[go: up one dir, main page]

RS60453B1 - Anti-cd3 antitela i postupci upotrebe - Google Patents

Anti-cd3 antitela i postupci upotrebe

Info

Publication number
RS60453B1
RS60453B1 RS20200791A RSP20200791A RS60453B1 RS 60453 B1 RS60453 B1 RS 60453B1 RS 20200791 A RS20200791 A RS 20200791A RS P20200791 A RSP20200791 A RS P20200791A RS 60453 B1 RS60453 B1 RS 60453B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
antibody
cell
cells
bispecific antibody
domain
Prior art date
Application number
RS20200791A
Other languages
English (en)
Inventor
Mark S Dennis
Xiaocheng Chen
Allen J Ebens Jr
Teemu T Junttila
Robert F Kelley
Mary A Mathieu
Liping L Sun
Original Assignee
Genentech Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=52394341&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS60453(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Genentech Inc filed Critical Genentech Inc
Publication of RS60453B1 publication Critical patent/RS60453B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/56—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids
    • A61K31/57—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms, e.g. pregnane or progesterone
    • A61K31/573—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms, e.g. pregnane or progesterone substituted in position 21, e.g. cortisone, dexamethasone, prednisone or aldosterone
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6881—Cluster-antibody conjugates, i.e. the modifying agent consists of a plurality of antibodies covalently linked to each other or of different antigen-binding fragments covalently linked to each other
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/08—Vasodilators for multiple indications
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2827—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against B7 molecules, e.g. CD80, CD86
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/283—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against Fc-receptors, e.g. CD16, CD32, CD64
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2887—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD20
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/522—CH1 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/524—CH2 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/526—CH3 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/54—F(ab')2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/71—Decreased effector function due to an Fc-modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)

Description

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na antitela protiv klastera diferencijacije 3 (CD3) i na postupke njihove upotrebe.
STANJE TEHNIKE
[0002] Poremećaje proliferacije ćelija, poput raka, karakteriše nekontrolisan rast ćelijskih sub-populacija. Oni su vodeći uzrok smrti u razvijenom svetu i drugi vodeći uzrok smrti u zemljama u razvoju, uz dijagnostikovanih preko 12 miliona novih slučajeva raka i 7 miliona smrtnih slučajeva od raka svake godine. National Cancer Institute procenjuje da će više od pola miliona Amerikanaca umreti od raka u 2013. godini, što predstavlja skoro jedan od svaka četiri smrtna slučaja u zemlji. Kako je starija populacija rasla, tako su se povećale i pojave raka, jer je verovatnoća da će se razviti rak više nego dvostruko veća nakon sedamdesete godine. Briga o pacijentima koji imaju rak tako predstavlja značajan i sve veći društveni teret.
[0003] Dugogodišnji pristupi tretmana raka uključuju hemoterapiju, zračenje i operaciju uklanjanja čvrstih tumora. Nedavno su razvijene imunoterapije zasnovane na bispecifičnim antitelima. Takva bispecifična antitela su sposobna da istovremeno vezuju ćelijske površinske antigene na citotoksičnim ćelijama i tumorskim ćelijama, sa namerom da vezana citotoksična ćelija uništi povezanu ćeliju tumora. WO 2008/119566 obelodanjuje bispecifične molekule koji se vezuje za CD3ε, I n. pr. HER2. WO 2011/131746 opisuje proteine koji sadrže heterodimerno antitelo-Fc, kao što su bispecifična antitela, uključujući heterodimerna antitela koja sadrže Fc. Postojeća bispecifična antitela koja su trenutno podvrgnuta kliničkim ispitivanjima za tretman raka ograničena su kratkim polu-životom i/ili varijabilnom efikasnošću. Zbog toga u oblasti postoji nezadovoljena potreba za razvojem efikasnih bispecifičnih antitela za upotrebu u tretmanu raka.
SAŽETAK
[0004] Predmet pronalaska je definisan u priloženim patentnim zahtevima. Predmetni pronalazak se odnosi na antitela protiv klastera diferencijacije 3 (CD3) i njihove upotrebe kako je definisano u priloženim patentnim zahtevima.
[0005] U jednom aspektu, pronalazak sadrži anti-CD3 antitelo koje je bispecifično antitelo; gde bispecifično antitelo sadrži anti-CD3 krak koji obuhvata prvi vezujući domen koji sadrži (a) VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 184 i (b) VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 185, i anti-HER2 krak koji obuhvata drugi vezujući domen koji sadrži (a) VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 270 i (b) VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID BR: 271.
[0006] U nekim otelotvorenjima, vezujući domen anti-CD3 antitela se vezuje za ljudski CD3 polipeptid ili CD3 polipeptid cinomolgus majmuna (cino). U nekim otelotvorenjima, ljudski CD3 polipeptid ili cino CD3 polipeptid je ljudski CD3ε polipeptid, odnosno cino CD3ε polipeptid, respektivno. U nekim otelotvorenjima, ljudski CD3 polipeptid ili cino CD3 polipeptid je ljudski CD3γ polipeptid, odnosno cino CD3γ polipeptid, respektivno.
[0007] U nekim otelotvorenjima, anti-CD3 antitela mogu sadržati mutaciju mesta aglikozilacije. U nekim otelotvorenjima, mutacija mesta aglikozilacije je supstituciona mutacija. U nekim otelotvorenjima, supstituciona mutacija je na aminokiselinskim ostacima N297, L234, L235 i/ili D265 (EU numeracija). U nekim otelotvorenjima, supstituciona mutacija je izabrana iz grupe koja se sastoji od N297G, N297A, L234A, L235A i D265A. U nekim otelotvorenjima, supstituciona mutacija je N297G mutacija. U nekim otelotvorenjima, mutacija mesta aglikozilacije smanjuje efektorsku funkciju anti-CD3 antitela. U nekim otelotvorenjima, mutacija mesta aglikozilacije smanjuje efektorsku funkciju anti-CD3 antitela. U nekim otelotvorenjima, anti-CD3 antitelo sadrži supstitucionu mutaciju u Fc regionu koja smanjuje efektorsku funkciju.
[0008] U nekim otelotvorenjima, anti-CD3 antitela mogu biti monoklonska, humanizovana ili himerna. U nekim otelotvorenjima, anti-CD3 antitela mogu biti fragment antitela koji vezuje CD3. U nekim otelotvorenjima, fragment antitela je izabran iz grupe koja se sastoji od Fab, Fab'-SH, Fv, scFv i (Fab')2fragmenata. U drugim otelotvorenjima, anti-CD3 antitelo je antitelo pune dužine. U nekim otelotvorenjima, anti-CD3 antitelo je IgG antitelo (npr., IgG1, IgG2 ili IgG3 antitelo). U nekim otelotvorenjima, anti-CD3 antitelo je Bispecific T-Cell Engager (BiTE®) antitelo.
[0009] U nekim otelotvorenjima ovog obelodanjenja, tumor antigen je HER2, a drugi vezujući domen sadrži sledećih šest HVR-ova: (a) HVR-Hl koji sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID NO: 169; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 170; (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 171; (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 172; (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 173; i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 174. U nekim otelotvorenjima VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 270. U nekim otelotvorenjima VL domen sadrži aminokiselinu sekvenca SEQ ID NO: 271.
[0010] U nekim otelotvorenjima, anti-CD3 antitela mogu sadržati jedan ili više konstantnih domena teškog lanca, gde su jedan ili više domena konstantnih teških lanaca izabrani od prvog CH1 (CH11) domena, prvog CH2 (CH21) domena, prvog CH3 (CH31) domena, drugog CH1 (CH12) domena, drugog CH2 (CH22) domena i drugog CH3 (CH32) domena. U nekim otelotvorenjima, bar jedan od jednog ili više konstantnih domena teškog lanca uparen je sa drugim konstantnim domenom teškog lanca. U nekim otelotvorenjima, CH31i CH32domeni sadrže ispupčenje ili šupljinu, i ispupčenje ili šupljina u CH31domenu su pozicionirani u šupljini ili ispupčenju u CH32domenu. U nekim otelotvorenjima CH31i CH32domeni se susreću na spoju između navedenog ispupčenja i šupljine. U nekim otelotvorenjima, CH21i CH22domeni sadrži ispupčenje ili šupljinu, i ispupčenje ili šupljina u CH21domen su pozicionirani u šupljini ili ispupčenju u CH22domenu. U nekim otelotvorenjima CH21i CH22domeni se susreću na spoju između navedenog ispupčenja i šupljine.
[0011] U nekim otelotvorenjima, polu-život bilo kog od prethodnih anti-CD3 antitela može biti oko 7 dana.
[0012] U nekim otelotvorenjima, pronalazak sadrži imunokonjugat koji sadrži anti-CD3 antitela konjugovana sa citotoksičnim agensom. Takođe je pružena smeša koja sadrži anti-CD3 antitela. U nekim otelotvorenjima, sastav dalje sadrži farmaceutski prihvatljiv nosač, ekscipijens ili razblaživač. U nekim otelotvorenjima, smeša je farmaceutski sastav. U nekim otelotvorenjima, sastav dalje sadrži antagonist koji vezuje PD-1 osu ili dodatni terapeutski agens. U drugom aspektu, pronalazak sadrži izolovanu nukleinsku kiselinu koja kodira bilo koje od ovde opisanih anti-CD3 antitela, koja sadrže vektor (npr. vektor eksprimiranja) za eksprimiranje antitela.
[0013] U drugom aspektu, pronalazak sadrži ćelije domaćine koji sadrže prethodne nukleinske kiseline i/ili vektore. U nekim otelotvorenjima ćelija domaćin je sisarska ćelija (npr. ćelija jajnika kineskog hrčka (CHO)). U drugim otelotvorenjima, ćelija domaćin je prokariotska ćelija (npr. E. Coli ćelija). Takođe je pružen postupak proizvodnje bilo kog od prethodnih anti-CD3 antitela, gde postupak uključuje kultivaciju ćelije domaćina koja proizvodi anti-CD3 antitelo i prikupljanje anti-CD3 antitela iz ćelije domaćina ili medijuma za kulturu.
[0014] U nekim aspektima, anti-CD3 antitela mogu biti upotrebljena kao lek. U nekim otelotvorenjima, anti-CD3 antitela mogu se koristiti za tretman ili odlaganje progresije poremećaja proliferacije ćelija kod pacijenta koji ima potrebu za tim. U nekim otelotvorenjima, anti-CD3 antitela mogu biti upotrebljena za pojačavanje imune funkcije kod pacijenta koji ima poremećaj proliferacije ćelija.
[0015] Naredni aspekt obelodanjenja je postupak tretmana ili odlaganja progresije poremećaja proliferacije ćelija ili autoimunog poremećaja kod pacijenta koji ima potrebu za tim, gde postupak uključuje primenu pacijentu efektivne količine bilo kog od prethodnih anti-CD3 antitela. U drugom aspektu, pronalazak sadrži bilo koje od prethodnih anti-CD3 antitela za upotrebu u postupku pojačavanja imunih funkcija kod pacijenta koji ima poremećaj proliferacije ćelija ili autoimuni poremećaj, gde postupak uključuje primenu pacijentu navedenih anti-CD3 antitela. U nekim otelotvorenjima, anti-CD3 antitelo se vezuje za (a) CD3 molekul koji se nalazi na imunoj efektorskoj ćeliji i (b) drugi biološki molekul smešten na ciljanoj ćeliji koja nije ćelija imunog efektora. U nekim otelotvorenjima, anti-CD3 antitelo aktivira imunu efektorsku ćeliju posle vezivanja za (a) i (b). U nekim otelotvorenjima, aktivirana ćelija imunog efektora je sposobna da eksprimira citotoksični efekat i/ili apoptotički efekat na ciljanu ćeliju. U nekim otelotvorenjima, anti-CD3 antitelo se primenjuje pacijentu u dozi od oko 0,01 mg/kg do oko 10 mg/kg. U nekim otelotvorenjima, anti-CD3 antitelo se primenjuje pacijentu u dozi od oko 0,1 mg/kg do oko 10 mg/kg. U nekim otelotvorenjima, anti-CD3 antitelo se primenjuje pacijentu u dozi od oko 1 mg/kg. U nekim otelotvorenjima, anti-CD3 antitelo se primenjuje subkutano, intravenski, intramuskularno, topikalno, oralno, transdermalno, intraperitonealno, intraorbitalno, implantacijom, inhalacijom, intratekalno, intraventrikularno ili intranazalno. U nekim otelotvorenjima, anti-CD3 antitelo se primenjuje subkutano. U nekim otelotvorenjima, anti-CD3 antitelo se primenjuje intravenski.
[0016] U nekim otelotvorenjima, postupak dalje uključuje primenu pacijentu antagonista koji vezuje PD-1 osu ili dodatnog terapeutskog agensa pacijentu. U nekim otelotvorenjima, dodatni terapeutski agens se primenjuje pre ili posle primene anti-CD3 antitela. U nekim otelotvorenjima, dodatni terapeutski agens se primenjuje istovremeno sa anti-CD3 antitelom. U nekim otelotvorenjima, antagonist koji vezuje PD-1 osu je izabran iz grupe koja se sastoji od antagonista koji vezuje PD-1, antagonista koji vezuje PD-L1 i antagonista koji vezuje PD-L2. U nekim otelotvorenjima, antagonist koji vezuje PD-1 osu je antagonist koji vezuje PD-1. U nekim otelotvorenjima, antagonist koji vezuje PD-1 je izabran iz grupe koja se sastoji od MDX-1106 (nivolumab), MK-3475 (lambrolizumab), CT-011 (pidilizumab) i AMP-224. U drugim otelotvorenjima, antagonist koji vezuje PD-1 osu je antagonist koji vezuje PD-L1. U nekim otelotvorenjima, antagonist koji vezuje PD-L1 je izabran iz grupe koja se sastoji od: YW243.55.S70, MPDL3280A, MDX-1105 i MEDI4736. U drugim otelotvorenjima, antagonist koji vezuje PD-1 osu je antagonist koji vezuje PD-L2. U nekim otelotvorenjima, antagonist koji vezuje PD-L2 je antitelo ili imunoadhezin.
[0017] U nekim otelotvorenjima, anti-CD3 antitelo sadrži anti-HER2 krak koji sadrži N297G supstitucionu mutaciju. U nekim otelotvorenjima, anti-CD3 antitelo sadrži anti-CD3 krak koji sadrži T366S, L368A, Y407V i/ili N297G supstitucionu mutaciju (i) i anti-HER2 krak koji sadrži N297G, N297A, L234A, L235A, i/ili D265A supstitucionu mutaciju. U nekim otelotvorenjima, anti-CD3 antitelo sadrži anti-CD3 krak koji sadrži N297G supstitucionu mutaciju. U nekim otelotvorenjima, anti-CD3 antitelo sadrži anti-HER2 krak koji sadrži T366S, L368A, Y407V i/ili N297G supstitucionu mutaciju (i) i anti-CD3 krak koji sadrži N297G, N297A, L234A, L235A, i/ili D265A supstitucionu mutaciju.
[0018] U nekim otelotvorenjima, postupak dalje uključuje primenu pacijentu glukokortikoida. U nekim otelotvorenjima, glukokortikoid je izabran iz grupe koja se sastoji od deksametazona, hidrokortizona, kortizona, prednizolona, prednizona, metilprednizona, triamcinolona, parametazona, betametazona, fludrokortizona i njihovih farmaceutski prihvatljivih estara, soli i kompleksa. U nekim otelotvorenjima, glukokortikoid je deksametazon. U nekim otelotvorenjima, glukokortikoid je farmaceutski prihvatljiv estar, so ili kompleks deksametazona.
[0019] U nekim otelotvorenjima, postupak dalje uključuje primenu rituksimaba pacijentu.
[0020] U nekim otelotvorenjima, postupak dalje obuhvata primenu obinutuzumaba pacijentu.
[0021] U nekim otelotvorenjima, postupak dalje uključuje primenu antitelo-lek konjugata (ADC) pacijentu.
[0022] U bilo kojoj od prethodnih upotreba, poremećaj proliferacije ćelija može biti rak. U nekim otelotvorenjima, rak je izabran iz grupe koju čine rak dojke, rak debelog creva, rak ne-malih ćelija pluća, ne-Hodžkinov limfom (NHL), limfom B ćelija, leukemija B ćelija, multipli mijelom, raka bubrega, raka prostate rak jetre, rak glave i vrata, melanom, rak jajnika, mezoteliom, glioblastom, germinalno-centralni DLBCL nalik B ćelijama (GCB), aktivirani DLBCL sličan B ćelijama (ABC), folikularni limfom (FL), limfom plaštastih ćelija (MCL), akutna mijeloidna leukemija (AML), hronična limfoidna leukemija (CLL), limfom marginalne zone (MZL), mala limfocitna leukemija (SLL), limfoplazmacitni limfom (LL), Valdenstromova makroglobulinemija (WM), limfom centralnog nervnog sistema (CNSL), Burkitov limfom (BL), prolimfocitna leukemija B-ćelija, limfom marginalne zone slezine, leukemija dlakavih ćelija, limfom/leukemija slezine, ne može da se klasifikuje, limfom malih β-ćelija difuzne crvene pulpe slezine, varijanta leukemije dlakavih ćelija, Valdenstromova makroglobulinemija, bolesti teškog lanca, bolest α teškog lanca, bolest γ teškog lanca, bolest µ teškog lanca, mijelom ćelija plazme, solitarni plazmacitom kosti, ekstraozalni plazmacitom, ekstrastranodalni limfom marginalne zone mukoznog limfnog tkiva (MALT limfom), nodalni limfom marginalne zone, pedijatrijski nodalni limfom marginalne zone, pedijatrijski folikularni limfom, limfom primarnih kožnih folikula, limfom T-ćelija/histiocitima bogatih velikih B-ćelija, primarni DLBCL centralnog nervnog sistema, primarni kožni DLBCL, tip nogu, EBV-pozitivan DLBCL starijih osoba, DLBCL povezan sa hroničnom upalom, limfomatoidna granulomatoza, primarni medijumastinalni (timični) limfom velikih β-ćelija, limfom intravaskularnih velikih β-ćelija, ALK-pozitivan limfom velikih B-ćelija, plazmablastični limfom, limfom velikih β-ćelija nastao u HHV8-povezanoj multicentričnoj Kaslmanovoj bolesti, primarni izlivni limfom: limfom β-ćelija, koji se ne može klasifikovati, sa karakteristikama sredine između difuznog limfoma velikih β-ćelija i Burkitovog limfoma, i limfom βćelija, koji se ne može klasifikovati, sa karakteristikama sredine između difuznog limfoma velikih β-ćelija i klasičnog Hodžkinovog limfoma. U nekim otelotvorenjima, poželjni rak je germinalno-centralni DLBCL nalik B ćelijama (GCB), aktivirani DLBCL sličan B ćelijama (ABC), folikularni limfom (FL), limfom plaštastih ćelija (MCL), akutna mijeloidna leukemija (AML), hronična limfoidna leukemija (CLL), limfom marginalne zone (MZL), mala limfocitna leukemija (SLL), limfoplazmacitni limfom (LL), Valdenstromova makroglobulinemija (WM), limfom centralnog nervnog sistema (CNSL), Burkitov limfom (BL)
[0023] U bilo kojoj od prethodnih primena, autoimuni poremećaj može biti izabran iz grupe koju čine reumatoidni artritis, juvenilni reumatoidni artritis, sistemski eritematozni lupus (SLE), Vegenerova bolest, upalna bolest creva, idiopatska trombocitopenična purpura (ITP), trombocitna trombocitopenična purpura (TTP), autoimuna trombocitopenija, multipla skleroza, psorijaza, IgA nefropatija, IgM polineuropatije, miastenija gravis, vaskulitis, dijabetes melitus, Rejnoov sindrom, Sjorgenov sindrom, glomerulonefritis, neuromijelitis optika (NMO) i IgM neuropatija.
[0024] U drugom aspektu, obelodanjenje obuhvata komplet koji sadrži: (a) sastav koji sadrži bilo koje od prethodnih anti-CD3 antitela i (b) umetak u pakovanju koji sadrži uputstva za primenu sastava pacijentu za tretman ili odlaganje napredovanja poremećaja proliferacije ćelija.
[0025] U bilo kojoj od prethodnih primena, pacijent može biti čovek.
Kratak opis slika
[0026]
Slika 1 prikazuje aminokiselinsku sekvencu jednolančanog ljudskog CD3εγ sa 26-mernim vezivnim sekvencama korišćenim u eksperimentima mapiranja CD3 epitopa (SEQ ID NO: 282).
Slika 2A je tabela koja sumira karakterizaciju odabranih hibridomskih klonova. Tabela sumira rezultate ELISA CD3 eksperimenata vezivanja korišćenjem ljudskog i cino CD3ε<1-27>-Fc; FACS eksperimenata vezivanja koristeći ljudske Jurkat T ćelije, ljudske PBMC i cino PBMC; eksperimenata aktivacije T ćelija korišćenjem FACS analize; i eksperimenata za određivanje izotipa.
Slika 2B je tabela koja sumira afinitete vezivanja (Kd vrednosti) odabranih hibridomskih klonova za komercijalni ljudski CD3εy antigen.
Slika 3A je tabela koja sumira karakterizaciju odabranog hibridoma. Tabela sumira rezultate ELISA CD3 eksperimenata vezivanja korišćenjem ljudskog i cino CD3ε<1-27>-Fc; FACS eksperimenata vezivanja koristeći ljudske Jurkat T ćelije, ljudske PBMC i cino PBMC; Eksperimenata aktivacije T ćelija korišćenjem FACS analize; i eksperimenata za određivanje izotipa.
Slike 3B i 3C su tabele koje sumiraju afinitete vezivanja (Kd vrednosti) odabranih hibridomskih klonova. Slika 4A prikazuje aminokiselinske sekvence varijabilnih domena lakog lanca anti-CD3 antitela. HVR sekvence su ograničene označenim poljima za svako od antitela.
Slika 4B prikazuje aminokiselinske sekvence varijabilnih domena lakog lanca anti-CD3 antitela.
Slika 4C prikazuje aminokiselinske sekvence varijabilnih domena teškog lanca anti-CD3 antitela.
Slika 5A prikazuje aminokiselinske sekvence varijabilnih domena lakog lanca anti-CD3 antitela.
Slika 5B prikazuje aminokiselinske sekvence varijabilnih domena teškog lanca anti-CD3 antitela.
Slika 6A prikazuje aminokiselinske sekvence varijabilnih domena lakog lanca anti-CD3 antitela 21A9 i Rab17.
Slika 6B prikazuje aminokiselinske sekvence varijabilnih domena teškog lanca anti-CD3 antitela 21A9 i Rab17.
Slika 7 je poravnjanje sekvenci varijabilnog domena lakog lanca (gornji) i varijabilnog domena teškog lanca (donji) aminokiselinskih sekvenci anti-CD3 antitela koja pokazuje konsenzus sekvencu, 40G5c, koja je izvedena iz srodnih klonskih antitela.
Slika 8A je poravnjanje sekvenci varijabilnog domena lakog lanca (gornji) i varijabilnog domena teškog lanca (donji) aminokiselinskih sekvenci anti-CD3 antitela 13A3 i njegove humanizovane varijante (hu13A3). Slika 8B je poravnjanje sekvenci varijabilnog domena lakog lanca (gornji) i varijabilnog domena teškog lanca (donji) aminokiselinskih sekvenci anti-CD3 antitela 30A1 i njegove humanizovane varijante (hu30A1). Slika 8C je poravnjanje sekvenci varijabilnog domena lakog lanca (gornji) i varijabilnog domena teškog lanca (donji) aminokiselinskih sekvenci anti-CD3 antitela 41D9a i njegove humanizovane varijante (hu41D9a).
Slika 8D je poravnjanje sekvenci varijabilnog domena lakog lanca (gornji) i varijabilnog domena teškog lanca (donji) aminokiselinskih sekvenci anti-CD3 antitela SP34 i njegove humanizovane varijante (huSP34). Slika 8E je poravnavanje sekvenci varijabilnog domena lakog lanca (gornji) i varijabilnog domena teškog lanca (donji) aminokiselinskih sekvenci anti-CD3 antitela 38E4 i njegove humanizovane varijante (hu38E4). Slika 8F je poravnavanje sekvenci varijabilnog domena lakog lanca (gornji) i varijabilnog domena teškog lanca (donji) aminokiselinskih sekvenci anti-CD3 antitela 40G5 i njegove humanizovane varijante (hu40G5). Slika 9A je tabela koja sumira odabrane humanizovane varijante anti-CD3 antitela 13A3 i njihove afinitete vezivanja, testirane upotrebom komercijalnih CD3ε (Creative Biomart, Shirley, NY; Kataloški broj CD3E-2194H).
Slika 9B je tabela koja sumira odabrane humanizovane varijante anti-CD3 antitela 30A1 i njihove afinitete vezivanja, testirane upotrebom komercijalnih CD3ε (Creative Biomart, Shirley, NY; Kataloški broj CD3E-2194H).
Slika 9C je tabela koja sumira odabrane humanizovane varijante anti-CD3 antitela 41D9a i njihove afinitete vezivanja, testirane upotrebom komercijalnih CD3ε (Creative Biomart, Shirley, NY; Kataloški broj CD3E-2194H).
Slika 9D je tabela koja sumira odabrane humanizovane varijante anti-CD3 antitela SP34 i njihove afinitete vezivanja, testirane upotrebom komercijalnih CD3ε (Creative Biomart, Shirley, NY; Kataloški broj CD3E-2194H).
Slika 9E je tabela koja sumira odabrane humanizovane varijante anti-CD3 antitela 38E4 i njihove afinitete vezivanja, testirane upotrebom komercijalnih CD3ε (Creative Biomart, Shirley, NY; Kataloški broj CD3E-2194H).
Slika 9F je tabela koja sumira odabrane humanizovane varijante anti-CD3 antitela 40G5c i njihove afinitete vezivanja, testirane upotrebom komercijalnih CD3ε (Creative Biomart, Shirley, NY; Kataloški broj CD3E-2194H).
Slika 10 je tabela koja sumira afinitet vezivanja humanizovanih anti-CD3 antitela za različite CD3ε antigene. Slika 11 je tabela koja sumira afinitet vezivanja humanizovanih antitela 38E4v1 do 38E4v1 i 40G5c anti-CD3, merenih koristeći Biacore sa ljudskim CD3εγ na čipu i anti-CD3 antitelima u protoku.
Slika 12A je tabela koja sumira relativne afinitete vezivanja za pojedinačne mutante alanina, serina, treonina ili glutamata humanizovanog anti-CD3 antitela 38E4v1 koje ima jednu mutaciju u HVR-L3 ili u HVR-H3, u poređenju sa 38E4v1 koristeći jedno-ciklusnu ili konvencionalnu multi-ciklusnu kinetičku Biacore analiza. Slika 12B prikazuje HVR-L3 (gornji) i HVR-H3 (donji) aminokiselinske sekvence humanizovanog anti-CD3 antitela 38E4v1.
Slika 13A je serija grafikona koji prikazuju relativno vezivanje označenih anti-CD3 antitela na alaninske varijante CD3ε<1-27>-Fc.
Slika 13B je grafikon koji prikazuje relativni deo CD3εγ alanina mutanata skeniranja fagemida vezanih za anti-CD3 antitela 38E4.v1, 40G5c i SP34.v52 u poređenju sa vezivanjem faga divljeg tipa CD3εγ.
Slika 13C je serija grafikona koji prikazuju relativno vezivanje anti-CD3 antitela 38E4.v1, 40G5c i SP34.v52 za izabrane mutante skeniranja fagemida za alanin CD3εγ kao funkcija koncentracije faga.
Slika 13D je skup tabela koje prikazuju relativne afinitete vezivanja anti-CD3 antitela SP34.v52 i 38E4v1 prema izabranim mutantima za skeniranje alanina CD3εγ, kako je procenjeno koristeći Biacore. NB = nema detektabilnog vezivanja.
Slika 14A prikazuje sekvencu 16-mernog CD3ε polipeptida korišćenog u eksperimentima za kokristalizaciju sa 38E4.v1 Fab.
Slike 14B-14F je serija prikaza kristalne strukture koja pokazuje različite poglede na hu38E4.v1 Fab/CD3ε peptidni kompleks.
Slika 14G je poravnjanje sekvenci varijabilnog domena lakog lanca (gornji) i varijabilnog domena teškog lanca (donji) aminokiselinskih sekvenci anti-CD3 antitela hu40G5c i hu38E4.v1, sa ostacima svakog antitela koji su važni za CD3 vezivanje (dodirni ostaci) okruženog u poravnanju. Otkriveno je da su okruženi ostaci unutar 5 Å od CD3 peptida, što je utvrđeno kristalografskom analizom. Δ označava vernijer položaje (za referencu, pogledati, npr., Foote i Winter. JMB. 224: 487, 1992);*označava FW-HVR interakcije (za referencu, pogledati, npr., Padlan i dr. Mol. Immunol. 31:169, 1994); i • označava VH-VL interakcije (za referencu, pogledati, npr., Padlan i dr. Mol. Immunol.31:169, 1994).
Slika 14H je prikaz kristalne strukture CD3ε polipeptida vezanog od strane hu38E4.v1 Fab. Svi ostaci dodirnih antigena su prikazani žutom bojom. Svi dodirni ostaci su identični između hu38E4.v1 i hu40G5, osim što G96 (prikazan narandžasto) jeste S96 u hu40G5.
Slike 14I i 14J prikazuju dijagram trake kristalnih struktura hu38E4.v1 Fab i SP34v52 Fab, u istoj orijentaciji, prekrivene sa VL regionom sa RMS = 2,24.
Slika 14K predstavlja model popunjavanja prostora za Hu38E4.v1 kompleksiran sa CD3ε N-terminalnim peptidom vezanim u rascepu između teških (plavi) i lakih (ljubičasti) lanaca.
Slika 14L predstavlja prikaz modela popunjavanja prostora za SP34v52 Fab sa CD3ε N-terminalnim peptidom postavljenim u istoj orijentaciji kao u Fab CD3ε/hu38E4.v1 kompleksu prikazanom na Slici 14K. Ostaci R50 i R52 (narandžasti) od HVR-H2 SP34v52 Fab važni su za CD3 vezivanje. Jasni sukobi CD3 peptida sa SP34v52 Fab su označeni strelicama.
Slika 14M predstavlja kristalnu strukturu hu38E4.v1 kompleksiranu sa N-terminalnim peptidom CD3εγ i ilustruje ključne intermolekularne interakcije koje su uključene u prvi ostatak piroglutamina i šesti ostatak (E6) u CD3εγ. Potencijalne vodonične veze prikazane su isprekidanim linijama.
Slika 14N predstavlja modela popunjavanja prostora za Hu38E4.v1 Fab kompleksiran sa CD3εγ N-terminalnim peptidom povezanim u rascepu između teških (plavi) i lakih (ljubičasti) lanaca. Peti ostatak (E5), kao što je prikazano, pokazuje od interaktivnog mesta koje sadrži šesti ostatak (E6) CD3εγ N-terminalnog peptida i Fab kompleks.
Slika 15 prikazuje šematsku generalizaciju formiranja TDB antitela. Navedeni TDB je prikazan u obliku TDB pune dužine u formatu čvor-u-otvoru (KIH), koji može imati mutaciju aglikozilacije, ako ga proizvodi eukariotska ćelija (npr. CHO ćelija). U alternativnom formatu, čvor može biti prisutan na anti-CD3 kraku, dok otvor može biti prisutna i na kraku anti-tumorskog antigena. Ovaj format takođe može imati mutaciju aglikozilacije, ako ga proizvodi eukariotska ćelija (npr. CHO ćelija).
Slika 16 su grafikoni koji pokazuju FACS rezultate in vitro testova vezivanja različitih CD3/CD20 TDB koja imaju različite kombinacije anti-CD3 kraka UCHT serije 1 i anti-CD20 kraka 2H7 serije. Vezivanje Bjab B tumorske ćelijske linije (CD20 vezivanje), levo. Vezivanje Jurkat ćelija (CD3 vezivanje), desno.
Slika 17 je skup tabela koje sumiraju jednovalentni (gornji) i (bivalentni) afinitet vezivanja kao Kd vrednosti za različite CD3/CD20 TDB koja imaju različite kombinacije anti-CD3 kraka UCHT serije 1 i anti-CD20 kraka 2H7 serije.
Slika 18 je grafikon koji prikazuje rezultate FACS testova in vitro vezivanja Jurkat ćelija (CD3 vezivanje) različitih CD3/CD20 TDB koja imaju različite kombinacije anti-CD3 kraka sa anti-CD20 krakom od 2H7v16.
Slika 19 je grafikon koji prikazuje rezultate FACS testova in vitro vezivanja Jurkat ćelija (CD3 vezivanje) različitih CD3/CD20 TDB koja imaju različite kombinacije anti-CD3 kraka sa anti-CD20 krakom od 2H7v16.
Slika 20 je grafikon koji prikazuje rezultate FACS testova in vitro vezivanja Bjab ćelija (CD20 vezivanje) različitih CD3/CD20 TDB koja imaju različite kombinacije anti-CD3 kraka sa anti-CD20 krakom od 2H7v16.
Slike 21A i 21B su grafikoni koji prikazuju rezultate FACS testova in vitro vezivanja Jurkat ćelija (CD3 vezivanje) različitih CD3/CD20 TDB koja imaju različite kombinacije anti-CD3 kraka sa anti-CD20 krakom od 2H7v16.
Slika 21C je tabela koja sumira EC50 (µg/ml) za svaki CD3/CD20 TDB testiran na Slikama 21A i 21B. Slike 22A i 22B su grafikoni koji prikazuju rezultate FACS testova in vitro vezivanja Bjab ćelija (CD20 vezivanje) različitih CD3/CD20 TDB koja imaju različite kombinacije anti-CD3 kraka sa anti-CD20 krakom od 2H7v16.
Slika 23 je grafikon koji prikazuje rezultate FACS testova in vitro vezivanja Jurkat ćelija (CD3 vezivanje) različitih CD3/CD20 TDB koja imaju različite kombinacije anti-CD3 kraka sa anti-CD20 krakom od 2H7v16.
Slika 24 je tabela koja sumira afinitete vezivanja za različite CD3/CD20 TDB i Fab, mereno Biacore analizom sa ljudskim CD3εγ na čipu i CD3/CD20 TDB ili Fab u protoku.
Slika 25A je grafikon koji prikazuje procenat aktiviranja T ćelija, mereno površinskim eksprimiranjem CD69 i CD25, posle 24 sata inkubacije određenog CD3/CD20 TDB (2H7 serija) sa 20.000 Bjab ćelija i 5x prečišćenim hu CD8+ T ćelijama.
Slika 25B je grafikon koji prikazuje procenat Bjab ubijanja u odnosu na kontrolu koja nije tretirana sa TDB, posle 24 sata inkubacije određenog CD3/CD20 TDB (serije 2H7) sa 20.000 Bjab ćelija i 5x prečišćenih huCD8+ T ćelija, mereno FACS analizom.
Slika 26A je grafikon koji prikazuje procenat aktivacije T ćelija, izmeren površinskim eksprimiranjem CD69 i CD25, posle 24 sata inkubacije određenog CD3/CD20 TDB (2H7 serija) sa 200.000 ljudskih PBMC po komorici.
Slika 26B je grafikon koji prikazuje procenat ubijanja endogenih (endo) B ćelija u odnosu na kontrolu koja nije tretirana sa TDB, posle 24 sata inkubacije određenog CD3/CD20 TDB (2H7 serija) sa 200.000 ljudskih PBMC po komorici, mereno FACS analizom.
Slika 27A je grafikon koji prikazuje procenat aktivacije T ćelija, izmeren površinskim eksprimiranjem CD69 i CD25, posle 24 sata inkubacije određenog CD3/CD20 TDB (UCHT1 serija) sa 20.000 Bjab ćelija i 5x prečišćenim Hu CD8+ T ćelijama.
Slika 27B je grafikon koji prikazuje procenat Bjab ubijanja u odnosu na kontrolu koja nije tretirana sa TDB, posle 24 sata inkubacije određenog CD3/CD20 TDB (UCHT1 serija) sa 20.000 Bjab ćelija i 5x prečišćenih huCD8+ T ćelija, mereno FACS analizom.
Slika 28A je grafikon koji prikazuje procenat aktivacije T ćelija, izmeren površinskim eksprimiranjem CD69 i CD25, posle 24 sata inkubacije određenog CD3/CD20 TDB (UCHT1 serija) sa 200.000 ljudskih PBMC po komorici.
Slika 28B je grafikon koji prikazuje procenat ubijanja endo B ćelija u odnosu na kontrolu koja nije tretirana sa TDB posle 24 sata inkubacije određenog CD3/CD20 TDB (UCHT1 serija) sa 200.000 ljudskih PBMC po komorici, mereno FACS analizom.
Slika 29A je grafikon koji prikazuje procenat ubijanja endo B ćelija u odnosu na kontrolu koja nije tretirana sa TDB posle 24 sata inkubacije različitih CD3/CD20 TDB koja imaju različite kombinacije anti-CD3 kraka sa anti-CD20 krakom od 2H7v16, sa 200.000 ljudskih PBMC (izolovanih od donora br. 3) po komorici, mereno FACS analizom.
Slika 29B je grafikon koji prikazuje procenat aktivacije T ćelija, mereno površinskim eksprimiranjem CD69 i CD25, posle 24 sata inkubacije različitih CD3/CD20 TDB koja imaju različite kombinacije anti-CD3 kraka sa anti-CD20 krakom od 2H7v16, sa 200.000 ljudskih PBMC (izolovanih od donora br. 3) po komorici, mereno FACS analizom.
Slika 30A je grafikon koji prikazuje procenat ubijanja endo B ćelija u odnosu na kontrolu koja nije tretirana sa TDB, posle 24 sata inkubacije različitih CD3/CD20 TDB koja imaju različite kombinacije anti-CD3 kraka sa anti-CD20 krakom od 2H7v16, sa 200.000 ljudskih PBMC (izolovanih od donora br. 4) po komorici, mereno FACS analizom.
Slika 30B je grafikon koji prikazuje procenat aktiviranja T ćelija, mereno površinskim eksprimiranjem CD69 i CD25, posle 24 sata inkubacije različitih CD3/CD20 TDB koja imaju različite kombinacije anti-CD3 kraka sa anti-CD20 krakom od 2H7v16, sa 200.000 ljudskih PBMC (izolovanih od donora br. 4) po komorici, mereno FACS analizom.
Slika 31A je grafikon koji prikazuje procenat ubijanja endo B ćelija u odnosu na kontrolu koja nije tretirana sa TDB, posle 24 sata inkubacije različitih CD3/CD20 TDB koja imaju različite kombinacije anti-CD3 kraka sa anti-CD20 krakom od 2H7v16, sa 200.000 cino PBMC (izolovanih od Donora br.2) po komorici, mereno FACS analizom.
Slika 31B je grafikon koji prikazuje procenat aktivacije T ćelija, mereno površinskim eksprimiranjem CD69 i CD25, posle 24 sata inkubacije različitih CD3/CD20 TDB koja imaju različite kombinacije anti-CD3 kraka sa anti-CD20 krakom od 2H7v16, sa 200.000 cino PBMC (izolovanih od Donora br.2) po komorici, mereno FACS analizom.
Slika 32A je grafikon koji prikazuje procenat ubijanja endo B ćelija u odnosu na kontrolu koja nije tretirana sa TDB, posle 24 sata inkubacije različitih CD3/CD20 TDB koja imaju različite kombinacije anti-CD3 kraka sa anti-CD20 krakom od 2H7v16, sa 200.000 cino PBMC (izolovanih od donora br.3) po komorici, mereno FACS analizom.
Slika 32B je grafikon koji prikazuje procenat aktivacije T ćelija, izmeren površinskim eksprimiranjem CD69 i CD25, posle 24 sata inkubacije različitih CD3/CD20 TDB koja imaju različite kombinacije anti-CD3 kraka sa anti-CD20 krakom od 2H7v16, sa 200.000 cino PBMC (izolovanih od donora br.3) po komorici, mereno FACS analizom.
Slika 33A je grafikon koji prikazuje procenat ubijanja Bjab ćelije u odnosu na kontrolu koja nije tretirana sa TDB, posle 24 sata inkubacije različitih CD3/CD20 TDB koja imaju različite kombinacije anti-CD3 kraka sa anti-CD20 krakom od 2H7v16, sa 200.000 cino PBMC po komorici, mereno FACS analizom.
Slika 33B je grafikon koji prikazuje procenat aktiviranja T ćelija, mereno površinskim eksprimiranjem CD69 i CD25, posle 24 sata inkubacije različitih CD3/CD20 TDB koja imaju različite kombinacije anti-CD3 kraka sa anti-CD20 krakom od 2H7v16, sa 200.000 cino PBMC po komorici, mereno FACS analizom.
Slika 34A je grafikon koji prikazuje procenat ubijanja endo B ćelija u odnosu na kontrolu koja nije tretirana sa TDB, posle 24 sata inkubacije različitih CD3/CD20 TDB koja imaju različite kombinacije anti-CD3 kraka sa anti-CD20 krakom od 2H7v16, sa 200.000 ljudskih PBMC (izolovanih od donora br. 2) po komorici, mereno FACS analizom.
Slika 34B je grafikon koji prikazuje procenat aktivacije T ćelija, izmeren površinskim eksprimiranjem CD69 i CD25, posle 24 sata inkubacije različitih CD3/CD20 TDB koja imaju različite kombinacije anti-CD3 kraka sa anti-CD20 krakom od 2H7v16, sa 200.000 ljudskih PBMC (izolovanih od donora br. 2) po komorici, mereno FACS analizom.
Slika 35A je grafikon koji prikazuje procenat ubijanja endo B ćelija u odnosu na kontrolu koja nije tretirana sa TDB, posle 24 sata inkubacije različitih CD3/CD20 TDB koja imaju različite kombinacije anti-CD3 kraka sa anti-CD20 krakom od 2H7v16, sa 200.000 ljudskih PBMC (izolovanih od donora br. 3) po komorici, mereno FACS analizom.
Slika 35B je grafikon koji prikazuje procenat aktiviranja T ćelija, izmeren površinskim eksprimiranjem CD69 i CD25, posle 24 sata inkubacije različitih CD3/CD20 TDB koja imaju različite kombinacije anti-CD3 kraka sa anti-CD20 krakom od 2H7v16, sa 200.000 ljudskih PBMC (izolovanih od donora br. 3) po komorici, mereno FACS analizom.
Slika 36A je grafikon koji prikazuje procenat ubijanja endo B ćelija u odnosu na kontrolu koja nije tretirana sa TDB, posle 24 sata inkubacije različitih CD3/CD20 TDB koja imaju različite kombinacije anti-CD3 kraka sa anti-CD20 krakom od 2H7v16, sa 200.000 ljudskih PBMC (izolovanih od donora br. 4) po komorici, mereno FACS analizom.
Slika 36B je grafikon koji prikazuje procenat aktivacije T ćelija, izmeren površinskim eksprimiranjem CD69 i CD25, posle 24 sata inkubacije različitih CD3/CD20 TDB koja imaju različite kombinacije anti-CD3 kraka sa anti-CD20 krakom od 2H7v16, sa 200.000 ljudskih PBMC (izolovanih od donora br. 4) po komorici, mereno FACS analizom.
Slike 37A i 37B su grafikoni koji pokazuju procenat aktivacije T ćelija, mereno površinskim eksprimiranjem CD69 i CD25, posle 24 sata inkubacije različitih CD3/CD20 TDB koja imaju različite kombinacije anti-CD3 kraka sa anti-CD20 krakom od 2H7v16, sa 200.000 ljudskih PBMC (izolovanih od donora br. 1) po komorici, mereno FACS analizom.
Slika 37C je tabela koja sumira EC50 aktivacije EC8+ T ćelija (ng/ml) za svaki CD3/CD20 TDB testiran na Slikama 37A i 37B.
Slike 38A i 38B su grafikoni koji prikazuju procenat ubijanja endo B ćelija u odnosu na kontrolu koja nije tretirana sa TDB, posle 24 sata inkubacije različitih CD3/CD20 TDB koja imaju različite kombinacije anti-CD3 kraka sa anti-CD20 krakom od 2H7v16, sa 200.000 ljudskih PBMC (izolovanih od donora br. 1) po komorici, mereno FACS analizom.
Slika 38C je tabela koja sumira EC50 ubijanja endo B ćelija (ng/ml) za svaki CD3/CD20 TDB testiran na Slikama 38A i 38B.
Slike 39A i 39B su grafikoni koji pokazuju procenat aktivacije T ćelija, mereno površinskim eksprimiranjem CD69 i CD25, posle 48 sati inkubacije različitih CD3/CD20 TDB koja imaju različite kombinacije anti-CD3 kraka sa anti-CD20 krakom od 2H7v16, sa 200.000 ljudskih PBMC (izolovanih od donora br. 1) po komorici, mereno FACS analizom.
Slika 39C je tabela koja sumira EC50 aktivacije EC8+ T ćelija (ng/ml) za svaki CD3/CD20 TDB testiran na Slikama 39A i 39B.
Slike 40A i 40B su grafikoni koji prikazuju procenat ubijanja endo B ćelija u odnosu na kontrolu koja nije tretirana sa TDB, posle 48 sati inkubacije različitih CD3/CD20 TDB koja imaju različite kombinacije anti-CD3 kraka sa anti-CD20 krakom od 2H7v16, sa 200.000 ljudskih PBMC (izolovanih od donora br. 1) po komorici, mereno FACS analizom.
Slika 40C je tabela koja sumira EC50 ubijanja endo B ćelija (ng/ml) za svaki CD3/CD20 TDB testiran na Slikama 40A i 40B.
Slike 41A i 41B su grafikoni koji pokazuju procenat aktivacije T ćelija, mereno površinskim eksprimiranjem CD69 i CD25, posle 24 sata inkubacije različitih CD3/CD20 TDB koja imaju različite kombinacije anti-CD3 kraka sa anti-CD20 krakom od 2H7v16, sa 200.000 ljudskih PBMC (izolovanih od Donora br. 2) po komorici, mereno FACS analizom.
Slika 41C je tabela koja sumira EC50 aktivacije EC8+ T ćelija (ng/ml) za svaki CD3/CD20 TDB testiran na Slikama 41A i 41B.
Slike 42A i 42B su grafikoni koji prikazuju procenat ubijanja endo B ćelija u odnosu na kontrolu koja nije tretirana sa TDB, posle 24 sata inkubacije različitih CD3/CD20 TDB koja imaju različite kombinacije anti-CD3 kraka sa anti-CD20 krakom od 2H7v16, sa 200.000 ljudskih PBMC (izolovanih od Donora br. 2) po komorici, mereno FACS analizom.
Slika 42C je tabela koja sumira EC50 ubijanja endo B ćelija (ng/ml) za svaki CD3/CD20 TDB testiran na Slikama 42A i 42B.
Slike 43A i 43B su grafikoni koji pokazuju procenat aktivacije T ćelija, mereno površinskim eksprimiranjem CD69 i CD25, posle 48 sati inkubacije različitih CD3/CD20 TDB koja imaju različite kombinacije anti-CD3 kraka sa anti-CD20 krakom od 2H7v16, sa 200.000 ljudskih PBMC (izolovanih od Donora br. 2) po komorici, mereno FACS analizom.
Slika 43C je tabela koja sumira EC50 aktivacije EC8+ T ćelija (ng/ml) za svaki CD3/CD20 TDB testiran na Slikama 43A i 43B.
Slike 44A i 44B su grafikoni koji prikazuju procenat ubijanja endo B ćelija u odnosu na kontrolu koja nije tretirana sa TDB, posle 48 sati inkubacije različitih CD3/CD20 TDB koja imaju različite kombinacije anti-CD3 kraka sa anti-CD20 krakom od 2H7v16, sa 200.000 ljudskih PBMC (izolovanih od Donora br. 2) po komorici, mereno FACS analizom.
Slika 44C je tabela koja sumira EC50 ubijanja endo B ćelija (ng/ml) za svaki CD3/CD20 TDB testiran na Slikama 44A i 44B.
Slika 45A je grafikon koji pokazuje da određena CD3/CD20, poput onih koja imaju anti-CD20 krak 2H7v16 i anti-CD3 krak od 72H6, ne pokazuju in vitro potencijal, kako je procenjeno u testovima Bjab ubijanja. Slike 45B i 45C su grafikoni koji pokazuju da određena CD3/CD20, poput onih koja imaju anti-CD20 krak 2H7v16 i anti-CD3 krak od 72H6, ne pokazuju in vitro potencijal, kako je procenjeno testovima ubijanja endo B ćelija (B) i aktivacijom T ćelija (C).
Slika 46A je grafikon koji pokazuje da određena CD3/CD20, poput onih koja imaju anti-CD20 krak 2H7v16 i anti-CD3 krak od 13A3, pokazuju nizak in vitro potencijal, kako je procenjeno u testovima Bjab ubijanja. Slika 46B je grafikon koji pokazuje da određena CD3/CD20, poput onih koja imaju anti-CD20 krak 2H7v16 i anti-CD3 krak od 30A1, pokazuju nizak in vitro potencijal, kako je procenjeno u testovima Bjab ubijanja. Slika 46C je grafikon koji pokazuje da određena CD3/CD20, poput onih koja imaju anti-CD20 krak 2H7v16 i anti-CD3 krak od 41D9a, pokazuju nizak in vitro potencijal, kako je procenjeno u testovima Bjab ubijanja. Prikazane su EC50 vrednosti (ng/ml) ubijanja Bjab ćelija za svako testirano CD3/CD20 TDB.
Slika 46D je grafikon koji pokazuje da određena CD3/CD20, poput onih koja imaju anti-CD20 krak 2H7v16
1
i anti-CD3 krak 41 D9a, pokazuju nizak in vitro potencijal, kako je procenjeno na testovima ubijanja endo B ćelija. Prikazane su EC50 vrednosti (ng/ml) endo-B ćelija za svako testirano CD3/CD20 TDB.
Slika 46E je grafikon koji pokazuje da određena CD3/CD20, poput onih koja imaju anti-CD20 krak 2H7v16 i anti-CD3 krak od 41D9a, pokazuju nizak in vitro potencijal, kako je procenjeno testovima aktivacije T ćelija.
Slika 47A je grafikon koji pokazuje da određena CD3/CD20, poput TDB koja imaju anti-CD20 krak 2H7v16 i anti-CD3 krak od UCHT1v9, 21A9 i 40G5c, pokazuju visok in vitro potencijal, kako je procenjeno testom ubijanja endo B ćelija korišćenjem 200.000 ljudskih PBMC (izolovanih od Donora br. 1) po komorici, mereno FACS analizom.
Slika 47B je grafikon koji pokazuje da određena CD3/CD20, poput TDB koja imaju anti-CD20 krak 2H7v16 i anti-CD3 krak od UCHT1v9, 21A9 i 40G5c, pokazuju visok in vitro potencijala, procenjena testom aktivacije T ćelija korišćenjem 200.000 ljudskih PBMC (izolovanih od donora br. 1) po komorici, mereno FACS analizom.
Slika 48A je grafikon koji pokazuje da određena CD3/CD20, poput TDB koja imaju anti-CD20 krak 2H7v16 i anti-CD3 krak od UCHT1v9, 21A9 i 40G5c, pokazuju visok in vitro potencija, procenjena je testom ubijanja endo B ćelija korišćenjem 200.000 ljudskih PBMC (izolovanih od Donora br. 2) po komorici, mereno FACS analizom.
Slika 48B je grafikon koji pokazuje da određena CD3/CD20, poput TDB koja imaju anti-CD20 krak 2H7v16 i anti-CD3 krak od UCHT1v9, 21A9 i 40G5c, pokazuju visok in vitro potencijal, kako je procenjeno testom aktivacije T ćelija korišćenjem 200.000 ljudskih PBMC (izolovanih od Donora br. 2) po komorici, mereno FACS analizom.
Slika 49 je tabela koja sumira in vitro potencijale različitih CD3/CD20 TDB koja imaju različite kombinacije anti-CD3 kraka sa anti-CD20 krakom od 2H7v16.
Slika 50 prikazuje aminokiselinske sekvence varijabilnog domena lakog lanca (gornji) i varijabilnog domena teškog lanca (donji) anti-CD20 antitela 2H7.v16.
Slika 51 prikazuje aminokiselinske sekvence varijabilnog domena lakog lanca (gornji) i varijabilnog domena teškog lanca (donji) anti-CD3 antitela hu40G5c.
Slike 52A i 52B pokazuju da prečišćeni CD3/CD20 TDB (40G5c/2H7v16) nema formiranje agregata koji se može detektovati kao što je određeno hromatografijom isključivanja veličine (SEC) (A) i ne može se uočiti homodimerna formacija (tj., formiranje CD3/CD3 ili CD20/CD20 antitela) kako je procenjeno masenom spektrometrijom (B).
Slika 53A je grafikon koji prikazuje farmakokinetiku serumskih koncentracija CD3/CD20 TDB u različitim dozama kod Sprague Dawley (SD) pacova tokom vremena (u danima), kako je procenjeno generičkim farmakokinetičkim imunoglobulinom (GRIP) ili specifičnim ispitivanjima.
Slika 53B je tabela koja sumira kvantifikovane vrednosti klirensa (ml/dan/kg) za testirana CD3/CD20 TDB antitela za svaku dozu testiranu na Slici 53A.
Slika 54A je grafikon koji pokazuje da je F(ab')2deo od CD20 TDB zadržao isti potencijal kao i IgG CD20 TDB pune džine pri ubijanju B ćelija (Bjab ubijanje) in vitro.20,000 Bjab ćelija i 200.000 PBMC izolovanih od zdravog donora inkubiraju se pri različitim CD20 TDB koncentracijama pune dužine ili F(ab')2 CD20 TDB tokom 24 sata.
Slika 54B je grafikon koji pokazuje da je aktivnost ubijanja B ćelija od CD20 TDB zavisna od T ćelija, jer nije detektovano ubijanje B ćelija sa PBMC osiromašenim sa CD3+ T ćelijama.20.000 Bjab ćelija i 200.000 PBMC izolovanih od zdravog donora, ili 200.000 PBMC osiromašenim sa CD3+ T ćelijama, inkubirano je pri različitim CD20 TDB koncentracijama tokom 24 sata.
Slika 54C je grafikon koji pokazuje da uporedivo ubijanje B ćelija može biti postignuto bilo sa CD4+ ili sa CD8+ T ćelijama kao efektorima. 20.000 Bjab ćelija i 100.000 prečišćenih CD8+ T ćelija ili CD4+ T ćelija inkubirano je u različitim CD20 TDB koncentracijama tokom 24 sata. Ubijanje ćelija i aktiviranje T ćelija označenih kao CD69+ CD25+ izmereni su i izračunati kao što je opisano u daljem tekstu.
Slika 54D je grafikon koji pokazuje da CD20 TDB može aktivirati i CD4+ i CD8+ T ćelije. 20.000 Bjab ćelija i 100.000 prečišćenih CD8+ T ćelija ili CD4+ T ćelija je inkubirano pri različitim CD20 TDB koncentracijama tokom 24 sata. Ubijanje ćelija i aktiviranje T ćelija označenih kao CD69+ CD25+ izmereni su i izračunati kao što je opisano u daljem tekstu.
Slika 54E je grafikon koji pokazuje da je Granzimska regulacija na gore prisutnija u CD8+ T ćelijama nakon dodavanja CD20 TDB. 20.000 Bjab ćelija i 100.000 prečišćenih CD8+ T ćelija ili CD4+ T ćelija je inkubirano pri različitim CD20 TDB koncentracijama tokom 24 sata. Indukcija Granzima B takođe je otkrivena pomoću FACS.
Slika 54F je grafikon koji pokazuje da je viši nivo oslobađanja perforina povezan sa CD8+ T ćelijama nakon dodavanja CD20 TDB. 20.000 Bjab ćelija i 100.000 prečišćenih CD8+ T ćelija ili CD4+ T ćelija je inkubirano pri različitim CD20 TDB koncentracijama tokom 24 sata. Koncentracija perforina u medijumu merena je pomoću ELISA
Slika 55 je serija grafikona protočne citometrije koji pokazuju da su aktivirane T ćelije sposobne da se razmnože u prisustvu CD20 TDB i Bjab ćelija.
Slika 56A je serija grafikona koji prikazuju krive ubijanja B ćelija kao odgovor na dozu kod 8 tumorskih ćelijskih linija B leukemije/limfoma (levo) i nivoe eksprimiranja CD20 za date linije B ćelija sa izotipskom kontrolom u sivoj boji, mereno pomoću FACS. B ćelije su kultivisane u RPMI 1640 medijumu sa 10% FBS. Za test ubijanja, 20.000 B ćelija inkubirano je sa 200.000 PBMC izolovanih od zdravog donora pri različitim CD20 TDB koncentracijama tokom 24 sata.
Slika 56B je grafikon koji prikazuje širok raspon u srednjoj vrednosti eksprimiranja CD20 kod 8 linija B ćelija testiranim na Slici 56A. CD4+ T ili CD8+ T ćelije, prečišćene od čitave krvi zdravog donora i označene sa CFSE, najpre su 24 sata inkubirane same, samo sa Bjab, samo sa CD20 TDB, ili sa Bjab i CD20 TDB, i zatim su ćelije isprane i stavljene u svež medijum još 48 sati. CFSE intenzitet T ćelija detektovan je pomoću FACS, pokazujući proliferaciju T ćelija samo u prisustvu Bjab i CD20 TDB.
Slika 56C je skup grafikona koji pokazuju da je CD20 TDB potentan pri ubijanju svih 8 linija na doznozavisan način, sa EC50 vrednostima ubijanja B ćelija (ng/ml) (vrh) i procentom ubijanja B ćelija (odozdo) predstavljen kao funkcija CD20 eksprimiranja na ciljanoj B ćeliji.
Slika 56D je grafikon koji pokazuje da su TDB koji ciljaju 5 različitih antigena B ćelija uporedivi u posredovanju T ćelijskog ubijanja Bjab ćelija. B ćelije su kultivisane u RPMI 1640 medijumu sa 10% FBS. Za test ubijanja, 20.000 Bjab ćelija inkubirano je sa 100.000 prečišćenih CD8+ T ćelija zdravog donora sa CD20 TDB (TDB A: 2H7v16/UCHT1v9) ili TDB koje cilja drugi antigen B ćelija (tj. TDB B-E, i svaka cilja različiti antigen B ćelija) u koncentraciji od 1000ng/ml tokom 24 sata.
Slika 56E je grafikon koji prikazuje stepen ubijanja B ćelija za 10 tumorskih ćelijskih linija B leukemije/limfoma. B ćelije su kultivisane u RPMI 1640 medijumu sa 10% FBS. Za test ubijanja, 20.000 B ćelija je inkubirano sa 100.000 prečišćenih CD8+ T ćelija zdravog donora i 1000ng/ml CD20 TDB (2H7v16/UCHT1v9) tokom 24 sata.
Slika 56F je grafikon koji prikazuje krive ubijanja u zavisnosti od doze za 8 nasumičnih donora.
Slika 56G je rezime grafikona za EC50 (levo) i stepen ubijanja B ćelija (desno) sa 1000ng/ml antitela u 24-očasovnom testu za 30 donora.
Slika 56H je skup grafikona koji pokazuju da je stepen ubijanja B ćelija u roku od 24 sata od strane CD20 TDB vrlo uporediv ili veći od ubijanja B ćelija pomoću CD19 scFv. Za autologno ubijanje B ćelija, 200.000 PBMC izolovanih od zdravog donora inkubirano je tokom 24 sata sa CD20 TDB u naznačenoj koncentraciji. Prijavljeno ubijanje ćelija izračunato je kao što je opisano u nastavku.
Slika 56I je skup grafikona koji pokazuju da je stepen ubijanja B ćelija u roku od 24 sata od strane CD20 TDB uporediv ili veći od ubijanja B ćelija pomoću CD19-TDB ili CD22-TDB (gornji panel) ili CD79a ili CD79b (donji panel). Za autologno ubijanje B ćelija, 200.000 PBMC izolovanih od zdravog donora inkubirano je sa 40.000 BJAB ćelija tokom 24 sata sa CD20, CD19, CD22, CD79a ili CD 79b TDB u naznačenoj koncentraciji. Prijavljeno ubijanje ćelija izračunato je kao što je opisano u daljem tekstu.
Slika 57A je serija grafikona koji prikazuju relativne vrednosti eksprimiranja za ljudski CD3ε detektovan u CD4+ T ćelijama (levi panel) i CD8+ T ćelija (srednji panel); i ljudski CD20 u CD19+ B ćelijama (desni panel) detektovan u mišjim (mu) ili ljudskim (hu) PBMC, izmereno pomoću FACS. Mišji PBMC su izvedeni iz krvi dvostruko transgenih huCD3/huCD20 miševa; ljudske PBMC su izvedeni iz krvi zdravog donora.
Slika 57B je grafikon koji pokazuje da CD20 TDB ne može delovati na mišje T ćelije kako bi osiromašio B ćelije bez eksprimiranja ljudskog CD3 u ljudskim CD20 transgenim miševima. HuCD20 transgeni miševi ili huCD20/CD3 dvostruko transgeni miševi tretirani su jednom intravenski sa antitelima kako je naznačeno (10 mg/kg za rituksimab, 0,5 mg/kg za CD20 TDB i HER2 TDB). Mišje slezine su sakupljene na D7 (7 dana nakon tretmana antitelom). Kao pozitivna kontrola koristi se rituksimab protiv ljudskog CD20 antitela. CD3/HER2 TDB se koristi kao negativna, izotipska kontrola.
Slika 57C je grafikon koji pokazuje da je CD20 TDB sposoban da deluje na mišje T ćelije koje eksprimiraju huCD3 u ljudskim CD3/CD20 dvostruko transgenim miševima kako bi potencijalno osiromašio mišje B ćelije koje eksprimiraju huCD20. HuCD20 transgeni miševi ili huCD20/CD3 dvostruko transgeni miševi tretirani su jednom intravenski sa antitelima kako je naznačeno (10 mg/kg za rituksimab, 0,5 mg/kg za CD20 TDB i HER2 TDB). Mišje slezine su sakupljene na D7 (7 dana nakon tretmana antitelom). CD3/HER2 TDB se koristi kao negativna, izotipska kontrola.
Slika 58A je serija grafikona vremenskog ispitivanja koja pokazuje da je CD20 TDB tretman rezultovao trajnim osiromašivanjem B ćelija do D15 (15 dana nakon doziranja). HuCD20/huCD3 dvostruko transgeni miševi su tretirani jednom intravenski različitim dozama CD20 TDB. Sakupljena je mišja krv (D1, D8 i D15).
Slika 58B je grafikon koji pokazuje da je skoro celokupno osiromašivanje B ćelija u slezini miša postignuto samo kod D7 nakon jedne doze od 0,5 mg/kg, dok je niža doza od 0,05 mg/kg samo delimično rezultovala osiromašivanjem B ćelija slezine. HuCD20/CD3 dvostruko transgeni miševi tretirani su jednom intravenski, različitim dozama CD20 TDB. Sakupljene su slezine (D7).
Slika 58C je grafikon koji pokazuje da se primećuje snažno osiromašivanje B ćelija na D7 u cirkulaciji dvostruko transgenih huCD3/huCD20 miševa tretiranih sa CD20 TDB. HuCD20/huCD3 dvostruko transgeni miševi tretirani su jednom intravenski pri 0,5 mg/kg CD20 TDB. Krv je sakupljena na D0-5 minuta (5 minuta nakon tretmana), D0-2č, D0-8č, D1, D2, D3 i D7. B ćelije koje eksprimiraju huCD20 su izmerene pomoću FACS.
Slika 58D je serija grafikona koji pokazuju aktivaciju T ćelija kod dvostruko transgenih huCD3/huCD20 miševa tretiranih sa CD20 TDB. Tretirani dvostruko transgeni huCD3/huCD20 miševi pokazali su do 80% porast broja CD8+ T ćelija koje eksprimiraju ljudski CD3ε unutar 2 sata nakon tretmana sa CDB TD2, što se vratilo na početni nivo do D2 i D7 (gornji panel). Slično tome, CD4+ T ćelije koje eksprimiraju ljudski CD3ε porasle su za 80% unutar 2 sata nakon tretmana sa CD20 TDB, i nakon toga su se vratile na početni nivo do D2. Dvostruko transgeni huCD3/huCD20 miševi su tretirani jednom intravenski pri 0,5 mg/kg CD20 TDB. Krv je sakupljena na D0-5 minuta (5 minuta nakon tretmana), D0-2č, D0-8č, D1, D2, D3 i D7. CD4+ i CD8+ T ćelije koje eksprimiraju CD3ε su izmerene pomoću FACS.
Slika 59A je serija grafikona protočne citometrije koji pokazuju da CD20 TDB osiromašuje B ćelije marginalne zone (MZB) jednako efikasno kao i folikularne B ćelije (FOB) nakon primene TDB dvostruko transgenim huCD3/huCD20 miševima. Dve dvostruko transgene životinje (levi i desni panel, respektivno) su tretirane nosačem (gornji paneli) ili jednom intravenskom dozom od 0,5 mg/kg TDB (donji paneli). Mišje slezine su sakupljene na D7 i analizirane pomoću FACS.
Slika 59B-59E je serija grafikona koji pokazuju da CD20 TDB osiromašuje B ćelije marginalne zone (MZB) (B) jednako efikasno kao i folikularne B ćelije (FOB) (C) nakon jedne intravenske doze od 0,5 mg/kg TDB, zajedno sa aktiviranjem CD8+ T ćelija (D) i proliferacijom CD8+ T ćelija (E) u slezini u naznačenim vremenskim tačkama. Mišje slezine su sakupljene na D1, D2, D3, D5, D7 i D14.
Slika 60A je grafikon koji pokazuje da su humanizovani NSG miševi tretirani sa 3 nedeljne doze CD20 TDB u količini od 0,5 mg/kg (postavka sa ponavljanjem doza) pokazali osiromašeni nivo B ćelija u krvi na D7, i na D21 skoro nisu otkrivene B ćelije. Humanizovani NSG miševi su tretirani sa 3 doze od 0,5 mg/kg CD20 TDB nedeljno, intravenski. Krv je sakupljena na D-5 (5 dana pre tretmana), D7, D14 i D21. Broj mišjih B ćelija u krvi meren pomoću FACS.
Slika 60B je grafikon koji pokazuje da je robusno osiromašivanje B ćelija na D21 primećeno u slezinama humanizovanih NSG miševa tretiranih sa CD20 TDB. Humanizovani NSG miševi su tretirani sa 3 doze od 0,5 mg/kg CD20 TDB nedeljno, intravenski. Slezine su sakupljene na D21. Broj mišjih B ćelija u slezini je izmeren pomoću FACS.
Slika 60C je serija grafikona protočne citometrije koji pokazuju da se huCD8+ T ćelije razmnožavaju, i
1
huCD19+ B ćelije su osiromašene 7 dana nakon tretmana (D7) humanizovanih NSG miševa sa CD20 TDB. Humanizovani NSG miševi tretirani su sa nosačem ili 0,5 mg/kg CD20 TDB (2H7v16/UCHT1v9). Slezine kontrolnih i CD20 TDB tretiranih humanizovanih NSG miševa sakupljeni su na D7. B ćelije koje eksprimiraju huCD19 i T ćelije koje eksprimiraju huCD8 su izmerene pomoću FACS.
Slika 60D je grafikon koji pokazuje da su humanizovani NSG miševi tretirani sa 3 nedeljne doze CD20 TDB u količini od 0,5 mg/kg (postavka sa ponavljanjem doza) pokazali do 10 puta povećanje broja CD8+ T ćelija na D7, koje se vratilo na početni nivo ili niže na D14 i D21. Humanizovani NSG miševi su tretirani sa 3 doze od 0,5 mg/kg CD20 TDB nedeljno, iv. Krv je sakupljena na D-5 (5 dana pre tretmana), D7, D14 i D21. Broj mišjih CD8+ T ćelija je u krvi, i aktivacija T ćelija mereni su pomoću FACS.
Slika 60E je serija grafikona protočne citometrije koji pokazuju početne nivoe huCD20+ B ćelija (središnji paneli) i huCD8+ i huCD4+ T ćelija (desni paneli) od 2 humanizovana NSG miša mereno pomoću FACS. Slika 60F je serija grafikona koji prikazuju nivoe ćelijskog površinskog eksprimiranja huCD3ε i CD20 eksprimiranja na CD19+ B ćelijama (levo), CD8+ T ćelijama (u sredini) i CD4+ T ćelijama (desno) kako je detektovano pomoću FACS.
Slika 61A je grafikon koji pokazuje da je CD20 TDB potentan pri ubijanju CLL B ćelija sa autolognim T ćelijama. 200.000 PBMC je inkubirano tokom 48 sati pri različitim CD20 TDB koncentracijama u RPMI medijumu sa 10% FBS. Slika 61B je grafikon koji pokazuje da je CD20 TDB potentan u indukciji aktivacije autolognih T ćelija u prisustvu CLL B ćelija. 200.000 PBMC je inkubiran tokom 48 sati pri različitim CD20 TDB koncentracijama u RPMI medijumu sa 10% FBS.
Slika 61C je skup grafikona koji pokazuju da je broj T ćelija visoko korelativan sa ubijanjem CLL B ćelija ex vivo. 200 000 PBMC je inkubirano tokom 28 sati sa 1000ng/ml CD20 TDB, bilo samostalno, bilo sa dodatkom CD8+ T ćelija prečišćenih od zdravog donora. Procenat CD19+ CD5+ B ćelija i CD8+ T ćelija u CLL PBMC iznosi 90/0,55 za uzorak A1645, 76/3,5 za A1957, 87/0,63 za A1978, 69/1,3 za A1980. Ubijanje ćelija, indukcija Granzima B i aktivacija T ćelija mereni su pomoću FACS kao što je opisano u daljem tekstu.
Slika 62A je skup grafikona koji pokazuju da je aktiviranje T ćelija (levo) nakon doziranja od 0,1 mg/kg ili 0,5 mg/kg CD20 TDB NSG miševima sa ugrađenim ćelijama CLL leukemije u korelaciji sa jakim osiromašivanjem ugrađenih CLL B ćelija (desno).
Slika 62B je skup imunohistohemijskih slika segmenata slezine od NSG miševa sa ugrađenim ćelijama CLL leukemije, koji pokazuju da se malo B ćelija može detektovati nakon tretmana sa CD20 TDB. B ćelije i T ćelije su ugrađene u NSG miševe kao što je opisano u daljem tekstu. Miševi su tretirani jednom intravenski sa HER2 TDB, rituksimabom od 0,5 mg/kg, CD20 TDB od 0,1 i 0,5 mg/kg, i slezine su sakupljene za FACS analizu 14 dana nakon tretmana.
Slika 63 je grafikon koji prikazuje prilagođenu zapreminu tumora od Bjab ugrađenih tumora od SCID miševa za Hrupu 1 (nosač: 20 mM histidin/acetat pH 5,5, 240 mM saharoza, 0,02% Tween 20); Grupa 2 (CD20 TDB: 2H7v114/UCHT1.v9; 0,5 mg/kg); Grupa 3 (nosač: 20 mM histidin/acetat pH 5,5, 240 mM Suharoza, 0,02% Tween 20, PBMC); i Grupa 4 (CD20 TDB: CD202H7v114/CD3 UCHT1.v9; 0,5 mg/kg, PBMC). Efektorske ćelije su PBMC dobijene od zdravog ljudskog donora. Miševi su tretirani jednom nedeljno tokom dve nedelje.
Slika 64A je grafikon koji prikazuje relativni nivo eksprimiranja CD20 u ćelijama Bjab, NALM-6, SC-1 i OCI-LY 19 ćelijama. B ćelije i T ćelije su ugrađene u NSG miševe kao što je opisano u daljem tekstu. Miševi su tretirani jednom intravenski sa HER2 TDB i rituksimabom od 0,5 mg/kg, CD20 TDB od 0,1 i 0,5 mg/kg, i slezine su sakupljene za IHC analizu 14 dana nakon tretmana.
Slika 64B je grafikon koji pokazuje da su rituksimab i CD20 TDB po svojoj efikasnosti uporedivi po pitanju ubijanja Bjab ćelija in vitro, koje eksprimiraju visok nivo CD20 na svojoj ćelijskoj površini. PBMC izolovani od zdravog donora bili su osiromašeni od B ćelija, i korišćeni su kao efektorske ćelije u ispitivanju ubijanja ćelija in vitro. 20.000 B ćelija i 200.000 efektorskih ćelija inkubirano je 24 sata pri različitim koncentracijama CD20 TDB ili rituksimaba. CD20 TDB eksprimiranje detektovano je pomoću FACS.
Slika 64C je grafikon koji pokazuje da je CD20 TDB, ali ne i rituksimab, sposoban da ubije NALM-6, SC-1 i OCI-LY 19 ćelije koje imaju relativno nizak nivo CD20 na svojoj ćelijskoj površini. PBMC izolovani od zdravog donora bili su osiromašeni od B ćelija, i korišćeni su kao efektorske ćelije u ispitivanju ubijanja ćelija in vitro. 20.000 B ćelija i 200.000 efektorskih ćelija inkubirano je 24 sata pri različitim koncentracijama CD20 TDB ili rituksimaba. CD20 TDB eksprimiranje detektovano je pomoću FACS.
Slika 64D je grafikon koji prikazuje nivoe površinskog eksprimiranja B ćelija deblokiranog CD20 antigena kao funkcija koncentracije rituksimab-DANA mereno pomoću FACS. CD20/CD3 dvostruko transgeni miševi tretirani su jednom dozom nosača ili rituksimab-DANA (10 mg/kg). Slezine su skupljene 5 dana nakon tretmana.
Slike 65A i 65B su grafikoni koji pokazuju da je CD20 TDB aktivan pri ubijanju B ćelija in vitro u prisustvu visokog nivoa rituksimaba (A) ili deksametazona (B).200.000 PBMC izolovanih od zdravog donora prvo je inkubirano rituksimabom-DANA u naznačenoj koncentraciji tokom 1 sata, zatim je dodat CD20 TDB i inkubiran tokom 24 sata. Za ispitivanje deksametazonom, ćelije su prethodno tretirane sa 1 µM deksametazona preko noći pre dodavanja CD20 TDB. Ubijanje ćelija je izračunato kao što je opisano u nastavku.
Slika 66 je skup grafikona koji pokazuju da je CD20 TDB aktivan u osiromašivanju B ćelija u krvi (levo) i slezini (desno) kod miševa koji su prethodno tretirani rituksimabom-DANA. Za tretman sa jednim agensom, huCD20/CD3 dvostruko transgeni miševi su tretirani jednom intravenski u naznačenoj dozi; za kombinovani tretman, miševi su prvo tretirani intravenski rituksimabom-DANA, i CD20 TDB je primenjen intravenskom injekcijom 30 minuta kasnije. Krv je sakupljena na D-7, D0-2č (2 sata nakon tretmana TDB) i D7; slezine su sakupljene na D7. Broj B ćelija meren je pomoću FACS kao što je opisano u daljem tekstu.
Slika 67A je skup grafikona koji prikazuju B-ćeliju (levo), CD4+ T ćeliju (sredina) i CD8+ T ćeliju (desno) u uzorcima krvi od 3 cinomolgus majmuna pre i 7 dana nakon tretmana jednom intravenskom dozom od 1 mg/kg CD20 TDB. Tri cinomolgus majmuna jednom su intravenski tretirana sa 1 mg/kg CD20 TDB. Krv je sakupljena na D-7 (7 dana pre doziranja), D0-4č (4 sata neposredno nakon doziranja) i D7.
Slika 67B je skup grafikona koji prikazuju nivoe B ćelija, CD4+ T ćelija i CD8+ T ćelija u slezini (levo), mandibularnim limfnim čvorovima (sredina) i mezenterični limfnim čvorovima (desno) od 3 cinomolgus majmuna 7 dana nakon tretmana sa pojedinačnom intravenskom dozom od 1 mg/kg CD20 TDB. Tri cinomolgus majmuna jednom su intravenski tretirana sa 1 mg/kg CD20 TDB. Krv je sakupljena na D-7 (7 dana pre doziranja), D0-4č (4 sata neposredno nakon doziranja) i D7.
Slika 67C je skup grafikona koji prikazuju nivoe B ćelija, CD4+ T ćelija i CD8+ T ćelija u slezini (levo), mandibularnim limfnim čvorovima (sredina) i mezenterični limfnim čvorovima (desno) od 3 cinomolgus majmuna pre tretmana sa pojedinačnom intravenska doza od 1 mg/kg CD20 TDB. Tri cinomolgus majmuna jednom su intravenski tretirana sa 1 mg/kg CD20 TDB. Krv je sakupljena na D-7 (7 dana pre doziranja), D0-4č (4 sata neposredno nakon doziranja) i D7.
Slika 67D je skup grafikona koji pokazuju početne nivoe B ćelija i CD4+ i CD8+ T ćelije kao procenat ukupnih limfocita detektovanih u slezini (levo) i mandibularnim limfnim čvorovima (desno) kod životinja tretiranih kontrolom nosača.
Slika 68A je skup grafikona koji prikazuju koncentraciju CD20 TDB u serumu iz prikupljenih uzoraka krvi i seruma kod četiri cinomolgus majmuna, tretirana 4 puta nedeljno sa 1 mg/kg CD20 TDB, intravenskom primenom.
Slika 68B je skup grafikona koji prikazuju koncentraciju CD20 TDB u uzorcima seruma prikupljenih od životinja opisanih na Slikama 65 i 66A. Srednja vrednost ± s.d. su iscrtani.
Slika 69A je histogram koji prikazuje PD-L1 eksprimiranje na A20-huCD20 ćelijama od A20-huCD20 singenskih Balb/C miševa, kako je procenjeno protočnom citometrijom.
Slika 69B je grafikon koji prikazuje relativnu zapreminu tumora tokom vremena za Grupu 1 (nosač); Grupu 2 (CD20 TDB u dozi od 0,5 mg/kg); Grupu 3 (anti-PD-L1 antitelo u 10 mg/kg); i Grupu 4 (CD20 TDB pri 0,5 mg/kg anti-PD-L1 antitelo).
Slika 70 je grafikon koji prikazuje krive vezivanja za svaki od tri FcRH5 TDB testirana za in vitro vezivanje za CD8+ T ćelije koje eksprimiraju CD3.
Slika 71A je grafikon koji prikazuje procenat ubijanja MOLP-2 ciljanih ćelija kao funkcija FcRH5 TDB koncentracije, sa CD8+ T ćelijama prečišćenim od ljudskih PBMC od Donora br.1.
Slika 71B je grafikon koji prikazuje procenat ubijanja MOLP-2 ciljanih ćelija kao funkcija FcRH5 TDB koncentracije, sa CD8+ T ćelijama prečišćenim od ljudskih PBMC od Donora br.2.
1
Slika 72A je grafikon koji prikazuje procenat CD8+CD69+ T ćelija kao funkcija FcRH5 TDB koncentracije, kako je procenjeno FACS analizom. Ciljane ćelije su MOLP-2, i CD8+ T ćelije su prečišćene od Donora br.
1.
Slika 72B je grafikon koji prikazuje procenat CD8+CD107a+ T ćelija kao funkcija FcRH5 TDB koncentracije, kako je procenjeno FACS analizom. Ciljane ćelije su MOLP-2, i CD8+ T ćelije su prečišćene od Donora br.1.
Slika 72C je grafikon koji prikazuje procenat CD8+CD69+ T ćelija kao funkcija FcRH5 TDB koncentracije, kako je procenjeno FACS analizom. Ciljane ćelije su MOLP-2, i CD8+ T ćelije su prečišćene od Donora br.
2.
Slika 72D je grafikon koji prikazuje procenat CD8+CD107a+ T ćelija kao funkcija FcRH5 TDB koncentracije, kako je procenjeno FACS analizom. Ciljane ćelije su MOLP-2, i CD8+ T ćelije su prečišćene od Donora br.2.
Slika 73 je skup grafikona koji prikazuju krive vezivanja za svaki od tri HER2 TDB testirana za in vitro vezivanje za SKBR3 ćelije koje eksprimiraju Her2 (gore) i CD8+ T ćelije koje eksprimiraju CD3 (dole). Slika 74A je grafikon koji prikazuje krive vezivanja za trastuzumab (bivalentni), trastuzumab (Fab) i HER2 TDB (UCHT1v9/hu4D5) (bispecifičan) za in vitro vezivanje za SKBR3 ćelije koje eksprimiraju Her2.
Slika 74B je grafikon koji prikazuje procenat održivih SKBR3 ćelija kao funkcija koncentracije trastuzumaba (bivalentni), trastuzumaba (Fab) i HER2 TDB (UCHT1v9/hu4D5) (bispecifičan), kako je procenjeno koristeći CELLTITERGLO® luminiscentni test održivosti ćelija.
Slika 74C je grafikon koji prikazuje procenat ubijanja SKBR ciljanih ćelija posredovano ćelijskiposredovanom citotoksičnošću zavisnom od antitela (ADCC) u prisustvu trastuzumaba (T-mab), trastuzumaba proizvedenog u E. Coli (T-mab E. Coli), i HER2 TDB (UCHT1v9/hu4D5), kako je procenjeno oslobađanjem laktat dehidrogenaze (LDH) iz liziranih ćelija.
Slika 75 je grafikon koji prikazuje procenat ubijanja SKBR3 ciljanih ćelija kao funkcija HER2 TDB koncentracije (hu4D5-TDB, hu4D5.91A-TDB i hu4D5.Y100A-TDB).
Slika 76A je serija panela. Na gornjoj ploči je prikaz kristalne strukture HER2 vanćelijskog domena (ECD) vezanog od strane Hu4D5 Fab (Trastuzumab), 2C4 Fab (Pertuzumab) i 7C2. Donji panel je trakasta struktura CD3ε vezana od strane 2C11, 38E4v1 i 40G5c.
Slika 76B je tabela koja pokazuje afinitete vezivanja, predstavljena konstantom disocijacije KD(nM) od HER2-TDB za tri različita HER2 kraka: hu4D5, 2C4 i 7C2. Donji desni panel je tabela koja pokazuje afinitete vezivanja, predstavljena konstantom disocijacije KD(nM) od HER2-TDB za tri različita CD3 ε kraka: 38E4v1, 40G5c i 2C11.
Slika 76C je grafikon koji prikazuje procenat ubijanja MCF7 ciljane ćelije koji eksprimira HER2 kao funkcija HER2-TDB koncentracije (hu4D5-TDB, 2C4-TDB i 7C2-TDB). Citotoksičnost je merena oslobađanjem laktat dehidrogenaze (LDH).
Slika 77 je grafikon koji prikazujeda su HER2 hu4D5 i 2C4 kraci snažni posrednici ubijanja ćelija kao što je prikazano maksimalnim procentom ubijanja SKBR3 ciljanih ćelija postignutim tretmanom sa narednim HER2-TDB varijantama: hu4D5-38E4v1, hu4D5-40G5c, 2C4- 38E4v1, 2C4-40G5c, 7C2-38E4v1 i 7C2-40G5c.
Slika 78 je serija grafikona koji prikazuju potencijale varijanti HER2-TDB u uništavanju HER2-eksprimirajućih SKBR3 (levo) i HER2-eksprimirajućih MCF7 (desno) ćelijskih linija na dozno-zavisan način, sa EC50 vrednostima ubijanja ciljanih ćelija. (pM).
Slika 79 je serija grafikona koji prikazuju procenat ubijanja SKBR3 ciljanih ćelija koje eksprimiraju HER2 za različite TDB sa HER2 kracima (hu4D5, 2C4 i 7C2) uparene sa CD3 kracima visokog afiniteta (38E4v1) ili niskog afiniteta (40G5c) kao funkcija koncentracije TDB (ng/mL).
Slika 80 je serija panela. Panel na levoj strani pokazuje potenciju varijanti HER2-TDB (hu4D5-38E4v1, 2C4-38E4v1, 7C2-38E4v1; hu4D5-40G5c, 2C4-40G5c, 7C2-40G5c) u uništavanju HER2-eksprimirajućih SKBR3 i HER2-eksprimirajućih MCF7 ćelijskih linija na dozno-zavisan način, sa EC50 vrednostima ubijanja ciljanih ćelija (pM). Panel na desnoj strani je tabela sa EC50 odnosom datih HER2-TDB varijanti u MCF7 u odnosu na SKBR3 ciljane ćelije za tri eksperimenta.
1
Slika 81 je serija panela. Gornji panel prikazuje tabelu u kojoj su navedene varijante hu4D5 HER2 kraka (hu4D5v7, hu4D5v5, hu4D5v10, hu4D5v31, hu4D5.Y100A) za HER2-TDB (40G5c CD3 krak) i odgovarajućeg EC50 (ng/mL) za ubijanje SKBR3 ciljane ćelije, afinitet vezivanja HER2 (KD, nM) pored odnosa KDafiniteta vezivanja HER2 i EC50 ubijanja SKBR3 ciljanih ćelija za hu4D5 varijante u odnosu na hu4D5. Donji panel je grafikon koji prikazuje korelaciju između SKBR3 EC50 odnosa za hu4D5 HER2-TDB varijante(hu4D5, hu4D5v7, hu4D5v5, hu4D5v10 i hu4D5v31) i relativnog KDodnosa za hu4D5 HER2-TDB varijante.
Slika 82 je serija grafikona koji prikazuju procenat ubijanja SKBR3 i MCF7 ciljanih ćelija kao funkcija koncentracije narednih HER2-TDB varijanti: hu4D5-40G5c (gore levo), hu4D5v7-40G5c (gornji centar), hu4D5v5-40G5c (gore desno), hu4D5v10-40G5c (dole levo), hu4D5v31-40G5c (donji centar), hu4D5.Y100A-40G5c (dole desno).
Slika 83 je serija grafikona. Grafikon na levoj strani prikazuje procenat ubijanja ciljanih ćelija kao funkcija koncentracije (µg/mL) HER2 koja blokira bivalentna monospecifična antitela specifična za označeni HER2 krak od HER2-TDB. (antitela koja blokiraju HER2: bivalentna monospecifična antitela za hu4D5, 2C4 i 7C2. HER2-TDB: hu4D5-40G5c, 2C4-40G5c i 7C2-38E4v1 u fiksnoj koncentraciji:10 ng/mL). Grafikon sa desne strane prikazuje održivih ćelija kao funkcija koncentracije HER2 antitela (hu4D5) trastuzumaba u prisustvu i odsustvu HER2-TDB hu4D5-40G5c.
Slika 84 je serija panela. Gornji panel je tabela koja pruža reaktivnost varijanti HER2 kraka sa HER2 izmerenim različitim testovima vezivanja pored reaktivnosti HER2 klonova sa antitelo hu4D5 trastuzumabom. Donji panel je grafikon koji prikazuje procenat ubijanja ciljanih ćelija kao funkcija koncentracije (pM) HER2 bispecifičnog Fab za date klonove (hu4D5, 3H4 i 2H11). EC50 vrednosti su u pM date za svaki klon.
Slika 85 je tabela koja pruža informacije o afinitetu i reaktivnosti za varijante HER2-TDB CD3 kraka (38E4v1, 38E4, SP34, 40G5c i 2C11).
Slika 86 je grafikon koji prikazuje ubijanje CT26 ciljane ćelije koja eksprimira HER2 kao funkcija koncentracije (ng/mL) varijanti HER2-TDB (hu4D5-2C11, hu4D5-SP34, 7C2-2C11 i 2C4-2C11). Efektorske ćelije: T-ćelije izvedene iz CD3-TG
Slika 87A je grafikon koji prikazuje zapreminu tumora (mm<3>) mereno tokom vremena (0-5 dana) kod životinja tretiranih sa nosačem ili HER2-TDB (.5 mg/kg).
Slika 87B je serija grafikona. Gornji levi grafikon prikazuje procenat perifernih CD45+ ćelija pri 5 ćelija detektovanih na dan 6 nakon tretmana nosačem ili sa HER2-TDB (.5 mg/kg). Gornji desni grafikon prikazuje procenat perifernih CD45+ ćelija koje su CD8+ ćelije detektovane na dan 6 nakon tretmana nosačem ili sa HER2-TDB (.5 mg/kg). Donji levi grafikon prikazuje procenat perifernih CD45+ ćelija koje su CD4+ detektovane na dan 6 nakon tretmana nosačem ili sa HER2-TDB (.5 mg/kg). Donji desni grafikon prikazuje procenat perifernih CD8+ ćelija koje su IFN+ detektovane na dan 6 nakon tretmana nosačem ili sa HER2-TDB (.5 mg/kg).
Slika 88A je serija grafikona. Gornji grafikon prikazuje vodostaj procentualne promene zapremine tumora kod životinja tretiranih nosačem ili HER2-TDB varijantom (hu4D5-SP34 ili hu4D5-2C11;.5 mg/kg; IV, nedeljno, 5 nedelja). Na donjem grafikonu je prikazana „vodopad“ grafikon procenta promene zapremine tumora kod životinja koje su tretirane sa HER2-TDB varijantom (2C4-38E4;.5 mg/kg; IV, nedeljno, 5 nedelja).
Slika 88B je serija grafikona. Gornji grafikon prikazuje zapreminu tumora kao procentu od početne zapremine u zavisnosti od vremena (dani) za životinje tretirane sa nosačem ili HER2-TDB (hu4D5-SP34). Donji grafikon prikazuje zapreminu tumora kao procenat od osnovne zapremine kao funkcija vremena (dani) za životinje tretirane sa nosačem ili HER2-TDB (hu4D5-2C11). (HER2-TDB:.5 mg/kg; IV, nedeljno, 5 nedelja).
Slika 89 je grafikon koji prikazuje procenat CD8+CD107a+ T ćelija kao funkcija HER2 TDB (hu4D5-TDB, hu4D5.91A-TDB i hu4D5.Y100A-TDB) koncentracije hu4D5, kako je procenjeno FACS analizom. Ciljane ćelije su SKBR3 ćelije; efektorske ćelije su CD8+ T ćelije; odnos efektorska ćelija:ciljana ćelija = 3:1.
Slika 90A je grafikon koji prikazuje procenat ubijanja SKBR3 ciljanih ćelija kao funkcija koncentracije HER2 TDB (UCHT1v9/hu4D5 i SP34/hu4D5).
1
Slika 90B je grafikon koji prikazuje procenat ubijanja SKBR3 ciljanih ćelija kao funkcija koncentracije HER2 TDB (SP34/hu4D5, 38E4c/hu4D5 i 40G5c/hu4D5).
Slika 90C je grafikon koji prikazuje procenat ubijanja SKBR3 ciljanih ćelija kao funkcija koncentracije HER2 TDB (SP34/hu4D5, 38E4c/hu4D5 i 40G5c/hu4D5).
Slika 91A je grafikon koji prikazuje krivu vezivanja za svaki od tri HER2-TDB (SP34/hu4D5, 38E4c/hu4D5 i 40G5c/hu4D5) testirana za in vitro vezivanje za CD8+ T ćelije koje eksprimiraju CD3 kako je procenjeno FACS analizom.
Slika 91B je grafikon koji prikazuje procenat CD8+CD69+ T ćelija kao funkcija HER2-TDB koncentracije (SP34/hu4D5, 38E4c/hu4D5 i 40G5c/hu4D5).
Slika 92A je grafikon koji prikazuje krivu vezivanja za dva HER2 TDB (38E4c/hu4D5 i 38E4/hu4D5) testirana za in vitro vezivanje za CD8+ T ćelije koje eksprimiraju CD3, kako je procenjeno FACS analizom. Slika 92B je grafikon koji prikazuje krivu vezivanja za dva HER2 TDB (38E4c/hu4D5 i 38E4/hu4D5) testirana za in vitro vezivanje za SKBR3 ćelije koje eksprimiraju Her2, kako je procenjeno FACS analizom. Slika 92C je grafikon koji prikazuje procenat ubijanja SKBR3 ciljanih ćelija kao funkcija koncentracije HER2 TDB (38E4c/hu4D5 i 38E4/hu4D5) kako je procenjeno FACS analizom. Efektorske ćelije su ljudske CD8+ T ćelije; odnos efektorska ćelija:ciljana ćelija = 3:1.
Slika 92D je grafikon koji prikazuje procenat CD8+CD69+ T ćelija kao funkcija HER2-TDB koncentracije (38E4c/hu4D5 i 38E4/hu4D5).
Slika 93A je grafikon koji prikazuje procenat CD8+CD69+GranzimB+ T ćelija kao funkcija koncentracije HER2 TDB (UCHT1v9/hu4D5), kako je procenjeno FACS analizom. Ciljane ćelije su SKBR3 ćelije; efektorske ćelije su CD8+ T ćelije; odnos efektorska ćelija:ciljana ćelija = 3:1.
Slika 93B je serija grafikona koji prikazuju HER2 TDB (UCHT1v9/hu4D5) T ćelijski posredovanu egzocitozu granula ciljane ćelije detektovanu pomoću ELISA za perforin i granzime A i B, i procenat ubijanja ciljanih ćelija procenjen oslobađanjem LDH. Ciljane ćelije su SKBR3 ćelije; efektorske ćelije su PBMC; odnos efektorska ćelija:ciljana ćelija = 30:1.
Slika 93C je serija grafikona koji prikazuju HER2 TDB (UCHT1v9/hu4D5) T ćelijski posredovanu apoptozu ciljane ćelije izmerenu pomoću aktivnosti kaspaze-3 i kaspaze-7 u CASPASE-GLO® 3/7 testu, apoptozu u Cell Death Detection ELISA<plus>testu i oslobađanje LDH. Ciljane ćelije su SKBR3 ćelije; efektorske ćelije su PBMC; odnos efektorska ćelija:ciljana ćelija = 10:1.
Slika 93D je Slika Western blota (gornji deo) koja prikazuje eksprimiranje Her2 u 3T3 transficiranim ćelijama i grafikon (dno) koji prikazuje procenat ubijanja ciljanih ćelija aktiviranim T ćelijama kao funkcija koncentracije HER2 TDB (UCHT1v9/hu4D5) mereno oslobađanjem LDH. Ciljane ćelije su 3T3-Vektor i 3T3-HER2; efektorske ćelije su PBMC; odnos efektorska ćelija:ciljana ćelija = 10:1.
Slika 93E je grafikon koji prikazuje procenat ubijanja BT474 ciljanih ćelija kao funkcija koncentracije HER2 TDB (UCHT1v9/hu4D5) u prisustvu trastuzumab Fab (T-Fab) ili rastvorljivog HER2 vanćelijskog domena (ECD), kako je procenjeno oslobađanjem LDH. Efektorske ćelije su CD8+ T ćelije; odnos efektorska ćelija:ciljana ćelija = 5:1.
Slika 93F je grafikon koji prikazuje procenat ubijanja SKBR3 ciljanih ćelija kao funkcija koncentracije HER2 TDB (UCHT1v9/hu4D5) nakon osiromašivanja CD3+ ćelija iz populacije PBMC efektorskih ćelija. Odnos efektorska ćelija:ciljana ćelija = 20:1.
Slika 94A je serija grafikona koji prikazuju procenat CD8+CD69+ T ćelija (levo) i CD8+ CD107a+ T ćelija (sredina) kao funkcija koncentracije HER2 TDB (UCHT1v9/hu4D5), kako je procenjeno FACS analizom, i procenat ubijanja SKBR3 ciljanih ćelija kao funkcija koncentracije HER2 TDB (UCHT1v9/hu4D5) (desno). Ciljane ćelije su SKBR3 ćelije; efektorske ćelije su CD8+ T ćelije; odnos efektorska ćelija:ciljana ćelija = 3:1.
Slika 94B je serija grafikona koji prikazuju procenat ubijanja BT474 ciljanih ćelija kao funkcija koncentracije HER2 TDB (UCHT1v9/hu4D5) (levo) i procenat CD8+CD69+GranzimB+ T ćelija kao funkcija koncentracije HER2 TDB (UCHT1v9/hu4D5) (desno), kako je procenjeno FACS analizom. Ciljane ćelije su BT474 ćelije; efektorske ćelije su CD8+ T ćelije; odnos efektorska ćelija:ciljana ćelija kao što je naznačeno.
1
Slika 95A je serija histograma koji pokazuju eksprimiranje CFSE u CD8+ T ćelijama u prisustvu SKBR3 ciljanih ćelija i/ili HER2 TDB (UCHT1v9/hu4D5).
Slika 95B je grafikon koji prikazuje stepen promene broja CD8+ ćelija kao funkcija vremena posle inkubacije sa SKBR3 ciljanim ćelijama i HER2 TDB (UCHT1v9/hu4D5), kako je procenjeno FACS analizom.
Slika 95C je serija grafikona koji pokazuju stepen promene broja CD8+ ćelija kao funkcija vremena posle inkubacije sa SKBR3 ciljanim ćelijama, HER2 TDB (UCHT1v9/hu4D5) i 20 ng/ml IL-2, kako je procenjeno FACS analizom.
Slika 96A je Western blot slika koja pokazuje nivo eksprimiranja Her2 na panelu ćelijskih linija ljudskog tumora.
Slika 96B je grafikon koji prikazuje procenat ubijanja ciljanih ćelija kao funkcija koncentracije HER2 TDB (UCHT1v9/hu4D5), kako je procenjeno oslobađanjem LDH. Ciljane ćelije su BJAB, MDA435, MDA231, MCF7, MDA453, SKBR3 i BT474; efektorske ćelije su PBMC; odnos efektorska ćelija:ciljana ćelija = 25:1. Slika 96C je grafikon koji prikazuje procenat ubijanja ciljanih ćelija kao funkcija koncentracije HER2 TDB (UCHT1v9/hu4D5) kako je procenjeno FACS analizom. Ciljane ćelije su MCF7 i SKBR3; efektorske ćelije su PBMC; odnos efektorska ćelija:ciljana ćelija = 20:1.
Slika 96D je grafikon koji prikazuje procenat ubijanja ciljanih ćelija kao funkcija koncentracije HER2 TDB (UCHT1v9/hu4D5) kako je procenjeno FACS analizom. Ciljane ćelije su BJAB i SKBR3; efektorske ćelije su PBMC; odnos efektorska ćelija:ciljana ćelija = 20:1.
Slika 96E je tabela koja prikazuje broj kopija HER2 za panel ciljanih ćelija, i za svaki, HER2 TDB EC50 i procenat zauzetosti HER2 u toj koncentraciji. Ciljane ćelije su MDA435, MDA231, MCF7, MDA453, BT474 i SKBR3.
Slika 97A je grafikon koji prikazuje procenat ubijanja ciljanih ćelija kao funkcija koncentracije HER2 TDB (UCHT1v9/hu4D5) kako je procenjeno oslobađanjem LDH. Ciljane ćelije su SKBR3, HCC1569, KPL4, HCC202, JIMT1 i CALU3; efektorske ćelije su PBMC; odnos efektorska ćelija:ciljana ćelija = 10:1.
Slika 97B je grafikon koji prikazuje procenat održivih ciljanih ćelija kao funkcija koncentracije trastuzumab emtansina (T-DM1), kako je procenjeno pomoću CELLTITERGLO® luminescentnog testa održivosti ćelija. Ciljane ćelije su roditeljske BT474-M1 i BT474-M1 rezistentne na T-DM1; efektorske ćelije su CD8+ T ćelije; odnos efektorska ćelija:ciljana ćelija = 3:1.
Slika 97C je grafikon koji prikazuje procenat održivih ciljanih ćelija kao funkcija koncentracije HER2 TDB (UCHT1v9/hu4D5) kako je procenjeno FACS analizom. Ciljane ćelije su roditeljske BT474-M1 i BT474-M1 rezistentne na T-DM1; efektorske ćelije su CD8+ T ćelije; odnos efektorska ćelija:ciljana ćelija = 3:1. Slika 98 je grafikon i tabela koja prikazuje farmakokinetiku (PK) HER2 TDB (UCHT1v9/hu4D5) kod Sprague-Dawley pacova kako je procenjeno pomoću ELISA.
Slika 99A je grafikon koji prikazuje relativnu zapreminu tumora tokom vremena za Grupu 1 (nosač od 0,5 mg/kg); Grupu 2 (PBMC (1) nosač pri 0,5 mg/kg); Grupu 3 (PBMC (1) HER2 TDB (UCHT1v9/hu4D5) pri 0,5 mg/kg); Grupu 4 (PBMC (2) nosač pri 0,5 mg/kg); i Grupu 5 (PBMC (2) HER2 TDB (UCHT1v9/hu4D5) pri 0,5 mg/kg).
Slika 99B je grafikon koji prikazuje procenat promene zapremine tumora tokom vremena za Grupu 1 (nosač od 0,5 mg/kg); i Grupu 2 (HER2 TDB (hu4D5/2C11) pri 0,5 mg/kg).
Slika 99C je histogram koji pokazuje relativni procenat promene zapremine tumora tokom vremena za Grupu 1 (nosač od 0,5 mg/kg); i Grupu 2 (HER2 TDB (hu4D5/2C11) pri 0,5 mg/kg).
Slika 99D je grafikon koji prikazuje relativnu zapreminu tumora tokom vremena za Grupu 1 (nosač od 0,5 mg/kg); i Grupu 2 (HER2 TDB (hu4D5/2C11) pri 0,5 mg/kg). Ispitivači su uključili tumore veće od 1000 mm<3>na početku tretmana.
Slika 99E je grafikon koji prikazuje procenat promene zapremine tumora tokom vremena za Grupu 1 (CD3 krak kontrola HER2 TDB (hu4D5/SP34) pri 0,5 mg/kg); i Grupu 2 (kontrolni TDB (2C11) pri 0,5 mg/kg). Slika 99F je grafikon koji prikazuje relativnu zapreminu tumora tokom vremena za Grupu 1 (nosač od 0,5 mg/kg); i Grupu 2 (HER2 TDB (hu4D5/SP34) pri 0,5 mg/kg).
1
Slika 99G je grafikon koji prikazuje relativnu zapreminu tumora tokom vremena za Grupu 1 (nosač od 0,5 mg/kg); Grupu 2 (HER2 TDB (hu4D5/2C11) pri 0,5 mg/kg); Grupu 3 (kontrolni TDB (2C11) pri 0,5 mg/kg); i Grupu 4 (T-DM1 u 15 mg/kg).
Slika 100A je grafikon koji prikazuje relativnu zapreminu tumora tokom vremena za Grupu 1 (netretirani); Grupu 2 (HER2 TDB (UCHT1v9/hu4D5) pri 0,5 mg/kg).
Slika 100B je grafikon koji prikazuje relativnu zapreminu tumora tokom vremena za Grupu 1 (nosač od 0,5 mg/kg); Grupu 2 (PBMC(3) nosač pri 0,5 mg/kg); i Grupu 3 (PBMC(3) kontrola TDB (2C11) u dozi od 0,5 mg/kg).
Slika 101A je grafikon koji prikazuje afinitet vezivanja za CD3-UCHT1 antitelo testirano za in vitro vezivanje za ljudski CD3 na ljudskim T ćelijama, CD3 TG T ćelije i BALB/c T ćelije, kako je procenjeno FACS analizom.
Slika 101B je grafikon koji prikazuje afinitet vezivanja za CD3-2C11 antitelo testirano za in vitro vezivanje za mišji CD3 na CD3 TG T ćelijama i BALB/c T ćelijama, kako je procenjeno FACS analizom.
Slika 102A je grafikon koji prikazuje procenat ubijanja CT26-HER2 ciljanih ćelija kao funkcija koncentracije HER2 TDB (UCHT1v9/hu4D5), kako je procenjeno FACS analizom. Efektorske ćelije su T ćelije izolovane iz ljudske periferne krvi, huCD3 transgene T ćelije slezine i BALB/c T ćelije slezine.
Slika 102B je grafikon koji prikazuje procenat ubijanja CT26-HER2 ciljanih ćelija kao funkcija koncentracije HER2 TDB (hu4D5/2C11), kako je procenjeno FACS analizom. Efektorske ćelije su T ćelije izolovane iz ljudske periferne krvi, huCD3 transgene T ćelije slezine i BALB/c T ćelije slezine.
Slika 103 je grafikon koji prikazuje relativnu zapreminu tumora tokom vremena za Grupu 1 (nosač od 0,5 mg/kg); i Grupu 2 (HER2 TDB (hu4D5/SP34) pri 0,5 mg/kg).
Slika 104 grafikon koji prikazuje krive vezivanja za svaki od tri LYPD1 TDB testirana za in vitro vezivanje za CD8+ T ćelije koje eksprimiraju CD3.
Slika 105 je grafikon koji prikazuje procenat ubijanja OVCAR3.Luc ciljanih ćelija kao funkcija koncentracije LYPD1 TDB.
Slika 106 je skup grafikona koji prikazuju procenat CD8+CD69+ (levo) i CD8+ CD25+ (desno) T ćelija kao funkcija koncentracije LYPD1 TDB, kako je procenjeno FACS analizom. Ciljane ćelije su OVCAR3.Luc ćelije; odnos efektorska ćelija:ciljana ćelija = 3:1.
Slika 107 prikazuje aminokiselinske sekvence varijabilnog domena lakog lanca (gore) i varijabilnog domena teškog lanca (dole) anti-RET antitela 41205.v6.
Slika 108A je grafikon koji prikazuje zapreminu tumora (mm<3>) kao funkcija vremena (dani) za Grupu 1 (nosač, qwx3, IV; n=9); Grupu 2 (CD20 TDB (2H7-mu2Cl1), 0,5 mg/kg, qwx3, IV; n=9); Grupu 3 (anti-PD1 (mu8F11 DANA), 10 mg/kg, tiwx3, IP; n=9); i Grupu 4 (anti-PD1 (mu8F11 DANA), 10 mg/kg, tiwx3, IP+ CD20 TDB (2H7-mu2C11), 0,5 mg/kg, qwx3, IV; n=9).
Slika 108B je grafikon koji prikazuje zapreminu tumora (mm<3>) kao funkcija vremena (dana) za Grupu 1 (nosač, qwx3, IV; n=9); Grupu 2 (CD20 TDB (2H7-mu2Cl1), 0,5 mg/kg, qwx3, IV; n=9); Grupu 3 (anti-PD1 (mu8F11 DANA), 10 mg/kg, tiwx3, IP; n=9); i Grupu 4 (anti-PD1 (mu8F11 DANA), 10 mg/kg, tiwx3, IP+ CD20 TDB (2H7-mu2C11), 0,5 mg/kg, qwx3, IV; n=9). Podebljana linija predstavlja odgovarajuću zapreminu tumora za navedenu grupu.
DETALJNI OPIS OTELOTVORENJA PRONALASKA
I. DEFINICIJE
[0027] Izraz „približno“ kako se ovde koristi odnosi se na uobičajeni raspon grešaka za odgovarajuću vrednost koja je poznata stručnjaku. Upućivanje na „približnu“ vrednost ili parametar ovde sadrži (i opisuje) otelotvorenja koja su sama po sebi usmerene na tu vrednost ili parametar.
[0028] „Akceptorski ljudski okvir“ u potrebe ovde je okvir koji sadrži aminokiselinsku sekvencu okvira varijabilnog domena lakog lanca (VL) ili okvir varijabilnog domena teškog lanca (VH) izveden iz ljudskog imunoglobulinskog okvira ili ljudskog konsenzus okvira, kako je definisano u nastavku. Akceptorski ljudski okvir „izveden“ iz ljudskog imunoglobulinskog okvira ili ljudskog konsenzus okvira može sadržati istu njegovu aminokiselinsku sekvencu ili može sadržati promene aminokiselinskih sekvenci. U nekim
2
otelotvorenjima broj promena aminokiselina je 10 ili manje, 9 ili manje, 8 ili manje, 7 ili manje, 6 ili manje, 5 ili manje, 4 ili manje, 3 ili manje, ili 2 ili manje. U nekim otelotvorenjima, VL akceptorski ljudski okvir identičan je sekvenci VL ljudskog imunoglobulinskog okvira ili sekvenci ljudskog konsenzus okvira.
[0029] „Afinitet“ se odnosi na jačinu ukupnog broja nekovalentnih interakcija između jednog mesta vezivanja molekula (npr., antitela) i njegovog vezujućeg partnera (npr. antigena). Ako nije drugačije naznačeno, kako se ovde koristi, „afinitet vezivanja“ odnosi se na svojstveni afinitet vezivanja koji odražava 1:1 interakciju između članova vezujućeg para (npr. antitela i antigena). Afinitet molekula X za njegovog partnera Y generalno može biti predstavljen konstantom disocijacije (KD). Afinitet se može meriti uobičajenim postupcima poznatim u struci, uključujući one opisane ovde. Specifična ilustrativna i ogledna otelotvorenja za merenje afiniteta vezivanja su opisane u nastavku.
[0030] „Afinitetno zrelo“ antitelo odnosi se na antitelo sa jednom ili više izmena u jednom ili više hipervarijabilnih regiona (HVR), u poređenju sa matičnim antitelom koje nema takve promene, i takve promene rezultuju poboljšanjem afiniteta antitela za antigen.
[0031] Izrazi „anti-CD3 antitelo“ i „antitelo koje se vezuje za CD3“ odnose se na antitelo koje je sposobno da vezuje CD3 sa dovoljnim afinitetom, tako da je antitelo korisno kao dijagnostički i/ili terapijski agens u ciljanju CD3. U jednom otelotvorenju, stepen vezivanja anti-CD3 antitela za nepovezani, ne-CD3 protein je manji od oko 10% vezivanja antitela za CD3, mereno, na primer, radioimunološkom analizom (RIA). U nekim otelotvorenjima, antitelo koje se vezuje za CD3 ima konstantu disocijacije (Kd) ≤ 1 µM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0,1 nM, ≤ 0,01 nM, ili ≤ 0,001 nM (npr.10<-8>M ili manje, npr. Od 10<-8>M do 10<-13>M, npr., Od 10<-9>M do 10<-13>M). U nekim rešenjima, antitelo protiv CD3 se vezuje za epitop CD3 koji je konzerviran između CD3 različitih vrsta.
[0032] Izraz „antitelo“ ovde se koristi u najširem smislu i obuhvata različite strukture antitela, uključujući, ali ne ograničavajući se na monoklonska antitela, poliklonska antitela, multispecifična antitela (npr. bispecifična antitela) i fragmente antitela sve dok pokazuju željenu aktivnost vezivanja antigena.
[0033] „Fragment antitela“ odnosi se na molekul, koji nije netaknuto antitelo, koji sadrži deo netaknutog antitela koje vezuje antigen za koji se netaknuto antitelo vezuje. Primeri fragmenata antitela uključuju, ali nisu ograničeni na Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; dijatela; linearna antitela; molekule jednolančanih antitela (npr. scFv); i multispecifična antitela formirana iz fragmenata antitela.
[0034] Pod „vezujućim domenom“ podrazumeva se deo jedinjenja ili molekula koji se specifično vezuje za ciljani epitop, antigen, ligand ili receptor. Vezujući domeni uključuju, ali nisu ograničeni na antitela (npr. monoklonska, poliklonska, rekombinantna, humanizovana i himerna antitela), fragmente antitela ili njihove delove (npr. Fab fragmenti, Fab'2, scFv antitela, SMIP, domenska antitela, dijatela, minitela, scFv-Fc, antitela, nanotela i VH i/ili VL domene antitela), receptore, ligande, aptamere i druge molekule koji imaju identifikovanog vezujućeg partnera.
[0035] „Hemoterapijski agens“ je hemijsko jedinjenje korisno u tretmanu raka. Primeri hemoterapeutika uključuju članove grupe koju čine alkilacioni agensi kao što su tiotepa i ciklosfosfamid (CITOXAN®); alkil sulfonati poput busulfana, improsulfana i piposulfana; aziridini kao što su benzodopa, karbokuon, meturedopa i uredopa; etilenimini i metilamelamini, uključujući altretamin, trietilenmelamin, trietilenfosforamid, trietilentiofosforamid i trimetilomelamin; acetogenini (posebno bulatacin i bulatacinon); delta-9-tetrahidrokanabinol (dronabinol, MARINOL®); beta-lapahon; lapahol; kolhicini; betulinska kiselina; kamptotecin (uključujući sintetički analog topotekan (HYCAMTIN®), CPT-11 (irinotekan, CAMPTOSAR®), acetilkamptotecin, skopolektin i 9-aminokamptotecin); briostatin; kalistatin; CC-1065 (uključujući sintetičke analoge adozelesina, karzelesina i bizelesina); podofilotoksin; podofilinska kiselina; teniposid; kriptoficini (posebno kriptoficin 1 i kriptoficin 8); dolastatin; duokarmicin (uključujući sintetičke analoge, KW-2189 i CB1-TM1); eleuterobin; pancratistatin; sarkodiktin; spongistatin; azotne ipirite kao što su hlorambucil, hlornafazin, hlorofosfamid, estramustin, ifosfamid, mehloretamin, mehlorethamin oksid hidrohlorid, melfalan, novembikin, fenestarin, prednimustin, trofosfamid, uracil ipirit; nitrozuree kao što su karmustin, hlorozotocin, fotemustin, lomustin, nimustin i ranimnustin; antibiotici poput enedinskih antibiotika (npr. kaliheamicin, naročito kaliheamicin gama1l i kaliheamicin omegaII (pogledati npr. Nicolaou i dr., Angew. Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)); CDP323, inhibitor oralnog alfa-4 integrina; dinemicin, uključujući dinemicin A; esperamicin; kao i neokarzinostatin hromofor i srodni hromoprotein enedin antibiotčki hromofori), aklacinomizini, aktinomicin, autramicin, azaserin, bleomicini, kaktinomicin, karabicin, kaminomicin, karzinofilin, hromomicini, daktinomicin, daunorubicin, detorubicin, 6-diazo-5-okso-L-norleukin, doksorubicin (uključujući ADRlAMYClN®, morfolino-doksorubicin, cijanomorfolino-doksorubicin, 2-pirolino-doksorubicin, lipozom doksorubicin HCI (DOXIL®) injekcija, lipozomalni doksorubicin TLC D-99 (MYOCET®), pegilovani lipozomalni doksorubicin (CAELYX®), i deoksidoksorubicin), epirubicin, esorubicin, idarubicin, marcelomicin, mitomicin kao što su mitomicin C, mikofenolna kiselina, nogalamicin, olivomicini, peplomicin, porfiromicin, puromicin, kuelamicin, rodorubicin, streptonigrin, streptozocin, tubercidin, ubenimeks, zinostatin, zorubicin; antimetaboliti poput metotreksata, gemcitabina (GEMZAR®), tegafur (UFTORAL®), kapecitabina (XELODA®), epotilona i 5-fluorouracila (5-FU); kombestastatin; analozi folne kiseline kao što su denopterin, metotreksat, pteropterin, trimetreksat; purinski analozi kao što su fludarabin, 6-merkaptopurin, tiamiprin, tioguanin; analozi pirimidina kao što su ancitabin, azacitidin, 6-azauridin, karmofur, citarabin, dideoksiuridin, doksifluridin, enocitabin, flokuridin; androgeni poput kalusterona, dromostanolona propionata, epitiostanola, mepitiostana, testolaktona; anti-adrenalne kiseline kao što su aminoglutetimid, mitotan, trilostan; obnavljač folne kiseline kao što je frolinska kiselina; aceglaton; aldofosfamid glikozid; aminolevulinska kiselina; eniluracil; amsakrin; bestrabucil; bisantren; edatraksat; defofamin; demekolcin; diazikuone; eformitin; eliptinijum acetat; epotilon; etoglucid; galijum nitrat; hidroksiurea; lentinan; lonidainin; majtansinoidi kao što su majtansin i ansamitocini; mitoguazon; mitoksantron; mopidanmol; nitraerin; pentostatin; fenamet; pirarubicin; losoksantron; 2-etilhidrazid; prokarbazin; PSK® polisaharidni kompleks (JHS Natural Products, Eugene, Oreg.); razoksan; rizoksin; sizofuran; spirogermanijum; tenuazonska kiselina; triazikuon; 2,2',2'-trihlorotrietilamin; trihoteceni (posebno T-2 toksin, verakurin A, roridin A i anguidin); uretan; vindezin (ELDISINE®, FILDESIN®); dakarbazin; manomustin; mitobronitol; mitolaktol; pipobroman; gacitozin; arabinozid („Ara-C“); tiotepa; taksidoid, npr. paklitaksel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), albumin-dizajnirana nanočestična formulacija paklitaksela (ABRAXANE™) i docetaksel (TAXOTERE®, Rhome-Poulene Rorer, Antony, France); hloranbucil; 6-tioguanin; merkaptopurin; metotreksat; agensi platine kao što su cisplatin, oksaliplatin (npr. ELOXATIN®) i karboplatin; vinke, koje sprečavaju da polimerizacija tubulina formira mikrotubule, uključujući vinblastin (VELBAN®), vinkristin (ONCOVIN®), vindezin (ELDISINE®, FILDESIN®) i vinorelbine (NAVELBINE®); etopozid (VP-16); ifosfamid; mitoksantron; leukovorin; novantron; edatrekat; daunomicin; aminopterin; ibandronat; inhibitor topoizomeraze RFS 2000; difluorometilornitin (DMFO); retinoidi poput retinoične kiseline, uključujući beksaroten (TARGRETIN®); bisfosfonati kao što su klodronat (na primer, BONEFOS® ili OSTAC®), etidronat (DIDROCAL®), NE-58095, zoledronska kiselina/zoledronat (ZOMETA®), alendronat (FOSAMAX®), pamidronat (AREDIA®), tiludronat (SKELID®) ili risedronat (ACTONEL®); troksacitabin (analog 1,3-dioksolan nukleozid citozina); antisens oligonukleotidi, posebno oni koji inhibiraju eksprimiranje gena u signalnim putevima koji su umešani u aberantnu proliferaciju ćelija, kao što su, na primer, PKC-alfa, Raf, H-Ras i receptor epidermalnog faktora rasta (EGF-R) (npr. erlotinib (Tarceva™)); i VEGF-A koji smanjuju proliferaciju ćelija; vakcine poput THERATOPE® i vakcina genske terapije, na primer, ALLOVECTIN® vakcina, LEUVECTIN® vakcina i VAXID® vakcina; inhibitor topoizomeraze 1 (npr. LURTOTECAN®); rmRH (npr. ABARELIX®); BAY439006 (sorafenib; Bayer); SU-11248 (sunitinib, SUTENT®, Pfizer); perifozin, COX-2 inhibitor (npr. celekoksib ili etorikoksib), inhibitor proteozoma (npr. PS341); bortezomib (VELCADE®); CCI-779; tipifarnib (R11577); orafenib, ABT510; Bcl-2 inhibitor, kao što je oblimersen natrijum (GENASENSE®); piksantron; EGFR inhibitori; inhibitori tirozin kinaze; inhibitori serin-treonin kinaze, poput rapamicina (sirolimus, RAPAMUNE®); inhibitori farnesiltransferaze kao što je lonafarnib (SCH 6636, SARASAR™); i farmaceutski prihvatljive soli, kiseline ili derivati bilo čega od gore navedenog; kao i kombinacije dva ili više od gore navedenog, kao što je CHOP, skraćenica za kombinovanu terapiju ciklofosfamidom, doksorubicinom, vinkristinom i prednizolonom; i FOLFOX, skraćenica za režim tretmana oksaliplatinom (ELOXATIN™) u kombinaciji sa 5-FU i leukovorinom, i farmaceutski prihvatljive soli, kiseline ili derivati bilo čega od gore navedenog; kao i kombinacije dva ili više od gore navedenog.
[0036] Hemoterapijski agensi koja su ovde definisani uključuju „anti-hormonske agense“ ili „endokrine terapeutike“ koji deluju na regulisanje, smanjenje, blokiranje ili inhibiranje dejstva hormona koji mogu pospešiti rast raka. Oni mogu i sami biti hormoni, uključujući, ali bez ograničavanja na: antiestrogene i selektivne modulatore receptora estrogena (SERM), uključujući, na primer, tamoksifen (uključujući NOLVADEX® tamoksifen), raloksifen, droloksifen, 4-hidroksitamoksifen, trioksifen, keoksifen, LY117018, onapriston i FARESTON.cndot.toremifen; inhibitore aromataze koji inhibiraju enzim aromatazu, koja reguliše proizvodnju estrogena u nadbubrežnoj žlezdi, kao što su, na primer, 4(5)-imidazoli, aminoglutethimid, MEGASE® megestrol acetat, AROMASIN® eksemestan, formestanie, fadrozol, RIVISOR® vorozol, FEMARA® letrozol i ARIMIDEX® anastrozol; i anti-androgene, poput flutamida, nilutamida, bikalutamida, leuprolida i goserelina; kao i troksacitabin (analog 1,3-dioksolan nukleozid citozina); antisens oligonukleotide, naročito one koji inhibiraju eksprimiranje gena u signalnim putevima umešanim u nepravilnu proliferaciju ćelija, kao što su, na primer, PKC-alfa, Raf i H-Ras; ribozimi kao što su inhibitor eksprimiranja VEGF (npr. ANGIOZYME® ribozim) i inhibitor eksprimiranja HER2; vakcine kao što su vakcine za gensku terapiju, na primer, ALLOVECTIN® vakcina, LEUVECTIN® vakcina i VAXID® vakcina; PROLEUKIN® rIL-2; LURTOTECAN® inhibitor topoizomeraze 1; ABARELIX® rmRH; vinorelbin i esperamicini (pogledati U.S. Pat. No. 4,675,187), i farmaceutski prihvatljive soli, kiseline ili derivati bilo čega od gore navedenog; kao i kombinacije dva ili više gore navedenih.
[0037] Izraz „himerno“ antitelo odnosi se na antitelo u kom deo teškog i/ili lakog lanca potiče iz određenog izvora ili vrste, dok ostatak teškog i/ili lakog lanca potiče iz drugog izvora ili vrste.
[0038] Izraz „klaster diferencijacije 3“ ili „CD3“, kako se ovde koristi, odnosi se na bilo koji izvorni CD3 iz bilo kog izvora kičmenjaka, uključujući sisare poput primata (npr. ljudi) i glodara (npr. miševi i pacovi), osim ako nije drugačije naznačeno, uključujući, na primer, CD3ε, CD3γ, CD3α i CD3β lance. Izraz obuhvata neobrađen CD3 „pune dužine“ (npr. neobrađen ili neizmenjeni CD3ε ili CD3γ), kao i bilo koji oblik CD3 koji nastaje obradom u ćeliji. Izraz takođe obuhvata varijante CD3 koje se javljaju u prirodi, uključujući, na primer, varijante spajanja ili alelne varijante. CD3 uključuje, na primer, ljudski CD3ε protein (NCBI RefSeq br. NP_000724), dužine 207 aminokiselina, i ljudski protein CD3γ(NCBI RefSeq br. NP_000064), dužine 182 aminokiselina.
[0039] „Klasa“ antitela odnosi se na tip konstantnog domena ili konstantnog regiona koji poseduje njegov teški lanac. Postoji pet glavnih klasa antitela: IgA, IgD, IgE, IgG i IgM, i nekoliko njih se može dalje podeliti u podklase (izotipove), npr. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1i IgA2. Konstantni domeni teških lanaca koji odgovaraju različitim klasama imunoglobulina zovu se α, δ, ε, γ i µ, respektivno.
[0040] Podrazumeva se da ovde opisani aspekti i otelotvorenja predmetnog pronalaska uključuju „sadrži,“ „obuhvata“ i „sastoji se pretežno od“ aspekte i otelotvorenja.
[0041] Izraz „citotoksični agens“ kako se ovde koristi odnosi se na supstancu koja inhibira ili sprečava ćelijsku funkciju i/ili uzrokuje ćelijsku smrt ili uništenje. Citotoksični agensi uključuju, ali nisu ograničeni na, radioaktivne izotope (npr. At<211>, I<131>, I<125>, Y<90>, Re<186>, Re<188>, Sm<153>, Bi<212>, P<32>, Pb<212>i radioaktivne izotope od Lu); hemoterapijske agense ili lekove (npr. metotreksat, adriamicin, vinka alkaloidi (vinkristin, vinblastin, etopozid), doksorubicin, mefalan, mitomicin C, hlorambucil, daunorubicin ili druge interkalirajuće agense); agense za inhibiciju rasta; enzime i njihove fragmente, kao što su nukleolitični enzimi; antibiotici; toksini kao što su toksini malih molekula ili enzimatski aktivni toksini bakterijskog, gljivičnog, biljnog ili životinjskog porekla, uključujući fragmente i/ili njihove varijante; i razne antitumorske ili antirakogene agense obelodanjene u nastavku.
[0042] „Poremećaj“ je svako stanje koje bi imalo koristi od tretmana, uključujući, ali ne ograničavajući se na, hronične i akutne poremećaje ili bolesti, uključujući ona patološka stanja koja predisponiraju sisara za poremećaj.
[0043] Izrazi „poremećaj proliferacije ćelija“ i „poremećaj proliferacije“ odnose se na poremećaje koji su povezani sa određenim stepenom nenormalne proliferacije ćelija. U jednom aspektu, poremećaj proliferacije ćelija je rak. U jednom aspektu, poremećaj proliferacije ćelija je tumor.
[0044] Izrazi „rak“ i „kancer“ odnose se na ili opisuju fiziološko stanje kod sisara kom je obično svojstven neregulisani rast ćelija. Primeri raka uključuju, ali nisu ograničeni na, rak, limfom, blastom, sarkom i leukemiju ili limfoidne malignitete. Konkretniji primeri takvih rakova uključuju, ali nisu ograničeni na, rak pločastih ćelija (npr. epitelni rak pločastih ćelija), rak pluća, uključujući rak malih ćelija pluća, rak ne-malih ćelija pluća, adenokarcinom pluća i pločasti rak pluća, rak peritoneuma, hepatocelularni rak, rak želuca ili stomaka, uključujući rak gastrointestinalnog trakta i stromalni rak gastrointestinalnog trakta, rak pankreasa, glioblastom, rak grlića materice, rak jajnika, rak jetre, rak mokraćne bešike, rak mokraćnih puteva, hepatom, rak dojke, rak debelog creva, rak rektuma, rak debelog creva, rak endometrijuma ili materice, rak pljuvačne žlezde, rak bubrega ili renalni rak, rak prostate, rak vulve, rak štitne žlezde, rak jetre, rak anusa, rak penisa, melanom, melanom koji se površinski širi, lentigo maligni melanom akralni lentiginalni melanomi, nodularni melanomi, multipli mijelom i limfom B-ćelija (uključujući niskog stepena/folikularni ne-Hodžkinov limfom (NHL); mali limfocitni (SL) NHL; NHL srednjeg stepena/folikularni; difuzni NHL srednjeg stepena; imunoblastni NHL visokog stepena; limfoblastni NHL visokog stepena; NHL visokog stepena malih nerazdvojenih ćelija; NHL glomazne bolesti; limfom plaštastih ćelija; limfom povezan sa AIDS-om; i Valdenstromova makrolobulinemija); hronična limfocitna leukemija (CLL); akutna limfoblastična leukemija
2
(ALL); leukemija dlakavih ćelija; hronična mijeloblastična leukemija; limfoproliferativni poremećaj nakon transplantacije (PTLD), kao i abnormalna vaskularna proliferacija povezana sa fakomatozama, edemi (poput onih povezanih sa tumorima mozga), Meigsov sindrom, mozak, kao i rak glave i vrata i pridružene metastaze. U određenim otelotvorenjima, rakovi koji su podložni tretmanu antitelima predmetnog pronalaska uključuju rak dojke, rak debelog creva, rektalni rak, rak ne-malih ćelija pluća, glioblastom, ne-Hodžkinov limfom (NHL), rak bubrežne ćelije, rak prostate, rak jetre, rak pankreasa, sarkom mekog tkiva, Kaposijev sarkom, karcinoidni rak, rak glave i vrata, rak jajnika, mezoteliom i multipli mijelom. U nekim otelotvorenjima, rak je odabran između: raka malih ćelija pluća, gliblastoma, neuroblastoma, melanoma, raka dojke, raka želuca, raka debelog creva (CRC) i hepatocelularnog raka. Ipak, u nekim otelotvorenjima, rak je odabran između: raka ne-malih ćelija pluća, raka debelog creva, glioblastoma i raka dojke, uključujući metastatske oblike tih rakova. U drugim otelotvorenjima, rak je izabran iz klase zrelih B-ćelijskih rakova isključujući Hodžkinov limfom, ali uključujući članove grupe koju čine germinalno-centralni DLBCL nalik B ćelijama (GCB), aktivirani DLBCL sličan B ćelijama (ABC), folikularni limfom (FL), limfom plaštastih ćelija (MCL), akutna mijeloidna leukemija (AML), hronična limfoidna leukemija (CLL), limfom marginalne zone (MZL), mala limfocitna leukemija (SLL), limfoplazmacitni limfom (LL), Valdenstromova makroglobulinemija (WM), limfom centralnog nervnog sistema (CNSL), Burkitov limfom (BL), prolimfocitna leukemija B-ćelija, limfom marginalne zone slezine, leukemija dlakavih ćelija, limfom/leukemija slezine, ne može da se klasifikuje, limfom malih B-ćelija difuzne crvene pulpe slezine, varijanta leukemije dlakavih ćelija, Valdenstromova makroglobulinemija, bolesti teškog lanca, bolest α teškog lanca, bolest γ teškog lanca, bolest µ teškog lanca, mijelom ćelija plazme, solitarni plazmacitom kosti, ekstraozalni plazmacitom, ekstrastranodalni limfom marginalne zone mukoznog limfnog tkiva (MALT limfom), nodalni limfom marginalne zone, pedijatrijski nodalni limfom marginalne zone, pedijatrijski folikularni limfom, limfom primarnih kožnih folikula, limfom T-ćelija/histiocitima bogatih velikih B-ćelija, primarni DLBCL centralnog nervnog sistema, primarni kožni DLBCL, tip nogu, EBV-pozitivan DLBCL starijih osoba, DLBCL povezan sa hroničnom upalom, limfomatoidna granulomatoza, primarni medijumastinalni (timični) limfom velikih B-ćelija, limfom intravaskularnih velikih B-ćelija, ALK-pozitivan limfom velikih B-ćelija, plazmablastični limfom, limfom velikih B-ćelija nastao u HHV8-povezanoj multicentričnoj Kaslmanovoj bolesti, primarni izlivni limfom: limfom B-ćelija, koji se ne može klasifikovati, sa karakteristikama sredine između difuznog limfoma velikih B-ćelija i Burkitovog limfoma, i limfom B-ćelija, koji se ne može klasifikovati, sa karakteristikama sredine između difuznog limfoma velikih B-ćelija i klasičnog Hodžkinovog limfoma.
[0045] „Tumor“, kako se ovde koristi, odnosi se na sav neoplastični rast i proliferaciju ćelija, bilo da je maligni ili benigni, i sve pred-kancerozne i kancerozne ćelije i tkiva. Izrazi „rak“, „rak“, „poremećaj proliferacije ćelija“, „poremećaj proliferacije“ i „tumor“ nisu međusobno isključivi, kako je ovde navedeno.
[0046] Izraz „tumorski antigen“, kako se ovde koristi, može se razumeti kao onaj antigen koji je predstavljen u ćelijama tumora. Ovi antigeni mogu se predstaviti na ćelijskoj površini sa vanćelijskim delom, koji se često kombinuje sa transmembranskim i citoplazmatskim delom molekula. Ovi antigeni se ponekad mogu predstaviti samo od strane tumorskih ćelija, i nikada od strane normalnih. Tumorski antigeni se mogu eksprimirati isključivo na ćelijama tumora ili mogu predstavljati mutaciju specifičnu za tumor u poređenju sa normalnim ćelijama. U tom slučaju se nazivaju antigenima specifičnim za tumor. Češći su tumorski antigeni koji predstavljaju tumorske ćelije i normalne ćelije, i nazivaju se antigenima povezanim sa tumorima. Ovi antigeni povezani sa tumorima mogu biti prekomerno eksprimirani u poređenju sa normalnim ćelijama, ili su dostupni za vezivanje antitela u tumorskim ćelijama usled manje kompaktne strukture tumorskog tkiva u poređenju sa normalnim tkivom. U jednom aspektu, tumorski antigen je izabran od onih navedenih u Tabeli 1 u nastavku.
[0047] „Efektorske funkcije“ se odnose na one biološke aktivnosti koje se mogu pripisati Fc regionu antitela, i koje se razlikuju u zavisnosti od izotipa antitela. Primeri efektorskih funkcija antitela uključuju: : C1q vezivanje i citotoksičnost zavisnu od komplementa (CDC); vezivanje Fc receptora; citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC); fagocitozu; regulaciju na dole ćelijskih površinskih receptora (npr. B ćelijski receptor); i aktivaciju B ćelija.
[0048] „Efektivna količina“ jedinjenja, na primer, anti-CD3 antitela pronalaska ili njegovog sastava (npr. farmaceutski sastav) je najmanje minimalna količina koja je potrebna za postizanje željenog terapijskog ili profilaktičkog rezultata, kao što je primetno poboljšanje ili sprečavanje određenog poremećaja (npr. poremećaj proliferacije ćelija, npr. rak). Efikasna količina ovde može da varira u zavisnosti od faktora kao što su stanje bolesti, starost, pol i težina pacijenta, i sposobnost antitela da kod pojedinca izazove željeni odgovor. Efikasna količina je i ona u kojoj bilo koji toksični ili štetni efekti tretmana pretežu terapeutski korisnim efektima. Za profilaktičku upotrebu, korisni ili željeni rezultati uključuju rezultate kao što su uklanjanje ili smanjenje rizika, smanjenje težine ili odlaganje početka bolesti, uključujući biohemijske, histološke i/ili bihejvioralne simptome bolesti, njene komplikacije i intermedijumarne patološke fenotipe koji se javljaju tokom razvoja bolesti. Za terapijsku upotrebu, korisni ili željeni rezultati uključuju kliničke rezultate kao što su smanjenje jednog ili više simptoma koji su posledica bolesti, povećanje kvaliteta života osoba koje pate od bolesti, smanjenje doze drugih lekova potrebnih za tretman bolesti, pojačavanje efekta drugog leka, kao što je putem ciljanja, odlaganja napredovanja bolesti i/ili produžavanja preživljavanja. U slučaju raka ili tumora, efikasna količina leka može imati efekat na smanjenje broja ćelija raka; smanjenje veličine tumora; inhibiranje (tj. usporavanje do određene mere ili poželjno zaustavljanje) infiltracije ćelija raka u periferne organe; inhibiranje (tj. usporavanje do određene mere i poželjno zaustavljanje) metastaze tumora; inhibiranje do neke mere rasta tumora; i/ili ublažavanje do neke mere jednog ili više simptoma povezanih sa poremećajem. Efikasna količina može se primeniti u jednoj ili više primena. U svrhe predmetnog pronalaska, efikasna količina leka, jedinjenja ili farmaceutskog sastava je količina dovoljna za postizanje profilaktičkog ili terapijskog tretmana bilo direktno ili indirektno. Kao što se razume u kliničkom kontekstu, efikasna količina leka, jedinjenja ili farmaceutskog sastava može ali ne mora biti postignuta zajedno sa drugim lekom, jedinjenjem ili farmaceutskim sastavom. Prema tome, „efikasna količina“ se može razmotriti u kontekstu primene jednog ili više terapijskih agenasa, i može se smatrati da je jedan agens primenjen u efikasnoj količini, ako u kombinaciji sa jednim ili više drugih lekova, poželjan rezultat može biti ili je postignut.
[0049] Izraz „Fc region“ ovde se koristi da definiše C-terminalni region teškog lanca imunoglobulina koji sadrži bar deo konstantnog regiona. Izraz uključuje nativnu sekvencu Fc regiona i varijante Fc regiona. U jednom aspektu, Fc region ljudskog teškog IgG teškog lanca se proteže od Cys226, ili od Pro230, do karboksilnog kraja teškog lanca. Međutim, C-terminalni lizin (Lys447) iz Fc regiona može ali ne mora biti prisutan. Ako ovde nije drugačije navedeno, numeracija aminokiselinskih ostataka u Fc regionu ili konstantnom regionu je u skladu sa EU sistemom numeracije, koji se takođe naziva i EU indeks, kao što je opisano kod Kabat i dr., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.
[0050] „Okvir“ ili „FR“ odnosi se na ostatke varijabilnih domena koji nisu ostaci hipervarijabilnog regiona (HVR). FR varijabilnog domena se obično sastoji od četiri FR domena: FR1, FR2, FR3 i FR4. Shodno tome, HVR i FR sekvence obično se pojavljuju u narednoj sekvenci u VH (ili VL): FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
[0051] Izrazi „antitelo pune dužine“, „netaknuto antitelo“ i „celo antitelo“ ovde se koriste naizmenično kako bi se označilo antitelo koje ima strukturu u osnovi sličnu prirodnoj strukturi antitela, ili ima teške lance koji sadrže Fc region kao što je ovde definisano.
[0052] „Agens za inhibiciju rasta“, kada se ovde koristi, odnosi se na jedinjenje ili smešu koja ili inhibira rast ćelije, bilo in vitro ili in vivo. U jednom aspektu, agens za inhibiciju rasta je antitelo inhibitora rasta koje sprečava ili smanjuje proliferaciju ćelije koja eksprimira antigen na koji se antitelo vezuje. U drugom otelotvorenju, agens za inhibiciju rasta može biti onaj koji značajno smanjuje procenat ćelija u S fazi. Primeri agenasa za inhibiciju rasta uključuju agense koji blokiraju napredovanje ćelijskog ciklusa (na mestu koje nije S faza), kao što su agensi koji indukuju zaustavljanje G1 i zaustavljanje M-faze. Klasični blokatori M faze uključuju vinkase (vinkristin i vinblastin), taksane i inhibitore topoizomeraze II kao što su doksorubicin, epirubicin, daunorubicin, etopozid i bleomicin. Oni agensi koji zaustavljaju G1 takođe se prelivaju u zaustavljanje S-faze, na primer, DNK alkilacioni agensi kao što su tamoksifen, prednizon, dakarbazin, mehloretamin, cisplatin, metotreksat, 5-fluorouracil i ara-C. Dodatne informacije mogu se pronaći kod Mendelsohn i Israel, eds., The Molecular Basis of Cancer, Chapter 1, pod nazivom „Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs“ od Murakami i dr. (W.B. Saunders, Philadelphia, 1995), npr, str. 13. Taksani (paklitaksel i docetaksel) su lekovi protiv raka koji potiču iz tisa. Docetaksel (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer), izveden iz evropske tisovine, je polusintetički analog paklitaksela (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb). Paklitaksel i docetaksel potiču sastavljanje mikrotubula iz dimera tubulina i stabilizuju mikrotubule sprečavanjem depolimerizacije, što rezultuje inhibicijom mitoze u ćelijama.
[0053] Izraz „HER2-pozitivni“ rak sadrži ćelije raka koje imaju HER2 nivo viši od normalnog. Primeri HER2-pozitivnog raka uključuju HER2-pozitivni rak dojke i HER2-pozitivni rak želuca. Po izboru, HER2-pozitivni rak ima imunohistohemijsku (IHC) ocenu 2+ ili 3+ i/ili odnos amplifikacije in situ hibridizacije
2
(ISH) ≥2,0.
[0054] Izrazi „ćelija domaćina“, „ćelijska linija domaćina“ i „kultura ćelija domaćina“ se koriste naizmenično i odnose se na ćelije u koje je uvedena egzogena nukleinska kiselina, uključujući potomstvo takvih ćelija. Ćelije domaćini uključuju „transformatore“ i „transformisane ćelije“, koje uključuju primarnu transformisanu ćeliju i potomstvo dobijeno od nje bez obzira na broj prolazaka. Potomstvo možda nije u potpunosti identično matičnoj ćeliji po sadržaju nukleinske kiseline, ali može sadržati mutacije. Ovde su uključeni mutirani potomci koji imaju istu funkciju ili biološku aktivnost kao što je skrinigovano ili odabrano u prvobitno transformisanoj ćeliji.
[0055] „Ljudsko antitelo“ je ono koje poseduje aminokiselinsku sekvencu koja odgovara sekvenci antitela koje proizvodi čovek ili ljudska ćelija ili je izvedena iz izvora koji nije čovek, i koji koristi repertoar ljudskih antitela ili druge sekvence koje kodiraju ljudska antitela. Ova definicija ljudskog antitela izričito isključuje humanizovano antitelo koje sadrži ostatke koji se ne vezuju za ljudski antigen. Ljudska antitela se mogu proizvesti korišćenjem različitih tehnika poznatih u struci, uključujući biblioteke prikaza faga. Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks i dr., J. Mol. Biol., 222:581 (1991). Postupci opisani kod Cole i dr., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner i dr., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991) su takođe su dostupni za dobijanje ljudskih monoklonskih antitela. Pogledati takođe van Dijk i van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol., 5: 368-74 (2001). Ljudska antitela se mogu pripremiti primenom antigena transgenoj životinji koja je modifikovana tako da proizvodi takva antitela kao odgovor na antigeni izazov, ali čiji su endogeni lokusi deaktivirani, npr., imunizovani ksenomiševi (pogledati, npr., SAD patente br.6,075,181 i 6,150,584 u vezi sa XENOMOUSE™ tehnologijom). Pogledati takođe, na primer, Li i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006) vezano za ljudska antitela koja su generisana pomoću tehnologije hibridoma ljudske B-ćelije.
[0056] „Ljudski konsenzus okvir“ je okvir koji predstavlja najčešće prisutne aminokiselinske ostatke u izboru sekvenci VL ili VH okvira ljudskog imunoglobulina. Generalno, izbor VL ili VH sekvenci ljudskog imunoglobulina je iz podgrupe sekvenci varijabilnih domena. Generalno, podgrupa sekvenci je podgrupa kao kod Kabat i dr., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols.1-3. U jednom aspektu, za VL, podgrupa je podgrupa kapa I kao kod Kabat i dr., supra. U jednom otelotvorenju, za VH, podgrupa je podgrupa III kao kod Kabat i dr., supra.
[0057] „Humanizovano“ antitelo odnosi se na himerno antitelo koje sadrži aminokiselinske ostatke neljudskih HVR i aminokiselinske ostatke ljudskih FR. U određenim otelotvorenjima, humanizovano antitelo će sadržati uglavnom najmanje jedan, i obično dva, varijabilna domene, u kojima svi ili suštinski svi HVR (npr. CDR) odgovaraju onima od ne-ljudskog antitela, i svi ili suštinski svi FR odgovaraju onima ljudskog antitela. Humanizovano antitelo opciono može da sadrži bar deo konstantnog regiona antitela izvedenog iz ljudskog antitela. „Humanizovani oblik“ antitela, npr., ne-ljudsko antitelo, odnosi se na antitelo koje je pretrpelo humanizaciju.
[0058] Izraz „hipervarijabilni region“ ili „HVR“, kako se ovde koristi, odnosi se na sve regione varijabilnog domena antitela koji su hipervarijabilni po sekvenci („regioni koji određuju komplementarnost“ ili „CDR“) i/ili formiraju strukturno definisane petlje („hipervarijabilne petlje“) i/ili sadrže ostatke koji se dovode u dodir sa antigenom („antigenski dodiri“). Generalno, antitela sadrže šest HVR: tri u VH (H1, H2, H3) i tri u VL (L1, L2, L3). Ovde prikazani primeri HVR uključuju:
(a) hipervarijabilne petlje koje se javljaju u aminokiselinskim ostacima 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2) i 96-101 (H3) (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol.196:901-917 (1987)); (b) CDR koji se javljaju u aminokiselinskim ostacima 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (H1), 50-65 (H2), i 95-102 (H3)) (Kabat i dr., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991));
(c) antigenski dodiri koji se javljaju u aminokiselinskim ostacima 27c-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (H1), 47-58 (H2), i 93-101 (H3) (MacCallum i dr. J. Mol. Biol.262: 732-745 (1996)); i (d) kombinacije (a), (b) i/ili (c), uključujući HVR aminokiselinske ostatke 46-56 (L2), 47-56 (L2), 48-56 (L2), 49-56 (L2), 26-35 (H1), 26-35b (Hl), 49-65 (H2), 93-102 (H3), i 94-102 (H3).
[0059] Ako nije drugačije naznačeno, HVR ostaci i drugi ostaci u varijabilnom domenu (npr. FR ostaci) su ovde numerisani prema Kabat i dr., supra.
[0060] „Imunokonjugat“ je antitelo konjugovano na jedan ili više heterolognih molekula, uključujući, ali ne
2
ograničavajući se na citotoksični agens.
[0061] „Pacijent“ ili „pojedinac“ je sisar. Sisari uključuju, ali nisu ograničeni na, domaće životinje (npr. krave, ovce, mačke, pse i konje), primate (npr. ljude i primate koji nisu čovek poput majmuna), zečeve i glodare (npr. miševe i pacove). U nekim otelotvorenjima, pacijent ili pojedinac je čovek.
[0062] „Izolovano“ antitelo je ono koje je izdvojeno iz komponente prirodnog okruženja. U nekim otelotvorenjima, antitelo se prečišćava do čistoće veće od 95% ili 99%, što je određeno, na primer, elektroforetski (npr. SDS-PAGE, izoelektrično fokusiranje (IEF), kapilarna elektroforeza) ili hromatografski (npr., jonskom razmena ili obrnuta faza HPLC). Za pregled postupaka za procenu čistoće antitela pogledati npr. Flatman i dr., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007).
[0063] „Izolovana“ nukleinska kiselina odnosi se na molekul nukleinske kiseline koji je odvojen od komponente prirodnog okruženja. Izolovana nukleinska kiselina uključuje molekul nukleinske kiseline sadržan u ćelijama koje obično sadrže molekul nukleinske kiseline, ali je molekul nukleinske kiseline prisutan ekstrahromozomski ili na hromozomskoj lokaciji koja je različita od njegove prirodne hromozomske lokacije.
[0064] „Izolovana nukleinska kiselina koja kodira anti-CD3 antitelo“ odnosi se na jedan ili više molekula nukleinske kiseline koji kodiraju teške i lake lance antitela (ili njihove fragmente), uključujući takve molekule nukleinske kiseline u jednom vektoru ili odvojenim vektorima, i takav molekul nukleinske kiseline prisutan na jednoj ili više lokacija u ćeliji domaćinu.
[0065] Izraz „monoklonsko antitelo“, kako se ovde koristi, odnosi se na antitelo dobijeno iz populacije suštinski homogenih antitela, tj. pojedinačna antitela koja obuhvataju populaciju su identična i/ili vezuju isti epitop, osim mogućih varijanti antitela, npr. koja sadrže prirodne mutacije ili one koje nastaju tokom proizvodnje monoklonskog preparata antitela, i takve varijante su obično prisutne u manjim količinama. Za razliku od preparata za poliklonska antitela, koji obično uključuju različita antitela usmerena protiv različitih determinanti (epitopi), svako monoklonsko antitelo monoklonskog preparata antitela usmereno je protiv jedne determinante na antigenu. Prema tome, modifikator „monoklonski“ ukazuje na karakter antitela koje je dobijeno iz suštinski homogene populacije antitela i ne treba ga tumačiti kao da zahteva proizvodnju antitela bilo kojim određenim postupkom. Na primer, monoklonska antitela koja će se koristiti u skladu sa predstavljenim pronalaskom mogu se napraviti različitim tehnikama, uključujući, ali ne ograničavajući se na postupak hibridoma, rekombinantne DNK postupke, postupke prikazivanja faga i postupke koji koriste transgene životinje koje sadrže sve ili deo ljudskog imunoglobulinskog lokusa, takvi postupci i drugi primerni postupci za pravljenje monoklonskih antitela su ovde opisani.
[0066] „Golo antitelo“ se odnosi na antitelo koje nije konjugovano sa heterolognom grupom (npr. citotoksičnim delom) ili radio-oznakom. Golo antitelo može biti prisutno u farmaceutskoj formulaciji.
[0067] „Nativna antitela“ se odnose na prirodne molekule imunoglobulina sa različitim strukturama. Na primer, nativna IgG antitela su heterotetramerni glikoproteini od oko 150.000 daltona, sastavljeni od dva identična laka lanca i dva identična teška lanca koja su disulfidno vezana. Od N-do C-terminusa, svaki teški lanac ima varijabilni region (VH), koji se takođe naziva varijabilni domen teškog ili varijabilni domen teškog lanca, i zatim slede tri konstantna domena (CH1, CH2 i CH3). Slično tome, od N- do C-terminusa, svaki laki lanac ima varijabilni region (VL), koji se takođe naziva laki varijabilni domen lakog ili varijabilni domen lakog lanca, i sledi laki konstantni domen (CL). Laki lanac antitela može se dodeliti jednoj od dve vrste, nazvane kapa (κ) i lambda (λ), na osnovu aminokiselinske sekvence njenog konstantnog domena.
[0068] Izraz „umetak u pakovanju“ koristi se za uputstva uobičajeno uključena u komercijalna pakovanja terapijskih proizvoda, koje sadrže informacije o indikacijama, upotrebi, doziranju, primeni, kombinovanoj terapiji, kontraindikacijama i/ili upozorenjima za upotrebu takvih terapijskih proizvoda.
[0069] Izraz „antagonist koji vezuje PD-1 osu“ odnosi se na molekul koji inhibira interakciju vezujućeg partnera PD-1 ose sa jednim ili više njegovih vezujućeg partnera, tako da ukloni disfunkciju T-ćelija koja je posledica signalizacije na PD-1 signalnoj osi – gde je rezultat obnavljanje ili poboljšanje funkcije T-ćelija (npr. proliferacija, proizvodnja citokina, ubijanje ciljane ćelije). Kako se ovde koristi, antagonist koji vezuje PD-1 osu uključuje antagonist koji vezuje PD-1, antagonist koji vezuje PD-L1 i antagonist koji vezuje PD-L2.
[0070] Izraz „antagonist koji vezuje PD-1“ odnosi se na molekul koji smanjuje, blokira, inhibira, ukida ili ometa transdukciju signala koja je posledica interakcije PD-1 sa jednim ili više njegovih vezujućih partnera,
2
kao što su PD-L1, PD -L2. U nekim otelotvorenjima, antagonist koji vezuje PD-1 je molekul koji inhibira vezivanje PD-1 za jednog ili više njegovih vezujućih partnera. U specifičnom aspektu, antagonist koji vezuje PD-1 inhibira vezivanje PD-1 za PD-L1 i/ili PD-L2. Na primer, antagonisti vezivanja za PD-1 uključuju anti-PD-1 antitela, njihove antigen vezujuće fragmente, imunoadhezine, fuzione proteine, oligopeptide i druge molekule koji smanjuju, blokiraju, inhibiraju, ukidaju ili ometaju transdukciju signala koja je posledica interakcije PD-1 sa PD-L1 i/ili PD-L2. U jednom aspektu, antagonist koji vezuje PD-1 smanjuje negativni ko-stimulišući signal posredovan proteinima ćelijske površine ili kroz proteine ćelijske površine, eksprimiran na T-limfocitima posredovanoj signalizaciji kroz PD-1, tako da čini disfunkcionalnu T-ćeliju manje disfunkcionalnom (npr., pojačavajući efektorske odgovore do prepoznavanja antigena). U nekim otelotvorenjima, antagonist koji vezuje PD-1 je antitelo protiv PD-1. U specifičnom aspektu, PD-1 antagonist koji vezuje je ovde opisan MDX-1106 (nivolumab). U drugom specifičnom aspektu, antagonist koji vezuje PD-1 je ovde opisan MK-3475 (lambrolizumab). U drugom specifičnom aspektu, PD-1 antagonist koji vezuje je ovde opisan CT-011 (pidilizumab). U drugom specifičnom aspektu, antagonist koji vezuje PD-1 je ovde opisan AMP-224.
[0071] Izraz „antagonist koji vezuje PD-L1“ odnosi se na molekul koji smanjuje, blokira, inhibira, ukida ili ometa transdukciju signala koja je posledica interakcije PD-L1 sa jednim ili više njegovih vezujućih partnera, kao što su PD-1, B7-1. U nekim otelotvorenjima, antagonist koji vezuje PD-L1 je molekul koji inhibira vezivanje PD-L1 za njegove vezujuće partnere. U specifičnom aspektu, antagonist koji vezuje PD-L1 inhibira vezivanje PD-L1 za PD-1 i/ili B7-1. U nekim otelotvorenjima, antagonisti vezivanja za PD-L1 uključuju anti-PD-L1 antitela, njihove antigen vezujuće fragmente, imunoadhezine, fuzione proteine, oligopeptide i druge molekule koji smanjuju, blokiraju, inhibiraju, ukidaju ili ometaju transdukciju signala koja je posledica interakcije PD-L1 sa jednim ili više njegovih vezujućih partnera, kao što su PD-1, B7-1. U jednom aspektu, antagonist koji vezuje PD-L1 smanjuje negativni ko-stimulišući signal, posredovan proteinima ćelijske površine ili kroz proteine ćelijske površine, eksprimiran na T-limfocitima posredovanoj signalizaciji kroz PD-L1, tako da čini disfunkcionalnu T-ćeliju manje disfunkcionalnom (npr., pojačavajući efektorske odgovore do prepoznavanja antigena). U nekim otelotvorenjima, antagonist koji vezuje PD-L1 je anti-PD-L1 antitelo. U specifičnom aspektu, anti-PD-L1 antitelo je ovde opisan YW243.55.S70. U drugom specifičnom aspektu, anti-PD-L1 antitelo je ovde opisan MDX-1105. U još jednom specifičnom aspektu, anti-PD-L1 antitelo je ovde opisan MPDL3280A. U još jednom specifičnom aspektu, anti-PD-L1 antitelo je ovde opisan MEDI4736.
[0072] Izraz „antagonist koji vezuje PD-L2“ odnosi se na molekul koji smanjuje, blokira, inhibira, ukida ili ometa transdukciju signala koja je posledica interakcije PD-L2 sa bilo jednim ili više njegovih vezujućih partnera, kao što je PD-1. U nekim otelotvorenjima, antagonist koji vezuje PD-L2 je molekul koji inhibira vezivanje PD-L2 za jednog ili više njegovih vezujućih partnera. U specifičnom aspektu, antagonist koji vezuje PD-L2 inhibira vezivanje PD-L2 za PD-1. U nekim otelotvorenjima, PD-L2 antagonisti uključuju anti-PD-L2 antitela, njihove antigen vezujuće fragmente, imunoadhezine, fuzione proteine, oligopeptide i druge molekule koji smanjuju, blokiraju, inhibiraju, ukidaju ili ometaju transdukciju signala koja je posledica interakcije PD -L2 sa jednim ili više njegovih vezujućih partnera, kao što je PD-1. U jednom otelotvorenju, antagonist koji vezuje PD-L2 smanjuje negativni ko-stimulišući posredovan proteinima ćelijske površine ili kroz proteine ćelijske površine, eksprimiran na T-limfocitima posredovanoj signalizaciji kroz PD-L2, tako da čini disfunkcionalnu T-ćeliju manje disfunkcionalnom (npr., pojačavajući efektorske odgovore do prepoznavanja antigena). U nekim otelotvorenjima, antagonist koji vezuje PD-L2 je imunoadhezin.
[0073] Izraz „protein“, kako se ovde koristi, odnosi se na bilo koji nativni protein iz bilo kog izvora kičmenjaka, uključujući sisare poput primata (npr. ljudi) i glodara (npr. miševi i pacovi), osim ako nije drugačije naznačeno. Izraz obuhvata neobrađen protein „pune dužine“, kao i bilo koji oblik proteina koji nastaje obradom u ćeliji. Izraz takođe obuhvata varijante proteina koje se javljaju u prirodi, npr. varijante spajanja ili alelne varijante. Proteini prema pronalasku uključuju, na primer, bilo koji protein naveden u Tabeli 1.
[0074] „Procenat (%) identičnosti aminokiselinske sekvence“ u odnosu na referentnu polipeptidnu sekvencu se definiše kao procenat aminokiselinskih ostataka u kandidat sekvenci koji su identični aminokiselinskim ostacima u referentnoj polipeptidnoj sekvenci, nakon poravnanja sekvenci i uvođenja razmaka, ako je potrebno, za postizanje maksimalnog procenta identičnosti sekvence, i ne uzima u razmatranje bilo koje konzervativne supstitucije kao deo identičnosti sekvence. Usklađivanje u svrhu određivanja procenta identičnosti aminokiselinskih sekvenci može se postići na različite načine koji su poznati u struci, na primer, korišćenjem javno dostupnog računarskog softvera poput BLAST, BLAST-2, ALIGN ili Megalign
2
(DNKSTAR) softvera. Stručnjaci mogu odrediti odgovarajuće parametre za poravnavanje sekvenci, uključujući bilo koje algoritme potrebne za postizanje maksimalnog poravnanja po celoj dužini sekvence koja se poredi. Međutim, za potrebe ovde, vrednosti % identičnosti aminokiselinskih sekvenci generišu se korišćenjem računarskog programa za poređenje sekvenci ALIGN-2. Kompjuterski program za poređenje sekvenci ALIGN-2 delo je Genentech, Inc., i izvorni kod je podnesen sa korisničkom dokumentacijom kod U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559, gde je registrovan pod SAD autorskim brojem TXU510087. Program ALIGN-2 javno je dostupan od Genentech, Inc., South San Francisco, California, ili se može sastaviti iz izvornog koda. Program ALIGN-2 treba da bude sastavljen za upotrebu u UNIX operativnom sistemu, uključujući digitalni UNIX V4.0D. Sve parametre za poređenje sekvenci postavlja program ALIGN-2 i oni ne variraju.
[0075] U situacijama kada se ALIGN-2 koristi za poređenje aminokiselinskih sekvenci, % identičnosti aminokiselinske sekvence date aminokiselinske sekvence A u odnosu na datu aminokiselinsku sekvencu B (što se alternativno može reći kao data aminokiselina sekvenca A koja ima ili sadrži izvestan % identičnosti aminokiselinske sekvence u odnosu na datu aminokiselinsku sekvencu B), izračunava se na naredni način: 100 puta razlomak X/Y
gde je X broj aminokiselinskih ostataka koji su zabeleženi kao identične podudarnosti programom za poravnavanje redosleda ALIGN-2 u poravnavanju A i B u tom programu, gde je Y ukupni broj aminokiselinskih ostataka u B. Podrazumevaće se da gde dužina aminokiselinske sekvence A nije jednaka dužini sekvence B aminokiselina B, % identičnosti aminokiselinske sekvence A u odnosu na B neće biti jednak % identičnosti aminokiselinske sekvence B u odnosu na A. Ako nije drugačije navedeno, svi vrednosti % identičnosti aminokiselinske sekvence koje se ovde koriste dobijene su kao što je opisano u prethodnom paragrafu pomoću računarskog programa ALIGN-2.
[0076] Izraz „farmaceutska formulacija“ odnosi se na preparat koji je u takvom obliku koji omogućava da biološka aktivnost aktivnog sastojka koji se nalazi u njemu bude efikasna, i koji ne sadrži dodatne komponente koje su neprihvatljivo toksične za pacijenta kom formulacija treba da se primeni.
[0077] „Farmaceutski prihvatljiv nosač“ odnosi se na sastojak u farmaceutskoj formulaciji, osim aktivnog sastojka, koji je netoksičan za pacijenta. Farmaceutski prihvatljiv nosač uključuje, ali nije ograničen na, pufer, ekscipijens, stabilizator ili konzervans.
[0078] Kako se ovde koristi, „tretman“ (i njegove gramatičke varijacije, kao što je „tretiranje“ ili „tretirati“) odnosi se na kliničku intervenciju u pokušaju da se promeni prirodni tok pojedinca koji se tretira, i može se izvesti bilo za profilaksu ili tokom tok kliničke patologije. Poželjni efekti tretmana uključuju, ali nisu ograničeni na, sprečavanje pojave ili ponavljanja bolesti, ublažavanje simptoma, smanjenje bilo kakvih direktnih ili indirektnih patoloških posledica bolesti, sprečavanje metastaza, smanjenje brzine napredovanja bolesti, poboljšanje ili ublažavanje bolesti stanje bolesti i remisiju ili poboljšanu prognozu. U nekim otelotvorenjima, antitela predmetnog pronalaska se koriste da odlože razvoj bolesti ili da uspore napredovanje bolesti.
[0079] Kako se ovde koristi, „odlaganje progresije“ poremećaja ili bolesti znači odlaganje, ometanje, usporenje, usporavanje, stabilizovanje i/ili odlaganje razvoja bolesti ili poremećaja (npr., poremećaj proliferacije ćelija, npr. rak). Ovo odlaganje može biti različito vreme, zavisno od istorije bolesti i/ili pojedinca koji se tretira. Kao što je očigledno stručnjaku, dovoljno ili značajno odlaganje može, suštinski, obuhvatiti prevenciju, tako da pojedinac ne razvije bolest. Na primer, rak u kasnoj fazi, kao što je razvoj metastaza, može da se odloži.
[0080] Pod „smanjenjem“ ili „inhibicijom“ podrazumeva se sposobnost izazivanja ukupnog smanjenja, na primer, od 20% ili više, od 50% ili više, ili od 75%, 85%, 90%, 95% ili više. U nekim otelotvorenjima, smanjenje ili inhibicija može da se odnosi na efektorsku funkciju antitela koja posredovana Fc regionom antitela, i takve efektorske funkcije posebno uključuju citotoksičnost zavisnu od komplementa (CDC), ćelijsku citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC) i ćelijsku fagocitozu zavisnu od antitela (ADCP).
[0081] Izraz „varijabilni region“ ili „varijabilni domen“ odnosi se na domen antitela teškog ili lakog lanca koji je uključen u vezivanje antitela na antigen. Varijabilni domeni teškog i lakog lanca (VH i VL, respektivno) nativnog antitela uglavnom imaju slične strukture, gde domeni svi sadrže četiri sačuvana okvirna regiona (FR) i tri hipervarijabilna regiona (HVR). (Pogledati npr. Kindt i dr. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007).) Jedan VH ili VL domen može biti dovoljan da prenese specifičnost vezivanja antigena. Dalje, antitela koja vezuju određeni antigen mogu biti izolovana
2
korišćenjem VH ili VL domena iz antitela koje vezuje taj antigen za skrining biblioteke komplementarnih VL ili VH domena, respektivno. Pogledati npr. Portolano i dr., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson i dr., Nature 352:624-628 (1991).
[0082] Izraz „vektor“, kako se ovde koristi, odnosi se na molekul nukleinske kiseline koji je sposoban da propagira drugu nukleinsku kiselinu na koju je povezan. Izraz uključuje vektor kao samoobnavajuću strukturu nukleinske kiseline, kao i vektor ugrađen u genom ćelije domaćina u koju je uveden. Određeni vektori su u stanju da usmere eksprimiranje nukleinskih kiselina sa kojima su operativno vezani. Takvi se vektori ovde nazivaju „vektori eksprimiranja“.
[0083] Kako se ovde koristi, „primena“ podrazumeva postupak primene doze jedinjenja (npr., anti-CD3 antitela pronalaska ili nukleinske kiseline koja kodira anti-CD3 antitelo pronalaska) ili sastava (npr. farmaceutski sastav, npr., farmaceutski sastav koja uključuje anti-CD3 antitelo pronalaska) pacijentu. Sastavi korišćeni u ovde opisanim postupcima mogu se primenjivati, na primer, intramuskularno, intravenski, intradermalno, perkutano, intraarterijalno, intraperitonealno, intralezionalno, intrakranijalno, intraartikularno, intraprostatično, intrapleuralno, intratrahealno, intranazalno, intraviteralno, intravaginalno, intrarektalno, topikalno, intratumoralno, peritonealno, subkutano, subkonjuktivno, intravestikularno, mukozno, intrapericardijalno, intraumbilično, intraokularno, oralno, topikalno, lokalno, inhalacijom, injekcijom, infuzijom, kontinuiranom infuzijom, lokalizovanim perfuzionim kupanjem ciljanih ćelijama direktno, kateterom, u kremama ili u lipidnim sastavima. Postupak primene može da varira u zavisnosti od različitih faktora (npr. jedinjenja ili smeše koje se primenjuje i težine stanja, bolesti ili poremećaja koji se tretira).
II. SASTAVI I POSTUPCI
[0084] U jednom aspektu, pronalazak pruža anti-CD3 antitelo koje je bispecifično antitelo, gde bispecifično antitelo sadrži anti-CD3 krak koji sadrži prvi vezujući domen koji sadrži (a) VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 184 i (b) VL domen koji sadrži aminokiselinu sekvenca SEQ ID NO: 185, i anti-HER2 krak koji sadrži drugi vezujući domen koji sadrži (a) VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 270 i (b) VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID BR: 271. Antitela prema pronalasku su korisna, na primer, za tretman ili odlaganje napredovanja poremećaja proliferacije ćelija (npr. raka) ili autoimunog poremećaja, ili za pojačavanje imune funkcije kod pacijenta koji ima takav poremećaj.
A. Primeri anti-CD3 antitela
[0085] U jednom aspektu, obelodanjenje pruža izolovana antitela koja se vezuju za CD3 (npr., CD3ε i/ili CD3γ).
[0086] Na primer, u jednom aspektu, obelodanjenje pruža anti-CD3 antitelo koje ima vezujući domen koji sadrži najmanje jedan, dva, tri, četiri, pet, ili šest hipervarijabilnih regiona (HVR) odabranih između (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 2; (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 3; (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 4; (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 5; i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 6. U nekim slučajevima, anti-CD3 antitelo sadrži najmanje jedan (npr.1, 2, 3 ili 4) okvirni region teškog lanca FR-H1, FR-H2, FR-H3 i FR-H4 koji sadrži sekvence SEQ ID NO: 301-304, i/ili najmanje jedan (npr. 1, 2, 3 ili 4) okvirni region lakog lanca FR-L1, FR-L2, FR-L3 i FR-L4 koji sadrži sekvence SEQ ID NO: 305-308, respektivno. U nekim slučajevima, anti-CD3 antitelo može imati varijabilni domen teškog lanca (VH) uključujući i aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 90% identičnosti sekvence (npr., najmanje 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sekvence) u odnosu na sekvencu, ili samu sekvencu, SEQ ID NO: 184 i/ili varijabilni domen lakog lanca (VL) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 90% identičnosti sekvence (npr., najmanje 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identičnosti sekvence) u odnosu na sekvencu, ili samu sekvencu, SEQ ID NO: 185. U drugim slučajevima, anti-CD3 antitelo sadrži najmanje jedan (npr. 1, 2, 3 ili 4) okvirni region teškog lanca FR-H1, FR-H2, FR-H3 i FR-H4 koji sadrže sekvence SEQ ID NO: 293-296, i/ili najmanje jedan (npr.1, 2, 3 ili 4) okvirni region lakog lanca FR-L1, FR-L2, FR-L3 i FR-L4 koji sadrže sekvence SEQ ID NO: 297-300, respektivno. U nekim slučajevima, anti-CD3 antitelo može imati VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 90% identičnosti sekvence (npr., najmanje 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sekvence) u odnosu na sekvencu, ili samu sekvencu, SEQ ID NO: 186 i/ili VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 90% identičnosti sekvence (npr., najmanje 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sekvence) u odnosu na sekvencu, ili samu sekvencu, SEQ ID NO: 187. U posebnom primeru, anti-CD3 antitelo može biti 40G5c, ili njegov derivat ili klonski srodnik.
[0087] U drugom aspektu, antitelo obelodanjenja sadrži (a) VH domen koji sadrži najmanje jednu, najmanje dve ili sve tri VH HVR sekvence odabrane između (i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1, (ii) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 2, i (iii) HVR-H3 koja sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu od SEQ ID NO: 3; i (b) VL domen koji sadrži najmanje jednu, najmanje dve, ili sve tri VL HVR sekvence odabrane između (i) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 4, (ii) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 5 i (iii) HVR-L3 koja sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 6. U nekim slučajevima, anti-CD3 antitelo može imati VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 184 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 185. U nekim slučajevima, anti-CD3 antitelo može imati VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 186 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 187. U posebnom primeru, anti-CD3 antitelo može biti 40G5c, ili njegov derivat ili klonski srodnik.
[0088] U bilo kom od gore navedenih otelotvorenja, anti-CD3 antitelo je humanizovano. U jednom otelotvorenju, anti-CD3 antitelo sadrži HVR kao u bilo kom od gore navedenih otelotvorenja, i dalje sadrži ljudski prihvatni okvir, npr. ljudski imunoglobulinski okvir ili ljudski konsenzusni okvir.
[0089] U drugom aspektu, pruženo je anti-CD3 antitelo, gde antitelo sadrži VH kao u bilo kom od gore navedenih otelotvorenja, i VL kao u bilo kom od gore navedenih otelotvorenja, gde jedna ili obe sekvence varijabilnih domena uključuju post-translacione modifikacije.
[0090] U narednom aspektu, obelodanjenje pruža antitelo koje se vezuje za isti epitop kao i anti-CD3 antitelo koje je ovde pruženo. Na primer, u određenim otelotvorenjima, pruženo je antitelo koje se vezuje za isti epitop kao i anti-CD3 antitelo koje sadrži VH sekvencu SEQ ID NO: 184 i VL sekvencu SEQ ID NO: 185. U nekim otelotvorenjima obelodanjenja pruženo je antitelo koje se vezuje za epitop unutar fragmenta CD3 (npr. ljudski CD3ε) koji se sastoji od aminokiselina 1-26 (SEQ ID NO: 283) ili 1-27 (SEQ ID NO: 278) ljudskog CD3ε.
[0091] U drugom aspektu, obelodanjenje pruža antitelo koje vezuje jedinstveni CD3 epitop. U nekim otelotvorenjima, anti-CD3 antitelo predmetnog obelodanjenja ostvaruje jedinstvene dodire sa aminokiselinama ljudskog CD3ε na rastojanju od 3,5 Angstroma, 3,25 Angstroma, 3,00 Angstroma, 2,75 Angstroma ili manje. U određenim otelotvorenjima pruženo je antitelo koje se vezuje za epitop koji se sastoji od jedne, dve, tri, četiri ili pet aminokiselina ljudskog CD3ε na rastojanju od 3,5 Angstroma, 3,25 Angstroma, 3,00 Angstroma, 2,75 Angstroma ili manje. U jednom obelodanjenju, anti-CD3 antitelo predmetnog obelodanjenja ostvaruje jedinstvene dodire sa aminokiselinama ljudskog CD3ε na udaljenosti od 3,5 Angstroma ili manje. U nekim otelotvorenjima obelodanjenja, pruženo je antitelo koje se vezuje za epitop koji se sastoji od jedne, dve, tri, četiri ili pet aminokiselina ljudskog CD3ε na udaljenosti od 3,5 Angstroma ili manje. Na primer, u određenim otelotvorenjima obelodanjenja, pruženo je antitelo koje se vezuje za epitop koji se sastoji od aminokiselina ljudskih CD3ε odabranih između Gln1, Asp2, Asn4, Glu6 i Met7. U jednom određenom otelotvorenju predmetnog obelodanjenja, anti-CD3 antitelo se vezuje za epitop koji posebno uključuje Glu6. U nekim drugim otelotvorenjima predmetnog obelodanjenja, pruženo je antitelo koje se ne vezuje za epitop koji uključuje ljudsku CD3ε aminokiselinu Glu5. U nekim drugim otelotvorenjima predmetnog obelodanjenja, pruženo je antitelo koje se ne vezuje za epitop koji uključuje ljudske CD3ε aminokiseline Gly3 i Glu5.
[0092] Anti-CD3 epitop se može odrediti vezivanjem anti-CD3 antitela za peptidne fragmente epitopa. Alternativno, anti-CD3 epitop može biti određen mutagenezom skeniranja alanina. U jednom otelotvorenju predmetnog obelodanjenja, smanjenje vezivanja anti-CD3 antitela na mutirani CD3 za 20%, 30%, 50%, 80% ili više ukazuje da je aminokiselinski ostatak CD3 mutiran u testu mutageneze skeniranja alanina epitopski ostatak za to anti-CD3 antitelo. Alternativno, anti-CD3 epitop se može odrediti masenom spektrometrijom. U nekim otelotvorenjima obelodanjenja, epitop je određen kristalografijom (npr., postupcima kristalografije opisanim u Primerima).
[0093] U nekim otelotvorenjima predmetnog obelodanjenja, epitop određen kristalografijom je određen pomoću aminokiselina Q1-M7 CD3. U nekim otelotvorenjima epitop, kako je određen kristalografijom, je određen upotrebom aminokiselina QDGNEEMGGITQTPYK (SEQ ID NO: 284) od CD3.
[0094] U nekim otelotvorenjima obelodanjenja, epitop kako je određen kristalografijom može se izvesti kombinovanjem anti-CD3 antitela Fab, rastvorenog u 0,15 M NaCI, 25 mM tris, pH 7,5 pri 10 mg/ml, sa dvostrukim molarnim viškom (1 mg) CD3ε peptida, i početnim skriningom retke matrice taloga u formatu
1
difuzije sedeće kapi. Optimizovani kristali mogu se uzgajati iz smeše 1:1 sa rastvorom rezervoara koji sadrži 70% v/v metil-pentandiola i 0,1 M HEPES puferom pri pH 7,5. Rezervoar se može koristiti kao krioprotektant. Kristali se mogu prebaciti na kriogenu temperaturu naglim uranjanjem u tečni azot.
[0095] Difrakcioni podaci za kristale mogu se prikupljati na Advanced Photon Source snopu 22ID, koristeći MAR300 CCD detektor. Snimljene difrakcije mogu se integrisrati i skalirati pomoću programa HKL2000.
[0096] Struktura se može fazirati postupkom molekularne zamene (MR) korišćenjem programa Phaser. Na primer, MR model pretrage je Fab podjedinica izvedena iz kristalne strukture HGFA/Fab kompleksa (PDB kod: 2R0L). CD3ε peptid je ugrađen u strukturu zasnovanu na Fo-Fc mapi. Struktura se može naknadno rafinirati programima REFMAC5 i PHENIX koristeći maksimalne verovatne ciljane funkcije, anizotropski postupak rafiniranja pojedinačnog B faktora i TLS postupak rafiniranja kako bi se postigla konvergencija.
[0097] U nekim drugim aspektima obelodanjenja, pruženo je antitelo koje uključuje paratop koji se vezuje za isti epitop kao i anti-CD3 antitelo koje je ovde pruženo. Na primer, pruženo je antitelo koje se vezuje za isti epitop kao i paratop anti-CD3 antitela koji sadrži aminokiseline koje formiraju dodire na udaljenosti od 3,5 Angstroma ili manje. U određenim aspektima obelodanjenja, pruženo je antitelo koje se vezuje za isti epitop kao i paratop anti-CD3 antitela koji se sastoji od aminokiselina VH regiona anti-CD3 antitela izabranog iz grupe koja sadrži 33Tyr, 35His, 50Trp, 97Tyr, i 98Ser. Na primer, pruženo je antitelo koje se vezuje za isti epitop kao i paratop anti-CD3 antitela koji se sastoji od jedne, dve, tri, četiri ili pet aminokiselina iz VH regiona anti-CD3 antitela izabranog iz grupe koja sadrži 33Tyr, 35His, 50Trp, 97Tyr i 98Ser. Na primer, pruženo je antitelo koje se vezuje za isti epitop kao i paratop anti-CD3 antitela koji se sastoji od aminokiselina VL regiona anti-CD3 antitela izabranog iz grupe koja sadrži 27Arg, 27Asn, 30Lys, 32Tyr, 92Phe, 94Leu i 96Arg. Na primer, pruženo je antitelo koje se vezuje za isti epitop kao i paratop anti-CD3 antitela koji se sastoji od jedne, dve, tri, četiri, pet, šest, ili sedam aminokiselina iz VL regiona anti-CD3 antitela izabranog iz grupe koja sadrži 27Arg, 27Asn, 30Lys, 32Tyr, 92Phe, 94Leu i 96Arg. Na primer, pruženo je antitelo koje se ne vezuje za isti epitop kao paratop anti-CD3 antitela koji se sastoji od aminokiselina iz VL regiona koji sadrži 91Ser. Na primer, anti-CD3 antitelo prema bilo kom od gore navedenih aspekta je monoklonsko antitelo, koje sadrži himerno, humanizovano ili ljudsko antitelo. U jednom otelotvorenju predmetnog obelodanjenja, anti-CD3 antitelo je fragment antitela, na primer, Fv, Fab, Fab', scFv, dijatelo ili F(ab')2 fragment. U drugom otelotvorenju, antitelo je antitelo pune dužine, npr., netaknuto IgG antitelo (npr., netaknuto IgG1 antitelo) ili druga klasa antitela ili izotip kao što je ovde definisano.
[0098] U narednom aspektu, anti-CD3 antitelo može sadržati bilo koje od karakteristika, pojedinačno ili u kombinaciji, kao što je opisano u Odeljcima 1-7 u nastavku.
1. Afinitet antitela
[0099] U jednom otelotvorenju obelodanjenja, KDse meri radio-označenim testom vezivanja antigena (RIA). U jednom otelotvorenju, RIA se izvodi sa Fab verzijom antitela od interesa i njegovog antigena. Na primer, afinitet vezivanja Fab za antigen meri se izjednačavanjem Fab sa minimalnom koncentracijom (<125>I)-označenog antigena u prisustvu serije titracije neoznačenih antigena, i zatim hvatanjem vezanog antigena sa pločom prekrivenom anti-Fab antitelom (pogledati npr. Chen i dr., J. Mol. Biol. 293:865-881(1999)). Kako bi se uspostavili uslovi za ispitivanje, MICROTITER® ploče sa više komorica (Thermo Scientific) su preko noći obložene sa 5 µg/ml hvatajućeg anti-Fab antitela (Cappel Labs) u 50 mM natrijum-karbonata (pH 9,6), i potom blokirane sa 2% (v/v) goveđeg serumskog albumina u PBS tokom dva do pet sati na sobnoj temperaturi (približno 23°C). Na ne-adsorbentnoj ploči (Nunc #269620), 100 pM ili 26 pM [<125>I]-antigena se meša sa serijskim razblaživanjem Fab od interesa (npr., u skladu sa procenom anti-VEGF antitela, Fab-12, kod Presta i dr., Cancer Res. 57:4593-4599 (1997)). Fab od interesa se zatim inkubira preko noći; međutim, inkubacija može da traje duže vreme (npr. oko 65 sati) kako bi se osiguralo postizanje ravnoteže. Nakon toga, smeše se prenose na ploču za hvatanje za inkubaciju na sobnoj temperaturi (npr. tokom jednog sata). Rastvor se zatim uklanja i ploča je isprana osam puta sa 0,1% polisorbatom 20 (Tween-20®) u PBS. Kada se ploče osuše, dose primenjuje 150 µl/komorica scintilanta (MICROSCINT-20™; Packard) i ploče se broje na TOPCOUNT™ gama brojaču (Packard) tokom deset minuta. Koncentracije svakog Fab koje daju manje ili jednako 20% maksimalnog vezivanja su izabrane za upotrebu u kompetitivnim testovima vezivanja.
[0100] Prema drugom otelotvorenju predmetnog obelodanjenja, KDse meri korišćenjem BIACORE® testa površinske plazmonske rezonance. Na primer, ispitivanje pomoću BIACORE®-2000 ili BIACORE®-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) se izvodi na 25°C sa imobilisanim CM5 čipovima antigena pri -10 jedinicama odziva (RU). U jednom otelotvorenju predmetnog obelodanjenja, karboksimetilirani dekstran
2
biosenzorski čipovi (CM5, BIACORE, Inc.) se aktiviraju sa N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)-karbodiimid hidrohloridom (EDC) i N-hidroksisukcinimidom (NHS) prema uputstvima dobavljača. Antigen je razblažen sa 10 mM natrijum acetata, pH 4,8, do 5 µg/ml (-0,2 µM) pre injekcije sa brzinom protoka od 5 µl/minut kako bi se postiglo približno 10 jedinica odgovora (RU) povezanog proteina. Nakon ubrizgavanja antigena, ubrzigava se 1 M etanolamina koji blokira nereagovane grupe. Za kinetička merenja, dvostruka serijska razblaženja Fab (0,78 nM do 500 nM) ubrizgavaju se u PBS sa 0,05% polisorbat 20 (Tween-20™) surfaktantom (PBST) na 25°C, sa protokom od približno 25 µl/minuta. Stope asocijacije (kon) i stope disocijacije (koff) izračunavaju se pomoću jednostavnog Langmuirovog modela vezivanja jedan na jedan (BIACORE® Evaluation Software verzija 3.2) istovremeno prilagođavanjem senzograma asocijacije i disocijacije. Ravnotežna konstanta disocijacije (KD) izračunava se kao kon/koffodnos. Pogledati, na primer, Chen i dr., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999). Ako je stopa dobijena gore navedenim testom površinske plazmonske rezonance veća od 10<6>M<-1>s<-1>, tada se brzina može odrediti upotrebom fluorescentne tehnike gašenja koja meri povećanje ili smanjenje intenziteta emisije fluorescencije (pobuđivanje = 295 nm; emisija = 340 nm, propusnost 16 nm) pri 25°C anti-antigen antitela od 20 nM (Fab oblik) u PBS, pH 7,2, u prisustvu povećanih koncentracija antigena merenih u spektrometru, kao što je spektrofometar opremljen sa stop-flow (Aviv Instruments) ili 8000-series SLM-AMINCO™ spektrofotometar (ThermoSpectronic) sa kivetom za mešanje.
2. Fragmenti antitela
[0101] U nekim aspektima obelodanjenja, antitelo koje je ovde pruženo je fragment antitela. Fragmenti antitela uključuju, ali nisu ograničeni na, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv i scFv fragmenti i drugi fragmenti opisani u nastavku. Za pregled određenih fragmenata antitela pogledati Hudson i dr. Nat. Med. 9:129-134 (2003). Za pregled scFv fragmenata pogledati, npr. Pluckthün, u The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg i Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994); takođe pogledati WO 93/16185; i SAD patente br. 5,571,894 i 5,587,458. Za diskusiju o Fab i F(ab')2fragmentima koji sadrže ostatke epitopa koji vezuju receptor oporavka i imaju povećan in vivo polu-život, pogledati SAD patent br.5,869,046.
[0102] Dijatela su fragmenti antitela sa dva mesta vezivanja antigena koja mogu biti dvovalentna ili bispecifična. Pogledati, na primer, EP 404,097; WO 1993/01161; Hudson i dr. Nat. Med.9:129-134 (2003); i Hollinger i dr. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993). Trijatela i tetratela su takođe opisana kod Hudson i dr. Nat. Med.9:129-134 (2003).
[0103] Jednodomenska antitela su fragmenti antitela koji sadrže čitav ili deo varijabilnog domena teškog lanca ili čitav ili deo varijabilnog domena lakog lanca antitela. U nekim otelotvorenjima, jednodomensko antitelo je ljudsko jednodomensko antitelo (Domantis, Inc., Waltham, MA; see, e.g., U.S. Patent No.
6,248,516 B1).
[0104] Fragmenti antitela mogu se napraviti različitim tehnikama, uključujući, ali ne ograničavajući se na proteolitičku digestiju netaknutih antitela, kao i proizvodnju rekombinantnih ćelija domaćina (npr. E. Coli ili fag), kao što je ovde opisano.
3. Himerna i humanizovana antitela
[0105] U nekim otelotvorenjima obelodanjenja, ovde pruženo antitelo je himerno antitelo. Određena himerna antitela su opisana, npr. u SAD patentu br. 4,816,567; i Morrison i dr. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). U jednom primeru, himerno antitelo sadrži ne-ljudski varijabilni region (npr. varijabilni region dobijen od miša, pacova, hrčka, zeca ili primata koji nije čovek, poput majmuna) i ljudski konstantni region. U narednom primeru, himerno antitelo je antitelo „sa prebačenom klasom“ u kom je klasa ili potklasa promenjena od one matičnog antitela. Himerna antitela uključuju njihove antigen vezujuće fragmente.
[0106] U nekim otelotvorenjima obelodanjenja, himerno antitelo je humanizovano antitelo. Tipično, neljudsko antitelo se humanizuje kako bi se smanjila imunogenost za ljude, zadržavajući specifičnost i afinitet roditeljskog ne-ljudskog antitela. Generalno, humanizovano antitelo sadrži jedan ili više varijabilnih domena u kojima su HVR, npr. CDR, (ili njihovi delovi) izvedeni iz ne-ljudskih antitela, i FR (ili njihovi delovi) su izvedeni iz sekvenci ljudskih antitela. Humanizovano antitelo opciono će takođe sadržati bar deo ljudskog konstantnog regiona. U nekim otelotvorenjima obelodanjenja, neki FR ostaci u humanizovanom antitelu su supstituisani odgovarajućim ostacima iz ne-ljudskog antitela (npr. antitela iz kojih su HVR ostaci izvedeni), npr. radi vraćanja ili poboljšanja specifičnosti ili afiniteta antitela.
[0107] Pregledana su humanizovana antitela i postupci za njihovo pravljenje, npr. kod Almagro i Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008), i dalje opisani npr., u Riechmann i dr., Nature 332:323-329 (1988); Queen i dr., Proc. Nat'lAcad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989); SAD patentima br. 5, 821,337, 7,527,791, 6,982,321, i 7,087,409; Kashmiri i dr., Methods 36:25-34 (2005) (opisuje graftovanje regiona koji određuje specifičnost (SDR)); Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) (opisuje „resurfacing“); Dall'Acqua i dr., Methods 36:43-60 (2005) (opisuje „FR pomeranje“); i Osbourn i dr., Methods 36:61-68 (2005) i Klimka i dr., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000)(opisuje pristup „navođene selekcije“ za FR pomeranje).
[0108] Ljudskog okvirni regioni koji se mogu koristiti za humanizaciju uključuju, ali nisu ograničeni na: okvirne regione odabrane postupkom „najboljeg uklapanja“ (pogledati npr. Sims i dr. J. Immunol. 151:2296 (1993)); okvirni regioni izvedene iz konsenzus sekvence ljudskih antitela određene podgrupe varijabilnih regiona lakog ili teškog lanca (pogledati npr. Carter i dr. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); i Presta i dr. J. Immunol., 151:2623 (1993)); ljudski zreli (stomatski mutirani) okvirni regioni ili ljudski germlinijski okvirni regioni (pogledati npr. Almagro i Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)); i okvirni regioni izvedeni iz skrining FR biblioteka (pogledati, npr., Baca i dr., J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997) i Rosok i dr., J. Biol. Chem.271:22611-22618 (1996)).
4. Ljudska antitela
[0109] U nekim aspektima obelodanjenja, ovde pruženo antitelo je ljudsko antitelo. Ljudska antitela se mogu proizvesti korišćenjem različitih tehnika poznatih u struci. Ljudska antitela su generalno opisana kod van Dijk i van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol.5: 368-74 (2001) i Lonberg, Curr. Opin. Immunol.20:450-459 (2008).
[0110] Ljudska antitela se mogu pripremiti primenom imunogena transgenoj životinji koja je modifikovana tako da proizvodi netaknuta ljudska antitela ili netaknuta antitela sa ljudskim varijabilnim regionima kao odgovor na antigeni izazov. Takve životinje obično sadrže sve ili deo ljudskog imunoglobulinskog lokusa koji zamenjuju endogene imunoglobulinske lokuse ili su prisutni ekstrahromozomski ili nasumično integrisani u životinjske hromozome. Kod takvih transgenih miševa, endogeni lokusi imunoglobulina su uglavnom inaktivirani. Za pregled postupaka za dobijanje ljudskih antitela od transgenih životinja, pogledati Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005). Pogledati takođe, npr. SAD patente br. 6,075,181 i 6,150,584 koji opisuju XENOMOUSE™ tehnologije; SAD patent br. 5,770,429 koji opisuje HUMAB® tehnologiju; SAD patent br. 7,041,870 koji opisuje K-M MOUSE® tehnologiju i SAD objavu patenata br. US 2007/0061900, koja opisuje VELOCIMOUSE® tehnologiju). Ljudski varijabilni regioni iz netaknutih antitela koja su generisana takvim životinjama mogu se dalje modifikovati, npr., kombinovanjem sa drugim ljudskim konstantnim regionom.
[0111] Ljudska antitela se takođe mogu proizvesti postupcima zasnovanim na hibridomima. Opisane su ćelijske linije ljudskog mijeloma i mišje-ljudskog heteromijeloma za proizvodnju ljudskih monoklonskih antitela. (Pogledati npr. Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur i dr., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); i Boerner i dr., J. Immunol., 147: 86 (1991).) Ljudska antitela koja su generisana pomoću tehnologije hibridoma ljudskih B-ćelija takođe su opisana kod Li i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006). Dodatni postupci uključuju one opisane, na primer, u SAD patentu br. 7,189,826 (opisuje proizvodnju monoklonskih ljudskih IgM antitela iz hibridoma ćelijskih linija) i Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006) (opisuje čovekčovek hibridome). Tehnologija ljudskih hibridoma (Trioma tehnologija) takođe je opisana i kod Vollmers and Brandlein, Histologi and Histopathologi, 20 (3): 927-937 (2005)) i Vollmers i Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005).
[0112] Ljudska antitela se takođe mogu generisati izolovanjem sekvenci varijabilnih domena Fv klona izabranih iz biblioteke prikaza faga izvedenih iz ljudi. Takve sekvence varijabilnih domena mogu se zatim kombinovati sa željenim ljudskim konstantnim domenom. Tehnike odabira ljudskih antitela iz biblioteka antitela su opisane u nastavku.
5. Antitela izvedena iz biblioteka
[0113] Antitela predmetnog obelodanjenja mogu biti izolovana pretragom kombinatornih biblioteka na antitela sa željenom aktivnošću ili aktivnostima. Na primer, u struci su poznati različiti postupci za generisanje biblioteka za prikaz faga i pretraga takvih biblioteka na antitela koja imaju željene karakteristike vezivanja. Takvi postupci su pregledani, na primer, kod Hoogenboom i dr. u Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien i dr., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001) i dalje opisani, npr. u McCafferty i dr., Nature 348:552-554; Clackson i dr., Nature 352: 624-628 (1991); Marks i dr., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992);
4
Marks i Bradbury, u Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu i dr., J. Mol. Biol.338(2): 299-310 (2004); Lee i dr., J. Mol. Biol.340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); i Lee i dr., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004).
[0114] U određenim postupcima prikaza faga, repertoari VH i VL gena odvojeno su klonirani lančanom reakcijom polimeraze (PCR) i rekombinovani nasumično u bibliotekama faga, koji se zatim mogu pretražiti za fag koji vezuje antigen kako je opisano kod Winter i dr., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994). Fagi obično prikazuju fragmente antitela, bilo kao jednolančani Fv (scFv) fragmenti ili kao Fab fragmenti. Biblioteke od imunizovanih izvora pružaju antitela visokog afiniteta na imunogen bez potrebe za stvaranjem hibridoma. Alternativno, naivni repertoar može biti kloniran (npr. od čoveka) kako bi se dobio jedan izvor antitela za širok spektar ne-samo i samo antigena bez imunizacije kako je opisano kod Griffiths i dr., EMBO J, 12: 725-734 (1993). Konačno, naivne biblioteke se takođe mogu napraviti sintetički kloniranjem neuređenih segmenata V gena iz matičnih ćelija i korišćenjem PCR prajmera koji sadrže nasumičnu sekvencu za kodiranje visoko varijabilnih CDR3 regiona i postizanje preuređenja. in vitro, kako je opisano kod Hoogenboom i Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992). Publikacije patenata koje opisuju biblioteke faga ljudskih antitela uključuju, na primer: SAD patent br. 5,750,373, i SAD publikacije patenata br.
2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936, i 2009/0002360.
[0115] Antitela ili fragmenti antitela izolovani iz biblioteke ljudskih antitela ovde se smatraju ljudskim antitelima ili fragmentima ljudskog antitela.
6. Multispecifična antitela
[0116] U bilo kom od gore navedenih aspekata predmetnog obelodanjenja, ovde pruženo anti-CD3 antitelo je multispecifično antitelo, na primer, bispecifično antitelo. Multispecifična antitela su monoklonska antitela koja imaju specifičnosti vezivanja za najmanje dva različita mesta. U nekim otelotvorenjima, bispecifična antitela se mogu vezivati za dva različita epitopa od CD3 (npr., CD3ε ili CD3i). U određenim aspektima obelodanjenja, jedna od specifičnosti vezivanja je za CD3 (npr. CD3ε ili CD3i), a druga je za bilo koji drugi antigen (npr. drugi biološki molekul, npr. antigen ćelijske površine, npr. antigen tumora). Prema tome, bispecifično anti-CD3 antitelo može imati karakteristike vezivanja za CD3 i drugi biološki molekul, kao što je drugi biološki molekul (npr. tumorski antigen) naveden u Tabeli 1 i opisan u SAD publikaciji br.
2010/0111856.
TABELA 1. Ciljevi tumorskog antigena bispecifičnih anti-CD3 antitela predmetnog pronalaska
[0118] Bispecifično anti-CD3 antitelo (npr. bilo koje od gore opisanih anti-CD3 antitela) može imati specifičnosti vezivanja za CD3 i drugi biološki molekul, kao što je ljudski leukocitni antigen (HLA)-peptid kompleks predstavljen na ćelijskoj površini od strane MHC. Bispecifično anti-CD3 antitelo (npr. bilo koje od gore opisanih anti-CD3 antitela) može imati specifičnosti vezivanja za CD3 i drugi biološki molekul koji sadrži HLA-peptid kompleks izabran iz grupe koju čine 0772P (CA125, MUC16; Genbank pristupni broj AF36148); adipofilin (perilipin-2, protein povezan sa diferencijacijom adipoze, ADRP, ADFP, MGC10598; NCBI referentna sekvenca: NP_001113.2); AIM-2 (odsutan u melanomu 2, PYHIN4, protein koji se može indukovati interferonom AIM2; NCBI referentna sekvenca: NP_004824.1); ALDH1A1 (porodica aldehid dehidrogenaza 1, član A1, ALDH1, PUMB1, retinaldehid dehidrogenaza 1, ALDC, ALDH-E1, ALHDII, RALDH 1, EC 1.2.1.36, ALDH11, HEL-9, HEL-S-53e, HEL12, RALDH 1, Acetaldehid dehidrogenaza 1, aldehid dehidrogenaza 1, rastvorljiva, aldehid dehidrogenaza, citosolna u jetri, ALDH klasa 1, Epididimis luminalni protein 12, Epididimis luminalni protein 9, Epididimis sekretorni protein Li 53e koji vzuje spermu, retinalna dehidrogenaza 1, RaIDH1, porodica aldehid dehidrogenaza 1, član A1, aldehid dehidrogenaza, citostolna, EC 1.2.1; NCBI referentna sekvenca: NP_000680.2); alfa-aktinin-4 (ACTN4, aktinin, alfa 4, FSGS1, fokalna segmentalna glomeruloskleroza 1, ne-mišićni alfa-aktinin 4, F-aktin umrežavajući protein, FSGS, AKTININ-4, aktinin Alfa4 izoform, alfa-aktinin-4; NCBI referentna sekvenca: NP_004915.2); alfafetoprotein (AFP, HPAFP, FETA, alfa-1-fetoprotein, alfa-fetoglobulin, alfa-1-fetoprotein, alfa-fetoglobulin, HP; GenBank: AAB58754.1); Amphiregulin (AREG, SDGF, faktor rasta izveden iz švanoma, faktor rasta izveden iz ćelija debelog creva, AR, CRDGF; GenBank: AAA51781.1); ARTC1 (ART1, ADP-Riboziltransferaza 1, Mono(ADP-Ribozil)Transferaza 1, ADP-Riboziltransferaza C2 i C3 Toksin-nalik 1, ART2, CD296, RT6, ADP-Riboziltransferaza 2, GPI-povezan NAD(P)(+)-Arginin ADP-Riboziltransferaza 1, EC 2.4.2.31, antigen CD296; NP); ASLG659; ASPHD1 (aspartat beta-hidroksilaze koji sadrži domen 1, aspartat beta-hidroksilaza protein koji sadrži domen 1, EC 1.14.11.-, EC 1.14.11; genBank: AAI44153.1); B7-H4 (VTCN1, inhibitor aktivacije T-ćelija koje sadrže V-set domen 1, B7H4, B7 superporodica član 1, imuno kostimulatorni protein B7-H4, B7h.5, kostimulatorni molekul T-ćelija B7x, B7S1, B7X, VCTN1, H4, B7 član porodice, PRO1291, član porodice B7, H4, kostimulatorni molekul T-ćelija B7x, inhibitor aktivacije T-ćelija koje sadrže V-set domen 1, protein B7S1; GenBank: AAZ17406.1); BAFF-R (TNFRSF13C, superporodica receptor faktora nekroze tumora, član 13C, BAFFR, receptor za aktiviranje B-ćelija, receptor BAFF, BLyS receptor 3, CVID4, BROMIX, CD268, receptor faktora koji aktivira B ćelije, proliksin, superporodica receptor faktora nekroze tumora, član 13C, BR3, CD268 antigen; NCBI referentna sekvenca: NP_443177.1); BAGE-1; BCLX (L); BCR-ABL fuzioni protein (b3a2); beta-katenin (CTNNB1, katenin (protein povezan sa kadherinom), Beta 1, 88kDa, CTNNB, MRD19, katenin (protein povezan sa kadherinom), beta 1 (88kD), armadilo, katenin Beta-1; GenBank: CAA61107.1); BING-4 (WDR46, WD domen ponavljanja 46, C6orf11, BING4, WD BING4 protein koji sadrži ponavljanje, hromozom 6 otvoren okvir za čitanje 11, FP221, UTP7, WD protein 46 koji sadrži ponavljanje; NP); BMPR1B (koštani morfogenetski receptor proteina tipa IB, Genbank pristupni br. NM_00120; NP); B-RAF (Brevikan (BCAN, BEHAB, Genbank pristupni br. AF22905); Brevikan (BCAN, hondroitin sulfat proteoglikan 7, mozgomobogaćen hijaluronan-vezujući protein, BEHAB, CSPG7, Brevikan proteoglikan, Brevikan jezgarni protein, hondroitin sulfat proteoglikan BEHAB; GenBank: AAH27971.1); CALCA (polipeptid srodan kalcitoninu Alfa, CALC1, kalcitonin 1, kalcitonin, alfa-tip CGRP, kalcitonin peptid I, CGRP-I, CGRP, CGRP1, CT, KC, kalcitonin/kalcitonin-srodni polipeptid, alfa, katakalcin; NP); CASP-5 (CASP5, kaspaza 5, cistein peptidaza povezana sa apoptozom, proteaza ICH-3, proteaza TY, ICE(rel)-III, ICE(rel)III, ICEREL-III, ICH-3, kaspaza-5, TY proteaza, EC 3.4.22.58, ICH3, EC 3.4.22; NP); CASP-8; CD19 (CD19 - B-limfocitni antigen CD19 izoform 2 prekursor, B4, CVID3 [Homo sapiens], NCBI referentna sekvenca: NP_001761.3); CD20 (CD20 - B-limfocitni antigen CD20, 4-domena preko membrane, podporodica A, član 1, B1,Bp35,CD20,CVID5,LEU-16,MS4A2,S7; NCBI referentna sekvenca: NP_690605.1); CD21 (CD21 (CR2 (komplementarni receptor ili C3DR (receptor C3d/Epstein Barr virusa) ili Hs.73792 Genbank pristupni br. M2600); (CD22 (receptor B ćelija CD22-B izoform, BL-CAM, Lyb-8, Lyb8, SIGLEC-2, FLJ22814, Genbank pristupni br. AK02646); CD22; CD33 (CD33 molekul, CD33 antigen (Gp67), vezivanje sijalinske kiseline Ig-nalik Lektin 3, sijalinska kiselina koja vezuje Ig-nalik lektin 3, SIGLEC3, gp67, SIGLEC-3, mijeloidni antigen ćelijske površine CD33, p67, Siglec-3, CD33 antigen; GenBank: AAH28152.1); CD45; Superfamija CD70 (CD70 - faktor nekroze tumora (ligand), član 7; površinski antigen CD70; antigen Ki-24; ligand CD27; CD27-L; ligand faktora nekroze tumora superporodica, član: 7; NCBI referentna sekvenca za vrstu homo sapiens: NP_001243.1); CD72 (CD72 (antigen za diferencijaciju B ćelija CD72, Lyb-; 359 aa, pl: 8.66, MW: 40225, TM:1 [P] Gen hromozom: 9p13.3, Genbank pristupni br. NP_001773.); CD79a (CD79a (CD79A, CD79a, imunoglobulin-povezani alfa, protein specifičan za B ćelije koji kovalentno komunicira sa Ig beta (CD79B) i formira kompleks na površini sa Ig M molekulima, prenosi signal uključen u diferencijaciju B ćelija), pl: 4.84, MW: 25028 TM: 2 [P] Gen hromozom: 19q13.2, Genbank pristupni br. NP_001774.1); CD79b (CD79b (CD79B, CD79b, IGb (imunoglobulin-povezan beta), B29, Genbank pristupni br. NM_000626 ili 1103867); Cdc27 (ciklus deobe ćelija 27, D0S1430E, D17S978E, kompleks promovisanja anafaze podjedinica 3, kompleks za promociju anafaze podjedinica 3, ANAPC3, APC3, CDC27Hs, H-NUC, CDC27 homolog, ciklus deobe ćelija 27 homolog (S. Cerevisia), HNUC, NUC2, kompleks za promociju anafaze, protein 3, ciklus deobe ćelija 27 homolog, proteina ciklusa deobe ćelija 27 homolog, Nuc2 homolog; GenBank: AAH11656.1); CDK4 (ciklin-zavisna kinaza 4, protein kinaza deobe ćelija 4, PSK-J3, EC 2.7.11.22, CMM3, EC 2.7.11; NCBI referentna sekvenca: NP_000066.1); CDKN2A (ciklin-zavisna kinaza inhibitor 2A, MLM, CDKN2, MTS1, ciklin-zavisna kinaza inhibitor 2A (Melanom, P16, inhibira CDK4), ciklin-zavisna kinaza 4, inhibitor A, višestruki supresor tumora 1, CDK4I, MTS-1, CMM2, P16, ARF, INK4, INK4A, P14, P14ARF, P16-INK4A, P16INK4, P16INK4A, P19, P19ARF, TP16, CDK4 Inhibitor P16-INK4, netativni regulator ćelijskog ciklusa Beta, p14ARF, p16-INK4, p16-INK4a, p161NK4A, p19ARF; NP); CEA; CLL1 (CLL-1 (CLEC12A, MICL, i DCAl, koji kodira člana superporodice tip C lektina/C-tip lektinu-nalik domena (CTL/CTLD). Članovi ove porodice imaju zajedničko savijanje proteina i imaju različite funkcije, poput ćelijske adhezije, ćelija-ćelija signalizacije, obrta glikoproteina i uloge u upali i imunom odgovoru. Protein kodiran ovim genom je negativni regulator funkcije granulocita i monocita. Opisano je nekoliko alternativno spojenih varijanti transkripta ovog gena, ali priroda nekih od ovih varijanti pune dužine nije utvrđena. Ovaj gen je usko povezan sa ostalim članovima superporodice CTL/CTLD u prirodnom regionu gen ubica kompleksa na hromozomu 12p13 ( Drickamer K Curr. Opin. Struct. Biol. 9):585-90; van Rhenen A, i dr., Blood 110):2659-66; Chen CH, i dr. Blood 107):1459-67; Marshall AS, i dr. Eur. J. Immunol. 36):2159-69; Bakker AB, i dr Cancer Res. 64 :8443-50; Marshall AS, i dr J. Biol. Chem. 279 :14792-80. CLL-1 je transmembranski receptor tipa II koji sadrži jedan C-tip lektinu-nalik domen (za koji nije predviđeno da vezuje ni kalcijum ili šećer), region stabla, transmembranski domen i kratak citoplazmatski rep koji sadrži ITIM motiv); CLPP (proteinolitička podjedinica kazeinolitne mitohondrijalne matrične peptidaze, Endopeptidaza Clp, EC 3.4.21.92, PRLTS3, ATP-zavisna proteaza CIpAP (E. Coli), ClpP (kazeinolitna proteaza, ATP-zavisna, proteolitička podjedinica, E. Coli) homolog, ClpP kazeinolitna proteaza, ATP-zavisna, proteolitička podjedinica homolog (E. Coli), ljudska, proteolitička podjedinica, ATP-zavisna proteaza, ClpAP, proteolitička podjedinica, ljudski, ClpP kazeinolitna Peptidaza ATP-zavisna, proteolitička podjedinica, ClpP kazeinolitna peptidaza, ATP-zavisna, proteolitička podjedinica homolog, ClpP kazeinolitna proteaza, ATP-zavisna, proteolitička podjedinica homolog, putativna ATP-zavisna Clp proteaza, proteolitička podjedinica; COA-1; CPSF; CRIPTO (CRIPTO (CR, CR1, CRGF, CRIPTO, TDGF1, faktor rasta koji potiče od teratokarcinoma, Genbank pristupni br. NP_003203 ili NM_00321); Cw6; CXCR5 CXCR5 (Burkitov receptor limfoma 1, receptor vezan za G-protein. CXCL13 hemokin, deluje u migraciji limfocita i humoralnoj odbrani, igra ulogu u HIV-2 infekciji i možda razvoju AIDS-a, limfoma, mijeloma i leukemije); 372 aa, pl: 8,54 MW: 41959 TM: 7 [P] Gen hromozome: 11q23.3, Genbank pristupni br. NP_001707.); CXORF61 CXORF61 - hromozom X otvoreni okvir za čitanje 61 [Homo sapiens], NCBI referentna sekvenca: NP_001017978.1); ciklin D1 (CCND1, BCL1, PRAD1, D11S287E, B-ćelijski CLL/limfom 1, limfom B ćelija 1 protein, BCL-1 onkogen, PRAD1 onkogen, Ciklin D1 (PRAD1:Paratiroidna adenomatoza 1), G1/S-specifični ciklin D1, paratiroidna adenomatoza 1, U21B31, G1/S-specifični ciklin-D1, BCL-1; NCBI referentna sekvenca: NP_444284.1); ciklin-A1 (CCNA1, CT146, ciklin A1; GenBank: AAH36346.1); dek-can fuzioni protein; DKK1 (Dickkopf WNT inhibitor signalnog puta 1, SK, hDkk-1, Dickkopf (Xenopus Laevis) homolog 1, Dickkopf 1 homolog (Xenopus Laevis), DKK-1, Dickkopf 1 homolog, Dickkopf srodni protein-1, Dickkopf-1 nalik, Dickkopfnalik protein 1, Dickkopf-srodni protein 1, Dickkopf-1, Dkk-1; GenBank: AAQ89364.1); DR1 (regulator na dole transkripcije 1, vezivanje TBP (negativni kofaktor 2), negativni kofaktor 2-beta, TATA-vezujući protein-povezan fosfoprotein, NC2, NC2-BETA, protein Dr1, NC2-beta, regulator na dole transkripcije 1; NCBI referentna sekvenca: NP_001929.1); DR13 (veliki kompleks histokompatibilnosti, klasa II, DR Beta 1, HLA-DR1 B, DRw10, DW2.2/DR2.2, SS1, DRB1, HLA-DRB, HLA antigeni kompatibilnost klase II, Beta lanac DR-1, ljudski leukocitni antigen DRB1, limfocitni antigen DRB1, MHC Klasa II antigen, MHC klasa II HLA-DR Beta 1 lanac, MHC klasa II HLA-DR-Beta ćelijski površinski glikoprotein, MHC klasa II HLA-DRw10-Beta, DR-1, DR-12, DR-13, DR-14, DR-16, DR-4, DR-5, DR-7, DR-8, DR-9, DR1, DR12, DR13, DR14, DR16, DR4, DR5, DR7, DR8, DR9, DRw11, DRw8, HLA-DRB2, klon P2-Beta-3, MHC klasa II antigen DRB1*1, MHC klasa II antigen DRB1*10, MHC klasa II antigen DRB1*11, MHC klasa II antigen DRB1*12, MHC klasa II antigen DRB1*13, MHC klasa II antigen DRB1*14, MHC klasa II antigen DRB1*15, MHC klasa II antigen DRB1*16, MHC klasa II antigen DRB1*3, MHC klasa II antigen DRB1*4, MHC klasa II antigen DRB1*7, MHC klasa II antigen DRB1*8, MHC klasa II antigen DRB1*9; NP); E16 (E16 (LAT1, SLC7A5, Genbank pristupni br. NM_00348); EDAR (EDAR - član superporodice receptora faktora nekroze tumora EDAR prekursor, receptor EDA-A1; homolog bez glave; ektodisplasin-A receptor; receptor ektodermalne displazije; receptor anhidrotskog ektodisplazina 1, DL; ECTD10A; ECTD10B; ED1R; ED3; ED5; EDA-A1R; EDA1R; EDA3; HRM1 [Homo sapiens]; NCBI referentna sekvenca: NP_071731.1); EFTUD2 (faktor izduživanja koji sadrži Tu GTP vezujući domen 2, protein faktora izduživanja koji sadrži Tu GTP vezujući domen 2, hSNU114, SNU114 homolog, protein specifičan za U5 SnRNP, 116 KDa, MFDGA, KIAA0031, 116 KD, protein specifičan za U5 SnRNP, 116 KDa U5, male nuklearne ribonukleoproteinske komponente, MFDM, SNRNP116, Snrp116, Snu114, U5-116KD, SNRP116, U5-116 KDa; GenBank: AAH02360.1); EGFR (receptor epidermalnog faktora rasta, ERBB, proto-onkogeni C-ErbB-1, receptor tirozina-proteinska kinaza ErbB-1, ERBB1, HER1, EC 2.7.10.1, receptor epidermalnog faktora rasta (virus ptičje eritroblastične leukemije (V-Erb-B) onkogeni homolog), virus eritroblastične leukemije (V-Erb-B) onkogeni homolog (ptičji), PIG61, virusa ptičje eritroblastične leukemije (V-Erb-B) onkogeni homolog, protein koji inhibira rast ćelije 40, protein koji indukuje proliferaciju ćelija 61, mENA, EC 2.7.10; GenBank: AAH94761.1); EGFR-G719A; EGFR-G719C; EGFR-G719S; EGFR-L858R; EGFR-L861Q; EGFR-S768I; EGFR-T790M; Faktor izduživanja 2 (EEF2, Eukariotski translacioni faktor izduživanja 2, EF2, polipeptidil-TRNK translokaza, EF-2, SCA26, EEF-2; NCBI referentna sekvenca: NP_001952.1); ENAH (hMena) (aktivirani homolog (drozofila), MENA, sisarski aktiviran, ENA, NDPP1, homolog aktiviran proteinima; GenBank: AAH95481.1) - rezultati samo za „ENAH“, a ne za „ENAH (hMena)“; EpCAM (molekul adhezije epitelnih ćelija, M4S1, MIC18, transducer kalcijumskih signala povezan sa tumorom 1, TACSTD1, TROP1, antigen povezan sa adenokarcinomom, glikoprotein ćelijske površine Trop-1, epitelni glikoprotein 314, glavni gastrointestinalni protein povezan sa tumorom GA733-2, EGP314, KSA, DIAR5, HNPCC8, antigen identifikovan monoklonskim antitelom AUA1, EGP-2, EGP40, ESA, KS1/4, MK-1, ljudski epitelni glikoprotein-2, membranska komponenta, hromozom 4, površinski marker (35kD glikoprotein), EGP, Ep-CAM, GA733-2, M1S2, CD326 antigen, površinski antigen epitelnih ćelija, hEGP314, KS 1/4 antigen, ACSTD1; GenBank: AAH14785.1); EphA3 (EPH receptor A3, ETK1, ETK, TYRO4, HEK, Eph-nalik tirozin-kinaza 1, receptor za tirozin-protein-kinazu ETK1, EK4, EPH-nalik kinaza 4, EC 2.7.10.1, EPHA3, HEK4, Efrin Tip-A receptor 3, ljudska embrionska kinaza 1, TYRO4 proteinska tirozin kinaza, hEK4, kinaza ljudskog embriona, tirozin proteinska kinaza TYRO4, EC 2.7.10; GenBank: AAH63282.1); EphB2R; Epiregulin (EREG, ER, proepiregulin; GenBank: AAI36405.1); ETBR (EDNRB, receptor endotelina tip B, HSCR2, HSCR, receptor endotelina, neselektivni tip, ET-B, ET-BR, ETRB, ABCDS, WS4A, ETB, receptor endotelina B; NP); ETV6-AML1 fuzioni protein; EZH2 (pojačivač Zesta homologa 2 (drozofila), lizin N-metiltransferaza 6, ENX-1, KMT6 EC 2.1.1.43, EZH1, WVS, pojačivač zesta (drozofila) homologa 2, ENX1, EZH2b, KMT6A, WVS2, HisV Lizin N-metiltransferaza EZH2, pojačivač Zesta homologa 2, EC 2.1.1; GenBank: AAH10858.1); FcRH1 (FCRL1, Fc Receptor-nalik 1, FCRH1, Fc Receptor homolog 1, FcR-nalik Protein 1, Protein povezan sa imunološkim receptorima 5, IFGP1, IRTA5, hIFGP1, IFGP porodica proteina 1, CD307a, Fc receptoru-nalik proteina 1, Fc Receptor superporodice imunoglobulina, Gp42, FcRL1, CD307a Antigen; GenBank: AAH33690.1); FcRH2 (FCRL2, Fc Receptor-nalik 2, SPAP1, protein 1 usidravanja fosfataze koji sadrži SH2 domen, Fc Receptor homolog 2, Fc receptoru-nalik protein 2, Protein 4 povezan sa translokacijom receptora imunoglobulina, FCRH2, IFGP4, IRTA4, protein četiri porodice IFGP, SPAP1A, SPAP1B, SPAP1C, CD307b, Fc receptoru-nalik protein 2, Protein 4 povezan sa translokacijom imunog receptora, Fc Receptor superporodice imunoglobulina, Gp42, protein 1 usidravanja fosfataze koji sadrži SH2 domen, FcRL2, CD307b antigen; GenBank: AAQ88497.1); FcRH5 (FCRL5, Fc Receptoru-nalik protein 5, povezan IRTA2, Fc Receptor homolog 5, FcR-nalik Protein 5, Protein 2 povezan sa translokacijom imunog receptorom, BXMAS1, FCRH5, CD307, CD307e, PRO820, Fc receptoru-nalik Protein 5, superporodica imunoglobulina povezana sa receptorom translokacije 2 (IRTA2), FcRL5, CD307e antigen; GenBank: AAI01070.1); FLT3-ITD; FN1 (Fibronektin 1, Globulin nerastvorljiv u hladnom stanju, FN, faktor stimulacije migracije, CIG, FNZ, GFND2, LETS, ED-B, FINC, GFND, MSF, fibronektin; GenBank: AAI43764.1); G250 (MN, CAIX, ugljenična anhidrataza IX, ugljenična dehidrataza, RCC-povezan protein G250, ugljenična dehidrataza IX, Membranski Antigen MN, antigen G250 povezan sa rakom bubrežnih ćelija, CA-IX, P54/58N, pMW1, Antigen G250 povezan sa RCC, ugljenična anhidrataza 9; NP); - alias rezultati za „G250“, a ne za „G250/MN/CAIX“; GAGE-1,2,8; GAGE-3,4,5,6,7; GDNF-Ra1 (alfa 1 receptor GDNF porodice; GFRA1; GDNFR; GDNFRA; RETL1; TRNR1; RET1L; GDNFR-alfa1; GFR-alfa-; U95847; BC014962; NM_145793 NM_005264); GEDA (Genbank pristupni br. AI26076); GFRA1 - GDNF porodica receptor alfa-1; GDNF receptor alfa-1; GDNFR-alfa-1; GFR-alfa-1; RET ligand 1; TGF-beta srodan receptor neurotrofičnog faktora 1 [Homo sapiens]; ProtKB/Swiss-Prot: P56159.2; glipikan-3 (GPC3, glipikan 3, SDYS, glipikan proteoglikan 3, crevni protein OCI-5, GTR2-2, MXR7, SGBS1, DGSX, OCI-5. SGB, SGBS, heparan sulfat proteoglikan, izlučeni glipikan-3, OCI5; GenBank: AAH35972.1); GnTVf; gp100 (PMEL, premelanozomski protein, SILV, D12S53E, PMEL17, SIL, melanocitni protein Pmel 17, antigen specifičan za melanocite GP100, antigen ME20 povezan sa melanomom, homolog proteina srebrnog lokusa, ME20-M, ME20M, P1, P100, Srebronalik (mišji homolog), homolog srebra (miš), ME20, SI, melanocitni protein Mel 17, melanocitni protein PMEL, melanozomalna matrica protein17, srebro, miš, homolog; GenBank: AAC60634.1); GPC; GPNMB (glikoprotein (transmembrana) Nmb, glikoprotein NMB, glikoprotein Nmb-nalik protein, osteoaktivin, transmembranski glikoprotein HGFIN, HGFIN, NMB, transmembranski glikoprotein, transmembranski glikoprotein NMB; gen78ank: Gen78ank) GPR172A (receptor vezan za G protein 172A; GPCR41; FLJ11856; D15Ertd747e); NP_078807.1; NM_024531.3); GPR19 (receptor vezan za G protein 19; Mm.478; NP_006134.1; NM_006143.2); GPR54 (receptor KISS1; KISS1R; GPR54; HOT7T175; AXOR1; NP_115940.2; NM_032551.4); HAVCR1 (ćelijski receptor za virus hepatitisa A 1, T-ćelijski imunolobulin mucin, član porodice 1, Molekul povrede bubrega 1, KIM-1, KIM1, TIM, TIM-1, TIM1,TIMD-1, TIMD1, T-ćelijski imunolobulin mucin receptor 1, T-ćelijski membranski protein 1, HAVCR, HAVCR-1, T ćelijski imunolobinski i mucinski domen protein 1, HAVcr-1,protein 1 koji sadrži T ćelijski imunolobinski i mucinski domen; GenBank: AAH13325.1); HER2 (ERBB2, V-Erb-B2, ptičja eritroblastična leukemija, virusni onkogen homolog 2, NGL, NEU, Neuro/glioblastom-izvedeni onkogeni homolog, protein 19 gena metastatskog limfnog čvora, proto-onkogen C-ErbB-2, proto-onkogen Neu, tirosin kinazni površinski receptor ćelijske površine HER2, MLN 19, p185erbB2, EC 2.7.10.1, V-Erb-B2 ptičja eritroblastična leukemija virusni onkogen homolog 2 (neuro/glioblastom-izvedeni onkogen homolog), CD340, HER-2, HER-2/neu, TKR1, C-Erb B2/Neu protein, herstatin, neuroblastoma/glioblastom-izvedeni onkogeni homolog, receptor tirozin-proteinske kinaze ErbB-2, V-Erb-B2, eritroblastična leukemija virusni onkogena homolog 2, meuro/Glioblastom-izvedeni onkogeni homolog, MLN19, CD340 Antigen, EC 2.7.10; NP); HER-2/neu – alias gore navedenog; HERV-K-MEL; HLA-DOB (Beta podjedinica molekula MHC klase II (la antigen) koji vezuje peptide i predstavlja ih CD4+ T limfocitima); 273 aa, pl: 6,56, MW: 30820.TM:1 [P] genski hromozom: 6p21,3, Genbank pristupni br. NP_002111); hsp70-2 (HSPA2, 70kDa protein toplotnog udara 2, 70kDa protein toplotnog udara 2, HSP70-3, protein povezan sa 70kDa proteinom toplotnog udara 2, 70kDa protein toplotnog udara 2; GenBank: AAD21815.1); IDO1 (Indoleamin 2,3-dioksigenaza 1, IDO, INDO, indoleamin-pirol 2,3-dioksigenaza, IDO-1, indoleamin-pirol 2,3 dioksigenaza, indolamin 2,3 dioksigenaza, indol 2,3 dioksigenaza, EC 1.13.11.52; NCBI referentna sekvenca: NP_002155.1); IGF2B3; IL13Ralfa2 (IL13RA2, lnterleukin 13 receptor, alfa 2, antigen za rak/testis 19, protein koji vezuje interleukin-13, IL-13R-alfa-2, IL-13RA2, IL-13 receptorska podjedinica Alfa-2, IL-13R podjedinica Alfa-2, CD213A2, CT19, IL-13R, IL13BP, protein vezivanja interleukina 13, interleukin 13 receptor alfa 2 lanac, alfa 2 podjedinica receptora interleukina-13,IL13R, antigen CD213a2; NP); IL20Ra; crevna karboksil estaraza; IRTA2 (alias od FcRH5); kalikrein 4 (KLK4, peptidaza 4, povezana sa kalikreinom, PRSS17, EMSP1, enamel matrica serinska proteinaza 1, protein nalik kalikreinu 1, serinska proteaza 17, KLK-L1, PSTS, AI2A1, kalikrein 4 (prostaza, enamel matrica, prostata), ARM1, EMSP, androgen-regulisana poruka 1, enamel matrica serinska proteaza 1, kalikrein, kalikrein-4, prostaza, EC 3.4.21.-, prostaza, EC 3.4.21; GenBank: AAX30051.1); KIF20A (član porodice kinezin 20A, RAB6KIFL, RAB6, interakcija, kinezinnalik (Rabkinezin6), Mitotični a; LAGE-1; LDLR-fukoziltransferazaASfuzioni protein; Lengsin (LGSN, Lengsin, lens protein sa glutamin sintetaza domenom, GLULD1, Protein 1 koji sadrži domen amonijak ligaze, LGS, glutamat-amonijak ligaza (glutamin sintetaza), koji sadrži 1, glutamat-amonijak ligaza (glutamin sintaza), domen koji sadrži 1, lens glutamin sintaza-nalik; GenBank: AAF61255.1); LGR5 (leukinbogato ponavljanje sadržano u G protein-spojenom receptoru 5; GPR49, GPR6; NP_003658.1; NM_003667.2; LY64 (limfocitni antigen 64 (RP10, membranski protein tipa I iz porodice ponovljanja bogatih leukinom (LRR), reguliše aktivaciju B ćelija i apoptozu, gubitak funkcije povezan je sa povećanom aktivnošću bolesti kod pacijenata sa sistemskom lupus eritematozom); 661 aa, pl: 6,20, MW: 74147 TM: 1 [P] genski hromozom: 5q12, Genbank pristupni br. NP_005573; Ly6E (limfociti antigen 6 kompleks, lokus E; Ly67,RIG- E,SCA-2,TSA-; NP_002337.1; NM_002346.2); Ly6G6D (limfocitni antigen 6 kompleks, lokus G6D; Ly6-D, MEGT; NP_067079.2; NM_021246.2); LY6K (limfocitni antigen 6 kompleks, lokus K; LY6K; HSJ001348; FLJ3522; NP_059997.3; NM_017527.3); LyPD1 - LY6/PLAUR domen koji sadrži 1, PHTS [Homo sapiens], GenBank: AAH17318.1); MAGE-A1 (porodica melanomskih antigena A, 1 (usmerava eksprimiranje antigena MZ2-E, MAGE1, porodice melanomskih antigena A 1, MAGEA1, melanomski antigen MAGE-1, antigen srodan melanomu 1, antigen povezan sa melanomom MZ2-E, antigen za rak/testis 1.1, CT1.1, MAGE-1 antigen, porodica antigena raka/testisa 1, član 10, porodica antigena raka/testisa 1, član 10, MAGE1A; NCBI referentna sekvenca: NP_004979.3); MAGE-A10 (MAGEA10, porodica melanomskih antigena A, 10, MAGE10, MAGE-10 Antigen, Antigen 10 povezan sa melanomom, antigen za rak/testis 1.10, CT1.10, porodice antigen za rak/testis 1, član 10, porodice antigen za rak/testis 1, član 10; NCBI referentna sekvenca: NP_001238757.1); MAGE-A12 (MAGEA12, porodica A antigena za melanom, 12, MAGE12, antigen za rak/testis 1.12, CT1.12, MAGE12F antigen, porodice antigena raka/testisa 1, Član 12, porodica antigena raka/testisa 1, član 12, antigen 12 koji je povezan sa melanomom, MAGE-12 antigen; NCBI referentna sekvenca: NP_001159859.1); MAGE-A2 (MAGEA2, melanomski antigen Porodica A, 2, MAGE2, antigen za rak/testis 1.2, CT1.2, MAGEA2A, MAGE-2 antigen, porodica antigen za rak/testis 1, član 2, porodica antigen za rak/testis 1, član 2, melanomski antigen 2, melanompovezan Antigen 2; NCBI referentna sekvenca:NP_001269434.1); MAGE-A3 (MAGEA3, porodica antigena melanoma A, 3, MAGE3, MAGE-3 Antigen, Antigen MZ2-D, antigen povezan sa melanomom 3, antigen za rak/testis, Antigen 1.3, CT1.3, porodica antigena raka/testisa 1, član 3, HIP8, HYPD, MAGEA6, porodica antigena za rak/testis 1, član 3; NCBI referentna sekvenca: NP_005353.1); MAGE-A4 (MAGEA4, melanomski antigen, porodica A, 4, MAGE4, Antigen 4 povezan sa melanomom, antigen za rak/testis 1.4, CT1.4, antigen MAGE-4, antigen MAGE-41, antigen MAGE-X2, MAGE4A, MAGE4B, porodica antigena raka/testisa 1, član 4, MAGE-41, MAGE-X2, porodica antigena raka/testisa 1, član 4; NCBI referentna sekvenca: NP_001011550.1); MAGE-A6 (MAGEA6, porodica melanomskih antigena A, 6, MAGE6, MAGE-6 Antigen, Antigen 6 povezan sa melanomom, antigen za rak/testis 1.6, CT1.6, antigen MAGE3B, porodica antigena raka/testisa 1, porodica melanomskih antigena A 6, član 6, MAGE-3b, MAGE3B, porodica antigena za rak/testis 1, član 6; NCBI referentna sekvenca: NP_787064.1); MAGE-A9 (MAGEA9, porodica melanomskih antigena A, 9, MAGE9, MAGE-9 Antigen, Antigen 9 povezan sa melanomom, antigen za rak/testis 1.9, CT1.9, porodica antigena raka/testisa 1, član 9, Antigen za rak/testis Porodica 1, član 9, MAGEA9A; NCBI referentna sekvenca: NP_005356.1); MAGE-C1 (MAGEC1, porodica C melanomskih antigena 1, antigen za rak/testis 7.1, CT7.1, antigen MAGE-C1, porodica antigena raka/testisa 7, član 1, CT7, porodica antigena raka/testisa 7, član 1, melanomski antigen C1; NCBI referentna sekvenca: NP_005453.2); MAGE-C2 (MAGEC2, porodica C melanomskih antigena C, 2, MAGEE1, antigen za rak/testis 10, CT10, HCA587, melanomski antigen, porodica E, 1, specifičan za rak/testis, antigen 587 povezan sa hepatocelularnim rakom, antigen MAGE-C2, MAGE-E1 antigen, antigen 587 hepatocelularnog raka, melanom-povezan antigen C2; NCBI referentna sekvenca: NP_057333.1); mamaglobin-A (SCGB2A2, sekretoglobin, porodica 2A, član 2, MGB1, mamaglobin 1, UGB2, mamaglobin A, mamaglobin-A, mamaglobin-1, porodica sekretoglobina 2A, član 2; P); MART2 (HHAT, jež, aciltransferaza, SKI1, melanomski antigen kog prepoznaju T ćelije 2, protein 1 mršavog ježa, Skn, Melanomski antigen kog prepoznaju T ćelije 2, Protein-Cistein N-Palmitoiltransferaza HHAT, EC 2.3.1.-; GenBank: AAH39071.1); M-CSF (CSF1, faktor 1 koji stimuliše koloniju (makrofag), MCSF, CSF-1, lanimostim, faktor 1 koji stimuliše koloniju makrofaga 1, Lanimostim; GenBank: AAH21117.1); MCSP (SMCP, cisteinom bogat protein povezan sa mitohondrijom sperme, MCS, mitohondrijska kapsula, selenoprotein, HSMCSGEN1, cisteinom bogat protein povezan sa mitohondrijom sperme; NCBI referentna sekvenca: NP_109588.2); XAGE-1b/GAGED2a; WT1 (Wilms Tumor 1, WAGR, GUD, WIT-2, WT33, Amino-terminal Domen EWS,
4
NPHS4, Poslednja tri cinkova prsta od DNK koji se vezuje za WT1, AWT1, Protein Wilms tumora, EVS-WT1; GenBank: AAB33443.1); VEGF; Tirozinaza (TYR; OCAIA; OCA1A; tirozinaza; SHEP; NP_000363.1; NM_000372.4; GenBank: AAB60319.1); TrpM4 (BR22450, FLJ20041, TRPM4, TRPM4B, transientni receptor potencijalnog katjonskog kanala, pod-porodica M, član 4, Genbank pristupni br. NM_01763); TRP2-INT2; TRP-2; TRP-1/gp75 (Protein 1 povezan sa tirozinazom, 5,6-dihidroksindol-2-karboksilna kiselina oksidaza, CAS2, CATB, TYRP, OCA3, katalaza B, b-PROTEIN, glikoprotein 75, EC 1.14.18., melanomski antigen Gp75, TYRP1, TRP, TYRRP, TRP1, SHEP11, DHICA Oksidaza, EC 1.14.18, GP75, EC 1.14.18.1; Triosefosfat izomeraza (triosefosfat izomeraza 1, TPID, trioza-fosfat izomeraza, HEL-S-49, TIM, Epididimis sekretorni protein Li 49, TPI, triosefosfat izomeraza, EC 5.3.1.1; TRAG-3 (član porodice CSAG 2, porodica antigena protiv raka/testisa 24, CSAG3B, član 2, porodica CSAG član 3B, porodica raka/testisa, antigen 24 člana 2, antigen za rak/testis 24.2, protein 2/3 gena povezanog sa hondrosarkomom, protein gena 3 povezanog sa rezistencijom na taksol, protein 2/3 gena povezanog sa hondrosarkomom, CT24.2, gen 3 povezan sa rezistencijom na taksol, TRAG-3, CSAG3A, TRAG3;); TMEM46 (shisa homolog 2 (Xenopus laevis); SHISA; NP_001007539.1; NM_001007538.1; TMEM118 (protein prstena, transmembrana2; RNFT2; FLJ1462; NP_001103373.1; 001109903.1; TMEFF1 (transmembranski protein sa EGF-nalik i dva folistatin-nalik domena 1; Tomoregulin-; H7365; C9orf2; C9ORF2; U19878; X83961; NM_080655; NM_003692; TGF-betaRII (TGFBR2, transformišući faktor rasta II, bet receptor II (70/80kDa), TGFbeta-RII, MFS2, tbetaR-II, TGFR-2, TGF-Beta receptor tip IIB, TGF-beta receptor tipa II, TGF-Beta receptor tipa-2, EC 2.7.11.30, faktor rasta transformisanja Beta receptor tipa IIC, AAT3, TbetaR-II, faktor rasta transformisanja, Beta receptor II (70-80kD), TGF-beta receptor tipa II, FAA3, faktor rasta transformisanja Beta receptor tipa II, LDS1B, HNPCC6, LDS2B, LDS2, RIIC, EC 2.7.11, TAAD2; TENB2 (TMEFF2, tomoregulin, TPEF, HPP1, TR, putativni transmembranski proteoglikan, srodan EGF/heregulin porodici faktora rasta i folikistatinu); 374 aa, NCBI pristupni br.: AAD55776, AAF91397, AAG49451, NCBI RefSeq: NP_057276; NCBI Gene: 23671; OMIM: 605734; SwissProt Q9UIK5; Genbank pristupni br. AF179274; AY358907, CAF85723, CQ782436; TAG-2; TAG-1 (dodirin 2 (aksonal), TAG-1, AXT, Aksonin-1 molekula ćelijske adhezije, TAX, dodirin 2 (prolazno eksprimiran), TAX1, dodirin-2, aksonal glikoprotein TAG-1, aksonal glikoprotein sa prolaznim eksprimiranjem, Prolazni aksonal glikoprotein, aksonin-1, TAX-1, TAG1, FAME5; PRF: 444868); SYT-SSX1 ili-SSX2 fuzioni protein; survivin; STEAP2 (HGNC_8639, IPCA-1, PCANAP1, STAMP1, STEAP2, STMP, gen povezan sa rakom prostate, protein 1 povezan sa rakom prostate, šest transmembranskih epitelnih antigena prostate 2, šest transmembranskih proteina prostate, Genbank pristupni br. AF45513; STEAP1 (šest transmembranskih epitelnih antigena prostate, Genbank pristupni br. NM_01244; SSX-4; SSX-2 (SSX2, sinovijalni sarkom, X Breakpoint2, X Breakpoint 2, SSX, X Breakpoint 2B, antigen za rak/testis 5.2, X-hromozom-srodan 2, Tumorski antigen HOM-MEL-40, CT5.2, HD21, porodica antigena za rak/testis 5, HOM-MEL-40, izoform B, porodica antigena za rak/testis 5 člana 2a, član 2a, Protein SSX2, sarkom, sarkom, Sinovial, X-hromozom-povezan 2, sinovijalni, sinovijalni sarkom, X Breakpoint 2B, sinovijalni sarkomm, SSX2A; Sp17; SOX10 (SRY (oblast određivanja pola Y)-Box 10, miš, PCWH, DOM, VW4, WS2E, WS4C, Dominantni megakolon, miš, ,judski homolog, Dominantni megakolon, HMG-box u vezi sa SRY, Gen 10, ljudski homolog transkripcioni faktor SOX-10; GenBan: CAG30470.1); SNRPD1 (mali nuklearni ribonukleoprotein D1, mali nuklearni ribonukleoprotein D1, polipeptid 16kDa, polipeptid (16kD), SNRPD, HsT2456, Sm-D1, SMD1, Sm-D autoantigen, mali nuklearni ribonukleoprotein D1 polipeptid 16kDa pseudogen, SnRNP jezgarni protein D1, mali nuglearni ribonukleoprotein Sm D1; SLC35D3 (porodica nosača rastvora 35, član D3, FRCL1, proteini 1 nalik na granicu, bA55K22.3, Frc, Fringe-nalik 1, porodica solute nosioca 35 člana D3; NCBI GenBank: NC_000006.11 NC_018917.2 NT_025741.16); SIRT2 (Sirtuin 2, NAD-zavisna deacetilaza sirtuin-2, SIRL2, tihi regulator informacija 2, regulatorni protein SIR2 homolog 2, Sir2-povezan protein tipa 2, SIR2-nalik protein 2, sirtuin tip 2, sirtuin (regulacija informacija o tihom parenju 2 homolog) 2 (S.Cerevisiae), Sirtuin-2, Sirtuin (regulacija informacija o tihom parenju 2, S.Cerevisiae, homolog) 2, EC 3.5.1., SIR2; GenBank: AAK51133.1); Sema 5b (FLJ10372, KIAA1445, Mm.42015, SEMA5B, SEMAG, semaforin 5b Hlog, sema domen, sedam ponavljanja hrombospondina (tip 1 i nalik tipu 1), transmembranski domen (TM) i kratak citoplazmatski domen, (semaforin) 5B, Genbank pristupni br. AB04087; secernin 1 (SCRN1, SES1, KIAA0193, secerin-1; GenBank: EAL24458.1); SAGE (SAGE1, sarkom antigen 1, antigen za rak/testis 14, CT14, putativni tumorski antigen; NCBI referentna sekvenca: NP_061136.2); RU2AS (KAAG1, antigen 1 povezan sa bubrezima, RU2AS, protein antisens gena RU2, antigen 1 povezan sa bubrezima; GenBank: AAF23613.1); RNF43 - E3 ubikvitin-protein ligaza RNF43 prekursor [Homo sapiens], RNF124; URCC; NCBI referentna sekvenca: NP_060233.3; RhoC (RGS5 (regulator G-proteinske signalizacije 5, MSTP032, regulator G-proteinske signalizacije 5, MSTP092, MST092, MSTP106, MST106, MSTP129, MST129; GenBank: AAB84001.1); RET (ret proto-onkogene; MEN2A; HSCR1; MEN2B; MTC1; PTC; CDHF12; Hs.168114; RET51; RET-ELE; NP_066124.1; NM_020975.4); RBAF600 (UBR4, ubikvitin proteinska ligaza E3 komponenta N-Rekognin 4, cinkov prst, UBR1 tip 1, ZUBR1, E3 ubikvitin proteinska ligaza UBR4, RBAF600, faktor povezan sa 600 KDa retinoblastom proteinom, cinkov prst UBR1-tip proteina 1, EC 6.3.2., N-rekognin-4, KIAA0462, p600, EC 6.3.2, KIAA1307; GenBank: AAL83880.1); RAGE-1 (MOK, MOK proteinska kinaza, antigen bubrežnog tumora, RAGE, MAPK/MAK/MRK preklapajuća kinaza, antigen bubrežnog tumora 1, antigen raka bubrežnih ćelija, RAGE-1, EC 2.7.11.22, RAGE1; UniProtKB/Swiss-Prot: Q9UQ07.1); RAB38/ NY-MEL-1 (RAB38, NY-MEL-1, RAB38, član RAS porodice onkogena, melanomski antigen NY-MEL-1, povezan za Rab GTP-vezivanje protein, Ras-srodni protein Rab-38, rrGTPbp; GenBank: AAH15808.1); PTPRK (DJ480J14.2.1 (protein tirozin fosfataza, Receptor Tip, K R-PTP-KAPA, protein tirozin fosfataza kapa, protein tirozin fosfataza kapa), protein tirozin fosfataza, Receptor Tip, K, protein-tirozin fosfataza kapa, protein-tirozin fosfataza, receptor tip, kapa, R-PTP-kapa, receptor-tip trozin-protein fosfataza kapa EC 3.1.3.48, PTPK; GenBank: AAI44514.1); PSMA; PSCA hlg (2700050C12Rik, C530008O16Rik, RIKEN cDNK 2700050C12, RIKEN cDNK 2700050C12 gen, Genbank pristupni br. AI358628); PSCA (prekursor antigena matičnih ćelija prostate, Genbank pristupni br. AJ29743; PRDX5 (peroksiredoksin 5, EC 1.11.1.15., TPx tip VI, B166, antioksidativni enzim B166, HEL-S-55, jetreno tkivo 2D-stranica, mesto 71B, PMP20, peroksisomalni antioksidativni enzim, PRDX6, tioredoksin peroksidaza PMP20, PRXV, AOEB166, epididimis-sekretorni protein Li 55, Alu ko-represor 1, peroksioreksin-5, mitohondrijalni, peroksiredoksin V, prx-V, tioredoksin reduktaza, prx-V, ACR1, alu kompresor, PLP; GenBank: CAG33484.1); PRAME (poželjno eksprimirani antigen kod melanoma, poželjno eksprimirani melanomski antigen, MAPE, OIP-4, OIPA, CT130, antigen za rak/testis 130, melanomski antigen koji se poželjno eksprimira u tumorima, protein 4 koji je opa-interaktivan, Opa-interaktivni protein OIP4; GenBank: CAG30435.1); pml-RARalfa fuzioni protein; PMEL17 (srebrni homolog; SILV; D12S53E; PMEL17; SI; SIL); ME20; gp10 BC001414; BT007202; M32295; M77348; NM_006928; PBF (ZNF395, protein cinkovog prsta 395, PRF-1, regulacija Hantingtonove bolesti, protein koji vezuje regulatorni region HD gen, protein 2 koji vezuje region, protein 2, regulatorni faktor 1 papiloma virusa, faktor 1 koji reguliše HD, faktor regulacije papiloma virusa, PRF1, HDBP-2, Si-1-8-14, HDBP2, protein koji vezuje regulatorni region gena Hantingtonove bolesti, HDRF-2, regulatorni faktor papiloma virusa PRF-1, PBF; GenBank: AAH01237.1); PAX5 (upareni okvir 5, upareni okvir homeotičkog gena 5, BSAP, protein uparenog okvira Pax-5, specifični aktivator za B-ćelijsku liniju, gen uparenih domena 5, gen uparenog okvira 5 (specifični aktivatorski protein za B-ćelijsku liniju), B-ćelijski-specifični transkripcioni faktor, gen uparenog okvira 5 (aktivator specifičan za B-ćelijsku liniju); PAP (REG3A, regenerišući 3 alfa izveden iz ostrvaca, INGAP, PAP-H, hepatointestinalni protein pankreasa, PBBCGF, peptid ljudskog proostrvca, REG-III, pankreatitis-povezani protein 1, Reg3, Reg III-alfa, hepatokarcinom-crevo-pankreas, regenerativni proteini dobijeni iz ostvaca III-alfa, beta faktor rasta pankreasa, HIP, PAP homologni protein, HIP/PAP, protein koji indukuje proliferaciju 34, PAP1, protein koji indukuje proliferaciju 42, REG-3-alfa, regenerativni protein dobijen iz ostrvaca 3-alfa, protein povezan sa pankreatitisom; GenBank: AAH36776.1); p53 (TP53, tumorski protein P53, TPR53, P53, antigen ćelijskog tumora P53, Antigen NY-CO-13, mutantni protein tumora 53, fosfoprotein P53, supresor tumora P53, BCC7, transformaciono-povezani protein 53, LFS1, tumorski protein 53, Li-Fraumeni sindrom, supresor tumora P53; P2X5 (purinergički receptor, P2X jonski kanal 5 sa ligandom, jonski kanal koji je blokiran vanćelijskim ATP, može biti uključen u sinaptički prenos i neurogenezu, nedostatak može doprineti patofiziologiji idiopatske nestabilnosti detruzora); 422 aa), pl: 7,63, MW: 47206 TM:1 [P] genski hromozom: 17p13,3, Genbank pristupni br. NP_002552; OGT (O-povezana N-acetilglukozamin (GlcNAc) transferaza, O-GlcNAc transferaza P110 podjedinica, O-povezana N-acetilglukozamin (GlcNAc) transferaza (UDP-N-acetilglukozamin:polipeptid-N-acetilglukozaminil transferaza, UDP-N-acetilglukozamin--peptid N-acetilglukozaminiltransferaza 110 KDa podjedinica, UDP-N-acetilglukozamin:polipeptid-N-acetilglukozaminil transferaza, Uridinedifosfo-N-acetilglukozamin:polipeptid Beta-N-acetilglukozaminil transferaza, O-GlcNAc transferaza podjedinica P110, EC 2.4.1.255, O-povezana N-acetilglukozamin transferaza 110 KDa podjedinica, EC 2.4.1, HRNT1, EC 2.4.1.186, O-GLCNAC; GenBank: AAH38180.1); OA1 (Osteoartritis QTL 1, OASD; GenBank: CAA88742.1); NY-ESO -1/LAGE-2 (antigen za rak/testis 1B, CTAG1B, NY-ESO-1, LAGE-2, ESO1, CTAG1, CTAG, LAGE2B, antigen za rak/testis 1, autoimunogeni antigen za rak/testis NY-ESO-1, Ancer Antigen 3, antigen za rak/testis 6.1, Njujorški rak skvamoznih ćelija 1, L člana porodice antigena 2, LAGE2, CT6.1, LAGE2A; GenBank: AAI30365.1); NY-BR-1 (ANKRD30A, ankirin domen ponavljanja 30A, antigen za rak dojke NY-BR-1, serološki definisan antigen protiv raka dojke NY-BR-1, Ankinin domen ponavljanja koji sadrži protein 30A; NCBI referentna sekvenca: NP_443723.2); N-ras (NRAS, Neuroblastoma RAS virusni (V-Ras) onkogeni homolog, NRAS1, transformacioni protein N-Ras, GTPaza NRas, ALPS4, N-Ras protein deo 4, NS6, onkogeni homolog, HRAS1; GenBank: AAH05219.1); NFYC (faktor nuklearne transkripcije Y, gama, HAP5, HSM, faktor nuklearne transkripcije Y, podjedinica C, transaktivator HSM-1/2, CCAAT vezujući faktor, podjedinica C, NF-YC, CCAAT tranksripcioni vezujući faktor, podjedinica gama, CAAT Box DNK-vezujući proteins, podjedinica C, histon H1 transkripcioni faktor velika podjedinica 2A, CBFC, faktor nuklearne transkripcije Y podjedinica gama, CBF-C, transaktivator HSM-1, H1TF2A, faktor transkripcije NF-Y, C podjedinica; neo-PAP (PAPOLG, poli(A) polimeraza gama, neo-poli(A) polimeraza, nuklearna poli(A) polimeraza gama, polinukleotidna adenililtransferaza gama, SRP RNK 3' adenilacioni enzim/Pap2, PAP-gama, neo-PAP, SRP RNK 3'-adenilacioni enzim, PAP2, EC 2.7.7.19, PAPG; NCBI referentna sekvenca: NP_075045.2); NCA (CEACAM6, Genbank pristupni br. M1872); Napi3b (NAPI-3B, NPTIIb, SLC34A2, porodica nosača rastvora 34 (natrijum fosfat), član 2, tip II natrijum-zavisni transporter fosfata 3b, Genbank pristupni br. NM_00642); klasa miozina I; MUM-3; MUM-2 (TRAPPC1, kompleks čestica transporta proteina 1, BET5, BET5 homolog, MUM2, melanom ubikvitinski mutiran 2, protein multiplog mijeloma 2, kompleks čestica transporta proteina podjedinica 1; MUM-1f; mucin (MUC1, mucin 1, povezan sa ćelijskom površinom, PEMT, PUM, CA 15-3, MCKD1, ADMCKD, medularsna cistična bubrežna bolest 1 (autozomno dominantna), ADMCKD1, mucin 1, transmembrana, CD227, antigen povezan sa rakom dojke DF3, MAM6, antigen raka 15-3, MCD, mucin, mucin povezan sa rakom, MCKD, Krebs Von Den Lungen-6, MUC-1/SEC, kikiriki-reaktivni urinarni mucin, MUC1/ZD, epitelna membrana antigena povezana sa tumorom, DF3 antigen, mucin povezan sa tumorom, episialin, EMA, antigen H23, H23AG, mucin-1, KL-6, epitelni mucin povezan sa tumorom, MUC-1, episialin, PEM, CD227 Antigen; UniProtKB/Swiss-Prot: P15941.3); MUC5AC (mucin 5AC, oligomerna sluz/formiranje gela, traheobronhijalni mucin MUC5, TBM, mucin 5, podtipovi A i C, traheobronhijalni/želudčani, leB, želudačni mucin, mucin 5AC, oligomerna sluz/pseudogen za formiranje gela, Luisov antigen B krvne grupe, LeB, glavni glikoprotein disajnih puteva, MUC-5AC, mucin-5 podtip AC, traheobronhijalni; MUC1 (mucin 1, povezan sa površinom ćelije, PEMT, PUM, CA 15-3, MCKD1, ADMCKD, medularna cistična bolest bubrega 1 (autozomno dominantna), ADMCKD1, mucin 1, transmembrana, CD227, antigen povezan sa rakom dojke DF3, MAM6, Antigen za rak 15-3, MCD, mucin, MCKD, Krebs Von Den Lungen-6, MUC-1/SEC, kikiriki-reaktivni urinarni mucin, MUC-1/X, polimorfni epitelni mucin, MUC1/ZD, epitelni membranski antigen, DF3 antigen, mucin povezan sa tumorima, episialin, EMA, h23 Antigen, H23AG, mucin-1, KL-6, tumorski epitelijski mucin, MUC-1, episialin, PEM, CD227 antigen; MSG783 (RNF124, hipotetički protein FLJ20315, Genbank pristupni br. NM-01776; MRP4 – protein 4 izoform 3 koji je povezan sa rezistencijom na više lekova, MOAT-B; MOATB [Homo sapiens]; NCBI referentna sekvenca: NP_001288758.1; MPF (MPF, MSLN, SMR, faktor koji potencira megakariocite, mezotelin, Genbank pristupni br. NM_00582; MMP-7 (MMP7, matrilisin, MPSL1, matrin, matrična metaloproteinaza 7 (matrilisin, uterin), uterin matrilisin, matrična metaloproteinaza-7, 3.4.24.23, Pump-1 proteaza, Matrin, uterin metaloproteinaza, PUMP1, MMP-7, EC 3.4.24, PUMP-1; GenBank: AAC37543.1); MMP-2 (MMP2, matrična metaloproteinaza 2 (želatinaza A, 72kDa Želatinaza, 72kD kolagenaza tipa IV), MONA, CLG4A, matrična metaloproteinaza 2 (želatinaza A, 72kD želatinaza, 72kD kolagenaza tipa IV), CLG4, 72kDa želatinaza, 72kDa kolagenaza tipa IV), matrična metaloproteinaza-2, MMP-II, 72 Kda želatinaza, kolagenaza tipa IV-A, MMP-2, matrična metaloproteinaza-II, TBE-1, neutrofilna želatinaza, EC 3.4.24.24, EC 3.4.24; GenBank: AAH02576.1); i Meloe.
[0118] U nekim slučajevima, anti-CD3 antitelo koje ima prvi vezujući domen koji sadrži najmanje jedan, dva, tri, četiri, pet, ili šest hipervarijabilnih regiona (HVR) odabranih između (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 2; (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 3; (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 4; (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 5; i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 6, kao što je 40G5c, može imati drugi vezujući domen koji se vezuje za HER2. Drugi vezujući domen koji se vezuje za HER2 može, na primer, da sadrži najmanje jedan, dve, tri, četiri, pet, ili šest hipervarijabilnih regiona (HVR) odabranih između (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 169; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 170; (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 171; (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 172; (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 173; i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 174, kao što poseduje anti-HER2 antitelo, hu4D5. U nekim slučajevima, drugi vezujući domen koji vezuje HER2 sadrži najmanje jednu (npr. 1, 2, 3 ili 4) okvirne regije teškog lanca FR-H1, FR-H2, FR-H3 i FR-H4 koji sadrže sekvence SEQ ID NO: 549-552, i/ili najmanje jedan (npr. 1, 2, 3 ili 4) okvirni regiona lakog lanca FR-L1, FR-L2, FR-L3 i FR -L4 koji naročito sadrži sekvence SEQ ID NO: 553-556. U nekim slučajevima, drugi vezujući domen koji se vezuje za HER2 može, na primer, sadržati (a) VH domen koji sadrži aminokiselinsku
4
sekvencu koja ima najmanje 90% identičnosti sekvence (npr., najmanje 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sekvence) u odnosu na sekvencu, ili samu sekvencu, SEQ ID NO: 266; (b) VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 90% identičnosti sekvence (npr. Najmanje 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sekvence) u odnosu na sekvencu, ili samu sekvencu, SEQ ID NO: 271; ili (c) VH domen kao u (a) i VL domen kao u (b).
[0119] U nekim aspektima obelodanjenja, bispecifična antitela se takođe mogu koristiti za lokalizaciju citotoksičnih agensa u ćelijama koje eksprimiraju tumorski antigen, kao što je tumorski antigen naveden u Tabeli 1 (npr. CD20, FcRH5, HER2, LYPD1, LY6G6D, PMEL17, LY6E, CD19, CD33, CD22, CD79A, CD79B, EDAR, GFRA1, MRP4, RET, Steap1 ili TenB2). Bispecifična antitela se takođe mogu pripremiti kao antitela pune dužine ili fragmenti antitela.
[0120] Tehnike pravljenja multispecifičnih antitela uključuju, ali nisu ograničene na, rekombinantno koeksprimiranje dva para teški lanac-laki lanac imunoglobulina koji imaju različite specifičnosti (pogledati Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983)), WO 93/08829, i Traunecker i dr., EMBO J.10: 3655 (1991)), i „čvor u otvoru“ inženjering (pogledati npr. SAD patent br. 5,731,168). Inženjering „čvor u otvoru“ multispecifičnih antitela može se koristiti za generisanje prvog kraka koji sadrži čvor i drugog kraka koji sadrži otvor u kom se može vezati čvor prvog kraka. Ručica multispecifičnih antitela predmetnog pronalaska može biti anti-CD3 krak u jednom otelotvorenju. Alternativno, čvor multispecifičnih antitela predmetnog pronalaska može biti anti-cilj/antigen krak u jednom otelotvorenju. Otvor multispecifičnih antitela predmetnog pronalaska može biti anti-CD3 krak u jednom otelotvorenju. Alternativno, otvor multispecifičnih antitela predmetnog pronalaska može biti anti-cilj/antigen krak u jednom otelotvorenju. Multispecifična antitela se takođe mogu proizvesti korišćenjem imunoglobulinske unakrsne promene (poznate i kao Fab razmena domena ili CrossMab format) (pogledati npr. WO2009/080253; Schaefer i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 108:11187-11192 (2011)). Multi-specifična antitela se takođe mogu proizvesti inženjerskim elektrostatičkim upravljačkim efektima za pravljenje Fc-heterodimernih molekula antitela (WO 2009/089004A1); umrežavanjem dva ili više antitela ili fragmenata (pogledati npr. SAD patent br.
4,676,980, i Brennan i dr., Science, 229: 81 (1985)); korišćenjem leukinskih zatvarača za proizvodnju bispecifičnih antitela (pogledati, npr., Kostelny i dr., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)); korišćenjem tehnologije„dijatela“ za pravljenje fragmenata bispecifičnih antitela (pogledati npr. Hollinger i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)); i korišćenjem jednolančanih Fv (sFv) dimera (pogledati, npr. Gruber i dr., J. Immunol., 152:5368 (1994)); i pripremanjem trispecifičnih antitela kako je opisano, npr., kod Tutt i dr. J. Immunol.147: 60 (1991).
[0121] Ovde su takođe uključena sintetička antitela sa tri ili više funkcionalnih mesta vezivanja antigena, uključujući „hobotnička antitela“ (pogledati, npr. US 2006/0025576A1).
[0122] Antitela, ili njihovi fragmenti antitela, mogu takođe da obuhvataju „dvostruko delujući FAb“ ili „DAF“ koji sadrže vezujuće mesto za antigen koji se vezuje za CD3 kao i drugi, različiti antigen (npr. drugi biološki molekul) (pogledati npr. US 2008/0069820).
7. Varijante antitela
[0123] U određenim aspektima obelodanjenja, razmatraju se varijante aminokiselinskih sekvenci anti-CD3 antitela pronalaska (npr. bispecifična anti-CD3 antitela pronalaska koja se vezuju za CD3 i drugi biološki molekul, npr. antigen ćelijske površine, npr. tumorski antigen, kao što su TDB antitela predmetnog pronalaska ili njihove varijante). Na primer, može biti poželjno da se poboljšaju afinitet vezivanja i/ili druga biološka svojstva antitela. Varijante aminokiselinske sekvence antitela mogu se pripremiti uvođenjem odgovarajućih modifikacija u nukleotidnu sekvencu koja kodira antitelo, ili sintezom peptida. Takve modifikacije uključuju, na primer, brisanja iz i/ili umetanja u i/ili supstitucije ostataka unutar aminokiselinskih sekvenci antitela.
[0124] Bilo koja kombinacija brisanja, umetanja i supstitucije može se načiniti kako bi se dobio krajnji konstrukt, pod uslovom da krajnji konstrukt poseduje željene karakteristike, na primer, vezivanje antigena.
a. Varijante zamene, umetanja i brisanja
[0125] U određenim aspektima obelodanjenja, pružene su varijante antitela koje imaju jednu ili više supstitucija aminokiselina. Mesta od interesa za supstitucionu mutagenezu uključuju HVR i FR. Konzervativne supstitucije prikazane su u Tabeli 2 pod naslovom „Poželjne supstitucije.“ Značajnije promene date su u Tabeli 2, pod naslovom „Primerne supstitucije“, i dalje su opisane u nastavku u smislu klasa bočnih lanaca aminokiselina. Supstitucije aminokiselina mogu se uvesti u antitelo od interesa i proizvodi su ispitani za željenu aktivnost, na primer, zadržavanje/poboljšanje vezivanja antigena, smanjenu imunogenost ili poboljšani ADCC ili CDC.
TABELA 2. Primeri i poželjne supstitucije aminokiselina
[0126] Aminokiseline se mogu grupisati prema uobičajenim svojstvima bočnih lanaca:
(1) hidrofobne: norleukin, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) neutralne hidrofilne: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) kisele: Asp, Glu;
(4) bazne: His, Lys, Arg;
(5) ostaci koji utiču na orijentaciju lanca: Gly, Pro;
(6) aromatične: Trp, Tyr, Phe.
[0127] Nekonzervativne supstitucije podrazumevaće razmenu člana jedne od ovih klasa za drugu klasu.
[0128] Jedna vrsta supstitucione varijante uključuje supstituciju jednog ili više hipervarijabilnih ostataka matičnog antitela (npr. humanizovano ili ljudsko antitelo). Generalno, rezultujuća varijanta odabrana za dalje ispitivanje imaće modifikacije (npr. poboljšanja) određenih bioloških svojstava (npr. povećani afinitet, smanjena imunogenost) u odnosu na matično antitelo i/ili će značajno zadržati određena biološka svojstva matičnog antitela. Primer supstitucione varijante je afinitetno sazrelo antitelo, koje se može pogodno generisati, npr., korišćenjem tehnika sazrevanja afiniteta na bazi faga, kao što su one opisane ovde. Ukratko, jedan ili više HVR ostataka su mutirani, i varijanta antitela prikazana na fagu i ispitana za određenu biološku aktivnost (npr. afinitet vezivanja).
[0129] Izmene (npr. supstitucije) mogu se izvršiti u HVR, npr. radi poboljšanja afiniteta antitela. Takve izmene mogu se izvršiti u HVR „vrućim mestima“, tj. ostacima kodiranim kodonima koji se podvrgavaju mutaciji pri velikoj frekvenciji tokom procesa somatskog sazrevanja (pogledati npr. Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)), i/ili ostatke koji dolaze u dodir sa antigenom, gde je rezultujuća varijanta VH ili VL testirana za afinitet vezivanja. Sazrevanje afiniteta konstrukcijom i ponovnim odabirom iz sekundarnih biblioteka opisano je, na primer, kod Hoogenboom i dr. in Methods in Molecular Biology
4
178:1-37 (O'Brien i dr., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001).) U nekim aspektima sazrevanja afiniteta, raznolikosti se uvode u varijabilne gene izabrane za sazrevanje bilo kojim od različitih postupaka (npr. sa PCR koji sklon greškama, pomeranjem lanca ili mutagenezom usmerenom na oligonukleotid). Zatim se stvara sekundarna biblioteka. Biblioteka se zatim pretražuje kako bi se identifikovale bilo koje varijante antitela sa željenim afinitetom. Drugi postupak uvođenja raznolikosti uključuje pristupe usmerene na HVR, u kojima je nekoliko HVR ostataka (npr.4-6 ostataka odjednom) nasumično odabrano. HVR ostaci uključeni u vezivanje antigena mogu se posebno identifikovati, npr., koristeći mutagenezu skeniranja alanina ili modeliranje. CDR-H3 i CDR-L3 naročito su pogođeni.
[0130] U određenim aspektima obelodanjenja, zamene, umetanja ili brisanja mogu se desiti unutar jednog ili više HVR sve dok takve promene ne smanjuju u značajnoj meri sposobnost antitela da vezuje antigen. Na primer, konzervativne izmene (npr. konzervativne supstitucije kao što je ovde pruženo) koje ne smanjuju značajno afinitet vezivanja mogu se izvršiti u HVR. Takve promene mogu biti, na primer, izvan ostataka koji dolaze u dodir sa antigenom u HVR. U određenim aspektima obelodanjenja varijanti VH i VL koje su navedene gore, svaki HVR je ili nepromenjen, ili ne sadrži više od jedne, dve ili tri supstitucije aminokiselina.
[0131] Koristan postupak za identifikaciju ostataka ili regiona antitela koja mogu biti ciljana na mutagenezu naziva se „mutageneza skeniranja alanina“, kako je opisano kod Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085. U ovom postupku, ostatak ili grupa ciljanih ostataka (npr. Naelektrisani ostaci kao što su arg, asp, his, lys i glu) se identifikuju i zamenjuju neutralnom ili negativno naelektrisanom aminokiselinom (npr. alaninom ili polialaninom) kako bi se odredio da li ima uticaja na interakciju antitela sa antigenom. Dalje supstitucije mogu se uvesti na mestima aminokiselina koja pokazuju funkcionalnu osetljivost na početne supstitucije. Alternativno, ili dodatno, kristalna struktura antigen-antitelo kompleksa za identifikaciju tačaka dodira između antitela i antigena. Takvi dodirni ostaci i susedni ostaci mogu biti ciljani ili eliminisani kao kandidati za supstituciju. Varijante se mogu ispitati kako bi se utvrdilo da li sadrže željena svojstva.
[0132] Umetanje aminokiselinskih sekvenci uključuje fuzije amino- i/ili karboksil-terminala u rasponu dužine od jednog ostatka do polipeptida koji sadrže stotinu ili više ostataka, kao i umetanje pojedinačnih ili više aminokiselinskih ostataka. Primeri terminalnih umetaka uključuju antitelo sa N-terminalnim metionilnim ostatkom. Ostale varijante umetanja molekula antitela uključuju fuziju N- ili C-terminusa antitela za enzim (npr. za ADEPT) ili polipeptid koji povećava polu-život antitela u serumu.
b. Varijante glikozilacije
[0133] U nekim otelotvorenjima obelodanjenja, anti-CD3 antitela pronalaska (npr. bispecifična anti-CD3 antitela pronalaska koja se vezuju za CD3 i drugi biološki molekul, npr. antigen ćelijske površine, npr. antigen tumora, kao što su TDB antitela predmetnog pronalaska) mogu se izmeniti tako da povećaju ili smanje raspon do koga je antitelo glikozilovano. Dodavanje ili brisanje mesta glikozilacije u anti-CD3 antitelu pronalaska može se prikladno izvršiti promenom aminokiselinske sekvence tako da se stvori ili ukloni jedno ili više mesta glikozilacije.
[0134] Ako antitelo sadrži Fc region, ugljeni hidrati vezani za njega mogu biti izmenjeni. Nativna antitela proizvedena od strane ćelija sisara obično sadrže razgranat, dvoantentski oligosaharid koji je generalno vezan N-vezom za Asn297 od CH2 domena u Fc regionu. Pogledati npr. Wright i dr. TIBTECH 15:26-32 (1997). Oligosaharid može da obuhvata različite ugljene hidrate, npr. manozu, N-acetil glukozamin (GlcNAc), galaktozu i sijalinsku kiselinu, kao i fukozu vezanu za GlcNAc u „stabljici“ dvoantentske oligosaharidne strukture. U nekim otelotvorenjima, modifikacije oligosaharida u antitelu predmetnog pronalaska mogu se načiniti kako bi se stvorile varijante antitela sa određenim poboljšanim svojstvima.
[0135] U jednom otelotvorenju predmetnog obelodanjenja, pružene su varijante anti-CD3 antitela koja imaju ugljenohidratnu strukturu kojoj nedostaje fukoza vezana (direktno ili indirektno) za Fc region. Na primer, količina fukoze u takvom antitelu može biti od 1% do 80%, od 1% do 65%, od 5% do 65% ili od 20% do 40%. Količina fukoze se određuje izračunavanjem prosečne količine fukoze u lancu šećera na Asn297, u odnosu na zbir svih glikostruktura vezanih za Asn 297 (npr. složene, hibridne i strukture visoke manoze) mereno MALDI-TOF masenom spektrometrijom, kako je opisano u WO 2008/077546, npr. Asn297 se odnosi na ostatak asparagina koji se nalazi oko položaja 297 u Fc regionu (EU numeracija ostataka Fc regiona); međutim, Asn297 se takođe može nalaziti oko ± 3 aminokiseline uzvodno ili nizvodno od položaja 297, tj. između položaja 294 i 300, zbog manjih varijacija sekvenci u antitelima. Takve varijante fukozilacije mogu poboljšati funkciju ADCC. Pogledati, npr., SAD patente br. US 2003/0157108 (Presta, L.); US
4
2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Primeri publikacija koje se odnose na „defukozilirane“ ili „fukozno-deficitarne“ varijante antitela uključuju: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; Okazaki i dr. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki i dr. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004). Primeri ćelijskih linija sposobnih da proizvode defukozilirana antitela uključuju Lec13 CHO ćelije sa nedostatkom fukozilacije proteina (Ripka i dr. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); US Pat Appl No US 2003/0157108 A1, Presta, L; and WO 2004/056312 A1, Adams i dr., naročito u Example 11), i izbacivanje ćelijskih linija, kao što je gen alfa-1,6-fukoziltransferaze, FUT8, knockout CHO ćelije (pogledati npr. Yamane-Ohnuki i dr. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. i dr., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006); i WO2003/085107).
[0136] Varijante anti-CD3 antitela se dalje pružaju sa razgrađenim oligosaharidima, na primer, u kojima se dvoantentski oligosaharid, vezan za Fc region antitela, deli od strane GlcNAc. Takve varijante antitela mogu imati smanjenu fukozilaciju i/ili poboljšanu ADCC funkciju. Primeri takvih varijanti antitela su opisani, na primer, u WO 2003/011878 (Jean-Mairet i dr.); SAD patent br.6,602,684 (Umana i dr.); i US 2005/0123546 (Umana i dr.). Takođe su date i varijante antitela sa najmanje jednim ostatkom galaktoze u oligosaharidu vezanom za Fc region. Takve varijante antitela mogu poboljšati CDC funkciju. Takve varijante antitela su opisane, na primer, u WO 1997/30087 (Patel i dr.); WO 1998/58964 (Raju, S.); i WO 1999/22764 (Raju, S.).
c. Varijante Fc regiona
[0137] U određenim otelotvorenjima, jedna ili više modifikacija aminokiselina mogu se uvesti u Fc region anti-CD3 antitela pronalaska (npr., bispecifično anti-CD3 anti-HER2 antitelo predmetnog pronalaska koje se vezuje za CD3 i HER2 kao što je TDB antitelo predmetnog pronalaska), stvarajući tako varijantu Fc regiona (pogledati npr. US 2012/0251531). Varijanta Fc regiona može da sadrži sekvencu ljudskog Fc regiona (npr. ljudski IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4 Fc region) koji sadrži modifikaciju aminokiselina (npr., supstitucija) na jednom ili više položaja aminokiselina.
[0138] U nekim otelotvorenjima, pronalazak razmatra varijantu anti-CD3 anti- HER2 bispecifičnog antitela koja poseduje neke, ali ne sve efektorske funkcije, što ga čini poželjnim kandidatom za primene u kojima je polu-život antitela in vivo važan ali su, međutim, određene efektorske funkcije (poput komplementa i ADCC) nepotrebne ili štetne. In vitro i/ili in vivo ispitivanja citotoksičnosti mogu se sprovesti kako bi se potvrdilo smanjenje/osiromašivanje CDC i/ili ADCC aktivnosti. Na primer, mogu da se sprovedu testovi vezivanja Fc receptora (FcR) kako bi se osiguralo da antitelo nema vezivanje FcγR (stoga mu verovatno nedostaje ADCC aktivnost), ali zadržava sposobnost vezivanja FcRn. Primarne ćelije za posredovanje ADCC, NK ćelije, eksprimiraju samo Fc(RIII, dok monociti eksprimiraju Fc(RI, Fc(RII i Fc(RIII. FcR eksprimiranje na hematopoetskim ćelijama sažeto je u Tabeli 3 na strani 464 od Ravetch i Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991). Neograničavajući primeri in vitro testova za procenu ADCC aktivnosti molekula od interesa opisani su u SAD patent br. 5,500,362 (pogledati npr. Hellstrom, I. i dr. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)) i Hellstrom, I i dr., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985); 5,821,337 (pogledati Bruggemann, M. i dr., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)). Alternativno, mogu se koristiti neradioaktivne postupci ispitivanja (pogledati, na primer, neradioaktivni test citotoksičnosti ACTI™ za protočnu citometriju (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA; i CytoTox 96® neradioaktivni test citotoksičnosti (Promega, Madison, WI). Korisne efektorske ćelije za takve testove uključuju mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) i ćelije prirodne ubice (NK). Alternativno, ili dodatno, može se proceniti ADCC aktivnost molekula od interesa. in vivo, npr., u životinjskom modelu kakav je onaj obelodanjen kod Clynes i dr. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998). Testovi za vezivanje C1q takođe se mogu izvesti kako bi se potvrdilo da antitelo nije u stanju da vezuje C1q i stoga mu nedostaje CDC aktivnost. Pogledati, na primer, C1q i C3c vezujući ELISA u WO 2006/029879 i WO 2005/100402. Za procenu aktivacije komplementa može se izvršiti CDC test (pogledati, na primer, Gazzano-Santoro i dr. J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M.S. i dr. Blood. 101:1045-1052 (2003); i Cragg, M.S. and M.J. Glennie Blood.
103:2738-2743 (2004)). FcRn vezivanje i in vivo određivanje klirensa/polu-života takođe se može obaviti korišćenjem postupaka poznatih u tehnici (pogledati npr. Petkova, S.B. i dr. Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006)).
[0139] Antitela sa smanjenom efektorskom funkcijom uključuju ona sa supstitucijom jednog ili više ostataka Fc regiona 238, 265, 269, 270, 297, 327 i 329 (SAD patenti br. 6,737,056 i 8,219,149). Takvi Fc mutanti uključuju Fc mutante sa supstitucijama na dva ili više aminokiselinskih položaja 265, 269, 270, 297 i 327, uključujući takozvane „DANA“ Fc mutante sa supstitucijom ostataka 265 i 297 za alanin (SAD patent br.
4
7,332,581 i 8,219,149).
[0140] U određenim otelotvorenjima, prolin na položaju 329 ljudskog Fc regiona divljeg tipa u antitelu je supstituisan glicinom ili argininom ili aminokiselinskim ostatkom dovoljno velikim da uništi prolinski sendvič u Fc/Fcg gama receptor interfejsu koji se formira između prolina 329 od Fc i ostataka triptofana Trp 87 i Trp 110 od FcgRIII (Sondermann i dr.: Nature 406, 267-273 (20 jul 2000)) U nekim otelotvorenjima, antitelo sadrži najmanje jednu dalju supstituciju aminokiselina. U jednom aspektu, dalja supstitucija aminokiselina je S228P, E233P, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D ili P331S, i u narednom otelotvorenju najmanje jedna dodatna supstitucija aminokiselina je L234A i L235A ljudskog IgG1 Fc regiona ili S228P i L235E ljudskog IgG4 Fc regiona (pogledati npr. US 2012/0251531), i u daljem otelotvorenju, najmanje jedna supstitucija aminokiselina je L234A i L235A i P329G ljudskog IgG1 Fc regiona.
[0141] Opisane su određene varijante antitela sa poboljšanim ili umanjenim vezivanjem za FcR. (Pogledati npr. SAD patent br.6,737,056; WO 2004/056312, i Shields i dr., J. Biol. Chem.9(2): 6591-6604 (2001).)
[0142] U nekim otelotvorenjima, varijanta antitela sadrži Fc region sa jednom ili više supstitucija aminokiselina koje poboljšavaju ADCC, na primer, supstitucije na položajima 298, 333 i/ili 334 iz Fc regiona (EU numeracija ostataka).
[0143] U nekim otelotvorenjima, izmene su napravljene u Fc regionu koje rezultuju izmenjenim (tj., bilo poboljšanim ili umanjenim) C1q vezivanjem i/ili citotoksičnosti zavisnom od komplementa (CDC), npr. kako je opisano u SAD patentu br. 6,194,551, WO 99/51642, i Idusogie i dr. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000).
[0144] Antitela sa produženim polu-životom i poboljšanim vezivanjem za neonatalni Fc receptor (FcRn), koji je odgovoran za prenos majčinih IgG na plod (Guyer i dr., J. Immunol.117:587 (1976) and Kim i dr., J. Immunol. 24:249 (1994)), opisani su u US2005/0014934A1 (Hinton i dr.). Ta antitela sadrže Fc region sa jednom ili više supstitucija koje poboljšavaju vezivanje Fc regiona za FcRn. Takve Fc varijante uključuju one sa supstitucijama na jednom ili više ostataka Fc regiona: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 ili 434, npr. supstitucija ostatka Fc regiona 434 (SAD patent br.7,371,826).
[0145] Takođe pogledati Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988); SAD patent br. 5,648,260; SAD patent br.5,624,821; i WO 94/29351 koji se tiče drugih primera varijanti Fc regiona.
[0146] U nekim aspektima, bispecifično anti-CD3 antitelo sadrži Fc region koji sadrži N297G mutaciju. U nekim aspektima obelodanjenja, anti-CD3 antitelo koje sadrži N297G mutaciju sadrži anti-CD3 krak koji sadrži prvi vezujući domen koji sadrži narednih šest HVR: (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 2; (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 3; (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 4; (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 5; i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 6; i anti-CD20 krak koji sadrži drugi vezujući domen koji sadrži narednih šest HVR: (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 157; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 158; (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 159; (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 160; (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 161; i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 162.
[0147] U nekim aspektima predmetnog obelodanjenja, anti-CD3 antitelo koje sadrži N297G mutaciju sadrži anti-CD3 krak koji sadrži prvi vezujući domen koji sadrži (a) VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 184 i (b) a VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 185, i anti-CD20 krak koji sadrži drugi vezujući domen koji sadrži (a) VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 266 i (b) VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 267.
[0148] U nekim otelotvorenjima predmetnog obelodanjenja, anti-CD3 antitelo koje sadrži N297G mutaciju sadrži jedan ili više konstantnih domena teškog lanca, gde su jedan ili više konstantnih domena teškog lanca izabrani od prvog CH1 (CH11) domena, prvog CH2 (CH21) domena, prvog CH3 (CH31) domena, drugog CH1 (CH12) domena, drugog CH2 (CH22) domena i drugog CH3 (CH32) domena. U nekim slučajevima, bar jedan od jednog ili više konstantnih domena teškog lanca uparen je sa drugim konstantnim domenom teškog lanca. U nekim slučajevima CH31i CH32domeni svi sadrže ispupčenje ili šupljinu, gde se ispupčenje ili šupljina u CH31domenu pozicionirani u šupljini ili ispupčenju u CH32domenu. U nekim slučajevima CH31i
4
CH32domeni se susreću na spoju između navedenog ispupčenja i šupljine. U nekim slučajevima CH21i CH22domeni svi sadrže ispupčenje ili šupljinu, gde se ispupčenje ili šupljina u CH21domena mogu postaviti u šupljini ili ispupčenju, u CH22domena. U ostalim slučajevima, CH21i CH22domeni se susreću na spoju između navedenog ispupčenja i šupljine. U nekim slučajevima, anti-CD3 antitelo je IgG1 antitelo.
[0149] U drugim aspektima, anti-CD3 antitelo koje sadrži N297G mutaciju sadrži anti-CD3 krak koji sadrži prvo vezujući domen, koji sadrži (a) VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 184 i (b) VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 185, i anti-CD20 krak koji sadrži drugi vezujući domen koji sadrži (a) VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 266 i (b) VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 267, gde (a) anti-CD3 krak sadrži T366S, L368A, Y407V i N297G supstitucione mutacije i (b) anti-CD20 krak sadrži T366W i N297G supstitucione mutacije.
d. Varijante antitela zasnovane na cisteinu
[0150] U određenim otelotvorenjima obelodanjenja, može biti poželjno stvoriti antitela napravljena od cisteina, na primer, „tioMAb“, u kojima su jedan ili više ostataka antitela supstituisani cisteinskim ostacima. U posebnim otelotvorenjima, supstituisani ostaci se javljaju na pristupačnim mestima antitela. Supstitucijom tih ostataka cisteinom, reaktivne tiolne grupe su tako pozicionirane na pristupačnim mestima antitela i mogu se koristiti za konjugaciju antitela sa drugim delovima, kao što su delovi leka ili veznik-lek delovi, radi stvaranja imunokonjugata, kao što je opisano dalje u tekstu. U nekim otelotvorenjima, bilo koji ili više narednih ostataka može biti zamenjen cisteinom: V205 (Kabat numeracija) lakog lanca; A118 (EU numeracija) teškog lanca; i S400 (EU numeracija) Fc regiona teškog lanca. Antitela zasnovana na cisteinom mogu biti generisana kako je opisano, na primer, u SAD patentu br.7,521,541.
e. Derivati antitela
[0151] U određenim otelotvorenjima, bispecifično anti-CD3 antitelo pronalaska koje se vezuje za CD3 i HER2, kao što je ovde dato TDB antitelo predmetnog pronalaska može biti dalje modifikovano tako da sadrži dodatne neproteinske delove, koji su poznati u struci i lako su dostupni. Grupe pogodne za derivatizaciju antitela uključuju, ali nisu ograničene na, polimere rastvorljive u vodi. Neograničavajući primeri polimera rastvorljivih u vodi uključuju, ali nisu ograničeni na, polietilen glikol (PEG), kopolimer etilen glikola/propilen glikola, karboksimetilcelulozu, dekstran, polivinil alkohol, polivinil pirolidone, poli-1,3-dioksolan, poli-1,3,6-trioksan, kopolimer etilena/maleinskog anhidrida, poliaminoakiseline (bilo homopolimeri ili nasumični kopolimeri), i dekstran ili poli(n-vinil pirolidon)polietilen glikol, homoprolimeri propropilen glikola, ko-polimeri prolipropilen oksida/etilen oksida, polioksietilovani polioli (npr. glicerol), polivinil alkohol i njihove smeše. Polietilen glikol propionaldehid može imati prednosti u proizvodnji zbog svoje stabilnosti u vodi. Polimer može biti bilo koje molekulske težine, i može biti razgranat ili nerazgranat. Broj polimera vezanih za antitelo može varirati, i ako je vezano više od jednog polimera, to mogu biti isti ili različiti molekuli. Generalno, broj i/ili vrsta polimera koji se koriste za derivatizaciju mogu se odrediti na osnovu razmatranja koja uključuju, ali nisu ograničena na, posebna svojstva ili funkcije antitela koje se trebaju poboljšati, da li će se derivat antitela koristiti u terapiji pod definisani uslovi itd.
[0152] U drugom otelotvorenju su pruženi konjugati antitela i neproteinski delovi koji se mogu selektivno zagrevati izlaganjem zračenju. U jednom aspektu, neproteinska grupa je ugljenična nanocev (Kam i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)). Zračenje može biti bilo koje talasne dužine, i uključuje, ali nije ograničeno na, talasne dužine koje ne štete običnim ćelijama, ali koje zagrijavaju neproteinsku jedinicu do temperature na kojoj se ubijaju ćelije proksimalne za antitelo-neproteinski deo.
B. Rekombinantne postupci i sastavi
[0153] Bispecifična anti-CD3 antitela pronalaska koja se vezuju za CD3 i HER2, kao što su TDB antitela predmetnog pronalaska ili njegove varijante mogu se proizvesti korišćenjem rekombinantnih postupaka i sastava, na primer, kao što je opisano u SAD patentu br.4,816,567. U jednom otelotvorenju je data izolovana nukleinska kiselina koja kodira ovde opisano anti-CD3 antitelo. Takva nukleinska kiselina može da kodira aminokiselinsku sekvencu koja sadrži VL i/ili aminokiselinsku sekvencu koja sadrži VH antitela (npr. laki i/ili teški lanci antitela). U narednom otelotvorenju je pružen jedan ili više vektora (npr. vektora eksprimiranja) koji sadrže takvu nukleinsku kiselinu. U narednom otelotvorenju je pružena ćelija domaćin koja sadrži takvu nukleinsku kiselinu. U jednom takvom otelotvorenju ćelija domaćin sadrži (npr., transformisana je sa): (1) vektorom koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira aminokiselinsku sekvencu koja sadrži VL antitela i aminokiselinsku sekvencu koja sadrži VH antitela ili (2) prvi vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira aminokiselinsku sekvencu koja sadrži VL antitela i drugi vektor koji sadrži
4
nukleinsku kiselinu koja kodira aminokiselinsku sekvencu koja sadrži VH antitela. U jednom aspektu, ćelija domaćin je eukariotska, npr. ćelija jajnika kineskog hrčka (CHO) ili limfoidna ćelija (npr. Y0, NS0, Sp20 ćelija). U jednom otelotvorenju je pružen postupak pravljenja anti-CD3 antitela, gde postupak uključuje kultivaciju ćelije domaćina koja sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira antitelo, kao što je navedeno iznad, pod uslovima pogodnim za eksprimiranje antitela i opciono oporavkom antitela iz ćelije domaćina (ili medijuma kulture ćelije domaćina).
[0154] Za rekombinantnu proizvodnju anti-CD3 antitela, nukleinska kiselina koja kodira antitelo, npr., kao što je opisano iznad, je izolovana i ubačena u jedan ili više vektora za dalje kloniranje i/ili eksprimiranje u ćeliji domaćinu. Takva nukleinska kiselina može se lako izolovati i sekvencionisati korišćenjem uobičajenih postupaka (npr., korišćenjem oligonukleotidnih sondi koje su sposobne da se specifično vezuju za gene koji kodiraju teški i laki lanac antitela).
[0155] Pogodne ćelije domaćina za kloniranje ili eksprimiranje vektora koji kodiraju antitelo uključuju prokariotske ili eukariotske ćelije opisane ovde. Na primer, antitela se mogu proizvesti u bakterijama, naročito kada nisu potrebne glikozilacija i Fc efektorska funkcija. Za eksprimiranje fragmenata antitela i polipeptida u bakterijama, pogledati, npr. SAD patente br. 5,648,237, 5,789,199, i 5,840,523. (Takođe pogledati Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254, koji opisuje eksprimiranje fragmenata antitela u E. Coli). Posle eksprimiranja, antitelo može biti izolovano iz paste bakterijskih ćelije u rastvorljivom fragmentu i može se dalje prečišćavati.
[0156] Pored prokariota, eukariotski mikrobi kao što su vlaknaste gljive ili kvasci su pogodni domaćini za kloniranje ili eksprimiranje za vektore koji kodiraju antitelo, uključujući sojeve gljiva i kvasaca čiji su putevi glikozilacije „humanizovani“, što rezultuje proizvodnjom antitela sa delimično ili potpuno ljudskim obrascem glikozilacije. Pogledati Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004), and Li i dr., Nat. Biotech.
24:210-215 (2006).
[0157] Pogodne ćelije domaćina za eksprimiranje glikozilovanog antitela takođe su izvedene iz višećelijskih organizama (beskičmenjaka i kičmenjaka). Primeri ćelija beskičmenjaka uključuju ćelije biljaka i insekata. Identifikovani su brojni bakuloviralni sojevi koji se mogu koristiti zajedno sa ćelijama insekata, posebno za transfekciju Spodoptera frugiperda ćelija.
[0158] Kulture biljnih ćelija se takođe mogu koristiti kao domaćini. Pogledati, npr., SAD patentne br.
5,959,177, 6,040,498, 6,420,548, 7,125,978, i 6,417,429 (opisuje PLANTIBODIES™ tehnologiju za proizvodnju antitela u transgenim biljkama).
[0159] Ćelije kičmenjaka takođe se mogu koristiti kao domaćini. Na primer, ćelijske linije sisara koje su prilagođene za rast u suspenziji mogu biti korisne. Ostali primeri korisnih ćelijskih linija domaćina sisara su CV1 linija majmunskog bubrega transformisana sa SV40 (COS-7); ljudska embrionalna linija bubrega (293 ili 293 ćelije kako je opisano, npr., kod Graham i dr., J. Gen Virol.36:59 (1977)); ćelije bubrega beba hrčaka (BHK); mišje sertolijske ćelije (TM4 ćelije kako je opisano, npr., kod Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); ćelije bubrega majmuna (CV1); ćelije bubrega afričkog zelenog majmuna (VERO-76); ćelije ljudskog raka grlića materice (HELA); ćelije bubrega pasa (MDCK; ćelije jetre bafalo pacova (BRL 3A); ljudske ćelije pluća (W138); ćelije ljudske jetre (Hep G2); tumor dojke miša (MMT 060562); TRI ćelije, kako je opisano, npr. kod Mather i dr., Annals N.Y. Acad. Sci.383:44-68 (1982); MRC 5 ćelije; i FS4 ćelije. Ostale korisne ćelijske linije domaćina sisara uključuju ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO), uključujući DHFR- CHO ćelije (Urlaub i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); i ćelijske linije mijeloma kao što su Y0, NSO i Sp2/0. Za pregled određenih ćelijskih linija domaćina sisara pogodnih za proizvodnju antitela, pogledati, npr. Yazaki i Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp.255-268 (2003)..
C. Analize
[0160] Bispecifična anti-CD3 antitela prema pronalasku koja se vezuju za CD3 i HER2, kao što su TDB antitela predmetnog pronalaska, mogu se identifikovati, ispitivati ili karakterisati po svojim fizičkim/hemijskim svojstvima i/ili biološkim aktivnostima pomoću različitih ispitivanja poznatih u struci.
1. Testovi vezivanja i drugi testovi
[0161] U jednom aspektu predmetnog obelodanjenja, anti-CD3 antitelo pronalaska je testirano na svoju aktivnost vezivanja antigena, na primer, poznatim postupcima kao što su ELISA, Western blot, itd.
[0162] U drugom aspektu predmetnog obelodanjenja, testovi nadmetanja mogu se koristiti za identifikovanje antitela koje se nadmeće sa anti-CD3 antitelom predmetnog pronalaska za vezivanje za CD3.
[0163] U primernom testu nadmetanja imobilisani CD3 se inkubira u rastvoru koji sadrži prvo označeno antitelo koje se vezuje za CD3 i drugo neoznačeno antitelo koje se testira za svoju sposobnost da se nadmeće sa prvim antitelom za vezivanje za CD3. Drugo antitelo može biti prisutno u hibridoma supernatantu. Kao kontrola, imobilisani CD3 se inkubira u rastvoru koji sadrži prvo označeno antitelo, ali ne i drugo neoznačeno antitelo. Posle inkubacije pod uslovima dozvoljenim za vezivanje prvog anti-CD3 antitela, uklanja se višak nevezanih antitela i meri se količina oznake povezane sa imobilisanim CD3. Ako je količina oznake sa imobilisanim CD3 značajno smanjena u test uzorku u odnosu na kontrolni uzorak, onda to ukazuje da se drugo antitelo nadmeće sa prvim antitelom za vezivanje za CD3. Pogledati npr. Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual. Ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).
2. Analiza aktivnosti
[0164] U jednom aspektu predmetnog obelodanjenja, daju se ispitivanja za identifikovanje anti-CD3 antitela koja imaju biološku aktivnost. Biološka aktivnost može da uključuje, na primer, vezivanje za CD3 (npr. CD3 na površini T ćelije) ili njegovog peptidnog fragmenta, bilo in vivo, in vitro, ili ex vivo. U slučaju multispecifičnog (npr. bispecifičnog) anti-CD3 antitela predmetnog pronalaska (npr., TDB antitelo koje ima jedan anti-CD3 krak i jedan krak koji prepoznaje drugi biološki molekul, npr. antigen ćelijske površine, npr. tumorski antigen), biološka aktivnost može takođe obuhvatati, na primer, aktivaciju efektorske ćelije (npr. aktivaciju T ćelije (npr. CD8+ i/ili CD4+ T ćeliju)), širenje populacije efektorskih ćelija (tj. povećanje broja T ćelija), smanjenje populacije ciljanih ćelija (tj. smanjenje populacije ćelija koje eksprimiraju drugi biološki molekul na njihovim ćelijskim površinama) i/ili ubijanje ciljanih ćelija. Data su antitela koja imaju takvu biološku aktivnost in vivo i/ili in vitro. U nekim otelotvorenjima, antitelo pronalaska je testirano na takvu biološku aktivnost, kao što je detaljno opisano u Primerima navedenim u nastavku.
[0165] U nekim otelotvorenjima predmetnog obelodanjenja, aktivnost uključuje aktiviranju citotoksičnih T ćelija. U nekim otelotvorenjima bilo kog od ovih ispitivanja aktivnosti, PBMC se mogu izolovati iz pune krvi zdravih donora pomoću Ficoll razdvajanja. Konkretno, ljudska krv može se prikupiti u heparinizovanim špricevma, i PBMC se izoluje pomoću Leucosep and Ficoll Paque Plus. Prema potrebi, CD4+T i CD8+T ćelije mogu se odvojiti Miltenyi kompletima prema uputstvima proizvođača.
[0166] Dalje, ćelije se mogu isprati u RPMI medijumu koji sadrži 10% FBS, dopunjen sa GlutaMax, penicilinom i streptomicinom i -0,2 miliona suspendovanih ćelija dodatih u ploču sa U-dnom sa 96 komorica. Ćelije se mogu uzgajati u RPMI1640 sa dodatkom 10% FBS na 37°C u vlažnom standardnom inkubatoru ćelijske kulture. Za testove ubijanja BJAB ćelija, 20.000 BJAB ćelija može se inkubirati sa efektorskim ćelijama, bilo kao huPBMC ili prečišćene T ćelije, kao što je naznačeno u odnosu na test, u prisustvu različitih koncentracija TDB antitela tokom 24 sata. Za ispitivanja endogenih B ćelija, 200.000 huPBMC može se inkubirati sa različitim koncentracijama TDB antitela tokom 24 sata.
[0167] Posle kultivisanja, ćelije se mogu isprati sa FACS puferom (0,5% BSA, 0,05% Na azida u PBS). Ćelije mogu zatim da se oboje u FACS puferu, isperu sa FACS puferom i suspenduju u 100 µl FACS pufera koji sadrži 1 µg/ml propidijum jodida. Podaci se mogu prikupiti na FACSCalibur protočnom citometru i analizirati pomoću FlowJo. Žive B ćelije mogu se prikazati kao PI-CD19+ ili PI-CD20+ B ćelije pomoću FACS, i apsolutno brojanje ćelija može se dobiti pomoću FITC zrnaca dodatih u reakcionu smešu kao unutrašnja kontrola brojanja. Procenat (%) ubijanja ćelija može se izračunati na osnovu kontrola koje nisu tretirane sa TDB. Aktivirane T ćelije mogu se otkriti površinskim eksprimiranjem CD69 i CD25 korišćenjem anti-CD69-FITC i anti-CD25-PE.
D. Imunokonjugati
[0168] Pronalazak takođe pruža imunokonjugate koji sadrže anti-CD3 antitelo predmetnog pronalaska konjugovano sa jednim ili više citotoksičnih agenasa, kao što su hemoterapijski agensi ili lekovi, agensi koji inhibiraju rast, toksini (npr. toksini proteina, enzimski aktivni toksini bakterijskog, gljivičnog, biljnog, ili životinjskog porekla, ili njihovi fragmenti), ili radioaktivnih izotopa.
[0169] U jednom aspektu, imunokonjugat je antitelo-lek konjugat (ADC) u kom je antitelo konjugovano sa jednim ili više lekova, uključujući, ali ne ograničavajući se na majtansinoid (pogledati SAD patente br.
5,208,020, 5,416,064 i Evropski patent EP 0425235 B1); auristatin kao što su monometilauristatin delovi lekova DE i DF (MMAE i MMAF) (pogledati SAD patente br. 5,635,483 i 5,780,588, i 7,498,298); dolastatin; kaliheamicin ili njegov derivat (pogledati SAD patente br. 5,712,374, 5,714,586, 5,739,116, 5,767,285, 5,770,701, 5,770,710, 5,773,001, i 5,877,296; Hinman i dr., Cancer Res. 53:3336-3342 (1993); i
1
Lode i dr., Cancer Res. 58:2925-2928 (1998)); antraciklin kao što je daunomicin ili doksorubicin (pogledati Kratz i dr., Current Med. Chem. 13:477-523 (2006); Jeffrey i dr., Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362 (2006); Torgov i dr., Bioconj. Chem.16:717-721 (2005); Nagy i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829-834 (2000); Dubowchik i dr., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532 (2002); King i dr., J. Med. Chem.
45:4336-4343 (2002); i SAD patent br. 6,630,579); metotreksat; vindesin; taksan kao što su docetaksel, paklitaksel, larotaksel, tezetaksel i ortataksel; trihotecen; i CC1065.
[0170] U drugom otelotvorenju, imunokonjugat sadrži anti-CD3 antitelo pronalaska povezano sa enzimatski aktivnim toksinom ili njegovim fragmentom, uključujući, ali ne ograničavajući se na lanac difterije A, nevezujuće aktivne fragmente toksina difterije, egzotoksin A lanac (od Pseudomonas aeruginosa), ricin A lanac, abrin A lanac, modecin A lanac, alfa-sarcin, Aleurites fordii proteini, diantin proteini, Phytolaca americana proteini (PAPI, PAPII i PAP-S), momordica charantia inhibitor, kurcin, krotin, sapaonaria officinalis inhibitor, gelonin, mitogelin, restrictocin, fenomicin, enomicin i trikotecene.
[0171] U drugom otelotvorenju, imunokonjugat sadrži anti-CD3 antitelo predmetnog pronalaska konjugovano za radioaktivni atom kako bi se formirao radiokonjugat. Za proizvodnju radiokonjugata dostupni su različiti radioaktivni izotopi. Primeri uključuju At<211>, I<131>, I<125>, Y<90>, Re<186>, Re<188>, Sm<153>, Bi<212>, P<32>, Pb<212>i radioaktivni izotopi od Lu. Kada se radiokonjugat koristi za detektovanje, on može sadržati radioaktivni atom za scintigrafijska ispitivanja, na primer tc99m ili 1123, ili spin oznaku za snimanje nuklearne magnetne rezonance (takođe poznato kao snimanje magnetnom rezonancom, mri), kao što je ponovo jod-123, jod-131, indijum-111, fluor-19, ugljenik-13, azot-15, kiseonik-17, gadolinijum, mangan ili gvožđe.
[0172] Konjugati antitela i citotoksičnog agensa mogu se proizvesti korišćenjem različitih bifunkcionalnih agenasa za vezivanje proteina, kao što su N-sukcinimidil-3-(2-pirididitio) propionat (SPDP), sukcinimidil-4-(N-maleimidometil) cikloheksan-1-karboksilat (SMCC), iminotiolan (IT), bifunkcionalni derivati imidoestara (kao što je dimetil adipimidat HCI), aktivni estri (poput disukcinimidil suberata), aldehidi (poput glutaraldehida), bis-azido jedinjenja (kao što su bis (p-azidobenzoil) heksandiamin), bis-diazonijum derivati (kao što je bis-(p-diazonijumbenzoil)-etilendiamin), diizocijanati (kao što je toluen 2,6-diizocijanat) i bisaktivna jedinjenja fluora (kao što je 1,5-difluoro-2, 4-dinitrobenzen). Na primer, imunotoksin ricin može da se pripremi kao što je opisano kod Vitetta i dr., Science 238:1098 (1987). 1-izotiocijanatobenzil-3-metildietilen triaminpentasirćetna kiselina (MX-DTPA) označena ugljenikom 14 je primer helatnog agensa za konjugaciju radionukleotida sa antitelom. Pogledati WO94/11026. Veznik može biti „razdvojivi veznik“ koji olakšava oslobađanje citotoksičnog leka u ćeliji. Na primer, mogu se koristiti veznik koji je labilan na kiselinu, veznik osetljiv na peptidazu, fotolabilni veznik, dimetil veznik ili veznik koji sadrži disulfid (Chari i dr., Cancer Res.52:127-131 (1992); U.S. Patent No.5,208,020).
[0173] Ovde navedeni imunokonjugati ili ADC izričito razmatraju, ali nisu ograničeni na takve konjugate, pripremljene sa reagensima za unakrsno vezivanje koji uključuju, ali nisu ograničeni na, BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC, and sulfo-SMPB i SVSB (sukcinimidil-(4-vinilsulfon) benzoat) koji su komercijalno dostupni (npr. od Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.A).
E. Postupci i sastavi za dijagnostiku i detektovanje
[0174] U određenim otelotvorenjima, bispecifična anti-CD3 antitela pronalaska koja se vezuju za CD3 i HER2, kao što su TDB antitela predmetnog pronalaska su korisna za detektovanje prisustva CD3 u biološkom uzorku. Izraz „detektovanje“ kako se ovde koristi obuhvata kvantitativno ili kvalitativno detektovanje. U nekim otelotvorenjima, biološki uzorak sadrži ćeliju ili tkivo.
[0175] U određenim otelotvorenjima obelodanjenja, pružena su označena anti-CD3 antitela. Oznake uključuju, ali nisu ograničene na, oznake ili delove koji se direktno detektuju (kao što su fluorescentne, hromoforne, elektro-guste, hemiluminiscentne i radioaktivne oznake), kao i delove, kao što su enzimi ili ligandi, koji se detektuju indirektno, npr. enzimatskom reakcijom ili molekularnom interakcijom. Primeri oznaka uključuju, ali nisu ograničeni na, radioizotope<32>P,<14>C,<125>I,<3>H, i<131>I, fluorofore kao što su retki helati zemnoalkalnih metala ili fluorescein i njegovi derivati, rodamin i njegovi derivati, dansil, umeliferon, luceriferaze, npr. luciferaza svica i bakterijska luciferaza (SAD patent br. 4,737,456), luciferin, 2,3-dihidroftalazindioni, peroksidaza rena (HRP), alkalna fosfataza, β-gataktozidaza, glukoamilaza, lizocim, saharid oksidaze, npr., glukoza oksidaza, galaktoza oksidaza, i glukoza-6-fosfat dehidrogenaza, heterociklične oksidaze kao što su uricaza i ksantin oksidaza, zajedno sa enzimom koji koristi vodonik
2
peroksid za oksidaciju prekursora boje kao što su HRP, laktoperoksidaza ili mikroperoksidaza, biotin/avidin, spin oznake, oznake bakteriofaga, stabilni slobodni radikali i slično.
F. Farmaceutske formulacije
[0176] Farmaceutske formulacije bispecifičnog anti-CD3 antitela pronalaska koja se vezuje za CD3 i HER2, kao što je TDB antitelo predmetnog pronalaska, dobijaju se mešanjem antitela koja imaju željeni stepen čistoće sa jednim ili više opcionih farmaceutski prihvatljivih nosača (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)), u obliku liofilizovanih formulacija ili vodenih rastvora. Farmaceutski prihvatljivi nosači uglavnom nisu toksični za primaoce u korišćenim dozama i koncentracijama i uključuju, ali nisu ograničeni na: pufere poput fosfata, citrata i drugih organskih kiselina; antioksidanse koji uključuju askorbinsku kiselinu i metionin; konzervanse (kao što ssu oktadecilldimetilbenzil ammonijum hlorid; heksametonijum hlorid; benzalkonijum hlorid; benzetonijum hlorid; fenol, butil ili benzil alkohol; alkil parabene kao što su metil ili propil paraben; katehol; resorcinol; cikloheksanol; 3-pentanol; i m-cresol) polipeptide niske molekularne mase (manje od oko 10 ostataka); proteine, kao što su serumski albumin, želatin ili imunoglobulini; hidrofilne polimere, poput polivinilpirolidona; aminokiseline kao što su glicin, glutamin, asparagin, histidin, arginin ili lizin; monosaharide, disaharide i drugi ugljene hidrate uključujući glukozu, manozu ili dekstrine; helatorske agense kao što je EDTA; šećere kao što su saharoza, manitol, trehaloza ili sorbitol; kontra-jone koji stvaraju so kao što je natrijum; metalne komplekse (npr. Zn-proteinske komplekse); i/ili nejonske surfaktante kao što je polietilen glikol (PEG). Primerni farmaceutski prihvatljivih nosača ovde uključuju međurpostorne agense za disperziju leka kao što su rastvorljivi neutralni aktivni hijaluronidazni glikoproteini (sHASEGP), na primer, ljudski rastvorljivi PH-20 hijaluronan glikoproteini, kao što je rHuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.). Neki uzorni sHASEGP i postupci upotrebe, uključujući rHuPH20, su opisani u SAD publikacijama patenata br. 2005/0260186 i 2006/0104968. U jednom aspektu, sHASEGP se kombinuje sa jednom ili više dodatnih glikozaminoglikanaza, kao što su hondroitinaze.
[0177] Primeri formulacija liofiliziranih antitela su opisani u SAD patentu br. 6,267,958. Formulacije vodenih antitela uključuju one opisane u SAD patentu br. 6,171,586 i WO2006/044908, gde formulacije drugog uključuju histidin-acetat pufer.
[0178] Formulacija ovde može takođe da sadrži više od jednog aktivnog sastojka prema potrebi za određenu indikaciju koja se tretira, poželjno one sa komplementarnim aktivnostima koje ne utiču štetno jedna na drugu. Na primer, može biti poželjno da se pruži dodatni terapeutski agens (npr., hemoterapijski agens, citotoksični agens, agens za inhibiciju rasta i/ili anti-hormonski agens, kao što je prethodno navedeno). Takvi aktivni sastojci su prikladno prisutni u kombinaciji u količinama koje su efikasne u predviđenu svrhu.
[0179] Aktivni sastojci se mogu ugraditi u mikrokapsule pripremljene, na primer, tehnikama koakervacije ili interfacijalnom polimerizacijom, na primer, hidroksimetilcelulozom ili želatinskim mikrokapsulama, odnosno poli-(metilmetacilatnim) mikrokapsulama, u sistemima za primenu koloidnih lekova (na primer, lipozomi, albumin mikrosfere, mikroemulzije, nano-čestice i nanokapsule) ili u makroemulzijama. Takve tehnike su obelodanjene u Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980).
[0180] Mogu se pripremiti preparati sa produženim oslobađanjem. Pogodni primeri preparata sa produženim oslobađanjem uključuju polupropusne matrice čvrstih hidrofobnih polimera koji sadrže antitelo, čije matrice su u obliku oblikovanih predmeta, na primer, filmova ili mikrokapsula.
[0181] Formulacije za koje se koristi za in vivo primenu su uglavnom sterilne. Sterilnost se može lako postići, npr. filtracijom kroz sterilne filtracione membrane.
G. Terapijski postupci i sastavi
[0182] Bilo koja od bispecifičnih anti-CD3 antitela pronalaska koja se vezuju za CD3 i HER2, kao što su TDB antitela predmetnog pronalaska, mogu biti iskorišćena u terapijskim postupcima.
[0183] U jednom aspektu, pruženo je anti-CD3 bispecifično antitelo za upotrebu kao lek. U daljim aspektima, anti-CD3 bispecifično antitelo pronalaska je predviđeno za upotrebu u tretmanu ili odlaganju napredovanja poremećaja proliferacije ćelija (npr. rak) ili autoimunog poremećaja (npr. artritis). U nekim otelotvorenjima pruženo je anti-CD3 bispecifično antitelo pronalaska za upotrebu u postupku tretmana. U nekim otelotvorenjima, pronalazak pruža anti-CD3 bispecifično antitelo pronalaska za upotrebu u postupku tretmana pojedinca koji ima poremećaj proliferacije ćelija koji uključuje primenu pojedincu efektivne količine anti-CD3 antitela. U jednoj takvom otelotvorenju, postupak dalje uključuje primenu pojedincu efektivne količine najmanje jednog dodatnog terapeutskog agensa, na primer, kao što je opisano u daljem tekstu. U daljim otelotvorenjima, anti-CD3 bispecifično antitelo pronalaska je predviđeno za upotrebu u pojačavanju imune funkcije kod pojedinca koji ima poremećaj proliferacije ćelija. U nekim otelotvorenjima, anti-CD3 antitelo pronalaska je predviđeno za upotrebu u postupku povećanja imune funkcije kod pojedinca koji ima poremećaj proliferacije ćelija i uključuje primenu pojedincu efektivnu količinu anti-CD3 antitela kako bi se aktivirale efektorske ćelije (npr. T ćelije, npr. CD8+ i/ili CD4+ T ćelije), proširila (povećala) populaciju efektorskih ćelija, smanjile populaciju ciljanih ćelija (npr. ćelije koje eksprimiraju HER2 prepoznate od strane bispecifičnog TDB antitela predmetnog pronalaska) i/ili ubile ciljane ćelije (npr. ciljane ćelije tumora). „Pojedinac“ prema bilo kom od gore navedenih otelotvorenja može biti čovek.
[0184] U narednom aspektu, obelodanjenje pruža upotrebu anti-CD3 antitela u proizvodnji ili pripremi leka. U jednom otelotvorenju predmetnog obelodanjenja, lek je za tretman poremećaja proliferacije ćelija (npr. rak). U narednom otelotvorenju predmetnog obelodanjenja, lek je za upotrebu u postupku tretmana poremećaja proliferacije ćelija koji obuhvata primenu pojedincu koji ima poremećaj proliferacije ćelija ili autoimuni poremećaj efektivne količine leka. U jednoj takvom otelotvorenju predmetnog obelodanjenja, postupak dalje uključuje primenu pojedincu efektivne količine najmanje jednog dodatnog terapeutskog agensa, na primer, kao što je opisano u daljem tekstu. U narednom otelotvorenju predmetnog obelodanjenja, lek je za aktiviranje efektorskih ćelija (npr. T ćelije, npr. CD8+ i/ili CD4+ T ćelije), širenje (povećanje) populacije efektorskih ćelija, smanjenje populacije ciljanih ćelija (npr. ćelije koje eksprimiraju drugi biološki molekul prepoznate od strane anti-CD3 antitela predmetnog pronalaska, kao što je bispecifično TDB antitelo predmetnog pronalaska) i/ili ubijaju ciljanih ćelija (npr. ciljane ćelije tumora) kod pojedinca. U narednom otelotvorenju predmetnog obelodanjenja, lek je za upotrebu u postupku povećanja imune funkcije kod pojedinca koji ima poremećaj proliferacije ćelije koji obuhvata primenu pojedincu efektivne količine leka za aktiviranje efektorskih ćelija (npr. T ćelije, npr. CD8+ i/ili CD4+ T ćelije), proširenje (povećanje) populacije efektorskih ćelija, smanjenje populacije ciljanih ćelija (npr. ćelije koje eksprimiraju HER2 prepoznat od anti-CD3 bispecifičnog antitelo predmetnog pronalaska) i/ili ubijanje ciljanih ćelija (npr. ciljane ćelije tumora). „Pojedinac“ prema bilo kom od gore navedenih otelotvorenja može biti čovek.
[0185] U narednom aspektu, obelodanjenje pruža postupak za tretman poremećaja proliferacije ćelija (npr. rak) ili autoimunog poremećaja (npr. artritisa). U jednom otelotvorenju predmetnog obelodanjenja, postupak uključuje primenu pojedincu koji ima takav poremećaj proliferacije ćelija efektivne količine anti-CD3 antitela. U jednom takvom otelotvorenju predmetnog obelodanjenja, postupak dalje uključuje primenu pojedincu efektivne količine najmanje jednog dodatnog terapeutskog agensa, na primer, kao što je opisano u daljem tekstu. „Pojedinac“ prema bilo kom od gore navedenih otelotvorenja može biti čovek.
[0186] U narednom aspektu, obelodanjenje pruža postupak za poboljšanje imune funkcije kod pojedinca koji ima poremećaj proliferacije ćelija ili autoimuni poremećaj kod pojedinca koji ima poremećaj proliferacije ćelija ili autoimuni poremećaj. U jednom otelotvorenju predmetnog obelodanjenja, postupak uključuje primenu pojedincu efektivne količine anti-CD3 antitela za aktiviranje efektorskih ćelija (npr. T ćelije, npr. CD8+ i/ili CD4+ T ćelije), proširenje (povećanje) populacije efektorskih ćelija, smanjenje populacije ciljanih ćelija (npr. ćelija koja eksprimiraju HER2 prepoznate od strane anti-CD3 bispecifičnog antitela predmetnog pronalaska) i/ili ubijanje ciljanih ćelija (npr. ciljana ćelija tumora). U jednom otelotvorenju predmetnog obelodanjenja, „pojedinac“ je čovek.
[0187] U narednom aspektu obelodanjenja dodatna terapija sadrži alkilacioni agens. U jednom aspektu, alkilacioni agens je 4-[5-[Bis(2-hloroetil)amino]-1-metilbenzimidazol-2-il]butanska kiselina i njene soli. U jednom aspektu, alkilacioni agens je bendamustin.
[0188] U narednom aspektu predmetnog pronalaska, dodatna terapija sadrži BCL-2 inhibitor. U jednom aspektu, BCL-2 inhibitor je 4-(4-{[2-(4-hlorofenil)-4,4-dimetilcikloheks-l-en-1-il]metil} piperazin-1-il)-N-({3-nitro-4-[(tetrahidro-2H-piran-4-ilmetil)amino]fenil}sulfonil)-2-(1H-pirolo[2,3-b]piridin-5-iloksi)benzamid i njegove soli. U jednom aspektu, BCL-2 inhibitor je venetokslaks (CAS br.:1257044-40-8).
[0189] U narednom aspektu obelodanjenja, dodatna terapija sadrži inhibitor fosfoinozid 3-kinaze (PI3K). U jednom otelotvorenju, PI3K inhibitor inhibira delta izoform PI3K (tj., P110δ). U nekim slučajevima, PI3K inhibitor je 5-fluoro-3-fenil-2-[(1S)-1-(7H-purin-6-ilamino)propil]-4 (3H)-kvinazolinon i njegove soli. U nekim slučajevima, PI3K inhibitor je idealaisib (CAS br.: 870281-82-6). U jednom slučaju, PI3K inhibitor inhibira alfa i delta izoforme PI3K. U nekim slučajevima, PI3K inhibitor je 2-{3-[2-(1-izopropil-3-metil-1H-1,2-4-triazol-5-il)-5,6-dihidrobenzo[f]imidazo[1,2-d][1,4]oksazepin-9-il]-1H-pirazol-1-il}-2-metilpropanamid i njegove soli.
4
[0190] U narednom aspektu obelodanjenja, dodatna terapija obuhvata Brutonov inhibitor tirozin-kinaze (BTK). U jednom slučaju, BTK inhibitor je 1-[(3R)-3-[4-amino-3-(4-fenoksifenil)-1H-pirazolo [3,4-d] pirimidin-1-il] piperidin-1- il]prop-2-en-1-on i njegove soli. U jednom slučaju, BTK inhibitor je ibrutinib (CAS br.: 936563-96-1).
[0191] U narednom aspektu obelodanjenja, dodatna terapija sadrži talidomid ili njegov derivat. U jednom slučaju, talidomid ili njegov derivat su (RS)-3-(4-amino-l-okso 1,3-dihidro-2H-izoindol-2-il)piperidin-2,6-dion i njegove soli. U jednom slučaju, talidomid ili njegov derivat je lendalidomid (CAS br.:191732-72-6).
[0192] U daljem aspektu obelodanjenja, dodatna terapija sadrži jedan ili više od ciklofosfamida, doksorubicina, vinkristina ili prednizolona (CHOP). U jednom alučaju, dodatna terapija dalje uključuje anti-CD20 antitelo kao što je opisano iznad (npr., GA-101 i/ili Rituxan®). Bilo koji od gore navedenih postupaka i terapija mogu se, bez ograničenja, upotrebiti za bilo koji rak, uključujući, na primer, tretman raka B-ćelija ili raka dojke.
[0193] U daljem aspektu, pronalazak obezbeđuje bispecifično antitelo pronalaska za upotrebu u postupku lečenja karcinoma pozitivnih na HER2. U jednom obelodanjenju, postupak uključuje davanje pojedincu koji ima takav rak efikasne količine anti-HER2 bispecifičnog TDB antitela preko ciljnog oruđa anti-HER2 i ciljnog oruđa protiv CD3. HER2-TDB poseduje prihvatljiv profil toksičnosti kada se daje u efikasnoj dozi kod pacijenta. CD3 kraka HER2-TDB s prihvatljivim profilom toksičnosti je krak CD3 niskog afiniteta, naime 40G5c.
[0194] U poželjnom rešenju, HER2-pozitivni karcinom je HER2-pozitivan karcinom dojke ili HER2-pozitivan karcinom želuca. U jednom aspektu, HER2 TDB se daje istovremeno sa jednim ili više dodatnih terapeutskih sredstava koja ciljaju HER put. U jednom aspektu, terapeutsko sredstvo koje cilja HER put je izabrano između EGFR inhibitora, HER2 inhibitora, HER3 inhibitora i / ili inhibitora HER4. U jednom aspektu, HER2 TDB se daje istovremeno sa jednim ili više dodatnih terapeutskih sredstava izabranih između trastuzumaba (Herceptin®), T-DM1 (Kadcila®) i pertuzumaba (Perjeta®). U jednom aspektu, HER2 TDB se daje istovremeno sa trastuzumabom. U jednoj realizaciji, HER2 TDB se daje istovremeno sa T-DM1. U jednom aspektu, HER2 TDB se daje istovremeno sa pertuzumabom. U jednom aspektu, HER2 TDB se daje istovremeno trastuzumabom i pertuzumabom. U jednoj realizaciji, HER2 TDB se daje istovremeno sa T-DM1 i pertuzumabom.
[195] U daljem aspektu, pronalazak pruža farmaceutske formulacije koje sadrže bilo koja anti-CD3 antitela predmetnog pronalaska, npr., za upotrebu u bilo kom od gore navedenih terapijskih postupaka. U jednom aspektu, farmaceutska formulacija sadrži bilo koje anti-CD3 antitelo predmetnog pronalaska i farmaceutski prihvatljiv nosač. U drugom otelotvorenju, farmaceutska formulacija sadrži bilo koje anti-CD3 antitelo pronalaskai bar jedan dodatni terapeutski agens, na primer, kao što je ovde opisano.
[0196] Antitela predmetnog pronalaska se mogu koristiti samostalno ili u kombinaciji sa drugim agensima u terapiji. Na primer, antitelo predmetnog pronalaska može se primeniti istovremeno sa najmanje jednim dodatnim terapeutskim agensom. U određenim otelotvorenjima, dodatni terapeutski agens je hemoterapijski agens, agens za inhibiciju rasta, citotoksični agens, agens koje se koristi u terapiji zračenjem, agens za antiangiogenezu, apoptotički agens, anti-tubulinski agens ili drugi agens, kao što je antagonist receptora epidermalnog faktora rasta (EGFR) (npr., inhibitor tirozin kinaze), HER1/EGFR inhibitor (npr., erlotinib (Tarceva™), inhibitor faktora rasta koji potiče od trombocita (npr., Gleevec™ (imatinib mezilat)), COX-2 inhibitor (npr., celekoksib), interferon, citokin, antitelo koje nije anti-CD3 antitelo pronalaska, kao što je antitelo koje se vezuje za jedan ili više narednih ciljeva ErbB2, ErbB3, ErbB4, PDGFR-beta, BlyS, APRIL, BCMA VEGF ili VEGF receptor, TRAIL/Apo2, PD-1, PD-L1, PD-L2 ili neko drugi bioaktivni ili organski hemijski agens.
[0197] U nekim otelotvorenjima, pronalazak omogućava upotrebu u postupku gde je dodatni terapeutski agens glukokortikoid. U jednom aspektu, glukokortikoid je deksametazon.
[0198] Takve kombinovane gore navedene terapije obuhvataju kombinovanu primenu (gde su dva ili više terapeutskih agenasa uključena u iste ili odvojene formulacije) i odvojenu primenu, u kom slučaju se primena antitela predmetnog pronalaska može dogoditi pre, istovremeno i/ili nakon toga, primene dodatnog terapeutskog agensa ili agenasa. U jednom aspektu, primena anti-CD3 antitela i primena dodatnog terapeutskog agensa se dešavaju u roku od oko jednog meseca, ili u roku od oko jedne, dve ili tri nedelje, ili unutar otprilike jednog, dva, tri, četiri, pet, ili šest dana razmaka.
Anti-CD3 antitela pronalaska (npr. bispecifična anti-CD3 antitela pronalaska koja se vezuju za CD3 i HER2 kao što je TDB antitelo pronalaska) takođe se može koristiti u kombinaciji sa terapijom zračenjem.
[0199] Antitelo pronalaska (i/ili bilo koji drugi terapeutski agens) za upotrebu u postupku terapije može se primeniti bilo kojim pogodnim načinom, uključujući parenteralnom, intrapulmonalnom i intranazalnom, i, ako se želi za lokalni tretman, intralezionalnom primenom. Parenteralne infuzije uključuju intramuskularnu, intravensku, intraarterijsku, intraperitonealnu ili subkutanu primenu. U nekim slučajevima, antitelo se primenjuje subkutanom primenom. U nekim slučajevima, anti-CD3 antitelo koje se primenjuje subkutanom injekcijom pokazuje manje toksičan odgovor kod pacijenta u poređenju sa istim anti-CD3 antitelom koje se primenjuje intravenskom injekcijom. Doziranje može biti bilo kojim pogodnim putem, na primer, injekcijama, kao što su intravenske ili subkutane injekcije, delimično u zavisnosti da li je primena kratka ili hronična. Ovde su razmotreni različiti planovi doziranja, uključujući, ali bez ograničavanja na jednu ili višestruku primenu, tokom različitih vremenskih tačaka, primenu bolusa i pulsnu infuziju.
[0200] Antitela predmetnog pronalaska bi se formulisala, dozirala i primenjivala na način koji je u skladu sa dobrom medicinskom praksom. Faktori za razmatranje u ovom kontekstu uključuju određeni poremećaj koji se tretira, određenog sisara koji se tretira, kliničko stanje pojedinog pacijenta, uzrok poremećaja, mesto isporuke agensa, načina primene, raspored primene i drugih faktora poznatih lekarima. Antitelo ne mora da bude, ali je opciono formulisano sa jednim ili više agenasa koji se trenutno koriste za sprečavanje ili tretman poremećaja o kome je reč. Efektivna količina takvih drugih agenasa zavisi od količine antitela prisutnih u formulaciji, vrste poremećaja ili tretmana i drugih faktora koji su razmotreni iznad. Oni se obično koriste u istim dozama i sa načinima primene kao što je ovde opisano, ili otprilike od 1 do 99% ovde opisanih doza, ili u bilo kojoj dozi i na bilo koji način za koji je empirijski/klinički utvrđeno da su primereni.
[0201] Za prevenciju ili tretman bolesti, odgovarajuća doza antitela prema pronalasku (kada se koristi sama ili u kombinaciji sa jednim ili više drugih dodatnih terapijskih agenasa) zavisi od vrste bolesti koja se tretira, tipa antitela, ozbiljnosti i toka bolesti, bez obzira na to da li se antitelo primenjuje u preventivne ili terapijske svrhe, prethodnu terapiju, kliničku istoriju pacijenta i odgovora na antitelo i diskreciono mišljenje lekara. Antitelo se na odgovarajući način primenjuje pacijentu odjednom ili tokom niza tretmana.
[0202] Kao opšti predlog, terapeutski efikasna količina anti-CD3 antitela koja se primenjuje čoveku biće u rasponu od oko 0,01 do oko 100 mg/kg telesne težine pacijenta, bilo da se vrši jedna ili više primena. U nekim otelotvorenjima, antitelo koje se koristi je oko 0,01 do oko 45 mg/kg, oko 0,01 do oko 40 mg/kg, oko 0,01 do oko 35 mg/kg, oko 0,01 do oko 30 mg/kg, oko 0,01 do oko 25 mg/kg, oko 0,01 do oko 20 mg/kg, oko 0,01 do oko 15 mg/kg, oko 0,01 do oko 10 mg/kg, oko 0,01 do oko 5 mg/kg, ili oko 0,01 do oko 1 mg/kg davano dnevno, npr. U jednom aspektu, ovde opisano anti-CD3 antitelo se primenjuje čoveku u dozi od oko 100 mg, oko 200 mg, oko 300 mg, oko 400 mg, oko 500 mg, oko 600 mg, oko 700 mg, oko 800 mg, oko 900 mg, oko 1000 mg, oko 1100 mg, oko 1200 mg, oko 1300 mg ili oko 1400 mg, na dan 1 od 21-dnevnog ciklusa. Doza se može primenjivati kao pojedinačna doza ili kao više doza (npr. 2 ili 3 doze), kao što su infuzije. Za ponovljene primene tokom nekoliko dana ili duže, u zavisnosti od stanja, tretman je obično održano sve dok se ne pojavi željena supresija simptoma bolesti. Jedna primerna doza antitela bila bi u rasponu od oko 0,05 mg/kg do oko 10 mg/kg. Dakle, jedna ili više doza od oko 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg ili 10 mg/kg (ili bilo koja njihova kombinacija) mogu se primeniti pacijentu. Takve doze mogu se primenjivati isprekidano, na primer, svake nedelje ili svake tri nedelje (npr., tako da pacijent primi od oko dve do oko dvadeset, ili, na primer, oko šest doza anti-CD3 antitela). Može se primeniti početna veća doza, praćena jednom ili više nižih doza. Napredak ove terapije lako se prati konvencionalnim tehnikama i analizama.
[0203] U nekim slučajevima, postupci mogu dalje sadržati dodatnu terapiju. Dodatna terapija može biti zračenje, hirurgija, hemoterapija, genska terapija, DNK terapija, virusna terapija, RNK terapija, imunoterapija, transplantacija koštane srži, nanoterapija, monoklonska terapija antitelom ili kombinacija gore navedenog. Dodatna terapija može biti u obliku adjuvantne ili neoadjuvantne terapije. U nekim slučajevima, dodatna terapija je primenu enzimskog inhibitora malih molekula ili anti-metastatskog agensa. U nekim slučajevima, dodatna terapija je primena agenasa za ograničavanje neželjenih dejstava (npr. agenasa namenjenih smanjenju pojave i/ili ozbiljnosti nuspojava tretmana, kao što su lekovi protiv mučnine, itd.). U nekim slučajevima, dodatna terapija je terapija zračenjem. U nekim otelotvorenjima, dodatna terapija je hirurgija. U nekim slučajevima, dodatna terapija je kombinacija terapije zračenjem i hirurgije. U nekim slučajevima, dodatna terapija je terapija gama zračenjem. U nekim slučajevima, dodatna terapija može biti odvojena primena jednog ili više terapeutskih agenasa opisanih iznad.
H. Predmeti proizvodnje
[0204] U drugom aspektu predmetnog obelodanjenja, pružen je predmet proizvodnje koji sadrži materijale korisne za tretman, prevenciju i/ili dijagnozu poremećaja opisanih iznad. Predmet proizvodnje sadrži kontejner i oznaku ili umetak u pakovanju na ili je povezan sa kontejnerom. Pogodni kontejneri uključuju, na primer, boce, bočice, špriceve, vrećice sa IV rastvorom, itd. Kontejneri mogu da se formiraju od različitih materijala kao što su staklo ili plastika. Kontejner sadrži smešu koja je sama po sebi ili kombinovana sa drugim sastavom efikasnim za tretman, sprečavanje i/ili dijagnostikovanje stanja i može imati sterilni pristupni otvor (na primer, kontejner može biti vrećica za intravenski rastvor ili bočica sa čepom koji se može probiti pomoću igle za hipodermičku injekciju). Barem jedan aktivan agens u sastavu je antitelo pronalaska. Oznaka ili umetak u pakovanju označavaju da se sastav koristi za tretman izabranog stanja. Štaviše, predmet proizvodnje može sadržati (a) prvi kontejner sa smešom koja se nalazi u njemu, gde smeša sadrži antitelo predmetnog pronalaska; i (b) drugi kontejner sa smešom koja se nalazi u njemu, gde smeša sadrži dodatni citotoksični ili na drugi način terapeutski agens. Predmet proizvodnje u ovom otelotvorenju pronalaska može dalje da sadrži umetak u pakovanju koji pokazuje da se sastavi mogu koristiti za tretman određenog stanja. Alternativno, ili dodatno, predmet proizvodnje može dalje sadržati drugi (ili treći) kontejner koji sadrži farmaceutski prihvatljiv pufer, kao što je bakteriostatska voda za injekcije (BWFI), fiziološka puferisani fosfatni rastvor, Ringerov rastvor i rastvor dekstroze. Takođe može da obuhvata i druge materijale poželjne sa komercijalnog i korisničkog stanovišta, uključujući druge pufere, razblaživače, filtere, igle i špriceve.
III. PRIMERI
[0205] Slede primeri postupaka i sastava pronalaska. Podrazumeva se da se mogu izvoditi i različita druga otelotvorenja, imajući u vidu opšti opis izložen iznad.
Primer 1. Generisanje anti-CD3 antitela
CD3ε antigeni
A. Bispecifični ljudski i cino CD3ε CD3γ fuzionisan za mišji IgG2a-Fc (CD3εγ-muFc)
[0206] cDNK koja kodira vanćelijske delove ljudskog ili cinomolgus majmuna (cino) CD3ε ili CD3γ fuzionisana je na C-terminusu za mišji IgG2a Fc kako bi se generisale CD3-Fc fuzije. cDNK koja kodira vanćelijske domene ljudskih ili cino CD3ε i CD3γ generisana je korišćenjem ukupne RNK iz mononuklearnih ćelija periferne krvi (PBMC) aktiviranih sa anti-CD3/anti-CD28. Normalni PBMC su aktivirani pomoću anti-CD3 i anti-CD28, imobilisanih na pločama, u RPMI dopunjenom sa 10% FBS u toku 72 sata. Ukupna mRNA je izolovana korišćenjem RNeasy mini kompleta od Qiagen. cDNK je klonirana korišćenjem genski-specifičnih prajmera pomoću RT-PCR u TOPO vektore korišćenjem PCR proizvoda koji su amplifikovani Taq polimerazom na osnovu protokola koji je isporučen sa TOPO TA kompletom za kloniranje od Invitrogen. Dobijeni fragmenti su uneti u vektor eksprimranja sisara koji sadrži mišji IgG2a Fc domen subkloniranjem bez restrikcije korišćenjem Phusion High-Fidelity DNK polimeraze (New England Biolabs, kataloški br. M0530L). CD3 fragmenti su na taj način amplifikovani sa preklapajućim regionima sadržanim u plazmidu šablona kako bi ih orijentisali direktno niz signalnu sekvencu i N-terminalno u odnosu na mišji Fc.
[0207] I za ljudske i za cino konstrukte, plazmid koji sadrži CD3ε-Fc bio je prolazno ko-ekspresioniran sa plazmidom koji sadrži CD3y-Fc u CHO ćelijama sisara. Heterodimeri CD3ε/γ su prečišćeni sa Protein A-Sepharose (Pharmacia Biotech).
B. KLH konjugati N-terminalnog peptida (CD3ε-KLH)
[0208] Sintetisani su peptidni fragmenti koji sadrže N-terminalne sekvence od cino i ljudskog CD3ε. Fragmenti namenjeni za imunizaciju konjugovani su sa Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH), široko korištenim nosačem proteina za generisanje značajnog imunog odgovora. Dodavanje cisteina koji se nalazi u prirodi na položaju 28 za cino i ljudski CD3ε dozvoljeno je za spajanje KLH aktiviranog maleimidom za C-terminalni cistein koji sadrži tiol.
C. Jednolančani CD3ε-26mer-CD3γ (CD3εγ)
[0209] cDNK koja kodira vanćelijske delove ljudskih CD3ε i CD3γ podjedinica je generisana pomoću PCR. Aminokiseline 1-97 ljudskog CD3ε i aminokiseline 1-81 ljudskog CD3γ povezane su korišćenjem fleksibilnog peptidnog veznika od 26 aminokiselina kako bi se stvorila CD3ε-26mer-CD3γ konstrukcija (CD3εγ) (Slika 1). Konstrukt je kloniran u vektor eksprimiranja sa His-oznakom za izlučivanje iz E. Coli korišćenjem promotera alkalne fosfotaze i STIII signalne sekvence izlučivanja. CD3εγ je prečišćen na Ni koloni i potom ponovo natopljen. Pravilno presavijeni CD3εγ su zatim prečišćeni koristeći OKT3 kolonu afiniteta.
[0210] Pored nekih eksperimenata sa vezivanjem, komercijalni CD3ε je kupljen od Creative Biomart, Shirley, New York 11967 (Kataloški broj CD3E-2194H).
Imunizacije
A: Imunizacije miševa
[0211] BALB/c ili C57BL/6 miševiu su imunizovani (2 µg ili 10 µg/injekcija po mišu). Antigeni, suspendovani u monofosforil lipid A/trehaloza dikorinomikolat adjuvantu, primenjeni su injekcijom u šape u razmacima od 3 do 4 dana, ukupno 12-15 pojačanja. Tri dana nakon konačnog pojačanja pre fuzije, prikupljeni su limfociti iz slezine i limfnih čvorova imunizovanih miševa. Izolovani mišji limfociti spojeni su sa mijelomskim ćelijama SP2/0-Ag14 (American Type Culture Collection) korišćenjem Cyto Pulse CEEF-50 uređaja (Cyto Pulse Sciences). Ukratko, dvaput ispiranje sa Citofusion Medium C (Cat #LCM-C), izolovane ćelije slezine i SP2/0-Ag14 mešaju se u odnosu 1:1, i zatim suspenduju pri 10 miliona ćelija/ml u Citofusion Medium C, elektrofuzija je izvedena prema uputstvima proizvođača. Spojene ćelije su kultivisane u ClonaCell-HY Medium C (Cat. 03803) preko noći na 37°C u 7% CO2inkubatoru. Narednog dana, fuzionisane ćelije su centrifugirane i suspendovane u 10 ml ClonaCell-HY Medium C, i zatim nežno pomešane sa 90 ml ClonaCell-HY Medium D na bazi metilceluloze (Cat #03804) koji sadrži HAT komponente. Ćelije su presađene u OmniTray ploče (Thermo Scientific) i ostavljene su da rastu na 37°C, u 7% CO2inkubatoru. Nakon inkubacije od 6-7 dana, koristeći ClonePix FL (Molecular Devices) odabrani su pojedinačni hibridomski klonovi i prebačeni u ploče sa ćelijama sa 96 komorica (#353075, Becton Dickinson) sa 200 µL/komorica ClonaCell-HY Medium E (kat. #03805). Medijumi za hibridomske kulture izmenjeni su pre ELISA testiranja.
B. Imunizacije zečeva
[0212] Imunizacije zečeva su izvedene koristeći 0,5 mg/injekciju sa CFA/IFA ljudskim i cino CD3ε-KLH svake 2 nedelje tokom 5 injekcija (d0, d14, d28, d42, d56). Krv je uzimana na dane 52 i 66.
[0213] PEG fuzija i skrining su izvedeni na naredni način. Klonovi su testirani na vezivanje za N-terminalni deo CD3ε konjugovan na tiroglobulin (THY) pomoću ELISA. Takođe je pomoću ELISA utvrđeno da svi pozitivni klonovi unakrsno reaguju sa cino CD3ε i 16 jedinstvenih klonova je odabrano za subkloniranje. Ukupna RNK je ekstrahovana iz peleta zamrznutih ćelija i prečišćena pomoću Qiagen RNeasy kompleta prema uputstvima proizvođača. cDNK prvog lanca je sintetisana pomoću jednostepenog RT-PCR (Qiagen). Zeečji VH i VL domeni dalje su PCR amplifikovani korišćenjem protokola opisanog za generisanje zečjih imunih biblioteka (Kontermann i Dubel. Antibody Engineering. 1:115-123, 2010). Umerena degeneracija dizajnirana je tako da predstavlja germlinijske imunoglobulinske gene zečeva.
Skrining antitela
A: Skrining mišjih hibridoma
[0214] 3 dana nakon promene medijuma, hibridomski supernatanti su testirani pomoću ELISA na vezivanje i za ljudski i za cino CD3ε, kao što je opisano u daljem tekstu. Svi ELISA pozitivni klonovi su dodatno pretraženi protočnom citometrijom radi vezivanja za ljudske Jurkat T ćelije, ljudske PBMC i cino PBMC (Slike 2 i 3). Supernatanti hibridoma su prečišćeni afinitetnom hromatografijom proteina A, zatim sterilno filtrirani (veličina pora 0,2 mm, Nalge Nunc International, NY, USA) i čuvani na 4°C u PBS. Prečišćena mAb su potvrđena od strane ELISA pre daljeg ispitivanja u funkcionalnim testovima. mAb izotip je određen pomoću mišjeg kompleta za izotipiranje monoklonskog antitela od Roche Diagnostics Corporation.
[0215] Aminokiselinske sekvence varijabilnih domena lakog i teškog lanca anti-CD3 antitela 13A3, 72H6 i 19B1 prikazane su na Slici 4A. Slika 4A takođe razgraničava HVR sekvence za svako od tri antitela. Slike 4B, 4C, 5A i 5B pokazuju dodatne aminokiselinske sekvence varijabilnih domena lakog i teškog lanca drugih anti-CD3 antitela.
B. Skrining nakon imunizacije zečeva
[0216] Osam jedinstvenih sekvenci teškog lanca i šest jedinstvenih sekvenci lakog lanca klonirano je iz ćelijskih linija hibridoma. Slika 7 prikazuje sekvence teškog i lakog lanca za jedno od ovih antitela, Rab17.
Velika sličnost sekvenci dovela je do odluke da se fokusiramo na 6 teških i lakih parova.6 dobijenih antitela su eksprimirana u obliku himernih zečjih/ljudskih IgG u malom obimu (100 ml kulture 293S), i testirane su na ELISA vezivanje za CD3 epsilon.
Karakterizacija antitela - Testovi aktivnosti vezivanja afiniteta i aktiviranja T ćelija
A. ELISA test CD3εγ vezivanja
[0217] ELISA test za CD3εγ vezivanje izvršen je na mikrotitarskim ELISA pločama sa 96 komorica (Greiner, Germany) obloženim ljudskim/cino CD3ε N-terminalnim aminokiselinama konjugovanim sa THY ili ljudskim/cino CD3ε/γ fuzionisanim za mišji Fc sa 2 µg/ml u 0,05 M karbonatnom puferu (pH 9,6), 4°C preko noći. Nakon tri puta ispiranja puferom za pranje (0,05% Tween 20 u PBS), ploče su blokirane sa 200 µL ELISA razblaživačima za ispitivanje sa BSA. Dodato je 100 µL kultivisanih supernanata ili razblaženih prečišćenih mAb i inkubirano je tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Ploče su isprane tri puta i inkubirane tokom 1 sata sa kozjim anti-mišjim IgG Fc konjugovanim sa HRP. Nakon ispiranja tri puta, vezani enzim je detektovan dodatkom 100 µL/komorica TMB supstrata (BioFX Laboratories, MD, USA) u trajanju od 5 minuta. Reakcije su zaustavljene dodavanjem 100 µL/komorica zaustavnog reagensa (BioFX, Laboratories, MD, SAD) i detekcijom boje na A630 nm.
B. Analiza protočne citometrije
[0218] Ljudske Jurkat T ćelije, ljudske PBMC ili cino PBMC isprane su dva puta sa FACS puferom za bojenje (fiziološki pufer sa punjenim fosfatom koji sadrži 1% fetalni goveđi serum), i zatim suspendovane u FACS obojenom puferu do krajnje koncentracije 5 x 10<6>ćelija/ml 100 µl ćelija je dodato u ploču sa kulturom tkiva sa 96 komorica sa U-dnom (#353077, Becton Dickinson) i dodato je 100 µl hibridoma supernatanta ili razblaženih prečišćenih mAb. Posle 30 minuta inkubacije na ledu, ćelije su isprane dva puta sa FACS puferom za bojenje i naknadno obojene sa FITC- ili alofikocijaninom (APC) konjugovanim kozjimantimišjim IgG antitelom (#1012-11, Southern Biotech) pri razređivanju 1:300 tokom 30 minuta. Nakon ispiranja dva puta sa FACS puferom za bojenje, ćelije su analizirane koristeći FACSCalibur (BD Biosciences) protočnu citometriju. Podaci su analizirani pomoću FlowJo softvera (Tree Star, Inc.).
C. Test aktivacije ljudske T ćelije
[0219] Ljudska krv je sakupljena u heparinizovanim špricevma, i PBMC su izolovane korišćenjem Leucosep (Greiner Bio-one, kat. br.227290P) i Ficoll Paque Plus (GE Healthcare Biosciences, kat. br.95038-168), kao što je preporučeno od proizvođača. Ćelije su isprane u RPMI medijumu koji sadrži 10% FBS, dopunjen sa GlutaMax (Gibco, kat. br. 35050-061), penicilin i streptomicin (Gibco, kat. br. 15140-122), i -0,2 miliona suspendovanih ćelija je dodato u ploču sa U-dnom i 96 komorica. Anti-CD3 antitela su dodata između 10 i 0,01 µg/ml. Posle kultivacije tokom -20 sati, ćelije su isprane FACS puferom (0,5% BSA, 0,05% Na azid u PBS). Ćelije su zatim obojene sa anti-CD69-FITC (BD, kat. br. 555530), anti-CD25-PE (BD, kat. br.
555432) anti-CD4-APC (BD, kat. br. 555349) ili anti-CD8-APC (BD, kat. 555369) u FACS puferu, isprane sa FACS puferom i suspendovane u 100 µl FACS pufera koji sadrži 1 µg/ml propidijum jodida. Podaci su prikupljeni na FACSCalibur protočnom citometru i analizirani korišćenjem FlowJo. Stepen aktivacije T ćelija određen je poređenjem procenta CD69+ i CD25+ populacije u CD4+ ili CD8+ T ćelijama.
D. Test aktivacije cino T ćelija
[0220] Sakupljena je cino krv u heparinizovanim epruvetama. Crvena krvna zrnca su lizirana dva puta ACK puferom za liziranje crvenih krvnih ćelija (0,874% NH4CI, 0,1% KHCO3, 0,00368 dinatrijum EDTA). Ćelije su isprane u RPMI medijumu koji sadrži 10% FBS, dopunjenim sa GlutaMax (Gibco, kat. br. 35050-061), penicilinom i streptomicinom (Gibco, kat. br. 15140-122), i -0,2 miliona suspendovanih ćelija je dodato u ploču sa U-dnom i 96 komorica. Anti-CD3 antitela su dodata pri 10 µg/ml. Posle kultivacije tokom -20 sati, ćelije su isprane FACS puferom (0.5% BSA, 0,05% Na azid u PBS). Ćelije su zatim obojene sa anti-CD69-FITC (BD, kat. br. 555530), anti-CD25-PE (BD, kat. br. 555432) anti-CD4-APC (BD, kat. br.
551980) u FACS puferu, isprane sa FACS puferom i suspendovane u 100 µg FACS pufera koji sadrži 1 µg/ml propidijum jodida. Podaci su prikupljeni na FACSCalibur protočnom citometru i analizirani korišćenjem FlowJo. Stepen aktivacije T ćelija određen je poređenjem procenta CD69+ i CD25+ populacije u CD4+ T ćelijama.
Generisanje varijanti anti-CD3 antitela
A. Kloniranje i sekvenciranje mišjeg CD3εγ ljudskih/cino unakrsno reaktivnih hibridoma
[0221] Ukupna RNK je ekstrahovana iz ćelija mišjih hibridoma sa RNeasy kompletom (Qiagen), i cDNK prvog lanca je sintetisana pomoću SuperScript III RT kompleta (Invitrogen). Geni antitela su amplifikovani pomoću Taq polimeraza PCR, koji je otporan na greške, sa 5' degenerisanom mešavinom prajmera i 3' Cγ-, Cκ-, Cλ-specifičnim prajmerima. PCR proizvodi su prečišćeni i varijabilni regioni teških i lakih lanaca antitela dobijeni su sekvencionisanjem PCR proizvoda. Varijabilni regioni teških i lakih lanaca antitela su digestirani odgovarajućim restrikcionim enzimima i klonirani u odgovarajuće vektore eksprimiranja pRK. Mišja antitela su eksprimirana u 293 ćelijama.
B. Humanizacija
[0222] Sekvence ljudskih/cino CD3εγ unakrsno reaktivnih hibridoma poravnate su sa najhomolognijim ljudskim konsenzusom ili lakim i teškim varijabilnim domenima (Slika 7). Konsenzus sekvenca nazvana mu40G5c izvedena je iz varijabilnih domena lakog i teškog lanca povezanih klonova hibridoma (Slika 7). Hipervarijabilni regioni (HVR) su projektovani u lake i teške ljudske akceptorske okvire kako bi se stvorili humanizovani CDR-graftovi (pogledati npr. Slike 8A-8F). Humanizovane varijante su procenjene u obliku Fab fragmenata ili kao IgG. Položaji VL domena 24-34 (L1), 50-56 (L2) i 89-97 (L3) i položaji VH domena 26-35 (H1), 50-65 (H2) i 95-102 (H3) korišćeni su za graftove (Slike 8A-8F). Dodatne varijante koje su uključivale različite kombinacije jednog ili više mišjeg vernijer položaja su takođe generisane i testirane na afinitet vezivanja (pogledati, npr., Slike 9A-9F). Ostaci mišjih varijabilnih domena po izabranom vernijer položaji su ugrađeni u konačnu humanizovanu sekvencu na osnovu svoje sposobnosti da poboljšaju afinitet vezivanja. Monovalentni afiniteti vezivanja za odabrana humanizovana antitela za različite CD3ε antigene prikazani su na Slici 10. Afiniteti vezivanja za afinitetne varijante humanizovanog antitela 38E4 (38E4v1-38E4v9) i 40G5c prikazani su na Slici 11.
C. Mapiranje paratopa
[0223] Svaki ostatak u HVR-L3 i HVR-H3 od hu38E4 je odvojeno mutiran do alanina korišćenjem Kunkle mutageneze. Pored toga, položaj 95 u HVR-H3 je takođe mutiran do serina, treonina ili glutamata. Varijante sa ovim mutacijama u jednoj tački su eksprimirane kao Fab u HEK293 ćelijama i u početku su prikazane postupkom kinetike jednog ciklusa na Biacore T100. Odabrane varijante su takođe umanjene i prečišćene za konvencionalni postupak kinetike više ciklusa. Za kinetiku jednog ciklusa, Biacore Series S CM5 senzorski čipovi su imobilisani sa anti-ljudskim Fab antitelimaa (komplet za hvatanje ljudskiH Fab, GE Healthcare). Svaki Fab je uzet iz supernatanta kulture, i povećavajuće koncentracije (u rasponu od 3 nM do 250 nM u HBSP puferu) ljudskog CD3εγ injektirano su uzastopno pri protoku od 30 µl/minut u jednom ciklusu analize bez regeneracije površine između injekcije; dobijeno je 10 minuta disocijacije za svaki ciklus. Za konvencionalnu kinetiku sa više ciklusa, ljudski CD3εγ, cino CD3εγ ili peptid od 27 mer su imobilizirani na Biacore Series S CM5 senzorskom čipu korišćenjem kompleta za spajanje amin od Biacore. Serijska trostruka razblaženja svake varijante Fab primenjena su injekcijom su brzinom protoka od 30 µl/minuta Svaki uzorak je analiziran protokolom 3-minutne asocijacije i 3-minutne disocijacije. U oba postupka, Biacore čipovi su regenerisani korišćenjem 10 mM glicina (pH 1,7). Odgovor vezivanja ispravljen je oduzimanjem praznih delova, i za analizu kinetike korišćen je 1:1 Languir model istovremenog uklapanja koni koff. Efekti ovih mutacija, sažeti na Slici 12, pokazuju ostatak lakog lanca R96 i ostatke teških lanaca Y97, R99 i F100b igraju kritičnu ulogu u vezivanju na CD3εγ.
D. CD3 mapiranje epitopa
[0224] Mutacije alanina uvedene su u CD3ε<1-27>-Fc u cilju procene prepoznavanja epitopa N-terminalno vezujućih anti-CD3ε antitela. Svaki CD3ε1-27Varijanta -Fc je imobilisana preko Nunc Maxisorp ploča preko noći u PBS sa 2 µg/ml na 4°C. Nakon blokade ploča sa 2% mleka u prahu u PBS koji sadrži 0,05% Tween 20 tokom 1 sata, doda se 100 µl 3 nM anti-CD3ε u svaku komoricu i ostavi se da se vezuje tokom 1 sata na 25°C. Nakon 6 pranja sa PBS koji sadrži 0,05% Tween 20, vezivanje antitela je detektovano dodavanjem antitelovog mišjeg IgG-HRP sekundarnog antitela, kao što je prikazano na Slici 13A.
[0225] CD3εγ je subkloniran u M13 fagemid koji sadrži C-terminalnu gD oznaku nakon čega sledi ćilibarni zaustavni kodon kako bi mogao da se prikaže na fagu ili eksprimira u ne-supresorskom soju E. Coli. Ovaj CD3εγ fagemid korišćen je kao obrazac za pravljenje pojedinačnih mutacija alanina u CD3ε pomoću Kunkel mutageneze. Svaki CD3ε alanin mutant prikazan na fagu, potvrđen je DNK sekvenciranjem, izolovan iz jedne kolonije, uzgajan preko noći u 2YT/Carb plus KO7 pomoćnom fagu i prečišćen taloženjem PEG. Uticaj mutacije alanina u CD3εγ na vezivanje anti-CD3 antitela procenjen je korišćenjem ELISA za fage. Svako anti-CD3 antitelo je imobilisano na NUNC Maxisorp ploči sa 2 µg/ml u PBS puferu preko noći na 4°C. Prečišćeni supernatant faga koji prikazuje CD3εγ alanin varijantu (1,0 OD450) dodat je u ploču i ostavljen je da se vezuje za sobnoj temperaturi uz mućkanje tokom 1 sata. Nakon pranja, vezan fag detektovan je pomoću anti-M13-HRP (GE Healthcare kat. br.45-001-419). Vezivanje svake varijante CD3εγ alanina je upoređeno sa vezivanja faga divljeg tipa CD3εγ (Slika 13B). Varijante alanina koje su uticale na vezivanje anti-CD3 antitela, dalje su karakterisane procenom vezivanja kao funkcije koncentracije faga (Slika 13C).
[0226] Kako bi se utvrdio uticaj mutacija alanina u CD3 na vezivanje antitela, odabrani mutanti CD3 alanina su eksprimirani u ne-supresorskom soju E. Coli Izlučene CD3εγ varijante su uzete iz sirovog periplazmatske fragmenta koristeći anti-CD3 antitelo UCHT1v9. UCHT1v9 je imobilisan na CM5 serios S čipu kroz uparivanje amina korišćenjem kompleta za hvatanje anti-ljudskog IgG (Fc) antitela (BR-1008-39) od GE Healthcare. SPR merenja izvedena su na Biacore 4000 instrumentu, koristeći softver za procenu kinetike. Kako bi se merili monovalentni afiniteti vezivanja, korišćena su anti-CD3 bispecifična antitela u kojima su jedan krak bila anti-CD3 koja se testiraju, i krak je prepoznao irelevantan antigen. Bispecifična anti-CD3 antitela su prenesena preko zarobljenog supernatanta u nizu koncentracija dvostrukog razblaženja od 0,39 do 100 nM. Rezultujuća kinetika (Slika 13D) je merena i izračunata korišćenjem Biacore 4000 BIAevaluation softvera (šifra proizvoda 28-9664-57).
E. Strukturno mapiranje mesta vezivanja CD3ε
1. Hu38E4.v1 Fab
[0227] Hu38E4.v1 Fab, rastvoren u 0,15 M NaCl, 25mM tris, pH 7,5 pri 10 mg/ml, i dvostruki molarni višak (1 mg) CD3ε peptida, QDGNEEMGGITQTPYK (SEQ ID NO: 284) (Slika 14A), su pomešani i podvrgnuti eksperimentima kristalizacije. Početni skrining je rađen sa retkom matricom sita za talog u formatu difuzije stajaće kapi. Optimizovani kristali rastu iz 1:1 smeše sa rastvorom rezervoara koji sadrži 70% v/v metilpentandiola i 0,1 M HEPES pufera na pH 7,5. Rezervoar je korišten kao krioprotektant. Kristali su preneti na kriogenu temperaturu naglim uranjanjem u tečni azot.
[0228] Podaci o difrakciji za hu38E4.v1 Fab i CD3ε ko-kristal prikupljeni su na Advanced Photon Source liniji snopa 221D, koristeći MAR300 CCD detektor. Snimljene difrakcije su zatim integrisane i skalirane pomoću programa HKL2000.
[0229] Struktura je fazirana postupkom molekularne zamene (MR) korišćenjem programa Phaser. MR pretraživački model bila je Fab podjedinica izvedena iz kristalne strukture HGFA/Fab kompleksa (PDB kod: 2R0L). CD3ε peptid je ugrađen u strukturu zasnovanu na Fo-Fc mapi. Struktura je potom rafinirana programima REFMAC5 i PHENIX koristeći maksimalne ciljane verovatnoće, anizotropski postupak pojedinačnog rafiniranja B-faktora i postupak rafiniranja TLS za postizanje konvergencije. Podaci i statistike rafiniranja prikazani su u Tabeli 3A.
TABELA 3A. Statistika prikupljanja i dorade podataka za hu38E4.v1/CD3εkompleks
1
[0230] Kristalna struktura hu38E4.v1 Fab/CD3ε peptidnog kompleksa određena je u 1,9Å rezoluciji. Struktura je otkrila da CD3ε peptid pravi mali zavoj i duboko se ubacuje u pukotinu između teških i lakih lanaca od Fab 38E4.v1 (Slike 14B i 14C). Vezivanje zakopava 666 Å<2>rastvorene površine rastvarača između peptida i Fab fragmenta i uključuje zamršenu mrežu hidrofobnih, vodoničnih vezivanja i jonskih interakcija (Slika 14D). N-terminalni piroglutamatni (piroglu) prsten pakuje se protiv teškog lanca Tyr33 i čini vodoničnu vezu sa teškim lancem His35 u HVR-H1. Veliki bočni lanac ostatka F100b u HVR-H3 gura His35 u odgovarajuću orijentaciju za njegovu interakciju sa pirogluom i objašnjava gubitak vezivanja primećen kada je F100b mutiran na alanin, mali ostatak bočnog lanca. Pored toga, u skladu sa rezultatima skeniranja alaninom, R96 u CDR-L3 stvara kritičnu vodoničnu vezu sa karboksilnom grupom u piroglu, dok Y97 u CDR-H3 pravi vodoničnu vezu sa Met7 od CD3ε (Slika 14E). Interesantno je da dok supstitucija alanina na R99 u CDR-H3 ima dramatičan efekat na vezivanje antigena, struktura otkriva da je ovaj bočni lanac okrenut suprotno od CD3ε peptida i ne uključuje bilo kakve interakcije sa peptidom. Umesto toga, R99 ostvaruje opsežne dodire sa nekoliko ostataka u CDR-H3, uključujući vodoničnu vezu sa D101 i hidrofobno pakovanje protiv Y100a, što dalje utiče na vernijeov ostatak, LC Y49 (Slika 14F). Ove interakcije su verovatno važne za podršku i celokupni raspored CDR petlji u 38E4.v1 Fab organizovanjem kritičnog centralnog raskola između teških i lakih lanaca kako bi se omogućilo vezivanje CD3ε peptida.
[0231] Slika 14G identifikuje sve ostatke Fab 38E4.v1 za koje je utvrđeno da se nalaze unutar 5 Å od CD3ε peptida. Ovi ostaci dodirnih antigena su identični za hu38E4.v1 i hu40G5c, osim što je ostatak G96 od hu38E4.v1 ostatak serina (S96) u hu40G5 (pogledati Sliku 14H, koja prikazuje lokaciju dodirnog ostatka G96 od hu38E4.v1).
[0232] Dodiri između anti-CD3 (38E4.v1) i CD3εγ peptida su izračunati na osnovu skeniranja alanina. Epitopi prepoznati od strane 38E4v1 anti-CD3 su dodiri u razmaku od 3,5 Angstroma ili kraći, kako je dato u Tabeli 3B u nastaavku. Iz ove analize, CD3 epitopi Gln1 (PCA1, piroglutaminska kiselina), Asp2, Glu6, i Met7 su ostaci koji stvaraju dodire sa paratopima varijabilnih regiona lakog lanca i teškog lanca CD3 antitela.
2
2. SP34v52 Fab
[0233] SP34v52 Fab je rastvoren u 0,25 M NaCl, 25 mM MES pH 5,5, u 10 mg/mL. Početni skrining kristalizacije izveden je sa retkom matricom (PEGII, Qiagen) sita u formatu difuzije stajaće kapi. Pronađen je pogodak kristalizacije u kapi sa rezervoarom koji sadrži 0,2M CaCl2, 0,1M HEPES pH 7,5 i 30% v/v PEG 4000. Optimizovani kristali rastu iz smeše 2 µL proteina i 2 µL rastvorskog rezervoara koji sadrži 20-23% w/v PEG 3350, 0,1M HEPES pH 7,2, 0,1 M CaCl2. Upotrebljen je postupak difuzije pare viseće kapi i konačni pad kristalizacije je inkubiran na 18°C.
[0234] Podaci difrakcije za SP34v52 Fab prikupljeni su na Stanford Synchrotron Light Source liniji snopa 12-2, koristeći PILATUS detektor. Snimljene difrakcije su zatim integrisane pomoću programa XDS i skalirane korišćenjem programa SCALA. Struktura je fazirana postupkom molekularne zamene (MR) korišćenjem programa Phaser. MR model pretrage bila je Fab podjedinica izvedena iz kristalne strukture HGFA/Fab kompleksa (PDB kod: 2R0L). CD3ε peptid je ugrađen u strukturu zasnovanu na Fo-Fcmapi. Struktura je nakon toga oplemenjena programima REFMAC5 i PHENIX koristeći maksimalne ciljane verovatne funkcije, anizotropski postupak preciznog rafiniranja B-faktora i TLS način rafiniranja kako bi se postigla konvergencija. Podaci i statistike rafiniranja prikazani su u Tabeli 4 u nastavku.
Tabela 4. Statistika prikupljanja i rafiniranja podataka za SP34v52
4
[0235] Na Slikama 14I-14L, kristalne strukture faktora hu38E4.v1 i SP34v52 su poređene u istoj orijentaciji. Kada je peptid CD3ε nanesen na SP34v52 Fab iste orijentacije kao u hu38E4.v1, primećeni su jasni sukobi peptida sa SP34v52 (Slika 14L). Otkriveno je da su HVR-H2 ostaci R50 i R52 od SP34v52, koji nisu bili prisutni ni u hu38E4.v1, ni u hu40G5c, važni za CD3 vezivanje sa SP34v52 (Slika 14L). Ovi podaci pokazuju da se hu38E4.v1 i hu40G5c vezuju za CD3 na način različit od onoga u SP34v52.
[0236] Kristalna struktura hu38E4.v1 u kompleksu sa N-terminalnim peptidom od CD3εγ je prikazana na Slikama 14M i 14N. Slika 14M pruža uvećan prikaz ključnih intermolekularnih interakcija koje su uključene u dolaženje u dodir sa šestim ostatkom u CD3εγ. U umanjenom prikazu, Slika 14N prikazuje model ispunjavanja prostora Fab/CD3 peptidnim kompleksom gde je peti ostatak potpuno okrenut od mesta interakcije. Šesti ostatak, kao što je prikazano, uključen je u interakcije sa Fab i upućuje na aktivno mesto.
Primer 2. Generisanje i selekcija bispecifičnih antitela zavisnih od T-ćelija (TDB)
[0237] Jedan pristup da se iskoristi visoki citotoksični potencijal T ćelija pri iskorenjivanju ćelija tumora je upotreba bispecifičnih antitela zavisnih od T-ćelija. Zabeleženi su ohrabrujući klinički odgovori sa molekulima kao što su B ćelije koje ciljaju blinatumomab, CD19/CD3-bispecifično BiTE antitelo. Međutim, terapijsko obećanje mnogih prijavljenih modaliteta bispecifičnih antitela ograničeno je odgovornostima uključujući nepovoljnu farmakokinetiku (PK), toksičnost i/ili probleme proizvodnje. Prema tome, inicijalno smo generisali i karakterisali anti-CD3 TDB antitela koja imaju različite kombinacije anti-CD3 i anti tumorskih antigena (npr. Anti-CD20, anti-FcRH5, anti-HER2, anti-LYPD1, anti-LY6E, anti-LY6G6D, anti-PMEL17, anti-CD19, anti-CD22, anti-CD33, anti-CD79A, anti-CD79B, anti-EDAR, anti-GFRA1, anti-MRP4, anti-RET, anti-Steap1, anti-TenB2) krake, proizvedene kao antitela pune dužine u formatu „čvor u otvoru“. Neočekivano, otkrili smo da određene kombinacije (parovi) kraka anti-CD3 i anti-tumora antigena rezultuju da TDB pokazuju povoljnu aktivnost u odnosu na ostale TDB.
[0238] TDB antitela su proizvedena kao antitela pune dužine u formatu čvor-u-otvoru kao ljudski IgG1, kao što je prethodno opisano (Atwell i dr. J. Mol. Biol.270: 26-35, 1997). Polovina antitela su eksprimirana u E. Coli ili ćelijama jajnika kineskog hrčka (CHO), prečišćenih afinitetnom hromatografijom proteina A i odgovarajuća polovina parova antitela su kalemljeni in vitro kao što je prethodno opisano (Spiess i dr. Nat. Biotechnol. 2013). Ako je proizvodnja TDB antitela izvedena u CHO ćelijama, antitelo može obuhvatati mutaciju aglikozilacije, na primer, na ostatku N297 (npr. N297G), tako da je TDB antitelo bilo varijanta bez efektora i nije u mogućnosti da pokrene ćelijski posredovanu citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC). Slika 15 prikazuje šematski pregled proizvodnje CD3/CD20 TDB.
[0239] Nakon kalemljenja, CD3/CD20 TDB su prečišćeni hidrofobnom interakcionom hromatografijom (HIC) i karakterisani analitičkim filtracionim gelom, masenom spektrometrijom i elektroforezom poliakrilamidnog gela. Prečišćena antitela su prošla kao jedan vrh (> 99% signala) u filtraciji gela sa manje od 0,2% agregata. Masenom spektrometrijom nisu detektovani homodimeri. Anti-CD20 kraci testirani u generisanju CD3/CD20 TDB uključuju 2H7v16, 2H7v114, 2H7v511 i GA101. Anti-CD3 kraaci testirani u generisanju CD3/CD20 TDB uključuju UCHT1v1, UCHT1v9, UCHT1vM1, 72H6, 13A3, 30A1, 41D9a, SP34v52, 40G5c, 38E4v1-38E4v9, 21B2, 125A1, i 21A9. CD3/CD20 TDB su testirani na vezivanje za CD3, kao i aktivnost, kako je procenjeno in vitro testovima ubijanja B ćelija i testovima aktivacije T ćelija.
A. Afiniteti vezivanja
[0240] Afiniteti vezivanja za svaki od CD3/CD20 TDB testirani su Biacore ili FACS analizom, kao što je opisano iznad za anti-CD3 antitela. Ukratko, za Biacore testove vezivanja, ljudski CD3εγ je imobilisan na Biacore Series S CM5 senzorskom čipu korišćenjem kompleta za spajanje amina od Biacore i CD3/CD20 TDB ili njegovih Fab varijanti. Za FACS testove vezivanja, Bjab ćelije (za antigene B ćelija) ili Jurkat ćelije (za CD3 antigen) su 30 minuta inkubirane pri različitim koncentracijama TDB antitela na 4°C, i zatim su ćelije isprane i inkubirane sa drugim antitelom (anti-hulgG-PE; BD Bioscience) još 15 minuta, pre nego što su ćelije ponovo isprane i spremne za FACS analizu. Slika 16 prikazuje rezultate in vitro FACS testova vezivanja za CD3/CD20 TDB. Rezultati pokazuju da određene kombinacije kraka anti-CD3 antitela i antitumorskog antigena (npr. anti-CD20 krak) dovode do TDB antitela sa povoljnijim svojstvima vezivanja. Slika 17 prikazuje monovalentne i bivalentne afinitete vezivanja za ove konkretne CD3/CD20 TDB. Naročito je uparivanje 2H7v16 sa anti-CD3 kracima (npr. UCHT1v9), na primer, rezultovao sa CD3/CD20 TDB koji je pokazao neočekivano snažno vezivanje i za Bjab i za Jurkat ćelije, u poređenju sa ostalim testiranim CD3/CD20 TDB koji imaju različite anti-CD20 krake. Afinitet vezivanja drugih CD3/CD20 TDB koja imaju 2H7v16 anti-CD20 krak i različite anti-CD3 krake takođe je testiran (pogledati Slike 18-24). B. Testovi za ubijanje in vitro B ćelija i aktiviranje T ćelija
[0241] Generisani CD3/CD20 TDB takođe su testirani za svoju sposobnost da podrže ubijanje B ćelija i aktiviranje citotoksičnog efekta T ćelija. U tim ispitivanjima, linije B ćelija (Bjab) su dobijene od ATCC, i PBMC su izolovane iz pune krvi zdravih donora koristeći Ficoll razdvajanje. Po potrebi CD4+T i CD8+T ćelije su razdvojene koristeći Miltenyi komplete prema uputstvima proizvođača. Ćelije su kultivisane u RPMI1640 sa dodatkom 10% FBS (Sigma-Aldrich) na 37°C u vlažnom standardnom inkubatoru ćelijske kulture. Za testove ubijanja Bjab ćelija, 20.000 Bjab ćelija inkubirano je sa efektorskim ćelijama, bilo kao huPBMC ili kao prečišćene T ćelije kao što je naznačeno u odnosima po ispitivanju, u prisustvu različitih koncentracija TDB antitela tokom vremenskog perioda kao što je naznačeno po testu. Za ispitivanja endogenih B ćelija, 200.000 huPBMC inkubirano je satima po ispitivanju sa različitim koncentracijama TDB antitela. Na kraju svakog testa, žive B ćelije su putem FACS izašle kao PI-CD19+ ili PI-CD20+ B ćelije, i obavljeno je apsolutno brojanje ćelija sa FITC zrncima dodatim u reakcionu smešu kao unutrašnja kontrola brojanja. % ubijanja ćelija izračunat je na osnovu kontrola koje nisu tretirane sa TDB. Aktivirane T ćelije otkrivene su CD69 i CD25 površinskim eksprimiranjem.
[0242] Različite efikasnosti generisanih TDB sa bispecifičnošću za CD3, i drugim biološkim molekulima (u ovom slučaju, CD20), podvlače kritične i nepredvidive doprinose oba krake antitela u stvaranju primernog TDB koji ima visoku efikasnost (pogledati Slike 25- 49).
Primer 3. Karakterizacija primernih CD3/CD20 TDB (CD20 TDB)
[0243] Dalje smo karakterisali dva primerna CD3/CD20 TDB (CD20 TDB) opisana iznad, koji su pokazala visoku efikasnost u in vitro testovima ubijanja B ćelija i aktiviranje T ćelija. CD20 krak svakog TDB antitela bio je anti-CD20 klon 2H7.v16 (pogledati Sliku 50), dok je CD3 krak bio klon UCHT1v9 (pogledati npr. Zhu i dr. Int. J. Cancer. 62: 319-324, 1995) ili cino unakrsno reaktivni klon 40G5c (pogledati npr. Sliku 51) koji dele uporedive aktivnosti.
Materijali i postupci
A. Proizvodnja antitela
[0244] Bispecifična (TDB) antitela zavisna od T-ćelija proizvedena su kao antitela pune dužine u formatu čvor-u-otvoru kao ljudski IgG1 kao što je prethodno opisano (Atwell i dr. J. Mol. Biol. 270: 26-35, 1997). Polovina antitela je izražena u E. Coli i tako aglikozilovana, prečišćena protein-A-afinitetnom hromatografijom, i odgovarajuće polovine parova antitela su kalemljene in vitro kao što je prethodno opisano (Spiess i dr. Nat. Biotechnol. 2013). Posle kalemljenja, antitela su prečišćena hidrofobnom interakcionom hromatografijom (HIC) i karakterisana analitičkom filtracijom gelom, masenom spektrometrijom i elektroforezom poliakrilamidnog gela. Prečišćena antitela su prošla kao jedan vrh (> 99% signala) u filtraciji gela bez agregata koji se mogu detektovati (Slika 52A), i masnim spektrometrijom nisu detektovani homodimeri (Slika 52B).
B. In vitro testovi ubijanja B ćelija i aktiviranja T ćelija
[0245] Ćelijske linije B tumora dobijene su od ATCC, i PBMC su izolovane iz pune krvi zdravih donora Ficoll razdvajanjem. CD4+ T i CD8+ T ćelije razdvojene su Miltenyi kompletima prema uputstvima proizvođača. Ćelije su kultivisane u RPMI1640 sa dodatkom 10% FBS (Sigma-Aldrich). Za testove ubijanja B ćelija, žive B ćelije su putem FACS izašle kao PI-CD19+ B ćelije, i obavljeno je apsolutno brojanje ćelija sa FITC zrncima dodatim u reakcionu smešu kao unutrašnja kontrola brojanja. Aktivirane T ćelije otkrivene su površinskim eksprimiranjem CD69 i CD25. Intracelularna indukcija Granzima B otkrivena pomoću FACS. Koncentracija perforina u medijuma detektovana je pomoću ELISA (eBioscience). Sva antitela su kupljena od BD Bioscience.
C. In vivo studije efikasnosti na mišjim modelima
[0246] Humanizovani NSG i SCID miševi kupljeni su od Jackson Labs. Ljudski CD20 transgeni miševi i ljudski CD3 transgeni miševi su dobijeni kao što je prethodno opisano (Gong i dr. J. Immunol.174: 817-826, 2005 and de la Here i dr. J. Exp. Med. 173: 7-17, 1991), i ljudski CD20/CD3 dvostruko transgeni miševi proizvedeni su ukrštanjem dva pojedinačna transgena miša. Mišji modeli ljudskog limfoma nastali su injekcijom 5 x 10<6>Bjab-luciferaraza ćelija, samih ili pomešanih sa 10 x 10<6>ljudskim donorskim PBMC, u HBSS subkutano u desne bokove 40 ženskih miševa. Miševi su tretirani intravenski sa nosačem ili 0,5 mg/kg CD20 TDB jedan sat posle inokulacije i jednu nedelju posle početnog tretmana. Tumori su mereni 1-2 puta nedeljno, i telesna težina je merena dva puta nedeljno, do 7 dana nakon završnog tretmana. Ako nije primećen gubitak težine, težine se više ne mere za određenu životinju. Ako je gubitak telesne težine veći od 15% ukupne telesne težine, pogođeni miševi su se svakodnevno merili i eutanazirani su (ili su stavljeni pod nadzor veterinarskog osoblja) ako je gubitak telesne težine premašio 20%. Klinička posmatranja su vršena dva puta nedeljno tokom trajanja studije radi praćenja zdravlja životinja; eutanazirana je svaka životinja sa veličinom ili stanjem tumora koji mogu uticati na zdravlje ili aktivnost životinje. U suprotnom, životinje su eutanazirane 6 meseci nakon početnog tretmana ili ako je tumor ulcerirao ili je njegova zapremina premašila 2500 mm<3>.
[0247] Stvoreni su modeli miševa hronične limfocitne leukemije (CLL) kao što je prethodno opisano (Bagnara i dr. Blood. 117: 5463-5472, 2011). Ukratko, 5 x 10<5>aktivirane T ćelije su prečišćene od CLL PBMC i primenjene retro-orbitalnom injekcijom NSG miševima. Nakon graftovanja T ćelija, 2 x 10<7>CLL PBMC su primenjene retro-orbitalnom injekcijom. Posle 14 dana, potvrđena je cirkulacija transplantiranih B i T ćelija FACS analizom. Uspešno graftovane životinje potom su tretirane 3,5 nedelje kasnije sa TDB antitelima koja su intravenski primenjena injekcijom u repnu venu. Životinje su eutanazirane 6 ili 14 dana nakon tretmana. Čitava krv je sakupljena punkcijom retro-orbitalnog sinusa pomoću heparinizovanih cevi i odmah prebačena u heparinizovane epruvete, dok su životinje bile pod anestezijom ili terminalnom srčanom punkcijom, heparinizovani špricem nakon eutanazije sa CO2. Slezine su sakupljene nakon eutanazije sa CO2. Za svako ispitivanje, klinička opažanja su vršena dva puta nedeljno radi praćenja zdravlja životinja. Težine životinja su se uzimale najmanje jednom nedeljno. PBMC su izolovane nakon lize crvenih krvnih zrnaca i analizirane pomoću FACS za B ćelije (muCD45+CD19+) i T ćelije (muCD90.2+CD4+, ili muCD90.2+CD8+). Sva antitela koja se koriste kupljena su od BD Biosciences ili od eBiosciences.
D. PKPD studija nad cinomolgus majmunima
[0248] Sva ispitivanja nad cinomolgus majmunima izvedena su upotrebom namenski uzgajanih, naivnih, cinomolgus majmuna kineskog porekla. Za PKPD ispitivanje sa jednom dozom, 3 mužjaka cinomolgus majmuna primila su jednu sporu bolus IV dozu od 1 mg/kg CD20 TDB; za ispitivanje ponavljane doze, 4 cinomolgus majmuna primila su IV sporu bolus dozu od 1 mg/kg CD20 TDB jednom nedeljno, ukupno 4 doze. Cela krv ili tkiva su sakupljeni u odabranim vremenskim tačkama za brojanje B ćelija i T ćelija pomoću FACS. Serum je sakupljen i čuvan na -70°C sve dok nije testiran koristeći ELISA kako bi se odredila količina test proizvoda u svakom uzorku seruma. Profili koncentracije i vremena seruma svake životinje korišćeni su za procenu farmakokinetičkih (PK) parametara korišćenjem WinNonlin softvera (Pharsight; Mountain View, CA).
CD20 TDB visokog kvaliteta proizveden kao humanizovan IgG pune dužine sa uobičajenim PK svojstvom antitela
[0249] Kako bismo istražili svojstva ciljanja koja mogu uticati na TDB potenciju ciljanja B-ćelija, uključujući identitet, veličinu vanćelijskog domena i udaljenost epitopa od membrane kod antigena, napravili smo preko 40 različitih TDB koji ciljaju epitope na CD3ε, CD19, CD20, CD22, CD79a i CD79b. Reprezentativni rezultati prikazani su na Slici 56I. Otkrili smo da su najjači TDB bili oni koji ciljaju antigene raka sa malim vanćelijskim domenima (ECD) i epitopima blizu membrana ciljane ćelije. Među najboljim metama bili su CD20, CD79a i CD79b sa potencijom od oko 10 ng/ml ili 67 pM za ubijanje normalnih ćelija donora B od strane autolognih T ćelija.
[0250] Anti-CD20/CD3 TDB (CD20-TDB) je ovde opisan kao dokaz konceptualnog molekula koji pokazuje farmakološku aktivnost ovih B ćelija koje ciljaju TDB. CD20 TDB su proizvedeni kao celoviti, potpuno humanizovani IgG sa prirodnom arhitekturom antitela iz bakterija, bez homodimera i agregata (Slika 52). Farmakokinetičko (PK) svojstvo CD20 TDB kod pacova, neobvezujuća vrsta, podseća na ono kod drugih ljudskih IgG antitela, sa polu-životom od oko 7 dana (Slika 53).
Ubijanje B ćelija sa CD20 TDB zavisi od T ćelija koristeći granzim-perforin put
[0251] Kako bismo procenili CD20 TDB kao potencijalnu terapiju za poremećaje proliferacije ćelija, kao što su CD20+ B ćelijski maligniteti, prvo smo istražili njegov mehanizam delovanja kao bispecifično antitelo koje regrutuje T ćelije. Za razliku od ADCC aktivnosti, koja je glavni mehanizam delovanja za klasičnu monoklonsku terapiju antitelom, CD20 TDB ne zahteva Fc region za svoju aktivnost. F(ab')2 deo CD20 TDB je zadržao istu potenciju kao i IgG pune dužine CD20 TDB pri ubijanju B ćelija (Slika 54A). CD20 TDB je uslovni agonist, koji za aktivnost zahteva eksprimiranje cilja, T ćelije i antitelo. Aktivnost ubijanja B ćelija od CD20 TDB zavisi od T ćelija, jer nije otkriveno ubijanje B ćelija sa PBMC osiromašenim od CD3+ T ćelija (Slika 54B). eksprimiranje cilja je potrebno za aktiviranje T ćelija, jer nijedno CD20 eksprimiranje ne rezultuje aktivnim T ćelijama (Slika 54C). CD20 TDB je u stanju da aktivira i CD4+ i CD8+ T ćelije izmereno indukcijom CD69 i CD25 na T ćelijama (Slika 54D). Uporedivo ubijanje B ćelija može se postići sa bilo kojim T ćelijama kao efektorima, dok se čini da su CD8+ T ćelije snažnije kod ubijanje BJAB ćelija, jer su CD8+ T ćelije rezultovale većim obimom ubijanja ćelija od jednakog broja CD4+ T ćelija (Slika 54C). Međutim, unošenje regulacije na gore granzima u većoj meri prevladava kod CD8+ T ćelija (Slika 54E), dok su pomoću ELISA otkriveni i viši nivoi oslobađanja perforina i granzima A i B (nije prikazano) povezani sa CD8+ T ćeljam (Slika 54F). Aktivirane T ćelije su sposobne za proliferaciju (Slika 55). Ukupan broj T ćelija, međutim, nije značajno porastao posle 24 sata u prisustvu CD20 TDB i B ćelija bez dodatka citokina in vitro, verovatno zbog uslova kulture. Zaista je primećena snažna ekspanzija T ćelija in vivo iz studija efikasnosti sa mišjim modelima i kod cinomolgus majmuna (Slike 58A i 67C).
CD20 TDB je potentan pri ubijanju ćelija leukemije/limfoma i pri autolognom ubijanju B ćelija in vitro
[0252] Potentnost ubijanja B ćelija CD20 TDB je takođe testirana kod više od desetine ćelijskih linija leukemije/limfoma B in vitro. Za procenu potencijala CD20-TDB odabrano je 8 linija koje predstavljaju ćelije sa širokim rasponom nivoa eksprimiranja CD20 (Slika 56B). Krive ubijanja B ćelija kao odgovor na dozu prikazane su sa 8 ćelijskih linija, gde je PBMC izolovan od zdravog donora kao efektorske ćelije (Slika 56A). Značajno je da CD20-TDB nije imao aktivnost protiv SU-DHL1 ćelija koje su lišene CD20 eksprimiranja. Potencija CD20-TDB je donekle korelirana sa različitim nivoima površinskog CD20 detektovanog protočnom citometrijom (56A). Ipak, CD20 TDB je potentan pri ubijanju svih 8 linija na zavisan od doze, sa EC50 u rasponu od 0,38 do 11ng/ml tokom 24 sata ispitivanja. Stepen ubijanja ćelija nekako varira od 60 do 90% sa do 1000ng/ml TDB u roku od 24 sata (Slika 56C). Generalno, potpuno ubijanje B ćelija može se postići sa većom koncentracijom antitela ili produženim vremenom ispitivanja. SU-DHL-1 ćelije su uključene u test ubijanja kao CD20 negativna kontrola, gde se ne primećuje ubijanje ćelija što pokazuje zahtev za eksprimiranjem cilja za CD20 TDB aktivnost. Čini se da CD20 TDB aktivnost zahteva veoma nizak nivo eksprimiranja cilja, jer ovde prikazane Nalm-6 i SC-1 ćelije imaju vrlo slabo površinsko eksprimiranje CD20 (Slika 56B). Monovalentni afinitet vezivanja CD20 TDB za CD20 je slabiji od bivalentnog afiniteta vezivanja roditeljskog anti-CD20, sa KDod 54 nM utvrđeno pomoću Scatchard jednačine. Uzeti zajedno, KDvrednost i CD20 TDB potencija za ubijanje B ćelij, popunjenost receptora potrebna za aktivnost CD20 TDB je samo manja od 0,1%. TDB generisani da ciljaju različite antigene B ćelija takođe su efikasni u posredovanju ubijanja B ćelija kao što je prikazano na Slici 56D, gde TDB cilja 5 različitih B ćelijskih antigena, uključujući CD20 TDB (TDB A: 2H7v16/UCHT1v9), ubija od 75% do 90% B ćelija. CD20 TDB može dalje posredovati kod ubijanja dodatnih linija B limfoma sa varijabilnom eksprimiranjem površinskog antigena CD20 (Slika 56E).
[0253] CD20 TDB je takođe veoma potentan u autolognom ubijanju B ćelija, testirano sa ljudskim PBMC izolovanim iz periferne krvi zdravih donora (Slika 56F). Na Slici 56F su prikazane krive ubijanja u zavisnosti od doze za 8 nasumičnih donora, kao i sažeti grafikon za EC50 i stepen ubijanja B ćelija (Slika 56G) sa antitelom od 1000ng/ml u toku 24 sata za 30 donora. Od 30 testiranih uzoraka, 57 do 96% B ćelija je ubijeno sa do 1000ng/ml antitela u roku od 24 sata, i vrednost EC50 iznosila je od 0,43 do 135ng/ml, uz srednju vrednost manju od 3ng/ml. Stepen ubijanja B ćelija u roku od 24 sata od strane CD20 TDB je vrlo uporediv ili veći od ubijanja B ćelija od strane anti-CD3/anti-CD19 scFv (Slika 56H).
CD20 TDB je potentan u osiromašivanju B ćelija in vivo u mišjim modelima
[0254] Pošto naš testirani CD20 TDB ne prepoznaje mišje CD20 i CD3 antigene, iskoristili smo prednost ljudskih CD20 i ljudskih CD3 transgenih miševa (opisanih iznad) da proizvedemo ljudske CD3/CD20 dvostruko transgene miševe za naknadna ispitivanja efikasnosti in vivo. Kao što je prikazano na Slici 57A, ljudski CD3/CD20 dvostruko transgeni miševi eksprimiraju huCD3ε na površini CD4+ i CD8+ T ćelija pored huCD20 na površini CD19+ B ćelija na nivoima koji se mogu detektovati u poređenju sa ljudskim T i B ćelijama. Sa ljudskim CD20 transgenim miševima, samo rituksimab može da osiromaši B ćelije, jer CD20 TDB ne može da angažuje mišje T ćelije bez ljudskog CD3 eksprimiranja (Slika 57B). Dok je sa ljudskim CD3/CD20 dvostrukim transgenim miševima, CD20 TDB je u stanju da deluje na mišje T ćelije koje eksprimiraju huCD3, i potentan je u osiromašivanju mišjih B ćelija koje eksprimiraju huCD20 (Slika 57C). Čini se da je CD20 TDB snažniji u osiromašivanju B ćelija in vivo, jer je manje B ćelija otkriveno u mišjim slezinama 7 dana nakon jedbe IV doze CD20 TDB u količini od 0,5 mg/kg, u poređenju sa jednom dozom rituksimaba od 10 mg/kg. HER2 TDB, koji ima istu CD3 krak dok se drugi krak vezuje za HER2, ovde je korišćen kao izotipska kontrola i ovde nije pokazao nikakvu aktivnost u osiromašivanju ćelija.
[0255] Kako bi se istražila najniža efikasna doza CD20 TDB u osiromašivanju B ćelija sa ljudskim CD3/CD20 dvostrukim transgenim miševima, miševi su tretirani jednom dozom CD20 TDB počevši od 0,5 mg/kg do 0,00005 mg/kg. Zatim je broj B ćelija u krvi praćen na D1 (24 sata nakon doze), D8 i D15. Smanjen broj B ćelija primećen je na D1, i osiromašivanje B ćelija održano je do D15 nakon CD20 TDB tretmana (Slika 58A). U skladu sa ovom opažanjem broja B ćelija u krvi, dostignuto je skoro potpuno osiromašivanje B ćelija u slezini miša na D7 nakon jedne doze od 0,5 mg/kg, dok je niža doza od 0,05 mg/kg delimično osiromašila B ćelije slezine i približno procenila ED50 nivo doze (Slika 58B). Vremenska studija dvostruko transgenih miševa otkrila je da je osiromašenje B ćelija gotovo kompletno u slezini već 3 dana nakon tretmana jednom dozom od 0,5 mg/kg, bez značajnih znakova oporavka B ćelija do D14 (Slika 58A). Kao što se može videti na Slici 58C, CD20 TDB posreduje osiromašivanje B ćelija na periferiji dvostrukog transgenetskog huCD20/huCD3, koji se detektuje u krvi već dva sata nakon tretmana i održava do sedam dana nakon tretmana. Pored toga, aktivirane CD8+ i CD4+ T ćelije mogu se otkriti u krvi u roku od dva sata od primene CD20 TDB, i zatim opadati dva dana nakon tretmana (Slika 58D).
[0256] Dalje, CD20 TDB iscrpio je B ćelije marginalne zone (MZB) (Slika 59A i Slika 59B) jednako efikasno kao i folikularne B ćelije (FOB) (Slika 59A i Slika 59C) u slezini miša, nakon pojedinačne IV doze od 0,5 mg/kg. Primetili smo da su B ćelije slezine opače ∼50% od početne vrednosti do prvog dana (24 sata nakon doze) i nastavile da se brzo smanjuju kako bi dostigle nadir na dan 3, koji je održavan tokom čitave studije. Ovo se očigledno razlikuje od prethodnog izveštaja sa rituksimabom, gde se smatra da mikrookolina igra ulogu u efikasnosti rituksimaba, što sugerirše drugačiji način delovanja za CD20 TDB in vivo nego za rituksimab. Aktivacija mišjih T ćelija obično se primećuje 30 minuta nakon CD20 TDB tretmana u krvi, i uglavnom tokom prva 24 sata u slezini (Slike 59D i 59E). Nakon aktiviranja T ćelija, primećeno je povećanje broja T ćelija oko D2-D3 (Slike 59D i 59E), kao rezultat proliferacije ćelija. Do drugog dana većina T ćelija više nije bila pozitivna na CD69, iako su nivoi CD69+ CD8+ ćelija nastavili da se kreću od 10-30% tokom ostatka dvonedeljnog ispitivanja. Međutim, verovatno usled smrti ćelija izazvanih aktiviranjem, broj T ćelija se smanjuje nakon faze ekspanzije. Broj T ćelija će se oporaviti nakon TDB tretmana, što sugeriše da ne postoji inhibitorni efekat CD20 TDB tretmana u regenerisanju mišjih T ćelija.
[0257] Humanizovani NSG miševi takođe su korišćeni za dalju validaciju potencije CD20 TDB pri osiromašivanju B ćelija na mišjim modelima i u okruženju ponavljanih doza. Miševi uključeni u studiju prikazanu na Slikama 60A-60D imali su 35-80% ljudskih CD45+ ćelija u perifernoj krvi, i raspon CD4+, CD8+ i CD20+ ćelija bio je 12-25, 2.1-8.7 i 32-60% respektivno (procenat prijavljen kao izvan održivih leukocitnih okvira). Reprezentativni primeri ove osnovne karakteristike prikazani su na Slici 60E. Nivoi CD3 i CD20 ciljanih antigena iz ovih miševa upoređeni su sa nivoima normalnih ljudskih donora i otkriveno je da se ne razlikuju značajno (Slika 60F). Prikazani na Slici 59, humanizovani NSG miševi su tretirani sa 3 nedeljne doze CD20 TDB pri dozi od 0,5 mg/kg. B ćelije su osiromašene na D7, i na D21 skoro nisu detektovane B ćelije (Slika 60A). Robusno osiromašivanje B ćelija takođe je primećeno kod slezina miševa tretiranih sa TDB na D21 (Slika 60B). Dalje, tretman humanizovanih NSG miševa sa CD20 TDB stimulisao je proliferaciju T ćelija i doveo do osiromašivanja B ćelija kao što je prikazano na Slici 60C. Za CD8+ T ćelije, njihov broj ćelija porastao je do 10 puta u krvi na D7 i vratio se na početnu ili nižu vrednost kod D14 i D21 (Slika 60D). Sličan trend je primećen i za CD4+ T ćelije.
CD20 TDB je potentan pri ubijanju CLL B ćelija in vitro i in vivo
[0258] Takođe smo testirali CD20 TDB potenciju za ubijanje ćelija B leukemije sa autolognim T ćelijama od CLL pacijenata, gde je opterećenje B tumora obično veliko dok je broj T ćelija nizak i funkcija T ćelija može biti potencijalno ugrožena (Riches i dr. Semin. Cancer Biol. 20(6): 431-438, 2010). PBMC izolovani iz periferne krvi devet bolesnika sa CLL su inkubirani sa jednom visokom dozom od 1000 ng/mL CD20 TDB do 48 sati. Kao što je prikazano na Slici 61A, CD20 TDB je potentan pri ubijanju CLL B ćelija sa autolognim T ćelijama. Za dva prikazana uzorka, opterećenje tumora B leukemije iznosi 70% sa 8,4% CD8+ T ćelija u PBMC za uzorak pacijenta br. 1 i 80% sa 4,4% CD8+ T ćelija za uzorak pacijenta br. 2. CD20 TDB očigledno može postići efikasno ubijanje B ćelija sa vrlo niskim odnosima efektora i cilja (1:8 i 1:18 sa 2 prikazana uzorka). Ubijanje CLL B ćelija sa autolognim T ćelijama pomoću CD20 TDB je visoko povezano sa brojem CD8+ T ćelija (Slika 61B). Otkrili smo da je sadržaj T ćelija značajno varirao (između 0,4 i 8% mononuklearnih ćelija), i neočekivano smo primetili da je obim citolize B ćelija u poređenju sa vrednostima prethodne obrade bio visoko povezan sa sadržajem T ćelija. Dopunjavanjem prečišćenih CD8+ T ćelija za CLL PBMC, gde je na raspolaganju vrlo malo autolognih T ćelija, ćelije B leukemije su efikasno ubijene od strane CD20 TDB na način zavisan od T ćelija (Slika 61C).
[0259] CD20 TDB je takođe potentan pri osiromašivanju ćelija CLL leukemije ugrađenih u miševe (Slika 62A). Ukratko, NSG miševi su graftovani sa ćelijama leukemije pacijenta nakon ugradnje autolognih aktiviranih T ćelija dobijenih od pacijenta, i tretman je započeto nakon potvrđenog uspostavljanja leukemijskog grafta. IHC bojenje reprezentativnih primera mišjih slezina pokazalo je uspešno graftovanje ćelija B leukemije i autolognih T ćelija od CLL pacijenata kod NSG miševa. Posle jedne doze tretmana CD20-TDB od 0,1 ili 0,5 mg/kg, nekoliko B ćelija je moglo da se detektuje. Osiromašenje B ćelija je takođe primećeno kod tretmana rituksimabom, dok se detektovanje B ćelija nije primetilo sa HER2-TDB kao izotipskom kontrolom. (Slika 62B).
[0260] U kontekstu progresije tumora, CD20 TDB tretman je efikasan u sprečavanju rasta tumora B ćelijskih limfoma u prisustvu PBMC ljudskog donora. SCID miševi (teška kombinovana imuna deficijencija), kojima su transplantirane su ljudske Bjab ćelije, razvili su tumore koji se mogu detektovati kada su tretirani nosačem ili samim CD20 TDB do dana 12 nakon inokulacije. Dalje, transplantacija samih PBMC odlagala rast tumora, ali su ovi miševi razvili tumore koji se mogu detektovati do dana 15 nakon inokulacije. Stoga je CD20 TDB takođe efikasan u sprečavanju rasta tumora in vivo u prisustvu PBMC efektorskih ćelija (Slika 63).
Za CD20 TDB potenciju potreban je veoma nizak nivo eksprimiranja CD20
[0261] Pored različitih potreba za Fc region antitela za aktivnost CD20 TDB u poređenju sa konvencionalnim anti-CD20 i verovatno različitu zavisnost od mikrookoline tumora, čini se da CD20 TDB zahteva i niži nivo eksprimiranja antigena za efikasno ubijanje B ćelija. Za Bjab ćelije, koje imaju visok nivo eksprimiranja CD20 (Slika 64A), uporedivo ubijanje ćelija je izvršeno sa rituksimabom i CD20 TDB (Slika 64B). Međutim, Nalm-6, SC-1 i OCI-Ly19 ćelije sa znatno smanjenim nivoom eksprimiranja CD20 (Slika 64A) su ubijene samo od strane CD20 TDB, dok ubijanje ćelija nije otkriveno sa rituksimabom (Slika 64C). Procenjeni broj CD20 primeraka za ove CD20-niske ćelijske linije je manji od 500, na osnovu Scatchard i FACS podataka vezivanja, u poređenju sa BJAB ćelijama (podaci nisu prikazani). Pored toga, monovalentni afinitet vezivanja CD20-TDB za CD20 je -50-100 nM, što je znatno manje od afiniteta rituksimaba od 1-5 nM (oba merena koristeći Scatchard). Uzeto zajedno, CD20-TDB potencija je u skladu sa tvrdnjom da TCR aktiviranje zahteva samo nisku popunjenost receptora od 10-100 molekula (Purbhoo, M.A., i dr. Nat Immunol 5:524-530, 2004; Irvine, D.J.,i dr. Nature 419:845-849, 2002; Sykulev, Y., i dr. Immunity 4:565-571, 1996).
CD20 TDB je aktivan u prisustvu rituksimaba i steroida
[0262] Budući da se rituksimab i njegova kombinacija sa hemoterapijom naširoko koriste u tretmanu maligniteta B ćelija u kliničkom okruženju, važno je istražiti kako se CD20 TDB može koristiti u ovom kontekstu, jer CD20 TDB i rituksimab ciljaju isti antigen. Iskoristili smo rituksimab-DANA, varijantu rituksimaba bez efektora (rituksimab koji sadrži supstitucije ostataka 265 i 297 za alanin (DANA mutacije su opisane u SAD patentima br. 7,332,581 i 8,219,149)), koji se vezuje samo za CD20 bez aktivnosti ubijanja B ćelija, kao što je testirano na ljudskim CD20/CD3 dvostruko transgenim miševima (Slika 64D). Pred tretman ciljanih B ćelija normalnog donora sa ovim inertnim molekulom rituksimaba koji se nadmeće sa vezivanjem CD20-TDB imao je izuzetno minimalan efekat u prikrivanju aktivnosti CD20-TDB. U koncentracijama do 250 µg/ml rituksimaba-DANA (5000 puta više od 42ng/ml EC50 nivoa doze), primetili smo samo skromne promene u krivama doza-odgovor in vitro (manja od 7-ostruke promene za EC50, 42 u odnosu na 320 ng/ml). Izuzetno, CD20 TDB je i dalje aktivan u ovoj postavci. Iako je EC50 za CD20-TDB povećan do ~7 puta sa višom koncentracijom rituksimaba-DANA, stepen ubijanja B ćelija nije značajno promenjen (Slika 65A). To je u skladu sa našim prethodnim nalazima da je za CD20 TDB potenciju potreban veoma nizak nivo eksprimiranja antigena, ili vrlo niska popunjenost receptora. In vitro zapažanja su rekapitulirana in vivo kod CD3/CD20 dvostruko transgenih miševa koji su prethodno tretirani sa 2 ili 10 mg/kg rituksimab-DANA proteina i naknadno izazvani sa CD20-TDB. Ovde pokazujemo in vivo da je CD20 TDB još uvek aktivan pri osiromašivanju B ćelija kod miševa koji su prethodno tretirani sa rituksimab-DANA (Slika 66). Ovi rezultati ukazuju na veliku svestranost u perspektivnim kombinovanim terapijama za malignitete B ćelija.
[0263] CD20 TDB je antitelo koje regrutuje T ćelije, i njegova potencija, zavise od aktiviranja T ćelija. Takođe je istraženo da li će steroidni pred-tretman, koji potencijalno može uticati na imuni odgovor T ćelija, uticati na CD20 TDB aktivnost. In vitro CD20 TDB je još uvek bio aktivan pri ubijanju B ćelija u prisustvu visoke koncentracije deksametazona (Slika 65B).
Predklinička validacija CD20 TDB kao potencijalne terapije za malignosti CD20+ B ćelija kod cinomolgus majmuna
[0264] Pilotna PKPD studija za CD20 TDB takođe je sprovedena kod cinomolgus majmuna. U studiji sa jednom dozom, gde su 3 životinje jednom tretirane intravenski sa 1 mg/kg CD20 TDB, primećeno je potpuno osiromašivanje B ćelija u krvi (Slika 67A), kao i u slezini i limfnim čvorovima (Slike 67B i 67C), 7 dana posle tretmana antitelom. Istorijske kontrole nosačem prikazane su kao srednje i standardno odstupanje za 4 životinje tretirane nosačem (Slika 67D). Nije primećen očigledan gubitak T-ćelija, jer su i CD8+ T ćelije i CD4+ T ćelije bile na uporedivom ili višem nivou u odnosu na kontrolne, izračunato kao % limfocita. Aktivacija T ćelija detektovana je u krvi 4 sata nakon doziranja. Nije primećen gubitak T ćelija, i očigledno je veći broj CD8+ T ćelija otkriven u krvi 7 dana nakon tretmana (Slika 67A).
[0265] Dugoročni efekat CD20 TDB tretmana na imune ćelije takođe je testiran četvonedeljnim ispitivanjima ponovljene doze, nakon čega je usledio period od 8 nedelja oporavka. U krvi od 4 tretirane životinje sa nedeljnom dozom od 1 mg/kg, merene su B i T ćelije, kao i koncentracija CD20 TDB u serumu za svaku pojedinačnu životinju tokom 77 dana (Slika 68A). Kod sve 4 životinje, B ćelije nisu detektovane u krvi ubrzo nakon tretmana, i nisu se vratile sve dok je koncentracija CD20 TDB u serumu ostala iznad 100 ng/ml (životinja 4502 naspram životinja 4001, 4002 i 4503). Broj CD8+ T ćelija, kao i broj CD4+ T ćelija u manjem obimu, značajno se povećavao nakon prve doze i postepeno se vratio unutar 25-150% od početnih vrednosti. Uzeto zajedno, CD20 TDB je visoko aktivan pri osiromašivanju B ćelija, bez ugrožavanja T ćelija.
[0266] PK svojstvo CD20 TDB je takođe sažeto na Slici 68B, sa koncentracijom CD20 TDB u serumu izmerenom iz obe studije. Kao što je pokazano za studiji ponovljene doze, CD20 TDB je tokom prve doze održavao dobru izloženost, sa CL na oko 17 ml/dan/kg (D0-D7). Čini se da je ciljani klirens posredovanja veći tokom prve doze (D0-D7), jer se vrednost CL smanjila na oko 6 ml/dan/kg tokom četvrte doze (D21-28).
Kombinacija CD20 TDB sa PD-L1 antagonistom u modelu singenskog tumora
[0267] Takođe je testirana efikasnost CD20 TDB u kombinaciji sa PD-L1 antagonistom (mišje IgG2a izotipsko anti-PD-L1 antitelo, 25A1, sa DANA mutacijama) u modelu singenskog tumora. U ovom ispitivanju, A20-huCD20 mišje B ćelije limfoma , koje eksprimiraju ljudski CD20 i mišji PD-L1 na svojoj ćelijskoj površini, korišćene su za generisanje modela singenskog tumora (pogledati, na primer, Sliku 69A). Upotrebljeni CD20 TDB bio je mišji IgG2a izotip 2H7v16/2C11 TDB proizveden u formatu čvor-u-otvoru formatu (K&H) (pogledati npr. Atwell i dr., J MolBiol., 270:26-35, 1997), gde je anti-CD202H7v16 krak „čvora“, i krak „rupe“ je anti-CD32C11 (Leo i dr., Proc Natl Acad Sci USA, 84:1374-8, 1987). Upotrebljeni antagonist PD-L1 je bio mišje IgG2a izotipno anti-PD-L1 antitelo sa DANA Fc mutacijama (supstitucija ostataka 265 i 297 alaninom; pogledati npr. SAD patentne br.7,332,581 i 8,219,149).
[0268] Na dan -7, 65 Balb/C miševa inokulirano je subkutano u desni unilateralno-torakalni prostor sa 2,5 miliona A20pRK-CD20-GFP ćelija u HBSS u količini od 100 µl (da ne pređe 200 µl). Miševima je omogućeno da im porastu na tumori. Miševi su zatim mereni 1-2 puta nedeljno dok tumori nisu postigli srednju zapreminu tumora od približno 100-200 mm<3>(otprilike 7 dana nakon inokulacije). Životinje su zatim podeljene u naredne četiri grupe za tretman: Grupa 1: 2,5 miliona A20/CD20, nosač, qwx3, IV, n=9; Grupa 2: 2,5 miliona A20/CD20, anti-CD20kCD3 K&H TDB (2H7v16-2C11 mišji IgG2), 0,5 mg/kg, qwx3, IV, n=9; Grupa 3: 2,5 miliona A20/CD20, aPDL1 (25A1, mlgG2a DANA), 10 mg/kg, tiwx3, IP, n=9; i grupa 4: 2,5 miliona A20/CD20, aPDL1 (25A1, mlgG2a DANA), 10 mg/kg, tiwx3, IP+ anti-CD20kCD3 K&H TDB (2H7-2C11 mišji IgG2), 0,5 mg/kg, qwx3, IV, n=9. Miševi koji nisu regrutovani u neku od gore navedenih grupa tretmana usled neodgovarajućeg obima tumora su eutanazirani. Tretman je počelo na dan 0, i svako doziranje antitela je sprovedeno intravenski u količini od 100 ml kako je opisano iznad.
[0269] Tumori su mereni 1-2 puta nedeljno. Telesna težina merena je dva puta nedeljno, do 7 dana nakon završnog tretmana. Ako nije primećen gubitak težine, težine se više nisu uzimale. Ako je primećeno da gubitak telesne težine iznosi >15%, zahvaćeni miševi se svakodnevno mere i eutanaziraju ako je gubitak težine veći ili jednak 20%. Tokom čitave studije, klinička opažanja su vršena dva puta nedeljno radi praćenja zdravlja životinja, i svaka životinja sa veličinom ili stanjem tumora koji mogu uticati na zdravlje ili aktivnost životinje je eutanazirana.
[0270] Kao što je prikazano na Slici 69B, kombinovani CD20 TDB tretman anti-PD-L1 antitelom (Grupa 4) pokazao je neočekivani i sinergetski efekat na inhibiciju rasta tumora u poređenju sa tretmanom CD20 TDB, anti-PD-L1 antitelom ili samim agensom.
1
Kombinacija CD20 TDB sa PD-1 antagonistom u modelu singenskog tumora
[0271] Pored toga in vivo efikasnost CD20 TDB u kombinaciji sa PD-1 antagonistom (mišji IgG2 izotip anti-PD1 antitelo, 8F11, sa DANA mutacijama) takođe je testirana u A20/huCD20 modelu singenskog mišjeg B limfoma. U ovom ispitivanju, korišćen CD20 TDB je mišji IgG2a izotip 2H7v16/2C11 TDB, i korišćeni PD-1 antagonist je mišje IgG2 izotipsko anti-PD-1 antitelo sa DANA Fc mutacijama.
[0272] A20 mišje ćelije B limfoma transficirane su da eksprimiraju ljudski CD20 i GFP, i potom su pojedinačne ćelije sortirane za klonsku selekciju i ekspanziju za implantaciju. Ženke Balb/c miševa (Charles River; Hollister, CA) uzrasta 8-10 nedelja inokulirane su potkožno u desni unilateralni torakalni region sa 2,5 miliona A20.hCD20-GFP ćelija. Kada su tumori dostigli srednju zapreminu tumora od 100-200 mm<3>, miševi su regrutovani i randomizovani u jednu od četiri grupe za tretman (n = 9 miševa/grupa) i tretman antitelom je počeo narednog dana 1:Grupa 1 (2,5 miliona A20/CD20, nosač, qwx3, IV); Grupa 2 (2,5 miliona A20/CD20, anti-CD20kCD3 K&H TDB (2H7v16-2C11 mišji IgG2), 0,5 mg/kg, qwx3, IV); Grupa 3 (2,5 miliona A20/CD20, anti-PD1 (8F11, mlgG2a DANA), 10 mg/kg, tiwx3, IP); i Grupa 4 (2,5 miliona A20/CD20, anti-PD1 (8F11, mlgG2a DANA), 10 mg/kg, tiwx3, IP anti-CD20kCD3 K&H TDB (2H7v16-2C11 mišji IgG2), 0,5 mg/kg, qwx3, IV).
[0273] Miševi su tretirani nosačem ili CD20 TDB pri 0,5 mg/kg nedeljno IV tokom 3 nedelje i/ili anti-PD-1 antitelom pri 10 mg/kg IV za prvu dozu, i zatim IP doziranjem 3 puta nedeljno u trajanju od 3 nedelje. (N = 9 miševa/grupa)
[0274] Kao što je prikazano na Slikama 108A i 108B, kombinovani CD20 TDB tretman sa anti-PD-1 antitelom (grupa 4) je pokazao neočekivani i sinergetski efekat u inhibiciji rasta tumora u poređenju sa tretmanom sa CD20 TDB, anti-PD-1 antitelom, ili samo nosačem.
Primer 4. Generisanje i karakterizacija primernih CD3/FcRH5 TDB (FcRH5 TDB)
[0275] Takođe smo istražili kapacitet TDB antitela da regrutuju citotoksične aktivnosti T ćelija pri iskorenjivanju ćelija tumora prepoznavanjem različitog antigena ćelijske površine, FcRH5. U tom cilju, generisali smo i karakterisali bispecifična anti-CD3 antitela koja imaju anti-CD3 krak i anti-FcRH5 krak (FcRH5 TDB). Kao što je prethodno opisano, FcRH5 TDB su proizvedeni kao antitela pune dužine u formatu čvor-u-otvoru kao ljudski IgG1, kao što je prethodno opisano (Atwell i dr. J. Mol. Biol.270: 26-35, 1997). Polovine antitela su eksprimirane u E. Coli, prečišćene protein-A-afinitetnom hromatografijom, i odgovarajući parovi polovina antitela su kalemljeni in vitro kao što je prethodno opisano (Spiess i dr. Nat. Biotechnol. 2013). Nakon kalemljenja, FcRH5 TDB su prečišćeni hidrofobnom interakcionom hromatografijom (HIC) i karakterisani analitičkim filtriranjem gelom, masnom spektrometrijom i elektroforezom poliakrilamidnog gela, kao što je opisano iznad. Anti-FcRH5 krak koji se koristi u stvaranju FcRH5 TDB bio je anti-FcRH5 antitelo 1G7, koje sadrži (a) VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 268 i (b) VL domen koji sadrži aminokiselinu sekvencu SEQ ID NO: 269. Anti-CD3 kraci testirani pri generisanju FcRH5 TDB uključuju UCHT1v9, 40G5c i 38E4v1.
[0276] Specifični FcRH5 TDB ispitivani su za vezivanje za CD8+ T ćelije (CD3 vezivanje), kao i aktivnost, kako je procenjeno pomoću in vitro testova citotoksičnosti i testova aktivacije T ćelija.
A. Afinitet vezivanja
[0277] Afiniteti vezivanja za svaki od FcRH5 TDB testirani su pomoću FACS analize, kao što je opisano iznad za CD20 TDB. Ukratko, za testove vezivanja FACS, CD8+ T ćelije su inkubirane sa različitim koncentracijama FcRH5 TDB antitela tokom 30 miinuta na 4°C, i zatim su ćelije isprane i inkubirane sa drugim antitelom (anti-hulgG-PE; BD Bioscience) tokom dodatnih 15 minuta, pre nego što su ćelije ponovo isprane i spremne za FACS analizu. Slika 70 prikazuje rezultate in vitro FACS testova vezivanja FcRH5 TDB. Rezultati pokazuju da određena kombinacija kraka anti-CD3 antitela, 38E4v1, para sa anti-FcRH5 krakom, 1G7, rezultuje FcRH5 antitelom sa većim afinitetom vezivanja za efektorske ćelije.
B. In vitro testovi ubijanja MOLP-2 ciljanih ćelija i aktiviranje T ćelija
[0278] Generisani FcRH5 TDB su takođe testirani za svoju sposobnost da podrže ubijanje ciljanih ćelija koje eksprimiraju FcRH5 i aktiviranje citotoksičnog efekta T ćelija. In vitro citotoksičnost je praćena protočnom citometrijom. Ciljane ćelije su označene sa CFSE prema protokolu proizvođača (Invitrogen, #C34554). Karboksifluorescentnim sukcinimidil estrom (CFSE) označene ciljane ćelije i prečišćene CD8+ T ćelije iz ljudske PBMC su mešane u odnosu 3:1, sa ili bez TDB tokom 48 sati. Ćelije su ponovo suspendovane u jednakoj zapremini PBS 2% FBS 1 mM EDTA propidijum jodid (PI). Analiza protočne citometrije
2
urađena je na FACSCalibur u formatu za automatizaciju. Broj živih ciljanih ćelija se računa brojanjem u CFSE+/PI negativnih ćelija. Procenat citotoksičnosti izračunat je na naredni način: % citotoksičnosti (broj živih ciljanih ćelije bez TDB - broj živih ciljanih ćelija sa TDB)/(broj živih ciljanih ćelije bez TDB) x 100. Kao što je prikazano na Slikama 71A i 71B, FcRH5 TDB sa UCHT1v9 ili 38E4v1, njihovi anti-CD3 kraci pokazali su robusno in vitro ubijanje MOLP-2 ciljanih ćelija u poređenju sa FcRH5 TDB koji ima 40G5c kao svoj krak protiv CD3.
[0279] Kada su ispitivani za testove aktiviranja T ćelija, Slike 72A-72D pokazuju da su FcRH5 TDB sa UCHT1v9 ili 38E4v1 za svoj anti-CD3 krak sposobni da snažno indukuju aktivnost T ćelija in vitro, u poređenju sa FcRH5 TDB koji ima 40G5c kao svoj anti-CD3 krak. U tim ispitivanjima, ciljane ćelije i prečišćene CD8+ T ćelije su pomešane u prisustvu ili odsustvu TDB, i aktiviranje T ćelija je analizirano protočnom citometrijom. Na kraju inkubacije, ćelije su obojene sa CD8-FITC (BD Bioscience, 555634) CD69-PE (BD Bioscience, 555531) i CD107a-Alexa-Fluor647 (eBioscience, 51-1079). Alternativno, nakon što su površinski obojene sa CD8-FITC i CD69-PE, ćelije su fiksirane i permeabilisane Cytofix/CytoPerm rastvorom (BD Bioscience, 554722) i intracelularno obojene anti-granzim B-Alexa-Fluor647 (BD Bioscience, 560212). Aktivacija T ćelije procenjena je procentom CD8+ CD69+, CD8+ CD107a+ i CD8+ CD69+GranzimB+ ćelija.
Primer 5. Generisanje i karakterizacija primernih CD3/HER2 TDB (HER2 TDB)
[0280] Takođe smo istražili kapacitet TDB antitela da regrutuju citotoksične aktivnosti T ćelija pri iskorenjivanju ćelija tumora prepoznavanjem različitog antigena ćelijske površine, HER2. U tom cilju, generisali smo i karakterisali bispecifična anti-CD3 antitela koja imaju anti-CD3 krak i anti-HER2 krak (HER2 TDB). Kao što je opisano iznad, HER2 TDB su proizvedeni kao antitela pune dužine u formatu čvoru-otvoru kao ljudski IgG1, kao što je prethodno opisano (Atwell i dr. J. Mol. Biol. 270: 26-35, 1997). Polovine antitela su eksprimirane u E. Coli, prečišćene protein-A-afinitetnom hromatografijom, i odgovarajući parovi polovina antitela su kalemljeni in vitro kao što je prethodno opisano (Spiess i dr. Nat. Biotechnol. 2013). Ako je proizvodnja TDB antitela izvedena u CHO ćelijama, antitelo uključuje mutaciju aglikozilacije, na primer, na ostatku N297 (npr., N297G), tako da je TDB antitelo varijanta bez efektora i nije u stanju da pokrene ćelijski posredovanu citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC). Nakon kalemljenja, HER2 TDB su prečišćeni hidrofobnom interakcionom hromatografijom (HIC) i karakterisani su analitičkom filtracijom gelom, masenom spektrometrijom i elektroforezom gela poliakrilamidnog materijala, kao što je opisano iznad. Jedan anti-HER2 krak korišćena u stvaranju HER2 TDB bio je onaj od anti-HER2 antitela hu4D5, koji sadrži (a) VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 270 i (b) VL domen koji sadrži aminokiselinu sekvenca SEQ ID NO: 271. Dodatni HER2 TDB su generisani kako bi ciljali različite oblasti vanćelijskog domena (ECD) HER2. Anti-HER2 antitelo, 2C4 je korišćeno kao anti-Her2 krak koji sadrži (a) VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 593 i (b) VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 594. Drugo anti-HER2 antitelo korišćeno kao anti-HER2 krak je bilo anti-HER2 antitelo, 7C2 koje sadrži (a) VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 595 i (b) VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 596. Ostali anti-HER2 kraci koja se koriste u stvaranju HER2 TDB uključuju varijante afiniteta hu4D5, hu4D5.91A i hu4D5.Y100A (opisano u US 7,435,797).
[0281] Specifični HER2 TDB ispitivani su na vezivanje za CD8+ T ćelije (CD3 vezivanje) i SKBR3 ćelije (Her2 vezivanje), kao i aktivnost, kako je procenjeno sa in vitro testovima citotoksičnosti i testovima aktivacije T ćelija.
A. Afinitet vezivanja
[0282] Afiniteti vezivanja za svaki od HER2 TDB su testirani FACS analizom, kao što je opisano iznad za CD20 TDB. Ukratko, za testove vezivanja FACS, Jurkat ćelije (za CD3 antigen), ljudske CD8+ ćelije (za CD3 antigen) ili SKBR3 (za Her2 antigen) inkubiraju se sa različitim koncentracijama HER2 TDB antitela na 4°C tokom 30 minuta, zatim su ćelije isprane i inkubirane sa drugim antitelom (anti-hulgG-PE, BD Bioscience; ili anti-hulgG-AlexaFluor647, Southern Biotech) tokom dodatnih 15 minuta, pre nego što su ćelije ponovo isprane i spremne za FACS analizu. Geografska srednja vrednost fluorescencije očitana je protočnom citometrijom. Slike 73, 76A, 78A-78C, 79A i 80A-80B prikazuju rezultate in vitro FACS testova vezivanja HER2 TDB. Višestruki kraci HER2 koji se vezuju za različite regione HER2 testirani su u kombinaciji sa više CD3 kraka koji se vezuju za različite regione CD3ε kako bi se karakterisala svojstva vezivanja svake kombinacije. Slika 76A daje kristalnu strukturu HER2 ECD i CD3ε i naglašava regione za koje se različiti HER2 i CD3 kraci vezuju za svaki. hu4D5 HER2 antitelo poznato je kao trastuzumab i vezuje se za epitop u domenu IV od HER2 koji je proteinski region najbliži ćelijskoj membrani. Rekombinantno humanizovano monoklonsko antitelo 2C4 (rhµMAb 2C4) je takođe poznato kao pertuzumab koji se vezuje za epitop u domenu II od HER2 koji je 50 Angstroma od onog gde se vezuje hu4D5. Pertuzumab (PERJETA®, Genentech, Inc, South San Francisco) predstavlja prvi u novoj klasi agenasa koji su poznati pod nazivom inhibitori HER dimerizacije (HDI) i funkcioniše da inhibira sposobnost HER2 da formira aktivne heterodimere ili homodimere sa drugim HER receptorima (kao što su EGFR/HER1, HER2, HER3 i HER4) (Harari i Yarden. Oncogene 19:6102-6114, 2000; Yarden i Sliwkowski. Nat. Rev. Mol. Cell Biol.2:127-137, 2001; Sliwkowski. Nat. Struct. Biol.10:158-159, 2003; Cho i dr. Nature 421:756-60, 2003; i Malik i dr. Pro. Am. Soc. Cancer Res. 44:176-177, 2003). Anti-HER2 mišje antitelo 7C2 se vezuje za epitop u domenu I od HER2 (PCT Publication No. WO 98/17797) koji je udaljen 100 Angstroma od HER2 regiona vezanog sa hu4D5 (Slika 76A).
[0283] Pored toga, afinitet vezivanja HER2 TDB je testiran sa više anti-CD3 kraka. Jedan od datih anti-HER2 kraka je kombinovan sa ljudskim CD3 kracima za ciljanje sa visokim afinitetom, kao što su SP34 i 38E4v1. Ostale HER2 TDB kombinacije obuhvatale su krake za ciljanje 40G5c sa niskim afinitetom, 40G5c, ili mišje krake za ciljanje CD3 2C11. UCHT1v9 za svoj anti-CD3 krak i hu4D5 za svoj anti-HER2 krak, ovde nazvan HER2 TDB (UCHT1v9/hu4D5) ili HER2 TDB, upoređen je sa anti-HER2 antitelom, trastuzumabom i trastuzumab-Fab fragmentima u kompetetivnom Scatchard testu (Ramirez-Carrozzi i dr. Nature Immunology. 12: 1159-1166, 2011). U ovom testu, vezivanje za SKBR-3 određeno je kompetitivnim vezivanjem<121>I-trastuzumab Fab sa trastuzumabom, trastuzumab-Fab ili bispecifičnim HER2 TDB. Na Slici 74A prikazani su rezultati in vitro kompetitivnog Scatchard testa HER2 TDB.
B. In vitro testovi ubijanja SKBR3 i MCF7 ciljanih ćelija i aktiviranja T ćelija
[0284] Testirane su HER2 TDB kombinacije jednog od tri anti-HER2 kraka (hu4D5, 2C4 i 7C2) bilo sa anti-CD3 krakom visokog afiniteta 38E4v1 ili krakom niskog afiniteta 40G5c in vitro na svoju sposobnost da posreduju ubijanju ciljanih SKBR3 ili MCF7 ćelija koje eksprimiraju HER2 (Slika 77). In vitro aktivnost hu4D5 TDB sa bilo kojim anti-CD3 krakom pokazala se efikasnijom od 2C4 i 7C2 TDB u posredovanju maksimalnog ubijanja SKBR3 i MCF7 ćelija, mereno njihovim EC50 (Slika 78). Ova aktivnost ubijanja je takođe zavisila od korišćenog CD3 kraka. Kombinacija anti-CD3 kraka 38E4v1 sa bilo kojim od anti-HER2 hu4D5, 2C4 ili 7C2 kraka bila je efikasnija od 40G5c HER2 TDB kombinacija (Slika 79). Daljim testiranjem 6 HER2 TDB kombinacija otkriveno je da njihova aktivnost ubijanja ciljanih ćelija ne zavisi od nivoa eksprimiranja HER2 u ciljanim ćelijama. Slika 80 pokazuje da HER2 TDB nisu bili selektivni za SKBR3 ciljane ćelije koje visoko eksprimiraju HER2 u odnosu na MCF7 ciljane ćelije koje nisko eksprimiraju HER2. Aktivnost HER2 TDB je umesto toga zavisila od afiniteta anti-HER2 kraka za HER2 (Slika 81). TDB niskog HER2 afiniteta zadržali su aktivnost na MCF7 ćelijama koje eksprimiraju HER2 i nisu bile u stanju da selektivno ubiju SKBR3 ćelije sa pojačanim HER2 (Slika 82).
[0285] HER2 TDB su takođe ispitani zbog specifičnosti anti-HER2 kraka za svoje HER2 epitope. Aktivnost ubijanja hu4D5-40G5c HER2-TDB je ograničena kada je kombinovana sa povećanjem koncentracije Trastuzumaba (hu4D5). Međutim, na efikasnost trastuzumaba ne utiče kombinacija hu4D5 TDB sa hu4D5 antitelom (Slika 83). Suprotno tome, ubijanje ciljanih ćelija posredovano sa 2C4-40G5c ili 7C2 38E4v1 blokirano je istovremenom primenom bivalentnog monospecifičnog antitela pertuzumaba (2C4), odnosno 7C2 (Slika 83). Kada su testirani dodatni anti-HER2 kraci u testu sa više afiniteta, svi klonovi koji pokazuju visoku ili srednju aktivnost HER2 TDB nadmetali su se sa trastuzumabom ili pertuzumabom (Slika 84). Za identifikaciju TDB kandidata koji treba da se analizira in vivo, testirani su CD3 kraci visokog (38E4v1, 38E4 i SP34) i niskog (40G5c i 2C11) afiniteta, in vitro sa humanizovanim CD3+ T ćelijama dobijenim od miševa u kombinaciji sa hu4D5, 2C4 i 7C2 anti-HER2 kracima (Slike 85-86). Iz ovog ispitivanja odabrana su tri kandidata TDB na osnovu svoje aktivnosti ubijanja za dalju karakterizaciju in vivo: hu4D5-SP34, hu4D5-2C11 i 2C4-38E4. Tretman životinja koje nose tumor koje eksprimiraju HER2 sa hu4D5-2C11 HER2 TDB rezultovao je povećanjem CD45+ i CD8+ ćelija u tumoru već 4 sata nakon tretmana. Daljom analizom, HER2-TDB tretirani tumori otkrili su porast IFNγ i PD1 CD8+ T ćelija kao i povećano prisustvo T regulatornih (Treg) ćelija (Slika 87B). Detektovanje povećanih imunih infiltrata u tumorima takođe je povezano sa smanjenjem zapremina tumora kod životinja tretiranih sa HER2-TDB u poređenju sa kontrolnim tretmanom nosača (Slika 87A). Na Slici 88A, anti-HER2 krak hu4D5 u kombinaciji sa anti-CD3 krakom niskog afiniteta, 2C11 ili anti-CD3 krakom visokog afiniteta, SP34, rezultovali su regresijom tumora kod transgenih miševa HER2. Međutim, ovaj odgovor nije primećen kod 2C4 anti-HER2 kraka nižeg afiniteta kombinovanog sa 38E4 anti-CD3 krakom visokog afiniteta (Slike 88A-88B).
[0286] HER2 TDB je takođe upoređen sa bivalentnim fragmentima trastuzumaba i trastuzumab-Fab zbog
4
svoje sposobnosti da direktno inhibira proliferaciju SKBR3. SKBR3 ciljane ćelije koja eksprimiraju HER2 su stavljene u ploče sa 96 komorica pri gustini 5 × 10<3>ćelija/komorica i inkubirane su tokom noći za vezivanje ćelija pre tretmana sa naznačenim antitelom ili fragmentom antitela. Proliferacija/vitalnost ćelija analizirana je nakon 6 dana tretmana sa CELLTITERGLO® CELLTITERGLO® Luminescent Cell Viability Assay (Promega, Madison, WI). Rezultati ovog ispitivanja prikazani su na Slici 74B. Pored toga, in vitro test citotoksičnosti izveden je sa trastuzumabom, trastuzumabom proizvedenim u E. Coli i HER2 TDB za merenje njihove sposobnosti da indukuju ćelijski posredovanu citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC) posredovanu NK ćelijama (Jefferis Trends in Pharmacological sciences. 30: 356-362, 2009; Simmons i dr. Journal of Immunological Methods. 263: 133-147, 2002). Antitela proizvedena u E. Coli nisu glikozilovana, što rezultuje oštećenim FcγR vezivanjem, što je potrebno za posredovanje ADCC. Test citotoksičnosti je izveden kao kod Junttila i dr. (Cancer Research. 70: 4481-4489, 2010) koristeći Cytotoxicity Detection Kit; LDH (Roche, Mannheim, Germany). Ukratko, detektovane su lizirane ćelije oslobađanjem laktat dehidrogenaze (LDH) nakon 4 sata tretmana navedenim antitelom. Rezultati su prikazani na Slici 74C.
[0287] Generisani HER2 TDB takođe su testirani za svoju sposobnost da podrže ubijanje ciljanih ćelija koje eksprimiraju HER2 i aktiviraju citotoksični efekat T ćelija. In vitro citotoksičnost je praćena protočnom citometrijom. Ciljane ćelije su označene sa karboksifluorescin sukcinimidil estrom (CFSE) prema protokolu proizvođača (Invitrogen, #C34554). Ciljane ćelije označene sa CFSE i prečišćene CD8+ T ćelije iz ljudskog PBMC mešaju se u određenom E:T odnosu (kao što je prikazano na legendi slike), sa ili bez TDB tokom 24 sata. Na kraju inkubacije, ćelije su podignute tripsinom i prikupljene sa ploče. Ćelije su resuspendovane u jednakoj zapremini PBS 2% FBS 1 mM EDTA propidijum jodid (PI). Analiza protočne citometrije urađena je na FACSCalibur u formatu za automatizaciju. Broj živih ciljanih ćelija se računa brojanjem CFSE /PI negativnih ćelija. Procenat citotoksičnosti izračunat je na naredni način: % citotoksičnosti (broj živih ciljanih ćelija bez TDB - broj živih ciljanih ćelija sa TDB)/(broj živih ciljanih ćelija bez TDB) x 100. Kao što je prikazano na Slici 75, HER2 TDB je pokazao robusno in vitro ubijanje SKBR3 ciljanih ćelija u poređenju sa HER2 TDB koji ima varijantu afiniteta hu4D5 91A ili Y100A kao anti-HER2 krak (EC50 od hu4D5/UCHT1v9 TDB = 0,1 ng/ml; hu4D5.91A/UCHT1v9 TDB = 25,5 ng/ml; hu4D5.Y100A/UCHT1v9 TDB = nije moguće odrediti).
[0288] Pored toga, afinitet vezivanja anti-HER2 hu4D5 varijante (,4 nM) za HER2 vanćelijski domen (ECD) je viši od HER2 kraka 2C4 (2,0 nM) i 7C2 (1,7 nM), što je prikazano na Slici 76B. Dalje, na Slici 76C prikazano je da je hu4D5 HER2-TDB potentniji posrednik ubijanja MCF7 ciljane ćelije od 2C4 HER2-TDB i 7C2 HER2-TDB. Kinetika ubijanja izazvana HER2 TDB je dodatno ispitana. Kako se može videti na Slici 94A, nije primećena značajna aktivnost ubijanja u periodu od 4-12 sati. Robusno ubijanje detektovano je na 24 sata, i aktivnosti ubijanja su se vremenom povećavale. Kao što je prikazano na Slikama 90A - 90C i 92C, dalja poređenja anti-CD3 kraka hu4D5 HER2-TDB pokazala su efikasnost različitih klonova u posredovanju ubijanja SKBR3 ćelija koje eksprimiraju HER2. Konkretno, dva HER2 TDB, hu4D5/38E4c i hu4D5/40G5c, bila su iznenađujuće efikasna ili bolja u posredovanju ubijanja ciljanih ćelija od HER2 TDB hu4D5/SP34 (Slike 90B i 90C).
[0289] Kada je ispitivan za test aktiviranja T ćelija, Slika 89 pokazuje da je HER2 TDB bio sposoban da snažno indukuje aktivnost T ćelija. in vitro, u poređenju sa HER2 TDB koji ima hu4D5 afinitetnu varijantu 91A ili Y100A kao svoj anti-HER2 krak. Tri anti-CD3 kraka (SP34, 38E4c i 40G5c) od testiranih hu4D5 HER2-TDB pokazali su različite afinitete vezivanja za CD3 antigen na ljudskim CD8+ T ćelijama, kao što je prikazano na Slici 91A. Bez obzira na to, sva tri HER2-TDB su mogla su posredovati aktivaciju CD8+ T-ćelija (Slika 91B). Dodatna analiza sposobnosti 38E4 i 38E4c anti-CD3 kraka hu4D5 HER2-TDB za posredovanje aktivacije CD8+ T ćelija prikazana je na Slici 92D. Kinetika aktiviranja T ćelija izazvana od strane HER2 TDB je dalje ispitana. Rani znaci aktivacije T ćelija (CD69) su se pojavili 4 sata nakon što je započet HER2 TDB tretman. Međutim, markeri kasne aktivacije (vanćelijski CD107a) detektovani su kasnije u vremenskoj tački na 24 sata (Slika 94A). Pored toga, aktivacija T ćelija nije otkrivena nakon 48 sati kada su CD8+ ćelije inkubirane sa HER2 TDB ili ciljanim ćelijama koje ne eksprimiraju ljudski HER2 (BJAB ćelije). Snažna aktivacija T ćelija primećena je kada su HER2 SKBR3 ćelije korišćene kao mete praćene oslobađanjem citotoksičnih granula (Slika 93A).
[0290] Takođe smo testirali sposobnost HER2 TDB da indukuje ubijanje BT474 ciljanih ćelija i aktiviranje T ćelija testirano je za narednih pet odnosa efektorskih CD8+ T ćelija prema ciljanim ćelijama: 1:5, 1:2, 1:1, 3:1, i 5:1. Ovaj eksperiment otkriva da je citotoksičnost merena oslobađanjem LDH značajno smanjena titracijom efektorskih ćelija; međutim, čak i kad E:T odnos iznosi ≤1:1, otkriven je slab LDH signal i snažna aktivacija T ćelija (Slika 94B).
[0291] U tim ispitivanjima, ciljane ćelije i prečišćene CD8+ T ćelije su pomešane u prisustvu ili odsustvu TDB i aktiviranje T ćelija je analizirano protočnom citometrijom. Na kraju inkubacije, ćelije su obojene sa CD8-FITC (BD Bioscience, 555634) CD69-PE (BD Bioscience, 555531) i CD107a-Alexa-Fluor647 (eBioscience, 51-1079). Po izboru, ćelije su obojene sa CD8-FITC i CD69-PE, gde je aktivacija T ćelija procenjena procentom CD8+ CD69+ u CD8+ ćelijama. Alternativno, nakon što su površinski obojene sa CD8-FITC i CD69-PE, ćelije su fiksirane i permeabilisane Cytofix/CytoPerm rastvorom(BD Bioscience, 554722) i intracelularno obojene sa anti-granzim B-Alexa-Fluor647 (BD Bioscience, 560212). Aktivacija T ćelije procenjena je procentom CD8+ CD107a+ ćelija.
[0292] Druga mera za T ćelijski posredovanu citotoksičnost za HER2 TDB (UCHT1v9/hu4D5) je test egzocitoze granula. Slika 93B prikazuje rezultate rastvorljivog perforina (Cell Sciences), granzima A i granzima B (eBioscience) koji su pomoću ELISA detektovani medijimu za rast prema protokolima proizvođača. U ovom testu, korišćen je kontrolni TDB (10 ng/ml), koji deli isti CD3-krak kao HER2 TDB, ali ima irelevantni ciljani krak, ili HER2 TDB (10 ng/ml). Antitela su pojedinačno inkubirana tokom 18 sati sa SKBR3 ciljanim ćelijama i mononuklearnim ćelijama periferne krvi (PBMC), koje su odvojene od krvi zdravih dobrovoljaca korišćenjem medijuma za razdvajanje limfocita (MP Biomedicals, Solon, OH). In vitro citotoksičnost je merena oslobađanjem LDH kao što je opisano iznad. Serija apoptotičkih ispitivanja izvedena je sa HER2 TDB (1 ng/ml), efektorskim PBMC i SKBR3 ciljanim ćelijama. Posle 24 sata tretmana, egzocitoza granula podudarala se sa značajnom povišenom aktivnošću kaspaze 3/7 indukovanom sa HER2 TDB (CASPASE-GLO® 3/7 test, Promega), apoptozom (Cell Death Detection ELISA<plus>analiza, Roche) i citotoksičnost merena merenjem oslobađanjem laktat dehidrogenaze (LDH), što je opisano iznad (Slika 93C).
[0293] Sposobnost HER2 TDB da indukuje ubijanje HER2 ili vektorski transficiranih 3T3 ćelija merena je pomenutim LDH testom citotoksičnosti, gde nije detektovano ubijanje vektorom-transficiranih 3T3-ćelija nakon 19 sati; nasuprot tome, HER2 transficirane 3T3-ćelije su vrlo efikasno ubijene (Slika 93D). Test ubijanja je modifikovan tako da blokira vezivanje HER2 kraka korišćenjem trastuzumab Fab (1 µg/ml) ili rastvorljivog HER2 vanćelijskog domena (HER2 ECD) (1 µg/ml) i rezultuje efikasnom inhibicijom aktivnosti ubijanja nakon 24 sata (Slika 93E). Kako bi potvrdili zavisnost od ubijanja T ćelija, CD3+ ćelije su osiromašene iz PBMC korišćenjem CD3+ MicroBeads od Miltenyi (#130-050-101). Slika 93F prikazuje osiromašivanje koje je rezultovao gubitkom aktivnosti ubijanja ciljanih ćelija nakon 19 sati kako je procenjeno FACS analizom u prisustvu HER2 TDB.
HER2 TDB indukuje proliferaciju T ćelija
[0294] Kako bi se istražilo da li HER2 TDB indukuje proliferaciju T ćelija, ko-kultivisane su CD8+ T ćelije, ciljane ćelije (SKBR3) i 0,1 µg/ml HER2 TDB, nakon čega je usledilo kultivisanje T ćelijska u odsustvu ciljanih ćelija i HER2 TDB. Proliferacija T ćelija merena je na dan 3 protočnom citometrijom kao razblaživanje CFSE u CD8+/PI ćelijama sa ćelijskim deobama. Nakon 3 dana, 75% T ćelija koje su pulsirane sa HER2 TDB i ciljanim ćelijama je prošlo ćelijsku deobu kao što je prikazano na Slici 95A. HER2 TDB indukovani broj T ćelija testiran je obeležavanjem prečišćenih CD8+ T ćelija CFSE prema protokolu proizvođača (Invitrogen, #C34554). CD8+ T ćelije označene sa CFSE inkubiraju se sa ciljanim ćelijama u prisustvu ili odsustvu TDB tokom 19 sati. T ćelije su sakupljene, isprane i kultivisane 2-7 dana (RPMI 10% FBS). Broj živih CD8+ broj ćelije (CD8+/PI-) i procenat CFSE dim ćelija detektovan je pomoću FACS. Na Slici 95B broj ćelija se nije povećavao. Dalje dopunjavanje medijuma za rast sa IL-2 (20 ng/ml) pružilo je signal za preživljavanje CD8+ ćelijama, i u T ćelijama je otkrivena snažna proliferacija T ćelija, ali samo ako su bile izložene i HER2 TDB i ciljanim ćelijama (Slika 95C). Ono što je važno, nije otkriven efekat posmatrača na ćelijama koje se ne eksprimiraju u uslovima kada je ubijena većina HER2 ćelija u istoj kulturi. HER2 TDB je indukovao proliferaciju i poliklonsku ekspanziju T ćelija, što može biti kritično za pojačavanje limfocita koji infiltriraju tumor.
HER2 TDB aktivnos je u korelaciji sa nivoom eksprimiranja HER2 od ciljane ćelije
[0295] Kako bi se istražila veza između ciljanog broja kopija i TDB aktivnosti, odabran je panel ćelija raka sa unapred određenim brojem HER2 receptora na ćelijskoj membrani (Aguilar i dr. Oncogene. 18:6050-62, 1999). Nivoi eksprimiranja HER2 proteina u HER2 negativnoj ćelijskoj liniji (BJAB LUC), 3 ćelijske linije sa niskim niske HER2 (MDA435, MDA231, MCF7) i 3 ćelijske linije sa pojačanim/prekomerno eksprimiranim HER2 (MD453, SKBR3, BT474) detektovane su koristeći Western blot (Slika 96A). HER2-negativne, HER2-niske i HER2-prekomerno eksprimirajuće ćelijske linije inkubiraju se sa HER2 TDB i sa efektorskim PBMC u odnosu E:T od 25:1 tokom 26 sati. U ovom trenutku, citotoksičnost je detektovana korišćenjem testa oslobađanja LDH. Slika 96B pokazuje da su ćelije sa pojačanim/prekomerno eksprimiranim HER2 bile značajno osetljivije na ubijanje posredovano sa TDB (p= 0,015, t-test) i efikasno su lizirane na femtomolarnim do niskim pikomolarnim koncentracijama (EC50 = 0,8-3 pM). Ćelijske linije koje eksprimiraju niske nivoe HER2 bile su značajno manje osetljive na HER2 TDB antitelo (EC50 = 33-51 pM). Mane od <1000 kopija ciljanog antigena bilo je dovoljno za podržavanje ubijanja T ćelija.
[0296] Za studije izvedene na Slikama 96C-96D, MCF7 ćelijska linija ili BJAB ćelijska linija zajednički je ciljana sa SKBR3 ćelijama u prisustvu HER2 TDB u istom testu ubijanja. U ovom testu, MCF7 ili BJAB ćelije su označene sa CFSE i pomešane sa SKBR3 i PBMC (E:T 20:1) nakon čega je usledilo 19-očasovni tretman sa HER2 TDB. Ćelije su obojene sa anti-HER2 APC i PI. Slika 96C prikazuje procenat živih ćelija SKBR3 (visoki HER2, PI-) i MCF7 (CFSE . PI-) detektovan pomoću FACS i normalizovan na fluorescentne kuglice. Ubijanje MCF7 ćelija nije detektovano na EC50 za SKBR3 ubijanje. Prikazan je procenat živih ćelija SKBR3 (HER2 visok, PI-) i BJAB (CFSE PI-) koji je detektovan pomoću FACS i normalizovan na fluorescentne kuglice. Nije bilo značajnog ubijanja BJAB ćelija u bilo kojoj koncentraciji HER2 TDB (Slika 96D).
Vrlo niska ciljana popunjenost dovoljna je za TDB aktivnosti
[0297] Zatim je HER2 popunjenost na EC50 za HER2 TDB izračunata pomoću formule [D]/[D] KD(gde je D = lek i KDza HER2 TDB iznosi 5,4 nM). Prethodno je prijavljen broj kopije HER2 (Aguilar i dr. Oncogene. 18: 6050-6062, 1999). EC50 vrednosti su izračunate iz podataka o odgovoru na dozu na Slici 97B. Slika 96E pokazuje da je u svim testiranim ćelijskim linijama manje od 1% ciljane popunjenosti bilo dovoljno za efikasno ubijanje. U slučaju visoko HER2 eksprimirajućih ćelijskih linija, tražena popunjenost je bila još niža (0,01-0,05%). Izračunati apsolutni broj HER2 TDB vezanih za HER2 na EC50 iznosio je samo 10-150 u ćelijama sa niskim eksprimiranjem. Ovi rezultati pokazuju ekstremnu potenciju HER2 TDB i u skladu su sa studijama aktiviranja TCR, koje sugerišu da treba aktivirati samo 1-25 TCR kako bi se pokrenuli odgovori T ćelija (Irvine i dr. Nature. 419: 845-849, 2002; Purbhoo i dr. Nature Immunology. 5: 524-530, 2004; Sykulev i dr. Immunity. 4: 565-571, 1996). Potencija HER2 TDB bila je konstantno u niskom pikomolarnom do femtomolarnom rasponu. Štaviše, samo 10-500 HER2-vezanih TDB bilo je dovoljno da indukuje značajna in vitro citotoksičnost. Svega ~1000 primeraka HER2 na plazma membrani bilo je dovoljno da izazove ubijanje. Ove studije su takođe pokazale povezanost između ciljanih nivoa eksprimiranja i in vitro osetljivosti na HER2 TDB.
HER2 TDB je efikasan u uništavanju HER2 ćelija raka refraktornih za anti-HER2 terapiju
[0298] Dalje, pregledane su ćelijske linije za koje je prethodno pokazano da eksprimiraju visoke nivoe HER2, ali su neosetljive na direktne ćelijske efekte trastuzumaba i lapatiniba in vitro (Junttila i dr., Cancer Cell, 15:429-40, 2009; Junttila i dr. Breast Cancer Res Treat, 2010). Za neke ćelijske linije aktiviranje PI3K puta usled stečenih aktivirajućih mutacija u katalitičkoj podjedinici PI3K (KPL4, HCC202) ili gubitkom PTEN (HCC1596) može izazvati rezistenciju. Panel sa šest ćelijskih linija (5 dojki, 1 pluća) testiran je na oslobađanje LDH kao meru citotoksičnosti u prisustvu efektorskih PBMC u odnosu 10:1 i HER2 TDB tokom 19 sati. EC50 za HER2 TDB posredovano ubijanje bio je u femtomolarnom ili niskom pikomolarnom rasponu (Slika 97A). Roditeljski i T-DM1 rezistentni klonovi BT474-M1 tretirani su sa T-DM1 tokom 3 dana. U ovom trenutku, vitalnost ćelija je merena korišćenjem CELLTITERGLO® (Slika 97B). Osetljivost ćelijskih linija na T-DM1 je ranije prijavljena (Junttila i dr. Breast Cancer Res Treat. 2010; Lewis Phillips i dr. Cancer Research. 68: 9280-9290, 2008). Poređenja radi, roditeljski i T-DM1 rezistentni klonovi BT474-M1 tretirani su sa HER2 TDB u prisustvu efektorskih CD8+ T ćelija u odnosu 3:1 tokom 24 sata. Citotoksičnost je detektovana pomoću FACS testa (Slika 97C). Pored toga, HER2 TDB je bio efikasan pri ubijanju HER2+ ćelija raka pluća. Koristeći dva nezavisna modela ćelijskih linija KPL4 i BT474 (Slika 97B-97C), stečena rezistencija na T-DM1 nije uticala na osetljivost na HER2 TDB.
[0299] Regrutovanje aktivnosti ubijanja T ćelija pomoću HER2 TDB zavisi od HER2 eksprimiranja, ali nezavisno od HER2 signalnog puta, što sugeriše da HER2 TDB može biti efikasan u tretmanu tumora koji su refraktorni prema trenutnim anti-HER2 terapijama. U skladu sa tim, podaci su pokazali jednaku aktivnost u tretmanu više ćelijskih linija rezistentnih na trastuzumab/lapatinib u poređenju sa osetljivim ćelijama. Rezistencija u tim ćelijama stvara se različitim mehanizmima koji utiču na HER2 put. Ovdje prikazani podaci sugerišu da prelazak na alternativni mehanizam delovanja pomoću HER2 TDB može široko omogućiti prevazilaženje rezistencije na antitelo-lek konjugate(npr. T-DM1), ciljane inhibitore malih molekula (npr. Lapatinib) i terapijska monoklonska antitela koja blokiraju signalizaciju put (npr. trastuzumab).
Farmakokinetika HER2 TDB kod pacova
[0300] Za procenu farmakokinetičkog (PK) profila HER2 TDB, korišćeni su Sprague-Dawley pacovi. Životinje su razdvojene u naredne dve grupe: Grupa 1: HER2 TDB (10 mg/kg, jedna IV, n=4); Grupa 2: trastuzumab (10 mg/kg, jedna IV, n=4). Uzorci su uzeti od 4 pacova po grupi u vremenskim tačkama kroz 35 dana nakon doze. Otprilike 0,2 ml cele krvi prikupljeno je kroz jugularnu venu (pod CO2/O2anestezijom). Uzorci su ostavljeni da se zgrušaju i centrifugiraju pod hlađenjem (5°C tokom 10 minuta pri 2000 k g) kako bi se dobio serum. Uzorci seruma su testirani na ljudski IgG pomoću ELISA, gde je mikrotiterska ploča premazana magarećim anti-huFc korišćena za hvatanje humanizovanih anti HER2 antitela u cirkulaciji, i kozje anti-huFc-HRP (mišji adsorbovani) za detektovanje. PK parametri su određeni postupkom sa 2 odeljka (Model 7) korišćenjem WINNONLIN®, verzija 5.2.1 (Pharsight Corp., Mountain View, CA). HER2 TDB ne reaguje unakrsno sa pacovskim CD3 ili pacovskim HER2, i pokazuje dvofaznu dispoziciju tipičnu za IgGl sa kratkom fazom raspodele i sporom fazom eliminacije (Slika 98). I klirens i polu-život HER2 TDB bili su slični trastuzumabu i unutar očekivanog raspona tipičnog IgG1 kod pacova.
HER2 TDB inhibira rast tumora in vivo kod imunokompromitovanih miševa
[0301] In vivo efikasnost HER2 TDB testirana je kod NOD-SCID miševa, koji nemaju endogene funkcionalne T i B ćelije i imaju smanjene nivoe NK, DC i makrofagnih tipova ćelija. U ovom eksperimentu, NOD/SCID miševi (NOD.CB17-Prkdcscid/ J, Jackson Labs West) implantirani su sa 0,36 mg pločama estrogena sa produženim 60-dnevnim oslobađanjem (Innovative Research of America) 1 do 3 dana pre inokulacije ćelija, subkutano preko suprotnog boka od inokulacije tumora. Na Dana 0, 5 × 10<6>MCF7-neo/HER2 ćelija injektirane su same ili zajedno sa 10 × 10<6>nestimulisanih ljudskih PBMC od jednog od dva zdrava donora (PBMC 1,2) u HBSS-matrigelu, u desnom 2/3 jastučetu za mlečne masti. Inokulirani miševi su podeljeni u narednih pet grupa: Grupa 1: Nosač (kontrolni TDB, 0,5 mg/kg, qwk x 3, IV, počevši od dana 0, n=5-10); Grupa 2: PBMC (1) (PBMC (1) kontrolni TDB, 0,5 mg/kg, qwk x 3, IV, počevši od dana 0, n=5-10); Grupa 3: PBMC (1) HER2 TDB (PBMC (1) HER2 TDB, 0,5 mg/kg, qwk x 3, IV, počevši od dana 0, n=5-10); Grupa 4: PBMC (2) (PBMC (2) kontrolni TDB, 0,5 mg/kg, qwk x 3, IV, počevši od dana 0, n=5-10); i grupa 5: PBMC (2) HER2 TDB (PBMC (2) HER2 TDB, 0,5 mg/kg, qwk x 3, IV, počevši od dana 0, n=5-10). Prvi tretmani su primenjeni 2 sata nakon inokulacije. Količine tumora od pojedinačnih miševa i odgovarajuće količine tumora tretiranih grupa prikazane su na Slici 99A, gde je HER2 TDB sprečio rast tumora koji eksprimiraju HER2.
[0302] Zavisnost od HER2 TDB kod ljudskih PBMC dalje je testirana na sličnom modelu miševa sa kompromitovanim imunim sistemom. Opet, 5 × 10<6>MCF7-neo/HER2 ćelija injektirane su same ili zajedno sa 10 × 106 nestimulisanih ljudskih PBMC od zdravog donora (PBMC 3) u HBSS-matrigelu u desnom 2/3 jastučetu za mlečne masti, i prvi tretmani su primenjeni 2 sata nakon inokulacije. Na Slici 100A, inokulirani miševi su podeljeni u naredne dve grupe: Grupa 1: netretirani (n = 7); Grupa 2: HER2 TDB (HER2 TDB, 0,5 mg/kg, qwk x 3, IV, počevši od dana 0, n=7). Na Slici 100B, inokulirani miševi su podeljeni u naredne tri grupe: Grupa 1: netretirani (n = 7); Grupa 2: PBMC(3) (PBMC(3) nosač, 0,5 mg/kg, qwk x 3, IV, počevši od dana 0, n=7); Grupa 3: PBMC(3) kontrolni TDB (PBMC(3) kontrola TDB-2C11, 0,5 mg/kg, qwk x 3, IV, počevši od dana 0, n=7). Merenja zapremina tumora koja su usledila ne pokazuju uticaj na rast tumora kod kontrolnih životinja tretiranih sa TDB.
HER2 TDB uzrokuje regresiju velikih tumora dojke kod huHER2 transgenih miševa
[0303] Za modeliranje aktivnosti HER2 TDB kod imuno-kompetentnih miševa korišćeni su ljudski MMTV-huHER2 transgeni miševi (Finkle i dr. Clinical Cancer Research. 10: 2499-2511; 2004), i surogat HER2 TDB koji sadrži reaktivni antitelo klon 2C11 mišjeg IgG2A CD3 (Leo i dr. Proc Natl Acad Sci USA. 84: 1374-1378, 1987) je generisan kako bi se izbegao imuni odgovor prema TDB. Za eksprimiranje kao muIgG2a, ekvivalentne čvor-u-otvoru mutacije (Atwell i dr. J Mol Biol.270: 26-35, 1997) uvedenie su u Fc region, kao i D265A i N297G (EU numeracija) radi ukidanja efektorske funkcije. U muIgG2a HER2 TDB, „čvor“ krak je mišji anti-HER2 hu4D5, i „otvor“ je ili himerni anti-mišji CD3 2C11 (Leo i dr. Proc Natl Acad Sci USA. 84: 1374-1378, 1987) (TDB 2C11/hu4D5) ili mišji anti-hu CD3 SP34 (Pessano i dr. The EMBO Journal. 4: 337-344, 1985) (TDB SP34/hu4D5). mulgG2a bispecifična antitela na su eksprimirana u CHO ćelijama i sastavljena in vitro. Bispecifična antitela su prečišćena od kontaminanata hidrofobnom interakcionom hromatografijom (HIC) kao što je opisano drugde (Speiss i dr. Nat Biotechnology. 31: 753-758, 2013). Dobijeni materijal je analiziran na nivo endotoksina korišćenjem prenosnog sistema za testiranje ENDOSAFE® (Charles River, USA), i po potrebi je sadržaj endotoksina smanjen ispiranjem proteina sa 0,1% TRITON™ X-114. In vitro aktivnost hu4D5/2C11-TDB bila je slična ljudskom CD3 reaktivnom HER2 TDB (Slika 101).
[0304] Na Slikama 99B-99D, transgene životinje MMTV-huHER2 sa utvrđenim tumorima dojke podeljene su u naredne dve grupe: Grupa 1: nosač (0,5 mg/kg, qwk x 5, IV, počevši od dana 0, n=7); i grupa 2: HER2 TDB (HER2 TDB (2C11/hu4D5), 0,5 mg/kg, qwk x 5, IV, počevši od dana 0, n=7). Slika 99B pokazuje da je regresija otkrivena kod 57% miševa, i 43% miševa nije imalo primetan tumor nakon tretmana. Slika 99C pokazuje da je HER2 TDB (2C11/hu4D5) rezultovao sa više od 50% regresije tumora, sa izuzetkom jednog tumora. Ispitivači su uključivali tumore >1000 mm<3>na početku tretmana kao što je prikazano na Slici 99D. U sličnom eksperimentu korišćena su dva kontrolna TDB gde je jedan CD3-krak kontrolni TDB, jedan sa mišje-specifičnim CD3-krakom prebačenim na ljudski-specifičan CD3 krak (HER2 TDB (SP34/hu4D5)), i jedan je kontrolni TDB, onaj koji ima isti CD3-krak kao HER2 TDB (2C11/hu4D5), ali ima irelevantni ciljani krak (CTRL TDB-2C11). Na Slici 99E, transgene životinje MMTV-huHER2 sa utvrđenim tumorima dojke podeljene su u naredne dve grupe: Grupa 1: CD3-krak kontrolni TDB(HER2 TDB (SP34/hu4D5), 0,5 mg/kg, qwk x 5, IV, počevši od dana 0, n=5); i Grupa 2: kontrolni TDB (kontrolni TDB-2C11, 0,5 mg/kg, qwk x 5, IV, počevši od dana 0, n=5). Na porast MMTV-huHER2 transgenih tumora nije uticao kontrolni TDB.
[0305] HER2 TDB je je testiran za in vivo efikasnost kod huCD3 transgenih miševa. Ljudski CD3ε transgeni miševi prethodno su opisani ((huCD3 transgeni), de la Hera i dr. J Exp Med. 173: 7-17, 1991). U ovom ispitivanju, 0,1 miliona CT26-HER2 ćelija ubrizgano je subkutano u huCD3 transgene miševe. Jednom kada su ustanovljeni CT26-HER2 tumori, životinje su podeljene u naredne dve grupe: Grupa 1: nosač (0,5 mg/kg, qwk x 3, IV, počevši od dana 0, n=7); Grupa 2: HER2 TDB (HER2 TDB (SP34/hu4D5), 0,5 mg/kg, qwk x 3, IV, počevši od dana 0, n=7). HER2 TDB inhibira rast ustaljenih tumora, ali efekat je bio prolazan i nisu primećeni potpuni odgovori (Slika 99F). Studija je pokazala potenciju in vivo aktivnost HER2 TDB, uključujući dramatične odgovore kod MMTV-huHER2 transgenih miševa.
[0306] U sličnom eksperimentu, in vivo efikasnost mišjeg reaktivnog HER2 TDB (2C11/hu4D5) testirana je na Balb/c miševima. Ponovo su ustanovljeni singenski tumori kod Balb/c miševa subkutanom injekcijom 1x10<5>CT26-HER2 ćelija. Životinje koje su nosile tumore podeljene su u jednu od naredne četiri grupe: Grupa 1: nosač (0,5 mg/kg, qwk x 3, IV, počevši od dana 0, n=10); Grupa 2: HER2 TDB (HER2 TDB (2C11/hu4D5), 0,5 mg/kg, qwk x 3, IV, počevši od dana 0, n=10); Grupa 3: kontrolni TDB (CTRL TDB (2C11/hu4D5), 0,5 mg/kg, qwk x 3, IV, počevši od dana 0, n=10); i grupa 4: TDM-1 (TDM-1, 15 mg/kg, qwk x 3, IV, počevši od dana 0, n=10). Slika 99G pokazuje da je, uprkos nepotpunim odgovorima, HER2 TDB značajno produžio vreme do progresije tumora (Log-Rank p-vrednost <0,0001). Suprotno tome, kontrolni TDB sa irelevantnim tumorskim krakom nije imao uticaja na rast tumora. Pored toga, tumori nisu bili osetljivi na TDM-1.
HER2 TDB inhibira rast ustanovljenih tumora kod imunokompetentnih miševa
[0307] Ljudski CD3ε transgeni miševi (de la Hera i dr. J Exp Med. 173: 7-17, 1991) korišćeni su za modeliranje HER2 TDB aktivnosti kod imunokompetentnih miševa. U ovom eksperimentu, huCD3 transgene T ćelije su ekstrahovane iz slezine huCD3 transgenih i BALB/c miševa ili iz periferne krvi zdravih ljudskih donora. Ćelije su obojene mišjim ili ljudskim CD8 i ljudskim CD3 (klon UCHT1) na Slici 101A ili mišjim CD3 (klon 2C11) na Slici 101B. CD8+ ćelije detektovane su protočnom citometrijom. Slika 101A prikazuje huCD3 transgene T ćelije koje eksprimiraju ljudski CD3 na približno 50% nivoa ljudskih T ćelija, i Slika 101B prikazuje huCD3 transgene T ćelije koje eksprimiraju mišje CD3 na približno 50% nivoa BALB/c miševa.
[0308] Zatim, huCD3 transgene T ćelije ispitivane su za svoju sposobnost da in vitro ubiju ljudske CT26 ciljane ćelije koje eksprimiraju HER2. U ovom ispitivanju, T ćelije su ekstrahovane iz slezine huCD3 transgenih miševa, BALB/c miševa ili iz periferne krvi od zdravih ljudskih donora. In vitro aktivnost ubijanja CT26-HER2 ćelija testirana je korišćenjem ljudskog CD3-specifičnog HER2 TDB (UCHT1v9/hu4D5) na Slici 102A ili mišjeg CD3-specifičnog HER2 TDB (2C11/hu4D5) na Slici 102B. Efektorske T ćelije su dodate u odnosu 20:1 ciljanim ćelijama u prisustvu označenih HER2 TDB tokom 40 sati. In vitro citotoksičnost je praćena protočnom citometrijom. Iako je aktivnost ubijanja mišjih T ćelija slezine (EC50 = 2,4 ng/ml) bila dosledno niža u poređenju sa perifernim T ćelijama ljudi (EC50 = 0,4 ng/ml), huCD3 transgene T ćelije su ubile ciljane ćelije koje eksprimiraju ljudski HER2 in vitro, kao što se vidi na Slici 102A. Mišje-specifični HER2 TDB (2C11/hu4D5) indukovao je ubijanje ciljane ćelije od strane T ćelija i od huCD3 transgenih (EC50 = 11 ng/ml) i BALB/c (EC50 = 10 ng/ml) miševa, kao što je prikazano na Slici 102B.
[0309] T ćelijska zavisnost antitumorske aktivnosti HER2 TDB je dalje ispitana u modelu singenskog tumora. Kao što je opisano iznad, 1 × 10<5>Ćelije CT26-HER2 su primenjene injekcijom potkožno u BALB/c miševe. Miševi sa utvrđenim tumorima podeljeni su u jednu od naredne dve grupe: Grupa 1: Nosač (n = 10); Grupa 2: HER2 TDB (SP34/hu4D5) (HER2 TDB (SP34/hu4D5), 0,5 mg/kg, qwx3, IV, n=10). Slika 103 pokazuje da je aktivnost HER2 TDB bila zavisna od T ćelija, pošto HER2 TDB nije imao efekta na nehuCD3 transgene miševe. Ovo ispitivanje pokazalo je da su transgeni miševi huCD3 mogu se koristiti kao novi model efikasnosti za ciljane molekule huCD3.
Primer 6. Generisanje i karakterizacija primernih CD3/LYPD1 TDB (LYPD1 TDB)
[0310] Takođe smo istražili kapacitet TDB antitela da regrutuju citotoksične aktivnosti T ćelija pri iskorenjivanju ćelija tumora prepoznavanjem različitog antigena ćelijske površine, LYPD1. U tom cilju, generisali smo i karakterisali bispecifična anti-CD3 antitela koja imaju anti-CD3 krak i anti-LYPD1 krak (LYPD1 TDB). Kao što je opisano iznad, LYPD1 TDB su proizvedeni kao antitela pune dužine u formatu čvor-u-otvoru kao ljudski IgG1, kao što je prethodno opisano (Atwell i dr. J. Mol. Biol. 270: 26-35, 1997). Polovine antitela su eksprimirane u bilo kojim od E. Coli ili ćelija jajnika kineskog hrčka (CHO), prečišćenih afinitetnom hromatografijom proteina A i odgovarajuće polovine parova antitela su kalemljene in vitro kao što je prethodno opisano (Spiess i dr. Nat. Biotechnol.2013). Ako je proizvodnja antitela za TDB izvedena u CHO ćelijama, antitelo uključuje mutaciju aglikozilacije, na primer, na ostatku N297 (npr., N297G), tako da je TDB antitelo varijanta bez efektora i nije u stanju da pokrene ćelijski posredovanu citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC). Nakon kalemljenja, LYPD1 TDB su prečišćeni hidrofobnom interakcionom hromatografijom (HIC) i karakterisani analitičkom filtracijom gela, masnom spektrometrijom i elektroforezom poliakrilamidnog gela, kao što je opisano iznad. Anti-LYPD1 krak korišćen u stvaranju LYPD1 TDB je bio od anti-LYPD1 antitela YWO.49.H6, koje sadrži (a) VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 272 i (b) VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 273. Anti-CD3 kraci testirani u generisanju LYPD1 TDB uključuju UCHT1v9, 40G5, SP34 i 38E4v1.
[0311] Specifični HER2 TDB ispitivani su na vezivanje za CD8+ T ćelije (CD3 vezivanje), kao i aktivnost, kako je procenjeno in vitro testovima citotoksičnosti i testovima aktivacije T ćelija.
A. Afinitet vezivanja
[0312] Afiniteti vezivanja za svaki od LYPD1 TDB testirani su pomoću FACS analize, kao što je opisano iznad za CD20 TDB. Ukratko, za FACS testove vezivanja, CD8+ T ćelije su 30 minuta inkubirane sa različitim koncentracijama LYPD1 TDB antitela na 4°C, i zatim su ćelije isprane i inkubirane sa drugim antitelom (anti-hulgG-PE; BD Bioscience) još 15 minuta, pre nego što su ćelije ponovo isprane i spremne za FACS analizu. Slika 104 prikazuje rezultate in vitro FACS testova vezivanja LYPD1 TDB. Studije vezivanja pokazale su da LYPD1 TDB koji imaju bilo UCHT1v9 ili 38E4v1 kao svoj anti-CD3 krak pokazuju veći afinitet vezivanja za efektorske ćelije.
B. In vitro testovi ubijanja OVCAR3.Luc ciljanih ćelija i aktiviranja T ćelija
[0313] Generisani LYPD1 TDB takođe su testirani za svoju sposobnost da podrže ubijanje ciljanih ćelija koje eksprimiraju LYPD1 i aktiviraju citotoksični efekat T ćelija. In vitro citotoksičnost je praćena protočnom citometrijom. Ciljane ćelije su označene sa CFSE prema protokolu proizvođača (Invitrogen, #C34554). Karboksifluorescentnim sukcinimidil estrom (CFSE) označene ciljane ćelije i prečišćene CD8+ T ćelije iz ljudskih PBMC su mešane u odnosu 3:1, sa ili bez TDB tokom 48 sati. Ćelije su ponovo suspendovane u jednakoj zapremini PBS 2% FBS 1 mM EDTA propidijum jodid (PI). Analiza protočne citometrije urađena je na FACSCalibur u formatu za automatizaciju. Broj živih ciljanih ćelija se računa brojanjem CFSE /PI negativnih ćelija. Procenat citotoksičnosti izračunat je na naredni način: % citotoksičnosti (broj živih ciljanih ćelija bez TDB - broj živih ciljanih ćelija sa TDB)/(broj živih ciljanih ćelija bez TDB) x 100. Kao što je prikazano na Slici 105, LYPD1 TDB sa UCHT1v9, 38E4v1 ili SP34 za svoj anti-CD3 krak pokazali su robusno in vitro ubijanje OVCAR3.Luc ciljanih ćelije u poređenju sa LYPD1 TDB koji ima 40G5 kao svoj anti-CD3 krak.
[0314] Kada su testirani na aktiviranje T ćelija, Slika 106 pokazuje da su LYPD1 TDB sa 38E4v1 i, u manjoj meri, UCHT1 v9 i SP34, za svoj anti-CD3 krak bili sposobni da snažno indukuju aktivnost T ćelija in vitro, u poređenju sa LYPD1 TDB koja ima 40G5c kao svoj anti-CD3 krak. U tim ispitivanjima, ciljane ćelije i prečišćene CD8+ T ćelije su pomešane u prisustvu ili odsustvu TDB i aktiviranje T ćelija je analizirano protočnom citometrijom. Na kraju inkubacije, ćelije su obojene sa CD8-FITC (BD Bioscience, 555634) CD69-PE (BD Bioscience, 555531) i CD107a-Alexa-Fluor647 (eBioscience, 51-1079). Alternativno, nakon što su površinski obojene sa CD8-FITC i CD69-PE, ćelije su fiksirane i permeabilisane rastvorom Cytofix/CytoPerm (BD Bioscience, 554722) i intracelularno obojene anti-granzimom B-Alexa-Fluor647 (BD Bioscience, 560212). Aktivacija T ćelije procenjena je procentom CD8+ CD69+ i CD8+ CD25+ ćelija.
1
2
4
1
2
4
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
11
11
11
11
11
11
11
12
12
12
12
12
12
12
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
14
14
14
14
14
14
14
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
21
21
21
21
21
21
21
22
22
22
22
22
22
22
2
21
22
�
24
2
2
2
2
2
24

Claims (33)

Patentni zahtevi
1. Anti-CD3 antitelo koje je bispecifično antitelo, gde bispecifično antitelo koje sadrži anti-CD3 krak koji sadrži prvi vezujući domen koji sadrži (a) VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 184 i (b) VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 185, i anti-HER2 krak koji sadrži drugi vezujući domen koji sadrži (a) VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 270 i (b) VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 271.
2. Bispecifično antitelo patentnog zahteva 1, gde se prvi vezujući domen vezuje za ljudski CD3 polipeptid ili CD3 polipeptid cinomolgus majmuna (cino CD3 polipeptid).
3. Bispecifično antitelo prema patentnom zahtevu 2, gde (a) ljudski CD3 polipeptid jeste ljudski CD3ε polipeptid ili ljudski CD3γ polipeptid; ili (b) cino CD3 polipeptid jeste cino CD3ε polipeptid ili cino CD3γ polipeptid.
4. Bispecifično antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1-3, gde bispecifično antitelo sadrži mutaciju mesta aglikozilacije.
5. Bispecifično antitelo prema patentnom zahtevu 4, gde mutacija mesta aglikozilacije (a) predstavlja supstitucionu mutaciju i/ili (b) smanjuje efektorsku funkciju bispecifičnog antitela.
6. Bispecifično antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1-5, gde bispecifično antitelo sadrži supstitucionu mutaciju u Fc regionu koja smanjuje efektorsku funkciju.
7. Bispecifično antitelo prema patentnom zahtevu 5, deo (a), ili patentnom zahtevu 6, gde je supstituciona mutacija na aminokiselinskim ostacima N297, L234, L235 i/ili D265 (EU numeracija).
8. Bispecifično antitelo prema patentnom zahtevu 7, gde je supstituciona mutacija izabrana iz grupe koja se sastoji od N297G, N297A, L234A, L235A i D265A.
9. Bispecifično antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1-8, gde je bispecifično antitelo:
(i) monoklonsko, humanizovano ili himerno;
(ii) antitelo pune dužine; i/ili
(iii) IgG antitelo.
10. Bispecifično antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1-10, gde bispecifično antitelo sadrži prvi CH1 (CH11) domen, prvi CH2 (CH21) domen, prvi CH3 (CH31) domen, drugi CH1 (CH12) domen, drugi CH2 (CH22) domen i drugi CH3 (CH32) domen i gde:
(i) CH31domen je uparen sa CH32domenom, gde CH31i CH32domeni svaki sadrži šupljinu ili ispupčenje CH32domena; gde je šupljina ili ispupčenje u CH31domenu pozicionirana u šupljini ili izbočenju, odnosno u domenu CH32 ; ili
(ii) CH31domen je uparen sa CH32domenom, gde CH21i CH22domen sadrže ispupčenje ili šupljinu, gde se ispupčenje ili šupljina u CH21domena mogu postaviti u šupljinu ili ispupčenje CH22domena.
11. Bispecifično antitelo prema patentnom zahtevu 10, gde bispecifično antitelo sadrži mutaciju mesta aglikozilacije N297G ili N297A i gde anti-CD3 krak sadrži šupljinu, a anti-HER2 krak sadrži izbočenje.
12. Izolovana nukleinska kiselina koja kodira bispecifično antitelo prema bilo kom patentnom zahtevu 1-11.
13. Vektor koji sadrži izolovanu nukleinsku kiselinu prema patentnom zahtevu 12.
14. Ćelija domaćin koja sadrži vektor prema patentnom zahtevu 13.
15. Postupak proizvodnje bispecifičnog antitela prema bilo kom od patentnih zahteva 1-11, gde postupak uključuje kultivaciju ćelije domaćina prema patentnom zahtevu 14 u medijumu za kulturu, i izvlačenje bispecifičnog antitela iz ćelije domaćina ili medijuma za kulturu.
16. Imunokonjugat koji sadrži bispecifično antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1-11 i citotoksični agens.
17. Sastav koji sadrži bispecifično antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1-11 i farmaceutski prihvatljiv nosač, ekscipijens ili razblaživač.
18. Sastav prema patentnom zahtevu 17, gde sastav dalje sadrži antagonist koji vezuje PD-1 osu ili dodatni terapeutski agens.
19. Bispecifično antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1-11, za primenu u postupku terapije u vidu:
(i) tretmana ili odlaganja napredovanja poremećaja proliferacije ćelija kod pacijenta koji ima potrebu za tim, ili
(ii) povećanja imune funkcije kod pacijenta koji ima poremećaj proliferacije ćelija.
20. Bispecifično antitelo za upotrebu prema patentnom zahtevu 19, gde ćelijski proliferativni poremećaj je HER2 pozitivan karcinom.
21. Bispecifično antitelo za upotrebu prema patentnom 20, gde HER2-pozitivni karcinom predstavlja HER2-pozitivan karcinom dojke ili HER2-pozitivan karcinom želuca.
22. Bispecifično antitelo za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 19-21, gde se bispecifično antitelo vezuje za (a) CD3 molekul koji se nalazi na imunoj efektorskoj ćeliji i (b) HER2 molekul smešten na ciljanoj ćeliji koja nije imuna efektorska ćelija.
23. Bispecifično antitelo za upotrebu prema patentnom zahtevu 22, gde bispecifično antitelo aktivira imunu efektorsku ćeliju posle vezivanja za (a) i (b).
24. Bispecifično antitelo za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 19-23, gde je bispecifično antitelo formulisano za primenu pacijentu:
(i) u dozi od 0,01 mg/kg do 10 mg/kg, 0,1 mg/kg do 10 mg/kg, ili 1 mg/kg; ili
(ii) u kombinaciji sa primenom antagonista koji vezuje PD-1 osu i/ili dodatnog terapeutskog agensa.
25. Bispecifično antitelo za upotrebu prema patentnom zahtevu 24, deo (ii), gde je antagonist koji vezuje PD-1 osu izabran iz grupe koja se sastoji od antagonista koji vezuje PD-1, antagonista koji vezuje PD-L1 i antagonista koji vezuje PD-L2.
26. Bispecifično antitelo za upotrebu prema patentnom zahtevu 24, deo (ii), gde je antagonist koji vezuje PD-1 osu:
(i) antagonist koji vezuje PD-1 izabran iz grupe koja se sastoji od MDX-1106 (nivolumab), MK-3475 (lambrolizumab) i AMP-224;
(ii) antagonist koji vezuje PD-L1 izabran iz grupe koja se sastoji od MPDL3280A, YW243.55.S70, MDX-1105 i MEDI4736; ili
(iii) antagonist koji vezuje PD-L2, gde je antagonist koji vezuje PD-L2 antitelo ili imunoadhezin.
27. Bispecifično antitelo za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 19-26, gde je bispecifično antitelo formulisano za primenu u kombinaciji sa primenom glukokortikoida ili antitelo-lek konjugata (ADC).
28. Bispecifično antitelo za upotrebu u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 19-27, gde je bispecifično antitelo formulisano za zajedničku primenu sa jednim ili više dodatnih terapeutskih agenasa koji ciljaju HER put.
29. Bispecifično antitelo za upotrebu prema patentnom zahtevu 28, gde je jedan ili više dodatnih terapeutskih agenasa izabran između trastuzumaba, T-DM1 i pertuzumaba.
30. Bispecifično antitelo za upotrebu prema patentnom zahtevu 29, gde je dodatno terapeutsko sredstvo trastuzumab.
31. Bispecifično antitelo za upotrebu prema bilo kom patentnom zahtevu 19-30, gde je bispecifično antitelo formulisano za primenu pacijentu subkutano, intravenski, intramuskularno, topikalno, oralno, transdermalno, intraperitonealno, intraorbitalno, implantacijom, inhalacijom, intratekularno, intraventrikularno ili intranazalno.
32. Bispecifično antitelo za upotrebu prema bilo kom patentnom zahtevu 19-31, gde je pacijent čovek.
33. Komplet koji sadrži:
(a) sastav prema patentnom zahtevu 17 ili 18; i
(b) umetak u pakovanju koji sadrži uputstva za primenu sastava pacijentu radi tretmana ili odlaganja progresije poremećaja proliferacije ćelija, poželjno HER2-pozitivnog karcinoma, i još poželjnije HER2-pozitivnog karcinoma dojke ili HER2-pozitivnog karcinoma želuca.
24
RS20200791A 2013-12-17 2014-12-17 Anti-cd3 antitela i postupci upotrebe RS60453B1 (sr)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361917346P 2013-12-17 2013-12-17
US201461949950P 2014-03-07 2014-03-07
US201462026594P 2014-07-18 2014-07-18
US201462053582P 2014-09-22 2014-09-22
US201462091441P 2014-12-12 2014-12-12
EP17156352.1A EP3192812B1 (en) 2013-12-17 2014-12-17 Anti-cd3 antibodies and methods of use

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS60453B1 true RS60453B1 (sr) 2020-07-31

Family

ID=52394341

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20200773A RS60443B1 (sr) 2013-12-17 2014-12-17 Anti-cd3 antitela i postupci upotrebe
RS20240770A RS65715B1 (sr) 2013-12-17 2014-12-17 Anti-cd3 antitela i postupci primene
RS20200791A RS60453B1 (sr) 2013-12-17 2014-12-17 Anti-cd3 antitela i postupci upotrebe

Family Applications Before (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20200773A RS60443B1 (sr) 2013-12-17 2014-12-17 Anti-cd3 antitela i postupci upotrebe
RS20240770A RS65715B1 (sr) 2013-12-17 2014-12-17 Anti-cd3 antitela i postupci primene

Country Status (34)

Country Link
US (7) US10174124B2 (sr)
EP (4) EP4410315A3 (sr)
JP (7) JP6449295B2 (sr)
KR (6) KR102433591B1 (sr)
CN (4) CN112390883A (sr)
AU (4) AU2014364805B2 (sr)
BR (3) BR122021025087B1 (sr)
CA (3) CA3055708C (sr)
CL (1) CL2016001556A1 (sr)
CR (1) CR20160314A (sr)
DK (3) DK3083689T3 (sr)
EA (1) EA038933B1 (sr)
ES (3) ES2813074T3 (sr)
FI (1) FI3736292T3 (sr)
FR (1) FR22C1048I2 (sr)
HR (3) HRP20240939T1 (sr)
HU (4) HUE050156T2 (sr)
IL (3) IL263466B2 (sr)
LT (4) LT3736292T (sr)
MX (2) MX379030B (sr)
NL (1) NL301194I2 (sr)
NO (1) NO2022037I1 (sr)
NZ (1) NZ721309A (sr)
PE (3) PE20210648A1 (sr)
PH (1) PH12016501186A1 (sr)
PL (3) PL3736292T3 (sr)
PT (3) PT3192812T (sr)
RS (3) RS60443B1 (sr)
SG (3) SG10201809385RA (sr)
SI (3) SI3083689T1 (sr)
TW (3) TWI747385B (sr)
UA (2) UA120753C2 (sr)
WO (1) WO2015095392A1 (sr)
ZA (2) ZA201603755B (sr)

Families Citing this family (274)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI807362B (zh) 2010-11-30 2023-07-01 日商中外製藥股份有限公司 細胞傷害誘導治療劑
MX356947B (es) 2011-08-23 2018-06-20 Roche Glycart Ag Anticuerpos bioespecíficos específicos para antígenos que activan células t y un antígeno tumoral y métodos de uso.
US12466897B2 (en) 2011-10-10 2025-11-11 Xencor, Inc. Heterodimeric human IgG1 polypeptides with isoelectric point modifications
US10851178B2 (en) 2011-10-10 2020-12-01 Xencor, Inc. Heterodimeric human IgG1 polypeptides with isoelectric point modifications
ES2702315T3 (es) 2012-08-24 2019-02-28 Univ California Anticuerpos y vacunas para su uso en tratar cánceres ROR1 e inhibir metástasis
JOP20200236A1 (ar) 2012-09-21 2017-06-16 Regeneron Pharma الأجسام المضادة لمضاد cd3 وجزيئات ربط الأنتيجين ثنائية التحديد التي تربط cd3 وcd20 واستخداماتها
US10087250B2 (en) 2012-10-08 2018-10-02 Roche Glycart Ag Fc-free antibodies comprising two fab-fragments and methods of use
CA2898100C (en) 2013-01-14 2023-10-10 Xencor, Inc. Novel heterodimeric proteins
US10968276B2 (en) 2013-03-12 2021-04-06 Xencor, Inc. Optimized anti-CD3 variable regions
US11053316B2 (en) 2013-01-14 2021-07-06 Xencor, Inc. Optimized antibody variable regions
US9605084B2 (en) 2013-03-15 2017-03-28 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US10487155B2 (en) 2013-01-14 2019-11-26 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
TWI682941B (zh) 2013-02-01 2020-01-21 美商再生元醫藥公司 含嵌合恆定區之抗體
AU2014222779B2 (en) 2013-02-26 2018-08-30 Roche Glycart Ag Bispecific T cell activating antigen binding molecules
MX2015010350A (es) 2013-02-26 2015-10-29 Roche Glycart Ag Moleculas de union a antigeno biespecificas que activan la celula t.
CA2902026C (en) * 2013-03-13 2023-08-29 Prothena Biosciences Limited Tau immunotherapy
WO2014153164A1 (en) 2013-03-14 2014-09-25 The California Institute For Biomedical Research Targeting agent antibody conjugates and uses thereof
EP3421495A3 (en) 2013-03-15 2019-05-15 Xencor, Inc. Modulation of t cells with bispecific antibodies and fc fusions
US10519242B2 (en) 2013-03-15 2019-12-31 Xencor, Inc. Targeting regulatory T cells with heterodimeric proteins
US10858417B2 (en) 2013-03-15 2020-12-08 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
UY35468A (es) 2013-03-16 2014-10-31 Novartis Ag Tratamiento de cáncer utilizando un receptor quimérico de antígeno anti-cd19
AR096687A1 (es) 2013-06-24 2016-01-27 Genentech Inc Anticuerpos anti-fcrh5
ES2776706T3 (es) * 2013-07-05 2020-07-31 Genmab As Anticuerpos contra CD3 humanizados o quiméricos
CN112390883A (zh) 2013-12-17 2021-02-23 基因泰克公司 抗cd3抗体及使用方法
MX2016008098A (es) 2013-12-20 2017-01-11 Hoffmann La Roche Anticuerpos biespecificos del receptor 2 de factor de crecimiento ipidermico himano (her2) y metodo de uso.
TWI681969B (zh) 2014-01-23 2020-01-11 美商再生元醫藥公司 針對ｐｄ-１的人類抗體
TWI680138B (zh) 2014-01-23 2019-12-21 美商再生元醫藥公司 抗ｐｄ-ｌ１之人類抗體
US10618963B2 (en) 2014-03-12 2020-04-14 Yeda Research And Development Co. Ltd Reducing systemic regulatory T cell levels or activity for treatment of disease and injury of the CNS
US9394365B1 (en) 2014-03-12 2016-07-19 Yeda Research And Development Co., Ltd Reducing systemic regulatory T cell levels or activity for treatment of alzheimer's disease
CN114081946A (zh) 2014-03-12 2022-02-25 耶达研究与开发有限公司 降低系统性调节性t细胞水平或活性来治疗cns疾病和损伤
US10519237B2 (en) 2014-03-12 2019-12-31 Yeda Research And Development Co. Ltd Reducing systemic regulatory T cell levels or activity for treatment of disease and injury of the CNS
TWI754319B (zh) * 2014-03-19 2022-02-01 美商再生元醫藥公司 用於腫瘤治療之方法及抗體組成物
JP2017510577A (ja) * 2014-03-26 2017-04-13 フラウンホーファ−ゲゼルシャフト ツァー フォルデルング デア アンゲバンデン フォルシュンク エー． ファオ．Ｆｒａｕｎｈｏｆｅｒ−Ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ Ｚｕｒ Ｆｏｒｄｅｒｕｎｇ Ｄｅｒ Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅｎ Ｆｏｒｓｃｈｕｎｇ Ｅ． Ｖ． 抗ＴＮＦ−α抗体療法の賦活剤としてのＣＤ６４ブロック剤の使用法
MX385936B (es) 2014-03-28 2025-03-11 Xencor Inc Anticuerpos biespecíficos que se unen a cd38 y cd3.
MX380176B (es) * 2014-04-07 2025-03-12 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Molecula ligada a antigeno inmunoactivada.
LT3129470T (lt) * 2014-04-07 2021-07-12 Novartis Ag Vėžio gydymas naudojant anti-cd19 chimerinį antigeno receptorių
CN106459954A (zh) 2014-05-13 2017-02-22 中外制药株式会社 用于具有免疫抑制功能的细胞的t细胞重定向的抗原结合分子
EP3936145A1 (en) * 2014-07-31 2022-01-12 The University Of Western Australia A method for the identification of immunotherapy-drug combinations using a network approach
MA40510A (fr) 2014-08-04 2017-06-14 Hoffmann La Roche Molécules bispécifiques de liaison à l'antigène activant les lymphocytes t
WO2016019969A1 (en) 2014-08-08 2016-02-11 Ludwig-Maximilians-Universität München Subcutaneously administered bispecific antibodies for use in the treatment of cancer
CR20170095A (es) 2014-09-12 2017-07-19 Genentech Inc Anticuerpos anti-cll-1 e inmunoconjugados referencias recíprocas con solicitudes relacionadas
US9616114B1 (en) 2014-09-18 2017-04-11 David Gordon Bermudes Modified bacteria having improved pharmacokinetics and tumor colonization enhancing antitumor activity
EP3699198B1 (en) * 2014-11-17 2025-03-26 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for tumor treatment using cd3xcd20 bispecific antibody
ES2926673T3 (es) 2014-11-20 2022-10-27 Hoffmann La Roche Politerapia de moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T y antagonistas de la unión al eje de PD-1
RS60615B1 (sr) 2014-11-20 2020-08-31 Hoffmann La Roche Zajednički laki lanci i postupci upotrebe
SG11201702976TA (en) 2014-11-20 2017-05-30 Hoffmann La Roche T cell activating bispecific antigen binding molecules agiant folr1 and cd3
US10259887B2 (en) 2014-11-26 2019-04-16 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind CD3 and tumor antigens
HRP20211273T1 (hr) 2014-11-26 2021-11-12 Xencor, Inc. Heterodimerna protutijela koja vežu cd3 i cd20
MX2017006918A (es) 2014-11-26 2018-01-25 Xencor Inc Anticuerpos heterodimericos que se unen a cd3 y cd38.
SG11201704449VA (en) 2014-12-05 2017-06-29 Genentech Inc ANTI-CD79b ANTIBODIES AND METHODS OF USE
EP3237449A2 (en) 2014-12-22 2017-11-01 Xencor, Inc. Trispecific antibodies
WO2016110576A1 (en) * 2015-01-08 2016-07-14 Genmab A/S Bispecific antibodies against cd3 and cd20
WO2016141387A1 (en) 2015-03-05 2016-09-09 Xencor, Inc. Modulation of t cells with bispecific antibodies and fc fusions
DK3277725T3 (da) 2015-03-30 2021-01-11 Regeneron Pharma Konstante tungkædeområder med reduceret binding til FC-gammareceptorer
HRP20220893T1 (hr) 2015-04-08 2022-10-14 Novartis Ag Cd20 terapije, cd22 terapije, i kombinirane terapije sa stanicom koja eksprimira cd19 kimerni antigenski receptor
MX2017013297A (es) * 2015-04-13 2018-06-19 Pfizer Anticuerpos terapeuticos y sus usos.
EP3778640A1 (en) 2015-05-01 2021-02-17 Genentech, Inc. Masked anti-cd3 antibodies and methods of use
US10676723B2 (en) 2015-05-11 2020-06-09 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
EP3310814B1 (en) * 2015-06-16 2023-08-02 F. Hoffmann-La Roche AG Humanized and affinity matured antibodies to fcrh5 and methods of use
WO2016204966A1 (en) 2015-06-16 2016-12-22 Genentech, Inc. Anti-cd3 antibodies and methods of use
CN107847568B (zh) 2015-06-16 2022-12-20 豪夫迈·罗氏有限公司 抗cll-1抗体和使用方法
KR20180012859A (ko) 2015-06-17 2018-02-06 제넨테크, 인크. 항-her2 항체 및 이용 방법
IL302486A (en) 2015-06-24 2023-06-01 Hoffmann La Roche Antibodies against the transnephrine receptor with adapted affinity
JP6837436B2 (ja) * 2015-07-10 2021-03-03 中外製薬株式会社 内因性ｃｄ３遺伝子をヒトｃｄ３遺伝子に置換した非ヒト動物
BR112018000768A2 (pt) 2015-07-13 2018-09-25 Cytomx Therapeutics Inc anticorpos anti-pd-1, anticorpos anti-pd-1 ativáveis e métodos de uso dos mesmos
TWI717375B (zh) * 2015-07-31 2021-02-01 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Ｃｄ７０及ｃｄ３抗體構築體
TWI744242B (zh) 2015-07-31 2021-11-01 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Egfrviii及cd3抗體構築體
TWI829617B (zh) 2015-07-31 2024-01-21 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Ｆｌｔ３及ｃｄ３抗體構築體
EA039859B1 (ru) 2015-07-31 2022-03-21 Эмджен Рисерч (Мюник) Гмбх Биспецифические конструкты антител, связывающие egfrviii и cd3
TWI796283B (zh) 2015-07-31 2023-03-21 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Ｍｓｌｎ及ｃｄ３抗體構築體
AR106188A1 (es) 2015-10-01 2017-12-20 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-cd19 humano humanizados y métodos de utilización
AR106189A1 (es) 2015-10-02 2017-12-20 Hoffmann La Roche ANTICUERPOS BIESPECÍFICOS CONTRA EL A-b HUMANO Y EL RECEPTOR DE TRANSFERRINA HUMANO Y MÉTODOS DE USO
CN114057885A (zh) 2015-10-02 2022-02-18 豪夫迈·罗氏有限公司 双特异性抗人cd20/人转铁蛋白受体抗体及使用方法
KR20180073561A (ko) 2015-10-02 2018-07-02 에프. 호프만-라 로슈 아게 이중특이적 항-ceaxcd3 t 세포 활성화 항원 결합 분자
US11660340B2 (en) 2015-11-18 2023-05-30 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Combination therapy using T cell redirection antigen binding molecule against cell having immunosuppressing function
EP3378488A4 (en) * 2015-11-18 2019-10-30 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha METHOD FOR IMPROVING THE HUMORAL IMMUNE REACTION
JP7058219B2 (ja) 2015-12-07 2022-04-21 ゼンコア インコーポレイテッド Ｃｄ３及びｐｓｍａに結合するヘテロ二量体抗体
KR102850929B1 (ko) 2015-12-09 2025-08-27 에프. 호프만-라 로슈 아게 항-약물 항체의 형성을 감소시키기 위한 ii형 항-cd20 항체
US10954301B2 (en) 2015-12-14 2021-03-23 Macrogenics, Inc. Bispecific molecules having immunoreactivity with PD-1 and CTLA-4, and methods of use thereof
HRP20231156T1 (hr) 2015-12-22 2024-01-05 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Kombinacija anti-pd-1 antitijela i bispecifičnih anti-cd20/anti-cd3 antitijela za liječenje raka
KR20180097615A (ko) 2016-01-08 2018-08-31 에프. 호프만-라 로슈 아게 Pd-1 축 결합 길항물질 및 항-cea/항-cd3 이중특이성 항체를 사용하는 cea-양성 암의 치료 방법
CN113817060B (zh) * 2016-01-09 2024-03-08 嘉立医疗科技(广州)有限公司 用于癌症治疗的钙粘蛋白-17特异性抗体和细胞毒性细胞
IL260920B (en) 2016-02-03 2022-09-01 Amgen Res Munich Gmbh Constructs of psma and cd3 bispecific antigens that bind to t-cells, preparations containing them and uses thereof
CA3013463C (en) 2016-02-04 2024-05-21 The California Institute For Biomedical Research Humanized anti-cd3 antibodies, conjugates and uses thereof
IL261188B (en) 2016-03-04 2022-08-01 Jn Biosciences Llc An anti-tigit antibody that binds to the tigit polypeptide on one or more amino acid residues
GB201604458D0 (en) 2016-03-16 2016-04-27 Immatics Biotechnologies Gmbh Peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against cancers
LT3433280T (lt) 2016-03-22 2023-07-10 F. Hoffmann-La Roche Ag Proteazės aktyvuojamos t ląstelei bispecifinės molekulės
EP3452508A1 (en) 2016-05-02 2019-03-13 Prothena Biosciences Limited Antibodies recognizing tau
PE20190208A1 (es) 2016-05-02 2019-02-07 Prothena Biosciences Ltd Anticuerpos que reconocen tau
US10752679B2 (en) 2016-05-02 2020-08-25 Prothena Biosciences Limited Tau immunotherapy
TWI755395B (zh) 2016-05-13 2022-02-21 美商再生元醫藥公司 抗-pd-1抗體與輻射治療癌症之組合
EP3252078A1 (en) 2016-06-02 2017-12-06 F. Hoffmann-La Roche AG Type ii anti-cd20 antibody and anti-cd20/cd3 bispecific antibody for treatment of cancer
CN110603266A (zh) * 2016-06-02 2019-12-20 豪夫迈·罗氏有限公司 用于治疗癌症的ii型抗cd20抗体和抗cd20/cd3双特异性抗体
RU2018145961A (ru) * 2016-06-07 2020-07-14 Макродженикс, Инк. Комбинированная терапия
FI3468586T3 (fi) 2016-06-14 2024-10-29 Xencor Inc Bispesifisiä immuuniaktivaatiota vapauttavia vasta-aineita
JP7461741B2 (ja) 2016-06-20 2024-04-04 カイマブ・リミテッド 抗ｐｄ－ｌ１およびｉｌ－２サイトカイン
MX2018016330A (es) 2016-06-27 2020-02-17 Univ California Combinaciones para tratamiento del cáncer.
EP3475304B1 (en) 2016-06-28 2022-03-23 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind somatostatin receptor 2
US10870709B2 (en) 2016-07-22 2020-12-22 New York University Specific murine and humanized monoclonal antibodies detecting pathology associated secondary structure changes in proteins and peptides
JP7125347B2 (ja) 2016-08-22 2022-08-24 中外製薬株式会社 ヒトｇｐｃ３ポリペプチドを発現する遺伝子改変非ヒト動物
US10793632B2 (en) 2016-08-30 2020-10-06 Xencor, Inc. Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors
US20180064758A1 (en) * 2016-09-05 2018-03-08 Ucl Business Plc Chimeric antigen receptor
US10621236B2 (en) * 2016-09-16 2020-04-14 At&T Intellectual Property I, L.P. Concept based querying of graph databases
EP3512548B1 (en) * 2016-09-16 2023-03-22 Bionomics Limited Antibody and checkpoint inhibitor combination therapy
RS63660B1 (sr) * 2016-09-23 2022-11-30 Regeneron Pharma Anti-muc16 (mucin 16) antitela
ES2897217T3 (es) 2016-09-30 2022-02-28 Hoffmann La Roche Anticuerpos biespecíficos frente a p95HER2
CA3040504A1 (en) 2016-10-14 2018-04-19 Xencor, Inc. Il15/il15ra heterodimeric fc-fusion proteins
KR20190074300A (ko) 2016-11-15 2019-06-27 제넨테크, 인크. 항-cd20/항-cd3 이중특이적 항체에 의한 치료를 위한 투약
US11129906B1 (en) 2016-12-07 2021-09-28 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
US11180535B1 (en) 2016-12-07 2021-11-23 David Gordon Bermudes Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria
WO2018106931A1 (en) 2016-12-07 2018-06-14 Progenity Inc. Gastrointestinal tract detection methods, devices and systems
IL267406B2 (en) 2016-12-20 2025-05-01 Hoffmann La Roche Combination therapy of anti-cd20/anti-cd3 bispecific antibodies and 4-1bb (cd137) agonists
IL268479B2 (en) 2017-02-21 2024-06-01 Regeneron Pharma Anti-PD-1 antibodies for the treatment of lung cancer
WO2018174274A1 (ja) * 2017-03-24 2018-09-27 全薬工業株式会社 抗ＩｇＭ／Ｂ細胞表面抗原二重特異性抗体
CA3054632A1 (en) 2017-03-30 2018-10-04 Progenity, Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with an immune modulatory agent released using an ingestible device
US11603407B2 (en) 2017-04-06 2023-03-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Stable antibody formulation
WO2018199593A1 (ko) * 2017-04-24 2018-11-01 재단법인 목암생명과학연구소 Her3 및 cd3에 결합하는 이중특이적 항체
WO2018203567A1 (en) * 2017-05-02 2018-11-08 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Cytotoxicity-inducing therapeutic agent
MX2019013045A (es) 2017-05-02 2020-02-12 Prothena Biosciences Ltd Anticuerpos que reconocen tau.
CN118562001A (zh) 2017-05-08 2024-08-30 阿迪马布有限责任公司 抗cd3结合结构域和包含它们的抗体以及它们的产生及使用方法
EP3409322A1 (en) 2017-06-01 2018-12-05 F. Hoffmann-La Roche AG Treatment method
WO2018223004A1 (en) * 2017-06-01 2018-12-06 Xencor, Inc. Bispecific antibodies that bind cd20 and cd3
MA49517A (fr) 2017-06-30 2020-05-06 Xencor Inc Protéines de fusion fc hétérodimères ciblées contenant il-15/il-15ra et domaines de liaison à l'antigène
LT3652215T (lt) 2017-07-14 2021-05-25 Immatics Biotechnologies Gmbh Pagerinta dvejopo savitumo polipeptido molekulė
US12486325B2 (en) 2017-09-21 2025-12-02 WuXi Biologics Ireland Limited Anti-CD3epsilon antibodies
KR102785140B1 (ko) * 2017-09-21 2025-03-25 우시 바이올로직스 아일랜드 리미티드 신규 항-cd3엡실론 항체
ES2759622T3 (es) 2017-10-02 2020-05-11 Certest Biotec S L Anticuerpos anti-Dps y dispositivos de prueba para la detección de bacterias del género Campylobacter
KR101973060B1 (ko) * 2017-10-20 2019-04-26 주식회사 녹십자 항-cd3 항체 및 이를 포함하는 암 치료용 약학적 조성물
BR112020007736A2 (pt) 2017-10-30 2020-10-20 F. Hoffmann-La Roche Ag composição e método de tratamento
ES2907054T3 (es) 2017-11-01 2022-04-21 Hoffmann La Roche TriFab-Contorsbody
WO2019094637A1 (en) 2017-11-08 2019-05-16 Xencor, Inc. Bispecific and monospecific antibodies using novel anti-pd-1 sequences
US10981992B2 (en) 2017-11-08 2021-04-20 Xencor, Inc. Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors
KR102722731B1 (ko) 2017-12-19 2024-10-25 젠코어 인코포레이티드 조작된 il-2 fc 융합 단백질
MA51302A (fr) 2017-12-21 2021-03-31 Hoffmann La Roche Anticorps se liant à hla-a2/wt1
CA3088878A1 (en) * 2018-01-09 2019-07-18 H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute Inc. Compositions and methods for targeting clec12a-expressing cancers
WO2019139987A1 (en) 2018-01-09 2019-07-18 Elstar Therapeutics, Inc. Calreticulin binding constructs and engineered t cells for the treatment of diseases
US20200339686A1 (en) * 2018-01-16 2020-10-29 Lakepharma, Inc. Bispecific antibody that binds cd3 and another target
CA3089287A1 (en) 2018-02-08 2019-08-15 Genentech, Inc. Bispecific antigen-binding molecules and methods of use
CN110218256B (zh) * 2018-03-02 2020-12-08 广西医科大学 抗CD3的纳米抗体CD3/Nb29及其制备方法与应用
CN110218253B (zh) * 2018-03-02 2020-12-04 广西医科大学 抗CD3的纳米抗体CD3/Nb14及其制备方法与应用
EP3765520A1 (en) * 2018-03-14 2021-01-20 NovImmune SA Anti-cd3 epsilon antibodies and methods of use thereof
WO2019178362A1 (en) 2018-03-14 2019-09-19 Elstar Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to calreticulin and uses thereof
CN110305217B (zh) * 2018-03-27 2022-03-29 广州爱思迈生物医药科技有限公司 双特异性抗体及其应用
CN112469477A (zh) 2018-04-04 2021-03-09 Xencor股份有限公司 与成纤维细胞活化蛋白结合的异源二聚体抗体
JP7418346B2 (ja) 2018-04-13 2024-01-19 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト ４－１ＢＢＬを含むＨｅｒ２標的化抗原結合分子
CA3097741A1 (en) 2018-04-18 2019-10-24 Xencor, Inc. Tim-3 targeted heterodimeric fusion proteins containing il-15/il-15ra fc-fusion proteins and tim-3 antigen binding domains
JP2021521784A (ja) 2018-04-18 2021-08-30 ゼンコア インコーポレイテッド ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲａＦｃ融合タンパク質とＰＤ−１抗原結合ドメインを含むＰＤ−１標的化ヘテロダイマー融合タンパク質およびそれらの使用
SMT202500221T1 (it) * 2018-05-24 2025-07-22 Janssen Biotech Inc Anticorpi anti-cd3 e usi di essi
MA52777A (fr) 2018-05-24 2021-04-14 Janssen Biotech Inc Agents de liaison psma et utilisations correspondantes
US20210380710A1 (en) * 2018-05-29 2021-12-09 WuXi Biologics Ireland Limited A novel anti-cd3/anti-cd20 bispecific antibody
TWI848953B (zh) * 2018-06-09 2024-07-21 德商百靈佳殷格翰國際股份有限公司 針對癌症治療之多特異性結合蛋白
WO2019246312A1 (en) 2018-06-20 2019-12-26 Progenity, Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with an immunomodulator
US12227565B2 (en) 2018-06-20 2025-02-18 Biora Therapeutics, Inc. Method of formulating a pharmaceutical composition comprising administering an immune modulator to the small intestine
AU2019297451A1 (en) 2018-07-03 2021-01-28 Marengo Therapeutics, Inc. Anti-TCR antibody molecules and uses thereof
TWI728400B (zh) * 2018-07-26 2021-05-21 美商美國禮來大藥廠 Cd226促效劑抗體
DK3844189T3 (da) 2018-08-31 2025-02-24 Regeneron Pharma Doseringsstrategi, der mindsker cytokinfrigivelsessyndrom for CD3/CD20-bispecifikke antistoffer
CN110872356B (zh) * 2018-09-03 2023-06-13 广西慧宝源健康产业有限公司 双特异性抗体及其使用方法
US11573226B2 (en) 2018-09-10 2023-02-07 Genentech, Inc. Systems and methods for affinity capillary electrophoresis
EP3837282B1 (en) 2018-09-10 2025-08-27 Genentech, Inc. Systems and methods for affinity capillary electrophoresis
SG11202103192RA (en) 2018-10-03 2021-04-29 Xencor Inc Il-12 heterodimeric fc-fusion proteins
TW202028244A (zh) 2018-10-09 2020-08-01 美商建南德克公司 用於確定突觸形成之方法及系統
EP3864049A1 (en) 2018-10-11 2021-08-18 Inhibrx, Inc. Pd-1 single domain antibodies and therapeutic compositions thereof
US20210340273A1 (en) 2018-10-11 2021-11-04 Inhlbrx, inc. 5t4 single domain antibodies and therapeutic compositions thereof
CA3115089A1 (en) 2018-10-11 2020-04-16 Inhibrx, Inc. Dll3 single domain antibodies and therapeutic compositions thereof
CA3115082A1 (en) 2018-10-11 2020-04-16 Inhibrx, Inc. B7h3 single domain antibodies and therapeutic compositions thereof
CN109400710A (zh) * 2018-11-02 2019-03-01 山西大医院（山西医学科学院） 一种靶向kif20a阳性胰腺癌双特异性抗体及其制备方法和应用
US20220033516A1 (en) * 2018-11-05 2022-02-03 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Her2 s310f specific antigen-binding molecules
CN116726361A (zh) 2018-11-19 2023-09-12 比奥拉治疗股份有限公司 用生物治疗剂治疗疾病的方法和装置
MX2021007307A (es) * 2018-12-21 2021-07-07 Hoffmann La Roche Anticuerpos que se unen a cd3.
PH12021551487A1 (en) 2018-12-21 2022-04-11 Hoffmann La Roche Tumor-targeted agonistic cd28 antigen binding molecules
GB201901305D0 (en) * 2019-01-30 2019-03-20 Immunocore Ltd Specific binding molecules
AU2020224681A1 (en) 2019-02-21 2021-09-16 Marengo Therapeutics, Inc. Antibody molecules that bind to NKp30 and uses thereof
GB2599228B (en) 2019-02-21 2024-02-07 Marengo Therapeutics Inc Multifunctional molecules that bind to T cell related cancer cells and uses thereof
MX2021010390A (es) 2019-03-01 2021-11-17 Xencor Inc Anticuerpos heterodimericos que se unen a enpp3 y cd3.
AU2020231366A1 (en) 2019-03-03 2021-08-12 Prothena Biosciences Limited Antibodies recognizing tau
AU2020236015B9 (en) 2019-03-14 2024-11-28 Genentech, Inc. Treatment of cancer with HER2XCD3 bispecific antibodies in combination with anti-HER2 MAB
KR102239781B1 (ko) 2019-04-08 2021-04-13 주식회사 녹십자 Gpnmb 및 cd3에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항체 및 이의 용도
AR118720A1 (es) 2019-04-19 2021-10-27 Janssen Biotech Inc Métodos para tratar el cáncer de próstata con un anticuerpo anti-psma / cd3
EP3725370A1 (en) 2019-04-19 2020-10-21 ImmunoBrain Checkpoint, Inc. Modified anti-pd-l1 antibodies and methods and uses for treating a neurodegenerative disease
KR20230031981A (ko) 2019-05-14 2023-03-07 프로벤션 바이오, 인코포레이티드 제1형 당뇨병을 예방하기 위한 방법 및 조성물
EP3972998A1 (en) 2019-05-21 2022-03-30 Novartis AG Cd19 binding molecules and uses thereof
EP3973000A4 (en) * 2019-06-07 2023-09-06 Adimab, LLC HIGH AFFINITY ANTI-CD3 ANTIBODIES AND METHOD FOR THE PRODUCTION AND USE THEREOF
CN114025802B (zh) * 2019-06-21 2024-04-23 瑞泽恩制药公司 结合psma和cd3的双特异性抗原结合分子与4-1bb共刺激组合的用途
WO2021006199A1 (ja) 2019-07-05 2021-01-14 小野薬品工業株式会社 Ｐｄ－１／ｃｄ３二重特異性タンパク質による血液がん治療
DE102019121007A1 (de) 2019-08-02 2021-02-04 Immatics Biotechnologies Gmbh Antigenbindende Proteine, die spezifisch an MAGE-A binden
WO2021034335A1 (en) * 2019-08-16 2021-02-25 Odonate Therapeutics, Inc. Methods of administering tesetaxel with glucocorticoids that are cyp3a4 inducers
EP4065164A4 (en) * 2019-11-26 2024-03-27 Shanghai Epimab Biotherapeutics Co., Ltd. ANTIBODIES AGAINST CD3 AND BCMA AND BISPECIFIC BINDING PROTEINS PRODUCED THEREOF
TW202135860A (zh) * 2019-12-10 2021-10-01 美商再生元醫藥公司 含有抗ｃｄ２０ｘ抗ｃｄ３雙特異性抗體之穩定調配物
AR120741A1 (es) * 2019-12-13 2022-03-16 Genentech Inc Anticuerpos anti-ly6g6d y métodos de uso
US11707610B2 (en) 2019-12-13 2023-07-25 Biora Therapeutics, Inc. Ingestible device for delivery of therapeutic agent to the gastrointestinal tract
JP2023509708A (ja) 2020-01-03 2023-03-09 マレンゴ・セラピューティクス，インコーポレーテッド 抗ｔｃｒ抗体分子およびその使用
TWI888487B (zh) * 2020-02-14 2025-07-01 日商協和麒麟股份有限公司 與ｃｄ３結合之雙特異性抗體
CA3171709A1 (en) * 2020-03-16 2021-09-23 Rahul Palchaudhuri T-cell bispecific binding proteins
EP4146175A1 (en) 2020-05-08 2023-03-15 Genmab A/S Bispecific antibodies against cd3 and cd20
WO2021231976A1 (en) 2020-05-14 2021-11-18 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind prostate specific membrane antigen (psma) and cd3
JP2023528350A (ja) 2020-05-27 2023-07-04 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド Ｃｄ３抗原結合ドメインを含むタンパク質及びその使用
US10981996B1 (en) 2020-06-01 2021-04-20 Abexxa Biologics, Inc. Antibodies targeting a complex comprising non-classical HLA-I and neoantigen and their methods of use
US11976120B2 (en) * 2020-06-01 2024-05-07 Boehringer Ingelheim International Gmbh Antibodies targeting a complex comprising non-classical HLA-I and neoantigen and their methods of use
AR122493A1 (es) 2020-06-02 2022-09-14 Arcus Biosciences Inc Anticuerpos anti-tigit
IL298999A (en) 2020-06-11 2023-02-01 Provention Bio Inc Methods and compositions for the prevention of type 1 diabetes
PE20231080A1 (es) 2020-06-19 2023-07-17 Hoffmann La Roche Anticuerpos que se unen a cd3 y cd19
CN111705084B (zh) * 2020-08-18 2020-12-08 江苏集萃药康生物科技有限公司 一种稳定表达荧光素酶及人cd20敲除鼠cd20的小鼠b细胞淋巴瘤细胞系构建方法
WO2022040482A1 (en) 2020-08-19 2022-02-24 Xencor, Inc. Anti-cd28 and/or anti-b7h3 compositions
WO2022053653A1 (en) 2020-09-10 2022-03-17 Genmab A/S Bispecific antibodies against cd3 and cd20 for treating chronic lymphocytic leukemia
BR112023004351A2 (pt) 2020-09-10 2023-04-04 Genmab As Método para tratar linfoma folicular em um sujeito humano
EP4210744A1 (en) 2020-09-10 2023-07-19 Genmab A/S Bispecific antibody against cd3 and cd20 in combination therapy for treating diffuse large b-cell lymphoma
CA3192251A1 (en) 2020-09-10 2022-03-17 Genmab A/S Bispecific antibody against cd3 and cd20 in combination therapy for treating diffuse large b-cell lymphoma
EP4210743A1 (en) 2020-09-10 2023-07-19 Genmab A/S Bispecific antibody against cd3 and cd20 in combination therapy for treating follicular lymphoma
EP4222171A1 (en) 2020-10-02 2023-08-09 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Combination of antibodies for treating cancer with reduced cytokine release syndrome
IL302396A (en) 2020-11-04 2023-06-01 Genentech Inc Dosage for treatment with bispecific anti-CD20/anti-CD3 antibodies
JP7716473B2 (ja) 2020-11-04 2025-07-31 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ｃｄ２０／抗ｃｄ３二重特異性抗体の皮下投薬
IL302217A (en) * 2020-11-04 2023-06-01 Genentech Inc Dosage for treatment with bispecific anti-CD20/anti-CD3 antibodies and anti-CD79B drug antibody conjugates
PH12023500013A1 (en) 2020-12-04 2024-03-11 Tidal Therapeutics Inc Ionizable cationic lipids and lipi nanoparticles, and methods of synthesis and use thereof
IL303656A (en) 2020-12-17 2023-08-01 Hoffmann La Roche Anti-hla-g antibodies and use thereof
CN114656562B (zh) 2020-12-23 2023-11-03 北京天广实生物技术股份有限公司 结合人和猴cd3的抗体及其应用
AU2022206061A1 (en) 2021-01-06 2023-07-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy employing a pd1-lag3 bispecific antibody and a cd20 t cell bispecific antibody
PE20240761A1 (es) 2021-01-28 2024-04-17 Janssen Biotech Inc Proteinas de union a psma y usos de estas
CN117157319A (zh) 2021-03-09 2023-12-01 Xencor股份有限公司 结合cd3和cldn6的异二聚抗体
KR20230154311A (ko) 2021-03-10 2023-11-07 젠코어 인코포레이티드 Cd3 및 gpc3에 결합하는 이종이량체 항체
WO2022216993A2 (en) 2021-04-08 2022-10-13 Marengo Therapeutics, Inc. Multifuntional molecules binding to tcr and uses thereof
TW202243689A (zh) 2021-04-30 2022-11-16 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 抗ｃｄ２０／抗ｃｄ３雙特異性抗體及抗ｃｄ７８ｂ抗體藥物結合物的組合治療之給藥
EP4329800A1 (en) 2021-04-30 2024-03-06 F. Hoffmann-La Roche AG Dosing for treatment with anti-cd20/anti-cd3 bispecific antibody
AU2022269312A1 (en) * 2021-05-06 2023-10-19 Amgen Research (Munich) Gmbh Cd20 and cd22 targeting antigen-binding molecules for use in proliferative diseases
AU2022273541A1 (en) 2021-05-14 2023-11-30 Genentech, Inc. Methods for treatment of cd20-positive proliferative disorder with mosunetuzumab and polatuzumab vedotin
CN115490770A (zh) * 2021-06-17 2022-12-20 鸿运华宁（杭州）生物医药有限公司 一种能与人eta和人cd3结合的双特异性抗体及其应用
EP4355785A1 (en) * 2021-06-17 2024-04-24 Amberstone Biosciences, Inc. Anti-cd3 constructs and uses thereof
EP4355778A1 (en) 2021-06-17 2024-04-24 Boehringer Ingelheim International GmbH Novel tri-specific binding molecules
CN115558023A (zh) * 2021-07-02 2023-01-03 安源医药科技（上海）有限公司 抗cd3抗体及其用途
CA3228259A1 (en) * 2021-08-04 2023-02-09 Abpro Corporation Anti-her2 antibodies and uses thereof
CN117897407A (zh) * 2021-08-27 2024-04-16 石药集团巨石生物制药有限公司 抗Nectin-4抗体、药物缀合物及其制备方法和用途
WO2023056391A1 (en) * 2021-09-30 2023-04-06 City Of Hope Anti-cd3 antibodies and uses thereof
CN118076387A (zh) * 2021-10-08 2024-05-24 艾贝乐医药科技有限公司 靶向表达cdh17的肿瘤的多特异性抗体及其制备和使用方法
AU2022389969A1 (en) * 2021-11-16 2024-05-02 Genentech, Inc. Methods and compositions for treating systemic lupus erythematosus (sle) with mosunetuzumab
EP4448570A1 (en) 2021-12-14 2024-10-23 CDR-Life AG Dual mhc-targeting t cell engager
WO2023183766A1 (en) * 2022-03-20 2023-09-28 Abcellera Biologics Inc. Anti-cd3 antibodies and t-cell engagers and methods of use
MX2024011468A (es) 2022-03-23 2024-09-25 Hoffmann La Roche Tratamiento conjunto de un anticuerpo biespecifico anti-cd20/anti-cd3 y quimioterapia.
PE20250559A1 (es) 2022-03-29 2025-02-24 Ngm Biopharmaceuticals Inc Agentes de union a ilt3 y cd3 y metodos de uso de estos
EP4508081A1 (en) 2022-04-13 2025-02-19 F. Hoffmann-La Roche AG Pharmaceutical compositions of anti-cd20/anti-cd3 bispecific antibodies and methods of use
AR129061A1 (es) 2022-04-13 2024-07-10 Genentech Inc Composiciones farmacéuticas de mosunetuzumab y métodos de uso
AU2023253705A1 (en) 2022-04-13 2024-10-17 F. Hoffmann-La Roche Ag Pharmaceutical compositions of therapeutic proteins and methods of use
WO2023219613A1 (en) * 2022-05-11 2023-11-16 Genentech, Inc. Dosing for treatment with anti-fcrh5/anti-cd3 bispecific antibodies
US20250304706A1 (en) * 2022-05-12 2025-10-02 Astellas Pharma Inc. Anti-taa/anti-cd3 multispecific antibody
TW202423482A (zh) 2022-06-08 2024-06-16 美商泰德治療公司 可電離陽離子脂質和脂質奈米顆粒、及其合成方法和用途
CR20250056A (es) 2022-07-22 2025-03-19 Genentech Inc Moléculas de unión al antígeno anti-steap1 y sus usos.
CN120359244A (zh) * 2022-10-18 2025-07-22 阿迪马布有限责任公司 Ph依赖性抗cd3抗体和与其相关的方法
WO2024088987A1 (en) 2022-10-26 2024-05-02 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy for the treatment of cancer
WO2024094741A1 (en) 2022-11-03 2024-05-10 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy with anti-cd19/anti-cd28 bispecific antibody
EP4619427A1 (en) 2022-11-15 2025-09-24 F. Hoffmann-La Roche AG Recombinant binding proteins with activatable effector domain
CN120603604A (zh) * 2022-11-18 2025-09-05 Jn生物科学有限责任公司 抗cd3抗体
CN120569191A (zh) 2022-11-23 2025-08-29 乔治亚大学研究基金公司 用于增加免疫应答的组合物及其使用方法
PE20252286A1 (es) 2023-01-18 2025-09-18 Genentech Inc Anticuerpos multiespecificos y usos de estos
WO2024191168A1 (ko) * 2023-03-13 2024-09-19 머스트바이오 주식회사 신규한 cd3 결합항체 및 이를 포함한 다중특이 항체
EP4474016A1 (en) 2023-06-07 2024-12-11 Julius-Maximilians-Universität Würzburg Strategies to target extracellularly accessible ras protein
US12319747B2 (en) 2023-07-03 2025-06-03 Medicovestor, Inc. Methods of using anti-SP17 immunotherapeutics
KR20250031973A (ko) 2023-08-30 2025-03-07 (주)제이피오토메이션 반도체 칠러장치용 밸브 모듈
EP4590714A1 (en) 2023-09-21 2025-07-30 Domain Therapeutics Anti-ccr8 monoclonal antibodies and their therapeutic use
WO2025061994A1 (en) 2023-09-21 2025-03-27 Domain Therapeutics Anti-ccr8 monoclonal antibodies and their therapeutic use
US12364777B2 (en) * 2023-10-20 2025-07-22 Medicovestor, Inc. Homodimeric antibodies for use in treating cancers and methods of use
US20250230251A1 (en) 2023-12-20 2025-07-17 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies targeting il-18 receptor beta (il-18rb) and related methods
WO2025131071A1 (zh) * 2023-12-22 2025-06-26 江苏恒瑞医药股份有限公司 靶向cd3的抗体及其应用
US12116410B1 (en) 2023-12-26 2024-10-15 Medicovestor, Inc. Methods of manufacturing dimeric antibodies
US20250242056A1 (en) 2024-01-26 2025-07-31 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for using plasma cell depleting agents and/or b cell depleting agents to suppress host anti-aav antibody response and enable aav transduction and re-dosing
WO2025160340A2 (en) 2024-01-26 2025-07-31 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Combination immunosuppression for inhibiting an immune response and enabling immunogen administration and re-administration
WO2025174825A2 (en) 2024-02-12 2025-08-21 Aera Therapeutics, Inc. Delivery compositions
WO2025184567A1 (en) 2024-03-01 2025-09-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for re-dosing aav using anti-cd40 antagonistic antibody to suppress host anti-aav antibody response
US20250381150A1 (en) 2024-03-08 2025-12-18 Genzyme Corporation Lipid nanoparticles
WO2025199352A2 (en) 2024-03-20 2025-09-25 Juno Therapeutics, Inc. Antibodies specific for solute carrier family 34 member 2 (slc34a2)
WO2025210181A1 (en) 2024-04-04 2025-10-09 Cdr-Life Ag Antigen binding proteins targeting an hla-restricted kk-lc-1 peptide
WO2025215160A1 (en) 2024-04-11 2025-10-16 Cdr-Life Ag Antigen binding proteins targeting an hla-restricted prame peptide
WO2025233264A1 (en) 2024-05-07 2025-11-13 Innate Pharma Use of cd73 blocking agents in combination with anti-cd20 x cd3 t cell engagers
WO2025233266A1 (en) 2024-05-07 2025-11-13 Innate Pharma Use of cd39 blocking agents in combination with anti-cd20 x cd3 t cell engagers
WO2025237931A1 (en) 2024-05-15 2025-11-20 F. Hoffmann-La Roche Ag Recombinant binding proteins with conditionally activatable t cell and nk cell recruiting effector domains
WO2025240670A2 (en) 2024-05-15 2025-11-20 Abalytics Oncology, Inc. Anti-pd-1 antibodies and related binding molecules and methods and uses thereof
GB2641580A (en) 2024-06-07 2025-12-10 T Therapeutics Ltd Tumour-transforming multispecific proteins

Family Cites Families (215)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4675187A (en) 1983-05-16 1987-06-23 Bristol-Myers Company BBM-1675, a new antibiotic complex
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
DE3883899T3 (de) 1987-03-18 1999-04-22 Sb2, Inc., Danville, Calif. Geänderte antikörper.
US4975278A (en) 1988-02-26 1990-12-04 Bristol-Myers Company Antibody-enzyme conjugates in combination with prodrugs for the delivery of cytotoxic agents to tumor cells
WO1989006692A1 (en) 1988-01-12 1989-07-27 Genentech, Inc. Method of treating tumor cells by inhibiting growth factor receptor function
ATE102631T1 (de) 1988-11-11 1994-03-15 Medical Res Council Klonierung von immunglobulin sequenzen aus den variabelen domaenen.
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
AU6290090A (en) 1989-08-29 1991-04-08 University Of Southampton Bi-or trispecific (fab)3 or (fab)4 conjugates
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
CA2095633C (en) 1990-12-03 2003-02-04 Lisa J. Garrard Enrichment method for variant proteins with altered binding properties
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
EP0940468A1 (en) 1991-06-14 1999-09-08 Genentech, Inc. Humanized antibody variable domain
GB9114948D0 (en) 1991-07-11 1991-08-28 Pfizer Ltd Process for preparing sertraline intermediates
FI941572A7 (fi) 1991-10-07 1994-05-27 Oncologix Inc Anti-erbB-2-monoklonaalisten vasta-aineiden yhdistelmä ja käyttömenete lmä
DE69334255D1 (de) 1992-02-06 2009-02-12 Novartis Vaccines & Diagnostic Marker für Krebs und biosynthetisches Bindeprotein dafür
WO1994029351A2 (en) 1993-06-16 1994-12-22 Celltech Limited Antibodies
US5767237A (en) 1993-10-01 1998-06-16 Teikoku Hormone Mfg. Co., Ltd. Peptide derivatives
US5798100A (en) 1994-07-06 1998-08-25 Immunomedics, Inc. Multi-stage cascade boosting vaccine
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
GB9603256D0 (en) 1996-02-16 1996-04-17 Wellcome Found Antibodies
AU751659B2 (en) 1997-05-02 2002-08-22 Genentech Inc. A method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components
US20030068623A1 (en) 1997-06-16 2003-04-10 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
JP2002506353A (ja) 1997-06-24 2002-02-26 ジェネンテック・インコーポレーテッド ガラクトシル化糖タンパク質の方法及び組成物
US6248564B1 (en) 1997-08-29 2001-06-19 Harvard University Mutant MHC class I molecules
WO1999022764A1 (en) 1997-10-31 1999-05-14 Genentech, Inc. Methods and compositions comprising glycoprotein glycoforms
US6610833B1 (en) 1997-11-24 2003-08-26 The Institute For Human Genetics And Biochemistry Monoclonal human natural antibodies
BR9813365A (pt) 1997-12-05 2004-06-15 Scripps Research Inst Método para produção e humanização de um anticorpo monoclonal de rato
PT1068241E (pt) 1998-04-02 2007-11-19 Genentech Inc Variantes de anticorpos e respectivos fragmentos
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
US20030175884A1 (en) 2001-08-03 2003-09-18 Pablo Umana Antibody glycosylation variants having increased antibody-dependent cellular cytotoxicity
DK1071700T3 (da) 1998-04-20 2010-06-07 Glycart Biotechnology Ag Glykosylerings-modifikation af antistoffer til forbedring af antistofafhængig cellulær cytotoksicitet
KR101063278B1 (ko) 1998-08-11 2011-09-07 바이오겐 아이덱 인크. Ｂ-세포 림프종을 치료하기 위한 항-ｃｄ２０ 항체를 포함하는 약제
EP1131093A4 (en) 1998-11-09 2002-05-02 Idec Pharma Corp TREATMENT OF HEMATOLOGICAL VILTIES ASSOCIATED WITH CIRCULATING TUMOR CELLS USING CHIMERIC ANTI-CD20 ANTIBODIES
KR101077001B1 (ko) 1999-01-15 2011-10-26 제넨테크, 인크. 효과기 기능이 변화된 폴리펩티드 변이체
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
AU3672800A (en) 1999-04-09 2000-11-14 Kyowa Hakko Kogyo Co. Ltd. Method for controlling the activity of immunologically functional molecule
EP1229125A4 (en) 1999-10-19 2005-06-01 Kyowa Hakko Kogyo Kk PROCESS FOR PREPARING A POLYPEPTIDE
EP1235847B1 (en) 1999-11-29 2016-01-20 The Trustees of Columbia University in the City of New York ISOLATION OF FIVE NOVEL GENES CODING FOR NEW Fc RECEPTORS-TYPE MELANOMA INVOLVED IN THE PATHOGENESIS OF LYMPHOMA/MELANOMA
US7105149B1 (en) 1999-11-29 2006-09-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Isolation of five novel genes coding for new Fc receptors-type melanoma involved in the pathogenesis of lymphoma/myeloma
CA2393869A1 (en) 1999-12-15 2001-06-21 Genetech,Inc. Shotgun scanning, a combinatorial method for mapping functional protein epitopes
US20040005561A1 (en) 2000-03-01 2004-01-08 Corixa Corporation Compositions and methods for the detection, diagnosis and therapy of hematological malignancies
MXPA02010011A (es) 2000-04-11 2003-04-25 Genentech Inc Anticuerpos multivalentes y usos para los mismos.
US7064191B2 (en) 2000-10-06 2006-06-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for purifying antibody
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
HU231090B1 (hu) 2000-10-06 2020-07-28 Kyowa Kirin Co., Ltd. Antitest-kompozíciót termelő sejt
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
US20040018194A1 (en) 2000-11-28 2004-01-29 Francisco Joseph A. Recombinant anti-CD30 antibodies and uses thereof
ES2405944T3 (es) 2000-11-30 2013-06-04 Medarex, Inc. Ácidos nucleicos que codifican las secuencias de inmunoglobulina humana reorganizadas a partir de ratones transcromoscómicos transgénicos zadas
PE20020574A1 (es) 2000-12-06 2002-07-02 Wyeth Corp Anticuerpos humanizados que reconocen el peptido amiloideo beta
CU23007A1 (es) 2001-04-06 2004-12-17 Ct De Inmunologia Molecular Ct De Inmunologia Mole Combinaciones inmunoterapéuticas para el tratamiencombinaciones inmunoterapéuticas para el tratamiento de tumores que sobre-expresan gangliósidos to de tumores que sobre-expresan gangliósidos
US6884869B2 (en) 2001-04-30 2005-04-26 Seattle Genetics, Inc. Pentapeptide compounds and uses related thereto
AU2002314495A1 (en) 2001-06-20 2003-01-02 Prochon Biotech Ltd. Antibodies that block receptor protein tyrosine kinase activation, methods of screening for and uses thereof
JP2005536439A (ja) 2001-09-18 2005-12-02 ジェネンテック・インコーポレーテッド 腫瘍の診断及び治療のための組成物と方法
US20050226869A1 (en) 2001-10-19 2005-10-13 Genentech, Inc. Compositions and methods for the treatment of tumor of hematopoietic origin
US7888478B2 (en) 2002-09-11 2011-02-15 Genentech, Inc. Compositions and methods for the treatment of tumor of hematopoietic origin
WO2005063299A2 (en) 2003-12-24 2005-07-14 Genentech, Inc. Compositions and methods for the treatment of tumor of hematopoietic origin
US7858330B2 (en) 2001-10-19 2010-12-28 Genentech, Inc. Compositions and methods for the treatment of tumor of hematopoietic origin
ATE430580T1 (de) 2001-10-25 2009-05-15 Genentech Inc Glycoprotein-zusammensetzungen
AU2002363939A1 (en) 2001-11-20 2003-06-10 Seattle Genetics, Inc. Treatment of immunological disorders using anti-cd30 antibodies
US20040093621A1 (en) 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
WO2003085102A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cell with depression or deletion of the activity of protein participating in gdp-fucose transport
EP1498491A4 (en) 2002-04-09 2006-12-13 Kyowa Hakko Kogyo Kk METHOD FOR ENHANCING ACTIVITY OF BINDING ANTIBODY COMPOSITION WITH FC GAMMA IIIA RECEPTOR
WO2003084569A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Drug containing antibody composition
JP4832719B2 (ja) 2002-04-09 2011-12-07 協和発酵キリン株式会社 ＦｃγＲＩＩＩａ多型患者に適応する抗体組成物含有医薬
EP1498485A4 (en) 2002-04-09 2006-09-06 Kyowa Hakko Kogyo Kk MODIFIED GENOME CELLS
CA2481837A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Production process for antibody composition
US7435797B2 (en) 2002-04-10 2008-10-14 Genentech, Inc. Anti-HER2 antibody variants
CA2488441C (en) 2002-06-03 2015-01-27 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
WO2004032828A2 (en) 2002-07-31 2004-04-22 Seattle Genetics, Inc. Anti-cd20 antibody-drug conjugates for the treatment of cancer and immune disorders
EP1391213A1 (en) 2002-08-21 2004-02-25 Boehringer Ingelheim International GmbH Compositions and methods for treating cancer using maytansinoid CD44 antibody immunoconjugates and chemotherapeutic agents
US7361740B2 (en) 2002-10-15 2008-04-22 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
CN103833854B (zh) 2002-12-16 2017-12-12 健泰科生物技术公司 免疫球蛋白变体及其用途
US20050079574A1 (en) 2003-01-16 2005-04-14 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
PT1631313E (pt) * 2003-06-05 2015-07-02 Genentech Inc Terapêutica de combinação para distúrbios de células b
CA2542046A1 (en) 2003-10-08 2005-04-21 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Fused protein composition
EP1705251A4 (en) 2003-10-09 2009-10-28 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd PROCESS FOR PRODUCING ANTIBODY COMPOSITION BY RNA INHIBITION OF FUNCTION OF $ G (A) 1,6-FUCOSYLTRANSFERASE
BRPI0416262B1 (pt) 2003-11-05 2022-04-12 Roche Glycart Ag Anticorpo anti-cd20 humano tipo ii humanizado, seu método de produção, seus usos, bem como polinucleotídeo isolado, vetor de expressão e composição farmacêutica
BR122018071808B8 (pt) 2003-11-06 2020-06-30 Seattle Genetics Inc conjugado
JPWO2005053742A1 (ja) 2003-12-04 2007-06-28 協和醗酵工業株式会社 抗体組成物を含有する医薬
AU2005216251B2 (en) 2004-02-23 2011-03-10 Genentech, Inc. Heterocyclic self-immolative linkers and conjugates
GB0404187D0 (en) 2004-02-25 2004-03-31 Biotransformations Ltd Binding agents
MXPA06011199A (es) 2004-03-31 2007-04-16 Genentech Inc Anticuerpos anti-tgf-beta humanizados.
US7785903B2 (en) 2004-04-09 2010-08-31 Genentech, Inc. Variable domain library and uses
WO2005100402A1 (en) 2004-04-13 2005-10-27 F.Hoffmann-La Roche Ag Anti-p-selectin antibodies
BRPI0510883B8 (pt) 2004-06-01 2021-05-25 Genentech Inc composto conjugado de droga e anticorpo, composição farmacêutica, método de fabricação de composto conjugado de droga e anticorpo e usos de uma formulação, de um conjugado de droga e anticorpo e um agente quimioterapêutico e de uma combinação
TWI309240B (en) 2004-09-17 2009-05-01 Hoffmann La Roche Anti-ox40l antibodies
CN101065151B (zh) 2004-09-23 2014-12-10 健泰科生物技术公司 半胱氨酸改造的抗体和偶联物
US20100111856A1 (en) 2004-09-23 2010-05-06 Herman Gill Zirconium-radiolabeled, cysteine engineered antibody conjugates
WO2006039238A2 (en) 2004-09-30 2006-04-13 The Goverment Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Irta2 antibodies and methods of use
US7947839B2 (en) 2004-12-01 2011-05-24 Genentech, Inc. Heterocyclic-substituted bis-1,8 naphthalimide compounds, antibody drug conjugates, and methods of use
US20070134243A1 (en) 2004-12-01 2007-06-14 Gazzard Lewis J Antibody drug conjugates and methods
US20080247944A1 (en) 2005-01-12 2008-10-09 Robert Graziano Irta-2 Antibodies and Their Uses
EP3050963B1 (en) 2005-03-31 2019-09-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Process for production of polypeptide by regulation of assembly
WO2006114115A1 (de) 2005-04-26 2006-11-02 Trion Pharma Gmbh Kombination von antikörpern mit glukokortikoiden zur behandlung von krebs
BRPI0611220A2 (pt) 2005-06-02 2010-08-24 Astrazeneca Ab anticorpos direcionados para cd20 e usos dos mesmos
ES2373080T3 (es) 2005-06-20 2012-01-31 Genentech, Inc. Anticuerpos que se unen al antígeno tat10772 asociado a tumores para el diagnóstico y tratamiento de un tumor.
US8219149B2 (en) 2005-06-29 2012-07-10 Nokia Corporation Mobile communication terminal
KR101607288B1 (ko) * 2005-07-01 2016-04-05 이. 알. 스퀴부 앤드 선즈, 엘.엘.씨. 예정 사멸 리간드 1 (피디-엘1)에 대한 인간 모노클로날 항체
US7612181B2 (en) 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
DK1940881T3 (en) 2005-10-11 2017-02-20 Amgen Res Munich Gmbh COMPOSITIONS WITH ARTICLE CROSS-SPECIFIC ANTIBODIES AND APPLICATIONS THEREOF
WO2007056441A2 (en) 2005-11-07 2007-05-18 Genentech, Inc. Binding polypeptides with diversified and consensus vh/vl hypervariable sequences
WO2007064919A2 (en) 2005-12-02 2007-06-07 Genentech, Inc. Binding polypeptides with restricted diversity sequences
EP1820513A1 (en) 2006-02-15 2007-08-22 Trion Pharma Gmbh Destruction of tumor cells expressing low to medium levels of tumor associated target antigens by trifunctional bispecific antibodies
AR059900A1 (es) * 2006-03-17 2008-05-07 Genentech Inc Anticuerpos anti-tat226 e inmunoconjugados
CA2646965C (en) 2006-03-24 2016-06-21 Jonathan H. Davis Engineered heterodimeric protein domains
AR060871A1 (es) 2006-05-09 2008-07-16 Genentech Inc Union de polipeptidos con supercontigos optimizados
EP2418223A3 (en) * 2006-06-12 2013-01-16 Emergent Product Development Seattle, LLC Single-chain multivalent binding proteins with effector function
US20080226635A1 (en) 2006-12-22 2008-09-18 Hans Koll Antibodies against insulin-like growth factor I receptor and uses thereof
WO2008109533A2 (en) 2007-03-02 2008-09-12 Medarex, Inc. Human antibodies that bind multiple irta family proteins, and uses thereof
FI2155783T4 (fi) 2007-04-03 2022-12-15 Lajien välisesti spesifinen cd3-epsilon-sitoutumisdomeeni
CA2682626A1 (en) * 2007-04-03 2008-10-09 Micromet Ag Cross-species-specific bispecific binders
HUE040467T2 (hu) 2007-04-03 2019-03-28 Amgen Res Munich Gmbh Keresztfaj-specifikus kötõdomén
ES2390243T3 (es) 2007-04-03 2012-11-07 Amgen Research (Munich) Gmbh Agentes de unión biespecíficos específicos de especies cruzadas
CN100592373C (zh) 2007-05-25 2010-02-24 群康科技(深圳)有限公司 液晶显示面板驱动装置及其驱动方法
CA3128656A1 (en) 2007-08-22 2009-02-26 The Regents Of The University Of California Activatable binding polypeptides and methods of identification and use thereof
EP2225275A4 (en) 2007-11-28 2013-04-03 Medimmune Llc PROTEIN FORMULATION
BRPI0820604A2 (pt) 2007-12-21 2017-05-09 Genentech Inc método de purificação de um anticorpo cd20, cristal de um anticorpo cd20, composição e método destinado ao tratamento de uma condição ou doença associada ao cd20
EP2238169A1 (en) 2007-12-26 2010-10-13 Biotest AG Method of decreasing cytotoxic side-effects and improving efficacy of immunoconjugates
US8742076B2 (en) 2008-02-01 2014-06-03 Genentech, Inc. Nemorubicin metabolite and analog reagents, antibody-drug conjugates and methods
WO2009106096A1 (en) * 2008-02-27 2009-09-03 Fresenius Biotech Gmbh Treatment of resistant tumors with trifunctional antibodies
AR072804A1 (es) 2008-07-15 2010-09-22 Genentech Inc Conjugados derivados de antraciclina,proceso para su preparacion,composiciones farmaceuticas que los contienen y su uso como agentes antitumorales.
US8895702B2 (en) 2008-12-08 2014-11-25 City Of Hope Development of masked therapeutic antibodies to limit off-target effects; application to anti-EGFR antibodies
US20110178279A1 (en) 2009-08-03 2011-07-21 Williams John C Development of masked therapeutic antibodies to limit off-target effects: application to anti-egfr antibodies
US20100189727A1 (en) 2008-12-08 2010-07-29 Tegopharm Corporation Masking Ligands For Reversible Inhibition Of Multivalent Compounds
EP2414399A1 (en) 2009-04-01 2012-02-08 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-fcrh5 antibodies and immunoconjugates and methods of use
CA2756988A1 (en) 2009-04-01 2010-10-07 Genentech, Inc. Anti-fcrh5 antibodies and immunoconjugates
EP2424567B1 (en) * 2009-04-27 2018-11-21 OncoMed Pharmaceuticals, Inc. Method for making heteromultimeric molecules
MX368932B (es) * 2009-06-26 2019-10-22 Regeneron Pharma Anticuerpos biespecificos facilmente aislados con formato de inmunoglobulina original.
US9493578B2 (en) 2009-09-02 2016-11-15 Xencor, Inc. Compositions and methods for simultaneous bivalent and monovalent co-engagement of antigens
JP2013505707A (ja) 2009-09-25 2013-02-21 上海抗体薬物国家工程研究中心有限公司 コンピュータ支援設計により高親和性の抗体又はタンパク質分子を得る方法
SI2519543T1 (sl) 2009-12-29 2016-08-31 Emergent Product Development Seattle, Llc Beljakovine, ki se vežejo s heterodimeri in njihova uporaba
US20130129723A1 (en) 2009-12-29 2013-05-23 Emergent Product Development Seattle, Llc Heterodimer Binding Proteins and Uses Thereof
TWI653333B (zh) 2010-04-01 2019-03-11 安進研究（慕尼黑）有限責任公司 跨物種專一性之ＰＳＭＡｘＣＤ３雙專一性單鏈抗體
BR112012026213B1 (pt) 2010-04-15 2021-12-28 Medimmune Limited Compostos de pirrolobenzodiazepinas, conjugado das mesmas, composição farmacêutica compreendendo o conjugado e uso do mesmo para o tratamento de uma doença proliferativa
US9150663B2 (en) 2010-04-20 2015-10-06 Genmab A/S Heterodimeric antibody Fc-containing proteins and methods for production thereof
WO2011143545A1 (en) * 2010-05-14 2011-11-17 Rinat Neuroscience Corporation Heterodimeric proteins and methods for producing and purifying them
WO2011147986A1 (en) * 2010-05-27 2011-12-01 Genmab A/S Monoclonal antibodies against her2
JP6082344B2 (ja) 2010-05-27 2017-02-15 ゲンマブ エー／エス Ｈｅｒ２エピトープに対するモノクローナル抗体
US9193791B2 (en) 2010-08-03 2015-11-24 City Of Hope Development of masked therapeutic antibodies to limit off-target effects
RU2013110876A (ru) 2010-08-24 2014-09-27 Рош Гликарт Аг Активируемые биспецифические антитела
US8962804B2 (en) 2010-10-08 2015-02-24 City Of Hope Meditopes and meditope-binding antibodies and uses thereof
RU2604490C2 (ru) 2010-11-05 2016-12-10 Займворкс Инк. ДИЗАЙН УСТОЙЧИВОГО ГЕТЕРОДИМЕРНОГО АНТИТЕЛА С МУТАЦИЯМИ В Fc ДОМЕНЕ
ES2842937T3 (es) 2010-11-10 2021-07-15 Amgen Res Munich Gmbh Prevención de efectos adversos provocados por dominios de unión específicos de CD3
TWI807362B (zh) 2010-11-30 2023-07-01 日商中外製藥股份有限公司 細胞傷害誘導治療劑
CA2818635C (en) 2010-12-06 2021-06-15 National Reseach Council Of Canada Antibodies selective for cells presenting erbb2 at high density
US10689447B2 (en) * 2011-02-04 2020-06-23 Genentech, Inc. Fc variants and methods for their production
JP6101638B2 (ja) 2011-03-03 2017-03-22 ザイムワークス，インコーポレイテッド 多価ヘテロマルチマー足場設計及び構築物
WO2012123949A1 (en) 2011-03-17 2012-09-20 Ramot At Tel-Aviv University Ltd. Bi- and monospecific, asymmetric antibodies and methods of generating the same
EA201791693A1 (ru) 2011-03-25 2018-05-31 Гленмарк Фармасьютикалс С.А. Гетеродимерные иммуноглобулины
HUE041335T2 (hu) 2011-03-29 2019-05-28 Roche Glycart Ag Antitest FC-variánsok
US20140170148A1 (en) 2011-04-20 2014-06-19 Genmab A/S Bispecific antibodies against her2
CN103796677B (zh) 2011-04-20 2019-08-16 健玛保 针对her2和cd3的双特异性抗体
CN107936121B (zh) 2011-05-16 2022-01-14 埃泰美德(香港)有限公司 多特异性fab融合蛋白及其使用方法
SG195072A1 (en) 2011-05-21 2013-12-30 Macrogenics Inc Cd3-binding molecules capable of binding to human and non-human cd3
EP2578230A1 (en) 2011-10-04 2013-04-10 Trion Pharma Gmbh Removal of Tumor Cells from Intraoperative Autologous Blood Salvage
US10851178B2 (en) 2011-10-10 2020-12-01 Xencor, Inc. Heterodimeric human IgG1 polypeptides with isoelectric point modifications
AU2012362378B2 (en) * 2011-12-27 2016-06-23 Dcb-Usa Llc Light chain-bridged bispecific antibody
GB201203442D0 (en) 2012-02-28 2012-04-11 Univ Birmingham Immunotherapeutic molecules and uses
MX353382B (es) 2012-03-01 2018-01-10 Amgen Res Munich Gmbh Moleculas de union polipeptido de larga duracion.
JP6514103B2 (ja) 2012-07-06 2019-05-15 ゲンマブ ビー．ブイ． 三重変異を有する二量体タンパク質
US20150203591A1 (en) 2012-08-02 2015-07-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mutivalent antigen-binding proteins
WO2014028560A2 (en) 2012-08-14 2014-02-20 Ibc Pharmaceuticals, Inc. T-cell redirecting bispecific antibodies for treatment of disease
JOP20200236A1 (ar) 2012-09-21 2017-06-16 Regeneron Pharma الأجسام المضادة لمضاد cd3 وجزيئات ربط الأنتيجين ثنائية التحديد التي تربط cd3 وcd20 واستخداماتها
CN120365432A (zh) 2012-11-21 2025-07-25 武汉友芝友生物制药股份有限公司 双特异性抗体
RU2692773C2 (ru) 2012-11-30 2019-06-27 Ф.Хоффманн-Ля Рош Аг Идентификация пациентов, нуждающихся в совместной терапии с использованием ингибитора pd-l1
US10131710B2 (en) 2013-01-14 2018-11-20 Xencor, Inc. Optimized antibody variable regions
US10968276B2 (en) 2013-03-12 2021-04-06 Xencor, Inc. Optimized anti-CD3 variable regions
JO3529B1 (ar) 2013-02-08 2020-07-05 Amgen Res Munich Gmbh مضاد التصاق خلايا الدم البيض من أجل التخفيف من الاثار السلبية الممكنة الناتجة عن مجالات ارتباط cd3- المحدد
DK2956175T3 (da) 2013-02-15 2017-11-27 Univ California Kimærisk antigenreceptor og fremgangsmåder til anvendelse deraf
WO2014153164A1 (en) 2013-03-14 2014-09-25 The California Institute For Biomedical Research Targeting agent antibody conjugates and uses thereof
US20140302037A1 (en) 2013-03-15 2014-10-09 Amgen Inc. BISPECIFIC-Fc MOLECULES
AU2014229282B2 (en) 2013-03-15 2017-02-02 Glaxosmithkline Intellectual Property (No.2) Limited Low concentration antibody formulations
CN105189544A (zh) 2013-04-19 2015-12-23 科瓦根股份公司 具有抗肿瘤活性的新颖的双特异性结合分子
US10633453B2 (en) 2013-05-28 2020-04-28 Kaohsiung Medical University Antibody locker for the inactivation of protein drug
SG11201509361TA (en) 2013-05-28 2015-12-30 Numab Ag Novel antibodies
AR096687A1 (es) 2013-06-24 2016-01-27 Genentech Inc Anticuerpos anti-fcrh5
CN105531374A (zh) 2013-07-12 2016-04-27 酵活有限公司 双特异性cd3和cd19抗原结合构建体
HRP20220553T1 (hr) 2013-07-25 2022-06-10 Cytomx Therapeutics Inc. Polispecifična protutijela, polispecifična protutijela koja se mogu aktivirati i postupci uporabe navedenih protutijela
JP2016538275A (ja) 2013-11-04 2016-12-08 グレンマーク ファーマシューティカルズ， エセ．アー． Ｔ細胞再標的化ヘテロ二量体免疫グロブリン（ｈｅｔｅｒｏ−ｄｉｍｅｒｉｃ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）の製造
PL3074424T3 (pl) 2013-11-27 2025-06-09 Zymeworks Bc Inc. Bispecyficzne konstrukty wiążące antygen ukierunkowane na her2
MY189089A (en) 2013-12-17 2022-01-25 Genentech Inc Methods of treating cancers using pd-1 axis binding antagonists and taxanes
CN112390883A (zh) 2013-12-17 2021-02-23 基因泰克公司 抗cd3抗体及使用方法
TWI754319B (zh) 2014-03-19 2022-02-01 美商再生元醫藥公司 用於腫瘤治療之方法及抗體組成物
TN2016000525A1 (en) 2014-05-29 2018-04-04 Macrogenics Inc Tri-specific binding molecules and methods of use thereof
US9611325B2 (en) 2014-07-21 2017-04-04 Wuhan Yzy Biopharma Co., Ltd. Construction and application of bispecific antibody HER2xCD3
WO2016014974A2 (en) 2014-07-25 2016-01-28 Cytomx Therapeutics, Inc. Anti-cd3 antibodies, activatable anti-cd3 antibodies, multispecific anti-cd3 antibodies, multispecific activatable anti-cd3 antibodies, and methods of using the same
RU2017105849A (ru) 2014-07-25 2018-08-29 Мемориал Слоан Кеттеринг Кэнсер Сентер Биспецифические молекулы, связывающие her2 и cd3
MA40510A (fr) 2014-08-04 2017-06-14 Hoffmann La Roche Molécules bispécifiques de liaison à l'antigène activant les lymphocytes t
WO2016019969A1 (en) 2014-08-08 2016-02-11 Ludwig-Maximilians-Universität München Subcutaneously administered bispecific antibodies for use in the treatment of cancer
WO2016036678A1 (en) 2014-09-02 2016-03-10 Medimmune, Llc Formulations of bispecific antibodies
MA40764A (fr) 2014-09-26 2017-08-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Agent thérapeutique induisant une cytotoxicité
EP3699198B1 (en) 2014-11-17 2025-03-26 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for tumor treatment using cd3xcd20 bispecific antibody
SG11201704449VA (en) 2014-12-05 2017-06-29 Genentech Inc ANTI-CD79b ANTIBODIES AND METHODS OF USE
WO2016110576A1 (en) 2015-01-08 2016-07-14 Genmab A/S Bispecific antibodies against cd3 and cd20
KR102790523B1 (ko) 2015-02-24 2025-04-02 바이오아트라, 인코퍼레이티드 조건부 활성 생체 단백질
WO2016135239A1 (en) 2015-02-25 2016-09-01 Biotecnol Limited Fusion protein comprising three binding domains to her2
EP3778640A1 (en) 2015-05-01 2021-02-17 Genentech, Inc. Masked anti-cd3 antibodies and methods of use
SI3303400T1 (sl) 2015-05-28 2021-01-29 Genentech, Inc. Na celicah osnovan test za detektiranje anti-CD3 homodimerov
CN107708741A (zh) 2015-06-12 2018-02-16 免疫医疗公司 用嵌合抗原受体(car)构建体和表达car构建体的t细胞(car‑t)或nk细胞(car‑nk)进行的疾病疗法
WO2016204966A1 (en) 2015-06-16 2016-12-22 Genentech, Inc. Anti-cd3 antibodies and methods of use
CN107847568B (zh) 2015-06-16 2022-12-20 豪夫迈·罗氏有限公司 抗cll-1抗体和使用方法
EP3310814B1 (en) 2015-06-16 2023-08-02 F. Hoffmann-La Roche AG Humanized and affinity matured antibodies to fcrh5 and methods of use
KR20180012859A (ko) 2015-06-17 2018-02-06 제넨테크, 인크. 항-her2 항체 및 이용 방법
WO2016210447A1 (en) 2015-06-26 2016-12-29 University Of Southern California Masking chimeric antigen receptor t cells for tumor-specific activation
KR102850929B1 (ko) 2015-12-09 2025-08-27 에프. 호프만-라 로슈 아게 항-약물 항체의 형성을 감소시키기 위한 ii형 항-cd20 항체
WO2017132279A1 (en) 2016-01-25 2017-08-03 Genentech, Inc. Methods for assaying t-cell dependent bispecific antibodies
KR20190074300A (ko) 2016-11-15 2019-06-27 제넨테크, 인크. 항-cd20/항-cd3 이중특이적 항체에 의한 치료를 위한 투약
US10561686B2 (en) 2018-01-12 2020-02-18 Innovative Cellular Therapeutics CO., LTD. Modified cell expansion and uses thereof
US20200339686A1 (en) 2018-01-16 2020-10-29 Lakepharma, Inc. Bispecific antibody that binds cd3 and another target

Also Published As

Publication number Publication date
JP7418501B2 (ja) 2024-01-19
IL302303A (en) 2023-06-01
SG11201604990PA (en) 2016-07-28
SI3083689T1 (sl) 2020-10-30
TWI701261B (zh) 2020-08-11
HRP20201144T1 (hr) 2020-10-30
IL245945B (en) 2020-11-30
HUS2200041I1 (hu) 2022-09-28
EP3736292A1 (en) 2020-11-11
DK3192812T3 (da) 2020-07-13
SG10201800250XA (en) 2018-02-27
PL3736292T3 (pl) 2024-09-23
US20200299409A1 (en) 2020-09-24
HRP20240939T1 (hr) 2024-10-25
JP6449295B2 (ja) 2019-01-09
SI3192812T1 (sl) 2020-10-30
KR102433591B1 (ko) 2022-08-18
PT3083689T (pt) 2020-08-27
CN106029696A (zh) 2016-10-12
HUE067282T2 (hu) 2024-10-28
FR22C1048I2 (fr) 2023-11-17
BR112016014022A2 (pt) 2019-10-01
US10640572B2 (en) 2020-05-05
JP2021006042A (ja) 2021-01-21
BR122021025087B1 (pt) 2023-04-04
ES2986082T3 (es) 2024-11-08
CA2932288A1 (en) 2015-06-25
JP2018082698A (ja) 2018-05-31
TW202118786A (zh) 2021-05-16
EP4410315A3 (en) 2024-10-30
EP3192812A1 (en) 2017-07-19
PL3192812T3 (pl) 2020-10-19
IL263466A (en) 2019-01-31
EP3736292B1 (en) 2024-05-08
KR20220116581A (ko) 2022-08-23
CL2016001556A1 (es) 2017-02-03
LT3083689T (lt) 2020-08-10
PL3083689T3 (pl) 2020-10-19
FI3736292T3 (fi) 2024-07-19
TWI747385B (zh) 2021-11-21
MX2016007958A (es) 2016-08-03
US11186650B2 (en) 2021-11-30
LTPA2022519I1 (sr) 2022-10-10
KR102357961B1 (ko) 2022-02-08
KR20210028735A (ko) 2021-03-12
US20190016823A1 (en) 2019-01-17
RS60443B1 (sr) 2020-07-31
AU2022203605A1 (en) 2022-06-16
KR20250035033A (ko) 2025-03-11
US10865251B2 (en) 2020-12-15
CA3055708C (en) 2023-01-31
BR112016014022B1 (pt) 2023-04-18
PE20161217A1 (es) 2016-11-16
PH12016501186A1 (en) 2016-08-15
JP6526158B2 (ja) 2019-06-05
CA2932288C (en) 2021-11-16
NZ758346A (en) 2021-10-29
KR102225489B1 (ko) 2021-03-10
NZ753232A (en) 2021-10-29
DK3736292T3 (da) 2024-07-22
TW201902932A (zh) 2019-01-16
LT3736292T (lt) 2024-07-25
CN110156893B (zh) 2023-03-03
US20200299408A1 (en) 2020-09-24
FR22C1048I1 (fr) 2022-12-09
US11732054B2 (en) 2023-08-22
ES2813074T3 (es) 2021-03-22
EP3083689A1 (en) 2016-10-26
AU2025226668A1 (en) 2025-09-25
PT3736292T (pt) 2024-07-25
TW201527323A (zh) 2015-07-16
KR20220018628A (ko) 2022-02-15
NL301194I2 (nl) 2023-09-13
IL245945A0 (en) 2016-07-31
AU2020200101A1 (en) 2020-01-30
ES2811923T3 (es) 2021-03-15
ZA201603755B (en) 2023-06-28
UA120753C2 (uk) 2020-02-10
ZA202206078B (en) 2023-11-29
CA3131724A1 (en) 2015-06-25
MX379030B (es) 2025-03-10
IL263466B2 (en) 2023-10-01
JP2017504314A (ja) 2017-02-09
EP4410315A2 (en) 2024-08-07
KR20160098464A (ko) 2016-08-18
NZ721309A (en) 2019-11-29
US12466896B2 (en) 2025-11-11
US20150166661A1 (en) 2015-06-18
US20190112389A1 (en) 2019-04-18
JP2019129831A (ja) 2019-08-08
WO2015095392A1 (en) 2015-06-25
CN112390883A (zh) 2021-02-23
DK3083689T3 (da) 2020-08-03
EP3083689B1 (en) 2020-05-27
US10174124B2 (en) 2019-01-08
SI3736292T1 (sl) 2024-08-30
MX2020001752A (es) 2021-01-15
LT3192812T (lt) 2020-08-10
AU2014364805B2 (en) 2020-01-16
NO2022037I1 (no) 2022-08-24
HUE050159T2 (hu) 2020-11-30
US11530275B2 (en) 2022-12-20
HRP20201143T1 (hr) 2020-10-30
JP2024119828A (ja) 2024-09-03
AU2014364805A1 (en) 2016-06-16
EA201691266A1 (ru) 2017-05-31
US20230002506A1 (en) 2023-01-05
CN106029696B (zh) 2020-07-28
CR20160314A (es) 2016-08-29
LTC3083689I2 (sr) 2024-05-27
EA038933B1 (ru) 2021-11-11
AU2020200101B2 (en) 2022-03-03
CN110156893A (zh) 2019-08-23
CN116041529A (zh) 2023-05-02
BR122021025085B1 (pt) 2023-04-04
IL263466B1 (en) 2023-06-01
MX372658B (es) 2020-05-04
NL301194I1 (sr) 2022-08-24
KR20230132612A (ko) 2023-09-15
US20170204194A1 (en) 2017-07-20
PE20210648A1 (es) 2021-03-26
JP2022137074A (ja) 2022-09-21
SG10201809385RA (en) 2018-11-29
RS65715B1 (sr) 2024-08-30
PT3192812T (pt) 2020-08-28
AU2022203605B2 (en) 2025-06-05
TWI643873B (zh) 2018-12-11
PE20210107A1 (es) 2021-01-19
EP3192812B1 (en) 2020-05-27
JP2022137073A (ja) 2022-09-21
JP6764968B2 (ja) 2020-10-07
CA3055708A1 (en) 2015-06-25
HUE050156T2 (hu) 2020-11-30
UA129760C2 (uk) 2025-07-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7418501B2 (ja) 抗ｃｄ３抗体および使用方法
HK40113554A (en) Anti-cd3 antibodies and methods of use
HK1240252B (en) Anti-cd3 antibodies and methods of use
NZ758555B2 (en) Beta-lactamase inhibitors and uses thereof
NZ758555A (en) Atropine pharmaceutical compositions
HK1240252A1 (en) Anti-cd3 antibodies and methods of use
HK1230625A1 (en) Anti-cd3 antibodies and methods of use
HK1230625B (en) Anti-cd3 antibodies and methods of use
NZ753232B2 (en) Anti-cd3 antibodies and methods of use
HK1227038B (zh) 抗cd3抗體及使用方法