RS65277B1 - Terapijski agens za amiotrofičnu lateralnu sklerozu i kompozicija za lečenje - Google Patents

Description

Opis

Tehnička oblast

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na terapijski agens i na kompoziciju koja sadrži navedeni agens za upotrebu u lečenju sporadične amiotrofične lateralne skleroze (ALS), ili porodične ALS sa mutacijom u FUS genu ili genu TAR DNK-vezujućeg proteina od 43 kDa (TDP-43). Prioritet se zahteva na osnovu japanske patentne prijave br. 2016-172255, koja je podneta u Japanu 2. septembra 2016.

Stanje tehnike

[0002] ALS je neurodegenerativna bolest koja uzrokuje tešku mišićnu atrofiju i slabost mišića i predstavlja tip bolesti motornih neurona. Kod ALS, uočavaju se lezije specifične za motorne neurone i bolest napreduje veoma brzo sa prosečnim vremenom preživljavanja koje posle početka bolesti iznosi nekoliko godina. Ne postoji efikasan tretman za ALS, i poželjan je razvoj terapijskog agensa što je pre moguće. Iako je većina slučajeva ALS sporadična, 10% pacijenata ima porodičnu ALS i tu su uključeni jasni genetički faktori.

[0003] Mutantni miš koji je poznat kao vobler (wobbler) miš upotrebljen je kao ALS model pošto miš pokazuje mišićnu atrofiju prednjih udova i facijalnih mišića kako miš raste i na kraju pokazuje mišićnu atrofiju zadnjih udova (pogledati, na primer, NPL 1). Međutim, poznato je da vobler mutacija nije uočena kod pacijenata sa ALS.

[0004] Pored toga, SOD1 je poznat kao jedan od glavnih uzročnih gena porodične ALS, i transgeni miš u kog je introdukovan mutirani SOD1 (NPL 2) upotrebljava se u istraživanju otkrivanja lekova, ali tek treba da bude razvijen lek koji pokazuje jasne terapijske efekte u kliničkoj praksi. Umesto toga, lekovi koji su odabrani upotrebom SOD1-ALS modela ne pokazuju korisnost kod stvarnih pacijenata sa ALS u većini slučajeva, i trenutno postoji zabrinutost da SOD1-ALS model možda nije funkcionalan model usled nepovezanosti između SOD1-ALS modela i stvarne kliničke prakse.

[0005] WO 2012/048330 obezbeđuje postupak za lečenje bolesti motornih neurona kod humanog pacijenta koji sadrži primenu navedenom pacijentu terapijski efikasne količine agensa koji povećava ekspresiju IGF-II gena.

[0006] Stoga, nije postojao dobar ALS model u srodnoj struci. Ovo bi mogao biti jedan od razloga zašto razvoj terapijskih agenasa za ALS ne napreduje.

[0007] Bez ograničavanja na ALS, postoje teško izlečive bolesti za koje ne postoji efikasan model bolesti. Poslednjih godina, očekivalo se da će istraživanje bolesti upotrebom iPS ćelija proizvesti modele bolesti za ove teško izlečive bolesti.

Lista citata

Nepatentna literatura

[0008]

[NPL 1] Moser J. M., et al., The wobbler mouse, an ALS animal model., Mol. Genet. Genomics., 288 (5-6), 207-229, 2013.

[NPL 2] Julien J. P., Kriz J., Transgenic mouse models of amyotrophic lateral sclerosis, Biochimica et Biophysica Acta, 1762 (11-12), 1013-1024, 2006.

Sažetak pronalaska

[0009] Predmetni pronalazak je definisan pomoću patentnih zahteva. Svaki predmet koji ne spada u obim patentnih zahteva obezbeđen je samo kao informacija.

Tehnički problem

[0010] Cilj predmetnog pronalaska je da obezbedi terapijski agens i kompoziciju koja sadrži navedeni agens za upotrebu u lečenju sporadične amiotrofične lateralne skleroze (ALS), ili porodične ALS sa mutacijom u FUS genu ili genu TAR DNK-vezujućeg proteina od 43 kDa (TDP-43).

Rešenje problema

[0011] Nije preterano reći da su iPS ćelije koje su specifične za bolest jedino sredstvo za in vitro reprodukovanje fenomena koji se javljaju in vivo kod pacijenata, naročito u nervnom sistemu. Upotreba iPS ćelija koje su specifične za bolest omogućava da se proizvedu precizniji modeli bolesti nego sa postojećim kultivisanim ćelijama i mišjim modelom bolesti. Konkretno, što se tiče bolesti centralnog nervnog sistema, upotreba neurona koji su diferencirani od iPS ćelija koje su specifične za bolest centralnog nervnog sistema omogućava da se odaberu efikasni terapijski kandidati za lek sa visokom preciznošću, ne samo razjašnjavajući mehanizam bolesti, već i čineći neurone preciznijim modelom bolesti/modelom za procenu efikasnosti.

[0012] Kao što će biti opisano u nastavku u Primerima, predmetni pronalazači su indukovali iPS ćelije koje su poreklom od pacijenata sa ALS da se diferenciraju u motorne neurone i primenjivali su terapijski agens za ALS, koji će biti opisan u nastavku, motornim neuronima koji odražavaju ALS bolest, kako bi razjasnili da se poboljšala ALS bolest u motornim neuronima. U skladu sa tim, moguće je lečiti ALS sa terapijskim agensom za ALS koji će biti opisan u nastavku.

[0013] Pored toga, većina pacijenata sa ALS ima sporadičnu ALS i, kao što je opisano u nastavku u Primerima, pronalazači su pronašli da terapijski agens za ALS koji će biti opisan u nastavku poboljšava bolest i za motorne neurone koji odražavaju porodičnu ALS bolest i za motorne neurone koji odražavaju sporadičnu ALS bolest. U skladu sa tim, terapijski agens za ALS koji je opisan u nastavku ima terapijski efekat i na porodičnu ALS i na sporadičnu ALS.

[0014] Pošto je terapijski agens za ALS koji će biti opisan u nastavku jedinjenje koje je dobijeno postavljanjem fenotipa koji je pronađen iz analize upotrebom modela bolesti upotrebom iPS ćelija koje su poreklom od pacijenata kao modela procene i pregleda upotrebom bolesti koja je eksprimirana u prelaznom periodu kada je fenotip bolesti uočen kao indikator, pre nego u kasnoj fazi blizu ćelijske smrti, njegov terapijski efekat za ALS je visok.

[0015] Predmetni pronalazak uključuje sledeće aspekte.

[1] Terapijski agens za upotrebu u lečenju sporadične amiotrofične lateralne skleroze (ALS), ili porodične ALS sa mutacijom u FUS genu ili genu TAR DNK-vezujućeg proteina od 43 kDa (TDP-43), uključujući jedinjenje koje je predstavljeno pomoću Formule (1), njegovu farmaceutski prihvatljivu so, ili njegov solvat, kao efikasan sastojak

[u Formuli (1), R<1>svaki nezavisno predstavlja alkil grupu koja ima 1 do 6 atoma ugljenika ili 4-hidroksifenetil grupu, i n predstavlja ceo broj od 1 do 3].

[2] Terapijski agens za ALS u skladu sa [1], u kome je n u Formuli (1) 2.

[3] Terapijski agens za ALS u skladu sa [1] ili [2], u kome je R<1>u Formuli (1) n-propil grupa.

[4] Terapijski agens za ALS u skladu sa bilo kojim od [1] do [3], u kome je jedinjenje koje je predstavljeno pomoću Formule (1) 4-[2-(dipropilamino)etil]-1,3-dihidro-2H-indol-2-on.

[5] Terapijski agens za ALS u skladu sa bilo kojim od [1] do [4], u kome je farmaceutski prihvatljiva so jedinjenja koje je predstavljeno pomoću Formule (1) 4-[2-(dipropilamino)etil]-1,3-dihidro-2H-indol-2-on hidrohlorid.

[6] Terapijski agens za ALS u skladu sa bilo kojim od [1] do [5], koji ima terapijski efekat i na porodičnu ALS i na sporadičnu ALS.

[7] Kompozicija za lečenje ALS koja uključuje terapijski agens za ALS u skladu sa bilo kojim od [1] do [5] i farmaceutski prihvatljiv nosač.

Povoljni efekti pronalaska

[0016] U skladu sa predmetnim pronalaskom, moguće je obezbediti terapijski agens i kompoziciju koja sadrži navedeni agens za upotrebu u lečenju sporadične amiotrofične lateralne skleroze (ALS), ili porodične ALS sa mutacijom u FUS genu ili genu TAR DNK-vezujućeg proteina od 43 kDa (TDP-43).

Kratak opis crteža

[0017]

SL. 1 je grafikon koji pokazuje rezultate merenja promena dužine neurita motornih neurona tokom vremena u Primeru I-2.

SL. 2 je grafikon koji pokazuje odnos CV kaspaza 3-pozitivnih neurona u svakom motornom neuronu izmeren u Primeru 1-3.

SL. 3 je grafikon koji pokazuje odnos curenja LDH u svakom motornom neuronu izmeren u Primeru I-4.

SL. 4 je grafikon koji pokazuje rezultate merenja odnosa motornih neurona kod kojih je uočena lokalizacija FUS proteina u citoplazmi u Primeru 1-5.

SL. 5 je grafikon koji pokazuje rezultate merenja broja inkluzija fosforilisanog TDP-43 proteina po motornom neuronu u Primeru 1-6.

SL. 6 je grafikon koji pokazuje broj stres granula po motornom neuronu izmeren u Primeru I-7.

SL. 7 je grafikon koji pokazuje promene odnosa curenja LDH u svakom motornom neuronu tokom vremena izmerene u Primeru II-3.

SL. 8 je grafikon koji pokazuje promene odnosa CV kaspaza 3-pozitivnih neurona u svakom motornom neuronu tokom vremena izmerene u Primeru II-4.

SL. 9 je grafikon koji pokazuje promene broja stres granula po motornom neuronu tokom vremena izmerene u Primeru II-5.

SL. 10 je grafikon koji pokazuje dužinu neurita svakog motornog neurona izmerenu u Primeru 111-1.

SL. 11 je grafikon koji pokazuje odnos CV kaspaza 3-pozitivnih neurona izmeren u Primeru III-2.

SL. 12 je grafikon koji pokazuje odnos curenja LDH svakog motornog neurona izmeren u Primeru III-3.

SL. 13 je grafikon koji pokazuje broj stres granula svakog motornog neurona izmeren u Primeru III-4.

SL. 14(a) je grafikon koji pokazuje promene dužine neurita svakog motornog neurona tokom vremena izmerene u Primeru I-9. SL. 14(b) je grafikon koji uvećava uokvireni deo grafikona sa SL. 14(a). SL. 14(c) je grafikon koji pokazuje dužinu neurita svakog motornog neurona na dane 50 i 62 od indukcije diferencijacije, kao što je izmereno u primeru I-9.

SL. 15 je grafikon koji pokazuje odnos CV kaspaza 3-pozitivnih neurona u svakom motornom neuronu izmeren u Primeru III-5.

Opis primera izvođenja

[Terapijski agens za ALS]

[0018] Predmetni pronalazak obezbeđuje terapijski agens za upotrebu u lečenju sporadične amiotrofične lateralne skleroze (ALS), ili porodične ALS sa mutacijom u FUS genu ili genu TAR DNK-vezujućeg proteina od 43 kDa (TDP-43), koji sadrži jedinjenje koje je predstavljeno pomoću Formule (1), njegovu farmaceutski prihvatljivu so, ili njegov solvat, kao efikasan sastojak.

[U Formuli (1), R<1>svaki nezavisno predstavlja alkil grupu koja ima 1 do 6 atoma ugljenika ili 4-hidroksifenetil grupu, i n predstavlja ceo broj od 1 do 3].

[0019] Terapijski agens iz predmetnog pronalaska je za upotrebu u lečenju porodične ALS sa mutacijom u FUS genu ili genu TAR DNK-vezujućeg proteina od 43 kDa (TDP-43). Pored toga, kao što je opisano u nastavku u Primerima, terapijski agens takođe ima terapijski efekat na sporadičnu ALS.

[0020] U terapijskom agensu za ALS iz predmetnog primera izvođenja, n u Formuli (1) može biti 1, 2, ili 3.

[0021] Pored toga, u Formuli (1), R<1>može biti linearna, razgranata, ili ciklična alkil grupa koja ima 1 do 6 atoma ugljenika, i specifičniji primeri za to uključuju metil grupu, etil grupu, n-propil grupu, izopropil grupu, n-butil grupu, izobutil grupu, sek-butil grupu, terc-butil grupu, ciklobutil grupu, n-pentil grupu, ciklopentil grupu, n-heksil grupu, cikloheksil grupu, i slično.

[0022] U terapijskom agensu za ALS iz predmetnog primera izvođenja, jedinjenje koje je predstavljeno pomoću Formule (1) može biti 4-[2-(dipropilamino)etil]-1,3-dihidro-2H-indol-2-on. To jest, jedinjenje koje je predstavljeno pomoću Formule (1) može biti ropinirol. Hemijska formula ropinirola pokazana je u Formuli (2).

[0023] Ropinirol je razvijen kao lek za lečenje Parkinsonove (Parkinsonꞌs) bolesti usled toga što ima aktivnost agonista dopaminskog D2 receptora u dopaminskim neuronima. Iz tog razloga, njegova klinička ispitivanja su već završena i zadovoljavajuće je potvrđena bezbednost u slučaju primene živim telima. Pošto je ropinirol postojeći lek čiji je mehanizam delovanja jasan, moguće je brzo razviti terapijski agens za ALS proširenjem njegove primene.

[0024] ALS je bolest uzrokovana poremećajem motornih neurona. Da jedinjenja koja su agonisti D2 receptora pokazuju terapijski efekat kod degenerativnih bolesti motornih neurona bez D2 receptora bio je iznenađujući nalaz. Takođe je moguće predvideti pronalaženje indicija u vezi sa mehanizmom bolesti ALS i potpuno razjašnjenje ALS bolesti iz analize mehanizma delovanja ropinirola.

[0025] Terapijski agens za ALS iz predmetnog primera izvođenja može biti so jedinjenja koje je predstavljeno pomoću Formule (1), solvat jedinjenja koje je predstavljeno pomoću Formule (1), ili solvat soli jedinjenja koje je predstavljeno pomoću Formule (1) .

[0026] So nije posebno ograničena sve dok je so farmaceutski prihvatljiva so, i njihovi primeri uključuju soli neorganske kiseline kao što su hidrohlorid, sulfat, hidrobromid, nitrat, i fosfat; soli organske kiseline kao što su acetat, mezilat, sukcinat, maleat, fumarat, citrat, i tartarat; soli alkalnih metala kao što su natrijumova so i kalijumova so; soli zemnoalkalnih metala kao što su magnezijumova so i kalcijumova so; soli metala kao što su soli aluminijuma i soli cinka; amonijumove soli kao što su amonijumove soli i tetrametilamonijumove soli; adicione soli organskih amina kao što su morfolin i piperidin; adicione soli aminokiselina kao što su glicin, fenilalanin, lizin, asparaginska kiselina, i glutaminska kiselina, i slično.

[0027] Pored toga, solvat jedinjenja koje je predstavljeno pomoću Formule (1) i solvat soli jedinjenja koje je predstavljeno pomoću Formule (1) nisu posebno ograničeni sve dok su solvati farmaceutski prihvatljivi i njihovi primeri uključuju hidrate, organske solvate, i slično.

[0028] Terapijski agens za ALS iz predmetnog primera izvođenja može biti 4-[2-(dipropilamino)etil]-1,3-dihidro-2H-indol-2-on hidrohlorid, to jest, ropinirol hidrohlorid.

[Kompozicija za lečenje ALS]

[0029] Predmetni pronalazak obezbeđuje kompoziciju za upotrebu u lečenju sporadične amiotrofične lateralne skleroze (ALS), ili porodične ALS sa mutacijom u FUS genu ili genu TAR DNK-vezujućeg proteina od 43 kDa (TDP-43), koja sadrži terapijski agens za ALS koji je prethodno opisan i farmaceutski prihvatljiv nosač.

[0030] Kompozicija za lečenje ALS iz predmetnog primera izvođenja može se pripremiti kao farmaceutska kompozicija i, na primer, može da se primenjuje oralno u obliku tableta, kapsula, eliksira, mikrokapsula, ili slično, ili parenteralno u obliku injekcije, supozitorije, eksternog preparata za kožu, ili slično. Specifičnije, primeri eksternog preparata za kožu uključuju formulacije kao što su masti i flasteri.

[0031] Kao farmaceutski prihvatljive nosače, moguće je upotrebljavati farmaceutski prihvatljive nosače koji se uobičajeno upotrebljavaju za pripremu farmaceutskih kompozicija bez posebnih ograničenja. Njihovi specifičniji primeri uključuju bajndere kao što su hipromeloza, dekstrin, makrogol 400, želatin, kukuruzni skrob, tragakant guma i gumarabika; ekscipijense kao što su laktoza hidrat, D-manitol, skrob, kristalna celuloza, i alginska kiselina; rastvarače za injekcije kao što su voda, etanol, i glicerin; adhezive kao što su adhezivi na bazi gume i adhezivi na bazi silikona, i slično.

[0032] Kompozicija za lečenje ALS može uključivati aditive. Primeri aditiva uključuju lubrikante kao što su kalcijum stearat i magnezijum stearat; zaslađivače kao što su saharoza, laktoza, saharin, i maltitol; arome kao što su pepermint i akamono ulje; stabilizatore kao što su karmeloza natrijum, hidrogenizovano ulje, laka anhidrovana silicijumova kiselina, povidon, estar masne kiseline na bazi glicerina, benzil alkohol, i fenol; agense za puferisanje kao što su fosfat i natrijum acetat; solubilizatore kao što su benzil benzoat i benzil alkohol; agense za bojenje kao što su gvožđe oksid žuti, gvožđe oksid, gvožđe oksid crni, titanijum oksid, i slično.

[0033] Moguće je pripremiti kompoziciju za lečenje ALS odgovarajućim kombinovanjem i mešanjem terapijskog agensa za ALS koji je prethodno opisan i farmaceutski prihvatljivog nosača i aditiva koji su prethodno opisani u obliku jedinične doze koja je potrebna za opšte prihvaćenu farmaceutsku praksu. U kompoziciji za lečenje ALS iz predmetnog primera izvođenja, jedan tip terapijskog agensa za ALS može se upotrebljavati sam, ili se dva ili više tipova mogu upotrebljavati u smeši.

[0034] Generalno, odgovarajuća dnevna doza kompozicije za lečenje ALS je količina koja uključuje najnižu dozu efikasnog sastojka (terapijskog agensa za ALS) koja je efikasna za stvaranje terapijskog efekta. Efikasna minimalna doza koja je prethodno opisana određuje se na osnovu različitih faktora uključujući aktivnost aktivnog sastojka koji je sadržan u kompoziciji za lečenje ALS, modifikaciju funkcionalne grupe koja definiše solubilnost u lipidima/solubilnost u vodi, put primene, vreme primene, stopu oslobađanja specifičnog efikasnog sastojka, trajanje lečenja, druge lekove, jedinjenja i/ili supstance koje se upotrebljavaju u kombinaciji sa njima, starost, pol, telesnu težinu, bolesti, zdravstveno stanje, istoriju bolesti pacijenta, i druge faktore koji su dobro poznati u medicini. Uobičajeno, doza kompozicije za lečenje ALS za pacijenta je količina koja uključuje efikasni sastojak od približno 0,0001 do približno 100 mg/kg telesne težine po danu. Kompozicija za lečenje ALS može se primenjivati jednom dnevno ili odvojeno približno 2 do 4 puta.

[0035] Konkretno, u slučaju gde je terapijski agens za ALS jedinjenje koje je predstavljeno pomoću Formule (2), za dozu kompozicije za lečenje ALS, poželjno, 2 mg aktivnog sastojka primenjuje se oralno jednom dnevno, količina se povećava svake nedelje, i količina treba da se primenjuje oralno unutar opsega u kome efikasni sastojak ne prelazi 16 mg dnevno.

[Primeri]

[0036] U nastavku biće dat detaljniji opis predmetnog pronalaska pokazivanjem Primera, ali predmetni pronalazak nije ograničen na sledeće Primere.

<1. Ispitivanje upotrebom iPS ćelija koje su poreklom od pacijenata sa porodičnom ALS>

[Primer 1-1]

(Diferencijacija u motorne neurone)

[0037] Poznato je da porodična ALS uključuje ALS uzrokovanu mutacijom FUS gena i ALS uzrokovanu mutacijom TDP-43 gena.

[0038] Prema tome, iPS ćelije koje su poreklom od zdravih subjekata, iPS ćelije koje su poreklom od pacijenata sa ALS koji imaju mutaciju u FUS, i iPS ćelije koje su poreklom od pacijenata sa ALS koji imaju mutaciju u TDP-43, diferencirane su u motorne neurone. Upotrebljene iPS ćelijske linije pokazane su u Tabeli 1 i sve su poreklom od fibroblasta kože.

TABELA 1

[0039] Specifično, svaka od prethodnih ćelijskih linija prvo je kultivisana u medijumu koji sadrži SB431542 (CAS broj: 301836-41-9) u krajnjoj koncentraciji od 3 μM, CHIR99021 (CAS broj: 252917-06-9) u krajnjoj koncentraciji od 3 μM, i dorzomorfin (CAS br. 866405-64-3) u krajnjoj koncentraciji od 3 μM tokom 5 dana kako bi se indukovale pluripotentne matične ćelije koje mogu da se promovišu na diferencijaciju (DiSC). Medijum je menjan svakog dana. U nastavku, vreme početka indukcije diferencijacije označava početak indukcije DiSC.

[0040] Nakon toga, dobijene DiSC su disocirane u ćelije jedna po jedna i dodatno kultivisane u medijumu koji ima kompoziciju koja je pokazana u Tabeli 2 u inkubatoru sa niskim sadržajem kiseonika tokom 7 dana. Koncentracija kiseonika je podešena na 5% (zapr./zapr.). Medijum je menjan svaka 2 do 3 dana.

TABELA 2

[0041] Nakon toga, ćelije su dodatno kultivisane u medijumu koji ima kompoziciju koja je pokazana u Tabeli 3 u inkubatoru sa niskim sadržajem kiseonika tokom 4 dana. Koncentracija kiseonika je podešena na 5% (zapr./zapr.). Medijum je menjan svaka 2 do 3 dana. DAPT (CAS broj: 208255-80-5) je dodat medijumu na dan 4 kultivisanja u medijumu koji ima kompoziciju koja je pokazana u Tabeli 3 tako da je krajnja koncentracija bila 5 μM.

TABELA 3

[0042] Na dan 14 kultivisanja sa medijumom koji ima kompoziciju koja je pokazana u Tabeli 3, ćelije su ponovo disocirane jedna po jedna, i dodatno kultivisane 5 do 40 dana u medijumu za indukciju diferencijacije neurona koji ima kompoziciju koja je pokazana u Tabeli 4. Ovo je indukovalo diferencijaciju u motorne neurone.

TABELA 4

[0043] Upotrebom diferencijacijom indukovanih motornih neurona, ispitivani su nivoi ekspresije svakog gena za neurogenu diferencijaciju 1 (NeuroD1), SRY-Box 1 (SOX 1), transkripcioni faktor oligodendrocitne linije 2 (OLIG 2), LIM Homeobox 3 (LHX 3), ISLET 1, HB9, i holin acetiltransferazu (ChAT). Kao pozitivna kontrola upotrebljeno je tkivo kičmene moždine. Kao rezultat, potvrđeno je da dobijeni motorni neuroni pokazuju obrasce ekspresije gena slične kičmenoj moždini. Iz ovih rezultata, potvrđeno je da je moguće indukovati iPS ćelije da se diferenciraju u motorne neurone.

[0044] Pored toga, diferencijacijom indukovani motorni neuroni su imuno obojeni i ispitivana je ekspresija glijalnog fibrilarnog kiselog proteina (GFAP), βIII-tubulina, HB9, i ChAT. Kao rezultat, potvrđeno je na osnovu rezultata imuno bojenja da je moguće indukovati iPS ćelije da se diferenciraju u motorne neurone.

[Primer 1-2]

(Analiza dužine neurita)

[0045] Za svaki diferencijacijom indukovani motorni neuron u Primeru I-1, izmerene su promene dužine neurita tokom vremena. Bio stanica CT (Nikon Corp.) upotrebljena je za merenje dužine neurita tokom vremena. SL. 1 je grafikon koji pokazuje rezultate merenja promena dužine neurita tokom vremena. Vertikalna osa predstavlja dužinu neurita (relativna vrednost), i horizontalna osa predstavlja broj dana kultivisanja od početka indukcije diferencijacije. Kao rezultat, otkriveno je da se kod motornih neurona koji su indukovani da se diferenciraju od iPS ćelija koje su poreklom od zdravih subjekata, dužina neurita kontinuirano povećava, dok je kod motornih neurona koji su indukovani da se diferenciraju od iPS ćelija koje su poreklom od pacijenata sa ALS, dužina neurita skraćena, sa približno 40 dana posle početka indukcije diferencijacije kao pikom. Ovaj rezultat ukazuje da diferencijacijom indukovani motorni neuroni odražavaju ALS bolest.

[Primer I-3]

(Analiza odnosa isečeni tip kaspaze 3-pozitivnih)

[0046] Na dan 40 od početka indukcije diferencijacije, svaki diferencijacijom indukovani motorni neuron u Primeru I-1 je imuno obojen upotrebom antitela prema isečenom tipu (Isečen, CV) kaspaze 3 (može se označiti kao "CV kaspaza 3"), i izmeren je odnos neurona koji su pozitivni na isečeni tip (Isečen, CV) kaspaze 3 (može se označiti kao "CV kaspaza 3"). CV kaspaza 3-pozitivni neuroni su neuroni kod kojih je indukovana apoptoza.

[0047] SL. 2 je grafikon koji pokazuje odnos CV kaspaza 3-pozitivnih neurona u svakom motornom neuronu. Na dijagramu, "**" ukazuje da postoji značajna razlika kada je rizik manji od 1%. Kao rezultat, otkriveno je da je, u poređenju sa motornim neuronima koji su indukovani da se diferenciraju od iPS ćelija koje su poreklom od zdravih subjekata, odnos CV kaspaza 3-pozitivnih neurona bio značajno veći kod motornih neurona koji su indukovani da da se diferenciraju od iPS ćelija koje su poreklom od pacijenata sa ALS. Ovaj rezultat dodatno podržava da diferencijacijom indukovani motorni neuroni odražavaju ALS bolest.

[Primer I-4]

(Analiza odnosa curenja LDH)

[0048] Na dan 40 od početka indukcije diferencijacije, izmereno je curenje laktat dehidrogenaze (LDH) iz ćelija upotrebom svakog diferencijacijom indukovanog motornog neurona u Primeru I-1. Količina curenja LDH u medijum je pokazatelj citotoksičnosti. Za merenje odnosa curenja LDH, upotrebljen je komercijalno dostupan komplet (model "LDH Cytotoxicity Detection Kit", Takara Bio Inc.).

[0049] SL. 3 je grafikon koji pokazuje rezultate merenja (relativne vrednosti) odnosa curenja LDH u svakom motornom neuronu. Na dijagramu, "**" ukazuje da postoji značajna razlika kada je rizik manji od 1%. Kao rezultat, otkriveno je da je, u poređenju sa motornim neuronima koji su indukovani da se diferenciraju od iPS ćelija koje su poreklom od zdravih subjekata, odnos curenja LDH bio značajno veći kod motornih neurona koji su indukovani da se diferenciraju od iPS ćelija koje su poreklom od pacijenata sa ALS. Ovaj rezultat dodatno podržava da diferencijacijom indukovani motorni neuroni odražavaju ALS bolest.

[Primer I-5]

(Analiza lokalizacije FUS proteina)

[0050] FUS protein je RNK vezujući protein koji je lokalizovan u nukleusu. Nasuprot tome, poznato je da se ektopična lokalizacija FUS proteina u citoplazmi uočava kod pacijenata sa ALS koji imaju mutaciju u FUS.

[0051] Prema tome, na dan 40 od početka indukcije diferencijacije, svaki diferencijacijom indukovani motorni neuron u Primeru 1-1 je imuno obojen i ispitana je lokalizacija FUS proteina u citoplazmi.

[0052] SL. 4 je grafikon koji pokazuje rezultate merenja odnosa neurona u kojima je uočena lokalizacija FUS proteina u citoplazmi u svakom motornom neuronu. Na dijagramu, "**" ukazuje da postoji značajna razlika kada je rizik manji od 1%.

[0053] Kao rezultat, otkriveno je da je, u poređenju sa motornim neuronima koji su indukovani da se diferenciraju od iPS ćelija koje su poreklom od zdravih subjekata, odnos neurona kod kojih je uočena lokalizacija FUS proteina u citoplazmi značajno veći kod motornih neurona koji su indukovani da se diferenciraju od iPS ćelija koje su poreklom od pacijenata sa ALS (FUS-ALS) koji imaju mutaciju u FUS.

[0054] S druge strane, kod motornih neurona koji su indukovani da se diferenciraju od iPS ćelija koje su poreklom od pacijenata sa ALS (TDP-43-ALS) koji imaju mutaciju u TDP-43, nije uočeno značajno povećanje lokalizacije FUS proteina u citoplazmi.

[0055] Ovaj rezultat dodatno podržava da diferencijacijom indukovani motorni neuroni odražavaju ALS bolest sa mutacijama u FUS.

[Primer I-6]

(Formiranje inkluzija fosforilisanog TDP-43 proteina)

[0056] TDP-43 protein je RNK vezujući protein koji je lokalizovan u nukleusu. Kod pacijenata sa ALS koji imaju mutaciju u TDP-43, poznato je da su vidljive inkluzije abnormalno fosforilisanog TDP-43 proteina.

[0057] Prema tome, na dan 40 od početka indukcije diferencijacije, svaki diferencijacijom indukovani motorni neuron u Primeru 1-1 je imuno obojen i ispitano je formiranje inkluzija fosforilisanog TDP-43 proteina.

[0058] SL. 5 je grafikon koji pokazuje rezultate merenja broja inkluzija fosforilisanog TDP-43 proteina (pTDP-43) po neuronu u svakom motornom neuronu. Na dijagramu, "**" ukazuje da postoji značajna razlika kada je rizik manji od 1%.

[0059] Kao rezultat, otkriveno je da je, u poređenju sa motornim neuronima koji su indukovani da se diferenciraju od iPS ćelija koje su poreklom od zdravih subjekata, kod motornih neurona koji su indukovani da se diferenciraju od iPS ćelija koje su poreklom od pacijenata sa ALS (TDP-43-ALS) koji imaju mutaciju u TDP-43, značajno povećan broj inkluzija fosforilisanog TDP-43 proteina po neuronu.

[0060] S druge strane, kod motornih neurona koji su indukovani da se diferenciraju od iPS ćelija koje su poreklom od pacijenata sa ALS (FUS-ALS) koji imaju mutaciju u FUS, nije uočeno značajno povećanje broja inkluzija fosforilisanog TDP-43 proteina.

[0061] Ovaj rezultat dodatno podržava da diferencijacijom indukovani motorni neuroni odražavaju ALS bolest sa mutacijama u TDP-43.

[Primer I-7]

(Analiza stres granula)

[0062] Na dan 40 od početka indukcije diferencijacije, ispitivano je formiranje stres granula upotrebom svakog diferencijacijom indukovanog motornog neurona u Primeru I-1. Detekcija stres granula izvedena je imunobojenjem sa G3BP, koji je marker stres granula.

[0063] SL. 6 je grafikon koji pokazuje rezultate merenja broja stres granula po neuronu u svakom motornom neuronu. Na dijagramu, "**" ukazuje da postoji značajna razlika kada je rizik manji od 1%. Kao rezultat, otkriveno je da je, u poređenju sa motornim neuronima koji su indukovani da se diferenciraju od iPS ćelija koje su poreklom od zdravih subjekata, značajno povećan broj stres granula po neuronu kod motornih neurona koji su indukovani da se diferenciraju od iPS ćelija koje su poreklom od pacijenata sa ALS. Ovaj rezultat dodatno podržava da diferencijacijom indukovani motorni neuroni odražavaju ALS bolest.

[Primer 1-8]

(Pregled terapijskog agensa za ALS)

[0064] Upotrebom diferencijacijom indukovanih motornih neurona u Primeru 1-1, pregledani su lekovi koji uzrokuju da se očuva ALS fenotip iz postojećih biblioteka lekova sa dužinom neurita, ektopičnom lokalizacijom FUS proteina, formiranjem stres granula, odnosom curenja LDH, odnosom CV kaspaza 3-pozitivnih, formiranja inkluzija fosforilisanog TDP-43 proteina, i slično kao indikacijama.

[0065] Kao rezultat pregleda, ropinirol je pronađen kao obećavajući terapijski agens za ALS. Tabele 5 i 6 pokazuju odnos poboljšanja (%) ALS fenotipa usled dodavanja ropinirola medijumu. Ovde je ropinirol dodat medijumu na dane 35 do 40 od početka indukcije diferencijacije svake iPS ćelije. Ovde, pretpostavlja se da dani 35 do 40 od početka indukcije diferencijacije odgovaraju ranoj fazi ALS bolesti.

[0066] Odnos poboljšanja (%) ALS fenotipa izračunat je pomoću Jednačine (1).

Odnos poboljšanja (%) = (A-B)/(A-C) x 100... (1)

[U Jednačini (1), A predstavlja izmerenu vrednost motornih neurona koji su indukovani da se diferenciraju od iPS ćelija koje su poreklom od pacijenata sa ALS u odsustvu ropinirola, i B predstavlja izmerenu vrednost motornih neurona koji su indukovani da se diferenciraju od iPS ćelija koje su poreklom od pacijenata sa ALS u prisustvu ropinirola, i C predstavlja izmerenu vrednost motornih neurona koji su indukovani da se diferenciraju od iPS ćelija koje su poreklom od zdravih subjekata u odsustvu ropinirola.]

[0067] Tabela 5 pokazuje rezultate dodavanja ropinirola u krajnjim koncentracijama od 0,1, 1, i 10 μM medijumu motornih neurona koji su indukovani i diferencirani od iPS ćelija koje su poreklom od pacijenata sa ALS (FUS-ALS) koji imaju mutaciju u FUS, i Tabela 6 pokazuje rezultate dodavanja ropinirola u krajnjim koncentracijama od 0,1, 1, i 10 μM medijumu motornih neurona koji su indukovani da se diferenciraju od iPS ćelija koje su poreklom od pacijenata sa ALS (TDP-43-ALS) koji imaju mutaciju u TDP-43.

TABELA 5

TABELA 6

[0068] Kao što je pokazano u Tabelama 5 i 6, otkriveno je da ropinirol pokazuje izuzetan efekat poboljšanja i na ALS sa mutacijom u FUS i na ALS sa mutacijom u TDP-43.

[0069] Nakon toga, na isti način kao prethodno, procenjena je efikasnost u slučajevima primene nižih koncentracija ropinirola. Tabela 7 pokazuje rezultate dodavanja ropinirola u krajnjim koncentracijama od 0,1, 1, 10 nM medijumu motornih neurona koji su indukovani da se diferenciraju od iPS ćelija koje su poreklom od pacijenata sa ALS (FUS-ALS) koji imaju mutaciju u FUS, i Tabela 8 pokazuje rezultate dodavanja ropinirola u krajnjim koncentracijama od 0,1, 1, i 10 nM medijumu motornih neurona koji su indukovani da se diferenciraju od iPS ćelija koje su poreklom od pacijenata sa ALS (TDP-43-ALS) koji imaju mutaciju u TDP-43.

TABELA 7

TABELA 8

[0070] Kao što je pokazano u Tabelama 7 i 8, otkriveno je da ropinirol pokazuje efekte poboljšanja i na ALS sa mutacijom u FUS i na ALS sa mutacijom u TDP-43 čak i pri krajnjim koncentracijama od 0,1 do 10 nM, posebno, pokazujući izuzetne efekte poboljšanja za sve stavke na 1 do 10 nM.

[0071] Pored toga, Tabele 9 i 10 u nastavku pokazuju rezultate izvođenja istog ispitivanja kao prethodno, osim što su umesto ropinirola, dodati riluzol i edaravon, koji su postojeći lekovi za ALS, i ceftriakson, lek koji se ranije upotrebljavao u kliničkim studijama za ALS. Svaki lek je dodat medijumu u krajnjoj koncentraciji od 10 μM.

[0072] Tabela 9 pokazuje rezultate dodavanja svakog leka medijumu motornih neurona koji su indukovani da se diferenciraju od iPS ćelija koje su poreklom od pacijenata sa ALS (FUS-ALS) koji imaju mutaciju u FUS. Pored toga, Tabela 10 pokazuje rezultate dodavanja svakog leka medijumu motornih neurona koji su indukovani da se diferenciraju od iPS ćelija koje su poreklom od pacijenata sa ALS (TDP-43-ALS) koji imaju mutaciju u TDP-43.

TABELA 9

TABELA 10

[0073] Kao rezultat, otkriveno je da ropinirol pokazuje izuzetnije efekte poboljšanja i na ALS sa mutacijom u FUS i na ALS sa mutacijom u TDP-43 u poređenju sa riluzolom, edaravonom, i ceftriaksonom.

[Primer I-9]

(Procena efikasnosti ropinirola u kasnoj fazi ALS bolesti)

[0074] Efikasnost ropinirola procenjena je na isti način kao u Primeru I-8, osim što je vreme dodavanja ropinirola promenjeno na dane 50 do 62 od početka indukcije diferencijacije svake iPS ćelije. Pretpostavlja se da dani 50 do 62 posle početka indukcije diferencijacije odgovaraju kasnoj fazi ALS bolesti.

[0075] Specifično, ropinirol je dodat medijumu motornih neurona koji su indukovani da se diferenciraju od iPS ćelija koje su poreklom od pacijenata sa ALS (FUS-ALS) koji imaju mutaciju u FUS i motornih neurona koji su indukovani da se diferenciraju od iPS ćelija koje su poreklom od pacijenata sa ALS (TDP-43-ALS) koji imaju mutaciju u TDP-43 i merene su promene dužine neurita tokom vremena. Merenje dužine neurita izvedeno je na isti način kao u Primeru I-2. Ropinirol je bio dodat medijumu u krajnjoj koncentraciji od 1 μM.

[0076] SL. 14(a) je grafikon koji pokazuje rezultate merenja promena dužine neurita svakog motornog neurona tokom vremena. Na SL. 14(a), vertikalna osa predstavlja dužinu neurita (relativna vrednost), horizontalna osa predstavlja broj dana kultivisanja od početka indukcije diferencijacije, i "+ROPI" predstavlja rezultat dodavanja ropinirola medijumu. Pored toga, SL. 14(b) je grafikon koji uvećava uokvireni deo grafikona sa SL. 14(a). Pored toga, SL.

14(c) je grafikon koji pokazuje dužinu neurita svakog motornog neurona na dan 50 i 62 od početka indukcije diferencijacije. Na SL.14(c), "**" i "++" ukazuju da postoji značajna razlika kada je rizik manji od 1%, i "+ROPI" predstavlja rezultat dodavanja ropinirola medijumu.

[0077] Kao rezultat, čak i na dane 50 do 62 od početka indukcije diferencijacije, uočeno je neuroprotektivno dejstvo (održavanje dužine neurita) usled dodavanja ropinirola. Ovaj rezultat ukazuje da ropinirol ima efekat poboljšanja ALS bolesti čak i u kasnoj fazi ALS bolesti.

<II. Ispitivanje upotrebom iPS ćelija koje su poreklom od pacijenata sa sporadičnom ALS>

[Primer II-1]

(Diferencijacija u motorne neurone)

[0078] Na isti način kao u Primeru I-1, iPS ćelije koje su poreklom od pacijenata sa sporadičnom ALS (mogu se u nastavku označiti kao "SALS") diferencirane su u motorne neurone. Sve upotrebljene iPS ćelije su poreklom od dermalnih fibroblasta. Kliničke informacije o pacijentima od kojih su poreklom iPS ćelije koje su upotrebljene pokazane su u Tabeli 11. U nastavku, svaki diferencirani motorni neuron identifikovan je pomoću broja pacijenta od kog je neuron poreklom.

TABELA 11

[Primer II-2]

(Analiza dužine neurita)

[0079] U pogledu svakog od diferencijacijom indukovanih motornih neurona u Primeru 11-1, promene dužine neurita tokom vremena analizirane su na isti način kao u Primeru 1-2. Kao rezultat, otkriveno je da je, na dane 40 do 45 od početka indukcije diferencijacije dužina neurita, koji se do tada kontinuirano izduživao, skraćena. Ovaj rezultat pokazuje da diferencijacijom indukovani motorni neuroni odražavaju ALS bolest.

[Primer 11-3]

(Analiza odnosa curenja LDH)

[0080] Odnos curenja LDH iz ćelija meren je tokom vremena upotrebom svakog diferencijacijom indukovanog motornog neurona u Primeru II-1. Odnos curenja LDH meren je na isti način kao u Primeru 1-4.

[0081] SL. 7 je grafikon koji pokazuje promene odnosa curenja LDH (relativne vrednosti) u svakom motornom neuronu tokom vremena. Horizontalna osa pokazuje broj dana od početka indukcije diferencijacije. Kao rezultat, otkriveno je da se odnos curenja LDH tokom vremena povećava u motornim neuronima koji su indukovani da se diferenciraju od iPS ćelija koje su poreklom od pacijenata sa sporadičnom ALS. Ovaj rezultat dodatno podržava da diferencijacijom indukovani motorni neuroni odražavaju ALS bolest.

[Primer II-4]

(Analiza odnosa CV kaspaza 3-pozitivnih)

[0082] Upotrebom svakog diferencijacijom indukovanog motornog neurona u Primeru II-1, odnos CV kaspaza 3-pozitivnih neurona meren je tokom vremena na isti način kao u Primeru 1-3.

[0083] SL. 8 je grafikon koji pokazuje promene odnosa CV kaspaza 3-pozitivnih neurona u svakom motornom neuronu tokom vremena. Horizontalna osa pokazuje broj dana od početka indukcije diferencijacije. Kao rezultat, otkriveno je da se u motornim neuronima koji su indukovani da se diferenciraju od iPS ćelija koje su poreklom od pacijenata sa sporadičnom ALS, povećava odnos CV kaspaza 3-pozitivnih neurona tokom vremena. Ovaj rezultat dodatno podržava da diferencijacijom indukovani motorni neuroni odražavaju ALS bolest.

[Primer II-5]

(Analiza stres granula)

[0084] Upotrebom svakog diferencijacijom indukovanog motornog neurona u Primeru II-1, mereno je formiranje stres granula tokom vremena na isti način kao u Primeru 1-7.

[0085] SL. 9 je grafikon koji pokazuje promene broja stres granula po neuronu u svakom motornom neuronu tokom vremena. Horizontalna osa pokazuje broj dana od početka indukcije diferencijacije. Kao rezultat, otkriveno je da se u motornim neuronima koji su indukovani da se diferenciraju od iPS ćelija koje su poreklom od pacijenata sa sporadičnom ALS, povećava broj stres granula tokom vremena. Ovaj rezultat dodatno podržava da diferencijacijom indukovani motorni neuroni odražavaju ALS bolest.

<III. Procena efikasnosti ropinirola upotrebom modela sporadične ALS>

[Primer III-1]

(Analiza dužine neurita)

[0086] Na isti način kao u Primeru II-1, iPS ćelije koje su poreklom od pacijenata sa sporadičnom ALS (SALS) indukovane su da se diferenciraju u motorne neurone, i zatim je medijumu dodat ropinirol sa krajnjom koncentracijom od 1 μM. Specifičnije, za period od dana 35 do 40 od početka indukcije diferencijacije, medijumu je dodat ropinirol koji ima krajnju koncentraciju od 1 μM. Pored toga, grupa u kojoj ropinirol nije dodat medijumu pripremljena je kao kontrola. Pored toga, za poređenje, iPS ćelije koje su poreklom od zdravih subjekata diferencirane su u motorne neurone na isti način kao u Primeru 1-1. Medijumu ovih motornih neurona nije dodat ropinirol. Kao iPS ćelije koje su poreklom od zdravog subjekta, upotrebljene su iste ćelije kao u Primeru 1-1.

[0087] Nakon toga, na dan 40 od početka indukcije diferencijacije, izmerena je dužina neurita za svaki motorni neuron na isti način kao u Primeru 1-2.

[0088] SL. 10 je grafikon koji pokazuje rezultate merenja dužine neurita svakog motornog neurona. Na dijagramu, "**" i "++" ukazuju da postoji značajna razlika kada je rizik manji od 1%. Kao rezultat, otkriveno je da je, u prisustvu ropinirola, značajno suprimirano smanjenje dužine neurita motornih neurona koji su indukovani da se diferenciraju od iPS ćelija koje su poreklom od pacijenata sa SALS.

[0089] Ovaj rezultat pokazuje da je ropinirol efikasan ne samo za lečenje porodične ALS već i sporadične ALS.

[Primer III-2]

(Analiza odnosa CV kaspaza 3-pozitivnih)

[0090] Na isti način kao u Primeru II-1, iPS ćelije koje su poreklom od pacijenata sa sporadičnom ALS (SALS) indukovane su da se diferenciraju u motorne neurone, i zatim je medijumu dodat ropinirol sa krajnjom koncentracijom od 1 μM. Specifičnije, za period od dana 35 do 40 od početka indukcije diferencijacije, medijumu je dodat ropinirol koji ima krajnju koncentraciju od 1 μM. Pored toga, grupa u kojoj ropinirol nije dodat medijumu pripremljena je kao kontrola. Pored toga, za poređenje, iPS ćelije koje su poreklom od zdravih subjekata diferencirane su u motorne neurone na isti način kao u Primeru 1-1. Medijumu ovih motornih neurona nije dodat ropinirol. Kao iPS ćelije koje su poreklom od zdravog subjekta, upotrebljene su iste ćelije kao u Primeru 1-1.

[0091] Nakon toga, na dan 40 od početka indukcije diferencijacije, izmeren je odnos CV kaspaza 3-pozitivnih neurona za svaki motorni neuron na isti način kao u Primeru 1-3.

[0092] SL. 11 je grafikon koji pokazuje rezultate merenja odnosa CV kaspaza 3-pozitivnih neurona. Na dijagramu, "**" i "++" ukazuju da postoji značajna razlika kada je rizik manji od 1%. Kao rezultat, otkriveno je da je, u prisustvu ropinirola, značajno smanjen odnos CV kaspaza 3-pozitivnih neurona u motornim neuronima koji su indukovani da se diferenciraju od iPS ćelija koje su poreklom od pacijenata sa SALS.

[0093] Ovaj rezultat dodatno podržava da je ropinirol efikasan ne samo za lečenje porodične ALS već i sporadične ALS.

[Primer III-3]

(Analiza odnosa curenja LDH)

[0094] Na isti način kao u Primeru II-1, iPS ćelije koje su poreklom od pacijenata sa sporadičnom ALS (SALS) indukovane su da se diferenciraju u motorne neurone, i zatim je medijumu dodat ropinirol sa krajnjom koncentracijom od 1 μM. Specifičnije, za period od dana 35 do 40 od početka indukcije diferencijacije, medijumu je dodat ropinirol koji ima krajnju koncentraciju od 1 μM. Pored toga, grupa u kojoj ropinirol nije dodat medijumu pripremljena je kao kontrola. Pored toga, za poređenje, iPS ćelije koje su poreklom od zdravih subjekata diferencirane su u motorne neurone na isti način kao u Primeru 1-1. Medijumu ovih motornih neurona nije dodat ropinirol. Kao iPS ćelije koje su poreklom od zdravog subjekta, upotrebljene su iste ćelije kao u Primeru I-1.

[0095] Nakon toga, na dan 40 od početka indukcije diferencijacije, izmeren je odnos curenja LDH za svaki motorni neuron na isti način kao u Primeru I-4.

[0096] SL.12 je grafikon koji pokazuje rezultat merenja odnosa curenja LDH. Na dijagramu, "**" i "++" ukazuju da postoji značajna razlika kada je rizik manji od 1%. Kao rezultat, otkriveno je da je, u prisustvu ropinirola, značajno smanjen odnos curenja LDH u motornim neuronima koji su indukovani da se diferenciraju od iPS ćelija koje su poreklom od pacijenata sa SALS.

[0097] Ovaj rezultat dodatno podržava da je ropinirol efikasan ne samo za lečenje porodične ALS već i sporadične ALS.

[Primer III-4]

(Analiza stres granula)

[0098] Na isti način kao u Primeru II-1, iPS ćelije koje su poreklom od pacijenata sa sporadičnom ALS (SALS) indukovane su da se diferenciraju u motorne neurone, i medijumu je dodat ropinirol sa krajnjom koncentracijom od 1 μM. Specifičnije, za period od dana 35 do 40 od početka indukcije diferencijacije, medijumu je dodat ropinirol koji ima krajnju koncentraciju od 1 μM. Pored toga, grupa u kojoj ropinirol nije dodat medijumu pripremljena je kao kontrola. Pored toga, za poređenje, iPS ćelije koje su poreklom od zdravih subjekata diferencirane su u motorne neurone na isti način kao u Primeru 1-1. Medijumu ovih motornih neurona nije dodat ropinirol. Kao iPS ćelije koje su poreklom od zdravog subjekta, upotrebljene su iste ćelije kao u Primeru I-1.

[0099] Nakon toga, na dan 40 od početka indukcije diferencijacije, izmeren je broj stres granula za svaki motorni neuron na isti način kao u Primeru 1-7.

[0100] SL. 13 je grafikon koji pokazuje rezultat merenja broja stres granula. Na dijagramu, "**" i "++" ukazuju da postoji značajna razlika kada je rizik manji od 1%. Kao rezultat, otkriveno je da je broj stres granula u motornim neuronima koji su indukovani da se diferenciraju od iPS ćelija koje su poreklom od pacijenata sa SALS značajno smanjen u prisustvu ropinirola.

[0101] Ovaj rezultat dodatno podržava da je ropinirol efikasan ne samo za lečenje porodične ALS već i sporadične ALS.

[Primer III-5]

(Procena efikasnosti ropinirola upotrebom modela sporadične ALS)

[0102] Na isti način kao u Primeru 11-1, iPS ćelije koje su poreklom od 24 pacijenta koji imaju sporadičnu ALS (SALS) diferencirane su u motorne neurone, i zatim je medijumu dodat ropinirol sa krajnjom koncentracijom od 1 μM. Pored toga, za poređenje, pripremljena je grupa u kojoj ropinirol nije dodat medijumu. Pored toga, kao kontrola, upotrebljena je grupa za koju su iPS ćelije koje su poreklom od zdravih subjekata diferencirane u motorne neurone na isti način kao u Primeru 1-1. Medijumu ovih motornih neurona nije dodat ropinirol. Kao iPS ćelije koje su poreklom od zdravog subjekta, upotrebljene su iste ćelije kao u Primeru I-1.

[0103] Sledeća Tabela 12 pokazuje kliničke informacije o pacijentima od kojih su poreklom iPS ćelije koje su upotrebljene. U nastavku, svaki diferencirani motorni neuron identifikovan je pomoću broja pacijenta od koga je neuron poreklom.

TABELA 12

[0104] U svim motornim neuronima, period dodavanja ropinirola bio je 5 dana. Vreme za početak dodavanja ropinirola variralo je u zavisnosti od slučaja i bilo je od dana 30 do dana 70 od početka indukcije diferencijacije svake od iPS ćelija.

[0105] Nakon toga, za svaki motorni neuron na dan 5 posle dodavanja ropinirola, izmeren je odnos CV kaspaza 3-pozitivnih neurona na isti način kao u Primeru 1-3.

[0106] SL. 15 je grafikon koji pokazuje rezultate merenja odnosa CV kaspaza 3-pozitivnih neurona. Na dijagramu, "**" i "++" ukazuju da postoji značajna razlika kada je rizik manji od 1%, i "+ROPI" predstavlja rezultat dodavanja ropinirola medijumu. Kao rezultat, među 24 slučaja modela SALS, bilo je 22 slučaja u kojima je potvrđeno povećanje odnosa CV kaspaza 3-pozitivnih. Pored toga, među ova 22 slučaja, bilo je 16 slučajeva u kojima je povećanje odnosa CV kaspaza 3-pozitivnih suprimirano dodavanjem ropinirola (72,73% SALS slučajeva).

[0107] Ovaj rezultat dodatno podržava da je ropinirol efikasan ne samo za lečenje porodične ALS već i sporadične ALS.

Industrijska primenljivost

[0108] U skladu sa predmetnim pronalaskom, moguće je obezbediti terapijski agens za ALS i kompoziciju za lečenje ALS. Moguće je lečiti ne samo porodičnu ALS već i sporadičnu ALS sa terapijskim agensom za ALS ili kompozicijom za lečenje ALS iz predmetnog pronalaska. Pored toga, moguće je razjasniti mehanizam bolesti ALS pomoću analize mehanizma delovanja terapijskog agensa za ALS iz predmetnog pronalaska u odnosu na motorne neurone koji su diferencirani od iPS ćelija koje su poreklom od pacijenata sa ALS.

Claims (8)

1. Patentni zahtevi 1. Jedinjenje koje je predstavljeno pomoću Formule (1), njegova farmaceutski prihvatljiva so, ili njegov solvat, naznačeno time što je za upotrebu u lečenju sporadične amiotrofične lateralne skleroze (ALS), ili porodične ALS sa mutacijom u FUS genu ili genu TAR DNK-vezujućeg proteina od 43 kDa (TDP-43),

   pri čemu u Formuli (1), R<1>svaki nezavisno predstavlja alkil grupu koja ima 1 do 6 atoma ugljenika ili 4-hidroksifenetil grupu, i n predstavlja ceo broj od 1 do 3.
2. 2. Jedinjenje za upotrebu u skladu sa patentnim zahtevom 1, naznačeno time što je n u Formuli (1) 2.
3. 3. Jedinjenje za upotrebu u skladu sa patentnim zahtevom 1 ili 2, naznačeno time što je R<1>u Formuli (1) n-propil grupa.
4. 4. Jedinjenje za upotrebu u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 do 3, naznačeno time što je jedinjenje koje je predstavljeno pomoću Formule (1) 4-[2-(dipropilamino)etil]-1,3-dihidro-2H-indol-2-on.
5. 5. Jedinjenje za upotrebu u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 do 4, naznačeno time što je farmaceutski prihvatljiva so jedinjenja koje je predstavljeno pomoću Formule (1) 4-[2-(dipropilamino)etil]-1,3-dihidro-2H-indol-2-on hidrohlorid.
6. 6. Jedinjenje za upotrebu u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 do 5, naznačeno time što ALS koja se leči je posle početka ALS fenotipa.
7. 7. Kompozicija, naznačeno time što sadrži: jedinjenje koje je predstavljeno pomoću Formule (1), njegovu farmaceutski prihvatljivu so, ili njegov solvat, i farmaceutski prihvatljiv nosač za upotrebu u lečenju sporadične ALS, ili porodične ALS sa mutacijom u FUS genu ili genu TAR DNK-vezujućeg proteina od 43 kDa (TDP-43),

   pri čemu u Formuli (1), R<1>svaki nezavisno predstavlja alkil grupu koja ima 1 do 6 atoma ugljenika ili 4-hidroksifenetil grupu, i n predstavlja ceo broj od 1 do 3.
8. 8. Kompozicija za upotrebu u skladu sa patentnim zahtevom 7, naznačeno time što ALS koja se leči je posle početka ALS fenotipa.