi, ili mogu da sadrže dodatne materijale korisne za fizičko formulisanje različitih dozirnih oblika kompozicija iz ove objave, kao što su boje, arome, konzervansi, antioksidansi, sredstva za opacifikaciju, sredstva za zgušnjavanje i stabilizatori. Međutim, takvi materijali, kada se dodaju, ne bi trebalo da neopravdano ometaju biološke aktivnosti komponenti kompozicija iz ove objave. Formulacije se mogu sterilisati i, po želji, pomešati sa pomoćnim agensima, npr. lubrikantima, konzervansima, stabilizatorima, agensima za vlaženje, emulgatorima, solima za uticanje na osmotski pritisak, puferima, bojama, aromama i/ili aromatičnim supstancama i slično, koji ne reaguju štetno sa nukleinskom kiselinom (nukleinskim kiselinama) formulacije.
[0644] Vodene suspenzije mogu da sadrže supstance koje povećavaju viskozitet suspenzije, uključujući, na primer, natrijum karboksimetilcelulozu, sorbitol i/ili dekstran. Suspenzija takođe može da sadrži stabilizatore.
[0645] U nekim slučajevima, farmaceutske kompozicije predstavljene u ovoj objavi uključuju (a) jedno ili više iRNK jedinjenja i (b) jedan ili više agensa koji funkcionišu po ne-RNKi mehanizmu i koji su korisni u lečenju hemolitičkog poremećaja. Primeri takvih agensa uključuju, ali nisu ograničeni na antiinflamatorni agens, anti-steatoza agens, antiviralni, i/ili anti-fibroza agens. Pored toga, druge supstance koje se obično koriste za zaštitu jetre, kao što je silimarin, takođe se mogu koristiti u kombinaciji sa iRNK opisanim ovde. Drugi agensi korisni za lečenje bolesti jetre uključuju telbivudin, entekavir i inhibitore proteaze kao što je telaprevir i drugi objavljeni, na primer, u Tung et al., američkim patentnim publikacijama br.
2005/0148548, 2004/0167116, i 2003/0144217; i u Hale et al., američkoj patentnoj publikaciji br. 2004/0127488.
[0646] Toksičnost i terapeutska efikasnost takvih jedinjenja mogu se odrediti standardnim farmaceutskim procedurama u ćelijskim kulturama ili eksperimentalnim životinjama, npr. za određivanje LD50 (doze koja je smrtonosna za 50% populacije) i ED50 (doze koja je terapeutski efikasna u 50% populacije). Odnos doze između toksičnih i terapijskih efekata je terapeutski indeks i može se izraziti kao odnos LD50/ED50. Kompozicije koje pokazuju visoke terapeutske indekse su poželjne.
[0647] Podaci dobijeni iz testova na ćelijskim kulturama i studija na životinjama mogu se koristiti za formulisanje raspona doza za upotrebu kod ljudi. Doza kompozicija prikazanih u ovoj objavi uglavnom leži u rasponu cirkulišućih koncentracija koje uključuju ED50 sa malom ili nikakvom toksičnošću. Doza može varirati unutar ovog raspona u zavisnosti od oblika doziranja i rute primene. Za bilo koje jedinjenje koje se koristi u ovde predstavljenim metodama, terapeutska efikasna doza se može proceniti na početku iz testova na ćelijskim kulturama. Doza se može formulisati na životinjskim modelima kako bi se postigao raspon cirkulišućih koncentracija jedinjenja u plazmi, ili, kada je to prikladno, polipeptidnog proizvoda ciljne sekvence (npr. postizanjem smanjene koncentracije polipeptida) koji uključuje ISERPINC10 (tj. koncentraciju test jedinjenja koja postiže polovinu maksimalne inhibicije simptoma) kako je određeno u ćelijskoj kulturi. Takve informacije se mogu koristiti za preciznije određivanje korisnih doza kod ljudi. Nivoi u plazmi mogu se meriti, na primer, tečnom hromatografijom visoke performanse.
[0648] Pored njihove primene, kao što je gore diskutovano, iRNK predstavljene u ovoj objavi mogu se primenjivati u kombinaciji sa drugim poznatim agensima koji su efikasni u lečenju patoloških procesa posredovanih ekspresijom SERPINC1. U svakom slučaju, lekar koji vrši primenu može prilagoditi količinu i vreme primene iRNK na osnovu rezultata uočenih korišćenjem standardnih mera efikasnosti poznatih u struci ili opisanih ovde.
VI. Kompleti
[0649] Ova objava takođe pruža komplete za izvođenje bilo koje od metoda iz ove objave. Takvi kompleti uključuju jedan ili više RNKi agensa i uputstva za upotrebu, npr. uputstva za primenu profilaktički ili terapeutski efikasne količine RNKi agensa (agenasa). Kompleti mogu opcionalno da sadrže i sredstva za primenu RNKi agensa (npr. uređaj za injekciju) ili sredstva za merenje inhibicije Serpinc1 (npr. sredstva za merenje inhibicije Serpinc1 mRNK, Serpinc1 proteina, i/ili aktivnosti Serpinc1). Takva sredstva za merenje inhibicije Serpinc1 mogu da sadrže sredstva za dobijanje uzorka od subjekta, kao što je, npr. uzorak plazme. Kompleti iz ove objave mogu opcionalno da sadrže i sredstva za određivanje terapeutske ili profilaktičke efikasne količine.
[0650] Ako nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni termini koji se ovde koriste imaju isto značenje kao što je opšte prihvaćeno od strane stručnjaka u oblasti kojoj ova objava pripada. Iako se metode i materijali slični ili ekvivalentni onima opisanim ovde mogu koristiti u praksi ili testiranju iRNK i metoda iz ove objave, pogodne metode i materijali su opisani u nastavku. Pored toga, materijali, metode i primeri su samo ilustrativni i nemaju za cilj da budu ograničavajući.
PRIMERI
[0651]
Tabela 1: Skraćenice monomera nukleinske kiseline korišćenih u prikazu sekvence nukleinske kiseline. Podrazumeva se da su ovi monomeri, kada su prisutni u oligonukleotidu, međusobno povezani 5'-3'-fosfodiesterskim vezama.
L96 N-[tris(GalNAc-alkyl)-amidodecanoyl)]-4-hydroxyprolinol Hyp-(GalNAc-
Primer 1: Primena jednokratne doze AD-57213 zdravim ljudskim subjektima
[0652] Dvadeset četiri zdrava ljudska dobrovoljca, u kohortama 3:1 (aktivni:placebo), primili su jednokratnu dozu od 0,03 mg/kg, 0,1 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0,6 mg/kg, ili 1,0 mg/kg AD-57213 (sens lanac (5' do 3'): GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAfL96 (SEQ ID NO:13); antisens lanac (5' do 3'): usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg (SEQ ID NO:14)). Uzorci plazme su uzeti 0, 1, 2, 3, 7, 10, 14, 21, 28, 42, 56 i 70 dana nakon primene radi praćenja nivoa AT proteina, AT aktivnosti i trajanja utišavanja AT proteina. Nivoi AT proteina su praćeni pomoću ELISA testa, a nivoi AT aktivnosti su praćeni generisanjem krivulja generisanja trombina pomoću kalibrisanog automatskog trombinoskopa (tkivni faktor = 1pM). Promena u maksimalnom nivou trombina izračunata je u odnosu na prosečnu vrednost maksimalnog nivoa trombina iz dva merenja pre doze za svakog subjekta.
[0653] Nije bilo ozbiljnih neželjenih događaja, 3 blaga neželjena događaja koja verovatno nisu bila povezana sa primenom agensa, i 1 blagi neželjeni događaj (glavobolja) koji je potencijalno bio povezan sa primenom agensa. Takođe nije bilo reakcija na mestu injekcije, a fizički pregledi, vitalni znaci i elektrokardiogrami svih subjekata bili su u granicama normale. Pored toga, svi testovi funkcije jetre, nivoi ukupnog bilirubina, međunarodni normalizovani odnos protrombinskog vremena (PT/INR), broj trombocita, nivoi hemoglobina i testovi koagulacije (tj. aktivirano parcijalno protrombinsko vreme (aPTT), protrombinsko vreme (PT), nivoi fibrinogena i nivoi fibrin D-dimera) svih subjekata nisu se menjali tokom studije i bili su u granicama normale.
[0654] Slike 1A - D i 2A - B pokazuju da jedna doza od 0.03 mg/kg AD-57213 dovodi do smanjenja nivoa AT proteina od približno 20% i do 33% (slike 2A i 2B) i do odgovarajućeg smanjenja AT aktivnosti (slike 1A - D) sa trajnošću smanjenja većom od 60 dana.
[0655] Slika 3 dalje pokazuje da postoji značajna povezanost između smanjenja AT i maksimalne generacije trombina. Konkretno, uočen je porast maksimalne generacije trombina do 152%, sa srednjim maksimalnim porastom maksimalnog nivoa trombina od 138% ± 8,9% (srednja vrednost ± SEM). Pored toga, i u skladu sa povećanom generacijom trombina sa povećanim smanjenjem AT, nivoi faktora VIII ili IX bili su normalni.
Primer 2: Primena višestrukih doza AD-57213 ljudskim pacijentima sa hemofilijom A ili B
Kliničko ispitivanje faze I - delovi B, C i D
[0656] U delu B kliničkog ispitivanja faze I AD-57213 (sens lanac (5' do 3'): GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAfL96 (SEQ ID NO: 13); antisens lanac (5' do 3'): usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg (SEQ ID NO:14)), tri pacijenta sa hemofilijom A (n=2) ili B (n=1) su supkutano primili jednokratnu dozu od 0,015 mg/kg svake nedelje tokom tri nedelje (15 mikrograma/kg qw x 3; 15 mcg/kg) AD-57213; šest pacijenata sa hemofilijom A je supkutano primilo 0,045 mg/kg svake nedelje tokom tri nedelje (45 mikrograma/kg qw x 3; 45 mcg/kg) AD-57213; i tri pacijenta sa hemofilijom A (n=2) ili B (n=1) su supkutano primili 0,075 mg/kg svake nedelje tokom tri nedelje (75 mikrograma/kg qw x 3; 75 mcg/kg) AD-57213.
[0657] U delu C kliničkog ispitivanja faze I AD-57213 (sens lanac (5' do 3'): GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAfL96 (SEQ ID NO: 13); antisens lanac (5' do 3'): usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg (SEQ ID NO:14)), tri pacijenta sa hemofilijom A (n=2) ili B (n=1) su supkutano primili mesečnu dozu od 0,225 mg/kg AD-57213 tokom tri meseca (225 mikrograma/kg qm x 3; 225 mcg/kg); tri pacijenta sa hemofilijom A (n=2) ili B (n=1) su supkutano primili mesečnu dozu od 0,450 mg/kg AD-57213 tokom tri meseca (450 mikrograma/kg qm x 3; 450 mcg/kg); tri pacijenta sa hemofilijom A su supkutano primili mesečnu dozu od 0,900 mg/kg AD-57213 tokom tri meseca (900 mikrograma/kg qm x 3; 900 mcg/kg); tri pacijenta sa hemofilijom A su supkutano primili mesečnu dozu od 1,800 mg/kg AD-57213 tokom tri meseca (1800 mikrograma/kg qm x 3; 1800 mcg/kg); i šest pacijenata sa hemofilijom A (n=3) ili B (n=3) su supkutano primili mesečnu fiksnu dozu od 80 mg AD-57213 tokom tri meseca (80 mg qM x 3).
[0658] U delu D kliničkog ispitivanja faze I AD-57213 (sens lanac (5' do 3'): GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAfL96 (SEQ ID NO: 13); antisens lanac (5' do 3'): usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg (SEQ ID NO:14)), šest pacijenata sa hemofilijom A (n=5) ili B (n=1) koji su koristili agense za premošćavanje (BPA) za kontrolu krvarenja, supkutano su primili fiksnu dozu od 50 mg AD-57213 mesečno tokom tri meseca (50 mg qM x 3); i 10 pacijenata sa hemofilijom A koji su koristili agense za premošćavanje (BPA) za kontrolu krvarenja, supkutano su primili fiksnu dozu od 80 mg AD-57213 mesečno tokom tri meseca (80 mg qM x 3).
[0659] Uzorci plazme su uzeti nakon primene AD-57213 radi praćenja nivoa AT proteina, AT aktivnosti i trajanja utišavanja AT proteina. Nivoi AT proteina su praćeni pomoću ELISA testa, a nivoi AT aktivnosti su praćeni generisanjem krivulja generisanja trombina pomoću kalibrisanog automatskog trombinoskopa (tkivni faktor = 1pM). Promena u maksimalnom nivou trombina izračunata je u odnosu na prosečnu vrednost maksimalnog nivoa trombina iz dva merenja pre doze za svakog subjekta.
[0660] Demografski podaci i početne karakteristike pacijenata koji su učestvovali u delovima B, C i D studije dati su u tabeli 2.
Tabela 2. Demografski podaci i osnovne karakteristike učesnika u studiji
Deo B Supkutana Deo C Supkutana mesečna primena x Deo D nedeljna primena x 3 3 Supkutana
Umerena 0 0 0 1 0 1 0 1 0 0
Težina 76 (10) 80 (22) 82 (8) 85 (12) 76 (16) 76 (2) 71 (12) 74 73 73
Deo B Supkutana Deo C Supkutana mesečna primena x Deo D nedeljna primena x 3 3 Supkutana
[0661] Za delove B, C i D studije, nije bilo ozbiljnih neželjenih događaja, nije bilo prekidanja studije, nije bilo reakcija na mestu injekcije, a fizički pregledi, vitalni znaci i elektrokardiogrami svih pacijenata bili su u granicama normale. Pored toga, svi testovi funkcije jetre i kompletna krvna slika svih pacijenata nisu se menjali tokom studije i bili su u granicama normale. Takođe, nije bilo tromboembolijskih događaja tokom ove studije niti klinički značajnog povećanja nivoa fibrin D-dimera kod bilo kog od pacijenata. Svi događaji krvarenja uspešno su kontrolisani standardnom primenom zamenskog faktora ili agensa za premošćavanje. Nadalje, nije bilo slučajeva formiranja antitela na lek (ADA).
[0662] Smanjenje nivoa AT u kohortama od 15 mcg/kg, 45 mcg/kg i 75 mcg/kg, prikazano kao srednje smanjenje AT u odnosu na početnu vrednost, prikazano je na slici 4. Slika 4 pokazuje da nedeljne doze od 0,015 mg/kg tokom tri nedelje AD-57213 rezultiraju srednjim maksimalnim smanjenjem AT od 29% ± 12% (srednja vrednost ± SEM). Maksimalno smanjenje AT iznosilo je do 53%. Slika 4 takođe pokazuje da nedeljne doze od 0,045 mg/kg tokom tri nedelje AD-57213 rezultiraju srednjim maksimalnim smanjenjem AT od 55 ± 9% (srednja vrednost ± SEM) i maksimalnim smanjenjem AT od 86%. Pored toga, slika 4 takođe pokazuje da nedeljne doze od 0,075 mg/kg tokom tri nedelje AD-57213 rezultiraju srednjim maksimalnim smanjenjem AT od 61 ± 8% (srednja vrednost ± SEM) i maksimalnim smanjenjem AT od 74%.
[0663] Smanjenje nivoa AT u kohortama od 225 mcg/kg, 450 mcg/kg, 900 mcg/kg, 1800 mcg/kg i 80 mg, prikazano kao srednje smanjenje AT u odnosu na početnu vrednost, prikazano je na slici 5A. Slika 5A pokazuje da mesečne doze od 0,225 mg/kg tokom tri meseca AD-57213 rezultiraju srednjim maksimalnim smanjenjem AT od 70% ± 9% (srednja vrednost ± SEM). Maksimalno smanjenje AT iznosilo je do 80%. Slika 5A takođe pokazuje da mesečne doze od 0,450 mg/kg tokom tri meseca AD-57213 rezultiraju srednjim maksimalnim smanjenjem AT od 77 ± 5% (srednja vrednost ± SEM) i maksimalnim smanjenjem AT od 85%. Pored toga, slika 5A takođe pokazuje da mesečne doze od 0,900 mg/kg tokom tri meseca AD-57213 rezultiraju srednjim maksimalnim smanjenjem AT od 78 ± 7% (srednja vrednost ± SEM) i maksimalnim smanjenjem AT od 88%. Dalje, slika 5A demonstrira da mesečne doze od 1.800 mg/kg tokom tri meseca AD-57213 rezultiraju srednjim maksimalnim smanjenjem AT od 79 ± 3% (srednja vrednost ± SEM) i maksimalnim smanjenjem AT od 84%. Slika 5A takođe demonstrira da mesečne doze od 80 mg tokom tri meseca AD-57213 rezultiraju srednjim maksimalnim smanjenjem AT od 87 ± 1% (srednja vrednost ± SEM).
[0664] Kao što je demonstrirano na slici 5B, koja prikazuje grafikon doze AD-57213 naspram relativnog najnižeg nivoa AT proteina, primena AD-57213 ljudskim pacijentima smanjuje nivoe AT proteina na način zavisan od doze.
[0665] Evaluacija generisanja trombina kod zdravih ljudskih dobrovoljaca (primer 1) i pacijenata sa hemofilijom A ili B demonstrirala je da nedeljne doze AD-57213 rezultiraju porastom generisanja trombina do 334% (u odnosu na početnu vrednost) kod pacijenata sa hemofilijom sa prosečnim porastom generisanja trombina od 112 ± 38% (p<0,05), u odnosu na početnu vrednost kada je AT smanjen za ≥50% (slika 6B). Slika 6A demonstrira da je maksimalni nivo trombina dostignut kod pacijenata sa hemofilijom A ili B, kojima su primenjene nedeljne doze AD-57213, bio u niskom opsegu generisanja trombina kod normalnih subjekata.
[0666] ROTEM<®>tromboelastometrijska analiza (videti npr. Young, et al. (2013) Blood 121:1944) pune krvi od jednog subjekta (subjekt 101-009) demonstrira da primena AD-57213 u dozi od 0,045 mg/kg nedeljno tokom tri nedelje ne samo da rezultira porastom maksimalne generacije trombina, već i značajnim i trajnim poboljšanjem formiranja ugruška pune krvi, što je demonstrirano smanjenjem vremena formiranja ugruška i vremena zgrušavanja (slika 7).
Subjekt 101-009 nije imao događaje krvarenja od 2. dana i trenutno je bez krvarenja već 47 dana.
[0667] Post-hoc analiza generisanja trombina po kvartilima smanjenja AT (delovi B i C) demonstrira da, u kvartilu sa najvećim smanjenjem AT (>75% smanjenja AT), postoji porast od 289% u srednjem generisanju trombina u odnosu na početnu vrednost (slika 9). Ovaj nivo generisanja trombina je u rasponu generisanja trombina uočenog kod zdravih dobrovoljaca.
[0668] Podstudija sa tri pacijenta istraživala je ekvivalentnost primene AD-57213 i faktora VIII. Faktor VIII je primenjen svakom od tri pacijenta, a uzorci plazme su uzeti pre, i na -0,5, 1, 2, 6, 24 i 48 sati nakon primene. Ovi uzorci su analizirani na nivoe faktora VIII i nivoe generisanja trombina, te su korišćeni za uspostavljanje individualnih odnosa između faktora VIII i maksimalne generacije trombina. Ovi podaci su potom upoređeni sa nivoima maksimalne generacije trombina postignutim primenom AD-57213. Kao što je prikazano na slikama 10A-10C, primena AD-57213 je dovoljna da se kod subjekta postignu vršni nivoi stvaranja trombina na otprilike istom nivou kao što se postižu primenom faktora VIII, i dovoljna da se postignu vršni nivoi stvaranja trombina veći od oko 40% kod subjekta.
[0669] Post-hoc analiza događaja krvarenja po kvartilu smanjenja AT (delovi B i C) pokazuje da postoji smanjena tendencija krvarenja sa porastom nivoa smanjenja AT, sa srednjom procenjenom godišnjom stopom krvarenja (ABR) od 5 ± 2 (medijana = 1) u najvišem kvartilu smanjenja AT (slika 11). Ova analiza obuhvata više od 1100 kumulativnih dana sa smanjenjem AT >75% kod 16 pacijenata.
[0670] Post-hoc analiza događaja krvarenja u kohorti dela C je takođe izvršena. Slika 12 pruža podatke o pacijentima korišćenim za ovu analizu. Na slici 13A je prikazano da je istorijska medijana ABR za sve pacijente uključene u kohortu C koji su primali profilaktičke (PPx) zamenske faktore bila 2, dok je istorijska medijana ABR za pacijente koji su primali zamenske faktore po potrebi (OD) bila 28. Primena AD-57213 kod ovih pacijenata rezultirala je značajnim smanjenjem medijane ABR. Konkretno, primena AD-57213 rezultovala je time da je medijana od 53% pacijenata prijavila da nije imala krvarenja tokom perioda posmatranja (od 29. dana do poslednje posete studiji ili poslednje doze 56 dana, šta god da je ranije), a medijana od 82% pacijenata prijavila je da nije imala spontana krvarenja tokom perioda posmatranja. Slika 13B pokazuje da je za pacijente koji su primali mesečne doze AD-57213 od 80 mg u kohorti C i profilaktičke zamenske faktore (PPx), medijana istorijske ABR (godišnje stope krvarenja) bila 6. Nakon primene AD-57213, medijana ABR tokom perioda posmatranja bila je 0.
[0671] Deo D studije faze I procenjivao je efekat primene AD-57213 kod pacijenata sa hemofilijom A ili B koji su razvili antitela (inhibitore) protiv zamenskih faktora koji su im dati i, stoga, postali refraktarni na zamenski faktor koagulacije. U skladu s tim, kako bi se procenio odgovor na maksimalnu generaciju trombina kod ovih pacijenata, pre primene AD-57213 pacijentima uključenim u kohortu od 50 mg je primenjen njihov standardni agens za premošćavanje (BPA) (npr. aktivirani koncentrat protrombinskog kompleksa (APCC) i/ili rekombinantni aktivirani FVII (rFVIIa)), uzorci plazme su sakupljeni na -1, 2, 6, i 24 sata nakon primene BPA, a uzorci su analizirani na generaciju trombina. Kao što je prikazano na slikama 14A-14F, smanjenje AT i generisanje trombina kod pacijenata sa inhibitorima kojima je primenjen AD-57213 su uporedivi sa smanjenjem AT i generisanjem trombina uočenim nakon primene AD-57213 sa sličnim dozama kod pacijenata bez inhibitora. Nadalje, slike 14A-14F pokazuju da generisanje trombina nakon primene AD-57213 dosledno premašuje prolazne nivoe postignute primenom BPA.
[0672] Kao što je demonstrirano na slici 15, jednomesečno supkutano doziranje AD-57213 u dozama od 50 mg i 80 mg postiže smanjenje AT zavisno od doze od oko 80% kod pacijenata sa hemofilijom i sa inhibitorima. Nadalje, kao što je demonstrirano na slici 16, efekat smanjenja AT postignut kod pacijenata kojima je primenjen AD-57213 je u korelaciji sa povećanim generisanjem trombina.
[0673] Takođe je izvršena eksploratorna post-hoc analiza događaja krvarenja kod pacijenata u delu D studije. Slika 17A pokazuje da primena AD-57213 pacijentima sa inhibitorima koji imaju hemofiliju A ili B jednom mesečno u dozi od 50 mg ili 80 mg rezultira značajnim smanjenjem ABR-a pre studije. Nadalje, kao što je demonstrirano na slici 17B, medijana godišnje stope krvarenja (ABR) je nula za sve pacijente sa inhibitorima kojima je primenjen AD-57213 u delu D ove studije faze I, a 56% pacijenata je bez krvarenja, dok je 69% pacijenata doživelo nula spontanih krvarenja.
[0674] Ukratko, AD-57213 se dobro podnosi kod pacijenata sa hemofilijom A i B, sa inhibitorima i bez njih. Nije bilo ozbiljnih neželjenih događaja (SAE) povezanih sa lekom u studiji, niti tromboemboličnih događaja. Podaci pokazuju da postoji klinička aktivnost i korekcija fenotipa hemofilije kod pacijenata bez inhibitora. Podaci dalje demonstriraju da postoji smanjenje AT zavisno od doze i porast generisanja trombina, uz jednomesečni režim supkutanog doziranja, i da primena fiksne doze od 50 mg ili 80 mg AD-57213 pruža dosledno smanjenje AT od približno 80%.
[0675] Nadalje, podaci pokazuju da primena AD-57213 pacijentima sa inhibitorima rezultira smanjenjem AT i porastom generisanja trombina koji su u skladu sa onima kod pacijenata bez inhibitora, i da porast generisanja trombina dosledno premašuje one postignute prolazno primenom BPA.
Primer 3: Primena višestrukih doza AD-57213 ljudskim pacijentima sa hemofilijom A ili B
Kliničko ispitivanje faze II sa otvorenim etiketiranjem (OLE)
[0676] U OLE studiju faze II AD-57213 (sens lanac (5' do 3'):
GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAfL96 (SEQ ID NO: 13); antisens lanac (5' do 3'): usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg (SEQ ID NO: 14)), pacijenti bez inhibitora, koji su prethodno primali AD-57213 u kliničkim ispitivanjima faze I Delovi B i C, opisanim iznad, bili su podobni za uključivanje u ovu studiju sa otvorenim etiketiranjem (OLE) faze II. Dvanaest pacijenata iz faze I dela B studije imajući hemofiliju A ili B koji su bili supkutano primenjeni 0,015 mg/kg nedeljno za tri nedelje (15 mikrograma/kg qw x 3; 15 mcg/kg) AD-57213; ili su bili supkutano primenjeni 0,045 mg/kg nedeljno za tri nedelje (45 mikrograma/kg qw x 3; 45 mcg/kg) AD-57213; ili su bili supkutano primenjeni 0,075 mg/kg nedeljno za tri nedelje (75 mikrograma/kg qw x 3; 75 mcg/kg) AD-57213; i 18 pacijenata iz faze I dela C studije imajući hemofiliju A ili B koji su bili supkutano primenjeni mesečnu 0,225 mg/kg dozu AD-57213 za tri meseca (225 mikrograma/kg qm x 3; 225 mcg/kg); ili su bili supkutano primenjeni mesečnu 0,450 mg/kg dozu AD-57213 za tri meseca (450 mikrograma/kg qm x 3; 450 mcg/kg); ili su bili supkutano primenjeni mesečnu 0,900 mg/kg dozu AD-57213 za tri meseca (900 mikrograma/kg qm x 3; 900 mcg/kg); ili su bili supkutano primenjeni mesečnu 1,800 mg/kg dozu AD-57213 za tri meseca (1800 mikrograma/kg qm x 3; 1800 mcg/kg); ili su bili supkutano primenjeni mesečnu fiksnu dozu od 80 mg AD-57213 za tri meseca (80 mg qM x 3) su bili podobni da budu upisani u ovu studiju.
[0677] U studiju je uključeno šesnaest pacijenata. Osam pacijenata sa hemofilijom A (n=6) ili hemofilijom B (n=2) supkutano je primalo fiksnu dozu AD-57213 od 50 mg mesečno tokom tri meseca (50 mg qM x 3); dok je osam pacijenata sa hemofilijom A (n=7) ili hemofilijom B (n=1) supkutano primalo fiksnu dozu AD-57213 od 80 mg mesečno tokom tri meseca (50 mg qM x 3). Demografski podaci i osnovne karakteristike pacijenata uključenih u ovu studiju prikazani su u tabeli 3. u nastavku.
Tabela 3. Demografski podaci i osnovne karakteristike učesnika u studiji
[0678] AD-57213 se generalno dobro podnosio kod pacijenata bez inhibitora u OLE studiji Faze II, sa najdužim periodom izloženosti do 14 meseci kontinuiranog lečenja, i nije bilo ozbiljnih neželjenih događaja (SAE) povezanih sa lekom u studiji, kao ni prekida studije zbog neželjenih događaja, niti tromboemboličnih događaja ili laboratorijskih dokaza o patološkom formiranju ugrušaka. Svi neželjeni događaji (AE) bili su blagi ili umereni po težini, a najčešći su bile blage reakcije na mestu injekcije (ISR) kod 4/16 (25%) pacijenata. Asimptomatska povećanja alanin aminotransferaze (ALT) veća od 3 puta od gornje granice normale (ULN), bez istovremenog povišenja bilirubina više od 2 puta ULN, uočena su kod 3 pacijenta, od kojih su svi imali hepatitis C u anamnezi. Svi događaji probojnog krvarenja su uspešno kontrolisani primenom zamenskog faktora. Nadalje, nije bilo slučajeva formiranja antitela na lek (ADA).
[0679] Slika 19A i 19B dalje demonstriraju kliničku aktivnost primene AD-57213. Konkretno, kao što je prikazano na slici 19A, jednomesečno supkutano doziranje AD-57213 od 50 mg ili 80 mg postiže smanjenje AT zavisno od doze od ~80%, i kao što je prikazano na slici 19B, jednomesečno supkutano doziranje AD-57213 od 50 mg ili 80 mg postiže nivoe generacije trombina koji se približavaju donjoj granici normalnog opsega.
[0680] Izvršena je i istraživačka post-hoc analiza događaja krvarenja kod pacijenata bez inhibitora u OLE studiji faze II. Slika 20A pokazuje da primena AD-57213 pacijentima sa hemofilijom A ili B jednom mesečno u dozi od 50 mg ili 80 mg rezultira značajnim smanjenjem ABR pre studije. Nadalje, kao što je prikazano na slici 20B, primena AD-57213 pacijentima sa hemofilijom A ili B jednom mesečno u dozi od 50 mg ili 80 mg smanjuje medijanu godišnje stope krvarenja (ABR) na 1, a medijanu godišnje stope spontanog krvarenja (AsBR) na nulu.
[0681] Pored toga, tokom OLE studije faze II, jedan pacijent (subjekt C1-3) podvrgnut je elektivnom hirurškom zahvatu. Konkretno, pacijentu sa teškom hemofilijom A koji je primao 50 mg AD-57213 mesečno urađena je elektivna septoplastika. Procedura je uspešno obavljena bez povezanih neželjenih događaja. Dalje, kako je izvestio istraživač putem lične komunikacije, kumulativna perioperativna upotreba rekombinantnog faktora VIII bila je približno 5 puta manja nego što je istraživač uobičajeno koristio za ovu vrstu operacije kod pacijenta sa teškom hemofilijom A. Na osnovu ocene hemostaze prema skoru Međunarodnog društva za trombozu i hemostazu (ISTH), istraživač je ocenio kontrolu hemostaze u intraoperativnom periodu, 24 sata nakon operacije i 7 dana nakon operacije kao „izvrsnu“.
[0682] Ukratko, AD-57213 je generalno dobro podnošen kod pacijenata sa hemofilijom A i B bez inhibitora. Nije bilo SAE i nije bilo tromboembolijskih događaja povezanih sa primenom AD-57213. Pored toga, podaci pokazuju da AD-57213 ima kliničku aktivnost, jer jednomesečno supkutano doziranje od 50 mg i 80 mg postiže smanjenje AT zavisno od doze od ~80% i nivoe generacije trombina koji se približavaju donjoj granici normalnog opsega. Nadalje, istraživačka post-hoc analiza događaja krvarenja kod pacijenata sa hemofilijom A ili B bez inhibitora pokazuje da je primena AD-57213 smanjila medijanu ABR na 1, a medijanu godišnje stope spontanog krvarenja (AsBR) na nulu. Osam od šesnaest (50%) pacijenata bilo je bez krvarenja, a jedanaest od šesnaest (69%) pacijenata nije doživelo spontana krvarenja.
Štaviše, tokom prvog hirurškog slučaja kod subjekta sa teškom hemofilijom A kojem je primenjen AD-57213, korišćeno je značajno smanjenje zamenskog faktora za održavanje hemostaze kod subjekta.

Claims (28)

  1. Patentni zahtevi 1. Dvolančani RNKi agens za upotrebu u sprečavanju najmanje jednog simptoma kod, ili u lečenju, ljudskog subjekta koji ima poremećaj kod koga bi bila korisna redukcija ekspresije Serpinc1, pri čemu se dvolančani RNKi agens primenjuje subjektu kao fiksna doza od oko 40 mg do oko 90 mg, pri čemu dvolančani RNKi agens sadrži sens lanac i antisens lanac, antisens lanac koji sadrži region komplementarnosti koji se sastoji od najmanje 15 uzastopnih nukleotida koji se ne razlikuju za više od 3 nukleotida od nukleotidne sekvence 5'-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3' (SEQ ID NO: 15), pri čemu su suštinski svi nukleotidi sens lanca i suštinski svi nukleotidi antisens lanca modifikovani nukleotidi, i pri čemu je sens lanac konjugovan sa ligandom pričvršćenim na 3' kraju.
  2. 2. Dvolančani RNKi agens za upotrebu iz patentnog zahteva 1, pri čemu se fiksna doza dvolančanog RNKi agensa primenjuje subjektu jednom mesečno, jednom u šest nedelja, jednom u 2 meseca, ili kvartalno.
  3. 3. Dvolančani RNKi agens za upotrebu iz patentnog zahteva 1 ili 2, pri čemu se dvolančani RNKi agens primenjuje subjektu kao fiksna doza od oko 50 mg ili oko 80 mg.
  4. 4. Dvolančani RNKi agens za upotrebu iz bilo kog od patentnih zahteva 1-3, pri čemu se dvolančani RNKi agens primenjuje subjektu supkutano.
  5. 5. Dvolančani RNKi agens za upotrebu iz bilo kog od patentnih zahteva 1-4, pri čemu primena dvolančanog RNKi agensa subjektu (i) smanjuje aktivnost Serpinc1 kod subjekta za oko 70% do oko 95%; i/ili (ii) povećava maksimalne nivoe trombina kod subjekta u rasponu maksimalnih nivoa trombina kod subjekta koji nema poremećaj kod koga bi bila korisna redukcija ekspresije Serpinc1; i/ili (iii) je dovoljna da se postignu nivoi maksimalne generacije trombina kod subjekta na približno istom nivou postignutom primenom faktora VIII subjektu; i/ili (iv) je dovoljna da se postignu nivoi maksimalne generacije trombina veći od oko 40% ekvivalentnosti sa primenom faktora VIII kod subjekta; i/ili (v) smanjuje godišnju stopu krvarenja (ABR) subjekta za oko 80 do oko 95% u poređenju sa medijanom istorijske ABR za terapiju po potrebi kod subjekata koji imaju poremećaj kod koga bi bila korisna redukcija ekspresije Serpinc1, a kojima se ne primenjuje dvolančani RNKi agens.
  6. 6. Dvolančani RNKi agens za upotrebu iz bilo kog od patentnih zahteva 1-5, pri čemu je poremećaj, poremećaj krvarenja.
  7. 7. Dvolančani RNKi agens za upotrebu iz patentnog zahteva 6, pri čemu je poremećaj krvarenja: (i) stečeni poremećaj krvarenja ili nasledni poremećaj krvarenja; ili (ii) hemofilija.
  8. 8. Dvolančani RNKi agens za upotrebu iz patentnog zahteva 7(ii), pri čemu je hemofilija hemofilija A ili hemofilija B; hemofilija je hemofilija A i subjekt je subjekt sa inhibitorom; ili hemofilija je hemofilija B i subjekt je subjekt sa inhibitorom.
  9. 9. Dvolančani RNKi agens za upotrebu iz bilo kog od patentnih zahteva 1-8, pri čemu su svi nukleotidi sens lanca i svi nukleotidi antisens lanca modifikovani nukleotidi.
  10. 10. Dvolančani RNKi agens za upotrebu iz bilo kog od patentnih zahteva 1-9, pri čemu su modifikovani nukleotidi nezavisno odabrani iz grupe koja se sastoji od 2'-deoksi-2'-fluoro modifikovanog nukleotida, 2'-deoksi-modifikovanog nukleotida, zaključanog nukleotida, abazičnog nukleotida, 2'-amino-modifikovanog nukleotida, 2'-alkilmodifikovanog nukleotida, 2'-O-metil modifikovanog nukleotida, 2'-fluoromodifikovanog nukleotida, morfolino nukleotida, fosforamidata, nukleotida koji sadrži fosforotioatnu grupu, terminalnog nukleotida povezanog sa holesterilnim derivatom ili dodekanskom kiselinom bisdecilamid grupom, i nukleotida koji sadrži neprirodnu bazu.
  11. 11. Dvolančani RNKi agens za upotrebu iz bilo kog od patentnih zahteva 1-10, pri čemu je region komplementarnosti: (i) dužine najmanje 17 nukleotida; i/ili (ii) dužine između 19 i 21 nukleotida.
  12. 12. Dvolančani RNKi agens za upotrebu iz patentnog zahteva 11(ii), pri čemu je region komplementarnosti dužine 21 nukleotid.
  13. 13. Dvolančani RNKi agens za upotrebu iz bilo kog od patentnih zahteva 1-12, pri čemu svaki lanac nije duži od 30 nukleotida.
  14. 14. Dvolančani RNKi agens za upotrebu iz bilo kog od patentnih zahteva 1-13, pri čemu najmanje jedan lanac sadrži 3' izbočinu od najmanje 1 nukleotida.
  15. 15. Dvolančani RNKi agens za upotrebu iz bilo kog od patentnih zahteva 1-14, pri čemu najmanje jedan lanac sadrži 3' izbočinu od najmanje 2 nukleotida.
  16. 16. Dvolančani RNKi agens za upotrebu iz bilo kog od patentnih zahteva 1-15, pri čemu je ligand N-acetilgalaktozamin (GalNAc) derivat.
  17. 17. Dvolančani RNKi agens za upotrebu iz bilo kog od patentnih zahteva 1-16, pri čemu je ligand
  18. 18. Dvolančani RNKi agens za upotrebu iz patentnog zahteva 17, pri čemu je dvolančani RNKi agens konjugovan na 3' kraju sens lanca sa ligandom kao što je prikazano na sledećoj šemi
    i gde je X O ili S; poželjno gde je X O.
  19. 19. Dvolančani RNKi agens za upotrebu iz bilo kog od patentnih zahteva 1-18, pri čemu dvolančani RNKi agens sadrži sens lanac koji sadrži nukleotidnu sekvencu 5'-GGUUAACACCAUUUACUUCAA -3' (SEQ ID NO: 16), i antisens lanac koji sadrži nukleotidnu sekvencu 5'-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3' (SEQ ID NO: 15).
  20. 20. Dvolančani RNKi agens za upotrebu iz patentnog zahteva 19, pri čemu sens lanac sadrži sekvencu 5'-GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf-3' (SEQ ID NO:13) i antisens lanac sadrži sekvencu 5'-usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg-3' (SEQ ID NO:14), pri čemu su a, c, g i u 2'-O-metil (2'-OMe) A, C, G i U; Af, Cf, Gf i Uf su 2'-fluoro A, C, G i U; i s je fosforotioatna veza.
  21. 21. Dvolančani RNKi agens za upotrebu iz bilo kog od patentnih zahteva 1-20, pri čemu sens lanac sadrži sekvencu 5'-GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf-3' (SEQ ID NO:13) i antisens lanac sadrži sekvencu 5'-usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg-3' (SEQ ID NO:14), pri čemu su a, c, g i u 2'-O-metil (2'-OMe) A, C, G i U; Af, Cf, Gf i Uf su 2'-fluoro A, C, G i U; i s je fosforotioatna veza; i pri čemu je sens lanac konjugovan na 3' kraju sa ligandom kao što je prikazano na sledećoj šemi
    , gde je X O ili S.
  22. 22. Dvolančani RNKi agens za upotrebu iz bilo kog od patentnih zahteva 1-21, pri čemu se dvolančani RNKi agens primenjuje subjektu kao farmaceutska kompozicija.
  23. 23. Dvolančani RNKi agens za upotrebu iz patentnog zahteva 22, pri čemu se dvolančani RNKi agens primenjuje subjektu: (i) u nepuferovanom rastvoru, pri čemu je poželjno da nepuferovani rastvor bude fiziološki rastvor ili voda; ili (ii) u puferovanom rastvoru.
  24. 24. Dvolančani RNKi agens za upotrebu iz patentnog zahteva 23(ii), pri čemu puferovani rastvor sadrži acetat, citrat, prolamin, karbonat ili fosfat ili bilo koju njihovu kombinaciju.
  25. 25. Dvolančani RNKi agens za upotrebu iz patentnog zahteva 24, pri čemu je puferovani rastvor fosfatno puferovani fiziološki rastvor.
  26. 26. Komplet za upotrebu u sprečavanju najmanje jednog simptoma kod, ili lečenju, subjekta koji ima poremećaj kod koga bi bila korisna redukcija ekspresije Serpinc1, koji sadrži a) dvolančani RNKi agens iz bilo kog od patentnih zahteva 1-25, pri čemu se dvolančani RNKi agens primenjuje subjektu u fiksnoj dozi od oko 40 mg do oko 90 mg, i b) uputstva za upotrebu, i c) opciono, sredstva za primenu dvolančanog RNKi agensa subjektu.
  27. 27. Dvolančani RNKi agens za upotrebu iz patentnog zahteva 1, pri čemu je poremećaj hemofilija, pri čemu se dvolančani RNKi agens primenjuje subjektu kao fiksna doza od 80 mg jednom mesečno, i pri čemu je sekvenca sens lanca 5'-GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf-3' (SEQ ID NO:13) i sekvenca antisens lanca je 5'-usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg-3' (SEQ ID NO:14), pri čemu su a, c, g i u 2'-O-metil (2'-OMe) A, C, G i U; Af, Cf, Gf i Uf su 2'-fluoro A, C, G i U; i s je fosforotioatna veza; i pri čemu je sens lanac konjugovan na 3' kraju sa ligandom kao što je prikazano na sledećoj šemi
    , gde je X O.
  28. 28. Komplet za upotrebu iz patentnog zahteva 26, pri čemu je poremećaj hemofilija, pri čemu se dvolančani RNKi agens primenjuje subjektu supkutano kao fiksna doza od 80 mg jednom mesečno, i pri čemu se sens lanac sastoji od 5'-GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf-3' (SEQ ID NO:13) i antisens lanac se sastoji od 5'-usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg-3' (SEQ ID NO:14), pri čemu su a, c, g i u 2'-O-metil (2'-OMe) A, C, G i U; Af, Cf, Gf i Uf su 2'-fluoro A, C, G i U; i s je fosforotioatna veza; i pri čemu je sens lanac konjugovan na 3' kraju sa ligandom kao što je prikazano na sledećoj šemi
    , gde je X O.
RS20250930A 2015-12-07 2016-12-07 Metode i kompozicije za lečenje poremećaja povezanog sa serpinc1 RS67250B1 (sr)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562264013P 2015-12-07 2015-12-07
US201662315228P 2016-03-30 2016-03-30
US201662366304P 2016-07-25 2016-07-25
US201662429241P 2016-12-02 2016-12-02
PCT/US2016/065245 WO2017100236A1 (en) 2015-12-07 2016-12-07 Methods and compositions for treating a serpinc1-associated disorder
EP16822817.9A EP3386518B1 (en) 2015-12-07 2016-12-07 Methods and compositions for treating a serpinc1-associated disorder

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS67250B1 true RS67250B1 (sr) 2025-10-31

Family

ID=58800158

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20250930A RS67250B1 (sr) 2015-12-07 2016-12-07 Metode i kompozicije za lečenje poremećaja povezanog sa serpinc1

Country Status (24)

Country Link
US (2) US11091759B2 (sr)
EP (2) EP4424828A1 (sr)
JP (3) JP6985283B2 (sr)
KR (3) KR20230119027A (sr)
CN (2) CN120284999A (sr)
AU (3) AU2016368289C1 (sr)
BR (1) BR112018011450A2 (sr)
CA (1) CA3007014A1 (sr)
CO (1) CO2018006590A2 (sr)
DK (1) DK3386518T3 (sr)
ES (1) ES3041380T3 (sr)
FI (1) FI3386518T3 (sr)
HR (1) HRP20251125T1 (sr)
IL (2) IL308717A (sr)
LT (1) LT3386518T (sr)
MX (2) MX2018006989A (sr)
PL (1) PL3386518T3 (sr)
PT (1) PT3386518T (sr)
RS (1) RS67250B1 (sr)
RU (2) RU2754188C2 (sr)
SG (2) SG11201804729RA (sr)
SI (1) SI3386518T1 (sr)
TW (3) TW202423457A (sr)
WO (1) WO2017100236A1 (sr)

Families Citing this family (47)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3212794B1 (en) 2014-10-30 2021-04-07 Genzyme Corporation Polynucleotide agents targeting serpinc1 (at3) and methods of use thereof
ES3041380T3 (en) 2015-12-07 2025-11-11 Genzyme Corp Methods and compositions for treating a serpinc1-associated disorder
EP3649243A1 (en) * 2017-07-07 2020-05-13 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating or preventing contact-activation pathway-associated diseases using irna compositions targeting factor xii (hageman factor) (f12)
JP2020530442A (ja) * 2017-07-10 2020-10-22 ジェンザイム・コーポレーション 血友病を有する対象の出血事象を処置するための方法および組成物
EP3775209A1 (en) * 2018-04-05 2021-02-17 Silence Therapeutics GmbH Sirnas with at least two ligands at different ends
EP3550021A1 (en) * 2018-04-05 2019-10-09 Silence Therapeutics GmbH Products and compositions for inhibiting expression of a target gene
WO2020055917A1 (en) * 2018-09-10 2020-03-19 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for modulating cln3 expression
AU2019406186A1 (en) * 2018-12-20 2021-07-15 Praxis Precision Medicines, Inc. Compositions and methods for the treatment of KCNT1 related disorders
CN113557023A (zh) * 2019-01-16 2021-10-26 建新公司 Serpinc1 iRNA组合物及其使用方法
KR20220163960A (ko) * 2020-03-06 2022-12-12 알리고스 테라퓨틱스 인코포레이티드 변경된 짧은 개재성 핵산(siNA) 분자 및 이의 용도
CA3188137A1 (en) 2020-06-22 2021-12-30 Genzyme Corporation Methods and compositions for treating hemophilia
WO2022120291A1 (en) 2020-12-06 2022-06-09 Genzyme Corporation Treatment of hemophilia with fitusiran
EP4255566A1 (en) 2020-12-06 2023-10-11 Genzyme Corporation Treatment of hemophilia with fitusiran
TW202342065A (zh) 2021-12-22 2023-11-01 美商健臻公司 治療血友病的方法和組成物
WO2023118150A1 (en) 2021-12-22 2023-06-29 Royal College Of Surgeons In Ireland A conjugate for use in localising a molecule to the vascular endothelium.
AU2023284452A1 (en) 2022-06-08 2025-01-23 Genzyme Corporation Fitusiran for the treatment of hemophilia a and b
WO2023240193A2 (en) 2022-06-08 2023-12-14 Genzyme Corporation Treatment of hemophilia with fitusiran in pediatric patients
CN120129547A (zh) 2022-10-31 2025-06-10 赛诺菲 用于药物递送装置的装置本体、用于药物递送装置的组件以及药物递送装置
WO2024094705A1 (en) 2022-10-31 2024-05-10 Sanofi Drug delivery device having a two-part user indicator
CN120476001A (zh) 2022-10-31 2025-08-12 赛诺菲 用于药物递送装置的前子组件
CN120187475A (zh) 2022-10-31 2025-06-20 赛诺菲 用于药物递送装置的组件
WO2024094703A1 (en) 2022-10-31 2024-05-10 Sanofi Plunger for expelling a drug, drug delivery device, rear sub-assembly and corresponding methods
EP4611855A1 (en) 2022-10-31 2025-09-10 Sanofi Audible indicator, indicator holder and method of assembling an audible indicator
WO2024094704A1 (en) 2022-10-31 2024-05-10 Sanofi Arrangement for a drug delivery device, drug delivery device and method for assembly
EP4611851A1 (en) 2022-10-31 2025-09-10 Sanofi Drug delivery device with feedback element and method for providing a user of a drug delivery device feedback regarding a dose dispensing process
CN120187476A (zh) 2022-10-31 2025-06-20 赛诺菲 容器固持器以及包括该容器固持器的药物递送装置
EP4611849A1 (en) 2022-10-31 2025-09-10 Sanofi Method for assembling an assembly for a drug delivery device and drug delivery device
EP4612687A1 (en) 2022-11-02 2025-09-10 Genzyme Corporation Systems and methods for modeling thrombin-antithrombin
CN118853663A (zh) * 2023-04-28 2024-10-29 北京福元医药股份有限公司 用于抑制marc1基因表达的双链核糖核酸及其修饰物、缀合物和用途
WO2024251792A1 (en) 2023-06-05 2024-12-12 Sanofi Drug delivery device
WO2024251796A1 (en) 2023-06-05 2024-12-12 Sanofi Drug delivery device having two drug delivery arrangements
WO2024251793A1 (en) 2023-06-05 2024-12-12 Sanofi Drug delivery device
WO2024251797A1 (en) 2023-06-05 2024-12-12 Sanofi Drug delivery device
WO2024251800A1 (en) 2023-06-05 2024-12-12 Sanofi Drug delivery device
WO2024251798A1 (en) 2023-06-05 2024-12-12 Sanofi Drug delivery device
WO2024251801A1 (en) 2023-06-05 2024-12-12 Sanofi Drug delivery device with laterally flexible needle sleeve
WO2024251794A1 (en) 2023-06-05 2024-12-12 Sanofi Piercing closure assistance member, drug delivery device and method
WO2024251795A1 (en) 2023-06-05 2024-12-12 Sanofi Drug delivery device
WO2024251799A1 (en) 2023-06-05 2024-12-12 Sanofi Self-driven medicament container and medicament delivery device
WO2024251802A1 (en) 2023-06-05 2024-12-12 Sanofi Drug delivery device and method for decoupling a drug administration element and at least one part of a drug delivery device
TW202525306A (zh) 2023-09-15 2025-07-01 美商健臻公司 用非妥西蘭（ｆｉｔｕｓｉｒａｎ）治療ａ型血友病
WO2025162927A1 (en) 2024-01-29 2025-08-07 Sanofi Purifying device, system and method for purifying a needle for delivering a medicament
WO2025162926A1 (en) 2024-01-29 2025-08-07 Sanofi Needle arrangement, drug delivery device comprising the needle arrangement and method for operating the drug delivery device
WO2025162928A1 (en) 2024-01-29 2025-08-07 Sanofi Needle shroud unlock device for a medicament delivery device
WO2025171279A1 (en) 2024-02-09 2025-08-14 Genzyme Corporation Treatment of hemophilia with fitusiran
WO2025212516A1 (en) 2024-04-01 2025-10-09 Genzyme Corporation Treatment of factor x deficiency with fitusiran
CN118557756B (zh) * 2024-05-24 2025-04-29 华中科技大学同济医学院附属协和医院 一种基于aav的遗传性抗凝血酶缺乏的基因疗法

Family Cites Families (247)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3687808A (en) 1969-08-14 1972-08-29 Univ Leland Stanford Junior Synthetic polynucleotides
US4469863A (en) 1980-11-12 1984-09-04 Ts O Paul O P Nonionic nucleic acid alkyl and aryl phosphonates and processes for manufacture and use thereof
US5023243A (en) 1981-10-23 1991-06-11 Molecular Biosystems, Inc. Oligonucleotide therapeutic agent and method of making same
US4517294A (en) 1982-03-03 1985-05-14 Genentech, Inc. Human antithrombin III
US4476301A (en) 1982-04-29 1984-10-09 Centre National De La Recherche Scientifique Oligonucleotides, a process for preparing the same and their application as mediators of the action of interferon
JPS5927900A (ja) 1982-08-09 1984-02-14 Wakunaga Seiyaku Kk 固定化オリゴヌクレオチド
FR2540122B1 (fr) 1983-01-27 1985-11-29 Centre Nat Rech Scient Nouveaux composes comportant une sequence d'oligonucleotide liee a un agent d'intercalation, leur procede de synthese et leur application
US4605735A (en) 1983-02-14 1986-08-12 Wakunaga Seiyaku Kabushiki Kaisha Oligonucleotide derivatives
US4948882A (en) 1983-02-22 1990-08-14 Syngene, Inc. Single-stranded labelled oligonucleotides, reactive monomers and methods of synthesis
US4824941A (en) 1983-03-10 1989-04-25 Julian Gordon Specific antibody to the native form of 2'5'-oligonucleotides, the method of preparation and the use as reagents in immunoassays or for binding 2'5'-oligonucleotides in biological systems
US4587044A (en) 1983-09-01 1986-05-06 The Johns Hopkins University Linkage of proteins to nucleic acids
US5118800A (en) 1983-12-20 1992-06-02 California Institute Of Technology Oligonucleotides possessing a primary amino group in the terminal nucleotide
US5118802A (en) 1983-12-20 1992-06-02 California Institute Of Technology DNA-reporter conjugates linked via the 2' or 5'-primary amino group of the 5'-terminal nucleoside
US5550111A (en) 1984-07-11 1996-08-27 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education Dual action 2',5'-oligoadenylate antiviral derivatives and uses thereof
FR2567892B1 (fr) 1984-07-19 1989-02-17 Centre Nat Rech Scient Nouveaux oligonucleotides, leur procede de preparation et leurs applications comme mediateurs dans le developpement des effets des interferons
US5367066A (en) 1984-10-16 1994-11-22 Chiron Corporation Oligonucleotides with selectably cleavable and/or abasic sites
US5258506A (en) 1984-10-16 1993-11-02 Chiron Corporation Photolabile reagents for incorporation into oligonucleotide chains
US5430136A (en) 1984-10-16 1995-07-04 Chiron Corporation Oligonucleotides having selectably cleavable and/or abasic sites
US4828979A (en) 1984-11-08 1989-05-09 Life Technologies, Inc. Nucleotide analogs for nucleic acid labeling and detection
FR2575751B1 (fr) 1985-01-08 1987-04-03 Pasteur Institut Nouveaux nucleosides de derives de l'adenosine, leur preparation et leurs applications biologiques
US5405938A (en) 1989-12-20 1995-04-11 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
US5166315A (en) 1989-12-20 1992-11-24 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
US5185444A (en) 1985-03-15 1993-02-09 Anti-Gene Deveopment Group Uncharged morpolino-based polymers having phosphorous containing chiral intersubunit linkages
US5034506A (en) 1985-03-15 1991-07-23 Anti-Gene Development Group Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages
US5235033A (en) 1985-03-15 1993-08-10 Anti-Gene Development Group Alpha-morpholino ribonucleoside derivatives and polymers thereof
US4762779A (en) 1985-06-13 1988-08-09 Amgen Inc. Compositions and methods for functionalizing nucleic acids
US5139941A (en) 1985-10-31 1992-08-18 University Of Florida Research Foundation, Inc. AAV transduction vectors
US5130300A (en) 1986-03-07 1992-07-14 Monsanto Company Method for enhancing growth of mammary parenchyma
US5317098A (en) 1986-03-17 1994-05-31 Hiroaki Shizuya Non-radioisotope tagging of fragments
JPS638396A (ja) 1986-06-30 1988-01-14 Wakunaga Pharmaceut Co Ltd ポリ標識化オリゴヌクレオチド誘導体
US5276019A (en) 1987-03-25 1994-01-04 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
US5264423A (en) 1987-03-25 1993-11-23 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
US4904582A (en) 1987-06-11 1990-02-27 Synthetic Genetics Novel amphiphilic nucleic acid conjugates
JP2828642B2 (ja) 1987-06-24 1998-11-25 ハワード フローレイ インスティテュト オブ イクスペリメンタル フィジオロジー アンド メディシン ヌクレオシド誘導体
US5585481A (en) 1987-09-21 1996-12-17 Gen-Probe Incorporated Linking reagents for nucleotide probes
US5188897A (en) 1987-10-22 1993-02-23 Temple University Of The Commonwealth System Of Higher Education Encapsulated 2',5'-phosphorothioate oligoadenylates
US4924624A (en) 1987-10-22 1990-05-15 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education 2,',5'-phosphorothioate oligoadenylates and plant antiviral uses thereof
US5525465A (en) 1987-10-28 1996-06-11 Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine Oligonucleotide-polyamide conjugates and methods of production and applications of the same
DE3738460A1 (de) 1987-11-12 1989-05-24 Max Planck Gesellschaft Modifizierte oligonukleotide
US5082830A (en) 1988-02-26 1992-01-21 Enzo Biochem, Inc. End labeled nucleotide probe
WO1989009221A1 (en) 1988-03-25 1989-10-05 University Of Virginia Alumni Patents Foundation Oligonucleotide n-alkylphosphoramidates
US5278302A (en) 1988-05-26 1994-01-11 University Patents, Inc. Polynucleotide phosphorodithioates
US5109124A (en) 1988-06-01 1992-04-28 Biogen, Inc. Nucleic acid probe linked to a label having a terminal cysteine
US5216141A (en) 1988-06-06 1993-06-01 Benner Steven A Oligonucleotide analogs containing sulfur linkages
US5175273A (en) 1988-07-01 1992-12-29 Genentech, Inc. Nucleic acid intercalating agents
US5262536A (en) 1988-09-15 1993-11-16 E. I. Du Pont De Nemours And Company Reagents for the preparation of 5'-tagged oligonucleotides
US5512439A (en) 1988-11-21 1996-04-30 Dynal As Oligonucleotide-linked magnetic particles and uses thereof
US5599923A (en) 1989-03-06 1997-02-04 Board Of Regents, University Of Tx Texaphyrin metal complexes having improved functionalization
US5457183A (en) 1989-03-06 1995-10-10 Board Of Regents, The University Of Texas System Hydroxylated texaphyrins
US5391723A (en) 1989-05-31 1995-02-21 Neorx Corporation Oligonucleotide conjugates
US4958013A (en) 1989-06-06 1990-09-18 Northwestern University Cholesteryl modified oligonucleotides
US5032401A (en) 1989-06-15 1991-07-16 Alpha Beta Technology Glucan drug delivery system and adjuvant
US5451463A (en) 1989-08-28 1995-09-19 Clontech Laboratories, Inc. Non-nucleoside 1,3-diol reagents for labeling synthetic oligonucleotides
US5134066A (en) 1989-08-29 1992-07-28 Monsanto Company Improved probes using nucleosides containing 3-dezauracil analogs
US5436146A (en) 1989-09-07 1995-07-25 The Trustees Of Princeton University Helper-free stocks of recombinant adeno-associated virus vectors
US5254469A (en) 1989-09-12 1993-10-19 Eastman Kodak Company Oligonucleotide-enzyme conjugate that can be used as a probe in hybridization assays and polymerase chain reaction procedures
US5591722A (en) 1989-09-15 1997-01-07 Southern Research Institute 2'-deoxy-4'-thioribonucleosides and their antiviral activity
US5399676A (en) 1989-10-23 1995-03-21 Gilead Sciences Oligonucleotides with inverted polarity
DE69034150T2 (de) 1989-10-24 2005-08-25 Isis Pharmaceuticals, Inc., Carlsbad 2'-Modifizierte Oligonukleotide
US5264564A (en) 1989-10-24 1993-11-23 Gilead Sciences Oligonucleotide analogs with novel linkages
US5292873A (en) 1989-11-29 1994-03-08 The Research Foundation Of State University Of New York Nucleic acids labeled with naphthoquinone probe
US5177198A (en) 1989-11-30 1993-01-05 University Of N.C. At Chapel Hill Process for preparing oligoribonucleoside and oligodeoxyribonucleoside boranophosphates
CA2029273A1 (en) 1989-12-04 1991-06-05 Christine L. Brakel Modified nucleotide compounds
US5486603A (en) 1990-01-08 1996-01-23 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide having enhanced binding affinity
US5681941A (en) 1990-01-11 1997-10-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Substituted purines and oligonucleotide cross-linking
US5670633A (en) 1990-01-11 1997-09-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Sugar modified oligonucleotides that detect and modulate gene expression
US5646265A (en) 1990-01-11 1997-07-08 Isis Pharmceuticals, Inc. Process for the preparation of 2'-O-alkyl purine phosphoramidites
US7037646B1 (en) 1990-01-11 2006-05-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. Amine-derivatized nucleosides and oligonucleosides
US6783931B1 (en) 1990-01-11 2004-08-31 Isis Pharmaceuticals, Inc. Amine-derivatized nucleosides and oligonucleosides
US5852188A (en) 1990-01-11 1998-12-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides having chiral phosphorus linkages
US5587361A (en) 1991-10-15 1996-12-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides having phosphorothioate linkages of high chiral purity
US5578718A (en) 1990-01-11 1996-11-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Thiol-derivatized nucleosides
US5459255A (en) 1990-01-11 1995-10-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. N-2 substituted purines
US5587470A (en) 1990-01-11 1996-12-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. 3-deazapurines
US5214136A (en) 1990-02-20 1993-05-25 Gilead Sciences, Inc. Anthraquinone-derivatives oligonucleotides
AU7579991A (en) 1990-02-20 1991-09-18 Gilead Sciences, Inc. Pseudonucleosides and pseudonucleotides and their polymers
US5321131A (en) 1990-03-08 1994-06-14 Hybridon, Inc. Site-specific functionalization of oligodeoxynucleotides for non-radioactive labelling
US5470967A (en) 1990-04-10 1995-11-28 The Dupont Merck Pharmaceutical Company Oligonucleotide analogs with sulfamate linkages
GB9009980D0 (en) 1990-05-03 1990-06-27 Amersham Int Plc Phosphoramidite derivatives,their preparation and the use thereof in the incorporation of reporter groups on synthetic oligonucleotides
DK0455905T3 (da) 1990-05-11 1998-12-07 Microprobe Corp Dipsticks til nukleinsyrehybridiseringsassays og fremgangsmåde til kovalent immobilisering af oligonukleotider
US5981276A (en) 1990-06-20 1999-11-09 Dana-Farber Cancer Institute Vectors containing HIV packaging sequences, packaging defective HIV vectors, and uses thereof
US5610289A (en) 1990-07-27 1997-03-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogues
US5623070A (en) 1990-07-27 1997-04-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Heteroatomic oligonucleoside linkages
JPH0874B2 (ja) 1990-07-27 1996-01-10 アイシス・ファーマシューティカルス・インコーポレーテッド 遺伝子発現を検出および変調するヌクレアーゼ耐性、ピリミジン修飾オリゴヌクレオチド
US5618704A (en) 1990-07-27 1997-04-08 Isis Pharmacueticals, Inc. Backbone-modified oligonucleotide analogs and preparation thereof through radical coupling
US5677437A (en) 1990-07-27 1997-10-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. Heteroatomic oligonucleoside linkages
US5602240A (en) 1990-07-27 1997-02-11 Ciba Geigy Ag. Backbone modified oligonucleotide analogs
US5688941A (en) 1990-07-27 1997-11-18 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods of making conjugated 4' desmethyl nucleoside analog compounds
US5138045A (en) 1990-07-27 1992-08-11 Isis Pharmaceuticals Polyamine conjugated oligonucleotides
US5489677A (en) 1990-07-27 1996-02-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleoside linkages containing adjacent oxygen and nitrogen atoms
US5541307A (en) 1990-07-27 1996-07-30 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogs and solid phase synthesis thereof
US5218105A (en) 1990-07-27 1993-06-08 Isis Pharmaceuticals Polyamine conjugated oligonucleotides
US5608046A (en) 1990-07-27 1997-03-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Conjugated 4'-desmethyl nucleoside analog compounds
PT98562B (pt) 1990-08-03 1999-01-29 Sanofi Sa Processo para a preparacao de composicoes que compreendem sequencias de nucleo-sidos com cerca de 6 a cerca de 200 bases resistentes a nucleases
US5245022A (en) 1990-08-03 1993-09-14 Sterling Drug, Inc. Exonuclease resistant terminally substituted oligonucleotides
US5512667A (en) 1990-08-28 1996-04-30 Reed; Michael W. Trifunctional intermediates for preparing 3'-tailed oligonucleotides
US5214134A (en) 1990-09-12 1993-05-25 Sterling Winthrop Inc. Process of linking nucleosides with a siloxane bridge
US5561225A (en) 1990-09-19 1996-10-01 Southern Research Institute Polynucleotide analogs containing sulfonate and sulfonamide internucleoside linkages
JPH06505704A (ja) 1990-09-20 1994-06-30 ギリアド　サイエンシズ，インコーポレイテッド 改変ヌクレオシド間結合
US5432272A (en) 1990-10-09 1995-07-11 Benner; Steven A. Method for incorporating into a DNA or RNA oligonucleotide using nucleotides bearing heterocyclic bases
ATE198598T1 (de) 1990-11-08 2001-01-15 Hybridon Inc Verbindung von mehrfachreportergruppen auf synthetischen oligonukleotiden
GB9100304D0 (en) 1991-01-08 1991-02-20 Ici Plc Compound
US7015315B1 (en) 1991-12-24 2006-03-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Gapped oligonucleotides
US5714331A (en) 1991-05-24 1998-02-03 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having enhanced binding affinity, sequence specificity and solubility
US5539082A (en) 1993-04-26 1996-07-23 Nielsen; Peter E. Peptide nucleic acids
US5719262A (en) 1993-11-22 1998-02-17 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having amino acid side chains
US5371241A (en) 1991-07-19 1994-12-06 Pharmacia P-L Biochemicals Inc. Fluorescein labelled phosphoramidites
US5571799A (en) 1991-08-12 1996-11-05 Basco, Ltd. (2'-5') oligoadenylate analogues useful as inhibitors of host-v5.-graft response
EP0538194B1 (de) 1991-10-17 1997-06-04 Novartis AG Bicyclische Nukleoside, Oligonukleotide, Verfahren zu deren Herstellung und Zwischenprodukte
US5594121A (en) 1991-11-07 1997-01-14 Gilead Sciences, Inc. Enhanced triple-helix and double-helix formation with oligomers containing modified purines
US5252479A (en) 1991-11-08 1993-10-12 Research Corporation Technologies, Inc. Safe vector for gene therapy
US5484908A (en) 1991-11-26 1996-01-16 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotides containing 5-propynyl pyrimidines
US6235887B1 (en) 1991-11-26 2001-05-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Enhanced triple-helix and double-helix formation directed by oligonucleotides containing modified pyrimidines
US5359044A (en) 1991-12-13 1994-10-25 Isis Pharmaceuticals Cyclobutyl oligonucleotide surrogates
KR940703846A (ko) 1991-12-24 1994-12-12 비. 린네 파샬 갭(gap)이 형성된 2′ 변성된 올리고뉴클레오티드(gapped 2′ modifed oligonucleotides)
US6277603B1 (en) 1991-12-24 2001-08-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. PNA-DNA-PNA chimeric macromolecules
US5595726A (en) 1992-01-21 1997-01-21 Pharmacyclics, Inc. Chromophore probe for detection of nucleic acid
US5565552A (en) 1992-01-21 1996-10-15 Pharmacyclics, Inc. Method of expanded porphyrin-oligonucleotide conjugate synthesis
FR2687679B1 (fr) 1992-02-05 1994-10-28 Centre Nat Rech Scient Oligothionucleotides.
DE4203923A1 (de) 1992-02-11 1993-08-12 Henkel Kgaa Verfahren zur herstellung von polycarboxylaten auf polysaccharid-basis
US5633360A (en) 1992-04-14 1997-05-27 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide analogs capable of passive cell membrane permeation
US5434257A (en) 1992-06-01 1995-07-18 Gilead Sciences, Inc. Binding compentent oligomers containing unsaturated 3',5' and 2',5' linkages
US5587308A (en) 1992-06-02 1996-12-24 The United States Of America As Represented By The Department Of Health & Human Services Modified adeno-associated virus vector capable of expression from a novel promoter
EP0577558A2 (de) 1992-07-01 1994-01-05 Ciba-Geigy Ag Carbocyclische Nukleoside mit bicyclischen Ringen, Oligonukleotide daraus, Verfahren zu deren Herstellung, deren Verwendung und Zwischenproduckte
US5272250A (en) 1992-07-10 1993-12-21 Spielvogel Bernard F Boronated phosphoramidate compounds
JPH07509133A (ja) 1992-07-17 1995-10-12 リボザイム・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 動物疾患の処置のための方法および剤
US6346614B1 (en) 1992-07-23 2002-02-12 Hybridon, Inc. Hybrid oligonucleotide phosphorothioates
US5783701A (en) 1992-09-08 1998-07-21 Vertex Pharmaceuticals, Incorporated Sulfonamide inhibitors of aspartyl protease
EP1024198A3 (en) 1992-12-03 2002-05-29 Genzyme Corporation Pseudo-adenoviral vectors for the gene therapy of haemophiliae
US5478745A (en) 1992-12-04 1995-12-26 University Of Pittsburgh Recombinant viral vector system
US5574142A (en) 1992-12-15 1996-11-12 Microprobe Corporation Peptide linkers for improved oligonucleotide delivery
US5476925A (en) 1993-02-01 1995-12-19 Northwestern University Oligodeoxyribonucleotides including 3'-aminonucleoside-phosphoramidate linkages and terminal 3'-amino groups
CA2156288C (en) 1993-02-19 2005-10-18 Junichi Yano Glycerol derivative, device and pharmaceutical composition
GB9304618D0 (en) 1993-03-06 1993-04-21 Ciba Geigy Ag Chemical compounds
ES2107205T3 (es) 1993-03-30 1997-11-16 Sanofi Sa Analogos de nucleosidos aciclicos y secuencias oligonucleotidas que los contienen.
HU9501974D0 (en) 1993-03-31 1995-09-28 Sterling Winthrop Inc Oligonucleotides with amide linkages replacing phosphodiester linkages
DE4311944A1 (de) 1993-04-10 1994-10-13 Degussa Umhüllte Natriumpercarbonatpartikel, Verfahren zu deren Herstellung und sie enthaltende Wasch-, Reinigungs- und Bleichmittelzusammensetzungen
US6191105B1 (en) 1993-05-10 2001-02-20 Protein Delivery, Inc. Hydrophilic and lipophilic balanced microemulsion formulations of free-form and/or conjugation-stabilized therapeutic agents such as insulin
US5955591A (en) 1993-05-12 1999-09-21 Imbach; Jean-Louis Phosphotriester oligonucleotides, amidites and method of preparation
US6015886A (en) 1993-05-24 2000-01-18 Chemgenes Corporation Oligonucleotide phosphate esters
US6294664B1 (en) 1993-07-29 2001-09-25 Isis Pharmaceuticals, Inc. Synthesis of oligonucleotides
US5502177A (en) 1993-09-17 1996-03-26 Gilead Sciences, Inc. Pyrimidine derivatives for labeled binding partners
WO1995014030A1 (en) 1993-11-16 1995-05-26 Genta Incorporated Synthetic oligomers having chirally pure phosphonate internucleosidyl linkages mixed with non-phosphonate internucleosidyl linkages
US5457187A (en) 1993-12-08 1995-10-10 Board Of Regents University Of Nebraska Oligonucleotides containing 5-fluorouracil
US5446137B1 (en) 1993-12-09 1998-10-06 Behringwerke Ag Oligonucleotides containing 4'-substituted nucleotides
US5519134A (en) 1994-01-11 1996-05-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Pyrrolidine-containing monomers and oligomers
US5596091A (en) 1994-03-18 1997-01-21 The Regents Of The University Of California Antisense oligonucleotides comprising 5-aminoalkyl pyrimidine nucleotides
US5599922A (en) 1994-03-18 1997-02-04 Lynx Therapeutics, Inc. Oligonucleotide N3'-P5' phosphoramidates: hybridization and nuclease resistance properties
US5627053A (en) 1994-03-29 1997-05-06 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. 2'deoxy-2'-alkylnucleotide containing nucleic acid
US5625050A (en) 1994-03-31 1997-04-29 Amgen Inc. Modified oligonucleotides and intermediates useful in nucleic acid therapeutics
US6054299A (en) 1994-04-29 2000-04-25 Conrad; Charles A. Stem-loop cloning vector and method
US5525711A (en) 1994-05-18 1996-06-11 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Pteridine nucleotide analogs as fluorescent DNA probes
US5597696A (en) 1994-07-18 1997-01-28 Becton Dickinson And Company Covalent cyanine dye oligonucleotide conjugates
US5597909A (en) 1994-08-25 1997-01-28 Chiron Corporation Polynucleotide reagents containing modified deoxyribose moieties, and associated methods of synthesis and use
US5580731A (en) 1994-08-25 1996-12-03 Chiron Corporation N-4 modified pyrimidine deoxynucleotides and oligonucleotide probes synthesized therewith
US6608035B1 (en) 1994-10-25 2003-08-19 Hybridon, Inc. Method of down-regulating gene expression
US5665557A (en) 1994-11-14 1997-09-09 Systemix, Inc. Method of purifying a population of cells enriched for hematopoietic stem cells populations of cells obtained thereby and methods of use thereof
AU5359496A (en) 1995-03-06 1996-09-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Improved process for the synthesis of 2'-o-substituted pyrimidines and oligomeric compounds therefrom
US6166197A (en) 1995-03-06 2000-12-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds having pyrimidine nucleotide (S) with 2'and 5 substitutions
US5645620A (en) 1995-05-25 1997-07-08 Foster Wheeler Development Corp. System for separating particulates and condensable species from a gas stream
WO1997014809A2 (en) 1995-10-16 1997-04-24 Dana-Farber Cancer Institute Novel expression vectors and methods of use
US6160109A (en) 1995-10-20 2000-12-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Preparation of phosphorothioate and boranophosphate oligomers
US5858401A (en) 1996-01-22 1999-01-12 Sidmak Laboratories, Inc. Pharmaceutical composition for cyclosporines
US5994316A (en) 1996-02-21 1999-11-30 The Immune Response Corporation Method of preparing polynucleotide-carrier complexes for delivery to cells
US6444423B1 (en) 1996-06-07 2002-09-03 Molecular Dynamics, Inc. Nucleosides comprising polydentate ligands
US6639062B2 (en) 1997-02-14 2003-10-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Aminooxy-modified nucleosidic compounds and oligomeric compounds prepared therefrom
US6576752B1 (en) 1997-02-14 2003-06-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Aminooxy functionalized oligomers
US6172209B1 (en) 1997-02-14 2001-01-09 Isis Pharmaceuticals Inc. Aminooxy-modified oligonucleotides and methods for making same
US6770748B2 (en) 1997-03-07 2004-08-03 Takeshi Imanishi Bicyclonucleoside and oligonucleotide analogue
JP3756313B2 (ja) 1997-03-07 2006-03-15 武 今西 新規ビシクロヌクレオシド及びオリゴヌクレオチド類縁体
JP2002510319A (ja) 1997-07-01 2002-04-02 アイシス・ファーマシューティカルス・インコーポレーテッド オリゴヌクレオチドの消化管を介したデリバリーのための組成物及び方法
US6794499B2 (en) 1997-09-12 2004-09-21 Exiqon A/S Oligonucleotide analogues
AU9063398A (en) 1997-09-12 1999-04-05 Exiqon A/S Oligonucleotide analogues
US6617438B1 (en) 1997-11-05 2003-09-09 Sirna Therapeutics, Inc. Oligoribonucleotides with enzymatic activity
US6528640B1 (en) 1997-11-05 2003-03-04 Ribozyme Pharmaceuticals, Incorporated Synthetic ribonucleic acids with RNAse activity
US6320017B1 (en) 1997-12-23 2001-11-20 Inex Pharmaceuticals Corp. Polyamide oligomers
US6436989B1 (en) 1997-12-24 2002-08-20 Vertex Pharmaceuticals, Incorporated Prodrugs of aspartyl protease inhibitors
PL341762A1 (en) 1997-12-24 2001-05-07 Vertex Pharma Precursors of aspartil protease inhibitors
US7273933B1 (en) 1998-02-26 2007-09-25 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for synthesis of oligonucleotides
US7045610B2 (en) 1998-04-03 2006-05-16 Epoch Biosciences, Inc. Modified oligonucleotides for mismatch discrimination
US6531590B1 (en) 1998-04-24 2003-03-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Processes for the synthesis of oligonucleotide compounds
US6867294B1 (en) 1998-07-14 2005-03-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Gapped oligomers having site specific chiral phosphorothioate internucleoside linkages
CA2345936A1 (en) 1998-10-09 2000-04-20 Ingene, Inc. Production of ssdna in a cell
BR9914772A (pt) 1998-10-09 2001-12-11 Ingene Inc Conjunto de elementos genéticos, vetor, célulahospedeira, conjunto para a produção de umasequência de ácido nucléico, método para aprodução in vivo ou in vitro de uma sequência deácido nucléico, transcrição de cdna, molécula deácido nucléico inibidor, transcrição de mrna,molécula heteroduplex e composiçãofarmacêutica
US6465628B1 (en) 1999-02-04 2002-10-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Process for the synthesis of oligomeric compounds
TNSN00027A1 (fr) 1999-02-12 2005-11-10 Vertex Pharma Inhibiteurs de l'aspartyle protease
US7084125B2 (en) 1999-03-18 2006-08-01 Exiqon A/S Xylo-LNA analogues
AU776362B2 (en) 1999-05-04 2004-09-09 Roche Innovation Center Copenhagen A/S L-ribo-LNA analogues
US6525191B1 (en) 1999-05-11 2003-02-25 Kanda S. Ramasamy Conformationally constrained L-nucleosides
US6593466B1 (en) 1999-07-07 2003-07-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Guanidinium functionalized nucleotides and precursors thereof
US6147200A (en) 1999-08-19 2000-11-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2'-O-acetamido modified monomers and oligomers
US7321029B2 (en) 2000-01-21 2008-01-22 Geron Corporation 2′-arabino-fluorooligonucleotide N3′→P5′ phosphoramidates: their synthesis and use
US6794493B2 (en) 2000-04-07 2004-09-21 Wisys Technology Foundation, Inc. Antithrombin H-helix mutants
IT1318539B1 (it) 2000-05-26 2003-08-27 Italfarmaco Spa Composizioni farmaceutiche a rilascio prolungato per lasomministrazione parenterale di sostanze idrofile biologicamente
JP4413493B2 (ja) 2000-10-04 2010-02-10 サンタリス ファーマ アー／エス プリンｌｎａ類似体の改善された合成方法
US7063860B2 (en) 2001-08-13 2006-06-20 University Of Pittsburgh Application of lipid vehicles and use for drug delivery
ES2550609T3 (es) 2002-07-10 2015-11-11 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Interferencia de ARN mediante de moléculas de ARN de cadena sencilla
US6878805B2 (en) 2002-08-16 2005-04-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Peptide-conjugated oligomeric compounds
EP2957568B1 (en) 2002-11-05 2016-12-21 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compositions comprising alternating 2'-modified nucleosides for use in gene modulation
AU2003291753B2 (en) 2002-11-05 2010-07-08 Isis Pharmaceuticals, Inc. Polycyclic sugar surrogate-containing oligomeric compounds and compositions for use in gene modulation
WO2006006948A2 (en) 2002-11-14 2006-01-19 Dharmacon, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS FOR SELECTING siRNA OF IMPROVED FUNCTIONALITY
EP2213738B1 (en) 2002-11-14 2012-10-10 Dharmacon, Inc. siRNA molecules targeting Bcl-2
JP5183064B2 (ja) 2003-07-02 2013-04-17 エムユーエスシー ファウンデイション フォー リサーチ デべロップメント 甲殻類動物、及び他の無脊椎動物における、ｄｓＲＮＡで誘導された特異的、及び非特異的免疫、及びそこで使用する生物送達媒体
ATE555118T1 (de) 2003-08-28 2012-05-15 Takeshi Imanishi Neue synthetische nukleidsäuren vom typ mit quervernetzter n-o-bindung
JP2005117918A (ja) 2003-10-14 2005-05-12 Glycomedics Inc 新規糖鎖プライマー
ATE452188T1 (de) 2004-02-10 2010-01-15 Sirna Therapeutics Inc Rna-interferenz-vermittelte hemmung der genexpression unter verwendung multifunktioneller sina (short interfering nucleic acid)
CA2566286A1 (en) 2004-05-11 2005-12-08 Rnai Co., Ltd. Polynucleotide causing rna interfere and method of regulating gene expression with the use of the same
US7740861B2 (en) 2004-06-16 2010-06-22 University Of Massachusetts Drug delivery product and methods
CA2603730A1 (en) 2005-03-31 2006-10-05 Calando Pharmaceuticals, Inc. Inhibitors of ribonucleotide reductase subunit 2 and uses thereof
EP1984381B1 (en) 2006-01-27 2010-09-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. 6-modified bicyclic nucleic acid analogs
US7569686B1 (en) 2006-01-27 2009-08-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for synthesis of bicyclic nucleic acid analogs
WO2007091269A2 (en) 2006-02-08 2007-08-16 Quark Pharmaceuticals, Inc. NOVEL TANDEM siRNAS
EP2021008B1 (en) 2006-04-07 2015-12-02 Idera Pharmaceuticals, Inc. Stabilized immune modulatory rna (simra) compounds for tlr7 and tlr8
ES2389737T3 (es) 2006-05-11 2012-10-31 Isis Pharmaceuticals, Inc. Análogos de ácidos nucleicos bicíclicos modificados en 5'
WO2008022309A2 (en) 2006-08-18 2008-02-21 F. Hoffmann-La Roche Ag Polyconjugates for in vivo delivery of polynucleotides
WO2008036933A2 (en) 2006-09-21 2008-03-27 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of the hamp gene
US20100105134A1 (en) 2007-03-02 2010-04-29 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting gene expression and uses thereof
US20100112687A1 (en) 2007-03-02 2010-05-06 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting erbb family gene expression and uses thereof
CN101679978B (zh) 2007-05-22 2016-05-04 阿克丘勒斯治疗公司 羟甲基取代的rna寡核苷酸和rna复合物
US8278425B2 (en) 2007-05-30 2012-10-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. N-substituted-aminomethylene bridged bicyclic nucleic acid analogs
DK2173760T4 (en) 2007-06-08 2016-02-08 Isis Pharmaceuticals Inc Carbocyclic bicyclic nukleinsyreanaloge
US8278283B2 (en) 2007-07-05 2012-10-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. 6-disubstituted or unsaturated bicyclic nucleic acid analogs
CN101795715A (zh) 2007-07-09 2010-08-04 艾德拉药物股份有限公司 稳定化免疫调控性rna(simra)化合物
US8741844B2 (en) 2007-07-20 2014-06-03 Universite Paris-Sud Xi Use of mutated antithrombins for treating or preventing coagulation disorders
WO2009082607A2 (en) 2007-12-04 2009-07-02 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Targeting lipids
EP2245039A4 (en) 2008-01-31 2012-06-06 Alnylam Pharmaceuticals Inc OPTIMIZED METHODS FOR EXPORING DSRNA TO TARGET THE PCSK9 GEN
JP5409658B2 (ja) 2008-03-13 2014-02-05 セレラ コーポレーション 静脈血栓症に関連した遺伝子多型、その検出方法および使用
WO2010065756A2 (en) 2008-12-03 2010-06-10 Mdrna, Inc. Usirna complexes
WO2010081878A1 (en) 2009-01-16 2010-07-22 Universite Paris-Sud Xi Mutated antithrombins, a process for preparing the same and their use as drugs
WO2010120526A2 (en) 2009-03-31 2010-10-21 Emory University Methods and systems for screening for and diagnosing dna methylation associated with autism spectrum disorders
EP2253715A1 (en) 2009-05-14 2010-11-24 RWTH Aachen New targets for cancer therapy and/or diagnosis
CA2764158A1 (en) 2009-06-01 2010-12-09 Halo-Bio Rnai Therapeutics, Inc. Polynucleotides for multivalent rna interference, compositions and methods of use thereof
KR102066189B1 (ko) 2009-06-10 2020-01-14 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 향상된 지질 조성물
WO2011005861A1 (en) 2009-07-07 2011-01-13 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide end caps
EP2470656B1 (en) 2009-08-27 2015-05-06 Idera Pharmaceuticals, Inc. Composition for inhibiting gene expression and uses thereof
RS54578B1 (sr) 2010-02-24 2016-06-30 Arrowhead Research Corporation Preparati za ciljano dopremanje sirnk
EP2563922A1 (en) 2010-04-26 2013-03-06 Marina Biotech, Inc. Nucleic acid compounds with conformationally restricted monomers and uses thereof
KR102232287B1 (ko) 2011-06-21 2021-03-29 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 안지오포이에틴-유사 3(ANGPTL3) iRNA 조성물 및 그 사용 방법
US20140356377A1 (en) 2011-08-25 2014-12-04 Umc Utrecht Holding B.V. Compounds for use in boosting coagulation
CN104136451A (zh) 2011-09-07 2014-11-05 玛瑞纳生物技术有限公司 具有构象限制的单体的核酸化合物的合成和用途
WO2013159108A2 (en) 2012-04-20 2013-10-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds comprising bicyclic nucleotides and uses thereof
US9127274B2 (en) 2012-04-26 2015-09-08 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Serpinc1 iRNA compositions and methods of use thereof
MX379208B (es) 2013-05-22 2025-03-10 Alnylam Pharmaceuticals Inc Composiciones de arni de serpina1 y sus metodos de uso.
TW201607559A (zh) * 2014-05-12 2016-03-01 阿尼拉製藥公司 治療ｓｅｒｐｉｎｃ１相關疾患之方法和組成物
US10689647B2 (en) 2015-05-08 2020-06-23 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for the specific inhibition of antithrombin 3 (AT3) by double-stranded RNA
ES3041380T3 (en) 2015-12-07 2025-11-11 Genzyme Corp Methods and compositions for treating a serpinc1-associated disorder
KR102318555B1 (ko) 2020-03-19 2021-10-29 한국과학기술연구원 광소자용 역나노콘과 그 제조방법

Also Published As

Publication number Publication date
WO2017100236A8 (en) 2017-07-20
JP6985283B2 (ja) 2021-12-22
KR20210157474A (ko) 2021-12-28
SG11201804729RA (en) 2018-07-30
KR20230119027A (ko) 2023-08-14
JP2024046760A (ja) 2024-04-04
TW202423457A (zh) 2024-06-16
BR112018011450A2 (en) 2018-11-27
IL259795A (en) 2018-07-31
EP4424828A1 (en) 2024-09-04
TW201726148A (zh) 2017-08-01
TWI836281B (zh) 2024-03-21
US20170159053A1 (en) 2017-06-08
IL259795B1 (en) 2023-12-01
US20220017902A1 (en) 2022-01-20
MX2018006989A (es) 2018-09-05
EP3386518A1 (en) 2018-10-17
TWI743069B (zh) 2021-10-21
RU2018123712A3 (sr) 2020-04-30
IL308717A (en) 2024-01-01
AU2023200828B2 (en) 2025-04-03
AU2023200828A1 (en) 2023-03-16
AU2016368289B2 (en) 2022-11-17
CO2018006590A2 (es) 2018-07-10
PL3386518T3 (pl) 2025-10-20
IL259795B2 (en) 2024-04-01
MX2024008022A (es) 2024-07-12
KR20180095843A (ko) 2018-08-28
FI3386518T3 (fi) 2025-09-25
AU2016368289C1 (en) 2023-11-16
JP2019504112A (ja) 2019-02-14
CN108601795A (zh) 2018-09-28
AU2016368289A1 (en) 2018-06-21
WO2017100236A1 (en) 2017-06-15
AU2025201684A1 (en) 2025-03-27
HRP20251125T1 (hr) 2025-11-21
LT3386518T (lt) 2025-12-10
CN120284999A (zh) 2025-07-11
DK3386518T3 (da) 2025-09-15
US11091759B2 (en) 2021-08-17
CA3007014A1 (en) 2017-06-15
SG10201913085TA (en) 2020-02-27
RU2021124592A (ru) 2021-11-01
RU2754188C2 (ru) 2021-08-30
ES3041380T3 (en) 2025-11-11
RU2018123712A (ru) 2020-01-10
JP7422120B2 (ja) 2024-01-25
PT3386518T (pt) 2025-09-16
SI3386518T1 (sl) 2025-10-30
JP2022031772A (ja) 2022-02-22
TW202206597A (zh) 2022-02-16
EP3386518B1 (en) 2025-06-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7422120B2 (ja) Ｓｅｒｐｉｎｃ１関連障害を処置するための方法および組成物
US20230158058A1 (en) Methods and compositions for treating a bleeding event in a subject having hemophilia
WO2015175510A1 (en) Methods and compositions for treating a serpinc1-associated disorder
RU2801263C2 (ru) Способы и композиции для лечения явления кровотечения у больного гемофилией
HK40115220A (en) Methods and compositions for treating a serpinc1-associated disorder