RS65784B1 - Klaudin-6-specifični imuno receptori i t-ćelijski epitopi - Google Patents

Description

Opis

TEHNIČKA OBLAST

[0001 ] Predmetno učenje se odnosi na obezbeđivanje Klaudin-6-specifičnih imuno receptora (T ćelijskih receptora i veštačkih T ćelijskih receptora (himernih antigenskih receptora; CAR)) i T-ćelijskih epitopa koji su korisni u imunoterapiji.

STANJE TEHNIKE

[0002 ] Evolucija imunološkog sistema je rezultirala kičmenjacima u visoko efikasnoj mreži baziranoj na dve vrste odbrane: urođenom i stečenom imunitetu.

[0003 ] Nasuprot evolutivnom drevnom, urođenom imunološkom sistemu koji se oslanja na invarijantne receptore koji prepoznaju zajedničke molekularne obrasce povezane sa patogenima, stečeni imunitet je baziran na visoko specifičnim antigenskim receptorima na B ćelijama (B limfocitima) i T ćelijama (T limfocitima) i klonskoj selekciji.

[0004 ] Dok B ćelije povećavaju humoralni imunološki odgovor sekrecijom antitela, T ćelije posreduju ćelijski imunološki odgovor koji dovodi do uništenja prepoznatih ćelija.

[0005 ] T ćelije igraju centralnu ulogu u ćelijski-posredovanom imunitetu kod ljudi i životinja. Prepoznavanje i vezivanje određenog antigena je posredovano T ćelijskim receptorima (TCR) eksprimiranim na površini T ćelija.

[0006 ] T ćelijski receptor (TCR) T ćelije je sposoban da stupi u interakciju sa imunogenim peptidima (epitopima) vezanim za molekule glavnog kompleksa histokompatibilnosti (MHC) i predstavljenim na površini ciljnih ćelija. Specifično vezivanje TCR-a pokreće signalnu kaskadu unutar T ćelije koja vodi do proliferacije i diferencijacije u zrelu efektorsku T ćeliju. Da bi bili sposobni da ciljaju veliki broj različitih antigena, potrebno je da T ćelijski receptori poseduju veliku raznolikost.

[0007 ] Ova raznolikost je dobijena genetičkom preraspodelom različitih diskontinuiranih genskih segmenata koji kodiraju različite strukturne regione TCR receptora. TCR receptori su sastavljeni od jednog α-lanca i jednog β-lanca ili jednog γ-lanca i jednog δ-lanca. TCR α/β lanci su sastavljeni od N-terminalnog visoko polimorfnog varijabilnog regiona uključenog u prepoznavanju antigena i nepromenljivog konstantnog regiona. Na genetskom nivou, ovi lanci su podeljeni u nekoliko regiona, varijabilni (V) region, region različitosti (D) (samo β- i δlanac), vezujući (J) region i konstantni (C) region. Geni humanog β-lanca sadrže preko 60 varijabilnih (V), 2 različita (D), preko 10 vezujućih (J) segmenata i 2 segmenta konstantnog regiona (C). Geni humanog α-lanca sadrže preko 50 V segmenata i preko 60 J segmenata, ali ne i D segmente, kao i jedan C segment. Geni mišjih β-lanaca sadrže preko 30 varijabilnih (V), 2 segmenta različitosti (D), preko 10 vezujućih (J) segmenata i 2 segmenta konstantnog regiona (C). Geni mišjeg α-lanca sadrže skoro 100 V segmenata, 60 J segmenata, nemaju D segmente, ali imaju jedan C segment. Tokom diferencijacije T ćelija, specifični geni receptora T ćelija su stvoreni preraspodelom gena jednog V, jednog D (samo β- i δ-lanca), jednog J i jednog C regiona. Raznolikost TCR receptora je dalje pojačana nepreciznom V-(D)-J preraspodelom, gde su slučajni nukleotidi uvedeni i / ili izbrisani na rekombinantnim mestima. Pošto se preraspodela lokusa TCR gena javlja u genomu tokom sazrevanja T ćelija, svaka zrela T ćelija eksprimira samo jedan specifičan α/β TCR ili γ/δ TCR.

[0008 ] MHC i vezivanje antigena je posredovano od strane regiona za određivanje komplementarnosti 1, 2 i 3 (CDR1, CDR2, CDR3) TCR-a. CDR3 β-lanca, koji je najkritičniji za prepoznavanje i vezivanje antigena je kodiran od strane V-D-J spoja reorganizovanog gena TCR β-lanca.

[0009 ] TCR je deo kompleksnog signalnog mehanizma, koji uključuje heterodimerni kompleks TCR α- i β-lanaca, ko-receptor CD4 ili CD8 i CD3 modul za transdukciju signala (Slika 1). Dok CD3 lanci prenose aktivacioni signal unutar ćelije, TCR α/β heterodimer je isključivo odgovoran za prepoznavanje antigena. Stoga, transfer TCR α/β lanaca nudi mogućnost preusmeravanja T ćelija prema bilo kom antigenu od interesa.

Imunoterapija

[0010 ] Antigen-specifična imunoterapija ima za cilj da poboljša ili indukuje specifične imunološke odgovore kod pacijenata, za kontrolu infektivnih ili malignih bolesti. Identifikacija sve većeg broja antigena povezanih sa patogenima i tumorima (TAA) je dovela do široke kolekcije pogodnih ciljeva za imunoterapiju. Ćelije koje predstavljaju imunogene peptide (epitope) izvedene iz ovih antigena, mogu biti specifično ciljane bilo aktivnim ili pasivnim strategijama imunizacije.

[0011 ] Aktivna imunizacija teži da indukuje i proširi antigen-specifične T ćelije kod pacijenta, koje su sposobne da specifično prepoznaju i ubiju obolele ćelije. Nasuprot tome, pasivna imunizacija se oslanja na adoptivni transfer T ćelija, koje su proširene i opciono genetski konstruisane in vitro (usvojena T-ćelijska terapija).

Vakcinacija

[0012 ] Tumorske vakcine imaju za cilj da indukuju endogene tumor-specifične imunološke odgovore aktivnom imunizacijom. Različiti oblici antigena se mogu koristiti za tumorsku vakcinaciju, uključujući cele ćelije raka, proteine, peptide ili imunizacione vektore, kao što su RNK, DNK ili virusni vektori koji mogu biti primenjeni bilo direktno in vivo ili in vitro pulsiranjem DC-a nakon čega sledi prenos kod pacijenta.

[0013 ] Broj kliničkih studija kod kojih se mogu identifikovati imunološki odgovori indukovani sa terapijom se neprekidno povećava usled poboljšanja strategija imunizacije i metoda za detekciju antigen-specifičnih imunskih odgovora (Connerotte, T. i sar. (2008). Cancer Res.68.

3931 -3940; Schmitt, M. i sar. (2008) Blood 111, 1357-1365; Speiser. D.E. i sar. (2008) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 105, 3849-3854; Adams, S. i sar. (2008) J. Immunol. 181, 776-784).

[0014 ] Međutim, u većini slučajeva otkriveni imunski odgovori ne mogu biti sistemski dovedeni u korelaciju sa kliničkim ishodima (Curigliano, G. i sar. (2006) Ann. Oncol.17. 750-762; Rosenberg. S.A. i sar. (2004) Nat. Med.10, 909-915).

[0015 ] Tačna definicija peptidnih epitopa izvedenih iz tumorskih antigena, može stoga doprineti poboljšanju specifičnosti i efikasnosti strategija vakcinacije, kao i metoda za imunomonitoring.

Adoptivni ćelijski transfer (ACT)

[0016 ] Imunoterapija na bazi ACT-a, može biti široko definisana kao oblik pasivne imunizacije sa prethodno senzibilisanim T ćelijama koje su prenete na ne-imune primaoce ili na autolognog domaćina nakon ex vivo ekspanzije od niskih prekursorskih frekvenci do klinički relevantnih brojeva ćelija. Tipovi ćelija koji su korišćeni za ACT eksperimente su ćelije ubice aktivirane sa limfokinom (LAK) ćelije (Mule, J.J. i sar. (1984) Science 225, 1487-1489; Rosenberg, S.A.

i sar. (1985) N. Engl. J. Med. 313, 1485-1492), limfociti koji infiltriraju tumor (TILs) (Rosenberg, S.A. i sar. (1994) J. Natl. Cancer Inst. 86, 1159-1166), donorski limfociti nakon transplantacije hematopoetskih matičnih ćelija (HSCT), kao i tumor-specifične T ćelijske linije ili klonovi (Dudley, M.E. i sar. (2001) J. Immunother. 24, 363-373; Yee, C. i sar. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 99, 16168-16173). Pokazano je da adoptivni T ćelijski transfer ima terapeutsku aktivnost protiv humanih virusnih infekcija, kao što je CMV. Dok je CMV infekcija i reaktivacija endogenih latentnih virusa kontrolisana od strane imunskog sistema kod zdravih pojedinaca, ona dovodi do značajnog morbiditeta i mortaliteta kod pojedinaca sa oštećenjem imuniteta, kao što su primaoci transplantata ili pacijenti sa AIDS-om.

[0017 ] Riddell i saradnici su prikazali rekonstituciju virusnog imuniteta pomoću usvojene T-ćelijske terapije kod pacijenata sa imunosupresijom, nakon prenosa CD8+ CMV-specifičnih T ćelijskih klonova izvedenih iz donora HLA-podudarnih CMV-seropozitivnih transplantata (Riddell, S.R. (1992) Science 257, 238-241).

[0018 ] Kao alternativni pristup, poliklonske CMV- ili EBV-specifične populacije T ćelija dobijene od donora su prenete na primaoce transplantata, što je rezultiralo povećanom istrajnošću prenesenih T ćelija (Rooney, C.M. i sar. (1998) Blood 92, 1549-1555; Peggs, K.S. i sar. (2003) Lancet 362, 1375-1377).

[0019 ] Za adoptivnu imunoterapiju melanoma, Rosenberg i saradnici su uspostavili ACT pristup koji se oslanjao na infuziju in vitro ekspandiranih autolognih tumor-infiltrirajućih limfocita (TILs) izolovanih iz isečenih tumora u kombinaciji sa ne-mijeloablativnom limfo depletirajućom hemoterapijom i visokim dozama IL2. Nedavno objavljena klinička studija je rezultirala objektivnom stopom odgovora od ~50% tretiranih pacijenata koji pate od metastatskog melanoma (Dudley, M.E. i sar. (2005) J. Clin. Oncol.23: 2346-2357).

[0020 ] Međutim, pacijenti moraju da ispune nekoliko pretpostavki da bi bili podobni za ACT imunoterapiju. Moraju imati operabilne tumore. Tumori moraju da generišu održive TIL-ove pod uslovima ćelijske kulture. TILs moraju biti reaktivni protiv tumorskih antigena i moraju biti prošireni in vitro do dovoljnog broja. Posebno kod drugih karcinoma od melanoma, teško je dobiti takve tumor reaktivne TIL-ove. Osim toga, ponovljena in vitro stimulacija i klonalna ekspanzija normalnih humanih T limfocita rezultira u progresivnom smanjenju aktivnosti telomeraze i skraćivanju telomera, što rezultira replikativnim starenjem i smanjenim potencijalom za postojanost prenesenih T ćelija (Shen, X. i sar. (2007) J. Immunother.30: 123-129).

ACT koji koristi genetski konstruisane T ćelije

[0021 ] Pristup koji prevazilazi ograničenja ACT-a je adoptivni transfer autolognih T ćelija reprogramiranih da eksprimiraju tumor-reaktivni imunski receptor definisane specifičnosti tokom kratkotrajne ex vivo kulture praćen reinfuzijom u pacijenta (Kershaw M.H. i sar. (2013) Nature Reviews Cancer 13 (8): 525-41). Ova strategija čini ACT primenjivim na različite uobičajene malignitete, čak i ako su tumor reaktivne T-ćelije odsutne kod pacijenta. Pošto je antigenska specifičnost T ćelija u potpunosti oslonjena na heterodimerni kompleks TCR α- i β-lanca, transfer kloniranih TCR gena u T ćelije pruža potencijal za njihovo preusmeravanje ka bilo kom antigenu od interesa. Stoga, TCR genska terapija pruža atraktivnu strategiju za razvoj antigen-specifične imunoterapije sa autolognim limfocitima kao opcijom tretmana. Glavne prednosti TCR transfera gena su stvaranje terapeutskih količina antigen-specifičnih T ćelija u roku od nekoliko dana i mogućnost uvođenja specifičnosti koje nisu prisutne u endogenom repertoaru TCR-a pacijenta.

[0022 ] Nekoliko grupa je pokazalo da je transfer TCR gena atraktivna strategija za preusmeravanje specifičnosti antigena primarnih T ćelija (Morgan, R.A. i sar. (2003) J. Immunol. 171, 3287-3295; Cooper, L.J. i sar. (2000) J. Virol.74, 8207-8212; Fujio, K. i sar. (2000) J. Immunol. 165, 528-532: Kessels, H.W. i sar. (2001) Nat. Immunol. 2, 957-961; Dembic, Z. i sar. (1986) Nature 320, 232-238).

[0023 ] Izvodljivost TCR genske terapije kod ljudi je nedavno prikazana u kliničkim ispitivanjima za lečenje malignog melanoma, od strane Rozenberga i njegove grupe. Adoptivni transfer autolognih limfocita transdukovanih retrovirusno sa antigenim-specifičnim TCR receptorima melanoma/melanocita doveo je do regresije raka kod do 30% tretiranih pacijenata sa melanomom (Morgan, R.A. i sar. (2006) Science 314, 126-129; Johnson, L.A. i sar. (2009) Blood 114, 535-546).

Himerni antigenski receptori

[0024 ] Himerni antigenski receptori (CARs) su konstruisani receptori koji kombinuju pojedinačni lanac varijabilnog fragmenta (scFv) monoklonskog antitela sa intracelularnim delom koji se sastoji od jednog ili više signalnih domena za aktivaciju T ćelija. CAR receptori prepoznaju prirodne antigene na način koji nije ograničen na MHC i stoga se mogu koristiti kod svih pojedinaca bez obzira na njihov HLA tip i oni su funkcionalni u CD4+ kao i CD8+ T ćelijama.

[0025 ] U protekloj deceniji je prijavljeno mnoštvo CAR receptora, koji ciljaju panel različitih tumorskih antigena na površini ćelija. Njihove biološke funkcije su dramatično poboljšane inkorporiranjem kostimulatornog domena koji je rezultirao u tripartitnim receptorima (scFv, CD28, CD3 ζ), nazvanim CAR receptorima druge generacije. CAR receptori treće generacije obuhvataju dodatne domene kostimulatornih molekula, kao što su OX40 i 4-1 BB kako bi se poboljšao proliferativni kapacitet i postojanost modifikovanih T-ćelija (slika 2).

Ciljne strukture za antigen-specifičnu imunoterapiju

[0026 ] Otkriće višestrukih antigena povezanih sa tumorom (TAA) je obezbedilo osnovu za antigen-specifične imunoterapijske koncepte (Novellino, L. i sar. (2005) Cancer Immunol. Immunother. 54, 187-207). TAA su neobični proteini eksprimirani na tumorskim ćelijama usled njihove genetske nestabilnosti, koji nemaju ili imaju ograničenu ekspresiju u normalnim ćelijama. Ovi TAA mogu dovesti do specifičnog prepoznavanja malignih ćelija od strane imunskog sistema.

[0027 ] Molekularno kloniranje TAA skriningom biblioteka ekspresije cDNK izvedenih iz tumora korišćenjem autolognih tumor-specifičnih T ćelija (van der Bruggen, P. i sar. (1991) Science 254, 1643-1647) ili cirkulišućih antitela (Sahin, U. i sar. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 92, 11810-11813), pristupa reverzne imunologije, biohemijskih metoda (Hunt, D.F. i sar. (1992) Science 256, 1817-1820), analize ekspresije gena ili in silico strategija kloniranja (Helftenbein, G. i sar. (2008) Gene 414, 76-84) dovelo je do značajnog broja ciljnih kandidata za imunoterapijske strategije. TAA spadaju u nekoliko kategorija, uključujući antigene diferencijacije, prekomerno eksprimirane antigene, varijante spoja specifične za tumor, mutirane proizvode gena, antigene virusa i raka testisa (CTA). Familija raka testisa je vrlo obećavajuća kategorija TAA, jer je njihova ekspresija ograničena na testis i mnoštvo različitih tumorskih entiteta (Scanlan, M.J. i sar. (2002) Immunol. Rev.188, 22-32). Do sada je opisano više od 50 CT gena (Scanlan, M.J. i sar. (2004) Cancer Immun.4, 1), a neki od njih su adresirani u kliničkim studijama (Adams, S. i sar. (2008) J. Immunol. 181, 776-784; Atanackovic, D. i sar. (2004) J. Immunol. 172, 3289-3296; Chen, Q. i sar. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 101, 9363-9368: Connerotte. T. i sar. (2008). Cancer Res.68, 3931 -3940; Davis. I.D. i sar.

(2004) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 101, 10697-10702; Jager, E. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 97.12198- 12203; Marchand, M. i sar. (1999) Int. J. Cancer 80, 219-230; Schuler-Thurner, B. i sar. (2000) J. Immunol.165, 3492-3496).

[0028 ] Uprkos rastućem broju atraktivnih ciljnih struktura za imunoterapijski pristup, specifični klonovi T ćelija ili linije definisane HLA restrikcije postoje samo za nekoliko od njih (Chaux, P. i sar. (1999) J. Immunol. 163, 2928-2936; Zhang. Y. i sar. (2002) Tkivni antigeni 60, 365-371; Zhao, Y. i sar. (2005) J. Immunol.174, 4415-4423).

[0029 ] Klaudini su integralni membranski proteini lokalizovani unutar uskih spojeva epitela i endotela. Klaudini su predviđeni da imaju četiri transmembranska segmenta sa dve ekstracelularne petlje i N- i C-krajeve koji se nalaze u citoplazmi. Klaudinska (CLDN) familija transmembranskih proteina igra kritičnu ulogu u održavanju epitelijalnih i endotelijalnih uskih veza i takođe, može igrati ulogu u održavanju citoskeleta i u ćelijskoj signalizaciji.

[0030 ] Klaudin-6 (CLDN6) je onkofetalni gen eksprimiran u mišjim i humanim matičnim ćelijama, kao i embrioidna tela koja su posvećena sudbini epitelnih ćelija (Turksen, K. i sar. (2001) Dev Dyn 222, 292-300; Anderson WJ. i sar. (2008) Dev Dyn 237, 504-12; Turksen K. i sar. (2002) Development, 129, 1775-84; Assou S. i sar. (2007) Stem Cells 25, 961-73). Kao antigen povezan sa tumorom, može biti klasifikovan kao antigen diferencijacije usled njegove ekspresije tokom ranog stadijuma epidermalne morfogeneze, gde je to ključno za epidermalnu diferencijaciju i formiranje barijere. Dodatno ekspresija je zapažena u epitelnim tkivima ili neonatalnom normalnom epitelnom tkivu jezika, kože, stomaka i dojke (Abuazza G. i sar. (2006), Am J Physiol Renal Physiol 291, 1132-1141; Troy T.C. i sar. (2007), Molecular Biotechnology 36, 166-74; Zhao L. i sar. (2008), Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 294, 1856-1862). Osim toga, sopstveni podaci takođe otkrivaju nisku ili veoma nisku ekspresiju CLDN6 u humanoj placenti, mokraćnoj bešici, endometrijumu, prostati i perifernom nervu i čestu prekomernu ekspresiju CLDN6 kod različitih vrsta raka. Pokazano je da je CLDN6 preterano eksprimiran kod tumora, uključujući pedijatrijske tumore mozga, želudačne adenokarcinome i tumore germinativnih ćelija, kao i visceralne karcinome, kao što su karcinomi jajnika (Slika 4). Takođe je pokazano da prekomerna ekspresija CLDN6 u ćelijama karcinoma želuca dovodi do povećane invazivnosti, migracije i proliferacije, što ukazuje na to da je CLDN6 marker za lošu prognozu i može imati potencijalnu ulogu u održavanju malignog fenotipa. Dodatno, pokazano je da CLDN6 funkcioniše kao supresor kancera putem inhibicije ćelijske proliferacije i indukcije apoptoze u ćelijskim linijama raka dojke.

[0031 ] Česta prekomerna ekspresija CLDN6 na tumorima kvalifikuje ovaj molekul kao visoko atraktivnu metu za razvoj terapeutika usmerenih protiv CLDN6, kao što su terapeutici iz vakcina i terapeutska antitela. Imunogeni MHC-vezivni peptidi izvedeni od CLDN6 i njihova upotreba u potsticanju specifičnih antitela, T-ćelijskih receptora i citolitičkih T limfocita, je opisana u WO2010/094499. Monoklonska antitela usmerena protiv CLDN6, koja imaju varijabilne domene koji sadrže osobite SEQ ID NO-a 32 (VH) i 33 (VL) su opisana u WO2011/057788, a ona koja sadrže SEQ ID NO-a 32 (VH) i 33, 38 ili 39 (VL) u WO2012/156018.

[0032 ] Međutim, do sada nisu opisani HLA-A*2-ograničeni epitopi CLDN6 T ćelija i T-ćelijski receptori koji ciljaju CLDN6 i nije poznato da li ćelije raka koje eksprimiraju CLDN6 mogu biti ciljane in vivo imunoterapijama koje uključuju T-ćelije, korišćenjem aktivnih ili pasivnih imunizacionih pristupa.

OPIS

Suština pronalaska

[0033 ] Sadašnji pronalazak je definisan priloženim patentnim zahtevima. On je zasnovan na sledećem učenju i njegovim različitim aspektima i primerima izvođenja

Suština učenja

[0034 ] Predmetno učenje se odnosi na T ćelijske receptore i veštačke T ćelijske receptore specifične za antigen CLDN6 povezan sa tumorom, posebno kada je prisutan na površini ćelije, kao što je obolela ćelija ili je eksprimiran na površini ćelije, kao što je bolesna ćelija ili ćelija za predstavljanje antigena, kao i peptidi koji sadrže epitope prepoznate od strane ovih T ćelijskih receptora, tj epitopi CLDN6-T ćelija.

[0035 ] Adoptivnim transferom T ćelija konstruisanih da eksprimiraju takve T ćelijske receptore ili veštačke T ćelijske receptore, kancerogene ćelije koje eksprimiraju CLDN6 mogu biti specifično ciljane na taj način dovodeći do selektivnog uništavanja ćelija raka. Osim toga, T ćelijski epitopi obezbeđeni prema učenju su korisni za dizajniranje vakcina protiv kancera koji eksprimiraju CLDN6.

[0036 ] U jednom aspektu, učenje se odnosi na peptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 3, 4 i 5 ili varijante navedene aminokiselinske sekvence. U jednom primeru izvođenja peptid je dužine 100 aminokiselina ili manje, 50 aminokiselina ili manje, 20 aminokiselina ili manje, ili 10 aminokiselina ili manje. U jednom primeru izvođenja, peptid može biti obrađen da se dobije peptid koji se sastoji od aminokiselinske sekvence izabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 3, 4 i 5 ili varijante navedene aminokiselinske sekvence U jednom primeru izvođenja, peptid se sastoji od aminokiselinske sekvence izabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 3, 4 i 5 ili varijante navedene aminokiselinske sekvence.

[0037 ] U jednom primeru izvođenja, peptid je prezentovani peptid MHC klase I ili klase II, poželjno prezentovani peptid MHC klase I, ili, ako je prisutan unutar ćelija, može biti obrađen da se na taj način proizvede proizvod obrade koji je MHC klase I ili klase II prezentovanog peptida, poželjno, MHC klase I prezentovanog peptida. Poželjno, navedena MHC klasa I ili klasa II prezentovanog peptida ima sekvencu koja u suštini odgovara datoj aminokiselinskoj sekvenci, tj. aminokiselinskoj sekvenci izabranoj iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 3, 4 i 5 ili varijante navedene aminokiselinske sekvence. Poželjno, peptid prema učenju je sposoban da stimuliše ćelijski odgovor protiv bolesti koja uključuje ćelije karakterisane prezentacijom CLDN6 sa klasom I MHC-a.

[0038 ] U daljim aspektima, učenje se odnosi na nukleinsku kiselinu koja sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira peptid prema učenju i ćeliju koja sadrži nukleinsku kiselinu. Nukleinska kiselina može biti rekombinantna nukleinska kiselina. Nukleinska kiselina može biti prisutna u plazmidu ili ekspresionom vektoru i može biti funkcionalno vezana za promotera. U jednom primeru izvođenja, nukleinska kiselina je RNK. Poželjno, ćelija eksprimira peptid. Ćelija može biti rekombinantna ćelija i može da sekretuje kodiranog peptida ili njegov proizvod obrade, može ga eksprimirati na površini i poželjno, može dodatno eksprimirati MHC molekul koji se vezuje za navedenog peptida ili njegov proizvod obrade i poželjno, predstavlja navedeni peptid ili njegov proizvod obrade na površini ćelije. U jednom izvođenju, ćelija eksprimira endogeno molekul MHC. U sledećem primeru izvođenja, ćelija eksprimira MHC molekul i / ili peptid na rekombinantni način. Ćelija je poželjno neproliferativna. U poželjnom primeru izvođenja, ćelija je antigen prezentujuća ćelija, naročito dendritska ćelija, monocit ili makrofag.

[0039 ] U daljem aspektu, učenje se odnosi na ćeliju koja prezentuje peptid prema učenju ili proizvod njegove obrade, pri čemu je proizvod obrade poželjno, peptid koji ima datu aminokiselinsku sekvencu, tj. aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 3, 4 i 5 ili varijante navedene aminokiselinske sekvence. U jednom primeru izvođenja, navedena ćelija je ćelija koja sadrži nukleinsku kiselinu koja sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira peptid prema učenju. Poželjno, navedena ćelija eksprimira navedenu nukleinsku kiselinu tako da proizvodi navedenog peptida. Po izboru, pomenuta ćelija obrađuje pomenuti peptid, tako da proizvodi peptid koji se sastoji od aminokiselinske sekvence izabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 3, 4 i 5 ili varijante navedene aminokiselinske sekvence. Ćelija može prezentovati peptid ili proizvod njegove obrade pomoću MHC molekula na njenoj površini. U jednom primeru izvođenja, ćelija endogeno eksprimira MHC molekul. U sledećem primeru izvođenja, ćelija rekombinantno eksprimira MHC molekul. U jednom primeru izvođenja, MHC molekuli ćelije su napunjeni (pulsirani) sa peptidom dodavanjem peptida u ćeliju. Ćelija može rekombinantno da eksprimira peptid i prezentuje pomenuti peptid ili njegov proizvod obrade na površini ćelije. Ćelija je poželjno neproliferativna. U poželjnom primeru izvođenja, ćelija je ćelija koja predstavlja antigen, kao što je dendritska ćelija, monocit ili makrofag.

[0040 ] U daljem aspektu, učenje se odnosi na imunoreaktivnu ćeliju koja je reaktivna sa peptidom prema učenju, naročito kada je predstavljena na površini ćelije, kao što je bolesna ćelija. Imunoreaktivna ćelija može biti ćelija koja je senzibilisana in vitro za prepoznavanje peptida. Imunoreaktivna ćelija može biti T ćelija, poželjno citotoksična T ćelija. Poželjno, imunoreaktivna ćelija se vezuje za sekvencu koja u suštini odgovara datoj aminokiselinskoj sekvenci, tj. aminokiselinskoj sekvenci izabranoj iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 3, 4 i 5 ili varijante navedene aminokiselinske sekvence, posebno kada je vezana za MHC, kao što je MHC na površini ćelije, kao što je bolesna ćelija.

[0041 ] U daljem aspektu, učenje se odnosi na vezivno sredstvo koje se vezuje za peptid prema učenju, opciono u kompleksu sa MHC molekulom.

[0042 ] U daljem aspektu, učenje se odnosi na T ćelijski receptor koji se vezuje za peptid prema učenju, opciono, u kompleksu sa MHC molekulom i poželjno je reaktivan sa pomenutim peptidom, ili polipeptidni lanac pomenutog T ćelijskog receptora. U jednom izvođenju, polipeptidni lanac pomenutog T ćelijskog receptora je α-lanac T ćelijskog receptora ili β-lanac T ćelijskog receptora.

[0043 ] U dodatnom aspektu, učenje se odnosi na α-lanac T ćelijskog receptora ili T ćelijski receptor koji sadrži pomenuti T ćelijski receptor α-lanca, pri čemu je pomenuti T ćelijski receptor α-lanca izabran iz grupe koja se sastoji od sledećih:

(i) T ćelijski receptor α-lanca koji sadrži najmanje jednu, poželjno dve, poželjnije sve tri CDR sekvence α-lanca T-ćelijskog receptora izabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26 i 28 ili njene varijante i

(ii) T ćelijski receptor α-lanca koji sadrži sekvencu α-lanca T-ćelijskog receptora izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26 i 28 ili njenog fragmenta, ili varijantu navedene sekvence ili fragmenta.

[0044 ] U jednom primeru izvođenja, pomenute SEQ ID NO: su izabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 14 i 16 i pomenuti T ćelijski receptor je reaktivan sa peptidom koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od SEQ ID NO: 3 ili varijantu navedene aminokiselinske sekvence.

[0045 ] U jednom primeru izvođenja, pomenute SEQ ID NO: su izabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 18, 20, 22, 24 i 26 i navedeni T ćelijski receptor je reaktivan sa peptidom koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od SEQ ID NO: 4 ili varijantu navedene aminokiselinske sekvence.

[0046 ] U jednom primeru izvođenja, pomenuta SEQ ID NO: je SEQ ID NO: 28 i navedeni T ćelijski receptor je reaktivan sa peptidom koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od SEQ ID NO: 5 ili varijantu navedene aminokiselinske sekvence.

[0047 ] U dodatnom aspektu, učenje se odnosi na β-lanac T ćelijskog receptora ili T-ćelijski receptor koji sadrži pomenuti β-lanac T-ćelijskog receptora, pri čemu je pomenuti β-lanac T ćelijskog receptora odabran iz grupe koja se sastoji od:

(i) T-ćelijskog receptora β-lanca koji sadrži najmanje jednu, poželjno dve, najpoželjnije sve tri CDR sekvence T-ćelijskog receptora β-lanca izabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27 i 29 ili njene varijante

i

(ii) T-ćelijskog receptora β-lanca koji sadrži sekvencu T-ćelijskog receptora β-lanca odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27 i 29 ili njenog fragmenta, ili varijantu navedene sekvence ili fragmenta.

[0048 ] U jednom primeru izvođenja, pomenute SEQ ID NO: su izabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 7, 9, 11, 13, 15 i 17 i navedeni T ćelijski receptor je reaktivan sa peptidom koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od SEQ ID NO: 3 ili varijantu navedene aminokiselinske sekvence.

[0049 ] U jednom primeru izvođenja, pomenute SEQ ID NO: su izabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 19, 21, 23, 25 i 27 i navedeni T ćelijski receptor je reaktivan sa peptidom koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od SEQ ID NO: 4 ili varijantu navedene aminokiselinske sekvence.

[0050 ] U jednom primeru izvođenja, pomenuta SEQ ID NO: je SEQ ID NO: 29 i navedeni T ćelijski receptor je reaktivan sa peptidom koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od SEQ ID NO: 5 ili varijantu navedene aminokiselinske sekvence.

[0051 ] U dodatnom aspektu, učenje se odnosi na T ćelijski receptor izabran iz grupe koja se sastoji od:

(I) T ćelijskog receptora koji sadrži:

(i) α-lanac T ćelijskog receptora koji sadrži najmanje jednu, poželjno dve, poželjnije sve tri CDR sekvence α-lanca T-ćelijskog receptora od SEQ ID NO: x ili njene varijante, i (ii) β-lanac T ćelijskog receptora koji sadrži najmanje jednu, poželjno dve, najpoželjnije sve tri CDR sekvence T-ćelijskog receptora β-lanca od SEQ ID NO: x 1 ili njene varijante; pri čemu je x izabran iz grupe koja se sastoji od 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26 i 28 i

(II) T ćelijskog receptora koji sadrži:

(i) α-lanac T ćelijskog receptora koji sadrži sekvencu α-lanca T-ćelijskog

receptora od SEQ ID NO: x ili njenog fragmenta, ili varijantu pomenute sekvence ili fragmenta, i

(ii) β-lanac T ćelijskog receptora koji sadrži sekvencu β-lanca T ćelijskog receptora od SEQ ID NO: x 1 ili njenog fragmenta, ili varijantu navedene sekvence ili fragmenta;

gde je x izabran iz grupe koja se sastoji od 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26 i 28.

[0052 ] U jednom primeru izvođenja, pomenuti x je izabran iz grupe koja se sastoji od 6, 8, 10, 12, 14 i 16 i navedeni T ćelijski receptor je reaktivan sa peptidom koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 3 ili varijantu navedene aminokiselinske sekvence.

[0053 ] U jednom primeru izvođenja, pomenuti x je izabran iz grupe koja se sastoji od 18, 20, 22, 24 i 26 i pomenuti T ćelijski receptor je reaktivan sa peptidom koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 4 ili varijantu navedene aminokiselinske sekvence.

[0054 ] U jednom primeru izvođenja, pomenuti x je 28 i pomenuti T ćelijski receptor je reaktivan sa peptidom koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 5 ili varijantu navedene aminokiselinske sekvence.

[0055 ] U jednom primeru izvođenja, vezivanje navedenog T ćelijskog receptora kada je eksprimiran od strane T ćelija i / ili prisutan na T ćelijama za CLDN6-peptidne epitope, kao što je gore opisano, prezentovane na ćelijama kao što su ćelije raka rezultira u proliferaciji i / ili aktivaciji pomenutih T ćelija, gde pomenute aktivirane T ćelije poželjno, oslobađaju citotoksične faktore, npr. perforine i granzime i iniciraju citolizu i / ili apoptozu ćelija raka.

[0056 ] U daljem aspektu, učenje se odnosi na veštački T-ćelijski receptor koji se vezuje za klaudin-6 (CLDN6). U jednom primeru izvođenja, vezivanje je specifično vezivanje.

[0057 ] U jednom primeru izvođenja, pomenuti CLDN6 je eksprimiran u ćeliji raka. U jednom primeru izvođenja, pomenuti CLDN6 je eksprimiran na površini ćelije raka. U jednom primeru izvođenja, pomenuti veštački T ćelijski receptor se vezuje za ekstracelularni domen ili za epitop u ekstracelularnom domenu CLDN6. U jednom primeru izvođenja, pomenuti veštački T ćelijski receptor se vezuje za prirodne epitope CLDN6, koji su prisutni na površini živih ćelija. U jednom primeru izvođenja, pomenuti veštački T ćelijski receptor se vezuje za prvu ekstracelularnu petlju CLDN6. U jednom izvođenju, vezivanje pomenutog veštačkog T ćelijskog receptora kada je eksprimiran od strane T ćelija i / ili prisutan na T ćelijama za CLDN6 koji je prisutan na ćelijama kao što su ćelije raka, rezultira u proliferaciji i / ili aktivaciji pomenutih T ćelija, pri čemu pomenute aktivirane T ćelije poželjno, oslobađaju citotoksične faktore, npr perforine i granzime i iniciraju citolizu i / ili apoptozu ćelija raka.

[0058 ] U jednom primeru izvođenja, veštački T-ćelijski receptor prema učenju sadrži vezivni domen za CLDN6. U jednom primeru izvođenja, vezivni domen za CLDN6 se sastoji od egzodomena navedenog veštačkog T ćelijskog receptora. U jednom primeru izvođenja, vezivni domen za CLDN6 sadrži jednolančani varijabilni fragment (scFv) antitela za CLDN6. U jednom izvođenju, vezivni domen za CLDN6 sadrži varijabilni region teškog lanca imunoglobulina (VH) sa specifičnošću za CLDN6 (VH (CLDN6)) i varijabilni region lakog lanca imunoglobulina (VL) sa specifičnošću za CLDN6 (VL (CLDN6)). U jednom izvođenju, pomenuti varijabilni region teškog lanca (VH) i odgovarajući varijabilni region lakog lanca (VL) su povezani preko peptidnog linkera, poželjno peptidnog linkera koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (GGGGS) 3. U jednom izvođenju, vezivni domen za CLDN6 sadrži VH (CLDN6) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu pomoću SEQ ID NO: 32 ili njen fragment, ili varijantu navedene aminokiselinske sekvence ili fragmenta. U jednom izvođenju, vezivni domen za CLDN6 sadrži VL (CLDN6) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu pomoću SEQ ID NO: 33, 38 ili 39 ili njen fragment, ili varijantu navedene aminokiselinske sekvence ili fragmenta. U jednom izvođenju, vezivni domen za CLDN6 sadrži VH (CLDN6) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu pomoću SEQ ID NO: 32 ili njen fragment, ili varijantu navedene aminokiselinske sekvence ili fragmenta i VL (CLDN6) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu pomoću SEQ ID NO: 39 ili njen fragment, ili varijantu navedene aminokiselinske sekvence ili fragmenta. U jednom izvođenju, vezivni domen za CLDN6 sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu pomoću SEQ ID NO: 40 ili njen fragment, ili varijantu navedene aminokiselinske sekvence ili fragmenta.

[0059 ] U jednom primeru izvođenja, veštački T ćelijski receptor prema učenju sadrži jedan transmembranski domen. U jednom primeru izvođenja, transmembranski domen je hidrofobni alfa heliks koji spaja membranu. U jednom primeru izvođenja, transmembranski domen obuhvata CD28 transmembranski domen ili njegov fragment.

[0060 ] U jednom primeru izvođenja, veštački T-ćelijski receptor prema učenju sadrži T-ćelijski domen za signalizaciju. U jednom primeru izvođenja, T ćelijski signalizacijski domen je lokalizovan intracelularno. U jednom primeru izvođenja, T ćelijski domen za signalizaciju sadrži CD3-zeta, poželjno endodomen CD3-zeta, opciono u kombinaciji sa CD28. U jednom primeru izvođenja, domen za signalizaciju T ćelija sadrži sekvencu prema SEQ ID NO: 45 ili njen fragment, ili varijantu navedene sekvence ili fragmenta.

[0061 ] U jednom primeru izvođenja, veštački T ćelijski receptor prema učenju sadrži signalni peptid koji usmerava nascentni protein u endoplazmatični retikulum. U jednom primeru izvođenja, signalni peptid prethodi domenu vezivanja za CLDN6. U jednom izvođenju, signalni peptid sadrži sekvencu prema SEQ ID NO: 42 ili njen fragment, ili varijantu pomenute sekvence ili fragmenta.

[0062 ] U jednom primeru izvođenja, veštački T-ćelijski receptor prema učenju sadrži region razdvajanja koji povezuje vezivni domen za CLDN6 sa transmembranskim domenom. U jednom primeru izvođenja, region razdvajanja omogućava da vezivni domen za CLDN6 bude orijentisan u različitim pravcima da olakša prepoznavanje CLDN6. U jednom primeru izvođenja, region za razdvajanje obuhvata spojni region od IgG1. U jednom primeru izvođenja, region za razdvajanje sadrži sekvencu prema SEQ ID NO: 43 ili njen fragment, ili varijantu navedene sekvence ili fragmenta.

[0063 ] U jednom primeru izvođenja, veštački T-ćelijski receptor prema učenju sadrži strukturu: NH2 - signalni peptid - vezujući domen za CLDN6 – region razdvajanja - transmembranski domen - T ćelijski domen za signalizaciju - COOH.

[0064 ] U jednom primeru izvođenja, veštački T ćelijski receptor prema učenju sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 46 ili njen fragment, ili varijantu navedene aminokiselinske sekvence ili fragmenta.

[0065 ] Gornji T-ćelijski receptori i veštački T-ćelijski receptori su poželjno, specifični za antigen CLDN6 povezan sa tumorom, posebno kada je prisutan na površini ćelije, kao što je obolela ćelija ili kada je prezentovan na površini ćelije, kao što je bolesna ćelija ili antigen prezentujuća ćelija.

[0066 ] T ćelijski receptori i veštački T ćelijski receptori prema učenju, mogu biti eksprimirani od strane i / ili prisutni na površini ćelija, kao što su T ćelije.

[0067 ] U daljem aspektu, učenje se odnosi na nukleinsku kiselinu koja sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira lanac T ćelijskog receptora ili T ćelijski receptor prema učenju ili kodira veštački T ćelijski receptor prema učenju. U jednom primeru izvođenja, nukleinska kiselina je rekombinantna nukleinska kiselina. U jednom primeru izvođenja, nukleinska kiselina je u obliku vektora ili u obliku RNK.

[0068 ] U daljem aspektu, učenje se odnosi na ćeliju koja sadrži T-ćelijski receptorski lanac ili T-ćelijski receptor prema učenju ili veštački T-ćelijski receptor prema učenju i / ili sadrži nukleinsku kiselinu koja sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira lanac T ćelijskog receptora ili T ćelijski receptor prema učenju ili koja kodira veštački T ćelijski receptor prema učenju. U jednom primeru izvođenja, navedena nukleinska kiselina je RNK, poželjno in vitro transkribovana RNK. Ćelija može biti ćelija koja eksprimira T-ćelijski receptorski lanac ili T-ćelijski receptor prema učenju ili veštački T-ćelijski receptor prema učenju i / ili može imati lanac T-ćelijskog receptora ili T-ćelijski receptor prema učenju ili veštački T-ćelijski receptor prema učenju na njenoj ćelijskoj površini. U jednom primeru izvođenja, navedena ćelija je ćelija koja je korisna za adoptivni prenos ćelija. Ćelija može biti efektorna ili matična ćelija, poželjno imunoreaktivna ćelija. Imunoreaktivna ćelija može biti T ćelija, poželjno citotoksična T ćelija. U jednom primeru izvođenja, imunoreaktivna ćelija je reaktivna sa antigenom CLDN6 povezanim sa tumorom. U jednom primeru izvođenja, pomenuti CLDN6 je prisutan na površini ćelije, kao što je bolesna ćelija. U jednom primeru izvođenja, pomenuti CLDN6 je prezentovan na površini ćelije, kao što je bolesna ćelija ili antigen prezentujuća ćelija, a imunoreaktivna ćelija je reaktivna sa peptidom prema učenju, naročito kada je predstavljen u kontekstu MHC i poželjno se vezuje za sekvencu koja u suštini odgovara datoj aminokiselinskoj sekvenci, tj. aminokiselinskoj sekvenci izabranoj iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 3, 4 i 5 ili varijante navedene aminokiselinske sekvence. U jednom primeru izvođenja, pomenutoj ćeliji nedostaje površinska ekspresija endogenog TCR-a ili je specifična za antigene koji nisu povezani sa CLDN6.

[0069 ] U jednom primeru izvođenja, ćelije prema učenju pre upotrebe u adoptivnom ćelijskom transferu su podvrgnute antigen-specifičnoj ekspanziji i ponovnom izazivanju, pri čemu se antigen-specifična ekspanzija i ponavljanje može izvršiti izlaganjem ćelija poželjnim autolognim antigen prezentujućim ćelijama koje predstavljaju CLDN6 ili njegov peptidni fragment.

[0070 ] U daljem aspektu, učenje se odnosi na postupak za proizvodnju imunoreaktivne ćelije koji obuhvata korak transdukcije T ćelije sa nukleinskom kiselinom koja sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira lanac T ćelijskog receptora ili T ćelijski receptor prema učenju ili kodira veštački T ćelijski receptor prema učenju.

[0071 ] Osim toga, sadašnji učenje generalno obuhvata lečenje bolesti ciljanjem obolelih ćelija, kao što su ćelije raka, posebno ćelija raka koje eksprimiraju CLDN6. Metode obezbeđuju selektivno iskorenjivanje ćelija koje eksprimiraju na svojoj površini i / ili predstavljaju antigen CLDN6 povezan sa tumorom, čime se umanjuju neželjeni efekti na normalne ćelije koje ne eksprimiraju i / ili predstavljaju CLDN6. Stoga, poželjne bolesti za terapiju su one u kojima je CLDN6 eksprimiran i opciono predstavljen, kao što su kancerogene bolesti, posebno one koje su ovde opisane.

[0072 ] Kada je primenjen peptid prema učenju, nukleinska kiselina koja sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira peptid prema učenju ili ćelija prema učenja koja sadrži navedenu nukleinsku kiselinu, tretman poželjno, uključuje aktivnu imunizaciju. Poželjno, CLDN6-specifične T ćelije su proširene kod pacijenta, a koje su sposobne da prepoznaju i ubijaju obolele ćelije. Kada je primenjena imunoreaktivna ćelija prema učenju , T ćelijski receptor prema učenju, veštački T ćelijski receptor prema učenju, nukleinska kiselina prema učenju koja sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira T-ćelijski receptor prema učenju ili kodira veštački T-ćelijski receptor prema učenju ili ćelija prema učenju koja sadrži receptor T ćelija ili veštački T ćelijski receptor prema učenju i / ili koja sadrži nukleinsku kiselinu prema učenju koja sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira T ćelijski receptor prema učenju ili koja kodira veštački T ćelijski receptor prema učenju, tretman poželjno, uključuje pasivnu imunizaciju. Poželjno, T-ćelije specifične za CLDN6 koje su u stanju da prepoznaju i ubijaju obolele ćelije i koje su opciono genetski konstruisane i / ili proširene in vitro, su adoptivno transferovane kod pacijenta.

[0073 ] U jednom aspektu, učenje se odnosi na farmaceutski preparat koji sadrži jedan ili više od:

(i) peptida prema učenju;

(ii) nukleinske kiseline prema učenju;

(iii) ćeliju prema učenju;

(iv) imunoreaktivnu ćeliju prema učenju;

(v) vezujući agens prema učenju;

(vi) T ćelijski receptor prema učenju; i

(vii) veštački T ćelijski receptor prema učenju.

[0074 ] Farmaceutska kompozicija prema pronalasku, može da sadrži farmaceutski prihvatljiv nosač i može opciono da sadrži jedan ili više adjuvanasa, stabilizatora itd. Farmaceutski preparat može biti u obliku terapeutske ili profilaktičke vakcine. U jednom primeru izvođenja, farmaceutski preparat je za upotrebu u lečenju ili prevenciji bolesti raka, kao što su one koje su ovde opisane.

[0075 ] Primena farmaceutskog preparata kao što je gore opisano, može da obezbedi epitope predstavljene MHC klasom II koji su sposobni da izazovu odgovor CD4+ pomoćnih T ćelija i / ili odgovor CD8+ T ćelija protiv CLDN6 (uključujući ćelije koje eksprimiraju CLDN6 na njihovoj površini i / ili prezentuju CLDN6 u kontekstu MHC molekula). Alternativno ili dodatno, primena farmaceutskog preparata kao što je gore opisano, može da obezbedi epitope predstavljene MHC klasom I koji su sposobni da izazovu odgovor CD8+ T ćelija protiv CLDN6.

[0076 ] U daljem aspektu, učenje se odnosi na postupak za lečenje ili prevenciju bolesti raka koji obuhvata primenu farmaceutskog preparata prema učenju, kod pacijenta.

[0077 ] U daljem aspektu, učenje se odnosi na peptid prema pronalasku, nukleinsku kiselinu prema učenju, ćeliju prema učenju, imunoreaktivnu ćeliju prema učenju, vezivno sredstvo prema učenju, T ćelijski receptor prema učenju, ili veštački T ćelijski receptor prema učenju za upotrebu u terapiji, naročito za upotrebu u lečenju ili prevenciji raka.

[0078 ] Drugi aspekt se odnosi na postupak za indukovanje imunog odgovora kod subjekta, koji obuhvata primenu farmaceutskog preparata prema učenju, kod subjekta.

[0079 ] Drugi aspekt se odnosi na postupak za stimulisanje, prajming i / ili širenje T ćelija, koji obuhvata kontaktiranje T ćelija sa jednim ili više od: peptida iz učenja, nukleinske kiseline iz učenja koja sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira peptid iz ovog učenja, ćelije iz pronalaska koja sadrži navedenu nukleinsku kiselinu i / ili ćelije iz učenja koja predstavlja peptid iz učenja ili njegov proizvod obrade. U jednom primeru izvođenja, peptid iz ovog učenja je predstavljen u kontekstu MHC molekula, kao što su MHC molekuli na površini ćelija, npr. antigenprezentujuće ćelije.

[0080 ] U ovom aspektu, učenje se može odnositi na postupak za pripremu CLDN6-specifičnih T ćelija. T ćelije mogu biti stimulisane, prajmovane i / ili proširene in vitro ili in vivo. Poželjno, T ćelije su prisutne u uzorku dobijenom od subjekta. Stimulisane, prajmovane i / ili ekspandirane T ćelije, mogu biti primenjene kod subjekta i mogu biti autologne, alogenične, singenične za subjekta.

[0081 ] Učenje u gore navedenim aspektima iz postupka za indukovanje imunog odgovora kod subjekta ili metode za stimulaciju, prajming i / ili ekspanziju T ćelija, može da se odnosi na metodu za lečenje bolesti raka, kod subjekta.

[0082 ] Drugi aspekt se odnosi na postupak ubijanja ćelija raka kod subjekta, koji obuhvata korak obezbeđivanja terapeutski efikasne količine peptida prema učenju, nukleinske kiseline prema učenju, ćelije prema učenju, imunoreaktivne ćelije prema učenju, vezivnog sredstva prema učenju, T ćelijskog receptora prema učenju, ili veštačkog T ćelijskog receptora prema učenju, kod subjekta.

[0083 ] Ovde opisani preparati i agensi su poželjno sposobni da indukuju ili promovišu ćelijski odgovor, poželjno aktivnost citotoksične T ćelije, protiv bolesti karakterisane ekspresijom CLDN6 i / ili prezentacijom CLDN6 sa MHC klasom I, npr. bolesti raka.

[0084 ] U jednom aspektu, učenje obezbeđuje sredstva i preparate, ovde opisane, za upotrebu u ovde opisanim postupcima lečenja.

[0085 ] Lečenja bolesti raka, ovde opisana, mogu biti kombinovana sa hirurškom resekcijom i / ili zračenjem i / ili tradicionalnom hemoterapijom.

[0086 ] U drugom aspektu, učenje se odnosi na postupak za određivanje imunološkog odgovora kod subjekta, koji obuhvata određivanje reaktivnih T ćelija sa peptidom prema učenju ili ćelijom prema učenju koja predstavlja peptid prema učenju ili proizvod njegove obrade u biološkom uzorku izolovanom od subjekta. Postupak može obuhvatiti korake:

(a) inkubiranja uzorka koji sadrži T ćelije izolovane iz subjekta sa jednim ili više od:

(i) peptida prema učenju;

(ii) nukleinske kiseline prema ućenju koja sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira peptid prema učenju; i

(iii) ćelije prema učenju koja sadrži navedenu nukleinsku kiselinu ili ćeliju prema učenju koja predstavlja peptid prema učenju ili njegov proizvod obrade;

i

(b) detektovanja specifične aktivacije T ćelija, otuda određivanje prisustva ili odsustva imunološkog odgovora kod navedenog subjekta.

[0087 ] Učenje u gornjim aspektima metode za određivanje imunološkog odgovora kod subjekta, može da se odnosi na metodu za dijagnostikovanje bolesti raka, kod subjekta.

[0088 ] U jednom primeru izvođenja metoda za dijagnostiku, biološki uzorak je iz tkiva ili organa, pri čemu ćelije u suštini ne eksprimiraju CLDN6 kada tkivo ili organ nije obolelo.

[0089 ] Tipično, nivo T ćelija u biološkom uzorku je poređen sa referentnim nivoom, pri čemu je odstupanje od pomenutog referentnog nivoa indikativno za prisustvo i / ili stadijum bolesti kod subjekta. Referentni nivo, može biti nivo kao što je određen u kontrolnom uzorku (npr., iz zdravog tkiva ili subjekta) ili srednji nivo od zdravih subjekata. "Odstupanje" od pomenutog referentnog nivoa označava svaku značajnu promenu, kao što je povećanje za najmanje 10%, 20%, ili 30%, poželjno za najmanje 40% ili 50%, ili čak i više. Poželjno, prisustvo T ćelija u navedenom biološkom uzorku ili količina T ćelija u biološkom uzorku koja je povećana u odnosu na referentni nivo ukazuje na prisustvo bolesti.

[0090 ] T ćelije mogu biti izolovane iz periferne krvi pacijenta, limfnih čvorova, uzoraka tkiva kao što su ona dobijena iz biopsije i resekcije, ili iz drugog izvora. Analize reaktivnosti mogu biti izvedene na primarnim T ćelijama ili drugim odgovarajućim derivatima. Na primer, T ćelije mogu biti fuzionisane da generišu hibridome. Testovi za merenje odgovora T ćelija su poznati u tehnici, i uključuju proliferacione testove i testove za oslobađanje citokina.

[0091 ] Testovi i popis za detektovanje reaktivnih T ćelija uključuju, ali nisu ograničeni na, upotrebu IFN γ ELISPOT i IFN γ intraćelijskog bojenja citokina. U struci su poznati drugi različiti postupci za određivanje da li će klon T ćelija reagovati na određeni peptid. Obično se peptid dodaje suspenziji T ćelija tokom perioda od jednog do tri dana. Odgovor T ćelija može biti izmeren proliferacijom, npr., preuzimanjem obeleženog timidina, ili oslobađanjem citokina, npr., IL-2. Dostupni su različiti testovi za otkrivanje prisustva oslobođenih citokina. T ćelijski citotoksični testovi, mogu biti korišćeni za detekciju citotoksičnih T ćelija koje imaju specifičnost za antigene. U jednom primeru izvođenja, citotoksične T ćelije su testirane na njihovu sposobnost da ubijaju ciljne ćelije koje predstavljaju antigen sa MHC molekulima klase I. Ciljne ćelije koje predstavljaju antigen, mogu biti obeležene i dodate suspenziji T ćelija iz uzorka pacijenta. Citotoksičnost može biti izmerena kvantifikovanjem oslobađanja obeleženih iz liziranih ćelija. Kontrole za spontano i ukupno oslobađanje mogu biti uključene u analizi.

[0092 ] U jednom primeru izvođenja prema učenju, karcinom koji je ovde opisan, uključuje ćelije raka koje eksprimiraju CLDN6 i / ili prezentuju CLDN6 u kontekstu MHC molekula. U jednom primeru izvođenja prema učenju, obolele ćelije su ćelije raka. U jednom primeru izvođenja, obolele ćelije kao što su ćelije raka su ćelije koje eksprimiraju CLDN6 i / ili predstavljaju CLDN6 u kontekstu MHC molekula. U jednom primeru izvođenja, ekspresija CLDN6 je na površini obolele ćelije.

[0093 ] U jednom primeru izvođenja prema učenju, karcinom je odabran iz grupe koju čine rak mokraćne bešike, rak jajnika, naročito adenokarcinom jajnika i teratokarcinom jajnika, rak pluća, uključujući mikrocelularni karcinom pluća (SCLC) i rak pluća koji nije mikrocelularni (NSCLC), posebno karcinom skvamoznih plućnih ćelija i adenokarcinom, rak želuca, rak dojke, rak jetre, rak pankreasa, rak kože, posebno karcinom bazalnih ćelija i karcinom skvamoznih ćelija, maligni melanom, rak glave i vrata, posebno maligni pleomorfni adenom, sarkom, posebno sinovijalni sarkom i karcinosarkom, rak žučnih kanala, rak mokraćne bešike, posebno karcinom tranzicionih ćelija i papilarni karcinom, rak bubrega, posebno karcinom bubrežnih ćelija, uključujući karcinom bubrežnih ćelija jasnih ćelija i papilarni karcinom bubrežnih ćelija, rak debelog creva, rak tankog creva, uključujući rak ileuma, posebno adenokarcinom tankog creva i adenokarcinom ileuma, embrionalni karcinom testisa, placentni horiokarcinom, rak grlića materice, rak testisa, posebno seminom testisa, teratoma testisa i embrionalni rak testisa, rak materice, tumori germinativnih ćelija kao što su teratokarcinom ili embrionalni karcinom, posebno tumori germinativnih ćelija testisa i njihovih metastatskih oblika.

[0094 ] U jednom primeru izvođenja prema učenju, ćelije raka su kancerogene ćelije raka izabrane iz grupe koja se sastoji od raka mokraćne bešike, raka jajnika, posebno adenokarcinoma jajnika i teratokarcinoma jajnika, raka pluća, uključujući mikrocelularni karcinom pluća (SCLC) i rak pluća koji nije mikrocelularni (NSCLC), posebno karcinom skvamoznih plućnih ćelija i adenokarcinom, raka želuca, raka dojke, raka jetre, raka pankreasa, raka kože, posebno bazalnog ćelijskog karcinoma i karcinoma skvamoznih ćelija, malignog melanoma, raka glave i vrata, posebno malignog pleomorfnog adenoma, sarkoma, posebno sinovijalnog sarkoma i karcinosarkoma, raka žučnih kanala, raka mokraćne bešike, posebno karcinoma prelaznih ćelija i papilarnog karcinoma, raka bubrega, posebno karcinoma bubrežnih ćelija, uključujući karcinom bubrežnih ćelija jasnih ćelija i papilarni karcinom bubrežnih ćelija, raka debelog creva, raka tankog creva, uključujući rak ileuma, posebno adenokarcinoma tankog creva i adenokarcinoma ileuma, embrionalnog karcinoma testisa, placentalnog horiokarcinoma, cervikalnog karcinoma, raka testisa, posebno seminoma testisa, teratoma testisa i embrionskog karcinoma testisa, raka uterusa, tumora germninativnih ćelija, kao što je teratokarcinom ili embrionalni karcinom, naročito tumora germinativnih ćelija testisa i njihovih metastatskih oblika.

[0095 ] Prema učenju CLDN6, poželjno ima aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 1 ili 2.

[0096 ] Druge karakteristike i prednosti sadašnjeg učenja biće očigledne iz sledećeg detaljnog opisa i patentnih zahteva.

Detaljan opis pronalaska

[0097 ] Iako je sadašnje učenje detaljno opisano u daljem tekstu, treba razumeti da ovo učenje nije ograničeno na posebne metodologije, protokole i reagense koji su ovde opisani, jer oni mogu da variraju. Takođe treba razumeti da se ovde korišćena terminologija koristi samo za opisivanje određenih primera izvođenja i nije namenjena da ograniči obim sadašnjeg učenja koji će biti ograničen samo priloženim patentnim zahtevima. Ukoliko nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni izrazi koji se ovde korišćeni imaju ista značenja kao što ih uobičajeno razume prosečan stručnjak u tehnici.

[0098 ] U nastavku će biti opisani elementi iz predmetnog učenja. Ovi elementi su navedeni sa specifičnim primerima izvođenja, međutim, treba razumeti da oni mogu biti kombinovati na bilo koji način i u bilo kojem broju da bi se kreirale dodatni primeri izvođenja. Različite opisane primere i poželjne primere izvođenja ne treba tumačiti tako da ograničavaju sadašnje učenje samo na eksplicitno opisane primere izvođenja. Ovaj opis treba shvatiti da podržava i obuhvata primere izvođenja koji kombinuju eksplicitno opisane primere izvođenja sa bilo kojim brojem otkrivenih i / ili poželjnih elemenata. Osim toga, bilo koje permutacije i kombinacije svih opisanih elemenata u ovoj prijavi treba smatrati obelodanjenim opisom sadašnje prijave, osim ukoliko nije drugačije naznačeno kontekstom.

[0099 ] Poželjno, ovde korišćeni izrazi su definisani kao što je opisano u izd. "Višejezični rečnik biotehnoloških izraza: (IUPAC Preporuke)", H.G.W. Leuenberger, B. Nagel, i H. Kolbl, Izd., (1995) Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Bazel, Switzerland.

[0100 ] Praksa prema predmetnom učenju će koristiti, ako nije drugačije naznačeno, konvencionalne metode biohemije, ćelijske biologije, imunologije i tehnike rekombinantne DNK koje su objašnjene u literaturi u ovoj oblasti (npr. Molekularno kloniranje: Laboratorijski priručnik, 2. izdanje, J. Sambrook i sar. izd., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989).

[0101 ] U ovoj specifikaciji i patentnim zahtevima koji slede, osim ako kontekst ne zahteva drugačije, reč "obuhvata", i varijacije kao što su "obuhvata" i "sadrži", biće shvaćene da znače uključenje navedenog člana, celog broja ili koraka ili grupe članova, celih brojeva ili koraka, ali ne i isključenja bilo kog drugog člana, celog broja ili koraka ili grupe članova, celih brojeva ili koraka, iako u nekim primerima izvođenja mogu biti isključeni takvi drugi članovi, celi brojevi ili korak ili članovi grupe, celi brojevi ili koraci, tj. predmet se sastoji od uključenja navedenog člana, celog broja ili koraka ili grupe članova, celih brojeva ili koraka. Izrazi "jedan" i "izvestan" i "taj" i slične reference korišćene u kontekstu opisa učenja (posebno u kontekstu patentnih zahteva) treba tumačiti tako da obuhvataju i jedninu i množinu, osim ukoliko nije drugačije ovde naznačeno ili jasno kontradiktorno kontekstom. Nabrajanje opsega vrednosti je ovde namenjeno samo da služi kao skraćena metoda koja se odnosi pojedinačno na svaku posebnu vrednost koja spada unutar opsega. Ukoliko ovde nije drugačije naznačeno, svaka pojedinačna vrednost je uključena u specifikaciju kao da je ovde pojedinačno navedena.

[0102 ] Svi ovde opisani postupci, mogu biti izvedeni prema bilo kom pogodnom redosledu, osim ako nije ovde drugačije naznačeno ili na drugi način jasno suprotno kontekstu. Upotreba bilo kog i svih primera, ili primernog jezika (npr. "kao što je"), koji je ovde dat, samo je namenjena boljoj ilustraciji učenja i ne predstavlja ograničenje obima učenja koji se inače zahteva. Nijedan jezik u specifikaciji ne treba tumačiti tako da ukazuje na bilo koji element koji se ne zahteva, a koji je bitan za praksu učenja.

[0103 ] Izraz "rekombinantan" u kontekstu sadašnjeg učenja znači "napravljen putem genetičkog inženjeringa". Poželjno, "rekombinantni objekt" kao što je rekombinantna ćelija u kontekstu sadašnjeg učenja se ne nalazi prirodno.

[0104 ] Izraz "nalazi se prirodno" koji se ovde koristi, odnosi se na činjenicu da se neki objekt može naći u prirodi. Na primer, jedan peptid ili nukleinska kiselina koja je prisutna u organizmu (uključujući viruse) i može biti izolovana iz izvora u prirodi i koja nije namerno modifikovana od strane čoveka u laboratoriji se javlja prirodno.

[0105 ] Izraz "imunski odgovor" se odnosi na integrisani telesni odgovor na antigen i poželjno se odnosi na ćelijski imunski odgovor ili ćelijski, kao i humoralni imunski odgovor. Imunski odgovor može biti zaštitni / preventivni / profilaktički i / ili terapeutski.

[0106 ] Izraz "indukovanje imunskog odgovora" može značiti da nije došlo do imunskog odgovora protiv određenog antigena pre indukcije, ali on takođe, može značiti da je postojao određeni nivo imunskog odgovora protiv određenog antigena pre indukcije i nakon indukcije, te je stoga navedeni imunski odgovor pojačan. Prema tome, "indukovanje imunskog odgovora" takođe, uključuje "pojačavanje imunskog odgovora". Poželjno, nakon indukovanja imunskog odgovora kod subjekta, navedeni subjekt je zaštićen od razvoja bolesti, kao što je bolest raka ili se stanje bolesti poboljšava indukcijom imunskog odgovora. Na primer, imunski odgovor protiv antigena povezanog sa tumorom, kao što je CLDN6, može biti indukovan kod pacijenta koji boluje od karcinoma ili kod subjekta koji je izložen riziku od nastanka karcinoma. Izazivanje imunskog odgovora u ovom slučaju može značiti da je stanje bolesti kod subjekta poboljšano, da subjekt ne razvija metastaze, ili da subjekt koji je izložen riziku od nastanka oboljenja od raka ne razvija bolest raka.

[0107 ] "Ćelijski imunski odgovor", "ćelijski odgovor", "ćelijski odgovor protiv antigena" ili sličan izraz označava da uključuje ćelijski odgovor usmeren na ćelije okarakterisane predstavljanjem antigena sa klasom I ili klasom II MHC-a. Ćelijski odgovor se odnosi na ćelije koje se nazivaju T ćelije ili T-limfociti koji deluju kao ‘pomagači’ ili ‘ubice’. Pomoćne T ćelije (takođe nazvane CD4<+>T ćelije) igraju centralnu ulogu regulisanjem imunskog odgovora i ćelije ubice (koje se takođe nazivaju citotoksične T ćelije, citolitičke T ćelije, CD8<+>T ćelije ili CTL) ubijaju obolele ćelije kao što su ćelije raka, sprečavajući proizvodnju više obolelih ćelija.

[0108 ] Izraz "antigen" se odnosi na izvesni agens koji sadrži epitop protiv kojeg treba biti generisan imunski odgovor i/ili je usmeren. Poželjno, antigen u kontekstu predmetnog učenja je molekul koji, opciono nakon obrade, indukuje imuno reakciju, koja je poželjno specifična za antigen ili ćelije koje eksprimiraju i/ili predstavljaju antigen. Izraz "antigen" obuhvata posebne proteine i peptide. Izvesni antigen je poželjno proizvod koji odgovara ili je izveden iz antigena koji se javlja prirodno. Takvi antigeni koji se prirodno javljuju, mogu da uključuju ili mogu biti izvedeni iz antigena povezanih sa tumorom.

[0109 ] Posebno, njihovi antigeni ili peptidni fragmenti bi trebali da budu prepoznatljivi pomoću T ćelijskog receptora. Poželjno, antigen ili peptid ako je prepoznat od strane receptora T ćelija je u stanju da indukuje u prisustvu odgovarajućih kostimulativnih signala, klonsku ekspanziju T ćelija koje nose T ćelijski receptor koji prepoznaje antigen ili peptid. U kontekstu primera izvođenja sadašnjeg učenja, antigen je poželjno predstavljen od strane ćelije, poželjno od strane antigen prezentujuće ćelije i/ili obolele ćelije, u kontekstu MHC molekula, što može dovesti do imunološke reakcije protiv antigena (ili ćelije koja predstavlja antigen).

[0110 ] U poželjnom primeru izvođenja, antigen je tumorski-povezan antigen, tj. sastojak ćelija raka koji može biti dobijen iz citoplazme, površine ćelije i ćelijskih jezgara, posebno onih antigena koji su proizvedeni, poželjno, u velikoj količini, intracelularno ili kao površinski antigeni na kancerogenim ćelijama.

[0111 ] U kontekstu predmetnog učenja, izraz "antigen povezan sa tumorom" ili "tumorski antigen" se odnosi na proteine koji su pod normalnim uslovima specifično eksprimirani ograničenom broju tkiva i/ili organa ili u specifičnim razvojnim stadijumima, na primer, antigen povezan sa tumorom, može biti pod normalnim uslovima specifično eksprimiran u tkivu stomaka, poželjno u sluznici želuca, u reproduktivnim organima, npr., u testisima, u trofoblastičnom tkivu, npr. u placenti, ili u ćelijama germinativne linije, a eksprimirani su ili abnormalno eksprimirani u jednom ili više tumora ili tkivima karcinoma. U ovom kontekstu, "ograničeni broj" poželjno znači ne više od 3, poželjnije ne više od 2. Antigeni povezani sa tumorom u kontekstu predmetnog učenja uključuju, na primer, diferencijacijske antigene, poželjno, diferencijacijske antigene specifične za tip ćelija, tj. proteine koji su pod normalnim uslovima specifično eksprimirani u određenom tipu ćelija, u određenoj fazi diferencijacije, raka /antigeni testisa, tj. proteini koji su pod normalnim uslovima specifično eksprimirani u testisima i ponekad u placenti i specifičnim antigenima germinativne linije. U kontekstu sadašnjeg učenja, antigen povezan sa tumorom je poželjno, povezan sa ćelijskom površinom ćelije raka i poželjno, nije ili je samo retko eksprimiran u normalnim tkivima. Poželjno, antigen povezan sa tumorom ili abnormalna ekspresija antigena povezanog sa tumorom identifikuje ćelije raka. U kontekstu sadašnjeg učenja, antigen povezan sa tumorom koji je eksprimiran od strane ćelije raka kod subjekta, npr., jednog pacijenta koji boluje od karcinoma, je poželjno samo protein u navedenom subjektu. U poželjnim primerima izvođenja, antigen povezan sa tumorom u kontekstu sadašnjeg učenja je eksprimiran pod normalnim uslovima specifično u tkivu ili organu koji nije esencijalan, tj. tkiva ili organi koji kada su oštećeni od strane imunskog sistema ne dovode do smrti subjekta, ili u organima ili strukturama tela koje nisu ili su teško dostupne od strane imuno sistema. Poželjno je da je aminokiselinska sekvenca antigena povezanog sa tumorom identična između antigena povezanog sa tumorom koji je eksprimiran u normalnim tkivima i antigena povezanog sa tumorom koji je eksprimiran u tkivima karcinoma. Poželjno, jedan tumorski-povezani antigen je predstavljen od strane ćelije raka u kojoj je eksprimiran.

[0112 ] Različiti aspekti prema učenju uključuju, antigen CLDN6 povezan sa tumorom i sadašnje učenje može uključivati stimulaciju ili obezbeđivanje anti-tumorske CTL reakcije protiv ćelija raka koje eksprimiraju pomenuti antigen povezan sa tumorom i poželjno predstavljaći navedeni tumorski-povezani antigen sa klasom I MHC.

[0113 ] Klaudini su familija proteina koji su najvažnije komponente uskih spojeva, gde uspostavljaju paracelularnu barijeru koja kontroliše protok molekula u međućelijskom prostoru između epitelnih ćelija. Klaudini su transmembranski proteini koji pokrivaju membranu 4 puta sa N-terminalnim i C-terminalnim krajem koji se nalaze u citoplazmi. Prva ekstracelularna petlja, nazvana EC1 ili ECL1, sastoji se u proseku od 53 aminokiselina, a druga ekstracelularna petlja, nazvana EC2 ili ECL2, sastoji se od oko 24 aminokiselina. Proteini ćelijske površine familije klaudina, kao što je CLDN6, su eksprimirani u tumorima različitog porekla, a posebno su pogodni kao ciljne strukture u vezi sa imunoterapijom raka posredovanom antitelima zbog njihove selektivne ekspresije (bez ekspresije u normalnom tkivu relevantne toksičnosti) i lokalizacije na plazma membrani.

[0114 ] CLDN6 je identifikovan kao diferencijalno eksprimiran u tumorskim tkivima, pri čemu su jedina normalna tkiva koja eksprimiraju CLDN6 placenta.

[0115 ] Nađeno je da je CLDN6 eksprimiran, na primer, kod raka jajnika, raka pluća, raka želuca, raka dojke, raka jetre, raka pankreasa, raka kože, melanoma, karcinoma vrata i glave, sarkoma, karcinoma žučnih kanala, raka bubrežnih ćelija i raka mokraćne bešike. CLDN6 je naročito poželjna meta za prevenciju i/ili lečenje raka jajnika, posebno adenokarcinoma jajnika i teratokarcinoma jajnika, raka pluća, uključujući sitnoćelijski karcinom pluća (SCLC) i karcinom pluća koji nije sitnoćelijski (NSCLC), posebno karcinom pluća skvamoznih ćelija i adenokarcinom, raka želuca, raka dojke, karcinoma jetre, raka pankreasa, raka kože, posebno karcinoma bazalnih ćelija i karcinoma skvamoznih ćelija, malignog melanoma, raka glave i vrata, posebno malignog pleomorfnog adenoma, sarkoma, posebno sinovijalnog sarkoma i karcinosarkoma, karcinoma žučnih kanala, raka mokraćne bešike, naročito karcinoma prelazne ćelije i papilarnog karcinoma, raka bubrega, posebno karcinoma bubrežnih ćelija, uključujući karcinom bubrežnih ćelija jasnih ćelija i papilarni karcinom bubrežnih ćelija, raka debelog creva, raka tankog creva, uključujući rak ileuma, posebno adenokarcinom tankog creva i adenokarcinom ileuma, testisnog embrionalnog karcinoma, placentnog horiokarcinoma, raka grlića materice, raka testisa, posebno seminoma testisa, teratoma testisa i embrionskog raka testisa, raka materice, tumora germinativnih ćelija, kao što je teratokarcinom ili embrionalni karcinom, naročito tumora germinativnih ćelija testisa i njihovih metastatskih oblika. U jednom primeru izvođenja, oboljenje raka povezano sa ekspresijom CLDN6 je izabrano iz grupe koja se sastoji od raka jajnika, raka pluća, metastatskog raka jajnika i metastatskog raka pluća. Poželjno, rak jajnika je karcinom ili adenokarcinom. Poželjno, rak pluća je karcinom ili adenokarcinom, a poželjno je karcinom bronhiola, kao što je bronhiolarni karcinom ili bronhiolarni adenokarcinom.

[0116 ] Izraz "CLDN", kako je ovde korišćen, označava klaudin i uključuje CLDN6. Poželjno, klaudin je humani klaudin. Izraz "CLDN6" se odnosi na klaudin 6 i uključuje bilo koje njegove varijante.

[0117 ] Izraz "CLDN6" se poželjno odnosi na humani CLDN6, a posebno na protein koji sadrži, poželjno se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2 iz listinga sekvenci ili varijante pomenute aminokiselinske sekvence. Prva ekstracelularna petlja CLDN6 poželjno sadrži aminokiseline 28 do 80, poželjnije aminokiseline 28 do 76 iz aminokiselinske sekvence prikazane u SEQ ID NO: 1 ili aminokiselinske sekvence prikazane u SEQ ID NO: 2. Druga ekstracelularna petlja CLDN6 poželjno sadrži aminokiseline 138 do 160, poželjno aminokiseline 141 do 159, još poželjnije aminokiseline 145 do 157 iz aminokiselinske sekvence prikazane u SEQ ID NO: 1 ili aminokiselinske sekvence prikazane u SEQ ID NO : 2. Pomenute prva i druga ekstracelularna petlja poželjno, formiraju ekstracelularni deo CLDN6.

[0118 ] Izraz "varijanta" prema učenju odnosi se, naročito, na mutante, spojne varijante, konformacije, izoforme, alelne varijante, varijante vrsta i homologe vrsta, posebno one koji su prisutni prirodno. Alelna varijanta se odnosi na promenu u normalnoj sekvenci gena, čija je značajnost često nejasna. Potpuno sekvenciranje gena često identifikuje brojne alelne varijante za dati gen. Homolog vrste je jedna nukleinska kiselina ili aminokiselinska sekvenca sa različitim vrstama porekla od one date sekvence nukleinske kiseline ili aminokiseline. Izraz "varijanta" obuhvata sve varijante i konformacijske varijante koje su modifikovane posttranslaciono.

[0119 ] Prema različitim aspektima iz učenja, cilj je poželjno da se indukuje ili odredi imunski odgovor protiv ćelija raka koje eksprimiraju CLDN6 i poželjno je karakterisan predstavljanjem CLDN6, kao i da se dijagnostikuje, leči ili spreči oboljenje raka koje uključuje ćelije koje eksprimiraju CLDN6. Poželjno, imunski odgovor uključuje, stimulaciju anti-CLDN6 CTL odgovora protiv ćelija raka koje eksprimiraju CLDN6 i poželjno, predstavljajući CLDN6 sa klasom I MHC-a.

[0120 ] Prema učenju, izraz "CLDN6 pozitivan kancer" ili slični izrazi označavaju rak koji uključuje ćelije raka koje eksprimiraju CLDN6, poželjno na površini navedenih ćelija raka. Alternativno ili dodatno, pomenute ćelije raka koje eksprimiraju CLDN6 predstavljaju CLDN6 u kontekstu MHC molekula. Ćelije raka koje predstavljaju CLDN6 u kontekstu MHC molekula, mogu biti ciljane od strane imunoreaktivnih ćelija koje nose T ćelijske receptore, dok ćelije raka koje eksprimiraju CLDN6 na površini, mogu biti ciljane od strane imunoreaktivnih ćelija koje nose veštačke T ćelijske receptore.

[0121 ] "Ćelijska površina" se koristi u skladu sa njenim normalnim značenjem u struci, a stoga uključuje spoljašnjost ćelije koja je dostupna za vezivanje pomoću proteina i drugih molekula.

[0122 ] CLDN6 je eksprimiran na površini ćelija ako je lokalizovan na površini pomenutih ćelija i dostupan je za vezivanje pomoću CLDN6-specifičnih antitela dodatih ćelijama.

[0123 ] Izraz "ekstracelularni deo" ili "egzodomen" u kontekstu sadašnjeg učenja se odnosi na deo molekula, kao što je protein koji je okrenut ka ekstracelularnom prostoru ćelije i poželjno je dostupan sa spoljne strane navedene ćelije, npr. molekulima koji vežu antigen, kao što su antitela lokalizovana izvan ćelije. Poželjno, izraz se odnosi na jednu ili više ekstracelularnih petlji ili domena ili njegovog fragmenta.

[0124 ] Izraz "deo" se odnosi na frakciju. U odnosu na određenu strukturu, kao što je aminokiselinska sekvenca ili protein, izraz njegov "deo" može označavati kontinuiranu ili diskontinuiranu frakciju navedene strukture. Poželjno, deo aminokiselinske sekvence sadrži najmanje 1%, najmanje 5%, najmanje 10%, najmanje 20%, najmanje 30%, poželjno najmanje 40%, poželjno najmanje 50%, poželjnije najmanje 60%, poželjnije najmanje 70%, čak poželjnije najmanje 80%, a najpoželjnije najmanje 90% aminokiselina navedene aminokiselinske sekvence. Poželjno, ako je deo diskontinuirane frakcije, navedena diskontinuirana frakcija je sastavljena od 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ili više delova strukture, pri čemu je svaki deo kontinualni element strukture. Na primer, diskontinuirana frakcija izvesne aminokiselinske sekvence može biti sastavljena od 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ili više, poželjno ne više od 4 dela navedene aminokiselinske sekvence, gde svaki deo poželjno sadrži najmanje 5 kontinuiranih aminokiselina, najmanje 10 kontinuiranih aminokiselina, poželjno najmanje 20 kontinuiranih aminokiselina, poželjno najmanje 30 kontinuiranih aminokiselina aminokiselinske sekvence.

[0125 ] Izrazi "deo" i "fragment" se ovde koriste naizmenično i odnose se na kontinuirani element. Na primer, deo strukture kao što je aminokiselinska sekvenca ili protein se odnosi na kontinuirani element navedene strukture. Porcija, deo ili fragment strukture, poželjno sadrži jedno ili više funkcionalnih svojstava navedene strukture. Na primer, porcija, deo ili fragment epitopa, peptida ili proteina je poželjno imunološki ekvivalentan epitopu, peptidu ili proteinu iz kojeg je izveden. U kontekstu sadašnjeg učenja, "deo" strukture kao što je aminokiselinska sekvenca poželjno sadrži, poželjno se sastoji od najmanje 10%, najmanje 20%, najmanje 30%, najmanje 40%, najmanje 50% %, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 92%, najmanje 94%, najmanje 96%, najmanje 98%, najmanje 99% ukupne strukture ili aminokiselinske sekvence. Deo ili fragment proteinske sekvence poželjno sadrži sekvencu od najmanje 6, posebno najmanje 8, najmanje 12, najmanje 15, najmanje 20, najmanje 30, najmanje 50, ili najmanje 100 aminokiselina u nizu od proteinske sekvence. Porcije, delovi ili fragmenti, kao što je gore razmatrano su obuhvaćeni izrazom "varijanta" koji je ovde korišćen.

[0126 ] Prema učenju, CLDN6 nije suštinski eksprimiran u ćeliji ako je nivo ekspresije niži u poređenju sa ekspresijom u ćelijama placente ili tkivu placente. Poželjno, nivo ekspresije je manji od 10%, poželjno manji od 5%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,1% ili 0,05% od ekspresije u placentnim ćelijama ili placentnom tkivu ili čak niži. Poželjno, CLDN6 nije suštinski eksprimiran u ćeliji ako nivo ekspresije prelazi nivo ekspresije u ne-kanceroznom tkivu koje nije placenta, za ne više od 2 puta, poželjno 1,5 puta, a poželjno ne prelazi nivo ekspresije u navedenom ne-kanceroznom tkivu. Poželjno, CLDN6 nije suštinski eksprimiran u ćeliji ako je nivo ekspresije ispod granice detekcije i / ili ako je nivo ekspresije suviše nizak da bi se omogućilo vezivanje pomoću CLDN6-specifičnih antitela dodatih ćelijama.

[0127 ] Prema učenju, CLDN6 je eksprimiran u ćeliji ako nivo ekspresije prelazi nivo ekspresije u ne-kanceroznom tkivu koje nije placenta, poželjno više od 2 puta, poželjno 10 puta, 100 puta, 1000 puta, ili 10000 puta. Poželjno, CLDN6 je eksprimiran u ćeliji ako je nivo ekspresije iznad granice detekcije i / ili ako je nivo ekspresije dovoljno visok da omogući vezivanje sa CLDN6-specifičnim antitelima koja se dodaju ćelijama. Poželjno, CLDN6 eksprimiran u ćeliji je eksprimiran ili izložen na površini navedene ćelije.

[0128 ] "Ciljna ćelija" će označavati ćeliju koja je cilj za imunski odgovor, kao što je ćelijski imunski odgovor. Ciljne ćelije uključuju ćelije koje predstavljaju antigen ili epitop antigena, tj. peptidni fragment izveden iz antigena, i uključuju bilo koje nepoželjne ćelije, kao što su ćelije raka. U poželjnim primerima izvođenja, ciljna ćelija je ćelija koja eksprimira CLDN6, koji je poželjno prisutan na površini ćelije i / ili predstavljen klasom I MHC.

[0129 ] Izraz "epitop" se odnosi na antigensku determinantu u molekuli kao što je antigen, tj. na deo ili fragment molekula koji je prepoznat od strane imunskog sistema, na primer, koji je prepoznat od strane T ćelije, posebno kada je predstavljen u kontekstu MHC molekula. Epitop proteina, kao što je antigen povezan sa tumorom, poželjno sadrži kontinuirani ili diskontinuirani deo pomenutog proteina i poželjno je u dužini između 5 i 100, poželjno između 5 i 50, poželjnije između 8 i 30, najpoželjnije između 10 i 25 aminokiselina, na primer, epitop može biti poželjno dužine 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, ili 25 aminokiselina. Naročito je poželjno da epitop u kontekstu sadašnjeg učenja predstavlja T ćelijski epitop.

[0130 ] Izrazi kao što su "epitop", "fragment antigena", "antigenski peptid" ili "imunogeni peptid" se ovde koriste naizmenično i poželjno se odnose na nepotpuno predstavljanje antigena koji je poželjno, sposoban za izazivanje imunskog odgovora protiv antigena ili ćelije koja eksprimira ili koja sadrži i poželjno koja predstavlja antigen. Poželjno, izrazi se odnose na imunogeni deo antigena. Poželjno, to je deo antigena koji je prepoznat (tj., specifično vezan) od strane T ćelijskog receptora, naročito ako je predstavljen u kontekstu MHC molekula. Određeni poželjni imunogeni delovi se vezuju za MHC klasu I ili klasu II molekula, kao što je na površini ćelije i stoga su MHC vezivni peptidi. Kako se ovde koristi, za peptid se kaže da se "vezuje za" molekulu MHC klase I ili klase II ako je takvo vezivanje otkriveno korišćenjem bilo kog testa poznatog u tehnici.

[0131 ] Poželjno, ovde opisani peptidi koji sadrže aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 3, 4 i 5 ili varijante pomenute aminokiselinske sekvence, sposobni su da stimulišu imunski odgovor, poželjno ćelijski odgovor protiv CLDN6 ili ćelija karakterisanih ekspresijom CLDN6 i poželjno karakterisanih predstavljanjem CLDN6. Poželjno, takav peptid je sposoban da stimuliše ćelijski odgovor protiv ćelije okarakterisane predstavljanjem CLDN6 sa klasom I MHC i poželjno je sposoban da stimuliše CTL koji reaguje na CLDN6. Poželjno, peptidi u skladu sa ovim učenjem su MHC klase I i / ili klase II prezentovani peptidi ili se mogu obraditi da bi se proizveli predstavljeni peptidi MHC klase I i / ili klase II. Poželjno, sekvenca vezana za MHC molekul je izabrana od SEQ ID NO: 3, 4 i 5.

[0132 ] Ako antigenski peptid treba da bude predstavljen direktno, tj. bez obrade, naročito bez cepanja, on ima dužinu koja je pogodna za vezivanje za MHC molekul, posebno za MHC molekul klase I, a poželjno je da je dužine 7-20 aminokiselina, poželjnije dužine 7-12 aminokiselina, još poželjnije dužine 8-11 aminokiselina, posebno dužine 9 ili 10 aminokiselina. Poželjno, sekvenca antigenskog peptida koja treba da bude predstavljena direktno, suštinski odgovara i poželjno je potpuno identična sekvenci izabranoj od SEQ ID NO: 3, 4 i 5.

[0133 ] Ako antigenski peptid treba da bude predstavljen nakon obrade, posebno nakon cepanja, peptid proizveden pomoću obrade ima dužinu koja je pogodna za vezivanje za MHC molekul, posebno za MHC molekul klase I, a poželjno je da je dužine 7-20 aminokiselina, poželjnije dužine 7-12 aminokiselina, poželjnije dužine 8-11 aminokiselina, naročito dužine 9 ili 10 aminokiselina. Poželjno, sekvenca peptida koja treba da bude predstavljena nakon obrade u suštini odgovara i poželjno je potpuno identična sekvenci izabranoj od SEQ ID NO: 3, 4 i 5. Prema tome, antigenski peptid prema učenju u jednom primeru izvođenja sadrži sekvencu izabranu od SEQ ID NO: 3, 4 i 5 i sledeća obrada antigenskog peptida čini sekvencu izabranu od SEQ ID NO: 3, 4 i 5.

[0134 ] Peptidi koji imaju aminokiselinske sekvence koje u suštini odgovaraju sekvenci peptida koji je predstavljen pomoću MHC molekula, mogu se razlikovati na jednom ili više ostataka koji nisu esencijalni za TCR prepoznavanje peptida, kao što je predstavljeno pomoću MHC, ili za peptid koji se vezuje za MHC. Takvi suštinski odgovarajući peptidi, poželjno su takođe sposobni da stimulišu antigen-specifičan ćelijski odgovor kao što je antigen-specifičan CTL. Peptidi koji imaju aminokiselinske sekvence koje se razlikuju od predstavljenog peptida na ostacima koji ne utiču na TCR prepoznavanje, ali poboljšavaju stabilnost vezivanja za MHC mogu poboljšati imunogenost antigenskog peptida, i mogu biti ovde označeni kao "optimizovani peptidi". Koristeći postojeća saznanja o tome koji od ovih ostataka će verovatnije uticati na vezivanje bilo za MHC ili za TCR, može se koristiti racionalan pristup u dizajniranju suštinski odgovarajućih peptida. Dobijeni peptidi koji su funkcionalni se smatraju antigenskim peptidima. Sekvence, kao što je gore razmatrano su obuhvaćene izrazom "varijanta" koji je ovde korišćen.

[0135 ] "Obrada antigena" se odnosi na degradaciju antigena u proizvode obrade, koji su fragmenti navedenog antigena (npr., degradacija proteina u peptide) i vezivanje jednog ili više ovih fragmenata (npr., preko vezivanja) sa MHC molekulima za prezentaciju od strane ćelija, poželjno antigen prezentujućih ćelija za specifične T ćelije.

[0136 ] Ćelija koja predstavlja antigen (APC) je ćelija koja prikazuje antigen u kontekstu glavnog kompleksa histokompatibilnosti (MHC) na njenoj površini. T ćelije mogu da prepoznaju ovaj kompleks korišćenjem njihovog T ćelijskog receptora (TCR). Antigenprezentujuće ćelije obrađuju antigene i prezentuju ih T ćelijama.

[0137 ] Profesionalne antigen-prezentujuće ćelije su veoma efikasne u internalizaciji antigena, bilo fagocitozom ili endocitozom posredovanom receptorom i zatim prikazivanjem fragmenta antigena, vezanog za MHC molekul klase II, na njihovoj membrani. T ćelija prepoznaje i stupa u interakciju sa kompleksom molekula MHC klase II antigena na membrani ćelije koja predstavlja antigen. Dodatni ko-stimulativni signal je zatim proizveden od strane antigenprezentujuće ćelije, što dovodi do aktivacije T ćelije. Ekspresija ko-stimulativnih molekula je karakteristika koja određuje profesionalne antigen-prezentujuće ćelije. Antigen-prezentujuće ćelije uključuju profesionalne antigen-prezentujuće ćelije i ne-profesionalne antigenprezentujuće ćelije.

[0138 ] Glavni tipovi profesionalnih antigen-prezentujućih ćelija su dendritske ćelije, koje imaju najširi raspon prezentacije antigena i verovatno su najvažnije antigen-prezentujuće ćelije, makrofage, B-ćelije i određene aktivirane epitelne ćelije.

[0139 ] Neprofesionalne antigen-prezentujuće ćelije ne eksprimiraju konstitutivno MHC proteine klase II potrebne za interakciju sa nativnim T ćelijama; oni su eksprimirani samo nakon stimulacije ne-profesionalnih antigen-prezentujućih ćelija određenim citokinima kao što je IFN γ.

[0140 ] Dendritske ćelije (DCs) su populacije leukocita koje prezentuju antigene uhvaćene u perifernim tkivima za T-ćelije, preko mehanizama za predstavljanje antigena MHC klasa II i I. Dobro je poznato da su dendritske ćelije moćni induktori imunskih odgovora i aktivacija ovih ćelija je kritičan korak za indukciju antitumorskog imuniteta.

[0141 ] Dendritske ćelije i progenitori mogu biti dobijeni iz periferne krvi, koštane srži, ćelija koje infiltriraju tumor, ćelija koje infiltriraju peritumoralna tkiva, limfnih čvorova, slezine, kože, krvi iz pupčane vrpce ili bilo kojeg drugog pogodnog tkiva ili tečnosti. Na primer, dendritske ćelije mogu biti diferencirane ex vivo dodavanjem kombinacije citokina kao što su GM-CSF, IL-4, IL-13 i / ili TNF α u kulture monocita sakupljenih iz periferne krvi.

Alternativno, CD34 pozitivne ćelije sakupljene iz periferne krvi, krvi pupčane vrpce ili koštane srži mogu biti diferencirane u dendritske ćelije dodavanjem u kulturu medijuma kombinacije od GM-CSF, IL-3, TNF α, CD40 liganda, LPS, flt3 liganda i / ili drugog jedinjenja koje indukuje diferencijaciju, sazrevanje i proliferaciju dendritskih ćelija.

[0142 ] Dendritske ćelije su pogodno kategorisane kao "nezrele" i "zrele" ćelije, koje se mogu koristiti kao jednostavan način za razlikovanje između dva dobro okarakterisana fenotipa. Međutim, ovu nomenklaturu ne treba tumačiti tako da isključuje sve moguće prelazne stadijume diferencijacije.

[0143 ] Nezrele dendritske ćelije su okarakterisane kao ćelije koje prezentuju antigen sa visokim kapacitetom za preuzimanje i obradu antigena, što je u korelaciji sa visokom ekspresijom Fc γ receptora i receptora manoze. Zreli fenotip je tipično karakterisan nižom ekspresijom ovih markera, ali visokom ekspresijom površinskih ćelijskih molekula odgovornih za aktivaciju T ćelija, kao što su MHC klasa I i klasa II, adhezivni molekuli (npr. CD54 i CD11) i kostimulatorni molekuli (npr., CD40, CD80, CD86 i 4-1 BB).

[0144 ] Sazrevanje dendritskih ćelija se naziva statusom aktivacije dendritskih ćelija, pri čemu takve dendritske ćelije koje prezentuju antigen dovode do prajminga T ćelija, dok prezentacija nezrelih dendritskih ćelija dovodi do tolerancije. Sazrevanje dendritskih ćelija je uglavnom uzrokovano biomolekulima sa mikrobnim karakteristikama detektovanim od strane urođenih receptora (bakterijska DNK, virusna RNK, endotoksin, itd.), pro-inflamatornim citokinima (TNF, IL-1, IFNs), ligacijom CD40 na dendritskoj ćelijskoj površini od strane CD40L i supstancama koje se oslobađaju iz ćelija koje prolaze kroz stresnu ćelijsku smrt. Dendritske ćelije mogu biti izvedene kultivacijom ćelija koštane srži in vitro sa citokinima, kao što je granulocitno-makrofagni faktor stimulacije kolonije (GM-CSF) i faktor tumorske nekroze alfa.

[0145 ] Ćelije kao što su ćelije koje predstavljaju antigen ili ciljne ćelije, mogu biti punjene sa prezentovanim peptidima MHC klase I izlaganjem, tj. pulsiranjem, ćelija sa peptidom ili transdukcijom ćelija sa nukleinskom kiselinom, poželjno RNK, koja kodira peptid ili protein koji sadrži peptid koji treba da bude predstavljen, npr nukleinska kiselina koja kodira antigen.

[0146 ] U nekim primerima izvođenja, farmaceutski preparat prema učenju sadrži ćelije koje predstavljaju antigen punjene sa antigenskim peptidom. U tom smislu, protokoli se mogu osloniti na in vitro kulturu / diferencijaciju dendritskih ćelija manipulisanih na takav način da one veštački predstavljaju antigenski peptid. Proizvodnja genetički konstruisanih dendritskih ćelija, može da uključuje uvođenje nukleinskih kiselina koje kodiraju antigene ili antigenske peptide u dendritskim ćelijama. Transfekcija dendritskih ćelija sa iRNK je obećavajuća tehnika punjenja antigena, za stimulisanje jake antitumorske imunosti. Takva transfekcija može da se dešava ex vivo i farmaceutski preparat koji sadrži takve transfektovane ćelije može zatim biti korišćen u terapeutske svrhe. Alternativno, nosač za isporuku gena koji cilja dendritsku ili drugu antigen prezentujuću ćeliju može biti primenjen kod pacijenta, što dovodi do transfekcije koja se javlja in vivo. In vivo i ex vivo transfekcija dendritskih ćelija, na primer, može generalno biti izvedena korišćenjem bilo kojih metoda poznatih u struci, kao što su one opisane u WO 97/24447, ili pristupa genskog pištolja opisanog od strane Mahvi i sar., Imunologija i ćelijska biologija 75: 456-460,1997. Antigensko punjenje dendritskih ćelija može biti postignuto inkubiranjem dendritskih ćelija ili progenitorskih ćelija sa antigenom, DNK (gola ili unutar plazmidskog vektora) ili RNK; ili sa rekombinantnim bakterijama ili virusima koji eksprimiraju antigen (npr. vektori vakcinije, ptičjih boginja, adenovirusa ili lentivirusa).

[0147 ] Izraz "imunogenost" se odnosi na relativnu efikasnost antigena da indukuje imunsku reakciju.

[0148 ] Izraz "imuno efektorne funkcije" u kontekstu sadašnjeg učenja obuhvata sve funkcije posredovane komponentama imunskog sistema koje nastaju, na primer, ubijanjem tumorskih ćelija, ili inhibicijom rasta tumora i / ili inhibicijom razvoja tumora, uključujući inhibiciju diseminacije tumora i metastaza. Poželjno, imuno efektorne funkcije u kontekstu sadašnjeg učenja su efektorne funkcije posredovane T ćelijama. Takve funkcije obuhvataju u slučaju pomoćnih T ćelija (CD4<+>ćelija) prepoznavanje antigena ili antigenskog peptida izvedenog iz antigena u kontekstu MHC molekula klase II od strane T ćelijskih receptora, oslobađanje citokina i / ili aktiviranje CD8<+>limfocita (CTLs) i / ili B-ćelija i u slučaju CTL, prepoznavanje antigena ili antigenskog peptida izvedenog iz antigena u kontekstu MHC klase I molekula pomoću T ćelijskih receptora, eliminaciju ćelija predstavljenih u kontekstu MHC molekula klase I, tj., ćelija karakterisanih predstavljanjem antigena sa klasom I MHC, na primer, putem apoptoze ili perforin-posredovane ćelijske lize, produkciju citokina kao što je IFN- γ i TNF- α i specifično citolitičko ubijanje ciljnih ćelija koje eksprimiraju antigen.

[0149 ] Izraz "imunoreaktivna ćelija" ili "imuno efektorna ćelija" u kontekstu sadašnjeg učenja se odnosi na ćeliju koja vrši efektorne funkcije tokom imuno reakcije. "Imunoreaktivna ćelija" poželjno je sposobna za vezivanje antigena, kao što je antigen koji je eksprimiran na površini ćelije ili ćelije karakterisane predstavljanjem antigena ili antigenskog peptida izvedenog iz antigena i koja posreduje imunski odgovor. Na primer, takve ćelije luče citokine i / ili hemokine, ubijaju mikrobe, sekretuju antitela, prepoznaju inficirane ili kancerozne ćelije i opciono eliminišu takve ćelije. Na primer, imunoreaktivne ćelije sadrže T ćelije (citotoksične T ćelije, pomoćne T ćelije, T ćelije koje infiltriraju tumor), B ćelije, prirodne ćelije ubice, neutrofile, makrofage i dendritske ćelije. Poželjno, u kontekstu sadašnjeg učenja, "imunoreaktivne ćelije" su T ćelije, poželjno CD4<+>i / ili CD8<+>T ćelije.

[0150 ] Poželjno, izvesna "imunoreaktivna ćelija" prepoznaje antigen ili antigenski peptid izveden iz antigena sa određenim stepenom specifičnosti, posebno ako je predstavljen u kontekstu MHC molekula, kao što je na površini ćelija koje predstavljaju antigen ili obolelih ćelija kao što su ćelije raka. Poželjno, pomenuto prepoznavanje omogućava ćeliji koja prepoznaje antigen ili antigenski peptid izveden od pomenutog antigena da odgovori ili reaguje. Ako je ćelija pomoćna T-ćelija (CD4<+>T ćelija) koja nosi receptore koji prepoznaju antigen ili antigenski peptid izveden iz antigena u kontekstu MHC molekula klase II, takva reakcija ili reaktivnost može da uključuje oslobađanje citokina i / ili ili aktiviranje CD8<+>limfocita (CTLs) i / ili B-ćelija. Ako je ćelija CTL takav odgovor ili reaktivnost može uključivati eliminaciju ćelija predstavljenih u kontekstu MHC molekula klase I, tj. ćelija karakterisanih predstavljanjem antigena sa klasom I MHC, na primer, preko apoptoze ili perforin-posredovane ćelijske lize. U skladu sa učenjem, CTL reakcija može uključivati ustaljeni fluks kalcijuma, deljenje ćelija, proizvodnju citokina kao što su IFN- γ i TNF- α, ushodnu regulaciju markera za aktivaciju, kao što su CD44 i CD69 i specifično citolitičko ubijanje ciljnih ćelija koje eksprimiraju antigen. CTL reaktivnost takođe, može biti određena korišćenjem veštačkog reportera koji tačno ukazuje na CTL osetljivost. Takvi CTL koji prepoznaju antigen ili antigenski peptid izveden iz antigena i koji su odgovorni ili reaktivni, ovde se takođe nazivaju "CTL koji reaguje na antigen". Ako je ćelija B ćelija, takva reakcija može uključivati oslobađanje imunoglobulina.

[0151 ] Prema učenju, izraz "imunoreaktivna ćelija" takođe obuhvata ćeliju koja može da sazri u imunsku ćeliju (kao što je T ćelija, posebno T pomoćna ćelija ili citolitička T ćelija) sa pogodnom stimulacijom. Imunoreaktivne ćelije obuhvataju CD34<+>hematopoetske matične ćelije, nezrele i zrele T ćelije i nezrele i zrele B ćelije. Ako je poželjna proizvodnja citolitičkih ili T pomoćnih ćelija koje prepoznaju antigen, imunoreaktivna ćelija se dovodi u kontakt sa ćelijom koja predstavlja antigen ili antigenski peptid pod uslovima koji pogoduju produkciji, diferencijaciji i / ili selekciji citolitičkih T ćelija i T pomoćnih ćelija. Diferencijacija prekursora T ćelija u citolitičku T ćeliju, kada je izložena antigenu, slična je klonskoj selekciji imunskog sistema.

[0152 ] "Limfoidna ćelija" je ćelija koja, opciono nakon odgovarajuće modifikacije, npr., nakon prenosa T ćelijskog receptora, je sposobna da proizvodi imunski odgovor, kao što je ćelijski imunski odgovor, ili prekursorska ćelija takve ćelije i uključuje limfocite, poželjno T limfocite, limfoblaste i plazma ćelije. Limfoidna ćelija može biti imunoreaktivna ćelija, kao što je ovde opisano. Poželjna limfoidna ćelija je T ćelija kojoj nedostaje endogena ekspresija T ćelijskog receptora i koja može biti modifikovana da eksprimira takav T ćelijski receptor na površini ćelije.

[0153 ] Izrazi "T ćelije" i "T limfociti" se ovde koriste naizmenično i uključuju T pomoćne ćelije (CD4+ T ćelije) i citotoksične T ćelije (CTL, CD8+ T ćelije) koje sadrže citolitičke T ćelije.

[0154 ] T ćelije pripadaju grupi belih krvnih zrnaca poznatih kao limfociti i igraju centralnu ulogu u ćelijski posredovanom imunitetu. Oni se mogu razlikovati od drugih tipova limfocita, kao što su B ćelije i prirodne ćelije ubice, prisustvom posebnog receptora na njihovoj površini ćelije koji se naziva T ćelijski receptor (TCR). Timus je glavni organ odgovoran za sazrevanje T ćelija iz T ćelija. Otkriveno je nekoliko različitih podgrupa T ćelija, svaka sa posebnom funkcijom.

[0155 ] T pomoćne ćelije pomažu drugim belim krvnim zrncima u imunološkim procesima, uključujući sazrevanje B ćelija u plazma ćelijama i aktiviranje citotoksičnih T ćelija i makrofaga, između ostalih funkcija. Ove ćelije su takođe poznate kao CD4+ T ćelije jer one eksprimiraju CD4 protein na njihovoj površini. T pomoćne ćelije postaju aktivne kada su predstavljene sa peptidnim antigenima pomoću MHC molekula klase II koji su eksprimirani na površini ćelija koje prezentuju antigen (APC). Jednom aktivirani, oni se brzo dele i sekretuju male proteine koji se nazivaju citokini koji regulišu ili pomažu aktivni imunski odgovor.

[0156 ] Citotoksične T ćelije uništavaju virusno inficirane ćelije i tumorske ćelije, a takođe su uključene u odbacivanju transplantata. Ove ćelije su takođe poznate kao CD8+ T ćelije pošto eksprimiraju CD8 glikoprotein na njihovoj površini. Ove ćelije prepoznaju njihove ciljeve vezivanjem za antigen povezan sa MHC klasom I, koji je prisutan na površini skoro svake ćelije tela.

[0157 ] Većina T ćelija ima T ćelijski receptor (TCR) koji postoji kao kompleks nekoliko proteina. Aktuelni T ćelijski receptor je sastavljen od dva odvojena peptidna lanca, koji su proizvedeni iz nezavisnih T-ćelijskih receptorskih alfa i beta (TCR α i TCR β) gena i nazivaju se α- i β- TCR lancima. γδ T ćelije (gama delta T ćelije) predstavljaju malu podgrupu T ćelija koje poseduju poseban T ćelijski receptor (TCR) na njihovoj površini. Međutim, u γδ T ćelijama, TCR je napravljen od jednog γ-lanca i jednog δ-lanca. Ova grupa T ćelija je mnogo ređa (2% od ukupnih T ćelija) nego αβ T ćelije.

[0158 ] Struktura T ćelijskog receptora je vrlo slična imunoglobulinskim Fab fragmentima, koji su regioni definisani kao kombinovani laki i teški lanac kraka antitela. Svaki lanac TCR-a je član superfamilije imunoglobulina i poseduje jedan N-terminalni imunoglobulinski (Ig)-varijabilni (V) domen, jedan Ig-konstantni (C) domen, jedan region za obuhvatanje transmembranske / ćelijske membrane i kratak citoplazmatski rep na C-terminalnom kraju.

[0159 ] Prema učenju, izraz "varijabilni region T ćelijskog receptora" se odnosi na varijabilne domene TCR lanaca.

[0160 ] Varijabilni region oba TCR α-lanca i β-lanca ima tri hipervarijabilna ili regiona za određivanje komplementarnosti (CDR), dok varijabilni region β-lanca ima dodatno područje hipervarijabilnosti (HV4) koje normalno ne kontaktira antigen i stoga se ne smatra CDR-om. CDR3 je glavni CDR koji je odgovoran za prepoznavanje obrađenog antigena, iako je za CDR1 α-lanca takođe pokazano da stupa u interakciju sa N-terminalnim delom antigenskog peptida, dok CDR1 β-lanca stupa u interakciju sa C-terminalnim delom peptida. Smatra se da CDR2 prepoznaje MHC. Smatra se da CDR4 β-lanca ne učestvuje u prepoznavanju antigena, ali se pokazalo da stupa u interakciju sa superantigenima.

[0161 ] Prema učenju, izraz "najmanje jedna od CDR sekvenci" poželjno označava najmanje CDR3 sekvencu. Izraz "CDR sekvence lanca T ćelijskog receptora" poželjno se odnose na CDR1, CDR2 i CDR3 od α-lanca ili β-lanca T ćelijskog receptora.

[0162 ] Konstantni domen TCR domena sastoji se od kratkih vezivnih sekvenci u kojima cisteinski ostatak formira disulfidne veze, koje formiraju vezu između dva lanca.

[0163 ] Sve T ćelije potiču od hematopoetskih matičnih ćelija u koštanoj srži. Hematopoetski progenitori izvedeni iz hematopoetskih matičnih ćelija naseljavaju timus i proširuju se ćelijskom podelom kako bi generisali veliku populaciju nezrelih timocita. Najraniji timociti ne eksprimiraju ni CD4 ni CD8, pa su stoga klasifikovane kao dvostruko negativne (CD4- CD8-) ćelije. Kako napreduju njihovim razvojem, oni postaju dvostruko pozitivni timociti (CD4+ CD8+), i na kraju sazrevaju u jedno-pozitivne (CD4+CD8- ili CD4-CD8+) timocite koji se zatim oslobađaju iz timusa u periferna tkiva.

[0164 ] Prvi signal u aktivaciji T ćelija je obezbeđen vezivanjem T ćelijskog receptora za jedan kratki peptid predstavljen pomoću glavnog kompleksa histokompatibilnosti (MHC) na drugoj ćeliji. Ovo osigurava da je aktivirana samo T-ćelija sa TCR-om specifičnim za taj peptid. Partnerska ćelija je obično profesionalna ćelija za predstavljanje antigena (APC), obično dendritska ćelija u slučaju nativnog odgovora, iako B ćelije i makrofagi mogu biti važne APC. Peptidi predstavljeni na CD8+ T ćelijama pomoću molekula MHC klase I su dužine 8-10 aminokiselina; peptidi predstavljeni na CD4+ T ćelijama pomoću MHC molekula klase II su duži, pošto su krajevi vezivnog rascepa MHC molekula klase II otvoreni.

[0165 ] T ćelije generalno, mogu biti pripremljene in vitro ili ex vivo, korišćenjem standardnih procedura. Na primer, T ćelije mogu biti prisutne unutar (ili izolovane iz) koštane srži, periferne krvi ili frakcije koštane srži ili periferne krvi sisara, kao što je pacijent, koristeći komercijalno dostupan sistem za razdvajanje ćelija. Alternativno, T ćelije mogu biti izvedene iz srodnih ili nepovezanih ljudi, ne-humanih životinja, ćelijskih linija ili kultura. "Uzorak koji sadrži T ćelije" mogu, na primer, biti mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC).

[0166 ] T ćelije mogu biti stimulisane sa antigenom, peptidom, nukleinskom kiselinom i / ili ćelijama koje predstavljaju antigen (APC) koje eksprimiraju antigen. Takva stimulacija je izvedena pod uslovima i za vreme koje je dovoljno da se omogući generisanje T ćelija koje su specifične za izvesni antigen, peptid i / ili ćelije koje predstavljaju antigen ili peptid.

[0167 ] Specifična aktivacija CD4+ ili CD8+ T ćelija može biti detektovana na različite načine. Postupci za detekciju specifične aktivacije T ćelija, uključuju detekciju proliferacije T ćelija, proizvodnju citokina (npr. limfokina) ili generisanje citolitičke aktivnosti. Za CD4+ T ćelije, poželjan postupak za detekciju specifične T ćelijske aktivacije je detekcija proliferacije T ćelija. Za CD8+ T ćelije, poželjan postupak za detekciju specifične T ćelijske aktivacije je detekcija generisanja citolitičke aktivnosti.

[0168 ] Da bi se generisale CD8+ T ćelijske linije, antigen-prezentujuće ćelije, poželjno autologne antigen-prezentujuće ćelije, transfektovane sa nukleinskom kiselinom koja proizvodi antigen, mogu biti korišćene kao stimulatorne ćelije.

[0169 ] Nukleinske kiseline kao što su lanci T ćelijskog receptora koji kodiraju RNK (TCR), mogu biti uvedeni u limfoidne ćelije kao što su T ćelije ili druge ćelije sa litičkim potencijalom. U pogodnom izvođenju, TCR α- i β-lanci su klonirani iz antigen-specifične T ćelijske linije i upotrebljeni za adaptivnu T-ćelijsku terapiju. U ovom pogledu, sadašnje učenje obezbeđuje T ćelijske receptore specifične za CLDN6 ili CLDN6 peptide, ovde opisane. Uopšteno, ovaj aspekt sadašnjeg učenja se odnosi na T ćelijske receptore koji prepoznaju ili vezuju CLDN6 peptide predstavljene u kontekstu MHC. Nukleinske kiseline koje kodiraju α- i β-lance T ćelijskog receptora, npr. jednog T ćelijskog receptora obezbeđenog prema sadašnjem učenju, mogu biti sadržane na odvojenim molekulima nukleinske kiseline, kao što su ekspresioni vektori ili alternativno, na jednom molekulu nukleinske kiseline. Prema tome, izraz "nukleinska kiselina koja kodira T ćelijski receptor" ili slični izrazi se odnose na molekule nukleinske kiseline koji kodiraju lance T ćelijskog receptora na istom ili poželjno na različitim molekulima nukleinske kiseline.

[0170 ] Izraz "imunoreaktivna ćelija reaktivna sa peptidom" se odnosi na imunoreaktivnu ćeliju koja kada prepozna peptida, posebno ako je predstavljen u kontekstu MHC molekula, kao što je na površini ćelija koje predstavljaju antigen ili obolelih ćelija, kao što su ćelije raka, ispoljava efektorne funkcije imunoreaktivnih ćelija, kao što je gore opisano.

[0171 ] Izraz "T-ćelijski receptor reaktivan sa peptidom" odnosi se na T-ćelijski receptor koji, kada je prisutan na imunoreaktivnoj ćeliji, prepoznaje peptid, posebno ako je predstavljen u kontekstu MHC molekula, kao što je na površini ćelija koje predstavljaju antigen ili obolelih ćelija kao što su ćelije raka, tako da imunoreaktivna ćelija ispoljave efektorne funkcije imunoreaktivnih ćelija, kao što je gore opisano.

[0172 ] Izraz "antigen-reaktivna T ćelija" ili slični izrazi se odnose na T-ćeliju koja prepoznaje izvesnog antigena, ako je predstavljen u kontekstu MHC molekula, kao što je na površini ćelija koje predstavljaju antigen ili obolelih ćelija, kao što su ćelije raka i ispoljava efektorske funkcije T ćelije, kao što je gore opisano.

[0173 ] Izraz "antigen-specifična limfoidna ćelija" se odnosi na limfoidnu ćeliju koja, posebno kada je obezbeđena sa antigen-specifičnim T ćelijskim receptorom, prepoznaje antigen ako je predstavljen u kontekstu MHC molekula, kao što je na površini ćelija koje predstavljaju antigen ili obolelih ćelija, kao što su ćelije raka i poželjno ispoljava efektorske funkcije T ćelija, kao što je gore opisano. Smatra se da su T ćelije i druge limfoidne ćelije specifične za antigen ako ćelije ubijaju ciljne ćelije koje eksprimiraju antigen i / ili predstavljaju antigenski peptid. Specifičnost T ćelija može biti procenjena korišćenjem bilo kog niza standardnih tehnika, na primer, u testu oslobađanja hroma ili testu proliferacije. Alternativno, može biti izmerena sinteza limfokina (kao što je interferon-γ).

[0174 ] Izraz "glavni kompleks histokompatibilnosti" i skraćenica "MHC" uključuje MHC klasu I i MHC klasu II molekula i odnosi se na kompleks gena koji se javlja kod svih kičmenjaka. MHC proteini ili molekuli su važni za signalizaciju između limfocita i ćelija koje predstavljaju antigen ili obolelih ćelija u imunskim reakcijama, pri čemu MHC proteini ili molekuli vezuju peptide i predstavljaju ih za prepoznavanje od strane T ćelijskih receptora. Proteini kodirani od strane MHC su eksprimirani na površini ćelija i prikazuju i sopstvene antigene (peptidne fragmente iz same ćelije) i antigene koji nisu sopstveni (npr. fragmente invazivnih mikroorganizama) u T ćeliji.

[0175 ] Region MHC je podeljen u tri podgrupe, klasu I, klasu II i klasi III. Proteini MHC klase I sadrže α-lanac i β2-mikroglobulin (nije deo MHC-a kodiranog od strane hromozoma 15). Oni predstavljaju fragmente antigena za citotoksične T ćelije. Na većini ćelija imunskog sistema, specifično na ćelijama koje predstavljaju antigen, proteini MHC klase II sadrže α- i β-lance i oni predstavljaju fragmente antigena za T-pomoćne ćelije. Region MHC klase III kodira za druge imunske komponente, kao što su komplementarne komponente i neke koje kodiraju citokine.

[0176 ] Kod ljudi, geni u MHC regionu koji kodiraju proteine koji prezentuju antigen na površini ćelije se nazivaju genima humanog leukocitnog antigena (HLA). Međutim, skraćenica MHC se često koristi za označavanje HLA genskih proizvoda. HLA geni uključuju devet takozvanih klasičnih MHC gena: HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DPA1, HLA-DPB1, HLA-DQA1, HLA-DQB1, HLA-DRA i HLA-DRB1.

[0177 ] U jednoj poželjnom primeru izvođenja svih aspekata prema učenju, MHC molekul je HLA molekul.

[0178 ] Pod "ćelijom karakterisanom pomoću predstavljanja antigena", "ćelijom koja prezentuje antigen", "antigenom prezentovanim od strane ćelije", "prezentovanim antigenom" ili sličnim izrazima podrazumeva se ćelija, kao što je obolela ćelija, kao što je ćelija raka, ili antigen prezentujuća ćelija koja predstavlja antigena koji eksprimira ili fragment izveden od navedenog antigena, npr obradom antigena, u kontekstu MHC molekula, posebno MHC klase I molekula. Slično tome, izrazi "bolest karakterisana predstavljanjem antigena" označava bolest koja uključuje ćelije karakterisane predstavljanjem antigena, naročito sa klasom I MHC. Prezentacija antigena od strane ćelije može se izvršiti transfekcijom ćelije sa nukleinskom kiselinom, kao što je RNK koja kodira antigen.

[0179 ] Pod "fragmentom antigena koji je predstavljen" ili sličnim izrazima misli se da fragment može biti predstavljen pomoću MHC klase I ili klase II, poželjno MHC klase I, npr. kada se dodaju direktno u ćelije koje predstavljaju antigen. U jednom primeru izvođenja, fragment je fragment koji je prirodno predstavljen od strane ćelija koje eksprimiraju antigen.

[0180 ] Neke terapijske metode se zasnivaju na reakciji imunskog sistema pacijenta, što rezultira lizom obolelih ćelija koje predstavljaju antigena sa klasom I MHC. U vezi sa tim, na primer, autologni citotoksični T limfociti specifični za kompleks antigenskog peptida i MHC molekula, mogu biti primenjivani kod obolelog pacijenta. Poznata je in vitro proizvodnja takvih citotoksičnih T limfocita. Primer metode za diferencijaciju T ćelija se može naći u WO-A-9633265. Generalno, uzorak koji sadrži ćelije, kao što su krvne ćelije se uzima od pacijenta i ćelije se dovode u kontakt sa ćelijom koja predstavlja kompleks i koji može izazvati propagaciju citotoksičnih T limfocita (npr. dendritske ćelije). Ciljna ćelija može biti transfektovana ćelija, kao što je COS ćelija. Ove transfektovane ćelije predstavljaju željeni kompleks na njihovoj površini i kada su u kontaktu sa citotoksičnim T limfocitima, stimulišu širenje potonjih. Klonalno ekspandirani autologni citotoksični T limfociti se zatim daju pacijentu.

[0181 ] U drugom postupku za selektovanje citotoksičnih T limfocita, fluorogenski tetrameri MHC molekula klase I / peptidnih kompleksa su korišćeni za dobijanje specifičnih klonova citotoksičnih T limfocita (Altman i sar., (1996), Science 274: 94-96; Dunbar i sar., (1998), Curr. Biol.8:413-416, 1998).

[0182 ] Osim toga, ćelije koje predstavljaju željeni kompleks (npr. dendritske ćelije), mogu biti kombinovane sa citotoksičnim T limfocitima zdravih pojedinaca ili drugih vrsta (npr. miša) koje mogu rezultirati proliferacijom specifičnih citotoksičnih T limfocita sa visokim afinitetom. Visoko afinitetni T ćelijski receptor ovih specifičnih T limfocita koji se razmnožavaju, može biti kloniran i opciono humanizovan u različitoj meri, i tako dobijeni T ćelijski receptori su transdukovani preko transfera gena, na primer upotrebom retrovirusnih vektora, u T ćelije pacijenata. Adoptivni transfer se zatim može izvesti korišćenjem ovih genetski izmenjenih T limfocita (Stanislawski i sar., (2001), Nat Immunol. 2:962-70; Kessels i sar. (2001), Nat Immunol. 2:957-61.

[0183 ] Citotoksični T limfociti, mogu takođe biti generisani in vivo načinom koji je poznat za sebe. Jedan metod koristi neproliferativne ćelije koje eksprimiraju kompleks MHC klase I / peptida. Ćelije koje se ovde koriste će biti one koje obično eksprimiraju kompleks, kao što su ozračene tumorske ćelije ili ćelije transfektovane sa jednim ili oba gena neophodna za predstavljanje kompleksa (tj. antigenski peptid i predstavljeni MHC molekul). Drugi poželjni oblik je uvođenje antigena u obliku rekombinantne RNK, koja može biti uvedena u ćelije liposomskim prenosom ili elektroporacijom, na primer. Dobijene ćelije predstavljaju kompleks od interesa i prepoznate su od strane autolognih citotoksičnih T limfocita koji se zatim razmnožavaju.

[0184 ] Sličan efekat se može postići kombinovanjem antigena ili antigenskog peptida sa adjuvansom kako bi se omogućilo inkorporiranje u ćelije koje predstavljaju antigen in vivo. Antigen ili peptid antigena, može biti predstavljen kao protein, kao DNK (npr. unutar vektora) ili kao RNK. Antigen se može obraditi da se dobije peptidni partner za MHC molekul, dok se njegov fragment može predstaviti bez potrebe za daljom obradom. Potonji je slučaj posebno, ako se ovi mogu vezati za MHC molekule. Prednost se daje oblicima primene u kojima se kompletan antigen obrađuje in vivo pomoću dendritske ćelije, jer to može takođe da proizvede odgovore T pomoćnih ćelija koje su potrebne za efikasan imunski odgovor (Ossendorp i sar., Immunol Lett. (2000), 74: 75-9; Ossendorp i sar., (1998), J. Exp. Med. 187:693-702. Generalno, moguće je na primer, dati pacijentu efikasnu količinu antigena povezanog sa tumorom intradermalnom injekcijom. Međutim, injekcija se takođe može izvesti intranodalno u limfni čvor (Maloy i sar., 2001), Proc Natl Acad Sci USA 95: 3299-303).

[0185 ] Prema učenju izraz "veštački T ćelijski receptor" je sinonim za izraze "himerni T ćelijski receptor" i "himerni antigenski receptor (CAR)".

[0186 ] Ovi izrazi se odnose na konstruisane receptore, koji daju proizvoljnu specifičnost, kao što je specifičnost monoklonskog antitela ka imuno efektornoj ćeliji, kao što je T ćelija. Na ovaj način, može biti generisan veliki broj T-limfocita specifičnih za rak, za adoptivni transfer ćelija. Stoga, veštački T ćelijski receptor može biti prisutan na T ćelijama, npr. umesto ili pored sopstvenog T ćelijskog receptora T ćelija. Takve T ćelije ne moraju nužno da zahtevaju obradu i prezentaciju antigena za prepoznavanje ciljne ćelije, već pre mogu da prepoznaju specifičnost bilo kog antigena prisutnog na ciljnoj ćeliji. Poželjno je da je pomenuti veštački T ćelijski receptor eksprimiran na površini ćelija. U svrhu sadašnjeg učenja T ćelije koje sadrže veštački T ćelijski receptor su obuhvaćene izrazom "T ćelije", kako je ovde korišćeno.

[0187 ] U jednom izvođenju, varijabilni fragment pojedinačnog lanca (scFv) izveden iz monoklonskog antitela je fuzionisan za CD3-zeta transmembranu i endodomen. Takvi molekuli rezultiraju u prenosu zeta signala kao odgovor na prepoznavanje od strane scFv-a njegovog antigenskog cilja na ciljnoj ćeliji i ubijanje ciljne ćelije koja eksprimira ciljni antigen. Domeni za prepoznavanje antigena koji se takođe mogu koristiti, uključuju između ostalih T-ćelijske receptorske (TCR) alfa i beta jednostruke lance. U stvari, gotovo sve što vezuje određeni cilj sa visokim afinitetom može se koristiti kao domen za prepoznavanje antigena.

[0188 ] Nakon prepoznavanja antigena, receptori se nagomilavaju i signal se prenosi u ćeliju. U ovom pogledu, "T ćelijski domen za signalizaciju" je domen, poželjno endodomen, koji prenosi aktivacioni signal T ćelijama nakon vezivanja antigena. Najčešće korišćena endodomenska komponenta je CD3-zeta.

[0189 ] Adoptivna ćelijska transfer terapija sa CAR-konstruisanim T-ćelijama koje eksprimiraju himerne antigenske receptore je obećavajući anti-karcinomski terapeutik, kao što su CAR-modifikovane T ćelije, mogu biti projektovane tako da ciljaju zapravo bilo koji tumorski antigen. Na primer, pacijentove T ćelije mogu biti genetski konstruisane tako da eksprimiraju CAR specifično usmerene ka antigenima na tumorskim ćelijama pacijenta, a zatim infuzionisane nazad u pacijenta.

[0190 ] Prema učenju, veštački T ćelijski receptor može da zameni funkciju T ćelijskog receptora, kao što je gore opisano i naročito, može da prenese reaktivnost, kao što je citolitička aktivnost na ćeliju, kao što je T ćelija, kao što je gore opisano. Međutim, za razliku od vezivanja T ćelijskog receptora za antigenski peptid-MHC kompleks, kao što je gore opisano, veštački T-receptor može da se veže za antigen, posebno eksprimiran na površini ćelije.

[0191 ] T-ćelijski površinski glikoproteinski CD3-zeta lanac je protein koji je kod ljudi kodiran od strane gena CD247. CD3-zeta zajedno sa T-ćelijskim receptorom alfa / beta i gama / delta heterodimerima i CD3-gama, -delta i -epsilon, obrazuju T-ćelijski receptor-CD3 kompleks. Zeta lanac igra važnu ulogu u povezivanju antigenskog prepoznavanja sa nekoliko mehanizama intracelularne transdukcije signala. Izraz "CD3-zeta" poželjno se odnosi na humani CD3-zeta, a posebno, na protein koji sadrži, poželjno se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 45 iz liste sekvenci ili varijante pomenute aminokiselinske sekvence.

[0192 ] CD28 (klaster diferencijacije 28) je jedan od molekula eksprimiranih na T ćelijama koji obezbeđuju ko-stimulativne signale, koji su potrebni za aktivaciju T ćelija. CD28 je receptor za CD80 (B7.1) i CD86 (B7.2). Stimulacija preko CD28 pored receptora T ćelija (TCR) može obezbediti snažan ko-stimulativni signal za T ćelije, za proizvodnju različitih interleukina (posebno IL-6). Izraz "CD28" se poželjno odnosi na humani CD28, a naročito na protein koji sadrži, poželjno se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 44 iz listinga sekvenci ili varijante pomenute aminokiselinske sekvence.

[0193 ] U skladu sa učenjem, CAR-i mogu generalno da sadrže tri domena.

[0194 ] Prvi domen je vezujući domen koji prepoznaje i vezuje CLDN6.

[0195 ] Drugi domen je domen ko-stimulacije. Domen za ko-stimulaciju služi da poboljša proliferaciju i preživljavanje citotoksičnih limfocita nakon vezivanja CAR za ciljanu grupu. Identitet domena ko-stimulacije je ograničen samo po tome što ima sposobnost da poboljša ćelijsku proliferaciju i preživljavanje nakon vezivanja ciljane grupe od strane CAR.

[0196 ] Pogodni ko-stimulacioni domeni uključuju CD28, CD137 (4-1 BB), člana familije receptora faktora nekroze tumora (TNF), CD134 (OX40), člana TNFR superfamilije receptora i CD278 (ICOS), CD28-superfamilije ko-stimulativnog molekula eksprimiranog na aktiviranim T ćelijama. Stručnjak će razumeti da se varijante sekvenci ovih pomenutih domena ko-stimulacije mogu koristiti bez negativnog uticaja na učenje, gde varijante imaju istu ili sličnu aktivnost kao domen na kome su modelovane. Takve varijante će imati najmanje oko 80% identičnosti sekvence prema aminokiselinskoj sekvenci domena iz koga su izvedene. U nekim primerima izvođenja ovog učenja, CAR konstrukti sadrže dva domena ko-stimulacije. Dok posebne kombinacije obuhvataju sve moguće varijacije četiri navedena domena, specifični primeri uključuju CD28 CD137 (4-1 BB) i CD28 CD134 (OX40).

[0197 ] Treći domen je aktivacioni signalni domen (ili T ćelijski signalni domen). Aktivacioni signalni domen služi za aktiviranje citotoksičnih limfocita nakon vezivanja CAR za CLDN6. Identitet domena za signalizaciju aktivacije je ograničen samo po tome što ima sposobnost da indukuje aktivaciju odabranog citotoksičnog limfocita nakon vezivanja CLDN6 od strane CAR. Pogodni signalizacioni domeni za aktivaciju, uključuju T-ćelijski CD3 [zeta ] lanac i Fc receptor [gama ]. Stručnjak će razumeti da se varijante sekvenci ovih pomenutih domena za signalizaciju aktivacije, mogu koristiti bez negativnog uticaja na učenje, gde varijante imaju istu ili sličnu aktivnost kao domen na kome su modelovane. Takve varijante će imati najmanje oko 80% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom od domena iz kojeg su izvedeni.

[0198 ] CAR-ovi iz predmetnog učenja mogu da sadrže tri domena, zajedno u obliku fuzionog proteina. Takvi fuzioni proteini će generalno sadržati vezujući domen, jedan ili više kostimulacionih domena i aktivacioni signalni domen, povezan u N-terminalnom do C-terminalnom pravcu. Međutim, CAR iz predmetnog učenja nisu ograničeni na ovaj aranžman i drugi aranžmani su prihvatljivi i uključuju vezujući domen, domen za signalizaciju aktivacije i jedan ili više domena ko-stimulacije. Podrazumeva se da, pošto domen za vezivanje mora biti slobodan za vezivanje CLDN6, postavljane vezujućeg domena u fuzionom proteinu će generalno biti takvo da se postiže prikaz regiona na spoljašnjoj strani ćelije. Na isti način, pošto ko-stimulacioni i aktivacioni signalni domeni služe da indukuju aktivnost i proliferaciju citotoksičnih limfocita, fuzioni protein će generalno prikazati ova dva domena u unutrašnjosti ćelije. CAR-ovi mogu uključivati dodatne elemente, kao što je signalni peptid da osiguraju pravilan izvoz fuzionog proteina na površinu ćelija, transmembranski domen kako bi se osiguralo da se fuzioni protein održava kao integralni membranski protein i zglobni domen (ili region razdvajanja) koji daje fleksibilnost domenu vezivanja i omogućava snažno vezivanje za CLDN6.

[0199] Ćelije korišćene u vezi sa CAR sistemom prema sadašnjem učenju su poželjno T ćelije, posebno citotoksični limfociti, poželjno izabrani od citotoksičnih T ćelija, prirodnih ćelija ubica (NK) i ćelija ubica aktiviranih sa limfokinom (LAK). Nakon aktivacije, svaki od ovih citotoksičnih limfocita aktivira uništavanje ciljnih ćelija. Na primer, citotoksične T ćelije pokreću uništavanje ciljnih ćelija pomoću jednog ili oba od sledećih sredstava. Prvo, nakon aktivacije T ćelije oslobađaju citotoksine, kao što su perforin, granzimi i granulizin. Perforin i granulizin stvaraju pore u ciljnoj ćeliji, a granzimi ulaze u ćeliju i aktiviraju kaskadu kaspaze u citoplazmi koja indukuje apoptozu (programiranu ćelijsku smrt) ćelije. Drugo, apoptoza može biti indukovana preko Fas-Fas ligand interakcije između T ćelija i ciljnih tumorskih ćelija. Citotoksični limfociti će poželjno biti autologne ćelije, mada se mogu koristiti heterologne ćelije ili alogenske ćelije.

[0200] Prema učenju, "referenca" kao što je referentni uzorak ili referentni organizam može biti korišćen za korelaciju i upoređivanje rezultata dobijenih u metodama prema učenju iz ispitivanog uzorka ili ispitivanog organizma. Obično je referentni organizam zdrav organizam, posebno organizam koji ne pati od bolesti, kao što je bolest raka. "Referentna vrednost" ili "referentni nivo" može biti određen iz reference empirijski, merenjem dovoljno velikog broja referenci. Poželjno, referentna vrednost je određena merenjem najmanje 2, poželjno najmanje 3, poželjno najmanje 5, poželjno najmanje 8, poželjno najmanje 12, poželjno najmanje 20, poželjno najmanje 30, poželjno najmanje 50 ili poželjno najmanje 100 referenci.

[0201] Prema učenju, izraz "vezivno sredstvo" uključuje bilo koje jedinjenje koje ima kapacitet vezivanja za cilj. Poželjno, takvo vezivno sredstvo sadrži najmanje jedan vezivni domen za cilj. Izraz uključuje molekule, kao što su antitela i fragmenti antitela, bispecifične ili multispecifične molekule, himerne antigenske receptore (CARs) i sve veštačke vezivne molekule (skele) koji imaju kapacitet vezivanja za cilj, uključujući, ali ne ograničavajući se na nanotela, afinitetna antitela, antikaline, DARPine, monotela, avimere i mikrotela. U jednom primeru izvođenja, pomenuto vezivanje je specifično vezivanje.

[0202] Izraz "imunoglobulin" se odnosi na proteine superfamilije imunoglobulina, poželjno na antigenske receptore, kao što su antitela ili B ćelijski receptor (BCR). Imunoglobulini su karakterisani strukturnim domenom, tj. domenom imunoglobulina, koji ima karakterističan imunoglobulinski (Ig) prevoj. Izraz obuhvata membranski vezane imunoglobuline, kao i rastvorljive imunoglobuline. Imunoglobulini vezani za membranu se takođe nazivaju površinski imunoglobulini ili membranski imunoglobulini, koji su generalno deo BCR. Rastvorljivi imunoglobulini se generalno nazivaju antitelima. Imunoglobulini obično sadrže nekoliko lanaca, tipično dva identična teška lanca i dva identična laka lanca koji su povezani preko disulfidnih veza. Ovi lanci su primarno sastavljeni od domena imunoglobulina, kao što su VLdomen (varijabilnog lakog lanca), CLdomen (konstantnog lakog lanca) i CHdomeni (konstantnog teškog lanca) CH1, CH2, CH3 i CH4. Postoji pet tipova imunoglobulinskih teških lanaca sisara, tj., α, δ, ε, γ i μ, koji su odgovorni za različite klase antitela, tj. IgA, IgD, IgE, IgG i IgM. Za razliku od teških lanaca rastvorljivih imunoglobulina, teški lanci membranskih ili površinskih imunoglobulina sadrže transmembranski domen i kratak citoplazmatski domen na njihovom karboksi-završetku. Kod sisara postoje dva tipa lakih lanaca, tj. lambda i kapa. Imunoglobulinski lanci obuhvataju varijabilni region i konstantni region. Konstantni region je u suštini konzerviran u okviru različitih izotipova imunoglobulina, pri čemu je varijabilni deo veoma raznolik i odgovoran za prepoznavanje antigena.

[0203] Izraz "antitelo" se odnosi na glikoprotein koji sadrži najmanje dva teška (H) lanca i dva laka (L) lanca međusobno povezana disulfidnim vezama. Izraz "antitelo" uključuje monoklonska antitela, rekombinantna antitela, humana antitela, humanizovana antitela i himerna antitela. Svaki teški lanac se sastoji od varijabilnog regiona teškog lanca (ovde skraćeno kao VH) i konstantnog regiona teškog lanca. Svaki laki lanac se sastoji od varijabilnog regiona lakog lanca (ovde skraćeno kao VL) i konstantnog regiona lakog lanca. VH i VL regioni mogu biti dalje podeljeni na regione hipervarijabilnosti, koji se nazivaju regionima za određivanje komplementarnosti (CDR), rasutim sa regionima koji su više konzervirani, nazvani okvirnim regionima (FR). Svaki VH i VL je sastavljen od tri CDR-a i četiri FR-a, raspoređenih od amino-terminusa do karboksi-terminusa sledećim redom: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Varijabilni regioni teških i lakih lanaca sadrže vezujući domen koji stupa u interakciju sa antigenom. Konstantni regioni antitela mogu da posreduju vezivanje imunoglobulina za tkiva domaćina ili faktore, uključujući različite ćelije imunskog sistema (npr. efektorske ćelije) i prvu komponentu (Clq) klasičnog sistema komplementa.

[0204] Izraz "monoklonsko antitelo", kao što je ovde korišćen, odnosi se na pripremu molekula antitela jednog molekularnog sastava. Monoklonsko antitelo pokazuje jednu specifičnost vezivanja i afinitet. U jednom izvođenju, monoklonska antitela su proizvedena pomoću hibridoma koji uključuje B ćelije dobijene od ne-humane životinje, npr., miša, fuzionisane sa besmrtnom ćelijom.

[0205] Izraz "rekombinantno antitelo", kako je ovde korišćen, uključuje sva antitela koja su pripremljena, eksprimirana, načinjena ili izolovana rekombinantnim sredstvima, kao što su (a) antitela izolovana iz životinje (npr. miša) koja je transgena ili transhromozomalna u odnosu na imunoglobulinske gene ili hibridome pripremljene od njih, (b) antitela izolovana iz ćelije domaćina transformisane da eksprimira antitelo, npr. iz transfektoma, (c) antitela izolovana iz biblioteke rekombinantnih, kombinatornih antitela i (d) antitela pripremljena, eksprimirana, kreirana ili izolovana na bilo koji drugi način koji uključuje spajanje imunoglobulinskih genskih sekvenci sa drugim DNK sekvencama.

[0206] Izraz "humano antitelo", kako je ovde korišćen, određen je da uključuje antitela koja imaju varijabilne i konstantne regione izvedene iz humanih imunoglobulinskih sekvenci germinativne linije. Humana antitela mogu da uključuju aminokiselinske ostatke koji nisu kodirani humanim sekvencama imunoglobulina humane germinativne linije (npr. mutacije uvedene slučajnom ili mesto-specifičnom mutagenezom in vitro ili somatskom mutacijom in vivo).

[0207] Izraz "humanizovano antitelo" se odnosi na molekul koji ima mesto za vezivanje antigena, koji je u osnovi izveden iz imunoglobulina iz vrste koja nije humana, pri čemu je preostala imunoglobulinska struktura molekule bazirana na strukturi i / ili sekvenci humanog imunoglobulina. Mesto za vezivanje antigena može ili da obuhvati kompletne varijabilne domene fuzionisane na konstantne domene ili samo regione koji određuju komplementarnost (CDR) presađene na odgovarajuće okvirne regione u varijabilnim domenima. Antigen vezujuća mesta, mogu biti divljeg tipa ili modifikovana sa jednom ili više aminokiselinskih supstitucija, npr. modifikovana tako da budu usko slični humanim imunoglobulinima. Neki oblici humanizovanih antitela čuvaju sve CDR sekvence (na primer humanizovano mišje antitelo koje sadrži svih šest CDR-a iz mišjeg antitela). Drugi oblici imaju jedan ili više CDR-a koji su promenjeni u odnosu na originalno antitelo.

[0208] Izraz "himerno antitelo" se odnosi na ona antitela u kojima je jedan deo svake od aminokiselinskih sekvenci teških i lakih lanaca homologan sa odgovarajućim sekvencama u antitelima izvedenim od određene vrste ili pripadanjem određenoj klasi, dok je preostali segment lanca homologan sa odgovarajućim sekvencama u drugom. Tipično varijabilni region i lakih i teških lanaca oponaša varijabilne regione antitela izvedene od jedne vrste sisara, dok su konstantni delovi homologni sekvencama antitela izvedenim iz drugog. Jedna jasna prednost takvih himernih oblika je da varijabilni region može pogodno biti izveden iz trenutno poznatih izvora, korišćenjem pripremljenih raspoloživih B-ćelija ili hibridoma iz ne-humanih organizama domaćina u kombinaciji sa konstantnim regionima izvedenim iz, na primer, preparata humanih ćelija. Iako varijabilni region ima prednost u lakoći pripreme i specifičnost nije pogođena izvorom, konstantni region koji je humani, je manje verovatno da će izazvati imunski odgovor od humanog subjekta kada su injektovana antitela, nego što bi konstantni region iz izvora koji nije humani. Međutim, definicija nije ograničena na ovaj poseban primer.

[0209] Antitela mogu biti izvedena iz različitih vrsta, uključujući, ali nisu ograničena na miša, pacova, zeca, morsko prase i čoveka.

[0210] Ovde opisana antitela, uključuju IgA, kao što su IgA1 ili IgA2, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgE, IgM i IgD antitela. U različitim primerima izvođenja, antitelo je IgG1 antitelo, specifičnije IgG1, kappa ili IgG1, lambda izotipa (tj. IgG1, κ, λ), IgG2a antitelo (npr. IgG2a, κ, λ), IgG2b antitelo (npr. IgG2b, κ, λ), IgG3 antitelo (npr. IgG3, κ, λ) ili IgG4 antitelo (npr. IgG4, κ, λ).

[0211] Ovde opisana antitela su poželjno izolovana. "Izolovano antitelo", kako je ovde korišćeno, određeno je da se odnosi na antitelo koje je suštinski slobodno od drugih antitela koje imaju različite antigenske specifičnosti (npr., izolovano antitelo koje se specifično vezuje za CLDN6 je u suštini bez antitela koja specifično vezuju druge antigene od CLDN6). Izolovano antitelo koje se specifično vezuje za epitop, izoformu ili varijantu humanog CLDN6 može, međutim, imati unakrsnu reaktivnost sa drugim srodnim antigenima, npr., od drugih vrsta (npr. homolozi CLDN6 vrsta). Štaviše, izolovano antitelo može biti suštinski bez drugih ćelijskih materijala i / ili hemikalija. U jednom primeru izvođenja prema učenju, kombinacija "izolovanih" monoklonskih antitela se odnosi na antitela koja imaju različite specifičnosti i koja su kombinovana u dobro definisanom sastavu ili smeši.

[0212] Izrazi "deo za vezivanje antigena" antitela (ili jednostavno "vezujući deo") ili "fragment za vezivanje antigena" antitela (ili jednostavno "vezujući fragment") ili slični izrazi, odnose se na jedan ili više fragmenata antitela koji zadržavaju sposobnost da se specifično vezuju za antigen. Pokazano je da antigen-vezujuća funkcija antitela može biti izvedena fragmentima antitela pune dužine. Primeri vezujućih fragmenata obuhvaćenih izrazom "antigen-vezujući deo" antitela uključuju (i) Fab fragmente, monovalentne fragmente koji se sastoje od VL, VH, CL i CH domena; (ii) F(ab')2fragmente, bivalentne fragmente koji sadrže dva Fab fragmenta povezana pomoću disulfidnog mosta u zglobnom regionu; (iii) Fd fragmente koji se sastoje od VH i CH domena; (iv) Fv fragmente koji se sastoje od VL i VH domena jednog kraka antitela, (v) dAt fragmenata (Ward i sar., (1989) Nature 341: 544-546), koji se sastoje od VH domena; (vi) izolovane regione za određivanje komplementarnosti (CDR), i (vii) kombinacije dva ili više izolovanih CDR-a koji opciono mogu biti vezani sa sintetičkim linkerom. Nadalje, iako su dva domena Fv fragmenta, VL i VH, kodirana za odvojene gene, oni mogu biti vezani, korišćenjem rekombinantnih metoda, pomoću sintetičkog linkera koji im omogućava da budu napravljeni kao jedan lanac proteina u kome se VL i VH regioni spajaju da obrazuju monovalentne molekule (poznate kao jednolančani Fv (scFv); videti npr., Bird i sar. (1988) Science 242: 423-426; i Huston i sar. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883). Takva jednolančana antitela su određena da budu obuhvaćena izrazom "fragment za vezivanje antigena" antitela. Dalji primer je vezujući-domen imunoglobulinskih fuzionih proteina koji sadrži (i) polipeptid vezujućeg domena koji je fuzionisan sa polipeptidom imunoglobulinskog zglobnog regiona, (ii) konstantni region CH2 teškog lanca imunoglobulina fuzionisan sa zglobnim regionom, i (iii) konstantni region CH3 teškog lanca imunoglobulina fuzionisan sa konstantnim regionom CH2. Vezujući domen polipeptida može biti varijabilni region teškog lanca ili varijabilni region lakog lanca. Fuzioni proteini imunoglobulina u domenu vezivanja su dalje opisani u US 2003/0118592 i US 2003/0133939. Ovi fragmenti antitela su dobijeni korišćenjem konvencionalnih tehnika koje su poznate stručnjacima u stanje tehnike, a fragmenti su pregledani za korisnost na isti način kao i čitava antitela.

[0213] Prema učenju, izraz "vezujući domen za CLDN6" uključuje i poželjno se odnosi na deo za vezivanje antigena CLDN6 antitela, tj. antitelo koje je usmereno protiv CLDN6 i poželjno je specifično za CLDN6.

[0214] Izraz "domen za vezivanje" karakteriše u vezi sa sadašnjim učenjem strukturu, npr. antitela, koje se vezuje za / stupa u interakciju sa datom ciljnom strukturom / antigenom / epitopom. Stoga, domen za vezivanje prema učenju označava "mesto interakcije antigena".

[0215] Sva antitela i derivati antitela, kao što su fragmenti antitela, kao što je ovde opisano za ciljeve prema učenju, obuhvaćeni su izrazom "antitelo".

[0216] Antitela mogu biti proizvedena različitim tehnikama, uključujući konvencionalnu metodologiju monoklonskih antitela, npr., standardnu tehniku hibridizacije somatskih ćelija od strane Kohler i Milstein, Nature 256: 495 (1975). Iako su poželjne procedure hibridizacije somatskih ćelija, u principu, mogu biti korišćene druge tehnike za proizvodnju monoklonskih antitela, npr., virusna ili onkogena transformacija B-limfocita ili tehnika prikazivanja faga korišćenjem biblioteka od gena antitela.

[0217] Poželjan životinjski sistem za pripremu hibridoma koji sekretuje monoklonska antitela je mišji sistem. Proizvodnja hibridoma u mišu je veoma dobro uspostavljena procedura. Protokoli imunizacije i tehnike za izolaciju imunizovanih splenocita za fuziju su poznati u tehnici. Fuzioni partneri (npr. mišje ćelije mijeloma) i postupci fuzije su takođe poznati.

[0218] Drugi poželjni životinjski sistemi za pripremu hibridoma koji izlučuju monoklonska antitela su sistem pacova i zeca (npr. opisani od strane Spieker-Polet i sar., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.92: 9348 (1995), videti takođe Rossi i sar., Am. J. Clin. Pathol.124: 295 (2005)).

[0219] Za generisanje antitela, miševi mogu biti imunizovani sa peptidima konjugovanim sa nosačem izvedenim iz sekvence antigena, tj. sekvence protiv koje će biti usmerena antitela, obogaćenim preparatom rekombinantno eksprimiranog antigena ili njegovim fragmentima i / ili ćelijama koje eksprimiraju antigen, kao što je opisano. Alternativno, miševi mogu biti imunizovani sa DNK koja kodira antigen ili njegove fragmente. U slučaju da imunizacija koja koristi prečišćeni ili obogaćeni preparat antigena ne rezultira antitelima, miševi takođe, mogu biti imunizovani sa ćelijama koje eksprimiraju antigen, npr., ćelijska linija, da bi se pospešili imunski odgovori.

[0220] Imunski odgovor može biti praćen tokom toka protokola imunizacije sa uzorcima plazme i seruma koji su dobijeni pomoću vene repa ili retroorbitalnim krvarenjima. Miševi sa dovoljnim titrom imunoglobulina, mogu biti korišćeni za fuzije. Miševi mogu biti pojačani intraperitonealno ili intravenozno sa ćelijama koje eksprimiraju antigen, 3 dana pre žrtvovanja i uklanjanjem slezine da bi se povećala stopa hibridoma koji sekretuju specifična antitela.

[0221] Da bi se generisali hibridomi koji proizvode monoklonska antitela, mogu biti izolovani splenociti i ćelije limfnih čvorova imunizovanih miševa i fuzionisani sa odgovarajućom imortalizovanom ćelijskom linijom, kao što je ćelijska linija mišjeg mijeloma. Dobijeni hibridomi zatim mogu biti ispitani za proizvodnju antigen-specifičnih antitela. Pojedinačni bazenčići se zatim mogu pregledati pomoću ELISA tehnike za hibridome koji izlučuju antitela. Antitela specifična za antigen, mogu biti identifikovana pomoću imunofluorescencije i FACS analize, korišćenjem ćelija koje eksprimiraju antigen. Hibridomi koji izlučuju antitela, mogu biti ponovo naneseni, ponovo ispitani, i ako su još uvek pozitivni na monoklonska antitela, mogu biti subklonirani ograničavajućim razblaživanjem. Stabilni subklonovi mogu zatim biti kultivisani in vitro da bi se generisalo antitelo u medijumu kulture tkiva za karakterizaciju.

[0222] Sposobnost antitela i drugih vezujućih agenasa da vežu antigen, može biti određena korišćenjem standardnih testova vezivanja (npr. ELISA, Western Blot, imunofluorescencija i protočna citometrijska analiza).

[0223] Antitela i derivati antitela su korisni za obezbeđivanje vezujućih domena, kao što su fragmenti antitela, naročito za obezbeđivanje VL i VH regiona.

[0224] Vezujući domen za CLDN6 koji može biti prisutan unutar veštačkog T ćelijskog receptora ima sposobnost vezivanja za CLDN6, tj. sposobnost vezivanja za epitop prisutan u CLDN6, poželjno epitop koji se nalazi unutar ekstracelularnih domena CLDN6, posebno prve ekstracelularne petlje, poželjno aminokiselinski položaji 28 do 76 iz CLDN6 ili druge ekstracelularne petlje, poželjno aminokiselinski položaji 141 do 159 iz CLDN6. U posebnim primerima izvođenja, vezujući domen za CLDN6 se vezuje za epitop na CLDN6 koji nije prisutan na CLDN9. Poželjno, domen za vezivanje za CLDN6 se vezuje za epitop na CLDN6 koji nije prisutan na CLDN4 i / ili CLDN 3. Najpoželjnije, vezujući domen za CLDN6 se vezuje za epitop na CLDN6 koji nije prisutan na CLDN proteinu drugačijem od CLDN6.

[0225] Vezujući domen za CLDN6 poželjno se vezuje za CLDN6, ali ne za CLDN9 i poželjno se ne vezuje za CLDN4 i / ili CLDN3. Poželjno, domen vezivanja za CLDN6 je specifičan za CLDN6. Poželjno, domen vezivanja za CLDN6 se vezuje za CLDN6 eksprimiran na površini ćelije. U posebno poželjnim primerima izvođenja, vezujući domen za CLDN6 se vezuje za prirodne epitope CLDN6 koji su prisutni na površini živih ćelija.

[0226] U poželjnom primeru izvođenja, domen za vezivanje za CLDN6 sadrži varijabilni region teškog lanca (VH) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 30, 32, 34 i 36 ili njenog fragmenta ili varijante navedene aminokiselinske sekvence ili fragmenta.

[0227] U poželjnom primeru izvođenja, domen za vezivanje za CLDN6 sadrži varijabilni region lakog lanca (VL) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 31, 33, 35, 37 i 39 ili njenog fragmenta, ili varijante navedene aminokiselinske sekvence ili fragmenta.

[0228] U određenim poželjnim primerima izvođenja, domen za vezivanje za CLDN6 sadrži kombinaciju varijabilnog regiona teškog lanca (VH) i varijabilnog regiona lakog lanca (VL) odabranu od sledećih mogućnosti (i) do (xi):

(i) VH sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 30 ili njen fragment i VL sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 31 ili njen fragment, (ii) VH sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 32 ili njen fragment i VL sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 33 ili njen fragment, (iii) VH sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 34 ili njen fragment i VL sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 35 ili njen fragment, (iv) VH sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 36 ili njen fragment i VL sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 37 ili njen fragment, (v) VH sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 32 ili njen fragment i VL sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 31 ili njen fragment, (vi) VH sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 32 ili njen fragment i VL sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 38 ili njen fragment, (vii) VH sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 32 ili njen fragment i VL sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 39 ili njen fragment,

[0229] U naročito poželjnom izvođenju, domen za vezivanje za CLDN6 sadrži sledeću kombinaciju varijabilnog regiona teškog lanca (VH) i varijabilnog regiona lakog lanca (VL): VH sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu pomoću SEQ ID NO: 32 ili njen fragment i VL sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu pomoću SEQ ID NO: 39 ili njen fragment.

[0230] Izraz "fragment" se odnosi, naročito, na jedan ili više regiona za određivanje komplementarnosti (CDR), poželjno najmanje na varijabilni region CDR3, varijabilni region teškog lanca (VH) i / ili varijabilni region lakog lanca (VL). U jednom primeru izvođenja je pomenuto da je jedan ili više regiona za određivanje komplementarnosti (CDR regiona) izabrano iz kompleta od regiona za određivanje komplementarnosti CDR1, CDR2 i CDR3. U posebno poželjnom izvođenju, izraz "fragment" se odnosi na regione za određivanje komplementarnosti CDR1, CDR2 i CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca (VH) i / ili varijabilnog regiona lakog lanca (VL).

[0231] U jednom primeru izvođenja, vezujući domen za CLDN6 koji sadrži jedan ili više CDR-a, komplet CDR-a ili kombinaciju kompleta CDR-a, kao što je ovde opisano, obuhvata pomenute CDR regione zajedno sa njihovim ubačenim okvirnim regionima. Poželjno, deo će takođe uključiti najmanje oko 50% bilo jednog ili oba od prvog i četvrtog okvirnog regiona, 50% koji je 50% C-terminalni od prvog okvirnog regiona i 50% N-terminalni od četvrtog okvirnog regiona. Konstrukcija domena vezivanja napravljenih tehnikama rekombinantne DNK može rezultirati uvođenjem ostataka N- ili C-terminala u varijabilnim regionima kodiranim od strane linkera uvedenim da olakšaju kloniranje ili druge korake manipulacije, uključujući uvođenje linkera za vezivanje varijabilnih regiona prema učenju za dalje proteinske sekvence, uključujući teške lance imunoglobulina, druge varijabilne domene (na primer u proizvodnji diatela) ili proteinskih markera.

[0232] U jednom primeru izvođenja, vezujući domen koji sadrži jedan ili više CDR-a, komplet CDR-a ili kombinaciju kompleta CDR-a, kao što je ovde opisano, sadrži pomenute CDR regione u okviru humanog antitela.

[0233] Izraz "vezivanje" prema učenju se poželjno odnosi na specifično vezivanje.

[0234] Prema sadašnjem učenju, sredstvo kao što je T ćelijski receptor ili antitelo je sposobno za vezivanje za prethodno određeni cilj ako ima značajan afinitet za prethodno određeni cilj i vezuje se za pomenuti prethodno određeni cilj u standardnim testovima. "Afinitet" ili "afinitet vezivanja" se često meri pomoću ravnotežne konstante disocijacije (KD). Poželjno, izraz "značajan afinitet" se odnosi na vezivanje za unapred određeni cilj sa konstantom disocijacije (KD) od 10<-5>M ili niže, 10<-6>M ili niže, 10<-7>M ili niže, 10<-8>M ili niže, 10<-9>M ili niže, 10<-10>M ili niže, 10<-11>M ili niže, ili 10<-12>M ili niže.

[0235] Agens nije (suštinski) sposoban da se vezuje za cilj ako nema značajan afinitet za pomenuti cilj i ne vezuje se značajno, naročito se ne vezuje detektabilno, za navedeni cilj u standardnim analizama. Poželjno, agens se ne može detektabilno vezati za navedeni cilj ako je prisutan u koncentraciji do 2, poželjno 10, poželjnije 20, posebno 50 ili 100 μg / ml ili više. Poželjno, agens nema značajan afinitet za cilj ako se vezuje za navedeni cilj sa KDkoja je najmanje 10 puta, 100 puta, 10<3>-puta, 10<4>-puta, 10<5>-puta, ili 10<6>-puta viša od KDza vezivanje za prethodno određeni cilj za koji je agens sposoban za vezivanje. Na primer, ako je KDza vezivanje agensa za cilj na koji je agens sposoban da se veže 10<-7>M, KDza vezivanje za cilj za koji agens nema značajan afinitet bi bila najmanje 10<-6>M, 10<-5>M, 10<-4>M, 10<-3>M, 10<-2>M, ili 10<-1>M.

[0236] Agens je specifičan za unapred određeni cilj, ako je sposoban da se veže za navedeni prethodno određeni cilj, dok nije (u suštini) sposoban da se veže za druge ciljeve, tj. nema značajan afinitet prema drugim ciljevima i ne vezuje se značajno za druge ciljeve u standardnim testovima. Prema učenju, agens je specifičan za CLDN6 ako je sposoban da se vezuje za CLDN6, ali nije (suštinski) sposoban da se vezuje za druge ciljeve. Poželjno, agens je specifičan za CLDN6 ako afinitet za i vezivanje za takve druge ciljeve ne prelazi značajno afinitet za ili vezivanje za proteine koji nisu povezani sa CLDN6, kao što je goveđi serumski albumin (BSA), kazein, humani serumski albumin (HSA), ili ne-klaudinski transmembranski proteini, kao što su MHC molekuli ili transferinski receptor ili bilo koji drugi specifični polipeptid. Poželjno, agens je specifičan za prethodno određeni cilj ako se vezuje za navedeni cilj sa KDkoja je najmanje 10-puta, 100-puta, 10<3>-puta, 10<4>-puta, 10<5>-puta, ili 10<6>-puta niža od KDza vezivanje za cilj za koji on nije specifičan. Na primer, ako je KDza vezivanje agensa za cilj za koji je on specifičan 10<-7>M, KDza vezivanje za cilj za koji on nije specifičan bi bila najmanje 10<-6>M, 10<-5>M, 10<-4>M, 10<-3>M, 10<-2>M, ili 10<-1>M.

[0237] Vezivanje agensa za cilj, može biti određeno eksperimentalno korišćenjem bilo kog pogodnog postupka; videti, na primer. Berzofsky i sar., "Interakcije antitela-antigena" u Fundamentalnoj imunologiji, Paul, W.E., Izd., Raven Press Njujork, N Y (1984), Kuby, Janis Immunology, W.H. Freeman and Company Njujork, N Y (1992), i ovde opisane metode. Afiniteti mogu biti lako određeni korišćenjem konvencionalnih tehnika, kao što je ravnotežna dijaliza; korišćenjem instrumenta BIAcore 2000, korišćenjem opštih procedura navedinih od strane proizvođača; radioimunološkim testom korišćenjem radioobeleženog ciljnog antigena; ili pomoću drugog postupka koji je poznat stručnjaku. Podaci o afinitetu mogu biti analizirani, na primer, metodom Scatchard i sar., Ann N.Y. Acad. ScL, 51: 660 (1949). Izmereni afinitet određene interakcije antitelo-antigen može da varira ako se meri pri različitim uslovima, npr., koncentracija soli, pH. Stoga, merenja afiniteta i drugih parametara vezivanja antigena, npr. KD, IC50, su poželjno urađena sa standardizovanim rastvorima antitela i antigena i standardizovanim puferom.

[0238] Podrazumeva se da ovde opisani peptidni i proteinski agensi, mogu biti obezbeđeni in vitro ili in vivo u obliku nukleinske kiseline, kao što je RNK koja kodira agensa i / ili u obliku ćelije domaćina koja sadrži nukleinsku kiselinu, kao što je RNK koja kodira agensa. Posebno, mogu se koristiti različiti postupci za uvođenje CAR konstrukata u T ćelije, uključujući transfekciju DNK koja nije na bazi virusa, sisteme zasnovane na transpozonu i sisteme zasnovane na virusima. Transfekcija DNK koja nije virusna ima nizak rizik od umetnute mutageneze. Sistemi zasnovani na transpozonima mogu integrisati transgene efikasnije od plazmida koji ne sadrže element za integrisanje. Sistemi zasnovani na virusu, uključuju upotrebu γ-retrovirusa i lentivirusnih vektora. γ-Retrovirusi se relativno lako proizvode, efikasno i trajno transdukuju T ćelije, i preliminarno su dokazani sigurni sa stanovišta integracije u primarnim humanim T ćelijama. Lentivirusni vektori takođe, efikasno i trajno transdukuju T ćelije, ali su skuplji za proizvodnju. Oni su takođe potencijalno sigurniji od sistema zasnovanih na retrovirusu.

[0239] Ovde opisani peptidni i proteinski agensi, mogu biti isporučeni pacijentu primenom nukleinske kiseline, kao što je RNK koja kodira agens i / ili primenom ćelije domaćina koja sadrži nukleinsku kiselinu, kao što je RNK koja kodira agens. Nukleinska kiselina, kada se primenjuje kod pacijenta, može biti prisutna u golom obliku ili u pogodnom nosaču za isporuku, kao što je u obliku liposoma ili virusnih čestica, ili unutar ćelije domaćina. Obezbeđena nukleinska kiselina može da proizvodi agens tokom produženih vremenskih perioda odloženim načinom, ublažavajući nestabilnost koja je bar delimično primećena za terapeutske proteine. Ako je nukleinska kiselina primenjena kod pacijenta bez da je prisutna u ćeliji domaćina, poželjno je preuzeta od strane ćelija pacijenta za ekspresiju agensa kodiranog nukleinskom kiselinom. Ako je nukleinska kiselina primenjena kod pacijenta dok je prisutna u ćeliji domaćina, poželjno je da je eksprimirana od strane ćelije domaćina unutar pacijenta, tako da se proizvede agens kodiran nukleinskom kiselinom.

[0240] Izraz "nukleinska kiselina", kao što je ovde korišćen, određen je da uključuje DNK i RNK, kao što su genomske DNK, cDNK, iRNK, rekombinantno proizvedeni i hemijski sintetizovani molekuli. Nukleinska kiselina može biti jednolančana ili dvolančana. RNK uključuje, in vitro transkribovanu RNK (IVT RNA) ili sintetsku RNK. Prema učenju, nukleinska kiselina je poželjno izolovana nukleinska kiselina.

[0241] Nukleinske kiseline mogu biti sadržane u vektoru. Izraz "vektor", kako se ovde koristi, uključuje bilo koje vektore koji su poznati prosečnom stručnjaku, uključujući plazmidske vektore, kozmidne vektore, fagne vektore kao što su lambda fag, virusni vektori kao što su adenovirusni ili bakulovirusni vektori, ili vektori veštačkih hromozoma kao što su bakterijski veštački hromozomi (BAC), veštački hromozomi kvasca (YAC) ili P1 veštački hromozomi (PAC). Navedeni vektori uključuju ekspresiju, kao i vektore kloniranja. Ekspresioni vektori sadrže plazmide kao i virusne vektore i generalno, sadrže željenu kodirajuću sekvencu i odgovarajuće DNK sekvence neophodne za ekspresiju operativno povezane kodirajuće sekvence u određenom organizmu domaćina (npr. bakterija, kvasac, biljka, insekt ili sisar) ili u in vitro ekspresionim sistemima. Vektori za kloniranje se generalno koriste za konstruisanje i amplifikaciju određenog željenog fragmenta DNK i mogu im nedostajati funkcionalne sekvence potrebne za ekspresiju željenih fragmenata DNK.

[0242] U kontekstu sadašnjeg učenja, izraz "RNK" se odnosi na molekul koji sadrži ostatke ribonukleotida i poželjno je da je u potpunosti ili suštinski sastavljen od ribonukleotidnih ostataka. "Ribonukleotid" se odnosi na nukleotid sa hidroksilnom grupom na položaju 2' od β-D-ribofuranozil grupe. Izraz uključuje dvolančanu RNK, jednolančanu RNK, izolovanu RNK, kao što je delimično prečišćena RNK, u suštini čista RNK, sintetska RNK, rekombinantno proizvedena RNK, kao i modifikovana RNK koja se razlikuje od prirodne RNK dodavanjem, delecijom, supstitucijom i / ili izmenom jednog ili više nukleotida. Takve promene mogu da uključuju dodavanje ne-nukleotidnog materijala, kao što je na završetku (-ecima) RNK ili interno, na primer na jednom ili više nukleotida RNK. Nukleotidi u RNK molekulima mogu takođe da sadrže nestandardne nukleotide, kao što su nukleotidi koji se ne javljaju u prirodi ili hemijski sintetizovani nukleotidi ili deoksinukleotidi. Ove promenjene RNK mogu biti označene kao analozi ili analozi RNK koje se javljaju u prirodi.

[0243] Prema sadašnjem učenju, izraz "RNK" uključuje i poželjno se odnosi na "iRNK", koja označava "mesindžer RNK " i odnosi se na "transkript" koji se može proizvesti upotrebom DNK kao šablona i kodira peptid ili protein. iRNK tipično sadrži 5 'neprevedeni region (5'-UTR), proteinski ili peptidni kodirajući region i 3' neprevedeni region (3'-UTR). iRNK ima ograničeno poluvreme u ćelijama i in vitro. Poželjno je da je iRNK proizvedena in vitro transkripcijom, korišćenjem DNK šablona. U jednom primeru izvođenja prema učenju, RNK je dobijena in vitro transkripcijom ili hemijskom sintezom. Metodologija transkripcije in vitro je poznata stručnjaku. Na primer, postoji niz komercijalno dostupnih in vitro kompleta za transkripciju.

[0244] U jednom primeru izvođenja prema sadašnjem učenju, RNK je samo-replikujuća RNK, kao što je jednolančana samo-replikujuća RNK. U jednom izvođenju, samo-replikujuća RNA je jednolančana RNK pozitivne orjentacije. U jednom izvođenju, samo-replikujuća RNK je virusna RNK ili RNK izvedena iz virusne RNK. U jednom primeru izvođenja, RNK koja se samo-replikuje je alfavirusna genomska RNK ili je izvedena iz alfavirusne genomske RNK. U jednom primeru izvođenja, RNK za samo-replikovanje je ekspresioni vektor virusnog gena. U jednom primeru izvođenja, virus je Semliki šumski virus. U jednom primeru izvođenja, RNK koja se samo-replikuje sadrži jedan ili više transgena, najmanje jedan od pomenutih transgena koji kodiraju ovde opisane agense. U jednom primeru izvođenja, ako je RNK virusna RNK ili izvedena iz virusne RNK, transgeni mogu delimično ili potpuno zameniti virusne sekvence, kao što su virusne sekvence koje kodiraju strukturne proteine. U jednom primeru izvođenja, RNK koja se samo-replikuje je in vitro transkribovana RNK.

[0245] Da bi se povećala ekspresija i / ili stabilnost RNK korišćene u skladu sa sadašnjim učenjem, može biti modifikovana, poželjno bez promene sekvence eksprimiranog peptida ili proteina.

[0246] Izraz "modifikacija" u kontekstu RNK, kao što je korišćeno prema sadašnjem učenju, uključuje bilo koju modifikaciju RNK koja nije prirodno prisutna u pomenutoj RNK.

[0247] U jednom primeru izvođenja prema učenju, RNK koja se koristi prema učenju nema nepokrivenih 5'-trifosfata. Uklanjanje takvih nepokrivenih 5'-trifosfata može se postići tretiranjem RNK sa fosfatazom.

[0248] RNK prema učenju, može imati modifikovane prirodne ili sintetske ribonukleotide kako bi se povećala njena stabilnost i / ili smanjila citotoksičnost. Na primer, u jednom primeru izvođenja, u RNK koja se koristi u skladu sa učenjem, 5-metilcitidin je supstituisan delimično ili potpuno, poželjno potpuno, citidinom. Alternativno ili dodatno, u jednom primeru izvođenja, u RNK upotrebljenoj prema učenju, pseudouridin je supstituisan delimično ili potpuno, poželjno potpuno, uridinom.

[0249] U jednom primeru izvođenja, izraz "modifikacija" se odnosi na obezbeđivanje RNK sa 5'-omotačem ili analogom 5'-omotača. Izraz "5'-omotač" se odnosi na strukturu poklopca koja se nalazi na 5'-kraju molekule iRNK i generalno se sastoji od guanozinskog nukleotida koji je povezan sa iRNK preko neobične 5' do 5 'trifosfatne veze. U jednom izvođenju, ovaj guanozin je metilovan na položaju 7. Izraz "konvencionalni 5'-kapsid" odnosi se na prirodno prisutan RNK 5'-kapsid, poželjno na 7-metilguanozin kapsid (m7G). U kontekstu sadašnjeg učenja, izraz "5'-kapsid" uključuje analoga 5'-kapsida koji liči na RNK strukturu omotača i modifikovan je da poseduje sposobnost da stabilizuje RNK ako je na nju vezan, poželjno in vivo i / ili u ćeliji.

[0250] Obezbeđivanje RNK sa 5'-omotačem ili analogom 5'-omotača može biti postignuto in vitro transkripcijom DNK šablona u prisustvu pomenutog 5'-omotača ili analoga 5'-omotača, pri čemu je pomenuti 5'-kapsid zajedno transkripciono ugrađen u generisani RNK lanac, ili RNK može biti generisana, na primer, in vitro transkripcijom i 5'-omotač može biti vezan za RNK nakon transkripcije upotrebom enzima za pokrivanje, npr. virusa vakcinije.

[0251] RNK može da sadrži dalje modifikacije. Na primer, dalja modifikacija RNK koja se koristi u sadašnjem učenju, može biti proširenje ili skraćivanje prirodno nastalog poli (A) repa ili promena 5'- ili 3'-neprevedenih regiona (UTR), kao što je uvođenje UTR koji nije povezan sa kodirajućim regionom navedene RNK, na primer, umetanjem jedne ili više, poželjno dve kopije 3'-UTR izvedene iz gena globina, kao što je alfa2-globin, alfa1-globin, beta-globin, poželjno beta-globin, poželjnije humani beta-globin.

[0252] Za ovo, da bi se povećala stabilnost i / ili ekspresija RNK koja se koristi u skladu sa sadašnjim učenjem, ona može biti modifikovana tako da bude prisutna zajedno sa poli-A sekvencom, poželjno da ima dužinu od 10 do 500, još poželjnije 30 do 300, još poželjnije 65 do 200 i posebno 100 do 150 adenozinskih ostataka. U posebno poželjnom izvođenju, poli-A sekvenca ima dužinu od približno 120 adenozinskih ostataka. Dodatno, inkorporiranje dva ili više 3'-neprevedenih regiona (UTR) u 3'-neprevedeni region RNK molecule, može dovesti do povećanja efikasnosti translacije. U jednom posebnom primeru izvođenja, 3'-UTR je izveden iz humanog gena β-globina.

[0253] Izraz "stabilnost" RNK se odnosi na "poluživot" RNK. "Poluživot" se odnosi na vremenski period koji je potreban da se eliminiše polovina aktivnosti, količine ili broja molekula. U kontekstu sadašnjeg učenja, poluživot RNK je indikativan za stabilnost pomenute RNK. Poluživot RNK može uticati na "trajanje ekspresije" RNK. Može se očekivati da će RNK sa dugim poluživotom biti eksprimirana tokom produženog vremenskog perioda.

[0254] U kontekstu sadašnjeg učenja, izraz "transkripcija" se odnosi na proces, gde je genetski kod u DNK sekvenci transkribovan u RNK. Nakon toga, RNK može biti prevedena u protein. Prema sadašnjem učenju, izraz "transkripcija" obuhvata "in vitro transkripciju", pri čemu se izraz "in vitro transkripcija" odnosi na proces u kome je RNK, posebno iRNK, sintetisana in vitro u sistemu bez ćelija, poželjno korišćenjem odgovarajućih ćelijskih ekstrakata. Poželjno, vektori kloniranja se primenjuju za generisanje transkripata. Ovi vektori za kloniranje su generalno označeni kao transkripcioni vektori i prema sadašnjem pronalasku su obuhvaćeni izrazom "vektor".

[0255] Izraz "translacija" prema učenju se odnosi na proces u ribozomima ćelije pomoću koje lanac iRNK usmerava skupinu sekvence aminokiselina da bi se dobio peptid ili protein.

[0256] Nukleinske kiseline mogu, prema učenju, biti prisutne same ili u kombinaciji sa drugim nukleinskim kiselinama, koje mogu biti homologne ili heterologne. U poželjnim primerima izvođenja, nukleinska kiselina je funkcionalno povezana sa kontrolnim sekvencama ekspresije koje mogu biti homologne ili heterologne u odnosu na navedenu nukleinsku kiselinu. Izraz "homologni" označava da su nukleinske kiseline takođe, prirodno funkcionalno povezane i izraz "heterologni" znači da nukleinske kiseline nisu prirodno funkcionalno povezane.

[0257] Nukleinska kiselina i sekvenca za kontrolu ekspresije su "funkcionalne" povezane jedna sa drugom, ako su kovalentno povezane jedna sa drugom na takav način da je ekspresija ili transkripcija navedene nukleinske kiseline pod kontrolom ili pod uticajem navedene sekvence za kontrolu ekspresije. Ako se nukleinska kiselina prevodi u funkcionalni protein, onda, sa kontrolnom sekvencom ekspresije koja je funkcionalno povezana sa kodirajućom sekvencom, indukcija navedene sekvence za kontrolu ekspresije rezultira transkripcijom pomenute nukleinske kiseline, bez izazivanja pomeranja okvira kodirajuće sekvence ili se navedena kodirajuća sekvenca ne može prevesti u željeni protein ili peptid.

[0258] Izraz "sekvenca za kontrolu ekspresije" ili "element za kontrolu ekspresije" sadrži prema učenju promotore, mesta za vezivanje ribozoma, pojačivače i druge kontrolne elemente koji regulišu transkripciju gena ili translaciju iRNK. U određenim primerima izvođenja prema učenju, sekvence za kontrolu ekspresije mogu biti regulisane. Tačna struktura ekspresionih kontrolnih sekvenci može da varira kao funkcija vrste ili tipa ćelije, ali generalno sadrži 5'-netranskribovane i 5'- i 3'-neprevedene sekvence koje su uključene u inicijaciju transkripcije i translacije, respektivno, kao što su TATA kutija, sekvenca omotača, CAAT sekvenca, i slično. Specifičnije, 5'-netranskribovane ekspresione kontrolne sekvence sadrže promoterski region koji uključuje promotersku sekvencu za transkripcionu kontrolu funkcionalno povezane nukleinske kiseline. Sekvence za kontrolu ekspresije, mogu takođe da sadrže sekvence pojačivača ili uzlazne sekvence aktivatora.

[0259] Izraz "ekspresija" je korišćen prema učenju u svom najopštijem značenju i obuhvata proizvodnju RNK i / ili peptida ili proteina, npr. transkripcijom i / ili translacijom. U odnosu na RNK, izraz "ekspresija" ili "translacija" se naročito odnosi na proizvodnju peptida ili proteina. On takođe obuhvata delimičnu ekspresiju nukleinskih kiselina. Štaviše, ekspresija može biti prolazna ili stabilna. Prema učenju, izraz ekspresija takođe uključuje "nenormalnu ekspresiju" ili "abnormalnu ekspresiju".

[0260] "Nenormalna ekspresija" ili "abnormalna ekspresija" označava prema učenju da je ekspresija promenjena, poželjno povećana, u poređenju sa referencom, npr. stanjem subjekta koji nema bolest koja je povezana sa nenormalnom ili abnormalnom ekspresijom određenog proteina, npr., tumorskog antigena. Povećanje u ekspresiji se odnosi na povećanje od najmanje 10%, posebno najmanje 20%, najmanje 50% ili najmanje 100%, ili više. U jednom izvođenju, ekspresija je nađena samo u obolelom tkivu, dok je ekspresija u zdravom tkivu potisnuta.

[0261] Izraz "specifično eksprimiran" označava da je protein suštinski eksprimiran samo u specifičnom tkivu ili organu. Na primer, tumorski antigen specifično eksprimiran u mukozi želuca znači da je navedeni protein primarno eksprimiran u sluznici želuca i nije eksprimiran u drugim tkivima ili nije eksprimiran u značajnoj meri u drugim tipovima tkiva ili organa. Stoga, protein koji je isključivo eksprimiran u ćelijama sluznice želuca i u značajno manjoj meri u bilo kom drugom tkivu, kao što je testis, specifično je eksprimiran u ćelijama sluznice želuca. U nekim izvođenjima, tumorski antigen može takođe biti specifično eksprimiran pod normalnim uslovima u više od jednom tipu tkiva ili organa, kao što je u 2 ili 3 tipa tkiva ili organa, ali poželjno u ne više od 3 različita tipa tkiva ili organa. U ovom slučaju, tumorski antigen je tada specifično eksprimiran u ovim organima. Na primer, ako je tumorski antigen eksprimiran pod normalnim uslovima, poželjno do približno jednakog obima u plućima i stomaku, pomenuti tumorski antigen je specifično eksprimiran u plućima i stomaku.

[0262] Prema učenju, izraz "kodirajuća nukleinska kiselina " označava da nukleinska kiselina, ako je prisutna u odgovarajućem okruženju, poželjno unutar ćelije, može biti eksprimirana da proizvodi protein ili peptid koji kodira.

[0263] Neki aspekti učenja se oslanjaju na adoptivni transfer ćelija domaćina koje su transfektovane in vitro sa nukleinskom kiselinom, kao što je RNK koja kodira ovde opisanog agensa i prenete na primaoce kao što su pacijenti, poželjno nakon ex vivo ekspanzije od niskih frekvenci prekursora do klinički relevantnih brojeva ćelija. Ćelije domaćina koje se koriste za lečenje u skladu sa učenjem mogu biti autologne, alogenične ili singenične prema tretiranom primaocu.

[0264] Izraz "autologni" se koristi za opisivanje svega što je izvedeno iz istog subjekta. Na primer, "autologna transplantacija" se odnosi na transplantaciju tkiva ili organa izvedenih iz istog subjekta. Takve procedure su pogodne jer prevazilaze imunološku barijeru koja inače rezultira odbacivanjem.

[0265] Izraz "alogeničan" se koristi za opisivanje svega što je izvedeno od različitih jedinki iste vrste. Za dve ili više jedinki se kaže da su alogenične jedna prema drugoj kada geni na jednom ili više lokusa nisu identični.

[0266] Izraz "singeničan" se koristi za opisivanje svega što je izvedeno od pojedinaca ili tkiva koji imaju identične genotipove, tj. identične blizance ili životinje istog gajenog soja, ili njihovih tkiva.

[0267] Izraz "heterologni" se koristi za opisivanje nečega što se sastoji od više različitih elemenata. Kao primer, prenos koštane srži jednog pojedinca u različitu osobu predstavlja heterolognu transplantaciju. Heterologni gen je gen izveden iz izvora drugačijeg od subjekta.

[0268] Izraz "transfekcija" se odnosi na uvođenje nukleinskih kiselina, posebno RNK, u ćeliju. U ciljevima sadašnjeg učenja, izraz "transfekcija" takođe, uključuje uvođenje nukleinske kiseline u ćeliju ili preuzimanje nukleinske kiseline od strane takve ćelije, pri čemu ćelija može biti prisutna u subjektu, npr. pacijentu. Stoga, prema sadašnjem učenju, ćelija za transfekciju nukleinske kiseline koja je ovde opisana, može biti prisutna in vitro ili in vivo, npr. ćelija može da obrazuje deo organa, tkiva i / ili organizma pacijenta. Prema učenju, transfekcija može biti prolazna ili stabilna. Za neke primene transfekcije, dovoljno je da je transfektovani genetski materijal samo prolazno eksprimiran. Pošto nukleinska kiselina uvedena u proces transfekcije obično nije integrisana u jedarnom genomu, strana nukleinska kiselina će biti razblažena preko mitoze ili degradirana. Ćelije koje dozvoljavaju epizomalnu amplifikaciju nukleinskih kiselina uveliko smanjuju stopu razblaženja. Ako je poželjno da transfektovana nukleinska kiselina zaista ostane u genomu ćelije i njenih ćerki ćelija, mora doći do stabilne transfekcije. RNK može biti transfektovana u ćelije da prolazno eksprimira svoj kodirani protein.

[0269] Prema sadašnjem učenju, može biti korišćena bilo koja tehnika korisna za uvođenje, tj. transferovanje ili transfektovanje nukleinskih kiselina u ćelije. Poželjno, RNK je transfektovana u ćelije standardnim tehnikama. Takve tehnike uključuju elektroporaciju, lipofekciju i mikroinjektiranje. U jednoj posebno poželjnom primeru izvođenja prema sadašnjem učenju, RNK je uvedena u ćelije elektroporacijom.

[0270] Elektroporacija ili elektropermeabilizacija se odnosi na značajno povećanje električne provodljivosti i permeabilnosti ćelijske plazma membrane uzrokovane eksterno primenjenim električnim poljem. Obično je korišćena u molekularnoj biologiji kao način uvođenja neke supstance u ćeliju.

[0271] Prema učenju, poželjno je da uvođenje nukleinske kiseline koja kodira jedan protein ili peptid u ćelijama rezultira ekspresijom navedenog proteina ili peptida.

[0272] Izraz "peptid" prema učenju sadrži oligo- i polipeptide i odnosi se na supstance koje sadrže dve ili više, poželjno 3 ili više, poželjno 4 ili više, poželjno 6 ili više, poželjno 8 ili više, poželjno 9 ili više, poželjno 10 ili više, poželjno 13 ili više, poželjno 16 ili više, poželjno 21 ili više i poželjno do 8, 10, 20, 30, 40 ili 50, naročito 100 aminokiselina koje su kovalentno vezane peptidnim vezama. Izraz "protein" se odnosi na velike peptide, poželjno na peptide sa više od 100 aminokiselinskih ostataka, ali generalno su izrazi "peptidi" i "proteini" sinonimi i ovde su korišćeni naizmenično.

[0273] Prema učenju, peptid može da uključuje prirodne aminokiseline i aminokiseline koje nisu prirodne. U jednom primeru izvođenja, peptid jedino uključuje prirodne aminokiseline.

[0274] Prema učenju, izraz "aminokiselina koja nije prirodna" se odnosi na aminokiselinu koja ima strukturu različitu od one iz 20 vrsta prirodnih aminokiselina. Pošto aminokiseline koje nisu prirodne imaju strukture slične onima od prirodnih aminokiselina, ne-prirodne amino kiseline mogu biti klasifikovane kao derivati ili analozi datih prirodnih aminokiselina.

[0275] Poželjno, izolovani su proteini i peptidi opisani prema učenju. Izrazi "izolovani protein" ili "izolovani peptid" označavaju da je protein ili peptid odvojen od njegovog prirodnog okruženja. Izolovani protein ili peptid mogu biti u suštinski prečišćenom stanju. Izraz "suštinski prečišćen" označava da je protein ili peptid suštinski oslobođen od drugih supstanci sa kojima je povezan u prirodi ili in vivo.

[0276] Podučavanje koje je ovde dato u vezi sa specifičnim aminokiselinskim sekvencama, npr. onima koje su prikazane u listingu sekvenci, treba tumačiti tako da se odnose i na varijante pomenutih specifičnih sekvenci koje rezultiraju sekvencama koje su funkcionalno ekvivalentne sa navedenim specifičnim sekvencama, npr. aminokiselinske sekvence koje pokazuju identična ili slična svojstva sa onima od specifičnih aminokiselinskih sekvenci. Jedno važno svojstvo je da zadržava vezivanje peptida za MHC molekul i / ili za T ćelijski receptor ili T ćelijskog receptora za njegov cilj ili da održava efektorske funkcije T ćelija. Poželjno, sekvenca koja je modifikovana u odnosu na specifičnu sekvencu, kada zamenjuje specifičnu sekvencu u T ćelijskom receptoru, zadržava vezivanje pomenutog T ćelijskog receptora za cilj i poželjno, funkcije pomenutog T ćelijskog receptora ili T ćelija koje nose T ćelijski receptor, kao što je ovde opisano.

[0277] Na primer, sekvence prikazane u listingu sekvenci, mogu biti modifikovane tako da se ukloni jedan ili više, poželjno svi slobodni cisteinski ostaci, posebno zamenom cisteinskih ostataka pomoću aminokiselina drugačijih od cisteina, poželjno serina, alanina, treonina, glicina, tirozina, leucina ili metionina, najpoželjnije alanina ili serina. Na primer, cistein na položaju 45 sekvence prikazane u SEQ ID NO: 33 liste sekvenci ili odgovarajući cistein u sekvenci koja sadrži navedenu sekvencu može biti modifikovan na ovaj način.

[0278] Stručnjaci u ovoj oblasti će shvatiti da se posebno sekvence CDR sekvenci, hipervarijabilni i varijabilni regioni mogu modifikovati bez gubitka sposobnosti da se vežu za cilj. Na primer, CDR regioni će biti ili identični ili visoko homologni regionima antitela koji su ovde specifikovani. Pod "visoko homolognim" smatra se da mogu biti napravljene od 1 do 5, poželjno od 1 do 4, kao što su 1 do 3 ili 1 ili 2 supstitucije, u CDR regionima. Pored toga, hipervarijabilni i varijabilni regioni mogu biti modifikovani tako da pokazuju značajnu homologiju sa regionima koji su ovde specifično opisani.

[0279] Peptidna "varijanta" može zadržati imunogenost datog peptida (npr. sposobnost varijante da reaguje sa T ćelijskim linijama ili klonovima nije značajno umanjena u odnosu na dati peptid). Drugim rečima, sposobnost varijante da reaguje sa T ćelijskim linijama ili klonovima može biti pojačana ili nepromenjena, u odnosu na dati peptid, ili može biti smanjena za manje od 50%, a poželjno manje od 20%, u odnosu na dati peptid.

[0280] Varijanta može biti identifikovana procenom njegove sposobnosti da se veže za MHC molekul. U jednoj poželjnom primeru izvođenja, varijantni peptid ima modifikaciju tako da je sposobnost varijantnog peptida da se veže za MHC molekul povećana u odnosu na dati peptid. Sposobnost varijante peptida da se veže za MHC molekul, može biti povećana najmanje 2 puta, poželjno najmanje 3 puta, 4 puta ili 5 puta u odnosu na onu od datog peptida. Shodno tome, u okviru određenih poželjnih primera izvođenja, peptid sadrži varijantu u kojoj su supstituisane 1 do 3 aminokiselina unutar imunogenog dela, tako da je sposobnost reagovanja sa T ćelijskim linijama ili klonovima statistički značajno veća od one za nemodifikovani peptid. Takve supstitucije su poželjno lokalizovane unutar mesta za vezivanje MHC od peptida. Poželjne supstitucije omogućavaju povećano vezivanje za MHC klasu I ili klasu II molekula. Određene varijante sadrže konzervativne supstitucije.

[0281] Izraz "varijanta" prema učenju takođe, uključuje mutante, varijante spajanja, konformacije, izoforme, alelne varijante, varijante vrsta i homologe vrsta, posebno one koji su prirodno prisutni. Alelna varijanta se odnosi na promenu u normalnoj sekvenci gena, čija je značajnost često nejasna. Potpuno sekvencioniranje gena često identifikuje brojne alelne varijante za dati gen. Homolog vrste je nukleinska kiselina ili aminokiselinska sekvenca sa različitim vrstama poreklom od one date nukleinske kiseline ili sekvence aminokiseline. Izraz "varijanta" će obuhvatiti bilo koje postranslaciono modifikovane varijante i konformacijske varijante.

[0282] Za svrhe sadašnjeg učenja, "varijante" aminokiselinske sekvence obuhvataju varijante umetanja aminokiselina, varijante dodavanja aminokiselina, varijante brisanja aminokiselina i / ili varijante supstitucije aminokiselina. Varijacije aminokiselinske delecije koje sadrže deleciju na N-terminalnom i / ili C-terminalnom kraju proteina se takođe nazivaju N-terminalne i / ili C-terminalne varijante odsecanja.

[0283] Varijante aminokiselinskog umetanja obuhvataju ubacivanja pojedinačnih ili dve ili više aminokiselina u određenu aminokiselinsku sekvencu. U slučaju da varijante aminokiselinske sekvence imaju ubacivanje, jedan ili više aminokiselinskih ostataka su ubačeni na određeno mesto u aminokiselinskoj sekvenci, mada je moguće i slučajno umetanje sa odgovarajućim skriningom dobijenog proizvoda.

[0284] Varijante aminokiselinskih dodavanja sadrže amino i / ili karboksi-terminalne fuzije jedne ili više aminokiselina, kao što su 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50, ili više aminokiselina.

[0285] Varijante aminokiselinske delecije su karakterisane uklanjanjem jedne ili više aminokiselina iz sekvence, kao što je uklanjanje 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50 ili više aminokiselina. Delecije mogu biti u bilo kom položaju proteina.

[0286] Varijante aminokiselinske supstitucije su karakterisane najmanje jednim ostatkom u sekvenci koji je uklonjen i drugim ostatkom koji je ubačen na njegovo mesto. Prednost je data modifikacijama koje su na položajima u aminokiselinskoj sekvenci koji nisu konzervirani između homolognih proteina ili peptida i / ili zamenama aminokiselina sa drugim koje imaju slična svojstva. Poželjno, aminokiselinske promene u varijantama proteina su konzervativne aminokiselinske promene, tj., supstitucije slično naelektrisanih ili nenaelektrisanih aminokiselina. Konzervativna promena aminokiselina podrazumeva supstituciju jedne od familije aminokiselina koje su povezane u njihovim bočnim lancima. Prirodne aminokiseline su generalno podeljene u četiri familije: kisele (aspartat, glutamat), osnovne (lizin, arginin, histidin), nepolarne (alanin, valin, leucin, izoleucin, prolin, fenilalanin, metionin, triptofan) i nenaelektrisane polarne (glicin, asparagin, glutamin, cistein, serin, treonin, tirozin) aminokiseline. Fenilalanin, triptofan i tirozin su ponekad zajednički klasifikovane kao aromatične aminokiseline.

[0287] Poželjno, stepen sličnosti, poželjno identičnost između date aminokiselinske sekvence i aminokiselinske sekvence koja je varijanta pomenute date aminokiselinske sekvence će biti najmanje oko 60%, 65%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99%. Stepen sličnosti ili identičnosti je dat poželjno za izvestan aminokiselinski region koji je najmanje oko 10%, najmanje oko 20%, najmanje oko 30%, najmanje oko 40%, najmanje oko 50%, najmanje oko 60%, najmanje oko 70%, najmanje oko 80%, najmanje oko 90% ili oko 100% od ukupne dužine referentne aminokiselinske sekvence. Na primer, ako se referentna aminokiselinska sekvenca sastoji od 200 aminokiselina, stepen sličnosti ili identičnosti je dat poželjno za najmanje oko 20, najmanje oko 40, najmanje oko 60, najmanje oko 80, najmanje oko 100, najmanje oko 120, najmanje oko 140, najmanje oko 160, najmanje oko 180, ili oko 200 aminokiselina, poželjno kontinuiranih aminokiselina. U poželjnim primerima izvođenja, stepen sličnosti ili identičnosti je dat za celokupnu dužinu referentne aminokiselinske sekvence. Poravnanje za određivanje sličnosti sekvenci, poželjno identičnost sekvenci može se izvršiti pomoću poznatih alata, poželjno koristeći najbolje poravnanje sekvenci, na primer, korišćenjem Align, koristeći standardne postavke, poželjno EMBOSS:: needle, Matriks: Blosum62, Gap Open 10,0, Gap Extend 0,5.

[0288] "Sličnost sekvence" označava procenat aminokiselina koje su ili identične ili koje predstavljaju konzervativne supstitucije aminokiselina. "Identičnost sekvence" između dve aminokiselinske sekvence označava procenat aminokiselina koje su identične između sekvenci.

[0289] Izraz "procenat identičnosti" je određen da označi procenat aminokiselinskih ostataka koji su identični između dve sekvence koje treba da se uporede, dobijene posle najboljeg poravnanja, ovaj procenat je čisto statistički i razlike između dve sekvence se distribuiraju slučajno i preko njihove celokupne dužine. Poređenja sekvenci između dve aminokiselinske sekvence se konvencionalno izvode upoređivanjem ovih sekvenci nakon što su ih optimalno poravnale, pri čemu se pomenuto poređenje sprovodi po segmentima ili "prozorima poređenja" kako bi se identifikovale i uporedile lokalne oblasti sličnosti sekvenci. Optimalno poravnanje sekvenci za poređenje može biti proizvedeno, osim ručno, pomoću algoritma lokalne homologije od Smitha i Watermana, 1981, Ads App. Math.2, 482, pomoću algoritma lokalne homologije od Neddlemana i Wunscha, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443, metodom pretraživanja sličnosti Pearson i Lipman, 1988, Proc. Natl Acad. Sci. USA 85, 2444, ili pomoću kompjuterskih programa koji koriste ove algoritme (GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST P, BLAST N i TFASTA u Wisconsin Genetics Softvare Package. Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis).

[0290] Procenat identičnosti se izračunava određivanjem broja identičnih položaja između dve sekvence koje se porede, deljenjem ovog broja sa brojem upoređenih položaja i množenjem dobijenog rezultata sa 100, tako da se dobije procenat identičnosti između ove dve sekvence.

[0291] Homologne aminokiselinske sekvence pokazuju prema učenju najmanje 40%, posebno najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90% i poželjno najmanje 95%, najmanje 98%, ili najmanje 99% identičnosti aminokiselinskih ostataka.

[0292] Varijante aminokiselinskih sekvenci koje su ovde opisane, mogu biti lako pripremljene od strane stručnjaka, na primer, rekombinantnom DNK manipulacijom. Manipulacija DNK sekvenci za pripremu proteina i peptida koji imaju supstitucije, adicije, umetanja ili delecije je detaljno opisana u Sambrook i sar. (1989), na primer. Osim toga, peptidi i aminokiselinske varijante koje su ovde opisane, mogu biti lako pripremljene uz pomoć poznatih tehnika sinteze peptida kao što su, na primer, sinteza na čvrstoj fazi i slični postupci.

[0293] Učenje uključuje derivate peptida ili proteina koji su ovde opisani i koji su obuhvaćeni izrazima "peptid" i "protein". Prema učenju, "derivati" proteina i peptida su modifikovani oblici proteina i peptida. Takve modifikacije uključuju bilo koju hemijsku modifikaciju i obuhvataju pojedinačne ili višestruke supstitucije, delecije i / ili dodavanja bilo kojih molekula povezanih sa proteinom ili peptidom, kao što su ugljeni hidrati, lipidi i / ili proteini ili peptidi. U jednom izvođenju, "derivati" proteina ili peptida, uključuju one modifikovane analoge koji nastaju iz glikozilacije, acetilacije, fosforilacije, amidacije, palmitoilacije, miristilacije, izoprenilacije, lipidacije, alkilacije, derivatizacije, uvođenja zaštitnih blokirajućih grupa, proteolitičkog cepanja ili vezivanja za antitelo ili za drugi ćelijski ligand. Izraz "derivat" se takođe proteže na sve funkcionalne hemijske ekvivalente pomenutih proteina i peptida. Poželjno, modifikovani peptid ima povećanu stabilnost i / ili povećanu imunogenost.

[0294] Takođe su uključeni mimetici peptida. Takvi mimetici mogu da sadrže aminokiseline povezane sa jednim ili više aminokiselinskih mimetika (tj., jedna ili više aminokiselina unutar peptida mogu biti zamenjene aminokiselinskim mimetikom) ili mogu biti potpuno nepeptidni mimetici. Aminokiselinski mimetik je jedinjenje koje je konformaciono slično aminokiselini, npr. tako da može biti zamenjeno aminokiselinom bez značajnog smanjenja sposobnosti da reaguje sa T ćelijskim linijama ili klonovima. Nepeptidni mimetik je jedinjenje koje ne sadrži aminokiseline i koje ima ukupnu konformaciju koja je slična peptidu, npr. tako da sposobnost mimetika da reaguje sa T ćelijskim linijama ili klonovima nije značajno smanjena u odnosu na sposobnost datog peptida.

[0295] Prema učenju, jedna varijanta, derivat, modifikovani oblik, fragment, deo ili porcija izvesne aminokiselinske sekvence, peptida ili proteina poželjno ima funkcionalno svojstvo aminokiselinske sekvence, peptida ili proteina, respektivno od kojih je izvedena, tj. ona je funkcionalno ekvivalentna. U jednom primeru izvođenja, jedna varijanta, derivat, modifikovani oblik, fragment, deo ili porcija izvesne aminokiselinske sekvence, peptida ili proteina je imunološki ekvivalentna aminokiselinskoj sekvenci, peptidu ili proteinu, respektivno, od kojih je izvedena. U jednom izvođenju, funkcionalno svojstvo je imunološko svojstvo.

[0296] Posebno svojstvo je sposobnost formiranja kompleksa sa MHC molekulama i, tamo gde je to prikladno, generisanje imunskog odgovora, poželjno stimulisanjem citotoksičnih ili T pomoćnih ćelija.

[0297] Izraz "imunološki ekvivalent" označava da imunološki ekvivalentna molekula, kao što je imunološki ekvivalentna aminokiselinska sekvenca ispoljava iste ili suštinski iste imunološke osobine i / ili ispoljava iste ili suštinski iste imunološke efekte, npr., u odnosu na tip imunološkog efekta, kao što je indukcija humoralnog i / ili ćelijskog imunskog odgovora, jačina i / ili trajanje indukovane imunske reakcije, ili specifičnost indukovane imunske reakcije. U kontekstu sadašnjeg učenja, izraz "imunološki ekvivalent" se poželjno koristi u odnosu na imunološke efekte ili osobine peptida ili peptidne varijante koja se koristi za imunizaciju. Na primer, izvesna aminokiselinska sekvenca je imunološki ekvivalentna referentnoj aminokiselinskoj sekvenci ako pomenuta aminokiselinska sekvenca kada je izložena imunološkom sistemu subjekta indukuje imunološku reakciju koja ima specifičnost reagovanja sa referentnom aminokiselinskom sekvencom.

[0298] Izraz "izveden" označava prema učenju da je određeni entitet, naročito određena sekvenca prisutna u objektu iz koga je izvedena, naročito organizma ili molekula. U slučaju aminokiselinskih sekvenci, naročito specifičnih sekvencijskih regiona, "izveden" posebno označava da je relevantna aminokiselinska sekvenca izvedena iz aminokiselinske sekvence u kojoj je prisutna.

[0299] Izraz "ćelija" ili "ćelija domaćina" se poželjno odnosi na čitavu ćeliju, tj. ćeliju sa netaknutom membranom koja nije oslobodila njene normalne intracelularne komponente, kao što su enzimi, organele ili genetski materijal. Čitava ćelija je poželjno živa ćelija, tj. živa ćelija sposobna da izvede njene normalne metaboličke funkcije. Poželjno je da se pomenuti izraz odnosi prema učenju na bilo koju ćeliju koja može biti transfektovana egzogenom nukleinskom kiselinom. Poželjno, ćelija kada je transfektovana sa egzogenom nukleinskom kiselinom i preneta na primaoca može da eksprimira nukleinsku kiselinu u primaocu. Izraz "ćelija" uključuje bakterijske ćelije; druge korisne ćelije su ćelije kvasca, ćelije gljivica ili ćelije sisara. Pogodne bakterijske ćelije, uključuju ćelije iz gram-negativnih bakterijskih sojeva kao što su sojevi Escherichia coli, Proteus i Pseudomonas, i gram-pozitivnih bakterijskih sojeva kao što su sojevi Bacillus, Streptomyces, Staphylococcus i Lactococcus. Pogodna ćelija gljivica uključuje ćelije iz vrsta Trichoderma, Neurospora i Aspergilusa. Pogodne ćelije kvasca uključuju ćelije iz vrsta Saccharomyces (na primer Saccharomyces cerevisiae), Schizosaccharomyces (na primer Schizo saccharomyces pombe), Pichia (na primer Pichia pastoris i Pichia methanolicd) i Hansenula. Pogodne ćelije sisara uključuju, na primer CHO ćelije, BHK ćelije, HeLa ćelije, COS ćelije, 293 HEK i slično. Međutim, takođe, mogu biti korišćene amfibijske ćelije, ćelije insekata, biljne ćelije i bilo koje druge ćelije koje su korišćene u struci za ekspresiju heterolognih proteina. Ćelije sisara su naročito poželjne za adoptivni prenos, kao što su ćelije od ljudi, miševa, hrčaka, svinja, koza i primata. Ćelije mogu biti izvedene iz velikog broja tipova tkiva i uključuju primarne ćelije i ćelijske linije kao što su ćelije imunskog sistema, posebno antigen-prezentujuće ćelije, kao što su dendritske ćelije i T ćelije, matične ćelije kao što su hematopoetske matične ćelije i mezenhimalne matične ćelije i drugi tipovi ćelija. Ćelija za predstavljanje antigena je ćelija koja prikazuje antigen u kontekstu glavnog kompleksa histokompatibilnosti na njenoj površini. T ćelije mogu prepoznati ovaj kompleks korišćenjem njihovog T ćelijskog receptora (TCR).

[0300] Ćelija koja sadrži molekul nukleinske kiseline poželjno, eksprimira peptid ili protein kodiran nukleinskom kiselinom.

[0301] Ćelija može biti rekombinantna ćelija i može da sekretuje kodirani peptid ili protein, može ga izraziti na površini i poželjno, može dodatno eksprimirati MHC molekul koji se vezuje za navedeni peptid ili protein ili njegov proizvod obrade. U jednom izvođenju, ćelija endogeno eksprimira molekul MHC. U dodatnom primeru izvođenja, ćelija eksprimira MHC molekul i / ili peptid ili protein ili njegov proizvod obrade na rekombinantni način. Ćelija je poželjno neproliferativna. U poželjnom primeru izvođenja, ćelija je antigen prezentujuća ćelija, naročito dendritska ćelija, monocit ili makrofag.

[0302] Izraz "klonalna ekspanzija" se odnosi na postupak u kome je specifični entitet umnožen. U kontekstu sadašnjeg učenja, izraz je poželjno korišćen u kontekstu imunološkog odgovora u kojem su limfociti stimulisani antigenom, proliferišu i specifični limfocit koji prepoznaje navedenog antigena je pojačan. Poželjno, klonalna ekspanzija dovodi do diferencijacije limfocita.

[0303] Bolest povezana sa ekspresijom antigena može biti detektovana na osnovu prisustva T ćelija koje specifično reaguju sa peptidom u biološkom uzorku. Unutar određenih metoda, biološki uzorak koji sadrži CD4+ i / ili CD8+ T ćelije izolovane od pacijenta je inkubiran sa peptidom prema učenju, nukleinskom kiselinom koja kodira takvog peptida i / ili ćelijom za predstavljanje antigena koja eksprimira i / ili predstavlja najmanje imunogeni deo takvog peptida, i detektovano je prisustvo ili odsustvo specifične aktivacije T ćelija. Pogodni biološki uzorci uključuju, ali nisu ograničeni na, izolovane T ćelije. Na primer, T ćelije mogu biti izolovane iz pacijenta rutinskim tehnikama (kao pomoću Ficoll / Hipaque gradijenta gustine centrifugiranjem limfocita periferne krvi). Za CD4+ T ćelije, aktivacija je poželjno detektovana procenom proliferacije T ćelija. Za CD8+ T ćelije, aktivacija je poželjno detektovana procenom citolitičke aktivnosti. Nivo proliferacije koji je najmanje dva puta veći i / ili nivo citolitičke aktivnosti koji je najmanje 20% veći nego kod subjekata bez bolesti ukazuje na prisustvo bolesti povezane sa ekspresijom antigena kod subjekta.

[0304] "Smanjuje" ili "inhibira", kako je ovde korišćeno, označava sposobnost da se izazove ukupno smanjenje, poželjno od 5% ili više, 10% ili više, 20% ili više, poželjnije 50% ili više, a najpoželjnije 75% ili više, u nivou. Izraz "inhibira" ili slične fraze uključuje potpunu ili suštinski potpunu inhibiciju, tj. redukciju na nulu ili suštinski na nulu.

[0305] Izrazi kao što su "povećava" ili "poboljšava" se poželjno odnose na povećanje ili poboljšanje za oko najmanje 10%, poželjno najmanje 20%, poželjno najmanje 30%, poželjnije najmanje 40%, još poželjnije najmanje 50%, čak još poželjnije najmanje 80%, a najpoželjnije najmanje 100%.

[0306] Agensi, preparati i postupci koji su ovde opisani, mogu biti korišćeni za lečenje subjekta sa bolešću, npr., bolešću koja je karakterisana prisustvom obolelih ćelija koje eksprimiraju CLDN6 i poželjno predstavljajući CLDN6 u kontekstu MHC molekula. Primeri bolesti koje mogu biti lečene i / ili sprečene obuhvataju sve bolesti koje eksprimiraju CLDN6. Posebno poželjne bolesti su bolesti raka.

[0307] Agensi, preparati i postupci koji su ovde opisani, mogu takođe biti korišćeni za imunizaciju ili vakcinaciju da bi se sprečila bolest koja je ovde opisana.

[0308] Izrazi "normalno tkivo" ili "normalni uslovi" se odnose na zdravo tkivo ili stanja u zdravom subjektu, tj., nepatološka stanja, pri čemu "zdravi" poželjno označava nekancerozni.

[0309] Izraz "bolest" se odnosi na abnormalno stanje koje utiče na telo pojedinca. Bolest se često tumači kao medicinsko stanje povezano sa specifičnim simptomima i znacima. Bolest može biti uzrokovana faktorima koji potiču iz spoljašnjeg izvora, kao što su infektivne bolesti, ili može biti uzrokovana unutrašnjim disfunkcijama, kao što su autoimune bolesti. Kod ljudi se "bolest" često koristi u širem smislu za označavanje bilo kog stanja koje uzrokuje bol, disfunkciju, distres, socijalne probleme ili smrt pojedinca koji boluje, ili sličnih problema za one koji su u kontaktu sa pojedincem. U ovom širem smislu, ponekad uključuje povrede, invaliditet, poremećaje, sindrome, infekcije, izolovane simptome, devijantna ponašanja i netipične varijacije strukture i funkcije, dok se u drugim kontekstima i za druge svrhe mogu smatrati prepoznatljivim kategorijama. Bolesti obično pogađaju pojedince ne samo fizički, već i emocionalno, jer kontaktiranje i življenje sa mnogim bolestima može promeniti nečije stavove o životu i nečiju ličnost. Prema učenju, izraz "bolest" uključuje rak, naročito one oblike raka koji su ovde opisani. Ovde, bilo koje upućivanje na rak ili određene oblike raka takođe, uključuje njegove metastaze. U poželjnom primeru izvođenja, bolest koja će biti tretirana u skladu sa sadašnjom prijavom, uključuje ćelije koje eksprimiraju CLDN6 i opciono predstavljaju CLDN6 u kontekstu MHC molekula.

[0310] "Bolesti koje uključuju ćelije koje eksprimiraju CLDN6" ili slične ekspresije označavaju prema učenju da je CLDN6 eksprimiran u ćelijama obolelog tkiva ili organa. U jednom primeru izvođenja, ekspresija CLDN6 u ćelijama obolelog tkiva ili organa je povećana u poređenju sa stanjem u zdravom tkivu ili organu. Povećanje se odnosi na povećanje od najmanje 10%, posebno najmanje 20%, najmanje 50%, najmanje 100%, najmanje 200%, najmanje 500%, najmanje 1000%, najmanje 10000% ili čak više. U jednom primeru izvođenja, ekspresija je nađena samo u obolelom tkivu, dok je ekspresija u zdravom tkivu potisnuta. Prema učenju, bolesti koje uključuju ćelije koje eksprimiraju CLDN6, uključuju bolesti raka. Štaviše, prema učenju, karcinomske bolesti su poželjno one u kojima ćelije raka eksprimiraju CLDN6.

[0311] Izrazi "karcinomska bolest" ili "rak" se odnose na ili opisuju fiziološko stanje kod pojedinca koje je tipično karakterisano neregulisanim ćelijskim rastom. Primeri raka uključuju, ali nisu ograničeni na, karcinom, limfom, blastom, sarkom i leukemiju. Preciznije, primeri takvih karcinoma uključuju rak kostiju, rak krvi, rak pluća, rak jetre, rak pankreasa, rak kože, rak glave ili vrata, kožni ili intraokularni melanom, rak materice, rak jajnika, rak rektuma, rak analnog regiona, rak želuca, rak debelog creva, rak dojke, rak prostate, rak materice, karcinom seksualnih i reproduktivnih organa, Hodgkinovu bolest, rak jednjaka, rak tankog creva, rak endokrinog sistema, rak štitne žlezde, rak paratiroidne žlezde, rak nadbubrežne žlezde, sarkom mekog tkiva, rak bešike, rak bubrega, karcinom bubrežnih ćelija, karcinom bubrežne karlice, neoplazme centralnog nervnog sistema (CNS), neuroektodermalni rak, tumore kičmene osovine, gliom, meningiom i adenom hipofize. Izraz "rak" prema učenju takođe, obuhvata metastaze raka. Poželjno, "bolest raka" je karakterisana ćelijama koje eksprimiraju CLDN6 i ćelijama raka koje eksprimiraju CLDN6.

[0312] Bolesna ćelija je poželjno, ćelija koja eksprimira CLDN6, pomenuti CLDN6 je poželjno prisutan na površini pomenute ćelije kao transmembranski protein i / ili je predstavljen od strane pomenute ćelije u kontekstu MHC, kao što je MHC I. Ćelija koja eksprimira CLDN6 poželjno je ćelija raka, poželjno ovde opisanih karcinoma.

[0313] U jednom primeru izvođenja, bolest raka je maligna bolest koja je karakterisana svojstvima anaplazije, invazivnosti i metastaza. Maligni tumor može biti u kontrastu sa nekancerogenim benignim tumorom, u tome da malignost nije samo-ograničena u svom rastu, sposobna je da napadne susedna tkiva, i može biti sposobna za širenje u udaljena tkiva (metastaziranje), dok benigni tumor nema nijednu od ovih osobina.

[0314] Prema učenju, izraz "tumor" ili "tumorska bolest" se odnosi na oticanje ili leziju formiranu abnormalnim rastom ćelija (nazvanih neoplastične ćelije ili tumorske ćelije). Pod izrazom "tumorska ćelija" podrazumeva se abnormalna ćelija koja raste brzom, nekontrolisanom ćelijskom proliferacijom i nastavlja da raste posle prekida stimulansa koji su inicirali novi rast. Tumori pokazuju delimičan ili potpuni nedostatak strukturalne organizacije i funkcionalne koordinacije sa normalnim tkivom i obično formiraju različitu masu tkiva, koja može biti ili benigna, pre-maligna ili maligna.

[0315] Prema učenju, "karcinom" je maligni tumor izveden iz epitelnih ćelija. Ova grupa predstavlja najčešće oblike raka, uključujući uobičajene oblike raka dojke, prostate, pluća i debelog creva.

[0316] "Adenokarcinom" je rak koji nastaje u žlezdanom tkivu. Ovo tkivo je takođe deo veće kategorije tkiva poznate kao epitelno tkivo. Epitelno tkivo uključuje kožu, žlezde i mnoga druga tkiva koja povezuju šupljine i organe tela. Epitel je izveden embriološki iz ektoderma, endoderma i mezoderma. Da bi se klasifikovale kao adenokarcinom, ćelije ne moraju nužno da budu deo žlezde, sve dok imaju sekretorna svojstva. Ovaj oblik karcinoma se može javiti kod nekih viših sisara, uključujući ljude. Dobro diferencirani adenokarcinomi imaju tendenciju da podsećaju na žlezdano tkivo iz kojeg potiču, dok slabo diferencirani ne mogu. Bojenjem ćelija iz biopsije, patolog će utvrditi da li je tumor adenokarcinom ili neki drugi tip raka. Adenokarcinomi mogu nastati u mnogim tkivima organizma zbog sveprisutne prirode žlezda unutar tela. Dok svaka žlezda ne može da izlučuje istu supstancu, sve dok postoji egzokrina funkcija u ćeliji, smatra se da je glandularna i da je zbog toga njen maligni oblik nazvan adenokarcinom. Maligni adenokarcinomi napadaju druga tkiva i često metastaziraju s obzirom na dovoljno vremena da to urade. Adenokarcinom jajnika je najčešći tip karcinoma jajnika. Uključuje serozne i mucinozne adenokarcinome, adenokarcinom čiste ćelije i endometrioidni adenokarcinom.

[0317] Limfom i leukemija su maligniteti koji potiču od hematopoetskih (krvno-obrazujućih) ćelija.

[0318] Blastični tumor ili blastom je tumor (obično maligni) koji liči na nezrelo ili embrionsko tkivo. Mnogi od ovih tumora su najčešći kod dece.

[0319] Pod "metastazom" se podrazumeva širenje ćelija raka sa originalnog mesta na drugi deo tela. Obrazovanje metastaza je veoma složen proces i zavisi od odvajanja malignih ćelija od primarnog tumora, invazije ekstracelularnog matriksa, prodiranja endotelnih bazalnih membrana da uđu u telesnu šupljinu i krvne sudove, a zatim, nakon prenošenja krvlju infiltracije ciljnih organa. Konačno, rast novog tumora na ciljnom mestu zavisi od angiogeneze. Metastaza tumora se često javlja čak i nakon uklanjanja primarnog tumora, jer tumorske ćelije ili komponente mogu ostati i razviti metastatski potencijal. U jednom primeru izvođenja, izraz "metastaza" prema učenju se odnosi na "udaljenu metastazu" koja se odnosi na metastazu koja je udaljena od primarnog tumora i regionalnog sistema limfnih čvorova. U jednom primeru izvođenja, izraz "metastaza" prema učenju se odnosi na metastaze limfnih čvorova.

[0320] Ćelije sekundarnog ili metastatskog tumora su poput onih u originalnom tumoru. Ovo označava, na primer, da, ako rak jajnika metastazira u jetru, sekundarni tumor je sačinjen od abnormalnih ćelija jajnika, a ne od abnormalnih ćelija jetre. Tumor u jetri se tada naziva metastatski rak jajnika, a ne rak jetre.

[0321] Recidiv ili vraćanje se dešava kada je osoba ponovo pogođena stanjem koje je imalo uticaja na nju u prošlosti. Na primer, ako je pacijent bolovao od tumorske bolesti, dobio je uspešno lečenje pomenute bolesti i ponovo razvio pomenutu bolest, navedeno novo razvijeno oboljenje se može smatrati recidivom ili povratkom. Međutim, prema učenju, recidiv ili povratak tumorske bolesti može, ali se ne mora desiti, na mestu originalne tumorske bolesti.

Tako, na primer, ako je pacijent bolovao od tumora jajnika i primio uspešan tretman, recidiv ili vraćanje može biti pojava tumora jajnika ili pojava tumora na mestu različitom od jajnika. Povraćaj ili ponavljanje tumora takođe, uključuje situacije u kojima se tumor javlja na mestu različitom od mesta originalnog tumora, kao i na mestu originalnog tumora. Poželjno, originalni tumor za koji je pacijent primio tretman je primarni tumor, a tumor na mestu različitom od mesta originalnog tumora je sekundarni ili metastatski tumor.

[0322] Izraz "tretman" ili "terapeutski tretman" se odnosi na bilo koji tretman koji poboljšava zdravstveni status i / ili produžava (povećava) životni vek pojedinca. Navedeno lečenje može eliminisati bolest kod pojedinca, zaustaviti ili usporiti razvoj bolesti kod pojedinca, inhibirati ili usporiti razvoj bolesti kod pojedinca, smanjiti učestalost ili ozbiljnost simptoma kod pojedinca, i / ili smanjiti recidiv kod pojedinca koji trenutno ima ili je prethodno imao bolest.

[0323] Izrazi "profilaktički tretman" ili "preventivni tretman" se odnose na bilo koji tretman koji je namenjen da spreči pojavu bolesti kod pojedinca. Izrazi "profilaktički tretman" ili "preventivni tretman" su ovde korišćeni naizmenično.

[0324] Izrazi "pojedinac" i "subjekt" su ovde korišćeni naizmenično. Oni se odnose na ljudska bića, nehumane primate ili druge sisare (npr. miš, pacov, zec, pas, mačka, stoka, svinja, ovca, konj ili primat) koji mogu biti pogođeni ili su podložni bolesti ili poremećaju (npr., rak), ali mogu ili ne moraju imati bolest ili poremećaj. U mnogim primerima izvođenja, pojedinac je ljudsko biće. Ukoliko nije drugačije navedeno, izrazi "pojedinac" i "subjekt" ne označavaju određenu starost, i stoga obuhvataju odrasle, starije osobe, decu i novorođenčad. U poželjnim primerima izvođenja sadašnjeg učenja, "pojedinac" ili "subjekt" je "pacijent". Izraz "pacijent" označava prema učenju subjekta za lečenje, naročito obolelog subjekta.

[0325] Pod "biti izložen riziku" se podrazumeva subjekt, tj. pacijent, koji je identifikovan kao onaj koji ima veću šansu od normalne za razvoj bolesti, posebno raka, u poređenju sa opštom populacijom. Osim toga, subjekt koji je bolovao, ili koji trenutno ima bolest, posebno rak je subjekt koji ima povećan rizik za razvoj bolesti, jer takav subjekt može nastaviti da razvija bolest. Subjekti koji trenutno imaju, ili koji su imali, rak takođe, imaju povećan rizik od metastaza raka.

[0326] Izraz "imunoterapija" se odnosi se lečenje koje uključuje specifičnu imunsku reakciju.

[0327] U kontekstu sadašnjeg učenju, izrazi kao što su "štiti", "sprečava", "profilaktički", "preventivni" ili "zaštitni" se odnose na prevenciju ili lečenje ili i na pojavu i / ili na širenje bolesti kod subjekta posebno, na smanjenje šanse da će subjekt razviti bolest ili odložiti razvoj bolesti. Na primer, osoba koja je izložena riziku od tumora, kao što je gore opisano, bila bi i kandidat za terapiju za sprečavanje tumora.

[0328] Profilaktička primena imunoterapije, na primer, profilaktička primena agensa ili preparata prema učenju, poželjno štiti primaoca od razvoja bolesti. Terapijska primena imunoterapije, na primer, terapeutska primena agensa ili preparata prema učenju, može dovesti do inhibicije napredovanja / rasta bolesti. Ovo obuhvata usporavanje napretka / rasta bolesti, posebno poremećaj progresije bolesti, koji poželjno dovodi do eliminacije bolesti.

[0329] Imunoterapija može biti izvedena korišćenjem bilo koje od različitih tehnika, u kojima agensi koji su ovde obezbeđeni poželjno funkcionišu da uklone ćelije koje eksprimiraju CLDN6 kod pacijenta. Takvo uklanjanje se može desiti kao rezultat poboljšanja ili indukovanja imunskog odgovora kod pacijenta specifičnog za CLDN6 ili ćelije koja eksprimira CLDN6 i / ili predstavlja CLDN6 u kontekstu MHC molekula.

[0330] U određenim primerima izvođenja, imunoterapija može biti aktivna imunoterapija, u kojoj se tretman oslanja na in vivo stimulaciju endogenog imunskog sistema domaćina da reaguje protiv obolelih ćelija uz primenu agenasa za modifikovanje imunskog odgovora (kao što su peptidi i nukleinske kiseline, kao što je ovde obezbeđeno).

[0331] U drugim primerima izvođenja, imunoterapija može biti pasivna imunoterapija, u kojoj tretman uključuje isporuku agenasa sa uspostavljenom tumorsko-imunskom reaktivnošću (kao što su efektorske ćelije) koji mogu direktno ili indirektno posredovati antitumorski efekat i ne mora nužno da zavisi od čitavog imunskog sistema domaćina. Primeri efektorskih ćelija, uključuju T limfocite (kao što su CD8+ citotoksični T limfociti i CD4+ T-pomoćni limfociti) i antigen-prezentujuće ćelije (kao što su dendritske ćelije i makrofagi). T ćelijski receptori specifični za CLDN6 peptide koji su ovde navedeni i veštački T-ćelijski receptori specifični za CLDN6 mogu biti preneti u efektorske ćelije za adaptivnu imunoterapiju.

[0332] Kao što je gore navedeno, imunoreaktivni peptidi kao što je ovde obezbeđeno, mogu biti korišćeni za brzo širenje T ćelijskih kultura specifičnih za antigen, kako bi se generisao dovoljan broj ćelija za imunoterapiju. Naročito, ćelije koje predstavljaju antigen, kao što su dendritske ćelije, makrofagi, monociti, fibroblasti i / ili B ćelije, mogu biti stimulisane sa imunoreaktivnim peptidima ili transfektovane sa jednom ili više nukleinskih kiselina korišćenjem standardnih tehnika koje su dobro poznate u struci. Kultivisane efektorske ćelije za korišćenje u terapiji, moraju biti sposobne da rastu i da se široko distribuišu, a i za dugoročno preživljavanje in vivo. Istraživanja su pokazala da se kultivisane efektorske ćelije mogu indukovati da rastu in vivo i da prežive dugoročno u značajnom broju ponovljenom stimulacijom sa antigenom dopunjenim sa IL-2 (videti, na primer, Cheever i sar. 1997), Immunological Reviews 157, 177.

[0333] Alternativno, nukleinska kiselina koja eksprimira peptid, ovde opisan, može biti uvedena u ćelije koje predstavljaju antigen i koje su uzete od pacijenta i klonalno umnožene ex vivo za transplantaciju nazad u istog pacijenta.

[0334] Transfektovane ćelije mogu biti ponovo uvedene u pacijenta korišćenjem bilo kog načina koji je poznat u struci, poželjno u sterilnom obliku, intravenskom, intrakavitarnom, intraperitonealnom ili intratumorskom primenom.

[0335] Ovde opisani postupci, mogu da uključuju primenu autolognih T ćelija koje su aktivirane kao odgovor na peptid ili antigen prezentujuću ćeliju koja eksprimira peptid. Takve T ćelije mogu biti CD4+ i / ili CD8+ i mogu biti proliferisane, kao što je gore opisano. T ćelije mogu biti primenjene kod subjekta u količini koja je efikasna da inhibira razvoj bolesti.

[0336] Izraz "imunizacija" ili "vakcinacija" opisuje postupak lečenja subjekta sa ciljem indukovanja imunskog odgovora za terapeutske ili profilaktičke razloge.

[0337] Izraz "in vivo" se odnosi na situaciju u subjektu.

[0338] Prema učenju, "uzorak" može biti bilo koji uzorak koji je koristan u skladu sa sadašnjim učenjem, naročito biološki uzorak, takav uzorak tkiva, uključujući telesne tečnosti, i / ili ćelijski uzorak i može biti dobijen na konvencionalan način, kao što je biopsijom tkiva, uključujući biopsiju perforiranjem i uzimanjem krvi, bronhijalnog aspirata, sputuma, urina, fecesa ili drugih telesnih tečnosti. Prema učenju, izraz "uzorak" takođe uključuje obrađene uzorke, kao što su frakcije ili izolati bioloških uzoraka, npr. izolati nukleinske kiseline i peptida / proteina.

[0339] Ovde opisana jedinjenja i sredstva, mogu biti primenjena u obliku bilo kog pogodnog farmaceutskog preparata.

[0340] Farmaceutski preparati prema učenju su poželjno sterilni i sadrže efikasnu količinu agenasa, ovde opisanih i opciono dodatnih agenasa, kao što je ovde razmatrano da bi se generisala željena reakcija ili željeni efekat.

[0341] Farmaceutski preparati su obično obezbeđeni u uniformnom obliku doziranja i mogu biti pripremljeni na način koji je poznat per se. Farmaceutski preparat može npr. biti u obliku rastvora ili suspenzije.

[0342] Farmaceutski preparat može da sadrži soli, puferske supstance, konzervanse, nosače, razblaživače i / ili ekscipijense od kojih su svi poželjno farmaceutski prihvatljivi. Izraz "farmaceutski prihvatljiv" se odnosi na netoksičnost materijala koji ne stupa u interakciju sa dejstvom aktivne komponente farmaceutskog preparata.

[0343] Soli koje nisu farmaceutski prihvatljive, mogu biti korišćene za pripremu farmaceutski prihvatljivih soli i uključene su u učenju. Farmaceutski prihvatljive soli ove vrste sadrže, na neograničavajući način, one pripremljene od sledećih kiselina: hlorovodonične, bromovodične, sumporne, azotne, fosforne, maleinske, sirćetne, salicilne, limunske, mravlje, malonske, sukcinske kiseline i slično. Farmaceutski prihvatljive soli, mogu takođe biti pripremljene kao soli alkalnih metala ili soli zemnoalkalnih metala, kao što su natrijumove soli, kalijumove soli ili kalcijumove soli.

[0344] Pogodne puferske supstance za upotrebu u farmaceutskom preparatu, uključuju sirćetnu kiselinu u soli, limunsku kiselinu u soli, bornu kiselinu u soli i fosfornu kiselinu u soli.

[0345] Pogodni konzervansi za upotrebu u farmaceutskom preparatu, uključuju benzalkonijum hlorid, hlorobutanol, paraben i timerosal.

[0346] Injektibilna formulacija može da sadrži farmaceutski prihvatljiv ekscipijens, kao što je Ringerov laktat.

[0347] Izraz "nosač" se odnosi na organsku ili neorgansku komponentu, prirodne ili sintetičke prirode, sa kojim je aktivna komponenta kombinovana kako bi se olakšala, poboljšala ili omogućila primena. Prema učenju, izraz "nosač" takođe, uključuje jedan ili više kompatibilnih čvrstih ili tečnih punioca, razblaživača ili supstanci za inkapsuliranje, koje su pogodne za primenu kod pacijenta.

[0348] Moguće supstance nosača za parenteralnu primenu su npr. sterilna voda, Ringer, Ringerov laktat, sterilni rastvor natrijum hlorida, polialkilen glikoli, hidrogenovani naftaleni i, naročito, biokompatibilni laktidni polimeri, laktid / glikolid kopolimeri ili polioksietilen / polioksipropilen kopolimeri.

[0349] Izraz "ekscipijens" kada se ovde koristi je namenjen da označava sve supstance koje mogu biti prisutne u farmaceutskom preparatu i koje nisu aktivni sastojci kao što su, na primer, nosači, vezivna sredstva, lubrikansi, zgušnjivači, površinski aktivna sredstva, konzervansi, emulgatori, puferi, sredstva za korigovanje ukusa ili boje.

[0350] Ovde opisana sredstva i preparati, mogu biti primenjivani bilo kojim konvencionalnim putem, kao što je parenteralna primena, uključujući injekcijom ili infuzijom. Primena je poželjno parenteralna, npr. intravenska, intraarterijska, subkutana, intradermalna ili intramuskularna.

[0351] Preparati pogodni za parenteralnu primenu, obično sadrže sterilni vodeni ili nevodeni preparat aktivnog jedinjenja, koji je poželjno izotoničan sa krvlju primaoca. Primeri kompatibilnih nosača i rastvarača su Ringerov rastvor i izotonični rastvor natrijum hlorida. Dodatno, obično su korišćena sterilna, fiksirana ulja u obliku rastvora ili suspenzionog medijuma.

[0352] Ovde opisana sredstva i preparati su primenjeni u efikasnim količinama. "Efikasna količina" se odnosi na količinu koja postiže željenu reakciju ili željeni efekat samostalno ili zajedno sa daljim dozama. U slučaju lečenju određene bolesti ili određenog stanja, poželjna reakcija se prvenstveno odnosi na inhibiciju toka bolesti. Ovo obuhvata usporavanje progresije bolesti i, posebno, prekidanje ili preokretanje progresije bolesti. Željena reakcija u lečenju bolesti ili stanja može takođe biti odlaganje početka ili prevencija nastanka pomenute bolesti ili navedenog stanja.

[0353] Efikasna količina ovde opisanog agensa ili preparata će zavisiti od stanja koje će biti lečeno, ozbiljnosti bolesti, pojedinačnih parametara pacijenta, uključujući starost, fiziološko stanje, veličinu i težinu, trajanje lečenja, tip prateće terapije (ako je prisutna), specifičan put primene i slične faktore. Prema tome, primenjene doze ovde opisanih agenasa mogu zavisiti od različitih takvih parametara. U slučaju da je reakcija kod pacijenta nedovoljna sa početnom dozom, mogu biti korišćene veće doze (ili efektivno veće doze postignute drugačijim, više lokalizovanim putem primene).

[0354] Ovde opisana sredstva i preparati mogu biti primenjeni kod pacijenata, npr. in vivo, za lečenje ili prevenciju različitih poremećaja, kao što su oni ovde opisani. Poželjni pacijenti uključuju, humane pacijente koji imaju poremećaje koji mogu biti korigovani ili poboljšani primenom agenasa i preparata ovde opisanih. Ovo uključuje poremećaje koji uključuju ćelije karakterisane ekspresijom CLDN6.

[0355] Na primer, u jednom primeru izvođenja, sredstva koja su ovde opisana, mogu biti korišćena za lečenje pacijenata obolelih od karcinoma, npr., bolesti raka, kao što je ovde opisano, karakterisane prisustvom ćelija raka koje eksprimiraju CLDN6.

[0356] Farmaceutski preparati i postupci lečenja koji su opisani u skladu sa ovim učenjem, mogu takođe biti korišćeni za imunizaciju ili vakcinaciju da bi se sprečila bolest koja je ovde opisana.

[0357] Farmaceutski preparat prema učenju može biti primenjen zajedno sa dopunskim supstancama koje povećavaju imunitet, kao što su jedan ili više adjuvanasa i mogu sadržati jednu ili više supstanci za poboljšanje imuniteta, da bi se dodatno povećala njegova efikasnost, poželjno da se postigne sinergistički efekat imunostimulacije. Izraz "adjuvans" se odnosi na jedinjenja koja produžavaju ili pojačavaju ili ubrzavaju imunski odgovor. U tom pogledu, mogući su različiti mehanizmi, u zavisnosti od različitih tipova pomoćnih sredstava. Na primer, jedinjenja koja omogućavaju sazrevanje DC, npr. lipopolisaharidi ili CD40 ligand, formiraju prvu klasu pogodnih adjuvanasa. Generalno, bilo koji agens koji utiče na imuni sistem tipa "signala opasnosti" (LPS, GP96, dsRNK itd.) ili citokina, kao što je GM-CSF, može biti korišćen kao adjuvans koji omogućava da se imunski odgovor intenzivira i / ili da se na njega utiče na kontrolisani način. CpG oligodeoksinukleotidi mogu opciono takođe, biti korišćeni u ovom kontekstu, mada treba uzeti u obzir njihove neželjene efekte koji se javljaju pod određenim okolnostima, kao što je gore objašnjeno. Naročito poželjni adjuvansi su citokini, kao što su monokini, limfokini, interleukini ili hemokini, npr. IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IFNα, IFNγ, GM-CSF, LT-a ili faktori rasta, npr hGH. Dalji poznati adjuvansi su aluminijum hidroksid, Freund-ov adjuvans ili ulje, kao što je Montanide®, najpoželjniji Montanide® ISA51. Lipopeptidi, kao što je Pam3Cys, takođe su pogodni za upotrebu kao adjuvansi u farmaceutskom preparatu iz predmetnog učenja.

[0358] Farmaceutski preparat može biti primenjen lokalno ili sistemski, poželjno sistemski.

[0359] Izraz "sistemska primena" se odnosi na primenu agensa tako da agens postaje široko distribuiran u telu pojedinca u značajnim količinama i razvija željeni efekat. Na primer, agens može da razvije njegov željeni efekat u krvi i / ili dođe do željenog mesta delovanja preko vaskularnog sistema. Tipični sistemski putevi primene, uključuju, primenu uvođenjem agensa direktno u vaskularni sistem ili oralnu, pulmonarnu ili intramuskularnu primenu, gde je agens adsorbovan, ulazi u vaskularni sistem i prenosi se na jedno ili više željenih mesta delovanja putem krvi.

[0360] U skladu sa sadašnjim učenjem, poželjno je da je sistemska primena parenteralna primena. Izraz "parenteralna primena" se odnosi na primenu agensa tako da agens ne prolazi crevo. Izraz "parenteralna primena" uključuje intravenoznu primenu, subkutanu primenu, intradermalnu primenu ili intraarterijsku primenu, ali nije ograničena na njih.

[0361] Primena takođe, može biti izvedena, na primer, oralno, intraperitonealno ili intramuskularno.

[0362] Agensi i preparati koji su ovde obezbeđeni, mogu biti korišćeni samostalno ili u kombinaciji sa konvencionalnim terapijskim režimima, kao što su hirurgija, zračenje, hemoterapija i / ili transplantacija koštane srži (autologna, singenična, alogena ili nepovezana).

[0363] Predmetno učenje je detaljno opisano slikama i primerima niže, koji su korišćeni samo u cilju ilustracije i nisu označeni kao ograničavajući. Zahvaljujući opisu i primerima, dodatni primeri izvođenja koji su takođe, uključeni u učenje su dostupni stručnom radniku.

SLIKE

[0364]

Slika 1: Predstavljanje kompleksa TCR-CD3. Motivi aktivacije na bazi intracitoplazmatskog imunoreceptora CD3 tirozina (ITAMs) su naznačeni kao cilindri (adaptirani iz "Knjige činjenica T receptora ćelija", MP Lefranc, G Lefranc, 2001).

Slika 2: Dizajn sukcesivnih generacija CAR-ova. Šematski prikaz različitih generacija CAR-a (1G, prva generacija, 2G, druga generacija, 3G, treća generacija). Prva generacija sadrži ekstracelularne scFv i citoplazmatski CD3ζ lanac / ZAP70 posredovanu citotoksičnost, druga generacija dodatno CD28 / PI3K promovišuću proliferaciju, a treća generacija dalje 4-1 BB ili OX40 / TRAF održavanje ćelijskog preživljavanja (Casucci, M. i sar. (2011) 2: 378-382).

Slika 3: Šematsko predstavaljanje različitih formata receptora za preusmeravanje T ćelija protiv CLDN6. Levo: CAR druge generacije sastavljen od CLSN6-specifičnog scFv fragmenta, IgG1-izvedenog spacer domena, CD28 kostimulatornog i CD3ζ signalnog domena (CAR-28ζ); sredina: novi CAR format zasnovan na povezivanju scFv sa konstantnim domenom mišjeg TCRβ lanca i koekspresijom konstantnog domena mišjeg TCRa lanca (CAR / Cα); desno: mišji TCR sastavljen od TCR α / β lanaca (mu, mišji TCR);

Slika 4: Klaudin-6 ekspresija u normalnim tkivima i različitim vrstama raka.

Ekspresija iRNK CLDN6 je analizirana pomoću qRT-PCR u različitim uzorcima normalnih tkiva i 47 ovarijalnih karcinoma.

Slika 5. Tehnološka platforma za izolaciju i validaciju TCR-a. Pristup integriše sve korake od izolacije antigen-specifičnih T-ćelija (vrh) do TCR kloniranja (sredina) i TCR validacije (dno). HLA-A2/DR1-transgeni miševi su imunizovani sa tumorskim antigenom koji kodira iRNK. Ćelije slezine ovih miševa su analizirane na ex vivo reaktivnost protiv odgovarajućeg antigena pomoću IFNγ-ELISPOT i antigen-specifične mišje CD8+ T ćelije su izolovane nakon in vitro restimulacije na osnovu ekspresije indukovane aktivacijom CD 137 pomoću protočne citometrije (vrh). Pojedinačne ćelije su sakupljene u pločama sa više bazenčića i podvrgnute sintezi prvog lanca cDNK i obogaćivanju pomoću opšteg koraka PGR amplifikacije. Varijabilni regioni TCR α / β su klonirani u vektore za in vitro transkripciju (IVT) koja sadrži kasete konstantnog regiona (sredina). TCR α / β lanac RNK je prenet u humane CD8+ T ćelije, kokultivisane sa APC-ovima koji eksprimiraju odgovarajuće antigene i HLA molekulima i testirane za funkcionalno reprogramiranje konstruisanih T-ćelija (dno).

Slika 6: Ex vivo reaktivnost ćelija slezene iz imunizovanih HLA-A*02-transgenih miševa protiv peptida dobijenih od CLDN6 analizirana pomoću IFNγ-ELISPOT testa. HLA-A*02 CLDN6-specifični vezujući peptidi su predviđeni primenom specifičnog algoritma (Rammensee H. i sar. (1999) Immunogenetics 50, 213-9). Ćelije slezine su analizirane na reaktivnost protiv bazena CLDN6 peptida ili predviđenih HLA-A *02-vezivnih peptida A2-1-6 izvedenih iz CLDN6. Pozitivna kontrola: ćelije slezine tretirane sa PMA; negativna kontrola: irelevantni peptidni bazen (HIV-gag), irelevantni nonamerni peptid (PLAC1-31-39).

Slika 7: Sortiranje pomoću protočne citometrije CLDN6-specifičnih mišjih CD8+ T ćelija iz HLA-A*02-transgenih miševa nakon in-vitro restimulacije. Pojedinačne CD8 / CD137+ T ćelije su izolovane protočnom citometrijom i sakupljene u pločama sa više bazenčića za TCR kloniranje nakon restimulacije ćelija slezine sa CLDN6 preklapajućim peptidnim bazenom. Kontrola: ćelije slezine restimulisane sa nerelevantnim bazenom peptida.

Slika 8: Testiranje specifičnosti TCR izolovanih iz CD8+ T ćelija miševa imunizovanih sa CLDN6. CD8+ T ćelije HLA-A*02-pozitivnog zdravog donora su transfektovane sa TCR-α/β lancem RNK i testirane za prepoznavanje K562-A2 ćelija koje su transfektovane sa CLDN6 RNK ili stimulisane sa CLDN6 preklapajućim 15mer peptidima (= C16 bazen) ili CLDN6 HLA-A*02 vezujućim peptidima (C16-A2-1, C16-A2-2) pomoću IFNγ-ELISPOT. Negativne kontrole: irelevantni peptidni bazen, irelevantni 9mer peptid; Pozitivna kontrola: SEB

Slika 9: Površinska ekspresija CLDN6-specifičnih mišjih TCR-a na humanim prethodno aktiviranim CD8+ T ćelijama. CD8+ T ćelije su prethodno aktivirane sa OKT3 i transfektovane sa 20 μg TCR α/β RNK. 20 sati nakon elektroporacije ćelije su obojene sa PE-konjugovanim anti-CD8 antitelom i APC-konjugovanim antitelom koja prepoznaju mišji konstantni domen TCR β lanca. Ćelije su zaustavljene na pojedinačnim limfocitima.

Slika 10: Liza tumorskih ćelija posredovana sa TCR receptorima specifičnim za CLDN6. Preaktivirane CD8+ T ćelije su transfektovane sa 20 μg TCR α/β RNK i kokultivisane 20h kasnije zajedno sa HLA-A*02-eksprimirajućim CLDN6-pozitivnim (PA1-Luc; NIH-OvCar3) ili -negativnim (SK-Mel-37) tumorskim ćelijskim linijama sa odnosom E: T (efektorska ćelija: ciljna ćelija) od 30: 1. Specifična liza je analizirana testom citotoksičnosti na bazi luciferaze nakon 4h zajedničke kulture.

Slika 11: Dozno-zavisna proliferacija posredovana pomoću CLDN6-specifičnih TCR receptora kao odgovor na CLDN6-eksprimirajuće ciljne ćelije. CD8+ T ćelije su transfektovane sa 20 μg TCR RNK, obeležene sa CFSE i kokultivisane sa autolognim monocitima transfektovanim sa titriranim količinama CLDN6 RNK. Nakon 4 dana ćelije kokulture su obojene sa APC-Cy7-obeleženim anti-CD8 antitelom. A) Specifična proliferacija je analizirana protočnom citometrijom na osnovu razblaženja boje CFSE proliferacije. Tačkasti dijagrami pokazuju žive CD8+ T limfocite nakon kokulture sa monocitima transfektovanim sa 1μg CLDN6-RNK. B) Barovi pokazuju procenat proliferirajućih CD8+ T ćelija.

Slika 12: Površinska ekspresija CLDN6-specifičnih CAR konstrukata na humanim CD4+ i CD8+ T ćelijama u mirovanju. PBMC su transfektovane sa 10μg CAR RNK. 20h nakon elektroporacije ćelije su obojene sa PE-konjugovanim anti-CD8, FITC-konjugovanim anti-CD4 i idiotipski-specifičnim antitelom obeleženim sa Dylight-650. Ćelije su zaustavljene na pojedinačnim CD4+ ili CD8+ T ćelijama.

Slika 13: Liza tumorskih ćelija posredovana različitim formatima CLDN-6 ciljajućih receptora. Preaktivirane CD8+ T ćelije su transfektovane sa CAR ili TCR RNK i kokultivisane 20h kasnije zajedno sa CLDN6-pozitivnim ili CLDN6-negativnim tumorskim ćelijskim linijama PA1 i MDA-MB-231-Luc pri različitim E: T odnosima. Specifična liza je analizirana testom citotoksičnosti na bazi luciferaze nakon 4h kokulture.

Slika 14: Antigen-specifična proliferacija posredovana CLDN6-specifičnim CAR kao odgovor na CLDN6-eksprimirajuće ciljne ćelije. CD8+ T ćelije su transfektovane sa 20μg TCR ili CAR RNK, obeležene sa CFSE i kokultivisane sa autolognim iDC transfektovanim sa CLDN6 ili kontrolnom RNK tokom 4 dana. A) TCR / CAR površinska ekspresija je analizirana protočnom citometrijom nakon bojenja sa mišjim APC-konjugovanim TCR β-specifičnim ili Dylight650-konjugovanim idiotipski-specifičnim antitelom. Specifična proliferacija je analizirana protočnom citometrijom na osnovu razblaženja boje CFSE proliferacije.

Slika 15: Površinska ekspresija različitih mutanata CLDN6-CAR-28ζ konstrukata sa mutiranim cisteinom 46 na preaktiviranim CD8+ T ćelijama. CD8+ T ćelije su prethodno aktivirane sa OKT3 i transfektovane sa 20μg CAR RNK.20h nakon elektroporacije ćelije su obojene sa PE-konjugovanim anti-CD8 antitelom i idiotipskispecifičnim antitelom obeleženim sa Dylight650. Ćelije su zaustavljene na singletima i limfocitima.

Slika 16: Površinska ekspresija različitih mutanata CAR-28ζ konstrukata sa mutiranim cisteinom 46 na preaktiviranim CD8+ T ćelijama tri različita donora. CD8 T ćelije su preaktivirane sa OKT3 i transfektovane sa 20μg CAR RNK.20h nakon elektroporacije ćelije su obojene sa idiotipski-specifičnim antitelom označenim sa Dylight650. Ćelije su zadržane na CAR-eksprimirajućim CD8+ T limfocitima.

Prikazani su rezultati iz tri nezavisna eksperimenta. Na vrhu: prikazan je procenat CAR+ / CD8+ T ćelija; dno: prikazan je srednji intenzitet fluorescencije CAR-pozitivnih CD8+ T ćelija;

Slika 17: Specifična liza tumorskih ćelija posredovana različitim mutantima od CLDN6-CΑR-28ζ konstrukata sa mutiranim cisteinom 46. A) CLDN6 površinska ekspresija na ciljnim ćelijskim linijama je analizirana nakon bojenja sa Alexa647-konjugovanim CLDN6-specifičnim antitelom protočnom citometrijom. B) Prethodno aktivirane CD8+ T ćelije su transfektovane sa 20μg CAR RNK i kokultivisane 20h kasnije zajedno sa CLDN6-pozitivnim (PA1) ili CLDN6-negativnim (MDA-MB-231-Luc-Tomato) tumorskim ćelijskim linijama pri različitim E: T odnosima. Specifična liza je analizirana testom citotoksičnosti na bazi luciferaze nakon 4h kokulture. C) Površinska ekspresija CAR na T ćelijama je analizirana nakon bojenja sa fluorohrom-konjugovanim CD8-specifičnim i idiotipski-specifičnim antitelom protočnom citometrijom.

Slika 18: Dozno-zavisna liza ciljnih ćelija posredovana različitim mutantima CLDN6CΑR-28ζ konstrukata sa mutiranim cisteinom 46. A) Preaktivirane CD8+ T ćelije su transfektovane sa 20 µg CAR RNK i kokultivisane 20h kasnije zajedno sa autolognim iDC transfektovanim sa titriranim količinama CLDN6-RNK (E: T = 30:1). B) Površinska ekspresija CLDN6 na transfektovanim iDC je analizirana nakon bojenja sa Alexa647-konjugovanim CLDN6-specifičnim antitelom protočnom citometrijom.

Slika 19: Šematski prikaz retrovirusnog SIN konstrukta koji se koristi za stabilnu CAR ekspresiju. Plazmid pES 12.6-CLDN6-CAR-C46S je korišćen za prolaznu generaciju GALV-omotanog SIN-vektora korišćenjem HEK293T ćelija.

Slika 20: Detekcija CLDN6-CAR i CAR protiv nepovezanog tumorskog antigena na transdukovanim humanim T ćelijama korišćenim za adoptivni transfer u NSG miševe. Ćelije su obojene sa fluorohrom-konjugovanim antitelima (BD Biosciences) usmerenim protiv CD8 i CD4, kao i sa idiotipski-specifičnim antitelima usmerenim protiv odgovarajućeg dela scFv CLDN6-CAR (anti-IMAB206, Ganymed Pharmaceuticals AG) i CAR protiv nepovezanog tumorskog antigena, respektivno. Ćelije su sakupljene na pojedinačnim CD8+ ili CD4+ limfocitima. Transdukovane T ćelije su korišćene za adoptivni prenos ćelija u OV90-SC12-usađenim NSG miševima. Stopa transdukcije za CLDN6-CAR i CAR protiv nepovezanog tumorskog antigena je oko 37% CD4+ i 20% CD8+, kao i 36% CD4+ i 24 CD8+ ćelija, respektivno. Grafikoni su prikazani u logaritamskoj skali.

Slika 21: Anti-tumorska aktivnost CLDN6-CAR transdukovanih T ćelija u modelu karcinoma jajnika. 1x10<7>humanih OV90-SC12 tumorskih ćelija (ATCC CRL 11732) je injektovano subkutano NSG miševima (10 miševa / grupa). Nakon 4 dana, miševi su tretirani sa pojedinačnom intravenskom injekcijom od 1x10<7>CD3/CD28 zrnaca stimulisanih, retrovirusno transdukovanim humanim T ćelijama (oko 37% CD4 i 20% CD8 su bili CLDN6-CAR pozitivni). A) Šema eksperimentalne postavke. B) Odlaganje rasta tumora kod miševa tretiranih CLDN6-CAR u poređenju sa kontrolnim grupama (bez T ćelija, netransdukovanih T ćelija i T ćelija transdukovanih sa CAR protiv nepovezanog tumorskog antigena). Praćenje tumora merenjem zapremine i analizom periferne krvi je izvršeno jednom nedeljno. Rezultati su eksprimirani kao srednja zapremina tumora ± SEM sa n = 10 miševa za sve grupe. Zapremina tumora je izračunata korišćenjem sledeće formule: V = 1/2*(dužina*širina kvadrata). Dijagram za CLDN6-CAR tretirane miševe je značajno različit od kontrolne tretirane grupe za t = 31 dana (* ANOVA, P<0,05). C) Prikazane su krive rasta tumora kod pojedinačnih miševa iz svake grupe.

Primedba da su 2 miša u grupi koja nije povezana sa tumorskim antigenom morala da budu žrtvovana 24. dana usled visokog tumorskog opterećenja (označeno sa ).

Slika 22. Proliferacija CAR T ćelija nakon ko-kulture sa CLND6 eksprimirajućim iDC. CD8+ T ćelije su transfektovane sa IVT-RNK koja kodira CAR usmeren protiv A) CLDN6 ili B) nepovezani tumorski antigen kao negativna kontrola, obeležen sa CFSE (karboksifluorescein sukcinimidil estar) i kokultivisan sa CLDN6-transfektovanim autolognim iDC-ima tokom 4 dana. Proliferacija CAR T ćelija je analizirana na osnovu razblaženja CFSE pomoću protočne citometrije. Ćelije su sakupljene na pojedinačnim živim CD8+ T limfocitima.

PRIMERI

[0365] Tehnike i postupci koji su ovde korišćeni su ovde opisani ili izvedeni na način koji je poznat per se i kao što je opisano, na primer, u Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. Sve metode, uključujući upotrebu kompleta i reagenasa, izvedene su prema informacijama proizvođača, osim ako nije posebno naznačeno.

Primer 1: Materijali i metode

Ćelijske linije i reagensi

[0366] Ćelijska linija K562 humane hronične mijeloidne leukemije (Lozzio, C.B. & Lozzio, B.B (1975), Blood 45, 321-334) je kultivisana pod standardnim uslovima. Ćelije K562 stabilno transfektovane sa HLA-A*0201 (Britten, C.M. et al. (2002), J. Immunol. Methods 259, 95-110) (koji se nazivaju npr. kao K562-A*0201) su korišćeni za testove validacije. Primarna humana fibroblastna ćelijska linija prepucijuma novorođenčeta CCD-1079Sk (ATCC br. CRL-2097) je kultivisana prema uputstvima proizvođača.

[0367] Ćelijska linija karcinoma jajnika koja eksprimira humani CLDN6, OV-90-SC12 je korišćena za in vivo validaciju CLDN6-CAR.

[0368] Medijum za kulturu za PA-1-SC12_A0201_luc_gfp F7 je sastavljen od 86% RPMI 1640+ Glutamax (Co. Gibco, Kat-br.61870), 10% FCS (Co. Biochrome, Kat-br. S0615), 1% natrijum piruvata (100mM) (Co. Gibco, Kat-br. 11360), 1% rastvora MEM ne-esencijalnih aminokiselina (100X) (Co. Gibco, Kat-br. 11140), 2% natrijum bikarbonat 7,5% rastvora (Co. Gibco, Kat-br.25080).

[0369] Medijum za kulturu za OV-90-SC 12 je sastavljen od 41,5% MCDB 105 (Co. Sigma Aldrich, Kat-br. M6395-1L), 41,5% Medijuma 199 (Co. Sigma Aldrich, Kat-br. M2154-500mL), 15% FCS-a (Co. Biochrome, Kat-br. S0615), 2% natrijum bikarbonat 7,5% rastvora (Co. Gibco. Kat. br.25080).

[0370] Medijum za kulturu za SK-MEL-37 je sastavljen od 90% DMEM Glutamax (Co. Gibco, Kat-br. 31966), 10% FCS (Co. Biochrome, Kat-br. S0615). Medijum za kulturu za MDA-MB-231_luc_tom je sastavljen od 88% RPMI 1640 Glutamax (Co. Gibco, Kat-br.

61870). 10% FCS (Co. Biochrome, Kat-br. S0615), 1% natrijum piruvata (100mM) (Co. Gibco, Kat-br.11360), 1% MEM ne-esencijalnog rastvora aminokiselina (100X) (Co. Gibco, Kat-br. 11140).

[0371] Hranjenje i / ili deljenje ćelijskih linija je vršeno svaka 2 do 3 dana.

Mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC), monociti i dendritske ćelije (DC)

[0372] PBMCs su izolovane pomoću Ficoll-Hipaque-ovog (Amersham Biosciences, Uppsala, Švedska) gradijenta gustine centrifugiranjem iz sloja belih krvnih ćelija i trombocita. HLA alelotipovi su određeni PCR standardnim metodama. Monociti su obogaćeni sa anti-CD14 mikrozrncima (Miltenyi Biotech, Bergisch-Gladbach, Nemačka). Nezreli DC (iDC) su dobijeni diferencijacijom monocita tokom 5 dana u medijumu kulture sa dodatkom citokina, kao što je opisano u Kreiter et al. (2007), Cancer Immunol. Immunother., CII, 56, 1577-87.

Peptidi i peptidno pulsiranje stimulativnih ćelija

[0373] Bazeni N- i C-terminalno slobodnih 15-mernih peptida sa preklapanjima 11 aminokiselina koji odgovaraju sekvencama Klaudin-6 ili HIV-gag (koji se označavaju kao bazen antigenskog peptida) su sintetisani standardnom hemijom čvrste faze (JPT GmbH, Berlin, Nemačka) i rastvoreni u DMSO do konačne koncentracije od 0,5 mg / ml. Nonamerni peptidi su rekonstituisani u PBS 10% DMSO. Za generisanje impulsa ćelije stimulatora su inkubirane tokom 1 h, na 37 ° C u medijumu za kulturu korišćenjem različitih koncentracija peptida.

Vektori za in vitro transkripciju (IVT) RNK

[0374] Svi konstrukti su varijante prethodno opisanog pST 1-sec-insert-2βgUTR-A(120)-Sap1 plazmida (Holtkamp, S. et al. (2006), Blood 108, 4009-4017). Da bi se dobili plazmidi koji kodiraju humane TCR lance, cDNK koje kodiraju TCR-α ili TCR-β1i TCR-β2konstantne regione su amplifikovane iz humanih CD8+ T ćelija i klonirane u ovu osnovu. Za generisanje plazmida koji kodiraju mišje TCR lance, cDNK kodirajuće za TCR-α, -β1i -β2konstantne regione su naručene od komercijalnog dobavljača i klonirane analogno (GenBank pristupni brojevi M14506, M64239 i X67127, respektivno). Specifični V(D)J PCR proizvodi su uvedeni u takve kasete da bi se dobili TCR lanci pune dužine (označeni kao pST1-humani / mišji TCRαβ-2βgUTR-A (120)).

[0375] Analogno, pojedinačni aleli HLA klase I i II klonirani iz PBMC-a od donora i beta-2 mikrogobulina (B2M) cDNK iz ljudskih DC-a su ubačeni u ovu osnovu (koji se nazivaju pST1-HLA klasa I / II-2βgUTR-A (120) i pST1-B2M-2βgUTR-A (120)).

[0376] Plazmidi koji kodiraju pp65 antigen CMV (pST1-sec-pp65-MITD-2βgUTR-A (120)) i NY-ESO-I (pST1-sec-NY-ESO-1-MITD-2βgUTR-A (120)) povezan sa sekrecionim signalom (sec) i signalom prometa MHC klase I (MITD) su opisani ranije (Kreiter, S. et al. (2008), J. Immunol. 180, 309-318). PLAC1 kodirajući plazmid pST1-sec-PLAC1-MITD-2βgUTR-A (120) je generisan kloniranjem cDNK dobijene od komercijalnog dobavljača (GenBank pristupni broj NM_021796) u Kreiter et al. backbone, TPTE kodirajući plazmidi pST1-αgUTR-TPTE-2βgUTR-A (120) i pST1-αgUTR-TPTE-MITD-2βgUTR-A (120) su generisani kloniranjem cDNK dobijene od komercijalnog dobavljača (GenBank pristupni broj AF007118) u varijantu Holtkamp i sar., vektora koji karakteriše dodatni alfa-globin 5'- neprevedeni region.

[0377] Prajmeri su nabavljeni od Operon Biotechnologies, Keln, Nemačka.

Generisanje in vitro transkribovane (IVT) RNK i transfer u ćelije

[0378] Generacija IVT RNK je izvedena kao što je prethodno opisano (Holtkamp, S. i sar. (2006). Blood 108, 4009-4017) i dodata u ćelije suspendovane u X-VIVO 15 medijumu (Lonza, Bazel, Švajcarska), u prethodno ohlađenoj sterilnoj kiveti za elektroporaciju otvora 4 mm (Bio-Rad Laboratories GmbH, Minhen, Nemačka). Elektroporacija je izvedena sa aparatom Gene-Pulser-II (Bio-Rad Laboratories GmbH, Minhen, Nemačka) (T ćelije: 450 V / 250 μF; IVSB T ćelije: 350 V / 200 μF; SupT1 (ATCC br. CRL-1942): 300 V / 200 μF; humani DC: 300 V / 150 μF; K562: 200 V / 300 μF).

In vivo prajming T ćelija intranodalnom imunizacijom HLA A2.1/ DR1 miševa sa IVT RNK

[0379] T ćelije A2 / DR1 miševa (Pajot A. i sar. (2004), Eur. J. Immunol. 34, 3060-69) su prajmovane in vivo protiv antigena od interesa repetitivnom intranodalnom imunizacijom upotrebom IVT RNK koja kodira antigen (Kreiter S. i sar. (2010), Cancer Research 70, 9031-40). Za intranodalne imunizacije, miševi su anestezirani sa ksilazinom / ketaminom. Ingvinalni limfni čvor je izložen hiruški, 10 μL RNK (20 μg) razblažene u Ringer-ovom rastvoru i vodi bez Rnaze je injektovano polako korišćenjem 0,3 ml šprica sa ultrafinom iglom za jednokratnu upotrebu (31G, BD Biosciences) i rana je bila zatvorena. Nakon šest ciklusa imunizacije, miševi su žrtvovani i izolovane su ćelije slezine.

Sakupljanje ćelija slezine

[0380] Nakon njihove disekcije pod sterilnim uslovima, slezine su prebačene u falkonijeve epruvete koje sadrže PBS. Slezine su mehanički isčupane pincetom i ćelijske suspenzije su dobijene sa cediljkom za ćelije (40 μm). Splenociti su isprani sa PBS-om, centrifugirani i resuspendovani u hipotoničnom puferu za lizu eritrocita. Nakon 5 min inkubacije na sobnoj temperaturi, reakcija je zaustavljena dodavanjem 20-30 mL medijuma ili PBS-a. Ćelije slezine su centrifugirane i isprane dva puta sa PBS-om.

Pojedinačno ćelijsko sortiranje antigen-specifičnih CD8 T ćelija nakon bojenja CD137

[0381] Za antigen-specifičnu restimulaciju 2,5x10<6>/ bazenčić ćelija slezine od imunizovanih A2 / DR1 miševa su zasejane u ploči sa 24 bazenčića i stimulisane sa bazenom preklapajućih peptida koji kodiraju antigen od interesa ili kontrolni antigen. Nakon 24 h inkubacije ćelije su sakupljene, obojene sa FITC-konjugovanim anti-CD3 antitelom, PE-konjugovanim anti-CD4 antitelom, PerCP-Cy5.5-konjugovanim anti-CD8 antitelom i Dylight-649-konjugovanim anti-CD 137 antitelom. Sortiranje je sprovedeno na BD FACS Aria protočnom citometru (BD Biosciences). Ćelije pozitivne na CD 137, CD3 i CD8 su razvrstane, jedna ćelija po bazenčiću je sakupljena u ploči V-dna sa 96-bazenčića (Greiner Bio-One) koja sadrži humane CCD-1079Sk ćelije kao ćelije za hranjenje, centrifugirane na 4 ° C i odmah skladištene na -80 ° C.

Ekstrakcija RNK, sinteza cDNK na bazi SMART i nespecifična amplifikacija iz sortiranih ćelija

[0382] RNK iz sortiranih T ćelija je ekstrahovana sa kompletom RNeasy Micro Kit (Qiagen, Hilden, Nemačka) prema uputstvima dobavljača. Modifikovani protokol BD SMART je korišćen za sintezu cDNK: BD PowerScript reverzna transkriptaza (BD Clontech, Mountain View. CA) je kombinovan sa oligo (dT)-T-prajmerom dugim za prajming reakcije sinteze prvog lanca i TS-kratkim (Eurogentec S.A., Seraing, Belgija) uvođenjem oligo (riboG) sekvence da bi se omogućilo stvaranje proširenog šablona aktivnošću terminalne transferaze od reverzne transkriptaze i za prebacivanje šablona (Matz, M. i sar. (1999) Nucleic Acids Res.

27, 1558-1560). Prvi lanac cDNK, sintetisan prema instukcijama proizvođača, podvrgnut je 21 ciklusu amplifikacije sa 5 U PfuUltra Hotstart High-Fidelity DNA polimerazom (Stratagene, La Jolla, CA) i 0,48 μΜ prajmera TS-PCR prajmera, u prisustvu 200 μΜ dNTP (uslovi cikliranja: 2 min na 95 ° C, 30 s na 94 ° C, 30 s na 65 ° C, 1 min na 72 ° C, za krajnje proširenje od 6 min na 72 ° C). Uspešna amplifikacija TCR gena je kontrolisana bilo sa humanim ili mišjim specifičnim prajmerima TCR-β konstantnog regiona i sledeći klonotipski specifični humani ili mišji Vα-/Vβ-PCR-ovi su izvedeni samo ako su detektovane jake trake.

[0383] Prvi lanac cDNK za amplifikaciju sekvenci HLA klase I ili II je sintetizovan sa SuperScriptII reverznom transkriptazom (Invitrogen) i Oligo (dT) prajmerom sa 1-5 μg RNK ekstrahovane iz PBMC ćelija od pacijenta.

Dizajn PCR prajmera za TCR i HLA amplifikaciju

[0384] Za dizajn humanih TCR konsenzusnih prajmera, svih 67 TCR-Vβ i 54 TCR-Vα gena (otvoreni okviri za čitanje i pseudogeni) kao što je navedeno u ImMunoGeneTics (IMGT) bazi podataka (http://www.imgt.org) zajedno sa njihovim odgovarajućim vodećim sekvencama su bile poravnane sa BioEdit Sequence Alignment Editor-om (npr. http:// www.bio-soft.net). Prednji prajmeri dužine od 24 do 27 bp sa maksimalno 3 degenerisane baze, sadržajem GC između 40-60% i G ili C na kraju 3’ su dizajnirani da se žare sa što više vodećih sekvenci koliko je moguće i opremljeni sa 5' proširenjem od 15 bp karakterisanim retkim položajem restrikcionog enzima i Kozak sekvencom. Reverzni prajmeri su dizajnirani da se žare sa prvim eksonima gena konstantnog regiona, sa prajmerom TRACex1as vezivanjem za sekvence koje odgovaraju aminokiselinama 7 do 16 od Cα i TRBCex1_as prema aminokiselinama (aa) 8 do 16 u Cβ1 i Cβ2. Oba oligonukleotida su sintetisana sa 5' fosfatom. Prajmeri su bili spojeni u bazenu od 2-5 prednjih oligosa sa istom temperaturom žarenja.

[0385] Ova strategija je replikovana za dizajniranje mišjih TCR konsenzusnih prajmera, poravnanjem 129 navedenih TCR-Vα i 35 navedenih TCR-Vβ gena. Reverzni prajmeri mTRACex1_as i mTRBCex_as su homologni sekvencama koje odgovaraju aa 24 do 31 i 8 do 15, respektivno.

[0386] HLA konsenzus prajmeri su dizajnirani poravnanjem svih sekvenci HLA klase I i II koje su navedene na web sajtu Istraživačkog Instituta Anthony Nolan (www.anthonynolan.com) sa BioEdit Sequence Alignment Editorom. Prednji prajmeri dužine 23 do 27 bp sa maksimumom od 3 degenerisane baze, ali baze koje čuvaju kodove koji se zagrevaju sa što je moguće više HLA sekvenci jednog lokusa su opremljeni sa 5'-fosfatom i produženjem Kozak sekvence. Reverzni prajmeri su dizajnirani analogno, ali bez uvođenja kolebljivih baza i opremljeni sa 5'-proširenjem od 14 bp koje kodira položaj AsiSI restrikcionog enzima.

PCR amplifikacija i kloniranje V (D) J sekvenci

[0387] 3-6 μl prethodno amplifikovane cDNK iz izolovanih T ćelija je podvrgnuto u 40 ciklusa od PCR-a u prisustvu 0,6 μΜ Vα-/Vβ-specifičnog oligo bazena, 0,6 μΜCα- ili Cβ-oligo, 200 μΜ dNTP i 5 U Pfu polimeraze (ciklični uslovi: 2 min na 95 ° C, 30 s na 94 ° C, 30 s temperatura žarenja, 1 min na 72 ° C, završno vreme produženja 6 min na 72 ° C). PCR proizvodi su analizirani korišćenjem Qiagen-ovog sistema kapilarne elektroforeze. Uzorci sa trakama na 400-500 bp su frakcionisani po veličini na agaroznim gelovima, trake su isečene i prečišćene korišćenjem kompleta Gel Extraction Kit (Qiagen, Hilden, Nemačka). Analiza sekvence je izvedena kako bi se otkrila sekvenca oba i V(D)J domena i β konstantnog regiona, kao TRBCex1_as i mTRBCex1_as prajmer, respektivno, koji odgovaraju prema oba gena β1 i β2 TCR konstantnog regiona kod čoveka i miša, respektivno. DNK je digestirana i klonirana u IVT vektore koji sadrže odgovarajuću osnovu za kompletan TCR-α/β lanac.

Analize protočne citometrije

[0388] Ekspresija transfektovanih TCR gena na površini ćelija je analizirana protočnom citometrijom, korišćenjem PE-konjugovanog anti-TCR antitela protiv odgovarajuće familije varijabilnog regiona ili konstantnog regiona TCR β lanca (Beckman Coulter Inc., Fullerton. USA) i FITC-/APC-obeleženih anti-CD8/-CD4 antitela (BD Biosciences). Ekspresija transfektovanih CAR (himernih antigenskih receptora) na površini ćelija je analizirana korišćenjem Dylight-650-konjugovanog idiotipski specifičnog antitela (Ganymed Pharmaceuticals) koje prepoznaje scFv fragment sadržan u svim CLDN6-CAR konstruktima. HLA antigeni su detektovani bojenjem sa FITC-obeleženim specifičnim HLA klase II (Beckman Coulter Inc., Fullerton, USA) i PE-obeleženim HLA klase I specifičnim antitelima (BD Biosciences). Površinska ekspresija CLDN6 na ciljnim ćelijama je analizirana bojenjem sa Alexa-Fluor647-konjugovanim CLDN6-specifičnim antitelom (Ganymed Pharmaceuticals). Protočna citometrijska analiza je izvedena na protočnom citometru FACS CANTO II, korišćenjem FACS Diva softvera (BD Biosciences).

Test citotoksičnosti luciferaze

[0389] Za procenu ćelijski posredovane citotoksičnosti, uspostavljena je analiza na bazi bioluminiscencije kao alternativa i optimizacija do oslobađanja<51>Cr. Za razliku od standardnog testa oslobađanja hroma, ovaj test meri litičku aktivnost efektorskih ćelija izračunavanjem broja održivih ciljnih ćelija koje eksprimiraju luciferazu nakon zajedničke inkubacije. Ciljne ćelije su stabilno ili prolazno transficirane sa luciferaznim genom koji kodira za luciferazu svitca iz firefly Photinus pyralis (EC 1.13.12.7). Luciferaza je enzim koji katalizuje oksidaciju luciferina. Reakcija je zavisna od ATP-a i odvija se u dva koraka:

luciferin ATP → luciferil adenilat PPi

luciferil adenilat O2→ oksiluciferin AMP svetlost

[0390] Ciljne ćelije su zasejane u koncentraciji od 10<4>ćelija po bazenčiću u belim pločama sa 96 bazenčića (Nunc, Wiesbaden, Nemačka) i zajedno kultivisane sa različitim brojem TCR-transfektovanih T ćelija, u konačnoj zapremini od 100 μl.3 h kasnije 50 μl D-Luciferina (BD Biosciences) koji sadrži reakcionu smešu (Luciferin (1 μg / μl), HEPES-pufera (50 mM, pH), Adenozin 5'-trifosfataze (ATPaza, 0.4 mU / μl, Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) je dodato u ćelije. Dodavanjem ATPaze u reakcionu smešu smanjena je luminescencija koja je rezultat luciferaze oslobođene iz mrtvih ćelija.

[0391] Nakon ukupnog vremena inkubacije od 4 h, bioluminiscencija koju emituju održive ćelije je merena korišćenjem čitača Tecan Infinite 200 (Tecan, Crailsheim, Nemačka). Aktivnost ubijanja ćelija je izračunata imajući u vidu vrednosti luminescencije dobijene nakon kompletne lize ćelija indukovane dodavanjem 2% Triton-X 100 i u odnosu na luminescenciju emitovanu od strane ciljnih ćelija samostalno. Izlazni podaci su bili u brojanju po sekundi (CPS) i procenat specifične lize je izračunat na sledeći način:

(1- (CPSexp- CPSmin) / (CPSmax- CPSmin))) * 100.

[0392] Maksimalna luminescencija (maksimalno brojanje u sekundi, CPSmax) je procenjena nakon inkubacije ciljnih ćelija bez efektora i minimalna luminescencija (CPSmin) je procenjena nakon tretmana cilja sa deterdžentom Triton-X-100 za kompletnu lizu.

ELISPOT (Enzimski-povezan ImunoSPOT test)

[0393] Mikrotitarske ploče (Millipore, Bedford, MA, USA) su obložene preko noći na sobnoj temperaturi sa anti-IFNγ antitelom 1-D1k (Mabtech, Štokholm, Švedska) i blokirane sa 2% humanog albumina (CSL Behring, Marburg, Nemačka). 2-5x10<4>antigen prezentujućih stimulatornih ćelija po bazenčiću je zasejano na ploču u triplikatima zajedno sa 0,3-3x10<5>/ bazenčiću CD4+ ili CD8+ efektorskih ćelija transfektovanih sa TCR-om, 24 h nakon elektroporacije. Ploče su inkubirane preko noći (37 ° C, 5% CO2), isprane sa PBS-om 0,05% Tween 20 i inkubirane tokom 2 sata sa anti-IFNγ biotinilovanim mAt 7-B6-1 (Mabtech), u završnoj koncentraciji od 1 μg/ml na 37 ° C. Avidin-vezana peroksidaza rena H (Vectastain Elite Kit; Vector Laboratories, Burlingame, USA) je dodata u bazenčiće, inkubirana tokom 1 sata na sobnoj temperaturi i razvijena sa 3-amino-9-etil karbazolom (Sigma, Deisenhofen, Nemačka).

Ispitivanje proliferacije CFSE (karboksifluorescein sukcinimidil estar)

[0394] CD8+ T ćelije su transfektovane sa TCR ili CAR RNK i obeležene sa 2,5 μΜ CFSE. Obeležene T ćelije su isprane i kokultivisane sa RNK-transfektovanim autolognim monocitima ili iDC (E: T (efektorske ćelije: ciljne (tumorske) ćelije) = 10: 1). Nakon 4 dana ćelije kokulture su sakupljene i proliferacija je analizirana protočnom citometrijom, zasnovanom na progresivnom prepolovljenju CFSE fluorescencije unutar ćerki ćelija nakon ćelijskih deoba.

Retrovirusni konstrukt za stabilnu CAR ekspresiju

[0395] Za stabilnu ekspresiju CLDN6-CAR ili CAR protiv nepovezanog tumorskog antigena korišćenog kao negativna kontrola, korišćen je retrovirusni SIN vektor ES 12.6 (Slika 19).

Transdukcija humanih T ćelija

[0396] Za eksperimente adoptivnog prenosa ćelija miša (ACT), humani T limfociti su obogaćeni iz PBMC-ova zdravih donora, uklanjanjem monocita nakon 2 h od plastične adherencije. T limfociti su kultivisani u medijumu X-Vivo15 (Lonza) dopunjenom sa 5% humanog AB seruma (Invitrogen), 100 U/ml IL2 (Proleukin S, Novartis), 20 ng/ml IL7 (Miltenyi), 10 ng/ml IL15 (Miltenyi) i stimulisani magnetnim anti-CD3/anti-CD28 zrnima (Dynabeads: Invitrogen) u odnosu 1: 3 CD3 ćelije prema zrnu i transdukovani 3. i 4. dana nakon stimulacije sa retrovirusnim supernatantima. Ćelije su ekspandirane u medijumu X-Vivo15 dopunjenom sa 5% humanog AB seruma, 300 U/ml IL2, 20 ng/ml IL7 i 10 ng/ml IL15. Inkubacija 37 ° C, 5% CO2, 95 % rH (Slika 20).

Mišji model za in vivo validaciju antitumorske aktivnosti

[0397] Tumori ksenografta su uspostavljeni subkutanom injekcijom od 1x10<7>OV90-SC12 humanih tumorskih ćelija jajnika kod 8-14 nedelja starih miševa NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME). Nakon 4 dana, miševi su tretirani sa pojedinačnom intravenskom injekcijom od 1x10<7>CAR transdukovanih T ćelija (20-37% CAR pozitivno). Praćenje tumora je vršeno nedeljno, merenjem zapremine korišćenjem kalibarskog šestara (Slika 21 (a)).

Primer 2: Izolacija visoko-afinitetnih HLA-A*02-ograničenih mišjih TCR-a specifičnih za Klaudin-6

[0398] Dokazali smo imunogeni potencijal CLDN6 kod A2/DR1 miševa ponavljajućom intranodalnom imunizacijom sa CLDN6 kodiranjem IVT-RNK i koristili ćelije slezine ovih miševa za izolaciju CLDN6-specifičnih T ćelija i naknadno kloniranje odgovarajućih TCR gena (Slika 5). Ćelije slezine imunizovanih miševa su analizirane na uspešnu indukciju CLDN6-specifičnih T ćelija i njihovu reaktivnost protiv predviđenih HLA-A*02 vezujućih CLDN6 peptida ex-vivo pomoću IFNγ-ELISPOT testa (Slika 6).

[0399] Značajne frekvencije T-ćelija specifičnih za CLDN6, mogu biti indukovane kod sva tri miša imunizacijom RNK, dok je reaktivnost T ćelija fokusirana na dva predviđena CLDN6 peptida, koji su bili sa najboljim skorom vezivanja HLA-A*02 (C16-A2-1 i C16-A2-2).

[0400] Za izolaciju CLDN6-specifičnih T ćelija, ćelije slezine imunizovanih miševa su restimulisane in vitro i sortirane protočnom citometrijom na osnovu aktivacijski indukovane ushodne regulacije CD 137 (Slika 7).

[0401] CLDN6-specifične CD8+ T ćelije, mogu biti ponovo dobijene iz sva tri imunizovana A2/DR1 miša i ukupno 11 CLDN-specifičnih TCR receptora je klonirano iz jedne sortirane mišje T ćelije.

[0402] TCR receptori su podvrgnuti testovima imunološke validacije, koji su otkrili da je šest CLDN6-TCR-a prepoznalo HLA-A*0201-ograničeni epitop CLDN6-91-99 (C16-A2-1) i četiri CLDN6-TCR-a je specifično za CLDN6-14-22 (C16-A2-2), dok su oba epitopa prethodno identifikovana pomoću ex-vivo ELISPOT analize (Slika 8). Jedan CLDN6-TCR (TCRCD8-CLDN6 # 7) je prepoznao peptid CLDN6-7-15 (C16-A2-3).

Primer 3: Komparativno ispitivanje mišjih TCR receptora specifičnih za CLDN691-99

[0403] Ukupno je identifikovano šest mišjih TCR receptora koji svi prepoznaju HLA-A*02-ograničeni epitop CLDN6-91-99. Da bi se potvrdilo da je ovaj epitop prirodno obrađen i predstavljen endogenim CLDN6 ekspresionim tumorskim ćelijskim linijama i da bi se procenio potencijal identifikovanih mišjih TCR da posreduju u ubijanju takvih ćelija, izveden je test citotoksičnosti zasnovan na luciferazi. Humane prethodno aktivirane CD8+ T ćelije su transfektovane sa TCR RNK i površinska ekspresija je analizirana protočnim citometrijom (Slika 9). Svi mišji TCR receptori su eksprimirani na visokom procentu humanih CD8+ T ćelija nakon prenosa RNK, kao što je naznačeno bojenjem sa fluorohrom-konjugovnim antitelom specifičnim za konstantni domen mišjeg TCR-β lanca. TCR-transfektovane T ćelije su bile podvrgnute testu citotoksičnosti zasnovanom na luciferazi, zajedno sa tumorskim ćelijskim linijama PA1 (teratoma) koje eksprimiraju CLDN6 i NIH-Ovcar3 (karcinoma jajnika).

CLND6-negativna ćelijska linija raka dojke MDA-MB-231 je služila kao negativna kontrola. Svi TCR-ovi su posredovali efikasnu lizu CLDN6-eksprimirajućih ćelijskih linija tumora u rasponu od 38-94% PA1 i 29-76% NIH-Ovcar3, dok se nije mogla uočiti liza sa netransfektovanim T ćelijama (Slika 10). Većina ciljnih ćelija je lizirana kada su korišćeni mTCRCD8-CLDN6 # 1, # 8 ili # 18.

[0404] Da bi se analiziralo, ako mišji TCR receptori mogu da posreduju specifičnu proliferaciju humanih T ćelija nakon zajedničke kulture sa autolognim ciljnim ćelijama koje eksprimiraju antigen, izveden je test proliferacije CFSE (Slika 11). TCR-transfektovane CD8+ T ćelije su kokultivisane sa autolognim monocitima transfektovanim sa titriranim količinama CLDN6 RNK. Sve specifične proliferacije posredovane TCR receptorima su naznačene razblaživanjem CFSE proliferacione boje, nakon 4 dana zajedničke kulture sa CLDN6-RNK-transfektovanim CD 14+ ćelijama, dok su ponovo mTCRCD8-CLDN6 # 1, # 8 ili # 18 pokazali najbolje rezultate, posebno kada su male količine CLDN6 RNK bile transfektovane u ciljne ćelije. Odlučili smo da koristimo mTCRCD8-CLDN6 # 18 kao zlatni standard za vodeći izbor strukture zajedno sa CAR formatima za ciljanje CLDN6.

Primer 4: Generacija i in-vitro validacija CAR-ova specifičnih za Klaudin-6

[0405] Ocenili smo dva različita CAR formata da specifično ciljaju CLDN6 na ciljnim ćelijama koje eksprimiraju CLDN6. Jedan od njih predstavlja novi format zasnovan na povezivanju scFv sa konstantnim domenom mišjeg TCRβ lanca i koekspresiji konstantnog domena TCRα lanca (CAR/Cα) (Voss RH i sar., (2011) Molecular Therapy 9, supplement, S86) (Slika 3). Drugi format predstavlja klasičan CAR druge generacije (CAR-28ζ) koji sadrži signalne i kostimulatorne grupe od CD3ζ i CD28, respektivno. Brisanje Ick vezujućeg ostatka u CD28 endodomenu ukida IL2 sekreciju nakon CAR angažmana da bi se sprečila indukcija regulatornih T ćelija (Kofler D.M. i sar., (2011) Molecular Therapy 19 (4), 760-767). Modifikacija IgG1 Fc 'spacer' domena u ekstracelularnom ostatku CAR-a izbegava 'off-target' aktivaciju i neželjenu inicijaciju urođenog imunskog odgovora (Hombach A. i sar., (2010) Gene Therapy 17, 1206-1213).

[0406] Kako CAR-ovi obezbeđuju HLA nezavisno scFv-posredovano vezivanje antigena, oni su funkcionalni i u CD4+ i u CD8+ T ćelijama. Stoga smo prvo analizirali površinsku ekspresiju CAR na CD4+ i CD8+ T ćelijama, nakon transfekcije CAR RNK u masu PBMC-a.

[0407] Oba, novi CAR/Cα i klasični CAR druge generacije (CΑR-28ζ) su eksprimirani na površini humanih T ćelija nakon prenosa RNK (Slika 12). CAR-28ζ je značajno bolje eksprimiran na površini CD4+ i CD8+ T ćelija od CAR/Cα. Potonji je prebačen bilo kotransfekcijom CAR i Cα lanca ili kao bicistronski vektor baziran na 2A peptidu za istovremenu ekspresiju CAR i Cα gena. Analiza protočne citometrije je pokazala da povezivanje CAR i Ca na bazi 2A dovodi do smanjenja površinske ekspresije u poređenju sa koekspresijom dve komponente. Kako bi se za kliničko testiranje koristio bicistronski vektor, potrebno je dodatno poboljšati povezanost dve komponente CAR/Cα.

[0408] Da bi se analizirala specifična liza tumorskih ćelija posredovana različitim formatima CLDN6-ciljnih receptora, izvršena je analiza citotoksičnosti zasnovana na luciferazi. CAR- ili TCR-transfektovane preaktivirane CD8+ T ćelije su kultivisane sa CLDN6-pozitivnim ili negativnim tumorskim ćelijskim linijama, pri različitim odnosima efektora prema cilju i specifična liza je izračunata nakon 4 h kokulture (Slika 13). Sve CAR-i TCR-transfektovane T ćelije su pokazale značajnu specifičnu lizu CLDN6 ekspresionih tumorskih ćelijskih linija u poređenju sa netransfektovanim T-ćelijama.

[0409] Preduslov za proliferaciju i perzistenciju CAR-konstruisanih T ćelija kod pacijenta je prisustvo antigena, kao što je pokazano obećavajućim rezultatima kliničkih ispitivanja CD 19-specifičnih CAR u hematološkim malignitetima. Analogno ekspanziji endogenih T ćelija imunizacijom RNK, želeli smo da analiziramo da li bi CAR T ćelije takođe, mogle da se prošire korišćenjem RNK vakcinacije ciljnih ćelija da bi se obezbedio prirodni CLND6 za stimulaciju CAR T ćelija. Ispitivanje proliferacije in vitro je izvedeno korišćenjem CAR-transfektovanih CD8+ T ćelija zajedno sa CLDN6 ili kontrolnim RNK-transfektovanim autolognim iDC-ima (Slika 14). mTCRCD8-CLDN6 # 18 je posredovao najbolju proliferaciju kao odgovor na CLDN6-transfektovane ciljne ćelije (73%). CLDN6-CAR-28ζ je takođe rezultirao u značajnom procentu proliferišućih T ćelija (44%), dok CLDN6-CAR/Cα nije uspeo da indukuje proliferaciju usled nedostatka kostimulacije posredovane CD28. Kako je indukcija proliferacije preduslov za uspešnu antitumorsku aktivnost, odlučili smo da koristimo CAR-28ζ format za dalju selekciju vodeće strukture.

Primer 5: CLDN6-CAR-28ζ izbor vodeće strukture za pretklinička i klinička ispitivanja

[0410] Fragment CLDN6-CAR-28ζ scFv koji je odgovoran za prepoznavanje antigena sadrži neupareni cistein. Kako bi takav slobodan cistein mogao da dovede do pogrešnog presavijanja CAR proteina pod određenim okolnostima ili u neželjenim interakcijama sa drugim cisteinima formiranjem disulfidnih veza, odlučili smo da eliminišemo ovaj cistein i zamenili ga serinom, glicinom ili alaninom.

[0411] Komparativno smo analizirali rezultirajuće konstrukte CLDN6-CΑR-28ζ u pogledu površinske ekspresije (Slika 15, 16) i citotoksičnosti (Slika 17). Osim varijante glicina, svi mutirani konstrukti su pokazali površinsku ekspresiju i lizu uporedivu sa varijantom divljeg tipa.

[0412] Da bi se uporedio afinitet mutiranih CAR konstrukata, analiziran je njihov citotoksični potencijal u odgovoru na autologne iDC transfektovane sa titriranim količinama CLDN6 RNK. Čak i ekstremno male količine CLDN6 RNK (0,001 μg) rezultiraju značajnom lizom ciljnih ćelija posredovanom pomoću svih CAR konstrukata. Pošto je serinska varijanta CLDN6-CΑR-28ζ pokazala nešto bolje rezultate u pogledu površinske ekspresije i citotoksičnosti, odlučili smo da ovu varijantu koristimo za pretklinička ispitivanja.

Primer 6: In-vivo antitumorska aktivnost CLDN6-CAR

[0413] Nakon što je određena antitumorska aktivnost protiv ćelijskih linija tumora koje eksprimiraju CLDN6 in-vitro, određena je antitumorska sposobnost kod miševa koji nose tumor. Stoga je jačina CLDN6-CAR transdukovanih humanih T ćelija poređena sa T ćelijama transdukovanim sa kontrolnim CAR protiv nepovezanog tumorskog antigena i netransdukovanim T ćelijama u modelu ksenografta. Subkutano je NSG miševima injektovano ukupno 1x10<7>ćelija ćelijske linije OV90-SC12 humanog karcinoma jajnika. Četiri dana nakon presađivanja tumora, miševi su tretirani sa pojedinačnom intravenoznom injekcijom od 1x10<7>CAR-transdukovanih T ćelija. Praćenje tumora je vršeno nedeljno na osnovu zapreminskih merenja pomoću kalibarskog šestara. Tretman miševa sa CLDN6-CAR-transdukovanim T ćelijama je značajno usporio rast tumora u poređenju sa kontrolnim grupama tretiranim sa nepovezanim tumorskim antigenom-CAR-transdukovanim, netransdukovanim T ćelijama ili grupom koja ne prima T ćelije (Slika 21 (b) i (c)).

Primer 7: In-vitro proliferacija CLDN6-CAR T ćelija kao odgovor na ciljne ćelije koje eksprimiraju CLDN6

[0414] Analogno ekspanziji endogenih T ćelija pomoću RNK imunizacije, stimulacija i ekspanzija CAR T ćelija, korišćenjem RNK-vakcinacije ciljnih ćelija da bi se obezbedio prirodni CLND6, analizirana je ispitivanjem proliferacije in vitro. CD8<+>T ćelije su transfektovane sa IVT-RNK koja kodira CAR protiv CLDN6 ili sa nepovezanim tumorskim antigenom kao negativnom kontrolom, obeležene sa CFSE (karboksifluorescein sukcinimidil estrom) i zajedno kultivisane sa CLDN6-transfektovanim autolognim iDC-ima, tokom 4 dana (Slika 22). CLDN6-CAR posredovana proliferacija skoro svih CD8+ T ćelija u odgovoru na iDC transfektovane sa CLDN6 je mogla biti zapažena (95%), dok je proliferacija samo u pozadini (1,5%) mogla biti primećena za nepovezani tumorski antigen-CAR transfektovane T ćelije ukazujući da proliferacija nije zavisila od osnove CAR-a, već je bila specifična za CLDN6.

T ćelijski epitopi specifični za CLDN6

[0415]

A2-1 (aa 91-99)

ALFGLLVYL

A2-2 (aa 14-22)

TLLGWVNGL

A2-3 (7-15)

QILGVVLTL

T ćelijski receptori specifični za CLDN6

[0416]

TCRCD8-mCl6 # 1:

SEQ ID NO: 6; > Vα9N.3 J 13 C

SEQ ID NO: 19; > Vβ2 D2 J2.4 C2

TCRCD8-mCl6 # 13:

SEQ ID NO: 22; > Vα16N J22 C

SEQ ID NO: 25; > Vβ4 D2 J2.7 C2

SEQ ID NO: 17; > Vβ26 D1 J2.7 C2

Claims (13)

PATENTNI ZAHTEVI

1. Nukleinska kiselina za upotrebu u postupku lečenja, pri čemu navedena nukleinska kiselina sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira veštački T ćelijski receptor koji se specifično vezuje za klaudin-6 (CLDN6),

pri čemu navedeni veštački T ćelijski receptor sadrži vezujući domen za CLDN6, transmembranski domen i T ćelijski signalni domen, pri čemu T ćelijski signalni domen sadrži endodomen CD3-zeta, izborno u kombinaciji sa CD28, i pri čemu navedeni postupak sadrži ekspresiju navedenog veštačkog T ćelijskog receptora u T ćelijama pacijenta sa kancerom, pri čemu vezivanje navedenog veštačkog T ćelijskog receptora, kada je eksprimiran od strane T ćelija, za CLDN6 prisutnog na ćelijama kancera rezultuje u proliferaciji i aktivaciji T ćelija.

2. Nukleinska kiselina za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, pri čemu vezujući domen za CLDN6 sadrži varijabilni region teškog lanca (VH) antitela, pri čemu navedeni VH sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 30, 32, 34 i 36, ili njegovog fragmenta koji sadrži jedan ili više regiona koji određuju komplementarnost (CDR) navedenog VH, poželjno najmanje CDR3 navedenog VH.

3. Nukleinska kiselina za upotrebu prema patentnom zahtevu 1 ili 2, pri čemu vezujući domen za CLDN6 sadrži varijabilni region lakog lanca (VL) antitela, pri čemu navedeni VL sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 31, 33, 35, 37, 38 i 39, ili njegovog fragmenta koji sadrži jedan ili više regiona koji određuju komplementarnost (CDR) navedenog VL.

4. Nukleinska kiselina za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3, pri čemu vezujući domen za CLDN6 sadrži kombinaciju VH i VL izabranu od sledećih mogućnosti (i) do (vii):

(i) VH sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 30 i VL sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 31,

(ii) VH sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 32 i VL sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 33,

(iii) VH sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 34 i VL sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 35,

(iv) VH sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 36 i VL sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 37,

(v) VH sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 32 i VL sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 31,

(vi) VH sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 32 i VL sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 38, i

(vii) VH sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 32 i VL sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 39.

5. Nukleinska kiselina za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4, pri čemu veštački T ćelijski receptor sadrži ko-stimulacioni domen koji je ko-stimulacioni domen izabran od CD28, CD137 (4-1BB), CD124 (OX40) i CD278 (ICOS).

6. Nukleinska kiselina za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5, pri čemu veštački T ćelijski receptor sadrži strukturu:

NH2- signalni peptid – vezujući domen za CLDN6 – spejser region - transmembranski domen - T ćelijski signalni domen - COOH.

7. Nukleinska kiselina za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 6, pri čemu, lečenje je tretman bolesti kancera naznačeno ćelijama kancera koje eksprimiraju CLDN6.

8. Nukleinska kiselina za upotrebu prema patentnom zahtevu 7, pri čemu navedeni kancer je kancer kostiju, kancer krvi, kancer pluća, kancer jetre, kancer pankreasa, kancer kože, kancer glave i vrata, kožni ili intraokularni melanom, kancer materice, kancer jajnika, rektalni kancer, kancer analnog regiona, kancer želuca, kancer debelog creva, kancer dojke, kancer prostate, kancer materice, karcinom polnih i reproduktivnih organa, Hodgkin-ova bolest, kancer jednjaka, kancer tankog creva, kancer endokrinog sistema, kancer štitne žlezde, kancer paratioroidne žlezde, kancer adrenalne žlezde, sarkom mekog tkiva, kancer bešike, kancer bubrega, karcinom bubrežnih ćelija, karcinom renalnog pelvisa, neoplazme centralnog nervnog sistema (CNS), neuroektodermalni kancer, tumori osovine kičme, gliom, meningiom i adenom hipofize.

9. Nukleinska kiselina za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 8, pri čemu navedeni postupak sadrži uvođenje navedene nukleinske kiseline u ćeliju domaćina pacijenta.

10. Nukleinska kiselina za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 9, pri čemu navedeni postupak sadrži korak primene na pacijenta nukleinske kiseline koja kodira veštački T ćelijski receptor ili ćelije domaćina koja sadrži navedenu nukleinsku kiselinu.

11. Nukleinska kiselina za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 10, pri čemu nukleinska kiselina je DNK ili RNK.

12. Nukleinska kiselina za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 11, pri čemu nukleinska kiselina je gola, pakovana u lipozom ili virusnu česticu.

13. Nukleinska kiselina za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 12, pri čemu nukleinska kiselina je sistem na bazi virusa izabran iz grupe koja se sastoji od γ-retrovirusa i lentivirusa.