RU2842334C2

RU2842334C2 - Кристаллическая форма ингибирующего wee1 соединения и ее применение

Info

Publication number: RU2842334C2
Application number: RU2021134141A
Authority: RU
Inventors: Вэньюань Цянь; Чуньдао ЯН; Чжэнвэй ЛИ; Цзе ЛИ; Цзянь Ли; Шухуэй Чэнь
Original assignee: Уси Байосити Байофармасьютикс Ко., Лтд.
Priority date: 2019-04-30
Filing date: 2020-04-30
Publication date: 2025-06-24

Abstract

Изобретение относится к кристаллической форме А соединения формулы (I), причем кристаллическая форма А имеет рентгеновскую порошковую дифрактограмму, содержащую характеристические дифракционные пики при следующих углах 2θ: 5,71±0,2°, 12,68±0,2°, 15,32±0,2°, 21,44±0,2°, 23,61±0,2° и 25,68±0,2°. Кристаллическая форма А соединения формулы (I) по изобретению применяется для лечения связанного с Wee1 заболевания. 2 н. и 4 з.п. ф-лы, 16 табл., 18 ил., 12 пр.

Description

Перекрестная ссылка на родственную заявку

Заявка CN201910364694.X, дата подачи: 30 апреля 2019 года.

Область техники настоящего изобретения

Раскрыты кристаллические формы соединения формулы (I) и применение кристаллических форм в изготовлении лекарственного средства для лечения связанного с Wee1 заболевания.

Уровень техники настоящего изобретения

Процесс клеточного цикла представляет собой сложный процесс, которым управляет ряд регуляторных систем клеточного цикла. Основная регуляторная система клеточного цикла представляет собой комплекс CDK и циклинов, который образуют в сочетании циклинзависимые киназы (CDK) и циклины. Этот комплекс может обеспечивать вступление клеток в цикл пролиферации, в котором комплекс CDK1 (аутоплоид человека также известен как CDC2) и циклина B играет главную роль в направлении клеток в фазу M.

Репликация ДНК должна быть завершена до вступления клетки в фазу M. Вследствие воздействия разнообразные эндогенных и экзогенных факторов, в ДНК часто возникают мутации или повреждения. Аномальная ДНК должна быть подвергнута репарации, иначе ее повреждение вызовет митотическое нарушение и приведет к гибели клетки. Контрольная точка клеточного цикла прекращает клеточный цикл и обеспечивает репарацию ДНК перед ее вступлением в фазу M. Контрольная точка G1/S в конце фазы G1 и контрольная точка G2/M в конце фазы G2 представляют собой две основные контрольные точки клеточного цикла, которые несут совместную ответственность за распознавание и устранение повреждения ДНК. В нормальных клетках контрольная точка G1/S используется для завершения репарации ДНК в фазе G1, в то время как приблизительно 50% раковых клеток содержат дефекты в подавляющем опухоль гене p53, которые лишают их функции контрольной точки G1/S. Эти клетки вынуждены полагаться в большей степени на контрольную точку G2/M для завершения репарации ДНК. Контрольная точка G2/M редко повергается мутациям, что позволяет раковым клеткам уклоняться от воздействия разрушающих ДНК агентов и излучения.

Протеинкиназа Wee1 является регулятором клеточного цикла, представителем семейства сериновых и треониновых протеинкиназ в ядре и основной киназой для контрольной точки G2/M. В семейство протеинкиназ Wee человека входят Wee1 и Myt1, обе из которых могут осуществлять фосфорилирование центра Tyr15 в CDC2, ингибировать активацию комплекса CDC2 и циклина B, а также блокировать вступление клеток в фазу M до завершения репарации ДНК. Myt1 также может осуществлять фосфорилирование центра Tyr14 в CDC2, что также представляет собой отрицательное регулирование активности CDC2. Киназа Wee1 проявляет высокую экспрессию во многих раковых клетках. Посредством ингибирования киназы Wee1 раковые клетки можно непосредственно заставить обходить репарацию ДНК на стадии G2 и досрочно вступать в митоз, что приведет к гибели раковой клетки и обеспечит достижение цели лечения рака.

В настоящее время ингибитор Wee1 AZD1775 от компании AstraZeneca вступил в клиническую фазу II, и продолжаются более тридцати клинических исследований, которые демонстрируют хорошие терапевтические эффекты. AZD1775 впервые был разработан компанией Merck, и, таким образом, он также известен как MK-1775. В сентябре 2013 года компания Merck передала это соединение компании AstraZeneca во всемирном масштабе, и соответствующие патенты представляют собой, главным образом, US20070254892, WO2007126122, EP2213673, WO2008133866, WO2011034743 и т.д. Компании Abbott и Abbvie также проводили исследования ингибиторов Wee1, и соответствующие патенты представляют собой, главным образом, US2012220572, WO2013126656, WO2013012681, WO2013059485, WO2013013031, WO2013126656 и т.д. Патенты компании Almac в отношении ингибиторов Wee1 представляют собой WO2014167347, WO2015019037, WO2015092431.

В документе WO2008133866 раскрыто соединение AZD1775, имеющее следующую структуру:

Краткое раскрытие настоящего изобретения

Предложена кристаллическая форма A соединения формулы (I), причем кристаллическая форма A имеет рентгеновскую порошковую дифрактограмму, содержащую характеристические дифракционные пики при следующих углах 2θ: 5,71±0,2°, 12,68±0,2(и 15,32±0,2°.

Формула (I)

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения кристаллическая форма A имеет рентгеновскую порошковую дифрактограмму, содержащую характеристические дифракционные пики при следующих углах 2θ: 5,71±0,2°, 12,68±0,2°, 15,32±0,2°, 19,72±0,2°, 21,44±0,2°, 23,61±0,2(и 25,68±0,2°.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения кристаллическая форма A имеет рентгеновскую порошковую дифрактограмму, содержащую характеристические дифракционные пики при следующих углах 2θ: 5,71±0,2°, 12,68±0,2°, 15,32±0,2°, 18,04±0,2°, 19,72±0,2°, 21,44±0,2°, 23,61±0,2(и 25,68±0,2°.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения кристаллическая форма A имеет рентгеновскую порошковую дифрактограмму, которая представлена на фиг.1.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения кристаллическая форма A имеет рентгеновскую порошковую дифрактограмму, результаты анализа которой представлены в таблице 1:

Таблица 1. Результаты анализа рентгеновской порошковой дифрактограммы кристаллической формы A

№	Угол 2(°)	Межплоскостное расстояние ()	Относительная интенсивность (%)	№	Угол 2(°)	Межплоскостное расстояние ()	Относительная интенсивность (%)
1	5,046	17,4994	0,7	17	20,08	4,4184	0,4
2	5,046	17,4994	0,7	18	20,413	4,3471	0,3
3	5,711	15,4612	100	19	21,2	4,1874	0,6
4	7,904	11,176	0,6	20	21,435	4,142	2,1
5	11,218	7,881	0,5	21	21,669	4,0979	0,5
6	12,677	6,9773	27,4	22	22,268	3,989	0,9
7	14,71	6,0172	1,4	23	23,234	3,8252	0,8
8	14,948	5,9216	0,8	24	23,607	3,7656	4,2
9	15,318	5,7794	1,5	25	25,517	3,488	1,9
10	16,051	5,5173	0,5	26	25,678	3,4665	2,2
11	17,159	5,1634	0,9	27	26,043	3,4187	0,5
12	17,768	4,9877	0,5	28	27,765	3,2104	0,4
13	18,043	4,9125	1	29	28,007	3,1832	1
14	18,597	4,7672	0,4	30	29,289	3,0467	0,4
15	18,906	4,69	0,9	31	30,426	2,9354	0,4
16	19,719	4,4984	1,7	-

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения кристаллическая форма A имеет кривую дифференциальной сканирующей калориметрии, содержащую одну начальную точку эндотермического пика при 34,95±3°C, 174,75±3°C и 219,12±3°C, соответственно.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения кристаллическая форма A имеет кривую дифференциальной сканирующей калориметрии, которая представлена на фиг.2.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения кристаллическая форма A имеет кривую термогравиметрического анализа, на которой потеря массы при 70,33±3°C составляет 0,7367%; и потеря массы при 209,42±3°C составляет 3,123%.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения кристаллическая форма A имеет кривую термогравиметрического анализа, которая представлена на фиг.3.

Кроме того, предложена кристаллическая форма B соединения формулы (I), причем кристаллическая форма B имеет рентгеновскую порошковую дифрактограмму, содержащую характеристические дифракционные пики при следующих углах 2θ: 5,58±0,2°, 12,44±0,2(и 22,16±0,2°.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения кристаллическая форма B имеет рентгеновскую порошковую дифрактограмму, содержащую характеристические дифракционные пики при следующих углах 2θ: 5,58±0,2°, 11,71±0,2°, 12,44±0,2°, 14,48±0,2°, 15,13±0,2°, 18,64±0,2°, 22,16±0,2(и 26,33±0,2°.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения кристаллическая форма B имеет рентгеновскую порошковую дифрактограмму, содержащую характеристические дифракционные пики при следующих углах 2θ: 5,58±0,2°, 11,71±0,2°, 12,44±0,2°, 14,48±0,2°, 15,13±0,2°, 17,57±0,2°, 18,64±0,2°, 22,16±0,2(и 26,33±0,2°.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения кристаллическая форма B имеет рентгеновскую порошковую дифрактограмму, которая представлена на фиг.4.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения кристаллическая форма B имеет рентгеновскую порошковую дифрактограмму, результаты анализа которой представлены в таблице 2:

Таблица 2. Результаты анализа рентгеновской порошковой дифрактограммы кристаллической формы B

№	Угол 2θ (°)	Межплоскостное расстояние	Относительная интенсивность (%)	№	Угол 2θ (°)	Межплоскостное расстояние	Относительная интенсивность (%)
1	5,577	15,8346	100	17	19,582	4,5295	4,3
2	7,838	11,2705	1,1	18	20,016	4,4325	5,3
3	9,807	9,0113	1,5	19	21,831	4,0677	3,2
4	11,028	8,0162	2,4	20	22,164	4,0075	18,7
5	11,713	7,549	6,4	21	23,018	3,8607	2,8
6	12,056	7,3351	1,3	22	23,626	3,7626	2,1
7	12,439	7,1098	30,4	23	25,007	3,5579	2,3
8	13,706	6,4552	4,6	24	25,261	3,5227	1,4
9	14,233	6,2177	2,9	25	25,808	3,4493	1,3
10	14,476	6,1138	5,7	26	26,327	3,3824	8,5
11	15,127	5,8522	5,8	27	28,535	3,1255	1
12	16,717	5,2989	1,1	28	30,939	2,8879	0,9
13	17,146	5,1674	1,2	29	31,076	2,8755	0,9
14	17,567	5,0443	7,7	30	32,083	2,7875	0,7
15	18,241	4,8596	2	31	34,201	2,6196	0,7
16	18,637	4,757	6,5	-

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения кристаллическая форма B имеет кривую дифференциальной сканирующей калориметрии, содержащую одну начальную точку эндотермического пика при 42,88±3°C, 198,79±3°C и 222,36±3°C, соответственно.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения кристаллическая форма B имеет кривую дифференциальной сканирующей калориметрии, которая представлена на фиг.5.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения кристаллическая форма B имеет кривую термогравиметрического анализа, на которой потеря массы при 64,21±3°C составляет 3,265%; и потеря массы при 243,05±3°C составляет 1,516%.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения кристаллическая форма B имеет кривую термогравиметрического анализа, которая представлена на фиг.6.

Кроме того, предложена кристаллическая форма C соединения формулы (I), причем кристаллическая форма C имеет рентгеновскую порошковую дифрактограмму, содержащую характеристические дифракционные пики при следующих углах 2θ: 5,05±0,2°, 5,58±0,2° и 12,44±0,2°.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения кристаллическая форма C имеет рентгеновскую порошковую дифрактограмму, содержащую характеристические дифракционные пики при следующих углах 2θ: 5,05±0,2°, 5,58±0,2°, 12,44±0,2°, 15,91±0,2°, 16,68±0,2°, 17,61±0,2°, 22,19±0,2° и 26,37±0,2°.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения кристаллическая форма C имеет рентгеновскую порошковую дифрактограмму, которая представлена на фиг.7.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения кристаллическая форма C имеет рентгеновскую порошковую дифрактограмму, результаты анализа которой представлены в таблице 3:

Таблица 3. Результаты анализа рентгеновской порошковой дифрактограммы кристаллической формы C

№	Угол 2θ (°)	Межплоскостное расстояние	Относительная интенсивность (%)	№	Угол 2θ (°)	Межплоскостное расстояние	Относительная интенсивность (%)
1	5,047	17,4944	12,4	17	19,6	4,5254	0,8
2	5,577	15,8334	100	18	20,032	4,4288	0,7
3	10,945	8,077	0,6	19	21,275	4,1728	0,5
4	11,137	7,9381	1,4	20	21,436	4,1418	0,7
5	11,712	7,5495	1,2	21	21,869	4,0608	0,8
6	12,438	7,1105	12,8	22	22,186	4,0036	6,1
7	13,726	6,4461	0,6	23	23,035	3,8578	1,8
8	14,221	6,2226	0,8	24	23,627	3,7626	0,9
9	14,496	6,1055	0,9	25	24,832	3,5826	0,3
10	15,126	5,8527	1,1	26	25,002	3,5586	0,6
11	15,911	5,5654	6,4	27	25,278	3,5203	0,5
12	16,108	5,4978	2,8	28	26,367	3,3773	3
13	16,685	5,309	3,3	29	26,98	3,302	0,4
14	17,61	5,0322	2,6	30	28,633	3,1151	0,2
15	17,921	4,9455	0,4	31	28,939	3,0828	0,4
16	18,694	4,7427	2,2	32	34,293	2,6127	0,2

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения кристаллическая форма C имеет кривую дифференциальной сканирующей калориметрии, содержащую одну начальную точку эндотермического пика при 37,06±3°C, 189,16±3°C и 218,61±3°C, соответственно.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения кристаллическая форма C имеет кривую дифференциальной сканирующей калориметрии, которая представлена на фиг.8.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения кристаллическая форма C имеет кривую термогравиметрического анализа, на которой потеря массы при 64,98±3°C составляет 2,211%; и потеря массы при 224,71±3°C составляет 1,127%.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения кристаллическая форма C имеет кривую термогравиметрического анализа, которая представлена на фиг.9.

Кроме того, предложена кристаллическая форма D соединения формулы (I), причем кристаллическая форма D имеет рентгеновскую порошковую дифрактограмму, содержащую характеристические дифракционные пики при следующих углах 2θ: 5,22±0,2°, 15,99±0,2° и 16,57±0,2°.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения кристаллическая форма D имеет рентгеновскую порошковую дифрактограмму, содержащую характеристические дифракционные пики при следующих углах 2θ: 5,22±0,2°, 15,99±0,2°, 16,57±0,2° и 21,22±0,2°.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения кристаллическая форма D имеет рентгеновскую порошковую дифрактограмму, содержащую характеристические дифракционные пики при следующих углах 2θ: 5,22±0,2°, 15,18±0,2°, 15,99±0,2°, 16,57±0,2°, 17,08±0,2°, 18,60±0,2°, 21,22±0,2° и 21,89±0,2°.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения кристаллическая форма D имеет рентгеновскую порошковую дифрактограмму, содержащую характеристические дифракционные пики при следующих углах 2θ: 5,22±0,2°, 15,18±0,2°, 15,99±0,2°, 16,57±0,2°, 17,08±0,2°, 17,90±0,2°, 18,60±0,2°, 21,22±0,2°, 21,89±0,2°, 25,24±0,2° и 27,00±0,2°.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения кристаллическая форма D имеет рентгеновскую порошковую дифрактограмму, которая представлена на фиг.10.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения кристаллическая форма D имеет рентгеновскую порошковую дифрактограмму, результаты анализа которой представлены в таблице 4:

Таблица 4. Результаты анализа рентгеновской порошковой дифрактограммы кристаллической формы D

№	Угол 2θ (°)	Межплоскостное расстояние	Относительная интенсивность (%)	№	Угол 2θ (°)	Межплоскостное расстояние	Относительная интенсивность (%)
1	5,224	16,9027	100	16	25,242	3,5253	8,2
2	10,424	8,4794	4	17	26,048	3,418	3,5
3	12,774	6,9241	1,9	18	26,609	3,3472	2
4	15,18	5,8316	7,9	19	26,997	3,3	7,6
5	15,595	5,6774	22,3	20	27,492	3,2417	2,9
6	15,992	5,5373	58,7	21	28,517	3,1274	1,6
7	16,567	5,3466	18,1	22	29,898	2,986	3,5
8	17,075	5,1886	15,3	23	30,55	2,9238	3,8
9	17,904	4,9503	4,9	24	31,333	2,8525	2
10	18,201	4,87	5,1	25	32,348	2,7653	1,7
11	18,599	4,7668	12,1	26	32,95	2,7161	1,3
12	19,506	4,5472	4,1	27	34,522	2,596	1,9
13	21,22	4,1834	25,5	28	34,545	2,5943	2
14	21,888	4,0573	4,8	29	36,655	2,4496	2,1
15	22,936	3,8743	1,6	30	39,522	2,2783	1,7

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения кристаллическая форма D имеет кривую дифференциальной сканирующей калориметрии, содержащую одну начальную точку эндотермического пика при 56,07±3°C, 193,93±3°C и 216,54±3°C, соответственно.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения кристаллическая форма D имеет кривую дифференциальной сканирующей калориметрии, содержащую одну начальную точку эндотермического пика при 56,07±3°C, 193,93±3°C и 216,54±3°C, соответственно; и одно пиковое значение экзотермического пика при 206,82±3°C.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения кристаллическая форма D имеет кривую дифференциальной сканирующей калориметрии, которая представлена на фиг.11.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения кристаллическая форма D имеет кривую термогравиметрического анализа, на которой потеря массы при 79,35±3°C составляет 1,977%; и потеря массы при 223,66±3°C составляет 1,589%.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения кристаллическая форма D имеет кривую термогравиметрического анализа, которая представлена на фиг.12.

Кроме того, предложена кристаллическая форма E соединения формулы (I), причем кристаллическая форма E имеет рентгеновскую порошковую дифрактограмму, содержащую характеристические дифракционные пики при следующих углах 2θ: 8,65±0,2°, 14,22±0,2° и 24,58±0,2°.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения кристаллическая форма E имеет рентгеновскую порошковую дифрактограмму, содержащую характеристические дифракционные пики при следующих углах 2θ: 8,65±0,2°, 11,41±0,2°, 13,13±0,2°, 14,22±0,2°, 17,35±0,2°, 18,34±0,2°, 20,39±0,2°, 20,94±0,2° и 24,58±0,2°.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения кристаллическая форма E имеет рентгеновскую порошковую дифрактограмму, которая представлена на фиг.13.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения кристаллическая форма E имеет рентгеновскую порошковую дифрактограмму, результаты анализа которой представлены в таблице 5:

Таблица 5. Результаты анализа рентгеновской порошковой дифрактограммы кристаллической формы E

№	Угол 2θ (°)	Межплоскостное расстояние	Относительная интенсивность (%)	№	Угол 2θ (°)	Межплоскостное расстояние	Относительная интенсивность (%)
1	6,507	13,5715	8,8	17	23,173	3,8352	2,8
2	8,653	10,2107	100	18	24,575	3,6195	28,2
3	11,414	7,7457	15,2	19	25,243	3,5252	11
4	13,132	6,7365	26,9	20	26,188	3,4001	6,7
5	14,217	6,2247	66,8	21	26,428	3,3697	6,9
6	16,211	5,4632	4,5	22	26,882	3,3139	1,7
7	17,354	5,1058	16,5	23	28,358	3,1446	5,4
8	18,065	4,9065	4,8	24	28,612	3,1173	2,2
9	18,341	4,8332	18,1	25	30,409	2,937	5,5
10	18,974	4,6733	1,8	26	31,1	2,8733	1,9
11	20,39	4,3518	22,8	27	31,688	2,8213	2,9
12	20,941	4,2386	23,4	28	32,322	2,7674	1,6
13	21,594	4,1119	9,6	29	32,874	2,7222	1,6
14	22,169	4,0065	5,5	30	33,876	2,6439	2
15	22,68	3,9174	9,9	31	34,711	2,5822	2,2
16	22,954	3,8713	4	32	35,02	2,5602	1,6

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения кристаллическая форма E имеет кривую дифференциальной сканирующей калориметрии, содержащую одну начальную точку эндотермического пика при 121,57±3°C, 197,26±3°C и 217,23±3°C, соответственно; и одно пиковое значение экзотермического пика при 168,31±3°C и 212,95±3°C, соответственно.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения кристаллическая форма E имеет кривую дифференциальной сканирующей калориметрии, которая представлена на фиг.14.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения кристаллическая форма E имеет кривую термогравиметрического анализа, на которой потеря массы при 143,31±3°C составляет 6,775%; и потеря массы при 213,62±3°C составляет 0,3184%.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения кристаллическая форма E имеет кривую термогравиметрического анализа, которая представлена на фиг.15.

Кроме того, предложена кристаллическая форма F соединения формулы (I), причем кристаллическая форма F имеет рентгеновскую порошковую дифрактограмму, содержащую характеристические дифракционные пики при следующих углах 2θ: 5,06±0,2°, 15,91±0,2° и 16,68±0,2°.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения кристаллическая форма F имеет рентгеновскую порошковую дифрактограмму, содержащую характеристические дифракционные пики при следующих углах 2θ: 5,06±0,2°, 8,34±0,2°, 10,98±0,2°, 15,13±0,2°, 15,91±0,2°, 16,68±0,2°, 17,63±0,2° и 18,87±0,2°.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения кристаллическая форма F имеет рентгеновскую порошковую дифрактограмму, содержащую характеристические дифракционные пики при следующих углах 2θ: 5,06±0,2°, 8,34±0,2°, 10,98±0,2°, 15,13±0,2°, 15,91±0,2°, 16,68±0,2°, 17,63±0,2°, 18,87±0,2°, 20,33±0,2°, 21,44±0,2°, 22,01±0,2°, 24,04±0,2°, 25,32±0,2° и 25,66±0,2°.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения кристаллическая форма F имеет рентгеновскую порошковую дифрактограмму, которая представлена на фиг.16.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения кристаллическая форма F имеет рентгеновскую порошковую дифрактограмму, результаты анализа которой представлены в таблице 6:

Таблица 6. Результаты анализа рентгеновской порошковой дифрактограммы кристаллической формы F

№	Угол 2θ (°)	Межплоскостное расстояние	Относительная интенсивность (%)	№	Угол 2θ (°)	Межплоскостное расстояние	Относительная интенсивность (%)
1	5,062	17,4414	100	13	21,44	4,1411	5,3
2	8,341	10,5913	3,3	14	22,006	4,0358	3,2
3	10,077	8,7708	1,8	15	23,328	3,81	1,2
4	10,98	8,0515	4,7	16	23,898	3,7204	2,7
5	15,128	5,8518	6,1	17	24,181	3,6776	3
6	15,911	5,5653	59	18	25,325	3,5139	3,1
7	16,685	5,3089	30	19	25,656	3,4694	2,5
8	17,628	5,027	12	20	26,96	3,3045	1,2
9	17,945	4,939	1,8	21	27,271	3,2674	1,9
10	18,869	4,6992	2,6	22	29,026	3,0738	1,8
11	19,719	4,4983	0,9	23	32,834	2,7254	0,8
12	20,332	4,3641	4	-

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения кристаллическая форма F имеет кривую дифференциальной сканирующей калориметрии, содержащую одну начальную точку эндотермического пика при 48,69±3°C и 225,26±3°C, соответственно.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения кристаллическая форма F имеет кривую дифференциальной сканирующей калориметрии, которая представлена на фиг.17.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения кристаллическая форма F имеет кривую термогравиметрического анализа, на которой потеря массы при 100±3°C составляет 3,404%.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения кристаллическая форма F имеет кривую термогравиметрического анализа, которая представлена на фиг.18.

Кроме того, предложен способ получения кристаллической формы F соединения формулы (I), включающий,

(a) добавление соединения формулы (I) в спиртовой растворитель в процессе перемешивания и нагревания на масляной бане до 55-65°C;

(b) перемешивание при 47°C-53°C в течение 72 ч;

(c) прекращение нагревания и продолжение перемешивания с самопроизвольным снижением температуры в течение 1 ч до 27°C;

(d) выдерживание в состоянии покоя в течение 18 ч, фильтрование и промывание отфильтрованного осадка метанолом;

(e) высушивание в вакууме при 60°C в течение 48 ч.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения спиртовой растворитель представляет собой метанол.

Кроме того, предложено применение кристаллической формы A, кристаллической формы B, кристаллической формы C, кристаллической формы D, кристаллической формы E или кристаллической формы F в изготовлении лекарственного средства для лечения связанного с Wee1 заболевания.

Технический эффект

Кристаллическая форма A, кристаллическая форма B, кристаллическая форма C, кристаллическая форма D, кристаллическая форма E и кристаллическая форма F соединения согласно настоящему изобретению проявляют хорошую устойчивость, в меньшей степени подвержен действию света, тепла и влаги, имеют высокую растворимость и представляют собой перспективные лекарственные средства.

Определения

Если не указано иное условие, приведенные ниже термины и выражения имеют следующие определения. Конкретные термины или выражения не следует рассматривать как неопределенные или неясные без конкретного определения, но следует понимать согласно обычным значениям. Товарные наименования, используемые в настоящем документе, означают соответствующий продукт или активный ингредиент.

Промежуточные соединения согласно настоящему изобретению могут быть получены с применением разнообразных методов синтеза, которые хорошо известны специалисту в данной области техники, включая конкретные варианты осуществления, представленные ниже, варианты осуществления посредством сочетания с другими методами химического синтеза и эквивалентные альтернативы, хорошо известные специалистам в данной области техники. Предпочтительные варианты осуществления представляют собой приведенные ниже примеры, но не ограничиваются ими.

Химическая реакция согласно конкретному варианту осуществления осуществляется в подходящем растворителе, и этот растворитель должен быть подходящим для химических превращений согласно настоящему изобретению, а также для требуемых реагентов и материалов. В целях получения соединения согласно настоящему изобретению специалисты в данной области техники могут модифицировать или выбирать стадии синтеза или схемы реакции на основании доступных вариантов осуществления.

Настоящее изобретение будет описано подробным образом, и приведенные примеры не следует рассматривать в качестве его ограничения.

Растворители, используемые согласно настоящему изобретению, имеются в продаже и могут быть использованы без дополнительной очистки.

Растворители, используемые согласно настоящему изобретению, могут представлять собой имеющиеся в продаже растворители. В настоящем документе использованы следующие сокращения: DCM представляет собой дихлорметан; DMF представляет собой N,N-диметилформамид; DMSO представляет собой диметилсульфоксид; EtOH представляет собой этанол; MeOH представляет собой метанол; TFA представляет собой трифторуксусную кислоту; TsOH представляет собой п-толуолсульфокислоту; т.пл. представляет собой температуру плавления; EtSO₃H представляет собой этансульфоновую кислоту; MeSO₃H представляет собой метансульфоновую кислоту; ATP представляет собой аденозинтрифосфат; HEPES представляет собой 4-гидроксиэтилпиперазинэтансульфоновую кислоту; EGTA представляет собой этиленбис(оксиэтиленнитрило)тетрауксусную кислоту; MgCl₂ представляет собой дихлорид магния; MnCl₂ представляет собой дихлорид марганца; DTT представляет собой дитиотрейтол; DCC представляет собой дициклогексилкарбодиимид; DMAP представляет собой 4-диметиламинопиридин; DIEA представляет собой N,N-диизопропилэтиламин; мас.% представляет собой массовое процентное содержание; THF представляет собой тетрагидрофуран.

Приборы и методы анализа

1.1. Рентгеновская порошковая дифрактометрия (РПД)

Устройство: рентгеновский порошковый дифрактометр BRUKER D8 Advance

Метод исследования: приблизительно 10-20 мг образца используется для анализа методом рентгеновской порошковой дифрактометрии.

Подробные параметры методом рентгеновской порошковой дифрактометрии представлены ниже:

Рентгеновская трубка: Cu-Kα, (λ=1,54056)

Напряжение трубки: 40 кВ, ток трубки: 40 мА

Щель расходимости: 0,60 мм

Щель детектора: 10,50 мм

Антирассеивающая щель: 7,10 мм

Диапазон сканирования 4-40°

Величина шага: 0,02°

Продолжительность шага: 0,12 с

Скорость вращения столика с образцом: 15 об/мин

1.2. Дифференциальная сканирующая калориметрия (ДСК)

Устройство: дифференциальный сканирующий калориметр TA Q2000

Метод исследования: образец (приблизительно 1 мг) помещают в алюминиевую лодочку для исследования и нагревают в токе азота (50 мл/мин) от 30°C до 300°C при скорости нагревания 10°C/мин.

1.3. Термогравиметрический анализ (ТГА)

Устройство: термогравиметрический анализатор TA Q5000

Метод исследования: образец (2-5 мг) помещают в платиновую лодочку для исследования и нагревают в токе азота (25 мл/мин) от 30°C (комнатная температура) до 300°C при скорости нагревания 10°C/мин или до потери 20% массы.

Краткое описание фигур

На фиг.1 представлена рентгеновская порошковая дифрактограмма (излучение Cu-Kα) кристаллической формы A соединения формулы (I);

на фиг.2 представляет кривая дифференциальной сканирующей калориметрии кристаллической формы A соединения формулы (I);

на фиг.3 представляет кривая термогравиметрического анализа кристаллической формы A соединения формулы (I);

на фиг.4 представлена рентгеновская порошковая дифрактограмма (излучение Cu-Kα) кристаллической формы B соединения формулы (I);

на фиг.5 представляет кривая дифференциальной сканирующей калориметрии кристаллической формы B соединения формулы (I);

на фиг.6 представляет кривая термогравиметрического анализа кристаллической формы B соединения формулы (I);

на фиг.7 представлена рентгеновская порошковая дифрактограмма (излучение Cu-Kα) кристаллической формы C соединения формулы (I);

на фиг.8 представляет кривая дифференциальной сканирующей калориметрии кристаллической формы C соединения формулы (I);

на фиг.9 представляет кривая термогравиметрического анализа кристаллической формы C соединения формулы (I);

на фиг.10 представлена рентгеновская порошковая дифрактограмма (излучение Cu-Kα) кристаллической формы D соединения формулы (I);

на фиг.11 представляет кривая дифференциальной сканирующей калориметрии кристаллической формы D соединения формулы (I);

на фиг.12 представляет кривая термогравиметрического анализа кристаллической формы D соединения формулы (I);

на фиг.13 представлена рентгеновская порошковая дифрактограмма (излучение Cu-Kα) кристаллической формы E соединения формулы (I);

на фиг.14 представляет кривая дифференциальной сканирующей калориметрии кристаллической формы E соединения формулы (I);

на фиг.15 представляет кривая термогравиметрического анализа кристаллической формы E соединения формулы (I);

на фиг.16 представлена рентгеновская порошковая дифрактограмма (излучение Cu-Kα) кристаллической формы F соединения формулы (I);

на фиг.17 представляет кривая дифференциальной сканирующей калориметрии кристаллической формы F соединения формулы (I);

на фиг.18 представляет кривая термогравиметрического анализа кристаллической формы F соединения формулы (I).

Подробное раскрытие настоящего изобретения

Далее настоящее изобретение будет подробно описано посредством представления примеров, что не означает какое-либо нежелательное ограничение. Настоящее изобретение подробно описано в настоящем документе, и его конкретные варианты осуществления также описаны. Для специалистов в данной области техники должно быть очевидным, что могут быть произведены разнообразные изменения и усовершенствования этих конкретных вариантов осуществления без отклонения от идеи и выхода за пределы объема настоящего изобретения.

Промежуточное соединение 1

Получение было осуществлено с применением метода синтеза, описанного в документе WO2007126122.

Пример 1. Соединение формулы (I)

Формула (I)

Схема синтеза:

Стадия 1. Синтез соединения 1-A

При температуре 0-15°C в атмосфере азота в раствор 2-ацетил-6-бромпиридина (7,35 г, 36,74 ммоль) в THF (150 мл) добавляли в капельном режиме 3-бутенилмагнийбромид (1 М, 55,12 мл) и затем реакционный раствор перемешивали при температуре 10-20°C в течение 3 ч. Для гашения реакции добавляли 100 мл насыщенного раствора хлорида аммония и осуществляли разделение жидких фаз, получая органический слой, который промывали, используя 50 мл насыщенного раствора хлорида натрия, высушивали над безводным сульфатом натрия и досуха концентрировали на роторном испарителе, получая бурое масло. Это бурое масло очищали методом колоночной хроматографии с силикагелем (PE/EA=7/1), получая соединение 1-A. ЯМР ¹H (400 МГц, DMSO-d₆): δ (м. д.) 7,73 (т, J=8,0 Гц, 1H), 7,64 (д, J=7,2 Гц, 1H), 7,46 (д, J=7,2 Гц, 1H), 5,78-5,7 (м, 1H), 4,94-4,85 (м, 2H), 2,07-2,01 (м, 1H), 1,90-1,71 (м, 3H), 1,41 (с, 3H).

Стадия 2. Синтез соединения 1-B

В смесь соединений 1-A (3,47 г, 13,55 ммоль) и 1-C (3,01 г, 13,55 ммоль) в диоксане (150 мл) добавляли N,N''-диметилэтилендиамин (1,31 г, 14,90 ммоль, 1,60 мл), йодид меди (2,58 г, 13,55 ммоль) и карбонат калия (2,62 г, 18,97 ммоль), и смесь трижды продували азотом. Смесь перемешивали при температуре 95°C в атмосфера азота в течение 1,5 ч и добавляли 200 мл раствора аммиака (28%). Реакционную смесь экстрагировали этилацетатом (дважды по 300 мл), и органические слои объединяли, промывали, используя 200 мл насыщенного раствора хлорида натрия, высушивали над безводным сульфатом натрия и концентрировали при пониженном давлении досуха. Смесь очищали методом колоночной хроматографии с силикагелем (PE/EA=3/1), получая соединение 1-B. ЯМР ¹H (400 МГц, DMSO-d₆): δ (м. д.) 9,02 (с, 1H), 8,04 (т, J=8,0 Гц, 1H), 7,76 (д, J=7,2 Гц, 1H), 7,64 (д, J=7,6 Гц, 1H), 5,77-5,67 (м, 2H), 5,01-4,79 (м, 6H), 2,56 (с, 3H), 2,15-2,11 (м, 1H), 1,85-1,75 (м, 2H), 1,70-1,60 (м, 1H), 1,46 (с, 3H).

Стадия 3. Синтез соединения 1-D

В раствор соединения 1-B (2,06 г, 5,18 ммоль) в толуоле (700 мл) добавляли катализатор Граббса второго поколения (1,32 г, 1,55 ммоль), и смесь перемешивали в течение 6 ч при температуре 80°C в атмосфере азота. Дополнительно добавляли катализатор Граббса второго поколения (0,65 г, 0,775 ммоль), и смесь перемешивали при температуре 80°C в атмосфере азота в течение 3 ч. Смесь охлаждали до комнатной температуры и фильтровали. Фильтрат концентрировали досуха, получая бурый осадок, который очищали методом колоночной хроматографии с силикагелем (PE/EA=1/1), получая соединение 1-D. ЯМР ¹H (400 МГц, DMSO-d₆): δ (м. д.) 9,07 (с, 1H), 8,06 (т, J=8,0 Гц, 1H), 7,79 (д, J=8,2 Гц, 1H), 7,70 (д, J=7,6 Гц, 1H), 5,39-5,25 (м, 3H), 4,66 (д, J=5,2 Гц, 2H), 2,62 (с, 3H), 2,40-1,95 (м, 3H), 1,85-1,65 (м, 1H), 1,64 (с, 3H).

Стадия 4. Синтез соединения 1-E

В раствор соединения 1-D (360 мг, 974,45 мкмоль) в толуоле (35 мл) добавляли мета-хлорбензойную кислоту (265,09 мг, 1,31 ммоль, чистота 85%), и реакционную смесь перемешивали при температуре 25°C в течение 2 ч. В реакционный раствор добавляли 4-(4-метилпиперазин)анилин (242,30 мг, 1,27 ммоль) и N,N-диизопропилэтиламин (503,76 мг, 3,90 ммоль). Реакционный раствор перемешивали при температуре 25°C в течение 12 ч. В реакционный раствор добавляли 25 мл воды в процессе перемешивания, и водную фазу экстрагировали, используя этилацетат (трижды по 30 мл). Органические фазы объединяли, промывали насыщенным раствором бикарбоната натрия (30 мл) и насыщенным раствором хлорида натрия (30 мл), соответственно, высушивали над безводным сульфатом натрия, фильтровали и высушивали в вакууме, получая неочищенный продукт, который разделяли методом препаративной жидкостной хроматографии (в нейтральной среде), получая соединение 1-E. ЯМР ¹H (400 МГц, CDCl₃): δ (м. д.) 1,70 (с, 3H) 1,78 (шд, J=13,54 Гц, 2H), 2,04 (шд, J=6,54 Гц, 1H), 2,08 -2,23 (м, 2 H), 2,39 (с, 3H), 2,62-2,64 (м, 4H), 3,21-3,24 (м, 4H), 4,24 (шс, 1H), 4,51 (шд, J=13,54 Гц, 1H), 5,61-5,88 (м, 2H), 6,95 (д, J=9,04 Гц, 2H) 7,49 (д, J=9,04 Гц, 3H), 7,81-7,90 (м, 2H) 8,87 (с, 1H); Масс-спектр (m/z): 513,1 [M+H]⁺.

Стадия 5. Синтез соединения формулы (I)

Соединение 1-E (100 мг, 195,08 мкмоль) подвергали хиральному разделению методом хроматографии со сверхкритической текучей фазой (хроматографическая колонка: длина 250 × внутренний диаметр 50 мм, размер частиц 10 мкм, подвижная фаза: A: сверхкритический CO₂, B: EtOH (0,1% NH₃∙H₂O), A:B=55:45 при скорости 200 мл/мин), время удерживания: 21 минута), получая соединение формулы (I). ЯМР 1H (400 МГц, CDCl₃): δ (м. д.) 1,60 (с, 3H), 1,68 (шс, 2H), 1,94 (шд, J=7,04 Гц, 1H), 2,00-2,20 (м, 2H), 2,30 (с, 3H), 2,52-2,55 (м, 4H), 3,12-3,15 (м, 4H), 4,24 (шс, 1H), 4,42 (шд, J=9,54 Гц, 1H), 5,65 (шс, 2H), 6,85 (д, J=9,04 Гц, 2H), 7,17 (с, 1H) 7,40 (д, J=9,04 Гц, 2H), 7,69-7,81 (м, 2H), 8,77 (с, 1H). Масс-спектр (m/z): 513,1 [M+H]⁺.

Пример 2. Получение кристаллической формы A соединения формулы (I)

В несколько стеклянных сосудов помещали приблизительно по 50 мг соединения формулы (I) и добавляли по 0,5 мл ацетона, соответственно, для получения суспензии. Образцы суспензии были исследованы при постоянной температуре (40°C) с применением устройства для встряхивания. Образцы суспензии были подвергнуты встряхиванию при 40°C в течение 2 суток и центрифугированию. Верхнюю жидкую фазу удаляли, и образцы остатка высушивали в вакуумном сушильном шкафу при температуре 40°C в течение ночи, получая кристаллическую форму A соединения формулы (I).

Пример 3. Получение кристаллической формы B соединения формулы (I)

В несколько стеклянных сосудов помещали приблизительно по 50 мг соединения формулы (I) и добавляли по 0,3 мл этанола, соответственно, для получения суспензии. Образцы суспензии были исследованы при постоянной температуре (40°C) с применением устройства для встряхивания. Образцы суспензии были подвергнуты встряхиванию при 40°C в течение 2 суток и центрифугированию. Верхнюю жидкую фазу удаляли, и образцы остатка высушивали в вакуумном сушильном шкафу при температуре 40°C в течение ночи, получая кристаллическую форму B соединения формулы (I).

Пример 4. Получение кристаллической формы C соединения формулы (I)

В несколько стеклянных сосудов помещали приблизительно по 50 мг соединения формулы (I) и добавляли по 0,2 мл метанола, соответственно, для получения суспензии. Образцы суспензии были исследованы при постоянной температуре (40°C) с применением устройства для встряхивания. Образцы суспензии были подвергнуты встряхиванию при 40°C в течение 2 суток и центрифугированию. Верхнюю жидкую фазу удаляли, и образцы остатка высушивали в вакуумном сушильном шкафу при температуре 40°C в течение ночи, получая кристаллическую форму C соединения формулы (I).

Пример 5. Получение кристаллической формы D соединения формулы (I)

В несколько стеклянных сосудов помещали приблизительно по 50 мг соединения формулы (I) и добавляли по 0,4 мл смеси метанола и воды в соотношении 1/1, соответственно, для получения суспензии. Образцы суспензии были исследованы при постоянной температуре (40°C) с применением устройства для встряхивания. Образцы суспензии были подвергнуты встряхиванию при 40°C в течение 2 суток и центрифугированию. Верхнюю жидкую фазу удаляли, и образцы остатка высушивали в вакуумном сушильном шкафу при температуре 40°C в течение ночи, получая кристаллическую форму D соединения формулы (I).

Пример 6. Получение кристаллической формы E соединения формулы (I)

В несколько стеклянных сосудов помещали приблизительно по 50 мг соединения формулы (I) и добавляли по 0,5 мл ацетонитрила, соответственно, для получения суспензии. Образцы суспензии были исследованы при постоянной температуре (40°C) с применением устройства для встряхивания. Образцы суспензии были подвергнуты встряхиванию при 40°C в течение 2 суток и центрифугированию. Верхнюю жидкую фазу удаляли, и образцы остатка высушивали в вакуумном сушильном шкафу при температуре 40°C в течение ночи, получая кристаллическую форму E соединения формулы (I).

Пример 7. Получение кристаллической формы F соединения формулы (I)

При температуре 25-26°C в однолитровую трехгорлую колбу, содержащую 560 мл MeOH, добавляли соединение формулы (I) в процессе перемешивания. Реакционную систему нагревали на масляной бане до 55-65°C. Через 20 минут внутреннюю температуру устанавливали на уровне 47°C-53°C и реакционную систему перемешивали в течение 72 ч при установленной температуре. Нагревание прекращали, а перемешивание продолжали, и при этом температура самопроизвольно снижалась в течение 1 ч до 27°C. Систему выдерживали в состоянии покоя в течение 18 ч и фильтровали, и отфильтрованный осадок промывали, используя 30 мл MeOH. Отфильтрованный осадок высушивали при температуре 60°C в вакууме в течение 48 ч, получая кристаллическую форму F соединения формулы (I).

Экспериментальный пример 1. Исследование устойчивости твердой кристаллической формы F соединения формулы (I) в условиях высокой температуры, высокой влажности и освещения

Согласно воздействующим факторам и условиям ускоренного исследования, точные навески (приблизительно по 5 мг) кристаллической формы F соединения формулы (I) помещали в два сухих и чистых стеклянных флакона и распределяли в форме тонкого слоя в качестве формальных исследуемых образцов, на которые воздействовали условия обычного исследования (температура 60°C, относительная влажность 92,5%) и условия ускоренного исследования (температура 40°C, относительная влажность 75%; температура 60°C, относительная влажность 75%), причем образцы были полностью открытыми. Исследуемую систему покрывали алюминиевой фольгой с мелкими отверстиями. Кроме того, небольшое количество образцов отбирали и помещали в стеклянные флаконы для образцов объемом 40 мл в таких же условиях для определения состояния кристалла. Отбор и анализ образцов осуществляли через 5 суток, 10 суток и один месяц. Метод анализа представлен в таблице 7, и результаты анализа представлены в таблице 8. Образцы помещали под источник света (видимый свет 1200000 люкс, ультрафиолетовый свет 200 Вт) в полностью открытом состоянии при комнатной температуре.

Таблица 7. Анализ соответствующих веществ методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Хроматографическая колонка	Waters XBridge Shield RP18 (4,6 мм × 150 мм, 3,5 мкм), номер изделия: 186003045
Длина волны	230 нм
Температура колонки	40°C
Скорость потока	0,8 мл/мин
Объем впрыскивания	10 мкл
Подвижная фаза	A: раствор 5 ммоль/л ацетата аммония (pH 4,5) (объемное соотношение) B: 100% ACN
Программа подвижной фазы	Время (минут)	A%	B%
	0,01	95	5
	10,00	95	5
	50,00	30	70
	51,00	10	90
	55,00	10	90
	56,00	95	5
	62,00	95	5
	62,01	Остановка
Время сбора данных	62 минуты
Растворитель	смесь ацетонитрила и воды в объемном соотношении 50:50
Растворитель для промывания иглы	смесь ацетонитрила и воды в объемном соотношении 50:50

Таблица 8. Результаты анализа устойчивости содержимого твердого образца и соответствующего вещества для кристаллической формы F соединения формулы (I) (5 суток, 10 суток, один месяц)

Условия и продолжительность воздействия	Кристаллическая форма	Полное содержание примесей, %	Содержимое, %
0 суток	Кристаллическая форма F	0,63	99,38
60°C, 5 суток	Кристаллическая форма F	0,74	99,39
60°C, 10 суток	Кристаллическая форма F	0,84	99,98
влажность 92,5%, 5 суток	Кристаллическая форма F	0,61	98,72
влажность 92,5%, 10 суток	Кристаллическая форма F	0,64	98,38
Защита от света	Кристаллическая форма F	0,61	97,77
Освещение	Кристаллическая форма F	0,67	98,58
40°C, влажность 75%, 10 суток	Кристаллическая форма F	0,63	98,01
40°C, влажность 75%, 1 месяц	Кристаллическая форма F	0,62	97,94
60°C, влажность 75%, 10 суток	Кристаллическая форма F	0,69	100,43
60°C, влажность 75%, 1 месяц	Кристаллическая форма F	0,75	99,46

Вывод: кристаллическая форма F соединения формулы (I) не изменяется в случае кристаллической формы соединения исходного материала в течение одного месяца воздействия устойчивых факторов и ускоренных исследований, проявляя хорошую физическую устойчивость. В анализе родственных веществ содержание примесей незначительно увеличивалось при высокой температуре (60°C) и ускоренных условиях (температура 60°C и относительная влажность 75%), причем полное количество примесей оставалось почти неизменным в других условиях, что демонстрирует небольшую чувствительность к температуре.

Экспериментальный вывод: кристаллическая форма согласно настоящему изобретению обладает хорошей устойчивостью и пригодностью для изготовления лекарственного средства.

Экспериментальный пример 2. Активность соединения формулы (I) по ингибированию ферментов в лабораторных условиях

Экспериментальное исследование было осуществлено в компании Eurofins, и экспериментальные результаты были представлены этой компанией.

В исследуемую систему при pH 8,5 добавляли раствор 20 мМ Tris-HCl, 0,2 мМ EDTA, 500 мкМ полипептидного субстрата (LSNLYHQGKFLQTFCGSPLYRRR), 10 мМ ацетата магния и 10 мкМ [γ-³³P]-АТФ (интенсивность составляла 500 импульсов в минуту на пмоль). После добавления Mg²⁺и смеси АТФ была инициирована реакция, которая протекала в условиях инкубации при комнатной температуре в течение 40 минут.Для прекращения реакции добавляли 3% фосфатного буферного раствора.

Отбирали 10 мкл реакционного раствора, который фильтровали на непрерывном фильтре P30 и промывали три раза 75 мкМ фосфатным буферным раствором и один раз метанолом, причем продолжительность каждого промывания составляла 5 минут.После высушивания значения активности измеряли методом сцинтилляционного счета. Результаты исследований представлены в таблице 9.

Таблица 9. Результаты исследований ферментативной активности соединений согласно настоящему изобретению в лабораторных условиях (IC₅₀)

Номер соединения	Wee1 (IC₅₀ нМ)
AZD1775	47
Соединение формулы (I)	29

Экспериментальный пример 3. Исследование проникающей способности соединения согласно настоящему изобретению в лабораторных условиях

Для исследования были использованы клетки MDR1-MDCK II, разрешенные лабораторией Piet Borst Нидерландского института рака; эти клетки представляют собой клетки почки собаки линии Мадин-Дарби, трансфицированные геном множественной лекарственной устойчивости (MDR1) человека, которые могут обеспечивать устойчивую экспрессию эффлюксного транспортера гликопротеина P (P-gp) и, таким образом, являются подходящими для скрининга субстрата P-gp или ингибитора и для прогнозирования проникающей способности соединений с высокими эффлюксными барьерами, такими как двенадцатиперстная кишка, гематоэнцефалический барьер, ядро клетки печени и нефрон. Клетки MDR1-MDCK II из канала 5-35 были использованы для исследования проникающей способности.

Клетки MDR1-MDCK II культивированы со средой α-MEM (минимально необходимая среда α) при культивации в условиях температуры 37±1°C, содержания 5% CO₂ и насыщенной относительной влажности. После этого клетки засевали 96-луночный планшет BD Transwell при плотности засева 2,3×10⁵ клеток на 1 см², а затем клетки культивированы в инкубаторе в атмосфере диоксида углерода в течение 4-7 суток для транспортного эксперимента. Способ получения соответствующей среды α-MEM осуществляли следующим образом.

Жидкая питательная основа была получена с применением порошка (порошок α-MEM от компании Gibco, каталожный номер 11900), растворенного в чистой воде, после чего в раствор добавляли L-глутамин и NaHCO₃. Затем добавляли 10% FBS (эмбриональная телячья сыворотка), 1% PS (двойное антитело) и 1% NEAA (заменимые аминокислоты) при применении для изготовления полной среды. Партия среды α-MEM представлена в таблице 10.

Таблица 10. Описание партии α-MEM (1 л)

Описание партии α-MEM (1 л)
Соединение (1 л)	Молекулярная масса	Концентрация (мМ)	Количество (мг/л)
Порошок среды	/	/	1 упаковка
L-глутамин	146	2	292
NaHCO₃	84	17,85	1500

AZD1775 (или соединение согласно настоящему изобретению) и дигоксин вводили в концентрации 2 мкМ в двух направлениях (направления A-B и B-A) с дублирующими лунками. В процессе исследования фенотерол и пропранолол присутствовали в одинаковой концентрации 2 мкМ и были введены в одном направлении (направление A-B) с дублирующими лунками.

Используемые растворы предварительно инкубировали при температуре 37±1°C в водяной бане в течение 30 минут.Дозировочный раствор и приемный раствор добавляли в лунки планшета с соответствующими клетками (75 и 250 мкл для каждой верхней и основной лунки, соответственно), соответственно, чтобы инициировать эксперимент с транспортом в двух направлениях. После добавления образцов планшеты с клетками помещали в инкубатор при температуре 37±1°C при содержании 5% CO₂ и насыщенной относительной влажности в целях инкубации в течение 150 минут. Информация о собранных образцах представлена в таблице 11.

Таблица 11. Информация о собранных образцах

Тип образца	Объем образца в каждой скважине (мкл)	Объем останавливающего раствора (мкл)	Объем транспортного буферного раствора (мкл)
Дозировочный конец A-B	50	250	100
Приемный конец A-B	150	250	0
Дозировочный конец B-A	50	250	100
Приемный конец B-A	50	250	100
T₀	50	250	100

Примечание: T₀ означает образец начального дозировочного раствора.

После того, как все образцы были подвергнуты встряхиванию и центрифугированию при ускорении 3220 g в течение 10 минут, соответствующий объем надосадочного раствора переносили на планшет для анализа образцов. После герметизации планшета образец следует хранить при температуре 2-8°C, если он не был немедленно подвергнут анализу с применением аналитического метода жидкостной хроматографии с тандемной масс-спектрометрией.

После завершения транспортного эксперимента целостность клеток MDR1-MDCK II была исследована с применением анализа отторжения люцифера желтого. После инкубации в течение 30 минут с раствором люцифера желтого собирали образец, содержащий люцифер желтый, и планшетный анализатор 2e, установленный на 425/528 нм (возбуждение/излучение), был использован для измерения относительной интенсивности флуоресценции люцифера желтого в образце.

Был осуществлен полуколичественный анализ исследуемого вещества AZD1775 (или соединения согласно настоящему изобретению), в котором присутствовало стандартное вещество (фенотерол, пропранолол и дигоксин), и соотношение площади пика анализируемого вещества и площади пика внутреннего стандарта было использовано для измерения концентрация исследуемого вещества.

Экспериментальные результаты представлены в таблице 12.

Таблица 12. Скорость проникновения (10^-6 см/с)

	AZD1775	Соединение формулы (I)
A-B	2,83	4,55
B-A	29,3	17,38
Эффлюксное соотношение	10,37	3,82

Экспериментальный вывод: по сравнению с AZD1775, свойство проникающей способности соединения формулы (I) оказалось значительно улучшенным, что является благоприятным при введении лекарственного средства в организм.

Экспериментальный пример 4. Фармакокинетическая оценка соединения

Этот эксперимент использован для исследования фармакокинетики AZD1775 (или соединения согласно настоящему изобретению) в плазме самок голых мышей линии BALB/c после однократного внутривенного введения и однократного перорального введения.

Двенадцать мышей (предоставленных компанией Lingchang) случайным образом разделили на две группы по шесть самок в каждой группе, и образцы были отобраны методом перекрестного отбора образцов крови. Все животные во внутривенной группе получали 1 мг/кг AZD1775 (или соединения согласно настоящему изобретению) посредством внутривенной инъекции, и композиция растворителя представляла собой прозрачный раствор 5% HP-betaCD (Kunshan Ruisk Chemical Materials Co., Ltd.), содержащий 0,2 мг/мл AZD1775 (или соединения согласно настоящему изобретению). Животные в пероральной группе получали 10 мг/кг AZD1775 (или соединения согласно настоящему изобретению) посредством зондового питания, и композиция растворителя представляла собой однородную суспензию 0,5% метилцеллюлозы, содержащую 1 мг/мл AZD1775 (или соединения согласно настоящему изобретению).

Во внутривенной группе образцы плазмы отбирали в девять моментов времени: через 5 минут, 15 минут, 30 минут, 1 час, 2 часа, 4 часа, 6 часов, 8 часов и 24 часа после введение. В пероральной группе образцы плазмы отбирали в восемь моментов времени: через 15 минут, 30 минут, 1 час, 2 часа, 4 часа, 6 часов, 8 часов и 24 часа после введения. Образцы анализировали методом жидкостной хроматографии с тандемной масс-спектрометрией, чтобы получить данные о концентрации в плазме AZD1775 (или соединения согласно настоящему изобретению), а также вычислить фармакокинетические параметры, такие как пиковая концентрация, время пика, скорость выведения, период полувыведения, площадь под кривой зависимости концентрации лекарственного средства от времени, биодоступность и т.д.

Экспериментальные результаты представлены в таблице 13.

Таблица 13. Результаты фармакокинетических исследований

Путь введения / доза	Внутривенное введение, 1 мг/кг		Введение посредством зондового питания, 10 мг/кг
Исследуемый продукт (соединение, полученное в каждом примере)	Скорость выведения (мл/мин/кг)	Период полувыведения T_1/2 (ч)	Площадь под кривой зависимости концентрации лекарственного средства от времени AUC_0-last (нМ∙ч)	Биодоступность F (%)
AZD1775	85,7	0,252	1200	31
Соединение формулы (I)	33,5	1,69	6037	62,4

Экспериментальные выводы: по сравнению с AZD1775, соединение формулы (I) может значительно улучшать множество фармакокинетических показателей у мышей, причем значительные преимущества продемонстрированы в отношении скорости выведения в условиях организма, периода полувыведения, интеграла концентрации в условиях организма и биодоступности.

Экспериментальный пример 5. Исследование в условиях организма

(1) В фармакодинамических исследованиях в условиях организма соединение испытано на модели голых мышей линии BALB/c под воздействием ксенотрансплантированной подкожной опухоли из клеток линии LoVo рака толстого кишечника человека.

Экспериментальные животные: выбранные экспериментальные животные (предоставленные компанией Shanghai SIPPR-BK Experimental Animal Co., Ltd.) представляли собой голых мышей линии BALB/c в возрасте 6-8 недель массой 18-22 г.

Клетки линии LoVo рака толстого кишечника человека культивировали в монослое в лабораторных условиях, и условия культивирования представляли собой среду Хэма F-12, содержащую 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 100 Ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 2 мМ глутамина, 37°C, 5% CO₂. Трипсин-EDTA использовали для рутинного разложения и пассирования два раза в неделю. Когда насыщение клеток составляло 80%-90%, клетки собирали, считали и инокулировали. Клетки линии LoVo (0,1 мл, 10×10⁶ клеток) подкожно инокулировали в правую часть спинки каждой голой мыши, и лечение группы начиналось, когда средний объем опухоли достигал 213 мм³. Дозировка для введения посредством зондового питания составляла по 40 мг/кг два раза в сутки. Экспериментальный показатель исследования представлял собой ингибирование, ослабление или прекращение роста опухоли. Диаметры опухолей измеряли два раза в неделю, используя штангенциркуль с нониусом. Для вычисления объема опухоли была использована формула V=0,5a×b², в которой а и b представляют собой большой диаметр и малый диаметр опухоли, соответственно.

Противоопухолевая эффективность соединения оценивали, используя TGI (%) или относительную скорость роста опухоли T/C (%). TGI (%) отражает степень ингибирования роста опухоли. Вычисление TGI (%) осуществляли следующим образом: TGI (%)=[(1 - (средний объем опухоли в конце введения лекарственного средства для определенной группы лечения - средний объем опухоли в начале введения лекарственного средства для группы лечения))/(средний объем опухоли в конце введения растворителя для контрольной группы - средний объем опухоли в начале введения растворителя для контрольной группы)]×100%.

Итоговые результаты лечения в течение 16 суток представлены в таблице 14.

Таблица 14. Результаты фармакодинамического исследования на модели мыши под воздействием ксенотрансплантированной опухоли из клеток линии LoVo рака толстого кишечника человека

Соединение	TGI (%)
AZD1775	26,73
Соединение формулы (I)	84,74

Вывод: по сравнению с AZD1775, соединение согласно настоящему изобретению может значительно улучшать ингибирующее воздействие опухоли в организме мыши, и хиральность соединения производит неожиданное воздействие на эффективность в условиях организма.

(2) В фармакодинамических исследованиях в условиях организма соединение испытано на модели голых мышей линии BALB/c под воздействием ксенотрансплантированной подкожной опухоли из клеток линии BxPC-3 рака поджелудочной железы человека.

Экспериментальные животные: выбранные экспериментальные животные представляли собой голых мышей линии BALB/c в возрасте 6-8 недель массой 18-22 г.

Клетки линии BxPC-3 десятого поколения культивировали в монослое в лабораторных условиях, и условия культивирования представляли собой среду RPMI 1640 (производитель Gibco, каталожный номер 22400-089), содержащую 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 100 Ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 2 мМ глутамина, 37°C, 5% CO₂, 4 пассажа. Метод пассирования осуществляли два раза в неделю, используя трипсин-EDTA для рутинного разложения и пассирования. Когда насыщение клеток достигало 80%-90%, клетки разлагали, используя трипсин-EDTA, считали и повторно суспендировали в PBS при плотности 5×10⁷ клеток на 1 мл. Каждому животному инокулировали 0,1 мл (5×10⁶ клеток) линии BxPC-3 в правую часть спинки. Когда средний объем опухоли достигал 153 мм³, животных случайным образом разделяли на группы согласно объему опухоли и начинали лечение. Дозировка для зондового питания составляла 25 мг/кг один раз в сутки.

Экспериментальный показатель исследования представлял собой ингибирование, ослабление или прекращение роста опухоли. Диаметры опухолей измеряли два раза в неделю, используя штангенциркуль с нониусом. Для оценки противоопухолевой эффективности соединения использовали TGI (%) или относительную скорость роста опухоли T/C (%). TGI (%) отражает степень ингибирования роста опухоли. Вычисление TGI (%) осуществляли следующим образом: TGI (%)=[(1 - (средний объем опухоли в конце введения лекарственного средства для определенной группы лечения - средний объем опухоли в начале введения лекарственного средства для группы лечения))/(средний объем опухоли в конце введения растворителя для контрольной группы - средний объем опухоли в начале введения растворителя для контрольной группы)]×100%.

Итоговые экспериментальные результаты лечения в течение 27 суток представлены в таблице 15.

Таблица 15. Результаты фармакодинамического исследования на модели мыши под воздействием ксенотрансплантированной опухоли из клеток линии BxPC-3 рака поджелудочной железы человека

Соединение	TGI (%)
AZD1775	24,3
Соединение формулы (I)	73,3

Вывод: как можно видеть в таблице 15, по сравнению с AZD1775, соединение формулы (I) может значительно улучшать ингибирующее воздействие на опухоли в организме мыши.

(3) В условиях организма исследована эффективность соединения на модели трансплантированной опухоли из клеток линии CT26 рака толстого кишечника мыши.

Экспериментальные животные: выбранные экспериментальные животные представляли собой самок голых мышей линии BALB/c в возрасте 7 недель массой 16-20 г.

Клетки: клетки линии CT26 рака толстого кишечника мыши (банк клеток Комитета коллекции типовых культур Академии наук КНР) культивировали в монослое в лабораторных условиях, и условия культивирования представляли собой среду RPMI 1640, содержащую 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 37°C, 5% CO₂, инкубатор. Трипсин-EDTA использовали для рутинного разложения и пассирования. Когда клетки находились в фазе экспоненциального роста, и насыщение составляло 80%-90%, клетки собирали, считали и инокулировали. В правую часть спинки каждой мыши подкожно инокулировали 0,1 мл раствора DPBS, содержащего 3×10⁵ клеток линии CT26. Когда средний объем опухоли достигал 50-70 мм³, осуществляли рандомизированное введение согласно объему опухоли. Дозировка для зондового питания составляла 30 мг/кг два раза в сутки.

Итоговые результаты лечения в течение 18 суток представлены в таблице 16.

Таблица 16. Результаты исследований эффективности в условиях организма на модели опухоли аллотрансплантированных клеток линии CT26 рака толстого кишечника мыши

Соединение	TGI (%)
AZD1775	66,43
Соединение формулы (I)	93,38

Вывод: как можно видеть в таблице 16, по сравнению с AZD1775, соединение формулы (I) может значительно улучшать ингибирующее воздействие на опухоли в организме мыши.

Claims

1. Кристаллическая форма А соединения формулы (I), причем кристаллическая форма А имеет рентгеновскую порошковую дифрактограмму, содержащую характеристические дифракционные пики при следующих углах 2θ: 5,71±0,2°, 12,68±0,2°, 15,32±0,2°, 21,44±0,2°, 23,61±0,2° и 25,68±0,2°

2. Кристаллическая форма А по п. 1, причем кристаллическая форма А имеет рентгеновскую порошковую дифрактограмму, содержащую характеристические дифракционные пики при следующих углах 2θ: 5,71±0,2°, 12,68±0,2°, 15,32±0,2°, 18,04±0,2°, 19,72±0,2°, 21,44±0,2°, 23,61±0,2° и 25,68±0,2°.

3. Кристаллическая форма А по п. 1, причем кристаллическая форма А имеет рентгеновскую порошковую дифрактограмму, которая представлена на фиг. 1.

4. Кристаллическая форма А по любому из пп. 1-3, причем кристаллическая форма А имеет кривую дифференциальной сканирующей калориметрии, содержащую одну начальную точку эндотермического пика при 34,95±3°С, 174,75±3°С и 219,12±3°С, соответственно.

5. Кристаллическая форма А по любому из пп. 1-3, причем кристаллическая форма А имеет кривую термогравиметрического анализа, на которой потеря массы при 70,33±3°С составляет 0,7367%, и потеря массы при 209,42±3°С составляет 3,123%.

6. Применение кристаллической формы А по любому из пп. 1-5 для лечения связанного с Wee1 заболевания.