[go: up one dir, main page]

ES3028882T3 - Agents, uses and methods for the treatment of synucleinopathy - Google Patents

Agents, uses and methods for the treatment of synucleinopathy Download PDF

Info

Publication number
ES3028882T3
ES3028882T3 ES16738736T ES16738736T ES3028882T3 ES 3028882 T3 ES3028882 T3 ES 3028882T3 ES 16738736 T ES16738736 T ES 16738736T ES 16738736 T ES16738736 T ES 16738736T ES 3028882 T3 ES3028882 T3 ES 3028882T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
synuclein
alpha
antibody
val
ser
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES16738736T
Other languages
English (en)
Inventor
Pekka Kallunki
Karina Fog
Louise Vesterager
Ann-Louise Bergström
Florence Sotty
David Satijn
Den Brink Edward Van
Paul Parren
Rik Rademaker
Tom Vink
Ibrahim Malik
Liliana Montezinho
Jeffrey B Stavenhagen
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
H Lundbeck AS
Original Assignee
H Lundbeck AS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by H Lundbeck AS filed Critical H Lundbeck AS
Application granted granted Critical
Publication of ES3028882T3 publication Critical patent/ES3028882T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2835—Movement disorders, e.g. Parkinson, Huntington, Tourette

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)

Abstract

La invención se refiere a nuevos anticuerpos monoclonales anti-alfa-sinucleína. Estos anticuerpos pueden utilizarse para el tratamiento de sinucleinopatías como la enfermedad de Parkinson (incluidas las formas idiopáticas y hereditarias), la enfermedad difusa de cuerpos de Lewy (DLBD), la variante de cuerpos de Lewy de la enfermedad de Alzheimer (LBV), la combinación de las enfermedades de Alzheimer y Parkinson, la insuficiencia autonómica pura y la atrofia multisistémica. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Agentes, usos y métodos para el tratamiento de la sinucleinopatía
Campo de la invención:
La presente invención se refiere a una nueva clase de anticuerpo monoclonal como se reivindica que se une específicamente a la alfa-sinucleína, así como a métodos para usar estas moléculas en el tratamiento y diagnóstico de sinucleinopatías.
Referencia al listado de secuencias:
Esta solicitud incluye uno o más Listados de Secuencias de acuerdo con 37 C.F.R. 1.821 et seq., que se desvelan en medios legibles por ordenador (nombre de archivo: 0992_ST25.txt, creado el 22 de junio de 2016 y que tiene un tamaño de 44 kB).
Antecedentes de la invención:
Las sinucleinopatías, también conocidas como enfermedades con cuerpos de Lewy (LBD), se caracterizan por la deposición de agregados de proteínas intracelulares que son visibles al microscopio como cuerpos de Lewy (LB) y/o neuritas de Lewy, donde la proteína alfa-sinucleína es el componente principal (Jellinger, Mov Disord. 2012 Jan;27(1):8-30; McKeith et al., Neurology (1996) 47:1113-24). Las sinucleinopatías incluyen la enfermedad de Parkinson(PD) (incluyendo formas idiopáticas y hereditarias de enfermedad de Parkinson) y la enfermedad Difusa por cuerpos de Lewy (DLB) (también conocida como Demencia con Cuerpos de Lewy (DLB), variante de la enfermedad de Alzheimer con cuerpos de Lewy (LBV), enfermedad de Alzheimer y Parkinson Combinada (CAPD), fallo autonómico puro(PAF) y atrofia multisistema (MSA; por ejemplo, Atrofia Olivopontocerebelar, Degeneración Estriatonigral y Síndrome de Shy-Drager)). Las sinucleinopatías frecuetemente tienen degeneración del sistema nigroestriatal dopaminérgico, responsable de los déficits motores centrales en el Parkinson (rigidez, bradicinesia, temblores en reposo), pero también hay una aparición muy extendida de cuerpos de Lewy y neuritas de Lewy distróficas en el sistema nervioso central, periférico y autonómico y en regiones cerebrales y otros órganos asociados con disfunciones no motoras, tales como demencia y déficits del sistema nervioso autonómico. Se cree que varios de los signos y síntomas no motores preceden a los síntomas motores de la enfermedad de Parkinson y otras sinucleinopatías. Estos signos prematuros incluyen, por ejemplo, trastornos del comportamiento del sueño REM (RBD) y pérdida de olfato y estreñimiento (Mahowald et al., Neurology (2010) 75:488-489). Las sinucleinopatías continúan siendo una causa común de trastornos del movimiento y deterioro cognitivo en la población en envejecimiento(Galasko et al., Arch.Neurol.(1994)51;888-95).
La alfa-sinucleína es un miembro de una familia de proteínas que incluyen la sinucleína beta y gamma y la sinoretina. La alfa-sinucleína se expresa en el estado normal asociado con sinapsis y se cree que juega un papel en la regulación de la liberación de vesículas sinápticas afectando de esta manera a la comunicación neural, plasticidad, aprendizaje y memoria.
Varios estudios han implicado a la alfa-sinucleína en un papel central en la patogénesis de la PD. La proteína puede agregarse formando fibrillas insolubles intracelulares en situaciones patológicas. Por ejemplo, la sinucleína se acumula en LB (Spillantini et al., Nature (1997) 388:839-40; Takeda et al., J. Pathol. (1998) 152:367-72; Wakabayashi et al., Neurosci. Lett. (1997) 239:45-8). Ciertas mutaciones en el gen de la alfasinucleína así como duplicaciones y triplicaciones del gen se cosegregan con formas familiares raras de parkinsonismo (Kruger et al., Nature Gen. (1998) 18:106-8; Polymeropoulos, et al., Science (1997) 276:2045-7). Un descubrimiento importante ha sido que la alfa-sinucleína puede secretarse en el fluido extracelular y estar presente en plasma y en el líquido cefalorraquídeo (CSF). Varios estudios, por ejemplo de Pacheco et al. (2015) y otros (Pacheco et al J Neurochem. 2015 Mar;132(6):731-4; Conway et al., Proc Natl Acad Sci USA (2000) 97:571-576; Volles et al., J. Biochem. 42:7871-7878, 2003) han sugerido que la sinucleína extracelular juega un papel patogénico en el cerebro. Demostraron que los oligómeros de alfa-sinucleína extracelular poseen neurotoxicidad hacia membranas plasmáticas de neuronas cerebrales. Otra hipótesis enigmática basada en los datos de la secreción de sinucleína es que una propagación de tipo priónico de la alfa-sinucleína es la base de la progresión de la enfermedad de Parkinson y otras sinucleinopatías(Lee et al. 2014, Nat Rev Neurol. 2014 Feb;10(2):92-8; Hansen and Li 2012, Trends Mol Med. 2012 May;18(5):248-55). Estos descubrimientos han dado lugar a la esperanza de que pueda pueda dirigirse una inmunoterapia a la sinucleína extracelular(Vekrellis et al.
2011, Lancet Neurol. 2011 Nov;10(11):1015-25).
Se ha demostrado que tanto en los pacientes con PD como en los controles sanos están presentes autoanticuerpos de alfa-sinucleína naturales (Smith et al. 2012, PLoS One. 2012;7(12):e52285; Maetzler et al.
2014, PLoS One. 2014 Feb 21;9(2):e88604, Papachroni et al. 2007 J Neurochem. 2007 May;101(3):749-56 and Woulfe et al. 2002, Neurology. 2002 May 14;58(9):1435-6), algunas veces se han notificado niveles aumentados de autoanticuerpos contra la alfa-sinucleína en PD (Gruden et al. 2011, J Neuroimmunol. 2011 Apr;233(1-2):2217, Gruden et al. 2012,Neuroimmunomodulation. 2012;19(6):334-42 and Yanamandra 2011, PLoS One. 2011 Apr 25;6(4):e18513) o autoanticuerpos disminuidos contra la alfa-sinucleína en pacientes con PD en comparación con los controles sanos (Besong-Agbo et al 2013, Neurology. 2013 Jan 8;80(2):169-75). . La posibilidad de que los autoanticuerpos anti-alfa-sinucleína circulantes puedan tener un papel protector con respecto a la agregacion de la alfa-sinucleína se sugirió muy poco después del descubrimiento de los autoanticuerpos (Woulfe et al. 2002, Neurology. 2002 May 14;58(9):1435-6).
La sobreexpresión de la alfa-sinucleína en ratones transgénicos imita algunos aspectos patológicos de la enfermedad con cuerpos de Lewy. En los últimos diez años se han generado varias líneas transgénicas diferentes de ratones que sobreexpresan la alfa-sinucleína (descrito en revisiones: Koehler et al 2014, PLoS One.
2013 May 31;8(5):e64649; Fleming and Chesselet, 2006,Behav Pharmacol. 2006 Sep;17(5-6):383-91; Springer and Kahle 2006,Curr Neurol Neurosci Rep. 2006 Sep;6(5):432-6). Las líneas de ratón con Thy-1 y promotores de PDGF-beta desarrollan déficits motores y déficits cognitivos y se han usado para demostrar un efecto neuroprotector de anticuerpos dirigidos contra la alfa-sinucleína in vivo. Sin embargo, ninguna de las líneas transgénicas tiene una degeneración sólida de neuronas dopaminérgicas, y con frecuencia los fenotipos motores se dirigen por expresión en neuronas motoras, que normalmente no degeneran en la enfermedad de Parkinson. Por lo tanto, no está claro si el resultado positivo de un posible tratamiento modificador de la enfermedad está mediado por efectos sobre neuronas dopaminérgicas u otras neuronas del sistema nervioso central.
Un descubrimiento sólido en los modelos de ratón transgénico ha sido que la sobreexpresión crónica de alfasinucleína humana afecta negativamente a la función sináptica. Usando estudios tanto en sistemas in vitro como en sistemas in vivo se demostró que la sobreexpresión de la alfa-sinucleína humana de tipo silvestre (wt) perjudicaba a la transmisión sináptica en el hipocampo (Nemani et al. 2010, Neuron. 2010 Jan 14;65(1):66-79; Paumier et al. 2013, PLoS One. 2013 Aug 1;8(8):e70274). Esto se demostró en la región CA1 del hipocampo, donde los dos estudios encontraron una transmisión sináptica basal reducida. Se supuso que el mecanismo subyacente a esto era la acumulación intracelular de alfa-sinucleína que conducía a una liberación sináptica disfuncional. Sin embargo, los recientes descubrimientos sobre la secreción de alfa-sinucleína en el espacio extracelular en la sinapsis y los efectos tóxicos de los oligómeros de alfa-sinucleína en la función sináptica abre la posibilidad de un papel de la alfa-sinucleína extracelular en la disfunción sináptica, y por lo tanto de la capacidad de anticuerpos terapéuticos de salvar el déficit.
El uso de vectores virales para sobreexpresar la alfa-sinucleína representa una forma importante para crear modelos de PD en ratones porque este enfoque produce una degeneración progresiva relativamente rápida de neuronas nigroestriatales, una característica que aún no se ha reproducido por mutaciones genéticas en ratones o ratas (Kirik and Bjorklund, 2003, Trends Neurosci. 2003 Jul;26(7):386-92). Además, la liberación de genes virales reveló la capacidad de la alfa-sinucleína wt de inducir la patología nigroestriatal (Kirik et al. 2002, J Neurosci. 2002 Apr 1;22(7):2780-91), un descubrimiento de acuerdo con la evidencia en formas familiares de PD con duplicaciones y triplicaciones de alfa-sinucleína(Lee and Trojanowski, 2006, Neuron. 2006 Oct 5;52(1):33-8). En un estudio, se ha demostrado que un conjunto de anticuerpos de cabra contra la alfa-sinucleína N-terminal protegía frente a la muerte de células dopaminérgicas y mejoraba los déficits conductuales en un modelo de rata de enfermedad de Parkinson basado en AAV-alfa-sinucleína (Shahaduzzaman et al 2015, PLoS One. 2015 Feb 6;10(2):e0116841).
Recientemente se ha demostrado que la propagación de tipo priónica de la patología de la alfa-sinucleína desarrolla una patología de alfa-sinucleína y también produce la muerte de células dopaminérgicas(Luk et al.
2012, Science. 2012 Nov 16;338(6109):949-53). Este modelo se ha usado para demostrar que los anticuerpos contra la alfa-sinucleína pueden mejorar la patología (Tranet al.2014, Cell Rep. 2014 Jun 26;7(6):2054-65). En este modelo, el tratamiento con anticuerpos pudo reducir la acumulación de alfa-sinucleína fosforilada en varias regiones cerebrales - incluyendo neuronas dopaminérgicas de la sustancia negra y reducir el desarrollo del déficit motor.
Además de las mutaciones, el corte y empalme alternativo del gen de la alfa-sinucleína y las modificaciones postraduccionales de la proteína, tales como fosforilación, ubiquitinación, nitración y truncamiento pueden crear formas de la proteína alfa-sinucleína con mayor capacidad de formar agregados y/o formas tóxicas de la alfasinucleína (Beyer and Ariza, Mol Neurobiol. 2013 Apr;47(2):509-24). Sin embargo, sigue sin conocerse la especie patológica precisa de la alfa-sinucleína. Varias especies con un plegamiento erróneo/agregadas/secretadas que varían desde oligómeros a fibrillas, y diferentes modificaciones postraduccionales se han asociado con toxicidad, pero no hay consenso sobre cual es la más importante, y ni si quiera si solo hay una especie tóxica.
En general, la acumulación de alfa-sinucleína con alteraciones morfológicas y neurológicas similares en modelos animales tan diversos como seres humanos, ratones y moscas sugiere que esta molécula es fundamental en la patogénesis de las enfermedades con cuerpos de Lewy.
Se ha demostrado que varios anticuerpos diferentes contra la alfa-sinucleína tienen un efecto terapéutico en modelos animales preclínicos. Se ha demostrado que tanto un anticuerpo que se dirige a un epítopo que incluye los restos 91-99 de la alfa-sinucleína como anticuerpos que se dirigen a un epítopo que incluye los restos 118126 de la alfa-sinucleína tienen un efecto sobre los déficits motores y cognitivos en ratones transgénicos (Games et al. 2014, J Neurosci. 2014 Jul 9;34(28):9441-54). El más avanzado de estos anticuerpos es un anticuerpo humanizado basado en el anticuerpo monoclonal de ratón 9E4, que se dirige a un epítopo que incluye los restos 118-126 de la alfa-sinucleína, y que ahora está en ensayos clínicos en fase I. También se demostró que un anticuerpo C terminal 274 que se dirige a un epítopo que incluye los restos 120-140 de la alfa-sinucleína(Bae et al. 2012, J Neurosci. 2012 Sep 26;32(39):13454-69) tenía un efecto en un modelo preclínico sobre la propagación de la patología de una célula a otra. Además de estos, se ha demostrado que ciertos anticuerpos que se dirigen a especies conformacionales tales como oligómeros y fibrillas de la alfa-sinucleína pueden al menos reducir los niveles de estas especies de alfa-sinucleína supuestamente tóxicas (Lindstrom et al. 2014, Neurobiol Dis. 2014 Sep;69:134-43 and Spencer et al. 2014, Mol Ther. 2014 Oct;22(10):1753-67). También se demostró que estos anticuerpos conformacionales que reducen los niveles de oligómero de alfa-sinucleína in vivo, tales como mab47 se dirigen a epítopos en el extremo C de la alfa-sinucleína, en los aminoácidos 121-125 (documento US20120308572). Otros anticuerpos conformacionales específicos para fibrillas y oligómeros también se dirigen a secuencias C terminales (Vaikath et al. Neurobiol Dis. 2015;79:81-99).
Como se desconoce la forma tóxica de la alfa-sinucleína, idealmente un anticuerpo terapéutico podría unirse a la mayor parte de las especies de alfa-sinucleína que se forman por corte y empalme alternativo o modificaciones postraduccionales, tales como truncamientos, así como formas oligoméricas y fibrilares. Un problema que surge con los anticuerpos actuales que se han ensayado como agentes terapéuticos en modelos preclínicos, como se ha analizado anteriormente, es que muchos de ellos se dirigen a epítopos C terminales, que no se encuentran en algunas de las formas truncadas importantes de la alfa-sinucleína. Por ejemplo, los aminoácidos que son importantes para la unión de 9E4 son la asparagina 122 y la tirosina 125 (de acuerdo con una mutagénesis mediante alanina presentada en la patente US20140127131), y esto significa que este anticuerpo no puede unirse a la alfa-sinucleína que está truncada en los aminoácidos 119 y 122, que son algunas de las especies truncadas importantes en el tejido de un cerebro con Parkinson (Kellieet al.Sci Rep. 2014;4:5797). Lo mismo ocurriría para el anticuerpo 274 y el anticuerpo mab47 (documento US8,632,776). Además, los anticuerpos amino terminales posiblemente no podrían unirse a algunas de las especies truncadas importantes que carecen de los primeros aminoácidos de la alfa-sinucleína, tales como la alfa-sinucleína truncada en los aminoácidos 5 140. En el caso del anticuerpo 9E4, un mecanismo de acción sugerido es la prevención del truncamiento en los aminoácidos 119-122 en el espacio extracelular, ya que el anticuerpo se unirá a la misma región que la proteasa que escindirá la alfa-sinucleína(Gameset al.2014, J Neurosci. 2014 Jul 9;34(28):9441-54). También podría encontrarse un mecanismo de acción similar con anticuerpos con una alta proximidad de sitio, y por lo tanto sería de esperar que muchos anticuerpos alrededor de esta región tuvieran esta actividad.
Existe algún respaldo para un papel tóxico de las especies de alfa-sinucleína truncadas en modelos animales. Se ha demostrado que la expresión de la alfa-sinucleína truncada bajo el promotor de tirosina-hidroxilasa conduce a una patología nigroestriatal, que normalmente no se observa en modelos transgénicos de alfa-sinucleína (Tofariset al.2006, J Neurosci. 2006 Apr 12;26(15):3942-50; Wakamatsuet al.2006, Neurobiol Aging. 2008 Apr;29(4):574-85). Por ejemplo, la expresión de los aminoácidos 1-130 de una proteína alfa-sinucleína humana que tiene la mutación A53T causó pérdida embrionaria de neuronas dopaminérgicas en la parte compacta de la sustancia negra, mientras que la expresión de la proteína de longitud completa no lo hacía (Wakamatsu et al.
2006, Neurobiol Aging. 2008 Apr;29(4):574-85). La expresión de una molécula de alfa-sinucleína de 120 aminoácidos bajo el promotor de la proteína quinasa II alfa dependiente de calcio/calmodulina(CamKII-alfa) se asoció con la agregación de alfa-sinucleína y un déficit progresivo en ensayos de memoria asociada con la corteza-hipocampo que incluían el laberinto de Barnes y el reconocimiento de nuevos objetos (Hall et al. 2015, Exp Neurol. 2015 Feb;264:8-13). También en el modelo de AAV de rata, la coexpresión de alfa-sinucleína truncada en el extremo C potenciaba la patología inducida por alfa-sinucleína de longitud completa(Ulusoy et al.
2010, Eur J Neurosci. 2010 Aug;32(3):409-22).
En esta invención, se han generado anticuerpos (tal como "GM37", descrito en los Ejemplos) que pueden unirse al fragmento 1-119/122 tóxico de la alfa-sinucleína y neutralizar esta forma truncada de alfa-sinucleína. Los anticuerpos de la invención, tal como GM37, pueden unirse a otras formas oligoméricas de la alfa-sinucleína y alterar su captación por otras células residentes del SNC de una manera que reduce la propagación de la enfermedad. Además, se descubrió que, sorprendentemente, los anticuerpos de la invención tal como GM37, eran superiores a los anticuerpos de la técnica anterior tales como 9E4 en la unión a diferentes especies de alfasinucleína en cerebro humano, y tienen un efecto superior sorprendente sobre la eliminación de la alfa-sinucleína extracelular y la normalización de la transmisión sináptica alterada inducida por la presencia de alfa-sinucleína anómala in vivo. Ilustrando adicionalmente sus capacidades terapéuticas, los anticuerpos de la invención, tal como GM37, pueden prevenir la aparición de un fenotipo motor relacionado con enfermedades en un modelo de rata de enfermedad de Parkinson. Finalmente, los anticuerpos GM37 y GM285 pueden inhibir la iniciación de la agregación y fosforilación de la alfa-sinucleína endógena inducida por iniciadores de alfa-sinucleína patológica recombinante añadidos extracelulares en neuronas primarias de ratón. Los anticuerpos tales como<g>M37 y 285 también pueden inhibir la iniciación de la patología por alfa-sinucleína en neuronas dopaminérgicas in vivo usando un modelo de ratón de enfermedad de Parkinson, respaldando adicionalmente la capacidad terapéutica de estos anticuerpos para prevenir la propagación de la patología de una célula a otra. Conjuntamente, estos datos respaldan fuertemente el uso de estos nuevos anticuerpos, GM37 y GM285, como nuevos agentes terapéuticos capaces de modificar la enfermedad a través de la inhibición del mecanismo por el cual la patología se propaga entre las neuronas de los pacientes con Parkinson.
En un aspecto adicional de la divulgación se proporcionan 3 variantes de aminoácidos del anticuerpo GM37. Todas las variantes tienen lecturas funcionales similares a las del anticuerpo parental, GM37, pero con mejores propiedades para facilitar su fabricación. Las variantes reducen el riesgo de modificación postraduccional dentro del dominio de unión del anticuerpo GM37 y proporcionan algunas mejoras en la producción del anticuerpo. Esto es ventajoso porque la fabricación comercial o clínica a gran escala de anticuerpos es complicada y cara, y proporcionar un producto homogéneo en medicamentos farmacéuticos es crucial, en particular, en el caso de las inmunoglobulinas y proteínas.
Sumario de la invención:
La invención se define mediante las reivindicaciones adjuntas.
Las referencias a los métodos de tratamiento deben interpretarse como referencias a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia (o para el diagnóstico).
La invención se refiere a nuevos anticuerpos monoclonales capaces de unirse específicamente a un epítopo en los aminoácidos 112-117 de la alfa-sinucleína (SEQ ID NO:9(ILEDMP)). El epítopo que se une a los anticuerpos de la invención, tal como el anticuerpo ejemplar "GM37",, se denomina en el presente documento "epítopo 112 117". Los anticuerpos de la presente invención se unen específicamente a un epítopo dentro del epítopo 112-117 y, de acuerdo con una realización, pueden competir con el anticuerpo GM37 o GM285 por la unión a un epítopo en los aminoácidos 112-117. Por ejemplo, los anticuerpos de acuerdo con la invención pueden competir por la unión a un epítopo en los aminoácidos 112-117 de la alfa-sinucleína humana con una cadena pesada que consiste en un dominio variable deSEQ ID NO:7y una cadena ligera que consiste en un dominio variable deSEQ ID NO:8. Tal inhibición de la unión competitiva puede determinarse usando ensayos y métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo usando un ensayo de unión no marcado tal como resonancia de plasmón superficial (SPR). Por ejemplo, inmovilizando la alfa-sinucleína humana en una superficie e incubando con o sin el anticuerpo de referencia "GM37" antes de la incubación con un anticuerpo o fragmento de unión a ensayar. Como alternativa, puede usarse un enfoque de mapeo de pares, en el que el anticuerpo de referencia "GM37" se inmoviliza en la superficie, el antígeno alfa-sinucléina humano se une al anticuerpo inmovilizado, y después se ensaya un segundo anticuerpo con respecto a la capacidad de unión simultánea a la alfa-sinucleína humana(véase 'BIAcore® Assay Handbook', GE Healthcare Life Sciences, 29-0194-00 AA 05/2012).
Más específicamente, el anticuerpo GM285 se une a un epítopo dentro de los restos 112-117 de la alfasinucleína que comprende los restos 112-115 de la alfa-sinucleína(ILED;SEQ ID NO:19).
En la presente se describen el anticuerpo monoclonal GM37, sus variantes (por ejemplo, Variante 1 de GM37, Variante 2 de GM37 y Variante 3 de GM37) o GM285.
En particular, la divulgación proporciona un anticuerpo monoclonal GM37, sus variantes (por ejemplo, Variante 1 de GM37, Variante 2 de GM37 y Variante 3 de GM37) o GM285 e incluye dichos anticuerpos así como derivados de los mismos que poseen un número suficiente (por ejemplo 1, 2 o 3) CDR de cadena ligera y un número suficiente (por ejemplo, 1, 2 o 3) CDR de cadena pesada para formar un sitio de unión capaz de unirse específicamente a la sinucleína humana. Preferentemente, dichos anticuerpos poseerán las tres CDR de cadena ligera y tres CDR de cadena pesada, como se definen más adelante. La numeración de restos de aminoácido en esta región se realiza de acuerdo con IMGT®, the international ImMunoGeneTics information system® o, Kabat, E. A., Wu, T. T., Perry, H. M., Gottesmann, K. S. & Foeller, C. (1991). Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th edit., NlH Publication no. 91-3242 U.S. Department of Health and Human Services; Chothia, C. & Lesk, A. M. (1987). Canonical structures For The Hypervariable domains Of Immunoglobulins. J. Mol. Biol. 196, 901-917.
El anticuerpo monoclonal o fragmentos de unión a antígeno del mismo descritos en la presente pueden poseer un fragmento de unión al antígeno sinucleína que comprende o consiste en:
(a) una CDR1 de Cadena Pesada que tiene la secuencia de aminoácidos deSEQ ID NO:1; y/o
(b) una CDR2 de Cadena Pesada que tiene la secuencia de aminoácidos deSEQ ID NO:2; y/o
(c) una CDR3 de Cadena Pesada que tiene la secuencia de aminoácidos deSEQ ID NO:3; y/o
(d) una CDR1 de Cadena Ligera que tiene la secuencia de aminoácidos deSEQ ID NO:4; y/o
(e) una CDR2 de Cadena Ligera que tiene la secuencia de aminoácidos deSEQ ID NO:5; y/o
(f) una CDR3 de Cadena Ligera que tiene la secuencia de aminoácidos deSEQ ID NO:6; que es capaz de unirse específicamente a la alfa-sinucleína humana.
El anticuerpo monoclonal o fragmentos de unión a antígeno del mismo descritos en la presente pueden poseer un fragmento de unión al antígeno sinucleína que comprende o consiste en:
(a) una CDR1 de Cadena Pesada que tiene la secuencia de aminoácidos deSEQ ID NO:1;
(b) una CDR2 de Cadena Pesada que tiene la secuencia de aminoácidos deSEQ ID NO:33,34 o 35;(c) una CDR3 de Cadena Pesada que tiene la secuencia de aminoácidos deSEQ ID NO:3;
(d) una CDR1 de Cadena Ligera que tiene la secuencia de aminoácidos deSEQ ID NO:4;
(e) una CDR2 de Cadena Ligera que tiene la secuencia de aminoácidos deSEQ ID NO:5; y
(f) una CDR3 de Cadena Ligera que tiene la secuencia de aminoácidos deSEQ ID NO:6;
que es capaz de unirse específicamente a la alfa-sinucleína humana.
El anticuerpo monoclonal o fragmentos de unión a antígeno del mismo descritos en la presente pueden poseer un fragmento de unión al antígeno sinucleína que comprende o consiste en:
(a) una CDR1 de Cadena Pesada que tiene la secuencia de aminoácidos deSEQ ID NO:20; y/o
(b) una CDR2 de Cadena Pesada que tiene la secuencia de aminoácidos deSEQ ID NO:21; y/o
(c) una CDR3 de Cadena Pesada que tiene la secuencia de aminoácidos deSEQ ID NO:22; y/o
(d) una CDR1 de Cadena Ligera que tiene la secuencia de aminoácidos deSEQ ID NO:23; y/o
(e) una CDR2 de Cadena Ligera que tiene la secuencia de aminoácidos deSEQ ID NO:24; y/o
(f) una CDR3 de Cadena Ligera que tiene la secuencia de aminoácidos deSEQ ID NO:25.
que es capaz de unirse específicamente a la alfa-sinucleína humana.
El anticuerpo monoclonal o fragmentos de unión a antígeno del mismo descritos en la presente pueden poseer un fragmento de unión al antígeno sinucleína que comprende una secuencia de aminoácidos (en sus CDR, sus dominios variables, sus restos marco conservados o en sus dominios constantes) que difiere de la de los anticuerpos anti-alfa-sinucleína naturales, y que presenta (con respecto a dichos anticuerpos anti-alfa-sinucleína naturales):
(i) una diferencia en la afinidad de unión (KD) por la alfa-sinucleína;
(ii) una diferencia en la capacidad de inhibir el truncamiento por proteasa de fibrillas de alfa-sinucleína;
(iii) una diferencia en la capacidad de invertir la alteración en la transmisión sináptica basal en ratones transgénicos F28-snca;
(iv) una diferencia en la capacidad de reducir los niveles de alfa-sinucleína en el hipocampo de ratón, como se mide por microdiálisis in vivo; y/o
(v) una diferencia en la capacidad, cuando se administra de forma crónica, de restaurar la función motora en un modelo de rata de enfermedad de Parkinson
(vi) una diferencia en la capacidad de prevenir la iniciación de alfa-sinucleína (tal como la acumulación de alfasinucleína fosforilada insoluble in vitro y/o en un modelo de ratón de enfermedad de Parkinson); y/o
(vii) una diferencia en la capacidad de unirse a la alfa-sinucleína truncada en un cerebro humano.
Los anticuerpos de la invención pueden usarse en un método para tratar, diagnosticar u obtener imágenes de sinucleinopatías, tales como la enfermedad de Parkinson((PD) incluyendo formas idiopáticas y hereditarias de la enfermedad de Parkinson), Enfermedad Difusa con Cuerpos de Lewy (DLB), variante de enfermedad de Alzheimer con cuerpos de Lewy (LBV), enfermedad de Gauchers (GD), enfermedad Combinada de Alzheimer y Parkinson (CAPD), fallo autonómico puro y atrofia multisistema.
Breve descripción de los dibujos
LaFig. 1muestra protocolos de inmunización para la generación de hibridomas. La tabla indica las diferencias de los inmunógenos y cepas de ratón usadas para la identificación de GM37 y GM285. Se inmunizadon diferentes ratones HCo17-Balb/c y HCo12/Balb/c de forma independiente (la descripción de estos ratones se proporciona más adelante). El hibridoma que expresaba GM37 se identificó a partir de ratones inmunizados con la alfa-sinucleína de longitud completa que contenía fibrillas con los aminoácidos 1-140 y re-estimulados con fragmentos 1-60 de alfa-sinucleína truncada y 1-119 de alfa-sinucleína de longitud completa (FL) (SEQ ID NO 10). El hibridoma que expresaba el anticuerpo GM285 procedía de un protocolo de inmunización en el que se inmunizaron ratones HCo12-Balb/c con alfa-sinucleína monomérica de longitud completa, aminoácidos 1-140 seguido de una re-estimulación con alfa-sinucleína fibrilar de longitud completa (Ejemplo 1).
LaFig. 2 (Paneles A-C)muestra la exploración de GM37 para determinar la unión a alfa-sinucleína, homólogos y ortólogos de alfa-sinucleína.
A) Unión del anticuerpo GM37 a alfa-sinucleína usando un ELISA no basado en solución de lavado (FMAT). B) El uso de la unión SPR (Fortebio)del anticuerpo GM37 es específica para la alfa-sinucleína (Panel Alfa) y no se une a las otras proteínas relacionadas de la familia de la sinucleína, beta-sinucleína (Panel Beta) y gammasinucleína (Panel Gamma). Las mediciones se realizaron usando SPR (Fortebio Octetred). GM37 muestra una unión similar a la alfa-sinucleína de mono cynomolgus (Panel Cyno) y ratón (Panel de Ratón). (Ejemplo 1). C) Usando SPR (Fortebio Octetred), la unión del anticuerpo GM285 es específica para la alfa-sinucleína y no se une a las otras proteínas relacionadas de la familia de la sinucleína, beta-sinucleína y gamma-sinucleína. Las mediciones se realizaron usando SPR (Fortebio Octetred) y muestra una unión similar de GM285 a la alfasinucleína de mono cynomolgus (Cyno) y ratón (Ratón)(Ejemplo 1).
Fig. 3 (Paneles A-C)muestra la Afinidad de unión en tiempo real de GM37
A) Unión del anticuerpo GM37 a la alfa-sinucleína medida en RU (Unidades Relativas) (eje y) a lo largo del tiempo (eje X) determinada por SPR (BIAcore® 3000). Se inmovilizó IgG de cabra anti-humana en el chip de CM5. Se capturó GM37 en el chip con IgG de cabra anti-humana inmovilizada y se ensayaron series de concentraciones de alfa-sinucleína humana (3.125, 6.25, 12.5, 25, 50, 100 nM) tras la unión a la superficie. La superficie del sensor se regeneró entre cada ciclo.
B) Señal de unión a diferentes concentraciones convertida en una curva de unión.
C) Constantes de unión calculadas de anticuerpo GM37 (denominado hlgG1-6004-037-C106S) (Ejemplo 2).Fig. 4 (Paneles A-C)muestra la Afinidad de unión en tiempo real de GM285
A) Unión del anticuerpo GM285 a alfa-sinucleína medido en RU (eje y) a lo largo del tiempo (eje X) determinado por SPR (BIAcore® 3000). Se inmovilizó IgG de cabra anti-humana en el chip de CM5. Se capturó GM285 en el chip con IgG de cabra anti-humana inmovilizada y se ensayaron series de concentraciones de alfasinucleína humana (3.125, 6.25, 12.5, 25, 50, 100 nM) tras la unión a la superficie. La superficie del sensor se regeneró entre cada ciclo.
B) Señal de unión a diferentes concentraciones convertida en una curva de unión.
C) Constantes de unión calculadas de anticuerpo GM285 (denominado hlgG1-6004-285) (Ejemplo 2).
Fig. 5 (Paneles A-C)muestra la unión en tiempo real del anticuerpo comparador 9E4
A) Muestra la unión de 9E4 a alfa-sinucleína medida en RU (eje y) a lo largo del tiempo (eje X) determinado por SPR (BIAcore® 3000). Se inmovilizó IgG de cabra anti-humana en el chip de CM5. Se capturó 9E4 en el chip mediante su unión a IgG de Cabra anti-humana que se había inmovilizado en el chip. Se ensayó una serie de concentraciones de alfa-sinucleína humana (3.125, 6.25, 12.5, 25, 50, 100 nM) para determinar la unión a la superficie. La superficie del sensor se regeneró entre cada ciclo.
B) Señal de unión a diferentes concentraciones convertida en una curva de unión.
C) Constantes de unión calculadas para el anticuerpo 9E4. (Ejemplo 2).
LaFig. 6muestra la secuencia de aminoácidos de la alfa-sinucleína. Los sitios de truncamiento principales (indicados por flechas) se identificaron por espectrometría de masas en tejido cerebral humano (Kellie JF, Higgs RE, Ryder JW, Major A, Beach TG, Adler CH, Merchant K, Knierman MD. Quantitative measurement of intact alpha-synuclein proteoforms from post-mortem control and Parkinson's disease brain tissue by mass spectrometry. Sci Rep. 2014 Jul 23;4:5797. doi: 10.1038/srep05797)
LaFig. 7 (Paneles A-B)muestra el mapeo de epítopos del anticuerpo GM37 y GM285. Los datos del ELISA muestran niveles relativos de unión de los anticuerpos a péptidos secuenciales (20 meros) derivados de la secuencia de aminoácidos 95 - 132 de la alfa-sinucleína (los otros péptidos sin unión no se muestran).
A) El epítopo de GM37 requiere la secuencia peptídica ILEDMP (SEQ ID NO:9) para la unión completa. B) GM285 requiere el péptido ILED (SEQ ID NO:19) para la unión completa. (Ejemplo 3).
LaFig. 8 (Paneles A-B)muestra una representación esquemática de formas truncadas de la alfa-sinucleína. A) los epítopos de unión de GM37/285 (ILEDMP;SEQ ID NO:9) y 9E4 (NEAYE;SEQ ID NO:36) se muestran en negrita en la secuencia de aminoácidos de la alfa-sinucleína (s Eq ID NO:10). Las flechas indican los sitios de truncamiento C terminales de la Fig. 6.
B) Formas truncadas principales de alfa-sinucleína que se han identificado a partir de material cerebral humano. El tamaño basado en los números de aminoácidos se indica en el lado derecho. La alfa-sinucleína de longitud completa tiene 140 aminoácidos. Como puede deducirse de los epítopos, GM37, sus variantes 1-3 y GM285 se unirían a la proteína de longitud completa y a los fragmentos 1-119/122, 1-135. El anticuepro 9E4 solo se uniría a la longitud completa y el fragmento 1-135. No se muestra la naturaleza específica de los fragmentos C-terminales más pequeños que quedan después de los truncamientos.
LaFig. 9muestra que los anticuerpos GM37 y GM285 inmunoprecitan la alfa-sinucleína de longitud completa así como la alfa-sinucleína truncada de cerebro humano. Se incubaron homogeneizados brutos de cerebro humano DLB con anticuerpos de ensayo (Perlas (Sin anticuerpo), anticuerpo de control B12-IgG1 humana que no se une a la alfa-sinucleína, GM-37, variante 2 de GM37, GM-285 y 9E4 murino (m)) y el sobrenadante sometido a inmunoeliminación y el material inmunoprecipitado se separaron en SDS-PAGE. La transferencia de western muestra las bandas que representan las formas de longitud completa y las diferentes formas truncadas de alfa-sinucleína que se eliminan del sobrenadante y se inmunoprecipitan con los anticuerpos (IP). Como puede verse, los anticuerpos GM37, GM37v2 y GM285 eliminaron las especies principales de alfa-sinucleína del sobrenadante, y la IP muestra estas especies, las especies truncadas 1-135, 1-119/122 y la alfa-sinucleína de longitud completa. El 9E4 no afecta a la especie 1-119/122, sino solo a la especie de longitud completa de IP y a la especie 1-135 (Ejemplo 4).
LaFig. 10muestra esquemas de la proteolisis de fibrillas de alfa-sinucleínas escindidas por calpaína en el aminoácido 119/122. Se añaden fibrillas de alfa-sinucleína (PFF) al cultivo con (PFF+) o sin (PFF) anticuerpo de ensayo. La presencia de GM-37/285 inhibe la formación de la alfa-sinucleína truncada en las células y secretada al medio celular.
LaFig. 11Amuestra que GM37 inhibe la formación de la banda truncada (12KD) tanto en el medio como en lisados celulares de cultivos corticales primarios tratados con PFF. Las proteínas se separaron por SDS-PAGE y se sometieron a transferencia de western para detectar diferentes especies de alfa-sinucleína. En las células tratadas solo con PFF o el anticuerpo de control (B12) se detectan dos bandas monoméricas de alfa-sinucleína a 12 y 14 kDa, que representan la alfa-sinucleína truncada y de longitud completa respectivamente. En presencia de GM-37, solo hay una banda tenue a 12 Kd que indica que la mayor parte de la escisión se ha bloqueado. Este efecto también se refleja en el medio de las células. Los niveles relativos de acumulación también pueden inhibirse por la presencia de GM-37 como se refleja en la reducción de la intensidad relativa de la banda de 14 Kd. Como alternativa, puede haber una cantidad reducida de la banda de 14 Kd disponible para la captación por las células. (Ejemplo 5).
LaFig. 11Bmuestra la inhibición dependiente de la dosis de la proteolisis de fibrillas de alfa-sinucleína por anticuerpos GM37, variante 2 de GM37 y GM285. En lisados celulares de cultivos corticales primarios de ratón a baja concentración de anticuerpo (0.1 ug/ml), existe tanto una banda que representa la alfa-sinucleína de longitud completa (FL) como una banda que representa la alfa-sinucleína truncada en el extremo C (CT) (indicado por flechas). El aumento de la concentración de anticuerpo a 1, 5 y 10 ug/ml conduce a una proteolisis reducida de las fibrillas de alfa-sinucleína en las células. Esto se observa tanto con el anticuerpo GM37, como con GM37v2 y GM285. Se tratan muestras de control con un anticuerpo IgG1 humano B12 que no reconoce la alfa-sinucleína. También hay un control sin anticuerpo añadido (No ab), y células a las que no se les ha añadido fibrillas de alfa-sinucleína (No Asyn). La cantidad total de alfa-sinucleína también está reducida en las muestras tratadas con 37, 37v2 y 285 en comparación con B12 o el control "sin anticuerpo", lo cual indica que los tres anticuerpos reducen la acumulación de alfa-sinucleína en las células de una manera dependiente de la concentración. La banda de actina de la parte superior del gel muestra una carga igual de las muestras (Ejemplo 5).
LaFig. 12muestra el impacto de GM37 y GM285 sobre la iniciación de agregación de alfa-sinucleína y la fosforilación de alfa-sinucleína en neuronas corticales primarias de ratón.
12A) Ejemplo de imágenes de neuronas primarias teñidas para alfa-sinucleína fosforilada, que aparecen como manchas o tinciones punteadas en las células cuando las células se inducen con 1 ng de iniciadores puros o iniciadores brutos de alfa-sinucleína.
12B) Transferencia de western de proteínas de neuronas corticales primarias separadas en fracciones solubles e insolubles. Las transferencias se tiñeron con anticuerpo específico para alfa-sinucleína humana (4B12/H a-syn), un anticuerpo específico para fosfo-Ser-129-alfa-sinucleína (ab51253/pS-a-Syn) y un anticuerpo específico para alfa-sinucleína de ratón (D37A2/M a-syn) y muestran que la adición de los iniciadores en bruto en neuronas primarias conduce a la acumulación de alfa-sinucleína endógena de ratón y alfa-sinucleína fosforilada y multímeros de mayor peso molecular de alfa-sinucleína en la fracción insoluble.
12C) GM37, la variante 2 de GM37 y GM285 inhiben la aparición de alfa-sinucleína fosforilada cuantificada como el número de puntos positivos para alfa-sinucleína fosfoserina 129 en las células por un microscopio automático Cellomics ARRAYSCAN™. GM37, GM37v2 y GM285 reducen la cantidad de manchas de alfa-sinucleína fosforilada en las células de una forma dependiente de la dosis.
12D) La transferencia de western de los homogeneizados de neuronas corticales primarias tratadas a la máxima dosis de anticuerpo (133 nM) y teñidas para actina, alfa-sinucleína humana, alfa-sinucleína fosforilada, y alfasinucleína de ratón demuestra que los anticuerpos 37, 37v2 y 285 inhiben el truncamiento de los iniciadores en bruto de la alfa-sinucleína captados por las células en la fracción insoluble. Todos los anticuerpos también inhiben la acumulación de alfa-sinucleína fosforilada, endógena de ratón y multímeros de mayor peso molecular de alfa-sinucleína de ratón fosforilada en la fracción insoluble. La banda de actina en la parte superior del gel muestra que la carga de las muestras es igual (Ejemplo 6).
LaFig 13muestra la transmisión sináptica basal en la sinapsis colateral de Schaffer-CA1 en el hipocampo de ratones transgénicos F28-snca y ratones de control de edad similar. Se evocaron potenciales excitadores postsinápticos de campo (fEPSP) por un solo estímulo aplicado en la vía colateral de Schaffer, y la transmisión sináptica basal se evaluó midiendo la pendiente de fEPSP en función de la intensidad de la estimulación. La plasticidad sináptica a corto plazo se evaluó por la inducción de la facilitación por pulsos pareados. Las diferentes intensidades de estimulación fueron 0, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 4O0 y 500 |<j>A, y se aplicaron sucesivamente en orden creciente, con 2 a 3 repeticiones para cada intensidad. Se observó que la transmisión sináptica basal se deterioraba significativamente en ratones transgénicos F28-snca que sobreexpresaban la alfasinucleína de tipo silvestre en comparación con los ratones de control de edad similar (Ejemplo 7).
LaFig 14muestra el efecto de la administración sistémica de una sola dosis de 9E4 humano (15 mg/kg, i.p.) sobre el deterioro de la transmisión sináptica basal en la sinapsis colateral de Schaffer-CA1 en el hipocampo de ratones transgénicos F28-snca. Se evocaron potenciales excitadores postsinápticos de campo (fEpSP) por un solo estímulo aplicado en la vía colateral de Schaffer, y la transmisión sináptica basal se evaluó midiendo la pendiente de fEPSP en función de la intensidad de estimulación. El tratamiento agudo con h9E4 indujo una versión significativa del deterioro en la transmisión sináptica basal en ratones transgénicos F28-snca (Tg-snca h9E4 vs. Tg-snca PBS, p=0.002). Sin embargo, la inversión por h9E4 solo era parcial, como se indica por una transmisión sináptica basal significativamente menor en comparación con los compañeros de camada tratados con PBS (p=0.007) (Ejemplo 7).
LaFig 15muestra el efecto de la administración sistémica de una sola dosis de GM37 humano (15 mg/kg, i.p) o un anticuerpo de control de isotipo (B12) sobre el deterioro en la transmisión sináptica basal en la sinapsis colateral de Schaffer-CA1 en el hipocampo de ratones transgénicos F28-snca. Se evocaron potenciales excitadores postsinápticos de campo (fEPSp) por un solo estímulo aplicado en la vía colateral de Schaffer, y la transmisión sináptica basal se evaluó midiendo la pendiente de fEPSP en función de la intensidad de estimulación. El tratamiento agudo con GM37 indujo la inversión completa del deterioro en la transmisión sináptica basal en ratones transgénicos F28-snca (Tg-snca GM37 vs. Tg-snca B12, p=0.004) (Ejemplo 7). LaFig 16muestra el efecto de la administración sistémica de una sola dosis de GM285 humano (15 mg/kg, i.p.) sobre el deterioro en la transmisión sináptica basal en la sinapsis colateral de Schaffer-CA1 en el hipocampo de ratones transgénicos F28-snca. Se evocaron potenciales excitadores postsinápticos de campo (fEPSP) por un solo estímulo aplicado a la vía colateral de Schaffer, y la transmisión sináptica basal se evaluó midiendo la pendiente de fEPSP en función de la intensidad del estímulo. El tratamiento agudo con GM285 indujo la inversión completa del deterioro en la transmisión sináptica basal en ratones transgénicos F28-snca (Tg-snca GM285 vs. Tg-snca B12, p=0.001) (Ejemplo 7).
LaFig 17 (Paneles A-B)muestra el efecto de la administración sistémica (15 mg/kg, i.p.) de 9E4 humano, GM37 o el anticuerpo de control de isotipo (anti-HEL) sobre los niveles de alfa-sinucleína humana en el fluido intersticial (isf) del hipocampo de ratones transgénicos F28-snca que se mueven libremente. La media de los dos-tres valores basales (4h-6h) antes del tratamiento del anticuerpo se consideró el punto inicial y se fijó al 100% para cada animal. Las diferencias se analizaron usando un análisis de varianza (ANOVA) de dos vías con medidas repetidas. Los niveles basales de alfa-sinucleína humana en el hipocampo fueron 8.1 ± 1.1 ng/ml (media ± SEM, n = 25, sin corregir para la recuperación de la sonda de diálisis in vitro). La administración de GM37 indujo una mayor reducción en la alfa-sinucleína humana en el hipocampo de ratones F28 en comparación con el anticuerpo comparador, 9E4 humano y el isotipo de control, anti-HEL. Los puntos de tiempo que muestran diferencias significativas en los niveles de alfa-sinucleína entre los animales tratados con GM37 o el anticuerpo de control se indican por un asterisco. (Ejemplo 8).
LaFig 18muestra una representación esquemática de la escala de tiempo para el tratamiento con anticuerpo (flechas hacia abajo), inyecciones virales y evaluación del comportamiento en el modelo de alfa-sinucleína humana AAV de rata mostrada en laFig. 19(Ejemplo 9).
LaFig 19muestra que el anticuerpo GM37 puede reducir los déficits motores del Parkinson después del tratamiento crónico en el modelo AAV de rata. El efecto del tratamiento crónico con GM37 o PBS en ratas AAV-alfa-sinucleína humana sobre la asimetría motora se evalúa en el ensayo del cilindro. En cada rata se ensayó el uso de las patas anteriores mediante una supervisión durante 5 minutos. El porcentaje de uso de la pata anterior derecha (ipsilateral con respecto la inyección) y el uso de la izquierda (patas anteriores contralateral+ derecha) se calculó para cada animal (como se muestra en el eje y) *, ** p<0.05 y 0.01 en comparación con la rata GFP-PBS. Las ratas tratadas con PBS siguen teniendo una asimetría significativa en el uso de la pata, mientras que los animales tratados con el anticuerpo GM37 ya no tienen un déficit significativo. (Ejemplo 9).
LaFig 20A-20Cmuestra que el tratamiento crónico con anticuerpo GM37 puede reducir la fosforilación patológica de la alfa-sinucleína inducida por inyección de iniciadores fibrilares de alfa-sinucleína patológica en el estridado de ratón. La Figura 20A muestra un esquema que indica los tiempos de tratamiento relativos con respecto a la inyección de iniciadores y recuento de células. El anticuerpo GM37 se administró un día antes de la inyección de iniciadores fibrilares de alfa-sinucleína recombinantes en el estriado dorsal de ratones, y después semanalmente durante seis semanas. El régimen de dosificación fue 15 mg/kg iv o 30 mg/kg ip. La Fig 20B muestra el nivel de exposición de GM37 en plasma basado en el sitio de inyección y la dosis. Se tomaron muestras semanales antes de la inyección de una nueva dosis de anticuerpo. La Fig 20C muestra el nivel de exposición de GM37 en csf basado en la dosis y el sitio de inyección al final del estudio. La Fig 20D compara el número de células con inclusiones positivas de alfa-sinucleína fosforilada contadas en una de cada seis secciones en la sustancia negra después del tratamiento con GM37 o control de PBS. Los ratones tratados con GM37 tanto a 15 mg/kg iv como a 30 mg/kg ip tuvieron una reducción significativa en las células con inclusiones de alfa-sinucleína fosforilada en comparación con los ratones tratados con PBS.(Ejemplo 10).
LaFig 21muestra el alineamiento de proteínas sinucleína humanas a (SEQ ID NO:10), p (SEQ ID NO:37) y<y>(SEQ ID NO:38). Los restos de aminoácido diferentes de la alfa-sinucleína están destacados. Los huecos están indicados con un punto. Los números SwissProt están entre paréntesis.
LaFig 22muestra el alineamiento de ortólogos de alfa-sinucleína (mono Cynomolgus,SEQ ID NO:39; Rata,SEQ ID NO:40; RatónSEQ ID NO:41). Los restos de aminoácido diferentes de alfa-sinucleína humana (SEQ ID NO:10) están destacados. Los números SwissProt se muestran entre paréntesis.
LaFig 23muestra la expresión transitoria de GM37 (denominado GM37 de tipo silvestre (wt) y 3 variantes de GM37, denominadas var 1, 2 y 3 de GM37. El asterisco indica que los datos se han determinado después de la purificación en proteína A y la neutralización. f indica que los datos se han calculado a partir del rendimiento conseguido después de la proteína A y neutralización en relación con la escala del cultivo de expresión (0.4 l). LaFig 24muestra un ELISA competitivo que mide la unión de cuatro anticuerpos GM37 wt, GM37 var 1, GM37 var 2 y GM37 var 3 a la alfa-sinucleína humana. Se usan placas revestidas con alfa-sinucleína para detectar la cantidad de anticuerpo que queda después de la preincubación en solución de cada anticuerpo (0.3 |jg/ml) con una concentración creciente de alfa-sinucleína (0-1000 nM). Los cuatro anticuerpos muestran una unión similar a la alfa-sinucleína.
LaFig 25muestra una tabla que compara los parámetros cinéticos de tasa de unión de GM37wt y variantes 1-3 a la alfa-sinucleína humana recombinante inmovilizada. La unión se midió usando SPR y las tasas se determinaron usando un algoritmo de unión 1:1 (BIAcore® T200).
LaFig. 26compara el efecto de anticuerpos contra la alfa-sinucleína sobre los niveles de alfa-sinucleína fosforilada en neuronas primarias murinas tratadas con iniciadores fibrilares de alfa-sinucleína patológica. Se trataron neuronas primarias con iniciadores (10 ng) en presencia o ausencia de cuatro GM37, GM37 var 1, GM37 var 2 y GM37 var 3 (2 jg). Las neuronas se fijaron y tiñeron después de 3 semanas y se analizaron por Cellomics ARRAYSCAN™ para las manchas positivas para alfa-sinucleína fosfo serina 129. Las células tratadas con iniciadores solo o con iniciadores más el anticuerpo de control de isotipo (B12) muestran niveles de fosforilación aumentados significativamente. Las células tratadas con GM37wt y las 3 variantes pueden inhibir la fosforilación de la alfa-sinucleína, y todas ellas muestran el mismo nivel de fosforilación que las células que no recibieron los iniciadores. Los datos se muestran como media ±SD, como se determina a partir de siete imágenes por pocillo en cinco pocillos. N=2.
LaFig 27compara la agregación dependiente de la temperatura de GM37 wt, var1, var2 y var3. Una muestra de cada uno de los anticuerpos se sometió a un aumento estacionario de temperatura a lo largo del tiempo y se midió simultáneamente el nivel de agregación por dispersión de luz en múltiples ángulos (Prometheus NT.48, NanoTemper Technologies). La temperatura para el inicio de la agregación es similar para GM37 y las variantes de GM37, sin embargo, se observó el menor nivel de agregación para GM37-Var2.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Definiciones
Como se usa en el presente documento, la expresión "alfa-sinucleína" es sinónimo de "la proteína alfasinucleína" y se refiere a cualquiera de las isoformas de proteína alfa-sinucleína (identificadas, por ejemplo, en UniProt como P37840, 1-3). La numeración de aminoácidos de la alfa-sinucleína se proporciona con respecto a laSEQ ID NO:10como se muestra más adelante, siendo la metionina (M) el resto de aminoácido 1:
SEQ ID NO:10:
MDVFMKGLSK AKEGVVAAAE KTKQGVAEAA GKTKEGVLYV GSKTKEGVVH GVATVAEKTK EQVTNVGGAV VTGVTAVAQK TVEGAGSIAA ATGFVKKDQL GKNEEGAPQE GILEDMPVDP DNEAYEMPSE EGYQDYEPEA
La presente invención se refiere a anticuerpos como se reivindican que son capaces de unirse específicamente a la alfa-sinucleína, y en particular a la alfa-sinucleína humana. En particular, los anticuerpos presentan la capacidad de unirse específicamente a un epítopo en 112-117 de la alfa-sinucleína humana.
El término "anticuerpo" (Ac) como se usa en la presente se refiere a una molécula de inmunoglobulina o un fragmento de una molécula de inmunoglobulina que tiene la capacidad de unirse específicamente a un epítopo de una molécula ("antígeno"). Los anticuerpos de origen natural comprenden típicamente un tetrámero que, normalmente está compuesto de al menos dos cadenas pesadas (H, de "heavy") y al menos dos cadenas ligeras (L, de "light"). Cada cadena pesada está compuesta por una región variable de cadena pesada (abreviada en el presente documento como VH) y un dominio constante de cadena pesada, normalmente compuesta de tres dominios (CH1, CH2 y CH3). Las cadenas pesadas pueden ser de cualquier isotipo, incluyendo IgG (subtipos IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4), IgA (subtipos IgA1 e IgA2), IgM e IgE. Cada cadena ligera está compuesta por un dominio variable de cadena ligera (abreviada en el presente documento como VL) y un dominio constante de cadena ligera (CL). Las cadenas ligeras incluyen cadenas kappa y cadenas lambda. El dominio variable de cadena pesada y ligera típicamente es responsable del reconocimiento del antígeno, mientras que el dominio constante de cadena pesada y ligera puede mediar la unión de la inmunoglobulina a tejidos o factores del hospedador, incluyendo diversas células del sistema inmunitario (por ejemplo, células efectoras) y el primer componente (C1q) del sistema del complemento clásico. Las regiones VH y VL pueden subdividirse adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, denominadas "regiones determinantes de complementariedad", que están intercaladas con regiones de secuencia más conservada, denominadas "regiones marco conservadas" (FR. Cada VH y VL está compuesta por tres dominios de CDR y cuatro dominios de FR dispuestos desde el extremo amino hasta el extremo carboxilo en el siguiente orden: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. Los dominios variables de las cadenas pesada y ligera contienen un dominio de unión que interacciona con un antígeno. Son de particular relevancia los anticuerpos y sus fragmentos de unión a antígeno que se han "aislado" de forma que existen en un medio físico distinto de aquel en el que pueden existir en la naturaleza o que se han modificado de tal forma que difieren de un anticuerpo natural en la secuencia de aminoácidos.
El término "epítopo" significa un determinante antigénico capaz de unirse de forma específica a un anticuerpo. Los epítopos suelen consistir en agrupamientos superficiales de moléculas tales como cadenas laterales de aminoácidos o azúcar y suelen tener características estructurales tridimensionales, así como características específicas de carga. Los epítopos conformacionales y lineales se distinguen en que la unión al primero, pero no al segundo, siempre se pierde en presencia de disolventes desnaturalizantes. El epítopo puede comprender restos de aminoácido implicados directamente en la unión y otros restos de aminoácido que no están implicados directamente en la unión, tales como restos de aminoácido que se bloquean eficazmente por el péptido que se une al antígeno específicamente(en otras palabras, el resto de aminoácido está dentro de la huella del péptido que se une al antígeno específicamente). La expresión "epítopo 112-117" se refiere a una región de la alfasinucleína humana que contiene al menos 4 de los 6 restos de aminoácido de la alfa-sinucleína humana 112-117, sin que dicho epítopo incluya ningún resto de 1-111 (incluyendo cualquier resto de 106-111) de la alfa-sinucleína humana, ni ningún resto de 118-140 (incluyendo los restos 118-120) de la alfa-sinucleína humana. Como se usa en el presente documento, se dice que un anticuerpo es capaz de unirse específicamente a un epítopo en el "epítopo 112-117" si es capaz de unirse específicamente a la alfa-sinucleína humana por unión de al menos 4 de los 6 restos de aminoácido del epítopo 112-117.
Como se usa en el presente documento, la expresión "fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo" significa un fragmento, porción, región o dominio de un anticuerpo (independientemente de como se produce (por ejemplo, mediante escisión, de forma recombinante, por síntesis, etc.)) que es capaz de unirse específicamente a un epítopo, y de esta manera la expresión "unión a antígeno" pretende hacer referencia a lo mismo que "unión a un epítopo" de forma que, por ejemplo, un "fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo" pretende ser igual que un "fragmento de unión a epítopo de un anticuerpo". Un fragmento de unión a antígeno puede contener 1, 2, 3, 4, 5 o los 6 Dominios CDR de dicho anticuerpo y, aunque es capaz de unirse específicamente a dicho epítopo, puede presentar una especificidad, afinidad o selectividad hacia dicho epítopo que difiera de la de dicho anticuerpo. Preferentemente, sin embargo, un fragmento de unión a antígeno contendrá los 6 dominios CDR de dicho anticuerpo. Un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo puede ser parte, o comprender, una sola cadena polipeptídica (por ejemplo, un scFv), o puede ser parte de, o comprender, dos o más cadenas polipeptídicas, teniendo cada una un extremo amino y un extremo carboxilo (por ejemplo, un diacuerpo, un fragmento Fab, un fragmento Fab2,etc.).Pueden obtenerse fragmentos de anticuerpos que presentan capacidad de unión a antígeno, por ejemplo, mediante escisión por proteasa de anticuerpos intactos. Más preferentemente, sin embargo, los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH se codifican naturalmente por genes separados, o los polinucleótidos que codifican dichas secuencias génicas (por ejemplo, su ADNc codificante) pueden unirse usando métodos recombinantes por un enlazador flexible que les permite fabricarse como una sola cadena de proteína en la que las regiones VL y VH se asocian para formar moléculas de unión a antígeno monovalentes (conocidos como Fv monocatenarios (scFv); véase, por ejemplo, Birdet al., (1988) Science 242:423-426; y Hustonet al.(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. (EE.u U.) 85:5879-5883). De forma alternativa, empleando un engarzador flexible que sea demasiado corto (p. ej., menos de alrededor de 9 restos) para permitir que las regiones VL y VH de un único polipéptido se asocien juntas, uno puede formar un anticuerpo, diacuerpo, o molécula similar, biespecífico (en el que dichas dos cadenas de polipéptido se asocian juntas para formar una molécula bivalente de unión a antígeno) (véase por ejemplo PNAS EE.UU. 90(14), 6444-8 (1993) para una descripción de los diacuerpos). Los ejemplos de fragmentos de unión a antígeno incluidos dentro de la presente invención incluyen (i) un fragmento Fab' o Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios VL, VH, CL y CH1, o un anticuerpo monovalente como se describe en el documento WO2007059782; (ii) fragmentos F(ab')2, fragmentos bivalentes que comprenden dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en el dominio de bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste esencialmente en los dominios VH y CH1; (iv) un fragmento Fv que consiste esencialmente en los dominios VL y VH, (v) un fragmento dAc de anticuerpo (Ward et al., Nature 341, 544-546 (1989)), que consiste esencialmente en un dominio VH y también denominado anticuerpos de dominio (Holt et al; Trends Biotechnol. 2003 nov;2i(ll):484-90); (vi) anticuerpos de camélido o nanocuerpos (Revets et al; Expert Opin Biol Ther. 2005 Jan; 5_(l): l ll-24) y (vii) una región determinante de complementariedad (CDR) aislada. Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, se codifican por genes separados, pueden unirse, usando métodos recombinantes, por un enlazador sintético que permite que se fabriquen como una sola cadena de proteína en la que las regiones VL y VH se emparejan para formar moléculas monovalentes (conocidas como anticuerpos monocatenarios o Fv monocatenarios (scFv); véase por ejemplo Bird et al., Science 242, 423-426 (1988) y Huston et al., PNAS USA 85, 5879-5883 (1988)). Estos y otros fragmentos de anticuerpo útiles se discuten adicionalmente en el presente documento. También debería entenderse que el término anticuerpo, a menos que se especifique otra cosa, también incluye polipéptidos de tipo anticuerpo, tales como anticuerpos quiméricos y anticuerpos humanizados, y fragmentos de anticuerpo que conservan la capacidad de unirse de forma específica al antígeno (fragmentos de unión a antígeno) proporcionados mediante cualquier técnica conocida, tal como escisión enzimática, síntesis de péptido y técnicas recombinantes. Un anticuerpo generado puede poseer cualquier isotipo. Como se usa en el presente documento "isotipo" se refiere a la clase de inmunoglobulina (por ejemplo IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE, o IgM) que se codifica por genes de dominio constante de cadena pesada. Dichos fragmentos de anticuerpo se obtienen usando técnicas convencionales conocidas por los expertos en la técnica; la utilidad de los fragmentos adecuados capaces de unirse a un epítopo deseado puede explorarse fácilmente de la misma manera que un anticuerpo intacto.
La expresión "anticuerpo biespecífico" se refiere a un anticuerpo que contiene dos fragmentos de unión a antígeno independientes que se dirigen cada uno a dianas independientes. Estas dianas pueden ser epítopos presentes en diferentes proteínas o diferentes epítopos presentes en la misma diana. Pueden obtenerse moléculas de anticuerpo biespecíficas usando cambios de aminoácidos compensatorios en los dominios constantes de las HC de las moléculas de anticuerpo bivalentes monoespecíficas parentales. El anticuerpo heterodimérico resultante contiene un Fab aportado a partir de dos anticuerpos monoespecíficos parentales diferentes. Los cambios de aminoácidos en el dominio Fc conducen a una mayor estabilidad del anticuerpo heterodimérico con biespecificidad que es estable a lo largo del tiempo. (Ridgway et al., Protein Engineering 9, 617-621 (1996), Gunasekaran et al., JBC 285, 19637-1(2010), Moore et al., MAbs 3:6546-557 (2011), Strop et al., JMB 420, 204-219 (2012), Metz et al., Protein Engineering 25:10 571-580 (2012), Labrijn et al., PNAS 110:113, 5145 -5150 (2013), Spreter Von Kreudenstein et al., MAbs 5:5 646-654 (2013)). Los anticuerpos biespecíficos también pueden incluir moléculas que se generan usando fusiones de ScFv. Dos scfv monoespecíficos entonces se unen independientemente a dominios Fc capaces de formar heterodímeros estables para generar una sola molécula biespecífica (Mabry et al., PEDS 23: 3115-127 (2010). Las moléculas biespecíficas tienen capacidades de unión dobles. Por ejemplo, la dirección tanto a una diana terapéutica como a un receptor de la superficie que interviene en la transcitosis con el objetivo de liberar un anticuerpo terapéutico a través de la barrera hematoencefálica para tratar una enfermedad en el SNC.
Los términos GM37, GM-37, GM37 de tipo silvestre (wt), mab37 y 6004-37 se usan indistintamente en el presente documento y todos ellos se refieren al mismo anticuerpo.
El término anticuerpo GM37 pretende incluir un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende o consiste en la Cadena Pesada como se proporciona en las CDR1-3SEQ ID Nos:1-3y la Cadena Ligera CDR1-3 como se proporciona en laSEQ ID Nos:4-6. El anticuerpo GM37 o fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender o consistir en el dominio variable de cadena pesada deSEQ ID NO 7y/o el dominio variable de cadena ligera deSEQ ID NO:8. Por ejemplo, el anticuerpo g M37 puede ser un anticuerpo IgG que comprende una cadena pesada que consiste en un dominio variable deSEQ ID NO:7y un dominio constante deSEQ ID NO:18junto con una cadena ligera que consiste en un dominio variable deSEQ ID NO:8y un dominio constante kappa deSEQ ID NO:17.
La desaminación de proteínas, y en este caso de anticuerpos, puede producirse de forma espontánea durante la fabricación y almacenamiento, pero también in vivo, y hace que la calidad del medicamento farmacéutico final sea difícil de controlar. La desaminación puede afectar también en algunos casos a la actividad de la molécula. La desaminación se produce en restos de asparagina, pero la localización de la asparagina relevante puede ser difícil de predecir con certeza, y puede verse influenciada en algunos casos por un motivo de asparagina-glicina. En al anticuerpo GM37 se encuentran varios motivos de desaminación posibles, sin embargo, se observó que un sitio probable de desaminación era el resto 54 de la cadena pesada. La sustitución posterior de asparagina por otro aminoácido no es directa, pero se observó que 3 variantes de GM37 (variantes (var) 1, 3 y 3 de GM37) retenían la actividad del GM37 original (GM37 de tipo silvestre (wt)).
El término variantes de GM37 se refiere a las variantes 1, 2 o 3 desaminadas, donde la variante 1 tiene una sustitución N54S, la variante 2 tiene una sustitución N54Q y la variante 3 tiene una N54H en comparación con el anticuerpo GM37 descrito anteriormente en el presente documento.
Las variantes (var) 1, 2 y 3 del anticuerpo GM37, por lo tanto, pretenden incluir un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende o consiste en la Cadena Pesada proporcionada en las CDR1 y 3SEQ ID Nos:1 y 3de GM 37 y las CDR1-3 de Cadena Ligera de GM37 como se proporcionan en laSEQ ID Nos:4-6, pero que difieren en su CDR2 de cadena pesada de forma que la variante 1 tiene la CDR2 deSEQ ID NO:33, la variante 2 tiene la CDR 2 deSEQ ID NO:34y la variante 3 tiene la CDR 2 deSEQ ID NO:35.
Las variantes del anticuerpo GM37 o sus fragmentos de unión a antígeno pueden comprender o consistir en el dominio variable de cadena pesada deSEQ ID NO 30, 31 y 32 para las variantes 1, 2 y 3 respectivamente, y el dominio variable de cadena ligera deSEQ ID NO:8. El anticuerpo GM37 puede ser un anticuerpo IgG que comprende una cadena pesada que consiste en un dominio variable deSEQ ID NO:30, 31 o 32 y un dominio constante deSEQ ID NO:18junto con una cadena ligera que consiste en un dominio variable deSEQ ID NO:8y un dominio constante kappa deSEQ ID NO:17.
Los términos GM-285, GM-285, mab285 y 6004-285 se usan indistintamente en el presente documento y todos ellos se refieren al mismo anticuerpo.
La expresión anticuerpo GM2850 pretende incluir un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende o consiste en la Cadena Pesada proporcionada en las CDR1-3SEQ ID Nos:20-22y la CDR1-3 de Cadena Ligera proporcionada en laSEQ ID Nos:23-25. El anticuerpo GM37 o fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender o consistir en el dominio variable de cadena pesada deSEQ ID NO 26y/o el dominio variable de cadena ligera deSEQ ID NO:27. Por ejemplo, el anticuerpo GM37 puede ser un anticuerpo IgG que comprende una cadena pesada que consiste en un dominio variable deSEQ ID NO:26y un dominio constante deSEQ ID NO:28junto con una cadena ligera que consiste en un dominio variable deSEQ ID NO:27y un dominio constante kappa deSEQ ID NO:29.
El anticuerpo GM285 se une específicamente a un epítopo en la secuencia 112-115 (ILED;SEQ ID NO:19) de la alfa-sinucleína humana (SEQ ID NO:10).
A menos que se especifique otra cosa en el presente documento, la numeración de restos de aminoácido de esta región está de acuerdo con IMGT®, the international ImMunoGeneTics information system® o, Kabat, E. A., Wu, T. T., Perry, H. M., Gottesmann, K. S. & Foeller, C. (1991). Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th edit., NIH Publication no. 91-3242 U.S. Department of Health and Human Services. Chothia, C. & Lesk, A. M. (1987). Canonical structures for the hypervariable domains of immunoglobulins. J. Mol. Biol. 196, 901-917).
Un "anticuerpo anti-alfa-sinucleína" o "anticuerpo contra alfa-sinucleína" (usados indistintamente en el presente documento, dependiendo del contexto en el que se escriba) es un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a la alfa-sinucleína o un fragmento de alfa-sinucleína como se ha definido anteriormente en el presente documento, en particular la secuencia de la alfa-sinucleína que correseponde a la SEQ ID NO 9 y/o 19.
La expresión "anticuerpo humano" (que puede abreviarse como "humAb" o "HuMab"), como se usa en el presente documento, pretende incluir anticuerpos que tienen dominios variables y constantes derivados de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. Los anticuerpos humanos de la invención pueden incluir restos de aminoácido no codificados por secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria o dirigida in vitro o durante transposición génica o por mutación somática in vivo).
Las expresiones "anticuerpo monoclonal" o "composición de anticuerpo monoclonal", como se usan en el presente documento, se refieren a una preparación de moléculas de anticuerpo de una sola composición molecular. Una composición de anticuerpo monoclonal convencional presenta una sola especificidad de unión y afinidad por un epítopo particular. En ciertas realizaciones, un anticuerpo monoclonal puede estar compuesto por más de un dominio Fab aumentando de esta manera la especificidad por más de una diana. Las expresiones "anticuerpo monoclonal" o "composición de anticuerpo monoclonal" no deben considerarse limitadas por ningún método de producción particular (por ejemplo, recombinante, transgénico, hibridoma, etc.).
El término "humanizado" se refiere a una molécula, generalmente preparada usando técnicas recombinantes, que tiene un sitio de unión a antígeno derivado de una inmunoglobulina de una especie no humana y una estructura de inmunoglobulina restante basada en la estructura y/o secuencia de una inmunoglobulina humana. El sitio de unión a antígeno puede comprender, bien dominios variables de anticuerpo no humano completos fusionados a dominios humanos constantes, o bien solo las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de dichos dominios variables injertados en regiones marco conservadas humanas apropiadas de dominios variables humanos. Los restos de regiones marco conservadas de dichas moléculas humanizadas pueden ser no modificados (p. ej., totalmente humanos) o pueden modificarse para contener una o más sustituciones de aminoácido que no se encuentran en el anticuerpo humano cuya secuencia ha servido como la base para la humanización. La humanización reduce o elimina la probabilidad de que un dominio constante de la molécula actúe como inmunógeno en los individuos humanos, pero se conserva la posibilidad de una respuesta inmunitaria frente al dominio variable extraño (LoBuglio, A.F.et al.(1989)"Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man: Kinetics And Immune Response,"Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:4220-4224). Otro enfoque se centra no solo en proporcionar dominios constantes derivados de humano, sino modificar los dominios variables así como reformarlos de forma que se parezcan lo máximo posible a la forma humana. Se sabe que los dominios variables tanto de las cadenas pesadas como de las cadenas ligeras contienen tres regiones determinantes de complementariedad (CDR) que varían en respuesta a los antígenos en cuestión y determinan la capacidad de unión, flanqueadas por cuatro regiones marco conservadas (FR) que están relativamente conservadas en una especie dada y que supuestamente proporcionan un armazón para las CDR. Cuando se preparan anticuerpos no humanos con respecto a un antígeno particular, los dominios variables pueden "reformarse" o "humanizarse" injertando CDR derivadas de un anticuerpo no humano en las FR presentes en el anticuerpo humano a modificar. La aplicación de este enfoque a diversos anticuerpos se ha notificaod por Sato, K.et al.(1993) Cancer Res 53: 851-856. Riechmann, L.et al.(1988)“Reshaping Human Antibodies for Therapy,’’Nature 332:323-327; Verhoeyen, M.et al.(1988)“Reshaping Human Antibodies: Grafting An Antilysozyme Activity,’’Science 239:1534-1536; Kettleborough, C. A.et al.(1991)“Humanization Of A Mouse Monoclonal Antibody By CDR-Grafting: The Importance Of Framework Residues On Loop Conformation,’’Protein Engineering 4:773-3783; Maeda, H.et al.(1991)“Construction Of Reshaped Human Antibodies With HIV-Neutralizing Activity,’’Human Antibodies Hybridoma 2:124-134; Gorman, S. D.et al.(1991)“Reshaping A Therapeutic CD4 Antibody,’’Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:4181-4185; Tempest, P.R.et al.(1991)“Reshaping A Human Monoclonal Antibody To Inhibit Human Respiratory Syncytial Virus Infection in vivo,"Bio/Technology 9:266-271; Co, M. S.et al.(1991)“Humanized Antibodies For Antiviral Therapy,"Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:2869-2873; Carter, P.et al.(1992)“Humanization Of An Anti-p185her2 Antibody For Human Cancer Therapy,"Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 89:4285-4289; y Co, M.S.et al.(1992)“Chimeric And Humanized Antibodies With Specificity For The CD33 Antigen,"J. Immunol. 148:1149-1154. En algunas realizaciones, los anticuerpos humanizados conservan todas las secuencias de CDR (por ejemplo, un anticuerpo de ratón humanizado que contiene las seis CDR de los anticuerpos de ratón). En otras realizaciones, los anticuerpos humanizados tienen una o más CDR (una, dos, tres, cuatro, cinco, seis) que están alteradas con respecto al anticuerpo original, que también se denominan una o más CDR "derivadas de" una o más CDR del anticuerpo original. La capacidad de humanizar un antígeno es bien conocida (véanse,por ejemplo,las Patentes de Estados Unidos n.° 5,225,539; 5,530,101; 5,585,089; 5,859,205; 6,407,213; 6,881,557).
Como se usa en el presente documento, se dice que un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se une "específicamente" a una región de otra molécula (es decir, un epítopo) si reacciona o se asocia más frecuentemente, más rápidamente, con mayor duración y/o mayor afinidad o avidez con ese epítopo que con epítopos alternativos. En una realización, el anticuerpo de la invención se une a su diana (alfa-sinucleína humana) con una fuerza al menos 10 veces mayor que a otra molécula; preferentemente, con una fuerza al menos 50 veces mayor y más preferentemente con una fuerza al menos 100 veces mayor. Preferentemente, el anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, se une en condiciones fisiológicas, por ejemplo,in vivo.De esta manera, un anticuerpo que es capaz de "unirse específicamente" a un epítopo en los restos 112-117 (ILEDMP (SEQ ID NO:9)) de la alfa-sinucleína humana incluye un anticuerpo o fragmentos de unión a antígeno del mismo, que es capaz de unirse a un epítopo en los restos 112-117 de la alfa-sinucleína humana con dicha especificidad y/o en dichas condiciones. Los métodos adecuados para determinar dicha unión serán conocidos por los expertos en la materia, y se describen métodos ejemplares en los Ejemplos adjuntos. Como se usa en el presente documento, el término "unión" en el contexto de la unión de un anticuerpo a un antígeno predeterminado, típicamente se refiere a la unión con una afinidad que corresponde a una KD de aproximadamente 10'7 M o menor, tal como aproximadamente 10'8 M o menor, tal como aproximadamente 10'9 M o menor cuando se determina, por ejemplo, por tecnología de plasmón superficial (SPR) en un instrumento BIAcore® 3000 o T200 usando el antígeno como ligando y el anticuerpo como analito, y se une al antígeno predeterminado con una afinidad correspondiente a una KD que es al menos 10 veces menor, tal como al menos 100 veces menor, por ejemplo al menos 1,000 veces menor, tal como al menos 10,000 veces menor, por ejemplo al menos 100,000 veces menor que su afinidad por la unión a un antígeno no específico (por ejemplo, bSa , caseína) distinto que el antígeno predeterminado o un antígeno muy relacionado. La cantidad con la que la afinidad es menor es dependiente de la KD del anticuerpo, de modo que cuando la KD del anticuerpo es muy baja (esto es, el anticuerpo es altamente específico), entonces la cantidad con la que la afinidad por el antígeno es menor que la afinidad por un antígeno inespecífico puede ser al menos 10,000 veces.
El término "kd" (seg -1 o 1/s), como se usa en el presente documento, se refiere a la constante de la velocidad de disociación de una interacción antígeno-anticuerpo particular. Dicho valor también se denomina valor de koff. El término "ka" (M-1 x seg-1 o 1/M), tal como se usa en el presente documento, se refiere a la constante de velocidad de asociación de una interacción de anticuerpo-antígeno particular.
El término "KD" (M), como se usa en el presente documento, se refiere a la constante de disociación de equilibrio de una interacción de anticuerpo-antígeno particular y se obtiene dividiendo la kd por la ka.
El término "KA" (M-1 o 1/M), como se usa en el presente documento, se refiere a la constante de asociación de equilibrio de una interacción de anticuerpo-antígeno particular y se obtiene dividiendo la ka por la kd.
En un aspecto, el anticuerpo presenta una o más de las siguientes propiedades:
i. una afinidad de unión (KD) por la alfa-sinucleína entre 0.5-10 nM, tal como 1-5 nM o 1-2 nM;
ii. capacidad de inhibir el truncamiento por proteasa de fibrillas de alfa-sinucleína;
iii. capacidad de invertir el deterioro en la transmisión sináptica basal en ratones transgénicos F28-snca;
iv. capacidad de reducir los niveles de alfa-sinucleína en el hipocampo de ratón, medido por microdiálisis in vivo; v. capacidad, cuando se administra de forma crónica, de restaurar la función motora en un modelo de rata de enfermedad de Parkinson
vi. Capacidad de prevenir la iniciación de alfa-sinucleína (tal como la acumulación de alfa-sinucleína fosforilada insoluble in vitro y/o en un modelo de ratón de enfermedad de Parkinson); y/o
vii. Capacidad de unirse a la alfa-sinucleína truncada en un cerebro humano.
La afinidad de unión (KD) por la alfa-sinucleína pude determinarse usando métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, como se describe en el Ejemplo 2.
La expresión "capacidad de inhibir el truncamiento por proteasa de fibrillas de alfa-sinucleína" incluye la capacidad de inhibir la formación inducida por calpaína-1 del fragmento 1-119-122 de la alfa sinucleína humana en neuronas corticales primarias (véase elEjemplo 5).
La expresión "capacidad de invertir el deterioro en la transmisión sináptica basal en ratones transgénicos F28-snca" incluye la capacidad de invertir el deterioro de la transmisión sináptica y la plasticidad en el área CA1 del hipocampo en ratones transgénicos F28-snca, por ejemplo, como se indica por la pendiente de fEPSP evocada medida electrofisiológicamente (Véase elEjemplo 6).
La expresión "capacidad de reducir los niveles de alfa-sinucleína en el hipocampo de ratón medida por microdiálisis in vivo" incluye la capacidad de reducir los niveles de alfa-sinucleína humana en el hipocampo despierto de ratones trangénicos F28-snca que se mueven libremente, medido usando microdiálisis in vivo (véase elEjemplo 7).
La expresión "capacidad, cuando se administra de forma crónica, de restaurar la función motora en un modelo de rata de enfermedad de Parkinson" incluye la capacidad de reducir o eliminar la simetría motora en un modelo de vector viral adenoasociado recombinante (rAAV) de Enfermedad de Parkinson (véase elEjemplo 8).
En algunos anticuerpos, solo parte de una CDR, particularmente la subserie de restos de CDR necesarios para la unión, denominados SDR, son necesarios para conservar la unión en un anticuerpo humanizado. Los restos de CDR que no entran en contacto con el epítopo relevante y no están en los SDR pueden identificarse basándose en estudios previos (por ejemplo, con frecuencia no se requieren lo restos H60-H65 en la CDR H2), a partir de regiones de c Dr de Kabat que están fuera de los bucles hipervariables de Chothia (véase, Kabatet al.(1992) Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health Publication No. 91-3242; Chothia, C.et al.(1987)“Canonical Structures For The Hypervariable domains Of Immunoglobulins,’’J. Mol. Biol.
196:901-917), por creación de modelos moleculares y/o empíricamente, o como se describe en Gonzales, N. R.et al.(2004)“SDR Grafting Of A Murine Antibody Using Multiple Human Germline Templates To Minimize Its Immunogenicity,’’Mol. Immunol. 41:863-872. En dichos anticuerpos humanizados en las posiciones en las que están ausentes uno o más restos de CDR donantes o en las que se omite una CDR donante entera, el aminoácido que ocupa la posición puede ser un aminoácido que ocupa la posición correspondiente (por numeración de Kabat) en la secuencia del anticuerpo aceptor. El número a incluir de dichas sustituciones de aminoácidos aceptores por donantes en las CDR refleja un equilibrio de consideraciones competitivas. Dichas sustituciones son potencialmente ventajosas para disminuir el número de aminoácidos de ratón en un anticuerpo humanizado y disminuir en consecuencia la inmunogenicidad potencial. Sin embargo, las sustituciones también pueden causar cambios de la afinidad y, preferentemente, se evitan las reducciones significativas de la afinidad. Las posiciones para la sustitución dentro de las CDR y los aminoácidos que se van a sustituir también pueden seleccionarse de forma empírica.
El hecho de que una alteración de un solo aminoácido de un resto de CDR pueda dar como resultado una pérdida de unión funcional (Rudikoff, S.etc.(1982)“Single Amino Acid Substitution Altering Antigen-BindingSpecificity,” Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 79(6):1979-1983) proporciona un medio para identificar sistemáticamente secuencias de CDR funcionales alternativas. En un método preferido para obtener dichas CDR variantes, se muta un polinucleótido que codifica la CDR (por ejemplo, por medio de mutagénesis aleatoria o mediante un método dirigido (p. ej., amplificación por medio de PCR con cebadores que codifican el locus mutado)) para producir una CDR que tiene un resto de aminoácido sustituido. Comparando la identidad del resto importante en la secuencia original (funcional) de CDR con la identidad de la secuencia variante sustituida (no funcional) de CDR, puede identificarse la puntuación de sustitución BLOSUM62.iij para esa sustitución. El sistema BLOSUM proporciona una matriz de sustituciones de aminoácidos creadas analizando una base de datos de secuencias para alineamientos probados (Eddy, S.R. (2004)“Where Did The BLOSUM62 Alignment Score Matrix Come From?,”Nature Biotech. 22(8):1035-1036; Henikoff, J. G. (1992) “Amino acid substitution matrices from protein blocks,” Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 89: 10915-10919; Karlin, S.et al.(1990)“Methods For Assessing The Statistical Significance Of Molecular Sequence Features By Using General Scoring Schemes"Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 87: 2264-2268; Altschul, S. F. (1991)“Amino Acid Substitution Matrices From An Information Theoretic Perspective"J. Mol. Biol. 219, 555-565. Actualmente, la base de datos BLOSUM más avanzada es la base de datos BLOSUM62 (BLOSUM62.iij). LaTabla 1presenta las puntuaciones de sustitución de BLOSUM62.iij (a mayor puntuación, mas conservativa es la sustitución y, por tanto, más probable es que la sustitución no afecte a la función). Si un fragmento de unión a antígeno que comprende la CDR resultante no se puede unir a la alfa-sinucleína, por ejemplo, la puntuación de sustitución de BLOSUM62.iij se considera insuficientemente conservativa, y se selecciona y se produce una nueva sustitución candidata que tenga una mayor puntuación de sustitución. Así, por ejemplo, si el resto original era glutamato (E), y el resto sustituto no funcional era histidina (H), entonces la puntuación de sustitución BLOSUM62.iij será 0, y se prefieren cambios más conservativos (tales como a aspartato, asparagina, glutamina o lisina).
De esta manera, la invención contempla el uso de mutagénesis aleatoria para identificar CDR mejoradas. En el contexto de la presente invención, las sustituciones conservativas pueden definirse por sustituciones dentro de las clases de aminoácidos reflejadas en una o más de las tres tablas siguientes:
Clases de restos de aminoácidos para sustituciones conservativas:
Clases alternativas de sustituciones conservativas de los restos de aminoácidos:
Clasificaciones físicas y funcionales alternativas de los restos de aminoácidos:
Los agrupamientos de sustituciones más conservativas incluyen: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, y asparagina-glutamina.
También pueden formularse grupos de aminoácidos adicionales usando los principios descritos, por ejemplo, en Creighton (1984) Proteins: Structure and Molecular Properties (2a Ed. 1993), W. H. Freeman and Company.
Como alternativa, puede usarse la tecnología de presentación en fagos para aumentar (o disminuir) la afinidad de CDR. Esta tecnología, denominada maduración de afinidad, emplea mutagénesis o "mutagénesis de secuencias de CDR" ("CDR walking") y la reselección usa el antígeno diana o un fragmento antigénico de unión a antígeno del mismo para identificar anticuerpos que tienen CDR que se unen con mayor (o menor) afinidad al antígeno en comparación con el anticuerpo inicial o parental (véase,por ejemplo,Glaseret al.(1992) J. Immunology 149: 3903). La mutagénesis de codones enteros en lugar de nucleótidos individuales da como resultado un repertorio de mutaciones de aminoácidos semialeatorias. Pueden construirse bibliotecas que consisten en un grupo de clones variantes cada uno de los cuales difiere en una única alteración de aminoácido en una única CDR y que contienen variantes que representan cada posible sustitución de aminoácido para cada resto de CDR. Los mutantes con afinidad de unión aumentada (o disminuida) por el antígeno pueden explorarse poniendo en contacto los mutantes inmovilizados con el antígeno marcado. Cualquier método de exploración conocido en la técnica puede usarse para identificar anticuerpos mutantes con afinidad por el antígeno aumentada o disminuida (p. ej., ELISA) (véase Wuet al.1998, Proc. Natl. Acad. Sci. (EE.UU.) 95:6037; Yeltonet al.,1995, J. Immunology 155:1994). Es posible usar mutagénesis de secuencias de CDR, que aleatoriza la cadena ligera (véase, Schieret al.,1996, J. Mol. Bio. 263:551).
Se describen métodos para realizar dicha maduración de afinidad, por ejemplo, en: Krause, J. C.et al.(2011)“An Insertion Mutation That Distorts Antibody Binding Site Architecture Enhances Function Of A Human Antibody,"MBio. 2(1) pii: e00345-10. doi: 10.1128/mBio.00345-10; Kuan, C. T.et al.(2010)“Affinity-Matured Anti-Glycoprotein NMB Recombinant Immunotoxins Targeting Malignant Gliomas And Melanomas,"Int. J. Cancer 10.1002/ijc.25645; Hackel, B. J.et al.(2010)“Stability And CDR Composition Biases Enrich Binder Functionality Landscapes,’’J. Mol. Biol. 401(1): 84-96; Montgomery, D. L.et al.(2009)“Affinity Maturation And Characterization Of A Human Monoclonal Antibody Against HIV-1 gp41,"MAbs 1(5): 462-474; Gustchina, E.et al.(2009)“Affinity Maturation By Targeted Diversification Of The CDR-H2 Loop Of A Monoclonal Fab Derived From A Synthetic Naive Human Antibody Library And Directed Against The Internal Trimeric Coiled-Coil Of Gp41 Yields A Set Of Fabs With Improved HlV-1 Neutralization Potency And Breadth,’’Virology 393(1): 112-119; Finlay, W. J.et al.(2009)“Affinity Maturation Of A Humanized Rat Antibody For Anti-RAGE Therapy: Comprehensive Mutagenesis Reveals A High Level Of Mutational Plasticity Both Inside And Outside The Complementarity-Determining Regions,"J. Mol. Biol. 388(3): 541-558; Bostrom, J.et al.(2009)“Improving Antibody Binding Affinity And Specificity For Therapeutic Development,”Methods Mol. Biol. 525: 353-376; Steidl, S.et al.(2008)“In Vitro Affinity Maturation Of Human GM-CsF Antibodies By Targeted CDR-Diversification,"Mol. Immunol. 46(1): 135 144; y Barderas, R.et al.(2008)“Affinity Maturation Of Antibodies Assisted By In Silico Modeling,"Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 105(26): 9029-9034.
De esta manera, la secuencia de variantes de CDR de anticuerpos incluidos o sus fragmentos de unión a antígeno pueden diferir de la secuencia de la CDR del anticuerpo parental, GM37, GM37 var 1-3, o 285, mediante sustituciones; por ejemplo, el resto de aminoácido 4 sustituido, el resto de aminoácido 3 sustituido, el resto de aminoácido 2 sustituido o 1 de los restos de aminoácido. Se concibe además que los aminoácidos de las regiones CDR puedan sustituirse con sustituciones conservativas, tal como se define en las 3 tablas anteriores.
El término "tratamiento" como se usa en el presente documento, significa la mejora, ralentización, atenuación o inversión del progreso o gravedad de una enfermedad o trastorno, o la mejora, ralentización, atenuación o inversión de uno o más síntomas o efectos secundarios de dicha enfermedad o trastorno. Para los fines de la presente invención, "tratamiento" significa además un enfoque para obtener resultados clínicos beneficiosos o deseados, donde los "resultados clínicos beneficiosos o deseados" incluyen, sin limitación, el alivio de un síntoma, la disminución del grado de un trastorno o enfermedad, la estabilización (es decir el no empeoramiento) de una enfermedad o patología, el retraso o ralentización de la progresión de una enfermedad o patología, la mejoría o mitigación de una enfermedad o patología y la revisión de una enfermedad o trastorno, ya sea parcial o total, detectable o indetectable.
Una "cantidad eficaz", cuando se aplica a un anticuerpo o a fragmentos de unión a antígeno del mismo, de la invención, se refiere a una cantidad suficiente, a dosificaciones y durante periodos de tiempo necesarios, para conseguir un efecto biológico deseado o un resultado terapéutico deseado que incluye, sin limitación, resultados clínicos. La frase "cantidad terapéuticamente eficaz" cuando se aplica a un anticuerpo o a fragmentos de unión a antígeno del mismo, de la invención, pretende indicar una cantidad del anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que es suficiente para mejorar, paliar, estabilizar, invertir, ralentizar, atenuar o retrasar la progresión de un trastorno o patología o de un síntoma del trastorno o enfermedad. En una realización, el método de la presente invención proporciona la administración del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, en combinaciones con otros compuestos. En dichos casos, la "cantidad eficaz" es la cantidad de la combinación suficiente para producir el efecto biológico deseado.
Una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo anti-alfa-sinucleína de la invención puede variar de acuerdo con factores tales como la patología, la edad, el sexo y el peso del individuo, y la capacidad del anticuerpo anti-alfa-sinucleína para inducir una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapéuticamente eficaz también es una en la que los efectos terapéuticamente beneficiosos superan cualquier efecto tóxico o perjudicial del anticuerpo o porción del anticuerpo.
Como se ha indicado anteriormente, la presente divulgación se refiere en particular a un anticuerpo monoclonal capaz de unirse específicamente a un epítopo dentro de los aminoácidos 112-117 de la alfa-sinucleína humana (SEQ ID NO:9(ILEDMP)). En una realización, el anticuerpo es capaz de competir con el anticuerpo GM37 por la unión a un epítopo en los aminoácidos 112-117 de la alfa-sinucleína.
Los anticuerpos de la presente invención, ejemplificados por GM37, sus variantes GM37 var 1-3 y GM285, y sus fragmentos de unión a la alfa-sinucleína son capaces de unirse al fragmento tóxico de la alfa-sinucleína que consiste en los restos 1-119/122 de la alfa-sinucleína y de neutralizar su toxicidad (por ejemplo, por unión extracelular al fragmento de alfa-sinucleína y previniendo de esta manera que se capte por las células. Sorprendentemente, los anticuerpos de la presente invención, que son capaces de unirse a un epítopo en los aminoácidos 112-117 de la alfa-sinucleína son superiores a los anticuerpos de la técnica anterior, tal como el anticuerpo 9E4, en la unión a especies tóxicas de la alfa-sinucleína en el cerebro humano, y tienen efectos superiores sobre la eliminación de la alfa-sinucleína extracelular y la normalización de la transmisión sináptica deteriorada inducida por la alfa-sinucleína in vivo. Los anticuerpos de la invención también son capaces de mejorar la aparición de un fenotipo motor relevante en un modelo de rata para la enfermedad de Parkinson. Los anticuerpos son preferentemente anticuerpos humanos o humanizados.
La presente divulgación también proporciona un método para reducir la formación de agregados de alfasinucleína en un paciente, que comprende administrar al paciente que necesita dicho tratamiento una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo de la invención.
Además, los anticuerpos pueden estar en una composición junto con un vehículo, diluyente y/o estabilizante farmacéuticamente aceptable. Los anticuerpos de la invención pueden usarse en terapia. En particular, los anticuerpos de la invención pueden usarse en el tratamiento de sinucleinopatías tales como la enfermedad de Parkinson (incluyendo formas idiopáticas o hereditarias de la enfermedad de Parkinson), Enfermedad de Gaucher, Enfermedad Difusa con Cuerpos de Lewy (DLB), variante de enfermedad de Alzheimer con cuerpos de Lewy (LBV), enfermedad Combinada de Alzheimer y de Parkinson, fallo autonómico puro y atrofia multisistema. El tratamiento previsto por la presente invención puede ser crónico y el paciente puede tratarse al menos 2 semanas, tal como al menos durante 1 mes, 6 meses, 1 año o más.
Los anticuerpos de la presente invención pueden producirse en diferentes líneas celulares, tales como una línea celular humana, una línea celular de un mamífero no humano, y una línea celular de insecto, por ejemplo, una línea celular CHO, línea celular HEK, línea celular BHK-21, línea celular murina (tal como una línea de células de mieloma), línea celular de fibrosarcoma, línea celular PER.C6, línea celular HKB-11, línea celular CAP y línea celular humana HuH-7 (Dumont et al, 2015, Crit Rev Biotechnol. Sep 18:1-13, cuyo contenido se incluye en el presente documento por referencia).
Los anticuerpos pueden ser, por ejemplo, anticuerpos monoclonales producidos por el método de hibridoma descrito por primera vez por Kohler et al., Nature 256, 495 (1975), o pueden producirse por métodos de ADN recombinante. También pueden aislarse anticuerpos monoclonales de bibliotecas de anticuerpos en fagos usando las técnicas descritas, por ejemplo, en Clackson et al., Nature 352, 624-628 (1991) y Marks et al., J. MoI. Biol. 222, 581-597 (1991). Pueden obtenerse anticuerpos monoclonales a partir de cualquier fuente adecuada. De esta manera, por ejemplo, pueden obtenerse anticuerpos monoclonales a partir de hibridomas preparados a partir de linfocitos B esplénicos murinos obtenidos a partir de ratones inmunizados con un antígeno de interés, por ejemplo, en forma de células que expresan el antígeno en la superficie, o un ácido nucleico que codifica un antígeno de interés. También pueden obtenerse anticuerpos monoclonales a partir de hibridomas derivados de células que expresan anticuerpos de humanos o mamíferos no humanos inmunizados tales como ratas, conejos, perros, ovejas, cabras, primates etc.
El anticuerpo de la invención es un anticuerpo humano. Pueden generarse anticuerpos monoclonales humanos dirigidos contra la alfa-sinucleína usando ratones transgénicos o transcromosómicos que llevan partes del sistema inmunitario humano en lugar de partes del sistema del ratón. Dichos ratones transgénicos y transcromosómicos incluyen ratones denominados en el presente documento ratones HyMAb y ratones KM, respectivamente.
El ratón HuMAb contiene un minilocus de gen de inmunoglobulina humana que codifica secuencias de inmunoglobulina de cadena variable y constante pesada humana (|j y Y) y secuencias de inmunoglobulina de cadena variable y constante ligera (<k>), junto con mutaciones dirigidas que inactivan los loci endógenos de las cadenas j y<k>(Lonberg, N. et al., Nature 368, 856-859 (1994)). Por consiguiente, los ratones presentan una expresión reducida de IgM o IgK de ratón y, en respuesta a la inmunización, los transgenes de cadena pesada y ligera humana introducidos experimentan un cambio de clase y mutación somática para generar anticuerpos monoclonales ^ IgG humana de alta afinidad (Lonberg, N. et al. (1994), supra; revisado en Lonberg, N., Handbook of Experimental Pharmacology 113, 49-101 (1994), Lonberg, N. y Huszar, D., Intern. Rev. Immunol. Vol. 1365-93 (1995) y Harding, F. y Lonberg, N., Ann. N. Y. Acad. Sci 764536-546 (1995)). La preparación de ratones HuMAb se describe con detalle en Taylor, L. et al., Nucleic Acids Research 20, 6287-6295 (1992), Chen, J. et al., International Immunology 5, 647-656 (1993), Tuaillon et al., J. Immunol. 152, 2912-2920 (1994), Taylor, L. et al., International Immunology 6, 579-591 (1994), Fishwild, D. et al., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996). Véanse también los documentos US 5,545,806, US 5,569,825, US 5,625,126, US 5,633,425, US 5,789,650, US 5,877,397, US 5,661,016, US 5,814,318, US 5,874,299, US 5,770,429, US 5,545,807, WO 98/24884, WO 94/25585, WO 93/1227, WO 92/22645, WO 92/03918 y WO 01/09187.
Los ratones HCo7, HCo12, HCo17 y HCo20 tienen una alteración de JKD en sus genes endógenos de cadena ligera (kappa) (como se describe en Chen et al., EMBO J. 12, 811-820 (1993)), una alteración de CMD en sus genes endógenos de cadena pesada (como se describe en el Ejemplo 1 del documento WO 01/14424), y un transgén de cadena ligera kappa humana KCo5 de (como se describe en Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996)). Además, los ratones HCo7 tienen un transgén de cadena pesada humana HCo7 (como se describe en el documento US 5,770,429), el ratón HCo12 tiene un transgén de cadena pesada humana HCo12 (como se describe en el Ejemplo 2 del documento WO 01/14424), el ratón HCo17 tiene un transgén de cadena pesada humana HCo17 (como se describe en el Ejemplo 2 del documento WO 01/09187) y los ratones HCo20 tienen un transgén de cadena pesada humana HCo20. Los ratones resultantes expresan transgenes de cadena ligera kappa y pesada de inmunoglobulina humana en un escenario homocigoto para la rotura de los loci endógenos de cadena ligera kappa y pesada de ratón.
En la cepa de ratón KM, el gen endógeno de cadena ligera kappa de ratón se ha roto por medio de homocigosis como se describe en Chen et al., EMBO J. 12, 811-820 (1993) y el gen endógeno de cadena pesada de ratón se ha roto por homocigosis como se describe en el Ejemplo 1 del documento WO 01/09187. Esta cepa de ratón lleva un transgén de cadena ligera kappa humana, KCo5, como se describe en Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996). Esta cepa de ratón también lleva un transcromosoma de cadena pesada humana compuesto del fragmento hCF del cromosoma 14 (SC20), como se describe en el documento WO 02/43478. Pueden generarse ratones HCo12-Balb/c, HCo17-Balb/c y HCo20-Balb/c por cruce de HCo12, HCo17 y HCo20 con KCo5[J/K](Balb) como se describe en el documento w O 09/097006.
En la cepa de ratón KM, el gen endógeno de cadena ligera kappa de ratón se ha roto por homocigosis como se describe en Chen et al., EMBO J. 12, 811-820 (1993) y el gen endógeno de cadena pesada de ratón se ha roto por homocigosis como se describe en el Ejemplo 1 del documento WO 01/09187. Esta cepa de ratón lleva un transgén de cadena ligera kappa humana, KCo5, como se describe en Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996). Esta cepa de ratón también lleva un transcromosoma de cadena pesada humana compuesto del fragmento de unión a antígeno del cromosoma 14 hCF (SC20) como se describe en el documento WO 02/43478.
Pueden usarse esplenocitos de estos ratones transgénicos para generar hibridomas que secretan anticuerpos monoclonales humanos de acuerdo con técnicas bien conocidas. También pueden generarse anticuerpos monoclonales humanos de la presente invención transgénicamente mediante la generación de otro mamífero no humano o planta que sea transgénica para las secuencias de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina de interés y la producción del anticuerpo en una forma recuperable a partir de dichos organismos. En relación con la producción transgénica en mamífero, pueden producirse anticuerpos en, y recuperarse a partir de, la leche de cabras, vacas u otros mamíferos. Véanse, por ejemplo, los documentos US 5,827,690; US 5,756,687; US 5,750,172 y US 5,741,957.
El anticuerpo de la divulgación puede ser de cualquier isotipo. La elección del isotipo típicamente estará guiada por las funciones efectoras deseadas, tales como la inducción de ADCC. Son isotipos ejemplares IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4. Puede usarse cualquiera de los dominios constantes de cadena ligera humana, kappa o lambda. Si se desea, la clase de un anticuerpo anti-alfa-sinucleína de la presente invención puede cambiarse por métodos conocidos. Por ejemplo, un anticuerpo de la presente invención que originalmente era IgM puede cambiarse de clase a un anticuerpo IgG de la presente invención. Además, pueden usarse técnicas de cambio de clase para convertir una subclase de IgG en otra, por ejemplo, de IgGl a IgG2. De esta manera, la función efectora de los anticuerpos de la presente invención puede cambiarse por cambio de isotipo, por ejemplo, a un anticuerpo IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 para diversos usos terapéuticos. Un anticuerpo de la presente invención es un anticuerpo IgG1, por ejemplo un IgG1, .^ Se dice que un anticuerpo es de un isotipo particular si su secuencia de aminoácidos es más homóloga a ese isotipo que a otros isotipos.
En una realización, el anticuerpo de la invención es un anticuerpo IgG de longitud completa, en particular, un anticuerpo IgG1, .^
Pueden obtenerse anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos, por ejemplo, por fragmentación de unión a antígeno usando técnicas convencionales, y los fragmentos de unión a antígeno pueden explorarse con respecto a su utilidad de la misma manera que se describe en el presente documento en el caso de los anticuerpos enteros. Por ejemplo, pueden generarse fragmentos de unión a antígeno F(ab')2 por tratamiento del anticuerpo con pepsina. El fragmento de unión a antígeno F(ab')2 resultante puede tratarse para reducir los puentes disulfuro para producir fragmentos de unión a antígeno Fab'. Pueden obtenerse fragmentos de unión a antígeno Fab por tratamiento de un anticuerpo IgG con papaína; pueden obtenerse fragmentos de unión a antígeno Fab' por digestión con pepsina de un anticuerpo IgG. Un fragmento de unión a antígeno F(ab') también puede producirse por unión a Fab'- descrito más adelante a través de un enlace tioéter o un enlace disulfuro. Un fragmento de unión a antígeno Fab' es un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo obtenido por corte de un enlace disulfuro del dominio de bisagra del F(ab')2. Un fragmento de unión a antígeno Fab' puede obtenerse por tratamiento de un fragmento de unión a antígeno F(ab')2 con un agente reductor, tal como ditiotreitol. También puede generarse un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo por expresión de ácidos nucleicos que codifican dichos fragmentos de unión a antígeno en células recombinantes (véase, por ejemplo, Evans et al., J. Immunol. Meth. 184, 123-38 (1995)). Por ejemplo, un gen quimérico que codifica una parte de un fragmento de unión a antígeno F(ab')2 podría incluir secuencias de ADN que codifican la región CH1 y el dominio de bisagra de la cadena H, seguido de un codón de terminación de la traducción para producir dicha molécula de fragmento de unión a antígeno de anticuerpo truncada.
En una realización de la divulgación, el anticuerpo anti-alfa-sinucleína es un anticuerpo monovalente, preferentemente un anticuerpo monovalente como se describe en el documento WO2007059782 que tiene una deleción del dominio de bisagra. Por consiguiente, en una realización, el anticuerpo es un anticuerpo monovalente, donde dicho anticuerpo anti-alfa-sinucleína se construye por un método que comprende: i) proporcionar una construcción de ácido nucleico que codifica la cadena ligera de dicho anticuerpo monovalente, comprendiendo dicha construcción una secuencia de nucleótidos que codifica la región VL de un anticuerpo antialfa-sinucleína específico de antígeno seleccionado y una secuencia de nucleótidos que codifica la región CL constante de una Ig, donde dicha secuencia de nucleótidos que codifica la región VL de un anticuerpo específico de antígeno seleccionado y dicha secuencia de nucleótidos que codifica la región CL de una Ig están unidas operativamente entre sí, y donde, en el caso de un subtipo IgG1, la secuencia de nucleótidos que codifica la región CL se ha modificado de tal forma que la región Cl no contiene ningún aminoácido capaz de formar enlaces disulfuro o enlaces covalentes con otros péptidos que comprenden una secuencia de aminoácidos idéntica de la región CL en presencia de IgG humana policlonal o cuando se administra a un animal o ser humano; ii) proporcionar una construcción de ácido nucléico que codifica la cadena pesada de dicho anticuerpo monovalente, comprendiendo dicha construcción una secuencia de nucleótidos que codifica la región VH de un anticuerpo específico de antígeno seleccionado y una secuencia de nucleótidos que codifica una región CH constante de una Ig humana, donde la secuencia de nucleótidos que codifica la región CH se ha modificado de tal forma que la región que corresponde al dominio de bisagra y, cuando se requiere por el subtipo de Ig, otras regiones de la región CH, tales como la región CH3, no comprende ningún resto de aminoácido que participa en la formación de enlaces disulfuro o enlaces covalentes o no covalentes estables entre cadenas las pesadas con otros péptidos que comprenden una secuencia de aminoácidos idéntica de la región CH de la Ig humana en presencia de IgG humana policlonal o cuando se administra a un ser humano animal, donde dicha secuencia de nucleótidos que codifica la región VH de un anticuerpo específico de antígeno seleccionado y dicha secuencia de nucleótidos que codifica la región CH de dicha Ig están unidas operativamente entre sí; iii) proporcionar un sistema de expresión celular para producir dicho anticuerpo monovalente; iv) producir dicho anticuerpo monovalente mediante por coexpresión de las construcciones de ácido nucleico de (i) y (ii) en células del sistema de expresión de (iii).
De forma similar, el anticuerpo anti-alfa-sinucleína puede ser un anticuepro monovalente, que comprende:
(i) un dominio variable de un anticuerpo de la invención como se describe en el presente documento o una parte de unión a antígeno de dicha región, y
(ii) un dominio CH de una inmunoglobulina o un dominio de la misma que comprende los dominios CH2 y CH3, donde el dominio CH o dominio del mismo se ha modificado de tal forma que el dominio que corresponde al dominio de bisagra y, si la inmunoglobulina no es un subtipo IgG4, otros dominios del dominio CH, tales como el dominio CH3, no comprenden ningún resto de aminoácido que sea capaz de formar enlaces disulfuro con un dominio CH idéntico u otro enlace covalente o no covalente estable entre las cadenas pesadas con un dominio CH idéntico en presencia de IgG humana policlonal.
La cadena pesada del anticuerpo anti-alfa-sinucleína monovalente se ha modificado de tal forma que se ha delecionado el dominio de bisagra entero.
La secuencia de dicho anticuerpo monovalente se ha modificado de forma que no comprende ningún sitio aceptor para la N-glicosilación.
La invención también incluye "Anticuerpos Biespecíficos", donde una región de unión anti-alfa-sinucleína (por ejemplo, una región de unión a alfa-sinucleína de un anticuerpo monoclonal anti-sinucleína) forma parte de un armazón biespecífico bivalente o polivalente que se dirige a más de un epítopo (por ejemplo, un segundo epítopo podría comprender un epítopo de un receptor de transporte activo, de tal forma que el anticuerpo biespecífico presentaría una mejor transcitosis a través de una barrera biológica, tal como la Barrera Hematoencefálica). De esta manera, en otra realización adicional, el Fab monovalente de un anticuerpo anti-sinucleína puede unirse a un Fab o scfv adicional que se dirige a una proteína diferente para generar un anticuerpo biespecífico. Un anticuerpos biespecífico puede tener una función doble, por ejemplo, una función terapéutica impartida por un dominio de unión anti-sinucleína y una función de transporte que puede realizar la unión a una molécula receptora para mejorar la transferencia a través de una barrera biológica, tal como la barrera hematoencefálica.
Los anticuerpos anti-alfa-sinucleína también incluyen anticuerpos monocatenarios. Los anticuerpos monocatenarios son péptidos en los que las regiones Fv de cadena pesada y ligera están conectadas. En la presente se describe un Fv monocatenario (scFv) donde las cadenas pesada y ligera en el Fv de un anticuerpo anti-alfa-sinucleína de la presente invención están unidas con un enlazador peptídico flexible (típicamente de aproximadamente 10, 12, 15 o más restos de aminoácido) en una sola cadena peptídica. Se describen métodos para producir dichos anticuerpos, por ejemplo, en el documento US 4,946,778, Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore eds. Springer-Verlag, New York, págs. 269-315 (1994), Bird et al., Science 242, 423-426 (1988), Huston et al., PNAS USA 85, 5879-5883 (1988) y McCafferty et al., Nature 348, 552-554 (1990). El anticuerpo monocatenario puede ser monovalente, si sólo se usa una sola VH y VL, bivalente, si se usan dos VH y VL, o polivalente, si se usan más de dos VH y VL.
Los anticuerpos anti-alfa-sinucleína y fragmentos de unión a antígeno de los mismos descritos en el presente documento pueden modificarse por inclusión de cualquier número adecuado de aminoácidos modificados y/o asociaciones con dichos sustituyentes conjugados. La idoneidad en este contexto generalmente se determinada por la capacidad de retener al menos sustancialmente la selectividad por la alfa-sinucleína y/o la especificidad de anti-alfa-sinucleína asociada con el anticuerpo anti-alfa-sinucleína parental no modificado. La inclusión de uno o más aminoácidos modificados puede ser ventajosa, por ejemplo, al aumentar la semivida en suero del polipéptido, reducir la antigenicidad del polipéptido o aumentar la estabilidad del polipéptido durante el almacenamiento. Los aminoácidos se modifican, por ejemplo, de forma cotraduccional o postraduccional durante la producción recombinante (por ejemplo, N-glicosilación en motivos N-X-S/T durante la expresión en células de mamífero) o se modifica por medios sintéticos. Los ejemplos no limitantes de un aminoácido modificado incluyen un aminoácido glicosilado, un aminoácido sulfatado, un aminoácido prenilado (por ejemplo farnesilado, geranilgeranilado), un aminoácido acetilado, un aminoácido acilado, un aminoácido pegilado, un aminoácido biotinilado, un aminoácido carboxilado, un aminoácido fosforilado y similares. La bibliografía está llena de referencias adecuadas para guiar a un experto en la modificación de aminoácidos. Se encuentran protocolos de ejemplos en Walker (1998) Protein Protocols On CD-Rom, Humana Press, Totowa, NJ. El aminoácido modificado puede seleccionarse, por ejemplo, a partir de un aminoácido glicosilado, un aminoácido pegilado, un aminoácido farnesilado, un aminoácido acetilado, un aminoácido biotinilado, un aminoácido conjugado con un resto de lípido, o un aminoácido conjugado con un agente de derivatización orgánico.
Los anticuerpos anti-alfa-sinucleína también pueden modificarse químicamente por conjugación covalente con un polímero para, por ejemplo, aumentar su semivida circulante. Se ilustran polímeros ejemplares, y métodos para unirlos a péptidos, por ejemplo, en los documentos US 4,766,106; US 4,179,337; US 4,495,285 y US 4,609,546. Otros polímeros ilustrativos incluyen polioles polioxietilados y polietilengliclol (PEG) (por ejemplo, un PEG con un peso molecular comprendido entre aproximadamente 1,000 y aproximadamente 40,000, tal como entre aproximadamente 2,000 y aproximadamente 20,000, por ejemplo, aproximadamente 3,000-12,000 g/mol).
Los anticuerpos de la presente invención pueden usarse adicionalmente en un método de diagnóstico o como un ligando de formación de imágenes de diagnóstico.
En un aspecto, se proporcionan anticuerpos anti-alfa-sinucleína que comprenden uno o más aminoácidos radiomarcados. Un anticuerpo anti-alfa-sinucleína radiomarcado puede usarse tanto para fines de diagnóstico como para fines terapéuticos (la conjugación con moléculas radiomarcadas es otra característica posible). Los ejemplos no limitantes de dichos marcadores incluyen, pero sin limitación bismuto (213Bi), carbono (11C, 13C, 14C), cromo (51Cr), cobalto (57Co, 60Co), cobre (64Cu), disprosio (165Dy), erbio (169Er), flúor (18f), gadolinio (153Gd, 159Gd), galio (68Ga, 67Ga), germanio (68Ge), oro (198Au), holmio (166Ho), hidrógeno (3H), indio (111In, 112In, 113In, 115In), yodo(121I, 123I, 125I, 131I), iridio (192Ir), hierro (59Fe), criptón (81mKr), lantano (140La), lutecio (177Lu), manganeso (54Mn), molibdeno (99Mo), nitrógeno (13N, 15N), oxígeno (15O), paladio (103Pd), fósforo (32P), potasio (42K), praseodimio (142Pr), prometio (149Pm), renio (186Re, 188Re), rodio (105Rh), rubidio (81Rb, 82Rb), rutenio (82Ru, 97Ru), samario (153Sm), escandio (47Sc), selenio (75Se), sodio (24Na), estroncio (85Sr, 89Sr, 92Sr), azufre (35S), tecnecio (99Tc), talio (201Tl), estaño (113Sn, 117Sn), xenón (133Xe), iterbio (169Yb, 175Yb, 177Yb), itrio (90Y) y cinc (65Zn). En la técnica se conocen métodos para preparar aminoácidos radiomarcados y derivados peptídicos relacionados (véase, por ejemplo Junghans et al., en Cancer Chemotherapy and Biotherapy 655-686 (2a edición, Chafner y Longo, eds., Lippincott Raven (1996)) y los documentos uS 4,681,581, uS 4,735,2l0, US 5,101,827, uS 5,102,990 (US RE35,500), US 5,648,471 y US 5,697,902. Por ejemplo, un radioisótopo puede conjugarse por el método T de cloramina (Lindegren, S.et al.(1998)“Chloramine-T In High-Specific-Activity Radioiodination Of Antibodies Using N-Succinimidyl-3-(Trimethylstannyl)Benzoate As An Intermedíate,” Nucl. Med. Biol. 25(7): 659 665; Kurth, M.et al.(1993)“Site-Specific Conjugation Of A Radioiodinated Phenethylamine Derivative To A Monoclonal Antibody Results In Increased Radioactivity Localization In Tumor,’’J. Med. Chem. 36(9): 1255-1261; Rea, D. W.et al.(1990) “Site-specifically radioiodinated antibody for targeting tumors,” Cancer Res. 50(3 Suppl): 857s-861s).
La invención también proporciona anticuerpos anti-alfa-sinucleína que se marcan de forma detectable usando un marcador fluorescente (tal como un quelato de tierras raras (por ejemplo, un quelato de europio)), un marcador de tipo fluoresceína (por ejemplo fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, 5-carboxifluoresceína, 6-carboxifluoresceína, diclorotriacinilaminofluoresceína), un marcador de tipo rodamina (por ejemplo, ALEXA FLUOR® 568 (Invitrogen), TAMRA® o cloruro de dansilo), VIVOTAG 680 XL FLUOROCHROME™ (Perkin Elmer), ficoeritrina; umbeliferona, lisamina; una cianina; una ficoeritrina, Texas Red, BODIPY FL-SE® (Invitrogen) o un análogo del mismo, siendo todos ellos adecuados para la detección óptica. Pueden emplearse marcadores quimioluminiscentes (por ejemplo, luminol, luciferasa, luciferina y aeuorina). Dicho diagnóstico y detección también pueden realizarse acoplando la molécula de diagnóstico de la presente invención con sustancias detectables incluyendo, pero sin limitación, diversas enzimas, enzimas que incluyen, pero sin limitación, peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, beta galactosidasa o acetilcolinestaresa, o con complejos de grupos prostéticos tales como, pero sin limitación, estreptavidina/biotina y avidina/biotina.
Pueden emplearse marcadores quimioluminiscentes (por ejemplo, luminol, luciferasa, luciferina y aecuorina). Dicho diagnóstico y detección también pueden realizarse acoplando la molécula de diagnóstico de la presente invención con sustancias detectables incluyendo, pero sin limitación, diversas enzimas, enzimas que incluyen, pero sin limitación, peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, beta galactosidasa o acetilcolinestaresa, o con complejos de grupos prostéticos tales como, pero sin limitación, estreptavidina/biotina y avidina/biotina. También pueden emplearse marcadores paramagnéticos y se detectan preferentemente usando tomografía de emisión de positrones (PET) o tomografía computerizada de emisión de un solo fotón (SPECT). Dichos marcadores paramagnéticos incluyen, pero sin limitación compuestos que contienen iones paramagnéticos de Aluminio (Al), Bario (Ba), Calcio (Ca), Cerio (Ce), Disprosio (Di), Erbio (Er), Europio (Eu), Gadolinio (Gd), Holmio (Ho), Iridio (Ir), Litio (Li), Magnesio (Mg), Manganeso (Mn), Molibdeno (m ), Neodimio (Nd), Osmio (Os), Oxígeno (O), Paladio (Pd), Platino (Pt), Rodio (Rh), Rutenio (Ru), Samario (Sm), Sodio (Na), Estroncio (Sr), Terbio (Tb), Tulio (Tm), Estaño (Sn), Titanio (Ti), Tungsteno (W) y Circonio (Zi), y particularmente, Co+2, CR+2, Cr+3, Cu+2, Fe+2, Fe+3, Ga+3, Mn+3, Ni+2, Ti+3, V+3 y V+4, metales de emisión de positrones usando diversas tomografías de emisión de positrones e iones metálicos paramagnéticos no radiactivos.
De esta manera, en un aspecto, el anticuerpo anti-alfa-sinucleína de la invención puede marcarse con un marcador fluorescente, un marcador quimioluminiscente, un marcador paramagnético, un marcador radioisotópico o un marcador enzimático. El anticuerpo marcado puede usarse para la detección o medición de la presencia o cantidad de dicha alfa-sinucleína en el cerebro de un sujeto. Este método puede comprender la detección o medición de formación de imágenes in vivo de anticuerpo anti-alfa-sinucleína unido a dicha alfasinucleína y puede comprender la formación de imágenes ex vivo de dicho anticuerpo anti-alfa-sinucleína unido a dicha alfa-sinucleína.
En un aspecto adicional, la divulgación se refiere a un vector de expresión que codifica una o más cadenas polipeptídicas de un anticuerpo de la invención o un fragmento de unión a antígeno del mismo. Dichos vectores de expresión pueden usarse para la producción recombinante de los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de la invención.
Un vector de expresión puede ser cualquier vector de ADN o ARN adecuado, incluyendo vectores cromosómicos, no cromosómicos y de ácido nucleico sintéticos (una secuencia de ácido nucleico que comprende una serie adecuada de elementos de control de la expresión). Los ejemplos de dichos vectores incluyen derivados de SV40, plásmidos bacterianos, ADN de fago, baculovirus, plásmidos de levadura, vectores derivados de combinaciones de plásmidos y ADN de fago y vectores de ácido nucleico viral (ARN o ADN). En una realización, un ácido nucleico que codifica un anticuerpo anti-alfa-sinucleína está comprendido en un vector de ADN o ARN desnudo, incluyendo, por ejemplo, un elemento de expresión lineal (como se describe, por ejemplo, en Sykes y Johnston, Nat Biotech 12, 355-59 (1997)), un vector de ácido nucleico compacto (como se describe, por ejemplo, en el documento US 6,077,835 y/o WO 00/70087), un vector de plásmido tal como pBR322, pUC 19/18 o pUC 118/119, un vector de ácido nucleico de tamaño muy pequeño "midge" (como se describe, por ejemplo, en Schakowski et al., Mol Ther 3, 793-800 (2001)), o como una construcción de vector de ácido nucleico precipitado, tal como una construcción precipitada con CaPO4 (como se describe, por ejemplo, en el documento WO 00/46147, Benvenisty y Reshef, PNAS USA 83, 9551-55 (1986), Wigler et al., Cell 14, 725 (1978), y Coraro y Pearson, Somatic Cell Genetics 2, 603 (1981)). Dichos vectores de ácido nucleico y el uso de los mismos son bien conocidos en la técnica (véanse, por ejemplo, los documentos US 5,589,466 y US 5,973,972).
El vector puede ser adecuado para la expresión de anticuerpos anti-alfa-sinucleína o fragmentos de unión a antígeno de los mismos en una célula bacteriana. Los ejemplos de dichos vectores incluyen vectores de expresión tales como BlueScript (Stratagene), vectores pIN (Van Heeke y Schuster, J. Biol. Chem. 264, 5503 5509 (1989), vectores pET (Novagen, Madison, WI) y similares.
Además, o como alternativa, un vector de expresión puede ser un vector adecuado para la expresión en un sistema de levadura. Puede emplearse cualquier vector adecuado para la expresión en un sistema de levadura. Los vectores adecuados incluyen, por ejemplo, vectores que comprenden promotores constitutivos o inducibles tales como el factor alfa, alcohol oxidasa y PGH (revisado en: F. Ausubelet al.,ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley InterScience New York (1987), Grantet al.,Methods in Enzymol 153, 516-544 (1987), Mattanovich, D.et al.Methods Mol. Biol. 824, 329-358 (2012), Celik, E.et al.Biotechnol. Adv. 30(5), 1108-1118 (2012), Li, P.et al.Appl. Biochem. Biotechnol. 142(2), 105-124 (2007), Boer, E.et al.Appl. Microbiol. Biotechnol. 77(3), 513-523 (2007), van der Vaart, J.M. Methods Mol. Biol. 178, 359-366 (2002), and Holliger, P. Methods Mol. Biol. 178, 349-357 (2002)).
En un vector de expresión, los ácidos nucleicos que codifican anticuerpo anti-alfa-sinucleína pueden comprender o estar asociados con cualquier promotor adecuado, potenciador y otros elementos que facilitan la expresión adecuado. Los ejemplos de dichos elementos incluyen promotores de expresión fuertes (por ejemplo, el promotor/potenciador de CMV IE humano así como los promotores de RSV, SV40, SL3-3, MMt V y LTR de VIH), secuencias de terminación poli (A) eficaces, un origen de replicación para el producto plasmídico en E. coli, un gen de resistencia a antibióticos como marcador de selección y/o un sitio de clonación conveniente(por ejemplo, un polienlazador). Los ácidos nucleicos también pueden comprender un promotor inducible en lugar de un promotor constitutivo tal como IE de CMV (el experto en la materia reconocerá que dichos términos actualmente describen un grado de expresión génica en ciertas condiciones).
Los anticuerpos de la presente invención pueden producirse en diferentes líneas celulares tales como una línea celular humana, una línea celular de mamífero no humano y una línea celular de insecto, por ejemplo, una línea celular CHO, línea celular HEK, línea celular BHK-21, línea celular murina (tal como una línea de celular de mieloma), línea celular de fibrosarcoma, línea celular PER.C6, línea celular HKB-11, línea celular CAP y línea celular humana HuH-7 (Dumont et al, 2015, Crit Rev Biotechnol. Sep 18:1-13, cuyo contenido se incluye en el presente documento por referencia).
En otro aspecto adicional, la divulgación se refiere a una célula hospedadora eucariota o procariota recombinante, tal como un transfectoma, que produce un anticuerpo o un dominio de unión a antígeno del mismo de la invención como se define en el presente documento o una molécula biespecífica de la invención como se define en el presente documento. Los ejemplos de células hospedadoras incluyen levaduras, bacterias y células de mamífero, tales como células CHO o HEK. Por ejemplo, la presente divulgación proporciona una célula que comprende un ácido nucleico integrado de forma estable en el genoma celular que comprende una secuencia que codifica la expresión de un anticuerpo anti-alfa-sinucleína de la presente invención. En otra realización, la presente divulgación proporciona una célula que comprende un ácido nucleico no integrado, tal como un plásmido, cósmido, fagémido o elemento de expresión lineal, que comprende una secuencia que codifica la expresión de un anticuerpo anti-alfa-sinucleína de la invención.
En un aspecto adicional, la divulgación se refiere a un método para producir un anticuerpo anti-alfa-sinucleína de la invención, comprendiendo dicho método las etapas de a) cultivar un hibridoma o una célula hospedadora de la invención como se ha descrito anteriormente en el presente documento y b) purificar el anticuerpo de la invención a partir del medio de cultivo.
En otro aspecto, la divulgación se refiere a una preparación que, como se usa tal término en el presente documento, comprende un anticuerpo anti-alfa-sinucleína como se define en el presente documento, y que carece sustancialmente de anticuerpos naturales que no son capaces de unirse a la alfa-sinucleína o que no alteran materialmente la funcionalidad anti-alfa-sinucleína de la preparación. De esta manera, dicha preparación no incluye suero natural, o un derivado purificado de dicho suero, que comprende una mezcla de un anticuerpo anti-alfa-sinucleína y otro anticuerpo que no altera la funcionalidad del anticuepro anti-alfa-sinucleína de la preparación; donde dicha funcionalidad se selecciona del grupo que consiste en:
(i) una afinidad de unión (KD) del anticuerpo anti-alfa-sinucleína por la alfa-sinucleína;
(ii) una capacidad del anticuerpo anti-alfa-sinucleína de inhibir el truncamiento por proteasa de fibrillas de alfasinucleína;
(iii) una capacidad del anticuerpo anti-alfa-sinucleína de invertir el deterioro en la transmisión sináptica basal en ratones transgénicos F28-snca;
(iv) una capacidad del anticuerpo anti-alfa-sinucleína de reducir los niveles de alfa-sinucleína en el hipocampo de ratón como se mide por microdiálisis in vivo; y
(v) una capacidad, cuando se administra de forma crónica, del anticuerpo anti-alfa-sinucleína de restaurar la función motora en un modelo de rata de enfermedad de Parkinson.
(vi) una capacidad para prevenir la iniciación de alfa-sinucleína (tal como la acumulación de alfa-sinucleína fosforilada insoluble in vitro y/o en un modelo de ratón de enfermedad de Parkinson); y/o
(vii) una capacidad de unirse a la alfa-sinucleína truncada en un cerebro humano.
La divulgación se refiere particularmente a preparaciones de dicho anticuerpo anti-alfa-sinucleína que tiene un cambio estructural en su secuencia de aminoácidos (en cualquiera de sus CDR, dominios variables, restos marco conservados y/o dominios constantes) con respecto a la estructura de un anticuerpo anti-alfa-sinucleína natural, donde dicho cambio estructural hace que el anticuerpo monoclonal anti-alfa-sinucleína presenta una funcionalidad notablemente alterada (es decir, una diferencia mayor del 20%, una diferencia mayor que el 40%, una diferencia mayor que el 60%, una diferencia mayor que el 80%, una diferencia mayor que el 100%, una diferencia mayor que el 150%, una diferencia más de 2 veces mayor, una diferencia más de 4 veces mayor, una diferencia más de 5 veces mayor, una diferencia más de 10 veces mayor en funcionalidad) con respecto a la funcionalidad presentada por dicho anticuepro anti-alfa-sinucleína natural; donde dicha funcionalidad es:
(i) una afinidad de unión (KD) del anticuerpo anti-alfa-sinucleína por la alfa-sinucleína;
(ii) una capacidad del anticuerpo anti-alfa-sinucleína de inhibir el truncamiento por proteasa de fibrillas de alfasinucleína;
(iii) una capacidad del anticuerpo anti-alfa-sinucleína de invertir el deterioro en la transmisión sináptica basal en ratones transgénicos F28-snca;
(iv) una capacidad del anticuerpo anti-alfa-sinucleína de reducir los niveles de alfa-sinucleína en el hipocampo de ratón como se mide por microdiálisis in vivo; y/o
(v) una capacidad, cuando se administra de forma crónica, del anticuerpo anti-alfa-sinucleína de restaurar la función motora en un modelo de rata de enfermedad de Parkinson;
(vi) una capacidad para prevenir la iniciación de alfa-sinucleína (tal como la acumulación de alfa-sinucleína fosforilada insoluble in vitro y/o en un modelo de ratón de enfermedad de Parkinson); y/o
(vii) una capacidad de unirse a la alfa-sinucleína truncada en un cerebro humano.
especialmente donde dicha funcionalidad alterada es el resultado del cambio estructural y por lo tanto es inseparable del mismo.
La expresión "sustancialmente sin" anticuerpos naturales se refiere a la ausencia completa de dichos anticuerpos naturales en dichas preparaciones, o a la inclusión de una concentración de dichos anticuerpos naturales en dichas preparaciones que no afecta materialmente a las propiedades de unión a la alfa-sinucleína de las preparaciones. Se dice que un anticuerpo está "aislado" si no tiene homólogo natural o se ha separado o purificado de componentes que lo acompañan de forma natural.
La expresión "anticuerpos naturales", cuando hace referencia a dichas preparaciones, se refiere a anticuerpos (incluyendo autoanticuerpos naturales) inducidos dentro de seres humanos u otros animales vivos, como consecuencia natural del funcionamiento de sus sistemas inmunitarios.
De esta manera, las preparaciones no excluyen, y de hecho incluyen esplícitamente, las preparaciones que contienen un anticuerpo anti-alfa-sinucleína y un anticuerpo adicional añadido deliberadamente capaz de unirse a un epítopo que no posee la alfa sinucleína. Dichas preparaciones particularmente incluyen realizaciones de las mismas en las que la preparción presenta una mayor eficacia en el tratamiento de sinucleinopatías tales como la enfermedad de Parkinson (incluyendo la forma idiopática y hereditaria de la enfermedad de Parkinson), Enfermedad de Gaucher, Enfermedad Difusa con Cuerpos de Lewy (DLB), variante de enfermedad de Alzheimer con cuerpos de Lewy (LBV), enfermedad Combinada de Alzheimer y Parkinson, fallo autonómico puro y atrofia multisistema.
En otro aspecto adicional, la divulgación se refiere a una composición farmacéutica que comprende:
(i) un anticuerpo anti-alfa-sinucleína o fragmento de unión a antígeno del mismo, ambos como se han definido en el presente documento o una preparación, como se define tal término en el presente documento, que comprende dicho anticuerpo anti-alfa-sinucleína o fragmento de unión a antígeno del mismo, y
(ii) un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Las composiciones farmacéuticas pueden formularse con vehículos o diluyentes farmacéuticamente aceptables así como cualquier otro adyuvante y excipiente conocido de acuerdo con técnicas convencionales tales como las desveladas en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22nd Edition, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 2013.
Los vehículos o diluyentes farmacéuticamente aceptables así como cualquier otro adyuvante y excipiente conocido debe ser adecuado para el compuesto elegido de la presente invención y el modo de administración elegido. La adecuación de los vehículos y otros componentes de las composiciones farmacéuticas se determina sobre la base de la falta de impacto negativo significativo sobre las propiedades biológicas deseadas del compuesto o composición farmacéutica elegidos (p. ej., menos de un impacto sustancial (inhibición relativa del 10 % o menos, inhibición relativa del 5 % o menos) en la unión al epítopo).
Una composición farmacéutica también puede incluir diluyentes, cargas, sales, tampones, detergentes (p. ej., un detergente no iónico, tal como Tween-20 o Tween- 80), estabilizadores (p. ej., azúcares o aminoácidos libres de proteína), conservantes, fijadores tisulares, solubilizadores y/u otros materiales adecuados para su inclusión en una composición farmacéutica. El diluyente se selecciona para no afectar a la actividad biológica de la combinación. Ejemplos de dichos diluyentes son agua destilada, solución salina fisiológica tamponada con fosfato, soluciones de Ringer, solución de dextrosa y solución de Hank. Además, la composición o formulación farmacéutica también puede incluir otros vehículos o estabilizadores y similares atóxicos, no terapéuticos, no inmunogénicos. Las composiciones también pueden incluir macromoléculas grandes de metabolismo lento, tales como proteínas, polisacáridos como quitosano, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos y copolímeros(p. ej., látex, sefarosa, agarosa, celulosa y similares funcionalizadas), aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos y agregados de lípido (p. ej., gotitas de aceite o liposomas).
Los niveles de dosificación reales de los principios activos en las composiciones farmacéuticas pueden variarse para obtener una cantidad de principio activo que sea eficaz para conseguir la respuesta terapéutica deseada para un paciente, composición y modo de administración particular. El nivel de dosificación seleccionado dependerá de una variedad de factores farmacocinéticos incluyendo la actividad de las composiciones farmacéuticas particulares empleadas, o la amida de las mismas, la vía de administración, el tiempo de administración, la velocidad de excreción del compuesto particular que se está empleando, la duración del tratamiento, otros fármacos, compuestos y/o materiales usados en combinación con las composiciones particulares empleadas, la edad, sexo, peso, afección, estado general de salud y antecedentes clínicos previos del paciente que se está tratando, y factores similares bien conocidos en las técnicas médicas.
La composición farmacéutica puede administrarse mediante cualquier vía y modo adecuados, incluyendo: medios parenterales, tópicos, orales o intranasales para el tratamiento profiláctico y/o terapéutico. Una composición farmacéutica se puede administrar por vía parenteral. Las frases "administración parenteral" y "administrado por vía parenteral" tal como se usan en el presente documento significan otros modos de administración distintos de la administración entérica y tópica, normalmente mediante inyección, e incluyen la inyección e infusión epidérmica, intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbitaria, intracardiaca, intradérmica, intraperitoneal, intratendinosa, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intrarraquídea, intracraneal, intratorácica, epidural e intraesternal. Son bien conocidas en la técnica vías de administración adicionales de administrar un compuesto de la presente invención in vivo e in vitro y los expertos habituales en la técnica pueden seleccionarlas. La composición farmacéutica se puede administrar mediante inyección o infusión intravenosa o subcutánea.
Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotonificantes, agentes antioxidantes y que retrasan la absorción y similares adecuados que sean fisiológicamente compatibles con un compuesto de la presente invención.
Los ejemplos de vehículos adecuados acuosos y no acuosos que pueden emplearse en las composiciones farmacéuticas incluyen agua, solución salina, solución salina tamponada con fosfato, etanol, dextrosa, polioles (tales como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol y similares), y mezclas adecuadas delos mismos, aceites vegetales, tales como aceite de oliva, aceite de maíz, aceite de maní, aceite de semilla de algodón y aceite de sésamo, soluciones coloidales de carboximetilcelulosa, goma tragacanto y ésteres orgánicos inyectables, tales como etil oleato, y/o diversos tampones. Otros vehículos son bien conocidos en las técnicas farmacéuticas.
Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen soluciones acuosas o dispersiones estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. El uso de dichos medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es conocido en la técnica. Excepto en tanto que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el compuesto activo, se contempla el uso del mismo en las composiciones farmacéuticas.
La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de materiales de recubrimiento tales como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula necesario en el caso de dispersiones y mediante el uso de tensioactivos.
Las composiciones farmacéuticas también pueden comprender antioxidantes farmacéuticamente aceptables, por ejemplo (1) antioxidantes hidrosolubles, tales como ácido ascórbico, clorhidrato de cisteína, bisulfato sódico, metabisulfito sódico, sulfito sódico y similares; (2) antioxidantes oleosolubles, tales como ascorbil palmitato, hidroxianisol butilado (HAB), hidroxitolueno butilado (HTB), lecitina, galato de propilo, alfa tocoferol, y similares; y (3) agentes quelantes de metales, tales como ácido cítrico, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico, y similares.
Las composiciones farmacéuticas también pueden comprender agentes isotonificantes, tales como azúcares, polialcoholes, tales como manitol, sorbitol, glicerol o cloruro sódico en las composiciones.
Las composiciones farmacéuticas también pueden contener uno o más adyuvantes apropiados para la vía de administración elegida tales como conservantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes, agentes de dispersión, conservantes o tampones que pueden potenciar la semivida o la eficacia de la composición farmacéutica. Los compuestos de la presente invención pueden prepararse con vehículos que protegerán el compuesto contra la liberación rápida, tales como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes, parches transdérmicos y sistemas de dispensación microencapsulados. Dichos vehículos pueden incluir gelatina, monoestearato de glicerilo, diestearato de glicerilo, polímeros biocompatibles biodegradables tales como etilenvinilacetato, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres, y ácido poliláctico solo o con una cera, u otros materiales bien conocidos en la técnica. Los métodos para la preparación de dichas formulaciones son conocidos, en general, por los expertos en la técnica. Véase, p. ej.,, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.
En un aspecto, los compuestos de la presente invención pueden formularse para garantizar su distribución apropiada in vivo. Los vehículos farmacéuticamente aceptables para la administración parenteral incluyen soluciones acuosas o dispersiones estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. El uso de dichos medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es conocido en la técnica. Excepto en tanto que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el compuesto activo, se contempla el uso del mismo en las composiciones farmacéuticas. También pueden incorporarse en las composiciones compuestos complementarios activos.
Las composiciones farmacéuticas para inyección han de ser típicamente estériles y estables en las condiciones de fabricación y almacenamiento. La composición puede formularse como una solución, microemulsión, liposoma u otra estructura ordenada adecuada para una alta concentración de fármaco. El vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersión acuoso o no acuoso que contiene, por ejemplo, agua, etanol, polioles (tales como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol y similares), y mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales, tales como aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables, tales como etil oleato. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula necesario en el caso de dispersión y mediante el uso de tensioactivos. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como glicerol, manitol, sorbitol o cloruro sódico en la composición. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede propiciarse incluyendo en la composición un agente que retrase la absorción del anticuerpo, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina. Las soluciones inyectables estériles pueden prepararse mediante incorporando el compuesto activo en la cantidad necesaria en un disolvente adecuado con uno o una combinación de ingredientes (p. ej., tal como se enumera anteriormente, de la forma necesaria, seguido de esterilización por microfiltración. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros principios necesarios p. ej., de entre los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, son ejemplos de métodos de preparación la deshidratación por vacío y la deshidratación por congelación (liofilización), que dan un polvo del principio activo más cualquier principio adicional deseado a partir de una solución previamente esterilizada por filtración del mismo.
Las soluciones inyectables estériles pueden prepararse mediante incorporando el compuesto activo en la cantidad necesaria en un disolvente adecuado con uno o una combinación de los ingredientes enumerados anteriormente, de la forma necesaria, seguido de esterilización por microfiltración. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros principios necesarios de entre los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, son ejemplos de métodos de preparación la deshidratación por vacío y la deshidratación por congelación (liofilización), que dan un polvo del principio activo más cualquier principio adicional deseado a partir de una solución previamente esterilizada por filtración del mismo.
Las pautas posológicas de los métodos anteriores de tratamiento y usos descritos en el presente documento se ajustan para proporcionar la respuesta óptima deseada (p. ej., una respuesta terapéutica). Por ejemplo, puede administrarse un bolo individual, pueden administrarse varias dosis divididas a lo largo del tiempo, o puede reducirse o incrementarse proporcionalmente la dosis tal como indiquen las exigencias de la situación terapéutica. Las composiciones parenterales pueden formularse en forma de dosificación unitaria para la facilidad de la administración y la uniformidad de la dosificación. La forma de dosificación unitaria tal como se usa en el presente documento se refiere a unidades físicamente discretas utilizables como dosificaciones unitarias para tratar a los sujetos; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico necesario. Las especificaciones para las formas de dosificación unitarias de la presente invención están establecidas y son directamente dependientes de (a) las características exclusivas del compuesto activo y del efecto terapéutico particular a conseguir (b) las limitaciones inherentes en la técnica de componer dicho compuesto activo para el tratamiento de la sensibilidad en los individuos.
Las dosificaciones y pautas posológicas eficaces para los anticuerpos anti-alfa-sinucleína, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, dependen de la enfermedad o afección que se va a tratar y pueden determinarlas los expertos en la técnica. En un determinado día en el que se da esa dosificación, la dosificación puede oscilar desde alrededor de 0.0001 hasta alrededor de 100 mg/kg, y más habitualmente, desde alrededor de 0.01 hasta alrededor de 5 mg/kg, de peso corporal del anfitrión. Por ejemplo, las dosificaciones pueden ser de 1 mg/kg de peso corporal o 10 mg/kg de peso corporal o dentro del intervalo de 1-10 mg/kg de peso corporal. Las dosis de ejemplo incluyen, por tanto: desde alrededor de 0.1 hasta alrededor de 10 mg/kg de peso corporal, desde alrededor de 0.1 hasta alrededor de 5 mg/kg de peso corporal, desde alrededor de 0.1 hasta alrededor de 2 mg/kg de peso corporal, desde alrededor de 0.1 hasta alrededor de 1 mg/kg de peso corporal, por ejemplo, alrededor de 0.15 mg/kg de peso corporal, alrededor de 0.2 mg/kg de peso corporal, alrededor de 0.5 mg/kg de peso corporal, alrededor de 1 mg/kg de peso corporal, alrededor de 1.5 mg/kg de peso corporal, alrededor de 2 mg/kg de peso corporal, alrededor de 5 mg/kg de peso corporal, o alrededor de 10 mg/kg de peso corporal.
Un médico que tenga experiencia ordinaria en la técnica puede determinar y prescribir fácilmente la cantidad eficaz de la composición farmacéutica necesaria. Por ejemplo, el médico puede iniciar las dosis del anticuerpo anti-alfa-sinucleína, o fragmentos de unión a antígeno del mismo, de la invención, empleado en la composición farmacéutica a niveles menores de los necesarios para lograr el efecto terapéutico deseado e incrementar gradualmente la dosificación hasta que se logra el efecto deseado. En general, una dosis diaria adecuada de una composición de la presente invención será aquella cantidad de compuesto que es la dosis mínima eficaz para producir un efecto terapéutico. Dicha dosis eficaz dependerá generalmente de los factores descritos anteriormente. La administración puede ser p. ej., intravenosa, intramuscular, intraperitoneal o subcutánea. Si se desea, la dosis diaria eficaz de una composición farmacéutica puede administrarse como dos, tres, cuatro, cinco, seis o más subdosis de forma separada a intervalos apropiados a lo largo del día, en formas de dosificación unitarias. Aunque es posible administrar un compuesto de la presente invención solo, es preferible administrar el compuesto como una composición farmacéutica, tal como se describe anteriormente.
Los anticuerpos marcados de la invención pueden usarse para fines diagnósticos para detectar, diagnosticar o vigilar enfermedades o trastornos. La invención proporciona la detección o diagnóstico de una enfermedad o trastorno neurodegenerativo o cognitivo, incluyendo, pero sin limitación, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Parkinson idiopática, la enfermedad de Parkinson familiar, Enfermedad Difusa con Cuerpos de Lewy (DLBD), variante de enfermedad de Alzheimer con cuerpos de Lewy (LBV), enfermedad Combinada de Alzheimer y Parkinson, fallo autonómico puro o atrofia multisistema, que comprende: (a) ensayar la existencia de especies y fragmentos de alfa-sinucleína en células o muestras de tejido de un sujeto usando uno o más anticuerpos que se unen específicamente a la alfa-sinucleína; y (b) comparar el nivel del antígeno con un nivel de control, por ejemplo, niveles en muestras de tejidos normales, con lo que un aumento en el nivel ensayado de antígeno en comparación con el nivel de control de antígeno es indicativo de la enfermedad o trastorno, o indicativo de la gravedad de la enfermedad o trastorno.
Pueden usarse anticuerpos de la invención para ensayar monómeros de alfa-sinucleína, oligómeros, formas fibrilares o fragmentos de alfa-sinucleína en una muestra biológica usando métodos inmunohistoquímicos bien conocidos en la técnica. Otros métodos basados en anticuerpos útiles para detectar proteínas incluyen inmunoensayos tales como el inmunoensayo ligado a enzimas (ELISA), radioinmunoensayo (RIA) y ensayos basados en plataformas de descubrimiento a mesoescala (MSD). Los marcadores de anticuerpo adecuados pueden usarse en dichos kits y métodos, y los marcadores conocidos en la técnica incluyen marcadores enzimáticos, tales como fosfatasa alcalina y glucosa oxidasa; marcadores de radioisótopos tales como yodo (125I, 131I), carbono (14C), azufre (35S), tritio (3H), indio (121In) y tecnecio (99mTc); y marcadores luminiscentes tales como luminol y luciferasa; y marcadores fluorescentes tales como fluoresceína y rodamina.
La presencia de anticuerpos anti-alfa-sinucleína marcados o sus fragmentos de unión a alfa-sinucleína pueden detectarse in vivo con fines de diagnóstico. En una realización, el diagnóstico comprende: a) administrar a un sujeto una cantidad eficaz de dicha molécula marcada; b) esperar un intervalo de tiempo después de la administración para permitir que la molécula marcada se concentre en sitios (si los hay) de deposición de Ap y permitir que la molécula marcada no unida se elimine hasta un nivel de fondo; c) determinar un nivel de fondo; y d) detectar la molécula marcada en el sujeto, de tal forma que la detección de la molécula marcada por encima del nivel de fondo es indicativa de que el sujeto tiene la enfermedad o trastorno, o es indicativa de la gravedad de la enfermedad o trastorno. De acuerdo con dicha realización, la molécula se marca con un resto de formación de imágenes adecuado para la detección usando un sistema de formación de imágenes particular conocido por los los expertos en la materia. Los niveles de fondo pueden determinarse por diversos métodos conocidos en la técnica, incluyendo al comparación de la cantidad de anticuerpo marcado detectado con un valor estándar previamente determinado para un sistema de formación de imágenes particular. Los métodos y sistemas que pueden usarse en los métodos de diagnóstico de la invención incluyen, pero si limitación, tomografía computarizada (TC), exploración del cuerpo entero tal como tomografía de emisión de positrones (PET), formación de imágenes de resonancia magnética (MRI) y sonografía.
En un aspecto adicional, la invención se refiere a un anticuerpo, de la invención, para uso en medicina.
En un aspecto adicional, la invención se refiere a un anticuerpo, de la invención, para uso en el tratamiento, diagnóstico o formación de imágenes de una sinucleinopatía.
En una realización, el anticuerpo monoclonal es para uso en el tratamiento de la enfermedad de Parkinson, enfermedad idiopática de Parkinson, formas familiares de enfermedad de Parkinson, Enfermedad Difusa con Cuerpos de Lewy (DLBD), variante de enfermedad de Alzheimer con cuerpos de Lewy (LBV), enfermedad Combinada de Alzheimer y Parkinson, fallo autonómico puro o atrofia multisistema.
En un aspecto adicional, la invención se refiere al uso del anticuerpo, de la invención, en la fabricación de un medicamento para tratar, diagnosticar o formar imágenes de una sinucleinopatía.
En un aspecto adicional, la invención se refiere al tratamiento, diagnóstico o formación de imágenes de la enfermedad de Parkinson u otras sinucleinopatías, que comprende administrar una dosificación eficaz de un anticuerpo de la invención.
Preferentemente, el tratamiento es crónico y preferentemente se realiza durante al menos 2 semanas, tal como al menos durante 1 mes, 6 meses, 1 año o más.
En un aspecto adicional, la divulgación proporciona un kit que comprende el anticuerpo, o fragmento de unión antígeno del mismo, de la invención.
EJEMPLOS
Ejemplo 1: Selección de anticuerpos
1. Producción de inmunógeno y ligando
Se adquirieron o produjeron las siguientes proteínas para uso como los inmunógenos mostrados en la Fig. 1. Los ratones se inmunizaron con tres inmunógenos: fibrillas de alfa-sinucleína humana recombinante de longitud completa; proteína recombinante alfa-sinucleína humana que contiene los aminoácidos 1-60 (Rpeptide, Bogart, Georgia) y proteína recombinante alfa-sinucleína humana que contiene los aminoácidos 1-119. Para obtener las fibrillas de longitud completa de la alfa-sinucleína, se usó un producto liofilizado de Rpeptide, Bogart, Georgia (número de Catálogo S-1001-2). Este se disolvió en tampón tris 20 mM y NaCl 300 mM a una concentración de 1 mg/ml de proteína. Para obtener las fibrillas, la solución de proteína se incubó en alícuotas de 170 |jl en una placa de 96 pocillos con una perla cerámica de 70 jm de diámetro en cada pocillo a 200 rpm en una incubadora agitadora Vortemp 56 (Labnet International, Edison, NJ, USA), a 37 °C durante 7 días, y la formación de las fibrillas se siguió añadiendo tioflavina T y midiendo la fluorescencia en uno de los pocillos. La alfa-sinucleína recombinante que contenía los aminoácidos 1-60 se disolvió en agua para dar una concentración de 1 mg/ml. La alfa-sinucleína recombinante que contenía los aminoácidos 1-119 se obtuvo usando la siguiente construcción: Se sintetizó un gen sintético que codificaba un marcador de Histidina de 6 aminoácidos, seguido por el sitio de escisión del factor Xa y la secuencia codificante para los aminoácidos 1-119 de la alfa-sinucleína humana:
MAHHHHHHIE GRMDVFMKGL SKAKEGVVAA AEKTKQGVAE AAGKTKEGVL YVGSKTKEGV VHGVATVAEK TKEQVTNVGG AVVTGVTAVA QKTVEGAGSI AAATGFVKKD QLGKNEEGAP QEGILEDMPV D (SEQ ID NO:16) por Genscript y se clonó en el sitio Ndel-Xhol en el vector de expresión pET24a(+) (Novagen).
El vector de expresión se utilizó para transformar E. coli BL21 y se repicó una sola colonia para la expresión usando el sistema de autoinducción exprés de una noche de Novagen (protocolo de Usuario TB383 rev. H1005). La escala fue de 500 ml de volumen de cultivo final. Las células se recogieron por centrifugación durante 10 minutos a 6000 g y posteriormente se lisaron usando el Reactivo de extracción de proteínas BugBuster (protocolo de Usuario TB245 Rev. 0304). Después de la lisis, la muestra se limpió por centrifugación y el sobrenadante se usó para una purificación adicional.
La proteína con marcador His se purificó en una columna HisTrap de 5 ml (GE healthcare) equilibrada en fosfato sódico 20 mM pH 7.5, NaCl 1 M (tampón A). Después de la aplicación de la muestra y del lavado usando tampón A, la proteína se eluyó en un gradiente hasta Imidazol 0.25 M en tampón A con 20 volúmenes de columna. Se recogieron fracciones de 5 ml y se analizaron por SDS-PAGE. Se reunieron las fracciones con la proteína de interés, se concentraron y se aplicaron a una columna de exclusión molecular S200 (26/60) (GE healthcare) en tris 10 mM pH 7.4, NaCl 300 mM. De nuevo, se reunieron fracciones de acuerdo con la presencia en SDS-PAGE de una banda con el tamaño esperado.
Para retirar el marcador N-terminal, la alfa-sinucleína 1-119 marcada con his purificada se incubó con factor Xa en una relación 1:50 usando el kit Novagen (69037-3FRX). Después de la incubación durante una noche, se retiró el factor Xa por lotes usando agarosa Xarrest. La alfa-sinucleína 1-119 escindida finalmente se purificó por cromatografía HisTrap permisiva como se ha descrito anteriormente. A partir del eluato se obtuvo la alfasinucleína 1-119 purificada y se concentró a ~400 |jg/ml usando dispositivos de concentración centricón.
La alfa-sinucleína (Rpeptide) se rehidrató en PBS a 2 mg/ml y se añadió gota a gota peroxinitrito (100 jl/mg de proteína) mientras se mezclaba. La alfa-sinucleína nitrosilada después se dializó en 5 l de PBS y se almacenó a -20 °C.
Se usó dopamina para oxidar la alfa-sinucleína. Se combinaron volúmenes iguales de una solución 200 jM de Dopamina-HCL (Sigma P5244) preparada en PBS 10 mM, pH 7.4 y una solución 28 jM de alfa-sinucleína (Rpeptide) en p Bs 10 mM, pH 7.4. La alfa-sinucleína 14 jM/Dopamina 100 jM resultante se incubó a 37 °C durante la noche. La alfa-sinucleína oxidada después se dializó en PBS y se almacenó a -20 °C.
Se produjeron diferentes versiones nativas y quiméricas de proteínas sinucleína para seleccionar una biblioteca diversa de anticuerpos anti-alfa-sinucleína. Las construcciones de selección incluían lo siguiente: alfa-sinucleína humana, de ratón, de rata y de mono cynomolgus, Beta-sinucleína humana, Gamma-sinucleína humana (fig 21 y 22) y finalmente un derivado de alfa-sinucleína que carecía de los restos 120-140 de la alfa-sinucleína. Además, se produjo una serie de 4 construcciones de barajado: A-Syn-AAKK-BAP, A-Syn-BAAK-BAP, A-Syn-BBAA-BAP, A-Syn-BBKK-BAP (SEQ ID NO:11-14).
Estas construcciones contenían tramos lineales de alfa-sinucleína humana (A), beta-sinucleína humana (B) y alfa-sinucleína de pollo (K). Se clonaron genes que contenían un marcado de Péptido Aceptor de Biotina (BAP) fusionado al extremo C de los ligandos para facilitar la biotinilación específica de sitio de cada uno de los ligandos. La biotinilación permitió la unión de los ligandos a perlas usadas en el formato ELISA soluble. Se construyeron vectores de expresión de mamífero que llevaban las diferentes construcciones de fusión de marcador BAP de alfa-sinucleína (ASynBAP). Los ligandos se expresaron en células HEK 293 usando transfección transitoria (Genmab A/S).
2. Inmunización
Se obtuvieron anticuerpos HuMab-Sinucleína a partir de las inmunizaciones de la cepa de ratón HuMAb HCo17-BALB/c y HCo12-BALB/c, con doble inactivación para la cadena ligera kappa de ratón y pesada de inmunoglobulina (Ig) de ratón, que impide la expresión de anticuerpos que sean completamente murinos (anticuerpo monoclonal humano; Medarex Inc., San Jose, CA, USA). Las diversas cepas de ratón se hicieron transgénicas mediante la inserción de loci de cadena ligera kappa de Ig humana y cadena pesada de Ig humana y difieren en el número de genes VL (dominio variable de cadena ligera) y VH (dominio variable de cadena pesada) humanos.
Se inmunizaron 48 ratones de forma alterna por vía intraperitoneal (IP) con 20 |jg de antígenos y por vía subcutánea (SC, en la base de la cola) con el mismo inmunógeno, con un intervalo de 14 días. Se realizó un máximo de ocho inmunizaciones, 4 IP y 4 SC.
La primera inmunización se realizó con inmunógenos de alfa-sinucleína en adyuvante completo de Freund (CFA; Difco Laboratories, Detroit, MI, USA), las siguientes inmunizaciones en adyuvante incompleto de Freund (IFA). Cuando se consideraron suficientes los títulos en suero (dilución de suero de 1/50 o menor considerada positiva en el ensayo de selección específico de antígeno como se ha descrito anteriormente en el presente documento en al menos dos acontecimientos de selección secuenciales, bisemanales), los ratones se reforzaron adicionalmente dos veces por vía intravenosa (IV) con 10 jg de proteína inmunógeno alfa-sinucleína en 100 j l de PBS, cuatro y tres días antes de la fusión.
Los protocolos de inmunización se muestran en laFig 1.
El anticuerpo 37 procedía de un protocolo de inmunización en el que se usaron fibrillas de a-Sinucleína de longitud completa humanas, alternando con formas truncadas en el extremo C de alfa-sinucleína con los aminoácidos 1-60 y 1-119.
El anticuerpo 285 procedía de un protocolo de inmunización en el que se usó monómero 1-140 de a-Sinucleína humana para las 4 primeras inmunizaciones. Sin o había título, la inmunización se continuaba con fibrillas (ip/sc), o de lo contrario se continuaba con monómero.
3. Generación de hibridoma HuMab
Se sacrificaron ratones HuMab con suficiente desarrollo de título específico de antígeno como se ha definido anteriormente y se recogieron el bazo y los ganglios linfáticos que flanqueaban la aorta abdominal y la vena cava. Se realizó una fusión de esplenocitos y células de ganglios linfáticos con una línea celular de mieloma de ratón por electrofusión usando un Sistema de Electrofusión CEEF 50 (Cyto Pulse Sciences, Glen Burnie, MD, USA), esencialmente de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las células fusionadas se sembraron medio de fusión que contenía suero Bovino Fetal Clon I (Perbio) al 10%, piruvato sódico 1 mM (Cambrex), 0.5 U/ml de penicilina, 0.5 U/ml de estreptomicina (Cambrex), 2-mercaptoetanol 50 |jM (Invitrogen), 600 ng/ml de interleucina 6 (IL-6) (Strathmann), HAT 1 x (Sigma) y 0.5 mg/ml de kanamicina (Invitrogen) en HyQ mADCF-Mab (Perbio). Después de diez días, se recogió el sobrenadante y las células se refrescaron con medio de recolección, que contenía suero bovino fetal Clon I al 10%, 0.5 U/ml de penicilina, 0.5 U/ml de estreptomicina, 600 ng/ml de IL-6 y proHT 1 x (Cambrex) en HyQ mADCF-Mab. Los sobrenadantes de los cultivos de hibridoma se seleccionaron por ensayos de selección primarios. Los sobrenadantes se caracterizaron por la unión a ocho ligandos diferentes. Estos incluían 4 ortólogos: humana, de ratón, de rata y de mono cynomolgus, alfa-sinucleína humana Betasinucleína y Gamma-sinucleína humana (SEQ ID NO 37-41) y finalmente se ensayaron con respecto a su capacidad de unirse a un derivado de alfa-sinucleína humana que carecía de los restos 120-140 de la alfasinucleína.
La selección de anticuerpos anti-alfa-sinucleína se realizó usando un formato ELISA en suspensión de alto rendimiento usando sistemas de manipulación de líquidos automático (Genmab A/S). La lectura de las placas ser realizó por dos sistemas, el FMAT 8200 de Applied Biosystems se usó para leer placas de 384 pocillos y el ImageXpress Velos Cytometer de Molecular Devices se usó para leer las placas de 1536 pocillos.
Los clones de selección primarios se caracterizaron por su capacidad de unirse a 8 ligandos diferentes. Estos incluían una serie de 4 construcciones de barajado: A-Syn-AAKK-BAP, A-Syn-BAAK-BAP, A-Syn-BBAA-BAP, A-Syn-BBKK-BAP (SEQ ID NO:11-14), alfa-sinucleína 120-140 deleción-BAP, alfa-sinucleína humana nitrada-BAP y alfa-sinucleína humana oxidada-BAP.
En resumen, los sueros o el sobrenadante que potencialmente contenía anticuerpos específicos par la alfasinucleína se añadieron a las perlas para permitir la unión a la alfa-sinucleína y/o a las construcciones derivadas de alfa-sinucleína. La unión de los anticuerpos anti-alfa-sinucleína se detecta usando un conjugado fluorescente, IgG de cabra anti-humana conjugada con DyLight649, específica de Fc. En las selecciones se incluyeron dos anticuerpos anti-alfa-sinucleína de ratón conocidos, LB509 y Syn211, como controles positivos. Para asegurar la detección específica de los anticuerpos contra la alfa-sinucleína, se usó un conjunto de suero anti-alfa-sinucleína como control negativo en la selección de títulos de formato de 384 pocillos mientras que se usó IgG ChromPure humana en el ensayo basado en 8 perlas con formato de 1536 pocillos.
Se sembraron células de hibridoma de los mejores pocillos primarios en medio semisólido hecho de CloneMedia al 40% (Genetix, Hampshire, Reino Unido) y medio completo HyQ 2x al 60% (Hyclone, Waltham, USA). Para cada pocillo primario, se sembró un pocillo de una placa negra Genetix de 6 pocillos. A partir de cada pocillo se repicaron 25 subclones usando el sistema ClonePix (Genetix). Los subclones se repicaron en medio de recolección. Después de siete días, los sobrenadantes de los subclones se seleccionaron de nuevo con respecto a la unión de IgG humana específica de sinucleína y la concentración de IgG humana se midió usando Octet (Fortebio, Menlo Park, USA). A partir d cada pocillo primario, se seleccionó el mejor subclón y se expandió en medio de expansión que contenía solo 600 ng/ml de IL-6, 0.5 U/ml de penicilina, 0.5 U/ml de estreptomicina y proHT 1 x. Los subclones se expandieron a partir de un pocillo de la placa de 96 pocillos a un pocillo de la placa de 24 pocillos a cuatro pocillos de la placa de 24 pocillos a seis pocillos de la placa de 6 pocillos. Los clones obtenidos por este proceso se denominaron clones primarios (PC).
Se realizaron estudios de unión a anticuerpo adicionales usando Octet 384RED (Fortebio, Menlo Park, USA). Se obtuvieron soluciones de anticuerpo HuMab de 2 |jg/ml por dilución en diluyente de muestra (ForteBio, art. n.° 18-5028). Se usaron sensores reactivos con amina (ForteBio, art.n.° 18-0008) para la inmovilización de los HuMab. Antes del acoplamiento con los sensores reactivos amina, los HuMab se diluyeron en tampón MES pH 6.0 (18-5027). El acoplamiento se realizó a 30 °C y 1000 rpm como se indica a continuación: los sensores reactivos a amina se prehumedecieron en PBS y posteriormente se activaron con solución de activación EDC/NHS(ForteBio. Art.n.° 18-1033/18-1034)(de acuerdo con las instrucciones del fabricante) durante 300 segundos. Los sensores activados se inmovilizaron con HuMab durante 600 segundos.
La unión de 37 y 285 en Octet a alfa-sinucleína humana, de mono cynomolgus y de ratón, y la ausencia de unión a la beta o gamma sinucleína humana se muestra en la Figura 2
4. Análisis de secuencia de los dominios variables de HuMab específicos de sinucleína y clonación en vectores de expresión
Se preparó ARN total a partir de 0.2 a 5 x 106 células de hibridoma y se preparó ADN complementario 5'-RACE (ADNc) a partir de 100 ng de ARN total, usando el kit de Amplificación de A<d>N<c>SMART RACE (Clontech), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las regiones codificantes VH y VL se amplificaron por PCR y se clonaron directamente, en fase, en los vectores de expresión p33G1f y p33Kappa (que contenía las secuencias codificantes del dominio constante IgG1/kappa humano), por clonación independiente de ligamiento (Aslanidis, C. y P. J. de Jong, Nucleic Acids Res 1990;18(20): 6069-74). Para cada anticuerpo, se secuenciaron 16 clones VL y 16 clones VH. Se seleccionaron clones con una Fase de Lectura Abierta (ORF) para el estudio y expresión adicional. Se coexpresaron de forma transitoria vectores de todas las combinaciones de cadenas pesadas y cadenas ligeras en células FreesyleTM 293-F usando 293fectin.
En el caso de la secuenciación de GM37 de la región VH, se identificó una cisteína extra en el dominio CDR3 en la posición 106. Para eliminar la posibilidad de un plegamiento erróneo y la pérdida potencial de actividad del anticuerpo debido a la formación de enlaces disulfuro, la cisteína se mutó a serina en la posición 106.
Se generó el anticuerpo comparador 9E4 basándose en la secuencia de VH y VL obtenida a partir del hibridoma PTA-8221 (patente de Estados Unidos 20080175838) (SEQ ID NO42y 43)
5. Expresión/purificación de anticuerpos
Se produjeron anticuerpos por transfección en células HEK293 6E usando los vectores pTT5 y PEIpro como agente de transfección transitoria (National Research Council of Canadá). En resumen, las cadenas pesada y ligera se transfectaron en células HEK293 usando PEIpro (VWR) y las células se suplementaron con TN1 (Sigma) 24 horas después de la transfección. Las células se dejaron crecer hasta que la viabilidad alcanzó un 50% y el rendimiento de anticuerpo se midió por título de IgG fácil (Thermo). El sobrenadante de cultivo se filtró sobre filtros ciegos "dead-end" de 0.2 |jm, cargados en columnas de Proteína A de 5 ml (rProtein A FF, Amersham Bioscience) y se eluyeron con ácido cítrico 0.1 M-NaOH, pH 3. El eluato se neutralizó inmediatamente con Tris-HCl 2 M, pH 9 y se dializó frente a NaH2PO4 12.6 mM , NaCl 140 mM, pH 7.4 (B.Braun), O/N. Después de la diálisis, las muestras se filtraron de forma estéril sobre filtros "dead-end" de 0.2 jm. La pureza se determinó por SDS-PAGE y la concentración se midió por nefelometría y absorbancia a 280 nm. Se recogieron alícuotas de los anticuerpos purificados y se almacenaron a -80 °C.
Ejemplo 2: Caracterización de anticuerpos usando resonancia de plasmón superficial
La unión en tiempo real de los anticuerpos a la alfa-sinucleína se midió usando un BIAcore® 3000. Se preparó una superficie de captura por acoplamiento de amina a un anticuerpo policlonal de conejo Anti-Ratón (parte del Kit de Captura de Anticuerpo de Ratón, GE Healthcare, Cat. n.°: BR-1008-38) en una primera celda de flujo (Fc1) y una segunda celda de flujo (Fc2) de un chip CM5 (BIAcore®). El anticuerpo de ratón se capturó en Fc2 a la concentración necesaria para conseguir un nivel de ligando de aproximadamente 500 RU. La línea basal se dejó estabilizar durante 10 minutos antes de inyectar el analito (ASynBAP) en Fc1-2 a 30 jl/min. ASynBAP se realizó a 100-3200 nM y 25-3200 RU, respectivamente. La máxima concentración en cada serie de titulación se realizó por duplicado. La superficie se regeneró con Glicina 10 mM-HCl, pH 1.7 (inyección 30 seg) para retirar el anticuerpo de ratón capturado y el analito al final de cada ciclo. se usó HBS-EP (GE Healthcare, Cat. n.°: BR-1001-88) como tampón de procesamiento y diluyente de la muestra en todos los experimentos y el ensayo se realizó a 25 °C. Todas las muestras se mantuvieron a 4 °C antes de la adquisición.
La respuesta registrada en Fc1, en la que el anticuerpo de captura se había inmovilizado pero no se había capturado el anticuerpo contra la Alfa-Sinucleína, se restó de la respuesta en Fc2. Se ajustó un algoritmo de unión 1:1 o 2:1 a la serie de datos usando el software BIAevaluation versión 4.1.1. Los resultados pueden verse en lasFigs. 3, 4 y 5que muestran la unión del anticuerpo 37, 285 y 9E4 a la alfa-sinucleína humana.
Ejemplo 3: Mapeo de epítopos
El mapeo de epítopos de los anticuerpos contra la alfa-sinucleína se realizó con series de péptidos lineales solapantes en Pepscan (Pepscan Zuidersluisweg 28243 RC Lelystad, Países Bajos). La unión del anticuerpo a cada uno de los péptidos 20 meros sintetizados se ensayó en un ELISA basado en Pepscan. La serie de péptidos lineales que cubría la secuencia codificante entera de la alfa-sinucleína, así como todos los péptidos con metioninas oxidadas o tirosinas nitrosiladas, se incubaron con solución de anticuerpo primario (durante una noche a 4 °C). Después del lavado, las series de péptidos se incubaron con una dilución 1/1000 de un conjugado el anticuerpo-peroxidasa (SBA, cat. n.° 2010-05) durante una hora a 25 °C. Después del lavado, se añadieron el sustrato de peroxidasa 2,2'-azino-di-3-etilbenzotiazolina sulfonato (ABTS) y 2 |jl/ml de H2O2 al 3 por ciento. Después de una hora, se midió el desarrollo de color. El desarrollo de color se cuantificó con una cámara de dispositivo acoplado a carga (CCD) y un sistema de procesamiento de imágenes. Para el procesamiento de los datos, los valores se obtuvieron a partir del intervalo de la cámara CCD de 0 a 3000 mAU, de forma similar a un lector ELISA de placas de 96 pocillos convencional. Los resultados se cuantificaron y se almacenaron en la base de datos Peplab. Ocasionalmente, un pocillo contiene una burbuja de aire que da como resultado un valor falso positivo, las tarjetas se inspeccionan manualmente y todos los valores debidos a la burbuja de aire reciben una puntuación de 0. Los datos de unión del anticuerpo 37 y 285 a péptidos que contienen la secuencia ILEDMP o ILED respectivamente pueden verse en laFigura 7.
Ejemplo 4: Inmunoprecipitación de alfa-sinucleína a partir de homogeneizados de cerebro humano de la corteza cingulada de pacientes con demencia con cuerpos de Lewy
La capacidad de los anticuerpos y eliminar la alfa-sinucleína de homogeneizados en bruto de corteza cingulada de DLB humana o controles sanos (marcados con *) se analizó por inmunoprecipitación. Se diseccionaron muestras congeladas de corteza cingulada humana (obtenida mediante Tissue Solutions Ltd, Escocia) en un criostato, y se añadieron 100 mg de muestra a 1600 |jl de reactivo de lisis de células M cellytic (Sigma C2978) que contenía inhibidores de proteasa e inhibidores de fosfatasa (Roche). El tejido cerebral se homogeneizó hasta que la muestra se disolvió completamente usando un homogeneizador de perlas Precellys (Bertin technologies, Francia) 4 veces durante 30 segundos a 5000 rpm. La solución se centrifugó a 3000 xg y el sobrenadante se usó como homogeneizado bruto para la inmunoprecipitación.
Para la inmunoprecipitación se mezclaron 10 jg de anticuerpo con perlas magnéticas de proteína G Dynabeads usando las instrucciones del fabricante (Life Technologies, Paisley, Reino Unido). El homogeneizado de cerebro bruto se diluyó 30 veces en tampón de lisis (Sigma). Se mezclaron dynabeads acopladas a anticuerpo con 500 ul de homogeneizado diluido y se incubaron 90 minutos a temperatura ambiente bajo una mezcla continua en un dispositivo rotatorio. Después de la incubación, las perlas se lavaron en tampón de lavado y los antígenos unidos se eluyeron usando el tampón de elución no desnaturalizante de acuerdo con las instrucciones del fabricante (protocolo Dynabeads G, Life Technologies, Paisley Reino Unido). El rendimiento de la inmunoprecipitación se visualizó por transferencia de Western con anticuerpo anti-alfa-sinucleína humana monoclonal de ratón(4B12, Thermo Scientific). Los patrones de las bandas que representan diferentes formas de peso molecular de alfasinucleína que se derrumban difieren entre los anticuerpos 37, variante 2 de 37 y 285 y el anticuerpo comparador 9E4 ya que el anticuerpo 37, 37v2 y 285 puede inmunoprecipitar las especies principales de alfa-sinucleína, la alfa-sinucleína de longitud completa (FL asyn 1-140) y la especie truncada en el extremo extremo C (1-135 y 1-119/122), mientras que el anticuerpo 9E4 no puede inmunoprecipitar la especie truncada 1-119/122.Figura 9.
Ejemplo 5: Inhibición del truncamiento por proteasa de fibrillas de alfa-sinucleína por anticuerpos en cultivo celular
Los monómeros y fibrillas de alfa-sinucleína recombinantes pueden captarse por neuronas primarias en cultivo. Como se muestra esquemáticamente en la Figura 10, después de la captación de la alfa-sinucleína en las neuronas, puede procesarse por proteasas intracelulares, tales como Calpaína I, con el sitio sensible a proteasa principal en el aminoácido 119/122. Para investigar el truncamiento de la alfa-sinucleína por proteasas, se prepararon neuronas corticales primarias de ratón como se describe en Elvang et al. 2009 (Elvang et al.. J Neurochem. 2009; 110(5): 1377-87) y se trataron con citarabina en DIV3 (3 días in vitro) para inhibir el crecimiento de astrocitos. Tras DIV4 (4 días in vitro) las neuronas se trataron con fibrillas de alfa-sinucleína preformadas (PFF) sonicadas (5 min a 50% de potencia en sonicador con punta) a una concentración final de 0.7 jM solo o junto con anticuerpos en las concentraciones indicadas. Después de 24 horas de incubación, se recogió el medio y las células se lisaron. Se realizaron Transferencias de Western en los dos medios y lisado celular usando el anticuerpo 4B12 (Fig 11A) (Pierce MA1-90346) y un anticuerpo secundario anti-ratón. Después de sondar con 4B12 anti ratón, las manchas de transferencia se retiraron y se volvieron a sondar con un anticuerpo anti-IgG humano. Tras la transferencia con 4B12, puede verse que en el medio de las células tratadas con PFF solo, había bandas fuertes a 14 y 12 kDa, donde 14 kDa representan la alfa-sinucleína de longitud completa (FL-asyn) y 12 kDa representa el fragmento 1-119/122 (CT-asyn) truncado en el extremo C. Además de esto, había bandas de mayor peso molecular, que lo más probable es que representen especies oligoméricas resistentes a SDS. El cotratamiento con el anticuerpo de control de isotipo B12 no cambió este patrón de proteólisis o captación.
En el medio de células tratadas con fibrillas junto con 37 hubo principalmente alfa-sinucleína de longitud completa (14 kD) y solo pequeñas cantidades de la banda truncada en el extremo (12 kD). En el lisado celular de células tratadas con fibrillas junto con 37 había solo alfa-sinucleína de longitud completa, indicando que 37 impedía la escisión de FL-alfa-sinucleína. Además, la cantidad total de FL-alfa-sinucleína está reducida en relación con las células tratadas con PFF solo o anticuerpo de control B12. Varios grupos (Games et al, Am J of Pathol, Vol. 182, n.° 3, March, 2013; Ritchie et al, Health, Vol. 4, Special Issue, 1167-1177, 2012; Mishizen-Eberz, Biochemistry, 2005, 44, 7818-7829; Dufty et al, Am J of Pathol, Vol. 170, n.° 5, May 2007) han demostrado que la alfa sinucleína puede escindirse por la Calpaína 1. El sitio de escisión de Calpaína 1 para la alfa-sinucleína en forma de fibrillas se ha encontrado en la región 114-122 (Mishizen-Eberz, J of Neurochem, 86, 836-847, 2003). In vivo en animales transgénicos y cerebro humano, 1-119/122 parece ser el producto de escisión principal - en la alfa-sinucleína, la escisión probablemente se realiza después del asparto 119 o la asparagina 122, que se desamida a aspartato y se escinde por Calpaína u otra proteasa con una especificidad de escisión similar. Estos resultados indican que el anticuerpo 37 puede inhibir el truncamiento C terminal de la alfa-sinucleína. El epítopo del anticuerpo 37 solapa con el sitio de unión de la enzima Calpaína, de forma que la unión de 37 a la alfasinucleína podría inhibir directamente la unión y escisión mediada por Calpaína 1 (Fig 10 y 11).
El epítopo de 285 solapa con el epítopo de 37 y también sería de esperar que inhibiera la escisión por proteasa. La secuencia de aminoácidos de 37v2 solo difiere de 37 en un aminoácido en CDR y tiene una unión similar a 37, de forma que también sería de esperar que inhibiera la escisión por proteasa de una manera similar a 37. Para investigar si el efecto de los anticuerpos era dependiente de la dosis, se preparó un experimento de 34 horas con la coadición de PFF y anticuerpos a neuronas corticales primarias. La concentración de PFF fue estable (10 |jg/ml), mientras que las concentraciones del anticuerpo de control B12 y los anticuerpos 37, 37v2 y 285 que se ensayó fue 10, 5, 1 y 0.1 ug/ml. Se detectó alfa-sinucleína en las Transferencias de Western con el anticuerpo 1904/4B12 (Abcam), que tiene un epítopo en la región 103-108 y por lo tanto se une tanto a la alfa-sinucleína FL como a la alfa-sinucleína truncada en el extremo C (Fig. 11B). Como puede verse en la Figura 11B, tanto GM37, 37v2 como GM285 tienen una inhibición dependiente de la dosis de la escisión por proteasa, con una inhibición casi completa de la escisión a alta concentración del anticuerpo.
Ejemplo 6: Inhibición mediada por anticuerpo de la iniciación de la agregación de alfa-sinucleína en cultivo celular
Varios estudios han demostrado que la adición exógena de agregados fibrilares de alfa-sinucleína recombinante puede entrar en las células y reclutar alfa-sinucleína endógena e inducir una agregación y fosforilación de la alfasinucleína in vitro e in vivo, lo cual imita a los LB. (Volpicelli-Daley et al. 2011, Luk et al. 2012a, Luk et al. 2012b, Recasens et al. 2013, Peelaerts et al. 2015). Para estudiar la iniciación de alfa-sinucleína de rata no endógena por iniciadores de alfa-sinucleína recombinantes, se cultivan neuronas corticales primarias de ratón preparadas como se ha indicado anteriormente en placas de 96 pocillos (15,000 células por pocillo). El día 5 del cultivo in vitro (DIV), se cambia el 50% del medio y se suplementa con arabinósido de citosina (conc. final de 1 uM). En DIV 6, se cambia la mitad del medio con medio acondicionado con glia junto con material fibrilar de alfasinucleína, iniciadores de fibrillas en bruto o iniciadores puros. Los iniciadores de fibrillas en bruto se preparan a partir de la alfa-sinucleína humana monomérica recombinante, que se aisló en bacterias y los monómeros se filtraron a través de un filtro Amicon Ultra de límite 100,000 (Millipore cat. n.° UFC510096) y se ajustó a una concentración de 1 mg/ml en PBS, pH 7.4. Para obtener los iniciadores en bruto de fibrillas, la solución de monómero se incubó en una termomezcladora a 37C con mezcla continua (800 rpm) hasta que se alcanzó una plataforma (evaluado por medidas diarias con Thioflavin S). Para minimizar la evaporación, se añadió una gota de aceite mineral para cubrir la solución. El tiempo total para la incubación fue de 5-7 días. Los iniciadores puros se obtienen a partir de iniciadores de fibrillas en bruto que se centrifugan para purificarlos y el sedimento agregado se resuspende en PBS reciente y se sonica. Los anticuerpos se añaden una vez en DlV 6 junto con iniciadores en bruto de alfa-sinucleína. La mitad del medio en las neuronas primarias se reemplaza con medio acondicionado con glia cada semana para mantener las hasta DIV21. Las neuronas se fijan y se tiñen para fosfosinucleína usando un anticuerpo de conejo específico para la fosforilación de alfa-sinucleína en el aminoácido S129 (abcam 51253), seguido de un anticuerpo anti-conejo marcado con fluorescencia, la fluorescencia se cuantifica usando un microscopio fluorescente automático, Cellomics Arrayscan. Se detectaron núcleos en un canal y definieron el número de células válidas. Se detectaron manchas de alfa-sinucleína fosforiladas en otro canal en un área con forma de anillo predefinida que rodeaba los núcleos, representando de esta manera el citoplasma de las células. Se calculó el número medio de manchas por célula. En la Fig 12A se muestra un ejemplo de la tinción de las células. En las neuronas no tratadas no se ven manchas de alfa-sinucleína fosforilada. Las neuronas incubadas con iniciadores en bruto o puros (1-10 ng por pocillo) inducen la fosforilación de la alfa-sinucleína (Fig. 12A). En las neuritas, la sinucleína fosforilada aparece como manchas o punteado y parte de la fosfosinucleína en las neuritas aparece con forma alargada.
Para los estudios de fraccionamiento, se recogieron células en solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se centrifugo. El sedimento se resuspendió en tampón tritón al 1% con inhibidores de proteasa. Las muestras se mantuvieron en hielo durante 15 minutos seguido de sonicación. Las muestras se centrifugaron a 100,000 xg durante 30 minutos a 4C. El sobrenadante se recoge y se marca como al fracción soluble. El sedimento se lavó una vez en tampón tritón y se resuspendió en tampón SDS al 1% seguido de sonicación. Las muestras se centrifugaron de nuevo a 100,000 xg durante 30 minutos, El sobrenadante se recoge como la fracción insoluble. Las concentraciones de proteína se midieron y las muestras se procesaron en gel SDS-PAGE al 4-12%, se transfirieron a membranas y la alfa-sinucleína y la alfa-sinucleína fosforilada (S129P) se detectan por el anticuerpo 4B12/1904 (Thermo scientific: MA1-90346-sinucleína humana), anticuerpo S129P-asyn (abcam 51253) y anticuerpo contra la sinucleína de ratón (señalización celular D37A6), respectivamente.
La Figura 12B muestra la transferencia de Western de la fracción soluble e insoluble de las neuronas primarias con y sin iniciadores en bruto. Como puede verse en la Figura 12B, la adición de los iniciadores conduce a la acumulación de alfa-sinucleína de ratón endógena y p-S129-alfa-sinucleína y multímeros de alfa-sinucleína de ratón fosforilada en la fracción insoluble de las células.
Para ensayar si los anticuerpos pueden inhibir la iniciación, se usaron iniciadores de alfa-sinucleína sinucleína a una concentración de 6.6 nM (10 ng/pocillo). Se añadieron diferentes concentraciones de anticuerpo e iniciadores de alfa-sinucleína juntos en DIV 6 para obtener una respuesta a la dosis (empezando desde la máxima concentración de anticuerpo a 133 nM hasta 133 pM). Las neuronas se fijaron de nuevo y se tiñeron para Fosfo-sinucleína (abcam 51253) y la fluorescencia de las células se cuantificó usando un microscopio fluorescente automático, Cellomics arrayscan. Las manchas/puntos por célula se contaron en Cellomics arrayscan. Como puede verse en la Figura 12C, tanto el anticuerpo 37, como 37v2 y el anticuerpo 285 redujeron la fosforilación de la alfa-sinucleína en neuronas de una manera dependiente de la dosis con una inhibición máxima similar para 37, 37v2 y 285 (alrededor del 70-75%) y una CE50 de aproximadamente 5 nM. El fraccionamiento de las proteínas celulares en la fracción soluble e insoluble después del tratamiento con el anticuerpo a la máxima concentración (133 nM) muestra que tanto los anticuerpos 37, como 37v2 y 285 inhibían el truncamiento de los iniciadores en bruto recombinantes y la acumulación del fragmento truncado en el extremo C (CT a-syn), y reducían la acumulación de alfa-sinucleína de ratón endógena fosforilada y formas agregadas de alfa-sinucleína de ratón en la fracción insoluble, como se ve en la Figura 12D.
Ejemplo 7. Efectos electrofisiológicos agudos de anticuerpos contra la alfa-sinucleína in vivoEn el hipocampo de ratones transgénicos F28-snca, un modelo que sobreexpresa la alfa-sinucleína de tipo silvestre bajo el control del promotor de la alfa-sinucleína de ratón (Westerlund M, et al. Mol Cell Neurosci. 2008 Dec; 39 (4): 586-91) están presentes altos niveles de expresión de la alfa-sinucleína. Se realizó una evaluación de la transmisión sináptica y plasticidad en el área CA1 del hipocampo en ratones transgénicos F28-snca macho de 4 a 6 meses de edad y ratones de control de edad similar mediante electrofisiología in vivo. Los datos muestran que la transmisión sináptica basal se ve perjudicada significativamente en los ratones transgénicos F28-snca en comparación con los ratones de control de edad similar (Fig. 13).
Se encerraron individualmente ratones transgénicos F28-snca y ratones macho de control de edad similar (cría CRO, Taconic Europe A/S) de 4 a 6 meses de edad en condiciones controladas de temperatura (22 ± 1.5 °C) y humedad (55-65%) y se mantuvieron con un ciclo de luz/oscuridad de 12:12 horas (la luz se enciende a las 06:00h). El alimento y el agua estaba disponible ad libitum.
Los animales se anestesiaron con una inyección intraperitoneal (i.p.) de uretano (1.2 g/kg). Los ratones después se montaron en un marco estereotáxico, su temperatura se ajustó a 37.5 °C mediante una almohadilla calefactora, y se expuso el cráneo. Se puso un alambre de platino en el hueso frontal para actuar como referencia y se taladró un orificio adicional para la inserción de los electrodos de registro y estimulación en el hipocampo, en las siguientes coordenadas de acuerdo con el atlas de Paxinos y Franklin (Paxinos y Franklin's the Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates, 4a Edición, 2001): registro, 1.5-1.7 mm posterior al Bregma, 1.0-1.2 mm lateral a la línea media, 1.4-1.7 mm por debajo de la superficie del cerebro; estimulación, 1.8-2.0 mm posterior al Bregma, 1.5-1.7 mm lateral a la línea media, 1.5-1.7 mm por debajo de la superficie del cerebro. Los animales se dejaron en el marco estereotáxico a lo largo de toda la duración de los registros y se comprobó regularmente su nivel de anestesia.
Se evocaron potenciales de campo (fEPSP) en el CA1 por estimulación eléctrica en el Schaffer colateral cada 30 s, y la profundidad del electrodo de registro se ajustó hasta que se registró un fEPSP negativo en respuesta a un pulso cuadrado unipolar. La pendiente del fEPSP evocado se midió entre un 30 y un 70% de la amplitud máxima del fEPSP.
Una vez inducido un fEPSP óptimo, se evaluó la transmisión sináptica basal por la relación entre la intensidad de la estimulación y la pendiente del fEPSP evocado (relación entrada-salida). Las diferentes intensidades de estimulación fueron 0, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400 y 500 |jA, y se aplicaron sucesivamente en orden creciente, con 2 a 3 repeticiones para cada intensidad. Se observó que la transmisión sináptica basal estaba afectada significativamente en los ratones transgénicos F28-snca en comparación con los ratones de control de edad similar.
Los deterioros identificados en la transmisión sináptica basal en los ratones transgénicos F28-snca se usaron para ensayar el GM37, GM285 y h9E4 comparador con respecto a su capacidad de bloquear el efecto mediado por la alfa-sinucleína.
Se realizaron registros en todos los experimentos de 3 a 6 h después de la administración de una sola dosis de anticuerpo a una dosis de 15 mg/kg (i. p.). La transmisión sináptica basal se registró en los dos hipocampos en cada animal cuando fue posible y se registró como experimentos individuales.
El tratamiento agudo con h9E4 indujo una inversión significativa del deterioro en la transmisión sináptica basal en ratones transgénicos F28-snca (Tg-snca h9E4 frente a Tg-snca PBS, p=0.002,Fig. 14). Sin embargo, la inversión por h9E4 solo fue parcial, como se indica por una diferenciación significativa con la transmisión sináptica basal en compañeros de camada tratados con PBS (p=0.007).
El tratamiento agudo con GM37 indujo una inversión significativa del deterioro en la transmisión sináptica basal en ratones transgénicos F28-snca (Tg-snca GM37 frente a Tg-snca PBS, p=0.004,Fig. 15). La transmisión sináptica basal en ratones transgénicos tratados con GM37 no fue significativamente diferente de la transmisión sináptica basal en compañeros de camada tratados con PBS, lo que indica una inversión completa del deterioro (Fig 15).
GM28 también indujo una inversión significativa del deterioro en la transmisión sináptica basal en ratones transgénicos F28-snca (Fig. 16). La transmisión sináptica basal en ratones transgénicos tratados con GM285 no fue significativamente diferente de la transmisión sináptica basal en compañeros de camada tratados con PBS, lo que indica una inversión completa del deterioro.
Ejemplo 8. Microdiálisis para evaluar la alfa-sinucleína humana en el cerebro de animales despiertos que se mueven libremente
El método de microdiálisis "push-pull" se usó para evaluar los niveles de alfa-sinucleína humana en fluido intersticial cerebral (ISF). Los ratones se encerraron individualmente en condiciones controladas de temperatura (22 ± 1.5 °C) y humedad (55-65%) y se mantuvieron con un ciclo de luz/oscuridad de 12:12 horas (la luz se enciende a 06:00 h). El alimento y el agua estaban disponiblesad libitum.El estudio actual se realizó en el hipocampo de ratones transgénicos F28-snca (50-54 semanas de edad). Para permitir la microdiálisis en el hipocampo, los ratones se anestesiaron con isoflurano y se implantó esterotáxicamente una cánula de guía intracerebral (CMA) en el cerebro, colocando la sonda de microdiálisis en el hipocampo (coordenadas de la punta de la sonda: 3.1 mm posterior y 2.8 mm lateral del bregma, y 1.3 mm con respecto a la duramadre), de acuerdo con el atlas de Paxinos y Franklin 2001. Se usaron tornillos de anclaje y cemento acrílico para la fijación de las cánulas de guía. Después de la implantación de la cánula, se dejó que los ratones se recuperaran de la cirugía durante 2-3 días antes de la diálisis.
El día del experimento, se insertó una sonda CMA con un límite de 1000 kDa, de 2 mm a través de la cánula de guía. Se conectó una sonda a una bomba peristáltica de microdiálisis con dos canales (MAB20; Microbiotech) y se hizo funcionar en modo "push-pull". El tubo de entrada de la sonda de microdiálisis se conectó a una bomba peristáltica que perfundía la sonda con líquido cefalorraquídeo (aCSF; en mM: 147 NaCl, 2.7 KCl, 1.2 CaCh, 0.85 MgCh). La bomba peristáltica también se conectó al tubo de salida para prevenir la pérdida de líquido de perfusión de la sonda, tirando del fluido a lo largo del tubo. Como tampón de perfusión, se diluyó la fracción V de albúmina bovina al 25% (Sigma) a 0.2% con CSF artificial el día de uso y se filtró a través de una membrana de 0.1 |jm. El flujo real de la bomba se determinó sin tener conectada la sonda. Los tubos de muestra se pesaron antes y después del muestreo para un periodo de tiempo dado y se calculó el caudal. La bomba después se fijó a un flujo constante de 1 jl/min. A lo largo de todo el periodo de experimento se usó un régimen de muestreo de 120 min. Para evitar la interferencia de las lesiones en el tejido, se fijó una ventana experimental de 14 a 48 h después de la implantación de la sonda. 14-16 h después de empezar los experimentos, se inyectaron GM37, 9E4 humano o control de isotipo (anti-HEL) i.p. a 15 mg/kg y se recogieron 6 muestras adicionales (12 h de recogida). Los dializados se almacenaron a -80 °C. La concentración de alfa-sinucleína humana se determinó por ELISA (kit ELISA Covance).
La media de los dos-tres valores basales (4 h-6 h) antes del tratamiento con anticuerpo se consideraron los valores iniciales y se fijaron al 100% para cada animal. Los datos se evaluaron usando un análisis de varianza de dos vías (ANOVA) con medidas repetidas para evaluar la relevancia estadística. Los niveles basales de alfasinucleína humana en el hipocampo fueron 8.1 ± 1.1 ng/ml (media ± SEM, n = 25, sin corregir para la recuperación de la sonda de diálisis in vitro). La administración de GM37 indujo una mayor reducción en la alfasinucleína humana en el hipocampo de ratones F28 en comparación tanto con el anticuerpo comparador, como con 9E4 humano y el control de isotipo (anti-HEL). (Fig. 17).
Ejemplo 9: Efectos crónicos de anticuerpos contra la alfa-sinucleína in vivo. El anticuerpo GM37 mejora el fenotipo motor en el modelo de Parkinson de rata.
La sobreexpresión dirigida de la alfa-sinucleína humana a neuronas dopaminérgicas en el mesencéfalo de rata puede conseguirse usando un vector viral adenoasociado recombinante (rAAV) y está asociada con una pérdida progresiva de células dopaminérgicas en la sustancia negra así como deterioros motores.
Se usaron ratas Sprague-Dawley hembra adultas (225-250 g) para expresar la alfa-sinucleína humana en la sustancia negra (SN) por inyección con virus adenoasociado de serotipo AAV2/5 que contenía el promotor de la beta-actina de pollo con elementos potenciadores del promotor de citomegalovirus, seguido de ADNc de alfasinucleína human y el elemento WPRE como se ha descrito previamente (Xu L, Daly T, Gao C, Flotte TR, Song S, Byrne BJ, Sands MS, Ponder KP (2001). En este modelo, se ha demostrado que la expresión de alfasinucleína humana conduce a la neurodegeneración de neuronas dopaminérgicas. Maingay M, et al. CNS Spectr.
2005 Mar;10(3):235-44). Para ensayar el efecto de un anticuerpo terapéutico contra la alfa-sinucleína en este modelo, el tratamiento con anticuerpo se inició de 2 a 4 días antes de las inyecciones virales y se continuó hasta el final del estudio (Fig. 18). La administración de PBS al mismo volumen (5 ml/kg: IP) se usó como control. GM37 se dosificó dos veces por semana a una dosis de 15 mg/kg (IP). Las partículas virales (rAAV2/5) que contenían el gen para la alfa-sinucleína wt humana o la proteína fluorescente verde (GFP) se inyectaron unilateralmente en el SN. Los animales se anestesiaron con una combinación de Hypnorm® y Dormicum® a 2.0 ml/kg s.c. y se pusieron en un marco estereotáxico. Su temperatura se ajustó a 37.5 °C mediante una almohadilla calefactora y se expusieron sus cráneos. Se taladró un orificio encima del SN derecho a las siguientes coordenadas, de acuerdo con el atlas de Paxinos y Watson (Paxinos y Watson, 1998): 5.5 mm posterior y 2.0 mm lateral del Bregma. Se realizó una sola inyección de 3 |jl de rAAV2/5-alfa-syn o rAAV2/5-GFP a una profundidad de 7.2 mm por debajo de la dura madre, y un caudal de 0.2 jl/min usando una jeringa de Hamilton conectada a un inyector estereotáxico. La aguja se dejó en su sitio 5 min más para permitir la difusión del vector en el SN. Después de la cirugía, los animales se devolvieron a sus jaulas y se pusieron en un entorno caliente donde se dejaron recuperar de la anestesia. El ensayo de la asimetría motora en el ensayo de cilindro se evaluó antes de las inyecciones de AAV, así como 3, 7 y 10 semanas después de las inyecciones de AAV. Los datos presentados corresponden a la relación entre el uso de la pata anterior derecha en comparación con el uso de las patas anteriores tanto izquierda como derecha. El comportamiento de cada animal en el cilindro se grabó durante un total de 5 min y se ha realizado una puntuación manual del número de toques usando las patas anteriores izquierda y derecha durante 5 minutos para el día de ensayo final 10 semanas después de la inyección de virus. Está presente un deterioro significativo en las ratas inyectadas con AAV-syn en comparación con AAV-GFP (p=0.012) en la semana 10. Se mostró una tendencia de inversión para los animales tratados con GM37, ya que su comportamiento es diferente del de las ratas GFP (p=0.163 y p=0.407 para gm37, respectivamente). Este descubrimiento indica que el anticuerpo GM37 puede mejorar el fenotipo motor Parkinsoniano en este modelo de rata (Figs 18 y 19).
Ejemplo 10: Efectos crónicos de anticuerpos contra la alfa-sinucleína in vivo. El anticuerpo GM37 inhibe la iniciación de agregación y fosforilación de alfa-sinucleína de ratón endógena
La inyección de fibrillas preformadas de alfa-sinucleína obtenidas a partir de una proteína recombinante en el estriado dorsal de ratones de tipo silvestre recluta alfa-sinucleína de ratón endógena e induce la formación de agregados fosforilados en la Ser-129 dentro de las neuronas de la corteza cerebral, la amígdala y la sustancia negra (Luk et al. 2012, Science. 2012 Nov 16; 338(6109): 949-53). Para ver si el anticuerpo monoclonal específico para la alfa-sinucleína GM37 podría reducir la aparición de inclusiones de alfa-sinucleína fosforiladas inducidas por fibrillas de alfa-sinucleína in vivo, se usó un total de 45 ratones. Los ratones se dosificaron con GM37 a 30 mg/kg i.p, GM 3715 mg/kg i.v. , o vehículo ip (PBS). Un día después, los ratones se anestesiaron y se inyectaron estereotácticamente en un hemisferio con 2 ul de iniciadores en bruto de alfa-Syn humana recombinante, obtenidos como se ha descrito previamente (Ejemplo 6) (total de 2 jg de iniciadores en bruto por animal). Para inyectar los iniciadores en bruto, se abrió en cráneo perforando un orificio y se insertó una sola pipeta de vidrio (coordenadas: 0.5 mm anterior a Bregma, 2.0 mm lateral a línea media) en el prosencéfalo derecho para dirigir el inóculo al neoestriado dorsal (+2.6 mm por debajo de la duramadre). Después de la recuperación, los ratones recibieron inyecciones i.p. o i.v. semanales de anticuerpos hasta el sacrificio que se realizó a los 45 días. Se dosificaron grupos de 15 ratones/grupo iv con GM3715 mg/kg, ip con GM3730 mg/kg o PBS (10 ml/kg) ip una vez por semana.
Para medir la concentración de anticuerpo en plasma, se extrajo sangre del carrillo una vez por semana justo antes de la siguiente inyección, es decir 7 días después de la última inyección. Se obtuvo plasma mediante una centrifugación de 2000 g, incubación 15 min a TA, el sobrenadante posteriormente se congeló a -20 °C. Se tomó una muestra de CSF al final del estudio y se congeló a -20 °C. Las muestras de plasma y CSF se analizaron para determinar la concentración de IgG humana por MSD. En resumen, se usó IgG de ratón anti humana (clón MH16-1 (M1268) para la captura, se incubó plasma o CSF en el pocillo, seguido de un anticuerpo de cabra anti humano sulfo-TAG como anticuerpo de detección (MSD cat n.°: R32AJ-1). Las placas se analizaron por electroquimioluminiscencia por MSD.
Los niveles de anticuerpo en plasma se muestran en la Figura 20B y muestran un aumento dependiente de la dosis en la concentración de anticuerpo en plasma y la acumulación de anticuerpo en plasma durante las seis semanas. Los niveles de anticuerpo en CSF se muestran en la Figura 20C y demuestran que puede medirse aproximadamente un 0.1% de nivel de anticuerpo en plasma en csf.
En el día 45, desde el momento de la inyección del iniciador fibrilar de alfa-sinucleína, los ratones se anestesiaron, y se perfundieron transcardialmente con PBS, seguido de perfusión con paraformaldehído tamponado neutro (4%). Los cerebros se retiraron y se incubaron durante una noche para la fijación posterior en paraformaldehído tamponado neutro. Se realizó inmunohistoquímica en secciones seriadas de 45 jm de espesor por Neuroscience associates. En resumen, usando al tecnología MultiBrain®, se incluyeron hasta 25 cerebros de ratón conjuntamente por bloque, en 3 bloques, se seccionaron por congelación con espesores de 45 jm en el plano coronal y se recogieron en recipientes que contenían solución de conservación de antígeno. Una de cada seis secciones se tiñó con anticuerpo contra alfa-sinucleína fosforilada en Ser-129 (anticuerpo Anti-alfa-Sinucleína (fosfo S129) [Psyn/81A] ab184674) para revelar las estructuras reactivas con la alfa-sinucleína fosforilada en la Ser129.
La cuantificación de la patología pSyn se realizó por recuento manual de las células positivas inmunorreactivas a partir de imágenes a 10 aumentos de 5-7 secciones que cubrían la sustancia negra entera procedentes de una de cada seis secciones. El recuento se realizó con un diseño ciego. Los recuentos celulares en la amígdala y en la sustancia nigra se analizaron por una ANOVA de una vía seguido por un ensayo t de Bonferoni, donde el efecto del anticuerpo GM37 se comparó con el tratamiento con PBS.
Como puede verse en la Fig 20C, el tratamiento con anticuerpo GM37 redujo el número de inclusiones intracelulares en la Sustancia Nigra significativamente en comparación con el control con PBS, tanto con el tratamiento ip como con el tratamiento iv. Los datos muestran que el anticuerpo GM37 podría tener un efecto terapéutico en PD al bloquear la entrada de alfa-sinucleína patológica extracelular en las neuronas, al bloquear su propagación entre las neuronas y/o facilitar la eliminación del ISF por captación en la microglia. Como esta aparición de inclusiones se ha asociado a la pérdida de neuronas dopaminérgicas y el desarrollo de déficits motores Parkinsonianos en modelos animales, el tratamiento con anticuerpo GM37 podría tener un efecto terapéutico sobre la pérdida de células dopaminérgicas y el desarrollo de déficits motores en PD.
Ejemplo 11: Posibilidad de fabricación de GM37 y variantes de GM37
Los anticuerpos anti-alfa-sinucleína se producen en cultivos de células de mamífero en condiciones que imitan las condiciones de producción que se usarán para producir el material de calidad clínica para uso en pacientes. Es bien sabido que las proteínas producidas de esta manera experimentan modificaciones postraduccionales que pueden impactar tanto a la potencia terapéutica del anticuerpo como a los atributos biofísicos que afectan a la estabilidad del anticuerpo a lo largo del tiempo. El conocimiento empírico adquirido a partir de décadas de estudios identificó una serie de modificaciones postraduccionales que se sabe que proporcionan riesgo de desarrollo de una molécula específica. Se ha demostrado que estas modificaciones postraduccionales se correlacionan con cadenas de aminoácidos presentes en la secuencia primaria de las proteínas de cadena pesadas y ligera. Se han generado algoritmos que pueden identificar esta secuencias y determinar el riesgo potencial que tendrán sobre la posibilidad de fabricar y desarrollar un anticuerpo terapéutico.
Puede usarse un análisis in silico de la secuencia primaria del anticuerpo para eliminar el riesgo de una molécula para que esta pueda desarrollarse como un agente terapéutico. En particular, el análisis detallado de las regiones VH y VL puede identificar aminoácidos únicos que se consideran importantes para la actividad de las moléculas pero que también pueden ser un riesgo potencial para su estabilidad a lo largo del tiempo. La desamidación específica de secuencia se ha identificado como un riesgo potencial para las estructuras proteicas. Puede producirse una desamidación de proteínas en las cadenas laterales de amida de glutaminas o en restos de asparagina y transformarlas en un grupo carboxilato (Lorenzo et al. PLOSone, DOI:10.1371, Dec. (2015)). La desamidación no enzimática a pH neutro se produce más rápido en el caso de la asparagina y por lo tanto se considera un riesgo mayor que la glutamina. La actividad se ha influenciado adicionalmente por el posterior aminoácido en la secuencia y puede producirse a una velocidad de días o años. El destino actual de la proteína que experimenta desamidación necesita evaluarse experimentalmente para determinar el impacto del cambio tanto sobre su estabilidad como sobre su actividad.
Se identificó un sitio para desamidación dentro del dominio VH de GM37. El resto de aminoácido 54 es una asparagina (N) seguida de una glicina (G) en la posición 55. La N54 tiene un alto riesgo de desamidación espontánea. Para mitigar este riesgo se genera una serie de 3 variantes que reemplazan la asparagina (N) con la serina (S), glutamina (Q) o histidina (H). Las 3 variantes se produjeron en un cultivo de células de mamífero usando métodos de transfección transitoria (ejemplo 1.5). Las 3 variantes mostraron propiedades de expresión y purificación similares a GM37wt. (Fig. 23).
Para cada uno de los ocho productos, se realizaron transfecciones transitorias de 400 ml usando células CHOK1SV GS-KO que habían estado en cultivo durante un mínimo de 2 semanas. Las células se subcultivaron 24 horas de la transfección. Todas las transfecciones se realizaron por electroporación usando Gene Pulse XCell (Bio-Rad). Para cada transfección, las células viables se resuspendieron en medio CD-CHO o precalentado suplementado con L-glutamina 6 mM para 2.86x107 células/ml. Se introdujeron alícuotas de 40 |jg de cada ADN SGV establecido que contenía las cadenas pesada y ligera apropiadas en cada cubeta (Bio-Rad, cubeta GenePulser, hueco 0.4 cm, 165-2088) y se añadieron 700 j l de suspensión celular. Las células se sometieron a electroporación a 300 V, 900 jF. Las células transfectadas se transfirieron a medio precalentado en matraces Erlenmayer y el contenido de las cubetas aclarado dos veces con medio precalentado también se transfirió a los matraces. Los cultivos transfectantes se incubaron en una incubadora de agitación a 36.5 °C 5% CO2, 85% de humedad, 140 rpm durante 6 días. La viabilidad celular se midió en el momento de la recolección usando un contador de células automático Cedex HiRes (Rosche).
Para evaluar la importancia del resto 54 en la unión a la alfa-sinucleína humana, se analizó la capacidad de las variantes de unirse en dos experimentos diferentes. Usando un formato ELISA competitivo, se evaluó el impacto que tendría el cambio en el resto 54 sobre la capacidad de GM37 de unirse a la alfa-sinucleína en solución. Mediante la evaluación de la concentración de sinucleína capaz de inhibir la unión del anticuerpo a placas ELISA revestidas con sinucleína, se demostró que las tres variantes mantenían la misma unión que GM37wt y se unían a la alfa-sinucleína con alta afinidad dando como resultado valores de CI50 de 1-2 nM (Fig. 24). Se realizó un ensayo competitivo usando preincubación de una concentración fija (0.3 jg/ml) de cada uno de los siguientes anticuerpos, GM37 (denominado GM37wt), variante 1 de GM37, variante 2 de Gm 37 y variante 3 de GM37 con un intervalo de alfa-sinucleína humana 0-1000 nM durante 60 minutos a temperatura ambiente. El anticuerpo no unido restante se capturó y midió en placas ELISA revestidas con 100 ng/ml de alfa-sinucleína humana recombinante usando un anticuerpo de detección anti-humano por electroquimioluminiscencia (MSD, Gathersburg, MD). Los valores de CI50 de la interacción son 1.9 nM, 1.6 nM, 2.1 nM y 1.4 nM para GM37 wt, variante 1 de GM37, variante 2 de GM37 y variante 3 de GM37, respectivamente (determinada usando Prism Graphpad®).
Usando resonancia de plasmón superficial (SPR), se evaluó la cinética a tiempo real de la unión de GM37 wt (2 lotes) y las tres variantes (Ejemplo 2). La alfa-sinucleína humana se capturó en el portaobjetos (ligando) y los anticuerpos se ensayaron a múltiples concentraciones como analitos. El análisis de las curvas de unión en presencia de anticuerpo a múltiples concentraciones demostró que las tasas de asociación eran iguales para los cuatro anticuerpos, de forma similar a cuando se retiró el anticuerpo del tampón las tasas de dosificación medidas no mostraron diferencia estadística entre los anticuerpos. Usando un algoritmo de unión 1:1 los 4 anticuerpos tienen constantes de unión casi idénticas (Fig. 25).
Para evaluar el impacto de los cambios en N54 sobre la actividad funcional de GM37 se analizó la capacidad de los anticuerpos de bloquear la actividad de iniciación de sinucleína en un cultivo de neuronas primarias (Ejemplo 6). El nivel de iniciación se mide usando un anticuerpo específico para la fosfo-sinucleína. Los 3 anticuerpos pudieron bloquear la iniciación como se mide por la señal de fosfo-sinucleína (Fig. 26). Además, el nivel de inhibición fue el mismo para los 4 anticuerpos. Estos datos basados en las células confirman además los datos de unión ya que el aminoácido 54 en el dominio VH no es necesario para la afinidad de unión a la alfa-sinucleína humana o para la inhibición de la iniciación en un ensayo basado en células primarias. Además, se descubrió que estos tres anticuerpos tenían capacidad de producción usando los métodos convencionales de expresión y purificación. Es interesante destacar que una de las variantes N54Q mostró mejoras en la producción con respecto a las demás variantes, lo cual tiene gran importancia cuando el anticuerpo se va a producir comercialmente a gran escala. Estos datos respaldan la posibilidad de reducir el riesgo potencial de desamidación al reemplazar la asparagina (N) por otro aminoácido sin que afecte a la pérdida de potencia.
Una muestra de cada uno de los anticuerpos wt GM37, var1, va2 y var3 se sometió a un aumento estacionario de la temperatura a lo largo del tiempo y simultáneamente se midió el nivel de agregación por dispersión de luz multiángulo (Prometheus NT.48, NanoTemper Technologies). Se descubrió que la temperatura para el inicio de la agregación era similar para GM37 y las variantes de GM37, sin embargo se observó el menor nivel de agregación para GM37-Var2 (Fig.
27).
LISTA DE SECUENCIAS
<110> H. Lundbeck A/S
<120><Nu ev os A n t i c u e r p o s M o n o c l o n a l e s C o n t r a la A l f a - S i n u c l e í n a><130> 0992
<160> 43
<170><P a t e n t I n v e r s i ó n 3.5>
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> A r t i f i c i a l
<220>
<223><C a d e n a Pe sa da de la C D R 1 de GM37>
<400> 1
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Thr
1 5 10
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> A r t i f i c i a l
<220>
<223><C a d e n a Pe sa da de la CDR2 de GM37>
<400> 2
Ala Ile Arg Ser Asn Gly Asp Arg Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15
Gly
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> A r t i f i c i a l
<220>
<223><C a d e n a Pe sa da de la CDR3 de GM37>
Ala Lys Asn Trp Ala Pro Phe Asp Ser
1 5
<210> 4
<211> 11
<212><PRT>
<213><A r t i f i c i a l>
<220>
<223><C a d e n a L i g e r a de la CDR1 de GM37>
<400> 4
Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 5
<211> 7
<212><PRT>
<213><A r t i f i c i a l>
<220>
<223><C a d e n a L i g e r a de la C D R 2 de GM37>
<400> 5
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr
1 5
<210> 6
<211> 9
<212><PRT>
<213><A r t i f i c i a l>
<220>
<223><C a d e n a L i g e r a de la C D R 3 de GM37>
<400> 6
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Trp Thr
1 5
<210> 7
<211> 116
<212><PRT>
<213><A r t i f i c i a l>
<220>
<223><C a d e n a Pe sa da de la C D R de GM37>
<400> 7
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Thr Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Ala Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Ala Ile Arg Ser Asn Gly Asp Arg Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Gln Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asn Trp Ala Pro Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 8
<211> 108
<212><PRT>
<213><A r t i f i c i a l>
<220>
<223><C a d e n a L i g e r a de G M 37>
<400> i8
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 9
<211> 6
<212><PRT>
<213><A r t i f i c i a l>
<220>
<223><E p ít op o 112-117>
<400> 9
Ile Leu Glu Asp Met Pro
1 5
<210> 10
<211> 140
<212><PRT>
<213><A r t i f i c i a l>
<220>
<223><A l f a - s i n u c l e í n a>
<400> 10
Met Asp Val Phe Met Lys Gly Leu Ser Lys Ala Lys Glu Gly Val Val 1 5 10 15
Ala Ala Ala Glu Lys Thr Lys Gln Gly Val Ala Glu Ala Ala Gly Lys 20 25 30
Thr Lys Glu Gly Val Leu Tyr Val Gly Ser Lys Thr Lys Glu Gly Val 35 40 45
Val His Gly Val Ala Thr Val Ala Glu Lys Thr Lys Glu Gln Val Thr 50 55 60
Asn Val Gly Gly Ala Val Val Thr Gly Val Thr Ala Val Ala Gln Lys 65 70 75 80
Thr Val Glu Gly Ala Gly Ser Ile Ala Ala Ala Thr Gly Phe Val Lys
85 90 95
Lys Asp Gln Leu Gly Lys Asn Glu Glu Gly Ala Pro Gln Glu Gly Ile 100 105 110
Leu Glu Asp Met Pro Val Asp Pro Asp Asn Glu Ala Tyr Glu Met Pro 115 120 125
Ser Glu Glu Gly Tyr Gln Asp Tyr Glu Pro Glu Ala
130 135 140
<210> 11
<211> 165
<212><PRT>
<213><A r t i f i c i a l>
<220>
<223><A - S y n - A A K K - B A P>
<400> 11
Met Asp Val Phe Met Lys Gly Leu Ser Lys Ala Lys Glu Gly Val Val 1 5 10 15
Ala Ala Ala Glu Lys Thr Lys Gln Gly Val Ala Glu Ala Ala Gly Lys 20 25 30
Thr Lys Glu Gly Val Leu Tyr Val Gly Ser Lys Thr Lys Glu Gly Val 35 40 45
Val His Gly Val Ala Thr Val Ala Glu Lys Thr Lys Glu Gln Val Thr 50 55 60
Asn Val Gly Gly Ala Val Val Thr Gly Val Thr Ala Val Ala Gln Lys 65 70 75 80
Thr Val Glu Gly Ala Gly Asn Ile Ala Ala Ala Thr Gly Leu Val Lys
85 90 95 Lys Asp Gln Leu Ala Lys Gln Asn Glu Glu Gly Phe Leu Gln Glu Gly 100 105 110
Met Val Asn Asn Thr Asp Ile Pro Val Asp Pro Glu Asn Glu Ala Tyr 115 120 125
Glu Met Pro Pro Glu Glu Glu Tyr Gln Asp Tyr Glu Pro Glu Ala Gly 130 135 140
Ser Ala Gly Gly Ser Gly Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys 145 150 155 160
Ile Glu Trp His Glu
165
<210> 12
<211> 165
<212><PRT>
<213><A r t i f i c i a l>
<220>
<223><A - S y n - B A A K - B A P>
<400> 12
Met Asp Val Phe Met Lys Gly Leu Ser Met Ala Lys Glu Gly Val Val 1 5 10 15
Ala Ala Ala Glu Lys Thr Lys Gln Gly Val Thr Glu Ala Ala Glu Lys 20 25 30
Thr Lys Glu Gly Val Leu Tyr Val Gly Ser Lys Thr Lys Glu Gly Val 35 40 45
Val His Gly Val Ala Thr Val Ala Glu Lys Thr Lys Glu Gln Val Thr 50 55 60
Asn Val Gly Gly Ala Val Val Thr Gly Val Thr Ala Val Ala Gln Lys 65 70 75 80
Thr Val Glu Gly Ala Gly Ser Ile Ala Ala Ala Thr Gly Phe Val Lys
85 90 95
Lys Asp Gln Leu Ala Lys Gln Asn Glu Glu Gly Phe Leu Gln Glu Gly 100 105 110
Met Val Asn Asn Thr Asp Ile Pro Val Asp Pro Glu Asn Glu Ala Tyr 115 120 125
Glu Met Pro Pro Glu Glu Glu Tyr Gln Asp Tyr Glu Pro Glu Ala Gly 130 135 140
Ser Ala Gly Gly Ser Gly Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys 145 150 155 160
Ile Glu Trp His Glu
165
<210> 13
<211> 162
<212><PRT>
<213><A r t i f i c i a l>
<220>
<223><A - S y n - B B A A - B A P>
<400> 13
Met Asp Val Phe Met Lys Gly Leu Ser Met Ala Lys Glu Gly Val Val 1 5 10 15
Ala Ala Ala Glu Lys Thr Lys Gln Gly Val Thr Glu Ala Ala Glu Lys 20 25 30
Thr Lys Glu Gly Val Leu Tyr Val Gly Ser Lys Thr Arg Glu Gly Val 35 40 45
Val Gln Gly Val Ala Ser Val Ala Glu Lys Thr Lys Glu Gln Ala Ser 50 55 60
His Leu Gly Gly Ala Val Val Thr Gly Val Thr Ala Val Ala Gln Lys 65 70 75 80
Thr Val Glu Gly Ala Gly Ser Ile Ala Ala Ala Thr Gly Phe Val Lys
85 90 95
Lys Asp Gln Leu Gly Lys Asn Glu Glu Gly Ala Pro Gln Glu Gly Ile 100 105 110 Leu Glu Asp Met Pro Val Asp Pro Asp Asn Glu Ala Tyr Glu Met Pro 115 120 125
Ser Glu Glu Gly Tyr Gln Asp Tyr Glu Pro Glu Ala Gly Ser Ala Gly 130 135 140
Gly Ser Gly Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp 145 150 155 160
His Glu
<210> 14
<211> 165
<212><PRT>
<213><A r t i f i c i a l>
<220>
<223><A - S y n - B B K K - B A P>
<400> 14
Met Asp Val Phe Met Lys Gly Leu Ser Met Ala Lys Glu Gly Val Val 1 5 10 15
Ala Ala Ala Glu Lys Thr Lys Gln Gly Val Thr Glu Ala Ala Glu Lys 20 25 30
Thr Lys Glu Gly Val Leu Tyr Val Gly Ser Lys Thr Arg Glu Gly Val 35 40 45
Val Gln Gly Val Ala Ser Val Ala Glu Lys Thr Lys Glu Gln Ala Ser 50 55 60
His Leu Gly Gly Ala Val Val Thr Gly Val Thr Ala Val Ala Gln Lys 65 70 75 80
Thr Val Glu Gly Ala Gly Asn Ile Ala Ala Ala Thr Gly Leu Val Lys
85 90 95
Lys Asp Gln Leu Ala Lys Gln Asn Glu Glu Gly Phe Leu Gln Glu Gly 100 105 110 Met Val Asn Asn Thr Asp Ile Pro Val Asp Pro Glu Asn Glu Ala Tyr 115 120 125
Glu Met Pro Pro Glu Glu Glu Tyr Gln Asp Tyr Glu Pro Glu Ala Gly 130 135 140
Ser Ala Gly Gly Ser Gly Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys 145 150 155 160
Ile Glu Trp His Glu
165
<210> 15
<211> 141
<212><PRT>
<213><A r t i f i c i a l>
<220>
<223><A - S y n - 120 - 140 De l - B A P>
<400> 15
Met Asp Val Phe Met Lys Gly Leu Ser Lys Ala Lys Glu Gly Val Val 1 5 10 15
Ala Ala Ala Glu Lys Thr Lys Gln Gly Val Ala Glu Ala Ala Gly Lys 20 25 30
Thr Lys Glu Gly Val Leu Tyr Val Gly Ser Lys Thr Lys Glu Gly Val 35 40 45
Val His Gly Val Ala Thr Val Ala Glu Lys Thr Lys Glu Gln Val Thr 50 55 60
Asn Val Gly Gly Ala Val Val Thr Gly Val Thr Ala Val Ala Gln Lys 65 70 75 80
Thr Val Glu Gly Ala Gly Ser Ile Ala Ala Ala Thr Gly Phe Val Lys
85 90 95
Lys Asp Gln Leu Gly Lys Asn Glu Glu Gly Ala Pro Gln Glu Gly Ile 100 105 110 Leu Glu Asp Met Pro Val Asp Gly Ser Ala Gly Gly Ser Gly Gly Leu 115 120 125
Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu
130 135 140
<210> 16
<211> 131
<212><PRT>
<213><A r t i f i c i a l>
<220>
<223><a l f a - s i n u c l e í n a a m i n o á c i d o s 1-119>
<400> 16
Met Ala His His His His His His Ile Glu Gly Arg Met Asp Val Phe 1 5 10 15
Met Lys Gly Leu Ser Lys Ala Lys Glu Gly Val Val Ala Ala Ala Glu 20 25 30
Lys Thr Lys Gln Gly Val Ala Glu Ala Ala Gly Lys Thr Lys Glu Gly 35 40 45
Val Leu Tyr Val Gly Ser Lys Thr Lys Glu Gly Val Val His Gly Val 50 55 60
Ala Thr Val Ala Glu Lys Thr Lys Glu Gln Val Thr Asn Val Gly Gly 65 70 75 80
Ala Val Val Thr Gly Val Thr Ala Val Ala Gln Lys Thr Val Glu Gly
85 90 95
Ala Gly Ser Ile Ala Ala Ala Thr Gly Phe Val Lys Lys Asp Gln Leu 100 105 110
Gly Lys Asn Glu Glu Gly Ala Pro Gln Glu Gly Ile Leu Glu Asp Met 115 120 125
Pro Val Asp
130
<210> 17
<211> 106
<212><PRT>
<213><a r t i f i c i a l>
<220>
<223><kappa (región c o n s t a n t e de LC)>
<400> 17
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 1 5 10 15
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 20 25 30
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 35 40 45
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 50 55 60
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 65 70 75 80
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
85 90 95
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 18
<211> 329
<212><PRT>
<213><A r t i f i c i a l>
<220>
<223><IgG1 (región c o n s t a n t e de HC)>
<400> 18
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255 Pro Ser Asp Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
325
<210> 19
<211> 4
<212><PRT>
<213><A r t i f i c i a l>
<220>
<223><e p ít op o 112-115 de GM285>
<400> 19
Ile Leu Glu Asp
1
<210> 20
<211> 13
<212><PRT>
<213><A r t i f i c i a l>
<220>
<223><C a d e n a Pe sa da de la CDR1 de GM285>
<400> 20
Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Phe Thr Met Thr
1 5 10
<210> 21
<211> 17
<212><PRT>
<213><A r t i f i c i a l>
<220>
<223><C a d e n a Pe sa da de la CDR2 de GM285>
<400> 21
Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Gly Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15
Gly
<210> 22
<211> 9
<212><PRT>
<213><A r t i f i c i a l>
<220>
<223><C a d e n a Pe sa da de la CDR3 de GM285>
<400> 22
Ala Lys Asn Trp Ala Pro Phe Asp Tyr
1 5
<210> 23
<211> 12
<212><PRT>
<213><A r t i f i c i a l>
<220>
<223><C a d e n a L i g e r a de la CDR1 de GM285>
<400> 23
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 24
<211> 7
<212><PRT>
<213><A r t i f i c i a l>
<220>
<223><C a d e n a L i g e r a de la CDR2 de GM285>
<400> 24
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr
1 5
<210> 25
<211> 9
<212><PRT>
<213><A r t i f i c i a l>
<220>
<223><C a d e n a L i g e r a de la CDR3 de GM285>
<400> 25
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Trp Thr
1 5
<210> 26
<211> 116
<212><PRT>
<213><A r t i f i c i a l>
<220>
<223><V H de GM285>
<400> 26
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Phe 20 25 30
Thr Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Gly Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Leu Thr Val Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asn Trp Ala Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 27
<211> 108
<212><PRT>
<213><A r t i f i c i a l>
<220>
<223><VL de GM285>
<400> 27
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Ser 20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Val Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 28
<211> 329
<212><PRT>
<213><A r t i f i c i a l>
<220>
<223><r e g i ó n c o n s t a n t e de IgG1 de GM285>
<400> 28
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
325
<210> 29
<211> 106
<212><PRT>
<213><A r t i f i c i a l>
<220>
<223><c a de na Ka pp a de GM285>
<400> 29
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 1 5 10 15
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 20 25 30
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 35 40 45
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 50 55 60
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 65 70 75 80
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
85 90 95 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 30
<211> 116
<212><PRT>
<213><A r t i f i c i a l>
<220>
<223><c a de na p e s a d a de la V a r i a n t e 1 de GM37>
<400> 30
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Thr Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Ala Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Ala Ile Arg Ser Ser Gly Asp Arg Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Gln Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asn Trp Ala Pro Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 31
<211> 116
<212><PRT>
<213><A r t i f i c i a l>
<220>
<223><c a de na p e s a d a de la v a r i a n t e 2 de GM 37>
<400> 31
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Thr Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Ala Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Ala Ile Arg Ser Gln Gly Asp Arg Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Gln Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asn Trp Ala Pro Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 32
<211> 116
<212><PRT>
<213><A r t i f i c i a l>
<220>
<223><c a de na p e s a d a de la v a r i a n t e 3 de GM 37>
<400> 32
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Thr Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Ala Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Ala Ile Arg Ser His Gly Asp Arg Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Gln Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asn Trp Ala Pro Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 33
<211> 17
<212><PRT>
<213><A r t i f i c i a l>
<220>
<223><C D R 2 de c a d e n a p e s a d a de la V a r i a n t e>1 de GM37
<400> 33
Ala Ile Arg Ser Ser Gly Asp Arg Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15
Gly
<210> 34
<211> 17
<212><PRT>
<213><A r t i f i c i a l>
<220>
<223><c a de na p e s a d a de la C D R 2 de la va ri a>nte 2 de GM37
<400> 34
Ala Ile Arg Ser Gln Gly Asp Arg Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15
Gly
<210> 35
<211> 17
<212><PRT>
<213><A r t i f i c i a l>
<220>
<223><c a de na p e s a d a de la C D R 2 de la v a r i a n t e 3 de GM37><400> 35
Ala Ile Arg Ser His Gly Asp Arg Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15
Gly
<210> 36
<211> 5
<212><PRT>
<213><A r t i f i c i a l>
<220>
<223><e p ít op o de u n i ó n a 9E4>
<400> 36
Asn Glu Ala Tyr Glu
1 5
<210> 37
<211> 134
<212><PRT>
<213><A r t i f i c i a l>
<220>
<223><B e t a - s i n u c l e í n a H U M A N A>
<400> 37
Met Asp Val Phe Met Lys Gly Leu Ser Met Ala Lys Glu Gly Val Val 1 5 10 15
Ala Ala Ala Glu Lys Thr Lys Gln Gly Val Thr Glu Ala Ala Glu Lys 20 25 30
Thr Lys Glu Gly Val Leu Val Gly Ser Lys Thr Arg Glu Gly Val 35 40 45
Val Gln Gly Val Ala Ser Val Ala Glu Lys Thr Lys Glu Gln Ala Ser 50 55 60
His Leu Gly Gly Ala Val Phe Ser Gly Ala Gly Asn Ile Ala Ala Ala 65 70 75 80
Thr Gly Leu Val Lys Arg Glu Glu Phe Pro Thr Asp Leu Lys Pro Glu
85 90 95
Glu Val Ala Gln Glu Ala Ala Glu Glu Pro Leu Ile Glu Pro Leu Met 100 105 110
Glu Pro Glu Gly Glu Ser Tyr Glu Asp Pro Pro Gln Glu Glu Tyr Gln 115 120 125
Glu Tyr Glu Pro Glu Ala
130
<210> 38
<211> 127
<212><PRT>
<213><A r t i f i c i a l>
<220>
<223><G a m m a - s i n u c l e í n a H U M A N A>
<400> 38
Met Asp Val Phe Lys Lys Gly Phe Ser Ile Ala Lys Glu Gly Val Val 1 5 10 15
Gly Ala Val Glu Lys Thr Lys Gln Gly Val Thr Glu Ala Ala Glu Lys 20 25 30
Thr Lys Glu Gly Val Met Tyr Val Gly Ala Lys Thr Lys Glu Asn Val 35 40 45
Val Gln Ser Val Thr Ser Val Ala Glu Lys Thr Lys Glu Gln Ala Asn 50 55 60
Ala Val Ser Glu Ala Val Val Ser Ser Val Asn Thr Val Ala Thr Lys 65 70 75 80 Thr Val Glu Glu Ala Glu Asn Ile Ala Val Thr Ser Gly Val Val Arg
85 90 95
Lys Glu Asp Leu Arg Pro Ser Ala Pro Gln Gln Glu Gly Glu Ala Ser 100 105 110
Lys Glu Lys Glu Glu Val Ala Glu Glu Ala Gln Ser Gly Gly Asp 115 120 125
<210> 39
<211> 140
<212><PRT>
<213><A r t i f i c i a l>
<220>
<223><o r t ó l o g o de la a l f a - s i n u c l e í n a de M o n o c y no mo lg us><400> 39
Met Asp Val Phe Met Lys Gly Leu Ser Lys Ala Lys Glu Gly Val Val 1 5 10 15
Ala Ala Ala Glu Lys Thr Lys Gln Gly Val Ala Glu Ala Ala Gly Lys 20 25 30
Thr Lys Glu Gly Val Leu Tyr Val Gly Ser Lys Thr Lys Glu Gly Val 35 40 45
Val His Gly Val Ala Thr Val Ala Glu Lys Thr Lys Glu Gln Val Thr 50 55 60
Asn Val Gly Gly Ala Val Val Thr Gly Val Thr Ala Val Ala Gln Lys 65 70 75 80
Thr Val Glu Gly Ala Gly Ser Ile Ala Ala Ala Thr Gly Phe Ile Lys
85 90 95
Lys Asp Gln Leu Gly Lys Asn Glu Glu Gly Ala Pro Gln Glu Gly Ile 100 105 110
Leu Gln Asp Met Pro Val Asp Pro Asp Asn Glu Ala Tyr Glu Met Pro 115 120 125
Ser Glu Glu Gly Tyr Gln Asp Tyr Glu Pro Glu Ala
130 135 140
<210> 40
<211> 140
<212><PRT>
<213><A r t i f i c i a l>
<220>
<223><o r t ó l o g o de la a l f a - s i n u c l e í n a de Rata>
<400> 40
Met Asp Val Phe Met Lys Gly Leu Ser Lys Ala Lys Glu Gly Val Val 1 5 10 15
Ala Ala Ala Glu Lys Thr Lys Gln Gly Val Ala Glu Ala Ala Gly Lys 20 25 30
Thr Lys Glu Gly Val Leu Tyr Val Gly Ser Lys Thr Lys Glu Gly Val 35 40 45
Val His Gly Val Thr Thr Val Ala Glu Lys Thr Lys Glu Gln Val Thr 50 55 60
Asn Val Gly Gly Ala Val Val Thr Gly Val Thr Ala Val Ala Gln Lys 65 70 75 80
Thr Val Glu Gly Ala Gly Asn Ile Ala Ala Ala Thr Gly Phe Val Lys
85 90 95
Lys Asp Gln Met Gly Lys Gly Glu Glu Gly Tyr Pro Gln Glu Gly Ile 100 105 110
Leu Glu Asp Met Pro Val Asp Pro Ser Ser Glu Ala Tyr Glu Met Pro 115 120 125
Ser Glu Glu Gly Tyr Gln Asp Tyr Glu Pro Glu Ala
130 135 140
<210> 41
<211> 140
<212><PRT>
<213><A r t i f i c i a l>
<220>
<223><o r t ó l o g o de la a l f a - s i n u c l e í n a de Ra tó n><400> 41
Met Asp Val Phe Met Lys Gly Leu Ser Lys Ala Lys Glu Gly Val Val 1 5 10 15
Ala Ala Ala Glu Lys Thr Lys Gln Gly Val Ala Glu Ala Ala Gly Lys 20 25 30
Thr Lys Glu Gly Val Leu Tyr Val Gly Ser Lys Thr Lys Glu Gly Val 35 40 45
Val His Gly Val Thr Thr Val Ala Glu Lys Thr Lys Glu Gln Val Thr 50 55 60
Asn Val Gly Gly Ala Val Val Thr Gly Val Thr Ala Val Ala Gln Lys 65 70 75 80
Thr Val Glu Gly Ala Gly Asn Ile Ala Ala Ala Thr Gly Phe Val Lys
85 90 95
Lys Asp Gln Met Gly Lys Gly Glu Glu Gly Tyr Pro Gln Glu Gly Ile 100 105 110
Leu Glu Asp Met Pro Val Asp Pro Gly Ser Glu Ala Tyr Glu Met Pro 115 120 125
Ser Glu Glu Gly Tyr Gln Asp Tyr Glu Pro Glu Ala
130 135 140
<210> 42
<211> 446
<212><PRT>
<213><a r t i f i c i a l>
<220>
<223><HC de 9E4>
<400> 42
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ala Ser Ile Ser Ser Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Asn Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Ala Gly Ile Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala 115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu 130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly 145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu 180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr 195 200 205
Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 225 230 235 240 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 260 265 270
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 340 345 350
Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 43
<211> 220
<212><PRT>
<213> a r t i f i c i a l
<220>
<223> LC de 9E4
<400> 43
Asp I l e Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser A la Ser V a l G ly 1 5 10 15
Asp Arg V a l Thr I l e Thr Cys Lys Ser I l e Gln Thr Leu Leu Tyr Ser 20 25 30
Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu A la Trp Phe Gln Gln Lys Pro G ly Lys 35 40 45
A la Pro Lys Leu Leu I l e Tyr Trp A la Ser I l e Arg Lys Ser G ly V a l 50 55 60
Pro Ser Arg Phe Ser G ly Ser G ly Ser G ly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80
I l e Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Leu A la Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
T yr Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe G ly G ly G ly Thr Lys Leu Glu I l e 100 105 110 Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp 115 120 125
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 130 135 140
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu 145 150 155 160
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
165 170 175
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 180 185 190
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser 195 200 205
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215 220

Claims (9)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo monoclonal humano capaz de unirse específicamente a la alfa-sinucleína humana, donde el anticuerpo monoclonal se selecciona del grupo que consiste en los anticuerpos monoclonales humanos (1)-(2):
(1) Un anticuerpo monoclonal humano que comprende:
a) el dominio variable de cadena pesada deSEQ ID NO:7y
b) el dominio variable de cadena ligera deSEQ ID NO:8;
(2) Un anticuerpo monoclonal humano que comprende:
a) el dominio variable de cadena pesada deSEQ ID NO:31y
b) el dominio variable de cadena ligera deSEQ ID NO:8;
y en donde el anticuerpo monoclonal humano es un isotipo de IgG1 humana.
2. El anticuerpo monoclonal de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende el dominio variable de cadena pesada deSEQ ID NO:7y el dominio variable de cadena ligera deSEQ ID NO:8.
3. El anticuerpo monoclonal de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende el dominio variable de cadena pesada deSEQ ID NO:31y el dominio variable de cadena ligera deSEQ ID NO:8
4. Un ácido nucleico que codifica el de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3.
5. El anticuerpo monoclonal de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 para uso en terapia.
6. El anticuerpo monoclonal de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 para uso en el tratamiento de una sinucleinopatía.
7. El anticuerpo monoclonal para el uso de acuerdo con la reivindicación 6, donde la sinucleinopatía se selecciona de enfermedad de Parkinson, formas idiopáticas y hereditarias de la enfermedad de Parkinson, Enfermedad de Gaucher (GD), Enfermedad Difusa por Cuerpos de Lewy (DLB), variante de enfermedad de Alzheimer con cuerpos de Lewy (LBV), enfermedad Combinada de Alzheimer y Parkinson, fallo autonómico puro o atrofia multisistema.
8. El anticuerpo monoclonal para el uso de acuerdo con la reivindicación 7, donde la sinucleinopatía es enfermedad de Parkinson.
9. El anticuerpo monoclona para el uso de acuerdo con una la reivindicación 7, donde la sinucleinopatía es atrofia multisistema.
ES16738736T 2015-07-13 2016-07-12 Agents, uses and methods for the treatment of synucleinopathy Active ES3028882T3 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB1512203.9A GB201512203D0 (en) 2015-07-13 2015-07-13 Agents,uses and methods
PCT/EP2016/066476 WO2017009312A1 (en) 2015-07-13 2016-07-12 Agents, uses and methods for the treatment of synucleinopathy

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES3028882T3 true ES3028882T3 (en) 2025-06-20

Family

ID=54013851

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES16738736T Active ES3028882T3 (en) 2015-07-13 2016-07-12 Agents, uses and methods for the treatment of synucleinopathy

Country Status (40)

Country Link
US (12) US10800836B2 (es)
EP (2) EP3322722B1 (es)
JP (4) JP7012004B2 (es)
KR (2) KR102793383B1 (es)
CN (2) CN115925921A (es)
AR (1) AR105336A1 (es)
AU (1) AU2016292896B2 (es)
CL (1) CL2018000075A1 (es)
CO (1) CO2017012941A2 (es)
CR (2) CR20180021A (es)
DK (1) DK3322722T3 (es)
DO (1) DOP2018000013A (es)
EA (1) EA036499B1 (es)
EC (1) ECSP18002645A (es)
ES (1) ES3028882T3 (es)
FI (1) FI3322722T3 (es)
GB (1) GB201512203D0 (es)
GE (1) GEP20207151B (es)
HR (1) HRP20250624T1 (es)
HU (1) HUE071541T2 (es)
IL (1) IL256501B (es)
JO (1) JO3692B1 (es)
LT (1) LT3322722T (es)
MA (1) MA42439B1 (es)
MX (2) MX2018000504A (es)
MY (1) MY194944A (es)
NI (1) NI201800006A (es)
PE (1) PE20181049A1 (es)
PH (1) PH12018500016A1 (es)
PL (1) PL3322722T3 (es)
PT (1) PT3322722T (es)
RS (1) RS66840B1 (es)
RU (1) RU2765303C2 (es)
SI (1) SI3322722T1 (es)
SV (1) SV2018005612A (es)
TN (1) TN2018000005A1 (es)
TW (1) TWI729992B (es)
UA (1) UA125501C2 (es)
WO (1) WO2017009312A1 (es)
ZA (1) ZA201708607B (es)

Families Citing this family (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201512203D0 (en) 2015-07-13 2015-08-19 Lundbeck & Co As H Agents,uses and methods
US11542332B2 (en) 2016-03-26 2023-01-03 Bioatla, Inc. Anti-CTLA4 antibodies, antibody fragments, their immunoconjugates and uses thereof
MA46836A (fr) 2016-11-15 2019-09-25 H Lundbeck As Agents, utilisations et procédés pour le traitement d'une synucléinopathie
CN110072888B (zh) 2016-12-16 2023-07-18 H.隆德贝克有限公司 药剂、用途和方法
US10364286B2 (en) 2016-12-22 2019-07-30 H. Lundbeck A/S Monoclonal anti-alpha-synuclein antibodies for preventing tau aggregation
MX2019008029A (es) 2017-01-06 2019-12-11 Abl Bio Inc Anticuerpo anti-alfa-sinucleina y su uso.
EP3583124A1 (en) 2017-02-17 2019-12-25 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies to alpha-synuclein and uses thereof
KR102623819B1 (ko) 2017-03-27 2024-01-10 체이스 테라퓨틱스 코포레이션 시누클레인병변을 치료하기 위한 조성물 및 방법
WO2018204352A1 (en) 2017-05-01 2018-11-08 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Monoclonal antibodies against alpha-synuclein fibrils
WO2019040617A1 (en) 2017-08-23 2019-02-28 The Trustees Of The University Of Pennsylvania MONOCLONAL ANTIBODIES AGAINST PATHOLOGICAL ALPHA-SYNUCLEIN AND METHODS USING SAME
AU2018370279B2 (en) * 2017-11-17 2022-11-03 Abl Bio Inc. Antibodies to a-synuclein and uses thereof
JP7212391B2 (ja) 2017-12-14 2023-01-25 エービーエル バイオ インコーポレイテッド ａ－ｓｙｎ／ＩＧＦ１Ｒに対する二重特異抗体およびその用途
GB201720975D0 (en) 2017-12-15 2018-01-31 Ucb Biopharma Sprl Anti-alpha synuclein antibodies
GB201720970D0 (en) 2017-12-15 2018-01-31 Ucb Biopharma Sprl Antibodies
MX2020007904A (es) 2018-01-26 2020-09-07 Quantum Si Inc Llamado de pulso y base habilitado por maquina de aprendizaje para dispositivos de secuenciacion.
WO2019157527A2 (en) * 2018-02-12 2019-08-15 The Scripps Research Institute Methods related to parkinson's disease and synucleinopathies
CN112839710B (zh) * 2018-08-09 2024-09-17 霍夫曼-拉罗奇有限公司 帕金森氏病的确定
TWI734279B (zh) * 2018-12-14 2021-07-21 美商美國禮來大藥廠 抗α-突觸核蛋白抗體及其用途
WO2020212593A1 (en) * 2019-04-18 2020-10-22 Ac Immune Sa Novel molecules for therapy and diagnosis
WO2020223310A2 (en) * 2019-04-29 2020-11-05 Thomas Jefferson University Methods for treating neurodegenerative disorders
CA3159964A1 (en) * 2019-12-04 2021-06-10 Ac Immune Sa Novel molecules for therapy and diagnosis
KR102466943B1 (ko) * 2020-04-02 2022-11-14 한국과학기술연구원 갭을 갖는 바이오 센서를 이용한 파킨슨병 모니터링 방법 및 시스템
CN111537738A (zh) * 2020-05-18 2020-08-14 南通大学附属医院 用于超早期帕金森病检测的试剂盒
JP2024534901A (ja) * 2021-09-01 2024-09-26 ヴァクシニティ， インコーポレイテッド シヌクレイノパチーの予防及び治療のための方法
CN117915952A (zh) 2021-09-16 2024-04-19 H.隆德贝克有限公司 用于治疗突触核蛋白病的组合物和方法
CN117430686B (zh) * 2022-07-22 2025-07-01 深圳市安群生物工程有限公司 α-突触核蛋白抗原表位肽及测定唾液中SNCA试剂盒和在帕金森病诊断中的应用
WO2024177999A2 (en) * 2023-02-21 2024-08-29 The Regents Of The University Of Michigan Human aggregated alpha-synuclein binding molecules
CN116077524A (zh) * 2023-02-27 2023-05-09 广西馨海药业科技有限公司 氯化铷在制备治疗帕金森综合征的药物中的用途
WO2025076635A1 (en) * 2023-10-12 2025-04-17 Universite Laval Anti-alpha-synuclein antibodies and uses thereof
WO2025186235A1 (en) 2024-03-05 2025-09-12 H. Lundbeck A/S Compositions and methods for treating multiple system atrophy (msa)

Family Cites Families (86)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
GB1512203A (en) 1974-05-08 1978-05-24 Aspin F Rolls for use in profiling film
JPS5896026A (ja) 1981-10-30 1983-06-07 Nippon Chemiphar Co Ltd 新規ウロキナ−ゼ誘導体およびその製造法ならびにそれを含有する血栓溶解剤
DE3380726D1 (en) 1982-06-24 1989-11-23 Japan Chem Res Long-acting composition
US4681581A (en) 1983-12-05 1987-07-21 Coates Fredrica V Adjustable size diaper and folding method therefor
US4766106A (en) 1985-06-26 1988-08-23 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US5776093A (en) 1985-07-05 1998-07-07 Immunomedics, Inc. Method for imaging and treating organs and tissues
US4735210A (en) 1985-07-05 1988-04-05 Immunomedics, Inc. Lymphographic and organ imaging method and kit
US5101827A (en) 1985-07-05 1992-04-07 Immunomedics, Inc. Lymphographic and organ imaging method and kit
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
JPH02504672A (ja) 1986-12-15 1990-12-27 ブリティッシュ　テクノロジー　グループ　ユーエスエイ，インコーポレイテッド 単量体性フタロシアニン試薬
US5750172A (en) 1987-06-23 1998-05-12 Pharming B.V. Transgenic non human mammal milk
US5648471A (en) 1987-12-03 1997-07-15 Centocor, Inc. One vial method for labeling antibodies with Technetium-99m
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
EP0486622B1 (en) 1989-08-09 1998-11-04 Rhomed, Incorporated Direct radiolabeling of antibodies and other proteins with technetium or rhenium
US5633076A (en) 1989-12-01 1997-05-27 Pharming Bv Method of producing a transgenic bovine or transgenic bovine embryo
US5859205A (en) 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
WO1992003918A1 (en) 1990-08-29 1992-03-19 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5877397A (en) 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5874299A (en) 1990-08-29 1999-02-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US6300129B1 (en) 1990-08-29 2001-10-09 Genpharm International Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
WO1992022645A1 (en) 1991-06-14 1992-12-23 Genpharm International, Inc. Transgenic immunodeficient non-human animals
CA2103059C (en) 1991-06-14 2005-03-22 Paul J. Carter Method for making humanized antibodies
EP0593592B1 (en) 1991-07-08 1998-03-25 The University Of Massachusetts At Amherst Thermotropic liquid crystal segmented block copolymer
ES2146648T3 (es) 1993-03-09 2000-08-16 Genzyme Corp Procedimiento de aislamiento de proteinas de la leche.
AU6819494A (en) 1993-04-26 1994-11-21 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5827690A (en) 1993-12-20 1998-10-27 Genzyme Transgenics Corporatiion Transgenic production of antibodies in milk
US6077835A (en) 1994-03-23 2000-06-20 Case Western Reserve University Delivery of compacted nucleic acid to cells
KR970029803A (ko) 1995-11-03 1997-06-26 김광호 반도체 메모리장치의 프리차지 회로
IL144084A0 (en) 1999-02-03 2002-05-23 Biosante Pharmaceuticals Inc Therapeutic calcium phosphate particles and methods of manufacture and use
US6281005B1 (en) 1999-05-14 2001-08-28 Copernicus Therapeutics, Inc. Automated nucleic acid compaction device
CA2380813A1 (en) 1999-07-29 2001-02-08 Medarex, Inc. Human monoclonal antibodies to her2/neu
WO2001014424A2 (en) 1999-08-24 2001-03-01 Medarex, Inc. Human ctla-4 antibodies and their uses
CN1440420A (zh) 2000-07-07 2003-09-03 万能药制药公司 预防神经组织损伤和治疗α－共核蛋白疾病的方法
DE60131456T2 (de) 2000-11-30 2008-07-10 Medarex, Inc., Milpitas Transchromosomale transgen-nagetiere zur herstellung von humanen antikörpern
AU2002345843A1 (en) 2001-06-22 2003-01-08 Panacea Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for preventing protein aggregation in neurodegenerative diseases
IL166244A0 (en) 2001-07-12 2006-01-15 Jefferson Foote Super humanized antibodies
US8829198B2 (en) 2007-10-31 2014-09-09 Proteotech Inc Compounds, compositions and methods for the treatment of beta-amyloid diseases and synucleinopathies
US9034337B2 (en) * 2003-10-31 2015-05-19 Prothena Biosciences Limited Treatment and delay of outset of synucleinopathic and amyloidogenic disease
US20080014194A1 (en) 2003-10-31 2008-01-17 Elan Pharmaceuticals, Inc. Prevention and Treatment of Synucleinopathic and Amyloidogenic Disease
TW200509968A (en) 2002-11-01 2005-03-16 Elan Pharm Inc Prevention and treatment of synucleinopathic disease
US8506959B2 (en) 2002-11-01 2013-08-13 Neotope Biosciences Limited Prevention and treatment of synucleinopathic and amyloidogenic disease
US7358331B2 (en) * 2003-05-19 2008-04-15 Elan Pharmaceuticals, Inc. Truncated fragments of alpha-synuclein in Lewy body disease
DK2361928T3 (en) 2003-05-19 2017-07-03 Prothena Biosciences Ltd Truncated fragments of alpha synuclein in Lewy body disease
WO2005047860A2 (en) * 2003-11-08 2005-05-26 Elan Pharmaceuticals, Inc. Antibodies to alpha-synuclein
JP2006031250A (ja) 2004-07-14 2006-02-02 Fuji Xerox Co Ltd 通信装置およびその制御方法
EA013752B1 (ru) * 2004-08-09 2010-06-30 Элан Фармасьютикалз, Инк. Предупреждение и лечение синуклеинопатических и амилоидогенных заболеваний
US20060205024A1 (en) 2005-03-08 2006-09-14 Sun Health Research Institute Method to diagnose and evaluate progression of Alzheimer's disease
WO2007011907A2 (en) * 2005-07-19 2007-01-25 University Of Rochester Alpha-synuclein antibodies and methods related thereto
EA016609B1 (ru) 2005-11-28 2012-06-29 Генмаб А/С Рекомбинантные моновалентные антитела и способы их получения
PL2583978T3 (pl) 2007-02-23 2016-07-29 Prothena Biosciences Ltd Co Profilaktyka i leczenie chorób synukleinopatycznych i amyloidogennych
PL3067066T3 (pl) 2007-02-23 2019-09-30 Prothena Biosciences Limited Zapobieganie i leczenie choroby synukleinopatycznej i amyloidogennej
PL2154969T3 (pl) * 2007-05-16 2016-04-29 Brigham & Womens Hospital Inc Leczenie synukleinopatii
EP2185692A4 (en) 2007-08-10 2012-05-02 Medarex Inc HCO32 AND HCO27 AND RELATED EXAMPLES
EP3470079A1 (en) 2008-04-29 2019-04-17 BioArctic AB Antibodies and vaccines for use in therapeutic and diagnostic methods for alpha-synuclein-related disorders
EA030826B1 (ru) * 2008-12-19 2018-10-31 Панима Фармасьютикалз Аг ЧЕЛОВЕЧЕСКИЕ АУТОАНТИТЕЛА ПРОТИВ α-СИНУКЛЕИНА
WO2010118282A1 (en) 2009-04-09 2010-10-14 Amicus Therapeutics, Inc. Methods for preventing and/or treating degenerative disorders of the central nervous system
ES2661925T3 (es) 2010-02-26 2018-04-04 Bioarctic Ab Anticuerpos de unión a las protofibrillas y su uso en métodos terapéuticos diagnósticos para la enfermedad de Parkinson, la demencia con cuerpos de Lewy y otras alfa-sinucleinopatías
EP2366714A1 (en) 2010-03-03 2011-09-21 Dr. Rentschler Holding GmbH & Co. KG Naturally occuring autoantibodies against alpha-synuclein that inhibit the aggregation and cytotoxicity of alpha-synuclein
GB201008682D0 (en) 2010-05-25 2010-07-07 Vib Vzw Epitope tag for affinity based applications
PT2627672T (pt) 2010-10-11 2018-11-16 Univ Zuerich Anticorpos anti-tau humanos
ES2699801T3 (es) 2011-06-23 2019-02-12 Biogen Int Neuroscience Gmbh Moléculas de unión anti-alfa sinucleína
JP2013059866A (ja) 2011-09-12 2013-04-04 Seiko Epson Corp 液体噴射装置、液体噴射装置の制御方法および液体噴射装置の制御プログラム
PT3378535T (pt) * 2011-10-28 2023-02-06 Prothena Biosciences Ltd Anticorpos humanizados que reconhecem a alfa-sinucleína
KR20200013072A (ko) 2012-07-03 2020-02-05 워싱턴 유니버시티 Tau에 대한 항체
UA118441C2 (uk) 2012-10-08 2019-01-25 Протена Біосаєнсиз Лімітед Антитіло, що розпізнає альфа-синуклеїн
JP6499077B2 (ja) 2012-10-25 2019-04-10 ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション アルツハイマー病と関連疾患の治療のための併用療法
US9534044B2 (en) 2013-02-28 2017-01-03 United Arab Emirates University Alpha-synuclein antibodies and uses thereof
US10513555B2 (en) 2013-07-04 2019-12-24 Prothena Biosciences Limited Antibody formulations and methods
CA2924268C (en) * 2013-11-21 2021-05-18 F. Hoffmann-La Roche Ag Anti-alpha-synuclein antibodies and methods of use
EP3207057A2 (en) 2014-10-16 2017-08-23 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-alpha-synuclein antibodies and methods of use
CA2985366A1 (en) 2015-05-07 2016-11-10 Axovant Sciences Gmbh Methods of treating a neurodegenerative disease
GB201512203D0 (en) 2015-07-13 2015-08-19 Lundbeck & Co As H Agents,uses and methods
US10160800B2 (en) 2016-06-02 2018-12-25 Medimmune Limited Antibodies to α-synuclein and uses thereof
MA46836A (fr) 2016-11-15 2019-09-25 H Lundbeck As Agents, utilisations et procédés pour le traitement d'une synucléinopathie
US10364286B2 (en) 2016-12-22 2019-07-30 H. Lundbeck A/S Monoclonal anti-alpha-synuclein antibodies for preventing tau aggregation

Also Published As

Publication number Publication date
ECSP18002645A (es) 2018-03-31
JP2021191763A (ja) 2021-12-16
US10364285B2 (en) 2019-07-30
FI3322722T3 (fi) 2025-06-05
BR112017027506A2 (pt) 2018-09-11
US10358483B2 (en) 2019-07-23
US20210054057A1 (en) 2021-02-25
RU2765303C2 (ru) 2022-01-28
JO3692B1 (ar) 2020-08-27
AR105336A1 (es) 2017-09-27
NZ738315A (en) 2024-12-20
IL256501B (en) 2021-10-31
US10358484B2 (en) 2019-07-23
RS66840B1 (sr) 2025-06-30
DK3322722T3 (da) 2025-05-26
JP7608404B2 (ja) 2025-01-06
US10800836B2 (en) 2020-10-13
US20230312693A1 (en) 2023-10-05
PE20181049A1 (es) 2018-07-03
US10640554B2 (en) 2020-05-05
MA42439B1 (fr) 2025-05-30
PT3322722T (pt) 2025-05-21
US20180127492A1 (en) 2018-05-10
US10647764B2 (en) 2020-05-12
JP2018529634A (ja) 2018-10-11
WO2017009312A1 (en) 2017-01-19
US10358482B2 (en) 2019-07-23
RU2017145653A (ru) 2019-08-13
RU2017145653A3 (es) 2019-11-21
SV2018005612A (es) 2018-07-20
KR102793383B1 (ko) 2025-04-08
EA036499B1 (ru) 2020-11-17
EP4582144A3 (en) 2025-07-16
US11524995B2 (en) 2022-12-13
UA125501C2 (uk) 2022-04-13
GEP20207151B (en) 2020-09-25
HRP20250624T1 (hr) 2025-07-18
US11542323B2 (en) 2023-01-03
US20190367594A1 (en) 2019-12-05
CN107709361A (zh) 2018-02-16
AU2016292896B2 (en) 2022-02-24
GB201512203D0 (en) 2015-08-19
JP2022174131A (ja) 2022-11-22
DOP2018000013A (es) 2018-04-15
EP3322722A1 (en) 2018-05-23
KR20180029205A (ko) 2018-03-20
US20210147522A1 (en) 2021-05-20
PH12018500016A1 (en) 2018-07-09
NI201800006A (es) 2018-10-18
MX2018000504A (es) 2018-04-30
US20180127491A1 (en) 2018-05-10
SI3322722T1 (sl) 2025-06-30
CL2018000075A1 (es) 2018-05-11
US20180179270A1 (en) 2018-06-28
MA42439A (fr) 2018-05-23
JP2025041734A (ja) 2025-03-26
EP4582144A2 (en) 2025-07-09
US20180179271A1 (en) 2018-06-28
JP7138322B2 (ja) 2022-09-16
MY194944A (en) 2022-12-27
US20190382473A1 (en) 2019-12-19
CN115925921A (zh) 2023-04-07
US11421024B2 (en) 2022-08-23
CR20230300A (es) 2023-08-25
LT3322722T (lt) 2025-06-10
PL3322722T3 (pl) 2025-06-30
EP3322722B1 (en) 2025-03-05
HK1254358A1 (en) 2019-07-19
JP7012004B2 (ja) 2022-02-10
EA201792616A1 (ru) 2018-06-29
AU2016292896A1 (en) 2018-01-18
US10647763B2 (en) 2020-05-12
US20210061892A1 (en) 2021-03-04
KR20250051158A (ko) 2025-04-16
US20170015739A1 (en) 2017-01-19
ZA201708607B (en) 2019-05-29
TN2018000005A1 (en) 2019-07-08
CO2017012941A2 (es) 2018-03-09
HUE071541T2 (hu) 2025-09-28
TW201716440A (zh) 2017-05-16
MX2023009483A (es) 2023-08-22
CR20180021A (es) 2018-03-13
CA2989735A1 (en) 2017-01-19
TWI729992B (zh) 2021-06-11
US20190367595A1 (en) 2019-12-05
IL256501A (en) 2018-02-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES3028882T3 (en) Agents, uses and methods for the treatment of synucleinopathy
AU2016292892B2 (en) Antibodies specific for hyperphosphorylated tau and methods of use thereof
ES2862427T3 (es) Anticuerpos específicos para tau hiperfosforilada y métodos de uso de los mismos
ES3008133T3 (en) Agents, uses and methods
CA2989735C (en) Antibodies binding alpha-synuclein and uses thereof for the treatment of synucleinopathy
BR112017027506B1 (pt) Anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, preparação, composição farmacêutica, uso dos mesmos e kit para o tratamento de sinucleinopatia
HK1254358B (en) Agents, uses and methods for the treatment of synucleinopathy