RS65747B1

RS65747B1 - Kristalni oblik jedinjenja inhibitora wee1 i njegova upotreba

Info

Publication number: RS65747B1
Application number: RS20240816A
Authority: RS
Inventors: Wenyuan Qian; Chundao Yang; Zhengwei Li; Jie Li; Jian Li; Shuhui Chen
Original assignee: Wuxi Biocity Biopharmaceutics Co Ltd
Priority date: 2019-04-30
Filing date: 2020-04-30
Publication date: 2024-08-30
Also published as: SG11202111315XA; AU2020266956A1; LT3964510T; US12291536B2; EP3964510A1; JP7582970B2; SMT202400303T1; BR112021021230A8; ES2984617T3; HRP20241008T1; HUE068061T2; EP3964510A4; US20220220120A1; CA3138240C; CN113784968B; PT3964510T; PL3964510T3; FI3964510T3; IL287472A; BR112021021230A2

Description

Opis

Unakrsna referenca na srodnu prijavu

[0001] CN201910364694.X, datum podnošenja: 30.4.2019.

Oblast tehnike

[0002] Otkriveni su kristalni oblici jedinjenja formule (I) i upotreba kristalnih oblika za proizvodnju leka za lečenje bolesti povezanih sa Wee1.

Stanje tehnike

[0003] Proces ćelijskog ciklusa je složen proces pod kontrolom serije regulatornih sistema ćelijskog ciklusa. Ključ regulatornog sistema ćelijskog ciklusa je kompleks CDK/ciklina formiran kombinacijom ciklin zavisnih kinaza (CDK) i ciklina (ciklini). Kompleks može pokrenuti ćelije da uđu u ciklus proliferacije, pri čemu CDK1 (humani autoploid je takođe poznat kao CDC2)/ciklin B kompleks igra ključnu ulogu u kontroli ćelija u M fazi.

[0004] Replikacija DNK mora biti završena pre nego što ćelija uđe u M fazu. Usled mešanja različitih endogenih i egzogenih faktora, često se javljaju mutacije ili oštećenja DNK. Abnormalna DNK mora biti popravljena ili će izazvati mitotičku katastrofu i smrt ćelije. Kontrolna tačka ćelijskog ciklusa će prekinuti ćelijski ciklus i omogućiti popravku DNK pre njenog ulaska u M fazu. G1/S kontrolna tačka na kraju G1 faze i G2/M kontrolna tačka u G2 fazi su dve glavne kontrolne tačke ćelijskog ciklusa, koje su zajedno odgovorne za prepoznavanje i popravku oštećenja DNK. Normalne ćelije koriste G1/S kontrolnu tačku da dovrše popravku DNK u G1 fazi, dok skoro 50% ćelija kancera imaju defekte u tumor supresorskom genu p53, zbog čega im nedostaje funkcija G1/S kontrolne tačke. Moraju se više oslanjati na G2/M kontrolnu tačku da bi završili popravku DNK. Kontrolna tačka G2/M retko prolazi kroz mutacije, zbog čega ćelije kancera izbegavaju tretman agenasa koji oštećuju DNK i zračenja.

[0005] Wee1 protein kinaza je regulator ćelijskog ciklusa, član porodice serin i treonin protein kinaza u jedru i ključna je kinaza za G2/M kontrolnu tačku. Porodica humanih protein kinaza "Wee" uglavnom uključuje Wee1 i Myt1, od kojih obe mogu da fosforilišu Tyr15 mesto na CDC2, inhibiraju aktivaciju CDC2/ciklin B kompleksa i blokiraju ćelije da uđu u M fazu dok se popravka DNK ne završi. Myt1 takođe može da fosforiliše Thr14 mesto na CDC2, što je takođe negativna regulacija aktivnosti CDC2. Wee1 kinaza je visoko eksprimirana u mnogim ćelijama kancera. Inhibicijom Wee1 kinaze, tumorske ćelije se mogu direktno naterati da preskoče popravku DNK G2 stadijuma i unapred uđu u mitozu, što dovodi do smrti tumorskih ćelija, i postižu svrhu lečenja kancera.

[0006] Trenutno inhibitor Wee1 AZD1775 kompanije AstraZeneca je ušao u kliničku fazu II, a u razvoju je više od 30 kliničkih ispitivanja koja pokazuju dobre terapeutske efekte. AZD1775 je prvi razvio Merck, pa je stoga poznat i kao MK-1775. U septembru 2013., Merck je izvršio prenos jedinjenja na AstraZeneca globalno, i relevantni patenti uglavnom uključuju US20070254892, WO2007126122, EP2213673, WO2008133866, WO2011034743, itd. Abbott i Abbvie su takođe sproveli istraživanja o inhibitorima Wee1, a relevantni patenti uglavnom uključuju US2012220572, WO2013126656, WO2013012681, WO2013059485, WO2013013031, WO2013126656, itd. Almac-ovi patenti u vezi sa inhibitorima Wee1 uključuju WO2014167347, WO2015019037, WO2015092431.

[0007] WO2019085933A1 otkriva makrociklično jedinjenje koje služi kao inhibitor Wee1 i njegovu primenu u pripremi lekova za lečenje bolesti povezanih sa Wee1. WO2019085933A1 posebno se odnosi na jedinjenje predstavljeno formulom (II), njegov izomer i njegovu farmaceutski prihvatljivu so

[0008] EP3875460A1 otkriva derivat pirimidopirazolona sledeće formule (I) kao inhibitor Wee1 i njegovu upotrebu u pripremi leka za lečenje bolesti povezanih sa Wee1

[0009] WO2008133866 otkriva jedinjenje AZD1775 koje ima sledeću strukturu:

[0010] CN108623615A otkriva makrociklični derivat pirazol[3,4-d]pirimidin-3-ona kako je predstavljen formulom (I) i/ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, kompoziciju koja sadrži jedinjenje predstavljeno formulom (I) i/ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, postupak za pripremu, upotrebu kao inhibitora Wee1 i upotrebu kao senzibilizatora u hemoterapiji ili radioterapiji kancera

Rezime

[0011] Obezbeđen je kristalni oblik A jedinjenja formule (I), pri čemu kristalni oblik A ima obrazac rendgenske difrakcije praha (XRPD) koji ima karakteristične difrakcione pikove pod sledećim uglovima 2θ: 5.71±0.2°, 12.68±0.2° i 15.32±0.2°.

[0012] U nekim primerima izvođenja prema predmetnom otkriću, kristalni oblik A ima obrazac rendgenske difrakcije praha (XRPD) koji ima karakteristične difrakcione pikove pod sledećim uglovima 2θ: 5.71±0.2°, 12.68±0.2°, 15.32±0.2°, 19.72±0.2°, 21.44±0.2°, 23.61±0.2° i 25.68±0.2°.

[0013] U nekim primerima izvođenja prema predmetnom otkriću, kristalni oblik A ima obrazac rendgenske difrakcije praha (XRPD) koji ima karakteristične difrakcione pikove pod sledećim uglovima 2θ: 5.71±0.2°, 12.68±0.2°, 15.32±0.2°, 18.04±0.2°, 19.72±0.2°, 21.44±0.2°, 23.61±0.2° i 25.68±0.2°.

[0014] U nekim primerima izvođenja prema predmetnom otkriću, kristalni oblik A ima XRPD obrazac kao što je prikazan na Slici 1.

[0015] U nekim primerima izvođenja prema predmetnom otkriću, kristalni oblik A ima XRPD obrazac sa podacima analize prikazanim u Tabeli 1:

Tabela 1: Podaci analize XRPD obrasca kristalnog oblika A

Br. 2θ ugao Inter- Relativni Br. 2θ ugao (°) Inter- Relativni

[0016] U nekim primerima izvođenja prema predmetnom otkriću, kristalni oblik A ima krivu diferencijalne skenirajuće kalorimetrije (DSC) koja ima jednu početnu tačku endotermnog pika na 34.95±3°C, 174.75 ±3°C i 219.12 ±3°C, respektivno.

[0017] U nekim primerima izvođenja prema predmetnom otkriću, kristalni oblik A ima DSC obrazac kao što je prikazan na slici 2.

[0018] U nekim primerima izvođenja prema predmetnom otkriću, kristalni oblik A ima krivu termogravimetrijske analize (TGA), pri čemu gubitak težine na 70.33±3°C je 0.7367%; i gubitak težine na 209.42±3°C je 3.123%.

[0019] U nekim primerima izvođenja prema predmetnom otkriću, kristalni oblik A ima TGA obrazac kao što je prikazan na slici 3.

[0020] Takođe je obezbeđen kristalni oblik B jedinjenja formule (I), pri čemu kristalni oblik B ima obrazac rendgenske difrakcije praha (XRPD) koji ima karakteristične difrakcione pikove pod sledećim 2θ uglovima: 5.58±0.2°, 12.44±0.2° i 22.16±0.2°.

[0021] U nekim primerima izvođenja prema predmetnom otkriću, kristalni oblik B ima obrazac rendgenske difrakcije praha koji ima karakteristične difrakcione pikove pod sledećim uglovima 2θ: 5.58±0.2°, 11.71±0.2°, 12.44±0.2°, 14.48±0.2°, 15.13±0.2°, 18.64±0.2°, 22.16±0.2° i 26.33±0.2°.

[0022] U nekim primerima izvođenja prema predmetnom otkriću, kristalni oblik B ima obrazac rendgenske difrakcije praha koji ima karakteristične difrakcione pikove pod sledećim uglovima 2θ: 5.58±0.2°, 11.71±0.2°, 12.44±0.2°, 14.48±0.2°, 15.13±0.2°, 17.57±0.2°, 18.64±0.2°, 22.16±0.2° i 26.33±0.2°.

[0023] U nekim primerima izvođenja prema predmetnom otkriću, kristalni oblik B ima XRPD obrazac kao što je prikazan na Slici 4.

[0024] U nekim primerima izvođenja prema predmetnom otkriću, kristalni oblik B ima XRPD obrazac sa podacima analize prikazanim u Tabeli 2:

Tabela 2: Podaci analize XRPD obrasca kristalnog oblika B Br. 2θ Inter- Relativni Br. 2θ ugao (°) Inter- Relativni

[0025] U nekim primerima izvođenja prema predmetnom otkriću, kristalni oblik B ima krivu diferencijalne skenirajuće kalorimetrije (DSC) koja ima jednu početnu tačku endotermnog pika na 42.88±3°C, 198.79±3°C i 222.36 ±3°C, respektivno.

[0026] U nekim primerima izvođenja prema predmetnom otkriću, kristalni oblik B ima DSC obrazac kao što je prikazan na slici 5.

[0027] U nekim primerima izvođenja prema predmetnom otkriću, kristalni oblik B ima krivu termogravimetrijske analize (TGA), pri čemu gubitak težine na 64.21±3°C je 3.265%; i gubitak težine na 243.05±3°C je 1.516%.

[0028] U nekim primerima izvođenja prema predmetnom otkriću, kristalni oblik B ima TGA obrazac kao što je prikazan na slici 6.

[0029] Takođe je obezbeđen kristalni oblik C jedinjenja formule (I), pri čemu kristalni oblik C ima obrazac rendgenske difrakcije praha (XRPD) koji ima karakteristične difrakcione pikove pod sledećim uglovima 2θ: 5.05±0.2°, 5.58±0.2° i 12.44±0.2°.

[0030] U nekim primerima izvođenja prema predmetnom otkriću, kristalni oblik C ima obrazac rendgenske difrakcije praha koji ima karakteristične difrakcione pikove pod sledećim uglovima 2θ: 5.05±0.2°, 5.58±0.2°, 12.44±0.2°, 15.91±0.2°, 16.68±0.2°, 17.61±0.2°, 22.19±0.2° i 26.37±0.2°.

[0031] U nekim primerima izvođenja prema predmetnom otkriću, kristalni oblik C ima XRPD obrazac kao što je prikazan na slici 7.

[0032] U nekim primerima izvođenja prema predmetnom otkriću, kristalni oblik C ima XRPD obrazac sa podacima analize prikazanim u Tabeli 3:

Tabela 3: Podaci analize XRPD obrasca kristalnog oblika C

Br. 2θ ugao (°) Inter- Relativni Br. 2θ ugao Inter- Relativni

[0033] U nekim primerima izvođenja prema predmetnom otkriću, kristalni oblik C ima krivu diferencijalne skenirajuće kalorimetrije (DSC) koja ima jednu početnu tačku endotermnog pika na 37.06±3°C, 189.16±3°C i 218.61±3°C, respektivno.

[0034] U nekim primerima izvođenja prema predmetnom otkriću, kristalni oblik C ima DSC obrazac kao što je prikazan na slici 8.

[0035] U nekim primerima izvođenja prema predmetnom otkriću, kristalni oblik C ima krivu termogravimetrijske analize (TGA), pri čemu gubitak težine na 64.98±3°C je 2.211%; i gubitak težine na 224.71±3°C je 1.127%.

[0036] U nekim primerima izvođenja prema predmetnom otkriću, kristalni oblik C ima TGA obrazac kao što je prikazan na slici 9.

[0037] Takođe je obezbeđen kristalni oblik D jedinjenja formule (I), pri čemu kristalni oblik D ima obrazac rendgenske difrakcije praha (XRPD) koji ima karakteristične difrakcione pikove pod sledećim uglovima 2θ: 5.22±0.2°, 15.99±0.2° i 16.57±0.2°.

[0038] U nekim primerima izvođenja prema predmetnom otkriću, kristalni oblik D ima obrazac rendgenske difrakcije praha koji ima karakteristične difrakcione pikove pod sledećim uglovima 2θ: 5.22±0.2°, 15.99±0.2°, 16.57±0.2° i 21.22±0.2°.

[0039] U nekim primerima izvođenja prema predmetnom otkriću, kristalni oblik D ima obrazac rendgenske difrakcije praha koji ima karakteristične difrakcione pikove pod sledećim uglovima 2θ: 5.22±0.2°, 15.18±0.2°, 15.99±0.2°, 16.57±0.2°, 17.08±0.2°, 18.60±0.2°, 21.22±0.2° i 21.89±0.2°.

[0040] U nekim primerima izvođenja prema predmetnom otkriću, kristalni oblik D ima obrazac rendgenske difrakcije praha koji ima karakteristične difrakcione pikove pod sledećim uglovima 2θ: 5.22±0.2°, 15.18±0.2°, 15.99±0.2°, 16.57±0.2°, 17.08±0.2°, 17.90±0.2°, 18.60±0.2°, 21.22±0.2°, 21.89±0.2°, 25.24±0.2° i 27.00±0.2°.

[0041] U nekim primerima izvođenja prema predmetnom otkriću, kristalni oblik D ima XRPD obrazac kao što je prikazan na slici 10.

[0042] U nekim primerima izvođenja prema predmetnom otkriću, kristalni oblik D ima XRPD obrazac sa podacima analize prikazanim u tabeli 4:

Tabela 4: Podaci analize XRPD obrasca kristalnog oblika D Br. 2θ ugao Inter- Relativni Br. 2θ ugao Inter- Relativni (°) planarni intenzitet (°) planarni intenzitet

1

[0043] U nekim primerima izvođenja prema predmetnom otkriću, kristalni oblik D ima krivu diferencijalne skenirajuće kalorimetrije (DSC) koja ima jednu početnu tačku endotermnog pika na 56.07±3°C, 193.93±3°C i 216.54±3°C, respektivno.

[0044] U nekim primerima izvođenja prema predmetnom otkriću, kristalni oblik D ima krivu diferencijalne skenirajuće kalorimetrije (DSC) koja ima jednu početnu tačku endotermnog pika na 56.07±3°C, 193.93±3°C i 216.54±3°C, respektivno; i jednu vrednost pika egzotermnog pika na 206.82 ±3°C.

[0045] U nekim primerima izvođenja prema predmetnom otkriću, kristalni oblik D ima DSC obrazac kao što je prikazan na slici 11.

[0046] U nekim primerima izvođenja prema predmetnom otkriću, kristalni oblik D ima krivu termogravimetrijske analize (TGA), pri čemu gubitak težine na 79.35±3°C je 1.977%; i gubitak težine na 223.66±3°C je 1.589%.

[0047] U nekim primerima izvođenja prema predmetnom otkriću, kristalni oblik D ima TGA obrazac kao što je prikazan na slici 12.

[0048] Takođe je obezbeđen kristalni oblik E jedinjenja formule (I), pri čemu kristalni oblik E ima obrazac rendgenske difrakcije praha (XRPD) koji ima karakteristične difrakcione pikove pod sledećim uglovima 2θ: 8.65±0.2°, 14.22±0.2° i 24.58±0.2°.

[0049] U nekim primerima izvođenja prema predmetnom otkriću, kristalni oblik E ima obrazac rendgenske difrakcije praha koji ima karakteristične difrakcione pikove pod sledećim uglovima 2θ: 8.65±0.2°, 11.41±0.2°, 13.13±0.2°, 14.22±0.2°, 17.35±0.2°, 18.34±0.2°, 20.39±0.2°, 20.94±0.2° i 24.58±0.2°.

[0050] U nekim primerima izvođenja prema predmetnom otkriću, kristalni oblik E ima XRPD obrazac kao što je prikazan na slici 13.

[0051] U nekim primerima izvođenja prema predmetnom otkriću, kristalni oblik E ima XRPD obrazac sa podacima analize prikazanim u tabeli 5:

Table 5: Podaci analize XRPD obrasca kristalnog oblika E

[0052] U nekim primerima izvođenja prema predmetnom otkriću, kristalni oblik E ima krivu diferencijalne skenirajuće kalorimetrije (DSC) koja ima jednu početnu tačku endotermnog pika na 121.57±3°C, 197.26±3°C i 217.23±3°C, respektivno; i jednu vrednost pika egzotermnog pika na 168.31 ±3°C i 212.95 ±3°C, respektivno.

[0053] U nekim primerima izvođenja prema predmetnom otkriću, kristalni oblik E ima DSC obrazac kao što je prikazan na slici 14.

[0054] U nekim primerima izvođenja prema predmetnom otkriću, kristalni oblik E ima krivu termogravimetrijske analize (TGA), pri čemu gubitak težine na 143.31±3°C je 6.775%; i gubitak težine na 213.62±3°C je 0.3184%.

[0055] U nekim primerima izvođenja prema predmetnom otkriću, kristalni oblik E ima TGA obrazac kao što je prikazan na slici 15.

[0056] Takođe je obezbeđen kristalni oblik F jedinjenja formule (I), pri čemu kristalni oblik F ima obrazac rendgenske difrakcije praha (XRPD) koji ima karakteristične difrakcione pikove na sledećim uglovima 2θ: 5.06±0.2°, 15.91±0.2° i 16.68±0.2°.

[0057] U nekim primerima izvođenja prema predmetnom otkriću, kristalni oblik F ima obrazac rendgenske difrakcije praha koji ima karakteristične difrakcione pikove pod sledećim uglovima 2θ: 5.06±0.2°, 8.34±0.2°, 10.98±0.2°, 15.13±0.2°, 15.91±0.2°, 16.68±0.2°, 17.63±0.2° i 18.87±0.2°.

[0058] U nekim primerima izvođenja prema predmetnom otkriću, kristalni oblik F ima obrazac rendgenske difrakcije praha koji ima karakteristične difrakcione pikove pod sledećim uglovima 2θ: 5.06±0.2°, 8.34±0.2°, 10.98±0.2°, 15.13±0.2°, 15.91±0.2°, 16.68±0.2°, 17.63±0.2°, 18.87±0.2°, 20.33±0.2°, 21.44±0.2°, 22.01±0.2°, 24.04±0.2°, 25.32±0.2° i 25.66±0.2°.

[0059] U nekim primerima izvođenja prema predmetnom otkriću, kristalni oblik F ima XRPD obrazac kao što je prikazan na slici 16.

[0060] U nekim primerima izvođenja prema predmetnom otkriću, kristalni oblik F ima XRPD obrazac sa podacima analize prikazanim u tabeli 6:

Table 6: Podaci analize XRPD obrasca kristalnog oblika F

1

[0061] U nekim primerima izvođenja prema predmetnom otkriću, kristalni oblik F ima krivu diferencijalne skenirajuće kalorimetrije (DSC) koja ima jednu početnu tačku endotermnog pika na 48.69±3°C i 225.26±3°C, respektivno.

[0062] U nekim primerima izvođenja prema predmetnom otkriću, kristalni oblik F ima DSC obrazac kao što je prikazan na slici 17.

[0063] U nekim primerima izvođenja prema predmetnom otkriću, kristalni oblik F ima krivu termogravimetrijske analize (TGA), pri čemu gubitak težine na 100±3°C je 3.404%.

[0064] U nekim primerima izvođenja prema predmetnom otkriću, kristalni oblik F ima TGA obrazac kao što je prikazan na slici 18.

[0065] Obezbeđen je dodatni postupak za pripremu kristalnog oblika F jedinjenja formule (I), koji sadrži,

(a) dodavanje jedinjenja formule (I) u alkoholni rastvarač uz mešanje koji se zagreva u uljanom kupatilu na 55-65°C;

(b) mešanje na 47°C-53°C u trajanju od 72 h;

(c) zaustavljanje zagrevanja i nastavljanje mešanja sa spontano sniženom temperaturom tokom 1 h do 27°C;

(d) omogućavanje da odstoji u trajanju od 18 h, filtriranje i ispiranje filter kolača metanolom;

(e) sušenje pod vakuumom na 60°C u trajanju od 48 h.

[0066] U nekim primerima izvođenja prema predmetnom otkriću, alkoholni rastvarač je metanol.

[0067] Obezbeđena je dalja upotreba kristalnog oblika A, kristalnog oblika B, kristalnog oblika C, kristalnog oblika D, kristalnog oblika E ili kristalnog oblika F za proizvodnju leka za lečenje bolesti povezane sa Wee1.

Tehnički efekat

[0068] Kristalni oblik A, kristalni oblik B, kristalni oblik C, kristalni oblik D, kristalni oblik E i kristalni oblik F jedinjenja prema predmetnom otkriću imaju dobru stabilnost, manje na njih utiče svetlost, toplota i vlažnost, imaju višu rastvorljivost i obećavajuća lekovita svojstva.

Definicija

[0069] Osim ako nije drugačije navedeno, sledeći termini i izrazi imaju sledeće definicije. Određeni termin ili izraz ne treba smatrati neodređenim ili nejasnim bez posebne definicije i treba ih razumeti u skladu sa normalnim značenjima. Trgovački naziv koji se ovde koristi odnosiće se na odgovarajući artikal ili aktivni sastojak.

[0070] Intermedijerna jedinjenja ovde mogu biti pripremljena različitim postupcima sinteze koji su dobro poznati stručnjacima, uključujući specifične primere izvođenja koji su navedeni u nastavku, primere izvođenja kombinacijom sa drugim postupcima hemijske sinteze, i ekvivalentne alternative dobro poznate stručnjaku iz date oblasti tehnike. Poželjni primeri izvođenja uključuju, ali nisu ograničeni na primere u nastavku.

[0071] Hemijska reakcija specifičnih primera izvođenja se izvodi u odgovarajućem rastvaraču, a rastvarač treba da bude pogodan za hemijske promene ovog otkrića i potrebne reagense i materijale. Da bi se dobilo jedinjenje prema ovom pronalasku, stručnjak u ovoj oblasti može da modifikuje ili izabere korak sinteze ili reakcionu šemu na osnovu dostupnih primera izvođenja.

[0072] Ovo otkriće će biti opisano na detaljan način i primere ne treba smatrati ograničenjem.

[0073] Rastvarači koji se ovde koriste su komercijalno dostupni i mogu se koristiti bez daljeg prečišćavanja.

[0074] Rastvarači koji se ovde koriste mogu biti komercijalno dostupni. Ovde se koriste sledeće skraćenice: DCM predstavlja dihlorometan; DMF predstavlja N,N-dimetil sulfoksid dimetilformamid; DMSO predstavlja dimetil sulfoksid; EtOH predstavlja etanol; MeOH

1

predstavlja metanol; TFA predstavlja trifluorosirćetnu kiselinu; TsOH predstavlja ptoluensulfonsku kiselinu; mp predstavlja tačku topljenja; EtSO3H predstavlja etansulfonsku kiselinu; MeSO3H predstavlja metansulfonsku kiselinu; ATP predstavlja adenozin trifosfat; HEPES predstavlja 4-hidroksietilpiperazin etansulfonsku kiselinu; EGTA predstavlja etilenbis(oksietilen nitrilo)tetrasirćetnu kiselinu; MgCl2predstavlja magnezijum dihlorid; MnCl2predstavlja mangan dihlorid; DTT predstavlja ditiotreitol; DCC predstavlja dicikloheksilkarbodiimid; DMAP predstavlja 4-dimetilaminopiridin; DIEA predstavlja N,N-diizopropiletilamin; tež.%: težinski procenat; THF predstavlja tetrahidrofuran.

Instrumenti i postupci analize

1.1 Rendgenski difraktometar praha (XRPD)

[0075]

Uređaj: BRUKER D8 advance rendgenski difraktometar

Postupak testiranja: oko 10-20 mg uzorka je korišćeno za XRPD detekciju.

[0076] Detaljni XRPD parametri su kao što sledi:

Svetlosna cev: Cu, kα, (λ=1.54056Ǻ).

Voltaža svetlosne cevi: 40 kV, Struja svetlosne cevi: 40 mA

Divergencijski prorez: 0.60 mm

Prorez detektora: 10.50 mm

Prorez protiv raspršivanja: 7.10 mm

Opseg skeniranja: 4-40 deg

Veličina koraka: 0.02 deg

Vreme/korak: 0.12 s

Brzina centrifuge uzorka: 15 rpm

1.2 Diferencijalni skenirajući kalorimetar (DSC)

[0077]

Uređaj: TA Q2000 diferencijalni skenirajući kalorimetar

Postupak testiranja: Uzorak (oko 1 mg) je postavljen u DSC aluminijumski lonac za testiranje, pod 50 mL/min N2, zagrevan je od 30°C do 300°C brzinom zagrevanja od 10°C/min.

1

1.3 Termalni gravimetrijski analizator (TGA)

[0078]

Uređaj: TA Q5000 termalni gravimetrijski analizator

Postupak testiranja: Uzorak (2-5 mg) je postavljen u TGA platinasti lonac za testiranje, pod 25 mL/min N2, zagrevan je na brzini zagrevanja od 10°C/min od 30°C (sobna temperatura) do 300°C, ili do gubitka težine od 20%.

Kratak opis crteža

[0079]

Slika 1 prikazuje XRPD obrazac na Cu-Kα zračenje kristalnog oblika A jedinjenja formule (I); Slika 2 prikazuje DSC obrazac kristalnog oblika A jedinjenja formule (I);

Slika 3 prikazuje TGA obrazac kristalnog oblika A jedinjenja formule (I);

Slika 4 prikazuje XRPD obrazac na Cu-Kα zračenje kristalnog oblika B jedinjenja formule (I); Slika 5 prikazuje DSC obrazac kristalnog oblika B jedinjenja formule (I);

Slika 6 prikazuje TGA obrazac kristalnog oblika B jedinjenja formule (I);

Slika 7 prikazuje XRPD obrazac na Cu-Kα zračenje kristalnog oblika C jedinjenja formule (I); Slika 8 prikazuje DSC obrazac kristalnog oblika C jedinjenja formule (I);

Slika 9 prikazuje TGA obrazac kristalnog oblika C jedinjenja formule (I);

Slika 10 prikazuje XRPD obrazac na Cu-Kα zračenje kristalnog oblika D jedinjenja formule (I);

Slika 11 prikazuje DSC obrazac kristalnog oblika D jedinjenja formule (I);

Slika 12 prikazuje TGA obrazac kristalnog oblika D jedinjenja formule (I);

Slika 13 prikazuje XRPD obrazac na Cu-Kα zračenje kristalnog oblika E jedinjenja formule (I); Slika 14 prikazuje DSC obrazac kristalnog oblika E jedinjenja formule (I);

Slika 15 prikazuje TGA obrazac kristalnog oblika E jedinjenja formule (I);

Slika 16 prikazuje XRPD obrazac na Cu-Kα zračenje kristalnog oblika F jedinjenja formule (I); Slika 17 prikazuje DSC obrazac kristalnog oblika F jedinjenja formule (I);

Slika 18 prikazuje TGA obrazac kristalnog oblika F jedinjenja formule (I).

1

Detaljan opis

[0080] Predmetno otkriće će biti detaljno opisano u daljem tekstu pozivanjem na Primere, koji nisu određeni tako označavaju bilo kakvo nepovoljno ograničenje. Predmetno otkriće je ovde opisano detaljno, i njegovi specifični primeri izvođenja su takođe otkriveni.

Intermedijer 1

[0081] Priprema je izvedena pozivanjem na postupak sinteze u WO2007126122.

Primer 1: Jedinjenje formule (I)

[0082]

Šema sinteze:

[0083]

1

Korak 1: Sinteza jedinjenja 1-A

[0084] Na 0~15°C i atmosferi azota, u rastvor 2-acetil-6-bromopiridina (7.35 g, 36.74 mmol) u THF (150 mL) ukapavanjem je dodat 3-butenilmagnezijum bromid (1 M, 55.12 mL) i zatim je reakcioni rastvor mešan na 10~20°C u trajanju od 3 h. 100 mL zasićenog rastvora amonijum hlorida je dodato da bi se ugasila reakcija i odvajanje tečnosti je izvedeno da bi se dobio organski sloj, koji je ispran sa 50 mL zasićenog natrijum hlorida, sušen preko anhidrovanog natrijum sulfata, rotiran i koncentrovan do sušenja da bi se dobilo braon ulje. Braon ulje je prečišćeno hromatografijom na koloni silika gela (PE/EA=7/1) da bi se dobio 1-A.<1>H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ 7.73 (t, J=8.0 Hz, 1H), 7.64 (d, J=7.2 Hz, 1H), 7.46 (d, J=7.2 Hz, 1H), 5.78-5.7 (m, 1H), 4.94-4.85 (m, 2H), 2.07∼2.01 (m, 1H), 1.90∼1.71 (m,3H), 1.41 (s,3H).

Korak 2: Sinteza jedinjenja 1-B

[0085] U smešu 1-A (3.47 g, 13.55 mmol) i 1-C (3.01 g, 13.55 mmol) u dioksanu (150 mL) dodati su N,N'-dimetiletilendiamin (1.31 g, 14.90 mmol, 1.60 mL), bakar jodid (2.58 g, 13.55 mmol) i kalijum karbonat (2.62 g, 18.97 mmol), koji je tri puta prečišćen azotom. Smeša je mešana na 95°C i atmosferi azota od 1.5 i dodato je 200 mL amonijaka (28%). Reakciona smeša je ekstrahovana sa etil acetatom (300 mL×2) i organski slojevi su spojeni, isprani sa 200 mL

1

zasićenog fiziološkog rastvora, sušeni preko anhidrovanog natrijum sulfata i koncentrovani pod sniženim pritiskom do sušenja. Smeša je prečišćena hromatografijom na koloni silika gela (PE/EA=3/1) da bi se dobio 1-B.<1>H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ 9.02 (s,1H), 8.04 (t, J=8.0 Hz, 1H), 7.76 (d, J=7.2 Hz, 1H), 7.64 (d, J=7.6 Hz, 1H), 5.77-5.67 (m, 2H), 5.01-4.79 (m, 6H), 2.56 (s, 3H), 2.15-2.11 (m, 1H), 1.85-1.75 (m, 2H), 1.70-1.60 (m, 1H), 1.46 (s, 3H).

Korak 3: Sinteza jedinjenja 1-D

[0086] U rastvor 1-B (2.06 g, 5.18 mmol) u toluenu (700 mL) dodat je Grubbs-ov katalizator druge generacije (1.32 g, 1.55 mmol) i smeša je mešana 6 h na 80°C i atmosferi azota. Dalje je dodat Grubbs-ov katalizator druge generacije (0.65 g, 0.775mmol) i smeša je mešana na 80°C i atmosferi azota tokom 3 h. Smeša je ohlađena do sobne temperature i filtrirana. Filtrat je koncentrovan do sušenja da bi se dobio braon ostatak, koji je prečišćen hromatografijom na koloni silika gela (PE/EA=1/1) da bi se dobio 1-D.<1>H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ 9.07 (s,1H), 8.06 (t, J=8.0 Hz, 1H), 7.79 (d, J=8.2 Hz, 1H), 7.70 (d, J=7.6 Hz, 1H), 5.39-5.25 (m, 3H), 4.66 (d, J=5.2 Hz, 2H), 2.62(s,3H), 2.40-1.95 (m,3H), 1.85-1.65 (m, 1H), 1.64 (s, 3H).

Korak 4: Sinteza jedinjenja 1-E

[0087] U rastvor jedinjenja 1-D (360 mg, 974.45 µmol) u toluenu (35 mL) dodata je metahloroperbenzojeva kiselina (265.09 mg, 1.31 mmol, 85% čistoća) i reakcioni sistem je mešan na 25°C tokom 2 h. U reakcioni rastvor dodati su 4-(4-metilpiperazion)anilin (242.30 mg, 1.27 mmol) i N,N-diizopropiletilamin (503.76 mg, 3.90 mmol). Reakcioni rastvor je mešan na 25°C tokom 12 h. U reakcioni rastvor je dodato 25 mL vode uz mešanje i vodena faza je ekstrahovana sa etil acetatom (30 mL×3). Organske faze su spojene, isprane jednom zasićenim rastvorom natrijum bikarbonata (30 mL) i zasićenim fiziološkim rastvorom (30 mL), respektivno, sušene preko anhidrovanog natrijum sulfata, filtrirane i sušene pod vakuumom da bi se dobio sirovi proizvod, koji je odvojen pomoću preparativne tečne hromatografije (neutralna) da bi se dobio 1-E.<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 1.70 (s, 3H) 1.78 (br d, J=13.54 Hz, 2H), 2.04 (br d, J=6.54 Hz, 1H), 2.08 -2.23 (m, 2 H), 2.39 (s, 3H), 2.62-2.64 (m, 4H), 3.21-3.24 (m, 4H), 4.24 (br s, 1H), 4.51 (br d, J=13.54 Hz, 1H), 5.61-5.88 (m, 2H), 6.95 (d, J=9.04 Hz, 2H) 7.49 (d, J=9.04 Hz, 3H), 7.81-7.90 (m, 2H) 8.87 (s, 1H); MS m/z: 513.1 [M+H]<+>.

2

Korak 5: Sinteza jedinjenja formule (I)

[0088] Jedinjenje 1-E (100 mg, 195.08 µmol) je podvrgnuto SFC hiralnom odvajanju (hromatografska kolona: AD 250×50mm I.D., 10µm pokretna faza: A: superkritični CO2, B: EtOH (0.1%NH3H2O), A:B =55:45 na 200 mL/min), vreme zadržavanja: 21 min, da bi se dobilo jedinjenje formule (I).<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 1.60 (s, 3H), 1.68 (br s, 2H), 1.94 (br d, J=7.04 Hz, 1H), 2.00-2.20 (m, 2H), 2.30 (s, 3H), 2.52-2.55 (m, 4H), 3.12-3.15 (m, 4H), 4.24 (br s, 1H), 4.42 (br d, J=9.54 Hz, 1H), 5.65 (br s, 2H), 6.85 (d, J=9.04 Hz, 2H), 7.17 (s, 1H) 7.40 (d, J=9.04 Hz, 2H), 7.69-7.81 (m, 2H), 8.77 (s, 1H). MS m/z: 513.1 [M+H]<+>.

Primer 2: Priprema kristalnog oblika A jedinjenja formule (I)

[0089] Oko 50 mg jedinjenja formule (I) je dodato u različite staklene boce, u koje je dodato 0.5 mL acetona respektivno da bi se formirala suspenzija. Uzorci suspenzije su testirani u aparatu za mućkanje na konstantnoj temperaturi (40°C). Uzorci suspenzije su mućkani na 40°C tokom 2 dana i centrifugirani. Gornja tečnost je uklonjena, a zaostali uzorci su sušeni u komori za sušenje u vakuumu (40°C) preko noći da bi se dobio kristalni oblik A jedinjenja formule (I).

Primer 3: Priprema kristalnog oblika B jedinjenja formule (I)

[0090] Oko 50 mg jedinjenja formule (I) je dodato u različite staklene boce, u koje je dodato 0.3 mL etanola da bi se formirala suspenzija. Uzorci suspenzije su testirani u aparatu za mućkanje na konstantnoj temperaturi (40°C). Uzorci suspenzije su mućkani na 40°C tokom 2 dana i centrifugirani. Gornja tečnost je uklonjena, a zaostali uzorci su sušeni u komori za sušenje u vakuumu (40°C) preko noći da bi se dobio kristalni oblik B jedinjenja formule (I).

Primer 4: Priprema kristalnog oblika C jedinjenja formule (I)

[0091] Oko 50 mg jedinjenja formule (I) je dodato u različite staklene boce, u koje je dodato 0.2 mL metanola da bi se formirala suspenzija. Uzorci suspenzije su testirani u aparatu za mućkanje na konstantnoj temperaturi (40°C). Uzorci suspenzije su mućkani na 40°C tokom 2 dana i centrifugirani. Gornja tečnost je uklonjena, a zaostali uzorci su sušeni u komori za sušenje u vakuumu (40°C) preko noći da bi se dobio kristalni oblik C jedinjenja formule (I).

Primer 5: Priprema kristalnog oblika D jedinjenja formule (I)

[0092] Oko 50 mg jedinjenja formule (I) je dodato u različite staklene boce, u koje je dodato 0.4 mL metanola/vode (1/1) da bi se formirala suspenzija. Uzorci suspenzije su testirani u aparatu za mućkanje na konstantnoj temperaturi (40°C). Uzorci suspenzije su mućkani na 40°C tokom 2 dana i centrifugirani. Gornja tečnost je uklonjena, a zaostali uzorci su sušeni u komori za sušenje u vakuumu (40°C) preko noći da bi se dobio kristalni oblik D jedinjenja formule (I).

Primer 6: Priprema kristalnog oblika E jedinjenja formule (I)

[0093] Oko 50 mg jedinjenja formule (I) je dodato u različite staklene boce, u koje je dodato 0.5 mL acetonitrila da bi se formirala suspenzija. Uzorci suspenzije su testirani u aparatu za mućkanje na konstantnoj temperaturi (40°C). Uzorci suspenzije su mućkani na 40°C tokom 2 dana i centrifugirani. Gornja tečnost je uklonjena, a zaostali uzorci su sušeni u komori za sušenje u vakuumu (40°C) preko noći da bi se dobio kristalni oblik E jedinjenja formule (I).

Primer 7: Priprema kristalnog oblika F jedinjenja formule (I)

[0094] Na 25-26°C, u balon sa tri grla od 1 L sa 560 mL MeOH dodato je jedinjenje formule (I) uz mešanje. Reakcioni sistem je zagrejan u uljanom kupatilu do 55~65°C. Posle 20 min, unutrašnja temperatura je održavana na 47°C-53°C i reakcioni sistem je mešan 72 h na održavanoj temperaturi. Zagrevanje je prekinuto i mešanje je nastavljeno, a temperatura je spontano snižena tokom 1 h na 27°C. Sistem je ostavljen da stoji 18 h i filtriran, a filterski kolač je ispran sa 30 mL MeOH. Filterski kolač je sušen na 60°C pod vakuumom tokom 48 h da bi se dobio kristalni oblik F jedinjenja formule (I).

Eksperimentalni primer 1: Test stabilnosti čvrstog kristalnog oblika F jedinjenja formule (I) na visokoj temperaturi, visokoj vlažnosti, uslovima osvetljenja

[0095] Prema faktorima uticaja i ubrzanim uslovima ispitivanja, oko 5 mg kristalnog oblika F jedinjenja formule (I) je precizno izmereno i stavljeno u suvu i čistu staklenu bocu, u duplikatu, i rašireno u tanak sloj, kao formalni test uzorak, stavljen u uslove ispitivanja faktora uticaja (60°C, 92.5% relativne vlažnosti) i ubrzane uslove (40°C/75% relativne vlažnosti i 60°C/75% relativne vlažnosti), sa uzorcima potpuno izloženim. Test sistem je bio prekriven papirom od aluminijumske folije sa malim rupicama. Pored toga, uzeta je mala količina uzoraka i stavljena u staklenu bocu za uzorke od 40 mL pod istim uslovima da bi se odredilo stanje kristala. Uzorkovanje i analiza vršeni su 5 dana, 10 dana i jedan mesec. Postupak analize je prikazan u Tabeli 7, a rezultati analize su prikazani u Tabeli 8. Uzorci postavljeni pod uslovima osvetljenja (vidljiva svetlost 1200000 Lux, UV 200W) potpuno su izloženi na sobnoj temperaturi.

Tabela 8 Rezultati analize sadržaja čvrstog uzorka stabilnosti i srodnih supstanci za kristalni oblik F jedinjenja formule (I) (5 dana, 10 dana, jedan mesec)

2

Uslovi i vremenske tačke Kristalni oblik Totalne Sadržaj %

[0096] Zaključak: Kristalni oblik F jedinjenja formule (I) se nije promenio za kristalni oblik jedinjenja sirovog materijala tokom jednomesečnog faktora uticaja čvrstog materijala i ubrzanog testa, pokazujući dobru fizičku stabilnost. U analizi srodnih supstanci, nečistoće su blago povećane na visokoj temperaturi (60°C) i ubrzanim uslovima (60°C/75%RH), a ukupna količina nečistoća je bila skoro nepromenjena u drugim uslovima, pokazujući blagu osetljivost na temperaturu.

[0097] Eksperimentalni zaključak: Kristalni oblik ovog pronalaska ima dobru stabilnost i lak je za proizvodnju lekova.

Eksperimentalni primer 2: In vitro enzimska inhibitorna aktivnost jedinjenja formule (I)

[0098] Eksperimentalni test je sproveden u Eurofins-u, a eksperimentalne rezultate je obezbedila kompanija.

[0099] U test sistem je dodato 20 mM Tris-HCl, pH 8.5, 0.2 mM EDTA, 500 µM polipeptidnog supstrata (LSNLYHQGKFLQTFCGSPLYRRR), 10 mM magnezijum acetata i 10 µM [γ-<33>P]-ATP (intenzitet od oko 500 cpm/pmol). Nakon dodavanja Mg<2+>i ATP smeše, reakcija je započeta i inkubirana na sobnoj temperaturi 40 min. 3% fosfatni pufer je dodat da se reakcija zaustavi.

[0100] 10 µL reakcionog rastvora je uzeto i filtrirano na kontinualnom filteru P30, i isprano tri puta sa 75 mM fosfatnog pufera, jednom metanolom, svako ispiranje po 5 min. Posle sušenja, vrednosti su očitane postupkom scintilacionog brojanja. Rezultati ispitivanja su prikazani u tabeli 9.

Tabela 9: Rezultati testa in vitro enzimske aktivnosti jedinjenja prema ovom pronalasku

(IC50)

Eksperimentalni primer 3: In vitro test permeabilnosti jedinjenja prema ovom pronalasku

[0101] U studiji je korišćena ćelija MDR1-MDCK II koju je odobrila Piet Borst Laboratory of the Netherlands Cancer Institute, ćelija je Madin-Darby pseća ćelija bubrega transfektovana humanim genom za rezistenciju na više lekova (MDR1), koji može stabilno da eksprimira efluks transporter P glikoproteina (P-gp) i stoga je pogodna za skrining P-gp supstrata ili inhibitora, i za predviđanje permeabilnosti jedinjenja sa visokim efluksnim barijerama kao što su duodenum, krvno-moždana barijera, jedro ćelija jetre i jedinica bubrega. MDR1-MDCK II ćelije iz pasusa 5-35 su korišćene za ispitivanje permeabilnosti.

[0102] MDR1-MDCK II ćelije su kultivisane sa α-MEM medijumom (a-Minimum Essential Media) pod uslovima kulture od 37±1°C, 5% CO2i zasićene relativne vlažnosti. Zatim su ćelije zasejane u BD Transwell ploču sa 96 bunarčića sa gustinom zasejavanja od 2.3×10<5>ćelija/cm<2>, a zatim su ćelije kultivisane u inkubatoru ugljen-dioksida 4-7 dana za eksperiment transporta. Postupak pripreme njegovog α-MEM medijuma bio je sledeći:

Tečna hranljiva baza je pripremljena sa prahom (α-MEM prah od Gibco, kat#:11900) rastvorenim u čistoj vodi i dodat je L-(L-glutamin) i NaHCO3. Zatim je dodat 10% FBS (fetalni goveđi serum), 1% PS (dvostruko antitelo) i 1% NEAA da bi se napravio kompletan medijum. Serija α-MEM medijuma je prikazana u tabeli 10.

2

Tabela 10. Tabela serije αMEM (1L×)

[0103] AZD1775 (ili jedinjenje prema ovom otkriću) i digoksin su primenjivani u koncentraciji od 2 µM, dvosmerno (A-B i B-A smerovi), sa duplim bunarčićima. Testirane koncentracije fenoterola i propranolola bile su 2 µM i primenjivane su u jednom smeru (smer A-B), sa duplim bunarčićima.

[0104] Rastvori koji će se koristiti su prethodno inkubirani u vodenom kupatilu na 37±1°C tokom 30 min. Rastvor za doziranje i rastvor za prijem su dodati u odgovarajuće bunarčiće ćelijske ploče (75 i 250 µL za svaki gornji i bazni bunarčić, respektivno) da bi se započeo eksperiment dvosmernog transporta. Nakon dodavanja uzoraka, ćelijske ploče su stavljene u inkubator na 37±1°C, 5% CO2i zasićenu relativnu vlažnost da se inkubiraju 150 min. Informacije o prikupljanju uzoraka navedene su u tabeli 11.

Tabela 11. Informacije o prikupljanju uzoraka

[0105] Nakon što su svi uzorci vorteksovani i centrifugirani na 3220 g tokom 10 minuta, odgovarajuća zapremina supernatanta je prebačena na ploču za analizu uzorka. Nakon što je

2

ploča zapečaćena, uzorak treba čuvati na 2-8°C ako nije odmah analiziran, upotrebom LC-MS/MS postupka za analizu.

[0106] Nakon što je eksperiment transporta završen, integritet ćelija MDR1-MDCK II je testiran testom Lucifer Yellow Rejection Assay. Nakon 30 minuta inkubacije sa rastvorom Lucifer Yellow, uzorak Lucifer Yellow je sakupljen, a čitač ploča 2e postavljen na 425/528 nm (ekscitacija/emisija) je korišćen za detekciju relativnog intenziteta fluorescencije (RFU) fluorescentne žute boje u uzorku.

[0107] Izvršena je semi-kvantitativna analiza ispitivane supstance AZD1775 (ili jedinjenja ovog otkrića), gde je referentna supstanca Fenoterol, Propranolol i Digoksin, korišćen je odnos površine pika analita prema onoj internog standarda kao koncentracija referentne supstance.

[0108] Eksperimentalni rezultati su prikazani u tabeli 12.

Tabela 12. Stopa prodiranja (10<-6>cm/s)

Eksperimentalni zaključak:

[0109] U poređenju sa AZD1775, osobina permeabilnosti jedinjenja formule (I) je znatno poboljšana, što je korisno za korišćenje lekova od strane organizama.

Eksperimentalni primer 4: Farmakokinetička procena jedinjenja

[0110] Ovaj eksperiment se koristi za proučavanje farmakokinetike AZD1775 (ili jedinjenja ovog otkrića) u plazmi ženki Balb/c golih miševa posle jedne intravenske primene i jedne oralne primene.

[0111] Dvanaest miševa (koji je obezbedio Lingchang) su nasumično podeljeni u dve grupe, po 6 ženki u svakoj grupi i uzorci su sakupljeni unakrsnim uzorkovanjem krvi. Svim životinjama u intravenskoj grupi dato je 1 mg/kg AZD1775 (ili jedinjenja iz ovog otkrića) intravenskom

2

injekcijom, a formulacija nosača je bila bistar rastvor 5% HP-betaCD (Kunshan Ruisk Chemical Materials Co., Ltd.) koji sadrži 0.2 mg/mL AZD1775 (ili jedinjenja prema ovom pronalasku). Životinjama u oralnoj grupi dato je 10 mg/kg AZD1775 (ili jedinjenja iz ovog otkrića) putem sonde, a formulacija nosača je bila uniformna suspenzija od 0.5% metilceluloze koja sadrži 1 mg/mL AZD1775 (ili jedinjenja iz ovog otkrića).

[0112] U intravenskoj grupi, uzorci plazme su sakupljeni u 9 vremenskih tačaka: 5 min, 15 min, 30 min, 1 h, 2 h, 4 h, 6 h, 8 h i 24 h nakon primene. U oralnoj grupi, uzorci plazme su sakupljeni u 8 vremenskih tačaka: 15 min, 30 min, 1 h, 2 h, 4 h, 6 h, 8 h i 24 h nakon primene. Uzorci su analizirani pomoću LC-MS/MS da bi se dobili podaci o koncentraciji u plazmi AZD1775 (ili jedinjenja ovog otkrića) i da bi se izračunali farmakokinetički parametri, kao što su koncentracija pika, vreme pika, stopa klirensa, polu-život, površina ispod krive lek-vreme, bioraspoloživost itd.

[0113] Eksperimentalni rezultati su prikazani u tabeli 13.

Tabela 13. Rezultati farmakokinetičkog testa

[0114] Eksperimentalni zaključci: U poređenju sa AZD1775, jedinjenje formule (I) može značajno poboljšati višestruke pokazatelje farmakokinetike kod miševa, gde su in vivo stopa

2

klirensa, polu-život, in vivo integral koncentracije i bioraspoloživost pokazali značajne prednosti.

Eksperimentalni primer 5: In vivo studija

(1) In vivo farmakodinamička studija jedinjenja na subkutanom ksenotransplatatu tumora LoVo ćelija humanog kancera debelog creva BALB/c modela golog miša

[0115] Eksperimentalni postupak: Izabrane eksperimentalne životinje (obezbeđen od Shanghai SIPPR-BK Experimental Animal Co., Ltd.) su bili BALB/c goli miševi, 6-8 nedelja, težine 18-22 g.

[0116] LoVo ćelije kancera debelog creva su uzgajane u monosloju in vitro, i uslovi kulture su bili Hamov F-12 medijum sa 10% fetalnog goveđeg seruma, 100 U/mL penicilina, 100 µg/mL streptomicina i 2 mM glutamina, 37°C, 5% CO2. Tripsin-EDTA je korišćen za rutinsku digestiju i pasažu, dva puta nedeljno. Kada je zasićenost ćelija bila 80%-90%, ćelije su sakupljene, prebrojane i inokulisane. 0.1 mL (10 × 10<6>ćelija) LoVo ćelija su subkutano inokulisane na desnoj strani svakog golog miša, a grupna primena je započeta kada je prosečna zapremina tumora dostigla 213 mm<3>. Doza za primenu putem gavaže bila je 40 mg/kg, dva puta dnevno. Eksperimentalni indeks je bio da se ispita da li je rast tumora inhibiran, ublažen ili izlečen. Prečnici tumora mereni su kaliperom dva puta nedeljno. Formula za izračunavanje zapremine tumora bila je V = 0.5a × b<2>, gde a i b predstavljaju dugi prečnik i kratak prečnik tumora, respektivno.

[0117] Antitumorska efikasnost jedinjenja je procenjena pomoću TGI (%) ili relativne stope rasta tumora T/C (%). TGI (%) odražava stopu inhibicije rasta tumora. Izračunavanje TGI (%): TGI (%)=[(1- (Prosečna zapremina tumora na kraju primene određene grupe za tretman -Prosečna zapremina tumora na početku primene grupe za tretman))/(Prosečna zapremina tumora na kraju tretmana u kontrolnoj grupi rastvarača - Prosečna zapremina tumora na početku lečenja u kontrolnoj grupi rastvarača)]×100%.

[0118] Konačni rezultati 16 dana primene prikazani su u tabeli 14.

2

Tabela 14. Rezultati farmakodinamičkog testa mišjeg modela ksenotransplantata tumora LoVo ćelija humanog kancera debelog creva

[0119] Zaključak: U poređenju sa AZD1775, jedinjenje prema ovom pronalasku može značajno poboljšati inhibitorni efekat na tumore tela miša, a hiralnost jedinjenja ima neočekivani efekat na in vivo efikasnost.

(2) In vivo farmakodinamička studija jedinjenja na tumorskom modelu humanog kancera pankreasa BxPC-3 BALB/c subkutano transplantiranom golim miševima

[0120] Eksperimentalni postupak: Izabrane eksperimentalne životinje su bili BALB/c goli miševi, 6-8 nedelja, težine 18-22 g.

[0121] 10. generacija BxPC-3 ćelija su kultivisane u monosloju in vitro, a uslovi kulture su bili RPMI 1640 medijum (Proizvođač: Gibco, Katalog: 22400-089) sa 10% fetalnog goveđeg seruma, 100 U/mL penicilina i 100 µg/mL Streptomicina, 37 °C, 5% CO2, 4 pasaža. Postupak pasaže je bio dva puta nedeljno sa tripsin-EDTA za rutinsku digestiju i pasažu. Kada je zasićenje ćelija dostiglo 80%-90%, ćelije su digestirane sa tripsinom-EDTA, prebrojane i resuspendovane u PBS pri gustini od 5 × 10<7>ćelija/mL. Svaka životinja je inokulisana sa 0.1 mL (5×10<6>ćelija) BxPC-3 ćelija sa desne strane. Kada je prosečna zapremina tumora dostigla 153 mm<3>, oni su nasumično grupisani prema zapremini tumora i započeta je primena. Doziranje gavažom: 25 mg/kg, jednom dnevno.

[0122] Eksperimentalni indeks je bio da se ispita da li je rast tumora inhibiran, ublažen ili izlečen. Prečnici tumora su mereni mernim kaliperom dva puta nedeljno. Antitumorska efikasnost jedinjenja je procenjena pomoću TGI (%) ili relativne stope rasta tumora T/C (%). TGI (%) odražava stopu inhibicije rasta tumora. Izračunavanje TGI (%): TGI (%)=[(1-(Prosečna zapremina tumora na kraju primene određene grupe za tretman - Prosečna zapremina tumora na početku primene grupe za tretman))/(Prosečna zapremina tumora na kraju tretmana u kontrolnoj grupi rastvarača - Prosečna zapremina tumora na početku tretmana u kontrolnoj grupi rastvarača)]×100%.

[0123] Konačni eksperimentalni rezultati od 27 dana primene su prikazani u tabeli 15.

Tabela 15. Rezultati farmakodinamičkog testa u mišjem modelu tumorskog ksenotransplatata ćelija humanog kancera pankreasa BxPC-3

[0124] Zaključak: Može se videti iz tabele 15, u poređenju sa AZD1775, jedinjenje formule (I) može značajno poboljšati inhibitorni efekat na tumore tela miša.

(3) In vivo antitumorska efikasnost jedinjenja na modelu tumora transplantiranih ćelija kancera debelog creva miša CT26

[0125] Eksperimentalni postupak: Izabrane eksperimentalne životinje su bili BALB/c goli miševi, 7 nedelja, težine 16-20 g, ženke.

[0126] Ćelije: CT26 ćelije kancera debelog creva miša (Cell Bank of Type Culture Collection Committee of Chinese Academy of Sciences) uzgajane su u monosloju in vitro, a stanje kulture je bilo RPMI-1640 medijum koji sadrži 10% fetalnog goveđeg seruma, na 37°C, 5% CO2inkubator. Tripsin-EDTA je korišćen za rutinsku digestiju i pasažu. Kada su ćelije bile u fazi eksponencijalnog rasta i zasićenje je bilo 80%-90%, ćelije su sakupljene, prebrojane i inokulisane. 0.1 mL DPBS (koji sadrži 3×10<5>CT26 ćelija) je subkutano inokulisano na desnoj strani svakog miša. Kada je prosečna zapremina tumora dostigla 50-70 mm<3>, nasumična primena je sprovedena prema zapremini tumora. Doziranje gavažom: 30 mg/kg, dva puta dnevno.

[0127] Eksperimentalni indeks je bio da se ispita da li je rast tumora inhibiran, ublažen ili izlečen. Prečnici tumora su mereni mernim kaliperom dva puta nedeljno. Antitumorska efikasnost jedinjenja je procenjena pomoću TGI (%) ili relativne stope rasta tumora T/C (%). TGI (%) odražava stopu inhibicije rasta tumora. Izračunavanje TGI (%): TGI (%)=[(1-(Prosečna zapremina tumora na kraju primene određene grupe za tretman - Prosečna zapremina tumora na početku primene grupe za tretman))/(Prosečna zapremina tumora na kraju tretmana u kontrolnoj grupi rastvarača – Prosečna zapremina tumora na početku tretmana u kontrolnoj grupi rastvarača)]×100%.

[0128] Konačni rezultati 18 dana primene su prikazani u tabeli 16.

1

Tabela 16. In vivo rezultati testa efikasnosti modela alotransplatata tumora ćelija CT26 mišjeg kancera debelog creva

[0129] Zaključak: Može se videti iz tabele 16, u poređenju sa AZD1775, jedinjenje formule (I) može značajno poboljšati inhibitorni efekat na tumore tela miša.

2

Claims

Patentni zahtevi 1. Kristalni oblik A jedinjenja formule (I), naznačen time što kristalni oblik A ima obrazac rendgenske difrakcije praha (XRPD) koji ima karakteristične difrakcione pikove pod sledećim 2Θ uglovima: 5.71±0.2°, 12.68±0.2° i 15.32±0.2°;

na primer, pri čemu kristalni oblik A ima obrazac rendgenske difrakcije praha koji ima karakteristične difrakcione pikove pod sledećim uglovima 2θ: 5.71±0.2°, 12.68±0.2°, 15.32±0.2°, 18.04±0.2°, 19.72±0.2°, 21.44±0.2°, 23.61±0.2° i 25.68±0.2°; na primer, pri čemu kristalni oblik A ima obrazac rendgenske difrakcije praha kao što je prikazan na slici 1.
2. Kristalni oblik A prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što kristalni oblik A ima krivu diferencijalne skenirajuće kalorimetrije (DSC) koja ima jednu početnu tačku endotermnog pika na 34.95±3°C, 174.75 ±3°C i 219.12 ±3°C, respektivno; na primer, pri čemu kristalni oblik A ima DSC obrazac kao što je prikazan na slici 2; ili pri čemu kristalni oblik A ima krivu termogravimetrijske analize (TGA), pri čemu gubitak težine na 70.33±3°C je 0.7367%, i gubitak težine na 209.42±3°C je 3.123%; na primer, pri čemu kristalni oblik A ima TGA obrazac kao što je prikazan na slici 3.
3. Kristalni oblik B jedinjenja formule (I), naznačen time što kristalni oblik B ima obrazac rendgenske difrakcije praha (XRPD) koji ima karakteristične difrakcione pikove pod sledećim 2θ uglovima: 5.58±0.2°, 12.44±0.2° i 22.16±0.2°; na primer, pri čemu kristalni oblik B ima obrazac rendgenske difrakcije praha koji ima karakteristične difrakcione pikove pod sledećim uglovima 2θ: 5.58±0.2°, 11.71±0.2°, 12.44±0.2°, 14.48±0.2°, 15.13±0.2°, 18.64±0.2°, 22.16±0.2° i 26.33±0.2°; na primer, pri čemu kristalni oblik B ima XRPD obrazac kao što je prikazan na slici 4.
4. Kristalni oblik B prema patentnom zahtevu 3, naznačen time što kristalni oblik B ima krivu diferencijalne skenirajuće kalorimetrije (DSC) koja ima jednu početnu tačku endotermnog pika na 42.88±3°C, 198.79±3°C i 222.36 ±3°C, respektivno; na primer, pri čemu kristalni oblik B ima DSC obrazac kao što je prikazan na slici 5; ili pri čemu kristalni oblik B ima krivu termogravimetrijske analize (TGA), pri čemu gubitak težine na 64.21±3°C je 3.265%; i gubitak težine na 243.05±3°C je 1.516%; na primer, pri čemu kristalni oblik B ima TGA obrazac kao što je prikazan na slici 6.
5. Kristalni oblik C jedinjenja formule (I), naznačen time što kristalni oblik C ima obrazac rendgenske difrakcije praha (XRPD) koji ima karakteristične difrakcione pikove pod sledećim uglovima 2θ: 5.05±0.2°, 5.58±0.2° i 12.44±0.2°; na primer, pri čemu kristalni oblik C ima obrazac rendgenske difrakcije praha koji ima karakteristične difrakcione pikove pod sledećim uglovima 2θ: 5.05±0.2°, 5.58±0.2°, 12.44±0.2°, 15.91±0.2°, 16.68±0.2°, 17.61±0.2°, 22.19±0.2° i 26.37±0.2°; na primer, pri čemu kristalni oblik C ima XRPD obrazac kao što je prikazan na slici 7.
6. Kristalni oblik C prema patentnom zahtevu 5, naznačen time što kristalni oblik C ima krivu diferencijalne skenirajuće kalorimetrije (DSC) koja ima jednu početnu tačku endotermnog pika na 37.06±3°C, 189.16±3°C i 218.61±3°C, respektivno; 4 na primer, pri čemu kristalni oblik C ima DSC obrazac kao što je prikazan na slici 8; ili pri čemu kristalni oblik C ima krivu termogravimetrijske analize (TGA), pri čemu gubitak težine na 64.98±3°C je 2.211%; i gubitak težine na 224.71±3°C je 1.127%; na primer, pri čemu kristalni oblik C ima TGA obrazac kao što je prikazan na slici 9.
7. Kristalni oblik D jedinjenja formule (I), naznačen time kristalni oblik D ima obrazac rendgenske difrakcije praha (XRPD) koji ima karakteristične difrakcione pikove pod sledećim uglovima 2θ: 5.22±0.2°, 15.99±0.2° i 16.57±0.2°; na primer, pri čemu kristalni oblik D ima obrazac rendgenske difrakcije praha koji ima karakteristične difrakcione pikove pod sledećim uglovima 2θ: 5.22±0.2°, 15.18±0.2°, 15.99±0.2°, 16.57±0.2°, 17.08±0.2°, 18.60±0.2°, 21.22±0.2° i 21.89±0.2°; na primer, pri čemu kristalni oblik D ima XRPD obrazac kao što je prikazan na slici 10.
8. Kristalni oblik D prema patentnom zahtevu 7, naznačen time što kristalni oblik D ima krivu diferencijalne skenirajuće kalorimetrije (DSC) koja ima jednu početnu tačku endotermnog pika na 56.07±3°C, 193.93±3°C i 216.54±3°C, respektivno; na primer, pri čemu kristalni oblik D ima DSC obrazac kao što je prikazan na slici 11; ili pri čemu kristalni oblik D ima krivu termogravimetrijske analize (TGA), pri čemu gubitak težine na 79.35±3°C je 1.977%; i gubitak težine na 223.66±3°C je 1.589%; na primer, pri čemu kristalni oblik D ima TGA obrazac kao što je prikazan na slici 12.
9. Kristalni oblik E jedinjenja formule (I), naznačen time što kristalni oblik E ima obrazac rendgenske difrakcije praha (XRPD) koji ima karakteristične difrakcione pikove pod sledećim uglovima 2θ: 8.65±0.2°, 14.22±0.2° i 24.58±0.2°; na primer, naznačen time što kristalni oblik E ima obrazac rendgenske difrakcije praha koji ima karakteristične difrakcione pikove pod sledećim uglovima 2θ: 8.65±0.2°, 11.41±0.2°, 13.13±0.2°, 14.22±0.2°, 17.35±0.2°, 18.34±0.2°, 20.39±0.2°, 20.94±0.2° i 24.58±0.2°; na primer, pri čemu kristalni oblik E ima XRPD obrazac kao što je prikazan na slici 13.
10. Kristalni oblik E prema patentnom zahtevu 9, naznačen time što kristalni oblik E ima krivu diferencijalne skenirajuće kalorimetrije (DSC) koja ima jednu početnu tačku endotermnog pika na 121.57±3°C, 197.26±3°C i 217.23±3°C, respektivno; i jednu vrednost pika egzotermnog pika na 168.31 ±3°C i 212.95 ±3°C, respektivno; na primer, pri čemu kristalni oblik E ima DSC obrazac kao što je prikazan na slici 14; ili pri čemu kristalni oblik E ima krivu termogravimetrijske analize (TGA), pri čemu gubitak težine na 143.31±3°C je 6.775%; i gubitak težine na 213.62±3°C je 0.3184%; na primer, pri čemu kristalni oblik E ima TGA obrazac kao što je prikazan na slici 15.
11. Kristalni oblik F jedinjenja formule (I), naznačen time što kristalni oblik F ima obrazac rendgenske difrakcije praha (XRPD) koji ima karakteristične difrakcione pikove pod sledećim uglovima 2θ: 5.06±0.2°, 15.91±0.2° i 16.68±0.2°; na primer, pri čemu kristalni oblik F ima obrazac rendgenske difrakcije praha koji ima karakteristične difrakcione pikove pod sledećim uglovima 2θ: 5.06±0.2°, 8.34±0.2°, 10.98±0.2°, 15.13±0.2°, 15.91±0.2°, 16.68±0.2°, 17.63±0.2° i 18.87±0.2°; na primer, pri čemu kristalni oblik F ima XRPD obrazac kao što je prikazan na slici 16.
12. Kristalni oblik F prema patentnom zahtevu 11, naznačen time što kristalni oblik F ima krivu diferencijalne skenirajuće kalorimetrije (DSC) koja ima jednu početnu tačku endotermnog pika na 48.69±3°C i 225.26±3°C, respektivno; na primer, pri čemu kristalni oblik F ima DSC obrazac kao što je prikazan na slici 17; ili pri čemu kristalni oblik F ima krivu termogravimetrijske analize (TGA), pri čemu gubitak težine na 100±3°C je 3.404%; na primer, pri čemu kristalni oblik F ima TGA obrazac kao što je prikazan na slici 18.
13. Kristalni oblik A prema patentnim zahtevima 1 ili 2, kristalni oblik B prema patentnim zahtevima 3 ili 4, kristalni oblik C prema patentnim zahtevima 5 ili 6, kristalni oblik D prema patentnim zahtevima 7 ili 8, kristalni oblik E prema patentnim zahtevima 9 ili 10 ili kristalni oblik F prema patentnim zahtevima 11 ili 12, za upotrebu u lečenju bolesti povezane sa Wee1.
14. Postupak za pripremu kristalnog oblika F jedinjenja formule (I), koji sadrži, (a) dodavanje jedinjenja formule (I) u alkoholni rastvarač uz mešanje koji je zagrevan u uljanom kupatilu do 55~65°C; (b) mešanje na 47°C-53°C tokom 72 h; (c) zaustavljanje zagrevanja i održavanje mešanja sa temperaturom spontano sniženom tokom 1 h do 27°C; (d) omogućavanje da odstoji tokom 18 h, filtriranje i ispiranje filter kolača metanolom; (e) sušenje pod vakuumom na 60°C tokom 48 h.
15. Postupak pripreme prema patentnom zahtevu 14, naznačen time što alkoholni rastvarač je metanol.