[go: up one dir, main page]

RS65715B1 - Anti-cd3 antitela i postupci primene - Google Patents

Anti-cd3 antitela i postupci primene

Info

Publication number
RS65715B1
RS65715B1 RS20240770A RSP20240770A RS65715B1 RS 65715 B1 RS65715 B1 RS 65715B1 RS 20240770 A RS20240770 A RS 20240770A RS P20240770 A RSP20240770 A RS P20240770A RS 65715 B1 RS65715 B1 RS 65715B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
antibody
amino acid
cells
cell
domain
Prior art date
Application number
RS20240770A
Other languages
English (en)
Inventor
Xiaocheng Chen
Mark S Dennis
Allen J Ebens Jr
Teemu T Junttila
Robert F Kelley
Mary A Mathieu
Liping L Sun
Original Assignee
Genentech Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=52394341&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS65715(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Genentech Inc filed Critical Genentech Inc
Publication of RS65715B1 publication Critical patent/RS65715B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/56—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids
    • A61K31/57—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms, e.g. pregnane or progesterone
    • A61K31/573—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms, e.g. pregnane or progesterone substituted in position 21, e.g. cortisone, dexamethasone, prednisone or aldosterone
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6881—Cluster-antibody conjugates, i.e. the modifying agent consists of a plurality of antibodies covalently linked to each other or of different antigen-binding fragments covalently linked to each other
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/08—Vasodilators for multiple indications
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2827—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against B7 molecules, e.g. CD80, CD86
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/283—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against Fc-receptors, e.g. CD16, CD32, CD64
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2887—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD20
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/522—CH1 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/524—CH2 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/526—CH3 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/54—F(ab')2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/71—Decreased effector function due to an Fc-modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)

Description

OPIS
OBLAST PRONALASKA
Predmetni pronalazak se odnosi na antitela na klaster diferencijacije 3 (CD3) i postupke za primenu istih.
OSNOVA
Poremećaje ćelijske proliferacije, kao što je karcinom, karakteriše nekontrolisani rast ćelijskih subpopulacija. Oni su vodeći uzrok smrti u razvijenom svetu i drugi vodeći uzrok smrti u zemljama u razvoju, sa preko 12 miliona novih slučajeva karcinoma i sedam miliona smrtnih slučajeva uzrokovanih karcinomom koji se javljaju svake godine. Nacionalni institut za rak (National Cancer Institute) procenjuje da će više od pola miliona Amerikanaca umreti od raka u 2013. godini, što predstavlja skoro svaku četvrtu smrt u zemlji. Uporedo sa rastom starije populacije rasla je i incidencija karcinoma, pošto je verovatnoća razvoja karcinoma više od dva puta veća nakon sedamdesete godine života. Stoga, lečenje obolelih od karcinoma predstavlja značajan i sve veći teret društva.
Dugogodišnji pristupi lečenju karcinoma uključuju hemoterapiju, radioterapiju i operaciju za uklanjanje čvrstih tumora. Nedavno su razvijene imunoterapije zasnovane na bispecifičnim antitelima. Takva bispecifična antitela su sposobna da istovremeno vezuju površinske antigene ćelije na citotoksičnim i tumorskim ćelijama sa ciljem da vezana citotoksična ćelija uništi vezanu tumorsku ćeliju. WO 2008/119566 otkriva bispecifične molekule koji se vezuju za CD3ε i, npr., HER2. WO 2011/131746 opisuje proteine koji sadrže Fc-heterodimerna antitela, kao što su bispecifična antitela, uključujući heterodimerna anti-CD3xHER2 antitela koja sadrže Fc. WO2012/162067 opisuje unakrsno reaktivne CD3 vezujuće molekule koji su sposobni da se vezuju za humani i nehumani CD3. Zhu et al. (1995) Int. J. Cancer 62 319-324 opisuju konstruisanje visokoafinitetnih humanizovanih antip185HER2/anti-CD3 bispecifičnih F(ab') i njihovu upotrebu u lizi tumorskih ćelija koje prekomerno eksprimiraju p185HER2. Postojeća bispecifična antitela koja se trenutno podvrgavaju kliničkim ispitivanjima za lečenje kancera ograničena su svojim kratkim poluživotom i/ili promenljivom efikasnošću. Prema tome, postoji nezadovoljena potreba u oblasti razvoja efikasnih bispecifičnih antitela za upotrebu u lečenju raka.
REZIME
Predmet pronalaska je definisan priloženim patentnim zahtevima.
Predmetni pronalazak se odnosi na antitela na klaster diferencijacije 3 (CD3) i njihovu primenu kako je definisano u priloženim zahtevima.
U jednom aspektu, pronalazak sadrži bispecifično antitelo, koje se sastoji od anti-CD3 kraka i anti-HER2 kraka, pri čemu: (a) anti-CD3 krak obuhvata prvi vezujući domen koji obuhvata: (i) VH domen koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 95% identičnosti sekvence u odnosu na aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 184, pri čemu VH domen obuhvata HVR-H1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1, HVR-H2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 2, i HVR-H3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 3, i (ii) VL domen koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 95% identičnosti sekvence u odnosu na aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 185, pri čemu VL domen obuhvata HVR-L1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 4, HVR-L2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 5, i HVR-L3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 6; i (b) anti-HER2 krak obuhvata drugi vezujući domen koji obuhvata: (i) VH domen koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 95% identičnosti sekvence u odnosu na aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 270, pri čemu VH domen obuhvata HVR-H1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 169, HVR-H2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 170, i HVR-H3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 171, i (ii) VL domen koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 95% identičnosti sekvence u odnosu na aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 271, pri čemu VL domen obuhvata HVR-L1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 172, HVR-L2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 173, i HVR-L3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 174.
U drugom aspektu, bispecifično antitelo se vezuje za epitop na CD3 koji sadrži aminokiselinski ostatak Glu6 CD3. U određenim aspektima, epitop dalje sadrži jedan ili više dodatnih aminokiselinskih ostataka izabranih iz grupe koja se sastoji od Gln1, Asp2 i Met7 CD3. U daljem aspektu, epitop sadrži aminokiselinske ostatke Gln1, Asp2 i Glu6 CD3. U određenim aspektima, epitop sadrži aminokiselinske ostatke Gln1, Asp2, Glu6 i Met7 CD3. U još jednom aspektu, epitop ne sadrži aminokiselinski ostatak Glu5 CD3. U daljem aspektu, epitop ne sadrži aminokiselinske ostatke Gly3 i Glu5 CD3. U određenim aspektima, epitop se sastoji od aminokiselinskih ostataka Gln1, Asp2, Glu6 i Met7 CD3.
U nekim otelotvorenjima, vezujući domen bispecifičnih antitela se vezuje za humani CD3 polipeptid ili CD3 polipeptid cinomolgus majmuna (cino). U nekim otelotvorenjima, humani CD3 polipeptid ili cino CD3 polipeptid je humani CD3ε polipeptid, odnosno cino CD3ε polipeptid. U nekim otelotvorenjima, humani CD3 polipeptid ili cino CD3 polipeptid je humani CD3γ polipeptid, odnosno cino CD3γ polipeptid.
U nekim otelotvorenjima, bispecifična antitela mogu da sadrže mutaciju mesta aglikozilacije. U nekim otelotvorenjima, mutacija na mestu aglikozilacije je supstituciona mutacija. U nekim otelotvorenjima, supstituciona mutacija je na aminokiselinskom ostatku N297, L234, L235 i/ili D265 (EU numeracija). U nekim otelotvorenjima, supstituciona mutacija je izabrana iz grupe koja se sastoji od N297G, N297A, L234A, L235A i D265A. U nekim otelotvorenjima, supstituciona mutacija je mutacija N297G. U nekim otelotvorenjima, mutacija mesta aglikozilacije smanjuje efektorsku funkciju bispecifičnog antitela. U nekim otelotvorenjima, mutacija mesta aglikozilacije smanjuje efektorsku funkciju bispecifičnog antitela. U nekim aspektima otkrića, bispecifično antitelo obuhvata supstitucionu mutaciju u Fc regionu koja smanjuje efektorsku funkciju.
U nekim otelotvorenjima, bispecifična antitela mogu biti monoklonska, humana, humanizovana ili himerna. U nekim otelotvorenjima, bispecifična antitela mogu biti fragment antitela koji se vezuje za CD3. U nekim otelotvorenjima, fragment antitela je izabran iz grupe koja se sastoji od fragmenata Fab, Fab’-SH, Fv, scFv, i (Fab’)2. U drugim otelotvorenjima, bispecifično antitelo je antitelo pune dužine. U nekim otelotvorenjima, bispecifično antitelo je IgG antitelo (npr. IgG1, IgG2 ili IgG3 antitelo). U nekim otelotvorenjima, bispecifično antitelo je bispecifično antitelo koje aktivira T-ćelije (Bispecific T-Cell Engager, BiTE<®>).
U nekim otelotvorenjima, bispecifična antitela mogu da obuhvataju jedan ili više konstantnih domena teškog lanca, pri čemu, jedan ili više konstantnih domena teškog lanca su izabrani od prvog CH1 (CH11) domena, prvog CH2 (CH21) domena, prvog CH3 (CH31) domena, drugog CH1 (CH12) domena, drugog CH2 (CH22) domena i drugog CH3 (CH32) domena. U nekim otelotvorenjima, najmanje jedan od jednog ili više konstantnih domena teškog lanca uparen je sa drugim konstantnim domenom teškog lanca. U nekim otelotvorenjima, svaki od domena CH31i CH32obuhvata ispupčenje ili šupljinu, pri čemu se ispupčenje ili šupljina u CH31domenu može pozicionirati u šupljinu, odnosno ispupčenje, u CH32domenu. U nekim otelotvorenjima, CH31i CH32domeni se sastaju na međupovršini između navedenog ispupčenja i šupljine. U nekim otelotvorenjima, svaki od domena CH21i CH22obuhvata ispupčenje ili šupljinu, pri čemu se ispupčenje ili šupljina u CH21domenu može pozicionirati u šupljinu, odnosno ispupčenje, u CH22domenu. U nekim otelotvorenjima, CH21i CH22domeni se sastaju na međupovršini između navedenog ispupčenja i šupljine.
U nekim otelotvorenjima, poluživot bilo kog od gorepomenutih bispecifičnih antitela može biti oko 7 dana.
U nekim otelotvorenjima, pronalazak sadrži imunokonjugat koji se sastoji od bispecifičnih antitela konjugovanih sa citotoksičnim agensom. Takođe je obezbeđena kompozicija koja se sastoji od bispecifičnih antitela. U nekim otelotvorenjima, kompozicija dalje sadrži farmaceutski prihvatljiv nosač, pomoćnu supstancu ili razblaživač. U nekim otelotvorenjima, kompozicija je farmaceutska kompozicija. U nekim otelotvorenjima, kompozicija dalje sadrži antagonist vezivanja PD-1 ose ili dodatni terapeutski agens. U još jednom aspektu, pronalazak sadrži izolovanu nukleinsku kiselinu koja kodira bilo koje od ovde otkrivenih bispecifičnih antitela, koja obuhvata vektor (npr. ekspresioni vektor) za ekspresiju antitela.
U drugom aspektu, pronalazak obuhvata ćelije domaćine koje sadrže prethodne nukleinske kiseline i/ili vektore. U nekim otelotvorenjima, ćelija domaćin je ćelija sisara (npr. ćelija jajnika kineskog hrčka (CHO)). U drugim otelotvorenjima, ćelija domaćin je prokariotska ćelija (npr. ćelija E. coli). Takođe je obezbeđen postupak za proizvodnju bilo kog od prethodnih bispecifičnih antitela, pri čemu taj postupak obuhvata uzgajanje ćelije domaćina koja proizvodi bispecifično antitelo i izolovanje bispecifičnog antitela iz ćelije domaćina ili medijuma za uzgajanje.
U nekim aspektima, bispecifična antitela mogu da se koriste kao lek. U nekim otelotvorenjima, bispecifična antitela mogu biti namenjena za upotrebu u lečenju ili odlaganju razvoja ćelijskog proliferativnog poremećaja kod ispitanika kome je to potrebno. U nekim otelotvorenjima, bispecifična antitela mogu biti namenjena za upotrebu u poboljšanju imunološke funkcije kod ispitanika koji ima ćelijski proliferativni poremećaj.
Dalji aspekt ovog otkrivanja je postupak za lečenje ili odlaganje razvoja ćelijskog proliferativnog poremećaja ili autoimunog poremećaja kod ispitanika kome je to potrebno, pri čemu taj postupak obuhvata primenu na ispitaniku delotvorne količine bilo kog od prethodnih bispecifičnih antitela. U još jednom aspektu, pronalazak sadrži bilo koje od prethodnih bispecifičnih antitela za upotrebu u postupku za poboljšanje imunološke funkcije kod ispitanika koji ima ćelijski proliferativni poremećaj ili autoimuni poremećaj, pri čemu taj postupak obuhvata primenu na ispitaniku navedenih bispecifičnih antitela. U nekim otelotvorenjima, bispecifično antitelo se vezuje za (a) molekul CD3 koji se nalazi na imunološkoj efektorskoj ćeliji i (b) drugi biološki molekul koji se nalazi na ciljnoj ćeliji koja nije imunološka efektorska ćelija. U nekim otelotvorenjima, drugi biološki molekul je molekul HER2. U nekim otelotvorenjima, bispecifično antitelo aktivira imunološku efektorsku ćeliju nakon vezivanja za (a) i (b). U nekim otelotvorenjima, aktivirana imunološka efektorska ćelija je sposobna da vrši citotoksično dejstvo i/ili apoptotsko dejstvo na ciljnu ćeliju. U nekim otelotvorenjima, bispecifično antitelo se na ispitaniku primenjuje u dozi od oko 0,01 mg/kg do oko 10 mg/kg. U nekim otelotvorenjima, bispecifično antitelo se na ispitaniku primenjuje u dozi od oko 0,1 mg/kg do oko 10 mg/kg. U nekim otelotvorenjima, bispecifično antitelo se na ispitaniku primenjuje u dozi od oko 1 mg/kg. U nekim otelotvorenjima, bispecifično antitelo se primenjuje supkutano, intravenski, intramuskularno, lokalno, oralno, transdermalno, intraperitonealno, intraorbitalno, implantacijom, inhalacijom, intratekalno, intraventrikularno ili intranazalno. U nekim otelotvorenjima, bispecifično antitelo se primenjuje supkutano. U nekim otelotvorenjima, bispecifično antitelo se primenjuje intravenski.
U nekim otelotvorenjima, postupak dalje obuhvata primenu na ispitaniku antagonista vezivanja PD-1 ose ili dodatnog terapeutskog agensa. U nekim otelotvorenjima, dodatni terapeutski agens se primenjuje pre ili posle primene bispecifičnog antitela. U nekim otelotvorenjima, dodatni terapeutski agens se primenjuje istovremeno sa bispecifičnim antitelom. U nekim otelotvorenjima, antagonist vezivanja PD-1 ose odabran je iz grupe koja se sastoji od antagonista vezivanja PD-1, antagonista vezivanja PD-L1 i antagonista vezivanja PD-L2. U nekim otelotvorenjima, antagonist vezivanja ose PD-1 je antagonist vezivanja PD-1. U nekim otelotvorenjima, antagonist vezivanja PD-1 je izabran iz grupe koja se sastoji od MDX-1106 (nivolumab), MK-3475 (lambrolizumab), CT-011 (pidilizumab) i AMP-224. U drugim otelotvorenjima, antagonist vezivanja ose PD-1 je antagonist vezivanja PD-L1. U nekim otelotvorenjima, antagonist vezivanja PD-L1 je izabran iz grupe koja se sastoji od: MPDL3280A, MDX-1105 i MEDI4736. U drugim otelotvorenjima, antagonist vezivanja ose PD-1 je antagonist vezivanja PD-L2. U nekim otelotvorenjima, antagonist vezivanja PD-L2 je antitelo ili imunoadhezin.
U nekim aspektima, pronalazak obuhvata bispecifična antitela iz pronalaska namenjena za upotrebu u postupku za lečenje ili odlaganje razvoja ćelijskog proliferativnog poremećaja kod ispitanika kome je to potrebno, pri čemu taj postupak obuhvata primenu na ispitaniku bispecifičnog antitela i antagonista vezivanja ose PD-1, pri čemu bispecifično antitelo obuhvata anti-CD3 krak i anti-HER2 krak. U nekim aspektima, pronalazak obuhvata bispecifično antitelo iz pronalaska namenjeno za upotrebu u postupku za poboljšanje imunološke funkcije kod ispitanika koji ima ćelijski proliferativni poremećaj, pri čemu taj postupak obuhvata primenu bispecifičnog antitela i antagonista vezivanja ose PD-1 na ispitaniku, pri čemu bispecifično antitelo obuhvata anti-CD3 krak i anti-HER2 krak (tj. HER2 TDB). U nekim otelotvorenjima, (a) anti-CD3 krak obuhvata prvi vezujući domen koji obuhvata (i) VH domen koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 95% identičnosti sekvence u odnosu na aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 184, pri čemu VH domen obuhvata HVR-H1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1, HVR-H2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 2 i HVR-H3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 3, i (ii) VL domen koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 95% identičnosti sekvence u odnosu na aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 185, pri čemu VL domen obuhvata HVR-L1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 4, HVR-L2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 5, i HVR-L3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 6; (b) anti-HER2 krak obuhvata drugi vezujući domen koji obuhvata (i) VH domen koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 95% identičnosti sekvence u odnosu na aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 270, pri čemu VH domen obuhvata HVR-H1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 169, HVR-H2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 170, i HVR-H3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 171, i (ii) VL domen koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 95% identičnosti sekvence u odnosu na aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 271, pri čemu VL domen obuhvata HVR-L1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 172, HVR-L2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 173, i HVR-L3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 174; i/ili (c) antagonist vezivanja PD-1 ose je anti-PD-L1 antitelo.
U nekim otelotvorenjima, bispecifično antitelo obuhvata anti-HER2 krak koji obuhvata supstitucionu mutaciju N297G. U nekim otelotvorenjima, bispecifično antitelo obuhvata anti-CD3 krak koji obuhvata supstitucione mutacije T366S, L368A, Y407V i/ili N297G i anti-HER2 krak koji obuhvata supstitucione mutacije N297G, N297A, L234A, L235A i/ili D265A. U nekim otelotvorenjima, bispecifično antitelo obuhvata anti-CD3 krak koji obuhvata supstitucionu mutaciju N297G. U nekim otelotvorenjima, bispecifično antitelo obuhvata anti-HER2 krak koji obuhvata supstitucione mutacije T366S, L368A, Y407V i/ili N297G i anti-CD3 krak koji obuhvata supstitucione mutacije N297G, N297A, L234A, L235A i/ili D265A.
U nekim otelotvorenjima, postupak se dalje sastoji od primene na ispitaniku jednog ili više dodatnih terapeutskih agensa koji ciljaju HER put. U nekim otelotvorenjima, jedan ili više dodatnih terapeutskih agensa su izabrani od trastuzumaba, T-DM1 i pertuzumaba. U nekim otelotvorenjima, dodatni terapeutski agens je trastuzumab.
U nekim otelotvorenjima, postupak dodatno uključuje primenu glukokortikoida na ispitaniku. U nekim otelotvorenjima, glukokortikoid je izabran iz grupe koju čine deksametazon, hidrokortizon, kortizon, prednizolon, prednizon, metilprednizon, triamcinolon, parametazon, betametazon, fludrokortizon i njihovi farmaceutski prihvatljivi estri, soli i kompleksi. U nekim otelotvorenjima, glukokortikoid je deksametazon. U nekim otelotvorenjima, glukokortikoid je farmaceutski prihvatljiv estar, so ili kompleks deksametazona.
U nekim otelotvorenjima, postupak dodatno uključuje primenu rituksimaba na ispitaniku.
U nekim otelotvorenjima, postupak dodatno uključuje primenu obinutuzumaba na ispitaniku.
U nekim otelotvorenjima, postupak dodatno uključuje primenu konjugata antitela i leka (ADC) na ispitaniku.
U bilo kojoj od prethodnih upotreba, ćelijski proliferativni poremećaj može biti kancer. U nekim otelotvorenjima, kancer je odabran iz grupe koja se sastoji od kancera dojke, kolorektalnog kancera, nemikrocelularnog kancera pluća, non-Hodžkinovog limfoma (NHL), B-ćelijskog limfoma, B-ćelijske leukemije, multiplog mijeloma, kancera bubrega, kancera prostate, kancera jetre, kancera glave i vrata, melanoma, kancera jajnika, mezotelioma, glioblastoma, DLBCL germinalnog centra nalik B-ćelijama (GCB), DLBCL nalik aktiviranim B-ćelijama (ABC), folikularnog limfoma (FL), limfoma ćelija plašta (MCL), akutne mijeloidne leukemije (AML), hronične limfoidne leukemije (CLL), limfoma marginalne zone (MZL), male limfocitne leukemije (SLL), limfoplazmocitnog limfoma (LL), Valdenstromove makroglobulinemije (WM), limfoma centralnog nervnog sistema (CNSL), Burkitovog limfoma (BL), B-ćelijske prolimfocitne leukemije, limfoma marginalne zone slezine, leukemije vlasastih ćelija, limfoma/leukemije slezine koji ne može da se klasifikuje, limfoma difuzne crvene pulpe slezine, varijante leukemije vlasastih ćelija, Valdenstromove makroglobulinemije, bolesti teškog lanca, bolesti teškog lanca α, bolesti teškog lanca γ, bolesti teškog lanca µ, mijeloma ćelija plazme, solitarnog plazmacitoma kostiju, ekstraosealnog plazmacitoma, limfoma ekstranodalne marginalne zone limfoidnog tkiva povezanog sa sluznicom (MALT limfom), limfoma nodalne marginalne zone, pedijatrijskog limfoma nodalne marginalne zone, pedijatrijskog folikularnog limfoma, limfoma centra primarnog kutanog folikula, B-krupnoćelijskog limfoma bogatog T-ćelijama/histiocitima, primarnog DLBCL CNS-a, primarnog kutanog DLBCL, nožni tip, EBV-pozitivnog DLBCL starijih osoba, DLBCL povezanog sa hroničnom inflamacijom, limfomatoidne granulomatoze, primarnog medijastinalnog (timičnog) B-krupnoćelijskog limfoma, intravaskularnog B-krupnoćelijskog limfoma, ALK-pozitivnog B-krupnoćelijskog limfoma, plazmablastnog limfoma, B-krupnoćelijskog limfoma koji nastaje kod multicentrične Kastlmanove bolesti povezane sa HHV8, primarnog efuzionog limfoma: B-ćelijskog limfoma koji ne može da se klasifikuje, sa karakteristikama između difuznog B-krupnoćelijskog limfoma i Burkitovog limfoma, i Bćelijskog limfoma koji ne može da se klasifikuje, sa karakteristikama između difuznog B-krupnoćelijskog limfoma i klasičnog Hodžkinovog limfoma. U nekim otelotvorenjima, preferirani kancer je DLBCL germinalnog centra nalik B-ćelijama (GCB), DLBCL nalik aktiviranim B-ćelijama (ABC), folikularni limfom (FL), limfom ćelija plašta (MCL), akutna mijeloidna leukemija (AML), hronična limfoidna leukemija (CLL), limfom marginalne zone (MZL), mala limfocitna leukemija (SLL), limfoplazmacitni limfom (LL), Valdenstromova makroglobulinemija (WM), limfom centralnog nervnog sistema (CNSL) ili Burkitov limfom (BL). U nekim otelotvorenjima, kancer je HER2-pozitivni kancer. U nekim otelotvorenjima, HER2-pozitivni kancer je hER2-pozitivni kancer dojke ili HER2-pozitivni kancer želuca.
U još jednom aspektu, otkriće sadrži komplet koji obuhvata: (a) kompoziciju koja obuhvata bilo koje od prethodnih bispecifičnih antitela i (b) uputstvo za upotrebu koje sadrži uputstva za primenu kompozicije na ispitaniku radi lečenja ili odlaganja razvoja ćelijskog proliferativnog poremećaja.
U bilo kojoj od prethodnih upotreba, ispitanik može biti čovek.
Kratak opis slika
SLIKA 1 prikazuje aminokiselinsku sekvencu jednolančanog humanog CD3εγ sa 26-mernom sekvencom linkera koja se koristi u eksperimentima mapiranja CD3 epitopa (SEQ ID NO: 282).
SLIKA 2A je tabela koja rezimira karakterizaciju odabranih klonova hibridoma. Tabela rezimira rezultate ELISA CD3 eksperimenata vezivanja koristeći humani i cino CD3ε<1-27>-Fc; FACS eksperimenata vezivanja koristeći humane Jurkatove T-ćelije, humane PBMC i cino PBMC; eksperimenata aktivacije T-ćelija koristeći FACS analizu; i eksperimenata određivanja izotipa.
SLIKA 2B je tabela koja rezimira afinitete vezivanja (Kd vrednosti) odabranih klonova hibridoma za komercijalni humani CD3εγ antigen.
SLIKA 3A je tabela koja rezimira karakterizaciju izabranog hibridoma. Tabela rezimira rezultate ELISA CD3 eksperimenata vezivanja koristeći humani i cino CD3ε<1-27>-Fc; FACS eksperimenata vezivanja koristeći humane Jurkatove T-ćelije, humane PBMC i cino PBMC; eksperimenata aktivacije T-ćelija koristeći FACS analizu; i eksperimenata određivanja izotipa.
SLIKE 3B i 3C su tabele koje rezimiraju afinitete vezivanja (Kd vrednosti) odabranih klonova hibridoma.
SLIKA 4A prikazuje aminokiselinske sekvence varijabilnih domena lakog lanca anti-CD3 antitela. HVR sekvence su ograničene označenim okvirima za svako od antitela.
SLIKA 4B prikazuje aminokiselinske sekvence varijabilnih domena lakog lanca antiCD3 antitela.
SLIKA 4C prikazuje aminokiselinske sekvence varijabilnih domena teškog lanca anti-CD3 antitela.
SLIKA 5A prikazuje aminokiselinske sekvence varijabilnih domena lakog lanca anti-CD3 antitela.
SLIKA 5B prikazuje aminokiselinske sekvence varijabilnih domena teškog lanca anti-CD3 antitela.
SLIKA 6A prikazuje aminokiselinske sekvence varijabilnih domena lakog lanca anti-CD3 antitela 21A9 i Rab17.
SLIKA 6B prikazuje aminokiselinske sekvence varijabilnih domena teškog lanca anti-CD3 antitela 21A9 i Rab17.
SLIKA 7 je poravnavanje aminokiselinskih sekvenci varijabilnog domena lakog lanca (gore) i varijabilnog domena teškog lanca (dole) anti-CD3 antitela koja pokazuje sekvencu konsenzusa, 40G5c, izvedenu iz povezanih klonskih antitela.
SLIKA 8A je poravnavanje aminokiselinskih sekvenci varijabilnog domena lakog lanca (gore) i varijabilnog domena teškog lanca (dole) anti-CD3 antitela 13A3 i njegove humanizovane varijante (hu13A3).
SLIKA 8B je poravnavanje aminokiselinskih sekvenci varijabilnog domena lakog lanca (gore) i varijabilnog domena teškog lanca (dole) anti-CD3 antitela 30A1 i njegove humanizovane varijante (hu30A1).
SLIKA 8C je poravnavanje aminokiselinskih sekvenci varijabilnog domena lakog lanca (gore) i varijabilnog domena teškog lanca (dole) anti-CD3 antitela 41D9a i njegove humanizovane varijante (hu41D9a).
SLIKA 8D je poravnavanje aminokiselinskih sekvenci varijabilnog domena lakog lanca (gore) i varijabilnog domena teškog lanca (dole) anti-CD3 antitela SP34 i njegove humanizovane varijante (huSP34).
SLIKA 8E je poravnavanje aminokiselinskih sekvenci varijabilnog domena lakog lanca (gore) i varijabilnog domena teškog lanca (dole) anti-CD3 antitela 38E4 i njegove humanizovane varijante (hu38E4).
SLIKA 8F je poravnavanje aminokiselinskih sekvenci varijabilnog domena lakog lanca (gore) i varijabilnog domena teškog lanca (dole) anti-CD3 antitela 40G5 i njegove humanizovane varijante (hu40G5).
SLIKA 9A je tabela koja rezimira izabrane humanizovane varijante anti-CD3 antitela 13A3 i njihove afinitete vezivanja, analizirane korišćenjem komercijalnog CD3ε (Creative
1
Biomart, Shirley, NY; kataloški br. CD3E-2194H).
SLIKA 9B je tabela koja rezimira izabrane humanizovane varijante anti-CD3 antitela 30A1 i njihov afinitet vezivanja, analizirane korišćenjem komercijalnog CD3ε (Creative Biomart, Shirley, NY; kataloški br. CD3E-2194H).
SLIKA 9C je tabela koja rezimira izabrane humanizovane varijante anti-CD3 antitela 41D9a i njihov afinitet vezivanja, analizirane korišćenjem komercijalnog CD3ε (Creative Biomart, Shirley, NY; kataloški br. CD3E-2194H).
SLIKA 9D je tabela koja rezimira izabrane humanizovane varijante anti-CD3 antitela SP34 i njihov afinitet vezivanja, analizirane korišćenjem komercijalnog CD3ε (Creative Biomart, Shirley, NY; kataloški br. CD3E-2194H).
SLIKA 9E je tabela koja rezimira izabrane humanizovane varijante anti-CD3 antitela 38E4 i njihov afinitet vezivanja, analizirane korišćenjem komercijalnog CD3ε (Creative Biomart, Shirley, NY; kataloški br. CD3E-2194H).
SLIKA 9F je tabela koja rezimira izabrane humanizovane varijante anti-CD3 antitela 40G5c i njihov afinitet vezivanja, analizirane korišćenjem komercijalnog CD3ε (Creative Biomart, Shirley, NY; kataloški br. CD3E-2194H).
SLIKA 10 je tabela koja rezimira afinitet vezivanja humanizovanih anti-CD3 antitela za različite CD3ε antigene.
SLIKA 11 je tabela koja rezimira afinitet vezivanja humanizovanih anti-CD3 antitela 38E4v1 do 38E4v9 i 40G5c, izmeren pomoću Biacore testa sa humanim CD3εγ na čipu i anti-CD3 antitelima protočno.
SLIKA 12A je tabela koja rezimira relativni afinitet vezivanja za pojedinačne mutante alanina, serina, treonina ili glutamata humanizovanog anti-CD3 antitela 38E4v1 koje ima jednu mutaciju u HVR-L3 ili HVR-H3, u poređenju sa 38E4v1 koristeći kinetičku Biacore analizu sa jednim ciklusom ili konvencionalnu multicikličnu kinetičku Biacore analizu.
SLIKA 12B prikazuje aminokiselinske sekvence HVR-L3 (gore) i HVR-H3 (dole) humanizovanog anti-CD3 antitela 38E4v1.
SLIKA 13A je niz grafikona koji prikazuju relativno vezivanje označenog anti-CD3 antitela za varijante alanina CD3ε<1-27>-Fc.
SLIKA 13B je grafikon koji prikazuje relativni udeo CD3εγ alanin skenirajućih fagemidnih mutanata vezanih za anti-CD3 antitela 38E4.v1, 40G5c i SP34.v52, u poređenju sa vezivanjem za divlji tip CD3εγ faga.
SLIKA 13C je niz grafikona koji prikazuju relativno vezivanje anti-CD3 antitela 38E4.v1, 40G5c i SP34.v52 za odabrane CD3εγ alanin skenirajuće fagemidne mutante u funkciji koncentracije faga.
SLIKA 13D je skup tabela koje prikazuju relativni afinitet vezivanja anti-CD3 antitela SP34.v52 i 38E4v1 za odabrane CD3εγ alanin skenirajuće mutante, kao što je procenjeno Biacore testom. NB = nema detektabilnog vezivanja.
SLIKA 14A prikazuje sekvencu 16-mernog CD3ε polipeptida koji se koristi u ispitivanjima kokristalizacije sa 38E4.v1 Fab.
SLIKE 14B-14F su niz prikaza kristalne strukture koji predstavljaju kompleks peptida hu38E4.v1 Fab/CD3ε iz različitih perspektiva.
SLIKA 14G je poravnavanje aminokiselinskih sekvenci varijabilnog domena lakog lanca (gore) i varijabilnog domena teškog lanca (dole) anti-CD3 antitela hu40G5c i hu38E4.v1, pri čemu su ostaci svakog antitela koji su važni za vezivanje CD3 (kontaktni ostaci) zaokruženi u poravnavanju. Utvrđeno je da su zaokruženi ostaci u okviru 5 Å od CD3 peptida, što je utvrđeno kristalografskom analizom. Δ označava Vernijeove pozicije (za referencu, vidite, npr. Foote i Winter. JMB. 224: 487, 1992); * označava interakcije FW-HVR (za referencu, vidite, npr. Padlan et al. Mol. Imunol.31: 169, 1994); i • označava interakcije VH-VL (za referencu, vidite, npr. Padlan et al. Mol. Imunol.31: 169, 1994).
SLIKA 14H je prikaz kristalne strukture CD3ε polipeptida koji vezuje hu38E4.v1 Fab. Svi kontaktni ostaci antigena su prikazani žutom bojom. Svi kontaktni ostaci su identični između hu38E4.v1 i hu40G5, osim što G96 (prikazan narandžastom bojom) predstavlja S96 u hu40G5.
SLIKE 14I i 14J su prikazi trakastih grafikona kristalnih struktura hu38E4.v1 Fab, odnosno SP34v52 Fab, sa istom orijentacijom, preklopljeni VL regionom sa RMS = 2,24.
SLIKA 14K je prikaz prostornog modela hu38E4.v1 Fab koji gradi kompleks sa CD3ε N-terminalnim peptidom vezanim u procepu između teškog (cijan) i lakog (ljubičasta boja) lanca.
SLIKA 14L je prikaz prostornog modela SP34v52 Fab pri čemu je CD3ε N-terminalni peptid superponiran u istom smeru kao u kompleksu CD3ε/hu38E4.v1 Fab koji je prikazan na slici 14K. Ostaci R50 i R52 (narandžasta boja) HVR-H2 iz SP34v52 Fab su važni za vezivanje CD3. Jasni konflikti CD3 peptida sa SP34v52 Fab označeni su strelicama.
SLIKA 14M je prikaz kristalne strukture hu38E4.v1 koji gradi kompleks sa N-terminalnim peptidom CD3εγ i ilustruje ključne intermolekulske interakcije koje se javljaju u prvom piroglutaminskom ostatku i šestom ostatku (E6) u CD3εγ. Potencijalne vodonične veze su prikazane kao isprekidane linije.
SLIKA 14N je prikaz prostornog modela hu38E4.v1 Fab koji gradi kompleks sa CD3εγ N-terminalnim peptidom vezanim u procepu između teškog (cijan) i lakog (ljubičasta boja) lanca. Peti ostatak (E5), kao što je prikazano, okrenut je u suprotnom smeru od mesta interakcije koje sadrži šesti ostatak (E6) kompleksa CD3εγ N-terminalnog peptida i Fab.
SLIKA 15 prikazuje uopšteni šematski prikaz formiranja TDB antitela. Konkretni prikazani TDB je prikazan kao TDB pune dužine u formatu dugme u rupici (knob-in-hole, KIH), koji može imati mutaciju aglikozilacije, ako ga proizvodi eukariotska ćelija (npr. ćelija CHO). U alternativnom formatu, dugme može biti prisutno na anti-CD3 kraku, a rupica može biti prisutna na kraku antitumorskog antigena. Ovaj format takođe može imati mutaciju aglikozilacije, ako ga proizvodi eukariotska ćelija (npr. ćelija CHO).
SLIKA 16 su grafikoni koji prikazuju rezultate FACS in vitro testova vezivanja različitih CD3/CD20 TDB koji imaju različite kombinacije anti-CD3 krakova serije UCHT1 i anti-CD20 krakova serije 2H7. Vezivanje Bjab B ćelijske linije tumora (vezivanje CD20), levo. Vezivanje Jurkatovih ćelija (vezivanje CD3), desno.
SLIKA 17 je skup tabela koje rezimiraju jednovalentne (gore) i (dvovalentne) afinitete vezivanja kao Kd vrednosti za različite CD3/CD20 TDB koji imaju različite kombinacije anti-CD3 krakova serije UCHT1 i anti-CD20 krakova serije 2H7.
SLIKA 18 je grafikon koji prikazuje rezultate in vitro FACS testova vezivanja Jurkatovih ćelija (vezivanje CD3) različitih CD3/CD20 TDB koji imaju različite kombinacije anti-CD3 krakova sa anti-CD20 krakom 2H7v16.
SLIKA 19 je grafikon koji prikazuje rezultate in vitro FACS testova vezivanja Jurkatovih ćelija (vezivanje CD3) različitih CD3/CD20 TDB koji imaju različite kombinacije anti-CD3 krakova sa anti-CD20 krakom 2H7v16.
SLIKA 20 je grafikon koji prikazuje rezultate in vitro FACS testova vezivanja Bjab ćelija (vezivanje CD20) različitih CD3/CD20 TDB koji imaju različite kombinacije anti-CD3 krakova sa anti-CD20 krakom 2H7v16.
SLIKE 21A i 21B su grafikoni koji prikazuju rezultate in vitro FACS testova vezivanja Jurkatovih ćelija (vezivanje CD3) različitih CD3/CD20 TDB koji imaju različite kombinacije anti-CD3 krakova sa anti-CD20 krakom 2H7v16.
SLIKA 21C je tabela koja rezimira EC50 (µg/ml) za svaki testirani CD3/CD20 TDB na slikama 21A i 21B.
SLIKE 22A i 22B su grafikoni koji prikazuju rezultate in vitro FACS testova vezivanja Bjab ćelija (vezivanje CD20) različitih CD3/CD20 TDB koji imaju različite kombinacije anti-CD3 krakova sa anti-CD20 krakom 2H7v16.
SLIKA 23 je grafikon koji prikazuje rezultate in vitro FACS testova vezivanja
1
Jurkatovih ćelija (vezivanje CD3) različitih CD3/CD20 TDB koji imaju različite kombinacije anti-CD3 krakova sa anti-CD20 krakom 2H7v16.
SLIKA 24 je tabela koja rezimira afinitete vezivanja za različite CD3/CD20 TDB i Fab, izmerene putem Biacore analize sa humanim CD3εγ na čipu i CD3/CD20 TDB ili Fab protočno.
SLIKA 25A je grafikon koji prikazuje procenat aktivacije T-ćelija, izmeren putem površinske ekspresije CD69 i CD25, nakon 24 sata inkubacije navedenog CD3/CD20 TDB (serija 2H7) sa 20.000 Bjab ćelija i 5x prečišćenih hu CD8+ T ćelija.
SLIKA 25B je grafikon koji prikazuje procenat ubijanja Bjab ćelija u odnosu na kontrolu koja nije tretirana TDB-om, nakon 24 sata inkubacije navedenog CD3/CD20 TDB (serija 2H7) sa 20.000 Bjab ćelija i 5x prečišćenih huCD8+ T ćelija, izmereno pomoću FACS analize.
SLIKA 26A je grafikon koji prikazuje procenat aktivacije T-ćelija, izmeren putem površinske ekspresije CD69 i CD25, nakon 24 sata inkubacije navedenog CD3/CD20 TDB (serija 2H7) sa 200.000 humanih PBMC po bunarčiću.
SLIKA 26B je grafikon koji prikazuje procenat endogenog (endo) ubijanja B ćelija u odnosu na kontrolu koja nije tretirana TDB-om, nakon 24 sata inkubacije navedenog CD3/CD20 TDB (serija 2H7) sa 200.000 humanih PBMC po bunarčiću, izmeren pomoću FACS analize.
SLIKA 27A je grafikon koji prikazuje procenat aktivacije T-ćelija, izmeren putem površinske ekspresije CD69 i CD25, nakon 24 sata inkubacije navedenog CD3/CD20 TDB (serija UCHT1) sa 20.000 Bjab ćelija i 5x prečišćenih hu CD8+ T ćelija.
SLIKA 27B je grafikon koji prikazuje procenat ubijanja Bjab ćelija u odnosu na kontrolu koja nije tretirana TDB-om, nakon 24 sata inkubacije navedenog CD3/CD20 TDB (serija UCHT1) sa 20.000 Bjab ćelija i 5x prečišćenih huCD8+ T ćelija, izmereno pomoću FACS analize.
SLIKA 28A je grafikon koji prikazuje procenat aktivacije T-ćelija, izmeren putem površinske ekspresije CD69 i CD25, nakon 24 sata inkubacije navedenog CD3/CD20 TDB (serija UCHT1) sa 200.000 humanih PBMC po bunarčiću.
SLIKA 28B je grafikon koji prikazuje procenat endo ubijanja B ćelija u odnosu na kontrolu koja nije tretirana TDB-om, nakon 24 sata inkubacije navedenog CD3/CD20 TDB (serija UCHT1) sa 200.000 humanih PBMC po bunarčiću, izmeren pomoću FACS analize.
SLIKA 29A je grafikon koji prikazuje procenat endo ubijanja B ćelija u odnosu na kontrolu koja nije tretirana TDB-om, nakon 24 sata inkubacije različitih CD3/CD20 TDB koji imaju različite kombinacije anti-CD3 krakova sa anti-CD20 krakom 2H7v16, sa 200.000 humanih PBMC (izolovanih od donora br.3) po bunarčiću, izmeren pomoću FACS analize.
SLIKA 29B je grafikon koji prikazuje procenat aktivacije T ćelija, izmeren površinskom ekspresijom CD69 i CD25, nakon 24 sata inkubacije različitih CD3/CD20 TDB koji imaju različite kombinacije anti-CD3 krakova sa anti-CD20 krakom 2H7v16, sa 200.000 humanih PBMC (izolovanih od donora br.3) po bunarčiću, izmeren pomoću FACS analize.
SLIKA 30A je grafikon koji prikazuje procenat endo ubijanja B ćelija u odnosu na kontrolu koja nije tretirana TDB-om, nakon 24 sata inkubacije različitih CD3/CD20 TDB koji imaju različite kombinacije anti-CD3 krakova sa anti-CD20 krakom 2H7v16, sa 200.000 humanih PBMC (izolovanih od donora br.4) po bunarčiću, izmeren pomoću FACS analize.
SLIKA 30B je grafikon koji prikazuje procenat aktivacije T ćelija, izmeren površinskom ekspresijom CD69 i CD25, nakon 24 sata inkubacije različitih CD3/CD20 TDB koji imaju različite kombinacije anti-CD3 krakova sa anti-CD20 krakom 2H7v16, sa 200.000 humanih PBMC (izolovanih od donora br.4) po bunarčiću, izmeren pomoću FACS analize.
SLIKA 31A je grafikon koji prikazuje procenat endo ubijanja B ćelija u odnosu na kontrolu koja nije tretirana TDB-om, nakon 24 sata inkubacije različitih CD3/CD20 TDB koji imaju različite kombinacije anti-CD3 krakova sa anti-CD20 krakom 2H7v16, sa 200.000 cino PBMC (izolovanih od donora br.2) po bunarčiću, izmeren pomoću FACS analize.
SLIKA 31B je grafikon koji prikazuje procenat aktivacije T ćelija, izmeren površinskom ekspresijom CD69 i CD25, nakon 24 sata inkubacije različitih CD3/CD20 TDB koji imaju različite kombinacije anti-CD3 krakova sa anti-CD20 krakom 2H7v16, sa 200.000 cino PBMC (izolovanih od donora br.2) po bunarčiću, izmeren pomoću FACS analize.
SLIKA 32A je grafikon koji prikazuje procenat endo ubijanja B ćelija u odnosu na kontrolu koja nije tretirana TDB-om, nakon 24 sata inkubacije različitih CD3/CD20 TDB koji imaju različite kombinacije anti-CD3 krakova sa anti-CD20 krakom 2H7v16, sa 200.000 cino PBMC (izolovanih od donora br.3) po bunarčiću, izmeren pomoću FACS analize.
SLIKA 32B je grafikon koji prikazuje procenat aktivacije T ćelija, izmeren površinskom ekspresijom CD69 i CD25, nakon 24 sata inkubacije različitih CD3/CD20 TDB koji imaju različite kombinacije anti-CD3 krakova sa anti-CD20 krakom 2H7v16, sa 200.000 cino PBMC (izolovanih od donora br.3) po bunarčiću, izmeren pomoću FACS analize.
SLIKA 33A je grafikon koji prikazuje procenat ubijanja Bjab ćelija u odnosu na kontrolu koja nije tretirana TDB-om, nakon 24 sata inkubacije različitih CD3/CD20 TDB koji imaju različite kombinacije anti-CD3 krakova sa anti-CD20 krakom 2H7v16, sa 200.000 cino PBMC po bunarčiću, izmeren pomoću FACS analize.
1
SLIKA 33B je grafikon koji prikazuje procenat aktivacije T ćelija, izmeren površinskom ekspresijom CD69 i CD25, nakon 24 sata inkubacije različitih CD3/CD20 TDB koji imaju različite kombinacije anti-CD3 krakova sa anti-CD20 krakom 2H7v16, sa 200.000 cino PBMC po bunarčiću, izmeren pomoću FACS analize.
SLIKA 34A je grafikon koji prikazuje procenat endo ubijanja B ćelija u odnosu na kontrolu koja nije tretirana TDB-om, nakon 24 sata inkubacije različitih CD3/CD20 TDB koji imaju različite kombinacije anti-CD3 krakova sa anti-CD20 krakom 2H7v16, sa 200.000 humanih PBMC (izolovanih od donora br.2) po bunarčiću, izmeren pomoću FACS analize.
SLIKA 34B je grafikon koji prikazuje procenat aktivacije T ćelija, izmeren površinskom ekspresijom CD69 i CD25, nakon 24 sata inkubacije različitih CD3/CD20 TDB koji imaju različite kombinacije anti-CD3 krakova sa anti-CD20 krakom 2H7v16, sa 200.000 humanih PBMC (izolovanih od donora br.2) po bunarčiću, izmeren pomoću FACS analize.
SLIKA 35A je grafikon koji prikazuje procenat endo ubijanja B ćelija u odnosu na kontrolu koja nije tretirana TDB-om, nakon 24 sata inkubacije različitih CD3/CD20 TDB koji imaju različite kombinacije anti-CD3 krakova sa anti-CD20 krakom 2H7v16, sa 200.000 humanih PBMC (izolovanih od donora br.3) po bunarčiću, izmeren pomoću FACS analize.
SLIKA 35B je grafikon koji prikazuje procenat aktivacije T ćelija, izmeren površinskom ekspresijom CD69 i CD25, nakon 24 sata inkubacije različitih CD3/CD20 TDB koji imaju različite kombinacije anti-CD3 krakova sa anti-CD20 krakom 2H7v16, sa 200.000 humanih PBMC (izolovanih od donora br.3) po bunarčiću, izmeren pomoću FACS analize.
SLIKA 36A je grafikon koji prikazuje procenat endo ubijanja B ćelija u odnosu na kontrolu koja nije tretirana TDB-om, nakon 24 sata inkubacije različitih CD3/CD20 TDB koji imaju različite kombinacije anti-CD3 krakova sa anti-CD20 krakom 2H7v16, sa 200.000 humanih PBMC (izolovanih od donora br.4) po bunarčiću, izmeren pomoću FACS analize.
SLIKA 36B je grafikon koji prikazuje procenat aktivacije T ćelija, izmeren površinskom ekspresijom CD69 i CD25, nakon 24 sata inkubacije različitih CD3/CD20 TDB koji imaju različite kombinacije anti-CD3 krakova sa anti-CD20 krakom 2H7v16, sa 200.000 humanih PBMC (izolovanih od donora br.4) po bunarčiću, izmeren pomoću FACS analize.
SLIKE 37A i 37B su grafikoni koji prikazuju procenat aktivacije T ćelija, izmeren površinskom ekspresijom CD69 i CD25, nakon 24 sata inkubacije različitih CD3/CD20 TDB koji imaju različite kombinacije anti-CD3 krakova sa anti-CD20 krakom 2H7v16, sa 200.000 humanih PBMC (izolovanih od donora br.1) po bunarčiću, izmeren pomoću FACS analize.
SLIKA 37C je tabela koja rezimira EC50 aktivacije CD8+ T ćelija (ng/ml) za svaki CD3/CD20 TDB testiran na slikama 37A i 37B.
1
SLIKE 38A i 38B su grafikoni koji prikazuju procenat endo ubijanja B ćelija u odnosu na kontrolu koja nije tretirana TDB-om, nakon 24 sata inkubacije različitih CD3/CD20 TDB koji imaju različite kombinacije anti-CD3 krakova sa anti-CD20 krakom 2H7v16, sa 200.000 humanih PBMC (izolovanih od donora br.1) po bunarčiću, izmeren pomoću FACS analize.
SLIKA 38C je tabela koja rezimira EC50 (ng/ml) za endo ubijanje B ćelija za svaki CD3/CD20 TDB testiran na slikama 38A i 38B.
SLIKE 39A i 39B su grafikoni koji prikazuju procenat aktivacije T ćelija, izmeren površinskom ekspresijom CD69 i CD25, nakon 48 sata inkubacije različitih CD3/CD20 TDB koji imaju različite kombinacije anti-CD3 krakova sa anti-CD20 krakom 2H7v16, sa 200.000 humanih PBMC (izolovanih od donora br.1) po bunarčiću, izmeren pomoću FACS analize.
SLIKA 39C je tabela koja rezimira EC50 aktivacije CD8+ T ćelija (ng/ml) za svaki CD3/CD20 TDB testiran na slikama 39A i 39B.
SLIKE 40A i 40B su grafikoni koji prikazuju procenat endo ubijanja B ćelija u odnosu na kontrolu koja nije tretirana TDB-om, nakon 48 sata inkubacije različitih CD3/CD20 TDB koji imaju različite kombinacije anti-CD3 krakova sa anti-CD20 krakom 2H7v16, sa 200.000 humanih PBMC (izolovanih od donora br.1) po bunarčiću, izmeren pomoću FACS analize.
SLIKA 40C je tabela koja rezimira EC50 (ng/ml) za endo ubijanje B ćelija za svaki CD3/CD20 TDB testiran na slikama 40A i 40B.
SLIKE 41A i 41B su grafikoni koji prikazuju procenat aktivacije T ćelija, izmeren površinskom ekspresijom CD69 i CD25, nakon 24 sata inkubacije različitih CD3/CD20 TDB koji imaju različite kombinacije anti-CD3 krakova sa anti-CD20 krakom 2H7v16, sa 200.000 humanih PBMC (izolovanih od donora br.2) po bunarčiću, izmeren pomoću FACS analize.
SLIKA 41C je tabela koja rezimira EC50 aktivacije CD8+ T ćelija (ng/ml) za svaki CD3/CD20 TDB testiran na slikama 41A i 41B.
SLIKE 42A i 42B su grafikoni koji prikazuju procenat endo ubijanja B ćelija u odnosu na kontrolu koja nije tretirana TDB-om, nakon 24 sata inkubacije različitih CD3/CD20 TDB koji imaju različite kombinacije anti-CD3 krakova sa anti-CD20 krakom 2H7v16, sa 200.000 humanih PBMC (izolovanih od donora br.2) po bunarčiću, izmeren pomoću FACS analize.
SLIKA 42C je tabela koja rezimira EC50 (ng/ml) za endo ubijanje B ćelija za svaki CD3/CD20 TDB testiran na slikama 42A i 42B.
SLIKE 43A i 43B su grafikoni koji prikazuju procenat aktivacije T ćelija, izmeren površinskom ekspresijom CD69 i CD25, nakon 48 sata inkubacije različitih CD3/CD20 TDB koji imaju različite kombinacije anti-CD3 krakova sa anti-CD20 krakom 2H7v16, sa 200.000 humanih PBMC (izolovanih od donora br.2) po bunarčiću, izmeren pomoću FACS analize.
1
SLIKA 43C je tabela koja rezimira EC50 aktivacije CD8+ T ćelija (ng/ml) za svaki CD3/CD20 TDB testiran na slikama 43A i 43B.
SLIKE 44A i 44B su grafikoni koji prikazuju procenat endo ubijanja B ćelija u odnosu na kontrolu koja nije tretirana TDB-om, nakon 48 sata inkubacije različitih CD3/CD20 TDB koji imaju različite kombinacije anti-CD3 krakova sa anti-CD20 krakom 2H7v16, sa 200.000 humanih PBMC (izolovanih od donora br.2) po bunarčiću, izmeren pomoću FACS analize.
SLIKA 44C je tabela koja rezimira EC50 (ng/ml) za endo ubijanje B ćelija za svaki CD3/CD20 TDB testiran na slikama 44A i 44B.
SLIKA 45A je grafikon koji pokazuje da određeni CD3/CD20 TDB, kao što je onaj koji ima anti-CD20 krak 2H7v16 i anti-CD3 krak 72H6, ne pokazuju in vitro potentnost, kako je procenjeno u testovima ubijanja Bjab.
SLIKE 45B i 45C su grafikoni koji pokazuju da određeni CD3/CD20 TDB, kao što je onaj koji ima anti-CD20 krak 2H7v16 i anti-CD3 krak 72H6, ne pokazuju in vitro potentnost, kako je procenjeno testovima endo ubijanja B ćelija (B) i aktivacije T ćelija (C).
SLIKA 46A je grafikon koji pokazuje da određeni CD3/CD20 TDB, kao što je onaj koji ima anti-CD20 krak 2H7v16 i anti-CD3 krak 13A3, pokazuju malu in vitro potetnost, kako je procenjeno u testovima ubijanja Bjab.
SLIKA 46B je grafikon koji pokazuje da određeni CD3/CD20 TDB, kao što je onaj koji ima anti-CD20 krak 2H7v16 i anti-CD3 krak 30A1, pokazuju malu in vitro potentnost, kako je procenjeno u testovima ubijanja Bjab.
SLIKA 46C je grafikon koji pokazuje da određeni CD3/CD20 TDB, kao što je onaj koji ima anti-CD20 krak 2H7v16 i anti-CD3 krak 41 D9a, pokazuju malu in vitro potentnost, kako je procenjeno u testovima ubijanja Bjab. Prikazane su vrednosti EC50 (ng/ml) za ubijanje Bjab ćelija za svaki testirani CD3/CD20 TDB.
SLIKA 46D je grafikon koji pokazuje da određeni CD3/CD20 TDB, kao što je onaj koji ima anti-CD20 krak 2H7v16 i anti-CD3 krak 41 D9a, pokazuju malu in vitro potentnost, kako je procenjeno u testovima endo ubijanja B ćelija. Prikazane su vrednosti EC50 (ng/ml) za endo ubijanje B ćelija za svaki testirani CD3/CD20 TDB.
SLIKA 46E je grafikon koji pokazuje da određeni CD3/CD20 TDB, kao što je onaj koji ima anti-CD20 krak 2H7v16 i anti-CD3 krak 41 D9a, pokazuju malu in vitro potentnost, kako je procenjeno u testovima aktivacije T ćelija.
SLIKA 47A je grafikon koji pokazuje da određeni CD3/CD20 TDB, kao što su TDB koji imaju anti-CD20 krak 2H7v16 i anti-CD3 krak UCHT1v9, 21A9 i 40G5c, pokazuju veliku in vitro potentnost, kako je procenjeno u testovima endo ubijanja B ćelija koristeći 200.000
1
humanih PBMC (izolovanih od donora br.1) po bunarčiću, izmereno pomoću FACS analize. SLIKA 47B je grafikon koji pokazuje da određeni CD3/CD20 TDB, kao što su TDB koji imaju anti-CD20 krak 2H7v16 i anti-CD3 krak UCHT1v9, 21A9 i 40G5c, pokazuju veliku in vitro potentnost, kako je procenjeno u testovima aktivacije T ćelija koristeći 200.000 humanih PBMC (izolovanih od donora br.1) po bunarčiću, izmereno pomoću FACS analize.
SLIKA 48A je grafikon koji pokazuje da određeni CD3/CD20 TDB, kao što su TDB koji imaju anti-CD20 krak 2H7v16 i anti-CD3 krak UCHT1v9, 21A9 i 40G5c, pokazuju veliku in vitro potentnost, kako je procenjeno u testovima endo ubijanja B ćelija koristeći 200.000 humanih PBMC (izolovanih od donora br.2) po bunarčiću, izmereno pomoću FACS analize.
SLIKA 48B je grafikon koji pokazuje da određeni CD3/CD20 TDB, kao što su TDB koji imaju anti-CD20 krak 2H7v16 i anti-CD3 krak UCHT1v9, 21A9 i 40G5c, pokazuju veliku in vitro potentnost, kako je procenjeno u testovima aktivacije T ćelija koristeći 200.000 humanih PBMC (izolovanih od donora br.2) po bunarčiću, izmereno pomoću FACS analize.
SLIKA 49 je tabela koja rezimira in vitro potentnost različitih CD3/CD20 TDB koji imaju različite kombinacije anti-CD3 krakova sa anti-CD20 krakom 2H7v16.
SLIKA 50 prikazuje aminokiselinske sekvence varijabilnog domena lakog lanca (gore) i varijabilnog domena teškog lanca (dole) anti-CD20 antitela 2H7.v16.
SLIKA 51 prikazuje aminokiselinske sekvence varijabilnog domena lakog lanca (gore) i varijabilnog domena teškog lanca (dole) anti-CD3 antitela hu40G5c.
SLIKE 52A i 52B pokazuju da prečišćeni CD3/CD20 TDB (40G5c/2H7v16) nema detektabilno formiranje agregata na osnovu hromatografije na molekulskim sitima (SEC) (A) i nema detektabilno formiranje homodimera (tj. formiranje antitela CD3/CD3 ili CD20/CD20) na osnovu masene spektrometrije (B).
SLIKA 53A je grafikon koji prikazuje farmakokinetiku serumskih koncentracija CD3/CD20 TDB pri različitim dozama kod pacova tipa Sprag-Doli (SD) tokom vremena (izraženog u danima), na osnovu generičkog testa farmakokinetike imunoglobulina (GRIP) ili specifičnog testa.
SLIKA 53B je tabela koja rezimira vrednosti kvantifikovanog klirensa (ml/dan/kg) testiranih CD3/CD20 TDB antitela pri svakoj dozi testiranoj na slici 53A.
SLIKA 54A je grafikon koji pokazuje da je F(ab')2deo CD20 TDB zadržao istu potentnost kao IgG CD20 TDB pune dužine za ubijanje B ćelija (ubijanje Bjab) in vitro.20.000 Bjab ćelija i 200.000 PBMC izolovanih od zdravog donora je inkubirano sa različitim koncentracijama CD20 TDB pune dužine ili F(ab')2 CD20 TDB tokom 24 sata.
SLIKA 54B je grafikon koji pokazuje da je aktivnost ubijanje B ćelija putem CD20
1
TDB zavisna od T ćelija, jer ubijanje B ćelija nije detektovano sa PBMC bez CD3+ T ćelija.
20.000 Bjab ćelija i 200.000 PBMC izolovanih od zdravog donora, ili 200.000 PBMC bez CD3+T ćelija, inkubirano je sa različitim koncentracijama CD20 TDB tokom 24 sata.
SLIKA 54C je grafikon koji pokazuje da uporedivo ubijanje B ćelija može da se postigne sa CD4+ ili CD8+T ćelijama kao efektorima.20.000 Bjab ćelija i 100.000 prečišćenih CD8+T ćelija ili CD4+T ćelija inkubirano je sa različitim koncentracijama CD20 TDB tokom 24 sata. Ubijanje ćelija i aktivacija T ćelija označenih kao CD69+CD25+ izmereni su i izračunati kako je opisano u nastavku.
SLIKA 54D je grafikon koji pokazuje da je CD20 TDB sposoban da aktivira CD4+ kao i CD8+T ćelije. 20.000 Bjab ćelija i 100.000 prečišćenih CD8+T ćelija ili CD4+T ćelija inkubirano je sa različitim koncentracijama CD20 TDB tokom 24 sata. Ubijanje ćelija i aktivacija T ćelija označenih kao CD69+CD25+ izmereni su i izračunati kako je opisano u nastavku.
SLIKA 54E je grafikon koji pokazuje da je povećana regulacija granzima zastupljenija kod CD8+T ćelija nakon dodavanja CD20 TDB. 20.000 Bjab ćelija i 100.000 prečišćenih CD8+T ćelija ili CD4+T ćelija inkubirano je sa različitim koncentracijama CD20 TDB tokom 24 sata. FACS je takođe detektovao indukciju granzima B.
SLIKA 54F je grafikon koji pokazuje da je veći nivo oslobađanja perforina povezan sa CD8+T ćelijama nakon dodavanja CD20 TDB. 20.000 Bjab ćelija i 100.000 prečišćenih CD8+T ćelija ili CD4+T ćelija inkubirano je sa različitim koncentracijama CD20 TDB tokom 24 sata. Koncentracija perforina u medijumu je izmerena ELISA testom
SLIKA 55 je niz grafikona protočne citometrije koji pokazuju da su aktivirane T ćelije sposobne za proliferaciju u prisustvu CD20 TDB i Bjab ćelija.
SLIKA 56A je niz grafikona koji prikazuju krive ubijanja B ćelija zavisnog od doze 8 B tumorskih ćelijskih linija leukemije/limfoma (levo) i nivoe ekspresije CD20 za date B ćelijske linije sa izotipskom kontrolom prikazanom sivom bojom, izmereno pomoću FACS. B ćelije su uzgajane u RPMI 1640 medijumu sa dodatkom 10% FBS. Za test ubijanja, 20.000 B ćelija je inkubirano sa 200.000 PBMC izolovanih od zdravog donora sa različitim koncentracijama CD20 TDB tokom 24 sata.
SLIKA 56B je grafikon koji prikazuje širok raspon prosečne ekspresije CD20 na 8 B ćelijskih linija testiranih na slici 56A. CD4+T ili CD8+T ćelije, prečišćene iz pune krvi zdravog donora i označene pomoću CFSE, inkubirane su samostalno, samo sa Bjab ćelijama, samo sa CD20 TDB, ili prvo sa Bjab ćelijama i CD20 TDB tokom 24 sata, nakon čega su ćelije isprane i stavljene u svež medijum još 48 sati. FACS je detektovao CFSE intenzitet T ćelija koji
2
pokazuje proliferaciju T ćelija samo u prisustvu Bjab i CD20 TDB.
SLIKA 56C je skup grafikona koji pokazuju da je CD20 TDB potentan za ubijanje svih 8 linija na način zavisan od doze, gde su vrednosti EC50 za ubijanje B ćelija (ng/ml) (gore) i procenat ubijanja B ćelija (dole) predstavljene u funkciji ekspresije CD20 na ciljnoj B ćeliji.
SLIKA 56D je grafikon koji pokazuje da su TDB koji ciljaju 5 različitih B ćelijskih antigena uporedivi u posredovanju u T ćelijskom ubijanju Bjab ćelija. B ćelije su uzgajane u RPMI 1640 medijumu sa dodatkom 10% FBS. Za test ubijanja, 20.000 Bjab ćelija je inkubirano sa 100.000 prečišćenih CD8+T ćelija zdravog donora sa CD20 TDB (TDB A: 2H7v16/UCHT1v9) ili TDB koji cilja različit B ćelijski antigen (tj. TDB B-E, od kojih svaki cilja drugi B ćelijski antigen) u koncentraciji od 1000 ng/ml tokom 24 sata.
SLIKA 56E je grafikon koji prikazuje obim ubijanja B ćelija za 10 B ćelijskih linija tumora leukemije/limfoma. B ćelije su uzgajane u RPMI 1640 medijumu sa dodatkom 10% FBS. Za test ubijanja, 20.000 B ćelija je inkubirano sa 100.000 prečišćenih CD8+T ćelija zdravog donora i 1000 ng/ml CD20 TDB (2H7v16/UCHT1v9) tokom 24 sata.
SLIKA 56F je grafikon koji prikazuje krive ubijanja zavisnog od doze za 8 nasumičnih donora.
SLIKA 56G je zbirni dijagram za EC50 (levo) i obim ubijanja B ćelija (desno) sa 1000 ng/ml antitela u 24-časovnom testu za 30 donora.
SLIKA 56H je skup grafikona koji pokazuju da je obim ubijanja B ćelija u roku od 24 sata putem CD20 TDB veoma uporediv sa ubijanjem B ćelija putem CD19 scFv ili veći od njega. Za ubijanje autolognih B ćelija, 200.000 PBMC izolovanih od zdravog donora je inkubirano tokom 24 sata sa CD20 TDB u naznačenoj koncentraciji. Prijavljeno ubijanje ćelija je izračunato kao što je opisano ispod.
SLIKA 56I je skup grafikona koji pokazuju da je obim ubijanja B ćelija u roku od 24 sata putem CD20 TDB uporediv sa ubijanjem B ćelija putem CD19-TDB ili CD22-TDB (gornji panel) ili CD79a ili CD79b (donji panel) ili veći od njega. Za autologno ubijanje B ćelija, 200.000 PBMC izolovanih od zdravog donora inkubirano je sa 40.000 BJAB ćelija tokom 24 sata sa CD20, CD19, CD22, CD79a ili CD 79B TDB u naznačenoj koncentraciji. Prijavljeno ubijanje ćelija je izračunato kao što je opisano ispod.
SLIKA 57A je niz grafikona koji prikazuju vrednosti relativne ekspresije za humani CD3ε detektovan u CD4+ T ćelijama (levi panel) i CD8+ T ćelijama (centralni panel); i humani CD20 u CD19+ B ćelijama (desni panel) detektovan u mišjim (mu) ili humanim (hu) PBMC putem FACS. Mišje PBMC su dobijene iz krvi dvostrukih transgenih huCD3/huCD20 miševa; humane PBMC su dobijene iz krvi zdravih donora.
SLIKA 57B je grafikon koji pokazuje da CD20 TDB ne može da aktivira mišje T ćelije da iscrpljuju B ćelije bez ekspresije humanog CD3 kod humanih CD20 transgenih miševa. huCD20 transgeni miševi ili huCD20/CD3 dvostruko transgeni miševi su jednom intravenski tretirani antitelima kao što je naznačeno (10 mg/kg za rituksimab, 0,5 mg/kg za CD20 TDB i HER2 TDB). Slezine miševa su sakupljene na D7 (7 dana nakon tretmana antitelima). Kao pozitivna kontrola se koristi antihumano CD20 antitelo rituksimab. CD3/HER2 TDB se koristi kao negativna, izotipska kontrola.
SLIKA 57C je grafikon koji pokazuje da CD20 TDB može da aktivira mišje T ćelije koje eksprimiraju huCD3 kod humanih CD3/CD20 dvostruko transgenih miševa da potencijalno iscrpljuju mišje B ćelije koje eksprimiraju huCD20. huCD20 transgeni miševi ili huCD20/CD3 dvostruko transgeni miševi su jednom intravenski tretirani antitelima kao što je naznačeno (10 mg/kg za rituksimab, 0,5 mg/kg za CD20 TDB i HER2 TDB). Slezine miševa su sakupljene na D7 (7 dana nakon tretmana antitelima). CD3/HER2 TDB se koristi kao negativna, izotipska kontrola.
SLIKA 58A je niz grafikona studije vremenskog toka koji pokazuju da je lečenje sa CD20 TDB dovelo do produženog iscrpljivanja B ćelija do D15 (15 dana nakon doziranja). huCD20/huCD3 dvostruko transgeni miševi su jednom intravenski tretirani različitim dozama CD20 TDB. Prikupljena je krv miševa (D1, D8 i D15).
SLIKA 58B je grafikon koji pokazuje da je skoro potpuno iscrpljivanje B ćelija u slezini miša postignuto samo na D7 nakon jedne doze od 0,5 mg/kg, dok je niža doza od 0,05 mg/kg samo delimično dovela do iscrpljivanja B ćelija slezine. huCD20/CD3 dvostruko transgeni miševi su jednom intravenski tretirani različitim dozama CD20 TDB. Prikupljene su slezine (D7).
SLIKA 58C je grafikon koji pokazuje da je robusno iscrpljivanje B ćelija na D7 primećeno u krvotoku dvostruko transgenih huCD3/huCD20 miševa tretiranih sa CD20 TDB. huCD20/huCD3 dvostruko transgeni miševi su jednom intravenski tretirani sa 0,5 mg/kg CD20 TDB. Krv je prikupljena u D0-5 min (5 minuta nakon tretmana), D0-2h, D0-8h, D1, D2, D3 i D7. B ćelije koje eksprimiraju huCD20 su izmerene pomoću FACS.
SLIKA 58D je niz grafikona koji prikazuju aktivaciju T ćelija kod dvostruko transgenih huCD3/huCD20 miševa tretiranih sa CD20 TDB. Tretirani dvostruko transgeni huCD3/huCD20 miševi pokazali su do 80% povećanja broja CD8+T ćelija koje eksprimiraju humani CD3ε 2 sata nakon tretmana sa CD20 TDB, koji se vratio na početni nivo do D2 i D7 (gornji panel). Slično tome, broj CD4+ T ćelija koje eksprimiraju humani CD3ε se povećao za 80% 2 sata nakon tretmana sa CD20 TDB i nakon toga se vratio na početni nivo do D2.
Dvostruko transgeni huCD3/huCD20 miševi su jednom intravenski tretirani sa 0,5 mg/kg CD20 TDB. Krv je prikupljena u D0-5 min (5 minuta nakon tretmana), D0-2h, D0-8h, D1, D2, D3 i D7. CD4+ i CD8+ T ćelije koje eksprimiraju CD3εsu izmerene pomoću FACS.
SLIKA 59A je niz grafikona protočne citometrije koji pokazuju da CD20 TDB iscrpljuje B ćelije marginalne zone (MZB) podjednako efikasno kao i folikularne B ćelije (FOB) nakon primene TDB na dvostruko transgenim huCD3/huCD20 miševima. Dve dvostruko transgene životinje (levi, odnosno desni panel) tretirane su vehikulumom (gornji paneli) ili jednom intravenskom dozom od 0,5 mg/kg TDB (donji paneli). Slezine miševa su prikupljene na D7 i analizirane pomoću FACS.
SLIKA 59B-59E je niz grafikona koji pokazuju da CD20 TDB iscrpljuje B ćelije marginalne zone (MZB) (B) podjednako efikasno kao i folikularne B ćelije (FOB) (C) nakon jedne intravenske doze od 0,5 mg/kg TDB, zajedno sa aktivacijom CD8+ T ćelija (D) i proliferacijom CD8+ T ćelija (E) u slezini u naznačenim terminima. Slezine miševa su sakupljene na D1, D2, D3, D5, D7 i D14.
SLIKA 60A je grafikon koji pokazuje da su humanizovani NSG miševi tretirani sa 3 nedeljne doze CD20 TDB od 0,5 mg/kg (postavka sa ponovljenim dozama) pokazali iscrpljene nivoe B ćelija u krvi na D7, pri čemu B ćelije skoro uopšte nisu detektovane na D21. Humanizovani NSG miševi su intravenski tretirani sa 3 doze od 0,5 mg/kg CD20 TDB nedeljno. Krv je sakupljena na D-5 (5 dana pre tretmana), D7, D14 i D21. Broj mišjih B ćelija u krvi izmeren je pomoću FACS.
SLIKA 60B je grafikon koji pokazuje da je robusno iscrpljivanje B ćelija na D21 uočeno u slezini humanizovanih NSG miševa tretiranih pomoću CD20 TDB. Humanizovani NSG miševi su intravenski tretirani sa 3 doze od 0,5 mg/kg CD20 TDB nedeljno. Slezine su sakupljene na D21. Broj mišjih B ćelija u slezini izmeren je pomoću FACS.
SLIKA 60C je niz grafikona protočne citometrije koji pokazuju da se huCD8+ T ćelije proliferuju, a huCD19+ B ćelije su iscrpljene 7 dana nakon tretmana (D7) humanizovanih NSG miševa sa CD20 TDB. Humanizovani NSG miševi su tretirani vehikulumom ili sa 0,5 mg/kg CD20 TDB (2H7v16/UCHT1v9). Slezine humanizovanih NSG miševa koji su tretirani kontrolom i sa CD20 TDB sakupljene su na D7. B ćelije koje eksprimiraju huCD19 i T ćelije koje eksprimiraju huCD8 izmerene su pomoću FACS.
SLIKA 60D je grafikon koji pokazuje da su humanizovani NSG miševi tretirani sa 3 nedeljne doze CD20 TDB od 0,5 mg/kg (postavka sa ponovljenim dozama) pokazali do 10-struko povećanje broja CD8+T ćelija na D7, koje su se vratile na početni ili niži nivo do D14 i D21. Humanizovani NSG miševi su tretirani sa 3 doze od 0,5 mg/kg CD20 TDB nedeljno i.v.
2
putem. Krv je sakupljena na D-5 (5 dana pre tretmana), D7, D14 i D21. Broj mišjih CD8+T ćelija u krvi i aktivacija T ćelija izmereni su pomoću FACS.
SLIKA 60E je niz grafikona protočne citometrije koji prikazuju osnovne nivoe huCD20+ B ćelija (centralni paneli) i huCD8+ i huCD4+ T ćelija (desni paneli) iz 2 humanizovana NSG miša na osnovu FACS.
SLIKA 60F je niz grafikona koji prikazuju nivoe površinske ćelijske ekspresije huCD3εi CD20 na CD19+ B ćelijama (levo), CD8+ T ćelijama (centar) i CD4+ T ćelijama (desno) na osnovu FACS.
SLIKA 61A je grafikon koji pokazuje da je CD20 TDB potentan za ubijanje CLL B ćelija putem autolognih T ćelija. 200.000 PBMC je inkubirano sa različitim koncentracijama CD20 TDB tokom 48 sati u RPMI medijumu sa dodatkom 10% FBS. SLIKA 61B je grafikon koji pokazuje da je CD20 TDB potentan za indukovanje aktivacije autolognih T ćelija u prisustvu CLL B ćelija.200.000 PBMC je inkubirano sa različitim koncentracijama CD20 TDB tokom 48 sati u RPMI medijumu sa dodatkom 10% FBS.
SLIKA 61C je skup grafikona koji pokazuju da je broj T ćelija u tesnoj korelaciji sa ubijanjem CLL B ćelija ex vivo.200.000 PBMC je inkubirano sa 1000 ng/ml CD20 TDB tokom 48 sati, samostalno ili sa dodatnim CD8+T ćelijama prečišćenim od zdravog donora. Procenat CD19+CD5+B ćelija i CD8+T ćelija u CLL PBMC je 90/0,55 za uzorak A1645, 76/3,5 za A1957, 87/0,63 za A1978, 69/1,3 za A1980. Ubijanje ćelija, indukcija granzima B i aktivacija T ćelija su izmereni pomoću FACS kao što je opisano u nastavku.
SLIKA 62A je skup grafikona koji pokazuju da je aktivacija T ćelija (levo) nakon doza CD20 TDB od 0,1 mg/kg ili 0,5 mg/kg kod NSG miševa sa graftovanim CLL ćelijama leukemije u korelaciji sa snažnim iscrpljivanjem graftovanih CLL B ćelija (desno).
SLIKA 62B je skup imunohistohemijskih slika preseka slezine NSG miševa sa graftovanim CLL ćelijama leukemije, koje pokazuju da je mali broj B ćelija mogao da se detektuje nakon tretmana sa CD20 TDB. B ćelije i T ćelije su graftovane u NSG miševe kao što je opisano u nastavku. Miševi su jednom intravenski tretirani sa HER2 TDB i rituksimabom sa 0,5 mg/kg, CD20 TDB sa 0,1 i 0,5 mg/kg, i slezine su sakupljene za FACS analizu 14 dana nakon tretmana.
SLIKA 63 je grafikon koji prikazuje zapreminu tumora tokom vremena za Bjab graftovane tumore SCID miševa za grupu 1 (vehikulum: 20 mM histidin/acetat pH 5,5, 240 mM saharoza, 0,02% Tween 20); grupu 2 (CD20 TDB: 2H7v114/UCHT1.v9; 0,5 mg/kg); grupu 3 (vehikulum: 20 mM histidin/acetat pH 5,5, 240 mM saharoza, 0,02% Tween 20, PBMC); i grupu 4 (CD20 TDB: CD20 2H7v114/CD3 UCHT1.v9; 0,5 mg/kg, PBMC).
Efektorske ćelije su bile PBMC dobijene od zdravog ljudskog donora. Miševi su tretirani jednom nedeljno tokom dve nedelje.
SLIKA 64A je grafikon koji prikazuje relativni nivo ekspresije CD20 na Bjab, NALM-6, SC-1 i OCI-LY 19 ćelijama. B ćelije i T ćelije su graftovane u NSG miševe kao što je opisano u nastavku. Miševi su jednom intravenski tretirani sa HER2 TDB i rituksimabom sa 0,5 mg/kg, CD20 TDB sa 0,1 i 0,5 mg/kg, i slezine su sakupljene za IHC analizu 14 dana nakon tretmana.
SLIKA 64B je grafikon koji pokazuje da su rituksimab i CD20 TDB imali uporedivu delotvornost ubijanja Bjab ćelija in vitro, koje eksprimiraju visok nivo CD20 na svojoj ćelijskoj površini. PBMC izolovane od zdravog donora su iscrpljene od B ćelija i korišćene su kao efektorske ćelije u testu in vitro ubijanja ćelija. 20.000 B ćelija i 200.000 efektorskih ćelija inkubirano je sa različitom koncentracijom CD20 TDB ili rituksimaba tokom 24 sata. FACS je detektovao ekspresiju CD20 TDB.
SLIKA 64C je grafikon koji pokazuje da je CD20 TDB, ali ne i rituksimab, sposoban da ubije NALM-6, SC-1 i OCI-LY 19 ćelije, koje imaju relativno nizak nivo CD20 na svojoj ćelijskoj površini. PBMC izolovane od zdravog donora su iscrpljene od B ćelija i korišćene su kao efektorske ćelije u testu in vitro ubijanja ćelija.20.000 B ćelija i 200.000 efektorskih ćelija inkubirano je sa različitom koncentracijom CD20 TDB ili rituksimaba tokom 24 sata. FACS je detektovao ekspresiju CD20 TDB.
SLIKA 64D je grafikon koji prikazuje nivoe površinske ekspresije B ćelija neblokiranog CD20 antigena u funkciji koncentracije rituksimab-DANA na osnovu FACS. CD20/CD3 dvostruko transgeni miševi su tretirani jednom dozom vehikuluma ili rituksimab-DANA (10 mg/kg). Slezine su sakupljene 5 dana nakon tretmana.
SLIKE 65A i 65B su grafikoni koji pokazuju da CD20 TDB aktivno ubija B ćelije in vitro u prisustvu visokih nivoa rituksimaba (A) ili deksametazona (B). 200.000 PBMC izolovanih od zdravog donora prvo je inkubirano sa rituksimab-DANA u naznačenoj koncentraciji tokom 1 sata, zatim su dodati CD20 TDB i inkubirani tokom 24 sata. Za test deksametazona, ćelije su prethodno tretirane 1 µM deksametazonom preko noći pre dodavanja CD20 TDB. Ubijanje ćelija je izračunato kao što je opisano ispod.
SLIKA 66 je skup grafikona koji pokazuju da je CD20 TDB aktivan u iscrpljivanju B ćelija u krvi (levo) i slezini (desno) kod miševa prethodno tretiranih sa rituksimab-DANA. Za lečenje jednim agensom, huCD20/CD3 dvostruko transgeni miševi su jednom intravenski tretirani u naznačenoj dozi; za kombinovano lečenje, miševi su prvo intravenski tretirani sa rituksimab-DANA, a CD20 TDB je intravenski ubrizgan 30 minuta kasnije. Krv je sakupljena u D-7, D0-2h (2 sata nakon lečenja sa TDB) i D7; slezine su sakupljene u D7. Broj B ćelija je
2
izmeren pomoću FACS kao što je opisano u nastavku.
SLIKA 67A je skup grafikona koji prikazuju broj B ćelija (levo), CD4+ T ćelija (sredina) i CD8+ T ćelija (desno) u uzorcima krvi 3 cinomolgus majmuna pre i 7 dana nakon tretmana jednom intravenskom dozom od 1 mg/kg CD20 TDB. Tri cinomolgus majmuna su jednom intravenski tretirana sa 1 mg/kg CD20 TDB. Krv je prikupljena u D-7 (7 dana pre doziranja), D0-4h (4 sata nakon doziranja) i D7.
SLIKA 67B je skup grafikona koji prikazuju nivo B ćelija, CD4+ T ćelija i CD8+ T ćelija u slezini (levo), mandibularnim limfnim čvorovima (sredina) i mezenteričnim limfnim čvorovima (desno) 3 cinomolgus majmuna 7 dana nakon tretmana jednom intravenskom dozom od 1 mg/kg CD20 TDB. Tri cinomolgus majmuna su jednom intravenski tretirana sa 1 mg/kg CD20 TDB. Krv je prikupljena u D-7 (7 dana pre doziranja), D0-4h (4 sata nakon doziranja) i D7.
SLIKA 67C je skup grafikona koji prikazuju nivo B ćelija, CD4+ T ćelija i CD8+ T ćelija u slezini (levo), mandibularnim limfnim čvorovima (sredina) i mezenteričnim limfnim čvorovima (desno) 3 cinomolgus majmuna pre tretmana jednom intravenskom dozom od 1 mg/kg CD20 TDB. Tri cinomolgus majmuna su jednom intravenski tretirana sa 1 mg/kg CD20 TDB. Krv je prikupljena u D-7 (7 dana pre doziranja), D0-4h (4 sata nakon doziranja) i D7.
SLIKA 67D je skup grafikona koji prikazuju početne nivoe B ćelija i CD4+ i CD8+ T ćelija kao procenat ukupnih limfocita otkrivenih u slezini (levo) i mandibularnim limfnim čvorovima (desno) kod životinja koje su tretirane vehikulumom kao kontrolom.
SLIKA 68A je skup grafikona koji pokazuju koncentraciju CD20 TDB u serumu kod prikupljenih uzoraka krvi i seruma četiri cinomolgus majmuna koji su tretirani 4 puta nedeljno sa 1 mg/kg CD20 TDB putem intravenske primene.
SLIKA 68B je skup grafikona koji prikazuju koncentraciju CD20 TDB u uzrcima seruma koji su prikupljeni od životinja opisanih na slikama 65 i 66A. Prikazana je srednja vrednost ± s.d.
SLIKA 69A je histogram koji pokazuje ekspresiju PD-L1 na A20-huCD20 ćelijama A20-huCD20 singenskih Balb/C miševa, na osnovu protočne citometrije.
SLIKA 69B je grafikon koji prikazuje relativnu zapreminu tumora tokom vremena za grupu 1 (vehikulum); grupu 2 (CD20 TDB sa 0,5 mg/kg); grupu 3 (anti-PD-L1 antitelo sa 10 mg/kg); i grupu 4 (CD20 TDB sa 0,5 mg/kg anti-PD-L1 antitelo).
SLIKA 70 je grafikon koji prikazuje krive vezivanja za svako od tri testirana FcRH5 TDB ispitana na in vitro vezivanje za CD8+ T ćelije koje eksprimiraju CD3.
SLIKA 71A je grafikon koji prikazuje procenat ubijanja MOLP-2 ciljnih ćelija u
2
funkciji koncentracije FcRH5 TDB, sa CD8+ T ćelijama prečišćenim od humanih PBMC od donora br.1.
SLIKA 71B je grafikon koji prikazuje procenat ubijanja MOLP-2 ciljnih ćelija u funkciji koncentracije FcRH5 TDB, sa CD8+ T ćelijama prečišćenim od humanih PBMC od donora br.2.
SLIKA 72A je grafikon koji prikazuje procenat CD8+CD69+ T ćelija u funkciji koncentracije FcRH5 TDB, na osnovu FACS analize. Ciljne ćelije su bile MOLP-2, a CD8+ T ćelije su prečišćene od donora br.1.
SLIKA 72B je grafikon koji prikazuje procenat CD8+CD107a+ T ćelija u funkciji koncentracije FcRH5 TDB, na osnovu FACS analize. Ciljne ćelije su bile MOLP-2, a CD8+ T ćelije su prečišćene od donora br.1.
SLIKA 72C je grafikon koji prikazuje procenat CD8+CD69+ T ćelija u funkciji koncentracije FcRH5 TDB, na osnovu FACS analize. Ciljne ćelije su bile MOLP-2, a CD8+ T ćelije su prečišćene od donora br.2.
SLIKA 72D je grafikon koji prikazuje procenat CD8+CD107a+ T ćelija u funkciji koncentracije FcRH5 TDB, na osnovu FACS analize. Ciljne ćelije su bile MOLP-2, a CD8+ T ćelije su prečišćene od donora br.2.
SLIKA 73 je skup grafikona koji prikazuju krive vezivanja za svako od tri HER2 TDB testirana na in vitro vezivanje za SKBR3 ćelije koje eksprimiraju Her2 (gore) i CD8+ T ćelije koje eksprimiraju CD3 (dole).
SLIKA 74A je grafikon koji prikazuje krive vezivanja za trastuzumab (dvovalentan), trastuzumab (Fab) i HER2 TDB (UCHT1v9/hu4D5) (bispecifičan) za in vitro vezivanje za SKBR3 ćelije koje eksprimiraju Her2.
SLIKA 74B je grafikon koji prikazuje procenat vijabilnih SKBR3 ćelija u funkciji koncentracije trastuzumaba (dvovalentan), trastuzumaba (Fab) i HER2 TDB (UCHT1v9/hu4D5) (bispecifičan), na osnovu testa luminescentne ćelijske vijabilnosti CELLTITERGLO<®>.
SLIKA 74C je grafikon koji prikazuje procenat ubijanja ciljnih ćelija SKBR posredovanog ćelijskom citotoksičnošću zavisnom od antitela (ADCC) u prisustvu trastuzumaba (T-mab), trastuzumaba proizvedenog u E. coli (T-mab E. coli) i HER2 TDB (UCHT1v9/hu4D5), na osnovu procene oslobađanja laktat dehidrogenaze (LDH) iz liziranih ćelija.
SLIKA 75 je grafikon koji prikazuje procenat ubijanja ciljnih ćelija SKBR3 u funkciji koncentracije HER2 TDB (hu4D5-TDB, hu4D5.91A-TDB i hu4D5.Y100A-TDB).
2
SLIKA 76A je niz panela. Gornji panel je prikaz kristalne strukture ekstracelularnog domena (ECD) HER2 vezanog za hu4D5 Fab (trastuzumab), 2C4 Fab (pertuzumab) i 7C2. Donji panel je trakasta struktura CD3ε vezanog za 2C11, 38E4v1 i 40G5c.
SLIKA 76B je tabela koja prikazuje afinitete vezivanja, predstavljene konstantom disocijacije KD(nM), HER2-TDB za tri različita kraka HER2: hu4D5, 2C4 i 7C2. Donji desni panel je tabela koja pokazuje afinitete vezivanja, predstavljene konstantom disocijacije KD(nM), HER2-TDB za tri različita kraka CD3ε: 38E4v1, 40G5c i 2C11.
SLIKA 76C je grafikon koji prikazuje procenat ubijanja ciljnih ćelija MCF7 koje eksprimiraju HER2 u funkciji koncentracije HER2-TDB (hu4D5-TDB, 2C4-TDB i 7C2-TDB). Citotoksičnost je izmerena na osnovu oslobađanja laktat dehidrogenaze (LDH).
SLIKA 77 je grafikon koji pokazuje da su krakovi HER2 hu4D5 i 2C4 potentni medijatori ubijanja ćelija kao što je prikazano maksimalnim procentom ubijanja ciljnih ćelija SKBR3 koje je postignuto tretiranjem sledećim varijantama HER2-TDB: hu4D5-38E4v1, hu4D5-40G5c, 2C4-38E4v1, 2C4-40G5c, 7C2-38E4v1 i 7C2-40G5c.
SLIKA 78 je niz grafikona koji prikazuju potentnost varijanti HER2-TDB za ubijanje ćelijskih linija SKBR3 (levo) i MCF7 (desno) koje eksprimiraju HER2 na način zavisan od doze, sa vrednostima EC50 za ubijanje ciljnih ćelija (pM).
SLIKA 79 je niz grafikona koji prikazuju procenat ubijanja ciljnih ćelija SKBR3 koje eksprimiraju HER2 za različite TDB sa krakovima HER2 (hu4D5, 2C4 i 7C2) uparenim sa krakovima CD3 sa visokim afinitetom (38E4v1) ili niskim afinitetom (40G5c) u funkciji koncentracije TDB (ng/ml).
SLIKA 80 je niz panela. Panel sa leve strane prikazuje potentnost varijanti HER2-TDB (hu4D5-38E4v1, 2C4-38E4v1, 7C2-38E4v1; hu4D5-40G5c, 2C4-40G5c, 7C2-40G5c) za ubijanje ćelijskih linija SKBR3 koje eksprimiraju HER2 i MCF7 koje eksprimiraju HER2 na način zavisan od doze, sa vrednostima EC50 za ubijanje ciljnih ćelija (pM). Panel sa desne strane je tabela sa odnosom EC50 datih varijanti HER2-TDB u MCF7 u odnosu na ciljne ćelije SKBR3 za tri eksperimenta.
SLIKA 81 je niz panela. Gornji panel prikazuje tabelu u kojoj su navedene varijante hu4D5 HER2 kraka (hu4D5v7, hu4D5v5, hu4D5v10, hu4D5v31, hu4D5.Y100A) za HER2-TDB (krak 40G5c CD3) i odgovarajuća vrednost EC50 (ng/ml) za ubijanje ciljnih ćelija SKBR3, afinitet vezivanja HER2 (KD, nM) pored odnosa afiniteta vezivanja HER2 KDi vrednosti EC50 za ubijanje ciljnih ćelija SKBR3 za varijante hu4D5 u odnosu na hu4D5. Donji panel je grafikon koji prikazuje korelaciju između odnosa SKBR3 EC50 za varijante hu4D5 HER2-TDB (hu4D5, hu4D5v7, hu4D5v5, hu4D5v10 i hu4D5v31) i odnosa relativnog KDza
2
varijante hu4D5 HER2-TDB.
SLIKA 82 je niz grafikona koji prikazuju procenat ubijanja ciljnih ćelija SKBR3 i MCF7 u funkciji koncentracije sledećih varijanti HER2-TDB: hu4D5-40G5c (gore levo), hu4D5v7-40G5c (gore centralno), hu4D5v5-40G5c (gore desno), hu4D5v10-40G5c (dole levo), hu4D5v31-40G5c (dole centralno), hu4D5.Y100A-40G5c (dole desno).
SLIKA 83 je niz grafikona. Grafikon sa leve strane prikazuje procenat ubijanja ciljnih ćelija u funkciji koncentracije (µg/ml) dvovalentnih monospecifičnih antitela koja blokiraju HER2 specifičnih za predviđeni HER2 krak HER2-TDB. (Antitela koja blokiraju HER2: dvovalentna monospecifična antitela na hu4D5, 2C4 i 7C2. HER2-TDB: hu4D5-40G5c, 2C4-40G5c i 7C2-38E4v1 pri fiksnoj koncentraciji: 10 ng/ml.) Desni grafikon prikazuje procenat vijabilnih ćelija u funkciji koncentracije HER2 antitela (hu4D5) trastuzumaba u prisustvu i odsustvu HER2-TDB hu4D5-40G5c.
SLIKA 84 je niz panela. Gornji panel je tabela koja prikazuje reaktivnost varijanti HER2 kraka sa HER2 na osnovu različitih testova vezivanja, pored reaktivnosti HER2 klonova sa hu4D5 antitelom trastuzumabom. Donji panel je grafikon koji prikazuje procenat ubijanja ciljnih ćelija u funkciji koncentracije (pM) HER2 bispecifičnog Fab za date klonove (hu4D5, 3H4 i 2H11). Vrednosti EC50 su date za svaki klon u pM.
SLIKA 85 je tabela koja pruža informacije o afinitetu i reaktivnosti za varijante HER2-TDB CD3 kraka (38E4v1, 38E4, SP34, 40G5c i 2C11).
SLIKA 86 je grafikon koji prikazuje ubijanje ciljnih ćelija CT26 koje eksprimiraju HER2 u funkciji koncentracije (ng/ml) varijanti HER2-TDB (hu4D5-2C11, hu4D5-SP34, 7C2-2C11 i 2C4-2C11). Efektorske ćelije: T ćelije dobijene od CD3-TG
SLIKA 87A je grafikon koji prikazuje zapreminu tumora (mm<3>) izmerenu tokom vremena (0-5 dana) kod životinja tretiranih vehikulumom ili sa HER2-TDB (0,5 mg/kg).
SLIKA 87B je niz grafikona. Gornji levi grafikon prikazuje procenat perifernih CD45+ ćelija na 5 ćelija detektovanih 6. dana nakon tretmana vehikulumom ili sa HER2-TDB (0,5 mg/kg). Gornji desni grafikon prikazuje procenat perifernih CD45+ ćelija koje su CD8+ ćelije detektovane 6. dana nakon tretmana vehikulumom ili sa HER2-TDB (0,5 mg/kg). Donji levi grafikon prikazuje procenat perifernih CD45+ ćelija koje su CD4+ detektovane 6. dana nakon tretmana vehikulumom ili sa HER2-TDB (0,5 mg/kg). Donji desni grafikon prikazuje procenat perifernih CD8+ ćelija koje su IFN+ detektovane 6. dana nakon tretmana vehikulumom ili sa HER2-TDB (0,5 mg/kg).
SLIKA 88A je niz grafikona. Gornji grafikon prikazuje dijagram vodopada procentualne promene zapremine tumora kod životinja tretiranih vehikulumom ili varijantom
2
HER2-TDB (hu4D5-SP34 ili hu4D5-2C11; 0,5 mg/kg; i.v., nedeljno, 5 nedelja). Donji grafikon prikazuje dijagram vodopada procentualne promene zapremine tumora kod životinja tretiranih varijantom HER2-TDB (2C4-38E4; 0,5 mg/kg; i.v., nedeljno, 5 nedelja).
SLIKA 88B je niz grafikona. Gornji grafikon prikazuje zapreminu tumora kao procenat početne zapremine u funkciji vremena (dana) za životinje tretirane vehikulumom ili sa HER2-TDB (hu4D5-SP34). Donji grafikon prikazuje zapreminu tumora kao procenat početne zapremine u funkciji vremena (dana) za životinje tretirane vehikulom ili sa HER2-TDB (hu4D5-2C11). (HER2-TDB: 0,5 mg/kg; i.v., nedeljno, 5 nedelja).
SLIKA 89 je grafikon koji prikazuje procenat CD8+CD107a+ T ćelija u funkciji koncentracije hu4D5 HER2 TDB (hu4D5-TDB, hu4D5.91A-TDB i hu4D5.Y100A-TDB), na osnovu FACS analize. Ciljne ćelije su bile SKBR3 ćelije; efektorske ćelije su bile CD8+ T ćelije; odnos efektorske ćelije: ciljne ćelije = 3:1.
SLIKA 90A je grafikon koji prikazuje procenat ubijanja ciljnih ćelija SKBR3 u funkciji koncentracije HER2 TDB (UCHT1v9/hu4D5 i SP34/hu4D5).
SLIKA 90B je grafikon koji prikazuje procenat ubijanja ciljnih ćelija SKBR3 u funkciji koncentracije HER2 TDB (SP34/hu4D5, 38E4c/hu4D5 i 40G5c/hu4D5).
SLIKA 90C je grafikon koji prikazuje procenat ubijanja ciljnih ćelija SKBR3 u funkciji koncentracije HER2 TDB (SP34/hu4D5, 38E4c/hu4D5 i 40G5c/hu4D5).
SLIKA 91A je grafikon koji prikazuje krivu vezivanja za svako od tri HER2-TDB (SP34/hu4D5, 38E4c/hu4D5 i 40G5c/hu4D5) testirana na in vitro vezivanje za CD8+ T ćelije koje eksprimiraju CD3, na osnovu FACS analize.
SLIKA 91B je grafikon koji prikazuje procenat CD8+CD69+ T ćelija u funkciji koncentracije HER2-TDB (SP34/hu4D5, 38E4c/hu4D5 i 40G5c/hu4D5).
SLIKA 92A je grafikon koji prikazuje krivu vezivanja za dva HER2 TDB (38E4c/hu4D5 i 38E4/hu4D5) testirana na in vitro vezivanje za CD8+ T ćelije koje eksprimiraju CD3, na osnovu FACS analize.
SLIKA 92B je grafikon koji prikazuje krivu vezivanja za dva HER2 TDB (38E4c/hu4D5 i 38E4/hu4D5) testirana na in vitro vezivanje za SKBR3 ćelije koje eksprimiraju Her2, na osnovu FACS analize.
SLIKA 92C je grafikon koji prikazuje procenat ubijanja ciljnih ćelija SKBR3 u funkciji koncentracije HER2 TDB (38E4c/hu4D5 i 38E4/hu4D5) na osnovu FACS analize. Efektorske ćelije su bile humane CD8+ T ćelije; odnos efektorske ćelije : ciljne ćelije = 3:1.
SLIKA 92D je grafikon koji prikazuje procenat CD8+CD69+ T ćelija u funkciji koncentracije HER2-TDB (38E4c/hu4D5 i 38E4/hu4D5).
SLIKA 93A je grafikon koji prikazuje procenat CD8+CD69+granzim B+ T ćelija u funkciji koncentracije HER2 TDB (UCHT1v9/hu4D5), na osnovu FACS analize. Ciljne ćelije su bile SKBR3 ćelije; efektorske ćelije su bile CD8+ T ćelije; odnos efektorske ćelije : ciljne ćelije = 3:1.
SLIKA 93B je niz grafikona koji prikazuju HER2 TDB (UCHT1v9/hu4D5) T ćelijski posredovanu egzocitozu ciljnih ćelijskih granula detektovanu ELISA testom za perforin i granzime A i B, i procenat ubijanja ciljnih ćelija na osnovu procene oslobađanja LDH. Ciljne ćelije su bile SKBR3 ćelije; efektorske ćelije su bile PBMC; odnos efektorske ćelije : ciljne ćelije = 30:1.
SLIKA 93C je niz grafikona koji prikazuju HER2 TDB (UCHT1v9/hu4D5) T ćelijski posredovanu apoptozu ciljnih ćelija izmerenu na osnovu aktivnosti kaspaze-3 i kaspaze-7 u testu CASPASE-GLO<®>3/7, apoptoze u ELISA<plus>testu detekcije ćelijske smrti i oslobađanja LDH. Ciljne ćelije su bile SKBR3 ćelije; efektorske ćelije su bile PBMC; odnos efektorske ćelije : ciljne ćelije = 10:1.
SLIKA 93D je slika vestern blot analize (gore) koja prikazuje ekspresiju Her2 u 3T3 transficiranim ćelijama i grafikon (dole) koji prikazuje procenat ubijanja ciljnih ćelija od strane aktiviranih T ćelija u funkciji koncentracije HER2 TDB (UCHT1v9/hu4D5) na osnovu oslobađanja LDH. Ciljne ćelije su bile 3T3-vektor i 3T3-HER2; efektorske ćelije su bile PBMC; odnos efektorske ćelije : ciljne ćelije = 10:1.
SLIKA 93E je grafikon koji prikazuje procenat ubijanja ciljnih ćelija BT474 u funkciji koncentracije HER2 TDB (UCHT1v9/hu4D5) u prisustvu Fab trastuzumaba (T-Fab) ili rastvorljivog HER2 ekstracelularnog domena (ECD) na osnovu oslobađanja LDH. Efektorske ćelije su bile CD8+ T ćelije; odnos efektorske ćelije : ciljne ćelije = 5:1.
SLIKA 93F je grafikon koji prikazuje procenat ubijanja ciljnih ćelija SKBR3 u funkciji koncentracije HER2 TDB (UCHT1v9/hu4D5) nakon iscrpljivanja CD3+ ćelija iz populacije efektorskih ćelija PBMC. Odnos efektorske ćelije : ciljne ćelije = 20:1.
SLIKA 94A je niz grafikona koji prikazuju procenat CD8+CD69+ T ćelija (levo) i CD8+ CD107a T ćelija (sredina) u funkciji koncentracije HER2 TDB (UCHT1v9/hu4D5), na osnovu FACS analize, i procenat ubijanja ciljnih ćelija SKBR3 u funkciji koncentracije HER2 TDB (UCHT1v9/hu4D5) (desno). Ciljne ćelije su bile SKBR3 ćelije; efektorske ćelije su bile CD8+ T ćelije; odnos efektorske ćelije : ciljne ćelije = 3:1.
SLIKA 94B je niz grafikona koji prikazuju procenat ubijanja ciljnih ćelija BT474 u funkciji koncentracije HER2 TDB (UCHT1v9/hu4D5) (levo) i procenat CD8+CD69+ granzim B+ T ćelija u funkciji koncentracije HER2 TDB (UCHT1v9/hu4D5) (desno), na osnovu FACS
1
analize. Ciljne ćelije su bile BT474 ćelije; efektorske ćelije su bile CD8+ T ćelije; odnos efektorske ćelije : ciljne ćelije kao što je naznačeno.
SLIKA 95A je niz histograma koji prikazuju ekspresiju CFSE u CD8+ T ćelijama u prisustvu ciljnih ćelija SKBR3 i/ili HER2 TDB (UCHT1v9/hu4D5).
SLIKA 95B je grafikon koji prikazuje obim promene broja CD8+ ćelija u funkciji vremena nakon inkubacije sa SKBR3 ciljnim ćelijama i HER2 TDB (UCHT1v9/hu4D5), na osnovu FACS analize.
SLIKA 95C je niz grafikona koji prikazuju obim promene broja CD8+ ćelija u funkciji vremena nakon inkubacije sa SKBR3 ciljnim ćelijama, HER2 TDB (UCHT1v9/hu4D5) i 20 ng/ml IL-2, na osnovu FACS analize.
SLIKA 96A je slika vestern blot analize koja pokazuje nivo ekspresije Her2 u panelu humanih ćelijskih linija tumora.
SLIKA 96B je grafikon koji prikazuje procenat ubijanja ciljnih ćelija u funkciji koncentracije HER2 TDB (UCHT1v9/hu4D5) na osnovu oslobađanja LDH. Ciljne ćelije su bile BJAB, MDA435, MDA231, MCF7, MDA453, SKBR3 i BT474; efektorske ćelije su bile PBMC; odnos efektorske ćelije : ciljne ćelije = 25:1.
SLIKA 96C je grafikon koji prikazuje procenat ubijanja ciljnih ćelija u funkciji koncentracije HER2 TDB (UCHT1v9/hu4D5) na osnovu FACS analize. Ciljne ćelije su bile MCF7 i SKBR3; efektorske ćelije su bile PBMC; odnos efektorske ćelije : ciljne ćelije = 20:1.
SLIKA 96D je grafikon koji prikazuje procenat ubijanja ciljnih ćelija u funkciji koncentracije HER2 TDB (UCHT1v9/hu4D5) na osnovu FACS analize. Ciljne ćelije su bile BJAB i SKBR3; efektorske ćelije su bile PBMC; odnos efektorske ćelije : ciljne ćelije = 20:1.
SLIKA 96E je tabela koja prikazuje broj HER2 kopija za panel ciljnih ćelija i za svaku, HER2 TDB EC50 i procenat zauzetosti HER2 pri toj koncentraciji. Ciljne ćelije su MDA435, MDA231, MCF7, MDA453, BT474 i SKBR3.
SLIKA 97A je grafikon koji prikazuje procenat ubijanja ciljnih ćelija u funkciji koncentracije HER2 TDB (UCHT1v9/hu4D5) na osnovu oslobađanja LDH. Ciljne ćelije su bile SKBR3, HCC1569, KPL4, HCC202, JIMT1 i CALU3; efektorske ćelije su bile PBMC; odnos efektorske ćelije : ciljne ćelije = 10:1.
SLIKA 97B je grafikon koji prikazuje procenat vijabilnih ciljnih ćelija u funkciji koncentracije trastuzumab emtanzina (T-DM1) na osnovu luminescentnog testa ćelijske vijabilnosti CELLTITERGLO<®>. Ciljne ćelije su bile matične BT474-M1 i BT474-M1 otporne na T-DM1; efektorske ćelije su bile CD8+ T ćelije; odnos efektorske ćelije : ciljne ćelije = 3:1.
SLIKA 97C je grafikon koji prikazuje procenat vijabilnih ciljnih ćelija u funkciji
2
koncentracije HER2 TDB (UCHT1v9/hu4D5) na osnovu FACS analize. Ciljne ćelije su bile matične BT474-M1 i BT474-M1 otporne na T-DM1; efektorske ćelije su bile CD8+ T ćelije; odnos efektorske ćelije : ciljne ćelije = 3:1.
SLIKA 98 je grafikon i tabela koja prikazuje farmakokinetiku (PK) HER2 TDB (UCHT1v9/hu4D5) kod pacova tipa Sprag-Doli na osnovu ELISA testa.
SLIKA 99A je grafikon koji prikazuje relativnu zapreminu tumora tokom vremena za grupu 1 (vehikulum sa 0,5 mg/kg); grupu 2 (PBMC(1) vehikulum sa 0,5 mg/kg); grupu 3 (PBMC(1) HER2 TDB (UCHT1v9/hu4D5) sa 0,5 mg/kg); grupu 4 (PBMC(2) vehikulum sa 0,5 mg/kg); i grupu 5 (PBMC(2) HER2 TDB (UCHT1v9/hu4D5) sa 0,5 mg/kg).
SLIKA 99B je grafikon koji prikazuje procenat promene zapremine tumora tokom vremena za grupu 1 (vehikulum sa 0,5 mg/kg); i grupu 2 (HER2 TDB (hu4D5/2C11) sa 0,5 mg/kg).
SLIKA 99C je histogram koji pokazuje relativni procenat promene zapremine tumora tokom vremena za grupu 1 (vehikulum sa 0,5 mg/kg); i grupu 2 (HER2 TDB (hu4D5/2C11) sa 0,5 mg/kg).
SLIKA 99D je grafikon koji prikazuje relativnu zapreminu tumora tokom vremena za grupu 1 (vehikulum sa 0,5 mg/kg); i grupu 2 (HER2 TDB (hu4D5/2C11) sa 0,5 mg/kg). Ispitanici sa odgovorom su uključivali tumore koji su bili veći od 1000 mm<3>na početku lečenja.
SLIKA 99E je grafikon koji prikazuje procenat promene zapremine tumora tokom vremena za grupu 1 (kontrolni HER2 TDB sa CD3 krakom (hu4D5/SP34) sa 0,5 mg/kg); i grupu 2 (kontrolni TDB (2C11) sa 0,5 mg/kg).
SLIKA 99F je grafikon koji prikazuje relativnu zapreminu tumora tokom vremena za grupu 1 (vehikulum sa 0,5 mg/kg); i grupu 2 (HER2 TDB (hu4D5/SP34) sa 0,5 mg/kg).
SLIKA 99G je grafikon koji prikazuje relativnu zapreminu tumora tokom vremena za grupu 1 (vehikulum sa 0,5 mg/kg); grupu 2 (HER2 TDB (hu4D5/2C11) sa 0,5 mg/kg); grupu 3 (kontrolni TDB (2C11) sa 0,5 mg/kg); i grupu 4 (T-DM1 sa 15 mg/kg).
SLIKA 100A je grafikon koji prikazuje relativnu zapreminu tumora tokom vremena za grupu 1 (bez tretmana); grupu 2 (HER2 TDB (UCHT1v9/hu4D5) sa 0,5 mg/kg).
SLIKA 100B je grafikon koji prikazuje relativnu zapreminu tumora tokom vremena za grupu 1 (vehikulum sa 0,5 mg/kg); grupu 2 (PBMC(3) vehikulum sa 0,5 mg/kg); i grupu 3 (PBMC(3) kontrolni TDB (2C11) sa 0,5 mg/kg).
SLIKA 101A je grafikon koji prikazuje afinitet vezivanja za CD3-UCHT1 antitelo testirano na in vitro vezivanje za humani CD3 na humanim T ćelijama, CD3 TG T ćelijama i BALB/c T ćelijama, na osnovu FACS analize.
SLIKA 101B je grafikon koji prikazuje afinitet vezivanja za CD3-2C11 antitelo testirano na in vitro vezivanje za mišji CD3 na CD3 TG T ćelijama i BALB/c T ćelijama, na osnovu FACS analize.
SLIKA 102A je grafikon koji prikazuje procenat ubijanja CT26-HER2 ciljnih ćelija u funkciji koncentracije HER2 TDB (UCHT1v9/hu4D5), na osnovu FACS analize. Efektorske ćelije su bile izolovane T-ćelije iz ljudske periferne krvi, huCD3 transgene T-ćelije slezine i BALB/c T-ćelije slezine.
SLIKA 102B je grafikon koji prikazuje procenat ubijanja CT26-HER2 ciljnih ćelija u funkciji koncentracije HER2 TDB (hu4D5/2C11), na osnovu FACS analize. Efektorske ćelije su bile izolovane T-ćelije iz ljudske periferne krvi, huCD3 transgene T-ćelije slezine i BALB/c T-ćelije slezine.
SLIKA 103 je grafikon koji prikazuje relativnu zapreminu tumora tokom vremena za grupu 1 (vehikulum sa 0,5 mg/kg); i grupu 2 (HER2 TDB (hu4D5/SP34) sa 0,5 mg/kg).
SLIKA 104 je grafikon koji prikazuje krive vezivanja za svako od tri LYPD1 TDB testirana na in vitro vezivanje za CD8+ T ćelije koje eksprimiraju CD3.
SLIKA 105 je grafikon koji prikazuje procenat ubijanja OVCAR3.Luc ciljnih ćelija u funkciji koncentracije LYPD1 TDB.
SLIKA 106 je skup grafikona koji prikazuju procenat CD8+CD69+ (levo) i CD8+CD25+ (desno) T ćelija u funkciji koncentracije LYPD1 TDB, na osnovu FACS analize. Ciljne ćelije su bile OVCAR3.Luc ćelije; odnos efektorske ćelije : ciljne ćelije = 3:1.
SLIKA 107 prikazuje aminokiselinske sekvence varijabilnog domena lakog lanca (gore) i varijabilnog domena teškog lanca (dole) anti-RET antitela 41205.v6.
SLIKA 108A je grafikon koji prikazuje zapreminu tumora (mm<3>) u funkciji vremena (dani) za grupu 1 (vehikulum, qwx3, i.v.; n=9); grupu 2 (CD20 TDB (2H7-mu2C11), 0,5 mg/kg, qwx3, i.v.; n=9); grupu 3 (anti-PD1 (mu8F11 DANA), 10 mg/kg, tiwx3, i.p.; n=9); i grupu 4 (anti-PD1 (mu8F11 DANA), 10 mg/kg, tiwx3, IP+ CD20 TDB (2H7-mu2C11), 0,5 mg/kg, qwx3, i.v.; n=9).
SLIKA 108B je grafikon koji prikazuje zapreminu tumora (mm<3>) u funkciji vremena (dani) za grupu 1 (vehikulum, qwx3, i.v.; n=9); grupu 2 (CD20 TDB (2H7-mu2C11), 0,5 mg/kg, qwx3, i.v.; n=9); grupu 3 (anti-PD1 (mu8F11 DANA), 10 mg/kg, tiwx3, i.p.; n=9); i grupu 4 (anti-PD1 (mu8F11 DANA), 10 mg/kg, tiwx3, IP+ CD20 TDB (2H7-mu2C11), 0,5 mg/kg, qwx3, i.v.; n=9). Podebljana puna linija predstavlja postavljenu zapreminu tumora za navedenu grupu.
4
DETALJAN OPIS OTELOTVORENJA PRONALASKA
I. DEFINICIJE
Termin „oko“ koji se ovde koristi se odnosi na uobičajeni opseg grešaka za odgovarajuću vrednost dobro poznatu stručnjaku u ovom tehničkom području. Upotreba reči „oko” za vrednosti ili parametre u ovom dokumentu obuhvata (i opisuje) otelotvorenja koja se odnose na tu vrednost ili parametar.
„Akceptorski humani okvir“ je za ove svrhe okvir koji sadrži aminokiselinske sekvence okvira varijabilnog domena lakog lanca (VL) ili varijabilnog domena teškog lanca (VH) dobijenog od okvira humanog imunoglobulina ili okvira humanog konsenzusa, kao što je definisano dole. Akceptorski humani okvir „dobijen od“ okvira humanog imunoglobulina ili okvira humanog konsenzusa može da obuhvati iste aminokiselinske sekvence kao što su njihove, ili može da sadrži izmene u sekvenci aminokiselina. U nekim otelotvorenjima, broj aminokiselinskih izmena je 10 ili manje, 9 ili manje, 8 ili manje, 7 ili manje, 6 ili manje, 5 ili manje, 4 ili manje, 3 ili manje, ili 2 ili manje. U nekim otelotvorenjima, VL humani akceptorski okvir je po sekvenci identičan sekvenci VL okvira humanog imunoglobulina ili humanog okvira konsenzusa.
„Afinitet“ se odnosi na zbir jačine ukupnih nekovalentnih interakcija između jednog mesta vezivanja molekula (npr. antitela) i njegovog partnera u vezivanju (npr. antigena). Ukoliko nije drugačije naznačeno, kao što je ovde upotrebljeno, „afinitet vezivanja“ se odnosi na suštinski afinitet prema vezivanju koji odražava 1:1 interakciju između članova vezujućeg para (npr. antitela i antigena). Afinitet molekula X prema svom partneru Y može generalno da se predstavi putem konstante disocijacije (Kd). Afinitet može da se izmeri uobičajenim postupcima poznatim u struci, uključujući one opisane u ovom dokumentu. Specifična otelotvorenja data kao ilustracija i primer za merenje afiniteta vezivanja opisana su u nastavku.
Termin „afinitetno zrelo” antitelo se odnosi na antitelo sa jednom ili više izmena u jednom ili više hipervarijabilnih regiona (HVR), u poređenju sa matičnim antitelom koje nema takve izmene, pri čemu takve izmene dovode do poboljšanja afiniteta antitela prema antigenu.
Izraz „anti-CD3 antitelo” i „antitelo koje se vezuje za CD3” se odnosi na antitelo koje je sposobno da veže CD3 sa dovoljnim afinitetom, na takav način da antitelo bude korisno kao dijagnostički i/ili terapeutski agens za ciljanje CD3. U jednom otelotvorenju, obim vezivanja anti-CD3 antitela za nepovezani protein koji nije CD3 je manji od oko 10% od vezivanja antitela za CD3, kao što je izmereno, npr. radioimunotestom (RIA). U nekim otelotvorenjima, antitelo koje se vezuje za CD3 ima konstantu disocijacije (Kd) ≤1 μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0,1 nM, ≤ 0,01 nM ili ≤ 0,001 nM (npr.10<-8>M ili manje, npr. od 10<-8>M do 10<-13>M, npr. od 10<-9>M do 10<-13>M). U određenim aspektima, anti-CD3 antitelo se vezuje za epitop CD3 koji je konzerviran između CD3 različitih vrsta.
Termin „antitelo“ ovde je upotrebljen u najširem smislu i obuhvata različite strukture antitela uključujući, bez ograničenja, monoklonska antitela, poliklonska antitela, multispecifična antitela (npr. bispecifična antitela) i fragmente antitela, dokle god oni pokazuju željenu aktivnost vezivanja za antigen.
„Fragment antitela“ ukazuje na molekul koji nije netaknuto antitelo, a koji sadrži deo netaknutog antitela koje vezuje antigen za koji se vezuje netaknuto antitelo. Primeri za fragmente antitela uključuju, ali se ne ograničavaju na Fv, Fab, Fab', Fab’-SH,F(ab')2; dijatela; linearna antitela; molekule antitela sa jednim lancem (npr. scFv); i multispecifična antitela nastala od fragmenata antitela.
Pod „vezujućim domenom” se podrazumeva deo jedinjenja ili molekul koji se specifično vezuje za ciljani epitop, antigen, ligand ili receptor. Vezujući domeni uključuju, bez ograničenja, antitela (npr. monoklonska, poliklonska, rekombinantna, humanizovana i himerna antitela), fragmente antitela ili njihove delove (npr. Fab fragmenti, Fab'2, scFv antitela, SMIP, domeni antitela, dijatela, minitela, scFv-Fc, afitela, nanotela i VH i/ili VL domeni antitela), receptore, ligande, aptamere i druge molekule koji imaju identifikovanog partnera u vezivanju.
„Hemoterapeutski agens“” je hemijsko jedinjenje koje je od koristi u lečenju kancera. Primeri za hemoterapeutske agense uključuju alkilujuće agense kao što je tiotepa i ciklosfosfamid (CYTOXAN<®>); alkil sulfonate kao što je busulfan, improsulfan i piposulfan; aziridine kao što je benzodopa, karbokvon, meturedopa i uredopa; etilenimine i metilamelamine uključujući altretamin, trietilenmelamin, trietilenfosforamid, trietilentiofosforamid i trimetilomelamin; acetogenine (naročito bulatacin i bulatacinon); delta-9-tetrahidrokanabinol (dronabinol, MARINOL<®>); beta-lapahon; lapahol; kolhicine; betulinsku kiselinu; kamptotecin (uključujući sintetički analog topotekan (HYCAMTIN<®>), CPT-11 (irinotekan, CAMPTOSAR<®>), acetilkamptotecin, skopolektin, i 9-aminokamptotecin); briostatin; kalistatin; CC-1065 (uključujući njegove sintetičke analoge adozelesin, karzelesin i bizelesin); podofilotoksin; podofilinsku kiselinu; tenipozid; kriptoficine (naročito kriptoficin 1 i kriptoficin 8); dolastatin; duokarmicin (uključujući sintetičke analoge, KW-2189 i CB1-TM1); eleuterobin; pankratistatin; sarkodiktiin; spongistatin; azotne iperite kao što je hlorambucil, hlornafazin, hlorfosfamid, estramustin, ifosfamid, mehloretamin, mehloretamin oksid hidrohlorid, melfalan, novembicin, fenesterin, prednimustin, trofosfamid, uracil iperit; nitrozureje kao što je karmustin, hlorozotocin, fotemustin, lomustin, nimustin i ranimnustin; antibiotike kao što su enediinski antibiotici (npr. kaliheamicin, naročito kaliheamicin gama1I i kaliheamicin omegall (vidite, npr. Nicolaou et al., Angew. Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)); CDP323, oralni inhibitor alfa-4 integrina; dinemicin, uključujući dinemicin A; esperamicin; kao i neokarzinostatin hromofor i povezane hromoproteinske hromofore enediinskog antibiotika), aklacinomisine, aktinomicin, autramicin, azaserin, bleomicine, kactinomicin, karabicin, kaminomicin, karzinofilin, hromomicine, daktinomicin, daunorubicin, detorubicin, 6-diazo-5-okso-L-norleucin, doksorubicin (uključujući ADRIAMYCIN<®>, morfolino-doksorubicin, cijanomorfolino-doksorubicin, 2-pirolino-doksorubicin, doksorubicin HCI lipozom injekciju (DOXIL<®>), lipozomski doksorubicin TLC D-99 (MYOCET<®>), pegilovani lipozomski doksorubicin (CAELYX<®>), i dezoksidoksorubicin), epirubicin, ezorubicin, idarubicin, marcelomicin, mitomicine kao što su mitomicin C, mikofenolna kiselina, nogalamicin, olivomicini, peplomicin, porfiromicin, puromicin, kvelamicin, rodorubicin, streptonigrin, streptozocin, tubercidin, ubenimeks, zinostatin, zorubicin; antimetabolite kao što je metotreksat, gemcitabin (GEMZAR<®>), tegafur (UFTORAL<®>), kapecitabin (XELODA<®>), epotilon, i 5-fluoruracil (5-FU); kombretastatin; analoge folne kiseline kao što je denopterin, metotreksat, pteropterin, trimetreksat; analoge purina kao što je fludarabin, 6-merkaptopurin, tiamiprin, tioguanin; analoge pirimidina kao što je ancitabin, azacitidin, 6-azauridin, karmofur, citarabin, didezoksiuridin, doksifluridin, enocitabin, floksuridin; androgene kao što je kalusteron, dromostanolon propionat, epitiostanol, mepitiostan, testolakton; antiadrenalne agense kao što su aminoglutetimid, mitotan, trilostan; agense za dopunjavanje folne kiseline kao što je frolinska kiselina; aceglaton; aldofosfamid glikozid; aminolevulinsku kiselinu; eniluracil; amsakrin; bestrabucil; bisantren; edatraksat; defofamin; demekolcin; diazikvon; elformitin; eliptinijum acetat; epotilon; etoglucid; galijum nitrat; hidroksiureu; lentinan; lonidainin; majtanzinoide kao što su majtanzin i ansamitocini; mitoguazon; mitoksantron; mopidanmol; nitraerin; pentostatin; fenamet; pirarubicin; losoksantron; 2-etilhidrazid; prokarbazin; PSK<®>kompleks polisaharida (JHS Natural Products, Eugene, Oreg.); razoksan; rizoksin; sizofuran; spirogermanijum; tenuazonsku kiselinu; triazikvon; 2,2',2'-trihlortrietilamin; trihotecene (naročito T-2 toksin, verakurin A, roridin A i anguidin); uretan; vindesin (ELDISINE<®>, FILDESIN<®>); dakarbazin; manomustin; mitobronitol; mitolaktol; pipobroman; gacitozin; arabinozid („Ara-C“); tiotepu; taksoid, npr. paklitaksel (TAXOL<®>, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), albuminom konstruisanu formulaciju nanočestica paklitaksela (ABRAXANE<™>), i docetaksel (TAXOTERE<®>, Rhome-Poulene Rorer, Antony, Francuska); hloranbucil; 6-tioguanin; merkaptopurin; metotreksat; platinske agense kao što je cisplatin, oksaliplatin (npr. ELOXATIN<®>), i karboplatin; vinke, koji sprečavaju polimerizaciju tubulina usled nastanka mikrotubula, uključujući vinblastin (VELBAN<®>), vinkristin (ONCOVIN<®>), vindezin (ELDISINE<®>, FILDESIN<®>), i vinorelbin (NAVELBINE<®>); etopozid (VP-16); ifosfamid; mitoksantron; leukovorin; novantron; edatreksate; daunomicin; aminopterin; ibandronat; inhibitor topoizomeraze RFS 2000; difluormetilornitin (DMFO); retinoide kao što je retinoinska kiselina, uključujući beksaroten (TARGRETIN<®>); bisfosfonate kao što je klodronat (na primer, BONEFOS<®>ili OSTAC<®>), etidronat (DIDROCAL<®>), NE-58095, zoledronsku kiselinu/zoledronat (ZOMETA<®>), alendronat (FOSAMAX<®>), pamidronat (AREDIA<®>), tiludronat (SKELID<®>), ili rizedronat (ACTONEL<®>); troksacitabin (1,3-dioksolan nukleozidni analog citozina); antisens oligonukleotide, naročito one koji inhibiraju ekspresiju gena u putevima signalizacije koji učestvuju u nenormalnoj proliferaciji ćelija, kao što je, na primer, PKC-alfa, Raf, H-Ras, i receptor epidermalnog faktora rasta (EGF-R) (npr. erlotinib (Tarceva<™>)); i VEGF-A koji redukuje proliferaciju ćelija; vakcine kao što je vakcina THERATOPE<®>i vakcine za gensku terapiju, na primer, vakcina ALLOVECTIN<®>, vakcina LEUVECTIN<®>, i vakcina VAXID<®>; inhibitor topoizomeraze 1 (npr. LURTOTECAN<®>); rmRH (e.g., ABARELIX<®>); BAY439006 (sorafenib; Bayer); SU-11248 (sunitinib, SUTENT<®>, Pfizer); perifozin, inhibitor COX-2 (npr. celekoksib ili etorikoksib), inhibitor proteozoma (npr. PS341); bortezomib (VELCADE<®>); CCI-779; tipifarnib (R11577); orafenib, ABT510; inhibitor Bcl-2 kao što je oblimersen natrijum (GENASENSE<®>); piksantron; inhibitore EGFR; inhibitore tirozinske kinaze; inhibitore serin-treoninske kinaze kao što je rapamicin (sirolimus, RAPAMUNE<®>); inhibitore farneziltransferaze kao što je lonafarnib (SCH 6636, SARASAR<™>); i farmaceutski prihvatljive soli, kiseline ili derivate bilo čega od prethodnog; kao i kombinacije dva ili više od prethodnog kao što je CHOP, što je skraćenica za kombinovanu terapiju ciklofosfamidom, doksorubicinom, vinkristinom, i prednizolonom; i FOLFOX, što je skraćenica za režim lečenja oksaliplatinom (ELOXATIN<™>) u kombinaciji sa 5-FU i leukovorinom, i farmaceutski prihvatljive soli, kiseline ili derivate bilo čega od prethodnog; kao i kombinacije dva ili više od prethodnog.
Hemoterapeutski agensi, prema definiciji iz ovog dokumenta, obuhvataju „antihormonske agense” ili „endokrine terapeutike” koji deluju tako što regulišu, smanjuju, blokiraju ili inhibiraju efekte hormona koji mogu pospešiti rast kancera. Oni mogu biti sami hormoni, uključujući, ali ne ograničavajući se na: antiestrogene i selektivne modulatore receptora estrogena (SERM-ovi), uključujući, na primer, tamoksifen (uključujući NOLVADEX<®>tamoksifen), raloksifen, droloksifen, 4-hidroksitamoksifen, trioksifen, keoksifen, LY117018, onapriston i FARESTON.cndot.toremifene; aromatazne inhibitore koji inhibiraju enzim aromatazu, koji reguliše proizvodnju estrogena u nadbubrežnoj žlezdi, kao što su, na primer, 4(5)-imidazoli, aminoglutetimid, MEGASE<®>megestrol acetat, AROMASIN<®>eksamestan, formestan, fadrozol, RIVISOR<®>vorozol, FEMARA<®>letrozol i ARIMIDEX<®>anastrozol; i antiandrogene poput flutamida, nilutamida, bikalutamida, leuprolida i goserelina; kao i troksacitabine (analog citozina 1,3-dioksolan nukleozid); antisens oligonukleotidi, posebno oni koji inhibiraju ekspresiju gena na putu signalizacije, koji je uključen u proliferaciju aberantnih ćelija, kao što su, na primer, PKC-alfa, Raf i H-Ras; ribozimi kao što su inhibitor ekspresije VEGF (npr. ANGIOZYME<®>ribozim) i inhibitor ekspresije HER2; vakcine poput vakcina za gensku terapiju, na primer, ALLOVECTIN<®>vakcina, LEUVECTIN<®>vakcina i VAXID<®>vakcina; PROLEUKIN<®>rIL-2; LURTOTECAN<®>inhibitor topoizomeraze 1; ABARELIX<®>rmRH; vinorelbin i esperamicini (pogledajte U.S. pat. br. 4,675,187), i farmaceutski prihvatljive soli, kiseline ili derivati bilo kog od gore navedenog; kao i kombinacije dva ili više od gore navedenih.
Termin „himerno“ antitelo ukazuje na antitelo kod koga je deo teškog i/ili lakog lanca dobijen od posebnog izvora ili vrste, dok je ostatak teškog i/ili lakog lanca dobijen od različitog izvora ili vrste.
Izraz „klaster diferencijacije 3” ili „CD3”, u smislu ovog dokumenta, ukazuje na svaki nativni CD3 koji potiče od bilo kog kičmenjaka, uključujući sisare, kao što su primati (npr. ljudi) i glodari (npr. miševi i pacovi), ako nije drugačije naznačeno, uključujući, na primer, lance CD3ε, CD3γ, CD3α i CD3β. Izraz obuhvata neobrađeni CD3 „pune dužine” (npr. neobrađeni ili nemodifikovani CD3ε ili CD3γ), kao i svaki oblik CD3 nastao kao rezultat procesa obrade u ćeliji. Izraz takođe obuhvata varijante CD3 koje se javljaju u prirodi, npr., splajsovane ili alelne varijante. CD3 uključuje, na primer, humani CD3ε protein (NCBI RefSeq No. NP_000724), koji ima 207 povezanih aminokiselina, i humani CD3γ protein (NCBI RefSeq No. NP_000064), koji ima 182 povezane aminokiseline.
"Klasa" antitela ukazuje na vrstu konstantnog domena ili konstantnog regiona koju ima njegov teški lanac. Postoji pet glavnih klasa antitela: IgA, IgD, IgE, IgG i IgM, a neke od njih mogu dalje da se dele na potklase (izotipove), npr. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, i IgA2. Konstantni domeni teškog lanca koji odgovaraju različitim klasama imunoglobulina zovu se α, δ, ε, γ, odnosno μ.
Izraz „citotoksični agens”, u smislu ovog dokumenta, se odnosi na supstancu koja inhibira ili sprečava ćelijsku funkciju i/ili izaziva smrt ili uništenje ćelije. Citotoksični agensi uključuju, ali se ne ograničavaju na, radioaktivne izotope (npr. At<211>, I<131>, I<125>, Y<90>, Re<186>, Re<188>, Sm<153>, Bi<212>, P<32>, Pb<212>i radioaktivne izotope Lu); hemoterapeutske agense ili lekove (npr. metotreksat, adriamicin, vinka alkaloide (vinkristin, vinblastin, etopozid), doksorubicin, melfalan, mitomicin C, hlorambucil, daunorubicin ili druge interkalirajuće agense); agense za inhibiciju rasta; enzime i njihove fragmente, kao što su nukleolitički enzimi; antibiotike; toksine, kao što su toksini malog molekula ili enzimski aktivni toksini bakterijskog, fungalnog, biljnog ili životinjskog porekla, uključujući njihove fragmente i/ili varijante, kao i različite antitumorske ili antikancerogene agense koji su objavljeni dole.
„Poremećaj“ je svako stanje koje bi imalo koristi od lečenja, uključujući, ali ne ograničavajući se na hronične i akutne poremećaje ili bolesti, uključujući i ona patološka stanja koja predstavljaju predispoziciju sisara za odgovarajući poremećaj.
Izrazi „proliferativni poremećaj ćelije” i „proliferativni poremećaj” se odnose na poremećaje koji su u vezi sa određenim stepenom abnormalne proliferacije ćelija. U jednom otelotvorenju, proliferativni poremećaj ćelija je kancer. U jednom otelotvorenju, poremećaj proliferacije ćelije je tumor.
Termini „kancer“ i „kancerogeni“ odnose se na fiziološko stanje sisara koje se tipično karakteriše neregulisanim rastom ćelija, ili ga opisuju. Primeri za kancer uključuju, ali nisu ograničeni na, karcinom, limfom, blastom, sarkom, i leukemiju ili limfoidne malignitete. Konkretniji primeri takvih karcinoma uključuju, ali se ne ograničavaju na karcinom skvamoznih ćelija (npr. skvamozne epitelne ćelije), karcinom pluća uključujući mikrocelularni karcinom pluća, nemikrocelularni karcinom pluća, adenokarcinom pluća i skvamozni karcinom pluća), karcinom peritoneuma, hepatocelularni karcinom, gastrični karcinom ili karcinom želuca uključujući gastrointestinalni karcinom i gastrointestinalni stromalni karcinom, karcinom pankreasa, glioblastom, karcinom cerviksa, karcinom jajnika, karcinom jetre, karcinom bešike, karcinom urinarnog trakta, hepatom, karcinom dojke, karcinom kolona, karcinom rektuma, kolorektalni karcinom, karcinom endometrijuma ili materice, karcinom pljuvačnih žlezda, karcinom bubrega ili renalni karcinom, karcinom prostate, karcinom vulve, tiroidni karcinom, karcinom jetre, analni karcinom, karcinom penisa, melanom, površinski šireći melanom, lentigo maligni melanom, akralne lentiginozne melanome, nodularne melanome, multipli mijelom i limfom B-ćelija (uključujući niskostepeni/folikularni non-Hodžkinsov limfom (NHL); mali limfocitni (SL) NHL; srednjestepeni/folikularni NHL; difuzni NHL srednje klase; imunoblastni NHL visokog stepena; visokostepeni limfoblastni NHL; NHL visokog stepena sa malim nezarezanim ćelijama; bujajuća bolest NHL; limfom ćelija plašta; limfom povezan sa AIDS-om; i Valdenstromova makroglobulinemija); hronična limfocitna leukemija (CLL); akutna limfoblastna leukemija (ALL); leukemija vlasastih ćelija; hronična mijeloblastna leukemija; i posttransplantacioni limfoproliferativni poremećaj (PTLD), kao i abnormalna vaskularna proliferacija u vezi sa fakomatozama, edemom (kao oni u vezi sa tumorom mozga), Meigsovim sindromom, mozgom, kao i karcinomom glave i vrata
4
i pridruženim metastazama. U određenim realizacijama, kanceri koji su podložni lečenju antitelima prema pronalasku uključuju rak dojke, kolorektalni karcinom, rektalni karcinom, nemikrocelularni karcinom pluća, glioblastom, ne-Hodžkinsov limfom (NHL), karcinom bubrežne ćelije, karcinom prostate, karcinom jetre, karcinom gušterače, sarkom mekog tkiva, kaposijev sarkom, karcinoidni karcinom, karcinom glave i vrata, karcinom jajnika, mezoteliom i multipli mijelom. U nekim realizacijama, karcinom je odabran između: mikrocelularnog karcinoma pluća, gliblastoma, neuroblastoma, melanoma, karcinoma dojke, gastričnog karcinoma, karcinoma debelog creva (CRC) i hepatocelularnog karcinoma. Međutim, u nekim realizacijama, karcinom je odabran između: nemikrocelularnog karcinoma pluća, karcinoma debelog crijeva, glioblastoma i karcinoma dojke, uključujući metastatske oblike tih karcinoma. U drugim otelotvorenjima, kancer je odabran iz klase zrelih B-ćelijskih kancera ne uključujući Hodžkinov limfom ali uključujući DLBCL germinalni centar nalik B-ćelijama (GCB), DLBCL nalik aktiviranim B-ćelijama (ABC), folikularnog limfoma (FL), limfoma ćelija plašta (MCL), akutne mijeloidne leukemije (AML), hronične limfoidne leukemije (CLL), limfoma marginalne zone (MZL), male limfocitne leukemije (SLL), limfoplazmocitnog limfoma (LL), Valdenstromove makroglobulinemije (WM), limfoma centralnog nervnog sistema (CNSL), Burkitovog limfoma (BL), B-ćelijske prolimfocitne leukemije, limfoma marginalne zone slezine, leukemije vlasastih ćelija, limfoma/leukemije slezine koji ne može da se klasifikuje, limfoma difuzne crvene pulpe slezine, varijante leukemije vlasastih ćelija, Valdenstromove makroglobulinemije, bolesti teškog lanca, bolesti teškog lanca α, bolesti teškog lanca γ, bolesti teškog lanca µ, mijeloma ćelija plazme, solitarnog plazmacitoma kostiju, ekstraosealnog plazmacitoma, limfoma ekstranodalne marginalne zone limfoidnog tkiva povezanog sa sluznicom (MALT limfom), limfa nodalne marginalne zone, pedijatrijskog limfoma nodalne marginalne zone, pedijatrijskog folikularnog limfoma, limfoma centra primarnog kutanog folikula, B-krupnoćelijskog limfoma bogatog T-ćelijama/histiocitima, primarnog DLBCL CNS-a, primarnog kutanog DLBCL-a, nožni tip, EBV-pozitivnog DLBCL-a starijih osoba, DLBCL-a povezanog sa hroničnom inflamacijom, limfomatoidne granulomatoze, primarnog medijastinalnog (timičnog) B-krupnoćelijskog limfoma, intravaskularnog B-krupnoćelijskog limfoma, ALK-pozitivnog B-krupnoćelijskog limfoma, plazmablastnog limfoma, B-krupnoćelijskog limfoma koji nastaje kod multicentrične Kastlemanove bolesti povezane sa HHV8, primarnog efuzionog limfoma: B-ćelijskog limfoma koji ne može da se klasifikuje, sa karakteristikama između difuznog B-krupnoćelijskog limfoma i Burkitovog limfoma, i B-ćelijskog limfoma koji ne može da se klasifikuje, sa karakteristikama između difuznog B-krupnoćelijskog limfoma i klasičnog Hodžkinovog limfoma.
Izraz „tumor”, koji se ovde koristi, se odnosi na rast i proliferaciju svih neoplastičnih ćelija, bilo malignih ili benignih, i svih prekancerogenih i kancerogenih ćelija i tkiva. Izrazi „kancer”, „kancerogeni”, „proliferativni poremećaj ćelija”, „proliferativni poremećaj” i „tumor” međusobno se ne isključuju prilikom pominjanja u ovom dokumentu.
Termin „tumorski antigen“, kako se ovde koristi, može se shvatiti kao oni antigeni koji su prezentovani na tumorskim ćelijama. Ovi antigeni se mogu prezentovati na površini ćelije sa ekstracelularnim delom, koji se često kombinuje sa transmembranskim i citoplazmatskim delom molekula. Ovе antigene ponekad mogu prezentovati samo ćelije tumora, a nikada normalne ćelije. Tumorski antigeni mogu biti isključivo eksprimirani na tumorskim ćelijama ili mogu predstavljati mutaciju specifičnu za tumor u poređenju sa normalnim ćelijama. U ovom slučaju, nazivaju se antigeni specifični za tumor. Češći su tumorski antigeni koje prezentuju tumorske ćelije i normalne ćelije, i oni se nazivaju antigeni povezani sa tumorom. Ovi antigeni povezani sa tumorom mogu biti prekomerno eksprimirani u poređenju sa normalnim ćelijama ili su dostupni za vezivanje antitela u tumorskim ćelijama zbog manje kompaktne strukture tumorskog tkiva u poređenju sa normalnim tkivom. U jednom aspektu, tumorski antigen se bira od onih navedenih u tabeli 1 u nastavku.
"Efektorske funkcije" ukazuju na one biološke aktivnosti koje mogu da se pripišu Fc regionu antitela, koji varira sa izotipom antitela. Primeri efektorskih funkcija antitela uključuju: vezivanje C1q i komplement-zavisnu citotoksičnost (CDC); Fc receptorsko vezivanje; ćelijsku citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC); fagocitozu; nishodnu regulaciju površinskih ćelijskih receptora (npr. B-ćelijski receptor), i aktivaciju B ćelija.
„Efikasna količina“ jedinjenja, na primer, anti-CD3 antitela iz pronalaska ili njegove kompozicije (npr. farmaceutska kompozicija), jeste najmanje minimalna količina potrebna za postizanje željenog terapeutskog ili profilaktičkog rezultata, kao što je merljivo poboljšanje ili prevencija određenog poremećaja (npr. poremećaj proliferacije ćelija, na primer, kancer). Efikasna količina iz ovog dokumenta može varirati u skladu sa faktorima kao što su stanje bolesti, starost, pol i težina pacijenta, kao i sposobnosti antitela da izazove željeni odgovor kod pojedinca. Efikasna količina je takođe ona pri kojoj su bilo koji toksični ili štetni uticaji lečenja manje važni u odnosu na terapeutski korisna dejstva. Za profilaktičku upotrebu, korisni ili željeni rezultati uključuju rezultate kao što su: eliminisanje ili smanjenje rizika, smanjenje ozbiljnosti ili odlaganje početka bolesti, uključujući biohemijske, histološke i/ili bihejvioralne simptome bolesti, njene komplikacije i posredne patološke fenotipove koji se javljaju tokom razvoja bolesti. Za terapeutsku upotrebu, korisni ili željeni rezultati uključuju kliničke rezultate, kao što su: smanjenje jednog ili više simptoma koji su rezultat bolesti, povećanje kvaliteta života onih koji pate od bolesti, smanjenje doze drugih lekova potrebnih za lečenje bolesti, pojačavanje dejstva drugih lekova, kao putem ciljanja, odlaganje napredovanja bolesti i/ili produžetak preživljavanja. U slučaju kancera ili tumora, efikasna količina leka može redukovati broj ćelija kancera; smanjiti veličinu tumora; inhibirati (tj. do izvesne mere usporiti ili, poželjno, zaustaviti) infiltraciju ćelija kancera u periferne organe; inhibirati (tj. do izvesne mere usporiti ili, poželjno, zaustaviti) metastaze tumora; do izvesne mere inhibirati rast tumora; i/ili do izvesne mere ublažiti jedan ili više simptoma povezanih sa poremećajem. Efikasna količina se može dati u jednoj ili više primena. Za potrebe ovog pronalaska, efikasna količina leka, jedinjenja ili farmaceutske kompozicije predstavlja količinu dovoljnu za ostvarivanje profilaktičkog ili terapeutskog lečenja, bilo posredno ili neposredno. Kao što se podrazumeva u kliničkom kontekstu, efikasna količina leka, jedinjenja ili farmaceutske kompozicije se može ili ne mora postići u kombinaciji sa drugim lekom, jedinjenjem ili farmaceutskom kompozicijom. Shodno tome, „efikasna količina“ se može razmatrati u kontekstu davanja jednog ili više terapeutskih agensa, a može se razmotriti i davanje jednog agensa u efikasnoj količini ako, u kombinaciji sa jednim ili više drugih agensa, može da se postigne, ili je postignut željeni rezultat.
Termin "Fc region" ovde se koristi da definiše C-terminalni region imunoglobulinskog teškog lanca koji sadrži barem deo konstantnog regiona. Ovaj izraz podrazumeva nativne sekvence Fc regiona i varijante Fc regiona. U jednom otelotvorenju, Fc region teškog lanca humanog IgG pruža se od Cys226, ili od Pro230, do karboksilnog terminusa teškog lanca. Međutim, na C-terminalnom kraju Fc regiona lizin (Lys447) može, ali ne mora da bude prisutan. Ako ovde nije drugačije naznačeno, označavanje aminokiselinskih ostataka u Fc regionu ili konstantnom regionu je prema EU sistemu numeracije, koji se zove i EU indeks, kao što su opisali Kabat i sar., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. izd. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.
„Okvir“ ili „FR“ se odnosi na ostatke varijabilnog domena koji nisu ostaci hipervarijabilnog regiona (HVR). FR varijabilnog domena generalno se sastoji od četiri FR domena: FR1, FR2, FR3 i FR4. Shodno tome, HVR i FR sekvence generalno se pojavljuju u sledećem redosledu u VH (ili VL): FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
Izrazi „antitelo pune dužine“, „netaknuto antitelo“ i „kompletno antitelo“ u ovom dokumentu se koriste kao sinonimi, i odnose se na antitelo koje ima strukturu suštinski sličnu strukturi nativnog antitela, ili koje ima teške lance koji sadrže Fc region, kao što je definisano u ovom dokumentu.
„Sredstvo inhibicije rasta“ kada je ovde korišćeno, odnosi se na jedinjenje ili smešu koje
4
inhibira rast ćelija, bilo in vitro ili in vivo. U jednom otelotvorenju, sredstvo za inhibiciju rasta je antitelo koje inhibira rast koje sprečava ili smanjuje proliferaciju ćelije koja eksprimira antigen za koji se antitelo veže. U drugom otelotvorenju, sredstvo za inhibiciju rasta može biti ono koje značajno smanjuje procenat ćelija u S fazi. Primeri sredstava za inhibiciju rasta obuhvataju sredstva koja blokiraju progresiju ćelijskog ciklusa (na mestu koje nije S faza), kao što su sredstva koja indukuju G1 zastoj i zastoj M-faze. Klasični blokatori M-faze uključuju vinke (vinkristin i vinblastin), taksane i inhibitore topoizomeraze II, kao što su: doksorubicin, epirubicin, daunorubicin, etopozid i bleomicin. Određeni agensi koji zaustavljaju G1, isto tako, šire se na zastoj S-faze, na primer, DNK alkilujući agensi, kao što su tamoksifen, prednizon, dakarbazin, mehloretamin, cisplatin, metotreksat, 5-fluorouracil i ara-C. Dalje informacije mogu se videti u Mendelsohn i Israel, izd., The Molecular Basis of Cancer, Poglavlje 1, nazvano "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" čiji su autori Murakami i sar. (W.B. Saunders, Philadelphia, 1995), npr. str. 13. Taksani (paklitaksel i docetaksel) su lekovi protiv kancera koji su dobijeni iz drveta tise. Docetaksel (TAXOTERE<®>, Rhone-Poulenc Rorer), dobijen iz evropske tise, je polusintetički analog paklitaksela (TAXOL<®>, Bristol-Myers Squibb). Paklitaksel i docetaksel podstiču obrazovanje mikrotubula iz dimera tubulina i stabilizuju mikrotubule sprečavanjem depolimerizacije, što dovodi do inhibicije mitoze u ćelijama.
Termin „HER2-pozitivan“ kancer obuhvata ćelije kancera koje imaju nivoe HER2 više od normalnih. Primeri za HER2-pozitivan kancer uključuju HER2-pozitivan karcinom dojke i HER2-pozitivan karcinom želuca. Opciono, HER2-pozitivan kancer ima imunohistohemijski rezultat (IHC) od 2+ ili 3+ i/ili odnos amplifikacije in situ hibridizacije (ISH) ≥2,0.
Izrazi „ćelija domaćin”, „ćelijska linija domaćina” i „kultura ćelije domaćina” koriste se kao sinonimi i ukazuju na ćelije u koje je uvedena egzogena nukleinska kiselina, uključujući potomstvo takvih ćelija. Ćelije domaćini uključuju „transformante“ i „transformisane ćelije“, u koje spadaju primarne transformisane ćelije i potomstvo dobijeno od njih, bez obzira na broj presejavanja. Potomstvo ne mora biti po sadržaju nukleinskih kiselina sasvim istovetno matičnoj ćeliji, već može da sadrži mutacije. Ovde se uključuje mutantno potomstvo koje ima istu funkciju ili biološku aktivnost kakva je ispitana ili odabrana u originalno transformisanoj ćeliji.
"Humano antitelo" je ono koje ima aminokiselinsku sekvencu koja odgovara aminokiselinskoj sekvenci koju proizvodi čovek ili humana ćelija, ili je dobijeno iz nehumanog izvora koji koristi humani repertoar antitela ili druge sekvence za kodiranje humanog antitela. Ova definicija humanog antitela posebno isključuje humanizovano antitelo koje sadrži antigen vezujuće ostatke koji nisu ljudskog porekla. Humana antitela se mogu proizvoditi korišćenjem različitih tehnika poznatih u struci, uključujući biblioteke prikaza faga. Hoogenboom i Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks i sar., J. Mol. Biol., 222:581 (1991). Takođe dostupni za pripremu humanih monoklonskih antitela su postupci opisani u radu Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, str. 77 (1985); Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991). Takođe pogledajte van Dijk i van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol., 5: 368-74 (2001). Humana antitela se mogu pripremiti davanjem antigena transgenoj životinji koja je modifikovana tako da proizvodi takva antitela kao odgovor na antigenski izazov, ali čiji su endogeni lokusi onemogućeni, npr. imunizovani ksenomiševi (pogledajte, npr. U.S. pat. br.6,075,181 i 6,150,584 vezano za tehnologiju XENOMOUSE™). Takođe pogledajte, na primer, Li i sar., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006) vezano za humana antitela koja su generisana tehnologijom humanog B-ćelijskog hibridoma.
„Okvir humanog konsenzusa“ je okvir koji predstavlja najčešće ostatke aminokiselina u izboru okvirnih sekvenci VL ili VH humanog imunoglobulina. Po pravilu, izbor VL ili VH sekvenci humanog imunoglobulina je iz podgrupe sekvenci varijabilnog domena. Po pravilu, podgrupa sekvenci je podgrupa kao u Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, peto izdanje, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), tom 1-3. U jednom otelotvorenju, za VL, podgrupa je podgrupa kapa I, kao u Kabat et al., supra. U jednom otelotvorenju, za VH, podgrupa je podgrupa III, kao u Kabat et al., supra.
"Humanizovano" antitelo ukazuje na himerno antitelo koje obuhvata aminokiselinske ostatke od ne-humanih HVR i aminokiselinske ostatke od humanih FR. U određenim otelotvorenjima, humanizovano antitelo će sadržati u suštini sve, ili najmanje jedan, a tipično dva varijabilna domena, u kojima svi, ili suštinski svi HVR-ovi (npr. CDR), odgovaraju onima iz nehumanog antitela, a svi, ili suštinski svi FR-ovi, odgovaraju onima iz humanog antitela. Humanizovano antitelo opciono može da sadrži najmanje deo konstantnog regiona antitela dobijenog od humanog antitela. "Humanizovani oblik" antitela, npr. ne-humanog antitela, ukazuje na antitelo koje je pretrpelo humanizaciju.
Termin „hipervarijabilni region“ ili „HVR“ kao što je ovde upotrebljen, ukazuje na svaki od regiona varijabilnog domena antitela koji su hipervarijabilni u sekvenci („regioni koji određuju komplementarnost“ ili „CDR“) i/ili formiraju strukturno definisane petlje („hipervarijabilne petlje“) i/ili sadrže ostatke u kontaktu sa antigenom („antigenski kontakti“). U suštini, antitela sadrže šest HVR: tri u VH (H1, H2, H3) i tri u VL (L1, L2, L3). U ovom dokumentu, primeri za HVR uključuju:
1. (a) hipervarijabilne petlje koje se pojavljuju na aminokiselinskim ostacima 26-32
4
(L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2) i 96-101 (H3); (Chothia i Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987));
2. (b) CDR koji se pojavljuju na aminokiselinskim ostacima 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (H1), 50-65 (H2) i 95-102 (H3) (Kabat i sar., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. izd. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991));
3. (c) antigenske kontakte koji se pojavljuju na aminokiselinskim ostacima 27c-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (H1), 47-58 (H2) i 93-101 (H3); (MacCallum i sar. J. Mol. Biol.262:732-745 (1996)); i
4. (d) kombinacije (a), (b) i/ili (c), uključujući aminokiselinske ostatke HVR 46-56 (L2), 47-56 (L2), 48-56 (L2), 49-56 (L2), 26-35 (H1), 26-35b (H1), 49-65 (H2), 93-102 (H3) i 94-102 (H3).
Ako nije drugačije naznačeno, ostaci HVR i drugi ostaci u varijabilnom domenu (npr. ostaci FR) ovde su numerisani prema Kabat et al., gore navedeno.
„Imunokonjugat“ je antitelo konjugovano sa jednim ili više heterolognih molekula, uključujući, bez ograničenja, citotoksični agens.
„Ispitanik“ ili „pojedinac“ je sisar. Sisari uključuju, ali nisu ograničeni na, domaće životinje (npr. krave, ovce, mačke, pse i konje), primate (npr. ljude i nehumane primate, poput majmuna), zečeve i glodare (npr. miševi i pacovi). U određenim otelotvorenjima, pojedinac ili ispitanik je čovek.
„Izolovano“ antitelo je ono koje je odvojeno od komponente svog prirodnog okruženja. U nekim otelotvorenjima, antitelo se prečišćava do čistoće veće od 95% ili 99%, što je određeno, na primer, elektroforezom (npr., SDS-PAGE, izoelektričnim fokusiranjem (IEF), kapilarnom elektroforezom) ili hromatografski (npr. jonskom izmenom ili reversno faznom HPLC). Za pregled postupaka za procenu čistoće antitela, pogledajte npr. Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007).
„Izolovana“ nukleinska kiselina se odnosi na molekul nukleinske kiseline koji je odvojen od komponenata svog prirodnog okruženja. Izolovana nukleinska kiselina uključuje molekul nukleinske kiseline koji se nalazi u ćelijama koje uobičajeno sadrže molekul nukleinske kiseline, ali je molekul nukleinske kiseline prisutan ekstrahromozomski, ili na hromozomskoj lokaciji koja se razlikuje od njegove prirodne hromozomske lokacije.
„Izolovana nukleinska kiselina koja kodira anti-CD3 antitelo“ ukazuje na jedan ili više molekula nukleinske kiseline koji kodiraju teške i lake lance antitela (ili njihove fragmente), uključujući takve molekule nukleinske kiseline u jednom vektoru ili odvojenim vektorima, i
4
takve molekule nukleinske kiseline na jednoj ili više lokacija u ćeliji domaćina.
Termin „monoklonsko antitelo“, u smislu ovog dokumenta, se odnosi na antitelo dobijeno iz populacije suštinski homogenih antitela, tj. pojedinačna antitela koja sadrže ovu populaciju su identična i/ili se vezuju za isti epitop, sa izuzetkom mogućih varijanti antitela, npr. koje sadrže mutacije koje postoje u prirodi ili se mogu razviti tokom stvaranja preparata monoklonskog antitela, a takve varijante su tipično prisutne u neznatnim količinama. Nasuprot preparatima poliklonskih antitela, koji tipično uključuju različita antitela, usmerena na različite determinante (epitope), svako monoklonsko antitelo iz preparata monoklonskog antitela je usmereno na pojedinačnu determinantu na antigenu. Tako, oznaka “monoklonsko” ukazuje na karakter antitela, da je dobijeno iz suštinski homogene populacije antitela, i ne bi je trebalo tumačiti kao zahtev da se antitela proizvode bilo kojom posebnom metodom. Na primer, monoklonska antitela koja će se koristiti u skladu sa predmetnim pronalaskom mogu se dobiti različitim tehnikama, uključujući, ali se ne ograničavajući na metodu hibridoma, postupke rekombinantne DNK, postupke displeja faga i postupke u kojima se koriste transgene životinje koje sadrže kompletne lokuse humanog imunoglobulina ili njihove delove, i ovde su opisani takvi postupci i primeri drugih postupaka za dobijanje monoklonskih antitela.
"Golo antitelo" ukazuje na antitelo koje nije konjugovano sa heterologim delom (npr. citotoksičnim delom) ili radiološkom oznakom. Golo antitelo može da bude prisutno u farmaceutskoj formulaciji.
„Nativna antitela“ se odnose na molekule imunoglobulina koji se sreću u prirodi, sa različitim strukturama. Na primer, nativna IgG antitela su heterotetramerni glikoproteini od oko 150.000 daltona, sastavljeni od dva identična laka lanca i dva identična teška lanca koji su povezani disulfidnim vezama. Od N-terminalnog do C-terminalnog kraja, svaki teški lanac ima varijabilni region (VH), koji se takođe zove varijabilni teški domen ili varijabilni domen teškog lanca, za kojim slede tri konstantna domena (CH1, CH2 i CH3). Slično tome, od N-terminalnog do C-terminalnog kraja, svaki laki lanac ima varijabilni region (VL), koji se takođe zove varijabilni laki domen ili varijabilni domen lakog lanca, za kojim sledi konstantni laki (CL) domen. Laki lanac antitela se može svrstati u jedan od dva tipa, koji se zovu kapa (κ) i lambda (λ), na osnovu aminokiselinske sekvence njihovog konstantnog domena.
Termin „uputstvo za upotrebu” se odnosi na uputstvo koje se uobičajeno nalazi u komercijalnim pakovanjima terapeutskih proizvoda, koje sadrži informacije o indikacijama, upotrebi, doziranju, primeni, kombinovanoj terapiji, kontraindikacijama i/ili upozorenjima u vezi sa upotrebom takvih terapeutskih proizvoda.
Termin „antagonist vezivanja PD-1 ose” odnosi se na molekul koji inhibira interakciju
4
partnera u vezivanju PD-1 ose sa jednim ili više partnera za vezivanje, kako bi se uklonila disfunkcija T ćelije koja je rezultat signalizacije na PD-1 signalnoj osi, a rezultat je obnavljanje ili poboljšanje funkcije T ćelija (npr. proliferacija, proizvodnja citokina, ubijanje ciljanih ćelija). U smislu ovog dokumenta, antagonist vezivanja PD-1 ose odnosi se na antagonist vezivanja PD-1, antagonist vezivanja PD-L1 i antagonist vezivanja PD-L2.
Izraz „antagonist koji vezuje PD-1” odnosi se na molekul koji smanjuje, blokira, inhibira, ukida ili ometa transdukciju signala koji nastaje usled interakcije PD-1 sa jednim ili više partnera za vezivanje, kao što su PD-L1, PD-L2. U nekim otelotvorenjima, antagonist vezivanja PD-1 je molekul koji inhibira vezivanje PD-1 za jedan ili više partnera u vezivanju. U specifičnom aspektu, antagonist vezivanja PD-1 inhibira vezivanje PD-1 za PD-L1 i/ili PD-L2. Na primer, antagonisti vezivanja PD-1 uključuju anti-PD-1 antitela, njihove fragmente koji vezuju antigen, imunoadhezine, fuzione proteine, oligopeptide i druge molekule koji smanjuju, blokiraju, inhibiraju, ukidaju ili ometaju transdukciju signala koji nastaje usled interakcije PD-1 sa PD-L1 i/ili PD-L2. U jednom otelotvorenju, antagonist vezivanja PD-1 smanjuje negativni kostimulativni signal posredovan pomoću ili putem proteina na ćelijskoj površini eksprimiranih na T limfocitima koji posreduju u signalizaciji putem PD-1 tako da se disfunkcionalna T ćelija učini manje disfunkcionalnom (npr. poboljšanje efektorskih odgovora na prepoznavanje antigena). U nekim otelotvorenjima, antagonist vezivanja PD-1 je anti-PD-1 antitelo. U specifičnom aspektu, antagonist koji vezuje PD-1 je MDX-1106 (nivolumab), opisan u ovom dokumentu. U sledećem specifičnom aspektu, antagonist koji vezuje PD-1 je MK-3475 (lambrolizumab), opisan u ovom dokumentu. U sledećem specifičnom aspektu, antagonist koji vezuje PD-1 je CT-011 (pidilizumab), opisan u ovom dokumentu. U još jednom specifičnom aspektu, antagonist vezivanja PD-1 je AMP-224, opisan u ovom dokumentu.
Izraz „antagonist koji vezuje PD-L1” odnosi se na molekul koji smanjuje, blokira, inhibira, ukida ili ometa transdukciju signala koji nastaje usled interakcije PD-L1 sa jednim partnerom ili više njegovih partnera za vezivanje, kao što je PD-1, B7-1. U nekim otelotvorenjima, antagonist vezivanja PD-L1 je molekul koji inhibira vezivanje PD-L1 za njegove partnere u vezivanju. U jednom posebnom aspektu, antagonist vezivanja PD-L1 inhibira vezivanje PD-L1 za PD-1 i/ili B7-1. U nekim otelotvorenjima, u antagoniste vezivanja PD-L1 spadaju anti-PD-L1 antitela, njihovi antigen vezujući fragmenti, imunoadhezini, fuzioni proteini, oligopeptidi i drugi molekuli koji smanjuju, blokiraju, inhibiraju, ukidaju ili ometaju transdukciju signala koji nastaje usled interakcije PD-L1 sa jednim ili više njegovih partnera u vezivanju, kao što je PD-1, B7-1. U jednom otelotvorenju, antagonist vezivanja PD-L1 smanjuje negativni kostimulativni signal posredovan pomoću ili putem proteina na ćelijskoj
4
površini eksprimiranih na T-limfocitima koji posreduju u signalizaciji putem PD-L1 tako da se disfunkcionalna T ćelija učini manje disfunkcionalnom (npr. poboljšanje efektorskih odgovora na prepoznavanje antigena). U nekim otelotvorenjima,antagonist koji vezuje PD-L1 je anti-PD-L1 antitelo. U jednom posebnom aspektu, anti-PD-L1 antitelo je YW243.55.S70, opisano u ovom dokumentu. U jednom drugom posebnom aspektu, anti-PD-L1 antitelo je MDX-1105, opisano u ovom dokumentu. U još jednom posebnom aspektu, anti-PD-L1 antitelo je MPDL3280A, opisano u ovom dokumentu. U još jednom posebnom aspektu, anti-PD-L1 antitelo je MEDI4736, opisano u ovom dokumentu.
Izraz „antagonist koji vezuje PD-L2” odnosi se na molekul koji smanjuje, blokira, inhibira, ukida ili ometa transdukciju signala koji nastaje usled interakcije PD-L2 sa jednim ili više partnera za vezivanje, kao što je PD-1. U nekim otelotvorenjima, antagonist vezivanja PD-L2 je molekul koji inhibira vezivanje PD-L2 za jedan ili više partnera u vezivanju. U jednom posebnom aspektu, antagonist vezivanja PD-L2 inhibira vezivanje PD-L2 za PD-1. U nekim otelotvorenjima, u antagoniste PD-L2 spadaju anti-PD-L2 antitela, njihovi antigen vezujući fragmenti, imunoadhezini, fuzioni proteini, oligopeptidi i drugi molekuli koji smanjuju, blokiraju, inhibiraju, ukidaju ili ometaju transdukciju signala koji nastaje usled interakcije PD-L2 sa jednim ili više partnera u vezivanju, kao što je PD-1. U jednom otelotvorenju, antagonist vezivanja PD-L2 smanjuje negativni kostimulativni signal posredovan pomoću ili putem proteina na ćelijskoj površini eksprimiranih na T limfocitima koji posreduju u signalizaciji putem PD-L2 tako da se disfunkcionalna T ćelija učini manje disfunkcionalnom (npr. poboljšanje efektorskih odgovora na prepoznavanje antigena). U nekim otelotvorenjima, antagonist vezivanja PD-L2 je imunoadhezin.
Termin „protein“, u smislu ovog dokumenta, ukazuje na svaki nativni protein koji potiče od bilo kog kičmenjaka, uključujući sisare, kao što su primati (npr. ljudi) i glodari (npr. miševi i pacovi), ako nije drugačije naglašeno. Termin obuhvata neobrađen protein, „kompletne dužine“, kao i svaki oblik proteina koji je rezultat obrade u ćeliji. Termin takođe obuhvata prirodno postojeće varijante proteina, npr. splajsovane ili alelne varijante.
„Procenat (%) identičnosti sekvence aminokiselina” u odnosu na sekvencu referentnog polipeptida definisan je kao procenat aminokiselinskih ostataka u sekvenci kandidatu koji su identični aminokiselinskim ostacima u sekvenci referentnog polipeptida, nakon poravnavanja sekvenci i uvođenja praznina, ako je potrebno, da bi se postigao maksimalni procenat identičnosti sekvence, ne uzimajući u obzir nikakve konzervativne supstitucije kao deo identiteta sekvence. Poravnavanje radi određivanja procenta identičnosti aminokiselinske sekvence može se postići na različite načine koji su poznati u okviru struke, na primer, pomoću
4
javno dostupnog kompjuterskog softvera, kao što je BLAST, BLAST-2, ALIGN ili Megalign (DNASTAR) softver. Stručna lica iz ove oblasti mogu da odrede odgovarajuće parametre za poravnavanje sekvenci, uključujući sve potrebne algoritme za postizanje maksimalnog poravnavanja u kompletnoj dužini sekvenci koje se porede. Međutim, ovde su u tu svrhu vrednosti za % identičnosti aminokiselinske sekvence dobijene pomoću računarskog programa za poređenje sekvenci ALIGN-2. Računarski program za poređenje sekvenci ALIGN-2 delo je kompanije Genentech, Inc., a izvorni kod je podnet sa korisničkom dokumentacijom u U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559, gde je registrovan pod patentnim brojem U.S. Copyright Registration No. TXU510087. Program ALIGN-2 je javno dostupan od Genentech, Inc., South San Francisco, California ili može biti kompiliran iz izvornog koda. Program ALIGN-2 treba da se kompilira za primenu na operativnom sistemu UNIX, uključujući digitalni UNIX V4.0D. Sve parametre poređenja sekvenci je postavio program ALIGN-2 i nisu se menjali.
U slučajevima kada je ALIGN-2 korišćen za poređenja aminokiselinskih sekvenci, % identičnosti aminokiselinske sekvence date aminokiselinske sekvence A sa datom aminokiselinskom sekvencom B, ili u odnosu na nju (što alternativno može da se izrazi kao data aminokiselinska sekvenca A koja ima ili sadrži određeni % identičnosti aminokiselinske sekvence prema, sa ili u odnosu na datu aminokiselinsku sekvencu B) izračunava se na sledeći način:
gde je X broj aminokiselinskih ostataka za koje je dobijen rezultat da su identični putem programa za poređenje sekvenci ALIGN-2 pri poravnavanju A i B u tom programu, i gde je Y ukupan broj aminokiselinskih ostataka u B. Treba shvatiti da, u slučaju da dužina aminokiselinske sekvence A nije jednaka dužini aminokiselinske sekvence B, % identičnosti aminokiselinske sekvence A u odnosu na B neće biti isti kao % identičnosti aminokiselinske sekvence B u odnosu na A. Osim ako nije drugačije objavljeno, sve ovde upotrebljene vrednosti % identičnosti aminokiselinske sekvence dobijene su kako je opisano u prethodnom paragrafu pomoću kompjuterskog programa ALIGN-2.
Termin „farmaceutska formulacija“ se odnosi na preparat koji je u takvom obliku da omogućava efikasnu biološku aktivnost aktivnog sastojka koji se u njoj nalazi i koji ne sadrži dodatne komponente koje su neprihvatljivo toksične za ispitanika na kome će formulacija biti primenjena.
"Farmaceutski prihvatljiv nosač" upućuje na sastojak farmaceutske formulacije koji nije aktivni sastojak, i koji je netoksičan za ispitanika. Farmaceutski prihvatljiv nosač uključuje, ali nije ograničen na pufer, ekscipijens, stabilizator ili konzervans.
Kao što je ovde upotrebljeno, "lečenje" (i gramatičke varijacije, kao što je "lečiti") se odnosi na kliničku intervenciju u pokušaju da se izmeni prirodni tok pojedinca koji se leči, i može se primenjivati ili radi profilakse ili tokom kliničke patologije. Poželjni efekti lečenja uključuju, bez ograničenja, sprečavanje pojave ili recidiva bolesti, ublažavanje simptoma, smanjenje svih direktnih ili indirektnih patoloških posledica bolesti, sprečavanje metastaze, usporavanje brzine napredovanja bolesti, poboljšavanje ili ublažavanje stanja bolesti, i remisiju ili poboljšanu prognozu. U nekim otelotvorenjima, antitela iz predmetnog pronalaska se primenjuju da odlože razvoj bolesti ili da uspore napredovanje bolesti.
U smislu ovog dokumenta, „odlaganje napredovanja” poremećaja ili bolesti podrazumeva odgađanje, ometanje, usporavanje, nazadovanje, stabilizaciju i/ili prolongiranje razvoja bolesti ili poremećaja (npr. proliferativni poremećaj ćelije, npr. kancer). Ovo odlaganje može biti različitog trajanja, u zavisnosti od istorije bolesti i/ili pojedinca koji se leči. Kao što je očigledno stručnjaku u ovoj oblasti, dovoljno ili značajno odlaganje može, u suštini, obuhvatiti prevenciju, u tom smislu što se kod pojedinca ne razvija bolest. Na primer, kasna faza kancera, kao što je razvoj metastaza, može biti odložena.
Pod „smanjiti” ili „inhibirati” podrazumeva se sposobnost da se uzrokuje opšte smanjenje, na primer, od 20% ili više, od 50% ili više, ili od 75%, 85%, 90%, 95% ili više. U određenim otelotvorenjima, smanjiti ili inhibirati može se odnositi na efektorsku funkciju antitela koja je posredovana Fc regionom antitela, pri čemu takve efektorske funkcije posebno uključuju citotoksičnost zavisnu od komplementa (CDC), ćelijsku citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC) i ćelijsku fagocitozu zavisnu od antitela (ADCP).
Termin „varijabilni region” ili „varijabilni domen” ukazuje na domen teškog ili lakog lanca antitela koji je uključen u vezivanje antitela za antigen. Varijabilni domeni teškog lanca i lakog lanca (VH odnosno VL) nativnog antitela tipično imaju slične strukture, pri čemu svaki domen sadrži četiri očuvana regiona okvira (FR) i tri hipervarijabilna regiona (HVR). (Vidite, npr. Kindt i sar. Kuby Immunology, 6. izd., W.H. Freeman i Co., strana 91 (2007).) Jedan VH ili VL domen može biti dovoljan za dodeljivanje antigen vezujuće specifičnosti. Nadalje, antitela koja vezuju određeni antigen mogu se izolovati pomoću VH ili VL domena iz antitela koje vezuje antigen radi pregledanja biblioteke komplementarnih VL odnosno VH domena. Videti, npr. Portolano et al., J. Immunol.150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991).
Termin „vektor”, kako se ovde koristi, odnosi se na molekul nukleinske kiseline koji
1
ima sposobnost propagacije druge nukleinske kiseline za koju je vezan. Ovaj termin obuhvata vektor kao samoumnožavajuću strukturu nukleinske kiseline, kao i vektor ugrađen u genom ćelije domaćina u koju je uveden. Pojedini vektori mogu da upravljaju ekspresijom nukleinskih kiselina za koje su operativno vezani. U ovom dokumentu, takvi vektori se pominju kao „ekspresioni vektori”.
Kako se ovde koristi, „primena“ podrazumeva postupak davanja doze jedinjenja (npr. anti-CD3 antitela prema pronalasku ili nukleinske kiseline koja kodira anti-CD3 antitelo prema pronalasku) ili kompozicije (npr. farmaceutska kompozicija, npr. farmaceutska kompozicija koja uključuje anti-CD3 antitelo prema pronalasku) ispitaniku. Kompozicije koje se koriste u metodama koje su ovde opisane mogu da se primenjuju, na primer, intramuskularno, intravenski, intradermalno, perkutano, intraarterijski, intraperitonealno, intraleziono, intrakranijalno, intraartikularno, intraprostatično, intrapleuralno, intratrahealno, intranazalno, intravitrealno, intraviginalno, intrarektalno, topikalno, intratumorski, peritonealno, supkutano, subkonjunktivno, intravezikularno, mukozno, intraperikardijalno, intraumbilikalno, intraokularno, oralno, topikalno, lokalno, inhalacijom, injekcijom, infuzijom, kontinuiranom infuzijom, lokalizovanom perfuzijom kupanjem ciljnih ćelija, direktno, kateterom, ispiranjem, u kremama ili u lipidnim kompozicijama. Način primene može da varira u zavisnosti od različitih faktora (npr. jedinjenja ili kompozicije koja se primenjuje i težine stanja, bolesti ili poremećaja koji se leči).
II. KOMPOZICIJE I POSTUPCI
Antitela iz pronalaska su korisna, na primer, za lečenje ili odlaganje razvoja ćelijskog proliferativnog poremećaja (npr. kancera) ili autoimunog poremećaja, ili za poboljšanje imunološke funkcije kod ispitanika koji ima takav poremećaj. Antitela iz pronalaska obuhvataju anti-CD3 krak i anti-HER2 krak, pri čemu: (a) anti-CD3 krak obuhvata prvi vezujući domen koji obuhvata: (i) VH domen koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 95% identičnosti sekvence u odnosu na aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 184, pri čemu VH domen obuhvata HVR-H1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1, HVR-H2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 2, i HVR-H3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 3, i (ii) VL domen koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 95% identičnosti sekvence u odnosu na aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 185, pri čemu VL domen obuhvata HVR-L1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 4, HVR-L2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 5, i HVR-L3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 6; i (b) anti-HER2 krak obuhvata drugi vezujući domen koji obuhvata: (i) VH domen koji
2
obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 95% identičnosti sekvence u odnosu na aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 270, pri čemu VH domen obuhvata HVR-H1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 169, HVR-H2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 170, i HVR-H3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 171, i (ii) VL domen koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 95% identičnosti sekvence u odnosu na aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 271, pri čemu VL domen obuhvata HVR-L1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 172, HVR-L2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 173, i HVR-L3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 174.
A. Primeri za anti-CD3 antitela
U jednom aspektu, otkriće obezbeđuje izolovana antitela koja se vezuju za CD3 (npr. CD3ε i/ili CD3γ).
Na primer, u jednom aspektu, otkriće obezbeđuje anti-CD3 antitelo koje ima vezujući domen koji obuhvata šest hipervarijabilnih regiona (HVR) odabranih od (a) HVR-H1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:1; (b) HVR-H2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:2; (c) HVR-H3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:3; (d) HVR-L1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:4; (e) HVR-L2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:5; i (f) HVR-L3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:6. U nekim slučajevima, anti-CD3 antitelo obuhvata najmanje jedan (npr.1, 2, 3 ili 4) region okvira teškog lanca FR-H1, FR-H2, FR-H3 i FR-H4 koji obuhvataju sekvence SEQ ID NO: 301-304, datim redosledom, i/ili najmanje jedan (npr. 1, 2, 3 ili 4) region okvira lakog lanca FR-L1, FR-L2, FR-L3 i FR-L4 koji obuhvataju sekvence SEQ ID NO: 305-308, datim redosledom; dodatno, anti-CD3 antitelo može imati varijabilni domen teškog lanca (VH) koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sekvence sa sekvencom SEQ ID NO: 184 ili tu sekvencu, i/ili varijabilni domen lakog lanca (VL) koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sekvence sa sekvencom SEQ ID NO: 185, ili tu sekvencu. U drugim slučajevima, anti-CD3 antitelo obuhvata najmanje jedan (npr. 1, 2, 3 ili 4) region okvira teškog lanca FR-H1, FR-H2, FR-H3 i FR-H4 koji obuhvataju sekvence SEQ ID NO: 293-296, datim redosledom, i/ili najmanje jedan (npr.1, 2, 3 ili 4) region okvira lakog lanca FR-L1, FR-L2, FR-L3 i FR-L4 koji obuhvataju sekvence SEQ ID NO: 297-300, datim redosledom. U posebnom slučaju, anti-CD3 antitelo može da bude 40G5c, njegov derivat ili klon srodnog porekla.
U drugom aspektu, antitelo iz otkrića obuhvata (a) VH domen koji obuhvata sve tri sekvence VH HVR izabrane od (i) HVR-H1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:1; (ii) HVR-H2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 2, i (iii) HVR-H3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu izabranu od ISEQ ID NO: 3, i (b) VL domen koji obuhvata sve tri sekvence VL HVR izabrane od (i) HVR-L1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 4; (ii) HVR-L2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 5, i (iii) HVR-L3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 6. U nekim slučajevima, anti-CD3 antitelo može da ima VH domen koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 184 i VL domen koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 185. U posebnom slučaju, anti-CD3 antitelo može da bude 40G5c, njegov derivat ili klon srodnog porekla.
U svim gore pomenutim otelotvorenjima, anti-CD3 antitelo je humanizovano. U jednom otelotvorenju, anti-CD3 antitelo sadrži HVR-ove kao u bilo kom od prethodnih otelotvorenja, i dodatno sadrži akceptorski humani okvir, npr. humani imunoglobulinski ili humani konsenzusni okvir.
U drugom aspektu, dato je anti-CD3 antitelo, pri čemu, antitelo sadrži VH kao u svakom gore navedenom otelotvorenju, i VL kao u svakom gore navedenom otelotvorenju, pri čemu jedna ili obe sekvence varijabilnog domena obuhvataju posttranslacione modifikacije.
U sledećem aspektu, otkriće obezbeđuje antitelo koje se vezuje za isti epitop kao anti-CD3 antitelo iz ovog dokumenta. Na primer, u nekim otelotvorenjima, obezbeđeno je antitelo koje se vezuje za isti epitop kao anti-CD3 antitelo koje sadrži VH sekvencu SEQ ID NO: 184, i VL sekvencu SEQ ID NO: 185. U nekim otelotvorenjima otkrića, obezbeđeno je antitelo koje se vezuje za epitop u fragmentu CD3 (npr. humani CD3ε) koji se sastoji od aminokiselina 1-26 (SEQ ID NO: 283) ili 1-27 (SEQ ID NO: 278) humanog CD3ε.
U još jednom aspektu, otkriće obezbeđuje antitelo koje se vezuje za jedinstveni CD3 epitop. U određenim otelotvorenjima, anti-CD3 antitelo iz otkrića ostvaruje jedinstvene kontakte sa aminokiselinama humanog CD3ε na rastojanju od 3,5 angstrema, 3,25 angstrema, 3,00 angstrema, 2,75 angstrema ili manje. U određenim otelotvorenjima, obezbeđeno je antitelo koje se vezuje za epitop koji se sastoji od jedne, dve, tri, četiri ili pet aminokiselina humanog CD3ε na rastojanju od 3,5 angstrema, 3,25 angstrema, 3,00 angstrema, 2,75 angstrema ili manje. U jednom otkriću, anti-CD3 antitelo iz pronalaska ostvaruje jedinstvene kontakte sa aminokiselinama humanog CD3ε na rastojanju od 3,5 angstrema ili manje. U određenim otelotvorenjima otkrića, obezbeđeno je antitelo koje se vezuje za epitop koji se sastoji od jedne, dve, tri, četiri ili pet aminokiselina humanog CD3ε na rastojanju od 3,5 angstrema ili manje. Na primer, u određenim otelotvorenjima otkrića, obezbeđeno je antitelo koje se vezuje za epitop
4
koji se sastoji od aminokiselina humanog CD3ε izabranih od Gln1, Asp2, Asn4, Glu6 i Met7. U jednom konkretnom otelotvorenju otkrića, anti-CD3 antitelo se vezuje za epitop koji posebno obuhvata Glu6. U određenim drugim otelotvorenjima otkrića, obezbeđeno je antitelo koje se ne vezuje za epitop koji obuhvata Glu5 aminokiselinu humanog CD3ε. U određenim drugim otelotvorenjima otkrića, obezbeđeno je antitelo koje se ne vezuje za epitop koji obuhvata aminokiseline Gly3 i Glu5 humanog CD3ε.
Anti-CD3 epitop se može odrediti vezivanjem anti-CD3 antitela za peptidne fragmente epitopa. Alternativno, anti-CD3 epitop se može odrediti primenom skenirajuće mutageneze sa alaninom. U jednom otelotvorenju otkrića, smanjenje vezivanja anti-CD3 antitela za mutirani CD3 za 20%, 30%, 50%, 80% ili više ukazuje da je aminokiselinski ostatak CD3 mutiranog u testu skenirajuće mutageneze sa alaninom epitopski ostatak za to anti-CD3 antitelo. Alternativno, anti-CD3 epitop se može odrediti masenom spektrometrijom. U nekim otelotvorenjima otkrića, epitop se određuje kristalografijom (npr. kristalografskim postupcima opisanim u primerima).
U nekim otelotvorenjima otkrića, epitop određen kristalografijom se određuje korišćenjem aminokiselina Q1-M7 CD3. U nekim otelotvorenjima, epitop određen kristalografijom se određuje korišćenjem aminokiselina QDGNEEMGGITQTPYK (SEQ ID NO: 284) CD3.
U nekim otelotvorenjima otkrića, epitop određen kristalografijom može se dobiti kombinovanjem Fab anti-CD3 antitela, rastvorenog u 0,15 M NaCl, 25 mM tris, pH 7,5 sa 10 mg/ml, sa 2-strukim molarnim viškom (1 mg) CD3ε peptida i početnim skriningom retke matrice precipitata u formatu difuzije pare iz sedeće kapi. Optimizovani kristali se mogu uzgajati iz smeše sa osnovnim rastvorom 1:1 koji sadrži 70% V/V metil-pentandiol i 0,1 M HEPES pufer na pH 7,5. Rezervoar se može koristiti kao krioprotektant. Kristali se mogu preneti na kriogenu temperaturu iznenadnim potapanjem u tečni azot.
Podaci o difrakciji kristala mogu se prikupljati na 22ID liniji zraka naprednog izvora fotona, koristeći detektor MAR300 CCD. Snimljene difrakcije se mogu integrisati i skalirati pomoću programa HKL2000.
Struktura se može podeliti na faze postupkom molekularne zamene (MR) pomoću programa Phaser. Na primer, model pretrage MR je Fab podjedinica izvedena iz kristalne strukture kompleksa HGFA/Fab (PDB kod: 2R0L). CD3ε peptid je ugrađen u strukturu na osnovu Fo-Fc mape. Struktura se može naknadno usavršiti programima REFMAC5 i PHENIX koristeći ciljne funkcije maksimalne verovatnoće, anizotropnu individualnu metodu prečišćavanja B-faktora i TLS metodu utačnjavanja, kako bi se postigla konvergencija.
U određenim drugim aspektima otkrića, obezbeđeno je antitelo koje obuhvata paratop koji se vezuje za isti epitop kao i ovde navedeno anti-CD3 antitelo. Na primer, u određenim aspektima otkrića, obezbeđeno je antitelo koje se vezuje za isti epitop kao i paratop anti-CD3 antitela koji obuhvata aminokiseline koje formiraju kontakte na rastojanju od 3,5 angstrema ili manje. U određenim aspektima otkrića, obezbeđeno je antitelo koje se vezuje za isti epitop kao i paratop anti-CD3 antitela koji se sastoji od aminokiselina VH regiona anti-CD3 antitela izabranih iz grupe koja se sastoji od 33Tyr, 35His, 50Trp, 97Tyr i 98Ser. U određenim aspektima otkrića, obezbeđeno je antitelo koje se vezuje za isti epitop kao i paratop anti-CD3 antitela koji se sastoji od jedne, dve, tri, četiri ili pet aminokiselina VH regiona anti-CD3 antitela izabranih iz grupe koja se sastoji od 33Tyr, 35His, 50Trp, 97Tyr i 98Ser. U određenim aspektima otkrića, obezbeđeno je antitelo koje se vezuje za isti epitop kao i paratop anti-CD3 antitela koji se sastoji od aminokiselina VL regiona anti-CD3 antitela izabranih iz grupe koja se sastoji od 27Arg, 27Asn, 30Lys, 32Tyr, 92Phe, 94Leu i 96Arg. U određenim aspektima otkrića, obezbeđeno je antitelo koje se vezuje za isti epitop kao i paratop anti-CD3 antitela koji se sastoji od jedne, dve, tri, četiri, pet, šest ili sedam aminokiselina VL regiona anti-CD3 antitela izabrane iz grupe koja se sastoji od 27Arg, 27Asn, 30Lys, 32Tyr, 92Phe, 94Leu i 96Arg. U opcionim aspektima otkrića, obezbeđeno je antitelo koje se ne vezuje za isti epitop kao paratop anti-CD3 antitela koji obuhvata aminokiseline VL regiona koji obuhvata 91Ser. U daljem aspektu otkrića, anti-CD3 antitelo prema bilo kom od gornjih otelotvorenja je monoklonsko antitelo, uključujući himerno, humanizovano ili humano antitelo. U jednom otelotvorenju, anti-CD3 antitelo je fragment antitela, na primer, Fv, Fab, Fab’, scFv, dijatelo, ili F(ab’)2fragment. U drugom otelotvorenju, antitelo je antitelo kompletne dužine, npr. netaknuto humano IgG antitelo (npr. netaknuto humano IgG1 antitelo) ili druga klasa ili izotip antitela, kao što je ovde definisano.
U sledećem aspektu, anti-CD3 antitelo prema bilo kom od gorepomenutih otelotvorenja može da obuhvata bilo koju karakteristiku, pojedinačno ili u kombinaciji, kao što je opisano u Odeljcima 1–7 u nastavku.
1. Afinitet antitela
U nekim otelotvorenjima, ovde dato antitelo ima konstantu disocijacije (Kd) ≤1 μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0,1 nM, ≤ 0,01 nM, ili ≤ 0,001 nM (npr.10<-8>M ili manje, npr. od 10<-8>M do 10<-13>M, npr. od 10<-9>M do 10<-13>M). U jednom otelotvorenju otkrića, Kd se meri analizom vezivanja radioaktivno označenog antigena (RIA). U jednom otelotvorenju, RIA se izvodi sa Fab verzijom željenog antitela i njegovog antigena. Na primer, afinitet vezivanja Fab u rastvoru za antigen određen je uravnotežavanjem Fab sa minimalnom koncentracijom antigena obeleženog pomoću (<125>I) u prisustvu titracionih serija neobeleženog antigena, a zatim hvatanjem vezanog antigena pomoću ploče prevučene anti-Fab antitelom (vidite npr. Chen i sar., J. Mol. Biol.293:865-881(1999)). Radi utvrđivanja uslova za test, MICROTITER<®>ploče sa više bunarčića (Thermo Scientific) preko noći su obložene sa 5 μg/ml anti-Fab antitela koje služi za hvatanje (Cappel Labs) u 50 mM natrijum karbonatu (pH 9,6), a zatim su blokirane pomoću 2% (m/V) albumina goveđeg seruma u PBS-u, tokom dva do pet sati na sobnoj temperaturi (oko 23 °C). Na neadsorbujućoj ploči (Nunc br.269620), 100 pM ili 26 pM [<125>I]-antigena je pomešano sa serijskim razblaženjima željenog Fab (npr. u skladu sa procenom anti-VEGF antitela, Fab-12, Presta i sar., Cancer Res.57:4593-4599 (1997)). Željeni Fab je zatim inkubiran tokom noći; međutim, inkubacija može da se nastavi u dužem periodu (npr. oko 65 sati) kako bi se obezbedilo uspostavljanje ravnoteže. Nakon toga, smeše su prenete na ploču za hvatanje i inkubirane su na sobnoj temperaturi (npr. tokom jednog sata). Rastvor se zatim uklanja, a ploča se ispira osam puta pomoću 0,1% polisorbata 20 (TWEEN-20<®>) u PBS-u. Kada su ploče osušene, dodato je 150 µl scintilansa po bunarčiću (MICROSCINT-20<™>; Packard), a zatim su ploče merene na TOPCOUNT<™>gama brojaču (Packard) tokom deset minuta. Koncentracije svakog Fab koje daju manje ili jednako 20% maksimalnog vezivanja odabrane su za primenu u testovima kompetitivnog vezivanja.
Prema drugom otelotvorenju otkrića, Kd se meri pomoću BIACORE<®>testa površinske plazmonske rezonance. Na primer, analiza pomoću uređaja BIACORE<®>-2000 ili BIACORE<®>-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) obavljena je na 25°C sa CM5 čipovima sa imobilisanim antigenom uz ~10 jedinica odgovora (response units, RU). U jednom otelotvorenju otkrića, biosenzorski čipovi sa karboksimetilovanim dekstranom (CM5, BIACORE, Inc.) aktivirani su pomoću N-etil-N’-(3-dimetilaminopropil)-karbodiimid hidrohlorida (EDC) i N-hidroksisukcinimida (NHS), prema uputstvu dobavljača. Antigen je razblažen 10 mM natrijum acetatom, pH 4,8, do 5 µg/ml (~0,2 µM) pre injektovanja pri protoku od 5 µl/minutu da bi se postiglo oko 10 jedinica odgovora (RU) vezanog proteina. Nakon ubrizgavanja antigena, injektovan je 1 M etanolamin da bi se blokirale grupe koje nisu reagovale. Radi merenja kinetike, injektuju se dvostruke serije razblaženja Fab (0,78 nM do 500 nM) u PBS-u sa 0,05% polisorbatom 20 (TWEEN-20<™>) surfaktantom (PBST) na 25 °C pri protoku od oko 25 μl/min. Brzina asocijacije (kon) i brzina disocijacije (koff) izračunata je pomoću jednostavnog jedan-najedan Lengmirovog modela vezivanja (BIACORE<®>Evaluation Software verzija 3.2) simultanim podešavanjem senzorgrama asocijacije i disocijacije. Ravnotežna konstanta disocijacije (Kd) izračunata je kao odnos kon/koff. Pogledajte, na primer, Chen i sar. J. Mol. Biol.
293:865-881 (1999). Ako brzina asocijacije pređe 10<6>M<-1>s<-1>prema gore opisanom testu površinske plazmonske rezonance, onda brzina asocijacije može da se odredi primenom tehnike fluorescentnog prigušivanja koja meri porast ili opadanje intenziteta fluorescentne emisije (ekscitacija = 295 nm; emisija = 340 nm, 16 nm širina trake) na 25 °C kod 20 nM anti-antigen antitela (Fab oblik) u PBS-u, pH 7,2, u prisustvu rastućih koncentracija antigena, određeno spektrometrom, kao što je spektrofotometar sa zaustavljanjem protoka (Aviv Instruments) ili spektrofotometar serije 8000 SLM-AMINCO<™>(ThermoSpectronic) sa kivetom za mešanje.
2. Fragmenti antitela
U određenim otelotvorenjima otkrića, antitelo koje je ovde dato je fragment antitela. Fragmenti antitela uključuju, ali se ne ograničavaju na Fab, Fab’, Fab’-SH, F(ab’)2, Fv i scFv fragmente, i druge fragmente opisane u nastavku. Pregled fragmenata pojedinih antitela potražite u Hudson i sar. Nat. Med.9:129-134 (2003). Pregled scFv fragmenata potražite, npr. u: Pluckthün, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, sveska 113, Rosenburg i Moore eds., (Springer-Verlag, New York), str. 269-315 (1994); videti takođe WO 93/16185; i U.S. Patent br.5,571,894 i 5,587,458. Raspravu o Fab i F(ab')2fragmentima koji sadrže regenerisane ostatke epitopa koji vezuju receptore i koji imaju produžen poluživot in vivo, vidite u U.S. Patentu br.5,869,046.
Dijatela su fragmenti antitela sa dva mesta za vezivanje antigena koja mogu biti dvovalentna ili bispecifična. Pogledajte, na primer, EP 404,097; WO 1993/01161; Hudson i sar., Nat. Med.9:129-134 (2003); i Hollinger i sar. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993). Trijatela i tetratela su takođe opisana u radu Hudson et al., Nat. Med.9:129-134 (2003).
Antitela sa jednim domenom su fragmenti antitela koji sadrže kompletan varijabilni domen teškog lanca antitela ili njegov deo, ili kompletan varijabilni domen lakog lanca antitela ili njegov deo. U pojedinim otelotvorenjima, antitelo sa jednim domenom je humano antitelo sa jednim domenom (Domantis, Inc., Waltham, MA; vidite, npr. U.S. Patent br.6,248,516 B1).
Fragmenti antitela se mogu dobiti različitim tehnikama, uključujući, bez ograničavanja, proteolitičku digestiju netaknutog antitela, kao i proizvodnju pomoću rekombinantnih ćelija domaćina (npr. E. coli ili faga), kao što je ovde opisano.
3. Himerna i humanizovana antitela
U nekim aspektima otkrića, antitelo iz ovog dokumenta je himerno antitelo. Pojedina himerna antitela opisuje, npr. U.S. Patent br.4,816,567; kao i Morrison i sar. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). U jednom primeru, himerno antitelo sadrži nehumani varijabilni region (npr. varijabilni region dobijen od miša, pacova, hrčka, zeca ili nehumanog primata, kao što je majmun) i humani konstantni region. U daljem primeru, himerno antitelo je antitelo "sa zamenjenom klasom", kod koga je klasa ili potklasa zamenjena klasom ili potklasom matičnog antitela. Himerna antitela obuhvataju njihove antigen-vezujuće fragmente. U određenim otelotvorenjima otkrića, himerno antitelo je humanizovano antitelo. Najčešće, nehumano antitelo je humanizovano da bi se smanjila imunogenost za ljude, pri čemu zadržava specifičnost i afinitet matičnog nehumanog antitela. Po pravilu, humanizovano antitelo sadrži jedan ili više varijabilnih domena kod kojih su HVR-ovi, npr. CDR-ovi (ili njihovi delovi) dobijeni od nehumanog antitela, a FR-ovi (ili njihovi delovi) su dobijeni od sekvenci humanog antitela. Humanizovano antitelo opciono takođe sadrži najmanje deo humanog konstantnog regiona. U nekim otelotvorenjima otkrića, neki FR ostaci u humanizovanom antitelu su supstituisani odgovarajućim ostacima nehumanog antitela (npr. antitela od koga su dobijeni HVR ostaci), npr. da bi se povratila ili poboljšala specifičnost antitela ili njegov afinitet.
Pregled humanizovanih antitela i postupaka za njihovu pripremu daju, npr. Almagro i Fransson, Front. Biosci.13:1619-1633 (2008), a dalje ih opisuju, npr. Riechmann i sar. Nature 332:323-329 (1988); Queen i sar. Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989); US Patent br. 5, 821,337, 7,527,791, 6,982,321, i 7,087,409; Kashmiri i sar., Methods 36:25-34 (2005) (opisuju graftovanje regiona koji određuje specifičnost (SDR)); Padlan, Mol. Immunol.
28:489-498 (1991) (opisuje „preuređivanje površine“); Dall’Acqua i sar. Methods 36:43-60 (2005) (opisuje „mešanje FR“); i „Osbourn i sar. Methods 36:61-68 (2005“) i Klimka i sar. Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000) (opisuje pristup „vođene selekcije“ kod mešanja FR).
Regioni humanog okvira koji se mogu upotrebiti za humanizaciju uključuju, ali se ne ograničavaju na: regione okvira izabrane pomoću postupka "najboljeg slaganja" (vidite, npr. Sims i sar. J. Immunol. 151:2296 (1993)); regione okvira dobijene iz sekvence konsenzusa humanih antitela konkretne podgrupe varijabilnih regiona lakog ili teškog lanca (vidite, npr. Carter i sar. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); i Presta i sar. J. Immunol., 151:2623 (1993)); humane zrele (somatski mutirane) regione okvira ili humane germinativne regione okvira (vidite, npr. Almagro i Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)); i regione okvira dobijene skriningom biblioteka FR (vidite, npr. Baca i sar. J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997) i Rosok i sar. J. Biol. Chem.271:22611-22618 (1996)).
4. Humana antitela
U nekim otelotvorenjima otkrića, antitelo iz ovog dokumenta je humano antitelo. Humana antitela se mogu dobiti primenom različitih tehnika poznatih u struci. Humana antitela su generalno opisali van Dijk i van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) i Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008).
Humana antitela se mogu dobiti primenom imunogena na transgenu životinju koja je modifikovana da proizvodi netaknuta humana antitela ili netaknuta antitela sa humanim varijabilnim regionima kao odgovor na antigenski izazov. Takve životinje tipično sadrže kompletne lokuse humanog imunoglobulina ili njihov deo, koji zamenjuju lokuse endogenog imunoglobulina, ili koji su prisutni ekstrahromozomski ili nasumično integrisani u hromozome životinje. U takvim transgenim miševima, lokusi endogenog imunoglobulina su po pravilu inaktivirani. Pogledajte pregled postupaka za dobijanje humanih antitela od transgenih životinja u: Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005). Videti takođe npr., U.S. Patent br.
6,075,181 i 6,150,584 koji opisuju tehnologiju XENOMOUSE<™>; U.S. Patent br.5,770,429 koji opisuje tehnologiju HuMab<®>; U.S. Patent br. 7,041,870 koji opisuje tehnologiju K-M MOUSE<®>, i U.S. Patennu prijavu br. US 2007/0061900, koja opisuje tehnologiju VELOCIMOUSE<®>). Humani varijabilni regioni netaknutih antitela koje stvaraju takve životinje mogu se dalje modifikovati, npr. kombinovanjem sa različitim humanim konstantnim regionom.
Humana antitela se mogu takođe dobiti postupcima na bazi hibridoma. Opisane su ćelijske linije humanog mijeloma i mišjeg-humanog heteromijeloma za proizvodnju humanih monoklonskih antitela. (Vidite, npr. Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, str. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); i Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991).) Humana antitela proizvedena putem tehnologije hibridoma humane B-ćelije takođe su opisali Li i sar., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006). Dodatni postupci uključuju one opisane, na primer, u U.S. Patentu br.7,189,826 (opisuje proizvodnju monoklonskih humanih antitela IgM iz ćelijskih linija hibridoma) i Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006) (opisuje humanohumane hibridome). Tehnologiju humanih hibridoma (tehnologija trioma) takođe su opisali Vollmers i Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) i Vollmers i Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005).
Humana antitela takođe mogu da se proizvedu izolovanjem sekvenci varijabilnog domena Fv klona izabranih iz biblioteka displeja faga humanog porekla. Takve sekvence varijabilnog domena mogu onda da se kombinuju sa željenim humanim konstantnim domenom. Tehnike za izbor humanih antitela iz biblioteka antitela su opisane u nastavku.
5. Antitela dobijena iz biblioteka
Antitela iz otkrića mogu da se izoluju pretraživanjem kombinatornih biblioteka u potrazi za antitelima sa željenom aktivnošću ili aktivnostima. Na primer, u struci je poznat veliki broj metoda za stvaranje biblioteka prikaza faga i pretraživanje takvih biblioteka za antitela koja imaju željene karakteristike vezivanja. Pregled takvih postupaka dali su, npr. Hoogenboom et al. u Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001) a dalje su ih opisali, npr. McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Marks i Bradbury, u Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol.338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol.340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); i Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004).
Kod pojedinih postupaka displeja faga, repertoari VH i VL gena su odvojeno klonirani putem lančane reakcije polimeraze (PCR), i nasumično rekombinovani u biblioteke faga, koje zatim mogu da se pretražuju za antigen-vezujuće fage, kao što opisuju Winter i sar. Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994). Fagi tipično vrše displej fragmenata antitela, bilo kao jednolančani Fv (scFv) fragmenti ili kao Fab fragmenti. Biblioteke iz imunizovanih izvora daju antitela velikog afiniteta prema imunogenu, ne zahtevajući konstruisanje hibridoma. Alternativno, naivni repertoar može biti kloniran (npr. od ljudi) da bi se dobio jedan izvor antitela za širok spektar nesvojstvenih, kao i svojstvenih antigena bez ikakve imunizacije, kao što opisuju Griffiths i sar., EMBO J, 12: 725-734 (1993). Najzad, naivne biblioteke mogu takođe da se naprave sintetički, kloniranjem nepreuređenih segmenata V-gena iz matičnih ćelija, i upotrebom PCR prajmera koji sadrže nasumične sekvence za kodiranje veoma varijabilnih CDR3 regiona, i za postizanje premeštanja in vitro, kao što opisuju Hoogenboom i Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992). Patentne publikacije koje opisuju biblioteke faga humanih antitela su, na primer, sledeće: US patent br.5,750,373, i US patentne publikacije br.
2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936, i 2009/0002360.
Antitela ili fragmenti antitela izolovani iz biblioteka humanih antitela se ovde smatraju humanim antitelima ili fragmentima humanih antitela.
6. Multispecifična antitela
U bilo kojem od gore navedenih aspekata otkrića, anti-CD3 antitelo koje je ovde predviđeno je multispecifično antitelo, na primer, bispecifično antitelo. Multispecifična antitela su monoklonska antitela koja imaju sposobnost specifičnog vezivanja za najmanje dva različita mesta. U određenim aspektima, bispecifična antitela mogu da se vežu za dva različita epitopa CD3 (npr. CD3ε ili CD3y). U određenim aspektima otkrića, jedna od specifičnosti vezivanja je za CD3 (npr. CD3ε ili CD3y), a druga za bilo koji drugi antigen (npr. drugi biološki molekul, npr. površinski antigen ćelije, npr. tumorski antigen). Shodno tome, bispecifično anti-CD3
1
antitelo može imati specifičnosti vezivanja za CD3 i drugi biološki molekul, kao što je drugi biološki molekul (npr. tumorski antigen) naveden u Tabeli 1 i opisan u U.S. Pub. br.
2010/0111856.
TABELA 1. Ciljni tumorski antigeni za bispecifična anti-CD3 antitela iz pronalaska CD20 CD79a ETBR IL13Ralpha2 M-CSF P2X5 SSX-2
2
Bispecifično anti-CD3 antitelo (npr. bilo koje od gore opisanih anti-CD3 antitela) može imati specifičnosti vezivanja za CD3 i drugi biološki molekul kao što je kompleks peptida humanog leukocitnog antigena (HLA) koji MHC prezentuje na površini ćelije. Bispecifično anti-CD3 antitelo (npr. bilo koje od gore opisanih anti-CD3 antitela) može imati specifičnosti vezivanja za CD3 i drugi biološki molekul koji obuhvata kompleks HLA-peptida izabranog iz grupe koja sadrži 0772P (CA125, MUC16; Genbank pristupni br. AF36148); adipofilin (perilipin-2, protein povezan sa adipoznom diferencijacijom, ADRP, ADFP, MGC10598; NCBI referentna sekvenca: NP_001113.2); AIM-2 (odsutan kod melanoma 2, PYHIN4, protein AIM2 koji može da se indukuje interferonom; NCBI referentna sekvenca: NP_004824.1); ALDH1A1 (porodica aldehid dehidrogenaze 1, član A1, ALDH1, PUMB1, retinaldehid dehidrogenaza 1, ALDC, ALDH-E1, ALHDII, RALDH 1, EC 1.2.1.36, ALDH11, HEL-9, HEL-S-53e, HEL12, RALDH1, acetaldehid dehidrogenaza 1, aldehid dehidrogenaza 1, rastvorljiva, aldehid dehidrogenaza, citosol jetre, ALDH klase 1, luminalni protein pasemenika 12, luminalni protein pasemenika 9, sekretorni protein koji vezuje spermu pasemenika Li 53e, retinalna dehidrogenaza 1, RaIDH1, aldehidid dehidrogenaza porodica 1, član A1, aldehid dehidrogenaza, citosolna, EC 1.2.1; NCBI referentna sekvenca: NP_000680.2); alfa-aktinin-4 (ACTN4, aktinin, alfa 4, FSGS1, fokalna segmentna glomeruloskleroza 1, nemuskularni alfaaktinin 4, F-aktin umrežavajući protein, FSGS, AKTININ-4, aktinin alfa4 izooblik, alfaaktinin-4; NCBI referentna sekvenca: NP_004915.2); alfa-fetoprotein (AFP, HPAFP, FETA, alfa-1-fetoprotein, alfa-fetoglobulin, alfa-1-fetoprotein, alfa-fetoglobulin, HP; GenBank:
4
AAB58754.1); Amfiregulin (AREG, SDGF, faktor rasta dobijen od švanoma, faktor rasta dobijen od kolorektalnih ćelija, AR, CRDGF; GenBank: AAA51781.1); ARTC1 (ART1, ADP-ribozil transferaza 1, mono(ADP-ribozil)transferaza 1, ADP-riboziltransferaza C2 i C3 nalik toksinu 1, ART2, CD296, RT6, ADP-ribozil transferaza 2, GPI vezana NAD(P)(+)--arginin ADP-ribozil transferaza 1, EC 2.4.2.31, CD296 antigen; NP); ASLG659; ASPHD1 (protein 1 koji sadrži domen aspartat beta-hidroksilaze, protein 1 koji sadrži domen aspartat betahidroksilaze, EC 1.14.11.-, EC 1.14.11; GenBank: AAI44153.1); B7-H4 (VTCN1, domen V-skupa koji sadrži inhibitor aktivacije T ćelija 1, B7H4, član B7 superporodice 1, imunološki kostimulatorni protein B7-H4, B7h.5, kostimulatorni molekul T ćelija B7x, B7S1, B7X, VCTN1, H4, član porodice B7, PRO1291, član porodice B7, H4, kostimulatorni molekul T ćelija B7x, inhibitor aktivacije T ćelija koji sadrži domen V-skupa 1, protein B7S1; GenBank: AAZ17406.1); BAFF-R (TNFRSF13C, superfamilija receptora faktora nekroze tumora, član 13C, BAFFR, receptor faktora aktivacije B-ćelija, BAFF receptor, BLyS receptor 3, CVID4, BROMIX, CD268, receptor faktora aktivacije B-ćelija, proliksin, član superfamilije receptora faktora nekroze tumora 13C, BR3, CD268 antigen; NCBI referentna sekvenca: NP_443177.1); BAGE-1; BCLX (L); BCR-ABL fuzioni protein (b3a2); beta-katenin (CTNNB1, katenin (protein povezan sa kadherinom), beta 1, 88kDa, CTNNB, MRD19, katenin (protein povezan sa kadherinom), beta 1 (88kD), armadiljo, katenin beta-1; GenBank: CAA61107.1); BING-4 (WDR46, domen WD ponavljanja 46, C6orf11, BING4, protein koji sadrži WD ponavljanje BING4, otvoreni okvir za čitanje 11 hromozoma 6, FP221, UTP7, protein koji sadrži WD ponavljanje 46; NP); BMPR1B (receptor za koštani morfogenetički protein tipa IB, Genbank pristupni br. NM_00120; NP); B-RAF (Brevican (BCAN, BEHAB, Genbank pristupni br. AF22905); Brevican (BCAN, hondroitin sulfat proteoglikan 7, moždano obogaćeni hijaluronan vezujući protein, BEHAB, CSPG7, Brevican proteoglikan, protein jezgra Brevican, hondroitin sulfat proteoglikan BEHAB; GenBank: AAH27971.1); CALCA (polipeptid alfa povezan sa kalcitoninom, CALC1, kalcitonin 1, kalcitonin, alfa-tip CGRP, peptid I povezan sa genom kalcitonina, CGRP-I, CGRP, CGRP1, CT, KC, kalcitonin/ polipeptid povezan sa kalcitoninom, alfa, katakalcin; NP); CASP-5 (CASP5, kaspaza 5, cisteinska peptidaza povezana sa apoptozom, kaspaza 5, cisteinska proteaza povezana sa apoptozom, proteaza ICH-3, proteaza TY, ICE(rel)-III, ICE(rel)lIl, ICEREL-III, ICH-3, kaspaza-5, TY proteaza, EC 3.4.22.58, ICH3, EC 3.4.22; NP); CASP-8; CD19 (prekusor CD19-B-limfocitnog antigena CD19 izooblik 2, B4,CVID3 [Homo sapiens], NCBI referentna sekvenca: NP_001761.3); CD20 (CD20 - B-limfocitni antigen CD20, membrana koja se proteže na 4 domena, potfamilija A, član 1, B1, Bp35,CD20, CVID5,LEU-16,MS4A2,S7; NCBI referentna sekvenca: NP_690605.1); CD21 (CD21 (CR2 (komplementni receptor ili C3DR (C3d/ receptor Epštajn-Barovog virusa) ili Hs.73792 Genbank pristupni br. M2600); (CD22 (B-ćelijski receptor CD22-B izooblik, BL-CAM, Lyb-8, Lyb8, SIGLEC-2, FLJ22814, Genbank pristupni br. AK02646); CD22; CD33 (CD33 molekul, CD33 antigen (Gp67), lektin nalik na Ig koji se vezuje za sijalinsku kiselinu 3, lektin nalik na Ig koji se vezuje za sijalinsku kiselinu 3, SIGLEC3, gp67, SIGLEC-3, površinski antigen mijeloidnih ćelija CD33, p67, Siglec-3, CD33 antigen; GenBank: AAH28152.1); CD45; CD70 (CD70 - superfamilija faktora nekroze tumora (ligand), član 7; površinski antigen CD70; Ki-24 antigen; CD27 ligand; CD27-L; član superfamilije liganda faktora nekroze tumora 7; NCBI referentna sekvenca za vrstu homo sapiens: NP_001243.1); CD72 (CD72 (antigen diferencijacije B ćelija CD72, Lyb-; 359 aa, pl: 8,66, MW: 40225, TM: 1 [P] genski hromozom: 9p13.3, Genbank pristupni br. NP_001773.); CD79a (CD79a (CD79A, CD79a, alfa povezan sa imunoglobulinom, protein specifičan za B ćelije koji kovalentno interaguje sa Ig beta (CD79B) i formira kompleks na površini sa molekulima Ig M, transdukuje signal uključen u diferencijaciju B ćelija), pl: 4,84, MW: 25028 TM: 2 [P] genski hromozom: 19q13.2, Genbank pristupni br. NP_001774.1); CD79b (CD79b (CD79B, CD79b, IGb (beta povezan sa imunoglobulinom), B29, Genbank pristupni br. NM_000626 ili 1103867); Cdc27 (ciklus ćelijske deobe 27, D0S1430E, D17S978E, podjedinica kompleksa za promovisanje anafaze 3, podjedinica kompleksa za promovisanje anafaze 3, ANAPC3, APC3, CDC27Hs, H-NUC, homolog CDC27, homolog ciklusa ćelijske deobe 27 (S. Cerevisiae), HNUC, NUC2, kompleks za promovisanje anafaze, protein 3, homolog ciklusa ćelijske deobe 27, homolog proteina ćelijske deobe 27, homolog Nuc2; GenBank: AAH11656.1); CDK4 (ciklin-zavisna kinaza 4, proteinska kinaza ćelijske deobe 4, PSK-J3, EC 2.7.11.22, CMM3, EC 2.7.11; NCBI referentna sekvenca: NP_000066.1); CDKN2A (inhibitor ciklin-zavisne kinaze 2A, MLM, CDKN2, MTS1, inhibitor ciklin-zavisne kinaze 2A (melanom, P16, inhibira CDK4), inhibitor ciklin-zavisne kinaze 4 A, supresor višestrukih tumora 1, CDK4I, MTS-1, CMM2, P16, ARF, INK4, INK4A, P14, P14ARF, P16-INK4A, P16INK4, P16INK4A, P19, P19ARF, TP16, CDK4 inhibitor P16-INK4, negativni regulator beta ćelijskog ciklusa, p14ARF, p16-INK4, p16-INK4a, p16INK4A, p19ARF, p19ARF; NP); CEA; CLL1 (CLL-1 (CLEC12A, MICL, i DCAL, kodira člana superfamilije lektina C-tipa / domena C-tipa nalik na lektin (CTL/CTLD). Članovi ove familije dele zajedničko savijanje proteina i imaju različite funkcije, kao što su adhezija ćelija, signalizacija između ćelija, konverzija glikoproteina i uloge u inflamaciji i imunološkom odgovoru. Protein kodiran ovim genom je negativni regulator funkcije granulocita i monocita. Opisano je nekoliko alternativno splajsovanih varijanti transkripta ovog gena, ali nije utvrđena priroda pune dužine za neke od ovih varijanti. Ovaj gen je usko povezan sa drugim članovima superfamilije CTL/CTLD u regionu kompleksa gena prirodnog ubice na hromozomu 12p13 (Drickamer K Curr. Opin. Struct. Biol.9):585-90; van Rhenen A, et al., Blood 110):2659-66; Chen CH, et al. Blood 107):1459-67; Marshall AS, et al. Eur. J. Immunol.36):2159-69; Bakker AB, et al Cancer Res.64:8443-50; Marshall AS, et al J. Biol. Chem. 279:14792-80. Pokazalo se da je CLL-1 vrsta transmembranskog receptora koja obuhvata jedan domen nalik lektinu C-tipa (za koji nije predviđeno da vezuje kalcijum ni šećer), region stabljike, transmembranski domen i kratki citoplazmatski rep koji sadrži motiv ITIM); CLPP (proteolitička podjedinica peptidaze kazeinolitičke mitohondrijske matrice, endopeptidaza Clp, EC 3.4.21.92, PRLTS3, ATP-zavisna proteaza CIpAP (E. Coli), ClpP (kazeinolitička proteaza, ATP-zavisna, proteolitička podjedinica, E. Coli) homolog, ClpP kazeinolitička peptidaza, ATP-zavisna, homolog proteolitičke podjedinice (E. Coli), ClpP kazeinolitička proteaza, ATP-zavisna, homolog proteolitičke podjedinice (E. Coli), humana, proteolitička podjedinica, ATP-zavisna proteaza ClpAP, proteolitička podjedinica, humana, ClpP kazeinolitička peptidaza ATP-zavisna, proteolitička podjedinica, ClpP kazeinolitička peptidaza, ATP-zavisna, homolog proteolitičke podjedinice, ClpP kazeinolitička proteaza, ATP-zavisna, homolog proteolitičke podjedinice, putativna proteolitička podjedinica ATP-zavisne Clp proteaze, mitohondrijska; NP); COA-1; CPSF; CRIPTO (CRIPTO (CR, CR1, CRGF, CRIPTO, TDGF1, faktor rasta dobijen od teratokarcinoma, Genbank pristupni br. NP_003203 ili NM_00321); Cw6; CXCR5 CXCR5 (receptor Burkitovog limfoma 1, receptor spojen sa G proteinom koji se aktivira hemokinom CXCL13, ima funkciju u migraciji limfocita i humoralnoj odbrani, igra ulogu u infekciji HIV-2, a možda i u razvoju AIDS-a, limfoma, mijeloma i leukemije); 372 aa, pl: 8,54 MW: 41959 TM: 7 [P] genski hromozom: 11q23.3, Genbank pristupni br. NP_001707.); CXORF61 CXORF61 - hromozom X otvoreni okvir za čitanje 61[Homo sapiens], NCBI referentna sekvenca: NP_001017978.1); ciklin D1 (CCND1, BCL1, PRAD1, D11S287E, B-ćelijski CLL/limfom 1, protein B-ćelijskog limfoma 1, BCL-1 onkogen, PRAD1 onkogen, ciklin D1 (PRAD1: paratiroidna adenomatoza 1), G1/S-specifični ciklin D1, paratiroidna adenomatoza 1, U21B31, G1/S-specifični ciklin-D1, BCL-1; NCBI referentna sekvenca: NP_444284.1); ciklin-A1 (CCNA1, CT146, ciklin A1; GenBank: AAH36346.1); fuzioni protein dek-kan; DKK1 (Dickkopf WNT inhibitor signalnog puta 1, SK, hDkk-1, Dickkopf (Xenopus Laevis) homolog 1, Dickkopf 1 homolog (Xenopus Laevis), DKK-1, Dickkopf 1 homolog, Dickkopf povezani protein-1, nalik na Dickkopf-1, protein nalik na Dickkopf-1, protein povezan sa Dickkopf-1, Dickkopf-1, Dkk-1; GenBank: AAQ89364.1); DR1 (nishodni regulator transkripcije 1, TBP-vezujući (negativni kofaktor 2), negativni kofaktor 2-beta, fosfoprotein povezan sa TATA vezujućim proteinom, NC2, NC2-beta, protein Dr1, NC2-beta, nishodni regulator transkripcije 1; NCBI referentna sekvenca: NP_001929.1); DR13 (glavni histokompatibilni kompleks, klasa II, DR beta 1, HLA-DR1B, DRw10, DW2.2/DR2.2, SS1, DRB1, HLA-DRB, HLA klasa II antigen histokompatibilnosti, DR-1 beta lanac, humani leukocitni antigen DRB1, limfocitni antigen DRB1, antigen MHC klase II, HLA-DR beta 1 lanac MHC klase II, HLA-DR-beta ćelijski površinski glikoprotein MHC klase II, HLA-DRw10-Beta MCH klase II, DR-1, DR-12, DR-13, DR-14, DR-16, DR-4, DR-5, DR-7, DR-8, DR-9, DR1, DR12, DR13, DR14, DR16, DR4, DR5, DR7, DR8, DR9, DRw11, DRw8, HLA-DRB2, klon P2-beta-3, antigen DRB1*1 MHC klase II, antigen DRB1*10 MHC klase II, antigen DRB1*11 MHC klase II, antigen DRB1*12 MHC klase, antigen DRB1*13 MHC klase II, antigen DRB1*14 MHC klase, antigen DRB1*15 MHC klase II, antigen DRB1*16 MHC klase II, antigen DRB1*3 MHC klase II, antigen DRB1*4 MHC klase II, antigen DRB1*7 MHC klase II, antigen DRB1*8 MHC klase II, antigen DRB1*9 MHC klase II; NP); E16 (E16 (LAT1, SLC7A5, Genbank pristupni br. NM_00348); EDAR (EDAR - EDAR prekursor člana superfamilije receptora faktora nekroze tumora, EDA-A1 receptor; neaktivni homolog; receptor ektodisplazina-A; receptor ektodermalne displazije; receptor anhidrotičke ektodisplazije 1, DL; ECTD10A; ECTD10B; ED1R; ED3; ED5; EDA-A1R; EDA1R; EDA3; HRM1 [Homo sapiens]; NCBI referentna sekvenca: NP_071731.1); EFTUD2 (protein 2 koji sadrži vezujući domen faktora elongacije Tu GTP, protein 2 koji sadrži vezujući domen faktora elongacije Tu GTP, hSNU114, homolog SNU114, U5 SnRNP-specifični protein, 116 KDa, MFDGA, KIAA0031, 116 KD, U5 SnRNP specifični protein, 116 KDa U5 mala nuklearna ribonukleoproteinska komponenta, MFDM, SNRNP116, Snrp116, Snu114, U5-116KD, SNRP116, U5-116 KDa; GenBank: AAH02360.1); eGFR (receptor epidermalnog faktora rasta, ERBB, proto-onkogen C-ErbB-1, receptor tirozin-protein kinaze ErbB-1, ERBB1, HER1, EC 2.7.10.1, receptor epidermalnog faktora rasta (virusni homolog onkogena ptičje eritroblastne leukemije (V-Erb-B)), virusni homolog (ptičje) eritroblastne leukemije (V-Erb-B), PIG61, virusni homolog onkogena ptičje eritroblastne leukemije (V-Erb-B), protein inhibicije ćelijskog rasta 40, protein koji indukuje proliferaciju ćelija 61, mENA, EC 2.7.10; GenBank: AAH94761.1); EGFR-G719A; EGFR-G719C; EGFR-G719S; EGFR-L858R; EGFR-L861Q; EGFR-S7681; EGFR-T790M; faktor elongacije 2 (EEF2, faktor elongacije eukariotske translacije 2, EF2, polipeptidil-TRNK translokaza, EF-2, SCA26, EEF-2; NCBI referentna sekvenca: NP_001952.1); ENAH (hMena) (omogućeni homolog (Drosophila), MENA, omogućen kod sisara, ENA, NDPP1, homolog omogućen proteinom; GenBank: AAH95481.1) - rezultati samo za „ENAH“, ne i za „ENAH (hMena)“; EpCAM (epitelni ćelijski adhezioni molekul, M4S1, MIC18, transduktor kalcijumskog signala povezanog sa tumorom 1, TACSTD1, TROP1, antigen povezan sa adenokarcinomom, ćelijski površinski glikoprotein Trop-1, epitelni glikoprotein 314, glavni gastrointestinalni protein povezan sa tumorom GA733-2, EGP314, KSA, DIAR5, HNPCC8, antigen identifikovan monoklonskim antitelom AUA1, EGP-2, EGP40, ESA, KS1/4, MK-1, humani epitelni glikoprotein-2, membranska komponenta, hromozom 4, površinski marker (glikoprotein 35 kD), EGP, Ep-CAM, GA733-2, M1S2, CD326 antigen, površinski antigen epitelnih ćelija, hEGP314, KS 1/4 antigen, ACSTD1; GenBank: AAH14785.1); EphA3 (EPH Receptor A3, ETK1, ETK, TYRO4, HEK, tirozinska kinaza nalik na Eph 1, ETK1 receptor tirozin-proteinske kinaze, EK4, kinaza nalik na EPH 4, EC 2.7.10.1, EPHA3, HEK4, receptor efrina tipa A 3, humana embrio kinaza 1, TYRO4 protein tirozinska kinaza, hEK4, humana embrio kinaza, tirozin-proteinska kinaza TYRO4, EC 2.7.10; GenBank: AAH63282.1); EphB2R; epiregulin (EREG, ER, proepiregulin; GenBank: AAI36405.1); ETBR (EDNRB, endotelinski receptor tipa B, HSCR2, HSCR, endotelinski receptor neselektivnog tipa, ET-B, ET-BR, ETRB, ABCDS, WS4A, ETB, endotelinski B receptor; NP); ETV6-AML1 fuzioni protein; EZH2 (pojačivač zeste homologa 2 (Drosophila), lizin N-metiltransferaza 6, ENX-1, KMT6 EC 2.1.1.43, EZH1, WVS, pojačivač zeste (Drosophila) homologa 2, ENX1, EZH2b, KMT6A, WVS2, histon-lizin N-metiltransferaza EZH2, pojačivač zeste homologa 2, EC 2.1.1; GenBank: AAH10858.1); FcRH1 (FCRL1, nalik Fc receptoru 1, FCRH1, homolog Fc receptora 1, protein nalik FcR 1, protein povezan sa translokacijom imunološkog receptora 5, IFGP1, IRTA5, hIFGP1, IFGP familija proteina 1, CD307a, protein nalik Fc receptoru 1, Fc receptor superfamilije imunoglobulina, Gp42, FcRL1, CD307a antigen; GenBank: AAH33690.1); FcRH2 (FCRL2, nalik Fc receptoru 2, SPAP1, protein vezivanja fosfataze koji obuhvata SH2 domen 1, homolog Fc receptora 2, protein nalik na FcR 2, protein povezan sa translokacijom receptora imunoglobulina 4, FCRH2, IFGP4, IRTA4, protein familije IFGP 4, SPAP1A, SPAP1B, SPAP1C, CD307b, protein nalik Fc receptoru 2, protein 4 povezan sa translokacijom imunološkog receptora, Fc receptor superfamilije imunoglobulina, Gp42, protein vezivanja fosfataze koji obuhvata SG2 domen 1, FcRL2, CD307b antigen; GenBank: AAQ88497.1); FcRH5 (FCRL5, nalik Fc receptoru 5, IRTA2, homolog Fc receptora 5, protein nalik FcR 5, protein povezan sa translokacijom imunološkog receptora 2, BXMAS1, FCRH5, CD307, CD307e, PRO820, protein nalik receptoru Fc 5, receptor iz superfamilije imunoglobulina povezan sa translokacijom 2 (IRTA2), FcRL5, CD307e antigen; GenBank: AAI01070.1); FLT3-ITD; FN1(fibronektin 1, hladno nerastvorljivi globulin, FN, faktor stimulacije migracije, CIG, FNZ, GFND2, LETS, ED-B, FINC, GFND, MSF, fibronektin; GenBank: AAI43764.1); G250 (MN, CAIX, ugljenična anhidraza IX, ugljenična dehidrataza, RCC povezani protein G250, karbonatna dehidrataza IX, membranski antigen MN, antigen povezan sa karcinomom bubrežnih ćelija G250, CA-IX, P54/58N, pMW1, RCC povezani antigen G250, ugljenična anhidraza 9; NP); - rezultati drugih naziva za „G250“, ne i za „G250 / MN / CAIX“; GAGE-1,2,8; GAGE-3,4,5,6,7; GDNF-Ra1 (alfa receptor familije GDNF 1; GFRA1; GDNFR; GDNFRA; RETL1; TRNR1; RET1L; GDNFR-alfa1; GFR-ALFA-; U95847; BC014962; NM_145793 NM_005264); GEDA (Genbank pristupni br. AY26076); GFRA1 - alfa receptor familije GDNF-1; GDNF receptor alfa-1; GDNFR-alfa-1; GFR-alfa-1; RET ligand 1; TGF-beta povezani receptor neurotrofnog faktora 1 [Homo sapiens]; ProtKB/Swiss-Prot: P56159.2; glipikan-3 (GPC3, glipikan 3, SDYS, glipikan proteoglikan 3, intestinalni protein OCI-5, GTR2-2, MXR7, SGBS1, DGSX, OCI-5. SGB, SGBS, heparan sulfat proteoglikan, sekretovani glipikan-3, OCI5; GenBank: AAH35972.1); GnTVf; gp100 (PMEL, premelanozomni protein, SILV, D12S53E, PMEL17, SIL, melanocitni protein Pmel 17, antigen specifičan za liniju melanocita GP100, antigen povezan sa melanomom ME20, homolog srebrnog lokusa proteina, ME20-M, ME20M, P1, P100, nalik srebrnom proteinu (mišji homolog), srebrni homolog (mišji), ME20, SI, melanocitni protein Mel 17, melanocitni protein PMEL, protein melanozomne matrice 17, srebrni, mišji, homolog; GenBank: AAC60634.1); GPC; GPNMB (glikoprotein (transmembranski) Nmb, glikoprotein NMB, protein nalik glikoproteinu Nmb, osteoaktivin, transmembranski glikoprotein HGFIN, HGFIN, NMB, transmembranski glikoprotein, transmembranski glikoprotein NMB; GenBank: AAH32783.1); GPR172A (receptor spojen sa G proteinom 172A; GPCR41; FLJ11856; D15Ertd747e); NP_078807.1; NM_024531.3); GPR19 (receptor spojen sa G proteinom 19; Mm.478; NP_006134.1; NM_006143.2); GPR54 (KISS1 receptor; KISS1R; GPR54; HOT7T175; AXOR1; NP_115940.2; NM_032551.4); HAVCR1 (ćelijski receptor virusa hepatitisa A 1, član familije mucina T-ćelijskog imunoglobulina 1, molekul povrede bubrega 1, KIM-1, KIM1, TIM, TIM-1, TIM1, TIMD-1, TIMD1, TIMD1, receptor mucina T-ćelijskog imunoglobulina 1, T-ćelijski membranski protein 1, HAVCR, HAVCR-1, protein domena T-ćelijskog imunoglobulina i domena mucina 1, HAVcr-1, protein koji obuhvata domen T-ćelijskog imunoglobulina i mucina 1; GenBank: AAH13325.1); HER2 (ERBB2, V-Erb-B2 virusni homolog onkogena ptičje eritroblastne leukemije 2, NGL, NEU, homolog onkogena dobijen od neuro/glioblastoma, protein metastatskog limfnog čvora 19, proto-onkogen C-ErbB-2, proto-onkogen Neu, receptor ćelijske površine tipa tirozinske kinaze HER2, MLN 19, p185erbB2, EC 2.7.10.1, V-Erb-B2 virusni homolog onkogena ptičje eritroblastne leukemije 2 (homolog onkogena dobijen od neuro/glioblastoma), CD340, HER-2, HER-2/neu, TKR1, C-Erb B2/neu protein, herstatin, homolog onkogena dobijen od neuroblastoma/glioblastoma, receptor tirozin-proteinske kinaze ErbB-2, V-Erb-B2 homolog onkogena eritroblastne leukemije 2, homolog onkogena dobijenog od neuro/glioblastoma, MLN19, CD340 antigen, EC 2.7.10; NP); HER-2 / neu - drugi naziv za prethodno; HERV-K-MEL; HLA-DOB (beta podjedinica MHC klase II molekula (Ia antigen) koji vezuje peptide i prezentuje ih CD4+ T limfocitima); 273 aa, pl: 6,56, MW: 30820.TM: 1 [P] genski hromozom: 6p21.3, Genbank pristupni br. NP_002111); hsp70-2 (HSPA2, protein toplotnog šoka 70kDa 2, protein toplotnog šoka 70kD 2, HSP70-3, protein povezan sa toplotnim šokom 70 KDa 2, protein toplotnog šoka 70 KDa 2; GenBank: AAD21815.1); IDO1 (indolamin 2,3-dioksigenaza 1, IDO, INDO, indolamin-pirol 2,3-dioksigenaza, IDO-1, indolamin-pirol 2,3 dioksigenaza, indolamin 2,3 dioksigenaza, Indol 2,3 dioksigenaza, EC 1.13.11.52; NCBI referentna sekvenca: NP_002155.1); IGF2B3; IL13Ralfa2 (IL13RA2, receptor interleukina 13, alfa 2, antigen kancera/testisa 19, interleukin-13 vezujući protein, IL-13R-alfa-2, IL-13RA2, IL-13 receptorska podjedinica alfa-2, IL-13R podjedinica alfa-2, CD213A2, CT19, IL-13R, IL13BP, interleukin 13 vezujući protein, alfa lanac receptora 2 interleukina 13, interleukin-13 receptorska podjedinica alfa-2, IL13R, CD213a2 antigen; NP); IL20Rα; intestinalna karboksil esteraza; IRTA2 (drugi naziv za FcRH5); kalikrein 4 (KLK4, peptidaza povezana sa kalikreinom 4, PRSS17, EMSP1, serinska proteaza emajl matrice 1, protein nalik kalikreinu 1, serinska proteaza 17, KLK-L1, PSTS, AI2A1, kalikrein 4 (prostaza, emajl matrica, prostata), ARM1, EMSP, androgenom regulisana poruka 1, serinska proteaza emajl matrice 1, kalikrein, kalikrein-4, prostaza, EC 3.4.21.-, prostaza, EC 3.4.21; GenBank: AAX30051.1); KIF20A (član familije kinezina 20A, RAB6KIFL, RAB6 interagujući, (Rabkinesin6) nalik kinezinu, mitotik a; LAGE-1; fuzioni protein LDLR-fukoziltransferaza A; lengsin (LGSN, lengsin, protein sočiva sa domenom glutamin sintetaze, GLULD1, protein koji obuhvata domen glutamatamonijak ligaze 1, LGS, protein koji obiuhvata domen glutamat-amonijak ligaze (glutamin sintetaza) 1, protein koji obuhvata domen glutamat-amonijak ligaze (glutamin sintaza) 1, nalik glutamin sintazi sočiva; GenBank: AAF61255.1); LGR5 (receptor spojen sa G proteinom bogatim leucinskim ponavljanjem 5; GPR49, GPR6; NP_003658.1; NM_003667.2; LY64 (limfocitni antigen 64 (RP10, membranski protein tipa I familije bogate leucinskim ponavljanjem (LRR), reguliše aktivaciju i apoptozu B-ćelija, gubitak funkcije je povezan sa povećanom aktivnošću bolesti kod pacijenata sa sistemskim eritemskim lupusom); 661 aa, pl: 6,20, MW: 74147 TM: 1 [P] genski hromozom: 5q12, Genbank pristupni br. NP_005573.; Ly6E (kompleks limfocitnog antigena 6, lokus E; Ly67, RIG-E, SCA-2, TSA-; NP_002337.1; NM_002346.2); Ly6G6D (kompleks limfocitnog antigena 6, lokus G6D; Ly6-D, MEGT; NP_067079.2; NM_021246.2); LY6K (kompleks limfocitnog antigena 6, lokus K; LY6K;
1
HSJ001348; FLJ3522; NP_059997.3; NM_017527.3); LyPD1 - protein koji obuhvata LY6/PLAUR domen 1, PHTS [Homo sapiens], GenBank: AAH17318.1); MAGE-A1 (familija antigena melanoma A, 1 (usmerava ekspresiju antigena MZ2-E, MAGE1, familija antigena melanoma A 1, MAGEA1, antigen melanoma MAGE-1, antigen povezan sa melanomom 1, antigen povezan sa melanomom MZ2-E, antigen MZ2-E, antigen kancera /testisa 1.1, CT1.1, antigen MAGE-1, familija antigena kancera /testisa 1, član 1, familija antigena kancera /testisa 1, član 1, MAGE1A; NCBI referentna sekvenca: NP_004979.3); MAGE-A10 (MAGEA10, familija antigena melanoma A, 10, MAGE10, antigen MAGE-10, antigen povezan sa melanomom 10, antigen kancera /testisa 1.10, CT1.10, familija antigena kancera /testisa 1, član 10, familija antigena kancera /testisa 1, član 10; NCBI referentna sekvenca: NP_001238757.1); MAGE-A12 (MAGEA12, familija antigena melanoma A, 12, MAGE12, antigen kancera /testisa 1.12, CT1.12, antigen MAGE12F, familija antigena kancera /testisa 1, član 12, familija antigena kancera /testisa 1, član 12, antigen povezan sa melanomom 12, antigen MAGE-12; NCBI referentna sekvenca: NP_001159859.1); MAGE-A2 (MAGEA2, familija antigena melanoma A, 2, MAGE2, antigen kancera /testisa 1.2, CT1.2, MAGEA2A, antigen MAGE-2, familija antigena kancera /testisa 1, član 2, familija antigena kancera /testisa 1, član 2, antigen melanoma 2, antigen povezan sa melanomom 2; NCBI referentna sekvenca: NP_001269434.1); MAGE-A3 (MAGEA3, familija antigena melanoma A, 3, MAGE3, MAGE-3 antigen, antigen MZ2-D, antigen povezan sa melanomom 3, antigen kancera /testisa 1.3, CT1.3, familija antigena kancera /testisa 1, član 3, HIP8, HYPD, MAGEA6, familija antigena kancera /testisa 1, član 3; NCBI referentna sekvenca: NP_005353.1); MAGE-A4 (MAGEA4, familija antigena melanoma A, 4, MAGE4, antigen povezan sa melanomom 4, antigen kancera /testisa 1.4, CT1.4, antigen MAGE-4, antigen MAGE-41, antigen MAGE-X2, MAGE4A, MAGE4B, familija antigena kancera /testisa 1, član 4, MAGE-41, MAGE-X2, familija antigena kancera /testisa 1, član 4; NCBI referentna sekvenca: NP_001011550.1); MAGE-A6 (MAGEA6, familija antigena melanoma A, 6, MAGE6, antigen MAGE-6, antigen povezan sa melanomom 6, antigen kancera /testisa 1.6, CT1.6, antigen MAGE3B, familija antigena kancera /testisa 1, familija antigena melanoma A 6, član 6, MAGE-3b, MAGE3B, familija antigena kancera /testisa 1, član 6; NCBI referentna sekvenca: NP_787064.1); MAGE-A9 (MAGEA9, familija antigena melanoma A, 9, MAGE9, antigen MAGE-9, antigen povezan sa melanomom 9, antigen kancera /testisa 1.9, CT1.9, familija antigena kancera /testisa 1, član 9, familija antigena kancera /testisa 1, član 9, MAGEA9A; NCBI referentna sekvenca: NP_005356.1); MAGE-C1 (MAGEC1, familija antigena melanoma C, 1, antigen kancera /testisa 7.1, CT7.1, antigen MAGE-C1, familija antigena kancera /testisa 7, član 1, CT7, familija antigena kancera /testisa
2
7, član 1, antigen povezan sa melanomom C1; NCBI referentna sekvenca: NP_005453.2); MAGE-C2 (MAGEC2, familija antigena melanoma C, 2, MAGEE1, antigen kancera /testisa 10, CT10, HCA587, antigen melanoma, porodica E, 1, specifičan za kancer/testisa, antigen povezan sa hepatocelularnim karcinomom 587, antigen MAGE-C2, antigen MAGE-E1, antigen hepatocelularnog kancera 587, antigen povezan sa melanomom C2; NCBI referentna sekvenca: NP_057333.1); mamaglobin-A (SCGB2A2, sekretoglobin, familija 2A, član 2, MGB1, mamaglobin 1, UGB2, mamaglobin A, mamaglobin-A, mamaglobin-1, član 2 familije sekretoglobina 2A; NP); MART2 (HHAT, aciltransferaza ježa, SKI1, antigen melanoma koji prepoznaju T-ćelije 2, mršavi protein ježa 1, Skn, antigen melanoma koji prepoznaju T-ćelije 2, protein-cistein N-palmitoil transferaza HHAT, EC 2.3.1.-; GenBank: AAH39071.1); M-CSF (CSF1, faktor stimulacije kolonija 1 (makrofag), MCSF, CSF-1, lanimostim, faktor stimulacije kolonija makrofaga 1, lanimostim; GenBank: AAH21117.1); MCSP (SMCP, protein bogat cisteinom povezanim sa mitohondrijom sperme, MCS, selenoprotein mitohondrijske kapsule, HSMCSGEN1, protein bogat cisteinom povezanim sa mitohondrijom sperme; NCBI referentna sekvenca: NP_109588.2); XAGE-1b/GAGED2a; WT1 (Vilmsov tumor 1, WAGR, GUD, WIT-2, WT33, amino-terminalni domen EWS, NPHS4, poslednja tri cinkova kraka DNK-vezujućeg domena WT1, AWT1, protein Vilmsovog tumora, EWS-WT1; GenBank: AAB33443.1); VEGF; tirozinaza (TYR; OCAIA; OCA1A; tirozinaza; SHEP; NP_000363.1; NM_000372.4; GenBank: AAB60319.1); TrpM4 (BR22450, FLJ20041, TRPM4, TRPM4B, potencijalni katjonski kanal prelaznog receptora, potfamilija M, član 4, Genbank pristupni br. NM_01763); TRP2-INT2; TRP-2; TRP-1 /gp75 (protein povezan sa tirozinazom 1, 5,6-dihidroksiindol-2-karboksilna kiselina oksidaza, CAS2, CATB, TYRP, OCA3, katalaza B, b-PROTEIN, glikoprotein 75, EC 1.14.18., antigen melanoma Gp75, TYRP1, TRP, TYRRP, TRP1, SHEP11, DHICA oksidaza, EC 1.14.18, GP75, EC 1.14.18.1; triozafosfat izomeraza (triozafosfat izomeraza 1, TPID, triozafosfat izomeraza, HEL-S-49, TIM, sekretorni protein pasemenika Li 49, TPI, triozafosfat izomeraza, EC 5.3.1.1; TRAG-3 (član familije CSAG 2, familija antigena kancera /testisa 24, CSAG3B, član 2, član familije CSAG 3B, familija antigena kancera /testisa 24, član 2, antigen kancera /testisa 24.2, protein gena 2/3 povezanog sa hondrosarkomom, protein gena 3 povezanog sa taksolom ili rezistentnim na njega, protein gena 2/3 povezanog sa hondrosarkomom, CT24.2, protein gena 3 povezanog sa rezistencijom na taksol, TRAG-3, CSAG3A, TRAG3;); TMEM46 (shisa homolog 2 (Xenopus laevis); SHISA; NP_001007539.1; NM_001007538.1; TMEM118 (protein kraka prstena, transmembranski 2; RNFT2; FLJ1462; NP_001103373.1; NM_001109903.1; TMEFF1 (transmembranski protein sa domenom nalik na EGF i dva domena nalik folistatinu 1; tomoregulin-; H7365; C9orf2; C9ORF2; U19878; X83961; NM_080655; NM_003692; TGF-betaRII (TGFBR2, transformišući faktor rasta, beta receptor II (70/80kDa), TGFbeta-RII, MFS2, tbetaR-II, TGFR-2, TGF-beta receptor tipa IIB, TGF-beta tip II receptor, TGF-beta receptor tip-2, EC 2.7.11.30, beta receptor transformišućeg faktora rasta tip IIC, AAT3, TbetaR-II, transformišući faktor rasta, beta receptor II (70-80kD), TGF-beta receptor tipa II, FAA3, transformišući faktor rasta-beta receptor tipa II, LDS1B, HNPCC6, LDS2B, LDS2, RIIC, EC 2.7.11, TAAD2; TENB2 (TMEFF2, tomoregulin, TPEF, HPP1, TR, putativni transmembranski proteoglikan, povezan sa EGF/heregulin familijom faktora rasta i folistatinom); 374 aa, NCBI pristup: AAD55776, AAF91397, AAG49451, NCBI referentna sekvenca: NP_057276; NCBI gen: 23671; OMIM: 605734; SwissProt Q9UIK5; Genbank pristupni br. AF179274; AY358907, CAF85723, CQ782436; TAG-2; TAG-1 (kontaktin 2 (aksonski), TAG-1, AXT, aksonin-1 ćelijski adhezioni molekul, TAX, kontaktin 2 (tranzijentno eksprimiran), TAX1, kontaktin-2, aksonski glikoprotein TAG-1, tranzijentno eksprimiran aksonski glikoprotein, tranzijentni aksonski glikoprotein, aksonin-1, TAX-1, TAG1, FAME5; PRF: 444868); SYT-SSX1 ili -SSX2 fuzioni protein; survivin; STEAP2 (HGNC_8639, IPCA-1, PCANAP1, STAMP1, STEAP2, STMP, gen 1 povezan sa kancerom prostate, protein 1 povezan sa kancerom prostate, šest transmembranski epitelni antigen prostate 2, šest transmembranski protein prostate, Genbank pristupni br. AF45513; STEAP1 (šest transmembranski epitelni antigen prostate, Genbank pristupni br. NM_01244; SSX-4; SSX-2 (SSX2, sinovijalni sarkom, X tačka prekida 2, X tačka prekida 2, SSX, X tačka prekida 2B, antigen kancera/testisa 5.2, X-hromozom-povezani 2, tumorski antigen HOM-MEL-40, CT5.2, HD21, familija antigena kancera/testisa 5, HOM-MEL-40, izooblik B, familija antigena kancera/testisa 5 član 2a, član 2a, protein SSX2, sarkom, sarkom, sinovijalni, X-hromozompovezani 2, sinovijalni, sinovijalni sarkom, X tačka prekida 2B, sinovijalni sarkom, SSX2A; Sp17; SOX10 (SRY (region za određivanje pola Y)-boks 10, miš, PCWH, DOM, WS4, WS2E, WS4C, dominantni megakolon, miš, humani homolog, dominantni megakolon, SRY-povezani HG 10-boks gen 10, humani homolog, faktor transkripcije SOX-10; GenBank: CAG30470.1); SNRPD1 (mali nuklearni ribonukleoprotein D1, mali nuklearni ribonukleoprotein D1, polipeptid 16kDa, polipeptid (16kD), SNRPD, HsT2456, Sm-D1, SMD1, Sm-D autoantigen, mali nuklearni ribonukleoprotein D1 polipeptid 16kDa pseudogen, SnRNP protein jezgra D1, mali nuklearni ribonukleoprotein Sm D1; SLC35D3 (familija nosača rastvorka 35, član D3, FRCL1, protein nalik graničnoj vezi 1, bA55K22.3, Frc, protein nalik granici 1, familija nosača rastvorka 35 član D3; NCBI GenBank: NC_000006.11 NC_018917.2 NT_025741.16); SIRT2 (sirtuin 2, NAD-zavisna deacetilaza sirtuin-2, SIRL2, tihi informacioni regulator 2, regulatorni protein SIR2 homolog 2, Sir2-povezani protein tipa 2, protein nalik na SIR22, sirtuin tipa 2,
4
sirtuin (homolog regulacije tihih informacija o sparivanju 2) 2 (S.Cerevisiae), sirtuin-2, sirtuin (regulacija tihih informacija o sparivanju 2, S.Cerevisiae, homolog) 2, EC 3.5.1., SIR2; GenBank: AAK51133.1); Sema 5b (FLJ10372, KIAA1445, Mm.42015, SEMA5B, SEMAG, semaforin 5b Hlog, sema domen, sedam trombospondinskih ponavljanja (tip 1 i nalik tipu 1), transmembranski domen (TM) i kratki citoplazmatski domen, (semaforin) 5B, Genbank pristupni br. AB04087; secernin 1 (SCRN1, SES1, KIAA0193, secerin-1; GenBank: EAL24458.1); SAGE (SAGE1, antigen sarkoma 1, antigen kancera/testisa 14, CT14, putativni tumorski antigen; NCBI referentna sekvenca: NP_061136.2); RU2AS (KAAG1, antigen povezan sa bubregom 1, RU2AS, RU2 protein antisens gena, antigen povezan sa bubregom 1; GenBank: AAF23613.1); RNF43 - prekursor E3 ubikvitin-protein ligaze RNF43 [Homo sapiens], RNF124; URCC; NCBI referentna sekvenca: NP_060233.3; RhoC (RGS5 (regulator signalizacije G-proteina 5, MSTP032, regulator signalizacije G-proteina 5, MSTP092, MST092, MSTP106, MST106, MSTP129, MST129; GenBank: AAB84001.1); RET (ret protoonkogen; MEN2A; HSCR1; MEN2B; MTC1; PTC; CDHF12; Hs.168114; RET51; RET-ELE; NP_066124.1; NM_020975.4); RBAF600 (UBR4, ubikvitin protein ligaza E3 komponenta N-rekognin 4, krak cinka, UBR1 tipa 1, ZUBR1, E3 ubikvitin-protein ligaza UBR4, RBAF600, faktor povezan sa proteinom retinoblastoma 600 KDa, protein kraka cinka tipa UBR1 1, EC 6.3.2., N-rekognin-4, KIAA0462, p600, EC 6.3.2, KIAA1307; GenBank: AAL83880.1); RAGE-1 (MOK, MOK proteinska kinaza, antigen renalnog tumora, RAGE, MAPK/MAK/MRK preklapajuća kinaza, antigen renalnog tumora 1, antigen karcinoma renalnih ćelija, RAGE-1, EC 2.7.11.22, RAGE1; UniProtKB/Swiss-Prot: Q9UQ07.1); RAB38 / NY-MEL-1 (RAB38, NY-MEL-1, RAB38, član familije RAS onkogena, antigen melanoma NY-MEL-1, GTP-vezujući protein povezan sa Rab, protein povezan sa Ras Rab-38, rrGTPbp; GenBank: AAH15808.1); PTPRK (DJ480J14.2.1 (proteinska tirozin fosfataza, receptorski tip, K R-PTP-KAPPA, proteinska tirozin fosfataza kapa, proteinska tirozin fosfataza kapa), proteinska tirozin fosfataza, receptorski tip, K, proteinska-tirozin fosfataza kapa, proteinskatirozin fosfataza, receptorski tip, kapa, R-PTP-kappa, tirozinska-protein fosfataza kapa receptorskog tipa, EC 3.1.3.48, PTPK; GenBank: AAI44514.1); PSMA; PSCA hlg(2700050C12Rik, C530008O16Rik, RIKEN kDNK 2700050C12, RIKEN kDNK 2700050C12 gen, Genbank pristupni br. AY358628); PSCA (prekursor antigena matičnih ćelija prostate, Genbank pristupni br. AJ29743; PRDX5 (peroksiredoksin 5, EC 1.11.1.15, TPx tipa VI, B166, antioksidantski enzim B166, HEL-S-55, tkivo jetre 2D-Page Spot 71B, PMP20, enzim peroksizomalnog antioksidanska, PRDX6, tioredoksin peroksidaza PMP20, PRXV, AOEB166, sekretorni protein pasemenika Li 55, Alu ko-represor 1, peroksiredoksin-5, mitohondrijski, peroksiredoksin V, prx-V, tioredoksin reduktaza, Prx-V, ACR1, Alu korepresor, PLP; GenBank: CAG33484.1); PRAME (preferencijalno eksprimirani antigen kod melanoma, preferencijalno eksprimirani antigen melanoma, MAPE, OIP-4, OIPA, CT130, antigen kancera/testisa 130, antigen melanoma koji je preferencijalno eksprimiran kod tumora, Opainteragujući protein 4, Opa-interagujući protein OIP4; GenBank: CAG30435.1); pml-RARalfa fuzioni protein; PMEL17 (srebrni homolog; SILV; D12S53E; PMEL17; SI; SIL); ME20; gp10 BC001414; BT007202; M32295; M77348; NM_006928; PBF (ZNF395, protein kraka cinka 395, PRF-1, regulator Hantingtonove bolesti, protein koji se vezuje za regulatorni region HD gena, protein koji se vezuje za region 2, protein 2, regulatorni faktor za papiloma virus 1, HD-regulatorni faktor 2, regulatorni faktor za papiloma virus, PRF1, HDBP-2, Si-1-8-14, HDBP2, protein koji se vezuje za regulatorni region gena za Hantingtonovu bolest 2, HDRF-2, regulatorni faktor za papiloma virus PRF-1, PBF; GenBank: AAH01237.1); PAX5 (upareni boks 5, upareni boks homeotski gen 5, BSAP, upareni boks protein Pax-5, aktivator specifičan za B-ćelijsku liniju, gen uparenog domena 5, upareni boks gen 5 (aktivatorski protein specifičan za B-ćelijsku liniju), faktor transkripcije specifičan za B-ćelije, upareni boks gen 5 (aktivator specifičan za B-ćelijsku liniju); PAP (REG3A, alfa dobijen od regeneracionih ostrvaca 3, INGAP, PAP-H, hepatointestinalni protein pankreasa, PBBCGF, humani peptid proostrvaca, REG-III, protein povezan sa pankreatitisom 1, Reg3, Reg III-alfa, hepatokarcinom-crevapankreasa, protein III alfa dobijen od regeneracionih ostrvaca, faktor rasta beta ćelija pankreasa, HIP, PAP homologni protein, HIP/PAP, protein koji indukuje proliferaciju 34, PAP1, protein koji indukuje proliferaciju 42, REG-3-alfa, protein 3-alfa dobijen od regeneracionih ostrvaca, protein povezan sa pankreatitisom; GenBank: AAH36776.1); p53 (TP53, tumorski protein P53, TPR53, P53, ćelijski tumorski antigen P53, antigen NY-CO-13, mutantni tumorski protein 53, fosfoprotein P53, P53 supresor tumora, BCC7, protein povezan sa transformacijom 53, LFS1, tumorski protein 53, Li-Fraumeni sindrom, supresor tumora P53; P2X5 (purinergijski receptor P2X jonski kanal zavisan od liganda 5, jonski kanal zavisan od ekstracelularnog ATP, može biti uključen u sinaptičku transmisiju i neurogenezu, nedostatak može doprineti patofiziologiji idiopatske detrusorske nestabilnosti); 422 aa), pl: 7,63, MW: 47206 TM: 1 [P] genski hromozom: 17p13.3, Genbank pristupni br. NP_002552.; OGT (O-vezana N-acetilglukozamin (GIcNAc) transferaza, O-GIcNAc transferaza P110 podjedinica, O-vezana N-acetilglukozamin (GIcNAc) transferaza (UDP-N-acetilglukozamin:polipeptid-N-acetilglukozaminil transferaza, UDP-N-acetilglukozamin--peptid N-acetilglukozaminil transferaza podjedinica 110 KDa, UDP-N-acetilglukozamin:polipeptid-N-acetilglukozaminil transferaza, uridin difosfo-N-acetilglukozamin:polipeptid beta-N-acetilglukozaminil transferaza, O-GIcNAc transferaza podjedinica P110, EC 2.4.1.255, O-vezana N-acetilglukozamin transferaza podjedinica 110 KDa, EC 2.4.1, HRNT1, EC 2.4.1.186, O-GLCNAC; GenBank: AAH38180.1); OA1 (osteoartritis QTL 1, OASD; GenBank: CAA88742.1); NY-ESO-1/LAGE-2 (antigen kancera/testisa 1B, CTAG1B, NY-ESO-1, LAGE-2, ESO1, CTAG1, CTAG, LAGE2B, antigen kancera/testisa 1, autoimunogeni antigen kancera/testisa NY-ESO-1, antigen kancera 3, antigen kancera/testisa 6.1, Njujork karcinom skvamoznih ćelija jednjaka 1, L član familije antigena 2, LAGE2, CT6.1, LAGE2A; GenBank: AAI30365.1); NY-BR-1 (ANKRD30A, domen ankirinskog ponavljanja 30A, antigen kancera dojke NY-BR-1, antigen serološki definisanog kancera dojke NY-BR-1, protein koji obuhvata domen ankirinskog ponavljanja 30A; NCBI referentna sekvenca: NP_443723.2); N-ras (NRAS, homolog onkogena virusnog neuroblastoma (V-Ras), NRAS1, transformišući protein N-Ras, GTPase NRas, ALPS4, N-Ras protein deo 4, NS6, homolog onkogena, HRAS1; GenBank: AAH05219.1); NFYC (faktor nuklearne transkripcije Y, gama, HAP5, HSM, faktor nuklearne transkripcije Y podjedinica C, transaktivator HSM-1/2, CCAAT vezujući faktor podjedinica C, NF-YC, CCAAT transkripcioni vezujući faktor podjedinica gama, CAAT boks DNK-vezujući protein podjedinica C, histon H1 transkripcioni faktor velika podjedinica 2A, CBFC, faktor nuklearne transkripcije Y podjedinica gama, CBF-C, transaktivator HSM-1, H1TF2A, transkripcioni faktor NF-Y, C podjedinica; neo-PAP (PAPOLG, poli(A) polimeraza gama, neo-poli(A) polimeraza, nuklearna poli(A) polimeraza gama, polinukleotid adenilil transferaza gama, SRP RNK 3' adenilujući enzim/Pap2, PAP-gama, Neo-PAP, SRP RNK 3'-adenilujući enzim, PAP2, EC 2.7.7.19, PAPG; NCBI referentna sekvenca: NP_075045.2); NCA (CEACAM6, Genbank pristupni br. M1872); Napi3b (NAPI-3B, NPTIIb, SLC34A2, familija nosača rastvorka 34 (natrijum fosfat), član 2, tip II natrijum-zavisni fosfatni transporter 3b, Genbank pristupni br. NM_00642); miozin klase I; MUM-3; MUM-2 (TRAPPC1, kompleks transportnih čestica proteina 1, BET5, homolog BET5, MUM2, melanom svepristuno mutiran 2, protein multiplog mijeloma 2, kompleks transportnih čestica proteina podjedinica 1; MUM-1f; mucin (MUC1, mucin 1, povezan sa ćelijskom površinom, PEMT, PUM, CA 15-3, MCKD1, ADMCKD, medularna cistična bolest bubrega 1 (autozomno dominantna), ADMCKD1, mucin 1, transmembranski, CD227, antigen povezan sa karcinomom dojke DF3, MAM6, antigen kancera 15-3, MCD, mucin povezan sa karcinomom, MCKD, Krebs Von Den Lungen-6, MUC-1/SEC, urinarni mucin reaktivan na kikiriki, MUC1/ZD, antigen epitelne membrane povezane sa tumorom, antigen DF3, mucin povezan sa tumorom, episialin, EMA, antigen H23, H23AG, mucin-1, KL-6, epitelni mucin povezan sa tumorom, MUC-1, episialin, PEM, antigen CD227; UniProtKB/Swiss-Prot: P15941.3); MUC5AC (mucin 5AC, oligomerna sluzokoža/koji formira gel, traheobronhijalni mucin<,>MUC5, TBM, mucin 5, podtipovi A i C, traheobronhijalni/gastrični, leB, gastrični mucin, mucin 5AC, pseudogen oligomerne sluzokože/koji formira gel, Luisov B antigen krvne grupe, LeB, glavni glikoprotein disajnih puteva, MUC-5AC, mucin-5 podtip AC, traheobronhijalni; MUC1 (mucin 1, povezan sa ćelijskom površinom, PEMT, PUM, CA 15-3, MCKD1, ADMCKD, medularna cistična bolest bubrega 1 (autozomno dominantna), ADMCKD1, mucin 1, transmembranski, CD227, antigen povezan sa karcinomom dojke DF3, MAM6, antigen kancera 15-3, MCD, mucin povezan sa karcinomom, MCKD, Krebs Von Den Lungen-6, MUC-1/SEC, urinarni mucin reaktivan na kikiriki, MUC-1/X, polimorfni epitelni mucin, MUC1/ZD, antigen epitelne membrane povezane sa tumorom, antigen DF3, mucin povezan sa tumorom, episialin, EMA, antigen h23, H23AG, mucin-1, KL-6, epitelni mucin povezan sa tumorom, MUC-1, episialin, PEM, antigen CD227; MSG783 (RNF124, hipotetički protein FLJ20315, Genbank pristupni br. NM-01776; MRP4 - protein 4 povezan sa rezistencijom na više lekova izooblik 3, MOAT-B; MOATB [Homo sapiens]; NCBI referentna sekvenca: NP_001288758.1; MPF (MPF, MSLN, SMR, faktor potencijacije megakariocita, mezotelin, Genbank pristupni br. NM_00582; MMP-7 (MMP7, matrilizin, MPSL1, matrin, materična metaloproteinaza 7 (matrilizin, uterini), uterini matrilizin, materična metaloproteinaza-7, EC 3.4.24.23, Pump-1 proteaza, matrin, uterina metaloproteinaza, PUMP1, MMP-7, EC 3.4.24, PUMP-1; GenBank: AAC37543.1); MMP-2 (MMP2, matrična metalopeptidaza 2 (želatinaza A, želatinaza 72 kDa, kolagenaza tip IV 72 kDa), MONA, CLG4A, materična metaloproteinaza 2 (želatinaza A, želatinaza 72 kD, kolagenaza tip IV 72 kDa), CLG4, želatinaza 72 kDa, kolagenaza tip IV 72 kDa), matrična metaloproteinaza-2, MMP-II, želatinaza 72 KDa, kolagenaza tip IV-A, MMP-2, matrična metaloproteinaza-II, TBE-1, neutrofilna želatinaza, EC 3.4.24.24, EC 3.4.24; GenBank: AAH02576.1); i Meloe.
Anti-CD3 antitela iz pronalaska obuhvataju prvi vezujući domen koji obuhvata šest hipervarijabilnih regiona (HVR) (a) HVR-H1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:1; (b) HVR-H2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:2; (c) HVR-H3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:3; (d) HVR-L1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:4; (e) HVR-L2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:5; i (f) HVR-L3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:6, kao što je 40G5c i imaju drugi vezujući domen koji se vezuje za HER2. Drugi vezujući domen koji se vezuje za HER2 obuhvata šest hipervarijabilnih domena (HVR) (a) HVR-H1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:169; (b) HVR-H2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:170; (c) HVR-H3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:171; (d) HVR-L1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:172; (e) HVR-L2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:173; i (f) HVR-L3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:174, kao što ima anti-HER2 antitelo, hu4D5. U nekim slučajevima, drugi vezujući domen koji se vezuje za HER2 obuhvata najmanje jedan (npr. 1, 2, 3 ili 4) region okvira teškog lanca FR-H1, FR-H2, FR-H3 i FR-H4 koji obuhvata sekvence SEQ ID NO: 549-552, datim redosledom, i/ili najmanje jedan (npr.1, 2, 3 ili 4) region okvira lakog lanca FR-L1, FR-L2, FR-L3 i FR-L4 koji obuhvata sekvence SEQ ID NO: 553-556, datim redosledom. Drugi vezujući domen koji se vezuje za HER2 obuhvata (a) VH domen koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sekvence sa sekvencom SEQ ID NO: 270 ili tu sekvencu; i (b) VL domen koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sekvence sa sekvencom SEQ ID NO: 271 ili tu sekvencu.
U nekim aspektima otkrića, bispecifična antitela se takođe mogu koristiti za lokalizaciju citotoksičnih agensa na ćelije koje eksprimiraju tumorski antigen, kao što je tumorski antigen naveden u Tabeli 1 (npr. CD20, FcRH5, HER2, LYPD1, LY6G6D, PMEL17, LY6E, CD19, CD33, CD22, CD79A, CD79B, EDAR, GFRA1, MRP4, RET, Steap1, ili TenB2). Bispecifična antitela takođe mogu da se dobiju kao antitela kompletne dužine ili kao fragmenti antitela.
Tehnike za dobijanje multispecifičnih antitela uključuju, bez ograničenja, rekombinantnu koekspresiju dva imunoglobulinska para teški lanac – laki lanac sa različitim specifičnostima (videti Milstein i Cuello, Nature 305: 537 (1983)), WO 93/08829 i Traunecker et al., EMBO J.10: 3655 (1991)), kao i inženjerstvo „dugme u rupici“ (videti, npr. U.S. Patent br. 5,731,168). Inženjering multispecifičnih antitela „dugme u rupici“ može da se koristi za generisanje prvog kraka koji sadrži dugme i drugog kraka koji sadrži rupicu za koju se može vezati dugme prvog kraka. Dugme multispecifičnih antitela iz pronalaska može biti anti-CD3 krak u jednom otelotvorenju. Alternativno, dugme multispecifičnih antitela iz pronalaska može biti anticiljni/antigenski krak u jednom otelotvorenju. Rupica multispecifičnih antitela iz pronalaska može biti anti-CD3 krak u jednom otelotvorenju. Alternativno, rupica multispecifičnih antitela iz pronalaska može biti anticiljni/antigenski krak u jednom otelotvorenju. Multispecifična antitela takođe mogu biti konstruisana korišćenjem tehnologije imunoglobulinskog ukrštanja (takođe poznatog kao razmena domena Fab ili CrossMAB format) (pogledajte, npr. WO2009/080253; Schaefer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 108:11187-11192 (2011)). Multispecifična antitela se takođe mogu dobiti dizajniranjem pomoću efekata elektrostatičkog upravljanja, za dobijanje antitela Fc-heterodimernih molekula (WO 2009/089004A1); biokonjugacijom dva ili više antitela ili fragmenata (vidite, npr. US Patent br.4,676,980, i Brennan i sar., Science, 229: 81 (1985)); primenom leucinskih zatvarača da se dobiju bispecifična antitela (vidite, npr. Kostelny i sar., J. Immunol., 148(5): 1547-1553 (1992)); primenom tehnologije „dijatela“ za dobijanje fragmenata bispecifičnih antitela (vidite, npr. Hollinger i sar., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)); i primenom jednolančanih Fv (sFv) dimera (vidite, npr. Gruber i sar., J. Immunol., 152:5368 (1994)); i pripremom trispecifičnih antitela kao što opisuju, npr. Tutt i sar. J. Immunol.147: 60 (1991).
Dizajnirana antitela sa tri ili više funkcionalnih mesta vezivanja antigena, uključujući „antitela hobotnice“, ovde su takođe obuhvaćena (pogledajte, npr. US 2006/0025576A1).
Antitela, ili njihovi fragmenti antitela, takođe mogu da uključuju „dvojno delujuće FAb“ ili „DAF“, koje sadrži mesto vezivanja antigena koje se vezuje za CD3, kao i za drugi, različit antigen (npr. drugi biološki molekul) (pogledajte, npr. US 2008/0069820).
7. Varijante antitela
U određenim aspektima otkrića, razmatraju se varijante aminokiselinskih sekvenci anti-CD3 antitela iz pronalaska (npr. bispecifična anti-CD3 antitela iz pronalaska koja se vezuju za CD3 i drugi biološki molekul, npr. površinski ćelijski antigen, npr. tumorski antigen, kao što su TDB antitela iz pronalaska ili njihove varijante). Na primer, može biti poželjno da se poboljša afinitet vezivanja i/ili druga biološka svojstva antitela. Varijante aminokiselinskih sekvenci antitela se mogu dobiti uvođenjem odgovarajućih modifikacija u sekvencu nukleotida koja kodira antitelo ili putem sinteze peptida. Takve modifikacije uključuju, na primer, uklanjanje, i/ili umetanje, i/ili supstituciju ostataka u aminokiselinskim sekvencama antitela. Bilo koja kombinacija uklanjanja, umetanja i supstitucije može se napraviti da se dođe do finalnog konstrukta, pod uslovom da finalni konstrukt ima željene karakteristike, na primer, antigen vezujuće karakteristike.
a. Varijante supstitucije, ubacivanja i izbacivanja
U nekim aspektima predmetnog pronalaska, obezbeđene su varijante antitela koje imaju jednu ili više supstitucija aminokiselina. Mesta od interesa za supstitucionu mutagenezu uključuju HVR-ove i FR-ove. Konzervativne supstitucije su prikazane u Tabeli 2 pod naslovom „poželjne supstitucije”. Konkretnije izmene su date u Tabeli 2 pod naslovom „primeri supstitucija“ i, kako je opisano u nastavku, prema klasama bočnih nizova aminokiselina. Aminokiselinske supstitucije mogu biti uvedene u željeno antitelo i proizvode ispitane na željenu aktivnost, na primer, zadržano/poboljšano vezivanje antigena, smanjena imunogenost, ili poboljšan ADCC ili CDC.
TABELA 2. Primeri i poželjne supstitucije aminokiselina
Val (V) Ile; Leu; Met; Phe; Ala; norleucin Leu Aminokiseline mogu da se grupišu prema zajedničkim osobinama bočnog lanca: 1. (1) hidrofobne: norleucin, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
2. (2) neutralne hidrofilne: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
3. (3) kisele: Asp, Glu;
4. (4) bazne: His, Lys, Arg;
5. (5) ostaci koji utiču na orijentaciju niza: Gly, Pro;
6. (6) aromatične: Trp, Tyr, Phe.
1
Nekonzervativne supstitucije zahtevaju izmenu člana jedne od ovih klasa drugom klasom.
Jedna vrsta supstitucionih varijanti uključuje supstituciju jednog ili više ostataka hipervarijabilnog regiona matičnog antitela (npr. humanizovanog ili humanog antitela). Po pravilu, nastale varijante izabrane za dalje ispitivanje će imati modifikacije (npr. poboljšanja) izvesnih bioloških osobina (npr. povećan afinitet, smanjenu imunogenost) u odnosu na matično antitelo i/ili će imati suštinski zadržane izvesne biološke osobine matičnog antitela. Primer supstitucione varijante je afinitetno zrelo antitelo, koje može biti stvoreno na pogodan način, npr. korišćenjem tehnika afinitetnog sazrevanja na osnovu displeja faga, kao što su one ovde opisane. Ukratko, jedan ili više HVR ostataka su mutirani, i varijantna antitela su izložena na fagu i ispitana u pogledu određene biološke aktivnosti (npr. afiniteta vezivanja).
Izmene (npr. supstitucije) mogu se napraviti u HVR-ima, npr. radi poboljšanja afiniteta antitela. Takve izmene mogu se napraviti na „žarištima“ HVR, tj. ostacima kodiranim kodonima, koji trpe mutaciju sa visokom učestalošću tokom procesa somatskog sazrevanja (vidite, npr. Chowdhury, Methods Mol. Biol.207:179-196 (2008)), i/ili ostacima koji ostvaruju kontakt sa antigenom, pri čemu se dobijene varijante VH ili VL ispituju na afinitet vezivanja. Afinitetno sazrevanje putem konstruisanja i ponovnog izbora iz sekundarnih biblioteka opisano je npr. u Hoogenboom et al. u Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O’Brien et al. eds., Human Press, Totowa, NJ, (2001).) U nekim aspektima afinitetnog sazrevanja, raznovrsnost se uvodi u varijabilne gene izabrane za sazrevanje putem bilo koje od raznovrsnih postupaka (npr. PCR koji favorizuje greške, mešanje lanaca ili mutageneza kontrolisana oligonukleotidima). Zatim se kreira sekundarna biblioteka. Biblioteka se zatim pretražuje radi identifikovanja varijanti antitela sa željenim afinitetom. Drugi postupak za uvođenje raznovrsnosti uključuje pristup usmeren na HVR, gde je nekoliko HVR ostataka randomizovano (npr. 4-6 ostataka istovremeno). HVR ostaci uključeni u vezivanje antigena mogu biti specifično identifikovani, npr. primenom skenirajuće mutageneze sa alaninom ili modelovanja. Posebno su često ciljani CDR-H3 i CDR-L3.
U nekim aspektima predmetnog pronalaska, supstitucije, umetanja ili uklanjanja se mogu desiti u jednom ili više HVR, dokle god takve izmene ne utiču značajno na smanjenje sposobnosti antitela da vezuje antigen. Na primer, u HVR regionima se mogu načiniti konzervativne izmene (npr. konzervativne supstitucije kao što su ovde date) koje znatno ne umanjuju afinitet vezivanja. Takve izmene mogu, na primer, biti izvan ostataka koji ostvaruju kontakt sa antigenom u HVR-ima. U nekim aspektima predmetnog pronalaska varijanti VH i
2
VL sekvenci datih iznad, svaki HVR je neizmenjen ili sadrži najviše jednu supstituciju, dve ili tri supstitucije aminokiselina.
Korisna metoda za identifikovanje ostataka ili regiona antitela koji mogu biti ciljani za mutagenezu zove se „skenirajuća mutageneza sa alaninom“, i opisali su je Cunningham i Wells (1989) Science, 244:1081-1085. Prema ovoj metodi, ostatak ili grupa ciljnih ostataka (npr. naelektrisani ostaci, kao što su arg, asp, his, lys i glu) identifikuje se i zamenjuje neutralnom ili negativno naelektrisanom aminokiselinom (npr. alaninom ili polialaninom) da bi se odredilo da li to utiče na interakciju antitela sa antigenom. Dalje supstitucije mogu biti uvedene na lokacijama aminokiselina koje pokazuju funkcionalnu osetljivost na inicijalne supstitucije. Alternativno, ili dodatno, kristalna struktura kompleksa antigen–antitelo služi za identifikovanje tačaka kontakta antitela sa antigenom. Takvi kontaktni ostaci i susedni ostaci mogu biti ciljani, ili eliminisani kao kandidati za supstituciju. Varijante se mogu pregledati da bi se odredilo da li imaju željena svojstva.
Ubacivanja aminokiselinskih sekvenci obuhvataju spajanje amino- i/ili karboksiterminalnog kraja, pri čemu se dužina kreće od jednog ostatka do polipeptida koji sadrže sto ili više ostataka, kao i ubacivanje u sekvencu jednog aminokiselinskog ostatka, ili većeg broja. Primeri terminalnih umetanja uključuju antitelo sa N-terminalnim metionil ostatkom. Druge varijante molekula antitela sa ubacivanjem obuhvataju spajanje sa N-terminalnim ili C-terminalnim krajem antitela sa enzimom (npr. za ADEPT) ili polipeptid, što povećava poluživot antitela u serumu.
b. Varijante glikozilacije
U određenim otelotvorenjima otkrića, anti-CD3 antitela iz pronalaska (npr. bispecifična anti-CD3 antitela iz pronalaska koja se vezuju za CD3 i drugi biološki molekul, npr. površinski antigen ćelije, npr. HER2) mogu se izmeniti kako bi se povećala ili smanjila mera u kojoj je antitelo glikozilovano. Dodavanje ili uklanjanje mesta glikozilacije na anti-CD3 antitelu iz pronalaska može se pogodno postići izmenom aminokiselinske sekvence, tako da se jedno ili više mesta glikozilacije dodaju ili uklone.
Kada antitelo sadrži Fc region, može biti izmenjen ugljovodonik vezan za njega. Nativna antitela koja proizvode ćelije sisara tipično sadrže razgranati, biantenarni oligosaharid koji je tipično vezan N-vezom za Asn297 CH2 domena Fc regiona. Pogledajte, npr. Wright i sar. TIBTECH 15:26-32 (1997). Oligosaharid može da obuhvata različite ugljene hidrate, npr. manozu, N-acetil glukozamin (GIcNAc), galaktozu i sijalinsku kiselinu, kao i fukozu vezanu za GIcNAc na „bazi“ biantenarne oligosaharidne strukture. U nekim otelotvorenjima, modifikacije oligosaharida u antitelu iz predmetnog pronalaska mogu biti načinjene da bi se dobile varijante antitela sa određenim poboljšanim svojstvima.
U jednom otelotvorenju otkrića, date su varijante anti-CD3 antitela koja imaju ugljovodoničnu strukturu kojoj nedostaje fukoza vezana (direktno ili indirektno) za Fc region. Na primer, količina fukoze u tom antitelu može biti od 1% do 80%, od 1% do 65%, od 5% do 65% ili od 20% do 40%. Količina fukoze se određuje izračunavanjem prosečne količine fukoze u šećernom lancu na Asn297, u odnosu na zbir svih glikostruktura vezanih za Asn297 (npr. kompleksne, hibridne ili strukture sa visokim sadržajem manoze), kao što je određeno MALDI-TOF masenom spektrometrijom, npr. kao što je opisano u WO2008/077546. Asn297 se odnosi na asparaginski ostatak koji se nalazi oko položaja 297 u Fc regionu (prema EU numeraciji ostataka Fc regiona); međutim, Asn297 takođe može da se nalazi oko ± 3 aminokiseline više ili niže od položaja 297, tj. između položaja 294 i 300, usled manjih varijacija sekvenci kod antitela. Takve varijante fukozilacije mogu da imaju poboljšanu ADCC funkciju. Videti npr. US Patent Publication br. US 2003/0157108 (Presta, L.); US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Primeri publikacija vezanih za „defukozilovane“ ili varijante antitela „sa manjkom fukoze“ uključuju: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; Okazaki et al. J. Mol. Biol.336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng.87: 614 (2004). Primeri za ćelijske linije sposobne za proizvodnju defukozilovanih antitela uključuju Led 3 CHO ćelije sa manjkom fukozilacije proteina (Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); US Pat Appl br. US 2003/0157108 A1, Presta, L; i WO 2004/056312 A1, Adams et al., naročito u Primeru 11) i nokaut ćelijske linije, kao što je gen alfa-1,6-fukozil transferaze, FUT8, nokaut CHO ćelije (videti, npr. Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006); i WO2003/085107).
Varijante anti-CD3 antitela su dalje obezbeđene sa prepolovljenim oligosaharidima, npr. kod kojih je biantenarni oligosaharid vezan za Fc region antitela bisektovan pomoću GIcNAc. Takve varijante antitela mogu da imaju smanjenu fukozilaciju i/ili poboljšanu ADCC funkciju. Primeri takvih varijanti antitela su opisani npr. u WO 2003/011878 (Jean-Mairet et al.); US Patent br.6,602,684 (Umana et al.); i US 2005/0123546 (Umana et al.). Takođe se obezbeđuju i varijante antitela sa najmanje jednim ostatkom galaktoze u oligosaharidu vezanom za Fc region. Takve varijante antitela mogu da imaju poboljšanu CDC funkciju. Takve varijante antitela su opisane, npr. u WO 1997/30087 (Patel et al.); WO 1998/58964 (Raju, S.); i WO 1999/22764 (Raju, S.).
4
c. Varijante Fc regiona
U određenim otelotvorenjima, jedna ili više modifikacija aminokiselina može se uvesti u Fc region anti-CD3 antitela iz pronalaska (npr. bispecifično anti-CD3 anti-HER2 antitelo iz pronalaska koje se vezuje za CD3 i HER2, kao što je TDB antitelo iz pronalaska ili njegove varijante), čime se stvara varijanta Fc regiona (vidi npr. US 2012/0251531). Varijanta Fc regiona može da sadrži sekvencu humanog Fc regiona (npr. humani Fc region IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4) koji sadrži modifikaciju aminokiseline (npr. supstituciju) na jednom ili više mesta aminokiselina.
U određenim otelotvorenjima, pronalazak razmatra varijantu anti-CD3 anti-HER2 bispecifičnog antitela koja ima neke, ali ne sve efektorske funkcije, što je čini pogodnim kandidatom za primene kod kojih je poluživot antitela in vivo važan, dok su pojedine efektorske funkcije (kao što su komplementna i ADCC) nepotrebne ili štetne. In vitro i/ili in vivo testovi citotoksičnosti se mogu sprovesti radi potvrde smanjenja/sniženja aktivnosti CDC i/ili ADCC. Na primer, testovi vezivanja Fc receptora (FcR) mogu se sprovesti kako bi se obezbedilo da antitelo nema vezivanje FcyR (stoga, verovatno nema aktivnost ADCC), ali zadržava sposobnost vezivanja FcRn. Primarne ćelije za posredovanje ADCC, NK ćelije, eksprimiraju samo Fc(RIII, dok monociti eksprimiraju Fc(RI, Fc(RII i Fc(RIII. Ekspresija FcR na hematopoetskim ćelijama je rezimirana u Tabeli 3 na strani 464, Ravetch i Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991). Neograničavajući primeri za in vitro testove za procenu aktivnosti ADCC željenog molekula opisani su u U.S. patentu br.5,500,362 (vidite, npr. Hellstrom, I. et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)) i Hellstrom, I et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985); 5,821,337 (vidite Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med.166:1351-1361 (1987)). Alternativno, mogu se koristiti neradioaktivni postupci analiza (videti, npr. ACTI<™>neradioaktivni test citotoksičnosti za protočnu citometriju (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA; i CytoTox 96<®>neradioaktivni test citotoksičnosti (Promega, Madison, WI). Korisne efektorske ćelije za takve testove uključuju mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) i ćelije prirodne ubice (NK). Umesto toga, ili pored toga, ADCC aktivnost željenog molekula može se odrediti in vivo, npr. na životinjskom modelu, kao što je izloženo u radu Clynes et al. Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998). Testovi vezivanja C1q mogu takođe da se izvedu kako bi se potvrdilo da antitelo ne može da veže C1q i da, stoga, nema CDC aktivnost. Pogledajte, npr. C1q i C3c vezujući ELISA test u WO 2006/029879 i WO 2005/100402. Za procenu aktivacije komplementa, može da se obavi CDC test (videti, na primer, Gazzano-Santoro et al. J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M.S. et al. Blood.
101:1045-1052 (2003); i Cragg, M.S. i M.J. Glennie Blood.103:2738-2743 (2004)). Vezivanje FcRn i in vivo određivanje klirensa/poluživota može takođe da se izvrši pomoću postupaka poznatih u struci (pogledajte, npr. Petkova, S.B. et al. Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006)).
Antitela sa redukovanom efektorskom funkcijom uključuju ona sa supstitucijom jednog ili više ostataka Fc regiona 238, 265, 269, 270, 297, 327 i 329 (U.S. Patent br. 6,737,056 i 8,219,149). Takvi Fc mutanti obuhvataju Fc mutante sa supstitucijama na dva ili više položaja aminokiselina 265, 269, 270, 297 i 327, uključujući takozvani „DANA“ Fc mutant sa supstitucijom ostataka 265 i 297 alaninom (US Patent br.7,332,581 i 8,219,149).
U određenim otelotvorenjima, prolin na položaju 329 humanog Fc regiona divljeg tipa u antitelu supstituisan je glicinom ili argininom ili aminokiselinskim ostatkom dovoljno velikim da uništi prolinski sendvič unutar međupovršine Fc/Fc.gama receptora koja se formira između prolina 329 Fc i ostataka triptofana Trp 87 i Trp 110 FcgRIII (Sondermann et al.: Nature 406, 267-273 (20 Jul. 2000)). U određenim otelotvorenjima, antitelo sadrži najmanje jednu dalju supstituciju aminokiselina. U jednom otelotvorenju, dalja supstitucija aminokiselina je S228P, E233P, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D ili P331S, a u još jednom otelotvorenju, najmanje jedna dodatna supstitucija aminokiselina je L234A i L235A Fc regiona humanog IgG1 ili S228P i L235E Fc regiona humanog IgG4 (vidite, npr. US 2012/0251531), a u drugom otelotvorenju, najmanje jedna dodatna supstitucija aminokiselina je L234A i L235A i P329G Fc regiona humanog IgG1.
Opisane su pojedine varijante antitela sa poboljšanim ili smanjenim vezivanjem za FcR. (Pogledajte, npr. U.S. Patent br. 6,737,056; WO 2004/056312, i Shields et al., J. Biol. Chem.
9(2): 6591-6604 (2001).)
U pojedinim otelotvorenjima, varijanta antitela sadrži Fc region sa jednom ili više supstitucija aminokiselina koje poboljšavaju ADCC, npr. supstitucije na položajima 298, 333 i/ili 334 Fc regiona (EU numeracija ostataka).
U pojedinim otelotvorenjima, napravljene su izmene u Fc regionu koje imaju za rezultat izmenjeno (tj. poboljšano ili smanjeno) C1q vezivanje i/ili komplementno zavisnu citotoksičnost (CDC), npr. kao što opisuje US Patent br.6,194,551, WO 99/51642, i Idusogie i sar. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000).
Antitela sa produženim poluživotom i poboljšanim vezivanjem za neonatalni Fc receptor (FcRn), koji je odgovoran za transfer IgG majke na fetus (Guyer et al., J. Immunol.
117:587 (1976) i Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)), opisana su u US2005/0014934A1 (Hinton et al.). Ta antitela sadrže Fc region sa jednom ili više supstitucija koje poboljšavaju vezivanje Fc regiona za FcRn. Takve Fc varijante uključuju one sa supstitucijom na jednom ili više ostataka Fc regiona: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 ili 434, npr. supstitucija ostatka Fc regiona 434 (US Patent br. 7,371,826).
Pogledajte takođe Duncan i Winter, Nature 322:738-40 (1988); U.S. Patent br.
5,648,260; U.S. Patent br.5,624,821; i WO 94/29351 koji se tiču drugih primera za varijante Fc regiona.
U nekim aspektima, bispecifično anti-CD3 antitelo obuhvata Fc region koji obuhvata N297G mutaciju. U nekim otelotvorenjima otkrića, anti-CD3 antitelo koje obuhvata mutaciju N297G obuhvata anti-CD3 krak koji obuhvata prvi vezujući domen koji obuhvata sledećih šest HVR: (a) HVR-H1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1; (b) HVR-H2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 2; (c) HVR-H3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 3; (d) HVR-L1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 4; (e) HVR-L2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 5; i (f) HVR-L3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 6; i anti-HER2 krak koji obuhvata drugi vezujući domen koji obuhvata sledećih šest HVR: (a) HVR-H1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 169; (b) HVR-H2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 170; (c) HVR-H3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 171; (d) HVR-L1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 172; (e) HVR-L2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 173; i (f) HVR-L3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 174.
Pored toga, anti-CD3 antitelo koje obuhvata mutaciju N297G obuhvata anti-CD3 krak koji obuhvata prvi vezujući domen koji obuhvata (a) VH domen koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 95% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 184 i (b) VL domen koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 95% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 185, i anti-HER2 krak koji obuhvata drugi vezujući domen koji obuhvata (a) VH domen koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 95% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 270 i (b) VL domen koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 95% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 271.
U nekim otelotvorenjima otkrića, anti-CD3 antitelo koje obuhvata N297G mutaciju obuhvata jedan ili više konstantnih domena teškog lanca, pri čemu su jedan ili više konstantnih domena teškog lanca izabrani od prvog CH1 (CH11) domena, prvog CH2 (CH21) domena, prvog CH3 (CH31) domena, drugog CH1 (CH12) domena, drugog CH2 (CH22) domena i drugog CH3 (CH32) domena. U nekim slučajevima, najmanje jedan od jednog ili više konstantnih domena teškog lanca sparen je sa drugim konstantnim domenom teškog lanca. U nekim slučajevima, svaki od domena CH31i CH32sadrži ispupčenje ili šupljinu, pri čemu se ispupčenje ili šupljina u CH31domenu može pozicionirati u šupljinu, odnosno ispupčenje, u CH32domenu. U nekim slučajevima, CH31i CH32domeni se sastaju na međupovršini između navedenog ispupčenja i šupljine. U nekim slučajevima, svaki od domena CH21i CH22sadrži ispupčenje ili šupljinu, pri čemu se ispupčenje ili šupljina u CH21domenu može pozicionirati u šupljinu, odnosno ispupčenje, u CH22domenu. U drugim slučajevima, CH21i CH22domeni se sastaju na međupovršini između navedenog ispupčenja i šupljine. U nekim slučajevima, anti-CD3 antitelo je IgG1 antitelo.
U drugim otelotvorenjima, anti-CD3 antitelo koje obuhvata mutaciju N297G obuhvata anti-CD3 krak koji se sastoji od prvog vezujućeg domena koji obuhvata (a) VH domen koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 95% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 184 i (b) VL domen koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 95% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 185, kao i sledećih šest HVR-ova: (i) HVR-H1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1; (ii) HVR-H2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 2; (iii) HVR-H3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 3; (iv) HVR-L1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 4; (v) HVR-L2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 5; i (vi) HVR-L3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 6; i anti-HER2 krak koji se sastoji od drugog vezujućeg domena koji obuhvata (a) VH domen koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 95% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 270 i (b) VL domen koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 95% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 271, kao i sledećih šest HVR-ova: (i) HVR-H1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 169; (ii) HVR-H2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 170; (iii) HVR-H3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 171; (iv) HVR-L1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 172; (v) HVR-L2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 173; i (vi) HVR-L3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 174; pri čemu (a) anti-CD3 krak obuhvata supstitucione mutacije T366S, L368A, Y407V i N297G i (b) anti-HER2 krak obuhvata supstitucione mutacije T366W i N297G.
d. Varijante antitela projektovane sa cisteinom
U nekim otelotvorenjima otkrića, može biti poželjno da se naprave antitela projektovana sa cisteinom, npr. „tioMAb”, kod kojih je jedan ostatak ili više ostataka antitela zamenjeno ostacima cisteina. U određenim otelotvorenjima, supstituisani ostaci se nalaze na pristupačnim mestima na antitelu. Supstitucijom tih ostataka cisteinom, reaktivne tiolske grupe se time postavljaju na pristupačna mesta na antitelu i mogu se koristiti za konjugovanje antitela sa drugim funkcionalnim ostacima, kao što su funkcionalni ostaci lekova ili funkcionalni ostaci linker-lek, da bi se dobio imunokonjugat, kao što je opisano ovde. U određenim otelotvorenjima, bilo koji, ili više ostataka navedenih u nastavku mogu biti supstituisani cisteinom: V205 (Kabatova numeracija) lakog lanca; A118 (EU numeracija) teškog lanca; i S400 (EU numeracija) teškog lanca Fc regiona. Antitela konstruisana sa cisteinom mogu se dobiti kao što je opisano, na primer, u U.S. Patentu br.7,521,541.
e. Derivati antitela
U određenim otelotvorenjima, bispecifično anti-CD3 antitelo iz ovog pronalaska koje se vezuje za CD3 i HER2, kao što je TDB antitelo iz pronalaska koje je ovde obezbeđeno može se dalje modifikovati tako da sadrži dodatne neproteinske delove koji su poznati u tehnici i lako dostupni. Funkcionalni ostaci pogodni za derivatizaciju antitela uključuju, bez ograničenja, polimere rastvorljive u vodi. Neograničavajući primeri za hidrosolubilne polimere uključuju, ali nisu ograničeni na polietilen glikol (PEG), kopolimere etilen glikol/propilen glikol, karboksimetilcelulozu, dekstran, polivinil alkohol, polivinil pirolidon, poli-1,3-dioksolan, poli-1,3,6-trioksan, kopolimer etilen/anhidrid maleinske kiseline, poliaminokiseline (homopolimere ili nasumične kopolimere), i dekstran ili poli(n-vinil pirolidon)polietilen glikol, propropilen glikol homopolimere, kopolimere polipropilen oksid/etilen oksid, polioksietilovane poliole (npr. glicerol), polivinil alkohol, i njihove smeše. Polietilen glikol propionaldehid može imati prednosti u proizvodnji zbog svoje stabilnosti u vodi. Polimer može imati bilo koju molekulsku masu, a može biti razgranat ili sa ravnim nizom. Broj polimera vezanih za antitelo može da varira i, ako je više od jednog polimera vezano, to mogu biti isti ili različiti molekuli. U suštini, broj i/ili vrsta polimera korišćenih za derivatizaciju može se odrediti na osnovu razmatranja, uključujući, bez ograničenja, naročite osobine ili funkcije antitela koje treba poboljšati i da li će derivat antitela biti korišćen u terapiji pod definisanim uslovima, itd.
U drugom otelotvorenju, dati su konjugati antitela i neproteinskog ostatka koji mogu selektivno da se zagrevaju izlaganjem radijaciji. U jednom otelotvorenju, neproteinski deo je ugljenična nanocevčica (Kam i sar., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)). Radijacija može biti bilo koje talasne dužine i uključuje, bez ograničenja, talasne dužine koje ne oštećuju obične ćelije, ali koje zagrevaju neproteinski funkcionalni ostatak na temperaturu na kojoj stradaju ćelije u blizini neproteinskog funkcionalnog ostatka antitela.
8. Rekombinantni postupci i kompozicije
Bispecifična anti-CD3 antitela iz pronalaska koja se vezuju za CD3 i HER2, kao što su TDB antitela iz pronalaska mogu se proizvesti korišćenjem rekombinantnih postupaka i kompozicija, na primer, kako je opisano u US patentu br.4,816,567. U jednom otelotvorenju, obezbeđena je izolovana nukleinska kiselina koja kodira anti-CD3 antitelo iz ovog dokumenta. Takva nukleinska kiselina može kodirati aminokiselinsku sekvencu koja sadrži VL i/ili aminokiselinsku sekvencu koja sadrži VH antitela (npr. lake i/ili teške lance antitela). U sledećem otelotvorenju, obezbeđen je jedan ili više vektora (npr., ekspresionih vektora) koji sadrže takvu nukleinsku kiselinu. U sledećem otelotvorenju, obezbeđena je ćelija domaćin koja sadrži takvu nukleinsku kiselinu. U jednom takvom otelotvorenju, ćelija domaćin sadrži (npr., transformisana je sa): (1) vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira aminokiselinsku sekvencu koja sadrži VL antitela, i aminokiselinsku sekvencu koja sadrži VH antitela, ili (2) prvi vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira aminokiselinsku sekvencu koja sadrži VL antitela, i drugi vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira aminokiselinsku sekvencu koja sadrži VH antitela. U jednom otelotvorenju, ćelija domaćin je eukariotska, npr. ćelija jajnika kineskog hrčka (CHO) ili limfoidna ćelija (npr., Y0, NS0, Sp20 ćelija). U jednom otelotvorenju, obezbeđen je postupak za proizvodnju anti-CD3 antitela, pri čemu postupak obuhvata uzgajanje ćelije domaćina koja sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira antitelo, kako je dato gore, u uslovima koji su pogodni za ekspresiju antitela i, eventualno, izolovanje antitela iz ćelije domaćina (ili medijuma za uzgajanje ćelija domaćina).
Za rekombinantnu proizvodnju anti-CD3 antitela, nukleinska kiselina koja kodira antitelo, npr. kako je gore opisano, izoluje se i ubacuje u jedan ili više vektora radi daljeg kloniranja i/ili ekspresije u ćeliji domaćina. Takva nukleinska kiselina može biti lako izolovana i sekvencirana korišćenjem klasičnih postupaka (npr. korišćenjem oligonukleotidnih sondi koje su sposobne da se selektivno vežu za gene koji kodiraju teške i lake lance antitela).
Pogodne ćelije domaćini za kloniranje ili ekspresiju vektora koji kodiraju antitelo uključuju prokariotske ili eukariotske ćelije, ovde opisane. Na primer, antitela se mogu proizvesti u bakteriji, naročito kada nije neophodna glikozilacija niti Fc efektorska funkcija. Za ekspresiju fragmenata antitela i polipeptida u bakteriji, pogledajte, npr. U.S. Patente br.
5,648,237, 5,789,199, i 5,840,523. (vidite takođe Charlton, Methods in Molecular Biology, sveska 248 (B.K.C. Lo, izd., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), str. 245-254, koja opisuje ekspresiju fragmenata antitela u E. coli.) Nakon ekspresije, antitelo može da se izoluje iz paste bakterijskih ćelija u rastvorljivoj frakciji, i može dalje da se prečišćava.
Osim prokariota, eukariotski mikrobi, kao što su filamentozne gljivice ili kvasci, pogodni su domaćini za kloniranje ili ekspresiju za vektore koji kodiraju antitelo, uključujući sojeve gljivica i kvasaca čiji su putevi glikozilacije "humanizovani", što dovodi do stvaranja antitela sa delimično ili potpuno humanim glikozilacionim obrascem. Videti Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004), i Li et al., Nat. Biotech.24:210-215 (2006).
Pogodne ćelije domaćini za ekspresiju glikozilovanog antitela su takođe izvedene od višećelijskih organizama (beskičmenjaka i kičmenjaka). Primeri ćelija beskičmenjaka uključuju ćelije biljaka i insekata. Identifikovani su brojni sojevi bakulovirusa koji mogu da se koriste zajedno sa ćelijama insekata, naročito za transfekciju ćelija Spodoptera frugiperda.
Kulture biljnih ćelija se takođe mogu koristiti kao domaćini. Pogledajte npr. US Patente br. 5,959,177, 6,040,498, 6,420,548, 7,125,978, i 6,417,429 (opisuju tehnologiju PLANTIBODIES<™>za proizvodnju antitela u transgenim biljkama).
Ćelije kičmenjaka se, slično tome, mogu upotrebiti kao domaćini. Na primer, mogu se koristiti ćelijske linije sisara koje su adaptirane za rast u suspenziji. Druge primere korisnih ćelijskih linija domaćina sisara predstavljaju CV1 linije iz bubrega majmuna transformisane pomoću SV40 (COS-7); humane embrionske linije iz bubrega (293 ili ćelije 293, kao što je opisano npr. u Graham i sar. J. Gen Virol.36:59 (1977)), ćelije bubrega mladunca hrčka (BHK), sertolijeve ćelije miša (TM4 ćelije kao što je opisano npr. u Mather, Biol. Reprod.23:243-251 (1980)), ćelije bubrega majmuna (CV1), ćelije burega afričkog zelenog majmuna (VERO-76), humane ćelije cervikalnog karcinoma (HELA), ćelije bubrega psa (MDCK), ćelije jetre bufalo pacova (BRL 3A), humane ćelije pluća (W138), humane ćelije jetre (Hep G2), tumorske ćelije mlečne žlezde miša (MMT 060562), TRI ćelije, kao što je opisano npr. u Mather et al., Annals N.Y Acad. Sci. 383:44-68 (1982); ćelije MRC 5; i ćelije FS4. Ostale korisne ćelijske linije domaćina sisara uključuju ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO), uključujući DHFR<->CHO ćelije (Urlaub i sar., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); i ćelijske linije mijeloma, kao što su Y0, NS0 i Sp2/0. Radi pregleda izvesnih ćelijskih linija domaćina sisara, pogodnih za proizvodnju antitela, vidite, npr. Yazaki i Wu, Methods in Molecular Biology, sveska 248 (B.K.C. Lo, izd., Humana Press, Totowa, NJ), str.255-268 (2003).
C. Testovi
Bispecifična anti-CD3 antitela iz pronalaska koja se vezuju za CD3 i HER2, kao što su TDB antitela iz pronalaska koja su ovde obezbeđena mogu se identifikovati, pretražiti ili okarakterisati na osnovu fizičkih/hemijskih svojstava i/ili bioloških aktivnosti različitim testovima poznatim u struci.
1. Testovi vezivanja i drugi testovi
U jednom aspektu otkrića, anti-CD3 antitelo prema pronalasku se testira na vezivanje za antigen, na primer, poznatim postupcima kao što su ELISA, vestern blot, itd.
1
U drugom aspektu otkrića, mogu se koristiti kompetitivni testovi za identifikovanje antitela koje se takmiči sa anti-CD3 antitelom iz ovog pronalaska u pogledu vezivanja za CD3.
U primeru kompetitivnog testa, imobilisani CD3 se inkubira u rastvoru koji sadrži prvo obeleženo antitelo koje se vezuje za CD3 i drugo neobeleženo antitelo, čija se sposobnost takmičenja sa prvim antitelom u pogledu vezivanja za CD3 ispituje. Drugo antitelo može da se nalazi u supernatantu hibridoma. Kao kontrola, imobilisani CD3 je inkubiran u rastvoru koji sadrži prvo, obeleženo antitelo, ali ne i drugo, neobeleženo antitelo. Nakon inkubacije, u uslovima koji dopuštaju vezivanje prvog antitela za CD3, višak nevezanog antitela se uklanja i meri se količina obeleživača vezanog za imobilisano CD3. Ako je količina obeleživača vezanog za imobilisani CD3 u ispitivanom uzorku značajno smanjena u odnosu na kontrolni uzorak, to ukazuje da se drugo antitelo takmiči sa prvim antitelom u pogledu vezivanja za CD3. Pogledajte, npr. Harlow i Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual. pogl.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).
2. Testovi za merenje aktivnosti
U jednom aspektu otkrića, dati su testovi za identifikaciju ovih anti-CD3 antitela koja imaju biološku aktivnost. Biološka aktivnost može uključivati, na primer, vezivanje za CD3 (npr. CD3 na površini T ćelije), ili njegov peptidni fragment, bilo in vivo, in vitro ili ex vivo. U slučaju multispecifičnog (npr. bispecifičnog) anti-CD3 antitela iz pronalaska (npr. TDB antitelo koje ima jedan anti-CD3 krak i jedan krak koji prepoznaje drugi biološki molekul, npr. ćelijski površinski antigen, npr. tumorski antigen), biološka aktivnost takođe može uključivati, na primer, aktivaciju efektorskih ćelija (npr. aktivaciju T ćelija (npr. CD8+ i/ili CD4+ T ćelija)), ekspanziju populacije efektorskih ćelija (tj. povećanje broja T ćelija), smanjenje populacije ciljnih ćelija (tj. smanjenje populacije ćelija koje eksprimiraju drugi biološki molekul na svojim ćelijskim površinama), i/ili ubijanje ciljnih ćelija. Obezbeđuju se antitela koja imaju takvu biološku aktivnost in vivo i/ili in vitro. U određenim otelotvorenjima, antitelo iz pronalaska se testira na takvu biološku aktivnost, kao što je detaljno opisano u primerima u nastavku ovog teksta.
D: Imunokonjugati
Pronalazak takođe pruža imunokonjugate koji sadrže bispecifično antitelo iz pronalaska konjugovano sa jednim ili više citotoksičnih agensa, kao što su hemoterapeutski agensi ili lekovi, agensi za inhibiciju rasta, toksini (npr. proteinski toksini, enzimski aktivni toksini bakterijskog, fungalnog, biljnog ili životinjskog porekla, ili njihovi fragmenti), ili radioaktivni izotopi.
U jednom otelotvorenju, imunokonjugat je konjugat antitela i leka (ADC) u kome je
2
antitelo konjugovano sa jednim lekom ili više lekova, uključujući, bez ograničenja, majtanzinoid (videti U.S. Patent br.5,208,020, 5,416,064 i evropski patent EP 0425 235 B1); auristatin, kao što su funkcionalni ostaci DE i DF leka monometilauristatina (MMAE i MMAF) (videti U.S. Patent br.5,635,483 i 5,780,588, i 7,498,298); dolastatin; kaliheamicin ili njegove derivate (videti U.S. Patent br. 5,712,374, 5,714,586, 5,739,116, 5,767,285, 5,770,701, 5,770,710, 5,773,001, i 5,877,296; Hinman et al., Cancer Res.53:3336-3342 (1993); i Lode et al., Cancer Res. 58:2925-2928 (1998)); antraciklin, kao što je daunomicin ili doksorubicin (videti Kratz et al., Current Med. Chem.13:477-523 (2006); Jeffrey et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362 (2006); Torgov et al., Bioconj. Chem.16:717-721 (2005); Nagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829-834 (2000); Dubowchik et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532 (2002); King et al., J. Med. Chem. 45:4336-4343 (2002); i U.S. Patent br. 6,630,579); metotreksat; vindezin; taksan, kao što je docetaksel, paklitaksel, larotaksel, tesetaksel i ortataksel; trihotecen; i CC1065.
U daljem otelotvorenju, imunokonjugat uključuje anti-CD3 antitelo prema pronalasku konjugovano sa enzimski aktivnim toksinom ili njegovim fragmentom, uključujući, ali se ne ograničavajući na A lanac difterije, nevezujuće aktivne fragmente toksina difterije, A lanac egzotoksina (iz Pseudomonas aeruginosa), A lanac ricina, A lanac abrina, A lanac modecina, alfa-sarcin, proteine Aleurites fordii, proteine diantina, proteine vinobojke (Phytolaca americana) (PAPI, PAPII i PAP-S), inhibitor iz gorke dinje (momordica charantia), kursin, krotin, inhibitor iz sapunjače (sapaonaria officinalis), gelonin, mitogelin, restriktocin, fenomicin, enomicin i trikotecene.
U drugom otelotvorenju, imunokonjugat uključuje anti-CD3 antitelo prema pronalasku konjugovano sa radioaktivnim atomom, dajući radiokonjugat. Dostupni su raznovrsni radioizotopi za proizvodnju radiokonjugata. Primeri uključuju At<211>, I<131>, I<125>, Y<90>, Re<186>, Re<188>, Sm<153>, Bi<212>, P<32>, Pb<212>i radioaktivne izotope Lu. Kada se radiokonjugat koristi za detekciju, on može da sadrži radioaktivni atom za scintigrafske studije, na primer tc99m ili I123, ili obeležavanje spinova za snimanje nuklearnom magnetnom rezonancom (NMR) (takođe poznata kao magnetna rezonanca, MR), kao što je jod-123, ponovo jod-131, indijum-111, fluor-19, ugljenik-13, azot-15, kiseonik-17, gadolinijum, mangan ili gvožđe.
Konjugati antitela i citotoksičnog agensa mogu se napraviti pomoću različitih agenasa za vezivanje bifunkcionalnih proteina, kao što je N-sukcinimidil-3-(2-piridilditio)propionat (SPDP), sukcinimidil-4-(N-maleimidometil)cikloheksan-1-karboksilat (SMCC), iminotiolan (IT), bifunkcionalni derivati imidoestara (kao što je dimetil adipimidat HCl), aktivni estri (kao što je disukcinimidil suberat), aldehidi (kao što je glutaraldehid), bis-azido jedinjenja (kao što je bis (p-azidobenzoil)heksandiamin), bis-diazonijum derivati (kao što je bis-(pdiazonijumbenzoil)-etilendiamin), diizocijanati (kao što je toluen 2,6-diizocijanat), i bisaktivna jedinjenja fluora (kao što je 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzen). Na primer, imunotoksin ricina se može dobiti kao što opisuju Vitetta et al., Science 238:1098 (1987). Ugljenikom-14 obeležena 1-izotiocijanatobenzil-3-metildietilen triaminpentasirćetna kiselina (MX-DTPA) primer je helatnog agensa za konjugaciju radionukleotida za antitelo. Pogledajte WO94/11026. Linker može biti "raskidivi linker" koji olakšava oslobađanje citotoksičnog leka u ćeliji. Na primer, može se koristiti kiselo labilni linker, linker osetljiv na peptidazu, fotolabilni linker, dimetil linker ili linker koji sadrži disulfid (Chari et al., Cancer Res.52:127-131 (1992); U.S. Patent br.5,208,020).
Imunokonjugati ili ADC-i ovde izričito razmatraju, ali nisu ograničeni na takve konjugate pripremljene sa reagensima za biokonjugaciju uključujući, bez ograničenja, BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SlAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC i sulfo-SMPB i SVSB (sukcinimidil-(4-vinilsulfon)benzoat) koji su komercijalno dostupni (npr. Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL.,SAD).
E. Metode i smeše za dijagnostiku i detektovanje
U određenim otelotvorenjima, bispecifična anti-CD3 antitela iz pronalaska koja se vezuju za CD3 i HER2, kao što su TDB antitela iz pronalaska, korisna su za otkrivanje prisustva CD3 u biološkom uzorku. Termin "detekcija" kako se ovde koristi obuhvata kvantitativnu ili kvalitativnu detekciju. U pojedinim otelotvorenjima, biološki uzorak uključuje ćeliju ili tkivo.
U jednom aspektu predmetnog pronalaska, obezbeđeno je anti-CD3 antitelo za upotrebu u postupcima za dijagnozu ili detekciju. U sledećem aspektu otkrića, obezbeđen je postupak za detekciju prisustva CD3 u biološkom uzorku. U nekim aspektima predmetnog pronalaska, postupak obuhvata kontakt biološkog uzorka sa anti-CD3 antitelom, kao što je opisano u ovom dokumentu, u uslovima koji dopuštaju vezivanje anti-CD3 antitela za CD3, kao i detektovanje eventualnog nastanka kompleksa između anti-CD3 antitela i CD3. Takav postupak može biti in vitro ili in vivo postupak.
U nekim otelotvorenjima otkrića, data su obeležena anti-CD3 antitela. Oznake uključuju, ali nisu ograničene na, oznake ili ostatke koji se detektuju direktno (kao što su fluorescentne, hromoforne, elektronski nepropusne, hemiluminescentne i radioaktivne oznake), kao i funkcionalne ostatke, kao što su enzimi ili ligandi, koji se detektuju indirektno, npr. putem enzimske reakcije ili molekulske interakcije. Primeri oznaka uključuju, ali se ne ograničavaju na radioizotope<32>P,<14>C,<125>I,<3>H, i<131>I, fluorofore, kao što su helati retkih zemalja ili fluorescein
4
i njegovi derivati, rodamin i njegovi derivati, dansil, umbeliferon, luceriferaze, npr. luciferaza svica i bakterijska luciferaza (U.S. Patent br. 4,737,456), luciferin, 2,3-dihidroftalazin dione, peroksidazu rena (HRP), alkalnu fosfatazu, β-galaktozidazu, glukoamilazu, lizozim, oksidaze saharida, npr. glukoza oksidaza, galaktoza oksidaza i glukoza-6-fosfat dehidrogenaza, heterociklične oksidaze, kao što je urikaza i ksantin oksidaza, vezane sa enzimom koji koristi vodonik peroksid za oksidaciju prekursora boje, kao što je HRP, laktoperoksidazu ili mikroperoksidazu, biotin/avidin, spin oznake, oznake bakteriofaga, stabilne slobodne radikale, i slično.
F. Farmaceutske formulacije
Farmaceutske formulacije bispecifičnog anti-CD3 antitela iz pronalaska koje se vezuje za CD3 i HER2, kao što je TDB antitelo iz pronalaska, pripremaju se mešanjem takvog antitela koje ima željeni stepen čistoće sa jednim ili više opcionih farmaceutski prihvatljivih nosača (Remington's Pharmaceutical Sciences 16. izdanje, Osol, A. Ed. (1980)), u obliku liofilizovanih formulacija ili vodenih rastvora. Farmaceutski prihvatljivi nosači su generalno netoksični za primaoca u primenjenim dozama i koncentracijama, i uključuju, ali se ne ograničavaju na: pufere, kao što je fosfatni, citratni, i puferi drugih organskih kiselina; antioksidanse, uključujući askorbinsku kiselinu i metionin; konzervanse (kao što je oktadecildimetilbenzil amonijum hlorid; heksametonijum hlorid; benzalkonijum hlorid, benzetonijum hlorid; fenol, butil ili benzil alkohol; alkil parabene, kao što je metil ili propil paraben; katehol; rezorcinol; cikloheksanol; 3-pentanol; i m-krezol); polipeptide male molekulske mase (manje od oko 10 ostataka); proteine, kao što je albumin iz seruma, želatin ili imunoglobulini; hidrofilne polimere, kao što je polivinilpirolidon; aminokiseline, kao što je glicin, glutamin, asparagin, histidin, arginin ili lizin; monosaharide, disaharide i druge ugljene hidrate, uključujući glukozu, manozu ili dekstrine; helatne agense, kao što je EDTA; šećere, kao što je saharoza, manitol, trehaloza ili sorbitol; kontrajone koji grade soli, kao što je natrijum; metalne komplekse (npr. komplekse Zn-protein); i/ili nejonske surfaktante, kao što je polietilen glikol (PEG). Primeri farmaceutski prihvatljivih nosača, iz ovog dokumenta, dalje uključuju agense za intersticijalnu disperziju lekova, kao što su rastvorni neutralno aktivni glikoproteini hijaluronidaze (sHASEGP), na primer, humani rastvorljivi PH-20 glikoproteini hijaluronidaze, kao što je rHuPH20 (HYLENEX<®>, Baxter International, Inc.). Pojedini primeri za sHASEGP i postupke primene, uključujući rHuPH20, opisani su u US Patent Publication br. 2005/0260186 i 2006/0104968. U jednom aspektu, sHASEGP se kombinuje sa jednom ili više dodatnih glikozaminoglikanaza, kao što je hondroitinaza.
Primeri liofilizovanih formulacija antitela opisani su u US Patentu br. 6,267,958.
Vodene formulacije antitela obuhvataju one opisane u US Patentu br. 6,171,586 i WO2006/044908, pri čemu ove druge formulacije uključuju histidin-acetatni pufer.
Formulacija ovde može takođe da sadrži više od jednog aktivnog sastojka, kao što je neophodno za naročitu indikaciju koja se leči, poželjno one sa komplementarnim aktivnostima koje ne utiču negativno jedna na drugu. Na primer, može biti poželjno dodatno obezbediti dodatni terapeutski agens (npr. hemoterapeutsko sredstvo, citotoksično sredstvo, sredstvo za inhibitore rasta i/ili antihormonsko sredstvo, poput onih koji su ovde navedeni gore). Takvi aktivni sastojci su pogodno prisutni u kombinaciji u količinama koje su efikasne za nameravane svrhe.
Aktivni sastojci mogu biti zarobljeni u pripremljenim mikrokapsulama, na primer, tehnikom koacervacije ili interfacijalne polimerizacije, na primer, hidroksimetilceluloze, odnosno želatinskih mikrokapsula, odnosno poli-(metilmetakrilat) mikrokapsula, u koloidnim sistemima za isporuku lekova (na primer, lipozomi, albuminske mikrosfere, mikroemulzije, nanočestice i nanokapsule) ili u makroemulzijama. Takve tehnike su objavljene u radu Remington's Pharmaceutical Sciences 16. izdanje, Osol, A. Ed. (1980).
Mogu se pripremiti preparati sa produženim oslobađanjem. Pogodni primeri preparata sa produženim oslobađanjem uključuju semipermeabilne matrice čvrstih hidrofobnih polimera koje sadrže antitelo, pri čemu su matrice uobličeni proizvodi, na primer, film ili mikrokapsule.
Formulacije za primenu in vivo generalno su sterilne. Sterilnost se može lako postići, npr. filtracijom kroz sterilne filtracione membrane.
G. Metode lečenja i smeše
Bilo koje od bispecifičnih anti-CD3 antitela iz pronalaska koja se vezuju za CD3 i HER2, kao što su TDB antitela iz pronalaska, može se koristiti u terapeutskim postupcima.
U jednom aspektu, dato je anti-CD3 bispecifično antitelo da se koristi kao lek. U daljim aspektima, anti-CD3 bispecifično antitelo iz pronalaska je predviđeno za upotrebu u lečenju ili odlaganju razvoja ćelijskog proliferativnog poremećaja (npr. kancera). U pojedinim otelotvorenjima, dato je anti-CD3 bispecifično antitelo iz pronalaska za upotrebu u postupku lečenja. U pojedinim otelotvorenjima, pronalazak daje anti-CD3 bispecifično antitelo za upotrebu u postupku lečenja pojedinca koji ima ćelijski proliferativni poremećaj, obuhvatajući davanje pojedincu efikasne količine anti-CD3 antitela. U jednom takvom otelotvorenju, postupak dalje uključuje davanje efikasne količine najmanje jednog dodatnog terapeutskog agensa pojedincu, na primer, kao što je opisano u nastavku. U daljim otelotvorenjima, anti-CD3 bispecifično antitelo iz pronalaska predviđeno je za upotrebu u poboljšanju imunološke funkcije kod pojedinca koji ima ćelijski proliferativni poremećaj. U određenim otelotvorenjima, anti-CD3 antitelo iz pronalaska je predviđeno za upotrebu u postupku poboljšanja imunološke funkcije kod pojedinca koji ima ćelijski proliferativni poremećaj, koji obuhvata primenu na pojedincu efikasne količine anti-CD3 antitela za aktiviranje efektorskih ćelija (npr. T ćelije, npr. CD8+ i/ili CD4+ T ćelije), proširivanje (povećanje) populacije efektorskih ćelija, smanjenje populacije ciljnih ćelija (npr. ćelija koja eksprimira HER2 prepoznat od strane bispecifičnog TDB antitela), i/ili ubijanje ciljnih ćelija (npr. ciljne ćelije tumora). "Pojedinac" prema bilo kom od gornjih otelotvorenja može biti čovek.
U daljem aspektu, otkriće obezbeđuje upotrebu anti-CD3 antitela u proizvodnji ili pripremi leka. U jednom otelotvorenju otkrića, lek je predviđen za lečenje ćelijskog proliferativnog poremećaja (npr. kancera). U dodatnom otelotvorenju otkrića, lek je predviđen za upotrebu u postupku lečenja poremećaja ćelijske proliferacije koji se sastoji od davanja efikasne količine leka pojedincu koji ima poremećaj ćelijske proliferacije. U jednom takvom otelotvorenju otkrića, postupak dalje uključuje davanje efikasne količine najmanje jednog dodatnog terapeutskog agensa pojedincu, na primer, kao što je opisano u nastavku. U daljem otelotvorenju otkrića, lek je za aktiviranje efektorskih ćelija (npr. T ćelije, npr. CD8+ i/ili CD4+ T ćelije), proširivanje (povećanje) populacije efektorskih ćelija, smanjenje populacije ciljnih ćelija (npr. ćelija koja eksprimira drugi biološki molekul prepoznat od strane anti-CD3 antitela iz pronalaska, kao što je bispecifično TDB antitelo iz pronalaska), i/ili ubijanje ciljnih ćelija (npr. ciljne ćelije tumora) kod pojedinca. U daljem otelotvorenju otkrića, lek je predviđen za upotrebu u postupku poboljšanja imunološke funkcije kod pojedinca koji ima ćelijski proliferativni poremećaj, koji obuhvata primenu na pojedincu efikasne količine leka za aktiviranje efektorskih ćelija (npr. T ćelije, npr. CD8+ i/ili CD4+ T ćelije), proširivanje (povećanje) populacije efektorskih ćelija, smanjenje populacije ciljnih ćelija (npr. ćelija koja eksprimira HER2 prepoznat od strane anti-CD3 bispecifičnog antitela iz pronalaska), i/ili ubijanje ciljnih ćelija (npr. ciljne ćelije tumora). "Pojedinac" prema bilo kom od gornjih otelotvorenja može biti čovek.
U daljem aspektu, otkriće obezbeđuje postupak za lečenje ćelijskog proliferativnog poremećaja (npr. kancer). U jednom otelotvorenju otkrića, postupak uključuje davanje pojedincu, koji ima takav ćelijski proliferativni poremećaj, efikasne količine anti-CD3 antitela. U jednom takvom otelotvorenju otkrića, postupak dalje uključuje davanje efikasne količine najmanje jednog dodatnog terapeutskog agensa pojedincu, na primer, kao što je opisano u nastavku. "Pojedinac" prema bilo kom od gornjih otelotvorenja može biti čovek.
U sledećem aspektu, otkriće obezbeđuje postupak za poboljšanje imunološke funkcije kod pojedinca koji ima poremećaj ćelijske proliferacije. U jednom otelotvorenju otkrića, postupak obuhvata primenu na pojedincu efekasne količine anti-CD3 antitela za aktiviranje efektorskih ćelija (npr. T ćelije, npr. CD8+ i/ili CD4+ T ćelije), proširivanje (povećanje) populacije efektorskih ćelija, smanjenje populacije ciljnih ćelija (npr. ćelija koja eksprimira HER2 prepoznat od strane anti-CD3 bispecifičnog antitela iz pronalaska), i/ili ubijanje ciljnih ćelija (npr. ciljne ćelije tumora). U jednom otelotvorenju objavljivanja, „pojedinac” je čovek.
U daljem aspektu, objavljivanje obezbeđuje postupak za lečenje hematološkog kancera, kao što je kancer B ćelija (na primer, zreli B-ćelijski limfom) putem primene efikasne količine anti-CD3 bispecifičnog TDB antitela iz pronalaska, kao što je HER2-TDB koji ima anti-CD3 krak i anti-HER2 krak. U daljem aspektu otkrića, zreli B-ćelijski limfom je non-Hodžkinov limfom (NHL). U daljem aspektu otkrića, NHL se bira iz grupe koja se sastoji od: DLBCL germinalnog centra nalik B-ćelijama (GCB), DLBCL nalik aktiviranim B-ćelijama (ABC), folikularnog limfoma (FL), limfoma ćelija plašta (MCL), akutne mijeloidne leukemije (AML), hronične limfoidne leukemije (CLL), limfoma marginalne zone (MZL), male limfocitne leukemije (SLL), limfoplazmocitnog limfoma (LL), Valdenstromove makroglobulinemije (WM), limfoma centralnog nervnog sistema (CNSL), Burkitovog limfoma (BL), B-ćelijske prolimfocitne leukemije, limfoma marginalne zone slezine, leukemije vlasastih ćelija, limfoma/leukemije slezine koji ne može da se klasifikuje, limfoma difuzne crvene pulpe slezine, varijante leukemije vlasastih ćelija, Valdenstromove makroglobulinemije, bolesti teškog lanca, bolesti teškog lanca α, bolesti teškog lanca γ, bolesti teškog lanca µ, mijeloma ćelija plazme, solitarnog plazmacitoma kostiju, ekstraosealnog plazmacitoma, limfoma ekstranodalne marginalne zone limfoidnog tkiva povezanog sa sluznicom (MALT limfom), limfa nodalne marginalne zone, pedijatrijskog limfoma nodalne marginalne zone, pedijatrijskog folikularnog limfoma, limfoma centra primarnog kutanog folikula, B-krupnoćelijskog limfoma bogatog T-ćelijama/histiocitima, primarnog DLBCL CNS-a, primarnog kutanog DLBCL-a, nožni tip, EBV-pozitivnog DLBCL-a starijih osoba, DLBCL-a povezanog sa hroničnom inflamacijom, limfomatoidne granulomatoze, primarnog medijastinalnog (timičnog) B-krupnoćelijskog limfoma, intravaskularnog B-krupnoćelijskog limfoma, ALK-pozitivnog B-krupnoćelijskog limfoma, plazmablastičnog limfoma, B-krupnoćelijskog limfoma koji nastaje kod multicentrične Kastlemanove bolesti povezane sa HHV8, primarnog efuzionog limfoma: B-ćelijskog limfoma koji ne može da se klasifikuje, sa karakteristikama između difuznog B-krupnoćelijskog limfoma i Burkitovog limfoma, i B-ćelijskog limfoma koji ne može da se klasifikuje, sa karakteristikama između difuznog B-krupnoćelijskog limfoma i klasičnog Hodžkinovog limfoma. U poželjnom otelotvorenju pronalaska, postupak obuhvata lečenje kancera koji uključuje DLBCL germinalnog centra nalik B-ćelijama (GCB), DLBCL nalik aktiviranim B-ćelijama (ABC), folikularni limfom (FL), limfom ćelija plašta (MCL), akutnu mijeloidnu leukemiju (AML), hroničnu limfoidnu leukemiju (CLL), limfom marginalne zone (MZL), malu limfocitnu leukemiju (SLL), limfoplazmacitni limfom (LL), Valdenstromovu makroglobulinemiju (WM), limfom centralnog nervnog sistema (CNSL) ili Burkitov limfom (BL).
U daljem aspektu otkrića, dodatna terapija obuhvata alkilujući agens. U jednom otelotvorenju, alkilujući agens je 4-[5-[bis (2-hloretil) amino]-1-metilbenzimidazol-2-il] butanska kiselina i njene soli. U jednom otelotvorenju, alkilujući agens je bendamustin.
U daljem aspektu otkrića, dodatna terapija obuhvata inhibitor BCL-2. U jednom otelotvorenju, BCL-2 inhibitor je 4-(4-{[2-(4-hlorfenil)-4,4-dimetilcikloheks-1-en-1-il]metil} piperazin-1-il)-N-({3-nitro-4-[(tetrahidro-2H-piran-4-ilmetil)amino]fenil}sulfonil)-2-(1H-pirolo[2,3-b]piridin-5-iloksi)benzamid i njegove soli. U jednom otelotvorenju, BCL-2 inhibitor je venetoklaks (CAS br: 1257044-40-8).
U daljem aspektu otkrića, dodatna terapija obuhvata inhibitor fosfoinozitid 3-kinaze (PI3K). U jednom otelotvorenju, inhibitor PI3K inhibira delta izooblik PI3K (tj. P110δ). U nekim slučajevima, inhibitor PI3K je 5-fluor-3-fenil-2-[(1S)-1-(7H-purin-6-ilamino)propil]-4(3H)-hinazolinon i njegove soli. U nekim slučajevima, inhibitor PI3K je idelalisib (CAS br: 870281-82-6). U jednom otelotvorenju, inhibitor PI3K inhibira alfa i delta izooblike PI3K. U nekim slučajevima, inhibitor PI3K je 2-{3-[2-(1-izopropil-3-metil-1H-1,2-4-triazol-5-il)-5,6-dihidrobenzo[f]imidazo[1,2-d][1,4]oksazepin-9-il]-1H-pirazol-1-il}-2-metilpropanamid i njegove soli.
U daljem aspektu otkrića, dodatna terapija obuhvata inhibitor Brutonove tirozinske kinaze (BTK). U jednom slučaju, BTK inhibitor je 1-[(3R)-3-[4-amino-3-(4-fenoksifenil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il]piperidin-1-il]prop-2-en-1-on i njegove soli. U jednom slučaju, inhibitor BTK je ibrutinib (CAS br: 936563-96-1).
U daljem aspektu otkrića, dodatna terapija obuhvata talidomid ili njegov derivat. U jednom slučaju, talidomid ili njegov derivat je (RS)-3-(4-amino-1-okso 1,3-dihidro-2H-izoindol- 2-il)piperidin-2,6-dion i njegove soli. U jednom slučaju, talidomid ili njegov derivat je lendalidomid (CAS br: 191732-72-6).
U daljem aspektu otkrića, dodatna terapija sadrži jedan ciklofosfamid, doksorubicin, vinkristin ili prednizolon (CHOP) ili više njih. Bilo koji od gore navedenih postupaka i terapija može da se koristi, bez ograničenja, za bilo koji kancer, uključujući, na primer, lečenje HER2-pozitivnog kancera.
U daljem aspektu, pronalazak obezbeđuje bispecifično antitelo iz pronalaska za upotrebu u postupku za lečenje HER2-pozitivnih kancera. U jednom otelotvorenju, postupak obuhvata primenu na pojedincu koji ima takav kancer efikasne količine anti-HER2 bispecifičnog TDB antitela sa anti-HER2 ciljajućim krakom i anti-CD3 ciljajućim krakom. HER2-TDB ima prihvatljiv profil toksičnosti kada se na pacijentu primenjuje u efikasnoj dozi. U jednom otelotvorenju, CD3 krak HER2-TDB sa prihvatljivim profilom toksičnosti je CD3 krak niskog afiniteta. U jednom otelotvorenju, CD3 krak HER2-TDB sa prihvatljivim profilom toksičnosti je 40G5c.
U poželjnom otelotvorenju, HER2-pozitivni kancer je HER2-pozitivni kancer dojke ili HER2-pozitivni kancer želuca. U jednom otelotvorenju, HER2 TDB se primenjuje istovremeno sa jednim ili više dodatnih terapeutskih agensa koja ciljaju put HER. U jednom otelotvorenju, terapeutski agens koje cilja put HER je izabran od inhibitora EGFR, inhibitora HER2, inhibitora HER3 i/ili inhibitora HER4. U jednom otelotvorenju, HER2 TDB se primenjuje istovremeno sa jednim ili više dodatnih terapeutskih agensa izabranih od trastuzumaba (Herceptin<®>), T-DM1 (Kadcyla<®>) i pertuzumaba (Perjeta<®>). U jednom otelotvorenju, HER2 TDB se primenjuje istovremeno sa trastuzumabom. U jednom otelotvorenju, HER2 TDB se primenjuje istovremeno sa T-DM1. U jednom otelotvorenju, HER2 TDB se primenjuje istovremeno sa pertuzumabom. U jednom otelotvorenju, HER2 TDB se primenjuje istovremeno sa trastuzumabom i pertuzumabom. U jednom otelotvorenju, HER2 TDB se primenjuje istovremeno sa T-DM1 i pertuzumabom.
U daljem aspektu, pronalazak obezbeđuje farmaceutske formulacije koje sadrže bilo koje od bispecifičnih anti-CD3 antitela iz pronalaska, npr. za upotrebu u bilo kom od gornjih terapeutskih postupaka. U jednom otelotvorenju, farmaceutska formulacija uključuje bilo koje od anti-CD3 antitela iz pronalaska i farmaceutski prihvatljiv nosač. U drugom otelotvorenju, farmaceutska formulacija uključuje bilo koje od anti-CD3 antitela iz pronalaska i najmanje jedno dodatno lekovito sredstvo, na primer, kao što je ovde opisano.
Antitela iz pronalaska se mogu koristiti ili sama ili u kombinaciji sa drugim agensima u terapiji. Na primer, antitelo predmetnog pronalaska može biti primenjeno uz najmanje jedan dodatni terapeutski agens. U određenim otelotvorenjima, dodatno terapeutsko sredstvo je hemoterapeutsko sredstvo, sredstvo za inhibiciju rasta, citotoksično sredstvo, sredstvo koje se koristi u radioterapiji, sredstvo protiv angiogeneze, apoptotičko sredstvo, antitubulinsko sredstvo ili drugo sredstvo, kao što je antagonist receptora epidermalnog faktora rasta (EGFR) (npr. inhibitor tirozin kinaze), inhibitor HER1/EGFR (npr. erlotinib (Tarceva<™>), inhibitor faktora rasta izvedenog iz trombocita (npr. Gleevec<™>(imatinib mezilat)), COX-2 inhibitor (npr. celekoksib), interferon, citokin, antitelo koje nije anti-CD3 antitelo iz pronalaska, kao što je
1
antitelo koje se vezuje za jedan ili više od sledećih ciljeva ErbB2, ErbB3, ErbB4, PDGFR-beta, BlyS, APRIL, BCMA VEGF, ili VEGF receptor(i), TRAIL/Apo2, PD-1, PD-L1, PD-L2, ili neki drugi bioaktivni ili organski hemijski agens.
U nekim otelotvorenjima, pronalazak predviđa primenu u postupku u kome je dodatno terapeutsko sredstvo glukokortikoid. U jednom otelotvorenju, glukokortikoid je deksametazon.
Takve kombinovane terapije koje su gore pomenute obuhvataju kombinovanu primenu (gde su dva ili više terapeutskih agenasa obuhvaćeni istom formulacijom, ili različitim formulacijama), i odvojenu primenu, u kom slučaju primena antitela predmetnog pronalaska može da se odigra pre primene dodatnog terapeutskog agensa i/ili agenasa, istovremeno sa njim i/ili nakon njegove primene. U jednom otelotvorenju, primena anti-CD3 antitela i primena dodatnog terapeutskog agensa se dešavaju približno u roku od jednog meseca, ili približno u roku od jedne, dve ili tri nedelje, ili približno u roku od jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest dana, jedna od druge. Bispecifična anti-CD3 antitela iz pronalaska (tj. bispecifična anti-CD3 antitela iz pronalaska koja se vezuju za CD3 i HER2, kao što je TDB antitelo iz pronalaska ili njegova varijanta) takođe mogu da se koriste u kombinaciji sa radioterapijom.
Antitelo iz pronalaska (i/ili svaki dodatni terapeutski agens) za upotrebu u terapijskom postupkui može biti primenjeno bilo kojim pogodnim načinom, uključujući parenteralnu, intrapulmonalnu i intranazalnu, i, ako se želi za lokalno lečenje, intralezionu primenu. Parenteralne infuzije uključuju intramuskularnu, intravensku, intraarterijsku, intraperitonealnu ili supkutanu primenu. U nekim slučajevima, antitelo se primenjuje supkutanom primenom. U nekim slučajevima, anti-CD3 antitelo primenjeno supkutanom injekcijom pokazuje manje toksičan odgovor kod pacijenta nego isto anti-CD3 antitelo primenjeno intravenskom injekcijom. Doziranje može biti bilo kojim prikladnim načinom, na primer putem injekcija, kao što su intravenske ili supkutane injekcije, što delimično zavisi od toga da li je primena kratkotrajna ili hronična. Ovde su razmatrani različiti rasporedi doziranja uključujući, bez ograničenja, pojedinačnu ili višestruku primenu u različitim terminima, bolusnu primenu i pulsnu infuziju.
Antitela iz predmetnog pronalaska biće formulisana, dozirana i primenjena u skladu sa dobrom lekarskom praksom. U ovom kontekstu se mogu razmatrati faktori kao što su konkretni poremećaj koji se leči, konkretni sisar koji se leči, kliničko stanje pojedinačnog pacijenta, uzrok poremećaja, mesto isporuke agensa, postupak primene, raspored primene, i drugi faktori poznati lekarima. Antitelo ne mora da bude, ali je opciono formulisano sa jednim ili više agenasa koji se trenutno primenjuju za sprečavanje ili lečenje poremećaja o kome se radi. Efikasna količina takvih drugih agenasa zavisi od količine antitela prisutnog u formulaciji, vrste
1 1
poremećaja ili lečenja, kao i drugih faktora koji su prethodno razmatrani. Oni se po pravilu koriste u istim dozama i sa istim načinom primene kao što je gore opisano, ili od oko 1 do 99% doza koje su ovde opisane, ili u bilo kojoj dozi i sa bilo kojim načinom primene za koje je empirijski/klinički dokazano da su odgovarajući.
Za prevenciju ili lečenje bolesti, odgovarajuća doza antitela iz predmetnog pronalaska (kada se koristi samostalno ili u kombinaciji sa jednim ili više drugih dodatnih terapeutskih agensa) zavisiće od vrste bolesti koja se leči, vrste antitela, težine i toka bolesti, bilo da se antitelo primenjuje u preventivne ili terapeutske svrhe, kao i od prethodne terapije, kliničke istorije pacijenta i njegovog odgovora na antitelo, kao i odluke nadležnog lekara. Antitelo se pogodno primenjuje na pacijentu jednokratno, ili kao serija terapija.
Kao opšta pretpostavka, terapeutski efikasna količina anti-CD3 antitela primenjena na čoveku biće u opsegu od oko 0,01 do oko 100 mg/kg telesne težine pacijenta, bilo da je u pitanju jedna ili više primena. U nekim realizacijama, korišćeno antitelo je, na primer, primenjivano u dnevnim dozama od oko 0,01 mg/kg do oko 45 mg/kg, oko 0,01 do oko 40 mg/kg, oko 0,01 do oko 35 mg/kg, oko 0,01 do oko 30 mg/kg, oko 0,01 do oko 25 mg/kg, oko 0,01 do oko 20 mg/kg, oko 0,01 do oko 15 mg/kg, oko 0,01 do oko 10 mg/kg, oko 0,01 do oko 5 mg/kg, ili oko 0,01 do oko 1 mg/kg. U jednom otelotvorenju, anti-CD3 antitelo prema opisu iz ovog dokumenta, daje se ljudima u dozi od oko 100 mg, oko 200 mg, oko 300 mg, oko 400 mg oko 500 mg, oko 600 mg, oko 700 mg, oko 800 mg, oko 900 mg, oko 1000 mg, oko 1100 mg, oko 1200 mg, oko 1300 mg ili oko 1400 mg 1. dana 21-dnevnog ciklusa. Doza se može primeniti kao pojedinačna doza ili kao višestruke doze (npr., 2 ili 3 doze), kao što su infuzije. Kod ponovljene primene u trajanju od nekoliko dana ili duže, u zavisnosti od stanja, lečenje će po pravilu biti nastavljeno sve do željenog suzbijanja simptoma bolesti. Doza antitela navedena kao primer bila bi u opsegu od oko 0,05 mg/kg do oko 10 mg/kg. Stoga, jedna ili više doza od oko 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg ili 10 mg/kg (ili bilo koja njihova kombinacija) može se dati pacijentu. Takve doze mogu se primenjivati povremeno, na primer. svake nedelje ili svake tri nedelje (npr. tako da pacijent primi od oko dve do oko dvadeset, ili na primer. oko šest doza anti-CD3 antitela). Može se primeniti veća početna doza, a nakon toga jedna ili više manjih doza. Napredak ove terapije jednostavno se prati klasičnim tehnikama i testovima.
U nekim slučajevima, postupci mogu dalje da sadrže dodatnu terapiju. Dodatna terapija može biti radioterapija, hirurški zahvat, hemoterapija, genska terapija, DNK terapija, virusna terapija, RNK terapija, imunoterapija, transplantacija koštane srži, nanoterapija, terapija monoklonskim antitelima, ili kombinacija prethodno navedenih. Dodatna terapija može biti u obliku adjuvantne ili neoadjuvantne terapije. U nekim slučajevima, dodatna terapija se sastoji
1 2
od davanja enzimskog inhibitora malog molekula ili antimetastatskog agensa. U nekim slučajevima, dodatna terapija se sastoji od davanja agensa za ograničavanje neželjenih dejstava (npr. agensi namenjeni za smanjivanje pojave i/ili težine neželjenih dejstava lečenja, kao što su agensi protiv mučnine, itd.). U nekim slučajevima, dodatna terapija je radioterapija. U nekim slučajevima, dodatna terapija je hirurški zahvat. U nekim slučajevima, dodatna terapija je kombinacija radioterapije i hirurškog zahvata. U nekim slučajevima, dodatna terapija je gama zračenje. U nekim slučajevima, dodatna terapija može biti odvojeno davanje jednog ili više terapeutskih agensa, kako je prethodno navedeno.
H. Proizvodi
U drugom aspektu predmetnog pronalaska, obezbeđen je proizvod koji sadrži materijale korisne za lečenje, prevenciju i/ili dijagnostikovanje gore opisanih poremećaja. Proizvod uključuje pakovanje i etiketu ili uputstvo za upotrebu, na pakovanju ili uz njega. Pogodno pakovanje uključuje, na primer, boce, bočice, špriceve, kese za IV rastvor, itd. Pakovanje može biti izrađeno od različitih materijala, kao što je staklo ili plastika. Pakovanje sadrži preparat koji je sam po sebi ili u kombinaciji sa drugim preparatom efikasan u lečenju, prevenciji i/ili dijagnostikovanju stanja, i može imati priključak za sterilni pristup (na primer, pakovanje može biti kesa za intravenski rastvor ili bočica sa zapušačem koji može da se probuši iglom za potkožnu injekciju). Najmanje jedan aktivni agens u kompoziciji je antitelo predmetnog pronalaska. Etiketa ili uputstvo za upotrebu ukazuje na to da se preparat koristi za lečenje stanja po izboru. Pored toga, proizvod može da sadrži (a) prvo pakovanje sa kompozicijom koja se u njemu nalazi, pri čemu kompozicija sadrži antitelo iz pronalaska; i (b) drugo pakovanje sa kompozicijom koja se u njemu nalazi, pri čemu kompozicija sadrži dodatni citotoksični ili drugi terapeutski agens. Proizvod u ovom otelotvorenju predmetnog pronalaska može dodatno da sadrži uputstvo za upotrebu koje ukazuje da kompozicije mogu da se koriste za lečenje određenog stanja. Alternativno, ili dodatno, proizvod može dalje da sadrži drugo (ili treće) pakovanje koje sadrži farmaceutski prihvatljiv pufer, kao što je bakteriostatska voda za injekcije (BWFI), fiziološki rastvor sa fosfatnim puferom, Ringerov rastvor i rastvor dekstroze. Proizvod može dodatno da sadrži druge materijale poželjne sa komercijalnog aspekta i sa aspekta upotrebe, uključujući druge pufere, razblaživače, filtere, igle i špriceve.
III. PRIMERI
U nastavku su dati primeri za postupke i preparate iz pronalaska. Podrazumeva se da mogu biti primenjena razna druga otelotvorenja, na osnovu opšteg opisa koji je gore dat.
Primer 1. Generisanje anti-CD3 antitela
CD3ε antigeni
1
A. Bispecifični humani i cino CD3ε CD3γ spojeni sa mišjim IgG2a-Fc (CD3εγ-muFc) kDNK koja kodira ekstracelularne delove CD3ε ili CD3γ čoveka ili cinomolgus majmuna (cino) spojena je na C-terminusu sa mišjim IgG2a Fc dajući fuzije CD3-Fc. kDNK koje kodiraju ekstracelularne domene humanih ili cino CD3ε i CD3γ su generisane korišćenjem ukupne RNK iz mononuklearnih ćelija periferne krvi (PBMC) aktiviranih putem anti-CD3/anti-CD28. Normalne PBMC su aktivirane putem anti-CD3 i anti-CD28 imobilisanih na ploči u RPMI sa dodatkom 10% FBS-a tokom 72 h. Ukupna iRNK je izolovana korišćenjem mini kompleta RNeasy kompanije Qiagen. kDNK je korišćenjem prajmera specifičnih za gene putem RT-PCR klonirana u vektore TOPO korišćenjem PCR proizvoda amoplifikovanih Taq polimerazom u skladu sa protokolom koji je obezbeđen sa kompletom za kloniranje TOPO TA kompanije Invitrogen. Dobijeni fragmenti su uvedeni u ekspresioni vektor sisara koji obuhvata mišji IgG2a Fc domen putem subkloniranja bez ograničenja koristeći Phusion High-Fidelity DNK polimerazu (New England Biolabs, kataloški br. M0530L). Fragmenti CD3 su tako amplifikovani sa preklapajućim regionima sadržanim u šablonskom plazmidu da bi ih usmerili direktno nishodno od signalne sekvence i N-terminalno u odnosu na mišji Fc.
Za humane kao i za cino konstrukte, plazmid koji obuhvata CD3ε-Fc je prolazno koeksprimiran sa plazmidom koji sadrži CD3y-Fc u CHO ćelijama sisara. Heterodimeri CD3ε/γ su prečišćeni putem Protein A-Sepharose (Pharmacia Biotech).
B. N-terminalni konjugati peptid-KLH (CD3ε-KLH)
Sintetisani su fragmenti peptida koji sadrže N-terminalne sekvence cino i humanog CD3ε. Fragmenti namenjeni za imunizaciju konjugovani su sa hemocijaninom Megathura crenulata (KLH), koji je naširoko korišćeni noseći protein za generisanje značajnog imunološkog odgovora. Dodavanje prirodnog cisteina na poziciju 28 za cino i humani CD3ε omogućilo je spajanje KLH aktiviranog maleimidom na C-terminalni cistein koji sadrži tiol.
C. Jednolančani CD3ε-26mer-CD3γ (CD3εγ)
kDNK koje kodiraju ekstracelularne delove humanih CD3ε i CD3γ podjedinica generisane su putem PCR. Aminokiseline 1-97 humanog CD3ε i aminokiseline 1-81 humanog CD3γ su povezane pomoću fleksibilnog peptidnog linkera od 26 aminokiselina da bi se formirao konstrukt CD3ε-26mer-CD3γ (CD3εγ) (slika 1). Konstrukt je kloniran u ekspresioni vektor sa His-oznakom za sekreciju iz E. coli koristeći promoter alkalne fosfotaze i signalnu sekvencu sekrecije STIII. CD3εγ je prečišćen na Ni koloni i naknadno ponovo savijen. Pravilno savijeni CD3εγ je zatim prečišćen pomoću afinitetne kolone OKT3.
Pored nekih eksperimenata vezivanja, komercijalni CD3ε je kupljen od kompanije Creative Biomart, Shirley, New York 11967 (kataloški broj CD3E-2194H).
1 4
Imunizacije
A. Imunizacije miševa
BALB/c ili C57BL/6 miševi su imunizovani (2 µg ili 10 µg/injekciji po mišu). Antigeni, suspendovani u adjuvansu monofosforil lipid A/trehaloza dikorinomikolat, ubrizgavani su u jastuče stopala u intervalima od 3 do 4 dana za ukupno 12-15 pojačavanja. Tri dana nakon konačnog pojačavanja pre fuzije, sakupljeni su limfociti iz slezine i limfnih čvorova imunizovanih miševa. Izolovani mišji limfociti su spojeni sa SP2/0-Ag14 ćelijama mijeloma (American Type Culture Collection) korišćenjem aparata Cyto Pulse CEEF-50 (Cyto Pulse Sciences). Ukratko, nakon ispiranja dva puta medijumom za citofuziju C (kat. br. LCM-C), izolovane ćelije slezine i SP2/0-Ag14 ćelije su pomešane u odnosu 1:1, a zatim suspendovane na 10 miliona ćelija/ml u medijumu za citofuziju C, elektrofuzija je izvršena prema uputstvu proizvođača. Spojene ćelije su kultivisane u ClonaCell-HY medijumu C (kat. br.03803) preko noći na 37 °C u inkubatoru sa 7% CO2. Sledećeg dana, spojene ćelije su centrifugirane i zatim suspendovane u 10 ml ClonaCell-HY medijuma C, a zatim nežno pomešane sa 90 ml ClonaCell-HY medijuma D na bazi metil celuloze (kat. br.03804) koji sadrži HAT komponente. Ćelije su stavljene u OmniTray ploče (Thermo Scientific) i ostavljene da rastu na 37 °C u inkubatoru sa 7% CO2. Nakon 6-7 dana inkubacije, pojedinačni klonovi hibridoma su sakupljeni putem ClonePix FL (Molecular Devices) i preneti u ploče za uzgajanje ćelija sa 96 bunarčića (br.353075, Becton Dickinson) sa 200 µl/bunarčiću ClonaCell-HY medijuma E (kat. br. 03805). Medijumi za uzgajanje hibridoma su promenjeni pre ELISA skrininga.
8. Imunizacije zečeva
Imunizacija zečeva je izvršena koristeći 0,5 mg/injekciji sa CFA/IFA humanim i cino CD3ε-KLH na svake 2 nedelje za ukupno 5 injekcija (d0, d14, d28, d42, d56). Uzorci krvi su uzeti 52. i 66. dana.
PEG fuzije i skrining su izvršeni na sledeći način. Klonovi su ispitani na vezivanje za N-terminalni deo CD3ε konjugovanog sa tireoglobulinom (THY) putem ELISA. ELISA testom je takođe utvrđeno da svi pozitivni klonovi unakrsno reaguju sa cino CD3ε i 16 jedinstvenih klonova je izabrano za subkloniranje. Ukupna RNK je ekstrahovana iz zamrznutih ćelijskih peleta i prečišćena pomoću kompleta Qiagen RNeasy prema uputstvu proizvođača. Prvi lanac kDNK je sintetisan korišćenjem RT-PCR u jednom koraku (Qiagen). VH i VL domeni zeca su dodatno PCR amplifikovani koristeći protokol koji je opisan za generisanje imunoloških biblioteka zeca (Kontermann i Dubel. Antibody Engineering. 1: 115-123, 2010). Konstruisana je umerena degeneracija da predstavlja uobičajene germinativne gene imunoglobulina zeca.
Skrining antitela
1
A. Skrining mišjeg hibridoma
3 dana nakon zamene medijuma, supernatanti hibridoma su ispitani putem ELISA na vezivanje za humani i cino CD3ε, kao što je ispod opisano. Svi ELISA pozitivni klonovi su dalje ispitani protočnom citometrijom na vezivanje za humane Jurkatove T ćelije, humane PBMC i cino PBMC (slike 2 i 3). Supernatanti hibridoma su prečišćeni afinitetnom hromatografijom sa proteinom A, zatim sterilno filtrirani (veličina pora 0,2 µm, Nalge Nunc International, NY, SAD) i skladišteni na 4 °C u PBS-u. Prečišćena mAb su potvrđena ELISA testom pre daljeg testiranja u funkcionalnim testovima. Izotip mAb je određen pomoću kompleta za izotipizaciju monoklonskih antitela miša kompanije Roche Diagnostics Corporation.
Aminokiselinske sekvence varijabilnih domena lakog i teškog lanca anti-CD3 antitela 13A3, 72H6 i 19B1 prikazane su na slici 4A. Slika 4A takođe prikazuje HVR sekvence za svako od tri antitela. Na slikama 4B, 4C, 5A i 5B prikazane su dodatne aminokiselinske sekvence varijabilnih domena lakog i teškog lanca drugih anti-CD3 antitela.
8. Skrining nakon imunizacije zečeva
Osam jedinstvenih sekvenci teškog lanca i šest jedinstvenih sekvenci lakog lanca je klonirano iz ćelijskih linija hibridoma. Na slici 7 prikazane su sekvence teškog lanca i lakog lanca za jedno od ovih antitela, Rab17. Velika sličnost sekvence dovela je do odluke da se pažnja usmeri na 6 teških i lakih parova. 6 dobijenih antitela je eksprimirano kao himerni zečji/humani IgG u malom obimu (100 ml kulture 293S), i ELISA testom je provereno vezivanje za CD3 epsilon.
Karakterizacija antitela - testovi afiniteta vezivanja i aktivnosti aktivacije T ćelija A. ELISA test vezivanja CD3εγ
ELISA test vezivanja CD3εγ je obavljen na ELISA mikrotitarskim pločama sa 96 bunarčića (Greiner, Nemačka) koje su obložene humanim/cino CD3ε N-terminalnim aminokiselinama konjugovanim sa THY ili humanim/cino CD3ε/γ fuzionisanim sa mišjim Fc sa 2 µg/ml u 0,05 M karbonatnom puferu (pH 9,6), na 4 °C preko noći. Posle tri ispiranja puferom za ispiranje (0,05% Tween 20 u PBS-u), ploče su blokirane sa 200 µl razblaživača za ELISA test sa BSA. Dodato je 100 µl kultivisanih supernatanta ili razblaženih prečišćenih mAb i inkubirano 1 sat na sobnoj temperaturi. Ploče su isprane tri puta i inkubirane sa HRP konjugovanim kozjim anti-mišjim IgG Fc tokom 1 sata. Nakon ispiranja tri puta, vezani enzim je detektovan dodavanjem 100 µl/bunarčiću TMB supstrata (BioFX Laboratories, MD, SAD) tokom 5 min. Reakcije su zaustavljene dodavanjem 100 µl/bunarčiću zaustavnog reagensa (BioFX, Laboratories, MD, SAD) i detekcijom boje na A630nm.
1
8. Analiza protočnom citometrijom
Humane Jurkatove T ćelije, humane PBMC ili cino PBMC su dva puta isprane FACS puferom za bojenje (fiziološki rastvor puferovan fosfatom koji sadrži 1% fetalnog goveđeg seruma) i zatim suspendovane u FACS puferu za bojenje do konačne koncentracije od 5 × 10<6>ćelija/ml. 100 µl ćelija je dodato u ploču za uzgajanje tkiva sa dnom u obliku slova U sa 96 bunarčića (br. 353077, Becton Dickinson), i dodato je 100 µl supernatanata hibridoma ili razblaženih prečišćenih mAb. Nakon 30 min inkubacije na ledu, ćelije su isprane dva puta FACS puferom za bojenje i zatim naknadno obojene kozjim anti-mišjim IgG antitelom konjugovanim sa FITC ili alofikocijaninom (APC) (br. 1012-11, Southern Biotech) pri razblaživanju 1:300 tokom 30 min. Nakon ispiranja dva puta FACS puferom za bojenje, ćelije su analizirane protočnom citometrijom na uređaju FACSCalibur (BD Biosciences). Podaci su analizirani pomoću softvera FlowJo (Tree Star, Inc.).
C. Test aktivacije humanih T ćelija
Ljudska krv je sakupljena u heparinizovanim špricevima, i PBMC su izolovane korišćenjem Leucosep (Greiner Bio-one, cat br.227290P) i Ficoll Paque Plus (GE Healthcare Biosciences, cat br. 95038-168), prema preporukama proizvođača. Ćelije su isprane u RPMI medijumu koji sadrži 10% FBS, u koji je dodat GlutaMax (Gibco, cat br.35050-061), penicilin i streptomicin (Gibco, cat br. 15140-122) i ~ 0,2 miliona suspendovanih ćelija je dodato na ploču sa U-dnom sa 96 bunarčića. Anti-CD3 antitela su dodata u količini od 10 do 0,01 µg/ml. Nakon kultivacije tokom ~20 sati, ćelije su isprane FACS puferom (0,5% BSA, 0,05% Na azid u PBS-u). Ćelije su zatim obojene pomoću anti-CD69-FITC (BD, kat. br.555530), anti-CD25-PE (BD, kat. br.555432) anti-CD4-APC (BD, kat. br.555349) ili anti-CD8-APC (BD, kat. br.
555369) u FACS puferu, isprane FACS puferom i suspendovane u 100 ul FACS pufera koji sadrži 1 µg/ml propidijum jodida. Podaci su prikupljeni na protočnom citometru FACSCalibur i analizirani pomoću FlowJo. Određen je stepen aktivacije T ćelija upoređujući procenat CD69+ i CD25+ populacije kod CD4+ ili CD8+ T ćelija.
D. Test aktivacije cino T ćelija
Krv majmuna cinomolgua prikupljena je u heparinizovane epruvete. Crvena krvna zrnca su dva puta lizirana ACK puferom za lizu crvenih krvnih zrnaca (0,874% NH4Cl, 0,1% KHCO3, 0,00368 dinatrijum EDTA). Ćelije su isprane u RPMI medijumu koji sadrži 10% FBS, u koji je dodat GlutaMax (Gibco, cat br. 35050-061), penicilin i streptomicin (Gibco, cat br.
15140-122) i ~ 0,2 miliona suspendovanih ćelija je dodato na ploču sa U-dnom sa 96 bunarčića. Anti-CD3 antitela su dodata pri 10 µg/ml. Nakon kultivacije tokom ~20 sati, ćelije su isprane FACS puferom (0,5% BSA, 0,05% Na azid u PBS-u). Ćelije su zatim obojene pomoću anti-
1
CD69-FITC (BD, kat. br.555530), anti-CD25-PE (BD, kat. br.555432) anti-CD4-APC (BD, kat. br.551980) u FACS puferu, isprane FACS puferom i suspendovane u 100 µg FACS pufera koji sadrži 1 µg/ml propidijum jodida. Podaci su prikupljeni na protočnom citometru FACSCalibur i analizirani pomoću FlowJo. Obim aktivacije T ćelija je utvrđen poređenjem procenta CD69+ i CD25+ populacije u CD4+ T ćelijama.
Generisanje varijanti anti-CD3 antitela
A. Kloniranje i sekvenciranje mišjih CD3εγ humanih/cino unakrsno reaktivnih hibridoma
Ukupna RNK je ekstrahovana iz ćelija hibridoma miša koristeći komplet RNeasy (Qiagen), a kDNK prvog lanca je sintetizovana pomoću kompleta SuperScript III RT (Invitrogen). Geni antitela su amplifikovani putem PCR otporne na greške sa Taq polimerazom sa 5' degenerisanom smešom prajmera i 3' Cy-, Cx-, Cλ-specifičnim prajmerima. Proizvodi PCR su prečišćeni i varijabilni regioni teških i lakih lanaca antitela su dobijeni sekvenciranjem proizvoda PCR. Varijabilni regioni teških i lakih lanaca antitela su digestovani odgovarajućim restrikcionim enzimima i klonirani u odgovarajuće pRK ekspresione vektore. Mišja antitela su eksprimirana u 293 ćelijama.
8. Humanizacija
Sekvence humanih/cino CD3εγ unakrsno reaktivnih hibridoma su usklađene sa najhomolognijim domenom humanog konsenzusa ili germinativnim lakim i teškim varijabilnim domenom (slika 7). Sekvenca konsenzusa nazvana mu40G5c izvedena je iz varijabilnih domena lakog i teškog lanca srodnih klonova hibridoma (slika 7). Hipervarijabilni regioni (HVR) projektovani su u lake i teške humane akceptorske okvire radi generisanja humanizovanih CDR-graftova (vidite, npr. slike 8A-8F). Humanizovane varijante su procenjene u obliku Fab fragmenata ili kao IgG. Za graftove su korišćene pozicije VL domena 24-34 (L1), 50-56 (L2) i 89-97 (L3) i pozicije VH domena 26-35 (H1), 50-65 (H2) i 95-102 (H3) (slike 8A-8F). Dodatne varijante koje su uključivale različite kombinacije jedne ili više Vernijeovih pozicija miša takođe su generisane i testirane na afinitet vezivanja (videti, npr. slike 9A-9F). Ostaci varijabilnog domena miša na odabranim Vernijeovim pozicijama su ugrađeni u konačnu humanizovanu sekvencu na osnovu njihove sposobnosti da poboljšaju afinitet vezivanja. Jednovalentni afiniteti vezivanja za odabrana humanizovana antitela za različite CD3ε antigene prikazani su na slici 10. Afiniteti vezivanja za afinitetne varijante humanizovanog anti-CD3 antitela 38E4 (38E4v1-38E4v9) i 40G5c prikazani su na slici 11.
C. Mapiranje paratopa
Svaki ostatak u HVR-L3 i HVR-H3 hu38E4 je odvojeno mutiran u alanin koristeći
1
Kunkelovu mutagenezu. Pored toga, pozicija 95 u HVR-H3 je takođe mutirana u serin, treonin ili glutamat. Varijante sa ovim mutacijama u jednoj tački izražene su kao Fab u HEK293 ćelijama i inicijalno su ispitane kinetičkim postupkom sa jednim ciklusom na instrumentu Biacore T100. Izabrane varijante su takođe uvećane i prečišćene za uobičajeni kinetički postupak sa više ciklusa. Za kinetiku sa jednim ciklusom, CM5 senzorski čipovi Biacore serije S su imobilizovani antihumanim Fab antitelima (komplet za hvatanje humanog Fab, GE Healthcare). Svaki Fab je uhvaćen iz supernatanta kulture i rastuće koncentracije (u rasponu od 3 nM do 250 nM u HBSP puferu) humanog CD3εγ redom su injektovane pri protoku od 30 µl/min u jednom ciklusu analize bez regeneracije površine između injekcija; za svaki ciklus je dobijena disocijacija od 10 min. Za konvencionalnu kinetiku sa više ciklusa, humani CD3εγ, cino CD3εγ ili 27-merni peptid imobilisani su na CM5 senzorskom čipu Biacore serije S pomoću kompleta za kuplovanje amina kompanije Biacore. Serijska trostruka razblaženja svake Fab varijante injektovana su pri protoku od 30 µl/min. Svaki uzorak je analiziran protokolom sa 3 minuta asocijacije i 3 minuta disocijacije. U oba postupka, Biacore čipovi su regenerisani korišćenjem 10 mM glicina (pH 1,7). Odgovor vezivanja je korigovan oduzimanjem slepe probe i Lengmirov model 1:1 sa istovremenim postavljanjem koni koffje korišćen za kinetičku analizu. Efekti ovih mutacija, sažeti na slici 12, ukazuju na to da ostatak lakog lanca R96 i ostaci teškog lanca Y97, R99 i F100b igraju ključnu ulogu u vezivanju za CD3εγ.
D. Mapiranje epitopa CD3
Mutacije alanina su uvedene u CD3ε<1-27>-Fc kako bi se procenilo prepoznavanje epitopa N-terminalno vezujućih anti-CD3ε antitela. Svaka varijanta CD3ε<1-27>-Fc je imobilisana na Nunc Maxisorp pločama preko noći u PBS-u pri 2 µg/ml na 4 °C. Nakon blokiranja ploča sa 2% mleka u prahu u PBS-u koji sadrži 0,05% Tween 20 tokom 1 h, u svaki bunarčić je dodato 100 µl 3 nM anti-CD3ε i ostavljeno da se veže tokom 1 h na 25 °C. Nakon 6 ispiranja PBS-om koji sadrži 0,05% Tween 20, vezivanje antitela je detektovano dodavanjem anti-mišjeg IgG-HRP sekundarnog antitela, kao što je prikazano na slici 13A.
CD3εγ je subkloniran u M13 fagemid koji sadrži C-terminalnu gD oznaku praćenu ćilibarnim zaustavnim kodonom tako da može biti prikazan na fagu ili eksprimiran u nesupresorskom soju E. coli. Ovaj CD3εγ fagemid je korišćen kao šablon za pravljenje pojedinačnih mutacija alanina u CD3ε pomoću Kunkelove mutageneze. Svaki CD3ε alaninski mutant prikazan na fagu potvrđen je DNK sekvenciranjem, izolovan iz jedne kolonije, uzgajan preko noći u 2YT/Carb plus KO7 pomoćni fag i prečišćen precipitacijom PEG. Efekat mutacije alanina u CD3εγ na vezivanje anti-CD3 antitela procenjen je pomoću ELISA testa faga. Svako
1
anti-CD3 antitelo je imobilisano na NUNC maxisorp ploči sa 2 µg/ml u PBS puferu preko noći na 4 °C. Prečišćeni supernatant faga koji prikazuje alaninsku varijantu CD3εγ (1,0 OD450) dodat je na ploču i ostavljen da se veže na sobnoj temperaturi uz tresenje tokom 1 h. Nakon ispiranja, vezani fag je detektovan sa anti-M13-HRP (GE Healthcare kat. br. 45-001-419). Vezivanje svake alaninske varijante CD3εγ upoređeno je sa vezivanjem CD3εγ faga divljeg tipa (slika 13B). Alaninske varijante koje su uticale na vezivanje anti-CD3 antitela dalje su okarakterisane procenom vezivanja u funkciji koncentracije faga (slika 13C).
Da bi se kvantifikovao uticaj mutacija alanina u CD3 na vezivanje antitela, izabrani CD3 alaninski mutanti su eksprimirani u nesupresorskom soju E. coli. Izlučene varijante CD3εγ su uhvaćene iz sirove periplazmičke frakcije koristeći anti-CD3 antitelo UCHT1v9. UCHT1v9 je imobilisan na čipu CM5 serije S putem kuplovanja amina pomoću kompleta za hvatanje antihumanog IgG (Fc) antitela (BR-1008-39) kompanije GE Healthcare. SPR merenja su izvršena na instrumentu Biacore 4000, korišćenjem softvera za kinetičku evaluaciju. Da bi se izmerio afinitet jednovalentnog vezivanja, korišćena su anti-CD3 bispecifična antitela u kojima je jedan krak bio anti-CD3 koji se testira a drugi krak je prepoznavao irelevantan antigen. Bispecifična anti-CD3 antitela su propuštena kroz uhvaćeni supernatant u seriji koncentracija dvostrukih razblaženja od 0,39 do 100 nM. Dobijeni kinetički parametri (slika 13D) izmereni su i izračunati pomoću softvera Biacore 4000 BIAevaluation (šifra proizvoda 28-9664-57).
E. Strukturno mapiranje mesta vezivanja CD3ε
1. Hu38E4.v1 Fab
Hu38E4.v1 Fab, rastvoren u 0,15 M NaCl, 25 mM tris, pH 7,5 pri 10 mg/ml i 2-struki molarni višak (1 mg) CD3ε peptida, QDGNEEMGGITQTPYK (SEQ ID NO: 284) (slika 14A), pomešani su i podvrgnuti ispitivanju kristalizacije. Inicijalni skrining je obavljen sa retkom matricom nataloženih supstanci u formatu difuzije pare iz sedeće kapi. Optimizovani kristali su izrasli iz smeše 1:1 sa depo rastvorom koji sadrži 70% V/V metil-pentandiola i 0,1 M HEPES pufer na pH 7,5. Depo je korišćen kao krioprotektant. Kristali su prebačeni na kriogenu temperaturu iznenadnim potapanjem u tečni azot.
Podaci o difrakciji za peptidni kokristal hu38E4.v1 Fab i CD3ε su prikupljeni na 22ID liniji zraka naprednog izvora fotona, koristeći detektor MAR300 CCD. Snimljene difrakcije su zatim integrisane i skalirane pomoću programa HKL2000.
Struktura je podeljena postupkom molekularne zamene (MR) pomoću programa Phaser. Model pretrage MR je bila Fab podjedinica izvedena iz kristalne strukture kompleksa HGFA/Fab (PDB kod: 2R0L). CD3ε peptid je ugrađen u strukturu na osnovu Fo-Fc mape. Struktura je naknadno usavršena programima REFMAC5 i PHENIX koristeći ciljne funkcije
11
maksimalne verovatnoće, anizotropnu individualnu metodu utačnjavanja B-faktora i TLS metodu utačnjavanja, kako bi se postigla konvergencija. Podaci i statistika za utačnjavanje su prikazani u tabeli 3A.
TABELA 3A. Prikupljanje podataka i statistički podaci za utačnjavanje za kompleks hu38E4.v1/CD3ε
<2>Rsym = gde je Ihiskalirani intenzitet i-tog zapažanja vezanog za simetriju refleksije h, a Ihje srednja vrednost.
<3>Rcryst = Σh|Fo,h- Fc,h| / ΣhFo,h, gde su Fo,hi Fc,huočene i izračunate amplitude strukturnog faktora za refleksiju h.
<4>Vrednost Rfreese izračunava za 5% nasumično odabranih refleksija koje nisu uključene u utačnjavanje.
Kristalna struktura kompleksa hu38E4.v1 Fab/CD3ε peptida je određena pri rezoluciji 19Å. Struktura je otkrila da CD3ε peptid pravi mali zaokret i duboko se ubacuje u procep između teškog i lakog lanca 38E4.v1 Fab (slike 14B i 14C). Vezivanjem se prekriva 666 Å<2>površine dostupne rastvaraču između peptida i Fab fragmenta, što uključuje složenu mrežu hidrofobnih, vodoničnih i jonskih interakcija (slika 14D). Prsten N-terminalnog piroglutamata (pyroglu) pakuje se naspram Tyr33 teškog lanca i stvara vodoničnu vezu sa His35 teškog lanca u HVR-H1. Bočni lanac velike zapremine ostatka F100b u HVR-H3 gura His35 u pravilnu orijentaciju za njegovu interakciju sa pyroglu i objašnjava gubitak vezivanja uočen kada se F100b mutira u alanin, ostatak sa bočnim lancem male zapremine. Pored toga, u skladu sa rezultatima skeniranja sa alaninom, R96 u CDR-L3 stvara kritičnu vodoničnu vezu sa karboksilnom grupom u pyroglu, dok Y97 u CDR-H3 stvara vodoničnu vezu sa Met7 CD3ε peptida (slika 14E). Interesantno je da, mada supstitucija alanina na R99 u CDR-H3 ima dramatičan efekat na vezivanje antigena, struktura otkriva da je ovaj bočni lanac orijentisan u smeru od CD3ε peptida i ne uključuje nikakve interakcije sa peptidom. Umesto toga, R99 ostvaruje opsežne kontakte sa nekoliko ostataka u CDR-H3, uključujući vodoničnu vezu sa D101 i hidrofobno pakovanje naspram Y100a koje dalje utiče na Vernijeov ostatak, LC Y49 (slika 14F). Ove interakcije su verovatno važne za potporu i ukupan raspored CDR petlji u 38E4.v1 Fab putem organizovanja kritičnog centralnog procepa između teškog i lakog lanca kako bi se omogućilo vezivanje CD3ε peptida.
Na slici 14G identifikovani su svi ostaci 38E4.v1 Fab za koje je utvrđeno da se nalaze unutar 5 Å od CD3ε peptida. Ovi antigenski kontaktni ostaci su identični između hu38E4.v1 i hu40G5c, osim što je ostatak G96 u hu38E4.v1 serinski ostatak (S96) u hu40G5 (videti sliku 14H, koja prikazuje lokaciju kontaktnog ostatka G96 u hu38E4.v1).
Kontakti između anti-CD3 (38E4.v1) i CD3εγpeptida su izračunati na osnovu skeniranja sa alaninom. Epitopi koje prepoznaje 38E4v1 anti-CD3 su kontakti sa rastojanjem od 3,5 angstrema ili kraćim, kao što je dato u tabeli 3B u nastavku. Na osnovu ove analize, utvrđeno je da su epitopi CD3 Gln1 (PCA1, piroglutaminska kiselina), Asp2, Glu6 i Met7 važni ostaci koji formiraju kontakt sa paratopima lakog lanca i varijabilnim regionima teškog lanca CD3 antitela.
TABELA 3B. CD3 kontakti za kompleks hu38E4.v1/CD3ε
11
*Predstavlja vodoničnu vezu između dva bočna lanca.
Sivo osenčene ćelije predstavljaju pouzdane kontakte za vodoničnu vezu.
Podebljani kontakti su vodonične veze formirane između bočnih lanaca i skeleta glavnih lanca.
2. SP34v52 Fab
SP34v52 Fab je rastvoren u 0,25 M NaCl, 25 mM MES pH 5,5 pri 10 mg/ml. Inicijalni skrining kristalizacije je obavljen putem ispitivanja sa retkom matricom (PEGII, Qiagen) u formatu difuzije pare iz sedeće kapi. Rezultat za kristalizaciju je pronadjen u kapljici sa depoom koji sadrži 0,2 M CaCl2, 0,1 M HEPES pH 7,5 i 30% m/V PEG 4000. Optimizovani kristali su rasli iz smeše 2 µl proteina i 2 µl depo rastvora koji sadrži 20-23% m/V PEG 3350, 0,1 M HEPES pH 7,2, 0,1 M CaCl2. Korišćen je postupak difuzije pare iz viseće kapi i konačna kap kristalizacije je inkubirana na 18 °C.
Podaci o difrakciji za SP34v52 Fab su prikupljeni na 12-2 liniji zraka izvora svetlosti Stanford Synchrotron pomoću detektora PILATUS. Snimljene difrakcije su zatim integrisane pomoću programa XDS i skalirane pomoću programa SCALA. Struktura je podeljena postupkom molekularne zamene (MR) pomoću programa Phaser. Model pretrage MR je bila Fab podjedinica izvedena iz kristalne strukture kompleksa HGFA/Fab (PDB kod: 2R0L). CD3ε peptid je ugrađen u strukturu na osnovu Fo-Fcmape. Struktura je naknadno usavršena programima REFMAC5 i PHENIX koristeći ciljne funkcije maksimalne verovatnoće, anizotropnu individualnu metodu utačnjavanja B-faktora i TLS metodu utačnjavanja, kako bi se postigla konvergencija. Podaci i statistika za usavršavanje su prikazani u tabeli 4 u nastavku.
TABELA 4. Prikupljanje podataka i statistički podaci za usavršavanje za SP34v52
, , .
<2>Rsym = gde je Ihiskalirani intenzitet i-tog zapažanja vezanog za simetriju refleksije h, a Ihje srednja vrednost.
<3>Rcryst = Σh|Fo,h- Fc,h| / ΣhFo,h, gde su Fo,hi Fc,huočene i izračunate amplitude strukturnog
11
faktora za refleksiju h.
<4>Vrednost Rfreese izračunava za 5% nasumično odabranih refleksija koje nisu uključene u utačnjavanje.
Na slikama 14I-14L kristalne strukture hu38E4.v1 i SP34v52 Fab su upoređene u istoj orijentaciji. Kada je CD3ε peptid superponiran na SP34v52 Fab sa istom orijentacijom kao u hu38E4.v1 uočeni su jasni sukobi peptida sa SP34v52 (slika 14L). Utvrđeno je da su ostaci R50 i R52 u HVR-H2 SP34v52, koji nisu bili prisutni kod hu38E4.v1 ni kod hu40G5c, važni za vezivanje CD3 putem SP34v52 (slika 14L). Ovi podaci pokazuju da se hu38E4.v1 i hu40G5c vezuju za CD3 na način različit od SP34v52.
Kristalna struktura hu38E4.v1 u kompleksu sa N-terminalnim peptidom CD3εγprikazana je na slikama 14M i 14N. Slika 14M daje uvećani prikaz ključnih intermolekulskih interakcija koje učestvuju u ostvarivanju kontakta sa šestim ostatkom u CD3εγ. Na uvećanom prikazu, slika 14N prikazuje prostorni model kompleksa Fab/CD3 peptida, pri čemu je peti ostatak u potpunosti okrenut od mesta interakcije. Šesti ostatak, kao što je prikazano, uključen je u interakcije sa Fab i okrenut je ka aktivnom mestu.
Primer 2. Stvaranje i odabir bispecifičnih antitela zavisnih od T-ćelija (TDB) Jedan od pristupa za iskorišćavanje velikog citotoksičnog potencijala T ćelija u iskorenjivanju tumorskih ćelija je upotreba bispecifičnih antitela zavisnih od T ćelija (TDB). Obećavajući klinički odgovori su prijavljeni kod molekula kao što je blinatumomab koji cilja B ćelije, CD19/CD3-bispecifično BiTE antitelo. Međutim, terapeutski potencijal brojnih prijavljenih modaliteta bispecifičnih antitela je ograničen nedostacima, uključujući nepovoljnu farmakokinetiku (PK), toksičnost i/ili probleme sa proizvodnjom. Shodno tome, inicijalno smo generisali i okarakterisali anti-CD3 TDB antitela koja imaju različite kombinacije anti-CD3 kraka i kraka antitumorskog antigena (npr. anti-CD20, anti-FcRH5, anti- HER2, anti-LYPD1, anti-LY6E, anti-LY6G6D, anti-PMEL17, anti-CD19, anti-CD22, anti-CD33, anti-CD79A, anti-CD79B, anti-EDAR, anti-GFRA1, anti-MRP4, anti-RET, anti-Steap1, anti-TenB2), proizvedena kao antitela pune dužine u formatu „dugme u rupici“. Neočekivano smo utvrdili da su određene kombinacije (parovi) anti-CD3 kraka i kraka antitumorskog antigena dovele do toga da TDB pokazuju povoljnu aktivnost u odnosu na druge TDB.
TDB antitela su proizvedena kao antitela pune dužine u formatu „dugme u rupici” kao humani IgG1, prema prethodnom opisu (Atwell et al. J. Mol Biol.270: 26-35, 1997). Polovina antitela je eksprimirana u ćelijama E. coli ili ćelijama jajnika kineskog hrčka (CHO), prečišćena
11
afinitetnom hromatografijom sa proteinom A, a odgovarajuća polovina parova antitela je komplementarno vezana in vitro, prema prethodnom opisu (Spiess et al. Nat. Biotechnol.2013). Ako je proizvodnja TDB antitela izvedena u CHO ćelijama, antitelo može da sadrži mutaciju aglikozilacije, na primer, na ostatku N297 (npr. N297G), tako da je TDB antitelo varijanta bez efektora i nije u stanju da inicira ćelijsku citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC). Na slici 15 je dat šematski prikaz proizvodnje CD3/CD20 TDB.
Nakon komplementarnog vezivanja, CD3/CD20 TDB antitela su prečišćena hromatografijom sa hidrofobnim interakcijama (HIC) i okarakterisana analitičkom gel filtracijom, masenom spektrometrijom i poliakrilamidnom gel elektroforezom. Prečišćena antitela su imala jedan pik (> 99% signala) na gel filtraciji sa manje od 0,2% agregata. Masenom spektometrijom nisu detektovani homodimeri. Anti-CD20 krakovi koji su testirani prilikom stvaranja CD3/CD20 TDB su uključivali 2H7v16, 2H7v114, 2H7v511 i GA101. Anti-CD3 krakovi koji su testirani prilikom stvaranja CD3/CD20 TDB su uključivali UCHT1v1, UCHT1v9, UCHT1vM1, 72H6, 13A3, 30A1, 41D9a, SP34v52, 40G5c, 38E4v1-38E4v9, 21B2, 125A1 i 21A9. CD3/CD20 TDB su testirana na vezivanje za CD3, kao i na aktivnost, na osnovu in vitro testova ubijanja B ćelija i testova aktivacije T ćelija.
A. Afinitet vezivanja
Afinitet vezivanja za svako CD3/CD20 TDB su testirani putem Biacore ili FACS analize, kao što je prethodno opisano za anti-CD3 antitela. Ukratko, za Biacore testove vezivanja, humani CD3εγ je imobilisan na senzorskom čipu Biacore Series S CM5 koristeći Biacore komplet za kuplovanje amina, a njihova CD3/CD20 TDB antitela ili Fab varijante su se nalazili u protoku. Za FACS testove vezivanja, Bjab ćelije (za antigene B-ćelija) ili Jurkatove ćelije (za CD3 antigen) inkubirane su sa različitim koncentracijama TDB antitela na 4 °C u trajanju od 30 minuta, zatim su ćelije isprane i inkubirane sa drugim antitelom (anti-huIgG-PE; BD Bioscience) dodatnih 15 minuta, pre nego što su ćelije ponovo isprane i pripremljene za FACS analizu. Na slici 16 su prikazani rezultati in vitro FACS testova vezivanja CD3/CD20 TDB. Rezultati pokazuju da određene kombinacije anti-CD3 kraka antitela i kraka antitumorskog antigena (npr. anti-CD20 krak) daju TDB antitela sa povoljnijim svojstvima vezivanja. Na slici 17 su prikazani afiniteti jednovalentnog i dvovalentnog vezivanja za ove konkretne CD3/CD20 TDB. Posebno uparivanje 2H7v16 sa anti-CD3 kracima (npr. UCHT1v9), na primer, dalo je CD3/CD20 TDB koje je pokazalo neočekivano snažno vezivanje za Bjab kao i za Jurkatove ćelije u poređenju sa drugim testiranim CD3/CD20 TDB koja imaju različite anti-CD20 krake. Ispitan je i afinitet vezivanja drugih CD3/CD20 TDB koja imaju 2H7v16 anti-CD20 krak i različite anti-CD3 krake (videti slike 18-24).
11
8. In vitro ubijanje B-ćelija i testovi aktivacije T-ćelija
Za generisana CD3/CD20 TDB antitela takođe je ispitana njihova sposobnost da podrže ubijanje B-ćelija i aktivaciju citotoksičnog dejstva T-ćelija. U ovim testovima, B tumorske ćelijske linije (Bjab) nabavljene su od organizacije ATCC, a PBMC su izolovane iz pune krvi zdravih donora separacijom sa fikolom. Po potrebi, CD4+ T i CD8+ T ćelije su odvojene pomoću Miltenyi setova prema uputstvu proizvođača. Ćelije su uzgajane u RPMI1640 uz dodatak 10% FBS (Sigma-Aldrich) na 37°C u vlažnom standardnom inkubatoru za kulturu ćelija. Za testove ubijanja Bjab ćelija, 20.000 Bjab ćelija je inkubirano sa efektorskim ćelijama u vidu huPBMC ili prečišćenih T-ćelija, u naznačenim razmerama po testu, u prisustvu različitih koncentracija TDB antitela u određenom vremenskom periodu koji je naznačen za test. Za endogene testove ubijanja B-ćelija, 200.000 huPBMC je inkubirano sa različitim koncentracijama TDB antitela tokom broja sati koji je naznačen za test. Na kraju svakog testa, žive B-ćelije su izvedene kao PI-CD19+ ili PI-CD20+ B-ćelije pomoću FACS, a apsolutni broj ćelija je dobijen sa FITC zrncima dodatim u reakcionu smešu kao interna kontrola brojanja. % ubijanja ćelija izračunat je na osnovu kontrola koje nisu tretirane TDB-om. Aktivirane T ćelije su detektovane na osnovu površinske ekspresije CD69 i CD25.
Različite efikasnosti generisanih TDB antitela sa bispecifičnošću za CD3 i drugi biološki molekul (u ovom slučaju, CD20) naglašavaju ključne i nepredvidive doprinose oba kraka antitela generisanju egzemplarnog TDB koji poseduje visoku efikasnost (vidite slike 25-49).
Primer 3. Karakterizacija primera za CD3/CD20 TDB (CD20 TDB)
Dalje smo okarakterisali dva gore opisana primera CD3/CD20 TDB (CD20 TDB), koji su pokazali visoku efikasnost u in vitro testovima ubijanja B ćelija i aktivacije T ćelija. CD20 krak oba TDB antitela je bio anti-CD20 klon 2H7.v16 (videti sliku 50), dok je CD3 krak bio klon UCHT1v9 (videti, npr. Zhu et al. Int. J. Cancer. 62: 319-324, 1995) ili cino unakrsno reaktivni klon 40G5c (videti, npr. sliku 51), koji ima uporedivu aktivnost.
Materijali i postupci
A. Proizvodnja antitela
Bispecifična antitela zavisna od T ćelija (TDB) proizvedena su kao antitela pune dužine u formatu „dugme u rupici” kao humani IgG1, prema prethodnom opisu (Atwell et al. J. Mol Biol. 270: 26-35, 1997). Polovina antitela je eksprimirana u ćelijama E. coli i tako aglikozilovana, prečišćena afinitetnom hromatografijom sa proteinom A, a odgovarajuća polovina parova antitela je komplementarno vezana in vitro, prema prethodnom opisu (Spiess et al. Nat. Biotechnol. 2013). Nakon komplementarnog vezivanja, antitela su prečišćena
11
hromatografijom sa hidrofobnim interakcijama (HIC) i okarakterisana analitičkom gel filtracijom, masenom spektrometrijom i poliakrilamidnom gel elektroforezom. Prečišćena antitela su imala jedan pik (>99% signala) na gel filtraciji bez detektabilnih agregata (slika 52A), a masenom spektrometrijom nisu detektovani homodimeri (slika 52B).
8. In vitro ubijanje B-ćelija i testovi aktivacije T-ćelija
B tumorske ćelijske linije su dobijene od organizacije ATCC, a PBMC su izolovane iz pune krvi zdravih donora separacijom sa fikolom. CD4+ T i CD8+ T ćelije mogu biti odvojene pomoću Miltenyi setova prema uputstvu proizvođača. Ćelije su uzgajane u RPMI1640 sa dodatkom 10% FBS-a (Sigma-Aldrich). Za testove ubijanja B-ćelija, žive B-ćelije su izvedene kao PI-CD19+ B-ćelije pomoću FACS, a apsolutni broj ćelija je dobijen sa FITC zrncima dodatim u reakcionu smešu kao interna kontrola brojanja. Aktivirane T ćelije su detektovane na osnovu površinske ekspresije CD69 i CD25. FACS je detektovao indukciju granzima B. Koncentracija perforina u medijumu je detektovana putem ELISA (eBioscience). Sva antitela su kupljena od kompanije BD Bioscience.
C. In vivo studije efikasnosti na mišjim modelima
Humanizovani NSG i SCID miševi su kupljeni od kompanije Jackson Labs. Humani CD20 transgeni miševi i humani CD3 transgeni miševi su proizvedeni kao što je prethodno opisano (Gong et al. J. Immunol. 174: 817-826, 2005 i de Ia Here et al. J. Exp. Med.173: 7-17, 1991), i humani CD20/CD3 dvostruko transgeni miševi su proizvedeni ukrštanjem dva pojedinačna transgena miša. Mišji modeli humanog limfoma su generisani ubrizgavanjem 5 × 10<6>ćelija Bjab-luciferaze samostalno ili pomešanih sa 10 × 10<6>PBMC humanog donora u HBSS supkutano u desni bok 40 ženki miševa. Miševi su intravenski tretirani vehikulumom ili sa 0,5 mg/kg CD20 TDB jedan sat nakon inokulacije i nedelju dana nakon početnog lečenja. Tumori su mereni 1-2 puta nedeljno, a telesna težina dva puta nedeljno do 7 dana nakon završnog lečenja. Ako nije primećen gubitak težine, težina više nije merena za datu životinju. Ako je gubitak težine bio veći od 15% ukupne telesne težine, dati miševi su svakodnevno mereni i eutanazirani (ili je na njih skrenuta pažnja veterinarskom osoblju) ako je gubitak težine premašio 20%. Klinička posmatranja su vršena dva puta nedeljno tokom trajanja studije kako bi se pratilo zdravlje životinja; svaka životinja sa tumorom određene veličine ili stanja koje može ometati zdravlje ili aktivnost životinje je eutanazirana. U suprotnom, životinje su eutanazirane 6 meseci nakon inicijalnog lečenja ili ako je tumor postao ulcerozan ili je njegova zapremina premašila 2500 mm<3>.
Modeli miševa sa hroničnom limfocitnom leukemijom (CLL) dobijenom od pacijenta generisani su kao što je prethodno opisano (Bagnara et al. Blood. 117: 5463-5472, 2011).
11
Ukratko, 5 × 10<5>aktiviranih T ćelija je prečišćeno iz CLL PBMC i ubrizgano retroorbitalno u NSG miševe. Nakon graftovanja T ćelija, 2 × 10<7>CLL PBMC je ubrizgano retro-orbitalno. Nakon 14 dana, putem FACS analize je potvrđena cirkulacija transplantiranih B i T ćelija. Životinje sa uspešnim graftovanjem su 3,5 nedelje kasnije naknadno tretirane TDB antitelima koja su primenjena intravenski injekcijom u repnu venu. Životinje su eutanazirane 6 ili 14 dana nakon tretmana. Puna krv je prikupljena punkcijom retroorbitalnog sinusa pomoću heparinizovanih pipeta i odmah prebačena u heparinizovane epruvete, dok su životinje bile pod anestezijom, ili terminalnom srčanom punkcijom, pomoću heparinizovanog šprica nakon eutanazije sa CO2. Slezina je prikupljena nakon eutanazije sa CO2. Za svaku studiju vršena su klinička zapažanja dva puta nedeljno radi praćenja zdravlja životinja. Telesna težina životinja je merena najmanje jednom nedeljno. PBMC su izolovane nakon lize crvenih krvnih zrnaca, i putem FACS analizirane na B ćelije (muCD45+CD19+) i T ćelije (muCD90.2+CD4+, ili muCD90.2+CD8+). Sva antitela koja se koriste su kupljena od kompanije BD Biosciences ili eBiosciences.
D. PKPD studija kod majmuna cinomolgusa
Sve studije na majmunima cinomolgus su sprovedene uz korišćenje namenski uzgojenih, naivnih, cinomolgus majmuna poreklom iz Kine. Za PKPD studiju sa jednom dozom, 3 mužjaka cinomolgus majmuna su dobilI jednu sporu bolusnu i.v. dozu od 1 mg/kg CD20 TDB; za studiju sa ponovljenom dozom, 4 majmuna cinomolgus su dobilI i.v. sporu bolusnu dozu od 1 mg/kg CD20 TDB jednom nedeljno za ukupno 4 doze. Puna krv ili tkivo su prikupljeni u odabranim terminima za prebrojavanje B ćelija ili T ćelija putem FACS. Serum je prikupljen i čuvan na -70 C do analize pomoću ELISA testa za određivanje količine ispitivane stavke u svakom uzorku seruma. Profili koncentracije u serumu tokom vremena svake životinje korišćeni su za procenu farmakokinetičkih (PK) parametara koristeći softver WinNonlin (Pharsight; Mountain View, CA).
Visokokvalitetno CD20 TDB proizvedeno kao humanizovani IgG pune dužine sa PK osobinama konvencionalnog antitela
Da bismo istražili svojstva ciljanja koja bi mogla uticati na potentnost TDB prilikom ciljanja B-ćelija, uključujući identitet antigena, veličinu ekstracelularnog domena i rastojanje epitopa od membrane, kreirali smo preko 40 različitih TDB koji ciljaju epitope na CD3ε, CD19, CD20, CD22, CD79a i CD79b. Reprezentativni rezultati su prikazani na slici 56I. Otkrili smo da su najpotentnija TDB antitela bila ona koja ciljaju ciljne antigene kancera sa malim ekstracelularnim domenima (ECD) i epitopima blizu membrane ciljne ćelije. Među najboljim ciljevima su bili CD20, CD79a i CD79b sa potentnošću oko 10 ng/ml ili 67 pM za ubijanje
12
normalnih donorskih B ćelija putem autolognih T ćelija.
Anti-CD20/CD3 TDB (CD20-TDB) ovde je opisano kao molekul za dokaz koncepta koji pokazuje farmakološku aktivnost ovih TDB koje ciljaju B-ćelije. CD20 TDB su proizvedena kao potpuno humanizovani IgG pune dužine sa uređenjem prirodnog antitela iz bakterija, bez homodimera i agregata (slika 52). Farmakokinetičko (PK) svojstvo CD20 TDB kod pacova, vrste koja se ne vezuje, podseća na svojstvo drugih humanih IgG antitela, sa poluživotom od oko 7 dana (slika 53).
Ubijanje B ćelija od strane CD20 TDB je zavisno od T ćelija na osnovu puta granzim-perforin
Da bismo procenili CD20 TDB kao potencijalnu terapiju za ćelijske proliferativne poremećaje, kao što su CD20+ B ćelijski maligniteti, prvo smo istražili njegov mehanizam delovanja kao bispecifičnog antitela koje regrutuje T ćelije. Za razliku od aktivnosti ADCC, koja je glavni mehanizam delovanja za klasičnu terapiju monoklonskim antitelima, Fc region nije potreban za aktivnost CD20 TDB. F(ab')2 deo CD20 TDB je zadržao istu potentnost kao IgG CD20 TDB pune dužine za ubijanje B ćelija (slika 54A). CD20 TDB je uslovni agonist kome su za aktivnost potrebni ciljna ekspresija, T ćelije i antitelo. Aktivnost ubijanja B ćelija CD20 TDB je zavisna od T ćelija, pošto ubijanje B ćelija nije detektovano sa PBMC bez CD3+ T ćelija (slika 54B). Ciljna ekspresija je potrebna za aktivaciju T ćelija, jer bez ekspresije CD20 nema aktiviranih T ćelija (slika 54C). CD20 TDB je u stanju da aktivira CD4+ kao i CD8+T ćelije, što se može videti na osnovu indukcije CD69 kao i CD25 na T ćelijama (slika 54D). Uporedivo ubijanje B ćelija se može postići sa bilo kojim T ćelijama kao efektorima, pri čemu deluje da su CD8+T ćelije potentnije za ubijanje BJAB ćelija, pošto su CD8+T ćelije dovele do većeg stepena ubijanja ćelija nego jednak broj CD4+ T ćelija (slika 54C). Međutim, povećana regulacija granzima je zastupljenija kod CD8+T ćelija (slika 54E), pri čemu su viši nivoi oslobađanja perforina i granzima A i B (nije prikazano) povezanog sa CD8+T ćelijama otkriveni u medijumu putem ELISA (slika 54F). Aktivirane T ćelije su sposobne za proliferaciju (slika 55). Međutim, ukupan broj T ćelija se nije značajno povećao nakon 24 sata u prisustvu CD20 TDB i B ćelija bez dodatka citokina in vitro, verovatno zbog uslova uzgajanja. Robusna ekspanzija T ćelija je zaista primećena in vivo u studijama efikasnosti sa mišjim modelima i kod cinomolgus majmuna (slike 58A i 67C).
CD20 TDB antitelo potentno za ubijanje B ćelija leukemije/limfoma i ubijanje autolognih B ćelija in vitro
Potentnost CD20 TDB za ubijanje B ćelija je takođe testirana sa više od desetak B ćelijskih linija leukemije/limfoma in vitro. Za procenu potentnosti CD20-TDB izabrano je 8 linija koje predstavljaju ćelije sa širokim opsegom nivoa ekspresije CD20 (slika 56B). Krive ubijanja B ćelija zavisnog od doze prikazane su sa 8 ćelijskih linija, pri čemu su PBMC izolovane od zdravog donora kao efektorske ćelije (slika 56A). Značajno je da CD20-TDB antitelo nije imalo aktivnost na SU-DHL1 ćelijama koje nemaju ekspresiju CD20. Potentnost CD20-TDB je donekle bila povezana sa različitim nivoima površinskog CD20 koji su detektovani protočnom citometrijom (56A). Bez obzira na to, CD20 TDB je potentno za ubijanje svih 8 linija na način zavisan od doze, sa EC50 u rasponu od 0,38 do 11 ng/ml za 24-časovni test. Obim ubijanja ćelija donekle varira od 60 do 90% sa do 1000 ng/ml TDB u 24-časovnom testu (slika 56C). Generalno, potpuno ubijanje B ćelija se može postići putem veće koncentracije antitela ili produženog trajanja testa. SU-DHL-1 ćelije su uključene u test ubijanja kao CD20 negativna kontrola, gde nije uočeno ubijanje ćelija, što pokazuje neophodnu ciljnu ekspresiju za aktivnost CD20 TDB. Čini se da aktivnost CD20 TDB zahteva veoma mali nivo ciljne ekspresije, jer ovde prikazane Nalm-6 i SC-1 ćelije imaju veoma malu površinsku ekspresiju CD20 (slika 56B). Afinitet jednovalentnog vezivanja CD20 TDB za CD20 je slabiji od afiniteta vovalentnog vezivanja matičnog anti-CD20, sa KDod 54 nM određenom Skačardovom analizom. Kada se vrednost KDi potentnost CD20 TDB za ubijanje B ćelija uzmu zajedno, zauzetost receptora potrebna za aktivnost CD20 TDB je manja od 0,1%. TDB antitela generisana da ciljaju različite antigena B ćelija su takođe efikasna u posredovanju ubijanja B ćelija kao što je prikazano na slici 56D, gde su TDB koje ciljaju 5 različitih antigena B ćelija, uključujući CD20 TDB (TDB A: 2H7v16/UCHT1v9), ubila 75% do 90% B ćelija. CD20 TDB dalje može da posreduje u ubijanju dodatnih B linija limfoma sa varijabilnom ekspresijom CD20 površinskog antigena (slika 56E).
CD20 TDB antitelo je takođe veoma potentno za ubijanje autolognih B ćelija, testirano sa humanim PBMC izolovanim iz periferne krvi zdravih donora (slika 56F). Na slici 56F prikazane su krive ubijanja zavisnog od doze za 8 nasumičnih donora, kao i zbirni dijagram za EC50 i opseg ubijanja B ćelija (slika 56G) sa 1000 ng/ml antitela u 24-časovnom testu za 30 donora. Od 30 testiranih uzoraka, 57 do 96% B ćelija je uništeno sa do 1000 ng/ml antitela u roku od 24 sata, sa EC50 u rasponu od 0,43 do 135 ng/ml sa medijalnom vrednošću manjom od 3 ng/ml. Obim ubijanja B ćelija u roku od 24 sata putem CD20 TDB je veoma uporediv sa ubijanjem B ćelija putem anti-CD3/anti-CD19 scFv ili veći od njega (slika 56H).
CD20 TDB antitelo je potentno za iscrpljivanje B ćelija in vivo na mišjim modelima Kako naše testirano CD20 TDB ne prepoznaje mišje CD20 i CD3 antigene, iskoristili smo humane CD20 i humane CD3 transgene miševe (gore opisane) za proizvodnju humanih CD3/CD20 dvostruko transgenih miševa za dalje ispitivanje efikasnosti in vivo. Kao što je prikazano na slici 57A, humani CD3/CD20 dvostruko transgeni miševi eksprimiraju huCD3εna površini CD4+ i CD8+ T ćelija pored huCD20 na površini CD19+ B ćelija na detektabilnom nivou u poređenju sa T i B ćelijama dobijenim od čoveka. Kod humanih CD20 transgenih miševa, samo rituksimab može da iscrpi B ćelije, jer CD20 TDB ne može da angažuje mišje T ćelije bez ekspresije humanog CD3 (slika 57B). Dok je kod humanog CD3/CD20 dvostruko transgenih miševa CD20 TDB bio u stanju da angažuje mišje T ćelije koje eksprimiraju huCD3 i potentan je za iscrpljivanje mišjih B ćelija koje eksprimiraju huCD20 (slika 57C). Čini se da je CD20 TDB potentnije za iscrpljivanje B ćelija in vivo, jer je manje B ćelija otkriveno u slezini miša 7 dana nakon jedne i.v.doze CD20 TDB od 0,5 mg/kg, u poređenju sa jednom dozom rituksimaba od 10 mg/kg. HER2 TDB, koje ima isti CD3 krak dok se sa drugi krak vezuje za HER2, ovde je korišćeno kao izotipska kontrola i ovde ne pokazuje aktivnost iscrpljivanja ćelija.
Da bi se istražila najniža efikasna doza za CD20 TDB za iscrpljivanje B ćelija sa humanim CD3/CD20 dvostruko transgenim miševima, miševi su tretirani jednom dozom CD20 TDB počevši od 0,5 mg/kg do 0,00005 mg/kg. Zatim je broj B ćelija u krvi praćen na D1 (24 sata nakon doze), D8 i D15. Smanjen broj B ćelija je uočen na D1, a iscrpljivanje B ćelija je održano do D15 nakon tretiranja sa CD20 TDB (slika 58A). U skladu sa ovim posmatranjem broja B ćelija u krvi, skoro potpuno iscrpljivanje B ćelija u slezini miša je postignuto na D7 nakon jedne doze od 0,5 mg/kg, dok je niža doza od 0,05 mg/kg dovela do delimičnog iscrpljivanja B ćelija slezine i bila je približna doznom nivou ED50 (slika 58B). Studija vremenskog toka sa dvostruko transgenim miševima otkrila je da je iscrpljivanje B ćelija skoro potpuno u slezini već 3 dana nakon tretmana jednom dozom od 0,5 mg/kg, bez značajnog znaka oporavka B ćelija do D14 (slika 58A). Kao što se vidi na slici 58C, CD20 TDB posreduje u iscrpljivanju B ćelija na periferiji dvostruko transgenog huCD20/huCD3, koje se detektuje u krvi već dva sata nakon tretmana i održava do sedam dana nakon tretmana. Dalje, aktivirane CD8+ i CD4+ T ćelije se mogu detektovati u krvi u roku od dva sata od primene CD20 TDB, a zatim opadaju dva dana nakon tretmana (slika 58D).
Dalje, CD20 TDB iscrpljuje B ćelije marginalne zone (MZB) (slika 59A i slika 59B) podjednako efikasno kao folikularne B ćelije (FOB) (slika 59A i slika 59C) u slezini miša, nakon jedne i.v. doze od 0,5 mg/kg. Uočili smo da se broj B ćelija u slezini smanjio za ~ 50% u odnosu na početnu vrednost do 1. dana (24 sata nakon doze) i nastavio je brzo da opada i 3. dana dostigao najnižu vrednost koja je održavana tokom cele studije. Ovo se očigledno razlikuje od prethodnog izveštaja za rituksimab, gde se smatralo da mikrookruženje igra ulogu u efikasnosti rituksimaba, što ukazuje na drugačiji način delovanja CD20 TDB in vivo od onog
12
za rituksimab. Aktivacija mišjih T ćelija se obično primećuje u krvi već 30 minuta nakon tretiranja sa CD20 TDB, a najviše u prva 24 sata u slezini (slike 59D i 59E). Nakon aktivacije T ćelija, primećeno je povećanje broja T ćelija oko D2-D3 (slika 59D i 59E), kao rezultat proliferacije ćelija. Do 2. dana većina T ćelija više nije bila pozitivna na CD69, iako su nivoi CD69+CD8+ ćelija nastavili da se kreću u rasponu od 10-30% do kraja dvonedeljne studije. Međutim, verovatno usled ubijanja ćelija indukovanog aktivacijom, broj T ćelija ima tendenciju da se smanji nakon faze ekspanzije. Broj T ćelija se na kraju oporavlja nakon tretiranja sa TDB, što ukazuje na to da nema inhibitornog dejstva tretiranja sa CD20 TDB na regeneraciju mišjih T ćelija.
Humanizovani NSG miševi su takođe korišćeni za dalju potvrdu potentnosti CD20 TDB u iscrpljivanju B ćelija na mišjim modelima, i u postavci sa ponovljenim dozama. Miševi koji su zapravo uključeni u studiju prikazani na slikama 60A-60D imali su 35-80% humanih CD45+ ćelija u perifernoj krvi, a opseg CD4+, CD8+ i CD20+ ćelija bio je 12-25, 2,1-8,7 odnosno 32-60% (procenat prijavljen na osnovu izdvojenih vijabilnih leukocita). Reprezentativni primeri ove osnovne karakterizacije prikazani su na slici 60E. Nivoi CD3 i CD20 ciljnih antigena kod ovih su miševa upoređeni sa nivoima normalnih ljudskih donora i utvrđeno je da se značajno ne razlikuju (slika 60F). Prikazano na slici 59, humanizovani NSG miševi su tretirani sa 3 nedeljne doze CD20 TDB od 0,5 mg/kg. B ćelije su iscrpljene u krvi na D7, a gotovo nijedna B ćelija nije detektovana na D21 (slika 60A). Robusno iscrpljivanje B ćelija je takođe primećeno u slezini miševa tretiranih sa TDB na D21 (slika 60B). Dalje, lečenje humanizovanih NSG miševa sa CD20 TDB stimulisalo je proliferaciju T ćelija i dovelo do iscrpljivanja B ćelija kao što je prikazano na slici 60C. Za CD8+T ćelije, njihov ćelijski broj se povećao do 10-struko u krvi na D7, a vratio se na početnu vrednost ili nižu na D14 i D21 (slika 60D). Sličan trend je uočen i za CD4+T ćelije.
CD20 TDB antitelo je potentno za ubijanje CLL B ćelija in vitro i in vivo Takođe smo testirali potentnost CD20 TDB za ubijanje B ćelija leukemije sa autolognim T ćelijama pacijenata sa CLL, gde je opterećenje B tumorom obično veliko, dok je broj T ćelija mali i funkcija T ćelija može potencijalno biti ugrožena (Riches et al. Semin. Cancer Biol.
20(6): 431-438, 2010). PBMC izolovane iz periferne krvi devet pacijenata sa CLL su inkubirane sa jednom visokom dozom od 1000 ng/ml CD20 TDB do 48 sati. Kao što je prikazano na slici 61A, CD20 TDB je potentan za ubijanje CLL B ćelija sa autolognim T ćelijama. Za 2 prikazana uzorka, opterećenje tumorom B leukemije je 70% sa 8,4% CD8+T ćelija u PBMC za uzorak pacijenta br.1, i 80% sa 4,4% CD8+T ćelija za uzorak pacijenta br.
2. CD20 TDB očito može postići efikasno ubijanje B ćelija sa veoma niskim odnosom efektora prema cilju (1:8 i 1:18 za 2 uzorka prikazana ovde). Ubijanje CLL B ćelija sa autolognim T ćelijama putem CD20 TDB je u tesnoj korelaciji sa brojem CD8+T ćelija (slika 61B). Utvrdili smo da je sadržaj T ćelija značajno varirao (između 0,4 i 8% mononuklearnih ćelija), i iznenađujuće smo uočili da je obim citolize B ćelija u poređenju sa vrednostima pre lečenja bio u tesnoj korelaciji sa brojem T ćelija. Dopunjavanjem prečišćenih CD8+T ćelija u CLL PBMC, gde je dostupno vrlo malo autolognih T ćelija, B ćelije leukemije su efikasno ubijane putem CD20 TDB na način zavisan od T ćelija (slika 61C).
CD20 TDB je takođe potentan za iscrpljivanje ćelija CLL leukemije graftovanih kod miševa (slika 62A). Ukratko, NSG miševima su graftovane ćelije pacijenta sa leukemijom nakon graftovanja autolognih aktiviranih T ćelija dobijenih od pacijenta, i lečenje je započeto nakon potvrđenog uspostavljanja leukemijskog grafta. IHC bojenje reprezentativnih primera mišje slezine je pokazalo uspešno graftovanje B ćelija leukemije i autolognih T ćelija pacijenata sa CLL kod NSG miševa. Nakon jedne doze lečenja sa CD20-TDB od 0,1 ili 0,5 mg/kg, bilo je moguće detektovati veoma malo B ćelija. Iscrpljivanje B ćelija je takođe primećeno kod lečenja rituksimabom, dok iscrpljivanje B ćelija nije otkriveno sa HER2-TDB kao izotipskom kontrolom. (Slika 62B).
U kontekstu razvoja tumora, tretiranje sa CD20 TDB je delotvorno za prevenciju rasta tumora B-ćelijskog limfoma u prisustvu PBMC ljudskog donora. SCID (teška kombinovana imunodeficijencija) miševi kojima su transplantirane humane Bjab ćelije razvili su detektabilne tumore kada su lečeni vehikulumom ili samo sa CD20 TDB do 12. dana nakon inokulacije. Dalje, transplantacija samo PBMC je odložila rast tumora, ali ovi miševi su razvili detektabilne tumore do 25. dana nakon inokulacije. Dakle, CD20 TDB je takođe delotvoran za sprečavanje rasta tumora in vivo u prisustvu PBMC efektorskih ćelija (slika 63).
Potentnost CD20 TDB zahteva veoma nizak nivo ekspresije CD20
Pored različitih zahteva vezanih za Fc region antitela za aktivnost CD20 TDB u poređenju sa konvencionalnim anti-CD20, i eventualno različitu zavisnost od mikrookruženja tumora, čini se da CD20 TDB takođe zahteva niži nivo ekspresije antigena za efikasno ubijanje B ćelija. Za Bjab ćelije, koje imaju visok nivo ekspresije CD20 (slika 64A), uporedivo ubijanje ćelija je postignuto sa rituksimabom i CD20 TDB (slika 64B). Međutim, Nalm-6, SC-1 i OCI-Ly19 ćelije sa znatno smanjenim nivoom ekspresije CD20 (slika 64A) ubijane su samo putem CD20 TDB, dok sa rituksimabom nije detektovano ubijanje ćelija (slika 64C). Procenjeni broj kopija CD20 za ove ćelijske linije sa niskom ekspresijom CD20 je manji od 500, na osnovu podataka o vezivanju iz Skačardove i FACS analize u poređenju sa BJAB ćelijama (podaci nisu prikazani). Pored toga, afinitet jednovalentnog vezivanja CD20-TDB za CD20 je ~50-100 nM,
12
što je značajno manje od 1-5 nM afiniteta rituksimaba (oba izmerena Skačardovom analizom). Sve u svemu, potentnost CD20-TDB je u skladu sa idejom da aktiviranje TCR zahteva samo malu zauzetost receptora od 10-100 molekula (Purbhoo, M.A., et al. Nat Immunol 5:524-530, 2004; Irvine, D.J.,et al. Nature 419:845-849, 2002; Sykulev, Y., et al. Immunity 4:565-571, 1996).
CD20 TDB je aktivan u prisustvu rituksimaba i steroida
Pošto se rituksimab i njegova kombinacija sa hemoterapijom naširoko koriste u kliničkom lečenju B ćelijskih maligniteta, važno je istražiti kako CD20 TDB može da se koristi u ovom kontekstu, pošto CD20 TDB i rituksimab ciljaju isti antigen. Iskoristili smo rituksimab-DANA, varijantu rituksimaba bez efektora (rituksimab koji obuhvata supstitucije ostataka 265 i 297 u alanin (DANA mutacije opisane u US patentu br.7,332,581 i 8,219,149)), koja se vezuje samo za CD20 bez aktivnosti ubijanja B ćelija, kao što je testirano na humanim CD20/CD3 dvostruko transgenim miševima (slika 64D). Prethodno tretiranje B ćelijskih ciljnih ćelija normalnog donora ovim inertnim molekulom rituksimaba koji se sa CD20-TDB takmiči za vezivanje imalo je izuzetno minimalno dejstvo na otupljivanje aktivnosti CD20-TDB. Pri koncentraciji do 250 µg/ml rituksimab-DANA (5000-struki višak u odnosu na dozni nivo EC50 od 42 ng/ml), primetili smo samo mali pomak krivih odgovora na dozu in vitro (manje od 7-strukog pomaka EC50, 42 u odnosu na 320 ng/ml). CD20 TDB je iznenađujuće i dalje aktivan u ovim okolnostima. Iako je EC50 za CD20-TDB povećan do ~7 puta sa većom koncentracijom rituksimab-DANA, obim ubijanja B ćelija nije značajno promenjen (slika 65A). Ovo je u skladu sa našim prethodnim otkrićem da je za potentnost CD20 TDB potreban veoma nizak nivo ekspresije antigena ili veoma mala zauzetost receptora. In vitro zapažanja su rekapitulirana in vivo kod CD3/CD20 dvostruko transgenih miševa koji su prethodno tretirani sa 2 ili 10 mg/kg proteina rituksimab-DANA i naknadno izazvani sa CD20-TDB. Ovde pokazujemo in vivo da je CD20 TDB i dalje aktivan u iscrpljivanju B ćelija kod miševa koji su prethodno tretirani sa rituksimab-DANA (slika 66). Ovi rezultati ukazuju na veliku raznovrsnost za potencijalne kombinovane terapije za B ćelijske malignitete.
CD20 TDB je antitelo koje regrutuje T ćelije, i njegova potentnost zavisi od aktiviranja T ćelija. Takođe je istraženo da li bi prethodno tretiranje steroidima, koji bi potencijalno mogli da utiču na imunski odgovor T-ćelija, uticalo na aktivnost CD20 TDB. In vitro CD20 TDB je i dalje bio aktivan u ubijanju B ćelija u prisustvu visoke koncentracije deksametazona (slika 65B).
Pretklinička validacija CD20 TDB kao potencijalne terapije za CD20+B ćelijske malignitete kod majmuna cinomolgus
12
Pilot PKPD studija za CD20 TDB je takođe sprovedena na majmunima cinomolgus. U studiji sa jednom dozom, gde su 3 životinje jednom intravenski tretirane sa 1 mg/kg CD20 TDB, potpuno iscrpljivanje B ćelija je uočeno u krvi (slika 67A), kao i u slezini i limfnim čvorovima (slike 67B i 67C), 7 dana nakon tretmana antitelom. Istorijske kontrole vehikulumom su prikazane kao srednja vrednost i standardna devijacija za 4 životinje tretirane vehikulumom (slika 67D). Nije primećen očigledan gubitak T-ćelija, jer su i CD8+ T-ćelije i CD4+ T-ćelije bile na uporedivom ili višem nivou od kontrola, kada se izračunaju kao % limfocita. Aktivacija T ćelija je detektovana u krvi 4 sata nakon doziranja. Nije primećen gubitak T ćelija, a očito veći broj CD8+T ćelija je detektovan u krvi 7 dana nakon lečenja (slika 67A).
Dugoročno dejstvo lečenja sa CD20 TDB na imunske ćelije je takođe testirano u 4-nedeljnoj studiji sa ponovljenim dozama, nakon čega je usledio 8-nedeljni period oporavka. Izmeren je i postavljen broj B i T ćelija u krvi 4 životinje tretirane nedeljnom dozom od 1 mg/kg, kao i koncentracija CD20 TDB u serumu za svaku pojedinačnu životinju tokom 77 dana (slika 68A). Kod sve 4 životinje, B ćelije nisu detektovane u krvi ubrzo nakon tretmana i nisu se vratile sve dok je koncentracija CD20 TDB u serumu bila iznad 100 ng/ml (životinja 4502 u odnosu na životinje 4001, 4002 i 4503). Broj CD8+T ćelija, kao i broj CD4+T ćelija u manjoj meri, značajno se povećao nakon prve doze, i postepeno se vratio u okvir od 25-150% od početnih vrednosti. Sve u svemu, CD20 TDB je veoma aktivan u iscrpljivanju B ćelija, bez ugrožavanja T ćelija.
PK svojstvo CD20 TDB je takođe sumirano na slici 68B, sa koncentracijom CD20 TDB u serumu izmerenom u obe studije. Kao što je prikazano za studiju sa ponovljenim dozama, CD20 TDB je održavao dobru izloženost tokom celog perioda, sa CL od oko 17 ml/dan/kg tokom prve doze (D0-D7). Čini se da je klirens posredovan ciljem veći tokom prve doze (D0-D7), jer se vrednost CL smanjila na oko 6 ml/dan/kg tokom četvrte doze (D21-28).
Kombinacija CD20 TDB sa PD-L1 antagonistom na modelu singenog tumora Takođe je testirana in vivo efikasnost CD20 TDB u kombinaciji sa antagonistom PD-L1 (anti-PD-L1 antitelo mišjeg izotipa IgG2a, 25A1, sa DANA mutacijama) na modelu singenog tumora. U ovoj studiji, ćelije mišjeg B limfoma A20-huCD20 koje eksprimiraju humani CD20 i mišji PD-L1 na svojoj ćelijskoj površini korišćene su za generisanje modela singenog tumora (vidite, npr. sliku 69A). CD20 TDB koji je korišćen bio je 2H7v16/2C11 TDB mišjeg IgG2a izotipa proizveden u formatu „dugme u rupici“ (knob-in-hole, K&H) (vidite, npr. Atwell et al., J Mol Biol., 270:26-35, 1997), pri čemu je krak „dugmeta“ anti-CD202H7v16, a krak „rupice“ je anti-CD3 2C11 (Leo et al., Proc Natl Acad Sci USA, 84:1374-8, 1987).
12
Korišćeni antagonist PD-L1 je bio anti-PD-L1 antitelo mišjeg IgG2a izotipa sa DANA Fc mutacijama (supstitucija ostataka 265 i 297 alaninom; videti, npr. US patent br. 7,332,581 i 8,219,149).
-7. dana, 65 Balb/C miševa je inokulisano supkutano u desnu unilateralnu torakalnu oblast sa 2,5 miliona A20pRK-CD20-GFP ćelija u HBSS-u u zapremini od 100 µl (ne sme da pređe 200 µl). Miševi su ostavljeni da razviju tumore. Miševima je zatim izmerena težina i mereni su 1-2 puta nedeljno dok tumori nisu postigli prosečnu zapreminu tumora od približno 100-200 mm<3>(približno 7 dana nakon inokulacije). Životinje su zatim podeljene u sledeće četiri terapijske grupe: grupa 1: 2,5 miliona A20/CD20, vehikulum, qwx3, i.v., n=9; grupa 2: 2,5 miliona A20/CD20, anti-CD20xCD3 TDB formata „dugme u rupici“ (2H7v16-2C11 mišji IgG2), 0,5 mg/kg, qwx3, i.v., n=9; grupa 3: 2,5 miliona A20/CD20, aPDL1 (25A1, mlgG2a DANA), 10 mg/kg, tiwx3, i.p., n=9; i grupa 4: 2,5 miliona A20/CD20, aPDL1 (25A1, mlgG2a DANA), 10 mg/kg, tiwx3, i.p. anti-CD20xCD3 TDB formata „dugme u rupici“ (2H7-2C11 mišji IgG2), 0,5 mg/kg, qwx3, i.v., n=9. Miševi koji zbog različite zapremine tumora nisu regrutovani u jednu od gore navedenih terapijskih grupa su eutanazirani. Lečenje je počelo 0. dana, i svako doziranje antitela je obavljeno intravenski u zapremini od 100 ml kao što je gore opisano.
Tumori su mereni 1–2 puta nedeljno. Telesna težina je merena dva puta nedeljno do 7 dana nakon poslednjeg tretmana. Ako nije uočen gubitak težine, težina više nije merena. Ako je uočeno da je gubitak težine >15%, ugroženi miševi su mereni svakodnevno i eutanazirani ako je gubitak težine bio 20% ili veći. Tokom cele studije, kliničko posmatranje je vršeno dva puta nedeljno kako bi se pratilo zdravlje životinja, i eutanazirane su sve životinje sa tumorom koji je imao veličinu ili stanje koje može da ometa zdravlje ili aktivnost životinje.
Kao što je prikazano na slici 69B, kombinovano lečenje sa CD20 TDB zajedno sa anti-PD-L1 antitelom (grupa 4) pokazalo je neočekivano i sinergijsko dejstvo u inhibiranju rasta tumora u poređenju sa lečenjem samo sa CD20 TDB, anti-PD-L1 antitelom ili vehikulumom.
Kombinacija CD20 TDB sa PD-1 antagonistom na modelu singenog tumora Pored toga, in vivo efikasnost CD20 TDB u kombinaciji sa antagonistom PD-1 (anti-PD1 antitelo mišjeg IgG2 izotipa, 8F11, sa DANA mutacijama) takođe je testirana na A20/huCD20 singenom modelu B limfoma miša. U ovoj studiji, CD20 TDB koji je korišćen bio je 2H7v16/2C11 TDB mišjeg IgG2a izotipa, a antagonist PD-1 koji je korišćen je bio anti-PD-1 antitelo mišjeg IgG2 izotipa sa DANA Fc mutacijama.
A20 ćelije mišjeg B limfoma su transficirane da eksprimiraju humani CD20 i GFP, a zatim su pojedinačne ćelije sortirane za selekciju klonova i ekspanziju za implantaciju. Ženke
12
Balb/c miševa (Charles River; Hollister, CA) stare 8-10 nedelja inokulisane su supkutano u desnom unilateralnom torakalnom regionu sa 2,5 miliona A20.hCD20-GFP ćelija. Kada su tumori dostigli prosečnu zapreminu tumora od 100-200 mm<3>, miševi su regrutovani i randomizovani u jednu od četiri terapijske grupe (n=9 miševa/grupi) i lečenje antitelima je počelo sledećeg dana 1: grupa 1 (2,5 miliona A20/CD20, vehikulum, qwx3, i.v.); grupa 2 (2,5 miliona A20/CD20, anti-CD20xCD3 TDB formata „dugme u rupici“ (2H7v16-2C11 mišji IgG2), 0,5 mg/kg, qwx3, i.v.); grupa 3 (2,5 miliona A20/CD20, anti-PD1 (8F11, mlgG2a DANA), 10 mg/kg, tiwx3, i.p.); i grupa 4 (2,5 miliona A20/CD20, anti-PD1 (8F11, mlgG2a DANA), 10 mg/kg, tiwx3, IP anti-CD20xCD3 TDB formata „dugme u rupici“ (2H7v16-2C11 mišji IgG2), 0,5 mg/kg, qwx3, i.v.).
Miševi su tretirani vehikulumom ili sa 0,5 mg/kg CD20 TDB nedeljno i.v. tokom 3 nedelje, i/ili sa 10 mg/kg anti-PD-1 antitela i.v. za prvu dozu, nakon čega je usledilo i.p. doziranje 3 puta nedeljno tokom 3 nedelje. (N=9 miševa/grupi)
Kao što je prikazano na slikama 108A 108B, kombinovano lečenje sa CD20 TDB zajedno sa anti-PD-1 antitelom (grupa 4) pokazalo je neočekivano i sinergijsko dejstvo u inhibiranju rasta tumora u poređenju sa lečenjem samo sa CD20 TDB, anti-PD-1 antitelom ili vehikulumom.
Primer 4. Generisanje i karakterizacija primera za CD3/FcRH5 TDB (FcRH5 TDB)
Takođe smo ispitali sposobnost TDB antitela da regrutuju citotoksičnu aktivnost T ćelija za iskorenjivanje tumorskih ćelija putem prepoznavanja drugog ćelijskog površinskog antigena, FcRH5. U tu svrhu smo generisali i okarakterisali bispecifična anti-CD3 antitela koja imaju anti-CD3 krak i anti-FcRH5 krak (FcRH5 TDB). Kao što je prethodno opisano, FcRH5 TDB antitela su proizvedena kao antitela pune dužine u formatu „dugme u rupici” kao humani IgG1, prema prethodnom opisu (Atwell et al. J. Mol. Biol.270: 26-35, 1997). Polovina antitela je eksprimirana u ćelijama E. coli, prečišćena afinitetnom hromatografijom sa proteinom A, a odgovarajuća polovina parova antitela je komplementarno vezana in vitro, prema prethodnom opisu (Spiess et al. Nat. Biotechnol. 2013). Nakon komplementarnog vezivanja, FcRH5 TDB antitela su prečišćena hromatografijom sa hidrofobnom interakcijom (HIC) i okarakterisana analitičkom gel filtracijom, masenom spektrometrijom i poliakrilamidnom gel elektroforezom, kao što je prethodno opisano. Anti-FcRH5 krak koji se koristi za generisanje FcRH5 TDB je bio krak anti-FcRH5 antitela 1G7, koji obuhvata (a) VH domen koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 268 i (b) VL domen koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 269. Anti-CD3 krakovi koji su testirani prilikom stvaranja FcRH5 TDB uključivali su
12
UCHT1v9, 40G5c i 38E4v1.
Specifična FcRH5 TDB antitela su testirana na vezivanje za CD8+ T ćelije (vezivanje za CD3), kao i na aktivnost, što je procenjeno in vitro testovima citotoksičnosti i testovima aktivacije T ćelija.
A. Afinitet vezivanja
Afinitet vezivanja za svako od FcRH5 TDB antitela je testiran putem FACS analize, kao što je prethodno opisano za CD20 TDB. Ukratko, za FACS testove vezivanja, CD8+ T ćelije su inkubirane sa različitim koncentracijama FcRH5 TDB antitela na 4 °C u trajanju od 30 minuta, zatim su ćelije isprane i inkubirane sa drugim antitelom (anti-huIgG-PE; BD Bioscience) dodatnih 15 minuta, pa su ćelije ponovo isprane i pripremljene za FACS analizu. Na slici 70 su prikazani rezultati in vitro FACS testova vezivanja FcRH5 TDB. Rezultati pokazuju da određena kombinacija anti-CD3 kraka antitela, 38E4v1, u paru sa anti-FcRH5 krakom, 1G7, daje FcRH5 antitelo sa većim afinitetom vezivanja za efektorske ćelije.
8. In vitro ubijanje MOLP-2 ciljnih ćelija i testovi aktivacije T-ćelija
Za generisana FcRH5 TDB antitela takođe je ispitana njihova sposobnost da podrže ubijanje MOLP-2 ciljnih ćelija koje eksprimiraju FcRH5 i aktivaciju citotoksičnog dejstva T-ćelija. In vitro citotoksičnost je praćena protočnom citometrijom. Ciljne ćelije su obeležene sa CFSE prema protokolu proizvođača (Invitrogen, br. C34554). Ciljne ćelije označene karboksifluorescein sukcinimidil estrom (CFSE) i prečišćene CD8+ T ćelije iz humanih PBMC su pomešane u odnosu 3:1, sa TDB ili bez njih tokom 48 sati. Ćelije su ponovo suspendovane u jednakoj zapremini PBS 2% FBS 1 mM EDTA propidijum jod (PI). Analiza protočnom citometrijom je urađena na instrumentu FACSCalibur u automatizovanom formatu. Broj živih ciljnih ćelija izračunat je izdvajanjem na CFSE+/Pi negativne ćelije. Procenat citotoksičnosti je izračunat na sledeći način: % citotoksičnosti (broj živih ciljnih ćelija bez TDB - broj živih ciljnih ćelija sa TDB) / (broj živih ciljnih ćelija bez TDB) × 100. Kao što je prikazano na slikama 71A i 71B, FcRH5 TDB antitelo koje ima UCHT1v9 ili 38E4v1 kao anti-CD3 krak pokazalo je robusno in vitro ubijanje MOLP-2 ciljnih ćelija u poređenju sa FcRH5 TDB koji ima 40G5c kao anti-CD3 krak.
Kada se testiraju u testovima aktivacije T ćelija, slike 72A-72D pokazuju da su FcRH5 TDB antitela koja imaju UCHT1v9 ili 38E4v1 kao anti-CD3 krak sposobna da snažno indukuju aktivnost T ćelija in vitro, u poređenju sa FcRH5 TDB antitelom koje ima 40G5c kao anti-CD3 krak. U ovim testovima, ciljne ćelije i prečišćene CD8+ T ćelije su pomešane u prisustvu ili odsustvu TDB i aktivacija T ćelija je analizirana protočnom citometrijom. Na kraju inkubacije, ćelije su obojene sa CD8-FITC (BD Bioscience, 555634) CD69-PE (BD Bioscience, 555531)
1
i CD107a-Alexa-Fluor647 (eBioscience, 51-1079). Alternativno, nakon površinskog bojenja sa CD8-FITC i CD69-PE, ćelije su fiksirane i permeabilizovane rastvorom Cytofix/CytoPerm (BD Bioscience, 554722) i intracelularno obojene anti-granzimom B-Alexa-Fluor647 (BD Bioscience, 560212). Aktivacija T ćelija je procenjena na osnovu procenta CD8+CD69+, CD8+CD107a+ i CD8+CD69+granzimB+ ćelija.
Primer 5. Generisanje i karakterizacija primera za CD3/HER2 TDB (HER2 TDB) Takođe smo ispitali sposobnost TDB antitela da regrutuju citotoksičnu aktivnost T ćelija za iskorenjivanje tumorskih ćelija putem prepoznavanja drugog ćelijskog površinskog antigena, HER2. U tu svrhu smo generisali i okarakterisali bispecifična anti-CD3 antitela koja imaju anti-CD3 krak i anti-HER2 krak (HER2 TDB). Kao što je prethodno opisano, HER2 TDB antitela su proizvedena kao antitela pune dužine u formatu „dugme u rupici” kao humani IgG1, prema prethodnom opisu (Atwell et al. J. Mol. Biol.270: 26-35, 1997). Polovina antitela je eksprimirana u ćelijama E. coli ili ćelijama jajnika kineskog hrčka (CHO), prečišćena afinitetnom hromatografijom sa proteinom A, a odgovarajuća polovina parova antitela je komplementarno vezana in vitro, prema prethodnom opisu (Spiess et al. Nat. Biotechnol.2013). Ako je proizvodnja TDB antitela izvedena u CHO ćelijama, antitelo sadrži mutaciju aglikozilacije, na primer, na ostatku N297 (npr. N297G), tako da je TDB antitelo varijanta bez efektora i nije u stanju da inicira ćelijsku citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC). Nakon komplementarnog vezivanja, HER2 TDB antitela su prečišćena hromatografijom sa hidrofobnom interakcijom (HIC) i okarakterisana analitičkom gel filtracijom, masenom spektrometrijom i poliakrilamidnom gel elektroforezom, kao što je prethodno opisano. Jedan anti-HER2 krak koji se koristi za generisanje HER2 TDB je bio krak anti-HER2 antitela hu4D5, koji obuhvata (a) VH domen koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 270 i (b) VL domen koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 271. Dodatna HER2 TDB antitela su generisana za ciljanje različitih regiona ekstracelularnog domena (ECD) HER2. Anti-HER2 antitelo, 2C4, korišćeno je kao anti-Her2 krak koji obuhvata (a) VH domen koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 593 i (b) VL domen koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 594. Još jedno anti-HER2 antitelo koje se koristi kao anti-HER2 krak bilo je anti-HER2 antitelo, 7C2, koje obuhvata (a) VH domen koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 595 i (b) VL domen koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 596. Ostali anti-HER2 kraci koji se koriste u generisanju HER2 TDB antitela uključivali su afinitetne varijante hu4D5, hu4D5.91A i hu4D5.Y100A (opisano u US 7,435,797).
Specifična HER2 TDB antitela su testirana na vezivanje za CD8+ T ćelije (vezivanje za
1 1
CD3) i SKBR3 ćelije (vezivanje za Her2), kao i na aktivnost, što je procenjeno in vitro testovima citotoksičnosti i testovima aktivacije T ćelija.
A. Afinitet vezivanja
Afinitet vezivanja za svako od HER2 TDB antitela je testiran putem FACS analize, kao što je prethodno opisano za CD20 TDB. Ukratko, za FACS testove vezivanja, Jurkatove ćelije (za CD3 antigen), humane CD8+ ćelije (za CD3 antigen) ili SKBR3 (za Her2 antigen) inkubirane su sa sa različitim koncentracijama HER2 TDB antitela na 4 °C u trajanju od 30 minuta, zatim su ćelije isprane i inkubirane sa drugim antitelom (anti-hulgG-PE, BD Bioscience; ili anti-hulgG-AlexaFluor647, Southern Biotech) dodatnih 15 minuta, pa su ćelije ponovo isprane i pripremljene za FACS analizu. Geometrijska sredina fluorescencije je očitana protočnom citometrijom. Na slikama 73, 76A, 78A-78C, 79A i 80A-80B prikazani su rezultati in vitro FACS testova vezivanja HER2 TDB. Više krakova HER2 koji se vezuju za različite regione HER2 testirano je u kombinaciji sa više krakova CD3 koji se vezuju za različite regione CD3ε kako bi se okarakterisala svojstva vezivanja svake kombinacije. Slika 76A daje kristalnu strukturu HER2 ECD i CD3ε i naglašava regione za koje se različiti kraci HER2 i CD3 vezuju. Hu4D5 HER2 antitelo je poznato kao trastuzumab i vezuje se za epitop u domenu IV HER2 koji je proteinski region najbliži ćelijskoj membrani. Rekombinantno humanizovano monoklonsko antitelo 2C4 (rhuMAb 2C4) takođe je poznato kao pertuzumab koji se vezuje za epitop u domenu II HER2 koji je 50 angstrema udaljen od mesta vezivanja hu4D5. Pertuzumab (PERJETA<®>, Genentech, Inc, South San Francisco) prvi je u novoj klasi agenasa poznatih kao inhibitori HER dimerizacije (HDI) i funkcija mu je da inhibira sposobnost HER2 da formira aktivne heterodimere ili homodimere sa drugim HER receptorima (kao što su EGFR/HER1, HER2, HER3 i HER4) (Harari i Yarden. Oncogene 19:6102-6114, 2000; Yarden i Sliwkowski. Nat. Rev. Mol. Cell Biol.2:127-137, 2001; Sliwkowski. Nat. Struct. Biol. 10:158-159, 2003; Cho et al. Nature 421:756-60, 2003; i Malik et al. Pro. Am. Soc. Cancer Res.44:176-177, 2003). Anti-HER2 mišje antitelo 7C2 se vezuje za epitop u domenu I HER2 (PCT publikacija br. WO 98/17797) koji je 100 angstrema udaljen od HER2 regiona koji vezuje hu4D5 (slika 76A).
Pored toga, afinitet vezivanja HER2 TDB je testiran sa više anti-CD3 krakova. Jedan od datih anti-HER2 krakova je kombinovan sa kracima koji ciljaju humani CD3 visokog afiniteta kao što je SP34 i 38E4v1. Druge kombinacije HER2 TDB su uključivale krakove koji ciljaju humani CD3 niskog afiniteta 40G5c ili krak koji cilja mišji CD32C11. UCHT1v9 za anti-CD3 krak i hu4D5 za anti-HER2 krak, u daljem tekstu HER2 TDB (UCHT1v9/hu4D5) ili HER2 TDB, upoređeni su sa anti-HER2 antitelom, trastuzumabom, i fragmentima trastuzumab-Fab u kompetitivnom Skačardovom testu (Ramirez-Carrozzi et al. Nature
1 2
Immunology. 12: 1159-1166, 2011). U ovom testu, vezivanje za SKBR-3 je određeno kompetitivnim vezivanjem<125>I-trastuzumab Fab sa trastuzumabom, trastuzumab-Fab ili bispecifičnim HER2 TDB. Na slici 74A prikazani su rezultati in vitro kompetitivnog Skačardovog testa HER2 TDB.
8. In vitro ubijanje SKBR3 i MCF7 ciljnih ćelija i testovi aktivacije T-ćelija Kombinacije HER2 TDB jednog od tri anti-HER2 kraka (hu4D5, 2C4 i 7C2) sa anti-CD3 krakom 38E4v1 visokog afiniteta ili 40G5c niskog afiniteta testirane su in vitro na sposobnost da posreduju u ubijanju ciljnih ćelija SKBR3 ili MCF7 ćelija koje eksprimiraju HER2 (slika 77). Na osnovu EC50 vrednosti, pokazalo se da je in vitro aktivnost hu4D5 TDB antitela sa bilo kojim anti-CD3 krakom efikasnija nego 2C4 i 7C2 TDB antitela u posredovanju maksimalnog ubijanja SKBR3 i MCF7 ćelija (slika 78). Ova aktivnost ubijanja je takođe zavisila od CD3 kraka koji se koristi. Kombinacija anti-CD3 kraka 38E4v1 sa bilo kojim od anti-HER2 hu4D5, 2C4 ili 7C2 krakova bila je efikasnija od kombinacija 40G5c HER2 TDB (slika 79). Dalje testiranje 6 kombinacija HER2 TDB otkrilo je da njihova aktivnost ubijanja ciljnih ćelija ne zavisi od nivoa ekspresije HER2 u ciljnim ćelijama. Slika 80 pokazuje da HER2 TDB antitela nisu bila selektivna za ciljne ćelije SKBR3 sa visokom ekspresijom HER2 u odnosu na ciljne ćelije MCF7 sa niskom ekspresijom HER2. Aktivnost HER2 TDB je umesto toga zavisila od afiniteta anti-HER2 kraka prema HER2 (slika 81). TDB antitela sa niskim afinitetom prema HER2 zadržala su aktivnost na MCF7 ćelijama sa niskom ekspresijom HER2 i nisu bila u stanju da selektivno unište SKBR3 ćelije sa povišenim nivoom HER2 (slika 82).
HER2 TDB antitela su takođe testirana na specifičnost anti-HER2 kraka za odgovarajuće HER2 epitope. Aktivnost ubijanja hu4D5-40G5c HER2-TDB je bila ograničena u kombinaciji sa rastućim koncentracijama trastuzumaba (hu4D5). Međutim, na efikasnost trastuzumaba ne utiče kombinacija hu4D5 TDB sa hu4D5 antitelom (slika 83). Nasuprot tome, ubijanje ciljnih ćelija posredovano sa 2C4-40G5c ili 7C2 38E4v1 ili blokirano istovremenom primenom dvovalentnih monospecifičnih antitela pertuzumaba (2C4), odnosno 7C2 (slika 83). Kada su dodatni anti-HER2 kraci testirani u višestrukim testovima afiniteta, svi klonovi koji pokazuju visoku ili srednju aktivnost HER2 TDB takmičili su se sa trastuzumabom ili pertuzumabom (slika 84). Za identifikaciju kandidata za TDB koje treba testirati in vivo, kraci sa visokim (38E4v1, 38E4 i SP34) i niskim (40G5c i 2C11) afinitetom prema CD3 testirani su in vitro sa humanizovanim CD3+ T ćelijama dobijenim od miša u kombinaciji sa hu4D5, 2C4 i 7C2 anti-HER2 kracima (slike 85-86). Na osnovu ovog testa, tri kandidata za TDB su na osnovu aktivnosti ubijanja izabrana za dalju karakterizaciju in vivo: hu4D5-SP34, hu4D5-2C11 i 2C4-38E4. Lečenje životinja koje imaju tumor koji eksprimira HER2 sa hu4D5-2C11 HER2
1
TDB dovelo je do povećanja CD45+ i CD8+ ćelija u tumoru već 4 sata nakon lečenja. Nakon dalje analize, kod tumora tretiranih sa HER2-TDB otkriveno je povećanje IFNγ+ i PD1+ CD8+ T ćelija, kao i povećano prisustvo T regulatornih (Treg) ćelija (slika 87B). Detekcija porasta imunoloških infiltrata u tumorima je takođe bila u korelaciji sa smanjenjem zapremine tumora životinja lečenih sa HER2-TDB u poređenju sa lečenjem vehikulumom kao kontrolom (slika 87A). Na slici 88A, anti-HER2 krak hu4D5 u kombinaciji sa anti-CD3 krakom niskog afiniteta, 2C11, ili anti-CD3 krakom visokog afiniteta, SP34, u oba slučaja dovodi do regresije tumora kod transgenih HER2 miševa. Međutim, ovaj odgovor nije primećen kod anti-HER2 kraka sa nižim afinitetom 2C4 u kombinaciji sa anti-CD3 krakom sa visokim afinitetom 38E4 (slike 88A-88B).
HER2 TDB antitelo je takođe upoređeno sa dvovalentnim fragmentima trastuzumaba i trastuzumab-Fab na sposobnost da direktno inhibira proliferaciju SKBR3. SKBR3 ciljne ćelije koje eksprimiraju HER2 su stavljene na ploče sa 96 bunarčića sa gustinom 5×10<3>ćelija/bunarčiću i inkubirane preko noći za vezivanje ćelija pre tretmana naznačenim antitelom ili fragmentom antitela. Ćelijska proliferacija/vijabilnost je analizirana nakon 6 dana lečenja putem luminescentnog testa ćelijske vijabilnosti CELLTITERGLO<®>(Promega, Madison, WI). Rezultati ovog testa su prikazani na slici 74B. Pored toga, in vitro test citotoksičnosti je obavljen sa trastuzumabom, trastuzumabom proizvedenim u E. coli i HER2 TDB antitelom kako bi se izmerila njihova sposobnost da indukuju ćelijsku citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC) posredovanu NK ćelijama (Jefferis Trends in Pharmacological sciences.30: 356-362, 2009; Simmons et al. Journal of Immunological Methods. 263: 133-147, 2002). Antitela proizvedena u E. coli nisu glikozilovana, što dovodi do narušenog vezivanja FcγR, što je potrebno za posredovanje ADCC. Test citotoksičnosti je obavljen kao u Junttila et al. (Cancer Research. 70: 4481-4489, 2010) sa kompletom za detekciju citotoksičnosti; LDH (Roche, Mannheim, Nemačka). Ukratko, lizirane ćelije su detektovane oslobađanjem laktat dehidrogenaze (LDH) nakon 4 sata lečenja navedenim antitelom. Rezultati su prikazani na slici 74C.
Za generisana HER2 TDB antitela takođe je ispitana njihova sposobnost da podrže ubijanje SKBR3 ciljnih ćelija koje eksprimiraju HER2 i aktivaciju citotoksičnog dejstva T-ćelija. In vitro citotoksičnost je praćena protočnom citometrijom. Ciljne ćelije su obeležene karboksifluorescein sukcinimidil estrom (CFSE) prema protokolu proizvođača (Invitrogen, br. C34554). Ciljne ćelije označene sa CFSE i prečišćene CD8+ T ćelije iz humanih PBMC su pomešane u određenom odnosu E:T (kao što je naznačeno u legendama slika), sa TDB antitelom ili bez njega tokom 24 sata. Na kraju inkubacije, ćelije su izdignute tripsinom i
1 4
sakupljene sa ploče. Ćelije su ponovo suspendovane u jednakoj zapremini PBS 2% FBS 1 mM EDTA propidijum jod (PI). Analiza protočnom citometrijom je urađena na instrumentu FACSCalibur u automatizovanom formatu. Broj živih ciljnih ćelija izračunat je izdvajanjem na CFSE+/Pi negativne ćelije. Procenat citotoksičnosti je izračunat na sledeći način: % citotoksičnosti (broj živih ciljnih ćelija bez TDB - broj živih ciljnih ćelija sa TDB) / (broj živih ciljnih ćelija bez TDB) × 100. Kao što je prikazano na slici 75, HER2 TDB antitelo je pokazalo robusno in vitro ubijanje ciljnih ćelija SKBR3 u poređenju sa HER2 TDB antitelom koje ima ili hu4D5 afinitetnu varijantu 91A ili Y100A kao anti-HER2 krak (EC50 hu4D5/ UCHT1v9 TDB = 0,1 ng/ml; hu4D5.91A/ UCHT1v9 TDB = 25,5 ng/ml; hu4D5.Y100A/ UCHT1v9 TDB = nije moguće odrediti).
Pored toga, afinitet vezivanja anti-HER2 hu4D5 varijante (0,4 nM) za ekstracelularni domen (ECD) HER2 veći je od HER2 kraka 2C4 (2,0 nM) i 7C2 (1,7 nM), što je prikazano na slici 76B. Nadalje, slika 76C pokazuje da je hu4D5 HER2-TDB potentniji medijator ubijanja ciljnih ćelija MCF7 nego 2C4 HER2-TDB i 7C2 HER2-TDB. Dodatno je analizirana kinetika ubijanja izazvanog sa HER2 TDB. Kao što se može videti na slici 94A, nije otkrivena značajna aktivnost ubijanja nakon 4-12 sati. Robusno ubijanje je otkriveno u roku od 24 sata, a aktivnost ubijanja se vremenom povećavala. Kao što je prikazano na slikama 90A - 90C i 92C, dalje poređenje anti-CD3 kraka hu4D5 HER2-TDB pokazalo je efikasnost različitih klonova u posredovanju ubijanja SKBR3 ćelija koje eksprimiraju HER2. Konkretno, dva HER2 TDB antitela, hu4D5/38E4c i hu4D5/40G5c, iznenađujuće su bila podjednako efikasna ili bolja u posredovanju ubijanja ciljnih ćelija nego HER2 TDB hu4D5/SP34 (slike 90B i 90C).
Kada se testira u testovima aktivacije T ćelija, slika 89 pokazuje da je HER2 TDB antitelo bilo sposobno da robusno indukuje aktivnost T ćelija in vitro, u poređenju sa HER2 TDB antitelom koje ima hu4D5 afinitetnu varijantu 91A ili Y100A kao anti-HER2 krak. Tri anti-CD3 kraka (SP34, 38E4c i 40G5c) testiranog hu4D5 HER2-TDB pokazala su različite afinitete vezivanja za CD3 antigen na humanim CD8+ T ćelijama, kao što je prikazano na slici 91A. Ipak, sva tri HER2-TDB antitela su bila u stanju da posreduju aktivaciju CD8+ T-ćelija (slika 91 B). Dodatna analiza sposobnosti 38E4 i 38E4c anti-CD3 kraka hu4D5 HER2-TDB antitela da posreduju aktivaciju CD8+ T ćelija prikazana je na slici 92D. Dalje je analizirana kinetika aktivacije T ćelija izazvane sa HER2 TDB. Rani znaci aktivacije T ćelija (CD69) pojavili su se 4 h nakon početka lečenja sa HER2 TDB. Međutim, markeri kasne aktivacije (ekstracelularni CD107a) detektovani su kasnije, u terminu 24 sata (slika 94A). Pored toga, aktivacija T ćelija nije detektovana nakon 48 sati kada su CD8+ ćelije inkubirane sa HER2 TDB ili ciljnim ćelijama koje ne eksprimiraju humani HER2 (BJAB ćelije). Robusna aktivacija
1
T ćelija je uočena kada su HER2+ SKBR3 ćelije korišćene kao cilj, što je praćeno oslobađanjem citotoksičnih granula (slika 93A).
Takođe smo testirali sposobnost HER2 TDB antitela da izazove ubijanje ciljnih ćelija BT474 i aktiviranje T ćelija za sledećih pet odnosa efektorskih CD8+ T ćelija prema ciljnim ćelijama: 1:5, 1:2, 1:1, 3:1 i 5:1. Ovaj eksperiment otkriva da je citotoksičnost izmerena oslobađanjem LDH značajno smanjena titracijom efektorskih ćelija; međutim, čak i sa odnosom E:T ≤1:1, detektovan je slab signal LDH i robusna aktivacija T ćelija (slika 94B).
U ovim testovima, ciljne ćelije i prečišćene CD8+ T ćelije su pomešane u prisustvu ili odsustvu TDB i aktivacija T ćelija je analizirana protočnom citometrijom. Na kraju inkubacije, ćelije su obojene sa CD8-FITC (BD Bioscience, 555634) CD69-PE (BD Bioscience, 555531) i CD107a-Alexa-Fluor647 (eBioscience, 51-1079). Ćelije su opciono obojene sa CD8-FITC i CD69-PE, gde je aktivacija T ćelija procenjena putem procenta CD8+CD69+ u CD8+ ćelijama. Alternativno, nakon površinskog bojenja sa CD8-FITC i CD69-PE, ćelije su fiksirane i permeabilizovane rastvorom Cytofix/CytoPerm (BD Bioscience, 554722) i intracelularno obojene anti-granzimom B-Alexa-Fluor647 (BD Bioscience, 560212). Aktivacija T ćelije je putem procenta CD8+CD107a+ ćelija.
Još jedan mereni pokazatelj citotoksičnosti posredovane T ćelijama za HER2 TDB antitelo (UCHT1v9/hu4D5) je test egzocitoze granula. Na slici 93B prikazani su rezultati za rastvorljivi perforin (Cell Sciences), granzim A i granzim B (eBioscience) detektovane u medijumu za rast ELISA testom prema protokolu proizvođača. U ovom testu korišćeno je kontrolno TDB antitelo (10 ng/ml) koje deli isti CD3 krak sa HER2 TDB antitelom, ali ima irelevantan ciljni krak, ili HER2 TDB (10 ng/ml). Antitela su pojedinačno inkubirana tokom 18 sati sa SKBR3 ciljnim ćelijama i efektorskim mononuklearnim ćelijama periferne krvi (PBMC), koje su izdvojene iz krvi zdravih dobrovoljaca koristeći medijum za separaciju limfocita (MP Biomedicals, Solon, OH). In vitro citotoksičnost je izmerena oslobađanjem LDH kao što je gore opisano. Niz apoptotskih testova je obavljen sa HER2 TDB (1 ng/ml), efektorskim PBMC i SKBR3 ciljnim ćelijama. Nakon 24 sata lečenja, egzocitoza granula se podudarala sa značajnim HER2 TDB indukovanim povećanjem aktivnosti kaspaze 3/7 (CASPASE-GLO<®>3/7 test, Promega), apoptoze (Cell Death Detection ELISA<plus>assay, Roche) i citotoksičnosti izmerene oslobađanjem laktat dehidrogenaze (LDH), što je gore opisano (slika 93C).
Sposobnost HER2 TDB antitela da izazove ubijanje HER2 ili vektorski transficiranih 3T3 ćelija izmerena je gorepomenutim testom citotoksičnosti LDH, gde nije otkriveno ubijanje vektorski transficiranih 3T3 ćelija nakon 19 sati; nasuprot tome, HER2 transficirane 3T3 ćelije
1
su veoma efikasno ubijane (slika 93D). Test ubijanja je modifikovan da blokira vezivanje HER2 kraka korišćenjem trastuzumab Fab (1 µg/ml) ili rastvorljivog ekstracelularnog domena HER2 (HER2 ECD) (1 µg/ml) i doveo je do efikasne inhibicije aktivnosti ubijanja nakon 24 sata (slika 93E). Da bi se potvrdila zavisnost ubijanja od T ćelija, CD3+ ćelije su iscrpljene iz PBMC koristeći CD3+ mikroperlice kompanije Miltenyi (br.130-050-101). Slika 93F pokazuje da je iscrpljivanje dovelo do gubitka aktivnosti ubijanja ciljnih ćelija nakon 19 sati, što je procenjeno FACS analizom u prisustvu HER2 TDB.
HER2 TDB antitelo izaziva proliferaciju T ćelija
Da bi se istražilo da li HER2 TDB antitelo indukuje proliferaciju T ćelija, zajedno su uzgajane CD8+ T ćelije, ciljne ćelije (SKBR3) i 0,1 µg/ml HER2 TDB, nakon čega su uzgajane T ćelije u odsustvu ciljnih ćelija i HER2 TDB. Proliferacija T ćelija je izmerena 3. dana putem protočne citometrije kao razblaženje CFSE u CD8+/PI-ćelijama sa ćelijskom deobom. Nakon 3 dana, 75% T ćelija je pulsiralo sa HER2 TDB i ciljne ćelije su prošle ćelijsku deobu kao što je prikazano na slici 95A. Broj T ćelija indukovan pomoću HER2 TDB analiziran je obeležavanjem prečišćenih CD8+ T ćelija pomoću CFSE prema protokolu proizvođača (Invitrogen, br. C34554). CD8+ T ćelije obeležene pomoću CFSE su inkubirane sa ciljnim ćelijama u prisustvu ili odsustvu TDB antitela tokom 19 sati. T ćelije su sakupljene, isprane i uzgajane tokom 2-7 dana (RPMI+10% FBS). Broj živih CD8+ ćelija (CD8+/PI-) i procenat CFSE dim ćelija su detektovani putem FACS. Na slici 95B, broj ćelija se nije povećao. Dalje dopunjavanje medijuma za rast sa IL-2 (20 ng/ml) dalo je signal preživljavanja CD8+ ćelijama, a kod T ćelija je otkrivena robusna proliferacija T ćelija, ali samo ako su bile izložene i HER2 TDB antitelu i ciljnim ćelijama (slika 95C). Važno je da nije otkriven efekat posmatrača na ćelije koje ne eksprimiraju cilj u uslovima u kojima je većina HER2+ ćelija u istoj kulturi ubijena. HER2 TDB indukuje proliferaciju i poliklonsku ekspanziju T ćelija, što može biti kritično za amplifikaciju limfocita koji infiltriraju tumor.
Aktivnost HER2 TDB je u korelaciji sa nivoom ekspresije ciljne ćelije HER2 Da bi se istražio odnos između broja ciljnih kopija i aktivnosti TDB, izabran je panel ćelijskih linija kancera sa unapred određenim brojem HER2-receptora na ćelijskoj membrani (Aguilar et al. Oncogene. 18:6050-62, 1999). Nivoi ekspresije HER2 proteina u HER2 negativnoj ćelijskoj liniji (BJAB LUC), 3 ćelijske linije sa malom ekspresijom HER2 (MDA435, MDA231, MCF7) i 3 ćelijske linije sa povećanom / prekomernom ekspresijom HER2 (MD453, SKBR3, BT474) detektovani su vestern blotom (slika 96A). Ćelijske linije koje su negativne na HER2, imaju nizak nivo ekspresije HER2 ili prekomerno eksprimiraju HER2 inkubirane su sa HER2 TDB antitelom i efektorskim PBMC u odnosu E:T od 25:1 tokom
1
26 sati. Citotoksičnost je tada detektovana pomoću testa oslobađanja LDH. Slika 96B pokazuje da su ćelije sa povećanom / prekomernom ekspresijom HER2 značajno osetljivije na TDB posredovano ubijanje (p=0,015, t-test) i da su efikasno lizirane pri koncentracija u rasponu od femtomolarnih do niskih pikomolarnih (EC50=0,8-3 pM). Ćelijske linije koje eksprimiraju nizak nivo HER2 su bile značajno manje osetljive na HER2 TDB antitelo (EC50=33-51 pM). Već <1000 kopija ciljnog antigena je bilo dovoljno da podrži ubijanje T ćelija.
Za studije sprovedene na slikama 96C-96D, ćelijska linija MCF7 ili ćelijska linija BJAB je zajedno ciljana sa SKBR3 ćelijama u prisustvu HER2 TDB u istom testu ubijanja. U ovom testu, MCF7 ili BJAB ćelije su označene sa CFSE i pomešane sa SKBR3 i PBMC (E:T 20:1), nakon čega je usledio 19-časovni tretman sa HER2 TDB. Ćelije su obojene sa anti-HER2 APC i PI. Na slici 96C je prikazan procenat živih SKBR3 (nivo HER2 visok, PI-) i MCF7 (CFSE+. PI-) ćelija koje su detektovane putem FACS i normalizovane na fluorescentne perlice. Nije detektovano ubijanje MCF7 ćelija pri EC50 za ubijanje SKBR3. Prikazan je procenat živih SKBR3 (nivo HER2 visok, PI-) i BJAB (CFSE PI-) ćelija koje su detektovane putem FACS i normalizovane na fluorescentne perlice. Nije detektovano značajno ubijanje BJAB ćelija pri bilo kojoj koncentraciji HER2 TDB (slika 96D).
Veoma niska zauzetost cilja je dovoljna za aktivnost TDB
Zatim, zauzetost HER2 pri EC50 za HER2 TDB antitelo je izračunata pomoću formule [D]/[D]+KD(gde je D = lek i KDza HER2 TDB je 5,4 nM). Prethodno je prijavljen broj kopija HER2 (Aguilar et al. Oncogene.18: 6050-6062, 1999). EC50 vrednosti su izračunate na osnovu podataka o odgovoru na dozu na slici 97B. Slika 96E pokazuje da je u svim testiranim ćelijskim linijama manje od 1% zauzetosti cilja bilo dovoljno za efikasno ubijanje. U slučaju ćelijskih linija sa velikom ekspresijom HER2, potrebna zauzetost je bila još niža (0,01-0,05%). Izračunati apsolutni broj HER2 TDB antitela vezanih za HER2 pri EC50 je bio čak 10-150 u ćelijskim linijama sa niskom ekspresijom. Ovi rezultati pokazuju ekstremnu potentnost HER2 TDB antitela i u skladu su sa studijama aktivacije TCR, koje sugerišu da je potrebno angažovati samo 1-25 TCR za aktivaciju odgovora T ćelija (Irvine et al. Nature. 419: 845-849, 2002; Purbhoo et al. Nature Immunology. 5: 524-530, 2004; Sykulev et al. Immunity. 4: 565-571, 1996). Potentnost HER2 TDB je bila dosledna u niskom pikomolarnom do femtomolarnom rasponu. Štaviše, već 10-500 TDB vezanih za HER2 bilo je dovoljno da izazove značajnu citotoksičnost in vitro. Samo ~1000 kopija HER2 na membrani plazme je bilo dovoljno da izazove ubijanje. Ove studije su takođe pokazale korelaciju između nivoa ekspresije cilja i in vitro osetljivosti na HER2 TDB.
HER2 TDB antitelo je efikasno za ubijanje HER2+ ćelija kancera refraktornih na
1
anti-HER2 terapije
Zatim su ispitane ćelijske linije za koje se prethodno pokazalo da eksprimiraju visok nivo HER2, ali su neosetljive na direktno ćelijsko dejstvo trastuzumaba i lapatiniba in vitro (Junttila et al., Cancer Cell, 15:429-40, 2009; Junttila et al. Breast Cancer Res Treat, 2010). Za neke ćelijske linije, aktiviranje PI3K puta usled stečenih aktivirajućih mutacija u PI3K katalitičkoj podjedinici (KPL4, HCC202) ili usled gubitka PTEN (HCC1596) može izazvati rezistenciju. Panel od šest ćelijskih linija (5 kancer dojke, 1 kancer pluća) testiran je na oslobađanje LDH kao meru citotoksičnosti u prisustvu efektorskih PBMC u odnosu 10:1 i HER2 TDB tokom 19 sati. EC50 za ubijanje posredovano putem HER2 TDB je bio u femtomolarnom ili niskom pikomolarnom rasponu (slika 97A). Matični i T-DM1 rezistentni BT474-M1 klonovi su tretirani pomoću T-DM1 tokom 3 dana. Tada je vijabilnost ćelija izmerena korišćenjem CELLTITERGLO<®>(slika 97B). Prethodno je prijavljena osetljivost ćelijskih linija na T-DM1 (Junttila et al. Breast Cancer Res Treat. 2010; Lewis Phillips et al. Cancer Research. 68: 9280-9290, 2008). Poređenja radi, matični i T-DM1 rezistentni BT474-M1 klonovi su tretirani HER2 TDB antitelom u prisustvu efektorskih CD8+ T ćelija u odnosu 3:1 tokom 24 sata. Citotoksičnost je detektovana pomoću FACS testa (slika 97C). Pored toga, HER2 TDB antitelo je bilo efikasno za ubijanje HER2+ ćelija kancera pluća. Na osnovu dva nezavisna modela ćelijskih linija KPL4 i BT474, (slika 97B-97C), stečena otpornost na T-DM1 nije uticala na osetljivost na HER2 TDB.
Pokretanje aktivnosti ubijanja T ćelija sa HER2 TDB zavisi od ekspresije HER2, ali je nezavisno od signalnog puta HER2, što ukazuje na to da HER2 TDB antitelo može biti efikasno u lečenju tumora koji su refraktorni na postojeće anti-HER2 terapije. U skladu sa tim, podaci pokazuju jednaku aktivnost u lečenju ćelija koje su višestruko rezistentne na trastuzumab/lapatinib u poređenju sa osetljivim ćelijama. Rezistentnost u ovim ćelijama nastaje različitim mehanizmima koji utiču na put HER2. Podaci koji su ovde dati ukazuju na to da prelazak na alternativni mehanizam delovanja korišćenjem HER2 TDB može u velikoj meri da omogući prevazilaženje rezistencije na konjugate antitela i lekova (npr. T-DM1), ciljane inhibitore malog molekula (npr. lapatinib) i terapeutska monoklonska antitela koja blokiraju signalizaciju puta (npr. trastuzumab).
Farmakokinetika HER2 TDB antitela kod pacova
Pacovi tipa Sprag-Doli su korišćeni za procenu farmakokinetičkog (PK) profila HER2 TDB antitela. Životinje su podeljene u sledeće dve grupe: grupa 1: HER2 TDB (10 mg/kg, jedna i.v. doza, n = 4); grupa 2: trastuzumab (10 mg/kg, jedna i.v. doza, n = 4). Uzorci su uzeti od 4 pacova po grupi u različitim terminima tokom 35 dana nakon doze. Približno 0,2 ml pune
1
krvi je prikupljeno iz jugularne vene (pod anestezijom sa CO2/O2). Uzorci su ostavljeni da se zgrušaju i centrifugirani su uz hlađenje (5 °C tokom 10 minuta na 2000 x g) da bi se dobio serum. Uzorci seruma su testirani na humani IgG ELISA testom, gde je magareći anti-huFc premazan na mikrotitarsku ploču korišćen za hvatanje humanizovanih anti HER2 antitela u krvotoku a kozji anti-huFc-HRP (adsorbovan na mišu) korišćen je za detekciju. PK parametri su određeni metodom sa 2 odeljka (model 7) koristeći WINNONLIN<®>, verzija 5.2.1 (Pharsight Corp., Mountain View, CA). HER2 TDB antitelo ne reaguje unakrsno sa CD3 pacova ili HER2 pacova i pokazuje dvofaznu dispoziciju tipičnu za IgG1 sa kratkom fazom distribucije i sporom fazom eliminacije (slika 98). I klirens i poluživot HER2 TDB antitela bili su slični trastuzumabu i u očekivanom rasponu tipičnog IgG1 kod pacova.
HER2 TDB antitelo inhibira rast tumora in vivo kod imunokompromitovanih miševa
In vivo efikasnost HER2 TDB antitela je testirana na NOD-SCID miševima, koji nemaju endogene funkcionalne T i B ćelije i imaju snižene nivoe NK, DC i makrofagnih tipova ćelija. U ovom eksperimentu, NOD/SCID miševima (NOD.CB17-Prkdcscid/J, Jackson Labs West) implantirani su peleti estrogena od 0,36 mg sa produženim oslobađanjem od 60 dana (Innovative Research of America) 1 do 3 dana pre ćelijske inokulacije, supkutano na suprotnom boku od onog koji je korišćen za inokulaciju tumora. 0. dana, 5×10<6>MCF7-neo/HER2 ćelija je ubrizgano samostalno ili zajedno sa 10×10 nestimulisanih humanih PBMC od jednog od dva zdrava donora (PBMC 1, 2) u HBSS-matrigel u adipoznom jastučetu desne 2/3 dojke. Inokulisani miševi su podeljeni u sledećih pet grupa: grupa 1: vehikulum (TDB kontrola, 0,5 mg/kg, qwk x 3, i.v., počevši od 0. dana, n=5-10); grupa 2: PBMC(1) (PBMC (1) TDB kontrola, 0,5 mg/kg, qwk x 3, i.v., počevši od 0. dana, n=5-10); grupa 3: PBMC (1) HER2 TDB (PBMC (1) HER2 TDB, 0,5 mg/kg, qwk x 3, i.v., počevši od 0. dana, n=5-10); grupa 4: PBMC(2) (PBMC (2) TDB kontrola, 0,5 mg/kg, qwk x 3, i.v., počevši od 0. dana, n=5-10); i grupa 5: PBMC (2) HER2 TDB (PBMC (2) HER2 TDB, 0,5 mg/kg, qwk x 3, i.v., počevši od 0. dana, n=5-10). Prve terapije su primenjene 2 sata nakon inokulacije. Zapremina tumora pojedinačnih miševa i postavljene zapremine tumora terapijskih grupa prikazane su na slici 99A, gde je HER2 TDB antitelo sprečilo rast tumora koji eksprimiraju HER2.
Zavisnost HER2 TDB antitela od humanih PBMC je dalje testirana na sličnom modelu imunokompromitovanog miša. Još jednom, 5×10<6>MCF7-neo/HER2 ćelija je ubrizgano samostalno ili zajedno sa 10×10<6>nestimulisanih humanih PBMC od zdravog donora (PBMC 3) u HBSS-matrigel u adipoznom jastučetu desne 2/3 dojke, a prve terapije su primenjene 2 sata nakon inokulacije. Na slici 100A, inokulisani miševi su podeljeni u sledeće dve grupe:
14
grupa 1: nelečeni (n=7); grupa 2: HER2 TDB (HER2 TDB, 0,5 mg/kg, qwk x 3, i.v., počevši od 0. dana, n=7). Na slici 100B, inokulisani miševi su podeljeni u sledeće tri grupe: grupa 1: nelečeni (n=7); grupa 2: PBMC(3) (PBMC (3) vehikulum, 0,5 mg/kg, qwk x 3, i.v., počevši od 0. dana, n=7); grupa 3: PBMC(3) TDB kontrola (PBMC(3) TDB-2C11 kontrola, 0,5 mg/kg, qwk x 3, i.v., počevši od 0. dana, n=7). Dalja merenja zapremine tumora ne otkrivaju uticaj na rast tumora kod životinja lečenih TDB kontrolom.
HER2 TDB antitelo uzrokuje regresiju velikih tumora dojke kod huHER2 transgenih miševa
Za modeliranje aktivnosti HER2 TDB antitela kod imunokompetentnih miševa korišćeni su humani MMTV-huHER2 transgeni miševi (Finkle et al. Clinical Cancer Research.
10: 2499-2511; 2004), i surogatno HER2 TDB antitelo koje obuhvata mišji IgG2A CD3 reaktivni klon antitela 2C11 (Leo et al. Proc Natl Acad Sci USA. 84: 1374-1378, 1987) generisano je kako bi se izbegao imunski odgovor na TDB. Za ekspresiju kao mulgG2a, ekvivalentne mutacije dugme u rupici (Atwell et al. J Mol Biol.270: 26-35, 1997) uvedene su u Fc region, kao i D265A i N297G (EU numeracija) kako bi se ukinula efektorska funkcija. U mulgG2a HER2 TDB antitelima krak „dugmeta“ je mišji anti-HER2 hu4D5, a „rupica“ je himerni anti-mišji CD32C11 (Leo et al. Proc Natl Acad Sci USA.84: 1374-1378, 1987) (TDB 2C11/hu4D5) ili mišji anti-hu CD3 SP34 (Pessano et al. The EMBO Journal.4: 337-344, 1985) (TDB SP34/hu4D5). MulgG2a bispecifična antitela su eksprimirana u CHO ćelijama i sastavljena in vitro sklapanjem. Bispecifična antitela su prečišćena od kontaminanata hromatografijom sa hidrofobnim interakcijama (HIC) kao što je drugde opisano (Speiss et al. Nat Biotechnology.31: 753-758, 2013). Dobijena supstanca je analizirana na nivoe endotoksina pomoću prenosnog sistema za testiranje ENDOSAFE<®>(Charles River, SAD), a sadržaj endotoksina je, po potrebi, smanjen ispiranjem proteina sa 0,1% TRITON<™>X-114. In vitro aktivnost hu4D5/2C1 1-TDB antitela je bila slična HER2 TDB antitelu reaktivnom na humani CD3 (slika 101).
Na slikama 99B-99D, MMTV-huHER2 transgene životinje sa postojećim tumorom dojke su podeljene u sledeće dve grupe: grupa 1: vehikulum (0,5 mg/kg, qwk x 5, i.v., počevši od 0. dana, n=7); i grupa 2: HER2 TDB (HER2 TDB (2C11/hu4D5), 0,5 mg/kg, qwk x 5, i.v., počevši od 0. dana, n=7). Slika 99B pokazuje da je regresija otkrivena kod 57% miševa i 43% miševa nije imalo detektabilni tumor nakon lečenja. Slika 99C pokazuje da je HER2 TDB antitelo (2C11/hu4D5) dovelo do više od 50% regresije tumora, sa izuzetkom jednog tumora. Ispitanici sa odgovorom su uključivali tumore koji su bili >1000 mm<3>na početku lečenja, kao što je prikazano na slici 99D. U sličnom eksperimentu korišćena su dva kontrolna TDB antitela gde je jedno kontrolno TDB antitelo sa CD3 krakom u kome je krak specifičan za mišji CD3 prebačen u krak specifičan za humani CD3 krak (HER2 TDB (SP34/hu4D5)), a jedno je kontrolno TDB antitelo koje deli isti CD3 krak sa HER2 TDB (2C11/hu4D5), ali ima irelevantni ciljni krak (CTRL TDB-2C11). Na slici 99E, MMTV-huHER2 transgene životinje sa postojećim tumorima dojke su podeljene u sledeće dve grupe: grupa 1: kontrolno TDB antitelo sa CD3 krakom (HER2 TDB (SP34/hu4D5), 0,5 mg/kg, qwk x 5, i.v., počevši od 0. dana, n=5); i grupa 2: kontrolno TDB antitelo (kontrolno TDB-2C11, 0,5 mg/kg, qwk x 5, i.v., počevši od 0. dana, n=5). Kontrolna TDB antitela nisu imala uticaj na rast MMTV-huHER2 transgenih tumora.
HER2 TDB antitelo je dalje testirano na efikasnost in vivo kod huCD3 transgenih miševa. Humani CD3ε transgeni miševi su prethodno opisani ((huCD3 transgenic), de la Hera et al. J Exp Med.173: 7-17, 1991). U ovoj studiji, 0,1 miliona CT26-HER2 ćelija je supkutano ubrizgano u huCD3 transgene miševe. Kada su ustanovljeni CT26-HER2 tumori, životinje su podeljene u sledeće dve grupe: grupa 1: vehikulum (0,5 mg/kg, qwk x 3, i.v., počevši od 0. dana, n=7); grupa 2: HER2 TDB (HER2 TDB (SP34/hu4D5), 0,5 mg/kg, qwk x 3, i.v., počevši od 0. dana, n=7). HER2 TDB antitelo je inhibiralo rast postojećih tumora, ali je dejstvo bilo prolazno i nisu uočeni potpuni odgovori (slika 99F). Studija je pokazala snažnu in vivo aktivnost HER2 TDB antitela, uključujući dramatične odgovore kod MMTV-huHER2 transgenih miševa.
U sličnom eksperimentu, in vivo efikasnost mišjeg reaktivnog HER2 TDB (2C11/hu4D5) testirana je na Balb/c miševima. Ponovo su ustanovljeni singeni tumori kod Balb/c miševa supkutanim ubrizgavanjem 1×10<5>CT26-HER2 ćelija. Životinje sa tumorom su raspoređene u jednu od sledeće četiri grupe: grupa 1: vehikulum (0,5 mg/kg, qwk x 3, i.v., počevši od 0. dana, n=10); grupa 2: HER2 TDB (HER2 TDB (2C11/hu4D5), 0,5 mg/kg, qwk x 3, i.v., počevši od 0. dana, n=10); grupa 3: TDB kontrola (CTRL TDB (2C11/hu4D5), 0,5 mg/kg, qwk x 3, i.v., počevši od 0. dana, n=10); i grupa 4: TDM-1 (TDM-1, 15 mg/kg, qwk x 3, i.v., počevši od 0. dana, n=10). Slika 99G pokazuje da je, uprkos nepotpunim odgovorima, HER2 TDB antitelo značajno produžilo vreme do razvoja tumora (log-rank p-vrednost < 0,0001). Nasuprot tome, kontrolno TDB antitelo sa irelevantnim tumorskim krakom nije imalo uticaja na rast tumora. Pored toga, tumori su bili neosetljivi na TDM-1.
HER2 TDB antitelo inhibira rast ustanovljenih tumora kod imunokompetentnih miševa
Humani CD3ε transgeni miševi (de la Hera et al. J Exp Med.173: 7-17, 1991) korišćeni su za modeliranje aktivnosti HER2 TDB antitela kod imunokompetentnih miševa. U ovom eksperimentu, huCD3 transgene T ćelije su ekstrahovane iz slezine huCD3 transgenih i BALB/c miševa ili iz periferne krvi zdravih ljudskih donora. Ćelije su obojene mišjim ili humanim CD8 i humanim CD3 (klon UCHT1) na slici 101A ili mišjim CD3 (klon 2C11) na slici 101B. CD8+ ćelije su detektovane protočnom citometrijom. Na slici 101A je prikazano da huCD3 transgene T ćelije eksprimiraju humani CD3 na približno 50% nivoa humanih T ćelija, a na slici 101B je prikazano da huCD3 transgene T ćelije eksprimiraju mišji CD3 na približno 50% nivoa BALB/c miševa.
Zatim, huCD3 transgene T ćelije su testirane na sposobnost da unište CT26 ciljne ćelije koje eksprimiraju humani HER2 in vitro. U ovoj studiji, T ćelije su ekstrahovane iz slezine huCD3 transgenih miševa, BALB/c miševa ili iz periferne krvi zdravih ljudskih donora. In vitro aktivnost ubijanja CT26-HER2 ćelija je testirana korišćenjem HER2 TDB specifičnog za humani CD3 (UCHT1v9/hu4D5) na slici 102A ili HER2 TDB specifičnog za mišji CD3 (2C11/hu4D5) na slici 102B. Efektorske T ćelije su dodate u odnosu 20:1 u ciljne ćelije u prisustvu naznačenog HER2 TDB antitela tokom 40 sati. In vitro citotoksičnost je praćena protočnom citometrijom. Iako je aktivnost ubijanja T ćelija slezine miša (EC50 = 2,4 ng/ml) bila konzistentno niža u poređenju sa humanim perifernim T ćelijama (EC50 = 0,4 ng/ml), huCD3 transgene T ćelije su uništile ciljne ćelije koje eksprimiraju humani HER2 in vitro kao što je prikazano na slici 102A. HER2 TDB antitelo specifično za miša (2C11/hu4D5) indukovalo je ubijanje ciljnih ćelija od strane T ćelija huCD3 transgenih (EC50 = 11 ng/ml) i BALB/c (EC50 = 10 ng/ml) miševa kao što je prikazano na slici 102B.
Zavisnost antitumorske aktivnosti HER2 TDB antitela od T ćelija je dalje ispitana na modelu singenog tumora. Kao što je gore opisano, 1×10<5>CT26-HER2 ćelija je supkutano ubrizgano u BALB/c miševe. Miševi sa postojećim tumorom su raspoređeni u jednu od sledeće dve grupe: grupa 1: vehikulum (n=10); grupa 2: HER2 TDB (SP34/hu4D5) (HER2 TDB (SP34/hu4D5), 0,5 mg/kg, qwx3, i.v., n=10). Slika 103 pokazuje da je aktivnost HER2 TDB antitela zavisna od T ćelija, pošto HER2 TDB antitelo nije imalo dejstvo kod ne-huCD3 transgenih miševa. Ova studija je pokazala da huCD3 transgeni miševi mogu da se koriste kao novi model efikasnosti za molekule koji ciljaju huCD3.
Primer 6. Generisanje i karakterizacija primera za CD3/LYPD1 TDB (LYPD1 TDB)
Takođe smo ispitali sposobnost TDB antitela da regrutuju citotoksičnu aktivnost T ćelija za iskorenjivanje tumorskih ćelija putem prepoznavanja drugog ćelijskog površinskog antigena, LYPD1. U tu svrhu smo generisali i okarakterisali bispecifična anti-CD3 antitela koja imaju anti-CD3 krak i anti-LYPD1 krak (LYPD1 TDB). Kao što je prethodno opisano, LYPD1
14
TDB antitela su proizvedena kao antitela pune dužine u formatu „dugme u rupici” kao humani IgG1, prema prethodnom opisu (Atwell et al. J. Mol. Biol.270: 26-35, 1997). Polovina antitela je eksprimirana u ćelijama E. coli ili ćelijama jajnika kineskog hrčka (CHO), prečišćena afinitetnom hromatografijom sa proteinom A, a odgovarajuća polovina parova antitela je komplementarno vezana in vitro, prema prethodnom opisu (Spiess et al. Nat. Biotechnol.2013). Ako je proizvodnja TDB antitela izvedena u CHO ćelijama, antitelo sadrži mutaciju aglikozilacije, na primer, na ostatku N297 (npr. N297G), tako da je TDB antitelo varijanta bez efektora i nije u stanju da inicira ćelijsku citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC). Nakon komplementarnog vezivanja, LYPD1 TDB antitela su prečišćena hromatografijom sa hidrofobnom interakcijom (HIC) i okarakterisana analitičkom gel filtracijom, masenom spektrometrijom i poliakrilamidnom gel elektroforezom, kao što je prethodno opisano. Anti-LYPD1 krak koji se koristi za generisanje LYPD1 TDB je bio krak anti-LYPD1 antitela YWO.49.H6, koji obuhvata (a) VH domen koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 272 i (b) VL domen koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 273. Anti-CD3 krakovi koji su testirani prilikom stvaranja LYPD1 TDB uključivali su UCHT1v9, 40G5, SP34 i 38E4v1.
Specifična HER2 TDB antitela su testirana na vezivanje za CD8+ T ćelije (vezivanje za CD3), kao i na aktivnost, što je procenjeno in vitro testovima citotoksičnosti i testovima aktivacije T ćelija.
A. Afinitet vezivanja
Afinitet vezivanja za svako od LYPD1 TDB antitela je testiran putem FACS analize, kao što je prethodno opisano za CD20 TDB. Ukratko, za FACS testove vezivanja, CD8+ T ćelije su inkubirane sa različitim koncentracijama LYPD1 TDB antitela na 4 °C u trajanju od 30 minuta, zatim su ćelije isprane i inkubirane sa drugim antitelom (anti-huIgG-PE; BD Bioscience) dodatnih 15 minuta, pa su ćelije ponovo isprane i pripremljene za FACS analizu. Na slici 104 su prikazani rezultati in vitro FACS testova vezivanja LYPD1 TDB. Studije vezivanja su pokazale da LYPD1 TDB antitela koja imaju UCHT1v9 ili 38E4v1 kao anti-CD3 krak pokazuju veći afinitet vezivanja za date efektorske ćelije.
8. In vitro ubijanje OVCAR3.Luc ciljnih ćelija i testovi aktivacije T-ćelija
Takođe je ispitana njihova sposobnost generisanih LYPD1 TDB antitela da podrže ubijanje OVCAR3.Luc ciljnih ćelija koje eksprimiraju LYPD1 i aktivaciju citotoksičnog dejstva T-ćelija. In vitro citotoksičnost je praćena protočnom citometrijom. Ciljne ćelije su obeležene sa CFSE prema protokolu proizvođača (Invitrogen, br. C34554). Ciljne ćelije označene karboksifluorescein sukcinimidil estrom (CFSE) i prečišćene CD8+ T ćelije iz humanih PBMC su pomešane u odnosu 3:1, sa TDB ili bez njih tokom 48 sati. Ćelije su ponovo suspendovane u jednakoj zapremini PBS 2% FBS 1 mM EDTA propidijum jod (PI). Analiza protočnom citometrijom je urađena na instrumentu FACSCalibur u automatizovanom formatu. Broj živih ciljnih ćelija izračunat je izdvajanjem na CFSE+/Pi negativne ćelije. Procenat citotoksičnosti je izračunat na sledeći način: % citotoksičnosti (broj živih ciljnih ćelija bez TDB - broj živih ciljnih ćelija sa TDB) / (broj živih ciljnih ćelija bez TDB) × 100. Kao što je prikazano na slici 105, LYPD1 TDB antitela koja imaju UCHT1 v9, 38E4v1 ili SP34 kao anti-CD3 krak pokazala su robusno in vitro ubijanje OVCAR3.Luc ciljnih ćelija u poređenju sa LYPD1 TDB antitelom koje ima 40G5 kao anti-CD3 krak.
Kada se testiraju u testovima aktivacije T ćelija, slika 106 pokazuje da su LYPD1 TDB antitela koja imaju 38E4v1, i, u manjoj meri, UCHT1 v9 i SP34, kao anti-CD3 krak bila sposobna da snažno indukuju aktivnost T ćelija in vitro, u poređenju sa LYPD1 TDB antitelom koje ima 40G5c kao anti-CD3 krak. U ovim testovima, ciljne ćelije i prečišćene CD8+ T ćelije su pomešane u prisustvu ili odsustvu TDB i aktivacija T ćelija je analizirana protočnom citometrijom. Na kraju inkubacije, ćelije su obojene sa CD8-FITC (BD Bioscience, 555634) CD69-PE (BD Bioscience, 555531) i CD107a-Alexa-Fluor647 (eBioscience, 51-1079). Alternativno, nakon površinskog bojenja sa CD8-FITC i CD69-PE, ćelije su fiksirane i permeabilizovane rastvorom Cytofix/CytoPerm (BD Bioscience, 554722) i intracelularno obojene anti-granzimom B-Alexa-Fluor647 (BD Bioscience, 560212). Aktivacija T ćelija je procenjena na osnovu procenta CD8+CD69+ i CD8+CD25+ ćelija.
14
14
14
14
14
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
21
21
21
21
21
21
21
22
22
22
22
22
22
22
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
24
24
24
24
24
24
24
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
1
2
4
1
11
��
�
14
1
1
1
�
1
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
1
2
4
4
41
42
4
44
4
4
4
4
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
4
41
42
4
44
4
4
4
4
4
41
41
41
41
41
41
41
42
42
42
42
42
42
42
4
41
42
4
44
4
4
4
4
4
44
44
44
44
44
44
44
4
41
42
4
44
4
4
4
4
4
4
41
42
4
44
4
4
4
4
4
4
41
42
4
44
4
4
�
�
�
4
41
42
4
44
4
4
4
4
4
4
41
42
4

Claims (32)

PATENTNI ZAHTEVI
1. Bispecifično antitelo koje obuhvata anti-CD3 krak i anti-HER2 krak pri čemu: (a) anti-CD3 krak obuhvata prvi vezujući domen koji obuhvata:
(i) VH domen koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 95% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 184, pri čemu VH domen obuhvata HVR-H1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1, HVR-H2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 2 i HVR-H3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 3, i
(ii) VL domen koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 95% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 185, pri čemu VL domen obuhvata HVR-L1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 4, HVR-L2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 5 i HVR-L3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 6, i
(b) anti-HER2 krak obuhvata drugi vezujući domen koji obuhvata:
(i) VH domen koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 95% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 270, pri čemu VH domen obuhvata HVR-H1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 169, HVR-H2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 170 i HVR-H3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 171, i
(ii) VL domen koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 95% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 271, pri čemu VL domen obuhvata HVR-L1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 172, HVR-L2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 173 i HVR-L3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 174.
2. Bispecifično antitelo prema zahtevu 1, pri čemu se prvi vezujući domen vezuje za CD3 epitop koji obuhvata aminokiselinski ostatak Glu6, opciono pri čemu CD3 epitop dalje obuhvata jedan ili više dodatnih aminokiselinskih ostataka izabranih iz grupe koja se sastoji od Gln1, Asp2 i Met7.
3. Bispecifično antitelo prema zahtevu 2, pri čemu CD3 epitop ne obuhvata aminokiselinski ostatak Glu5 i/ili Gly3.
4. Bispecifično antitelo prema bilo kom od zahteva 1-3, pri čemu se prvi vezujući domen vezuje za humani CD3 polipeptid ili CD3 polipeptid cinomolgus majmuna (cino).
5. Bispecifično antitelo prema bilo kom od zahteva 1-4, pri čemu se drugi vezujući domen vezuje za HER2 epitop u domenu IV HER2.
4 4
6. Bispecifično antitelo prema bilo kom od zahteva 1-5, pri čemu bispecifično antitelo sadrži mutaciju na mestu aglikozilacije.
7. Bispecifično antitelo prema zahtevu 6, pri čemu mutacija mesta aglikozilacije je supstituciona mutacija na aminokiselinskom ostatku N297, L234, L235 i/ili D265 prema EU numeraciji.
8. Bispecifično antitelo prema zahtevu 7, pri čemu supstituciona mutacija je izabrana iz grupe koja se sastoji od N297G, N297A, L234A, L235A i D265A.
9. Bispecifično antitelo prema bilo kom od zahteva 1-8, pri čemu bispecifično antitelo je:
(i) monoklonsko, humanizovano ili himerno;
(ii) antitelo pune dužine; i/ili
(iii) IgG antitelo.
10. Bispecifično antitelo prema bilo kom od zahteva 1-9, pri čemu bispecifično antitelo obuhvata konstantne domene teškog lanca, pri čemu konstantni domeni teškog lanca su izabrani od prvog CH1 (CH11) domena, prvog CH2 (CH21) domena, prvog CH3 (CH31) domena, drugog CH1 (CH12) domena, drugog CH2 (CH22) domena i drugog CH3 (CH32) domena, i pri čemu najmanje jedan od konstantnih domena teškog lanca je uparen sa drugim konstantnim domenom teškog lanca pri čemu:
(i) svaki od domena CH31i CH32obuhvata ispupčenje ili šupljinu, i pri čemu ispupčenje ili šupljina u CH31domenu može da se pozicionira u šupljinu, odnosno ispupčenje, u CH32domenu; ili
(ii) svaki od domena CH21i CH22obuhvata ispupčenje ili šupljinu, i pri čemu ispupčenje ili šupljina u CH21domenu može da se pozicionira u šupljinu, odnosno ispupčenje, u CH22domenu.
11. Izolovana nukleinska kiselina koja kodira bispecifično antitelo prema bilo kom od zahteva 1-10.
12. Vektor koji sadrži izolovanu nukleinsku kiselinu prema zahtevu 11.
13. Ćelija domaćin koja sadrži vektor prema zahtevu 12.
14. Postupak za proizvodnju bispecifičnog antitela prema bilo kom od zahteva 1-10, postupak obuhvata uzgajanje ćelije domaćina prema zahtevu 13 u medijumu za uzgajanje ćelija i izolovanje bispecifičnog antitela iz ćelije domaćina ili medijuma za uzgajanje.
15. Imunokonjugat koji obuhvata bispecifično antitelo prema bilo kom od zahteva 1-10 i citotoksični agens.
4
16. Kompozicija koja obuhvata bispecifično antitelo prema bilo kom od zahteva 1-10 i farmaceutski prihvatljiv nosač, ekscipijens ili razblaživač.
17. Kompozicija prema zahtevu 16, pri čemu kompozicija dalje sadrži antagonist vezivanja PD-1 ose ili dodatni terapeutski agens.
18. Bispecifično antitelo prema bilo kom od zahteva 1-10 za upotrebu u postupku lečenja putem: (i) lečenja ili odlaganja razvoja ćelijskog proliferativnog poremećaja kod ispitanika kome je to potrebno, ili (ii) poboljšanja imunološke funkcije kod ispitanika koji ima ćelijski proliferativni poremećaj.
19. Bispecifično antitelo za upotrebu prema zahtevu 18, pri čemu ćelijski proliferativni poremećaj je HER2-pozitivni kancer.
20. Bispecifično antitelo za upotrebu prema zahtevu 19, pri čemu, HER2-pozitivni kancer je HER2-pozitivni kancer dojke ili HER2-pozitivni kancer želuca.
21. Bispecifično antitelo za upotrebu prema bilo kom od zahteva 18-20, pri čemu se bispecifično antitelo vezuje za (a) molekul CD3 koji se nalazi na imunskoj efektorskoj ćeliji i (b) molekul HER2 koji se nalazi na ciljnoj ćeliji koja nije imunska efektorska ćelija.
22. Bispecifično antitelo za upotrebu prema zahtevu 21, pri čemu bispecifično antitelo aktivira imunsku efektorsku ćeliju nakon vezivanja za (a) i (b).
23. Bispecifično antitelo za upotrebu prema bilo kom od zahteva 18-22, pri čemu bispecifično antitelo je formulisano za primenu na ispitaniku:
(i) u dozi od 0,01 mg/kg do 10 mg/kg, 0,1 mg/kg do 10 mg/kg, ili 1 mg/kg; ili (ii) u kombinaciji sa primenom antagonista vezivanja ose PD-1 i/ili dodatnim terapeutskim agensom.
24. Bispecifično antitelo za upotrebu prema zahtevu 23, deo (ii), pri čemu antagonist vezivanja PD-1 ose izabran je iz grupe koja se sastoji od antagonista vezivanja PD-1, antagonista vezivanja PD-L1 i antagonista vezivanja PD-L2.
25. Bispecifično antitelo za upotrebu prema zahtevu 23, deo (ii), pri čemu antagonist vezivanja ose PD-1 je:
(i) antagonist vezivanja PD-1 izabran iz grupe koja se sastoji od MDX-1106 (nivolumab), MK-3475 (lambrolizumab) i AMP-224;
(ii) antagonist vezivanja PD-L1 izabran iz grupe koja se sastoji od MPDL3280A, MDX-1105 i MEDI4736; ili
(iii) antagonist vezivanja PD-L2, pri čemu antagonist vezivanja PD-L2 je antitelo ili imunoadhezin.
4
26. Bispecifično antitelo za upotrebu prema bilo kom od zahteva 18-25, pri čemu bispecifično antitelo je formulisano za primenu u kombinaciji sa primenom glukokortikoida ili konjugata antitela i leka (ADC).
27. Bispecifično antitelo za upotrebu prema bilo kom od zahteva 18-26, pri čemu bispecifično antitelo je formulisano za primenu u kombinaciji sa jednim ili više dodatnih terapeutskih agensa koji ciljaju HER put.
28. Bispecifično antitelo za upotrebu prema zahtevu 27, pri čemu jedan ili više dodatnih terapeutskih agenasa odabrani su od trastuzumaba, T-DM1 i pertuzumaba.
29. Bispecifično antitelo za upotrebu prema zahtevu 28, pri čemu dodatni terapeutski agens je trastuzumab.
30. Bispecifično antitelo za upotrebu prema bilo kom od zahteva 18-29, pri čemu bispecifično antitelo je formulisano za primenu na ispitaniku supkutano, intravenski, intramuskularno, topikalno, oralno, transdermalno, intraperitonealno, intraorbitalno, implantacijom, inhalacijom, intratekalno, intraventrikularno ili intranazalno.
31. Bispecifično antitelo za upotrebu prema bilo kom od zahteva 18-30, pri čemu ispitanik je čovek.
32. Komplet koji obuhvata:
(a) kompoziciju prema zahtevu 16 ili 17; i
(b) uputstvo za upotrebu koje obuhvata uputstvo za primenu kompozicije na ispitaniku radi lečenja ili odlaganja razvoja ćelijskog proliferativnog poremećaja ili poboljšanja imunske funkcije kod ispitanika koji ima ćelijski proliferativni poremećaj.
RS20240770A 2013-12-17 2014-12-17 Anti-cd3 antitela i postupci primene RS65715B1 (sr)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361917346P 2013-12-17 2013-12-17
US201461949950P 2014-03-07 2014-03-07
US201462026594P 2014-07-18 2014-07-18
US201462053582P 2014-09-22 2014-09-22
US201462091441P 2014-12-12 2014-12-12
EP20170466.5A EP3736292B1 (en) 2013-12-17 2014-12-17 Anti-cd3 antibodies and methods of use

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS65715B1 true RS65715B1 (sr) 2024-08-30

Family

ID=52394341

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20200773A RS60443B1 (sr) 2013-12-17 2014-12-17 Anti-cd3 antitela i postupci upotrebe
RS20240770A RS65715B1 (sr) 2013-12-17 2014-12-17 Anti-cd3 antitela i postupci primene
RS20200791A RS60453B1 (sr) 2013-12-17 2014-12-17 Anti-cd3 antitela i postupci upotrebe

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20200773A RS60443B1 (sr) 2013-12-17 2014-12-17 Anti-cd3 antitela i postupci upotrebe

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20200791A RS60453B1 (sr) 2013-12-17 2014-12-17 Anti-cd3 antitela i postupci upotrebe

Country Status (34)

Country Link
US (7) US10174124B2 (sr)
EP (4) EP4410315A3 (sr)
JP (7) JP6449295B2 (sr)
KR (6) KR102433591B1 (sr)
CN (4) CN112390883A (sr)
AU (4) AU2014364805B2 (sr)
BR (3) BR122021025087B1 (sr)
CA (3) CA3055708C (sr)
CL (1) CL2016001556A1 (sr)
CR (1) CR20160314A (sr)
DK (3) DK3083689T3 (sr)
EA (1) EA038933B1 (sr)
ES (3) ES2813074T3 (sr)
FI (1) FI3736292T3 (sr)
FR (1) FR22C1048I2 (sr)
HR (3) HRP20240939T1 (sr)
HU (4) HUE050156T2 (sr)
IL (3) IL263466B2 (sr)
LT (4) LT3736292T (sr)
MX (2) MX379030B (sr)
NL (1) NL301194I2 (sr)
NO (1) NO2022037I1 (sr)
NZ (1) NZ721309A (sr)
PE (3) PE20210648A1 (sr)
PH (1) PH12016501186A1 (sr)
PL (3) PL3736292T3 (sr)
PT (3) PT3192812T (sr)
RS (3) RS60443B1 (sr)
SG (3) SG10201809385RA (sr)
SI (3) SI3083689T1 (sr)
TW (3) TWI747385B (sr)
UA (2) UA120753C2 (sr)
WO (1) WO2015095392A1 (sr)
ZA (2) ZA201603755B (sr)

Families Citing this family (274)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI807362B (zh) 2010-11-30 2023-07-01 日商中外製藥股份有限公司 細胞傷害誘導治療劑
MX356947B (es) 2011-08-23 2018-06-20 Roche Glycart Ag Anticuerpos bioespecíficos específicos para antígenos que activan células t y un antígeno tumoral y métodos de uso.
US12466897B2 (en) 2011-10-10 2025-11-11 Xencor, Inc. Heterodimeric human IgG1 polypeptides with isoelectric point modifications
US10851178B2 (en) 2011-10-10 2020-12-01 Xencor, Inc. Heterodimeric human IgG1 polypeptides with isoelectric point modifications
ES2702315T3 (es) 2012-08-24 2019-02-28 Univ California Anticuerpos y vacunas para su uso en tratar cánceres ROR1 e inhibir metástasis
JOP20200236A1 (ar) 2012-09-21 2017-06-16 Regeneron Pharma الأجسام المضادة لمضاد cd3 وجزيئات ربط الأنتيجين ثنائية التحديد التي تربط cd3 وcd20 واستخداماتها
US10087250B2 (en) 2012-10-08 2018-10-02 Roche Glycart Ag Fc-free antibodies comprising two fab-fragments and methods of use
CA2898100C (en) 2013-01-14 2023-10-10 Xencor, Inc. Novel heterodimeric proteins
US10968276B2 (en) 2013-03-12 2021-04-06 Xencor, Inc. Optimized anti-CD3 variable regions
US11053316B2 (en) 2013-01-14 2021-07-06 Xencor, Inc. Optimized antibody variable regions
US9605084B2 (en) 2013-03-15 2017-03-28 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US10487155B2 (en) 2013-01-14 2019-11-26 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
TWI682941B (zh) 2013-02-01 2020-01-21 美商再生元醫藥公司 含嵌合恆定區之抗體
AU2014222779B2 (en) 2013-02-26 2018-08-30 Roche Glycart Ag Bispecific T cell activating antigen binding molecules
MX2015010350A (es) 2013-02-26 2015-10-29 Roche Glycart Ag Moleculas de union a antigeno biespecificas que activan la celula t.
CA2902026C (en) * 2013-03-13 2023-08-29 Prothena Biosciences Limited Tau immunotherapy
WO2014153164A1 (en) 2013-03-14 2014-09-25 The California Institute For Biomedical Research Targeting agent antibody conjugates and uses thereof
EP3421495A3 (en) 2013-03-15 2019-05-15 Xencor, Inc. Modulation of t cells with bispecific antibodies and fc fusions
US10519242B2 (en) 2013-03-15 2019-12-31 Xencor, Inc. Targeting regulatory T cells with heterodimeric proteins
US10858417B2 (en) 2013-03-15 2020-12-08 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
UY35468A (es) 2013-03-16 2014-10-31 Novartis Ag Tratamiento de cáncer utilizando un receptor quimérico de antígeno anti-cd19
AR096687A1 (es) 2013-06-24 2016-01-27 Genentech Inc Anticuerpos anti-fcrh5
ES2776706T3 (es) * 2013-07-05 2020-07-31 Genmab As Anticuerpos contra CD3 humanizados o quiméricos
CN112390883A (zh) 2013-12-17 2021-02-23 基因泰克公司 抗cd3抗体及使用方法
MX2016008098A (es) 2013-12-20 2017-01-11 Hoffmann La Roche Anticuerpos biespecificos del receptor 2 de factor de crecimiento ipidermico himano (her2) y metodo de uso.
TWI681969B (zh) 2014-01-23 2020-01-11 美商再生元醫藥公司 針對ｐｄ-１的人類抗體
TWI680138B (zh) 2014-01-23 2019-12-21 美商再生元醫藥公司 抗ｐｄ-ｌ１之人類抗體
US10618963B2 (en) 2014-03-12 2020-04-14 Yeda Research And Development Co. Ltd Reducing systemic regulatory T cell levels or activity for treatment of disease and injury of the CNS
US9394365B1 (en) 2014-03-12 2016-07-19 Yeda Research And Development Co., Ltd Reducing systemic regulatory T cell levels or activity for treatment of alzheimer's disease
CN114081946A (zh) 2014-03-12 2022-02-25 耶达研究与开发有限公司 降低系统性调节性t细胞水平或活性来治疗cns疾病和损伤
US10519237B2 (en) 2014-03-12 2019-12-31 Yeda Research And Development Co. Ltd Reducing systemic regulatory T cell levels or activity for treatment of disease and injury of the CNS
TWI754319B (zh) * 2014-03-19 2022-02-01 美商再生元醫藥公司 用於腫瘤治療之方法及抗體組成物
JP2017510577A (ja) * 2014-03-26 2017-04-13 フラウンホーファ−ゲゼルシャフト ツァー フォルデルング デア アンゲバンデン フォルシュンク エー． ファオ．Ｆｒａｕｎｈｏｆｅｒ−Ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ Ｚｕｒ Ｆｏｒｄｅｒｕｎｇ Ｄｅｒ Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅｎ Ｆｏｒｓｃｈｕｎｇ Ｅ． Ｖ． 抗ＴＮＦ−α抗体療法の賦活剤としてのＣＤ６４ブロック剤の使用法
MX385936B (es) 2014-03-28 2025-03-11 Xencor Inc Anticuerpos biespecíficos que se unen a cd38 y cd3.
MX380176B (es) * 2014-04-07 2025-03-12 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Molecula ligada a antigeno inmunoactivada.
LT3129470T (lt) * 2014-04-07 2021-07-12 Novartis Ag Vėžio gydymas naudojant anti-cd19 chimerinį antigeno receptorių
CN106459954A (zh) 2014-05-13 2017-02-22 中外制药株式会社 用于具有免疫抑制功能的细胞的t细胞重定向的抗原结合分子
EP3936145A1 (en) * 2014-07-31 2022-01-12 The University Of Western Australia A method for the identification of immunotherapy-drug combinations using a network approach
MA40510A (fr) 2014-08-04 2017-06-14 Hoffmann La Roche Molécules bispécifiques de liaison à l'antigène activant les lymphocytes t
WO2016019969A1 (en) 2014-08-08 2016-02-11 Ludwig-Maximilians-Universität München Subcutaneously administered bispecific antibodies for use in the treatment of cancer
CR20170095A (es) 2014-09-12 2017-07-19 Genentech Inc Anticuerpos anti-cll-1 e inmunoconjugados referencias recíprocas con solicitudes relacionadas
US9616114B1 (en) 2014-09-18 2017-04-11 David Gordon Bermudes Modified bacteria having improved pharmacokinetics and tumor colonization enhancing antitumor activity
EP3699198B1 (en) * 2014-11-17 2025-03-26 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for tumor treatment using cd3xcd20 bispecific antibody
ES2926673T3 (es) 2014-11-20 2022-10-27 Hoffmann La Roche Politerapia de moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T y antagonistas de la unión al eje de PD-1
RS60615B1 (sr) 2014-11-20 2020-08-31 Hoffmann La Roche Zajednički laki lanci i postupci upotrebe
SG11201702976TA (en) 2014-11-20 2017-05-30 Hoffmann La Roche T cell activating bispecific antigen binding molecules agiant folr1 and cd3
US10259887B2 (en) 2014-11-26 2019-04-16 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind CD3 and tumor antigens
HRP20211273T1 (hr) 2014-11-26 2021-11-12 Xencor, Inc. Heterodimerna protutijela koja vežu cd3 i cd20
MX2017006918A (es) 2014-11-26 2018-01-25 Xencor Inc Anticuerpos heterodimericos que se unen a cd3 y cd38.
SG11201704449VA (en) 2014-12-05 2017-06-29 Genentech Inc ANTI-CD79b ANTIBODIES AND METHODS OF USE
EP3237449A2 (en) 2014-12-22 2017-11-01 Xencor, Inc. Trispecific antibodies
WO2016110576A1 (en) * 2015-01-08 2016-07-14 Genmab A/S Bispecific antibodies against cd3 and cd20
WO2016141387A1 (en) 2015-03-05 2016-09-09 Xencor, Inc. Modulation of t cells with bispecific antibodies and fc fusions
DK3277725T3 (da) 2015-03-30 2021-01-11 Regeneron Pharma Konstante tungkædeområder med reduceret binding til FC-gammareceptorer
HRP20220893T1 (hr) 2015-04-08 2022-10-14 Novartis Ag Cd20 terapije, cd22 terapije, i kombinirane terapije sa stanicom koja eksprimira cd19 kimerni antigenski receptor
MX2017013297A (es) * 2015-04-13 2018-06-19 Pfizer Anticuerpos terapeuticos y sus usos.
EP3778640A1 (en) 2015-05-01 2021-02-17 Genentech, Inc. Masked anti-cd3 antibodies and methods of use
US10676723B2 (en) 2015-05-11 2020-06-09 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
EP3310814B1 (en) * 2015-06-16 2023-08-02 F. Hoffmann-La Roche AG Humanized and affinity matured antibodies to fcrh5 and methods of use
WO2016204966A1 (en) 2015-06-16 2016-12-22 Genentech, Inc. Anti-cd3 antibodies and methods of use
CN107847568B (zh) 2015-06-16 2022-12-20 豪夫迈·罗氏有限公司 抗cll-1抗体和使用方法
KR20180012859A (ko) 2015-06-17 2018-02-06 제넨테크, 인크. 항-her2 항체 및 이용 방법
IL302486A (en) 2015-06-24 2023-06-01 Hoffmann La Roche Antibodies against the transnephrine receptor with adapted affinity
JP6837436B2 (ja) * 2015-07-10 2021-03-03 中外製薬株式会社 内因性ｃｄ３遺伝子をヒトｃｄ３遺伝子に置換した非ヒト動物
BR112018000768A2 (pt) 2015-07-13 2018-09-25 Cytomx Therapeutics Inc anticorpos anti-pd-1, anticorpos anti-pd-1 ativáveis e métodos de uso dos mesmos
TWI717375B (zh) * 2015-07-31 2021-02-01 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Ｃｄ７０及ｃｄ３抗體構築體
TWI744242B (zh) 2015-07-31 2021-11-01 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Egfrviii及cd3抗體構築體
TWI829617B (zh) 2015-07-31 2024-01-21 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Ｆｌｔ３及ｃｄ３抗體構築體
EA039859B1 (ru) 2015-07-31 2022-03-21 Эмджен Рисерч (Мюник) Гмбх Биспецифические конструкты антител, связывающие egfrviii и cd3
TWI796283B (zh) 2015-07-31 2023-03-21 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Ｍｓｌｎ及ｃｄ３抗體構築體
AR106188A1 (es) 2015-10-01 2017-12-20 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-cd19 humano humanizados y métodos de utilización
AR106189A1 (es) 2015-10-02 2017-12-20 Hoffmann La Roche ANTICUERPOS BIESPECÍFICOS CONTRA EL A-b HUMANO Y EL RECEPTOR DE TRANSFERRINA HUMANO Y MÉTODOS DE USO
CN114057885A (zh) 2015-10-02 2022-02-18 豪夫迈·罗氏有限公司 双特异性抗人cd20/人转铁蛋白受体抗体及使用方法
KR20180073561A (ko) 2015-10-02 2018-07-02 에프. 호프만-라 로슈 아게 이중특이적 항-ceaxcd3 t 세포 활성화 항원 결합 분자
US11660340B2 (en) 2015-11-18 2023-05-30 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Combination therapy using T cell redirection antigen binding molecule against cell having immunosuppressing function
EP3378488A4 (en) * 2015-11-18 2019-10-30 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha METHOD FOR IMPROVING THE HUMORAL IMMUNE REACTION
JP7058219B2 (ja) 2015-12-07 2022-04-21 ゼンコア インコーポレイテッド Ｃｄ３及びｐｓｍａに結合するヘテロ二量体抗体
KR102850929B1 (ko) 2015-12-09 2025-08-27 에프. 호프만-라 로슈 아게 항-약물 항체의 형성을 감소시키기 위한 ii형 항-cd20 항체
US10954301B2 (en) 2015-12-14 2021-03-23 Macrogenics, Inc. Bispecific molecules having immunoreactivity with PD-1 and CTLA-4, and methods of use thereof
HRP20231156T1 (hr) 2015-12-22 2024-01-05 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Kombinacija anti-pd-1 antitijela i bispecifičnih anti-cd20/anti-cd3 antitijela za liječenje raka
KR20180097615A (ko) 2016-01-08 2018-08-31 에프. 호프만-라 로슈 아게 Pd-1 축 결합 길항물질 및 항-cea/항-cd3 이중특이성 항체를 사용하는 cea-양성 암의 치료 방법
CN113817060B (zh) * 2016-01-09 2024-03-08 嘉立医疗科技(广州)有限公司 用于癌症治疗的钙粘蛋白-17特异性抗体和细胞毒性细胞
IL260920B (en) 2016-02-03 2022-09-01 Amgen Res Munich Gmbh Constructs of psma and cd3 bispecific antigens that bind to t-cells, preparations containing them and uses thereof
CA3013463C (en) 2016-02-04 2024-05-21 The California Institute For Biomedical Research Humanized anti-cd3 antibodies, conjugates and uses thereof
IL261188B (en) 2016-03-04 2022-08-01 Jn Biosciences Llc An anti-tigit antibody that binds to the tigit polypeptide on one or more amino acid residues
GB201604458D0 (en) 2016-03-16 2016-04-27 Immatics Biotechnologies Gmbh Peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against cancers
LT3433280T (lt) 2016-03-22 2023-07-10 F. Hoffmann-La Roche Ag Proteazės aktyvuojamos t ląstelei bispecifinės molekulės
EP3452508A1 (en) 2016-05-02 2019-03-13 Prothena Biosciences Limited Antibodies recognizing tau
PE20190208A1 (es) 2016-05-02 2019-02-07 Prothena Biosciences Ltd Anticuerpos que reconocen tau
US10752679B2 (en) 2016-05-02 2020-08-25 Prothena Biosciences Limited Tau immunotherapy
TWI755395B (zh) 2016-05-13 2022-02-21 美商再生元醫藥公司 抗-pd-1抗體與輻射治療癌症之組合
EP3252078A1 (en) 2016-06-02 2017-12-06 F. Hoffmann-La Roche AG Type ii anti-cd20 antibody and anti-cd20/cd3 bispecific antibody for treatment of cancer
CN110603266A (zh) * 2016-06-02 2019-12-20 豪夫迈·罗氏有限公司 用于治疗癌症的ii型抗cd20抗体和抗cd20/cd3双特异性抗体
RU2018145961A (ru) * 2016-06-07 2020-07-14 Макродженикс, Инк. Комбинированная терапия
FI3468586T3 (fi) 2016-06-14 2024-10-29 Xencor Inc Bispesifisiä immuuniaktivaatiota vapauttavia vasta-aineita
JP7461741B2 (ja) 2016-06-20 2024-04-04 カイマブ・リミテッド 抗ｐｄ－ｌ１およびｉｌ－２サイトカイン
MX2018016330A (es) 2016-06-27 2020-02-17 Univ California Combinaciones para tratamiento del cáncer.
EP3475304B1 (en) 2016-06-28 2022-03-23 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind somatostatin receptor 2
US10870709B2 (en) 2016-07-22 2020-12-22 New York University Specific murine and humanized monoclonal antibodies detecting pathology associated secondary structure changes in proteins and peptides
JP7125347B2 (ja) 2016-08-22 2022-08-24 中外製薬株式会社 ヒトｇｐｃ３ポリペプチドを発現する遺伝子改変非ヒト動物
US10793632B2 (en) 2016-08-30 2020-10-06 Xencor, Inc. Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors
US20180064758A1 (en) * 2016-09-05 2018-03-08 Ucl Business Plc Chimeric antigen receptor
US10621236B2 (en) * 2016-09-16 2020-04-14 At&T Intellectual Property I, L.P. Concept based querying of graph databases
EP3512548B1 (en) * 2016-09-16 2023-03-22 Bionomics Limited Antibody and checkpoint inhibitor combination therapy
RS63660B1 (sr) * 2016-09-23 2022-11-30 Regeneron Pharma Anti-muc16 (mucin 16) antitela
ES2897217T3 (es) 2016-09-30 2022-02-28 Hoffmann La Roche Anticuerpos biespecíficos frente a p95HER2
CA3040504A1 (en) 2016-10-14 2018-04-19 Xencor, Inc. Il15/il15ra heterodimeric fc-fusion proteins
KR20190074300A (ko) 2016-11-15 2019-06-27 제넨테크, 인크. 항-cd20/항-cd3 이중특이적 항체에 의한 치료를 위한 투약
US11129906B1 (en) 2016-12-07 2021-09-28 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
US11180535B1 (en) 2016-12-07 2021-11-23 David Gordon Bermudes Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria
WO2018106931A1 (en) 2016-12-07 2018-06-14 Progenity Inc. Gastrointestinal tract detection methods, devices and systems
IL267406B2 (en) 2016-12-20 2025-05-01 Hoffmann La Roche Combination therapy of anti-cd20/anti-cd3 bispecific antibodies and 4-1bb (cd137) agonists
IL268479B2 (en) 2017-02-21 2024-06-01 Regeneron Pharma Anti-PD-1 antibodies for the treatment of lung cancer
WO2018174274A1 (ja) * 2017-03-24 2018-09-27 全薬工業株式会社 抗ＩｇＭ／Ｂ細胞表面抗原二重特異性抗体
CA3054632A1 (en) 2017-03-30 2018-10-04 Progenity, Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with an immune modulatory agent released using an ingestible device
US11603407B2 (en) 2017-04-06 2023-03-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Stable antibody formulation
WO2018199593A1 (ko) * 2017-04-24 2018-11-01 재단법인 목암생명과학연구소 Her3 및 cd3에 결합하는 이중특이적 항체
WO2018203567A1 (en) * 2017-05-02 2018-11-08 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Cytotoxicity-inducing therapeutic agent
MX2019013045A (es) 2017-05-02 2020-02-12 Prothena Biosciences Ltd Anticuerpos que reconocen tau.
CN118562001A (zh) 2017-05-08 2024-08-30 阿迪马布有限责任公司 抗cd3结合结构域和包含它们的抗体以及它们的产生及使用方法
EP3409322A1 (en) 2017-06-01 2018-12-05 F. Hoffmann-La Roche AG Treatment method
WO2018223004A1 (en) * 2017-06-01 2018-12-06 Xencor, Inc. Bispecific antibodies that bind cd20 and cd3
MA49517A (fr) 2017-06-30 2020-05-06 Xencor Inc Protéines de fusion fc hétérodimères ciblées contenant il-15/il-15ra et domaines de liaison à l'antigène
LT3652215T (lt) 2017-07-14 2021-05-25 Immatics Biotechnologies Gmbh Pagerinta dvejopo savitumo polipeptido molekulė
US12486325B2 (en) 2017-09-21 2025-12-02 WuXi Biologics Ireland Limited Anti-CD3epsilon antibodies
KR102785140B1 (ko) * 2017-09-21 2025-03-25 우시 바이올로직스 아일랜드 리미티드 신규 항-cd3엡실론 항체
ES2759622T3 (es) 2017-10-02 2020-05-11 Certest Biotec S L Anticuerpos anti-Dps y dispositivos de prueba para la detección de bacterias del género Campylobacter
KR101973060B1 (ko) * 2017-10-20 2019-04-26 주식회사 녹십자 항-cd3 항체 및 이를 포함하는 암 치료용 약학적 조성물
BR112020007736A2 (pt) 2017-10-30 2020-10-20 F. Hoffmann-La Roche Ag composição e método de tratamento
ES2907054T3 (es) 2017-11-01 2022-04-21 Hoffmann La Roche TriFab-Contorsbody
WO2019094637A1 (en) 2017-11-08 2019-05-16 Xencor, Inc. Bispecific and monospecific antibodies using novel anti-pd-1 sequences
US10981992B2 (en) 2017-11-08 2021-04-20 Xencor, Inc. Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors
KR102722731B1 (ko) 2017-12-19 2024-10-25 젠코어 인코포레이티드 조작된 il-2 fc 융합 단백질
MA51302A (fr) 2017-12-21 2021-03-31 Hoffmann La Roche Anticorps se liant à hla-a2/wt1
CA3088878A1 (en) * 2018-01-09 2019-07-18 H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute Inc. Compositions and methods for targeting clec12a-expressing cancers
WO2019139987A1 (en) 2018-01-09 2019-07-18 Elstar Therapeutics, Inc. Calreticulin binding constructs and engineered t cells for the treatment of diseases
US20200339686A1 (en) * 2018-01-16 2020-10-29 Lakepharma, Inc. Bispecific antibody that binds cd3 and another target
CA3089287A1 (en) 2018-02-08 2019-08-15 Genentech, Inc. Bispecific antigen-binding molecules and methods of use
CN110218256B (zh) * 2018-03-02 2020-12-08 广西医科大学 抗CD3的纳米抗体CD3/Nb29及其制备方法与应用
CN110218253B (zh) * 2018-03-02 2020-12-04 广西医科大学 抗CD3的纳米抗体CD3/Nb14及其制备方法与应用
EP3765520A1 (en) * 2018-03-14 2021-01-20 NovImmune SA Anti-cd3 epsilon antibodies and methods of use thereof
WO2019178362A1 (en) 2018-03-14 2019-09-19 Elstar Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to calreticulin and uses thereof
CN110305217B (zh) * 2018-03-27 2022-03-29 广州爱思迈生物医药科技有限公司 双特异性抗体及其应用
CN112469477A (zh) 2018-04-04 2021-03-09 Xencor股份有限公司 与成纤维细胞活化蛋白结合的异源二聚体抗体
JP7418346B2 (ja) 2018-04-13 2024-01-19 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト ４－１ＢＢＬを含むＨｅｒ２標的化抗原結合分子
CA3097741A1 (en) 2018-04-18 2019-10-24 Xencor, Inc. Tim-3 targeted heterodimeric fusion proteins containing il-15/il-15ra fc-fusion proteins and tim-3 antigen binding domains
JP2021521784A (ja) 2018-04-18 2021-08-30 ゼンコア インコーポレイテッド ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲａＦｃ融合タンパク質とＰＤ−１抗原結合ドメインを含むＰＤ−１標的化ヘテロダイマー融合タンパク質およびそれらの使用
SMT202500221T1 (it) * 2018-05-24 2025-07-22 Janssen Biotech Inc Anticorpi anti-cd3 e usi di essi
MA52777A (fr) 2018-05-24 2021-04-14 Janssen Biotech Inc Agents de liaison psma et utilisations correspondantes
US20210380710A1 (en) * 2018-05-29 2021-12-09 WuXi Biologics Ireland Limited A novel anti-cd3/anti-cd20 bispecific antibody
TWI848953B (zh) * 2018-06-09 2024-07-21 德商百靈佳殷格翰國際股份有限公司 針對癌症治療之多特異性結合蛋白
WO2019246312A1 (en) 2018-06-20 2019-12-26 Progenity, Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with an immunomodulator
US12227565B2 (en) 2018-06-20 2025-02-18 Biora Therapeutics, Inc. Method of formulating a pharmaceutical composition comprising administering an immune modulator to the small intestine
AU2019297451A1 (en) 2018-07-03 2021-01-28 Marengo Therapeutics, Inc. Anti-TCR antibody molecules and uses thereof
TWI728400B (zh) * 2018-07-26 2021-05-21 美商美國禮來大藥廠 Cd226促效劑抗體
DK3844189T3 (da) 2018-08-31 2025-02-24 Regeneron Pharma Doseringsstrategi, der mindsker cytokinfrigivelsessyndrom for CD3/CD20-bispecifikke antistoffer
CN110872356B (zh) * 2018-09-03 2023-06-13 广西慧宝源健康产业有限公司 双特异性抗体及其使用方法
US11573226B2 (en) 2018-09-10 2023-02-07 Genentech, Inc. Systems and methods for affinity capillary electrophoresis
EP3837282B1 (en) 2018-09-10 2025-08-27 Genentech, Inc. Systems and methods for affinity capillary electrophoresis
SG11202103192RA (en) 2018-10-03 2021-04-29 Xencor Inc Il-12 heterodimeric fc-fusion proteins
TW202028244A (zh) 2018-10-09 2020-08-01 美商建南德克公司 用於確定突觸形成之方法及系統
EP3864049A1 (en) 2018-10-11 2021-08-18 Inhibrx, Inc. Pd-1 single domain antibodies and therapeutic compositions thereof
US20210340273A1 (en) 2018-10-11 2021-11-04 Inhlbrx, inc. 5t4 single domain antibodies and therapeutic compositions thereof
CA3115089A1 (en) 2018-10-11 2020-04-16 Inhibrx, Inc. Dll3 single domain antibodies and therapeutic compositions thereof
CA3115082A1 (en) 2018-10-11 2020-04-16 Inhibrx, Inc. B7h3 single domain antibodies and therapeutic compositions thereof
CN109400710A (zh) * 2018-11-02 2019-03-01 山西大医院（山西医学科学院） 一种靶向kif20a阳性胰腺癌双特异性抗体及其制备方法和应用
US20220033516A1 (en) * 2018-11-05 2022-02-03 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Her2 s310f specific antigen-binding molecules
CN116726361A (zh) 2018-11-19 2023-09-12 比奥拉治疗股份有限公司 用生物治疗剂治疗疾病的方法和装置
MX2021007307A (es) * 2018-12-21 2021-07-07 Hoffmann La Roche Anticuerpos que se unen a cd3.
PH12021551487A1 (en) 2018-12-21 2022-04-11 Hoffmann La Roche Tumor-targeted agonistic cd28 antigen binding molecules
GB201901305D0 (en) * 2019-01-30 2019-03-20 Immunocore Ltd Specific binding molecules
AU2020224681A1 (en) 2019-02-21 2021-09-16 Marengo Therapeutics, Inc. Antibody molecules that bind to NKp30 and uses thereof
GB2599228B (en) 2019-02-21 2024-02-07 Marengo Therapeutics Inc Multifunctional molecules that bind to T cell related cancer cells and uses thereof
MX2021010390A (es) 2019-03-01 2021-11-17 Xencor Inc Anticuerpos heterodimericos que se unen a enpp3 y cd3.
AU2020231366A1 (en) 2019-03-03 2021-08-12 Prothena Biosciences Limited Antibodies recognizing tau
AU2020236015B9 (en) 2019-03-14 2024-11-28 Genentech, Inc. Treatment of cancer with HER2XCD3 bispecific antibodies in combination with anti-HER2 MAB
KR102239781B1 (ko) 2019-04-08 2021-04-13 주식회사 녹십자 Gpnmb 및 cd3에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항체 및 이의 용도
AR118720A1 (es) 2019-04-19 2021-10-27 Janssen Biotech Inc Métodos para tratar el cáncer de próstata con un anticuerpo anti-psma / cd3
EP3725370A1 (en) 2019-04-19 2020-10-21 ImmunoBrain Checkpoint, Inc. Modified anti-pd-l1 antibodies and methods and uses for treating a neurodegenerative disease
KR20230031981A (ko) 2019-05-14 2023-03-07 프로벤션 바이오, 인코포레이티드 제1형 당뇨병을 예방하기 위한 방법 및 조성물
EP3972998A1 (en) 2019-05-21 2022-03-30 Novartis AG Cd19 binding molecules and uses thereof
EP3973000A4 (en) * 2019-06-07 2023-09-06 Adimab, LLC HIGH AFFINITY ANTI-CD3 ANTIBODIES AND METHOD FOR THE PRODUCTION AND USE THEREOF
CN114025802B (zh) * 2019-06-21 2024-04-23 瑞泽恩制药公司 结合psma和cd3的双特异性抗原结合分子与4-1bb共刺激组合的用途
WO2021006199A1 (ja) 2019-07-05 2021-01-14 小野薬品工業株式会社 Ｐｄ－１／ｃｄ３二重特異性タンパク質による血液がん治療
DE102019121007A1 (de) 2019-08-02 2021-02-04 Immatics Biotechnologies Gmbh Antigenbindende Proteine, die spezifisch an MAGE-A binden
WO2021034335A1 (en) * 2019-08-16 2021-02-25 Odonate Therapeutics, Inc. Methods of administering tesetaxel with glucocorticoids that are cyp3a4 inducers
EP4065164A4 (en) * 2019-11-26 2024-03-27 Shanghai Epimab Biotherapeutics Co., Ltd. ANTIBODIES AGAINST CD3 AND BCMA AND BISPECIFIC BINDING PROTEINS PRODUCED THEREOF
TW202135860A (zh) * 2019-12-10 2021-10-01 美商再生元醫藥公司 含有抗ｃｄ２０ｘ抗ｃｄ３雙特異性抗體之穩定調配物
AR120741A1 (es) * 2019-12-13 2022-03-16 Genentech Inc Anticuerpos anti-ly6g6d y métodos de uso
US11707610B2 (en) 2019-12-13 2023-07-25 Biora Therapeutics, Inc. Ingestible device for delivery of therapeutic agent to the gastrointestinal tract
JP2023509708A (ja) 2020-01-03 2023-03-09 マレンゴ・セラピューティクス，インコーポレーテッド 抗ｔｃｒ抗体分子およびその使用
TWI888487B (zh) * 2020-02-14 2025-07-01 日商協和麒麟股份有限公司 與ｃｄ３結合之雙特異性抗體
CA3171709A1 (en) * 2020-03-16 2021-09-23 Rahul Palchaudhuri T-cell bispecific binding proteins
EP4146175A1 (en) 2020-05-08 2023-03-15 Genmab A/S Bispecific antibodies against cd3 and cd20
WO2021231976A1 (en) 2020-05-14 2021-11-18 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind prostate specific membrane antigen (psma) and cd3
JP2023528350A (ja) 2020-05-27 2023-07-04 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド Ｃｄ３抗原結合ドメインを含むタンパク質及びその使用
US10981996B1 (en) 2020-06-01 2021-04-20 Abexxa Biologics, Inc. Antibodies targeting a complex comprising non-classical HLA-I and neoantigen and their methods of use
US11976120B2 (en) * 2020-06-01 2024-05-07 Boehringer Ingelheim International Gmbh Antibodies targeting a complex comprising non-classical HLA-I and neoantigen and their methods of use
AR122493A1 (es) 2020-06-02 2022-09-14 Arcus Biosciences Inc Anticuerpos anti-tigit
IL298999A (en) 2020-06-11 2023-02-01 Provention Bio Inc Methods and compositions for the prevention of type 1 diabetes
PE20231080A1 (es) 2020-06-19 2023-07-17 Hoffmann La Roche Anticuerpos que se unen a cd3 y cd19
CN111705084B (zh) * 2020-08-18 2020-12-08 江苏集萃药康生物科技有限公司 一种稳定表达荧光素酶及人cd20敲除鼠cd20的小鼠b细胞淋巴瘤细胞系构建方法
WO2022040482A1 (en) 2020-08-19 2022-02-24 Xencor, Inc. Anti-cd28 and/or anti-b7h3 compositions
WO2022053653A1 (en) 2020-09-10 2022-03-17 Genmab A/S Bispecific antibodies against cd3 and cd20 for treating chronic lymphocytic leukemia
BR112023004351A2 (pt) 2020-09-10 2023-04-04 Genmab As Método para tratar linfoma folicular em um sujeito humano
EP4210744A1 (en) 2020-09-10 2023-07-19 Genmab A/S Bispecific antibody against cd3 and cd20 in combination therapy for treating diffuse large b-cell lymphoma
CA3192251A1 (en) 2020-09-10 2022-03-17 Genmab A/S Bispecific antibody against cd3 and cd20 in combination therapy for treating diffuse large b-cell lymphoma
EP4210743A1 (en) 2020-09-10 2023-07-19 Genmab A/S Bispecific antibody against cd3 and cd20 in combination therapy for treating follicular lymphoma
EP4222171A1 (en) 2020-10-02 2023-08-09 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Combination of antibodies for treating cancer with reduced cytokine release syndrome
IL302396A (en) 2020-11-04 2023-06-01 Genentech Inc Dosage for treatment with bispecific anti-CD20/anti-CD3 antibodies
JP7716473B2 (ja) 2020-11-04 2025-07-31 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ｃｄ２０／抗ｃｄ３二重特異性抗体の皮下投薬
IL302217A (en) * 2020-11-04 2023-06-01 Genentech Inc Dosage for treatment with bispecific anti-CD20/anti-CD3 antibodies and anti-CD79B drug antibody conjugates
PH12023500013A1 (en) 2020-12-04 2024-03-11 Tidal Therapeutics Inc Ionizable cationic lipids and lipi nanoparticles, and methods of synthesis and use thereof
IL303656A (en) 2020-12-17 2023-08-01 Hoffmann La Roche Anti-hla-g antibodies and use thereof
CN114656562B (zh) 2020-12-23 2023-11-03 北京天广实生物技术股份有限公司 结合人和猴cd3的抗体及其应用
AU2022206061A1 (en) 2021-01-06 2023-07-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy employing a pd1-lag3 bispecific antibody and a cd20 t cell bispecific antibody
PE20240761A1 (es) 2021-01-28 2024-04-17 Janssen Biotech Inc Proteinas de union a psma y usos de estas
CN117157319A (zh) 2021-03-09 2023-12-01 Xencor股份有限公司 结合cd3和cldn6的异二聚抗体
KR20230154311A (ko) 2021-03-10 2023-11-07 젠코어 인코포레이티드 Cd3 및 gpc3에 결합하는 이종이량체 항체
WO2022216993A2 (en) 2021-04-08 2022-10-13 Marengo Therapeutics, Inc. Multifuntional molecules binding to tcr and uses thereof
TW202243689A (zh) 2021-04-30 2022-11-16 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 抗ｃｄ２０／抗ｃｄ３雙特異性抗體及抗ｃｄ７８ｂ抗體藥物結合物的組合治療之給藥
EP4329800A1 (en) 2021-04-30 2024-03-06 F. Hoffmann-La Roche AG Dosing for treatment with anti-cd20/anti-cd3 bispecific antibody
AU2022269312A1 (en) * 2021-05-06 2023-10-19 Amgen Research (Munich) Gmbh Cd20 and cd22 targeting antigen-binding molecules for use in proliferative diseases
AU2022273541A1 (en) 2021-05-14 2023-11-30 Genentech, Inc. Methods for treatment of cd20-positive proliferative disorder with mosunetuzumab and polatuzumab vedotin
CN115490770A (zh) * 2021-06-17 2022-12-20 鸿运华宁（杭州）生物医药有限公司 一种能与人eta和人cd3结合的双特异性抗体及其应用
EP4355785A1 (en) * 2021-06-17 2024-04-24 Amberstone Biosciences, Inc. Anti-cd3 constructs and uses thereof
EP4355778A1 (en) 2021-06-17 2024-04-24 Boehringer Ingelheim International GmbH Novel tri-specific binding molecules
CN115558023A (zh) * 2021-07-02 2023-01-03 安源医药科技（上海）有限公司 抗cd3抗体及其用途
CA3228259A1 (en) * 2021-08-04 2023-02-09 Abpro Corporation Anti-her2 antibodies and uses thereof
CN117897407A (zh) * 2021-08-27 2024-04-16 石药集团巨石生物制药有限公司 抗Nectin-4抗体、药物缀合物及其制备方法和用途
WO2023056391A1 (en) * 2021-09-30 2023-04-06 City Of Hope Anti-cd3 antibodies and uses thereof
CN118076387A (zh) * 2021-10-08 2024-05-24 艾贝乐医药科技有限公司 靶向表达cdh17的肿瘤的多特异性抗体及其制备和使用方法
AU2022389969A1 (en) * 2021-11-16 2024-05-02 Genentech, Inc. Methods and compositions for treating systemic lupus erythematosus (sle) with mosunetuzumab
EP4448570A1 (en) 2021-12-14 2024-10-23 CDR-Life AG Dual mhc-targeting t cell engager
WO2023183766A1 (en) * 2022-03-20 2023-09-28 Abcellera Biologics Inc. Anti-cd3 antibodies and t-cell engagers and methods of use
MX2024011468A (es) 2022-03-23 2024-09-25 Hoffmann La Roche Tratamiento conjunto de un anticuerpo biespecifico anti-cd20/anti-cd3 y quimioterapia.
PE20250559A1 (es) 2022-03-29 2025-02-24 Ngm Biopharmaceuticals Inc Agentes de union a ilt3 y cd3 y metodos de uso de estos
EP4508081A1 (en) 2022-04-13 2025-02-19 F. Hoffmann-La Roche AG Pharmaceutical compositions of anti-cd20/anti-cd3 bispecific antibodies and methods of use
AR129061A1 (es) 2022-04-13 2024-07-10 Genentech Inc Composiciones farmacéuticas de mosunetuzumab y métodos de uso
AU2023253705A1 (en) 2022-04-13 2024-10-17 F. Hoffmann-La Roche Ag Pharmaceutical compositions of therapeutic proteins and methods of use
WO2023219613A1 (en) * 2022-05-11 2023-11-16 Genentech, Inc. Dosing for treatment with anti-fcrh5/anti-cd3 bispecific antibodies
US20250304706A1 (en) * 2022-05-12 2025-10-02 Astellas Pharma Inc. Anti-taa/anti-cd3 multispecific antibody
TW202423482A (zh) 2022-06-08 2024-06-16 美商泰德治療公司 可電離陽離子脂質和脂質奈米顆粒、及其合成方法和用途
CR20250056A (es) 2022-07-22 2025-03-19 Genentech Inc Moléculas de unión al antígeno anti-steap1 y sus usos.
CN120359244A (zh) * 2022-10-18 2025-07-22 阿迪马布有限责任公司 Ph依赖性抗cd3抗体和与其相关的方法
WO2024088987A1 (en) 2022-10-26 2024-05-02 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy for the treatment of cancer
WO2024094741A1 (en) 2022-11-03 2024-05-10 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy with anti-cd19/anti-cd28 bispecific antibody
EP4619427A1 (en) 2022-11-15 2025-09-24 F. Hoffmann-La Roche AG Recombinant binding proteins with activatable effector domain
CN120603604A (zh) * 2022-11-18 2025-09-05 Jn生物科学有限责任公司 抗cd3抗体
CN120569191A (zh) 2022-11-23 2025-08-29 乔治亚大学研究基金公司 用于增加免疫应答的组合物及其使用方法
PE20252286A1 (es) 2023-01-18 2025-09-18 Genentech Inc Anticuerpos multiespecificos y usos de estos
WO2024191168A1 (ko) * 2023-03-13 2024-09-19 머스트바이오 주식회사 신규한 cd3 결합항체 및 이를 포함한 다중특이 항체
EP4474016A1 (en) 2023-06-07 2024-12-11 Julius-Maximilians-Universität Würzburg Strategies to target extracellularly accessible ras protein
US12319747B2 (en) 2023-07-03 2025-06-03 Medicovestor, Inc. Methods of using anti-SP17 immunotherapeutics
KR20250031973A (ko) 2023-08-30 2025-03-07 (주)제이피오토메이션 반도체 칠러장치용 밸브 모듈
EP4590714A1 (en) 2023-09-21 2025-07-30 Domain Therapeutics Anti-ccr8 monoclonal antibodies and their therapeutic use
WO2025061994A1 (en) 2023-09-21 2025-03-27 Domain Therapeutics Anti-ccr8 monoclonal antibodies and their therapeutic use
US12364777B2 (en) * 2023-10-20 2025-07-22 Medicovestor, Inc. Homodimeric antibodies for use in treating cancers and methods of use
US20250230251A1 (en) 2023-12-20 2025-07-17 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies targeting il-18 receptor beta (il-18rb) and related methods
WO2025131071A1 (zh) * 2023-12-22 2025-06-26 江苏恒瑞医药股份有限公司 靶向cd3的抗体及其应用
US12116410B1 (en) 2023-12-26 2024-10-15 Medicovestor, Inc. Methods of manufacturing dimeric antibodies
US20250242056A1 (en) 2024-01-26 2025-07-31 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for using plasma cell depleting agents and/or b cell depleting agents to suppress host anti-aav antibody response and enable aav transduction and re-dosing
WO2025160340A2 (en) 2024-01-26 2025-07-31 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Combination immunosuppression for inhibiting an immune response and enabling immunogen administration and re-administration
WO2025174825A2 (en) 2024-02-12 2025-08-21 Aera Therapeutics, Inc. Delivery compositions
WO2025184567A1 (en) 2024-03-01 2025-09-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for re-dosing aav using anti-cd40 antagonistic antibody to suppress host anti-aav antibody response
US20250381150A1 (en) 2024-03-08 2025-12-18 Genzyme Corporation Lipid nanoparticles
WO2025199352A2 (en) 2024-03-20 2025-09-25 Juno Therapeutics, Inc. Antibodies specific for solute carrier family 34 member 2 (slc34a2)
WO2025210181A1 (en) 2024-04-04 2025-10-09 Cdr-Life Ag Antigen binding proteins targeting an hla-restricted kk-lc-1 peptide
WO2025215160A1 (en) 2024-04-11 2025-10-16 Cdr-Life Ag Antigen binding proteins targeting an hla-restricted prame peptide
WO2025233264A1 (en) 2024-05-07 2025-11-13 Innate Pharma Use of cd73 blocking agents in combination with anti-cd20 x cd3 t cell engagers
WO2025233266A1 (en) 2024-05-07 2025-11-13 Innate Pharma Use of cd39 blocking agents in combination with anti-cd20 x cd3 t cell engagers
WO2025237931A1 (en) 2024-05-15 2025-11-20 F. Hoffmann-La Roche Ag Recombinant binding proteins with conditionally activatable t cell and nk cell recruiting effector domains
WO2025240670A2 (en) 2024-05-15 2025-11-20 Abalytics Oncology, Inc. Anti-pd-1 antibodies and related binding molecules and methods and uses thereof
GB2641580A (en) 2024-06-07 2025-12-10 T Therapeutics Ltd Tumour-transforming multispecific proteins

Family Cites Families (215)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4675187A (en) 1983-05-16 1987-06-23 Bristol-Myers Company BBM-1675, a new antibiotic complex
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
DE3883899T3 (de) 1987-03-18 1999-04-22 Sb2, Inc., Danville, Calif. Geänderte antikörper.
US4975278A (en) 1988-02-26 1990-12-04 Bristol-Myers Company Antibody-enzyme conjugates in combination with prodrugs for the delivery of cytotoxic agents to tumor cells
WO1989006692A1 (en) 1988-01-12 1989-07-27 Genentech, Inc. Method of treating tumor cells by inhibiting growth factor receptor function
ATE102631T1 (de) 1988-11-11 1994-03-15 Medical Res Council Klonierung von immunglobulin sequenzen aus den variabelen domaenen.
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
AU6290090A (en) 1989-08-29 1991-04-08 University Of Southampton Bi-or trispecific (fab)3 or (fab)4 conjugates
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
CA2095633C (en) 1990-12-03 2003-02-04 Lisa J. Garrard Enrichment method for variant proteins with altered binding properties
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
EP0940468A1 (en) 1991-06-14 1999-09-08 Genentech, Inc. Humanized antibody variable domain
GB9114948D0 (en) 1991-07-11 1991-08-28 Pfizer Ltd Process for preparing sertraline intermediates
FI941572A7 (fi) 1991-10-07 1994-05-27 Oncologix Inc Anti-erbB-2-monoklonaalisten vasta-aineiden yhdistelmä ja käyttömenete lmä
DE69334255D1 (de) 1992-02-06 2009-02-12 Novartis Vaccines & Diagnostic Marker für Krebs und biosynthetisches Bindeprotein dafür
WO1994029351A2 (en) 1993-06-16 1994-12-22 Celltech Limited Antibodies
US5767237A (en) 1993-10-01 1998-06-16 Teikoku Hormone Mfg. Co., Ltd. Peptide derivatives
US5798100A (en) 1994-07-06 1998-08-25 Immunomedics, Inc. Multi-stage cascade boosting vaccine
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
GB9603256D0 (en) 1996-02-16 1996-04-17 Wellcome Found Antibodies
AU751659B2 (en) 1997-05-02 2002-08-22 Genentech Inc. A method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components
US20030068623A1 (en) 1997-06-16 2003-04-10 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
JP2002506353A (ja) 1997-06-24 2002-02-26 ジェネンテック・インコーポレーテッド ガラクトシル化糖タンパク質の方法及び組成物
US6248564B1 (en) 1997-08-29 2001-06-19 Harvard University Mutant MHC class I molecules
WO1999022764A1 (en) 1997-10-31 1999-05-14 Genentech, Inc. Methods and compositions comprising glycoprotein glycoforms
US6610833B1 (en) 1997-11-24 2003-08-26 The Institute For Human Genetics And Biochemistry Monoclonal human natural antibodies
BR9813365A (pt) 1997-12-05 2004-06-15 Scripps Research Inst Método para produção e humanização de um anticorpo monoclonal de rato
PT1068241E (pt) 1998-04-02 2007-11-19 Genentech Inc Variantes de anticorpos e respectivos fragmentos
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
US20030175884A1 (en) 2001-08-03 2003-09-18 Pablo Umana Antibody glycosylation variants having increased antibody-dependent cellular cytotoxicity
DK1071700T3 (da) 1998-04-20 2010-06-07 Glycart Biotechnology Ag Glykosylerings-modifikation af antistoffer til forbedring af antistofafhængig cellulær cytotoksicitet
KR101063278B1 (ko) 1998-08-11 2011-09-07 바이오겐 아이덱 인크. Ｂ-세포 림프종을 치료하기 위한 항-ｃｄ２０ 항체를 포함하는 약제
EP1131093A4 (en) 1998-11-09 2002-05-02 Idec Pharma Corp TREATMENT OF HEMATOLOGICAL VILTIES ASSOCIATED WITH CIRCULATING TUMOR CELLS USING CHIMERIC ANTI-CD20 ANTIBODIES
KR101077001B1 (ko) 1999-01-15 2011-10-26 제넨테크, 인크. 효과기 기능이 변화된 폴리펩티드 변이체
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
AU3672800A (en) 1999-04-09 2000-11-14 Kyowa Hakko Kogyo Co. Ltd. Method for controlling the activity of immunologically functional molecule
EP1229125A4 (en) 1999-10-19 2005-06-01 Kyowa Hakko Kogyo Kk PROCESS FOR PREPARING A POLYPEPTIDE
EP1235847B1 (en) 1999-11-29 2016-01-20 The Trustees of Columbia University in the City of New York ISOLATION OF FIVE NOVEL GENES CODING FOR NEW Fc RECEPTORS-TYPE MELANOMA INVOLVED IN THE PATHOGENESIS OF LYMPHOMA/MELANOMA
US7105149B1 (en) 1999-11-29 2006-09-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Isolation of five novel genes coding for new Fc receptors-type melanoma involved in the pathogenesis of lymphoma/myeloma
CA2393869A1 (en) 1999-12-15 2001-06-21 Genetech,Inc. Shotgun scanning, a combinatorial method for mapping functional protein epitopes
US20040005561A1 (en) 2000-03-01 2004-01-08 Corixa Corporation Compositions and methods for the detection, diagnosis and therapy of hematological malignancies
MXPA02010011A (es) 2000-04-11 2003-04-25 Genentech Inc Anticuerpos multivalentes y usos para los mismos.
US7064191B2 (en) 2000-10-06 2006-06-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for purifying antibody
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
HU231090B1 (hu) 2000-10-06 2020-07-28 Kyowa Kirin Co., Ltd. Antitest-kompozíciót termelő sejt
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
US20040018194A1 (en) 2000-11-28 2004-01-29 Francisco Joseph A. Recombinant anti-CD30 antibodies and uses thereof
ES2405944T3 (es) 2000-11-30 2013-06-04 Medarex, Inc. Ácidos nucleicos que codifican las secuencias de inmunoglobulina humana reorganizadas a partir de ratones transcromoscómicos transgénicos zadas
PE20020574A1 (es) 2000-12-06 2002-07-02 Wyeth Corp Anticuerpos humanizados que reconocen el peptido amiloideo beta
CU23007A1 (es) 2001-04-06 2004-12-17 Ct De Inmunologia Molecular Ct De Inmunologia Mole Combinaciones inmunoterapéuticas para el tratamiencombinaciones inmunoterapéuticas para el tratamiento de tumores que sobre-expresan gangliósidos to de tumores que sobre-expresan gangliósidos
US6884869B2 (en) 2001-04-30 2005-04-26 Seattle Genetics, Inc. Pentapeptide compounds and uses related thereto
AU2002314495A1 (en) 2001-06-20 2003-01-02 Prochon Biotech Ltd. Antibodies that block receptor protein tyrosine kinase activation, methods of screening for and uses thereof
JP2005536439A (ja) 2001-09-18 2005-12-02 ジェネンテック・インコーポレーテッド 腫瘍の診断及び治療のための組成物と方法
US20050226869A1 (en) 2001-10-19 2005-10-13 Genentech, Inc. Compositions and methods for the treatment of tumor of hematopoietic origin
US7888478B2 (en) 2002-09-11 2011-02-15 Genentech, Inc. Compositions and methods for the treatment of tumor of hematopoietic origin
WO2005063299A2 (en) 2003-12-24 2005-07-14 Genentech, Inc. Compositions and methods for the treatment of tumor of hematopoietic origin
US7858330B2 (en) 2001-10-19 2010-12-28 Genentech, Inc. Compositions and methods for the treatment of tumor of hematopoietic origin
ATE430580T1 (de) 2001-10-25 2009-05-15 Genentech Inc Glycoprotein-zusammensetzungen
AU2002363939A1 (en) 2001-11-20 2003-06-10 Seattle Genetics, Inc. Treatment of immunological disorders using anti-cd30 antibodies
US20040093621A1 (en) 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
WO2003085102A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cell with depression or deletion of the activity of protein participating in gdp-fucose transport
EP1498491A4 (en) 2002-04-09 2006-12-13 Kyowa Hakko Kogyo Kk METHOD FOR ENHANCING ACTIVITY OF BINDING ANTIBODY COMPOSITION WITH FC GAMMA IIIA RECEPTOR
WO2003084569A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Drug containing antibody composition
JP4832719B2 (ja) 2002-04-09 2011-12-07 協和発酵キリン株式会社 ＦｃγＲＩＩＩａ多型患者に適応する抗体組成物含有医薬
EP1498485A4 (en) 2002-04-09 2006-09-06 Kyowa Hakko Kogyo Kk MODIFIED GENOME CELLS
CA2481837A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Production process for antibody composition
US7435797B2 (en) 2002-04-10 2008-10-14 Genentech, Inc. Anti-HER2 antibody variants
CA2488441C (en) 2002-06-03 2015-01-27 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
WO2004032828A2 (en) 2002-07-31 2004-04-22 Seattle Genetics, Inc. Anti-cd20 antibody-drug conjugates for the treatment of cancer and immune disorders
EP1391213A1 (en) 2002-08-21 2004-02-25 Boehringer Ingelheim International GmbH Compositions and methods for treating cancer using maytansinoid CD44 antibody immunoconjugates and chemotherapeutic agents
US7361740B2 (en) 2002-10-15 2008-04-22 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
CN103833854B (zh) 2002-12-16 2017-12-12 健泰科生物技术公司 免疫球蛋白变体及其用途
US20050079574A1 (en) 2003-01-16 2005-04-14 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
PT1631313E (pt) * 2003-06-05 2015-07-02 Genentech Inc Terapêutica de combinação para distúrbios de células b
CA2542046A1 (en) 2003-10-08 2005-04-21 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Fused protein composition
EP1705251A4 (en) 2003-10-09 2009-10-28 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd PROCESS FOR PRODUCING ANTIBODY COMPOSITION BY RNA INHIBITION OF FUNCTION OF $ G (A) 1,6-FUCOSYLTRANSFERASE
BRPI0416262B1 (pt) 2003-11-05 2022-04-12 Roche Glycart Ag Anticorpo anti-cd20 humano tipo ii humanizado, seu método de produção, seus usos, bem como polinucleotídeo isolado, vetor de expressão e composição farmacêutica
BR122018071808B8 (pt) 2003-11-06 2020-06-30 Seattle Genetics Inc conjugado
JPWO2005053742A1 (ja) 2003-12-04 2007-06-28 協和醗酵工業株式会社 抗体組成物を含有する医薬
AU2005216251B2 (en) 2004-02-23 2011-03-10 Genentech, Inc. Heterocyclic self-immolative linkers and conjugates
GB0404187D0 (en) 2004-02-25 2004-03-31 Biotransformations Ltd Binding agents
MXPA06011199A (es) 2004-03-31 2007-04-16 Genentech Inc Anticuerpos anti-tgf-beta humanizados.
US7785903B2 (en) 2004-04-09 2010-08-31 Genentech, Inc. Variable domain library and uses
WO2005100402A1 (en) 2004-04-13 2005-10-27 F.Hoffmann-La Roche Ag Anti-p-selectin antibodies
BRPI0510883B8 (pt) 2004-06-01 2021-05-25 Genentech Inc composto conjugado de droga e anticorpo, composição farmacêutica, método de fabricação de composto conjugado de droga e anticorpo e usos de uma formulação, de um conjugado de droga e anticorpo e um agente quimioterapêutico e de uma combinação
TWI309240B (en) 2004-09-17 2009-05-01 Hoffmann La Roche Anti-ox40l antibodies
CN101065151B (zh) 2004-09-23 2014-12-10 健泰科生物技术公司 半胱氨酸改造的抗体和偶联物
US20100111856A1 (en) 2004-09-23 2010-05-06 Herman Gill Zirconium-radiolabeled, cysteine engineered antibody conjugates
WO2006039238A2 (en) 2004-09-30 2006-04-13 The Goverment Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Irta2 antibodies and methods of use
US7947839B2 (en) 2004-12-01 2011-05-24 Genentech, Inc. Heterocyclic-substituted bis-1,8 naphthalimide compounds, antibody drug conjugates, and methods of use
US20070134243A1 (en) 2004-12-01 2007-06-14 Gazzard Lewis J Antibody drug conjugates and methods
US20080247944A1 (en) 2005-01-12 2008-10-09 Robert Graziano Irta-2 Antibodies and Their Uses
EP3050963B1 (en) 2005-03-31 2019-09-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Process for production of polypeptide by regulation of assembly
WO2006114115A1 (de) 2005-04-26 2006-11-02 Trion Pharma Gmbh Kombination von antikörpern mit glukokortikoiden zur behandlung von krebs
BRPI0611220A2 (pt) 2005-06-02 2010-08-24 Astrazeneca Ab anticorpos direcionados para cd20 e usos dos mesmos
ES2373080T3 (es) 2005-06-20 2012-01-31 Genentech, Inc. Anticuerpos que se unen al antígeno tat10772 asociado a tumores para el diagnóstico y tratamiento de un tumor.
US8219149B2 (en) 2005-06-29 2012-07-10 Nokia Corporation Mobile communication terminal
KR101607288B1 (ko) * 2005-07-01 2016-04-05 이. 알. 스퀴부 앤드 선즈, 엘.엘.씨. 예정 사멸 리간드 1 (피디-엘1)에 대한 인간 모노클로날 항체
US7612181B2 (en) 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
DK1940881T3 (en) 2005-10-11 2017-02-20 Amgen Res Munich Gmbh COMPOSITIONS WITH ARTICLE CROSS-SPECIFIC ANTIBODIES AND APPLICATIONS THEREOF
WO2007056441A2 (en) 2005-11-07 2007-05-18 Genentech, Inc. Binding polypeptides with diversified and consensus vh/vl hypervariable sequences
WO2007064919A2 (en) 2005-12-02 2007-06-07 Genentech, Inc. Binding polypeptides with restricted diversity sequences
EP1820513A1 (en) 2006-02-15 2007-08-22 Trion Pharma Gmbh Destruction of tumor cells expressing low to medium levels of tumor associated target antigens by trifunctional bispecific antibodies
AR059900A1 (es) * 2006-03-17 2008-05-07 Genentech Inc Anticuerpos anti-tat226 e inmunoconjugados
CA2646965C (en) 2006-03-24 2016-06-21 Jonathan H. Davis Engineered heterodimeric protein domains
AR060871A1 (es) 2006-05-09 2008-07-16 Genentech Inc Union de polipeptidos con supercontigos optimizados
EP2418223A3 (en) * 2006-06-12 2013-01-16 Emergent Product Development Seattle, LLC Single-chain multivalent binding proteins with effector function
US20080226635A1 (en) 2006-12-22 2008-09-18 Hans Koll Antibodies against insulin-like growth factor I receptor and uses thereof
WO2008109533A2 (en) 2007-03-02 2008-09-12 Medarex, Inc. Human antibodies that bind multiple irta family proteins, and uses thereof
FI2155783T4 (fi) 2007-04-03 2022-12-15 Lajien välisesti spesifinen cd3-epsilon-sitoutumisdomeeni
CA2682626A1 (en) * 2007-04-03 2008-10-09 Micromet Ag Cross-species-specific bispecific binders
HUE040467T2 (hu) 2007-04-03 2019-03-28 Amgen Res Munich Gmbh Keresztfaj-specifikus kötõdomén
ES2390243T3 (es) 2007-04-03 2012-11-07 Amgen Research (Munich) Gmbh Agentes de unión biespecíficos específicos de especies cruzadas
CN100592373C (zh) 2007-05-25 2010-02-24 群康科技(深圳)有限公司 液晶显示面板驱动装置及其驱动方法
CA3128656A1 (en) 2007-08-22 2009-02-26 The Regents Of The University Of California Activatable binding polypeptides and methods of identification and use thereof
EP2225275A4 (en) 2007-11-28 2013-04-03 Medimmune Llc PROTEIN FORMULATION
BRPI0820604A2 (pt) 2007-12-21 2017-05-09 Genentech Inc método de purificação de um anticorpo cd20, cristal de um anticorpo cd20, composição e método destinado ao tratamento de uma condição ou doença associada ao cd20
EP2238169A1 (en) 2007-12-26 2010-10-13 Biotest AG Method of decreasing cytotoxic side-effects and improving efficacy of immunoconjugates
US8742076B2 (en) 2008-02-01 2014-06-03 Genentech, Inc. Nemorubicin metabolite and analog reagents, antibody-drug conjugates and methods
WO2009106096A1 (en) * 2008-02-27 2009-09-03 Fresenius Biotech Gmbh Treatment of resistant tumors with trifunctional antibodies
AR072804A1 (es) 2008-07-15 2010-09-22 Genentech Inc Conjugados derivados de antraciclina,proceso para su preparacion,composiciones farmaceuticas que los contienen y su uso como agentes antitumorales.
US8895702B2 (en) 2008-12-08 2014-11-25 City Of Hope Development of masked therapeutic antibodies to limit off-target effects; application to anti-EGFR antibodies
US20110178279A1 (en) 2009-08-03 2011-07-21 Williams John C Development of masked therapeutic antibodies to limit off-target effects: application to anti-egfr antibodies
US20100189727A1 (en) 2008-12-08 2010-07-29 Tegopharm Corporation Masking Ligands For Reversible Inhibition Of Multivalent Compounds
EP2414399A1 (en) 2009-04-01 2012-02-08 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-fcrh5 antibodies and immunoconjugates and methods of use
CA2756988A1 (en) 2009-04-01 2010-10-07 Genentech, Inc. Anti-fcrh5 antibodies and immunoconjugates
EP2424567B1 (en) * 2009-04-27 2018-11-21 OncoMed Pharmaceuticals, Inc. Method for making heteromultimeric molecules
MX368932B (es) * 2009-06-26 2019-10-22 Regeneron Pharma Anticuerpos biespecificos facilmente aislados con formato de inmunoglobulina original.
US9493578B2 (en) 2009-09-02 2016-11-15 Xencor, Inc. Compositions and methods for simultaneous bivalent and monovalent co-engagement of antigens
JP2013505707A (ja) 2009-09-25 2013-02-21 上海抗体薬物国家工程研究中心有限公司 コンピュータ支援設計により高親和性の抗体又はタンパク質分子を得る方法
SI2519543T1 (sl) 2009-12-29 2016-08-31 Emergent Product Development Seattle, Llc Beljakovine, ki se vežejo s heterodimeri in njihova uporaba
US20130129723A1 (en) 2009-12-29 2013-05-23 Emergent Product Development Seattle, Llc Heterodimer Binding Proteins and Uses Thereof
TWI653333B (zh) 2010-04-01 2019-03-11 安進研究（慕尼黑）有限責任公司 跨物種專一性之ＰＳＭＡｘＣＤ３雙專一性單鏈抗體
BR112012026213B1 (pt) 2010-04-15 2021-12-28 Medimmune Limited Compostos de pirrolobenzodiazepinas, conjugado das mesmas, composição farmacêutica compreendendo o conjugado e uso do mesmo para o tratamento de uma doença proliferativa
US9150663B2 (en) 2010-04-20 2015-10-06 Genmab A/S Heterodimeric antibody Fc-containing proteins and methods for production thereof
WO2011143545A1 (en) * 2010-05-14 2011-11-17 Rinat Neuroscience Corporation Heterodimeric proteins and methods for producing and purifying them
WO2011147986A1 (en) * 2010-05-27 2011-12-01 Genmab A/S Monoclonal antibodies against her2
JP6082344B2 (ja) 2010-05-27 2017-02-15 ゲンマブ エー／エス Ｈｅｒ２エピトープに対するモノクローナル抗体
US9193791B2 (en) 2010-08-03 2015-11-24 City Of Hope Development of masked therapeutic antibodies to limit off-target effects
RU2013110876A (ru) 2010-08-24 2014-09-27 Рош Гликарт Аг Активируемые биспецифические антитела
US8962804B2 (en) 2010-10-08 2015-02-24 City Of Hope Meditopes and meditope-binding antibodies and uses thereof
RU2604490C2 (ru) 2010-11-05 2016-12-10 Займворкс Инк. ДИЗАЙН УСТОЙЧИВОГО ГЕТЕРОДИМЕРНОГО АНТИТЕЛА С МУТАЦИЯМИ В Fc ДОМЕНЕ
ES2842937T3 (es) 2010-11-10 2021-07-15 Amgen Res Munich Gmbh Prevención de efectos adversos provocados por dominios de unión específicos de CD3
TWI807362B (zh) 2010-11-30 2023-07-01 日商中外製藥股份有限公司 細胞傷害誘導治療劑
CA2818635C (en) 2010-12-06 2021-06-15 National Reseach Council Of Canada Antibodies selective for cells presenting erbb2 at high density
US10689447B2 (en) * 2011-02-04 2020-06-23 Genentech, Inc. Fc variants and methods for their production
JP6101638B2 (ja) 2011-03-03 2017-03-22 ザイムワークス，インコーポレイテッド 多価ヘテロマルチマー足場設計及び構築物
WO2012123949A1 (en) 2011-03-17 2012-09-20 Ramot At Tel-Aviv University Ltd. Bi- and monospecific, asymmetric antibodies and methods of generating the same
EA201791693A1 (ru) 2011-03-25 2018-05-31 Гленмарк Фармасьютикалс С.А. Гетеродимерные иммуноглобулины
HUE041335T2 (hu) 2011-03-29 2019-05-28 Roche Glycart Ag Antitest FC-variánsok
US20140170148A1 (en) 2011-04-20 2014-06-19 Genmab A/S Bispecific antibodies against her2
CN103796677B (zh) 2011-04-20 2019-08-16 健玛保 针对her2和cd3的双特异性抗体
CN107936121B (zh) 2011-05-16 2022-01-14 埃泰美德(香港)有限公司 多特异性fab融合蛋白及其使用方法
SG195072A1 (en) 2011-05-21 2013-12-30 Macrogenics Inc Cd3-binding molecules capable of binding to human and non-human cd3
EP2578230A1 (en) 2011-10-04 2013-04-10 Trion Pharma Gmbh Removal of Tumor Cells from Intraoperative Autologous Blood Salvage
US10851178B2 (en) 2011-10-10 2020-12-01 Xencor, Inc. Heterodimeric human IgG1 polypeptides with isoelectric point modifications
AU2012362378B2 (en) * 2011-12-27 2016-06-23 Dcb-Usa Llc Light chain-bridged bispecific antibody
GB201203442D0 (en) 2012-02-28 2012-04-11 Univ Birmingham Immunotherapeutic molecules and uses
MX353382B (es) 2012-03-01 2018-01-10 Amgen Res Munich Gmbh Moleculas de union polipeptido de larga duracion.
JP6514103B2 (ja) 2012-07-06 2019-05-15 ゲンマブ ビー．ブイ． 三重変異を有する二量体タンパク質
US20150203591A1 (en) 2012-08-02 2015-07-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mutivalent antigen-binding proteins
WO2014028560A2 (en) 2012-08-14 2014-02-20 Ibc Pharmaceuticals, Inc. T-cell redirecting bispecific antibodies for treatment of disease
JOP20200236A1 (ar) 2012-09-21 2017-06-16 Regeneron Pharma الأجسام المضادة لمضاد cd3 وجزيئات ربط الأنتيجين ثنائية التحديد التي تربط cd3 وcd20 واستخداماتها
CN120365432A (zh) 2012-11-21 2025-07-25 武汉友芝友生物制药股份有限公司 双特异性抗体
RU2692773C2 (ru) 2012-11-30 2019-06-27 Ф.Хоффманн-Ля Рош Аг Идентификация пациентов, нуждающихся в совместной терапии с использованием ингибитора pd-l1
US10131710B2 (en) 2013-01-14 2018-11-20 Xencor, Inc. Optimized antibody variable regions
US10968276B2 (en) 2013-03-12 2021-04-06 Xencor, Inc. Optimized anti-CD3 variable regions
JO3529B1 (ar) 2013-02-08 2020-07-05 Amgen Res Munich Gmbh مضاد التصاق خلايا الدم البيض من أجل التخفيف من الاثار السلبية الممكنة الناتجة عن مجالات ارتباط cd3- المحدد
DK2956175T3 (da) 2013-02-15 2017-11-27 Univ California Kimærisk antigenreceptor og fremgangsmåder til anvendelse deraf
WO2014153164A1 (en) 2013-03-14 2014-09-25 The California Institute For Biomedical Research Targeting agent antibody conjugates and uses thereof
US20140302037A1 (en) 2013-03-15 2014-10-09 Amgen Inc. BISPECIFIC-Fc MOLECULES
AU2014229282B2 (en) 2013-03-15 2017-02-02 Glaxosmithkline Intellectual Property (No.2) Limited Low concentration antibody formulations
CN105189544A (zh) 2013-04-19 2015-12-23 科瓦根股份公司 具有抗肿瘤活性的新颖的双特异性结合分子
US10633453B2 (en) 2013-05-28 2020-04-28 Kaohsiung Medical University Antibody locker for the inactivation of protein drug
SG11201509361TA (en) 2013-05-28 2015-12-30 Numab Ag Novel antibodies
AR096687A1 (es) 2013-06-24 2016-01-27 Genentech Inc Anticuerpos anti-fcrh5
CN105531374A (zh) 2013-07-12 2016-04-27 酵活有限公司 双特异性cd3和cd19抗原结合构建体
HRP20220553T1 (hr) 2013-07-25 2022-06-10 Cytomx Therapeutics Inc. Polispecifična protutijela, polispecifična protutijela koja se mogu aktivirati i postupci uporabe navedenih protutijela
JP2016538275A (ja) 2013-11-04 2016-12-08 グレンマーク ファーマシューティカルズ， エセ．アー． Ｔ細胞再標的化ヘテロ二量体免疫グロブリン（ｈｅｔｅｒｏ−ｄｉｍｅｒｉｃ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）の製造
PL3074424T3 (pl) 2013-11-27 2025-06-09 Zymeworks Bc Inc. Bispecyficzne konstrukty wiążące antygen ukierunkowane na her2
MY189089A (en) 2013-12-17 2022-01-25 Genentech Inc Methods of treating cancers using pd-1 axis binding antagonists and taxanes
CN112390883A (zh) 2013-12-17 2021-02-23 基因泰克公司 抗cd3抗体及使用方法
TWI754319B (zh) 2014-03-19 2022-02-01 美商再生元醫藥公司 用於腫瘤治療之方法及抗體組成物
TN2016000525A1 (en) 2014-05-29 2018-04-04 Macrogenics Inc Tri-specific binding molecules and methods of use thereof
US9611325B2 (en) 2014-07-21 2017-04-04 Wuhan Yzy Biopharma Co., Ltd. Construction and application of bispecific antibody HER2xCD3
WO2016014974A2 (en) 2014-07-25 2016-01-28 Cytomx Therapeutics, Inc. Anti-cd3 antibodies, activatable anti-cd3 antibodies, multispecific anti-cd3 antibodies, multispecific activatable anti-cd3 antibodies, and methods of using the same
RU2017105849A (ru) 2014-07-25 2018-08-29 Мемориал Слоан Кеттеринг Кэнсер Сентер Биспецифические молекулы, связывающие her2 и cd3
MA40510A (fr) 2014-08-04 2017-06-14 Hoffmann La Roche Molécules bispécifiques de liaison à l'antigène activant les lymphocytes t
WO2016019969A1 (en) 2014-08-08 2016-02-11 Ludwig-Maximilians-Universität München Subcutaneously administered bispecific antibodies for use in the treatment of cancer
WO2016036678A1 (en) 2014-09-02 2016-03-10 Medimmune, Llc Formulations of bispecific antibodies
MA40764A (fr) 2014-09-26 2017-08-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Agent thérapeutique induisant une cytotoxicité
EP3699198B1 (en) 2014-11-17 2025-03-26 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for tumor treatment using cd3xcd20 bispecific antibody
SG11201704449VA (en) 2014-12-05 2017-06-29 Genentech Inc ANTI-CD79b ANTIBODIES AND METHODS OF USE
WO2016110576A1 (en) 2015-01-08 2016-07-14 Genmab A/S Bispecific antibodies against cd3 and cd20
KR102790523B1 (ko) 2015-02-24 2025-04-02 바이오아트라, 인코퍼레이티드 조건부 활성 생체 단백질
WO2016135239A1 (en) 2015-02-25 2016-09-01 Biotecnol Limited Fusion protein comprising three binding domains to her2
EP3778640A1 (en) 2015-05-01 2021-02-17 Genentech, Inc. Masked anti-cd3 antibodies and methods of use
SI3303400T1 (sl) 2015-05-28 2021-01-29 Genentech, Inc. Na celicah osnovan test za detektiranje anti-CD3 homodimerov
CN107708741A (zh) 2015-06-12 2018-02-16 免疫医疗公司 用嵌合抗原受体(car)构建体和表达car构建体的t细胞(car‑t)或nk细胞(car‑nk)进行的疾病疗法
WO2016204966A1 (en) 2015-06-16 2016-12-22 Genentech, Inc. Anti-cd3 antibodies and methods of use
CN107847568B (zh) 2015-06-16 2022-12-20 豪夫迈·罗氏有限公司 抗cll-1抗体和使用方法
EP3310814B1 (en) 2015-06-16 2023-08-02 F. Hoffmann-La Roche AG Humanized and affinity matured antibodies to fcrh5 and methods of use
KR20180012859A (ko) 2015-06-17 2018-02-06 제넨테크, 인크. 항-her2 항체 및 이용 방법
WO2016210447A1 (en) 2015-06-26 2016-12-29 University Of Southern California Masking chimeric antigen receptor t cells for tumor-specific activation
KR102850929B1 (ko) 2015-12-09 2025-08-27 에프. 호프만-라 로슈 아게 항-약물 항체의 형성을 감소시키기 위한 ii형 항-cd20 항체
WO2017132279A1 (en) 2016-01-25 2017-08-03 Genentech, Inc. Methods for assaying t-cell dependent bispecific antibodies
KR20190074300A (ko) 2016-11-15 2019-06-27 제넨테크, 인크. 항-cd20/항-cd3 이중특이적 항체에 의한 치료를 위한 투약
US10561686B2 (en) 2018-01-12 2020-02-18 Innovative Cellular Therapeutics CO., LTD. Modified cell expansion and uses thereof
US20200339686A1 (en) 2018-01-16 2020-10-29 Lakepharma, Inc. Bispecific antibody that binds cd3 and another target

Also Published As

Publication number Publication date
JP7418501B2 (ja) 2024-01-19
IL302303A (en) 2023-06-01
SG11201604990PA (en) 2016-07-28
SI3083689T1 (sl) 2020-10-30
TWI701261B (zh) 2020-08-11
HRP20201144T1 (hr) 2020-10-30
IL245945B (en) 2020-11-30
HUS2200041I1 (hu) 2022-09-28
EP3736292A1 (en) 2020-11-11
DK3192812T3 (da) 2020-07-13
SG10201800250XA (en) 2018-02-27
PL3736292T3 (pl) 2024-09-23
US20200299409A1 (en) 2020-09-24
HRP20240939T1 (hr) 2024-10-25
JP6449295B2 (ja) 2019-01-09
SI3192812T1 (sl) 2020-10-30
KR102433591B1 (ko) 2022-08-18
PT3083689T (pt) 2020-08-27
CN106029696A (zh) 2016-10-12
HUE067282T2 (hu) 2024-10-28
FR22C1048I2 (fr) 2023-11-17
BR112016014022A2 (pt) 2019-10-01
US10640572B2 (en) 2020-05-05
JP2021006042A (ja) 2021-01-21
BR122021025087B1 (pt) 2023-04-04
ES2986082T3 (es) 2024-11-08
CA2932288A1 (en) 2015-06-25
JP2018082698A (ja) 2018-05-31
TW202118786A (zh) 2021-05-16
EP4410315A3 (en) 2024-10-30
EP3192812A1 (en) 2017-07-19
PL3192812T3 (pl) 2020-10-19
IL263466A (en) 2019-01-31
EP3736292B1 (en) 2024-05-08
KR20220116581A (ko) 2022-08-23
CL2016001556A1 (es) 2017-02-03
LT3083689T (lt) 2020-08-10
PL3083689T3 (pl) 2020-10-19
FI3736292T3 (fi) 2024-07-19
TWI747385B (zh) 2021-11-21
MX2016007958A (es) 2016-08-03
US11186650B2 (en) 2021-11-30
LTPA2022519I1 (sr) 2022-10-10
KR102357961B1 (ko) 2022-02-08
KR20210028735A (ko) 2021-03-12
US20190016823A1 (en) 2019-01-17
RS60443B1 (sr) 2020-07-31
AU2022203605A1 (en) 2022-06-16
KR20250035033A (ko) 2025-03-11
US10865251B2 (en) 2020-12-15
CA3055708C (en) 2023-01-31
BR112016014022B1 (pt) 2023-04-18
PE20161217A1 (es) 2016-11-16
PH12016501186A1 (en) 2016-08-15
JP6526158B2 (ja) 2019-06-05
CA2932288C (en) 2021-11-16
NZ758346A (en) 2021-10-29
KR102225489B1 (ko) 2021-03-10
NZ753232A (en) 2021-10-29
DK3736292T3 (da) 2024-07-22
TW201902932A (zh) 2019-01-16
LT3736292T (lt) 2024-07-25
CN110156893B (zh) 2023-03-03
US20200299408A1 (en) 2020-09-24
FR22C1048I1 (fr) 2022-12-09
US11732054B2 (en) 2023-08-22
ES2813074T3 (es) 2021-03-22
EP3083689A1 (en) 2016-10-26
AU2025226668A1 (en) 2025-09-25
PT3736292T (pt) 2024-07-25
TW201527323A (zh) 2015-07-16
KR20220018628A (ko) 2022-02-15
NL301194I2 (nl) 2023-09-13
IL245945A0 (en) 2016-07-31
AU2020200101A1 (en) 2020-01-30
ES2811923T3 (es) 2021-03-15
ZA201603755B (en) 2023-06-28
UA120753C2 (uk) 2020-02-10
ZA202206078B (en) 2023-11-29
CA3131724A1 (en) 2015-06-25
MX379030B (es) 2025-03-10
IL263466B2 (en) 2023-10-01
JP2017504314A (ja) 2017-02-09
EP4410315A2 (en) 2024-08-07
KR20160098464A (ko) 2016-08-18
NZ721309A (en) 2019-11-29
US12466896B2 (en) 2025-11-11
US20150166661A1 (en) 2015-06-18
US20190112389A1 (en) 2019-04-18
JP2019129831A (ja) 2019-08-08
WO2015095392A1 (en) 2015-06-25
CN112390883A (zh) 2021-02-23
DK3083689T3 (da) 2020-08-03
EP3083689B1 (en) 2020-05-27
US10174124B2 (en) 2019-01-08
SI3736292T1 (sl) 2024-08-30
MX2020001752A (es) 2021-01-15
LT3192812T (lt) 2020-08-10
AU2014364805B2 (en) 2020-01-16
NO2022037I1 (no) 2022-08-24
HUE050159T2 (hu) 2020-11-30
US11530275B2 (en) 2022-12-20
HRP20201143T1 (hr) 2020-10-30
JP2024119828A (ja) 2024-09-03
AU2014364805A1 (en) 2016-06-16
EA201691266A1 (ru) 2017-05-31
US20230002506A1 (en) 2023-01-05
CN106029696B (zh) 2020-07-28
CR20160314A (es) 2016-08-29
LTC3083689I2 (sr) 2024-05-27
EA038933B1 (ru) 2021-11-11
AU2020200101B2 (en) 2022-03-03
CN110156893A (zh) 2019-08-23
CN116041529A (zh) 2023-05-02
BR122021025085B1 (pt) 2023-04-04
IL263466B1 (en) 2023-06-01
MX372658B (es) 2020-05-04
NL301194I1 (sr) 2022-08-24
KR20230132612A (ko) 2023-09-15
US20170204194A1 (en) 2017-07-20
PE20210648A1 (es) 2021-03-26
JP2022137074A (ja) 2022-09-21
SG10201809385RA (en) 2018-11-29
RS60453B1 (sr) 2020-07-31
PT3192812T (pt) 2020-08-28
AU2022203605B2 (en) 2025-06-05
TWI643873B (zh) 2018-12-11
PE20210107A1 (es) 2021-01-19
EP3192812B1 (en) 2020-05-27
JP2022137073A (ja) 2022-09-21
JP6764968B2 (ja) 2020-10-07
CA3055708A1 (en) 2015-06-25
HUE050156T2 (hu) 2020-11-30
UA129760C2 (uk) 2025-07-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7418501B2 (ja) 抗ｃｄ３抗体および使用方法
HK40113554A (en) Anti-cd3 antibodies and methods of use
HK40047393A (en) Anti-cd3 antibodies and methods of use
HK1240252B (en) Anti-cd3 antibodies and methods of use
NZ758555B2 (en) Beta-lactamase inhibitors and uses thereof
NZ758555A (en) Atropine pharmaceutical compositions
HK1240252A1 (en) Anti-cd3 antibodies and methods of use
HK1227038B (zh) 抗cd3抗體及使用方法
HK1230625A1 (en) Anti-cd3 antibodies and methods of use
HK1230625B (en) Anti-cd3 antibodies and methods of use
NZ753232B2 (en) Anti-cd3 antibodies and methods of use