RS66840B1 - Agensi, koristi i postupci za lečenje sinukleinopatije - Google Patents

Description

Opis

Oblast pronalaska:

[0001] Ovaj pronalazak odnosi se na novu klasu monoklonalnog antitela kako se tvrdi da se specifično vezuje za alfa-sinuklein, kao i na postupke za upotrebu ovih molekula u lečenju i dijagnozi sinukleinopatija.

Upućivanje na listu sekvenci:

[0002] Ova prijava uključuje jednu ili više listi sekvenci u skladu sa 37 C.F.R.1.821 et seq., koje su otkrivene u računarski čitljivim medijumima (naziv datoteke: 0992_ST25.txt, kreirana 22. Juna 2016. i veličine 44 kB).

Pozadina pronalaska:

[0003] Sinukleinopatije, takođe poznate kao bolesti Levijevih tela (LBD), karakterišu se taloženjem unutarćelijskih proteinskih agregata koji su vidljivi pod mikroskopom kao Levijeva tela (LB) i/ili Levijevi neuriti, gde je protein alfa-sinuklein glavna komponenta (Jellinger, Mov Disord.2012 Jan;27(1):8-30; McKeith et al., Neurology (1996) 47:1113-24). Sinukleinopatije uključuju Parkinsonovu bolest (PD) (uključujući idiopatske i nasledne oblike Parkinsonove bolesti) i difuznu bolest Levijevih tela (DLB) (takođe poznata kao demencija sa Levijevim telima (DLB), varijanta Alchajmerove bolesti sa Levijevim telima (LBV), kombinovana Alchajmerova i Parkinsonova bolest (CAPD), čisto autonomno zatajenje (PAF) i višestruka sistemska atrofija (MSA; npr., olivopontocerebelarna atrofija, strijatonigralna degeneracija, Šaj-Dragerov sindrom)). Sinukleinopatije često imaju degeneraciju dopaminergičkog nigrostrijatalnog sistema, odgovornog za osnovne motoričke deficite kod Parkinsonizma (rigidnost, bradikinezija, tremor u mirovanju), ali postoji i široko rasprostranjena pojava Levijevih tela i distrofičnih Levijevih neurita u centralnom, perifernom i autonomnom nervnom sistemu i oblastima u mozgu i drugim organima povezanim sa nemotoričkim disfunkcijama, kao što su demencija i deficiti autonomnog nervnog sistema. Za nekoliko nemotoričkih znakova i simptoma smatra se da prethode motoričkim simptomima kod Parkinsonove bolesti i drugih sinukleinopatija. Ti rani znaci uključuju, na primer, poremećaj ponašanja u REM fazi sna (RBD) i gubitak mirisa i konstipaciju (Mahowald et al., Neurology (2010) 75:488-489).

Sinukleinopatije su i dalje najčešći uzrok za poremećaje kretanja i pogoršanje kognitivnih sposobnosti pri starenju stanovnika (Galasko et al., Arch. Neurol. (1994) 51:888-95).

[0004] Alfa-sinuklein je član porodice proteina koja uključuje beta- i gama-sinuklein i sinoretin. Alfasinuklein eksprimira se u normalnom stanju povezan sa sinapsama i veruje se da ima ulogu u regulisanju oslobađanja sinaptičkih vezikula, a čime utiče na neuronske veze, plastičnost, učenje i memoriju.

[0005] Nekoliko studija je impliciralo alfa-sinuklein sa centralnom ulogom u PD patogenezi. Protein može da gradi agregat kako bi se formirala unutarćelijska nerastvorljiva vlakna u patološkim uslovima. Na primer, sinuklein akumulira u LB (Spillantini et al., Nature (1997) 388:839-40; Takeda et al., J. Pathol. (1998) 152:367-72; Wakabayashi et al., Neurosci. Lett. (1997) 239:45-8). Mutacije u genu alfa-sinukleina kao i duplikacije i triplikacije gena ko-segregiraju sa retkim porodičnim oblicima parkinsonizma (Kruger et al., Nature Gen. (1998) 18:106-8; Polymeropoulos, et al., Science (1997) 276:2045-7). Značajno otkriće je da se alfa-sinuklein može izlučiti u vanćelijsku tečnost i da bude prisutan u plazmi i cerebrospinalnoj tečnosti (CSF). Nekoliko studija, na primer od Pacheco et al. (2015) i ostalih (Pacheco et al J Neurochem.

2015 Mar;132(6):731-4; Conway et al., Proc Natl Acad Sci USA (2000) 97:571-576; Volles et al., J.

Biochem.42:7871-7878, 2003) predlažu da vanćelijski sinuklein ima patogenu ulogu u mozgu. Pokazali su da vanćelijski oligomeri alfa-sinukleina imaju neurotoksičnost ka membranama plazme moždanih neurona. Još jedna intrigantna hipoteza zasnovana na podacima o lučenju sinukleina je da je širenje alfasinukleina, slično prionima, osnova progresije Parkinsonove bolesti i drugih sinukleinopatija (Lee et al.

2014, Nat Rev Neurol.2014 Feb;10(2):92-8; Hansen and Li 2012, Trends Mol Med.2012 May;18(5):248-55). Ovi nalazi su dali povoda za nadu da se vanćelijski sinuklein može ciljati imunoterapijom (Vekrellis et al.2011, Lancet Neurol.2011 Nov;10(11):1015-25).

[0006] Pokazalo se da su auto-antitela alfa-sinukleina, koja se prirodno javljaju, prisutna i kod PD pacijenata i kod zdravih kontrola (Smith et al.2012, PLoS One.2012;7(12):e52285; Maetzler et al.2014, PLoS One.2014 Feb 21;9(2):e88604, Papachroni et al.2007 J Neurochem.2007 May;101(3):749-56 i Woulfe et al.2002, Neurology.2002 May 14;58(9):1435-6), prijavljeni su ponekad povišeni nivoi auto-antitela prema alfa-sinukleinu kod PD (Gruden et al.2011, J Neuroimmunol.2011 Apr;233(1-2):221-7, Gruden et al.2012,Neuroimmunomodulation.2012;19(6):334-42 i Yanamandra 2011, PLoS One.2011 Apr 25;6(4):e18513) ili smanjena auto-antitela prema alfa-sinukleinu kod PD pacijenata u odnosu na zdrave kontrole (Besong-Agbo et al 2013, Neurology.2013 Jan 8;80(2):169-75).. Mogućnost da cirkulišuća autoantitela protiv alfa-sinukleina mogu da imaju zaštitnu ulogu u odnosu na stvaranje agregata alfa-sinukleina veoma rano se pokazala, nakon otkrića auto-antitela (Woulfe et al.2002, Neurology.2002 May 14;58(9):1435-6).

[0007] Prekomerna ekspresija alfa-sinukleina kod transgenih miševa imitira neke patološke aspekte bolesti Levijevih tela. Nekoliko različitih transgenih linija miševa koji prekomerno eksprimiraju alfasinuklein generisane su u poslednjih deset godina (opisano u recenzijama: Koehler et al 2014, PLoS One.

2013 May 31;8(5):e64649; Fleming and Chesselet, 2006,Behav Pharmacol.2006 Sep;17(5-6):383-91; Springer and Kahle 2006,Curr Neurol Neurosci Rep.2006 Sep;6(5):432-6). Mišje linije sa Thy-1 i PDGF-beta promoterima razvijaju motoričke deficite i kognitivne deficite i koriste se da bi se demonstrirao neuroprotektivni efekat antitela usmerenih protiv alfa-sinukleina in vivo. Međutim, nijedna od transgenih linija nema tešku degeneraciju dopaminergičkih neurona, i često su motorni fenotipovi vođeni ekspresijom u motornim neuronima, koji normalno ne degenerišu kod Parkinsonove bolesti. Stoga nije jasno da li je pozitivan ishod potencijalnog lečenja koji modifikuje tok bolesti posredovan efektima na dopaminergičke neurone ili druge neurone centralnog nervnog sistema.

[0008] Jedno snažno otkriće kod transgenih mišjih modela je da hronična prekomerna ekspresija humanog alfa-sinukleina narušava sinaptičku funkciju. Korišćenje studija i u in vitro i u in vivo sistemima pokazalo je da prekomerna ekspresija humanog alfa-sinukleina divljeg tipa (wt) narušava sinaptičku transmisiju u hipokampusu (Nemani et al.2010, Neuron.2010 Jan 14;65(1):66-79; Paumier et al.2013, PLoS One.2013 Aug 1;8(8):e70274). Ovo se pokazalo u CA1 regiji hipokampusa gde se kod obe studije pokazalo da se smanjuje bazalna sinaptička transmisija. Pretpostavljalo se da je mehanizam koji stoji iza ovoga unutarćelijsko nakupljanje alfa-sinukleina koje dovodi do disfunkcionalnog sinaptičkog oslobađanja. Međutim, nedavna otkrića o izlučivanju alfa-sinukleina u vanćelijski prostor u sinapsama i toksični efekti oligomera alfa-sinukleina na funkciju sinapsi otvara mogućnost uloge vanćelijskog alfasinukleina u sinaptičkoj disfunkciji, i kao takvog, za sposobnost terapijskih antitela da reše deficit.

[0009] Upotreba virusnih vektora za prekomernu ekspresiju alfa-sinukleina predstavlja važan način modeliranja PD kod glodara, jer ovaj pristup proizvodi relativno brzu progresivnu degeneraciju nigrostrijatalnih neurona, karakteristiku koja još nije reprodukovana genetskim mutacijama kod miševa ili pacova (Kirik and Bjorklund, 2003, Trends Neurosci.2003 Jul;26(7):386-92). Osim toga, isporuka virusnih gena otkrila je sposobnost wt alfa-sinukleina da indukuje nigrostrijatalnu patologiju (Kirik et al.

2002, J Neurosci.2002 Apr 1;22(7):2780-91), nalaz koji je u skladu sa dokazima kod porodičnih oblika PD sa duplikacijama i triplikacijama alfa-sinukleina (Lee and Trojanowski, 2006, Neuron.2006 Oct 5;52(1):33-8). U jednoj studiji, pokazalo se da pul kozjih antitela protiv alfa-sinukleina N-terminalno štiti protiv dopaminergičke ćelijske smrti i ublažava poremećaje u ponašanju kod pacovskog modela Parkinsonove bolesti na bazi AAV-alfa-sinukleina (Shahaduzzaman et al 2015, PLoS One.2015 Feb 6;10(2):e0116841).

[0010] Nedavno se pokazalo da širenje, poput priona, patologije alfa-sinukleina razvija patologiju alfasinukleina i takođe razvija dopaminergičku ćelijski smrt (Luk et al.2012, Science.2012 Nov 16;338(6109):949-53). Ovaj model koristi se da pokaže da antitela protiv alfa-sinukleina mogu da ublaže patologiju (Tran et al.2014, Cell Rep.2014 Jun 26;7(6):2054-65). U ovom modelu, lečenje antitelima moglo je da smanji nakupljanje fosforilisanog alfa-sinukleina u nekoliko regija mozga - uključujući dopaminergičke neurone u crnoj supstanci, i smanji razvoj motoričkog deficita.

[0011] Pored mutacija, alternativnim spajanjem gena alfa-sinukleina i posttranslacionim modifikacijama proteina, kao što su fosforilacija, ubikvitinacija, nitracija i skraćivanje, mogu da se obrazuju proteinski oblici alfa-sinukleina koji imaju poboljšan kapacitet za obrazovanje agregatnih i/ili toksičnih oblika alfasinukleina (Beyer and Ariza, Mol Neurobiol.2013 Apr;47(2):509-24). Međutim, precizne patološke vrste alfa-sinukleina ostaju nepoznate. Razne pogrešno savijene/agregatne/izlučene vrste u opsegu od oligomera do vlakana, i različite posttranslacione modifikacije povezane su sa toksičnošću ali ne postoji konsenzus o tome šta je najvažnije, ako uopšte postoji i jedna toksična vrsta.

[0012] Sveukupno, nakupljanje alfa-sinukleina sa sličnim morfološkim i neurološkim promenama u životinjskim modelima raznovrsnim kao ljudi, miševi i muve pokazuje da ovaj je molekul u središtu patogeneze bolesti Levijevih tela.

[0013] Pokazalo se da nekoliko različitih antitela prema alfa-sinukleinu imaju terapijski efekat kod predkliničkih životinjskih modela. Pokazalo se da i antitelo koje cilja epitop koji uključuje ostatke alfasinukleina 91-99 i antitela koji ciljaju epitop koji uključuje ostatke alfa-sinukleina 118-126 imaju dejstvo na motoričke i kognitivne deficite kod transgenih miševa (Games et al.2014, J Neurosci.2014 Jul 9;34(28):9441-54). Najnaprednije od ovih antitela je humanizovano antitelo na bazi mišjeg monoklonalnog antitela 9E4, koje cilja epitop koji uključuje ostatke alfa-sinukleina 118-126, i koji je trenutno u kliničkim probama u fazi I. Takođe se pokazalo da C-terminalno antitelo 274 koje cilja epitop koji uključuje ostatke alfa-sinukleina 120-140 (Bae et al.2012, J Neurosci.2012 Sep 26;32(39):13454-69) ima dejstva u predkliničkom modelu na širenje patologije od ćelije na ćeliju. Pored ovoga, pokazalo se da antitela koja ciljaju konformacione vrste kao što su oligomeri i vlakna alfa-sinukleina mogu najmanje da smanje nivoe ovih verovatno toksičnih vrsta alfa-sinukleina (Lindström et al.2014, Neurobiol Dis.2014 Sep;69:134-43 i Spencer et al.2014, Mol Ther.2014 Oct;22(10):1753-67). Takođe se pokazalo da ova konformaciona antitela koja spuštaju nivoe oligomera alfa-sinukleina in vivo, kao što je mab47, ciljaju epitope na C-kraju alfa-sinukleina, od aminokiseline 121-125 (US20120308572). Druga antitela specifična za konformaciije, vlakna i oligomere takođe ciljaju C-terminalne sekvence (Vaikath et al. Neurobiol Dis.2015;79:81-99).

[0014] Budući da je toksični oblik alfa-sinukleina nepoznat, terapijsko antitelo u idealnim uslovima trebalo bi da može da se veže za većinu vrsta alfa-sinukleina koje se obrazuju alternativnim spajanjem ili posttranslacionim modifikacijama, kao što su skraćivanja, kao i oligomerne i vlaknaste oblike. Jedan problem s trenutnim antitelima koji su ispitivani kao terapije u predkliničkim modelima, kao što je prethodno opisano, je da mnogi od njih ciljaju C-terminalne epitope, koji se ne nalaze u nekima od glavnih skraćenih oblika alfa-sinukleina. Na primer, aminokiseline koje su značajne za vezivanje 9E4 su asparagin 122 i tirozin 125 (prema skeniranju alanina prikazanog u patentu US20140127131), i ovo znači da ovo antitelo ne može da veže alfa-sinuklein koji je skraćen na aminokiselinama 119 i 122, koje su neke od glavnih skraćenih vrsta u tkivu mozga kod Parkinsonove bolesti (Kellie et al. Sci Rep.

2014;4:5797). Isto bi bio slučaj za antitelo 274 i antitelo mab47 (US8,632,776). Takođe, amino terminalna antitela verovatno ne bi mogla da se vežu za neke od glavnih skraćenih vrsta kojima nedostaju prve aminokiseline alfa-sinukleina, kao što je alfa-sinuklein skraćen na aminokiseline 5-140. Za 9E4 antitelo, jedan od predloženih mehanizama delovanja je prevencija skraćivanja na aminokiselinama 119-122 u vanćelijskom prostoru, kao antitelo vezaće se za isti region gde i proteaza koja će cepati alfasinuklein (Games et al.2014, J Neurosci.2014 Jul 9;34(28):9441-54). Sličan mehanizam delovanja može se naći i kod antitela u neposrednoj blizini mesta, i stoga bi se očekivalo da mnoga antitela oko ovog regiona imaju ovu aktivnost.

[0015] Postoje izvesne podrške za toksičnu ulogu skraćenih vrsta alfa-sinukleina u životinjskim modelima. Pokazalo se da ekspresija skraćenog alfa-sinukleina ispod promotera tirozinhidroksilaze dovodi do nigrostrijatalne patologije, koja se u normalnim uslovima ne vidi kod transgenih modela alfasinukleina (Tofaris et al.2006, J Neurosci.2006 Apr 12;26(15):3942-50; Wakamatsu et al.2006, Neurobiol Aging.2008 Apr;29(4):574-85). Na primer, ekspresija aminokiselina 1-130 humanog proteina alfa-sinukleina sa A53T mutacijom izazvala je embrionalni gubitak dopaminergičkih neurona u pars compacta crne supstance dok ekspresija proteina pune dužine nije (Wakamatsu et al.2006, Neurobiol Aging.2008 Apr;29(4):574-85). Ekspresija molekula alfa-sinukleina sa 120 aminokiselina pod alfa promoterom proteina kinaze II zavisnog od kalcijuma/kalmodulina (CamKll-alfa) povezana je sa stvaranjem agregata alfa-sinukleina i progresivnim deficitom u testovima kortikalno-hipokampalne memorije uključujući Barnsov lavirint i prepoznavanje novih objekata (Hall et al.2015, Exp Neurol.2015 Feb;264:8-13). Takođe, u pacovskom AAV modelu koekspresija C-terminalno skraćenog alfa-sinukleina poboljšala je patologiju indukovanu alfa-sinukleina pune dužine (Ulusoy et al.2010, Eur J Neurosci.2010 Aug;32(3):409-22).

[0016] U ovom pronalasku, antitela (kao što je "GM37", opisan u Primerima) su generisana koja mogu da se vezuju za toksični alfa-sinukleinski fragment 1-119/122 i neutrališu ovaj skraćeni oblik alfasinukleina. Antitela ovog pronalaska, kao što je GM37, mogu da se vezuju za druge oligomerne oblike alfa-sinukleina i menjaju njihov unos od strane drugih ćelija u CNS na način da se smanji širenje bolesti. Osim toga, neočekivano je otkriveno da su antitela ovog pronalaska, kao što je GM37, superiorna u odnosu na antitela iz stanja tehnike, kao što je 9E4, u vezivanju za različite vrste alfa-sinukleina u humanom mozgu i imaju neočekivano superiorno dejstvo na čišćenje vanćelijskog alfa-sinukleina i normalizaciju pogoršane sinaptičke transmisije indukovane prisustvom abnormalnog alfa-sinukleina in vivo. Daljim prikazom njihovih terapijskih mogućnosti, antitela ovog pronalaska, kao što je GM37, mogu da spreče pojavu bolesti povezane sa motoričkim fenotipom u pacovskom modelu za Parkinsonovu bolest. Konačno, antitela GM37 i GM285 mogu da inhibiraju zasejavanje agregacije i fosforilacije endogenog alfa-sinukleina indukovane vanćelijski dodatim rekombinantnim patološkim semenima alfasinukleina u primarnim mišjim neuronima. Antitela, kao što su GM37 i 285, takođe mogu da inhibiraju zasejavanje patologije alfa-sinukleina u dopaminergičke neurone in vivo korišćenjem mišjeg modela za Parkinsonovu bolest, pri čemu se dalje omogućava terapijska sposobnost ovih antitela u sprečavanju propagacije patologije od ćelije u ćeliju. Zajedno ovi podaci snažno podržavaju upotrebu ovih novih antitela, GM37 i GM285, kao novih terapijskih agenasa koji mogu da modifikuju bolest inhibicijom mehanizma kojim se patologija bolesti širi između neurona pacijenata sa Parkinsonovom bolešću.

[0017] U daljem aspektu ovog otkrivanja obezbeđene su 3 aminokiselinske varijante GM37 antitela. Sve varijante imaju slična funkcionalna očitavanja kao matično antitelo, GM37, ali sa poboljšanim svojstvima za sposobnost proizvodnje. Te varijante smanjuju rizik od posttranslacione modifikacije koji se javlja unutar domena vezivanja GM37 antitela i obezbeđuju izvesno poboljšanje u proizvodnji antitela. Ovo je prednost jer je velika klinička ili komercijalna proizvodnja antitela složena i skupa, i obezbeđivanje homogenog proizvoda u farmaceutskim lekovima je naročito posebno za imunoglobuline i proteine.

Suština ovog pronalaska:

[0018] Ovaj pronalazak definisan je priloženim patentnim zahtevima.

[0019] Upućivanja na postupke lečenja treba smatrati upućivanjima na jedinjenja, farmaceutske kompozicije i lekove ovog pronalaska za upotrebu u postupku za lečenje ljudskog (ili životinjskog) tela terapijom (ili za dijagnozu).

[0020] Ovaj pronalazak odnosi se na nova monoklonalna antitela, koja mogu specifično da vezuju epitop unutar aminokiselina 112-117 u alfa-sinukleinu (SEQ ID NO:9 (ILEDMP)). Epitop vezan antitelima ovog pronalaska, kao što je na primer antitelo "GM37, ovde se naziva "112-117 epitop". Antitela ovog pronalaska specifično se vezuju za epitop unutar 112-117 epitopa i mogu, prema jednom načinu ostvarivanja, da se takmiče sa antitelom GM37 ili GM285 u vezivanju za epitop unutar aminokiselina 112-117. Na primer, antitela prema ovom pronalasku mogu da se takmiče u vezivanju za neki epitop unutar aminokiselina 112-117 humanog alfa-sinukleina sa teškim lancem koji se sastoji od varijabilnog domena iz SEQ ID NO:7 i lakim lancem koji se sastoji od varijabilnog domena iz SEQ ID NO:8. Takva inhibicija kompetitivnog vezivanja može se odrediti korišćenjem testova i postupaka koji su dobro poznati u tehnici, na primer korišćenjem testa neobeleženog vezivanja kao što je rezonancija površinskih plazmona (SPR). Na primer, imobilizacija humanog alfa-sinukleina na površini i inkubacija sa ili bez referentnog antitela 'GM37' pre inkubacije sa antitelom ili vezivanja fragmenta koji se ispituje.

Alternativno, može se koristiti pristup mapiranja po parovima, u kojem se referentno antitelo 'GM37' imobiliše na površinu, humani alfa-sinukleinski antigen vezuje se za imobilisano antitelo, i potom se ispituje drugo antitelo na sposobnost simultanog vezivanja za humani alfa-sinuklein (videti 'BlAcore® Assay Handbook', GE Healthcare Life Sciences, 29-0194-00 AA 05/2012).

[0021] Određenije, GM285 antitelo vezuje epitop unutar ostataka 112-117 alfa-sinukleina koji obuhvata ostatke 112-115 alfa-sinukleina (ILED; SEQ ID NO:19).

[0022] Ovde su opisani monoklonalno antitelo GM37, njegove varijante (npr., GM37 Varijanta 1, GM37 Varijanta 2 i GM37 Varijanta 3) ili GM285.

[0023] Posebno, ovo otkrivanje obezbeđuje monoklonalno antitelo GM37, njegove varijante (npr., GM37 Varijanta 1, GM37 Varijanta 2 i GM37 Varijanta 3) ili GM285, i obuhvata takva antitela kao i njihove derivate koji imaju dovoljan broj (npr., 1, 2 ili 3) CDR-ova lakog lanca i dovoljan broj (npr., 1, 2 ili 3) CDR-ova teškog lanca za obrazovanje mesta vezivanja koje može specifično da se veže za humani sinuklein. Poželjno, takva antitela imaće tri CDR-a lakog lanca i tri CDR-a teškog lanca, kao što je definisano u nastavku. Numeracija aminokiselinskih ostataka u ovom regionu je u skladu sa IMGT<®>, međunarodni ImMunoGeneTics information system<®>ili, Kabat, E. A., Wu, T. T., Perry, H. M., Gottesmann, K. S. & Foeller, C. (1991). Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th edit., NIH Publication no.91-3242 U.S. Department of Health and Human Services; Chothia, C. & Lesk, A. M. (1987). Canonical structures For The Hypervariable domains Of Immunoglobulins. J. Mol. Biol.196, 901-917.

[0024] Monoklonalno antitelo ili njegovi fragmenti koji se vezuju za antigen, opisani ovde, mogu da imaju fragment koji se vezuje za antigen sinukleina koji obuhvata ili se sastoji od:

(a) CDR1 teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO:1; i/ili

(b) CDR2 teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO:2; i/ili

(c) CDR3 teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO:3; i/ili

(d) CDR1 lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO:4; i/ili

(e) CDR2 lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO:5; i/ili

(f) CDR3 lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO:6; koji se može specifično vezati za humani alfa-sinuklein.

[0025] Monoklonalno antitelo ili njegovi fragmenti koji se vezuju za antigen, opisani ovde, mogu da imaju fragment koji se vezuje za antigen sinukleina koji obuhvata ili se sastoji od:

(a) CDR1 teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO:1;

(b) CDR2 teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO:33, 34 ili 35;

(c) CDR3 teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO:3;

(d) CDR1 lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO:4;

(e) CDR2 lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO:5; i

(f) CDR3 lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO:6; koji se može specifično vezati za humani alfa- sinuklein.

[0026] Monoklonalno antitelo ili njegovi fragmenti koji se vezuju za antigen, opisani ovde, mogu da imaju fragment koji se vezuje za antigen sinukleina koji obuhvata ili se sastoji od:

(a) CDR1 teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO:20; i/ili

(b) CDR2 teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO:21; i/ili

(c) CDR3 teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO:22; i/ili

(d) CDR1 lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO:23; i/ili

(e) CDR2 lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO:24; i/ili

(f) CDR3 lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO:25. koji se može specifično vezati za humani alfa-sinuklein.

[0027] Monoklonalno antitelo ili njegovi fragmenti koji se vezuju za antigen, opisani ovde, mogu da imaju fragment koji se vezuje za antigen sinukleina koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu (u svojim CDR-ovima, svojim varijabilnim domenima, svojim ostacima okvira ili u svojim konstantnim domenima) koji se razlikuju od onih antitela protiv alfa-sinukleina koji se prirodno javljaju, i koji pokazuju (u odnosu na ta antitela protiv alfa-sinukleina koja se prirodno javljaju):

(i) razliku u afinitetu vezivanja (KD) za alfa-sinuklein;

(ii) razliku u sposobnosti inhibicije skraćivanja alfa-sinukleinskih vlakana proteazom;

(iii) razliku u sposobnosti preokretanja oštećenja bazalne sinaptičke transmisije kod F28-snca transgenih miševa;

(iv) razliku u sposobnosti smanjenja nivoa alfa-sinukleina u mišjem hipokampusu kao što je mereno in vivo mikrodijalizom; i/ili

(v) razliku u sposobnosti, kada se hronično daje, da se obnovi motorička funkcija u pacovskom modelu Parkinsonove bolesti

(vi) razliku u sposobnosti da se spreči zasejavanje alfa-sinukleina (kao što je nakupljanje nerastvorljivog fosforilisanog alfa-sinukleina in vitro i/ili u mišjem modelu Parkinsonove bolesti); i/ili

(vii) razliku u sposobnosti da vezuje skraćeni alfa-sinuklein u mozgu ljudi.

[0028] Antitela ovog pronalaska mogu da se koriste u postupku za lečenje, dijagnozu ili imidžing sinukleinopatija, kao što su Parkinsonova bolest ((PD), uključujući idiopatske i nasledne oblike Parkinsonove bolesti), difuzna bolest Levijevih tela (DLBD), varijanta Alchajmerove bolesti sa Levijevim telima (LBV), Gošeova bolest (GD), kombinovana Alchajmerova i Parkinsonova bolest (CAPD), čisto autonomno zatajenje i višestruka sistemska atrofija.

Kratak opis nacrta

[0029]

Fig.1 prikazuje protokole imunizacije za generisanje hibridoma. Tabela navodi razlike imunogena i mišji sojevi korišćeni za identifikaciju GM37 i GM285. Različiti HCo17-Balb/c i HCo12/Balb/c miševi imunizovani su nezavisno (opis ovih miševa obezbeđen je u nastavku). Hibridoma koji eksprimira GM37 identifikovan je iz miševa imunizovanih sa alfa-sinukleinom pune dužine koji sadrži vlakna aminokiselina 1-140 i pojačan sa skraćenim fragmentima alfasinukleina 1-60 i 1-119 alfa-sinukleina pune dužine (FL) (SEQ ID NO 10). Hibridoma koja eksprimira antitelo GM285 dolazi iz protokola imunizacije u kojem su HCo12-Balb/c miševi imunizovani sa monomernim alfa-sinukleinom pune dužine, aminokiseline 1-140 praćene pojačanjem sa vlaknastim alfa-sinukleinom pune dužine (Primer 1).

Fig.2 (PANEL A-C) prikazuje skrining GM37 za vezivanje za alfa sinuklein, homologe i ortologe alfa-sinukleina.

A) Vezivanje antitela GM37 za alfa-sinuklein korišćenjem ELISA testa bez rastvora za ispiranje (FMAT).

B) Korišćenje SPR (Fortebio) koji vezuje antitela GM37 je specifično za alfa-sinuklein (Alfa Panel) i ne vezuje druge srodne proteine iz porodice sinukleina, beta-sinuklein (Beta Panel) i gamasinuklein (Gama Panel). Merenja su izvedena korišćenjem SPR (Fortebio Octetred) GM37 koji prikazuje slično vezivanje za alfa-sinuklein iz cinomolgus majmuna (Cino Panel) i miša (Mišji Panel). (Primer 1).

C) Korišćenje SPR (Fortebio Octetred) koji vezuje antitela GM285 je specifično za alfa-sinuklein i ne vezuje druge srodne proteine iz porodice sinukleina, beta-sinuklein i gama-sinuklein. Merenja su izvedena korišćenjem SPR (Fortebio Octetred) koji prikazuje slično vezivanje GM285 za alfasinuklein iz cinomolgus majmuna (Cino) i miša (mišji) (Primer 1).

Fig.3 (Paneli A-C) prikazuje afinitet vezivanja GM37 u realnom vremenu

A) Vezivanje antitela GM37 za alfa-sinuklein mereno u RU (Relativne Jedinice) (y-osa) tokom vremena (X-osa) kao što je određeno pomoću SPR (BIAcore<®>3000). Kozji anti-humani IgG imobilisan je na CM5 čipu. GM37 je zarobljen na kozjem anti-humanom IgG imobilisanom čipu i testirane su serije koncentracija humanog alfa-sinukleina (3.125, 6.25, 12.5, 25, 50, 100 nM) na vezivanje za površinu. Površina senzora regenerisana je između svakog ciklusa.

B) Signal od vezivanja na različitim koncentracijama preveden je u krivu vezivanja.

C) Izračunate konstante vezivanja antitela GM37 (označen sa hlgG1-6004-037-C106S) (Primer 2).

Fig.4 (Paneli A-C) prikazuje afinitet vezivanja GM285 u realnom vremenu

A) Vezivanje antitela GM285 za alfa-sinuklein izmereno u RU (y-osa) tokom vremena (X-osa) kao što je određeno pomoću SPR (BIAcore<®>3000). Kozji anti-humani IgG imobilisan je na CM5 čipu. GM285 je zarobljen na kozjem anti-humanom IgG imobilisanom čipu i testirane su serije koncentracija humanog alfa-sinukleina (3.125, 6.25, 12.5, 25, 50, 100 nM) na vezivanje za površinu. Površina senzora regenerisana je između svakog ciklusa.

B) Signal od vezivanja na različitim koncentracijama preveden je u krivu vezivanja.

C) Izračunate konstante vezivanja antitela GM285 (označen sa hlgG1-6004-285) (Primer 2).

Fig.5 (Paneli A-C) prikazuje vezivanje uporednog antitela 9E4 u realnom vremenu

A) Prikazuje vezivanje 9E4 za alfa-sinuklein izmereno u RU (y-osa) tokom vremena (X-osa) kao što je određeno pomoću SPR (BIAcore<®>3000). Kozji anti-humani IgG imobilisan je na CM5 čipu.

9E4 je zarobljen na čipu svojim vezivanjem za kozji anti-humani IgG koji je imobilisan na čipu. Testirane su serije koncentracija humanog alfa-sinukleina (3.125, 6.25, 12.5, 25, 50, 100 nM) za vezivanje za površinu. Površina senzora regenerisana je između svakog ciklusa.

B) Signal od vezivanja na različitim koncentracijama preveden je u krivu vezivanja.

C) Izračunate konstante vezivanja za antitelo 9E4. (Primer 2).

Fig.6 prikazuje aminokiselinsku sekvencu alfa-sinukleina. Glavna mesta skraćivanja (označena strelicama) identifikovana su masenom spektrometrijom u humanom tkivu mozga (Kellie JF, Higgs RE, Ryder JW, Major A, Beach TG, Adler CH, Merchant K, Knierman MD. Quantitative measurement of intact alpha-synuclein proteoforms from post-mortem control and Parkinson's disease brain tissue by mass spectrometry. Sci Rep.2014 Jul 23;4:5797. doi: 10.1038/srep05797) Fig.7 (Paneli A-B) prikazuje epitopsko mapiranje antitela GM37 i GM285. ELISA podaci koji prikazuju relativne nivoe vezivanja antitela za uzastopne peptide (20meri) izvedene iz aminokiselinske sekvence alfa-sinukleina 95 - 132 (ostali nevezujući peptidi nisu prikazani).

A) GM37 epitop zahteva peptidnu sekvencu ILEDMP (SEQ ID NO:9) za potpuno vezivanje.

B) GM285 zahteva peptid ILED (SEQ ID NO:19) za potpuno vezivanje. (Primer 3).

Fig.8 (Paneli A-B) je šematski prikaz skraćenih oblika alfa-sinukleina.

A) vezujući epitop iz GM37/285 (ILEDMP; SEQ ID NO:9) i 9E4 (NEAYE; SEQ ID NO:36) prikazani su podebljano na aminokiselinskoj sekvenci alfa-sinukleina (SEQ ID NO:10). Strelice označavaju cterminalna mesta skraćivanja sa Fig.6.

B) Glavni skraćeni oblici alfa-sinukleina koji su identifikovani iz humanog moždanog materijala. Veličina na bazi aminokiselinskih brojeva naznačena je na desnoj strani. Alfa-sinuklein pune dužine je 140 aminokiselina. Kao što se može zaključiti iz epitopa, GM37, njegove varijante 1-3, i GM285 treba da vezuju pune dužine u 1-119/122, 1-135 fragmente. Antitelo 9E4 će se vezati samo za pune dužine i 1-135 fragment. Nije prikazana specifična priroda malih c-terminalnih fragmenata ostalih nakon skraćivanja.

Fig.9 prikazuje da antitela GM37 i GM285 imunotalože alfa-sinuklein pune dužine kao i skraćeni alfa-sinuklein iz humanog mozga. Sirovi homogenati humanog DLB mozga inkubirani su sa testnim antitelima (Perle (Bez ab), B12-humano IgG1 kontrolno antitelo koje se ne vezuje za alfa-sinuklein, GM-37, GM37 varijanta 2, GM-285 i mišji (m)9E4) i imunodepletiran supernatant i imunoistaložen materijal odvojeni su na SDS-PAGE. Western blot prikazuje trake koje predstavljaju pune dužine i različite skraćene oblike alfa-sinukleina koji su iscrpljeni iz supernatanta i koji su imunoistaloženi sa antitelima (IP). Kao što se može videti, GM37, GM37v2 i GM285 antitelo iscrpljuje glavne vrste alfa-sinukleina iz supernatanta, i IP prikazuje ove vrste, skraćene vrste 1-135, 1-119/122 i alfa sinuklein pune dužine.9E4 ne deluje na 1-119/122 vrste već samo na IP-ove pune dužine i 1-135 (Primer 4).

Fig.10 je šematski prikaz proteolize vlakana alfa-sinukleina odvojenih pomoću kalpaina na aminokiselini 119/122. Vlakna alfa-sinukleina (PFF) dodata su kulturi sa (PFF+) ili bez (PFF) testnog antitela. Prisustvo GM-37/285 inhibira obrazovanje skraćenog alfa-sinukleina u ćelijama i izlučivanje u ćelijski medijum.

Fig.11A prikazuje da GM37 inhibira obrazovanje skraćene trake (12KD) i u podlogama i u ćelijskim lizatima primarnih mišjih kortikalnih kultura tretiranih sa PFF. Proteini su odvojeni pomoću SDS-PAGE i western blotirani da bi se detektovale različite vrste alfa-sinukleina. U ćelijama tretiranim samo sa PFF ili kontrolnim antitelom (B12) dve monomerne trake alfasinukleina detektovane su na 12 i 14 kDa, koje predstavljaju skraćeni i alfa-sinuklein pune dužine, tim redom. U prisustvu GM-37, postoji samo slaba traka na 12Kd koja pokazuje da je najveći deo cepanja blokiran. Ovaj efekat se takođe odražava u u medijumu ćelija. Relativni nivoi nakupljanja mogu se takođe inhibirati prisustvom GM-37 što se odražava smanjenjem relativnog intenziteta 14Kd trake. Alternativno, može postojati smanjena količina 14Kd trake dostupna za apsorpciju od strane ćelija. (Primer 5).

Fig.11B prikazuje dozno zavisna inhibiciju proteolize vlakana alfa-sinukleina antitelima GM37, GM37 varijanta 2 i GM285. U ćelijskim lizatima iz primarnih mišjih kortikalnih kultura na niskoj koncentraciji antitela (0,1 ug/ml), postoje dve, traka koja predstavlja alfa-sinulkein pune dužine (FL) i traka koja predstavlja C-terminalno skraćeni (CT) alfa-sinuklein (označena strelicama). Porast koncentracije antitela do 1, 5 i 10 ug/ml dovodi do smanjenja proteolize vlakana alfasinukliena u ćelijama. Ovo je primećeno i sa antitelom GM37, GM37v2 i GM285. Kontrolni uzorci tretirani su sa humanim IgG1 antitelom B12 koje ne prepoznaje alfa-sinuklein. Postoji i kontrola bez nekog dodatog antitela (Bez ab), i ćelije bez dodatih vlakana alfa-sinukleina (Bez Asyn). Ukupna količina alfa-sinukleina takođe je smanjena u uzorcima tretiranim sa 37, 37v2 i 285 u poređenju sa B12 ili kontrola "bez antitela", indikativno da sva tri antitela smanjuju nakupljanje alfa-sinukleina u ćelijama na način zavisno od koncentracije. Traka aktina na vrhu gela prikazuje jednako opterećenje uzoraka (Primer 5).

Fig.12 prikazuje uticaj GM37 i GM285 na zasejavanje agregacije alfa-sinukleina i fosforilaciju alfa-sinukleina u mišjim primarnim kortikalnim neuronima.

12A) Primer slika primarnih neurona obojenih za fosforilisan alfa-sinuklein, što se pojavljuje kao tačke ili tačkasto bojenje u ćelijama kada se ćelije zaseju sa ili 1 ng čistih semena ili sirovih semena alfa-sinukleina.

12B) Western blot proteina iz primarnih kortikalnih neurona odvojenih na rastvorljive i nerastvorljive frakcije. Mrlje su obojene humanim antitelom specifičnim za alfa-sinuklein (4B12/H a-syn), fosfo-Ser-129-antitelom specifičnim za alfa-sinuklein (ab51253/pS-a-Syn) i mišjim antitelom specifičnim za alfa-sinuklein (D37A2/M a-syn) i pokazuju da dodavanje sirovih semena u primarnim neuronima dovodi do nakupljanja endogenog mišjeg alfa-sinukleina i fosforilisanog alfa-sinukleina i multimera alfa-sinukleina veće molekulske mase u nerastvorljivoj frakciji.

12C) GM37, GM37 varijanta 2 i GM285 inhibiraju pojavu fosforilisanog alfa-sinukleina kvantifikovano kao broj 129 pozitivnih tačaka alfa-sinuklein fosfoserina u ćelijama pomoću Cellomics ARRAYSCAN<™>automatizovanog mikroskopa. GM37, GM37v2 i GM285 smanjuju količinu tačaka fosforilisanog alfa-sinukleina u ćelijama na način zavisan od doze.

12D) Western blot homogenata iz primarnih kortikalnih neurona tretiranih najvećom dozom antitela (133 nM), i obojenih za aktin, humani alfa-sinuklein, fosforilisan alfa-sinuklein i mišji alfa-sinuklein prikazuje da antitela 37, 37v2 i 285 inhibiraju skraćivanje sirovih semena alfasinukleina koje apsorbuju ćelije u nerastvorljivoj frakciji. Sva antitela takođe inhibiraju nakupljanje fosforilisanih, endogenih mišjih multimera fosforilisanog mišjeg alfa-sinukleina veće molekulske mase u nerastvorljivoj frakciji. Traka aktina na vrhu gela prikazuje jednako opterećenje uzoraka (Primer 6).

Fig.13 prikazuje bazalnu sinaptičku transmisiju na Schaffer kolateralnoj-CA1 sinapsi u hipokampusu F28-snca transgenih miševa i kontrolnih miševa iste starosti. Ekscitatorni postsinaptički potencijali polja (fEPSP) bili su izazvani jednim stimulansom primenjenim na Schaffer kolateral, i bazalna sinaptička transmisija ocenjena je merenjem fEPSP nagiba kao funkcije intenziteta stimulacije. Kratkotrajna sinaptička plastičnost ocenjena je indukcijom facilitacije uparenim impulsima. Različiti intenziteti stimulacije bili su 0, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400 i 500 µA, i primenjeni su uzastopno rastućim redosledom, sa 2 do 3 ponavljanja za svaki intenzitet. Otkriveno je da je bazalna sinaptička transmisija značajno pogoršana kod F28-snca transgenih miševa koji su prekomerno eksprimirali alfa-sinuklein divljeg tipa u poređenju sa kontrolnim miševima iste starosti (Primer 7).

Fig.14 prikazuje efekat sistemskog davanja jedne doze humanog 9E4 (15 mg/kg, i.p.) na pogoršanje u bazalnoj sinaptičkoj transmisiji na Schaffer kolateralnoj- CA1 sinapsi u hipokampusu F28-snca transgenih miševa. Ekscitatorni postsinaptički potencijali polja (fEPSP) bili su izazvani jednim stimulansom primenjenim na Schaffer kolateralu, i bazalna sinaptička transmisija ocenjena je merenjem fEPSP nagiba kao funkcije intenziteta stimulacije. Akutno tretiranje sa h9E4 izazvalo je značajan preokret oštećenja u bazalnoj sinaptičkoj transmisiji kod F28-snca transgenih miševa (Tg-snca h9E4 vs. Tg-snca PBS, p=0.002). Međutim, preokret pomoću h9E4 bio je samo delimičan, kao što je određeno značajno manjom bazalnom sinaptičkom transmisijom u poređenju s jedinkama u leglu tretiranih sa PBS (p=0.007) (Primer 7).

Fig.15 prikazuje efekat sistemskog davanja jedne doze humanog GM37 (15 mg/kg, i.p) ili izotipskog kontrolnog antitela (B12) na pogoršanje u bazalnoj sinaptičkoj transmisiji na Schaffer kolateralnoj-CA1 sinapsi u hipokampusu F28-snca transgenih miševa. Ekscitatorni postsinaptički potencijali polja (fEPSP) bili su izazvani jednim stimulansom primenjenim na Schaffer kolateralu, i bazalna sinaptička transmisija ocenjena je merenjem fEPSP nagiba kao funkcije intenziteta stimulacije. Akutno tretiranje sa GM37 indukovalo je potpuni preokret pogoršanja u bazalnoj sinaptičkoj transmisiji kod F28-snca transgenih miševa (Tg-snca GM37 vs. Tg-snca B12, p=0.004) (Primer 7).

Fig.16 prikazuje efekat sistemskog davanja jedne doze humanog GM285 (15 mg/kg, i.p) na oštećenja u bazalnoj sinaptičkoj transmisiji na Schaffer kolateralnoj-CA1 sinapsi u hipokampusu F28-snca transgenih miševa. Ekscitatorni postsinaptički potencijali polja (fEPSP) bili su izazvani jednim stimulansom primenjenim na Schaffer kolateralu, i bazalna sinaptička transmisija ocenjena je merenjem fEPSP nagiba kao funkcije intenziteta stimulacije. Akutno tretiranje sa GM285 indukovalo je poptuni preokret pogoršanja u bazalnoj sinaptičkoj transmisiji kod F28-snca transgenih miševa (Tg-snca GM285 vs. Tg-snca PBS, p=0.001) (Primer 7).

Fig.17 (Paneli A-B) prikazuje efekat sistemskog davanja (15 mg/kg, i.p.) humanog 9E4, GM37 ili izotipskog kontrolnog antitela (anti-HEL) na nivoe humanog alfa-sinukleina u intersticijalnoj tečnosti (isf) u hipokampusu F28-snca transgenih miševa koji se slobodno pomeraju. Prosek dvetri bazalne vrednosti (4h-6h) pre tretiranja antitelom uzeta je kao osnovna linija i postavljena na 100% za svaku životinju. Razlike su analizirane korišćenjem dvosmerne analize varijanse (ANOVA) sa ponovljenim merenjima. Bazalni nivoi humanog alfa-sinukleina u hipokampusu bili su 8.1 ± 1.1 ng/ml (srednja vrednost ± SEM, n = 25, nije korigovana za in vitro oporavak sonde za dijalizu). Davanje GM37 indukovalo je veće smanjenje humanog alfa-sinukleina u hipokampusu F28 miševa u odnosu i na uporedno antitelo, humani 9E4, i na kontrolni izotip, anti-HEL Vremenske tačke koje pokazuju značajne razlike u nivoima alfa-sinukleina između životinja tretiranih sa GM37 ili kontrolnim antitelom označeni su zvezdicom. (Primer 8).

Fig.18 je šematski prikaz vremenske linije za tretiranje antitelom (strelice nadole), virusne injekcije i procenu ponašanja kod pacovskog AAV modela humanog alfa-sinukleina prikazanog na Fig.19 (Primer 9).

Fig.19 prikazuje da antitelo GM37 može da smanji Parkinsonove motoričke deficite nakon hroničnog tretiranja kod pacovskog AAV modela. Efekat hroničnog tretiranja sa GM37 ili PBS kod pacova sa AAV-humanim- alfa-sinukleinom na motoričku asimetriju ocenjena je u testu cilindra. Svaki pacov testiran je za upotrebu prednjih šapa praćenjem tokom 5 minuta. Procenat upotrebe desne prednje šape (ipsilateralno u odnosu na injekciju) i upotrebe leve (kontralateralno desna prednja šapa) izračunat je za svaku životinju (kao što je prikazano na yosi) *, ** p<0.05 i 0.01 u odnosu na GFP-PBS pacove. Pacovi tretirani sa PBS i dalje imaju značajnu asimetriju u upotrebi šape, dok životinje tretirane antitelom GM37 nemaju više značajni deficit. (Primer 9).

Fig.20A-20C prikazuje da hronično tretiranje antitelom GM37 može da smanji patološku fosforilaciju alfa-sinukleina indukovanu injekcijom patoloških vlaknastih semena alfa-sinukleina u mišji strijatum. Fig.20A prikazuje šemu koja pokazuje relativno vreme tretiranja u odnosu na injekciju semena i brojanje ćelija. Antitelo GM37 dato je jedan dan pre injekcije rekombinantnih vlaknastih semena alfa-sinukleina u dorzalni strijatum miševa, a potom jednom nedeljno tokom šest nedelja. Režim doziranja bio je ili 15 mg/kg iv ili 30 mg/kg ip. Fig.20B prikazuje nivo izlaganja GM37 u plazmi na osnovu mesta injekcije i doze. Uzorci po nedeljama uzeti su pre injekcije nove doze antitela. Fig.20C prikazuje nivo izlaganja GM37 u csf na osnovu doze i mesta injekcije na kraju ispitivanja. Fig.20D poredi broj ćelija sa pozitivnim inkluzijama fosforilisanog alfa-sinukleina računato od svake šeste oblasti u crnoj supstanci nakon tretiranja sa GM37 ili PBS kontrolom. Miševi tretirani sa GM37 i 15 mg/kg iv i 30 mg/kg ip imali su značajno smanjenje u ćelijama sa inkluzijama fosforilisanog alfa-sinukleina u odnosu na PBS tretirane miševe (Primer 10).

Fig.21 prikazuje poravnanje humanih proteina α (SEQ ID NO:10), β (SEQ ID NO:37) i γ (SEQ ID NO:38) sinukleina. Aminokiselinski ostaci različiti od α- sinukleina istaknuti su. Praznine su označene tačkom. SwissProt brojevi su u zagradi.

Fig.22 prikazuje poravnanje ortologa alfa-sinukleina (Cinomolgus majmun, SEQ ID NO:39; pacov, SEQ ID NO:40; miš, SEQ ID NO:41). Aminokiselinski ostaci različiti od humanog alfasinukleina (SEQ ID NO:10) su istaknuti. SwissProt brojevi prikazani su u zagradi.

Fig.23 prikazuje prelaznu ekspresiju GM37 (naziv GM37 divljeg tipa (wt) i 3 GM37 varijante, naziv GM37 var 1, 2 i 3. Zvezdica označava da su podaci određeni nakon prečišćavanje i neutralizacije proteina A. † označava da su podaci izračunati iz prinosa postignutog nakon proteina A i neutralizacije u vezi sa skalom kulture za ekspresiju (0.4L).

Fig.24 prikazuje takmičenje vezivanja koje je izmereno pomoću ELISA za četiri antitela GM37 wt, GM37 var 1, GM37 var 2 i GM37 var 3 za humani alfa-sinuklein. Ploče premazane alfasinukleinom koriste se za detekciju količine antitela preostale nakon predinkubacije u rastvoru svakog antitela (0.3 µg/ml) sa rastućom koncentracijom alfa-sinukleina (0-1000nM). Sva četiri antitela pokazuju slično vezivanje za alfa-sinuklein.

Fig.25 prikazuje tabelu koja poredi kinetičke parametre brzine vezivanja GM37wt i varijanti 1-3 za imobilisani rekombinantni humani alfa-sinuklein. Vezivanje je izmereno pomoću SPR i brzine su određene korišćenjem 1:1 algoritma vezivanja (BIAcore<®>T200).

Fig.26 poredi efekat antitela protiv alfa-sinukleina na nivoe fosforilisanog alfa-sinukleina u mišjim primarnim neuronima tretiranim sa patološkim vlaknastim semenima alfa-sinukleina. Primarni neuroni tretirani su semenima (10ng) u prisustvu ili odsustvu četiri GM37, GM37 var 1, GM37 var 2 i GM37 var 3 (2µg). Neuroni su fiksirani i obojeni nakon 3 nedelje i analizirani pomoću Cellomics ARRAYSCAN<™>za alfa-sinuklein fosfo serin 129 pozitivne tačke. Ćelije tretirane samo semenima ili semenima plus izotipsko kontrolno antitelo (B12) prikazuju značajno povećane nivoe fosforilacije. Ćelije tretirane sa GM37wt i 3 varijante mogu da inhibiraju fosforilaciju alfa-sinukleina, sve pokazuju isti nivo fosforilacije kao ćelije koje nisu primile semena. Podaci su prikazani kao srednja vrednost ±SD kao što je određeno na osnovu sedam slika po bunarčiću u pet bunarčića. N=2.

Fig.27 poredi agregaciju wt GM37, var1, var2 i var3 zavisnu od temperature. Uzorak svakog od antitela podvrgnut je stalnom porastu temperature tokom vremena i nivo agregacije istovremeno je meren višeugaonim rasejanjem svetlosti (Prometheus NT.48, NanoTemper Technologies). Temperatura za pojavu agregacije slična je za GM37 i GM37-varijante, međutim najmanji nivo agregacije primećen je za GM37-Var2.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

Definicije

[0030] Kao što je ovde korišćeno, pojam "alfa-sinuklein" je sinonim za "protein alfa-sinukleina" i odnosi se na bilo koju od izoformi proteina alfa-sinukleina (identifikovane u, na primer, UniProt kao P37840, 1-3). Numerisanje aminokiselina alfa-sinukleina dato je u odnosu na SEQ ID NO:10 kao što je prikazano dole, pri čemu je metionin (M) aminokiselinski ostatak1:

SEQ ID NO:10:

[0031] Ovaj pronalazak odnosi se na antitela, kako su navedena u patentnim zahtevima, koja se mogu specifično vezati za alfa-sinuklein, a posebno za humani alfa-sinuklein. Posebno, antitela pokazuju sposobnost da se specifično vežu za neki epitop unutar 112-117 humanog alfa-sinukleina.

[0032] Pojam "antitelo" (Ab) kao što je ovde korišćeno odnosi se na molekul imunoglobulina ili fragment molekula imunoglobulina koji ima sposobnost da se specifično vezuje za epitop molekula ("antigen"). Antitela koja se prirodno javljaju obično obuhvataju tetramer koji se obično sastoji do najmanje dva teška (H) lanca i najmanje dva laka (L) lanca. Svaki teški lanac sastoji se od varijabilnog domena teškog lanca (ovde je skraćenica VH) i konstantnog domena teškog lanca, obično obuhvata tri domena (CH1, CH2 i CH3). Teški lanci mogu biti bilo kog izotipa, uključujući IgG (IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4 podtipove), IgA (IgA1 i IgA2 podtipove), IgM i IgE. Svaki laki lanac sastoji se od varijabilnog domena lakog lanca (ovde je skraćenica VL) i konstantnog domena lakog lanca (CL). Laki lanci uključuju kapa lance i lambda lance. Varijabilni domen teškog i lakog lanca obično je odgovoran za prepoznavanje antigena, dok konstantni domen teškog i lakog lanca može da posreduje u vezivanju imunoglobulina za tkiva ili faktore domaćina, uključujući razne ćelije imunološkog sistema (npr., efektorske ćelije) i prvu komponentu (C1q) klasičnog sistema komplementa. VH i VL regioni mogu se dalje podeliti na regione hipervarijabilnosti, nazivaju se "regioni koji određuju komplementarnost," koji su ispresecani regionima sa konzervativnijom sekvencom, nazivaju se "okvirni regioni" (FR). Svaki VH i VL sastoji se od tri CDR domena i četiri FR domena raspoređena od amino-kraja do karboksi-kraja sledećim redosledom: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. Varijabilni domeni teških i lakih lanaca sadrže vezujući domen koji uzajamno deluje sa antigenom. Od posebnog značaja su antitela i njihovi fragmenti koji se vezuju za antigen koji je "izolovan" tako da postoje u fizičkom okruženju različitom od onog u kojem se mogu javiti u prirodi ili koji su modifikovani tako da se razlikuju od antitela koje se prirodno javlja u aminokiselinskoj sekvenci.

[0033] Pojam "epitop" predstavlja antigensku determinantu sposobnu za specifično vezivanje za antitelo. Epitopi se obično sastoje od površinskih grupacija molekula kao što su aminokiseline ili bočni lanci šećera i obično imaju specifične trodimenzionalne strukturne karakteristike, kao i specifične karakteristike naelektrisanja. Konformacioni i linearni epitopi se razlikuju po tome što se vezivanje za prve, ali ne i za druge, uvek gubi u prisustvu denaturišućih rastvarača. Epitop može da sadrži aminokiselinske ostatke direktno uključene u vezivanje i druge aminokiselinske ostatke, koji nisu direktno uključeni u vezivanje, kao što su aminokiselinski ostaci koje efikasno blokira specifični peptid koji vezuje antigen (drugim rečima, aminokiselinski ostatak se nalazi unutar traga specifičnog peptida koji vezuje antigen). Pojam "112-117 epitop" odnosi se na region humanog alfa-sinukleina koji sadrži najmanje 4 od 6 aminokiselinskih ostataka iz 112-117 humanog alfa-sinukleina, koji epitop ne uključuje ni jedan ostatak iz 1-111 (uključujući bilo koji ostatak iz 106-111) humanog alfa-sinukleina, niti ni jedan ostatak iz 118-140 (uključujući ostatak 118-120) humanog alfa-sinukleina. Kao što je ovde korišćeno, za antitelo se kaže da može specifično da se veže za neki epitop unutar "112-117 epitopa" ako može specifično da se veže za humani alfa-sinuklein vezivanjem za najmanje 4 od 6 aminokiselinskih ostataka iz 112-117 epitopa.

[0034] Kao što je ovde korišćeno, pojam "antigen-vezujući fragment antitela" predstavlja fragment, deo, region ili domen nekog antitela (bez obzira kako se proizvodi (npr., cepanjem, rekombinantno, sintetički, itd.)) koji se može specifično vezati za neki epitop, i tako pojam "antigen-vezujući" treba da znači isto što i "epitop-vezujući" tako da, na primer, "antigen-vezujući fragment antitela" treba da je isti kao "epitop-vezujući fragment antitela". Antigen-vezujući fragment može da sadrži 1, 2, 3, 4, 5 ili svih 6 od CDR domena takvog antitela i, iako se može specifično vezati za takav epitop, može da pokazuje specifičnost, afinitet ili selektivnost ka takvom epitopu koji se razlikuje od onog takvog antitela. Poželjno, međutim, antigen-vezujući fragment sadržaće svih 6 od CDR domena tog antitela. Antigen-vezujući fragment antitela može da bude deo, ili da sadrži, jedan polipeptidni lanac (npr., scFv), ili može da bude deo, ili da obuhvata, dva ili više polipeptidnih lanaca, od kojih svaki ima amino-kraj i karboksilni kraj (npr., dijatelo, Fab fragment, Fab2fragment, itd.). Fragmenti antitela koji pokazuju antigen-vezujuću sposobnost mogu se dobiti, na primer, cepanjem proteaze netaknutih antitela. Poželjnije, iako su dva domena Fv fragmenta, VL i VH, prirodno kodirana posebnim genima, ili iako se mogu spojiti polinukleotidi koji kodiraju takve sekvence gena (npr., njihova kodirajuća cDNK), korišćenje rekombinantnih postupaka, fleksibilnim linkerom koji im omogućava da budu napravljeni kao jedan proteinski lanac u kome se VL i VH regioni spajaju i formiraju monovalentne molekule koji vezuju antigen (poznat kao jednolančani Fv (scFv); videti npr., Bird et al. , (1988) Science 242:423-426; i Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 85:5879-5883). Alternativno, korišćenjem fleksibilnog linkera koji je prekratak (npr., manje od oko 9 ostataka) da bi se omogućilo da se VL i VH regioni jednog polipeptidnog lanca povežu zajedno, može se formirati bispecifično antitelo, dijatelo ili sličan molekul (u kome se dva takva polipeptidna lanca povezuju zajedno da bi obrazovala dvovalentni molekul koji vezuje antigen) (videti na primer PNAS USA 90(14), 6444-8 (1993) radi opisa dijatela). Primeri fragmenata koji se vezuju za antigen obuhvaćeni unutar ovog pronalaska uključuju (i) Fab' ili Fab fragment, monovalentni fragment koji se sastoji od VL, VH, CL i CH1 domena, ili monovalentno antitelo kao što je opisano u WO2007059782; (ii) F(ab')2 fragmente, dvovalentne fragmente koji obuhvataju dva Fab fragmenta spojena disulfidnim mostom na zglobnom domenu; (iii) Fd fragment koji se suštinski sastoji od VH i CH1 domena; (iv) Fv fragment koji se suštinski sastoji od VL i VH domena, (v) dAb fragment (Ward et al., Nature 341, 544-546 (1989)), koji se suštinski sastoji od VH domena i takođe se naziva domenska antitela (Holt et al; Trends Biotechnol.2003 Nov;2i(II) :484-90); (vi) kamelid ili nanotela (Revets et al; Expert Opin Biol Ther.2005 Jan;5_(I): I II-24) i (vii) izolovani region koji određuje komplementarnost (CDR). Osim toga, iako su dva domena iz Fv fragmenta, VL i VH, kodirana posebnim genima, mogu se spojiti, korišćenjem rekombinantnih postupaka, sintetičkim linkerom koji im omogućava da se izvedu kao jedan proteinski lanac u kojem VL i VH par regiona da obrazuju monovalentne molekule (poznate kao jednolančana antitela ili jednolančani Fv (scFv), videti na primer Bird et al., Science 242, 423-426 (1988) i Huston et al., PNAS USA 85, 5879-5883 (1988)). Ovi i drugi korisni fragmenti antitela ovde su dalje objašnjeni. Takođe treba razumeti da pojam antitelo, osim ako nije naznačeno drugačije, takođe uključuje polipeptide poput antitela, kao što su himerna antitela i humanizovana antitela, i fragmente antitela koji zadržavaju sposobnost da se specifično vezuje za antigen (fragmenti koji se vezuju za antigen) obezbeđen bilo kojom poznatom tehnikom, kao što je enzimsko cepanje, sinteza peptida i rekombinantne tehnike. Antitelo kao što se generiše može da ima bilo koji izotip. Kao što je ovde korišćeno, "izotip" odnosi se na klasu imunoglobulina (na primer IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4) koja se kodira genima konstantnog domena teškog lanca. Takvi fragmenti antitela dobijaju se korišćenjem konvencionalnih tehnika poznatih stručnjacima u ovoj oblasti; pogodni fragmenti koji mogu da se vezuju za željeni epitop mogu se lako pregledati za korišćenje na isti način kao netaknuto antitelo.

[0035] Pojam "bispecifično antitelo" odnosi se na antitelo koje sadrži dva nezavisna fragmenta koji se vezuju za antigen od kojih svaki cilja nezavisne ciljeve. Ovi ciljevi mogu biti epitopi prisutni na različitim proteinima ili različiti epitopi prisutni na istom cilju. Molekuli bispecifičnih antitela mogu se izraditi korišćenjem kompenzatornih promena aminokiselina u konstantnim domenima HC-ova matičnih monospecifičnih dvovalentnih molekula antitela. Dobijeno heterodimerno antitelo sadrži jedan Fabs izveden od dva različita matična monospecifična antitela. Aminokiselinske promene u Fc domenu dovodi do povećane stabilnosti heterodimernog antitela sa bispecifičnošću koja je stabilna tokom vremena. (Ridgway et al., Protein Engineering 9, 617-621 (1996), Gunasekaran et al., JBC 285, 19637-1(2010), Moore et al., MAbs 3:6546-557 (2011), Strop et al., JMB 420, 204-219 (2012), Metz et al., Protein Engineering 25:10571-580 (2012), Labrijn et al., PNAS 110:113, 5145 -5150 (2013), Spreter Von Kreudenstein et al., MAbs 5:5646-654 (2013)). Bispecifična antitela mogu dalje da uključuju molekule koji se generišu korišćenjem ScFv fuzija. Dva monospecifična scfv zatim se nezavisno spajaju sa Fc domenima koji mogu da obrazuju stabilne heterodimere za generisanje pojedinačnog bispecifičnog molekula (Mabry et al., PEDS 23:3115-127 (2010). Bispecifični molekuli imaju mogućnosti dvostrukog vezivanja. Na primer, ciljanje i terapijske mete i transcitoznog površinskog receptora za svrhu isporuke terapijskog antitela kroz krvno-moždanu barijeru za lečenje CNS bolesti.

[0036] Pojmovi GM37, GM-37, GM37 divljeg tipa (wt), mab37 i 6004-37 koriste se ovde naizmenično i svi se odnose na isto antitelo.

[0037] Pojam antitelo GM37 treba da uključuje antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji obuhvata ili se sastoji od teškog lanca kao što je dato u CDR1-3 SEQ ID No:1-3 i lakog lanca CDR1-3 kao što je dato u SEQ ID No:4-6. Antitelo GM37 ili njegov antigen-vezujući fragment može da obuhvata ili da se sastoji od varijabilnog domena teškog lanca iz SEQ ID NO:7 i/ili varijabilnog domena lakog lanca iz SEQ ID NO:8. Na primer, antitelo GM37 može biti IgG antitelo koji obuhvata teški lanac koji se sastoji od varijabilnog domena SEQ ID NO:7 i konstantnog domena iz SEQ ID NO:18 zajedno sa lakim lancem koji se sastoji od varijabilnog domena iz SEQ ID NO:8 i kapa konstantnog domena iz SEQ ID NO:17.

[0038] Deaminacija proteina, i u ovim primerima antitela, može da se javi spontano tokom proizvodnje i skladištenja, ali i in vivo, i čini kvalitet krajnjeg farmaceutskog leka teškim za kontrolu. U nekim slučajevima, deaminacija može, takođe, da utiče na aktivnost molekula. Deaminacija se javlja na ostacima asparagina, ali mesto relevantnog asparagina može biti teško za predvideti sa sigurnošću, ali može biti u nekim slučajevima pod uticajem motiva asparaginglicina. Nekoliko mogućih motiva deaminacije nalaze se na GM37 antitelu, međutim, otkriveno je da je jedno verovatno mesto deaminacije na ostatku 54 teškog lanca. Uzastopna supstitucija asparagina drugom aminokiselinom nije jednostavna, ali je utvrđeno da 3 varijante GM37 (GM37 varijanta (var) 1, 2 i 3) zadržavaju aktivnost originalnog GM37 (GM37 divljeg tipa (wt)).

[0039] Pojam GM37 varijante odnosi se na deaminovane varijante 1,2 ili 3, pri čemu varijanta 1 ima N54S supstituciju, varijanta 2 ima N54Q supstituciju i varijanta 3 ima N54H u odnosu na GM37 antitelo prethodno opisano ovde.

[0040] Prema tome, varijante antitela GM37 (var) 1, 2 i 3 treba da uključuju neko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji obuhvata ili se sastoji od teškog lanca kao što je dato u CDR1 i 3 SEQ ID No:1 i 3 iz GM 37 i lakog lanca CDR1-3 iz GM37 kao što je dato u SEQ ID No:4-6, ali se razlikuju u njihovom teškom lancu CDR2 tako da varijanta 1 ima CDR 2 iz SEQ ID NO:33, varijanta 2 ima CDR 2 iz SEQ ID NO:34, a varijanta 3 ima CDR 2 iz SEQ ID NO:35.

[0041] Varijante antitela GM37 ili njihovi fragmenti koji se vezuju za antigen mogu da obuhvataju ili se sastoje od varijabilnog domena teškog lanca iz SEQ ID NO:30, 31 i 32 za varijantu 1, 2 i 3, tim redom, i varijabilnog domena lakog lanca iz SEQ ID NO:8. Antitelo GM37 može biti IgG antitelo koje obuhvata teški lanac koji se sastoji od varijabilnog domena iz SEQ ID NO:30, 31 ili 32 i konstantnog domena iz SEQ ID NO:18 zajedno sa lakim lancem koji se sastoji od varijabilnog domena iz SEQ ID NO:8 i kapa konstantnog domena iz SEQ ID NO:17.

[0042] Pojmovi GM285, GM-285, mab285 i 6004-285 koriste se ovde naizmenično i svi se odnose na isto antitelo.

[0043] Pojam antitelo GM285 treba da uključuje antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji obuhvata ili se sastoji od teškog lanca kao što je dato u CDR1-3 SEQ ID No:20-22 i lakog lanca CDR1-3 kao što je dato u SEQ ID No:23-25. Antitelo GM37 ili njegov antigen-vezujući fragment može da obuhvata ili se sastoji od varijabilnog domena teškog lanca iz SEQ ID NO:26 i/ili varijabilnog domena lakog lanca iz SEQ ID NO:27. Na primer, antitelo GM37 može biti IgG antitelo koje obuhvata teški lanac koji se sastoji od varijabilnog domena iz SEQ ID NO:26 i konstantnog domena iz SEQ ID NO:28 zajedno sa lakim lancem koji se sastoji od varijabilnog domena iz SEQ ID NO:27 i kapa konstantnog domena iz SEQ ID NO:29.

[0044] GM285 antitelo specifično vezuje epitop unutar sekvence 112-115 (ILED; SEQ ID NO:19) humanog alfa-sinukleina (SEQ ID NO:10).

[0045] Osim ako nije drugačije naznačeno ovde, numerisanje aminokiselinskih ostataka u ovom regionu je u skladu sa IMGT<®>, the international ImMunoGeneTics information system<®>ili, Kabat, E. A., Wu, T. T., Perry, H. M., Gottesmann, K. S. & Foeller, C. (1991). Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th edit., NIH Publication no.91-3242 U.S. Department of Health and HumanServices. Chothia, C. & Lesk, A. M. (1987). Canonical structures for the hypervariable domains of immunoglobulins. J. Mol. Biol.

196, 901-917).

[0046] "Antitelo protiv alfa-sinukleina" ili "antitelo prema alfa-sinukleinu" (ovde se koriste naizmenično, zavisno od konteksta gde je napisano) je neko antitelo ili neki njegov antigen-vezujući fragment koji se specifično vezuje za alfa-sinuklein ili fragment alfa-sinukleina kako je prethodno definisano ovde, posebno sekvenca alfa-sinukleina koja odgovara SEQ ID NO 9 i/ili 19.

[0047] Pojam "humano antitelo" (što se može biti skraćeno "humAb" ili "HuMab"), kao što je ovde korišćeno, treba da uključuje antitela sa varijabilnim i konstantnim domenima izvedenim iz humanih sekvenci germinativne linije imunoglobulina. Humana antitela ovog pronalaska mogu da uključuju aminokiselinske ostatke ne kodirane humanim sekvencama germinativne linije imunoglobulina (npr., mutacije uvedene slučajnom ili mesto-specifičnom mutagenezom in vitro ili tokom preuređenja gena ili somatskom mutacijom in vivo).

[0048] Pojmovi "monoklonalno antitelo" ili "kompozicija monoklonalnog antitela" kao što je ovde korišćeno odnose se na pripremu molekula antitela pojedinačne molekulske kompozicije. Uobičajena kompozicija monoklonalnog antitela pokazuje specifičnost pojedinačnog vezivanja i afinitet za poseban epitop. U određenim načinima ostvarivanja, monoklonalno antitelo može da se sastoji od više od jednog Fab domena čime se povećava specifičnost prema više od jednog cilja. Pojmovi "monoklonalno antitelo" ili "kompozicija monoklonalnog antitela" ne treba da su ograničeni bilo kojim posebnim postupkom proizvodnje (npr., rekombinantni, transgeni, hibridoma, itd.).

[0049] Pojam "humanizovan" odnosi se na molekul, generalno pripremljen korišćenjem rekombinantnih tehnika, koje imaju antigen-vezujuće mesto izvedeno iz imunoglobulina iz nehumanih vrsta i preostalih imunoglobulinskih struktura na bazi strukture i/ili sekvence humanog imunoglobulina. Antigen-vezujuće mesto može da obuhvata ili potpuno nehumane varijabilne domene antitela spojene sa humanim konstantnim domenima, ili samo regione koji određuju komplementarnost (CDR) tih varijabilnih domena kalemljene za odgovarajuće humane okvirne regione humanih varijabilnih domena. Ostaci okvira tih humanizovanih molekula mogu biti divljeg tipa (npr., potpuno humani) ili mogu biti modifikovani tako da sadrže jednu ili više aminokiselinskih supstitucija kojih nema u humanom antitelu čija je sekvenca poslužila kao osnova za humanizaciju. Humanizacija smanjuje ili eliminiše verovatnoću da će konstantni domen molekula delovati kao imunogen kod humanih pojedinaca, ali ostaje verovatnoća imunog odgovora na strani varijabilni domen (LoBuglio, A.F. et al. (1989) "Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man: Kinetics And Immune Response," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:4220-4224). U fokusu drugog pristupa nije samo obezbeđivanje humano-izvedenih konstantnih domena, već i modifikovanje varijabilnih domena kako bi se preoblikovali što je moguće bliže humanom obliku.

Poznato je da varijabilni domeni i teških i lakih lanaca sadrže tri regiona koji određuju komplementarnost (CDR) koji variraju u odgovoru na antigene u pitanju i određuju mogućnost vezivanja, flankirani sa četiri okvirna regiona (FR) koji su relativno očuvani u datim vrstama i koji navodno obezbeđuju savijanje za CDR-ove. Kada se nehumana antitela pripremaju u odnosu na poseban antigen, varijabilni domeni mogu se "preoblikovati" ili "humanizovati" kalemljenjem CDR-ova izvedenih iz nehumanog antitela na FR-ovima prisutnim u humanom antitelu koje se modifikuje. Primena ovog pristupa na različita antitela prijavljena je od strane Sato, K. et al. (1993) Cancer Res 53:851-856. Riechmann, L. et al. (1988) "Reshaping Human Antibodies for Therapy," Nature 332:323-327; Verhoeyen, M. et al. (1988) "Reshaping Human Antibodies: Grafting An Antilysozyme Activity," Science 239:1534-1536; Kettleborough, C. A. et al. (1991) "Humanization Of A Mouse Monoclonal Antibody By CDR-Grafting: The Importance Of Framework Residues On Loop Conformation," Protein Engineering 4:773-3783; Maeda, H. et al. (1991) "Construction Of Reshaped Human Antibodies With HIV-Neutralizing Activity," Human Antibodies Hybridoma 2:124-134; Gorman, S. D. et al. (1991) "Reshaping A Therapeutic CD4 Antibody," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:4181-4185; Tempest, P.R. et al. (1991) "Reshaping A Human Monoclonal Antibody To Inhibit Human Respiratory Syncytial Virus Infection in vivo," Bio/Technology 9:266-271; Co, M. S. et al. (1991) "Humanized Antibodies For Antiviral Therapy," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:2869-2873; Carter, P. et al. (1992) "Humanization Of An Antip185her2 Antibody For Human Cancer Therapy," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 89:4285-4289; and Co, M.S. et al. (1992) "Chimeric And Humanized Antibodies With Specificity For The CD33 Antigen," J.

Immunol.148:1149-1154. U nekim načinima ostvarivanja, humanizovana antitela očuvaju sve CDR sekvence (na primer, humanizovano mišje antitelo koje sadrži svih šest CDR-ova iz mišjih antitela). U drugim načinima ostvarivanja, humanizovana antitela imaju jedan ili više CDR-ova (jedan, dva, tri, četiri, pet, šest) koji su promenjeni u odnosu na originalno antitelo, koji se takođe nazivaju jedno ili više CDR-ova "izvedenih iz" jednog ili više CDR-ova iz originalnog antitela. Sposobnost da humanizuju antigen dobro je poznata (videti, npr., US Patente Br.5,225,539; 5,530,101; 5,585,089; 5,859,205; 6,407,213; 6,881,557).

[0050] Kao što je ovde korišćeno, kaže se da se antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment "specifično" vezuje za region drugog molekula (tj., epitop) ako reaguje ili vezuje češće, brže, sa većim trajanjem i/ili sa većim afinitetom ili avidnošću sa tim epitopom u odnosu na alternativne epitope. U jednom načinu ostvarivanja, antitelo, ovog pronalaska vezuje se najmanje 10-puta jače za svoju metu (humani alfa sinuklein) nego za drugi molekul; poželjno najmanje 50-puta jače i poželjnije najmanje 100-puta jače. Poželjno, antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, vezuje se pod fiziološkim uslovima, na primer, in vivo. Tako, antitelo koje može da se "specifično vezuje" za epitop unutar ostataka 112-117 (ILEDMP (SEQ ID NO:9)) humanog alfa-sinukleina obuhvata antitelo ili njegove antigen-vezujuće fragmente, to jest koji mogu da se vežu za epitop unutar ostataka 112-117 humanog alfa-sinukleina sa takvom specifičnošću i/ili pod takvim uslovima. Postupci pogodni za određivanje takvog vezivanja biće poznati stručnjacima u ovoj oblasti, a primeri postupaka opisani su u pratećim Primerima. Kao što je ovde korišćeno, pojam "vezivanje" u kontekstu vezivanja antitela za prethodno određen antigen obično se odnosi na vezivanje sa afinitetom koji odgovara KD od oko 10<-7>M ili manje, kao što je od oko 10<-8>M ili manje, kao što je od oko 10<-9>M ili manje kada se određuje pomoću, na primer, tehnologijom površinske plazmonske rezonancije (SPR) ili u BIAcore<®>3000 ili u T200instrument korišćenjem antigena kao liganda i antitela kao analita, i vezuje se za prethodno određen antigen sa afinitetom koji odgovara KD koji je najmanje deset puta niži, kao što je najmanje 100 puta niži, na primer najmanje 1000 puta niži, kao što je najmanje 10000 puta niži, na primer najmanje 100000 puta niži od njegovog afiniteta za vezivanje za nespecifični antigen (npr., BSA, kazein) koji se razlikuje od prethodno određenog antigena ili blisko srodnog antigena. Količina za koju je afinitet niži zavisi od KD antitela, tako da kada je KD antitela veoma nizak (to jest, antitelo je visoko specifično), onda količina za koju je afinitet za antigen niži od afiniteta za nespecifični antigen može biti najmanje 10000 puta.

[0051] Pojam "kd" (s -1 ili 1/s), kao što je ovde korišćeno, odnosi se na konstantu brzine disocijacije posebne antitelo-antigen interakcije. Pomenuta vrednost takođe se naziva koff vrednost.

[0052] Pojam "ka" (M-1 x s-1 ili 1/Ms), kao što je ovde korišćeno, odnosi se na konstantu brzine asocijacije posebne antitelo-antigen interakcije.

[0053] Pojam "KD" (M), kao što je ovde korišćeno, odnosi se na konstantu ravnoteže disocijacije posebne antitelo-antigen interakcije i dobija se deljenjem kd sa ka.

[0054] Pojam "KA" (M-1 ili 1/M), kao što je ovde korišćeno, odnosi se na konstantu ravnoteže asocijacije posebne antitelo-antigen interakcije i dobija se deljenjem ka sa kd.

[0055] U jednom aspektu antitelo ima jednu ili više od sledećih svojstava:

i. afinitet vezivanja (KD) za alfa-sinuklein između 0.5-10 nM, kao što je 1-5 nM ili 1-2 nM;

ii. sposobnost inhibicije skraćivanja alfa-sinukleinskih vlakana proteazom;

iii. sposobnosti preokretanja oštećenja bazalne sinaptičke transmisije kod F28-snca transgenih miševa;

iv. sposobnosti smanjenja nivoa alfa-sinukleina u mišjem hipokampusu kao što je izmereno pomoću in vivo mikrodijalize;

v. sposobnost, kada se hronično daje, da se obnovi motorička funkcija u pacovskom modelu Parkinsonove bolesti

vi. sposobnost da se spreči zasejavanje alfa-sinukleina (kao što je nakupljanje nerastvorljivog fosforilisanog alfa-sinukleina in vitro i/ili u mišjem modelu Parkinsonove bolesti); i/ili

vii. sposobnost da se veže skraćeni alfa-sinuklein u mozgu ljudi.

[0056] Afinitet vezivanja (KD) za alfa-sinuklein može da se odredi korišćenjem postupaka dobro poznatih u ovoj oblasti, npr. kao što je opisano u Primeru 2.

[0057] Pojam "sposobnost inhibicije skraćivanja alfa-sinukleinskih vlakana proteazom" uključuje sposobnost inhibicije obrazovanja fragmenta 1-119-122 humanog alfa sinukleina indukovanog kalpainom-1 u primarnim kortikalnim neuronima (videti Primer 5).

[0058] Pojam "sposobnosti preokretanja oštećenja bazalne sinaptičke transmisije kod F28-snca transgenih miševa" uključuje sposobnost da se preokrene oštećenje sinaptičke transmisije i plastičnost u CA1 regiji hipokampusa kod F28-snca transgenih miševa, na primer kao što je određeno sa evociranim fEPSP nagibom kao što je izmereno elektrofiziološki (Videti Primer 6).

[0059] Pojam "sposobnost smanjenja nivoa alfa-sinukleina u mišjem hipokampusu kao što je izmereno in vivo mikrodijalizom" uključuje sposobnost smanjenja nivoa humanog alfa sinukleina u hipokampusu budnih, slobodno pokretnih F28-snca transgenih miševa, kao što je izmereno korišćenjem in vivo mikrodijalize (videti Primer 7).

[0060] Pojam "sposobnost, kada se hronično daje, da se obnovi motorička funkcija u pacovskom modelu Parkinsonove bolesti" uključuje sposobnost da smanji ili otkloni motoričku asimetriju u pacovskom modelu rekombinantnog adeno-povezanog virusnog vektora (rAAV) Parkinsonove bolesti (videti Primer 8).

[0061] U nekim antitelima, samo deo CDR, naime podskup CDR ostataka potrebnih za vezivanje, nazivaju se SDR, treba da zadrži vezivanje kod humanizovanog antitela. CDR ostaci koji nisu u kontaktu sa relevantnim epitopom i nisu u SDR-ovima mogu se identifikovati na osnovu prethodnih studija (na primer ostaci H60-H65 u CDR H2 često nisu potrebni), iz regiona Kabat CDR-ova koji su van Chothia hipervarijabilne petlje (videti, Kabat et al. (1992) SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, National Institutes of Health Publication No.91-3242; Chothia, C. et al. (1987) "Canonical Structures For The Hypervariable domains Of Immunoglobulins," J. Mol. Biol.196:901-917), molekularnim modelovanjem i/ili empirijski, ili kao što je opisano u Gonzales, N.R. et al. (2004) "SDR Grafting Of A Murine Antibody Using Multiple Human Germline Templates To Minimize Its Immunogenicity," Mol. Immunol.41:863-872. Kod takvih humanizovanih antitela na položajima u kojima jedan ili više donorskih CDR ostataka nedostaje ili u kojima je ceo donorski CDR izostavljen, aminokiselina koja zauzima položaj može biti aminokiselina koja zauzima odgovarajući položaj (Kabat numerisanjem) u akceptorskoj sekvenci antitela. Broj tih supstitucija akceptora za donorske aminokiseline u CDR-ovima koje treba uključiti odražava ravnotežu konkurentskih razmatranja. Takve supstitucije su potencijalno korisne u smanjenju broja mišjih aminokiselina u humanizovanom antitelu i posledično smanjenju potencijalne imunogenosti. Međutim, supstitucije takođe mogu izazvati promene afiniteta, a značajna smanjenja afiniteta se poželjno izbegavaju. Položaji za supstituciju unutar CDR-ova i aminokiseline za supstituciju takođe se mogu empirijski odabrati.

[0062] Činjenica da promena jedne aminokiseline CDR ostatka može dovesti do gubitka funkcionalnog vezivanja (Rudikoff, S. etc. (1982) "Single Amino Acid Substitution Altering Antigen-Binding Specificity," Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 79(6):1979-1983) obezbeđuje sredstvo za sistematsko identifikovanje alternativnih funkcionalnih CDR sekvenci. U jednom poželjnom postupku za dobijanje tih varijanti CDR, polinukleotid koji kodira CDR se mutagenizuje (na primer putem slučajne mutageneze ili postupkom usmerenim na mesto (npr., amplifikacija posredovana lancem polimeraze sa prajmerima koji kodiraju mutirani lokus)) za proizvodnju CDR koji ima supstituisani aminokiselinski ostatak. Poređenjem identiteta relevantnog ostatka u originalnoj (funkcionalnoj) CDR sekvenci za identifikovanje supstituisane (nefunkcionalne) varijantne CDR sekvence, BLOSUM62.iij rezultat supstitucije za tu supstituciju može da se identifikuje. BLOSUM sistem obezbeđuje matricu aminokiselinskih supstitucija izvedenih analizom baze podataka sekvenci za pouzdana poravnanja (Eddy, S.R. (2004) "Where Did The BLOSUM62 Alignment Score Matrix Come From?," Nature Biotech.22(8):1035-1036; Henikoff, J.G. (1992) "Amino acid substitution matrices from protein blocks," Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 89:10915-10919; Karlin, S. et al. (1990) "Methods For Assessing The Statistical Significance Of Molecular Sequence Features By Using General Scoring Schemes," Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 87:2264-2268; Altschul, S.F. (1991) "Amino Acid Substitution Matrices From An Information Theoretic Perspective," J. Mol. Biol.219, 555-565. Trenutno, najnaprednija BLOSUM baza podataka je BLOSUM62 baza podataka (BLOSUM62.iij). Tabela 1 predstavlja BLOSUM62.iij rezultate supstitucije (što je veći rezultat, to je supstitucija konzervativnija i samim tim je veća verovatnoća da supstitucija neće uticati na funkciju). Ako se antigen-vezujući fragment koji obuhvata rezultujući CDR ne veže za alfa-sinuklein, na primer, onda je BLOSUM62.iij rezultat supstitucije se smatra nedovoljno konzervativnom, i nova kandidatna supstitucija se bira i proizvodi a koja ima veći rezultat supstitucije. Tako, na primer, ako je originalni ostatak bio glutamat (E), a nefunkcionalni zamenski ostatak bio histidin (H), onda će BLOSUM62.iij rezultat supstitucije biti 0, i poželjne su konzervativnije promene (kao što su u aspartat, asparagin, glutamin ili lizin).

[0063] Stoga, ovaj pronalazak predviđa upotrebu slučajne mutageneze za identifikaciju poboljšanih CDR-ova. U kontekstu ovog pronalaska, konzervativne supstitucije mogu se definisati pomoću supstitucija unutar klasa aminokiselina što je prikazano u jednoj ili više od sledeće tri tabele:

Klase aminokiselinskih ostataka za konzervativne supstitucije:

[0064]

Aromatični ostaci Phe (F), Tyr (Y) i Trp (W)

Alternativne klase supstitucija konzervativnih aminokiselinskih ostataka:

[0065]

Alternativne fizičke i funkcionalne klasifikacije aminokiselinskih ostataka:

[0066]

Hidrofobni ostaci A, C, F, G, H, I, L, M, R, T, V, W i Y Negativno naelektri D i E

Polarni ostaci C, D, E, H, K, N, Q, R Pozitivno naelektris H, K i R

Mali ostaci A, C, D, G, N, P, S, T

Veoma mali ostaci A, G i S

Ostaci uključeni u formiranje zavoja A, C, D, E, G, H, K, N, Q, R, S, P i T

Fleksibilni ostaci Q, T, K, S, G, P, D, E i R

[0067] Konzervativnije grupe supstitucija uključuju: valin-leucin-izoleucin, fenilalanin-tirozin, lizinarginin, alanin-valin i asparagin-glutamin.

[0068] Dodatne grupe aminokiselina mogu se takođe formulisati korišćenjem principa opisanih u, npr., Creighton (1984) Proteins: Structure and Molecular Properties (2d Ed.1993), W. H. Freeman and Company.

[0069] Tehnologija fagnog prikaza može alternativno da se koristi za povećanje (ili smanjenje) CDR afiniteta. Ova tehnologija, nazvana sazrevanje afiniteta, koristi mutagenezu ili "CDR hodanje" a ponovna selekcija koristi ciljni antigen ili njegov antigenski fragment koji vezuje antigen da bi se identifikovala antitela koja imaju CDR-ove koji se vezuju sa višim (ili nižim) afinitetom za antigen u poređenju sa početnim ili matičnim antitelom (Videti, npr. Glaser et al. (1992) J. Immunology 149:3903).

Mutagenizacija celih kodona umesto pojedinačnih nukleotida rezultira polu-randomizovanim repertoarom mutacija aminokiselina. Mogu se konstruisati biblioteke koje se sastoje od pula varijantnih klonova, od kojih se svaki razlikuje po jednoj promeni aminokiseline u jednom CDR-u i koje sadrže varijante koje predstavljaju svaku moguću supstituciju aminokiseline za svaki CDR ostatak. Mutanti sa povećanim (ili smanjenim) afinitetom vezivanja za antigen mogu se pregledati dolaskom u kontakt sa imobilisanim mutantima sa obeleženim antigenom. Bilo koji postupak skrininga poznat u tehnici može da se koristi za identifikaciju mutantnih antitela sa povećanim ili smanjenim afinitetom prema antigenu (npr., ELISA) (Videti Wu et al.1998, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 95:6037; Yelton et al., 1995, J.

Immunology 155:1994). Može da se koristi i CDR hodanje koje randomizuje laki lanac (videti, Schier et al., 1996, J. Mol. Bio.263:551).

[0070] Postupci za postizanje takvog sazrevanja afiniteta su opisani na primer u: Krause, J.C. et al. (2011) "An Insertion Mutation That Distorts Antibody Binding Site Architecture Enhances Function Of A Human Antibody," MBio.2(1) pii: e00345-10. doi: 10.1128/mBio.00345-10; Kuan, C.T. et al. (2010) "Affinity-Matured Anti-Glycoprotein NMB Recombinant Immunotoxins Targeting Malignant Gliomas And Melanomas," Int. J. Cancer 10.1002/ijc.25645; Hackel, B.J. et al. (2010) "Stability And CDR Composition Biases Enrich Binder Functionality Landscapes," J. Mol. Biol.401(1):84-96; Montgomery, D.L. et al. (2009) "Affinity Maturation And Characterization Of A Human Monoclonal Antibody Against HIV-1 gp41," MAbs 1(5):462-474; Gustchina, E. et al. (2009) "Affinity Maturation By Targeted Diversification Of The CDR-H2 Loop Of A Monoclonal Fab Derived From A Synthetic Naïve Human Antibody Library And Directed Against The Internal Trimeric Coiled-Coil Of Gp41 Yields A Set Of Fabs With Improved HIV-1 Neutralization Potency And Breadth," Virology 393(1):112-119; Finlay, W.J. et al. (2009) "Affinity Maturation Of A Humanized Rat Antibody For Anti-RAGE Therapy: Comprehensive Mutagenesis Reveals A High Level Of Mutational Plasticity Both Inside And Outside The Complementarity-Determining Regions," J. Mol. Biol.388(3):541-558; Bostrom, J. et al. (2009) "Improving Antibody Binding Affinity And Specificity For Therapeutic Development," Methods Mol. Biol.525:353-376; Steidl, S. et al. (2008) "In Vitro Affinity Maturation Of Human GM-CSF Antibodies By Targeted CDR-Diversification," Mol. Immunol.

46(1):135-144; i Barderas, R. et al. (2008) "Affinity Maturation Of Antibodies Assisted By In Silico Modeling," Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 105(26):9029-9034.

[0071] Tako, sekvenca CDR varijanti obuhvaćenih antitela ili njihovih fragmenata koji se vezuju za antigen može da se razlikuje od sekvence iz CDR matičnog antitela, GM37, GM37 var 1-3 ili 285, supstitucijama; na primer supstituisana 4 aminokiselinska ostatka, 3 aminokiselinska ostatka, 2 aminokiselinska ostatka ili 1 od aminokiselinskih ostataka. Osim toga, predviđeno je da se aminokiseline u CDR regionima mogu supstituisati konzervativnim supstitucijama, kako je definisano u prethodne 3 tabele.

[0072] Pojam "lečenje" ili "tretiranje" kao što je ovde korišćeno predstavlja ublažavanje, usporavanje, slabljenje ili preokretanje napretka ili težine bolesti ili poremećaja, ili ublažavanje, usporavanje, slabljenje ili preokretanje jednog ili više simptoma ili neželjenih efekata takve bolesti ili poremećaja. Za svrhe ovog pronalaska, "lečenje" ili "tretiranje" dalje predstavlja pristup za dobijanje korisnih ili željenih kliničkih rezultata, gde "korisni ili željeni klinički rezultati" uključuju, bez ograničenja, ublažavanje simptoma, smanjenje obima poremećaja ili bolesti, stabilizovanje (tj., nepogoršanje) stanja bolesti ili poremećaja, odlaganje ili usporavanje progresije stanja bolesti ili poremećaja, ublažavanje ili palijacija stanja bolesti ili poremećaja i remisiju bolesti ili poremećaja, delimičnu ili potpunu, detektabilnu ili nedetektabilnu.

[0073] "Efektivna količina," kada se primenjuje na antitelo ili njegove antigen-vezujuće fragmente, ovog pronalaska, odnosi se na količinu dovoljnu, u dozama i tokom neophodnih vremenskih perioda za postizanje željenog biološkog efekta ili željenog terapijskog rezultata koji uključuje, bez ograničenja, kliničke rezultate. Izraz "terapijska efektivna količina" kada se primenjuje za antitelo ili njegove antigenvezujuće fragmente, ovog pronalaska treba da označava neku količinu antitela, ili njegov antigenvezujući fragment, koja je dovoljna da se ublaži, palijativno ublaži, stabilizuje, preokrene, uspori, oslabi ili odloži progresija stanja poremećaja ili bolesti, ili simptoma poremećaja ili bolesti. U nekom načinu ostvarivanja, postupak ovog pronalaska obezbeđuje davanje antitela, ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, u kombinacijama sa drugim jedinjenjima. U takvim slučajevima, "efektivna količina" je količina kombinacije dovoljna da izazove željeni biološki efekat.

[0074] Terapijska efektivna količina anti-alfa-sinukleina ovog pronalaska može da varira u skladu sa faktorima kao što su stanje bolesti, starost, pol i masa pojedinca, i sposobnost antitela protiv alfasinukleina da izazove željeni odgovor kod pojedinca. Terapijska efektivna količina je takođe ona pri kojoj su svi toksični ili štetni efekti antitela ili dela antitela nadmašeni terapijski korisnim efektima.

[0075] Kao što je prethodno naznačeno, ovo otkrivanje se posebno odnosi na monoklonalno antitelo koje se može specifično vezati za neki epitop unutar aminokiselina 112-117 humanog alfa-sinukleina (SEQ ID NO:9 (ILEDMP)). U jednom načinu ostvarivanja antitelo može da se takmiči sa antitelom GM37 za vezivanje za neki epitop unutar 112-117 aminokiselina alfa-sinukleina.

[0076] Antitela ovog pronalaska, data putem primera, GM37 njegove varijante GM37 var 1-3 i GM285, i njihovi fragmenti koji vezuju alfa-sinuklein mogu da se vežu za toksični fragment alfa-sinukleina koji se sastoji od ostataka 1-119/122 alfa-sinukleina i neutrališu njegovu toksičnost (na primer, vanćelijskim vezivanjem za fragment alfa-sinukleina, a čime se sprečava njihov unos u ćelije. Neočekivano, antitela ovog pronalaska, koja mogu da se vezuju za neki epitop unutar aminokiselina 112-117 alfa-sinukleina su superiorna u odnosu na antitela iz stanja tehnike, kao što je antitelo 9E4, u vezivanju za toksične vrste alfa-sinukleina u mozgu ljudi, i imaju superiorne efekte na čišćenje vanćelijskog alfa-sinukleina i normalizaciju pogoršane sinaptičke transmisije indukovane alfa-sinukleinom in vivo. Antitela ovog pronalaska mogu takođe da ublaže pojavu relevantnog motoričkog fenotipa u pacovskom modelu za Parkinsonovu bolest.

[0077] Antitela su poželjno humana ili humanizovana antitela.

[0078] Ovo otkrivanje takođe obezbeđuje postupak za smanjenje obrazovanja agregata alfa-sinukleina kod pacijenta, koji obuhvata davanje pacijentu kojem je potrebno takvo lečenje, neke terapijski efektivne količine antitela ovog pronalaska.

[0079] Dalje, antitela mogu biti u kompoziciji zajedno sa farmaceutski prihvatljivim nosačem, razblaživač i/ili stabilizator. Antitela ovog pronalaska mogu da se koriste u terapiji. Posebno, antitela ovog pronalaska mogu da se koriste u lečenju sinukleinopatija kao što su Parkinsonova bolest (uključujući idiopatske nasledne oblike Parkinsonove bolesti), Gošeova bolest, difuzna bolest Levijevih tela (DLBD), varijanta Alchajmerove bolesti sa Levijevim telima (LBV), kombinovana Alchajmerova i Parkinsonova bolest, čisto autonomno zatajenje i višestruka sistemska atrofija.

[0080] Lečenje predviđeno ovim pronalaskom može biti hronično i pacijent može biti lečen najmanje 2 nedelje, kao što je najmanje tokom 1 meseca, 6, meseci, 1 godinu ili više.

[0081] Antitela ovog pronalaska mogu se proizvesti u različitim ćelijskim linijama, kao što je humana ćelijska linija, nehumana ćelijska linija sisara i ćelijska linija insekata, na primer CHO ćelijska linija, HEK ćelijska linija, BHK-21 ćelijska linija, mišja ćelijska linija (kao što je ćelijska linija mijeloma), ćelijska linija fibrosarkoma, PER.C6 ćelijska linija, HKB-11 ćelijska linija, CAP ćelijska linija i HuH-7 humana ćelijska linija (Dumont et al, 2015, Crit Rev Biotechnol. Sep 18:1-13., sadržaji koji su uključeni ovde referencom).

[0082] Antitela mogu, na primer, da budu monoklonalna antitela proizvedena postupkom hibridoma koji je prvo opisan od strane Kohler et al., Nature 256, 495 (1975), ili se mogu proizvesti postupcima rekombinantne DNK. Monoklonalna antitela mogu se izolovati i iz biblioteka fagnih antitela korišćenjem tehnika opisanih u, na primer, Clackson et al., Nature 352, 624-628 (1991) i Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581-597 (1991). Monoklonalna antitela mogu se dobiti iz bilo kog pogodnog izvora. Tako, na primer, monoklonalna antitela mogu se dobiti iz hibridoma pripremljenih iz B limfocitnih ćelija slezine miševa dobijenih od miševa imunizovanih antigenom od interesa, na primer, u obliku ćelija koje eksprimiraju antigen na površini, ili nukleinske kiseline koja kodira neki antigen od interesa.

Monoklonalna antitela mogu se takođe dobiti iz hibridoma izvedenih iz ćelija koje eksprimiraju antitela imunizovanih ljudi ili nehumanih sisara kao što su pacovi, zečevi, psi, ovce, koze, primati, itd.

[0083] Antitelo ovog pronalaska je humano antitelo. Humana monoklonalna antitela usmerena protiv alfa-sinukleina mogu da se generišu korišćenjem transgenih ili transhromozomalnih miševa koji nose delove humanog imunološkog sistema pre nego mišji sistem. Takvi transgeni i transhromozomalni miševi uključuju miševe koji se ovde nazivaju HuMAb miševi i KM miševi, tim redom.

[0084] HuMAb miš sadrži minilokus humanih gena imunoglobulina koji kodira neuređene human imunoglobulinske sekvence teškog varijabilnog i konstantnog (µ i Y) i lakog varijabilnog i konstantnog (κ) lanca, zajedno sa ciljanim mutacijama koje inaktiviraju endogene lokuse µ i κ lanaca (Lonberg, N. et al., Nature 368, 856-859 (1994)). Prema tome, miševi pokazuju smanjenu ekspresiju mišjeg IgM ili Igκ i kao odgovor na imunizaciju, uvedeni humani transgeni teškog i lakog lanca, prolaze kroz promenu klase i somatsku mutaciju da bi se generisala humana IgG, monoklonalna antitela visokog afiniteta (Lonberg, N. et al. (1994), supra; pregledano u Lonberg, N., Handbook of Experimental Pharmacology 113, 49-101 (1994), Lonberg, N. i Huszar, D., Intern. Rev. Immunol. Vol.1365-93 (1995) i Harding, F. i Lonberg, N., Ann. N. Y. Acad. Sci 764536-546 (1995)). Priprema HuMAb miševa je detaljno opisana u Taylor, L. et al., Nucleic Acids Research 20, 6287-6295 (1992), Chen, J. et al., International Immunology 5, 647-656 (1993), Tuaillon et al., J. Immunol.152, 2912-2920 (1994), Taylor, L. et al., International Immunology 6, 579-591 (1994), Fishwild, D. et al., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996). Videti, takođe, US 5,545,806, US 5,569,825, US 5,625,126, US 5,633,425, US 5,789,650, US 5,877,397, US 5,661,016, US 5,814,318, US 5,874,299, US 5,770,429, US 5,545,807, WO 98/24884, WO 94/25585, WO 93/1227, WO 92/22645, WO 92/03918 i WO 01/09187.

[0085] HCo7, HCo12, HCo17 i HCo20 miševi imaju JKD poremećaj u svojim endogenim genima (kapa) lakog lanca (kao što je opisano u Chen et al., EMBO J.12, 811-820 (1993)), CMD poremećaj u njihovim endogenim genima teškog lanca (kao što je opisano u Primeru 1 iz WO 01/14424), i KCo5 humanom transgenu kapa lakog lanca (kao što je opisano u Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996)). Pored toga, HCo7 miševi imaju HCo7 humani transgen teškog lanca (kao što je opisano u US 5,770,429), HCo12 miševi imaju HCo12 humani transgen teškog lanca (kao što je opisano u Primeru 2 iz WO 01/14424), HCo17 miševi imaju HCo17 humani transgen teškog lanca (kao što je opisano u Primeru 2 iz WO 01/09187) dok HCo20 miševi imaju HCo20 humani transgen teškog lanca. Rezultujući miševi eksprimiraju humane transgene teškog i kapa lakog lanca imunoglobulina u pozadini homozigota za poremećaj endogenih mišjih lokusa teškog i kapa lakog lanca.

[0086] Kod KM mišjeg soja, endogeni mišji gen kapa lakog lanca je homozigotno poremećen kao što je opisano u Chen et al., EMBO J.12, 811-820 (1993) dok je endogeni mišji gen teškog lanca homozigotno poremećen kao što je opisano u Primer 1 iz WO 01/09187. Ovaj mišji soj nosi humani transgen kapa lakog lanca, KCo5, kao što je opisano u Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996). Ovaj mišji soj nosi i humani transhromozom teškog lanca koji se sastoji od fragmenta hromozoma 14 hCF (SC20) kao što je opisano u WO 02/43478. HCo12-Balb/c, HCo17-Balb/c i HCo20-Balb/c miševi mogu se generisati ukrštanjem HCo12, HCo17 i HCo20 do KCo5[J/K](Balb) kao što je opisano u WO 09/097006.

[0087] Kod KM mišjeg soja, endogeni mišji gen kapa lakog lanca je homozigotno poremećen kao što je opisano u Chen et al., EMBO J.12, 811-820 (1993) dok je endogeni mišji gen teškog lanca je homozigotno poremećen kao što je opisano u Primeru 1 iz WO 01/09187. Ovaj mišji soj nosi humani transgen kapa lakog lanca, KCo5, kao što je opisano u Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996). Ovaj mišji soj nosi i humani transhromozom teškog lanca koji se sastoji od antigen-vezujućeg fragmenta hromozoma 14 hCF (SC20) kao što je opisano u WO 02/43478.

[0088] Splenociti iz ovih transgenih miševa mogu da se koriste za generisanje hibridoma koji izlučuje humana monoklonalna antitela prema dobro poznatim tehnikama. Humana monoklonalna antitela ovog pronalaska mogu da se generišu i transgeno kroz generacije drugih nehumanih sisara ili biljaka koji je transgeni za sekvence teškog i lakog lanca imunoglobulina od interesa i proizvodnja antitela u obliku koji se može obnoviti odatle. U vezi sa transgenom proizvodnjom kod sisara, antitela se mogu proizvesti u, i ponovo dobiti iz, mleka koza, krava ili drugih sisara. Videti na primer US 5,827,690, US 5,756,687, US 5,750,172 i US 5,741,957.

[0089] Antitelo ovog otkrivanja može biti bilo kog izotipa. Izbor izotipa obično će se sprovesti željenim efektorskim funkcijama, kao što je ADCC indukcija. Primeri izotipova su IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4. Može da se koristi svaki od humanih konstantnih domena lakog lanca, kapa ili lambda. Po potrebi, klasa antitela protiv alfa-sinukleina ovog pronalaska može se promeniti poznatim postupcima. Na primer, neko antitelo ovog pronalaska koje je izvorno bilo IgM može se promeniti u klasu IgG antitela ovog pronalaska. Dalje, tehnike promene klase mogu se koristiti za pretvaranje jedne IgG podklase u drugu, na primer iz IgGI u IgG2. Dakle, efektorska funkcija antitela ovog pronalaska može se promeniti promenom izotipa, npr., IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4 antitelo za različite terapijske koristi. Antitelo ovog pronalaska je IgG1 antitelo, na primer IgG1, . Za antitelo se kaže da je posebnog izotipa ako je njegova aminokiselinska sekvenca najhomolognija tom izotipu, u odnosu na ostale izotipove.

[0090] U jednom načinu ostvarivanja, antitelo ovog pronalaska je IgG1 antitelo pune dužine, posebno IgG1, antitelo.

[0091] Antitela i njegovi antigen-vezujući fragmenti mogu se npr. dobiti pomoću antigen-vezujuće fragmentacije korišćenjem konvencionalnih tehnika, i fragmenti koji se vezuju za antigen pregledaju se za korisnost na isti način kao što je opisano ovde za cela antitela. Na primer, F(ab')2 fragmenti koji se vezuju za antigen mogu se generisati tretiranjem antitela pepsinom. Dobijeni F(ab')2 antigen-vezujući fragment može da se tretira da bi se smanjili disulfidni mostovi kako bi se proizveli Fab' fragmenti koji se vezuju za antigen. Fab fragmenti koji se vezuju za antigen mogu se dobiti tretiranjem IgG antitela papainom; Fab' fragmenti koji se vezuju za antigen mogu se dobiti digestijom IgG antitela pepsinom. F(ab') antigen-vezujući fragment može se proizvesti i vezivanjem Fab'-opisanog u nastavku tioetarskom vezom ili disulfidnim mostom. Fab' antigen-vezujući fragment je fragment antitela koji se vezuje za antigen dobijen prekidanjem disulfidne veze zglobnog domena u F(ab')2. Fab'- antigen-vezujući fragment može se dobiti tretiranjem F(ab')2 antigen-vezujući fragmenta nekim redukcionim sredstvom, kao što je ditiotreitol. Antitelo antigen-vezujući fragment može se generisati i ekspresijom nukleinskih kiselina koje kodiraju te fragmente koji se vezuju za antigen u rekombinantnim ćelijama (videti na primer Evans et al., J. Immunol. Meth.184, 123-38 (1995)). Na primer, himerni gen koji kodira deo F(ab')2 antigen-vezujućeg fragmenta može da uključuje DNK sekvence koje kodiraju CH1 region i zglobni domen H lanca, nakon čega sledi translacioni stop kodon da bi se dobio takav skraćeni molekul fragmenta antitela koji se vezuje za antigen.

[0092] U jednom načinu ostvarivanja ovog otkrivanja, antitelo protiv alfa-sinukleina je monovalentno antitelo, poželjno monovalentno antitelo kao što je opisano u WO2007059782 sa delecijom zglobnog domena. Prema tome, u jednom načinu ostvarivanja, antitelo je monovalentno antitelo, pri čemu je pomenuto antitelo protiv alfa-sinukleina konstruisano postupkom koji obuhvata: i) obezbeđivanje konstrukta nukleinske kiseline koji kodira laki lanac pomenutog monovalentnog antitela, pri čemu pomenuti konstrukt obuhvata nukleotidnu sekvencu koja kodira VL region izabranog antitela protiv alfasinukleina specifičnog za antigen i nukleotidnu sekvencu koja kodira konstantni CL region iz Ig, pri čemu su pomenuta nukleotidna sekvenca koja kodira VL region izabranog antitela specifičnog za antigen i pomenuta nukleotidna sekvenca koja kodira CL region iz Ig radno međusobno povezane, i pri čemu, u slučaju IgG1 podvrste, nukleotidna sekvenca koja kodira CL region se modifikuje tako da CL region ne sadrži nikakve aminokiseline koje mogu da obrazuju disulfidne veze ili kovalentne veze sa drugim peptidima koji obuhvataju identičnu aminokiselinsku sekvencu iz CL regiona u prisustvu poliklonalnog humanog IgG ili kada se daje nekoj životinji ili čoveku; ii) obezbeđivanje konstrukta nukleinske kiseline koji kodira teški lanac pomenutog monovalentnog antitela, pri čemu pomenuti konstrukt obuhvata nukleotidnu sekvencu koja kodira VH region izabranog antitela specifičnog za antigen i nukleotidnu sekvencu koja kodira konstantni CH region iz humanog Ig, pri čemu je nukleotidna sekvenca koja kodira CH region modifikovana tako da region koji odgovara zglobnom domenu i, po potrebi za Ig podvrste, ostali regioni CH regiona, kao što je CH3 region, ne obuhvataju nikakve aminokiselinske ostatke koji učestvuju u obrazovanju disulfidnih veza ili kovalentnih ili stablnih nekovalentnih veza između teških lanaca sa drugim peptidima koji obuhvataju identičnu aminokiselinsku sekvencu CH regiona humanog Ig u prisustvu poliklonalnog humanog IgG ili kada se daje životinji čoveku, pri čemu su pomenuta nukleotidna sekvenca koja kodira VH region izabranog antitela specifičnog za antigen i pomenuta nukleotidna sekvenca koja kodira CH region iz pomenutog Ig radno međusobno povezane; iii) obezbeđivanje ćelijskog ekspresionog sistema za proizvodnju pomenutog monovalentnog antitela; iv) proizvodnja pomenutog monovalentnog antitela koje koeksprimira konstrukte nukleinske kiseline iz (i) i (ii) u ćelijama ćelijskog ekspresionog sistema iz (iii).

[0093] Slično tome, antitelo protiv alfa-sinukleina može biti monovalentno antitelo, koji obuhvata:

(i) varijabilni domen antitela ovog pronalaska kao što je opisano ovde ili antigen-vezujući deo pomenutog regiona, i

(ii) CH domen imunoglobulina ili njegov domen koji obuhvata CH2 i CH3 domene, pri čemu CH domen ili njegov domen je modifikovan tako da domen koji odgovara zglobni domen i, ako imunoglobulin nije IgG4 podvrsta, ostali domeni CH domena, kao što je CH3 domen, ne obuhvataju one aminokiselinske ostatke koji mogu da obrazuju disulfidne veze sa identičnim CH domenom ili druge kovalentne ili stabilne nekovalentne veze između teških lanaca sa identičnim CH domenom u prisustvu poliklonalnog humanog IgG.

[0094] Teški lanac monovalentnog antitela protiv alfa-sinukleina je modifikovan tako da je obrisan ceo zglobni domen.

[0095] Sekvenca pomenutog monovalentnog antitela je modifikovana tako da ne obuhvata nikakva akceptorska mesta za N-povezanu glikozilaciju.

[0096] Ovaj pronalazak takođe obuhvata "bispecifična antitela," pri čemu neki anti-alfa-sinuklein vezujući region (npr., alfa-sinuklein-vezujući region nekog monoklonalnog antitela protiv alfa-sinukleina) je deo dvovalentne ili polivalentne bispecifične rešetke koja cilja više od jednog epitopa, (na primer, drugi epitop može da obuhvata epitop receptora aktivnog transporta, tako da će bispecifično antitelo imati poboljšanu transcitozu kroz biološku barijeru, kao što je krvno-moždana barijera). Tako, u nekom drugom načinu ostvarivanja, monovalentno Fab anti-sinuklein antitela može se spojiti sa dodatnim Fab ili scfv koji cilja drugačiji protein za generisanje bispecifičnog antitela. Bispecifično antitelo može imati dvostruku funkciju, na primer, terapijska funkcija dodeljena od strane anti-sinuklein vezujućeg domena i funkcija transporta koja može da se veže za receptorski molekul da bi se poboljšao prenos kroz biološku barijeru, kao što je krvno-moždana barijera.

[0097] Antitela protiv alfa-sinukleina takođe uključuju jednolančana antitela. Jednolančana antitela su peptidi u kojima su povezani Fv regioni teškog i lakog lanca. Opisan ovde jednolančani Fv (scFv), pri čemu su teški i laki lanci u Fv antitela protiv alfa-sinukleina ovog pronalaska spojeni sa fleksibilnim peptidnim linkerom (obično od oko 10, 12, 15 ili više aminokiselinskih ostataka) u jednom peptidnom lancu. Postupci proizvodnje tih antitela opisani su na primer u US 4,946,778, Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol.113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp.269-315 (1994), Bird et al., Science 242, 423-426 (1988), Huston et al., PNAS USA 85, 5879-5883 (1988) and McCafferty et al., Nature 348, 552-554 (1990). Jednolančano antitelo može biti monovalentno, ako se koriste samo jedan VH i VL, dvovalentno, ako se koriste dva VH i VL, ili polivalentno, ako se koriste više od dva VH i VL.

[0098] Antitela protiv alfa-sinukleina i njegovi antigen-vezujući fragmenti opisani ovde mogu se modifikovati uključivanjem bilo kog pogodnog broja modifikovanih aminokiselina i/ili veza sa tim konjugovanim supstituentima. Pogodnost u ovom kontekstu je generalno određena pomoću sposobnosti da najmanje u značajnoj meri zadrži selektivnost alfa-sinukleina i/ili anti-alfa-sinuklein specifičnost povezana sa nederivatizovanim matičnim antitelom protiv alfa-sinukleina. Uključivanje jedne ili više modifikovanih aminokiselina može biti povoljno, na primer, u povećanju poluživota polipeptida u serumu, smanjenju polipeptidne antigenosti ili povećanje stabilnosti skladištenja polipeptida. Aminokiselina(e) je(su) modifikovana(e), na primer, kotranslaciono ili posttranslaciono tokom rekombinantne proizvodnje (npr., N-povezana glikozilacija na N-X-S/T motivima tokom ekspresije kod ćelija sisara) ili modifikovana(e) sintetičkim sredstvima. Neograničavajući primeri modifikovane aminokiseline uključuju glikozilovanu aminokiselinu, sulfatiranu aminokiselinu, prenilovanu (npr., farnezilovanu, geranilgeranilisanu) aminokiselina, acetilovanu aminokiselinu, aciliranu aminokiselinu, PEGilovanu aminokiselinu, biotinilovanu aminokiselinu, karboksilovanu aminokiselinu, fosforilisanu aminokiselinu, i slično. Literatura obiluje referencama adekvatnim za vođenje stručnjaka u modifikaciji aminokiselina. Primeri protokola nalaze se u Walker (1998) Protein Protocols On CD-Rom, Humana Press, Totowa, NJ. Modifikovana aminokiselina može, na primer, da se odabere od glikozilovane aminokiseline, PEGilovane aminokiseline, farnezilovane aminokiseline, acetilovane aminokiseline, biotinilovane aminokiseline, aminokiseline konjugovane sa lipidnim ostatkom, ili aminokiseline konjugovane sa nekim organskim derivatizujućim agensom.

[0099] Antitela protiv alfa-sinukleina mogu se takođe hemijski modifikovati kovalentnom konjugacijom sa nekim polimerom da bi se, na primer, povećao njihov poluživot u cirkulaciji. Primeri polimera, i postupaka za njihovo vezivanje sa peptidima, prikazani su, na primer, u US 4,766,106, US 4,179,337, US 4,495,285 i US 4,609,546. Dodatni ilustrativni polimeri uključuju polioksietilovane poliole i polietilen glikol (PEG) (npr., PEG sa molekulskom masom između oko 1000 i oko 40000, kao što je između oko 2000 i oko 20000, npr., oko 3000-12000 g/mol).

[0100] Antitela ovog pronalaska mogu se dalje koristiti u dijagnostičkom postupku ili kao ligand za dijagnostičko snimanje.

[0101] U jednom aspektu, obezbeđena su antitela protiv alfa-sinukleina koje obuhvata jednu ili više radioobeleženih aminokiselina. Radioobeleženo antitelo protiv alfa-sinukleina može da se koristi i za dijagnostičke i za terapijske svrhe (konjugacija sa radioobeleženim molekulima je druga moguća karakteristika). Neograničavajući primeri tih obeleživača uključuje, ali nisu ograničeni na bizmut (<213>Bi), ugljenik (<11>C,<13>C,<14>C), hrom (<51>Cr), kobalt (<57>Co,<60>Co), bakar (<64>Cu), disprozijum (<165>Dy), erbijum (<169>Er), fluor (<18>F), gadolinijum (<153>Gd,<159>Gd), galijum (<68>Ga,<67>Ga), germanijum (<68>Ge), zlato (<198>Au), holmijum (<166>Ho), vodonik (<3>H), indijum (<111>In,<112>In,<113>In,<115>In), jod (<121>I,<123>I,<125>I,<131>I), iridijum (<192>Ir), železo (<59>Fe), kripton (<81m>Kr), lantanijum (<140>La), lutelijum (<177>Lu), mangan (<54>Mn), molibden (<99>Mo), azot (<13>N,<15>N), kiseonik (<15>O), paladijum (<103>Pd), fosfor (<32>P), kalijum (<42>K), prazeodimijum (<142>Pr), prometijum (<149>Pm), renijum (<186>Re,<188>Re), rodijum (<105>Rh), rubidijum (<81>Rb,<82>Rb), rutenijum (<82>Ru,<97>Ru), samarijum (<153>Sm), skandijum (<47>Sc), selen (<75>Se), natrijum (<24>Na), stroncijum (<85>Sr,<89>Sr,<92>Sr), sumpor (<35>S), tehnecijum (<99>Tc), talijum (<201>Tl), kalaj (<113>Sn,<117>Sn), ksenon (<133>Xe), iterbijum (<169>Yb,<175>Yb,<177>Yb), itrijum (<90>Y) i cink (<65>Zn). Postupci za pripremu radioobeleženih aminokiselina i povezanih derivata peptida poznati su u ovoj oblasti (videti, na primer, Junghans et al., u Cancer Chemotherapy and Biotherapy 655-686 (2nd edition, Chafner and Longo, eds., Lippincott Raven (1996)) i US 4,681,581, US 4,735,210, US 5,101,827, US 5,102,990 (US RE35,500), US 5,648,471 i US 5,697,902. Na primer, radioizotop može da se konjuguje pomoću postupka sa hloraminom T (Lindegren, S. et al. (1998) "Chloramine-T In High-Specific-Activity Radioiodination Of Antibodies Using N-Succinimidyl-3-(Trimethylstannyl)Benzoate As An Intermediate," Nucl. Med. Biol.25(7):659-665; Kurth, M. et al. (1993) "Site-Specific Conjugation Of A Radioiodinated Phenethylamine Derivative To A Monoclonal Antibody Results In Increased Radioactivity Localization In Tumor," J. Med. Chem.36(9):1255-1261; Rea, D.W. et al. (1990) "Site-specifically radioiodinated antibody for targeting tumors," Cancer Res.50(3 Suppl):857s-861s).

[0102] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje antitela protiv alfa-sinukleina koja su detektabilno obeležena korišćenjem fluorescentnog obeleživača (kao što je helat retkih zemnih elemenata (npr., helat evropijuma)), obeleživač tipa fluoresceina (npr., fluorescein, fluorescein izotiocijanat, 5-karboksifluorescein, 6-karboksi fluorescein, dihlortriazinilamin fluorescein), obeleživač tipa rodamina (npr., ALEXA FLUOR<®>568 (Invitrogen), TAMRA<®>ili danzil hlorid), VIVOTAG 680 XL

FLUOROCHROME<™>(Perkin Elmer), fikoeritrin; umbeliferon, lisamin; cijanin; fikoeritrin, Teksas crveno, BODIPY FL-SE<®>(Invitrogen) ili neki njihov analog, od kojih su svi pogodni za optičku detekciju.

Hemiluminescentni obeleživači mogu da se koriste (npr., luminol, luciferaza, luciferin, i ekvorin). Takva dijagnoza i detekcija može se postići i spajanjem dijagnostičkog molekula ovog pronalaska sa detektabilnim supstancama koje uključuju, ali nisu ograničene na, različite enzime, enzimi koji uključuju, ali nisu ograničene na, peroksidazu rena, alkalnu fosfatazu, beta-galaktozidazu ili acetilholinesterazu ili sa kompleksima protetičkih grupa kao što su, ali nisu ograničeni na, streptavidin/biotin i avidin/biotin.

[0103] Hemiluminescentni obeleživači mogu da se koriste (npr., luminol, luciferaza, luciferin, i ekvorin). Takva dijagnoza i detekcija može se postići i spajanjem dijagnostičkog molekula ovog pronalaska sa detektabilnim supstancama koje uključuju, ali nisu ograničene na, različite enzime, enzime koji uključuju, ali nisu ograničene na, peroksidazu rena, alkalnu fosfatazu, beta-galaktozidazu ili acetilholinesterazu ili sa kompleksima protetičkih grupa kao što su, ali nisu ograničeni na, streptavidin/biotin i avidin/biotin.

Mogu se takođe koristiti paramagnetni obeleživači, a poželjno se detektuju korišćenjem pozitronske emisione tomografije (PET) ili kompjuterizovane tomografije sa jednom fotonskom emisijom (SPECT). Takvi paramagnetni obeleživači uključuju, ali nisu ograničeni na, jedinjenja koja sadrže paramagnetne jone aluminijuma (Al), barijuma (Ba), kalcijuma (Ca), cerijum (Ce), disprozijum (Dy), erbijum (Er), evropijum (Eu), gandolinijum (Gd), holmijum (Ho), iridijum (Ir), litijum (Li), magnezijum (Mg), mangan (Mn), molibden (M), neodimijum (Nd), osmijum (Os), kiseonik (O), paladijum (Pd), platina (Pt), rodijum (Rh), rutenijum (Ru), samarijum (Sm), natrijum (Na), stroncijum (Sr), terbijum (Tb), tulijum (Tm), kalaj (Sn), titanijum (Ti), volfram (W) i cirkonijum (Zi), a posebno, Co<+2>, CR<+2>, Cr<+3>, Cu<+2>, Fe<+2>, Fe<+3>, Ga<+3>, Mn<+3>, Ni<+2>, Ti<+3>, V<+3>i V<+4>, metale koji emituju pozitrone korišćenjem različitih pozitronskih emisionih tomografija i neradioaktivni paramagnetni metalni joni.

[0104] Tako, u jednom aspektu, antitelo protiv alfa-sinukleina ovog pronalaska može da bude obeleženo sa fluorescentnim obeleživačem, hemiluminescentnim obeleživačem, paramagnetnim obeleživačem, radioizotopskim obeleživačem ili enzimskim obeleživačem. Obeleženo antitelo može da se koristi u detekciji ili merenju prisustva ili količine pomenutog alfa-sinukleina u mozgu subjekta. Ovaj postupak može da obuhvata detekciju ili merenje in vivo snimanja antitela protiv alfa-sinukleina vezanog za pomenuti alfa-sinuklein i može da obuhvata ex vivo snimanje pomenutog antitela protiv alfa-sinukleina vezanog za pomenuti alfa-sinuklein.

[0105] U daljem aspektu, ovo otkrivanje odnosi se na ekspresiju vektora koji kodira jedan ili više polipeptidnih lanaca antitela ovog pronalaska ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta. Takvi ekspresioni vektori mogu da se koriste za rekombinantnu proizvodnju antitela i fragmenata koji se vezuju za antigen ovog pronalaska.

[0106] Ekspresioni vektor može biti pogodan DNK ili RNK vektor, koji uključuje hromozomalne, nehromozomalne i sintetičke vektore nukleinskih kiselina (sekvenca nukleinske kiseline koja obuhvata pogodan skup kontrolnih elemenata ekspresije). Primeri tih vektora uključuju derivate SV40, bakterijske plazmide, fagnu DNK, bakulovirus, plazmide kvasca, vektore izvedene kombinacijama plazmida i fagne DNK, i virusne vektore nukleinskih kiselina (RNK ili DNK). U jednom načinu ostvarivanja, nukleinska kiselina koja kodira antitelo protiv alfa-sinukleina sadržana je u golom DNK ili RNK vektoru, uključujući, na primer, element linearne ekspresije (kao što je opisano, na primer, u Sykes and Johnston, Nat Biotech 12, 355-59 (1997)), vektor kompaktnih nukleinskih kiselina (kao što je opisano, na primer, u US 6,077,835 i/ili WO 00/70087), plazmidni vektor kao što je pBR322, pUC 19/18 ili pUC 118/119, vektor nukleinskih kiselina minimalne veličine "mušice" (kao što je opisano, na primer, u Schakowski et al., Mol Ther 3, 793-800 (2001)), ili kao istaloženi konstrukt vektora nukleinskih kiselina, kao što je CaPO4-istaloženi konstrukt (kao što je opisano, na primer, u WO 00/46147, Benvenisty and Reshef, PNAS USA 83, 9551-55 (1986), Wigler et al., Cell 14, 725 (1978), i Coraro and Pearson, Somatic Cell Genetics 2, 603 (1981)). Takvi vektori nukleinskih kiselina i njihova upotreba dobro su poznati u ovoj oblasti (videti na primer US 5,589,466 i US 5,973,972).

[0107] Vektor može da bude pogodan za ekspresiju antitela protiv alfa-sinukleina ili njegove antigenvezujuće fragmente u bakterijskoj ćeliji. Primeri tih vektora uključuju ekspresione vektore kao što su BlueScript (Stratagene), pIN vektori (Van Heeke & Schuster, J Biol Chem 264, 5503-5509 (1989), pET vektori (Novagen, Madison, WI) i slično).

[0108] Ekspresioni vektor može, takođe ili alternativno, da bude vektor pogodan za ekspresiju u sistemu kvasca. Može da se koristi bilo koji vektor pogodan za ekspresiju u sistemu kvasca. Pogodni vektori uključuju, na primer, vektore koji obuhvataju konstitutivne ili inducibilne promotere kao što su alfa faktor, alkohol oksidaza i PGH (pregledano u: F. Ausubel et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley InterScience New York (1987), Grant et al., Methods in Enzymol 153, 516-544 (1987), Mattanovich, D. et al. Methods Mol. Biol.824, 329-358 (2012), Celik, E. et al. Biotechnol. Adv.30(5), 1108-1118 (2012), Li, P. et al. Appl. Biochem. Biotechnol.142(2), 105-124 (2007), Böer, E. et al. Appl. Microbiol. Biotechnol.77(3), 513-523 (2007), van der Vaart, J.M. Methods Mol. Biol.178, 359-366 (2002), i Holliger, P. Methods Mol. Biol.178, 349-357 (2002)).

[0109] U ekspresionom vektoru, nukleinske kiseline koje kodiraju antitelo protiv alfa-sinukleina mogu da obuhvataju ili da budu povezane sa bilo kojim pogodnim promoterom, pojačivačem i drugim elementima koji olakšavaju ekspresiju. Primeri tih elemenata uključuju snažne promotere ekspresije (npr., humani CMV IE promoter/pojačivač kao i RSV, SV40, SL3-3, MMTV i HIV LTR promotere), efektivne poli (A) terminacione sekvence, mesto porekla replikacije za plazmidni proizvod u E. coli, gen otpornosti na antibiotike kao selektivni marker i/ili pogodno mesto za kloniranje (npr., polilinker). Nukleinske kiseline mogu takođe da obuhvataju inducibilni promoter za razliku od konstitutivnog promotora kao što je CMV IE (stručnjak će prepoznati da su ti pojmovi zapravo deskriptori stepena ekspresije gena pod određenim uslovima).

[0110] Antitela ovog pronalaska mogu se proizvesti u različitim ćelijskim linijama, kao što su humana ćelijska linija, nehumana ćelijska linija sisara i ćelijska linija insekata, na primer CHO ćelijska linija, HEK ćelijska linija, BHK-21 ćelijska linija, mišja ćelijska linija (kao što je ćelijska linija mijeloma), ćelijska linija fibrosarkoma, PER.C6 ćelijska linija, HKB-11 ćelijska linija, CAP ćelijska linija i HuH-7 humana ćelijska linija (Dumont et al, 2015, Crit Rev Biotechnol. Sep 18:1-13., sadržaji koji su uključeni ovde referencom).

[0111] U nekom još daljem aspektu, ovo otkrivanje odnosi se na rekombinantnu eukariotsku ili prokariotsku ćeliju domaćina, kao što je transfektoma, koja proizvodi neko antitelo ili njegov antigenvezujući domen ovog pronalaska kako je ovde definisano ili bispecifični molekul ovog pronalaska kako je ovde definisan. Primeri ćelija domaćina uključuju kvasac, bakterije i ćelije sisara, kao što su CHO ili HEK ćelije. Na primer, ovo otkrivanje obezbeđuje ćeliju koja obuhvata nukleinsku kiselinu stabilno integrisanu u ćelijski genom koja obuhvata sekvencu koja kodira ekspresiju nekog antitela protiv alfa-sinukleina ovog pronalaska. U nekom drugom načinu ostvarivanja, ovo otkrivanje obezbeđuje ćeliju koja obuhvata neintegrisanu nukleinsku kiselinu, kao što je plazmid, kozmid, fagmid ili element linearne ekspresije, koja obuhvata sekvencu koja kodira ekspresiju antitela protiv alfa-sinukleina ovog pronalaska.

[0112] U nekom daljem aspektu, ovo otkrivanje odnosi se na postupak za proizvodnju antitela protiv alfa-sinukleina ovog pronalaska, pri čemu pomenuti postupak obuhvata faze a) kultivisanje hibridoma ili ćelije domaćina ovog pronalaska kao što je opisano ovde, i b) prečišćavanje antitela ovog pronalaska iz podloge za kultivisanje.

[0113] Neki drugi aspekt ovo otkrivanje odnosi se na preparat koji, kao što se taj pojam ovde koristi, obuhvata antitelo protiv alfa-sinukleina kao što je ovde definisano, i koji je suštinski bez prirodno nastalih antitela koji ili ne mogu da se vežu za alfa-sinuklein ili koji značajno ne menjaju funkcionalnost preparata protiv alfa-sinukleina. Tako, takav preparat ne obuhvata prirodno nastali serum, ili prečišćeni derivat takvog seruma, koji obuhvata mešavinu antitela protiv alfa-sinukleina i nekog drugog antitela koji ne menja funkcionalnost preparata antitela protiv alfa-sinukleina; pri čemu je ta funkcionalnost izabrana iz grupe koju čine:

(i) afinitet vezivanja (KD) antitela protiv alfa-sinukleina za alfa-sinuklein;

(ii) sposobnost antitela protiv alfa-sinukleina da inhibira skraćivanje alfa-sinukleinskih vlakana proteazom;

(iii) sposobnost antitela protiv alfa-sinukleina da preokrene oštećenje u bazalnoj sinaptičkoj transmisiji kod F28-snca transgenih miševa;

(iv) sposobnost antitela protiv alfa-sinukleina da smanji nivoe alfa-sinukleina u mišjem hipokampusu kao što je izmereno in vivo mikrodijalizom; i

(v) sposobnost antitela protiv alfa-sinukleina da obnovi motoričku funkciju u pacovskom modelu Parkinsonove bolesti, kada se hronično daje.

(vi) sposobnost da spreči zasejavanje alfa-sinukleina (kao što je nakupljanje nerastvorljivog fosforilisanog alfa-sinukleina in vitro i/ili u mišjem modelu Parkinsonove bolesti); i/ili

(vii) sposobnost da se veže za skraćen alfa-sinuklein u mozgu ljudi.

[0114] Ovo otkrivanje posebno se odnosi se na preparate takvog antitela protiv alfa-sinukleina koji ima strukturnu promenu u svojoj aminokiselinskoj sekvenci (u bilo kojoj iz njegovih CDR-ova, varijabilni domeni, ostaci okvira i/ili konstantni domeni) u odnosu na strukturu antitela protiv alfa-sinukleina koji se prirodno javlja, pri čemu pomenuta strukturna promena dovodi do toga da monoklonalno antitelo protiv alfa-sinukleina pokazuje primetno izmenjenu funkcionalnost (tj., više od 20% razlike, više od 40% razlike, više od 60% razlike, više od 80% razlike, više od 100% razlike, više od 150% razlike, više od 2-puta razlike, više od 4-puta razlike, više od 5-puta razlike ili više od 10-puta razlike u funkcionalnosti) u odnosu na funkcionalnost koju ima pomenuto antitelo protiv alfa-sinukleina koje se prirodno javlja; pri čemu je takva funkcionalnost:

(i) afinitet vezivanja (KD) monoklonalnog antitela protiv alfa-sinukleina za alfa-sinuklein;

(ii) sposobnost monoklonalnog antitela protiv alfa-sinukleina da inhibira skraćivanje alfasinukleinskih vlakana proteazom;

(iii) sposobnost monoklonalnog antitela protiv alfa-sinukleina da preokrene oštećenje u bazalnoj sinaptičkoj transmisiji kod F28-snca transgenih miševa;

(iv) sposobnost monoklonalnog antitela protiv alfa-sinukleina da smanji nivoe alfa-sinukleina u mišjem hipokampusu kao što je izmereno in vivo mikrodijalizom; i/ili

(v) sposobnost monoklonalnog antitela protiv alfa-sinukleina da obnovi motoričku funkciju u pacovskom modelu Parkinsonove bolesti, kada se hronično daje;

(vi) sposobnost da spreči zasejavanje alfa-sinukleina (kao što je nakupljanje nerastvorljivog fosforilisanog alfa-sinukleina in vitro i/ili u mišjem modelu Parkinsonove bolesti); i/ili

(vii) sposobnost da se veže za skraćeni alfa-sinuklein u mozgu ljudi.

posebno gde je takva izmenjena funkcionalnost rezultat strukturne promene i stoga se ne može odvojiti od nje.

[0115] Pojam "suštinski bez" prirodno nastalih antitela odnosi se na potpuno odsustvo tih prirodno nastalih antitela u tim preparatima, ili uključivanja koncentracije tih prirodno nastalih antitela u tim preparatima koji značajno ne utiče na svojstva vezivanja preparata za alfa-sinuklein. Za antitelo kaže se da je "izolovano" ako nema prirodno nastali ekvivalent ili je odvojen ili prečišćen od komponenata koje ga prirodno prate.

[0116] Pojam "prirodno nastala antitela," kada se odnosi se na takve preparate, odnosi se na antitela (uključujući prirodno nastala autoantitela) izazvana u živim ljudima ili drugim životinjama, kao prirodna posledica funkcionisanja njihovih imunoloških sistema.

[0117] Tako, preparati ne isključuju, i zaista eksplicitno obuhvataju, takve preparate koji sadrže antitelo protiv alfa-sinukleina i namerno dodato dodatno antitelo koje može da se veže za epitop koji alfasinuklein ne poseduje. Takvi preparati posebno uključuju njihove realizacije gde preparat ima povećanu efikasnost u lečenju sinukleinopatija kao što su Parkinsonova bolest (uključujući idiopatski i nasledni oblik Parkinsonove bolesti), Gošeova bolest, difuzna bolest Levijevih tela (DLBD), varijanta Alchajmerove bolesti sa Levijevim telima (LBV), kombinovana Alchajmerova i Parkinsonova bolest, čisto autonomno zatajenje i višestruka sistemska atrofija.

[0118] U još nekom daljem aspektu, ovo otkrivanje odnosi se na farmaceutsku kompoziciju koja obuhvata:

(i) antitelo protiv alfa-sinukleina ili njegov antigen-vezujući fragment, kako su oba definisana ili preparat, kako je takav pojam ovde definisan, koji obuhvata takvo antitelo protiv alfa-sinukleina ili njegov antigen-vezujući fragment, i

(ii) neki farmaceutski prihvatljivi nosač.

[0119] Farmaceutske kompozicije mogu se formulisati sa farmaceutski prihvatljiv nosačima ili razblaživačima kao i sa bilo kojim drugim adjuvansima i ekscipijensima u skladu sa uobičajenim tehnikama kao što su one opisane u Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22nd Edition, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 2013.

[0120] Farmaceutski prihvatljivi nosači ili razblaživači kao i bilo koji drugi poznati adjuvansi i ekscipijensi treba da su pogodni za izabrano jedinjenje ovog pronalaska i izabrani način davanja. Pogodnost za nosače i druge komponente farmaceutskih kompozicija određena je na osnovu nedostatka značajnog negativnog uticaja na željena biološka svojstva izabranog jedinjenja ili farmaceutske kompozicije (npr., manje od značajnog uticaja (10% ili manje relativne inhibicije, 5% ili manje relativne inhibicije, itd.)) na vezivanje epitopa.

[0121] Farmaceutska kompozicija može da uključuje i razblaživače, punila, soli, pufere, deterdžente (npr., nejonski deterdžent, kao što je Tween-20 ili Tween- 80), stabilizatore (npr., šećeri ili aminokiseline bez proteina), konzervanse, fiksative za tkivo, rastvarače i/ili druge materijale pogodne za uključivanje u farmaceutsku kompoziciju. Razblaživač se odabira tako da ne utiče na biološku aktivnost kombinacije. Primeri tih razblaživača su destilovana voda, fiziološki fosfatno puferovani rastvor soli, Ringerovi rastvori, rastvor dekstroze i Hankov rastvor. Pored toga, farmaceutska kompozicija ili formulacija može da uključuje i druge nosače, ili notoksične, neterapijske, neimunogene stabilizatore i slično. Kompozicije mogu da uključuju i velike makromolekule koji sporo metabolišu, kao što su proteini, polisaharidi poput hitozana, polimlečne kiseline, poliglikolne kiseline i kopolimeri (npr., lateks funkcionalizovana sefaroza, agaroza, celuloza i slično), polimerne aminokiseline, kopolimere aminokiselina i lipidni agregati (npr., kapljice ulja ili lipozomi).

[0122] Stvarni nivoi doziranja aktivnih sastojaka u farmaceutskim kompozicijama mogu se menjati tako da se dobije količina aktivnog sastojka koja je efikasna za postizanje željenog terapijskog odgovora za određenog pacijenta, kompoziciju i način davanja. Izabrani nivo doziranja zavisi od različitih farmakokinetičkih faktora, uključujući aktivnost određenih kompozicija koje se koriste ili njihovog amida, način davanja, vreme davanja, brzinu izlučivanja određenog jedinjenja koje se koristi, trajanje lečenja, druge lekove, jedinjenja i/ili materijale koji se koriste u kombinaciji sa određenim kompozicijama koje se koriste, starost, pol, težinu, stanje, opšte zdravstveno stanje i prethodnu medicinsku istoriju pacijenta koji se leči, i slične faktore dobro poznate u medicinskoj struci.

[0123] Farmaceutska kompozicija može da se daje bilo kojim pogodnim putem ili načinom, uključujući: parenteralna, topikalna, oralna ili intranazalna sredstva za profilaktičko i/ili terapijsko lečenje.

Farmaceutska kompozicija može da se daje parenteralno. Izraz "parenteralno davanje" i "davanje parenteralno", kao što se ovde koriste, predstavljaju načine davanja osim enteralne i lokalne primene, obično injekcijom, i uključuju epidermalnu, intravensku, intramuskularnu, intraarterijalnu, intratekalnu, intrakapsularnu, intraorbitalnu, intrakardijalnu, intradermalnu, intraperitonealnu, intratetivnu, transtrahealnu, subkutanu, subkutikularnu, intraartikularnu, subkapsularnu, subarahnoidnu, intraspinalnu, intrakranijalnu, intratorakalnu, epiduralnu i intrasternalnu injekciju i infuziju. Dodatni načini davanja nekog jedinjenja ovog pronalaska in vivo i in vitro dobro su poznati u tehnici i mogu se odabrati od strane prosečnog stručnjaka u ovoj oblasti. Farmaceutska kompozicija može da se daje intravenskom ili subkutanom injekcijom ili infuzijom.

[0124] Farmaceutski prihvatljivi nosači uključuju bilo koji i sve pogodne rastvarače, disperzione podloge, premaze, antibakterijska i antifungalna sredstva, sredstva za izotoničnost, antioksidanse i sredstva za odlaganje apsorpcije i slično, koja su fiziološki kompatibilna sa jedinjenjem ovog pronalaska.

[0125] Primeri pogodnih vodenih i nevodenih nosača koji mogu da se koriste u farmaceutskim kompozicijama uključuju vodu, rastvor soli, fosfatno puferisan rastvor soli, etanol, dekstrozu, poliole (kao što je glicerol, propilen glikol, polietilen glikol, i slično), i njihove pogodne mešavine, biljna ulja, kao što su maslinovo ulje, kukuruzno ulje, ulje od kikirikija, ulje od pamučnog semena i susamovo ulje, karboksimetil koloidne rastvore celuloze, tragakant gumu i injekcione organske estre, kao što su etil oleat i/ili razne pufer. Ostali nosači dobro su poznati u farmaceutskoj oblasti.

[0126] Farmaceutski prihvatljivi nosači uključuju sterilne vodene rastvore ili disperzije i sterilne praškove za ekstemporni preparat sterilnih rastvora ili disperzija za injekcije. Upotreba takvih podloga i agenasa za farmaceutski aktivne supstance poznata je u tehnici. Osim ako je bilo koji konvencionalni medijum ili sredstvo nekompatibilno sa aktivnim jedinjenjem, razmatra se njihova upotreba u farmaceutskim kompozicijama.

[0127] Odgovarajuća fluidnost može se održati, na primer, upotrebom materijala za premaze, kao što je lecitin, održavanjem potrebne veličine čestica u slučaju disperzija i upotrebom surfaktanata.

[0128] Farmaceutske kompozicije mogu da obuhvataju i farmaceutski prihvatljive antioksidanse na primer (1) antioksidansi rastvorljivi u vodi, kao što su askorbinska kiselina, cistein hidrohlorid, natrijum bisulfat, natrijum metabisulfit, natrijum sulfit i slično; (2) antioksidansi rastvorljivi u ulju, kao što su askorbil palmitat, butilovani hidroksianizol (BHA), butilovani hidroksitoluen (BHT), lecitin, propil galat, alfa-tokoferol, i slično; i (3) helirajući agensi metala, kao što je limunska kiselina, etilendiamin tetrasirćetna kiselina (EDTA), sorbitol, vinska kiselina, fosforna kiselina, i slično.

[0129] Farmaceutske kompozicije mogu da obuhvataju i sredstva za izotoničnost, kao što su šećeri, polialkoholi, kao što je manitol, sorbitol, glicerol ili natrijum hlorid u kompozicijama.

[0130] Farmaceutske kompozicije mogu da sadrže i jedan ili više adjuvanasa pogodna za odabrani način davanja kao što su konzervansi, agensi za vlaženje, emulgatori, sredstva za dispergovanje, konzervansi ili puferi, koji mogu da poboljšaju rok trajanja ili efikasnost farmaceutske kompozicije. Jedinjenja ovog pronalaska može se pripremiti sa nosačima koji će zaštiti jedinjenje protiv brzog oslobađanja, kao što je formulacija sa kontrolisanim oslobađanjem, uključujući implante, transdermalne flastere i mikroenkapsulirane sisteme za isporuku. Takvi nosači mogu da uključuju želatin, gliceril monostearat, gliceril distearat, biorazgradive, biokompatibilne polimere kao što je etilen vinil acetat, polianhidride, poliglikolnu kiselinu, kolagen, poliortoestre i polimlečnu kiselinu samu ili sa voskom, ili druge materijale dobro poznate u ovoj oblasti. Postupci za pripremu takvih formulacija opšte su poznati stručnjacima u ovoj oblasti. Videti, npr., Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.

[0131] U jednom aspektu, jedinjenja ovog pronalaska mogu da se formulišu da bi se obezbedila pravilna distribucija in vivo. Farmaceutski prihvatljivi nosači za parenteralno davanje uključuju sterilne vodene rastvore ili disperzije i sterilne praškove za ekstemporni preparat sterilnih rastvora za injekcije ili disperzije. Upotreba takvih sredstava i agenasa za farmaceutski aktivne supstance poznata je u tehnici. Osim ukoliko je bilo koji konvencionalni medijum ili sredstvo nekompatibilno sa aktivnim jedinjenjem, razmatra se njihova upotreba u farmaceutskim kompozicijama. Dodatna aktivna jedinjenja takođe mogu biti uključena u kompozicije.

[0132] Farmaceutske kompozicije za injekciju moraju obično da budu sterilne i stabilne u uslovima proizvodnje i skladištenja. Kompozicija se može formulisati kao rastvor, mikroemulzija, lipozom ili neka druga uređena struktura pogodna za visoku koncentraciju leka. Nosač može biti vodeni ili nevodeni rastvarač ili disperziono sredstvo koje sadrži, na primer, vodu, etanol, poliole (kao što su glicerol, propilen glikol, polietilen glikol, i slično), i njihove pogodne mešavine, biljna ulja, kao što je maslinovo ulje i injekcione organske estre, kao što su etil oleat. Odgovarajuća fluidnost može da se održi, na primer, upotreba premaza kao što je lecitin, održavanjem potrebne veličine čestica u slučaju disperzije i upotrebom surfaktanta. U mnogim slučajevim, poželjno je da budu uključeni izotonični agensi, na primer, šećeri, polialkoholi kao što su glicerol, manitol, sorbitol ili natrijum hlorid u kompoziciji.

Produžena apsorpcija injekcionih kompozicija može se postići uključivanjem u kompoziciju sredstva koje odlaže apsorpciju antitela, na primer, monostearatnih soli i želatina. Sterilni injekcioni rastvori mogu da se pripreme uključivanjem aktivnog jedinjenja u potrebnoj količini u odgovarajući rastvarač sa jednim sastojkom ili sa kombinacijom sastojaka npr. kako je navedeno gore, po potrebi, praćeno mikrofiltracijom sa sterilizacijom. Uopšteno, disperzije se pripremaju uključivanjem aktivnog jedinjenja u sterilni vehikulum koji sadrži osnovno disperziono sredstvo i potrebne druge sastojke npr. od onih prethodno navedenih. U slučaju sterilnih praškova za preparat sterilnih injekcionih rastvora, primeri postupaka preparata su sušenje u vakuumu i sušenje zamrzavanjem (liofilizacija) koje daje prašak aktivnog sastojka plus bilo koji dodatni željeni sastojak iz njegovog prethodno sterilno-filtriranog rastvora.

[0133] Sterilni injekcioni rastvori mogu se pripremiti uključenjem aktivnog jedinjenja u potrebnoj količini u odgovarajući rastvarač sa jednim od sastojaka ili nekom kombinacijom sastojaka prethodno navedenih, po potrebi, praćeno mikrofiltracijom sa sterilizacijom. Uopšteno, disperzije se pripremaju uključivanjem aktivnog jedinjenja u sterilni vehikulum koji sadrži osnovno sredstvo za raspršivanje i potrebne druge sastojke od onih prethodno navedenih. U slučaju sterilnih praškova za preparat sterilnih injekcionih rastvora, primeri postupaka preparata su sušenje u vakuumu i sušenje zamrzavanjem (liofilizacija) koji daju prah aktivnog sastojka plus bilo koji dodatni željeni sastojak iz njegovog prethodno sterilno filtriranog rastvora.

[0134] Režimi doziranja u gornjim postupcima lečenja i upotrebe opisane ovde podešene su da bi se obezbedio optimalni željeni odgovor (npr., terapijski odgovor). Na primer, pojedinačan bolus može da se daje, nekoliko podeljenih doza može da se daje tokom nekog vremena ili doza može proporcionalno da se smanji ili poveća kako je naznačeno zahtevima terapijske situacije. Parenteralne kompozicije mogu se formulisati u jediničnom doznom obliku radi olakšanog davanja i ujednačenosti doziranja. Jedinični dozni oblik, kako je ovde korišćen, odnosi se na fizički diskretne jedinice pogodne kao jedinstvene doze za subjekte koji se leče; pri čemu svaka jedinica sadrži prethodno određeni kvantitet aktivnog jedinjenja izračunat za proizvodnju željenog terapijskog efekata u vezi sa potrebnim farmaceutskim nosačem. Specifikacije za jedinične dozne oblike ovog pronalaska diktirane su i direktno zavise od (a) jedinstvenih karakteristika aktivnog jedinjenja i posebnog terapijskog efekta koji treba da se postigne, i (b) ograničenja svojstvena tehnici pripreme takvog aktivnog jedinjenja za lečenje osetljivosti kod pojedinaca.

[0135] Efektivne doze i dozni režimi za antitela protiv alfa-sinukleina zavise od bolesti ili stanja koje se leči i može ih odrediti stručnjak u ovoj oblasti. Bilo kog dana kada se daje doza, doza može biti u opsegu od oko 0.0001 do oko 100 mg/kg, a češće od oko 0.01 do oko 5 mg/kg, telesne mase domaćina. Na primer, doze mogu biti 1 mg/kg telesne mase ili 10 mg/kg telesne mase ili unutar opsega od 1-10 mg/kg telesne mase. Primeri doza stoga uključuju: od oko 0.1 do oko 10 mg/kg/telesne mase, od oko 0.1 do oko 5 mg/kg/telesne mase, od oko 0.1 do oko 2 mg/kg/telesne mase, od oko 0.1 do oko 1 mg/kg/telesne mase, na primer oko 0.15 mg/kg/telesne mase, oko 0.2 mg/kg/telesne mase, oko 0.5 mg/kg/telesne mase, oko 1 mg/kg/telesne mase, oko 1.5 mg/kg/telesne mase, oko 2 mg/kg/telesne mase, oko 5 mg/kg/telesne mase ili oko 10 mg/kg/telesne mase.

[0136] Lekar koji je stručan u ovoj oblasti može lako odrediti i propisati efikasnu količinu potrebne farmaceutske kompozicije. Na primer, lekar bi mogao da započne sa dozama antitela protiv alfasinukleina koje se koristi u farmaceutskoj kompoziciji na nivoima nižim od onih potrebnih da bi se postigao željeni terapijski efekat i postepeno povećava dozu dok se ne postigne željeni efekat.

Generalno, odgovarajuća dnevna doza kompozicije ovog pronalaska biće ona količina jedinjenja koja je najniža doza efikasna za stvaranje terapijskog efekta. Takva efikasna doza će generalno zavisiti od gore opisanih faktora. Primena može biti npr. intravenska, intramuskularna, intraperitonealna ili subkutana. Po želji, efikasna dnevna doza farmaceutske kompozicije može da se daje kao dve, tri, četiri, pet, šest ili više poddoza koje se daju posebno u odgovarajućim intervalima tokom dana, opciono, u jediničnim doznim oblicima. Iako je moguće da se jedinjenje ovog pronalaska daje samo, poželjno je da se jedinjenje daje kao farmaceutska kompozicija kako je prethodno opisano.

[0137] Obeležena antitela ovog pronalaska mogu da se koriste za dijagnostičke svrhe za otkrivanje, dijagnozu ili praćenje bolesti ili poremećaja. Ovaj pronalazak obezbeđuje otkrivanje ili dijagnozu neke neurodegenerativne ili kognitivne bolesti ili poremećaja, uključujući, ali ne ograničavajući se na, Parkinsonovu bolest, idiopatsku Parkinsonovu bolest, porodičnu Parkinsonove bolest, difuznu bolest Levijevih tela (DLBD), varijantu Alchajmerove bolesti sa Levijevim telima (LBV), kombinovanu Alchajmerovu i Parkinsonovu bolest, čisto autonomno zatajenje ili višestruku sistemsku atrofija, koje obuhvata: (a) ispitivanje postojanja vrsti i fragmenata alfa-sinukleina u uzorcima ćelija ili tkiva subjekta koje koristi jedno ili više antitela koji se specifično vezuju za alfa-sinuklein; i (b) poređenje nivoa antigena sa kontrolnim nivoem, npr. nivoi u normalnim uzorcima tkiva, pri čemu je povećanje ispitivanog nivoa antigena u odnosu na kontrolni nivo antigena pokazatelj bolesti ili poremećaja, ili pokazatelj težine bolesti ili poremećaja.

[0138] Antitela ovog pronalaska mogu da se koriste za ispitivanje monomera, oligomera, vlaknastih oblika alfa-sinukleina ili fragmenata alfa-sinukleina u biološkom uzorku pomoću imunohistohemijskih postupaka koji su dobro poznati u ovoj oblasti. Drugi postupci na bazi antitela korisni za otkrivanje proteina uključuju imunološke testove kao što su enzimski imunološki test (ELISA), radioimunološki test (RIA) i testovi zasnovani na platformi za otkrivanje mezoskala (MSD). Pogodni obeleživači antitela mogu da se koriste u tim kompletima i postupcima, a obeleživači poznati u ovoj oblasti uključuju enzimske obeleživače, kao što su alkalna fosfataza i glukoza oksidaza; radioizotopske obeleživače, kao što su jod (<125>I,<131>I), ugljenik (<14>C), sumpor (<35>S), tricijum (<3>H), indijum (<121>In) i tehnecijum (<99m>Tc); i luminescentne obeleživače, kao što su luminol i luciferaza; i fluorescentne obeleživače, kao što je fluorescein i rodamin.

[0139] Prisustvo obeleženih antitela protiv alfa-sinukleina ili njihovih fragmenata koji vezuju alfasinuklein može da se otkrije in vivo za svrhe dijagnoze. U jednom načinu ostvarivanja, dijagnoza obuhvata: a) davanje subjektu neke efektivne količine tog obeleženog molekula; b) čekanje vremenskog intervala nakon davanja da bi se omogućilo koncentrovanje obeleženog molekula na mestima (ako ima) Aβ taloženja i da bi se omogućilo da se nevezani obeleženi molekul očisti do nivoa pozadine; c) određivanje nivoa pozadine; i d) otkrivanje obeleženog molekula kod subjekta, tako da je detekcija obeleženog molekula iznad nivoa pozadine pokazatelj da subjekt ima bolest ili poremećaj, ili je pokazatelj težine bolesti ili poremećaja. U skladu sa takvim načinom ostvarivanja, molekul je obeležen delom za snimanje pogodnim za detekciju korišćenjem posebnog sistema za snimanje koji je poznat stručnjacima u ovoj oblasti. Nivoi pozadine mogu se odrediti pomoću različitih postupaka poznatih u ovoj oblasti, uključujući poređenje količine obeleženog antitela detektovanog sa standardnom vrednošću prethodno određenom za određeni sistem za snimanje. Postupci i sistemi koji mogu da se koriste u dijagnostičkim postupcima ovog pronalaska uključuju, ali nisu ograničeni na, kompjuterizovanu tomografiju (CT), skeniranje celog tela kao što je pozitronska emisiona tomografija (PET), magnetna rezonanca (MRI) i sonografija.

[0140] U nekom daljem aspektu, ovaj pronalazak odnosi se na neko antitelo ovog pronalaska, za upotrebu u medicini.

[0141] U nekom daljem aspektu, ovaj pronalazak odnosi se na neko antitelo ovog pronalaska, za upotrebu u lečenju, dijagnozi ili snimanju sinukleinopatije.

[0142] U jednom načinu ostvarivanja, monoklonalno antitelo je za upotrebu u lečenju Parkinsonove bolesti, idiopatske Parkinsonove bolesti, porodičnih oblika Parkinsonove bolesti, difuzne bolesti Levijevih tela (DLBD), varijante Alchajmerove bolesti sa Levijevim telima (LBV), kombinovane Alchajmerove i Parkinsonove bolesti, čisto autonomnog zatajenja ili višestruke sistemske atrofije.

[0143] U nekom daljem aspektu, ovaj pronalazak odnosi se na upotrebu antitela ovog pronalaska, u proizvodnji leka za lečenje, dijagnozu ili snimanje sinukleinopatije.

[0144] U nekom daljem aspektu, ovaj pronalazak odnosi se na lečenje, dijagnozu ili snimanje Parkinsonove bolesti ili drugih sinukleinopatija, koje obuhvata davanje neke efektivne doze antitela ovog pronalaska.

[0145] Poželjno, lečenje je hronično, i poželjno traje najmanje 2 nedelje, kao što je najmanje 1 mesec, 6, meseci, 1 godinu ili više.

[0146] U nekom daljem aspektu, ovo otkrivanje obezbeđuje komplet koji obuhvata antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, ovog pronalaska.

SEQ ID NO:28 GM285 IgG1 Konstantni domen teškog lanca

SEQ ID NO:29 GM285 Kapa Konstantni domen lakog lanca

SEQ ID NO:30 Varijabilni domen teškog lanca GM37 Varijante 1

SEQ ID NO:31 Varijabilni domen teškog lanca GM37 Varijante 2 SEQ ID NO:32 Varijabilni domen teškog lanca GM37 Varijante 3 SEQ ID NO:33 CDR 2 teškog lanca GM3

SEQ ID NO:34 CDR 2 teškog lanca GM3

SEQ ID NO:35 CDR 2 teškog lanca GM3

SEQ ID NO:36 9E4 Vezujući Epitop

SEQ ID NO:37 Humani Beta-Sinuklein

SEQ ID NO:38 Humani Gama-Sinuklein

SEQ ID NO:39 Ortolog alfa-sinukleina za Cinomolgus Majmuna

PRIMERI

Primer 1: Skrining antitela

1. Proizvodnja imunogena i liganda

[0147] Sledeći proteini su nabavljeni ili proizvedeni za upotrebu kao imunogeni kao što je prikazano na Fig.1. Miševi su imunizovani sa tri imunogena: rekombinantna humana alfa-sinukleinska vlakna pune dužine; humani rekombinantni protein alfa-sinukleina koji sadrži aminokiseline 1-60 (Rpeptide, Bogart, Georgia) i humani rekombinantni protein alfa-sinukleina koji sadrži aminokiseline 1-119. Da bi se proizvela vlakna iz pune dužine alfa-sinuklein liofilizovani proizvod iz Rpeptide, Bogart, Georgia (Kataloški broj S-1001-2) je korišćen. Rastvoren je u 20 mM tris i 300 mM NaCl pufera u koncentraciji od 1 mg/ml proteina. Da bi se proizvela vlakna, rastvor proteina je inkubiran 170 µl alikvota u ploči sa 96 bunarčića sa keramičkim perlama prečnika 70 µm u svakom bunarčiću sa 200 o/min u Vortemp 56 vibrirajućem inkubatoru (Labnet International, Edison, NJ, USA), na 37°C tokom 7 dana, i obrazovanje vlakana praćeno je dodavanjem tioflavina T i merenjem fluorescencije i jednom od bunarčića.

Rekombinantni alfa-sinuklein koji sadrži aminokiseline 1-60 rastvoren je u vodi da bi se dobila koncentracija od 1 mg/ml.

[0148] Rekombinantni alfa-sinuklein koji sadrži aminokiseline 1-119 proizveden je korišćenjem sledećeg konstrukta: Sintetički gen koji kodira 6 aminokiselina Histidin oznaku, praćeno mestom cepanja faktora Xa i sekvencom koja kodira aminokiseline 1-119 humanog alfa-sinukleina:

sintetizovan je pomoću Genscript i kloniran u Ndel-Xhol mesto u pET24a(+) ekspresionom vektoru (Novagen).

[0149] Ekspresioni vektor prenet je u E. coli BL21 i jedna kolonija odabrana za ekspresiju korišćenjem sistema autoindukcije preko noći od Novagen (Korisnički protokol TB383 rev. H1005). skala je bila 500 ml krajnje zapremine kulture. Ćelije su sakupljene centrifugiranjem 10 min pri 6000g i naknadno lizirane korišćenjem BugBuster reagensa za ekstrakciju proteina (Korisnički protokol TB245 Rev.0304). Nakon lize, uzorak je prečišćen centrifugiranjem i supernatant je korišćen za dalje prečišćavanje.

[0150] His-obeležen protein prečišćen je na 5ml HisTrap koloni (GE healthcare) uravnoteženoj u 20 mM natrijum fosfata pH7.5, 1 M NaCl (A-pufer). Nakon nanošenja uzorka i ispiranja A-puferom, protein je eluiran u gradijentu do 0.25 M Imidazola u A-puferu preko 20 zapremina kolone. Frakcije od 5 ml prikupljene su i analizirane pomoću SDS-PAGE. Frakcije sa proteinom od interesa su sakupljene, koncentrovane i primenjene na S200 (26/60) koloni za isključivanje po veličini (GE healthcare) u 10 mM tris pH 7.4, 300 mM NaCl. Ponovo su frakcije sakupljene u skladu sa prisustvom trake očekivane veličine u SDS-PAGE.

[0151] Da bi se uklonila N-terminalna oznaka, prečišćen his-obeležen alfa-sinuklein 1-119 inkubiran je sa faktorom Xa u odnosu 1:50 korišćenjem Novagen kompleta (69037-3FRX). Nakon inkubacije preko noći, faktor Xa je uklonjen u serijama korišćenjem Xarrest agaroze. Razdvojeni alfa-sinuklein 1-119 je konačno prečišćen permisivnom HisTrap hromatografijom kako je prethodno opisano. Iz toka kroz prečišćeni alfasinuklein 1-119 je dobijen i koncentrovan do ~400 µg/ml korišćenjem centricon uređaja za koncentrovanje.

[0152] Alfa-sinuklein (Rpeptide) je rehidriran u PBS sa 2 mg/ml i peroksinitirit (100µL/mg protein) dodavan je kap po kap uz mešanje. Nitrozilirani alfa-sinuklein je zatim dijalizovan u 5L PBS i čuvan na -20°C.

[0153] Dopamin je korišćen za oksidaciju alfa-sinukleina. Kombinovane su jednake zapremine 200uM rastvora Dopamina-HCL (Sigma P5244) pripremljene u 10mM PBS, pH7.4 i 28µM rastvora alfa-sinukleina (Rpeptide) u 10mM PBS, pH7.4. Dobijeni 14 uM alfa-sinuklein/100 uM Dopamin inkubirani su na 37°C O/N (preko noći). Oksidovani alfa-sinuklein je potom dijalizovan u PBS i čuvan na - 20°C.

[0154] Različite prirodne i himerne verzije proteina sinukleina proizvedene su kako bi se pregledala raznolika biblioteka antitela protiv alfa-sinukleina. Konstrukti skrininga obuhvatali su sledeće: humani, mišji, pacovski i cinomolgus majmunski alfa-sinuklein, humani Beta-sinuklein, Humani Gama-sinuklein (Fig.21 i 22) i na kraju derivat alfa-sinukleina kojem nedostaju ostaci 120-140 alfa-sinukleina. Pored toga, proizvedene su serije od 4 izmešana konstrukta: A-Syn-AAKK-BAP, A-Syn-BAAK-BAP, A-Syn-BBAA-BAP, A-Syn-BBKK-BAP (SEQ ID No:11-14).

[0155] Ovi konstrukti su sadržali linearne delove humanog alfa-sinukleina (A), humanog Beta-sinukleina (B) i pilećeg alfa-sinukleina (K). Geni su klonirani tako što sadrže oznaku biotinskog akceptorskog peptida (BAP) spojenu sa C-krajem liganada kako bi se olakšala biotinilacija specifična za mesto svakog od liganada. Biotinilacija je omogućila vezivanje liganada za perlice korišćene u rastvorljivom ELISA formatu. Konstruisani su vektori ekspresije sisara koji nose različite konstrukte spajanja alfa-sinukleina i BAP oznake (ASynBAP). Ligandi su eksprimirani u HEK 293 ćelijama korišćenjem prolazne transfekcije (Genmab A/S).

2. Imunizacija

[0156] Antitela HuMab-Sinuklein dobijena su imunizacijama HuMAb mišjeg soja HCo17-BALB/c i HCo12-BALB/c miševa, sa dvostrukim nokautom za mišji teški lanac imunoglobulina (Ig) i mišji kapa laki lanac, koji sprečava ekspresiju antitela koji su potpuno mišji (humano monoklonalno antitelo; Medarex Inc., San Jose, CA, USA). Različiti mišji sojevi izvedeni su transgeno umetanjem lokusa humanog Ig teškog i humanog Ig kapa lakog lanca i razlikuju se po broju humanih VH (varijabilni domen teškog lanca) i VL (varijabilni domen lakog lanca) gena.

[0157] 48 miševa je imunizovano naizmenično intraperitonealno (IP) sa 20 µg antigena i subkutano (SC, u koren repa) istim imunogenom, sa intervalom od 14 dana. Izvedeno je najviše osam imunizacija, 4 IP i 4 SC.

[0158] Prva imunizacija izvedena je imunogenima alfa-sinukleina u potpunom Frojndovom adjuvansu (CFA; Difco Laboratories, Detroit, MI, USA), sledeće imunizacije u potpunom Frojndovom adjuvansu (IFA). Kada je otkriveno da su titri seruma dovoljni (razblaženje seruma od 1/50 ili manje je pozitivno utvrđeno u antigen-specifičnom skrining testu, kao što je gore opisano, na najmanje dva uzastopna, dvonedeljna skrininga), miševi su dodatno bustovani dva puta intravenski (IV) sa 10 µg proteina imunogena alfa-sinukleina u 100 µL PBS, četiri i tri dana pre fuzije.

[0159] Protokoli imunizacije prikazani su na Fig.1.

[0160] Antitelo 37 je poticalo iz protokola imunizacije gde su korišćena humana α-Sinuklein-vlakna pune dužine, naizmenično sa skraćenim oblicima alfa-sinukleina na C- kraju sa aminokiselinama 1-60 i 1-119.

[0161] Antitelo 285 je poticalo iz protokola imunizacije gde je korišćen Humani α-Sinuklein-monomer 1-140 za prve 4 imunizacije. Ako nije bilo titra, imunizacija je nastavljena vlaknima (ip/sc), u suprotnom je nastavljena sa monomerom.

3. Generacija HuMab hibridoma

[0162] HuMAb miševi sa dovoljnim razvojem antigen-specifičnog titra, kao što je prethodno definisano, žrtvovani su, a slezina i limfni čvorovi koji okružuju abdominalnu aortu i šuplju venu su sakupljeni. Fuzija splenocita i ćelija limfnih čvorova sa ćelijskom linijom mišjeg mijeloma izvedena je elektrofuzijom korišćenjem CEEF 50 elektrofuzijskog sistema (Cyto Pulse Sciences, Glen Burnie, MD, USA), suštinski prema instrukcijama proizvođača. Fuzione ćelije su posejane u podlogu za fuziju koja sadrži 10% fetalnog klona I goveđeg seruma (Perbio), 1 mM natrijum piruvata (Cambrex), 0.5 U/mL penicilina, 0.5 U/mL streptomicina (Cambrex), 50 µM 2-merkaptoetanola (Invitrogen), 600 ng/mL interleukina 6 (IL-6) (Strathmann), 1 x HAT (Sigma) i 0.5 mg/mL kanamicina (Invitrogen) u HyQ mADCF-Mab (Perbio). Nakon deset dana, supernatant je sakupljen i ćelije su osvežene podlogom za sakupljanje, koja sadrži 10 % fetalnog klona I goveđeg seruma, 0.5 U/mL penicilina, 0.5 U/mL streptomicina, 600 ng/mL IL-6 i 1 x proHT (Cambrex) u HyQ mADCF-Mab. Supernatanti kultura hibridoma pregledani su pomoću primarnih skrining testova. Supernatanti su okarakterisani za vezivanje za osam različitih liganada. To je uključivalo 4 ortologa: humani, mišji, pacovski i cinomologus majmunski, humani alfa-sinuklein Beta-sinuklein i humani Gama-sinuklein (SEQ ID NO 37-41) i na kraju su testirani na svoju sposobnost da se vezuju za derivata humanog alfa-sinukleina kojem nedostaju ostaci 120-140 alfa-sinukleina.

[0163] Skrining antitela protiv alfa-sinukleina izveden je korišćenjem ELISA formata sa visokim propusnim opsegom suspenzije i automatizovanim sistemima za rukovanje tečnostima (Genmab A/S). Očitavanje ploča je izvedeno pomoću dva sistema, FMAT 8200 od Applied Biosystems korišćeno je za očitavanje ploča sa 384 bunarčića, a ImageXpress Velos Citometar od Molecular Devices korišćen je za očitavanje ploča sa 1536 bunarčića.

[0164] U primarnom skriningu, klonovi su okarakterisani na svoju sposobnost da vezuju 8 različitih liganada. Ovo je uključivalo serije od 4 izmešana konstrukta: A-Syn-AAKK-BAP, A-Syn-BAAK-BAP, A-Syn-BBAA-BAP, A-Syn-BBKK-BAP (SEQ ID No:11-14), alfa-sinuklein 120-140 delecija-BAP, nitrirani humani alfa-sinuklein-BAP i oksidovani humani alfa-sinuklein-BAP.

[0165] Ukratko, serumi ili supernatant koji potencijalno sadrže specifična antitela za alfa-sinuklein dodati su perlama da bi se omogućilo vezivanje za alfa-sinuklein i/ili konstrukte izvedene iz alfa-sinukleina. Vezivanje antitela protiv alfa-sinukleina detektovano je korišćenjem fluorescentnog konjugata, DyLight649 konjugovanog kozjeg antihumanog IgG, Fc specifičnog. Dva poznata mišja antitela protiv alfa-sinukleina, LB509 i Syn211, uključena su u skrininge kao pozitivne kontrole. Da bi se obezbedila specifično otkrivanje antitela protiv alfa-sinukleina, pul seruma anti-alfa-sinukleina korišćen je kao negativna kontrola u skriningu titra u formatu od 384 bunarčića dok je humani ChromPure IgG korišćen u testu zasnovanom na 8 perli u formatu od 1536 bunarčića.

[0166] Ćelije hibridoma iz najboljih primarnih bunarčića zasejane su u polučvrstoj podlozi izrađenoj od 40% CloneMedia (Genetix, Hampshire, UK) i 60% HyQ 2x kompletne podloge (Hyclone, Waltham, USA). Za svaki primarni bunarčić, zasejan je bunarčić Genetix crne ploče sa 6 bunarčića. Iz svakog bunarčića odabrano je 25 podklonova, korišćenjem ClonePix sistema (Genetix). Podklonovi su prikupljeni u podlozi za sakupljanje. Nakon sedam dana, supernatanti podklonova su pregledani ponovo za Sinukleinspecifični humani IgG vezivanje i humana IgG koncentracija izmerena je korišćenjem Octet-a (Fortebio, Menlo Park, USA). Iz svakog primarnog bunarčića, najbolji podklon izabran je i proširen u podlozi za širenje koja sadrži samo 600 ng/mL IL-6, 0.5 U/mL penicilina, 0.5 U/mL streptomicina i 1 x proHT.

Podklonovi su proširen iz jednog bunarčića ploče sa 96 bunarčića na jedan bunarčić ploče sa 24 bunarčića do četiri bunarčića ploče sa 24 bunarčića do šest bunarčića ploče sa 6 bunarčića. Klonovi izvedeni ovim postupkom označeni su kao primarni klonovi (PC).

[0167] Dodatna ispitivanja vezivanja antitela izvedena su korišćenjem Octet 384RED (Fortebio, Menlo Park, USA). Rastvori HuMab antitela od 2 µg/ml napravljeni su razblaživanjem u razblaživaču uzorka (ForteBio, art. br.18-5028). Amino-reaktivni senzori (ForteBio, art. br.18-0008) korišćeni su za imobilizaciju HuMabs-ova Pre kuplovanja sa amino-reaktivnim senzorima, HuMab su razblažena u MES pH 6.0 puferu (18-5027). Kuplovanje je izvedeno na 30°C i 1000 o/min kao što sledi: Amino-reaktivni senzori su prethodno navlaženi u PBS, a zatim aktivirani sa EDC/NHS(ForteBio. Art.br.18-1033/18-1034) aktivacionim rastvorom (prema uputstvu proizvođača) tokom 300 sekundi. Aktivirani senzori su imobilisani sa HuMab-ovima tokom 600 sekundi.

[0168] Vezivanje 37 i 285 u Octet-u za rekombinantni human, cinomolgus i mišji alfa-sinuklein, i nedostatak vezivanja za humani beta ili gama-sinuklein prikazano je na Fig.2

4. Analiza sekvenci HuMab varijabilnih domena specifičnih za sinuklein i kloniranje ekspresionih vektora

[0169] Ukupna RNK pripremljena je od 0.2 do 5x106 ćelija hibridoma i 5'-RACE-komplementarna DNK (cDNK) pripremljena je od 100 ng ukupne RNK, korišćenjem kompleta za SMART RACE cDNK amplifikaciju (Clontech), prema uputstvima proizvođača. VH i VL kodirajući regioni su amplifikovani pomoću PCR i klonirani direktno, u okviru, u p33G1f i p33Kapa ekspresionim vektorima (koji sadrže humane sekvence koje kodiraju IgG1/kapa konstantni domen), kloniranjem nezavisnim od ligacije (Aslanidis, C. and P.J. de Jong, Nucleic Acids Res 1990;18(20): 6069-74). Za svako antitelo, sekvencirano je 16 VL klonova i 16 VH klonova. Klonovi sa ispravnim otvorenim okvirom čitanja (ORF) odabrani su za dalje ispitivanje i ekspresiju. Vektori svih kombinacija teških lanaca i lakih lanaca su prolazno koeksprimirani u FreestyleTM 293-F ćelijama korišćenjem 293fektina.

[0170] U slučaju GM37 sekvenciranja VH regiona identifikovan je ekstra cistein u CDR3 domenu na položaju 106. Da bi se eliminisala mogućnost pogrešnog savijanja i mogući gubitak aktivnosti antitela zbog obrazovanja disulfidnih veza, cistein je mutiran u serin na položaju 106.

[0171] Uporedno antitelo 9E4 je generisano na osnovu VH i VL sekvence izvedene iz hibridoma PTA-8221 (US patent 20080175838) (SEQ ID NO 42 i 43)

5. Ekspresija/prečišćavanje antitela

[0172] Antitela su proizvedena transfekcijom u HEK2936E ćelijama korišćenjem pTT5 vektora i PElpro kao agensa za prolaznu transfekciju (National Research Council of Canada). Ukratko, teški i laki lanci transfektovani su u HEK293 ćelije korišćenjem PElpro (VWR), i ćelije su dopunjene sa TN1 (Sigma) 24 sata nakon transfekcije. Ćelije su gajene dok se vijabilnost nije približila 50%, a prinos antitela je meren titrom lakog IgG (Thermo). Supernatant kulture je filtriran preko filtera sa slepim krajem od 0.2 µm, napunjen na kolone sa 5 mL Proteina A (rProtein A FF, Amersham Bioscience) i eluiran sa 0.1 M limunske kiseline-NaOH, pH 3. Eluat je odmah neutralizovan sa 2M Tris-HCl, pH 9 i dijalizovan u 12.6 mM NaH2PO4, 140 mM NaCl, pH 7.4 (B.Braun), O/N. Nakon dijalize, uzorci su sterilno filtrirani preko filtera sa slepim krajem od 0.2 µm. Čistoća je određena pomoću SDS-PAGE i koncentracija je izmerena nefelometrijom i apsorbancijom na 280 nm. Prečišćena antitela su alikvotirana i čuvana na -80°C.

Primer 2: Karakterizacija antitela pomoću površinske plazmonske rezonance

[0173] Vezivanje antitela za alfa-sinuklein u realnom vremenu izmereno je korišćenjem BlAcore<®>3000. Površina za hvatanje je pripremljena aminskim kuplovanjem poliklonalnog zečjeg anti-mišjeg antitela (deo kompleta za hvatanje mišjih antitela, GE Healthcare, Kat. br: BR-1008-38) u prvoj protočnoj ćeliji (Fc1) i drugoj protočnoj ćeliji (Fc2) CM5 čipa (BlAcore<®>). Mišje antitelo je zarobljeno u Fc2 u koncentraciji potrebnoj da se postigne nivoa liganda od oko 500RU. Osnovna linija je ostavljena da se stabilizuje za 10min pre ubrizgavanja analita (ASynBAP) u Fc1-2 pri 30µl/min. ASynBAP ispitan je na 100-3200nM i 25-3200RU, tim redom. Najviša koncentracija u svakoj titracionoj seriji je ispitana u duplikatu. Površina je regenerisana sa 10mM Glicina-HCl, pH 1.7 (30 sekundi injekcije) da bi se uklonili zarobljeni mišje antitelo i analit na kraju svakog ciklusa. HBS-EP (GE Healthcare, Kat. br: BR-1001-88) korišćen je kao pufer za ispitivanje i razblaživač uzorka u svim eksperimentima i ispitivanje je izvedeno na 25°C. Svi uzorci su čuvani na 4°C pre akvizicije.

[0174] Odgovor zabeležen u Fc1, gde je antitelo za hvatanje imobilisano ali antitelo protiv alfa-sinukleina nije bilo uhvaćeno, oduzet je od odgovora u Fc2. Algoritam vezivanja 1:1 ili 2:1 prilagođen je skupu podataka korišćenjem BIAevaluation verzije softvera 4.1.1. Rezultati se mogu videti na Fig.3, 4 i 5 koje prikazuju vezivanje antitela 37, 285 i 9E4 za humani alfa-sinuklein.

Primer 3: Epitopsko mapiranje

[0175] Epitopsko mapiranje antitela za alfa-sinuklein izvedeno je sa nizovima preklapajućih linearnih peptida na Pepscan (Pepscan Zuidersluisweg 28243 RC Lelystad, Holandija). Vezivanje antitela za svaki od sintetisanih 20 mer peptida ispitano je u ELISA zasnovanoj na Pepscan. Niz linearnih peptida koji pokrivaju celu kodirajuću sekvencu alfa-sinukleina, kao i svi peptidi sa oksidovanim metioninima ili nitrozilovanim tirozinima, inkubirani su sa rastvorom primarnih antitela (preko noći na 4°C). Nakon ispiranja, peptidni nizovi inkubirani su sa 1/1000 razblaženjem konjugata antitela sa peroksidazom (SBA, kat. br.2010-05) za jedan sat na 25°C. Nakon ispiranja, dodati su supstrat peroksidaze 2,2'-azino-di-3-etilbenztiazolin sulfonat (ABTS) i 2 µl/ml 3-procentnog H2O2. Nakon jednog sata, izmeren je razvoj boje. Razvoj boje kvantifikovan je uređajem sa spregnutim naelektrisanjem (CCD) - kamerom i sistemom za obradu slike. Za obradu podataka, vrednosti su dobijene od CCD kamere u opsegu od 0 do 3000 mAU, slično standardnom ELISA-čitaču ploča sa 96 bunarčića. Rezultati su kvantifikovani i čuvani u Peplab bazi podataka. Povremeno bunarčić sadrži mehurić vazduha što rezultira lažno pozitivnom vrednošću, kartice se ručno pregledaju i sve vrednosti izazvane mehurićem vazduha se ocenjuju kao 0. Podaci o vezivanju antitela 37 i 285 za peptide koji sadrže sekvencu ILEDMP ili ILED tim redom mogu se videti na Fig.7.

Primer 4: Imunotaloženje alfa-sinukleina iz humanih homogenata mozga cingularnog korteksa iz pacijenata sa demencijom sa Levijevim telima

[0176] Sposobnost antitela da se vežu za i povuku alfa-sinuklein iz sirovih homogenata cingularnog korteksa iz humanog DLB ili zdrave kontrole (obeležena sa *) ispitivana je imunotaloženjem. Zaleđeni uzorak iz humanog cingularnog korteksa (dobijen od Tissue Solutions Ltd, Škotska) seciran je u kriostatu, i 100mg uzorka dodato je u 1600µl cellytic reagens za lizu M ćelija (Sigma C2978) koji sadrži inhibitore proteaze i inhibitore fosfataze (Roche). Moždano tkivo je homogenizovano dok se uzorak potpuno ne rastvori korišćenjem Precellys homogenizatora sa perlama (Bertin technologies, Francuska) 4x30 sekundi pri 5000 o/min. Rastvor je centrifugiran na 3000 x g i supernatant je korišćen kao sirovi homogenat za imunotaloženje.

[0177] Za imunotaloženje 10 µg antitela je umešano sa magnetnim Dynabeads protein G perlama korišćenjem uputstva proizvođača (Life Technologies, Paisley, UK). Sirovi moždani homogenat je razblažen 30 puta u puferu za lizu (Sigma). Antitelima spregnute dynabeads umešane su sa 500 ul razblaženog homogenata i inkubiranje 90 minuta na sobnoj temperaturi uz kontinuirano mešanje u rotatoru. Nakon inkubacije, perle su isprane u puferu za ispiranje i vezani antigeni su eluirani korišćenjem nedenaturisanog pufera za eluaciju prema uputstvima proizvođača (Dynabeads G protocol, Life Technologies, Paisley UK). Prinos imunotaloženja vizuelizovan je pomoću Western blotinga sa detekcijom mišjeg monoklonalnog antitela protiv humanog alfa-sinukleina, (4B12, Thermo Scientific). Obrasci traka koje predstavljaju različite oblike molekulske težine alfa-sinukleina koji se povlače razlikuju se između 37, 37 varijante 2 i 285 antitela i uporednog antitela 9E4 u tome što 37, 37v2 i 285 antitelo mogu da imunotalože glavne vrste alfa-sinukleina, alfa-sinuklein pune dužine (FL asyn 1-140) i skraćene vrste na C-kraju (1-135 i 1-119/122), dok antitelo 9E4 ne može da imunotaloži skraćene vrste 1-119/122. Fig.9.

Primer 5: Inhibicija skraćivanja alfa-sinukleinskih vlakana proteazom korišćenjem antitela u ćelijskoj kulturi

[0178] Rekombinantni alfa-sinuklein monomeri i vlakna mogu biti apsorbovani od strane primarnih neurona u kulturi. Kao što je šematski prikazano na Fig.10, nakon apsorpcije alfa-sinukleina u neuronima, može se obraditi unutarćelijskim proteazama, kao što je Kalpain I, sa glavnim mestom osetljivim na proteazu na aminokiselini 119/122. Za ispitivanje skraćivanja alfa-sinukleina proteazama mišji primarni kortikalni neuroni pripremljeni su kao što je opisano u Elvang et al.2009 (Elvang et al.. J Neurochem.2009;110(5):1377-87) i tretirani citarabinom na DIV3 (3 dana in vitro) da inhibira rast astrocita. Na DIV4 (4 dana in vitro), neuroni su tretirani sa soniciranim (5 min na 50 % snage u sonikatoru s kupom i rogom) prethodno obrazovanim alfa-sinukleinskim vlaknima (PFF) pri krajnjoj koncentraciji od 0.7 µM sami ili zajedno sa antitelima u naznačenim koncentracijama. Nakon 24 sata inkubacije, podloga je sakupljena i ćelije su lizirane. Western blotovi ispitivani su i na podlogama i na ćelijskom lizatu korišćenjem 4B12 antitela (Fig.11A) (Pierce MA1-90346) i sekundarnog anti-mišjeg antitela. Nakon ispitivanja sa 4B12 anti-mišjim, blotovi su uklonjeni i ponovo ispitani sa anti-humani-IgG antitelom. Na blotu sa 4B12, može se videti da su u podlogama iz ćelija tretiranih sa PFF-ovima samo, bile snažne trake na 14 i 12 kDa, gde 14 kDa predstavlja alfa-sinuklein pune dužine (FL-asyn), a 12 kDa predstavlja C-terminalno skraćeni fragment 1-119/122 (CT-asyn). Pored toga, postojale su trake veće molekulske mase, najverovatnije koje predstavljaju oligomerne vrste otporne na SDS. Ko-tretiranje sa izotipskim kontrolnim antitelom B12 nije promenilo ovaj obrazac proteolize ili apsorpcije.

[0179] U medijumu iz ćelija tretiranih vlaknima zajedno sa 37 postojao je uglavnom alfa-sinuklein pune dužine (14 kD) i samo male količine terminalno skraćene trake (12 kD). U ćelijskom lizatu inform ćelija tretiranih vlaknima zajedno sa 37 postojao je alfa-sinuklein pune dužine samo, što ukazuje da 37 sprečava cepanje FL-alfa-sinukleina. Osim toga, ukupna količina FL-alfa-sinukleina smanjena je u vezi sa ćelijama tretiranim sa PFF-ovima samo ili B12 kontrolnim antitelom. Pokazalo se za nekoliko grupa (Games et al, Am J of Pathol, Vol.182, No.3, March, 2013; Ritchie et al, Health, Vol.4, Special Issue, 1167-1177, 2012; Mishizen-Eberz, Biochemistry, 2005, 44, 7818-7829; Dufty et al, Am J of Pathol, Vol.

170, No.5, May 2007) da se alfa-sinuklein može cepati pomoću Kalpaina-1. Utvrđeno je da se mesto cepanja Kalpaina-1 za fibrilizovani alfa-sinuklein nalazi u regionu 114-122 (Mishizen-Eberz, J of Neurochem, 86, 836-847, 2003). In vivo kod transgenih životinja i u humanom mozgu, izgleda da je 1-119/122 glavni proizvod cepanja - u alfa-sinukleinu, cepanje je verovatno nakon asparta 119 ili asparagina 122, koji se deamiduje do aspartata i cepa se Kalpainom ili drugom proteazom sa sličnom specifičnošću cepanja. Ovi rezultati pokazuju da antitelo 37 može da inhibira C-terminalno skraćivanje alfa-sinukleina. Epitop antitela 37 preklapa se sa mestom vezivanja enzima Kalpaina-1, tako da vezivanje 37 za alfa-sinuklein može direktno da inhibira vezivanje i cepanje posredovano Kalpainom-1 (Fig.10 i 11).

[0180] Epitop iz 285 preklapa se sa epitopom iz 37 i takođe se očekuje da inhibira cepanje proteazom. Aminokiselinska sekvenca iz 37v2 samo se razlikuje od 37 po jednoj aminokiselini u CDR i ima slično vezivanje kao 37, tako da se očekuje i da inhibira cepanje proteazom na sličan način kao 37. Da bi se ispitalo da li je efekat antitela zavistan od doze, postavljen je 24-časovni eksperiment sa zajedničkim dodavanjem PFF-ova i antitela primarnim kortikalnim neuronima. Koncentracija PFF-ova bila je stabilna (10 µg/ml), dok su koncentracije kontrolnog antitela B12 i antitela 37, 37v2 i 285 koji su ispitivani bile 10, 5, 1 i 0,1 ug/ml. Alfa-sinuklein na Western blotovima detektovan je pomoću 1904/4B12 antitela (Abcam), koji ima epitop u regionu 103-108 i, stoga, se vezuje i za FL i za C-terminalno skraćeni alfasinuklein (Fig.11B). Kao što se može videti na Fig.11B, i GM37, 37v2 i GM285 imaju dozno zavisnu inhibiciju cepanja proteazom, uz skoro potpunu inhibiciju cepanja pri visokoj koncentraciji antitela.

Primer 6: Antitelom posredovana inhibicija zasejavanja agregacije alfa-sinukleina u ćelijskoj kulturi

[0181] Nekoliko ispitivanja pokazalo je da egzogeno dodavanje rekombinantnih fibrilarnih agregata alfa sinukleina može ući u ćelije i regrutovati endogeni alfa-sinuklein i indukovati agregaciju i fosforilaciju alfa-sinukleina in vitro i in vivo, što podseća na LB. (Volpicelli-Daley et al.2011, Luk et al.2012a, Luk et al.2012b, Recasens et al.2013, Peelaerts et al.2015). Radi ispitivanja zasejavanja endogenog mišjeg alfa-sinukleina rekombinantnim semenima alfa-sinukleina, mišji primarni kortikalni neuroni pripremljeni kao što je prethodno pomenuto, posejani su na ploče sa 96 bunarčića (15000 ćelija po bunarčiću).5. dana in vitro kulture (DIV), 50% podloge je promenjeno i obogaćeno citozin arabinozidom (krajnja konc.

1uM). Na DIV 6, polovina podloge zamenjena je glija kondicioniranom podlogom zajedno sa vlaknastim materijalom alfa sinukleina, ili sirova fibrilna semena ili čista semena. Sirova fibrilna semena proizvedena su od rekombinantnog monomernog humanog alfa-sinukleina, koji je izolovan iz bakterija i monomeri su filtrirani kroz Amicon Ultra 100.000 odsečen filter (Millipore kat. br UFC510096) i podešeni na koncentraciju od 1mg/ml u PBS, pH 7.4. Za izradu fibrilnih sirovih semena, rastvor monomera inkubiran je u termomikseru na 37C uz kontinuirano mešanje (800o/min) dok se ne postigne plato (procenjeno dnevnim merenjima sa Tioflavinom S). Da bi se minimiziralo isparavanje, kap mineralnog ulja je dodata da prekrije rastvor. Ukupno vreme inkubacije bilo je 5-7 dana, Čista semena proizvedena su od sirovih fibrilnih semena koja su centrifugirana da bi se prečistila i agregiran pelet je resuspendovan u svežem PBS i soniciran. Antitela su dodata jednom na DIV 6 zajedno sa sirovim semenima alfa-sinukleina.

Polovina podloge u primarnim neuronima zamenjena je sa glija kondicioniranom podlogom svake nedelje do bi se održale do DIV21. Neuroni su fiksirani i obojeni fosfo-sinukleinom korišćenjem zečjeg antitela specifičnog za fosforilaciju alfa-sinukleina na aminokiselini S129 (abcam 51253), praćeno fluorescentno obeleženim anti-zečjim antitelom, fluorescencija je kvantifikovana korišćenjem automatizovanog fluorescentnog mikroskopa, Cellomics Arrayscan. Jezgra su detektovana u jednom kanalu i definisan je broj validnih ćelija. Tačke fosforilisanog alfa-sinukleina detektovane su u drugom kanalu u prethodno definisanoj površini oblika prstena koja okružuje jezgro, čime predstavlja citoplazmu ćelija. Prosečan broj tačaka po ćelije je izračunat. Primer bojenja ćelije prikazan je na Fig.12A. Tačke fosforilisanog alfa sinukleina nisu zapažene u netretiranim neuronima. Neuroni inkubirani sirovim ili čistim semenima (1-10ng po bunarčiću) indukuju fosforilaciju alfa sinukleina (Fig.12A). U neuritima, fosforilisan sinuklein pojavljuje se kao tačke ili mrlje, a deo fosfo-sinukleina u neuritima izgleda izduženo.

[0182] Za ispitivanje frakcionisanja, ćelije su sakupljene u fosfatno puferisanom rastvoru soli (PBS) i centrifugirane. Pelet je resuspendovan in 1% tritonskom puferu sa inhibitorima proteaze. Uzorci su čuvani na ledu tokom 15 min. praćeno sonikacijom. Uzorci su centrifugirani na 100000x g tokom 30 min. na 4C. Supernatant je prikupljen i obeležen kao rastvorljiva frakcija. Pelet je ispran jednom u tritonskom puferu i resuspendovan u 1% SDS puferu praćeno sonikacijom. Uzorci su centrifugirani ponovo na 100000xg tokom 30 min. Supernatant je sakupljen kao nerastvorljiva frakcija. Koncentracije proteina izmerene su i uzorci su ispitani na 4-12% SDS_PAGE gelu, blotovani na membranama i alfa sinuklein i fosforilisani alfa sinuklein (S129P) detektovani su 4B12/1904 antitelom (Thermo scientific: MA1-90346-humani sinuklein), S129P-asyn antitelom (abcam 51253) i mišjim antitelom za sinuklein (ćelijska signalizacija- D37A6), tim redom.

[0183] Fig.12 B prikazuje Western blot rastvorljive i nerastvorljive frakcije iz primarnih neurona sa i bez sirovih semena. Kao što se može videti sa Fig.12B, dodavanje semena dovelo je do nakupljanja endogenog mišjeg alfa-sinukleina i p-S129-alfa-sinukleina i multimera fosforilisanog mišjeg alfasinukleina u nerastvorljivoj frakciji ćelija.

[0184] Da bi se ispitalo da li antitela mogu da inhibiraju zasejavanje, alfa sinuklein sinuklein semena korišćena su u konc. od 6.6nM (10ng/ bunarčić). Različite koncentracije antitela i semena alfa- sinukleina dodate su zajedno na DIV 6, da bi se dobio odgovor na dozu (polazeći od najveće konc. antitela na 133nM do 133 pM). Neuroni su ponovo fiksirani i obojeni za fosfo-sinuklein (abcam 51253) i fluorescencija iz ćelija kvantifikovana je korišćenjem automatizovanog fluorescentnog mikroskopa, Cellomics arrayscan. Tačke/mrlje po ćeliji izbrojane su u Cellomics arrayscan. Kao što se može videti na Fig.12C, i antitelo 37, 37v2 i antitelo 285 smanjili su fosforilaciju alfa sinukleina u neuronima na način zavisan od doze sa sličnom maksimalnom inhibicijom za 37, 37v2 i 285 (oko 70-75%) i EC50 oko 5 nM. Frakcionisanje ćelijskih proteina na rastvorljivu i nerastvorljivu frakciju nakon tretiranja antitelom na najvišoj koncentraciji (133 nM) pokazuje da su i antitela 37, 37v2 i 285 inhibirala skraćivanje rekombinantnih sirovih semena i nakupljanje C terminalnog skraćenog fragmenta (CT a-syn), i smanjila nakupljanje fosforilisanog endogenog mišjeg alfa-sinukleina i agregatnih oblika mišjeg alfa-sinukleina u nerastvorljivoj frakciji, kao što se može videti na Fig.12D.

Primer 7. Akutni elektrofiziološki efekti antitela protiv alfa-sinukleina in vivo

[0185] Visoki nivoi ekspresije humanog alfa-sinukleina prisutni su u hipokampusu F28-snca transgenih miševa, model koji prekomerno eksprimira alfa-sinuklein divljeg tipa pod kontrolom promotera mišjeg alfa-sinukleina (Westerlund M, et al. Mol Cell Neurosci.2008 Dec; 39 (4):586-91). Ispitivanje sinaptičke transmisije i plastičnosti u CA1 oblasti hipokampusa kod 4 do 6 meseci starih mužjaka F28-snca transgenih i kontrolnih miševa iste starosti izvedeno je in vivo elektrofiziologijom. Podaci pokazuje da je bazalna sinaptička transmisija značajno pogoršana kod F28-snca transgenih u odnosu na kontrolne miševe iste starosti (Fig.13).

[0186] F28-snca transgeni mužjaci miševa i kontrolni mužjaci miševa iste starosti (CRO breeding, Taconic Europe A/S) starosti 4 do 6 meseca bili su smešteni pojedinačno u uslovima kontrolisane temperature (22 ± 1.5°C) i vlažnosti (55-65%) i čuvani u ciklusu svetlo/mrak 12:12 sati (paljenje svetla u 06:00h). Hrana i voda su bile dostupne ad libitum.

[0187] Životinje su anestezirane intraperitonealnom (i.p.) injekcijom uretana (1.2 g/kg). Miševi su zatim stavljeni u stereotaksični okvir, njihova temperatura podešena na 37.5°C preko grejne podloge, i lobanja je bila otkrivena. Platinasta žica je postavljena u frontalnu kost da bi služila kao referenca, i dodatni otvor je izbušen za umetanje elektroda za snimanje i stimulaciju u hipokampusu, na sledećim koordinatama prema atlasu Paxinos-a i Franklin-a (Paxinos and Franklin's the Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates, 4th Edition, 2001): snimanje, 1.5-1.7 mm posteriorno od Bregme, 1.0-1.2 mm lateralno od srednje linije, 1.4-1.7 mm ispod površine mozga; stimulacija, 1.8-2.0 mm posteriorno od Bregme, 1.5-1.7 mm lateralno od srednje linije, 1.5-1.7 mm ispod površine mozga. Životinje su ostavljene u stereotaksičnom okviru tokom celog trajanja snimanja i njihov nivo anestezije je redovno proveravan.

[0188] Potencijali polja (fEPSP) su izazvani u CA1 električnom stimulacijom Šaferovog kolaterala svakih 30 s, i dubina elektrode za snimanje podešavana je sve dok se nisu zabeležili negativni fEPSP kao odgovor na unipolarni kvadratni impuls. Nagib izazvanih fEPSP izmeren je između 30 i 70% maksimalne amplitude fEPSP.

[0189] Kada je indukovan optimalni fEPSP, bazalna sinaptička transmisija procenjena je vezom između intenziteta stimulacije i nagiba izazvanog fEPSP (veza ulaz-izlaz). Različiti intenziteti stimulacije bili su 0, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400 i 500 µA, i primenjivani su uzastopno rastućim redosledom, sa 2 do 3 ponavljanja za svaki intenzitet. Otkriveno je da je bazalna sinaptička transmisija značajno pogoršana kod F28-snca transgenih u odnosu na kontrolne miševe iste starosti.

[0190] Identifikovana pogoršanja u bazalnoj sinaptičkoj transmisiji kod F28-snca transgenih miševa korišćena su za ispitivanje GM37, GM285 i uporedno h9E4 na njihovu sposobnost da blokiraju efekat posredovan alfa sinukleinom.

[0191] Snimanja su izvedena u svim eksperimentima 3 do 6 h nakon davanja jedne doze antitela u dozi od 15 mg/kg (i.p.). Bazalna sinaptička transmisija zabeležena je u oba hipokampusa kod svake životinje kada je to bilo moguće i zabeležena je kao pojedinačni eksperimenti.

[0192] Akutno tretiranje sa h9E4 izazvalo je značajan preokret oštećenja u bazalnoj sinaptičkoj transmisiji kod F28-snca transgenih miševa (Tg-snca h9E4 vs. Tg-snca PBS, p=0.002, Fig. 14). Međutim, preokret pomoću h9E4 bio je samo delimičan, što pokazuje značajna diferencijacija u odnosu na bazalnu sinaptičku transmisiju kod jedinki iz legla tretiranih sa PBS (p=0.007).

[0193] Akutno tretiranje sa GM37 izazvalo je značajan preokret oštećenja u bazalnoj sinaptičkoj transmisiji kod F28-snca transgenih miševa (Tg-snca GM37 vs. Tg-snca PBS, p=0.004, Fig.15). Bazalna sinaptička transmisija kod GM37-tretiranih transgenih miševa nije bila značajno drugačija od bazalne sinaptičke transmisije kod PBS-tretiranih jedinki iz legla, što pokazuje potpuno poništenje oštećenja (Fig. 15).

[0194] GM285 su takođe izazvala značajan preokret oštećenja u bazalnoj sinaptičkoj transmisiji kod F28-snca transgenih miševa (Fig.16). Bazalna sinaptička transmisija kod GM285-tretiranih transgenih miševa nije bila značajno drugačija od bazalne sinaptičke transmisije kod PBS-tretiranih jedinki iz legla, što pokazuje potpuno poništenje oštećenja.

Primer 8. Mikrodijaliza za procenu humanog alfa-sinukleina u mozgu probuđenih životinja koje se slobodno kreću

[0195] Postupak mikrodijalize pritiska i povlačenja korišćen je za ocenu nivoa humanog alfa-sinukleina u intersticijalnoj tečnosti mozga (ISF). Miševi su pojedinačno smešteni u uslovima kontrolisane temperature (22 ± 1.5°C) i vlažnosti (55-65%) i čuvani u ciklusu svetlo/mrak 12:12 sati (paljenje svetla u 06:00h). Hrana i voda su bile dostupne ad libitum. Trenutno ispitivanje izvedeno je u hipokampusu F28-snca transgenih miševa (50-54 nedelja starih). Da bi se omogućila mikrodijaliza u hipokampusu, miševi su anestezirani izofluranom i intracerebralna vodilica kanile (CMA) je stereotaksično implantirana u mozak, postavljanje sonde za mikrodijalizu u hipokampusu (koordinate vrha sonde: 3.1 mm posteriorno i 2.8 mm lateralno od bregme, i 1.3 mm u odnosu na tvrdu moždanu opnu) prema atlasu Paxinos-a i Franklin-a 2001. Za fiksiranje vodilica kanila korišćeni su ankerni vijci i akrilni cement. Nakon implementacije kanile, miševima je dozvoljeno da se oporave od operacije 2-3 dana pre dijalize.

[0196] Na dan eksperimenta, 2-mm, 1000 kDa zasečena CMA sonda umetnuta je kroz vodilicu kanilu. Sonda je povezana sa peristaltičkom pumpom za mikrodijalizu sa dva kanala (MAB20; Microbiotech) i radila je u režimu pritiska-povlačenja. Ulazna cev sonde za mikrodijalizu povezana je sa peristaltičkom pumpom koja perfuzira sondu veštačkom cerebrospinalnom tečnošću (aCSF; u mM: 147 NaCl, 2.7 KCl, 1.2 CaCl2, 0.85 MgCl2). Peristaltička pumpa bila je takođe povezana sa izlaznom cevi kako bi se sprečio gubitak perfuzione tečnosti iz sonde, povlačenjem tečnosti kroz cev. Kao pufer za perfuziju, 25% frakcije V goveđeg albumina (Sigma) razblažena je do 0.2 % veštačkim CSF na dan upotrebe i filtrirana kroz 0.1-µm membranu. Stvarni protok pumpe određen je bez povezivanja sonde. Epruvete za uzorke su merene pre i posle uzorkovanja tokom datog vremenskog perioda i izračunat je protok. Pumpa je zatim podešena sa konstantnim protokom od 1 µL/min. Korišćen je režim uzorkovanja od 120 min tokom trajanja perioda eksperimenta. Da bi se izbeglo ometanje oštećenja tkiva, eksperimentalni prozor je podešen od 14 do 48 h nakon implementacije sonde.14-16 h nakon početka eksperimenata, GM37, humani 9E4 ili izotipska kontrola(anti-HEL) su ubrizgani i.p. pri 15 mg/kg, i dodatnih 6 uzoraka (12h sakupljanja) je prikupljeno. Dijalizati su čuvani na -80 °C. Koncentracija humanog alfa sinukleina određena je pomoću ELISA (Covance ELISA komplet).

[0197] Prosek dve-tri bazalne vrednosti (4h-6h) pre tretiranja antitelom uzet je kao osnovna linija i postavljen na 100% za svaku životinju. Podaci su ocenjeni korišćenjem dvosmerne analize varijanse (ANOVA) sa ponovljenim merenjima da bi se ocenila statistička relevantnost. Bazalni nivoi humanog alfasinukleina u hipokampusu bili su 8.1 ± 1.1 ng/ml (srednja vrednost ± SEM, n = 25, nije korigovana za in vitro oporavak sonde za dijalizu). Davanje GM37 indukovalo je veće smanjenje humanog alfa-sinuklein u hipokampusu F28 miševa u odnosu i na uporedno antitelo, humani 9E4, i na izotipsku kontrolu (anti-HEL). (Fig.17).

Primer 9: Hronični efekti antitela protiv alfa-sinukleina in vivo. Antitelo GM37 poboljšava motorički fenotip u pacovskom Parkinsonovom modelu.

[0198] Ciljana prekomerna ekspresija humanog alfa-sinukleina na dopaminergičke neurone u srednjem mozgu pacova može se postići pomoću rekombinantnog adeno-povezanog virusnog vektora (rAAV) i povezana je sa progresivnim gubitkom dopaminergičkih ćelija u crnoj supstanci kao i motoričkim oštećenjima.

[0199] Odrasle ženke Sprague-Dawley pacova (225-250g) korišćene su za ekspresiju humanog alfasinukleina u crnoj supstanci (SN) injekcijom sa adeno-povezanim virusom AAV2/5 serotipa koji sadrži pileći beta-aktin promoter sa elementima pojačivača iz promotera citomegalovirusa, praćeno humanom cDNK alfa-sinukleina i WPRE elementom kako je prethodno opisano (Xu L, Daly T, Gao C, Flotte TR, Song S, Byrne BJ, Sands MS, Ponder KP (2001). U ovom modelu, pokazalo se da ekspresija humanog alfasinukleina dovodi do neurodegeneracije dopaminergičkih neurona. Maingay M, et al. CNS Spectr.2005 Mar;10(3):235-44). Da bi se ispitalo dejstvo terapijskog antitela protiv alfa sinukleina u ovom modelu tretiranje antitelom započeto je 2 do 4 dana pre virusnih injekcija, i nastavljeno je do kraja studije (Fig. 18). PBS davanje u istoj zapremini (5 ml/kg: IP) korišćeno je kao kontrola. GM37 doziran je dvaput nedeljno u dozi od 15 mg/kg (IP). Virusne čestice (rAAV2/5) koje sadrže gen za humani wt alfa-sinuklein ili zeleni fluorescentni protein (GFP) ubrizgane su unilateralno u SN. Životinje su anestezirane kombinacijom Hypnorm<®>i Dormicum<®>pri 2.0 ml/kg s.c. i smeštene u stereotaksični okvir. Njihova temperatura podešena je na 37.5°C preko grejne podloge, i njihova lobanja je izložena. Otvor je izbušen iznad desne SN na sledećim koordinatama, prema atlasu Paxinos-a i Watson-a (Paxinos & Watson, 1998): 5.5 mm posteriorno i 2.0 mm lateralno od Bregme. Jedna injekcija od 3 µL rAAV2/5-alfa-syn ili rAAV2/5-GFP data je na dubini od 7.2 mm ispod dura materije, i sa protokom od 0.2 µL/min korišćenjem Hamilton šprica povezanog sa stereotaksičnim injektor. Igla je ostavljen u mestu dodatnih 5 min da bi se omogućila difuzija vektora u SN. Nakon operacije, životinje su vraćene u svoje kaveze, i smeštene u zagrejanu sredinu gde im je bilo omogućeno da se oporave od anestezije. Testiranje motoričke asimetrije u testu cilindra procenjeno je pre AAV injekcija, kao i 3, 7 i 10 nedelja nakon AAV injekcija. Prikazani podaci odgovaraju odnosu između upotrebe desne prednje šape u odnosu na ukupnu upotrebu i leve i desne prednje šape. Performanse svake životinje u cilindru su snimane ukupno 5 min, a ručno ocenjivanje broja dodira levom i desnom prednjom šapom tokom 5 minuta je izvedeno za poslednji dan testiranja 10 nedelja nakon injekcije virusa. Značajno oštećenje je prisutno kod AAV-syn u odnosu na pacove sa ubrizganim AAV-GFP (p=0.012) u 10. nedelji. Pokazan je trend preokreta kod životinja tretiranih GM37, jer se njihove performanse razlikuju od GFP pacova (p=0.163 i p=0.407 za gm37, tim redom). Ovo otkriće ukazuje da je antitelo GM37 u stanju da poboljša motorički fenotip Parkinsonove bolesti kod ovog modela pacova (Fig.18 i 19).

Primer 10: Hronični efekti antitela protiv alfa sinukleina in vivo. Antitelo GM37 inhibira zasejavanje agregacije i fosforilacije endogenog mišjeg alfa sinukleina

[0200] Injekcija prethodno obrazovanih vlakana alfa sinukleina izrađenih od rekombinantnog proteina u dorzalni strijatum miševa divljeg tipa regrutuje endogeni mišji alfa sinuklein i indukuje obrazovanje Ser-129 fosforilisanih agregata unutar neurona u korteksu, amigdali i crnoj supstanci (Luk et al.2012, Science.2012 Nov 16;338(6109):949-53). Da bi se videlo da li monoklonalno antitelo GM37 specifično za alfa-sinuklein može da smanji pojavu obrazovanja inkluzija fosforilisanog alfa sinukleina indukovano alfasinukleinskim vlaknima in vivo korišćeno je ukupno 45 miševa. Miševi su dozirani sa GM 37 pri 30 mg/kg i.p, GM 3715 mg/kg i.v. , ili vehikulumom ip (PBS).Dan kasnije, miševi su anestezirani i stereotaktički im je u jednu hemisferu ubrizgano 2 ul sirovih semena rekombinantnog humanog alfa-Syn, izrađenih kao što je prethodno opisano (Primer 6) (ukupno 2 µg sirovih semena po životinji). Da bi se ubrizgala sirova semena, otvoren je lobanja bušenjem otvora i jedna staklena pipeta je umetnuta (koordinate: 0.5 mm ispred Bregme, 2.0 mm lateralno na srednju liniju) u desni prednji mozak da bi se inokulum usmerio na dorzalni neostrijatum (+2.6 mm ispod dure). Nakon oporavka, miševi su primali nedeljno i.p. ili i.v. injekcije antitela do žrtvovanja nakon 45 dana. Grupe od 15 miševa/grupi dozirane su ili iv w. GM37 15mg/kg, ip sa GM3730mg/kg, ili PBS (10 ml/kg) ip jednom nedeljno.

[0201] Da bi se izmerila koncentracija antitela u plazmi, krv iz obraza je uzimana jednom nedeljno neposredno pre sledeće injekcije, tj.7 dana nakon poslednje injekcije. Plazma je dobijena centrifugiranjem na 2000g, inkubacijom tokom 15min na ST, supernatant je potom zamrznut na -20°C. CSF uzorak uzet je na kraju ispitivanja i zamrznut na -20°C. Plazma i CSF uzorci su analizirani da bi se odredila koncentracija humanog IgG pomoću MSD. Ukratko, mišji anti-humani IgG (klon MH16-1 (M1268) korišćen je za hvatanje, plazma ili CSF je inkubirana u bunarčiću, a zatim je dodato sulfo-TAG kozje anti-humano antitelo kao antitelo za detekciju (MSD kat. br: R32AJ-1). Ploče su analizirane elektrohemiluminiscencijom pomoću MSD.

[0202] Nivoi antitela u plazmi prikazani su na Fig.20B i prikazuju povećanje koncentracije antitela u plazmi zavisno od doze i nakupljanje antitela u plazmi tokom šest nedelja. Nivoi antitela u csf prikazani su na Fig.20C, i prikazuju da se oko 0.1% nivoa antitela u plazmi može izmeriti u csf.

[0203] 45. dana, od trenutka injekcije vlaknastog semena alfa sinukleina, miševi su anestezirani, transkardijalno perfuzirani sa PBS, nakon čega su perfuzirani neutralnim puferovanim paraformaldehidom (4%). Mozgovi su uklonjeni i inkubirani preko noći za postfiksacije u neutralnom puferovanom paraformaldehidu. Imunohistohemija je sprovedena na serijskim isečcima debljine 45 µm od strane saradnika sa neuronauke. Ukratko, korišćenjem MultiBrain<®>tehnologije, do 25 mišjih mozgova je ugrađeno zajedno po bloku, u 3 bloka, zamrznuto isečeno na debljinu od 45µm u koronalnoj ravni, i sakupljeno u čašice koje sadrže rastvor za konzerviranje antigena. Svaki šesti isečak obojen je antitelom za Ser-129 fosforilisani alfa-sinuklein (anti-alfa sinuklein (fosfo S129) antitelo [Psyn/81A] ab184674) da bi se otkrile reaktivne strukture Ser129 fosforilisanog alfa sinukleina.

[0204] Kvantifikacija pSyn patologije izvedena je ručnim brojanjem imunoreaktivnih pozitivnih ćelija sa slika pri uvećanju od 10 x iz 5-7 isečaka koji pokrivaju celu supstanciju nigru iz svakog šestog isečka. Brojanje je izvedeno naslepo. Broj ćelija u amigdali i nigri je analiziran je jednosmernom ANOVA nakon čega je izveden Bonferoni t-test, gde je dejstvo GM37 antitela upoređeno sa PBS tretiranjem.

[0205] Kao što se može videti sa Fig.20C, tretiranje antitelom GM37 smanjilo je broj intra-celularnih inkluzija u crnoj supstanci značajno u odnosu na PBS kontrolu, ili ip ili iv tretiranjem. Podaci pokazuju da antitelo GM37 može da ima terapijski efekat u PD blokiranjem ulaska vanćelijskog patološkog alfasinukleina u neurone, blokiranjem njegove propagacije između neurona i/ili olakšavanjem klirensa iz ISF apsorpcijom u mikrogliju. Budući da je ova pojava inkluzija povezana sa gubitkom dopaminergičkih neurona i razvojem Parkinsonovih motoričkih deficita kod životinjskih modela, tretiranje antitelom GM37 može imati terapijski efekat na gubitak dopaminergičkih ćelija i razvoj motoričkih deficita u PD.

Primer 11: Proizvodljivost GM37 i GM37 varijanti

[0206] Antitela protiv alfa-sinukleina proizvedena su u ćelijskoj kulturi sisara u uslovima koji imitiraju uslove proizvodnje koji će se koristiti za proizvodnju materijala kliničkog kvaliteta za upotrebu kod pacijenata. Dobro je poznato da su proteini proizvedeni na ovaj način podvrgnuti posttranslacionim modifikacijama koje mogu uticati i na terapijski potencijal antitela kao i na biofizička svojstva koja utiču na stabilnost antitela tokom vremena. Empirijsko znanje utvrđeno decenijama studija identifikovalo je skup posttranslacionih modifikacija za koje se zna da predstavljaju rizik za razvoj određenog molekula. Pokazano je da ove posttranslacione modifikacije koreliraju sa aminokiselinskim nizovima prisutnim u primarnoj sekvenci proteina teškog i lakog lanca. Generisani su algoritmi koji mogu identifikovati ove sekvence i odrediti potencijalni rizik koji će imati na proizvodnost i razvoj terapijskog antitela.

[0207] In silico analiza primarne sekvence antitela može se koristiti za smanjenje rizika molekula u pogledu njegovog potencijalnog razvoja kao terapije. Konkretno, detaljna analiza VH i VL regiona može identifikovati jedinstvene aminokiseline koje se smatraju važnim za aktivnost molekula, ali takođe mogu biti potencijalni rizik za njegovu stabilnost tokom vremena. Deamidacija specifična za sekvencu je identifikovana kao potencijalni rizik za proteinske strukture. Deamidacija proteina može se desiti na amidnim bočnim lancima glutamina ili ostataka asparagina i transformisati ih u karboksilatnu grupu (Lorenzo et al. PLOSone, DOI:10.1371, Dec. (2015)). Neenzimska deamidacija pri neutralnom pH se brže odvija za asparagin i stoga se smatra većim rizikom od glutamina. Na aktivnost dodatno utiče sledeća aminokiselina u sekvenci i može se odvijati brzinom od nekoliko dana ili godina. Stvarna sudbina proteina koji se podvrgava deamidaciji mora se eksperimentalno proceniti kako bi se utvrdio uticaj promene i na njegovu stabilnost i na aktivnost.

[0208] Identifikovano je mesto za deamidaciju unutar VH domena iz GM37. Aminokiselinski ostaci 54 su asparagin (N) praćen glicinom (G) na položaju 55. N54 ima visok rizik od spontane deamidacije. Da bi se ublažio ovaj rizik, generisan je skup od 3 varijante koje zamenjuju asparagin (N) serinom (S), glutaminom (Q) ili histidinom (H). Sve 3 varijante proizvedene su u ćelijskoj kulturi sisara korišćenjem postupaka prolazne transfekcije (primer 1.5). Sve 3 varijante pokazale su sličnu ekspresiju i svojstva prečišćavanja kao GM37wt. (Fig.23).

[0209] Za svaki od osam proizvoda izvedene su prolazne transfekcije od 400 ml korišćenjem CHOK1SV GS-KO ćelija koje su bile u kulturi najmanje 2 nedelje. Ćelije su subkultivisane 24 sata pre transfekcije. sve transfekcije izvedene su elektroporacijom pomoću Gene Pulse XCell (Bio-Rad). Za svaku transfekciju, održive ćelije su resuspendovane u prethodno zagrejanoj CD-CHO podlozi obogaćenoj 6mM L-glutaminom do 2.86×10<7>ćelija/ml.40 µg svake uspostavljene SGV DNK koja je sadržala odgovarajuće teške i lake lance je alikvotirano u svaku kivetu (Bio-Rad, GenePulser kiveta, razmak od 0.4 cm, 165-2088) i dodato je 700 µl ćelijske suspenzije. Ćelije su elektroporisane na 300V, 900µF. Transfektovane ćelije su prebačene u ponovo zagrejane podloge u erlenmajerovim bočicama, a sadržaj kiveta ispranih dva puta prethodno zagrejanom podlogom je takođe prebačen u bočice. Transfektantne kulture su inkubirane u vibrirajućem inkubatoru na 36.5°C, 5% CO2, 85% vlažnosti, 140 o/min tokom 6 dana.

Vijabilnost ćelija je merena u vreme sakupljanja pomoću Cedex HiRes automatizovanog brojača ćelija (Rosche).

[0210] Da bi se procenio značaj ostatka 54 u vezivanju za humani alfa-sinuklein, ispitivana je sposobnost varijanti da se vezuju u dva različita eksperimenta. Koristeći konkurentski ELISA format, procenjen je uticaj koji bi promena na ostatku 54 imala na sposobnost GM37 da veže alfa-sinuklein u rastvoru.

Procenom koncentracije sinukleina koja može da inhibira vezivanje antitela za ELISA ploče obložene sinukleinom, pokazalo se da su sve varijante održale isto vezivanje kao GM37wt i da su se vezale za alfasinuklein sa visokim afinitetom, što rezultira IC50 od 1-2nM (Fig.24). Test konkurencije je sproveden korišćenjem prethodne inkubacije fiksne koncentracije (0.3 µg/ml) svakog od sledećih antitela, GM37 (naziv GM 37wt), GM37 varijanta1, GM37 varijanta2 i GM37 varijanta3, sa opsegom od 0-1000 nM humanog alfa-sinukleina za 60 minuta na sobnoj temperaturi. Preostalo nevezano antitelo je zarobljeno i mereno na ELISA pločama premazanim sa 100 ng/ml rekombinantnog humanog alfa-sinukleina korišćenjem anti-humanog antitela za detekciju elektrohemiluminisencijom (MSD, Gathersburg, MD). IC50 vrednosti interakcije su 1.9nM, 1.6nM, 2.1nM i 1.4nM za GM37 wt, GM37varijantu1, GM37varijantu2 i GM37varijantu3, tim redom (kako je određeno korišćenjem Prism Graphpad<®>).

[0211] Koristeći površinsku plazminsku rezonancu (SPR), procenjene su kinetike vezivanja GM37 wt (2 serije) i tri varijante u realnom vremenu (Primer 2). Humani alfa-sinuklein je zarobljen na pločici (ligandu) i antitela su testirana u višestrukim koncentracijama kao analiti. Analiza krivih vezivanja u prisustvu antitela u višestrukim koncentracijama pokazala je da su brzine vezivanja bile iste za sva četiri antitela, slično tome, kada je antitelo uklonjeno iz pufera, izmerene brzine vezivanja nisu pokazale statističku razliku između antitela. Koristeći algoritam vezivanja 1:1, sva 4 antitela imaju skoro identične konstante vezivanja (Fig.25).

[0212] Kako bi se procenio uticaj izmena na N54 na funkcionalnu aktivnost GM37, ispitivana je sposobnost antitela da blokiraju aktivnost zasejavanja sinukleina u kulturi primarnih neurona (Primer 6). Nivo zasejavanja izmeren je korišćenjem antitela specifičnog za fosfo-sinuklein . Sva 3 antitela mogla su da blokiraju zasejavanje kao što je izmereno signalom fosfo-sinukleina (Fig.26). Osim toga, nivo inhibicije bio je isti za sva 4 antitela. Ovi podaci zasnovani na odzivu dodatno potvrđuju podatke o vezivanju da aminokiselina 54 u VH domenu nije potrebna za afinitet vezivanja za humani alfa-sinuklein ili za inhibiciju zasejavanja u testu zasnovanom na primarnim ćelijama. Osim toga, otkriveno je da su sva tri od ovih antitela sposobna za proizvodnju korišćenjem standardnih postupaka ekspresije i prečišćavanja. Zanimljivo je da je jedna od varijanti N54Q pokazala poboljšanje u proizvodnji u odnosu na ostale varijante, što je od velikog značaja kada se antitelo komercijalno proizvodi u velikim razmerama. Ovi podaci podržavaju mogućnost smanjenja potencijalnog rizika od deamidacije zamenom asparagina (N) drugom aminokiselinom bez brige o gubitku potencije.

[0213] Uzorci svakog od antitela wt GM37, var1, var2 i var3 podvrgnuti su stalnom porastu temperature tokom vremena, a nivo agregacije je istovremeno meren višeugaonim rasejanjem svetlosti (Prometheus NT.48, NanoTemper Technologies). Utvrđeno je da je temperatura za pojavu agregacije slična za GM37 i GM37-varijante, međutim najniži nivo agregacije primećen je za GM37-Var2 (Fig.27).

LISTA SEKVENCI

[0214]

<110> H. Lundbeck A/S

<120> Nova monoklonalna antitela protiv alfa-sinukleina

<130> 0992

<160> 43

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 10

<212> PRT

<213> Veštačka

<220>

<223> GM37 CDR 1 Teški lanac

<400> 1

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> Veštačka

<220>

<223> GM37 CDR2 Teški lanac <400> 2

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> Veštačka

<220>

<223> GM37 CDR3 Teški lanac <400> 3

<210> 4

<211> 11

<212> PRT

<213> Veštačka

<220>

<223> GM37 CDR1 Laki lanac <400> 4

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> Veštačka

<220>

<223> GM37 CDR 2 Laki lanac <400> 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> Veštačka

<220>

<223> GM37 CDR 3 Laki lanac <400> 6

<210> 7

<211> 116

<212> PRT

<213> Veštačka

<220>

<223> GM37 CDR Teški lanac <400> 7

<210> 8

<211> 108

<212> PRT

<213> Veštačka

<220>

<223> GM 37 Laki lanac

<210> 9

<211> 6

<212> PRT

<213> Veštačka <220>

<223> Epitop 112-117 <400> 9

<210> 10

<211> 140

<212> PRT

<213> Veštačka <220>

<223> Alfa-sinuklein

<210> 11

<211> 165

<212> PRT

<213> Veštačka <220>

<223> A-Syn-AAKK-BAP <400> 11

<211> 165

<212> PRT

<213> Veštačka <220>

<223> A-Syn-BAAK-BAP <400> 12

<211> 162

<212> PRT

<213> Veštačka <220>

<223> A-Syn-BBAA-BAP <400> 13

<211> 165

<212> PRT

<213> Veštačka <220>

<223> A-Syn-BBKK-BAP <400> 14

<211> 141

<212> PRT

<213> Veštačka

<220>

<223> A-Syn-120-140_Del-BAP

<400> 15

<210> 16

<211> 131

<212> PRT

<213> Veštačka

<220>

<223> aminokiseline 1-119 alfa-sinukleina

<210> 17

<211> 106

<212> PRT

<213> veštačka

<220>

<223> kapa (LC konstantni region) <400> 17

<211> 329

<212> PRT

<213> Veštačka

<220>

<223> IgG1 (HC Konstantni region) <400> 18

<211> 4

<212> PRT

<213> Veštačka

<220>

<223> GM285 epitop 112-115 <400> 19

<210> 20

<211> 13

<212> PRT

<213> Veštačka

<220>

<223> GM285 CDR1 Teški lanac <400> 20

<210> 21

<212> PRT

<213> Veštačka

<220>

<223> GM285 CDR2 Teški lanac <400> 21

<210> 22

<211> 9

<212> PRT

<213> Veštačka

<220>

<223> GM285 CDR3 Teški lanac <400> 22

<210> 23

<211> 12

<212> PRT

<213> Veštačka

<220>

<223> GM285 CDR1 Laki lanac <400> 23

<210> 24

<211> 7

<212> PRT

<213> Veštačka

<220>

<223> GM285 CDR2 Laki lanac <400> 24

<210> 25

<212> PRT

<213> Veštačka

<220>

<223> GM285 CDR3 Laki lanac <400> 25

<210> 26

<211> 116

<212> PRT

<213> Veštačka

<220>

<223> GM285 VH

<400> 26

<210> 27

<211> 108

<212> PRT

<213> Veštačka

<220>

<223> GM285 VL

<210> 28

<211> 329

<212> PRT

<213> Veštačka

<220>

<223> GM285 IgG1 konstantni region <400> 28

<211> 106

<212> PRT

<213> Veštačka

<220>

<223> GM285 Kapa lanac

<210> 30

<211> 116

<212> PRT

<213> Veštačka

<220>

<223> teški lanac GM37 varijante 1 <400> 30

<210> 31

<212> PRT

<213> Veštačka

<220>

<223> teški lanac GM 37 varijante 2 <400> 31

<210> 32

<211> 116

<212> PRT

<213> Veštačka

<220>

<223> teški lanac GM 37 varijante 3

<210> 33

<211> 17

<212> PRT

<213> Veštačka

<220>

<223> CDR 2 teškog lanca GM37 varijante 1 <400> 33

<210> 34

<211> 17

<212> PRT

<213> Veštačka

<220>

<223> CDR 2 teški lanac GM37 varijante 2 <400> 34

<210> 35

<212> PRT

<213> Veštačka

<220>

<223> CDR 2 teški lanac GM37 varijante 3 <400> 35

<210> 36

<211> 5

<212> PRT

<213> Veštačka

<220>

<223> 9E4 vezujući epitop

<400> 36

<210> 37

<211> 134

<212> PRT

<213> Veštačka

<220>

<223> HUMANI Beta-sinuklein

<400> 37

<211> 127

<212> PRT

<213> Veštačka

<220>

<223> HUMANI Gama-sinuklein <400> 38

<210> 39

<211> 140

<212> PRT

<213> Veštačka

<220>

<223> ortolog alfa-sinukleina za cinomolgus majmuna <400> 39

<210> 40

<211> 140

<212> PRT

<213> Veštačka

<220>

<223> ortolog alfa-sinukleina za pacova

<400> 40

<211> 140

<212> PRT

<213> Veštačka

<220>

<223> ortolog alfa-sinukleina za miša <400> 41

<210> 42

<212> PRT <213> veštačka <220> <223> 9E4 HC <400> 42

<211> 220 <212> PRT <213> veštačka <220> <223> 9E4 LC

Claims (9)

1. Patentni zahtevi 1. Humano monoklonalno antitelo koje se može specifično vezati za humani alfa-sinuklein, pri čemu je monoklonalno antitelo odabrano iz grupe koju čine humana monoklonalna antitela (1)-(2): (1) humano monoklonalno antitelo koje obuhvata: a) varijabilni domen teškog lanca iz SEQ ID NO:7, i b) varijabilni domen lakog lanca iz SEQ ID NO:8; (2) humano monoklonalno antitelo koje obuhvata: a) varijabilni domen teškog lanca iz SEQ ID NO:31, i b) varijabilni domen lakog lanca iz SEQ ID NO:8; i pri čemu humano monoklonalno antitelo predstavlja humani IgG1 izotip.
2. 2. Monoklonalno antitelo prema zahtevu 1, koje obuhvata varijabilni domen teškog lanca iz SEQ ID NO:7 i varijabilni domen lakog lanca iz SEQ ID NO:8.
3. 3. Monoklonalno antitelo prema zahtevu 1, koje obuhvata varijabilni domen teškog lanca iz SEQ ID NO:31 i varijabilni domen lakog lanca iz SEQ ID NO:8.
4. 4. Nukleinska kiselina koja kodira antitelo prema bilo kom od zahteva 1-3.
5. 5. Monoklonalno antitelo prema bilo kom od zahteva 1-3 za upotrebu u terapiji.
6. 6. Monoklonalno antitelo prema bilo kom od zahteva 1-3 za upotrebu u lečenju sinukleinopatije.
7. 7. Monoklonalno antitelo za upotrebu prema zahtevu 6, pri čemu je sinukleinopatija izabrana iz grupe koju čine Parkinsonova bolest, idiopatski i nasledni oblici Parkinsonove bolesti, Gošeova bolest (GD), Difuzna bolest Levijevih tela (DLBD), varijanta Alchajmerove bolesti sa Levijevim telima (LBV), Kombinovana Alchajmerova i Parkinsonova bolest, čisto autonomno zatajenje ili višestruka sistemska atrofija.
8. 8. Monoklonalno antitelo za upotrebu prema zahtevu 7, pri čemu je sinukleinopatija Parkinsonova bolest.
9. 9. Monoklonalno antitelo za upotrebu prema zahtevu 7, pri čemu je sinukleinopatija višestruka sistemska atrofija.