RS65540B1 - Metodi predviđanja terapijske koristi anti-cd19 terapije kod pacijenata - Google Patents

Description

Opis

Oblast pronalaska

[0001] Ovaj pronalazak je usmeren na identifikovanje karakteristika i biomarkera kod pacijenata koji se leče anti-CD19 antitelima.

Pozadina

[0002] CD19 je transmembranski glikoprotein od 95 kDa iz superporodice imunoglobulina koji sadrži dva vanc ́elijska domena slična imunoglobulinu i opsežni rep citoplazme. Protein je površinski receptor pan-B limfocita i sveprisutno se eksprimira od najranijih faza razvoja pre-B c ́elija nadalje dok se ne reguliše tokom terminalne diferencijacije u plazma c ́elije. Specifičan je za liniju B-limfocita i nije izražen na matičnim c ́elijama hematopoeze i drugim imunološkim c ́elijama, osim nekih folikularnih dendritičnih c ́elija. CD19 funkcioniše kao pozitivni regulator signalizacije receptora B c ́elija (BCR) i važan je za aktivaciju i proliferaciju B c ́elija i za razvoj humoralnih imunoloških odgovora. Deluje kao kostimulativni molekul u sprezi sa CD21 i CD81 i presudan je za odgovore B c ́elija na antigene zavisne od T-c ́elija. Citoplazmatski rep CD19 je fizički povezan sa porodicom tirozin kinaza koje pokrec ́u nizvodne signalne puteve preko src porodice proteinskih tirozin kinaza. CD19 je atraktivna meta za karcinome limfoidnog porekla, jer je visoko izražen u skoro svim hroničnim limfocitnim leukemijama (CLL) i ne-Hodgkinovim limfomima (NHL), kao i mnogim drugim različitim vrstama leukemija, uključujuc ́i akutnu limfocitnu leukemiju (ALL) i leukemiju dlakavih c ́elija (HCL).

[0003] Klinički razvoj antitela usmerenih na CD19 ranije je bio ograničen internalizacijom antigena CD19, međutim, poboljšana tehnologija modifikacije antitela obnovila je ovaj potencijalni terapijski cilj. MOR00208 (prethodno nazvano XmAb5574) je Fc inženjersko humanizovano monoklonsko antitelo koje vezuje CD19. Povec ́anje vezivanja MOR00208 Fc za FcγR, usled mutacija stvorenih sa XmAb, značajno poboljšava in vitro zavisnu od c ́elija citotoksičnost (ADCC), c ́elijski posredovanu fagocitozu (ADCP) i direktne citotoksične efekte (apoptoza) na tumor u odnosu na nemodifikovano antitelo. Nije pokazano da MOR00208 posreduje u zavisnosti od citotoksičnosti komplementa.

[0004] MOR00208 je ili se trenutno proučava u kliničkim ispitivanjima u CLL, ALL i NHL. Konkretno, ispitivanje faze I pod naslovom Bezbednost i podnošljivost XmAb®5574 kod hronične limfocitne leukemije i ispitivanje faze IIa pod nazivom Studija Fc-optimizovanog antitela na CD19 (MOR00208) za lečenje B-c ́elijske akutne limfoblastne leukemije (B-ALL) su završeni. Suđenje u fazi I Fc-projektovanog CD19 antitela XmAb5574 (MOR00208) pokazalo je sigurnost i preliminarnu efikasnost kod recidiva CLL (Woyach et al., Blood 124, br. 24: 3553-60 (4. decembar 2014.). Ocena faze IIa pod nazivom Studija Fcoptimizovanog anti-CD19 antitela (MOR00208) za lečenje ne-Hodgkinovog limfoma (NHL) je urađena. A sledec ́a ispitivanja su planirana/ili su u toku: ispitivanje faze II/III pod nazivom Ogledi za procenu efikasnosti i bezbednosti MOR00208 sa bendamustinom (BEN) naspram rituksimaba (RTKS) sa BEN kod odraslih pacijenata sa relapsom ili vatrostalnim difuznim velikim B-c ́elijama limfoma (DLBCL) (B-MIND), studija II faze pod nazivom Studija za procenu efikasnosti i bezbednosti MOR00208 sa idelalizibom kod pacijenata sa R/R CLL/SLL lečenih sa BTKi, studija II faze pod nazivom Studija za procenu bezbednosti i efikasnosti lenalidomida sa MOR00208 kod pacijenata sa RR DLBCL i ispitivanje faze II pod nazivom Faza II MOR00208 u kombinaciji sa lenalidomidom za pacijente sa relapsiranim ili vatrostalnim CLL, SLL ili PLL ili starije pacijente sa nelečenim CLL, SLL ili PLL. U daljem tekuc ́em ispitivanju faze II (COSMOS) proučava se efikasnost i bezbednost MOR00208 u kombinaciji sa idelalisibom ili venetoklaksom kod pacijenata sa relapsom ili vatrostalnom CLL, SLL.

[0005] Efikasnost MOR00208 za jedno sredstvo je prijavljena u CLL i NHL. Opšte promenljive stope odgovora pacijenata na terapije monoklonskim antitelima, međutim, ukazuju na to da su potrebni metodi za tačno predviđanje koji c ́e pacijenti verovatno reagovati na takve terapije antitelima, tako da se lečenje može primenjivati na onim pacijentima koji c ́e najverovatnije dobiti beneficije. Mogu se nac ́i određeni biomarkeri ili karakteristike pacijenata za koje određena koncentracija ili opseg za svaki biomarker korelira sa reakcijom na takvu terapiju.

[0006] Procenjen je uticaj broja prirodnih ubica (NK) na preživljavanje pacijenata sa DLBCL lečenih rituksimabom, ciklofosfamidom, doksorubicin hidrohloridom (hidroksidaunomicin), vinkristin sulfatom (oncovin) i prednizonom (R-CHOP). Kim i sar., Istraživanje krvi, 49: 3, 162-169 (septembar 2014). Ranije je prijavljeno da je broj perifernih NK c ́elija povezan sa kliničkim ishodom kod pacijenata sa aalPI 2-3 DLBCL.

Plonkuet i sar., Ann Oncol 2007; 18: 1209-15. US 2014/328842 A1 otkriva metod za identifikovanje subjekta koji ima ne-Hodgkinov limfom (NHL) koji reaguje na lečenje anti-CD20 antitelom, pri čemu se odgovor na lečenje zasniva na polimorfizmu CD16 (takođe poznat kao FcγRIIIA ). US 2015/0239974 A1 otkriva da trogocitoza (brijanje antigena) izazvana humanizovanim antitelom na CD22 (hRBF4) igra značajnu ulogu u određivanju efikasnosti antitela i reakcije na bolesti za lečenje B-c ́elijskih bolesti, kao što su rak hematopoeze, disfunkcija imunog sistema i/ili autoimune bolesti.

[0007] Jasno je da su potrebni značajni napori i ulaganja da bi se otkrile i identifikovale takve karakteristike pacijenta i biomarkeri koji daju efikasnost.

Rezime pronalaska

[0008] MOR00208 je proučavan na pacijentima koji imaju CLL, ALL, NHL i SLL. Shodno tome, do danas je završena temeljna analiza kliničkih podataka kako bi se identifikovale karakteristike ili biomarkeri pacijenata za koga je verovatnije da c ́e imati koristi od lečenja MOR00208.

[0009] MOR00208 specifično cilja CD19 površinski antigen i posreduje u direktnom ubijanju tumorskih c ́elija pomoc ́u svoje poboljšane ADCC efektorske funkcije. U predkliničkim studijama je pokazano da MOR00208 značajno pojačava in vitro ADCC, ADCP i direktne citotoksične efekte (apoptozu) na c ́elijske linije CD19 koji obuhvataju širok spektar ljudskih limfoma i leukemija (Burkitov limfom, CLL, leukemija dlakavih c ́elija (HCL), CD19 hronična mijeloična leukemija (CML), difuzni limfom velikih c ́elija B (DLBCL) i akutna limfoblastna leukemija (ALL), izražavajuc ́i nivo CD19 antigena u rasponu od 15.000 do 105.000 molekula/c ́eliji. Pacijent sa CLL ili ALL c ́elijama i takođe se očekuje da se prevedu u primarne c ́elije ne-Hodgkinovog limfoma (NHL), jer opseg ekspresije prijavljen za ALL i CLL B c ́elije pokriva opseg primec ́en za NHL B c ́elije (Ginaldi et al., 1998; Olejniczak et al., 2006). Na osnovu široke i homogene površinske ekspresije CD19 u različitim vrstama neoplazmi B c ́elija, efekat MOR00208 u ovoj studiji može se preneti na širok spektar humanog limfoma i leukemije, kao što su CLL, ALL, NHL i SLL i njihovi podtipovi.

[0010] Podaci iz faze IIa ispitivanja pod nazivom Studija Fc-optimizovanog anti-CD19 antitela (MOR00208) za lečenje ne-Hodgkinovog limfoma (NHL) temeljito su analizirani. Kao rezultat ovih napora, sledec ́e otkric ́e daje karakteristike i biomarkere pacijenata kod kojih su antitela CD19 efikasna.

[0011] Konkretno, u najmanjem su procenjene sledec ́e karakteristike pacijenata: a) starost, b) pol, c) da li su pacijenti primili dozu Ritukimaba u poslednjih 6 meseci, d) da li su pacijenti imali reakciju na Ritukimab, e) da li su pacijenti imaju alele FCgammaRllla sa visokim ili malim afinitetom, f) da li pacijenti imaju alele FCgammaRIIa sa visokim ili niskim afinitetom g) da li su pacijenti imali odgovor na prethodni tretman duži od 12 meseci, h) osnovni broj perifernih T c ́elija ( c ́elije/µl), i) osnovni broj perifernih NK c ́elija (c ́elije /µl) i j) bazna ekspresija CD16 na perifernim NK c ́elijama (vezana antitela po c ́elijama -ABC).

[0012] I 1) osnovni broj perifernih NK c ́elija i 2) početna ekspresija CD16 na perifernim NK c ́elijama pokazali su jasne korelacije sa odgovorima pacijenta sa terapijom MOR00208. Preciznije, pacijenti sa vec ́im početnim brojem perifernih NK c ́elija po µl korelirali su sa vec ́om stopom kontrole bolesti (DCR). DCR uključuje pacijente koji imaju potpuni odgovor (CR) delimični odgovor (PR) stabilnu bolest (SD). Pored toga, takvi pacijenti su imali znatno bolju stopu preživljavanja bez progresije bolesti (PFS) u poređenju sa pacijentima sa nižim brojem NK c ́elija. Pored toga, pacijenti koji imaju početnu ekspresiju CD16 na NK c ́elijama od najmanje 60 000 (ABC) korelirali su sa vec ́om stopom kontrole bolesti (DCR).

[0013] Stoga c ́e verovatnije imati koristi od lečenja MOR00208 pacijenti kojima je dijagnostikovan CLL, ALL, NHL i SLL i koji imaju: a) visok broj perifernih NK c ́elija ili 2) početnu ekspresiju CD16 na perifernim NK c ́elijama od najmanje 60000 ABC.

[0014] I 1) osnovni broj perifernih NK c ́elija i 2) početna ekspresija CD16 na perifernim NK c ́elijama pokazali su jasne korelacije sa odgovorima pacijenta sa terapijom MOR00208. Preciznije, pacijenti sa početnim brojem perifernih NK c ́elija od najmanje 50 c ́elija/µl korelirali su sa višom stopom kontrole bolesti (DCR). DCR uključuje pacijente koji imaju potpuni odgovor (CR) delimični odgovor (PR) stabilnu bolest (SD). Pored toga, pacijenti sa početnim brojem NK c ́elija od najmanje 50 c ́elija/µl su imali zbačajno bolju stopu preživljavanja bez progresije bolesti (PFS) u poređenju sa pacijentima sa nižim brojem NK c ́elija. Pored toga, pacijenti koji imaju početnu ekspresiju CD16 na NK c ́elijama od najmanje 60 000 (ABC) korelirali su sa vec ́om stopom kontrole bolesti (DCR).

[0015] Stoga su bolji rezultati pacijenta kojima je dijagnostikovan CLL, ALL, NHL i SLL i koji imaju: a) početni broj perifernih NK c ́elija od najmanje 50 c ́elija/µl ili 2) početnu ekspresiju CD16 na perifernim NK c ́elijama od najmanje 60.000 ABC od tretmana MOR00208.

[0016] I 1) osnovni broj perifernih NK c ́elija i 2) početna ekspresija CD16 na perifernim NK c ́elijama pokazali su jasne korelacije sa odgovorima pacijenta sa terapijom MOR00208. Preciznije, pacijenti sa početnim brojem perifernih NK c ́elija od najmanje 100 c ́elija/µl korelirali su sa višom stopom kontrole bolesti (DCR). DCR uključuje pacijente koji imaju potpuni odgovor (CR) delimični odgovor (PR) stabilnu bolest (SD). Pored toga, pacijenti sa početnim brojem NK c ́elija od najmanje 100 c ́elija/µl imali su značajno bolju stopu preživljavanja bez progresije bolesti (PFS) u poređenju sa pacijentima sa nižim brojem NK c ́elija. Pored toga, pacijenti koji imaju početnu ekspresiju CD16 na NK c ́elijama od najmanje 60 000 (ABC) korelirali su sa vec ́om stopom kontrole bolesti (DCR).

[0017] Stoga su bolji rezultati kod pacijenta kojima je dijagnostikovan CLL, ALL, NHL i SLL i koji imaju: a) početni broj perifernih NK c ́elija od najmanje 100 c ́elija/µl l ili 2) početnu ekspresiju CD16 na perifernim NK c ́elijama od najmanje 60.000 ABC od tretmana MOR00208.

[0018] Pronalazak obezbeđuje metod identifikacije subjekta koji ima hroničnu limfocitnu leukemiju (CLL) ili akutnu limfoblastnu leukemiju (ALL) koji reaguje na lečenje anti-CD19 antitelom, navedeni postupak obuhvata:

a. obezbeđivanje uzorka krvi dobijenog od navedenog subjekta pre lečenja navedenim antitelom CD19,

b. određivanje nivoa najmanje jednog biomarkera u navedenom uzorku odabranom iz grupe koju čine:

i. broj perifernih NK c ́elija i

ii. nivoi ekspresije CD16 na perifernim NK c ́elijama,

c. upoređivanje nivoa navedenog najmanje jednog biomarkera u navedenom uzorku sa unapred određenim graničnim nivoom,

pri čemu nivoi navedenog najmanje jednog biomarkera na ili iznad unapred određenog graničnog nivoa ukazuju na subjekta koji bi imao koristi od tretmana sa anti-CD19 antitelom.

[0019] Pronalazak takođe obezbeđuje anti-CD19 antitelo za upotrebu u lečenju pacijenata koji boluju od hronične limfocitne leukemije (CLL) ili akutne limfoblastne leukemije (ALL), pri čemu je pacijent identifikovan u skladu sa metodom pronalaska.

Opis crteža

[0020]

Slika 1 prikazuje aminokiselinske sekvence promenljivih domena MOR00208 i CDR.

Slika 2 prikazuje aminokiselinske sekvence punih teških i laganih lanaca MOR00208.

Slika 3 prikazuje analizu primljenih operativnih karakteristika (ROC) perifernih brojeva NK c ́elija kao prediktora za DCR.

Slika 4 prikazuje ROC analizu nivoa ekspresije CD16 na perifernim NK c ́elijama (ABC) kao prediktor za DCR.

Slika 5 prikazuje ROC analizu broja perifernih T c ́elija kao potencijalnih prediktora za DCR.

Slika 6 pokazuje da su brojevi perifernih NK c ́elija i nivoi ekspresije CD16 na perifernim NK c ́elijama nezavisne promenljive i da nisu u korelaciji.

Slika 7 prikazuje deo sa DCR-ima u podskupovima pacijenata sa specifičnim osnovnim karakteristikama i biomarkerima.

Slika 8 prikazuje razliku u stopi preživljavanja bez progresije bolesti kod pacijenata koji imaju najmanje 100 c ́elija/µl broja perifernih NK c ́elija naspram pacijenata sa nižim brojem NK c ́elija.

Slika 9 prikazuje razliku u stopi preživljavanja bez progresije bolesti između pacijenata koji imaju najmanje 60 000 ABC u ekspresiji CD16 na perifernim NK c ́elijama u odnosu na pacijente koji imaju nižu ekspresiju CD16 na NK c ́elijama.

Slika 10 prikazuje razliku u stopi preživljavanja bez progresije bolesti između pacijenata koji imaju najmanje 500 c ́elija/µl broja perifernih T c ́elija u odnosu na pacijente sa nižim brojem T c ́elija.

Detaljan opis

[0021] Izraz "antitelo" označava monoklonska antitela, uključujuc ́i bilo koji izotip, kao što su IgG, IgM, IgA, IgD i IgE. IgG antitelo se sastoji od dva identična teška lanca i dva identična laka lanca koja su povezana disulfidnim vezama. Svaki teški i laki lanac sadrži konstantni i promenljivi region. Svaka varijabilna regija sadrži tri segmenta nazvana „regioni koji određuju komplementarnost“ („CDR“) ili „hipervarijabilni regioni“, koji su prvenstveno odgovorni za vezivanje epitopa antigena. Oni se nazivaju CDR1, CDR2 i CDR3, numerisani redom od N-kraja. Veoma konzervirani delovi promenljivih regiona izvan CDR-a nazivaju se „okvirni regioni“. „Fragment antitela“ označava Fv, scFv, dsFv, Fab, Fab ’F (ab’) 2 fragment ili drugi fragment, koji sadrži najmanje jedan promenljivi teški ili promenljivi laki lanac, od kojih svaki sadrži CDR i okvirne regione.

[0022] "VH" se odnosi na promenljivi region teškog lanca imunoglobulina antitela ili njegovog fragmenta. "VL" se odnosi na promenljivi region lakog lanca imunoglobulina antitela ili njegovog fragmenta.

[0023] "Fc region" označava konstantni region antitela, koji kod ljudi može biti iz podklase IgG1, 2, 3, 4 ili drugih. Sekvence humanih Fc regiona dostupne su na IMGT, Human IGH C-REGIONs, www.imgt.org/IMGTrepertoire/Proteins/protein/human/IGH/IGHC/Hu_IGHCallgenes.html

(preuzeto 16. maja 2011).

[0024] Termin pacijent uključuje čoveka.

[0025] NHL je heterogeni malignitet poreklom iz limfocita. U Sjedinjenim Državama (SAD), učestalost se procenjuje na 65 000/godišnje sa smrtnošc ́u od približno 20 000 (American Cancer Society, 2006; i SEER Cancer Statistics Review). Bolest se može javiti u svim uzrastima, uobičajeni početak započinje kod odraslih starijih od 40 godina, a učestalost se povec ́ava sa godinama. NHL karakteriše klonska proliferacija limfocita koji se akumuliraju u limfnim čvorovima, krvi, koštanoj srži i slezini, iako može biti uključen bilo koji glavni organ. Trenutni sistem klasifikacije koji koriste patolozi i kliničari je Klasifikacija tumora Svetske zdravstvene organizacije (WHO), koja organizuje NHL u prekursor i zrele neoplazme B-c ́elija ili T-c ́elija. PDK trenutno deli NHL kao pasivan ili agresivan za ulazak u klinička ispitivanja. Pasivnu NHL grupu čine prvenstveno folikularni podtipovi, mali limfocitni limfom, MALT (limfoidno tkivo povezano sa sluzokožom) i marginalna zona; indolent obuhvata približno 50 % novootkrivenih NHL pacijenata sa B-c ́elijama. Agresivni NHL uključuje pacijente sa histološkim dijagnozama primarno difuznih velikih B c ́elija (DLBL, DLBCL ili DLCL) (40 % svih novootkrivenih pacijenata ima difuzne velike c ́elije), Burkitove i ćelije omotača. Klinički tok NHL je veoma varijabilan. Glavna odrednica kliničkog toka je histološki podtip. Vec ́ina indolentnih tipova NHL-a smatra se neizlečivom bolešc ́u. Pacijenti u početku reaguju na hemoterapiju ili terapiju antitelima i vec ́ina c ́e se oporaviti. Dosadašnje studije nisu pokazale poboljšanje stope preživljavanja ranom intervencijom. Kod asimptomatskih pacijenata, prihvatljivo je „gledati i čekati“ dok pacijent ne postane simptomatičan ili dok se čini da se tempo bolesti ubrzava. Vremenom se bolest može transformisati u agresivniju histologiju. Medijan preživljavanja je 8 do 10 godina, a indolentni pacijenti često dobijaju 3 ili više tretmana tokom faze lečenja svoje bolesti. Početno lečenje simptomatskog indolentnog NHL pacijenta u prošlosti je bilo kombinovana hemoterapija. Sredstva koja se najčešc ́e koriste uključuju: ciklofosfamid, vinkristin i prednizon (CVP); ili ciklofosfamid, adriamicin, vinkristin, prednizon (CHOP). Otprilike 70 % do 80 % pacijenata c ́e odgovoriti na početnu hemoterapiju, a trajanje remisije traje oko 2-3 godine. Na kraju se vec ́ina pacijenata recidivira. Otkric ́e i klinička upotreba CD20 antitela, rituksimab, obezbedilo je značajna poboljšanja u odgovoru i stopi preživljavanja. Trenutni standard nege za vec ́inu pacijenata je rituksimab CHOP (R-CHOP) ili ritukimab CVP (R-CVP). Interferon je odobren za početno lečenje NHL u kombinaciji sa alkilirajuc ́im agensima, ali se pokazalo da ima ograničenu upotrebu u SAD-u. Rituksimab je efikasan u nekoliko vrsta NHL-a i trenutno je odobren kao prva linija lečenja za indolentne (folikularni limfom) i agresivne NHL (difuzni limfom velikih B c ́elija). Međutim, postoje značajna ograničenja anti-CD20 monoklonskih antitela (mAb), uključujuc ́i primarnu rezistenciju (50 % odgovora kod recidiviranih indolentnih pacijenata), stečenu rezistenciju (50 % stopa odgovora nakon ponovnog lečenja), retki potpuni odgovor (2 % potpunog rezoniranja) stopa ponovljene populacije) i kontinuirani obrazac recidiva. Konačno, mnoge B c ́elije ne eksprimiraju CD20, a samim tim mnogi poremec ́aji B c ́elija se ne leče korišc ́enjem terapije CD20 antitelima.

[0026] Pored NHL-a, postoji nekoliko vrsta leukemija koje su rezultat disregulacije B c ́elija. Hronična limfocitna leukemija (poznata i kao „hronična limfoidna leukemija“ ili „CLL“) je vrsta leukemije odraslih uzrokovana abnormalnim nakupljanjem B limfocita. U CLL, maligni limfociti mogu izgledati normalno i zrelo, ali nisu u stanju da se efikasno nose sa infekcijom. CLL je najčešc ́i oblik leukemije kod odraslih. Muškarci imaju dvostruko vec ́u verovatnoc ́u da c ́e razviti HLO nego žene. Međutim, ključni faktor rizika je starost. Preko 75 % novih slučajeva dijagnostikuje se kod pacijenata starijih od 50 godina. Više od 10.000 slučajeva dijagnostikuje se svake godine, a smrtnost je skoro 5.000 godišnje (American Cancer Society, 2006; i SEER Cancer Statistics Reviev). HLL je neizlečiva bolest, ali u vec ́ini slučajeva sporo napreduje. Mnogi ljudi sa CLL vode dugi niz godina normalan i aktivan život. Zbog svog sporog početka, CLL u ranoj fazi se uglavnom ne leči, jer se veruje da rana intervencija CLL ne poboljšava vreme preživljavanja ili kvalitet života. Umesto toga, stanje se nadgleda tokom vremena. Početni CLL tretmani variraju u zavisnosti od tačne dijagnoze i progresije bolesti. Postoje desetine sredstava koja se koriste za CLL terapiju. Kombinovani režimi hemoterapije kao što su FCR (fludarabin, ciklofosfamid i rituksimab) i BR (ibrutinib i rituksimab) efikasni su i kod novootkrivenih i kod relapsnih CLL. Alogena transplantacija koštane srži (matične c ́elije) retko se koristi kao posledica prve linije lečenja za CLL zbog njegovog rizika.

[0027] Druga vrsta leukemije je mali limfocitni limfom (SLL) koji se smatra varijantom CLL-a kojoj nedostaje klonska limfocitoza potrebna za CLL dijagnozu, ali na drugi način deli patološke i imunofenotipske osobine (Campo et al., 2011). Definicija SLL zahteva prisustvo limfodenopatije i/ili splenomegalije. Štaviše, broj B limfocita u perifernoj krvi ne bi trebalo da prelazi 5 x 109/L. U SLL, dijagnozu treba potvrditi histopatološkom procenom biopsije limfnih čvorova kad god je to moguc ́e (Hallek i sar., 2008). Incidencija SLL je približno 25 % CLL u SAD-u (Dores et al., 2007).

[0028] Druga vrsta leukemije je akutna limfoblastna leukemija (ALL), takođe poznata kao akutna limfocitna leukemija. ALL karakteriše hiperprodukcija i kontinuirano umnožavanje malignih i nezrelih belih krvnih zrnaca (poznatih i kao limfoblasti) u koštanoj srži. „Akutno“ se odnosi na nediferencirano, nezrelo stanje cirkulišuc ́ih limfocita („eksplozije“) i da bolest brzo napreduje sa očekivanim životnim vekom od nekoliko nedelja do meseci ako se ne leči. ALL je najčešći u detinjstvu sa najvec ́om incidencijom od 4-5 godina. Deca od od 12 do 16 godina umiru lakše od nje od ostalih. Trenutno se najmanje 80 % svih stanja smatra izlečivim. Svake godine se dijagnostikuje manje od 4.000, a smrtnost je skoro 1.500 godišnje (American Cancer Society, 2006; i SEER Cancer Statistics Review).

[0029] Upotreba antitela CD19 u nespecifičnim limfomima B c ́elija razmatrana je u WO2007076950 (US2007154473). Upotreba antitela CD19 u CLL, NHL i ALL opisana je u Scheuermann et al., Antigen CD19 kod dijagnoza leukemije, limfoma i imunoterapije, Leukemjia and Limfom, Vol. 18, 385-397 (1995).

[0030] Dodatna specifična CD19 antitela su opisana u WO2005012493 (US7109304), WO2010053716 (US12/ 266,999) (Immunomedics); WO2007002223 (US US8097703) (Medarex); WO2008022152 (US12/377,251) i WO2008150494 (Xencor), WO2008031056 (US11/852,106) (Medimmune); WO 2007076950 (US 11/648.505) (Merck Patent GmbH); WO 2009/052431 (US12/253,895) (Seattle Genetics); i WO2010095031 (US12/ 710,442) (Glenmark Pharmaceuticals), WO2012010562 i WO2012010561 (Međunarodni razvoj lekova), WO2011147834 (Roche Glycart) i WO 2012/156455 (Sanofi).

[0031] Pojam "CD19" odnosi se na protein poznat kao CD19, koji ima sledec ́e sinonime: B4, B-limfocitni antigen CD19, B-limfocitni površinski antigen B4, CVID3, antigen diferencijacije CD19, MGC12802 i antigen površinske T-c ́elije Leu-12.

[0032] Humani CD19 ima aminokiselinsku sekvencu:

[0033] "MOR00208" je anti-CD19 antitelo . Sekvenca aminokiselina promenljivih domena je data na slici 1. Sekvenca aminokiselina Fc regiona teškog i lakog lanca MOR00208 data je na slici 2. "MOR00208" i "XmAb 5574" se koriste kao sinonimi za opis antitela prikazanih na slikama 1 i 2. Antitelo MOR00208 je opisano u US patentnoj prijavi serijski broj 12/377,251.

[0034] US broj 12/377,251 opisuje antitelo nazvano 4G7 H1.52 Hibrid S239D/I332E/4G7 L1.155 (kasnije nazvano MOR00208) kako sledi:

[0035] Farmaceutska kompozicija uključuje aktivno sredstvo, npr. antitelo za terapijsku upotrebu kod ljudi. Farmaceutska kompozicija može dodatno da uključuje farmaceutski prihvatljive nosače ili pomoc ́ne supstance.

[0036] "Administrirani" ili "administracija" se odnosi na isporuku farmaceutskog preparata u obliku za injekcije, kao što je, na primer, intravenski, intramuskularni, intradermalni ili potkožni put ili put sluzokože, na primer, kao sprej za nos ili aerosol za inhalaciju ili kao rastvor, kapsula ili tableta za gutanje.

[0037] Antitelo koje se daje prema ovom pronalasku daje se pacijentu u terapeutski efikasnoj količini. „Terapeutski efikasna količina“ odnosi se na količinu dovoljnu da obezbedi izvesno poboljšanje kliničkih manifestacija date bolesti ili poremec ́aja. Kao primer, pacijenti u prikazanoj studiji primali su dozu MOR00208 od 12 mg/kg jednom nedeljno, i na održavanju jednom u dve nedelje ili mesečno.

[0038] Količina koja je efikasna za određenu terapijsku svrhu zavisic ́e od težine bolesti ili povrede, kao i od težine i opšteg stanja subjekta. Podrazumeva se da se određivanje odgovarajuc ́e doze može postic ́i rutinskim eksperimentisanjem konstruisanjem matrice vrednosti i ispitivanjem različitih tačaka u matrici, i sve to je u okviru uobičajenih veština obučenog lekara ili kliničkog naučnika.

[0039] Osnovno stanje znači pre primene željene terapije. Na primer, pre primene željenog anti- CD19 antitela.

[0040] Analiza operativnih karakteristika prijemnika (ROC) korišc ́ena je za analizu predvidljivosti, osetljivosti, specifičnosti i određivanje graničnih vrednosti za potencijalne biomarkere, kao što je broj NK c ́elija, nivo ekspresije CD16 na NK c ́elijama i broj T c ́elija. Sledec ́e dodatne metode postoje za procenu optimalne granične vrednosti: „Max. tačnost“ - granična vrednost koja maksimizira tačnost; b) "Max.DOR" -granična vrednost koja maksimizira dijagnostički odnos stopa; c) „Stopa greške“ - granična vrednost koja minimizira stopu greške; d) "Max.tačnost regije" - granična vrednost koja maksimizira regiju tačnosti; e) "Max.Sens Spec" - granična vrednost koja maksimizira zbir osetljivosti sa specifičnošc ́u; f) "Mak.Iouden" -granica koja maksimizira Ioudenov indeks; g) "Se = Sp" - granična vrednost č iji je osetljivost jednaka specifičnosti; h) „Min.ROC.Dist“ - granična vrednost koja umanjuje rastojanje između krivine i gornjeg levog ugla grafikona; i) "Maks. efikasnost" - granična vrednost koja maksimizira efikasnost; i j) "Min.MCT" -granična vrednost koja minimizira period troškova pogrešne klasifikacije. Videti Lopez-Raton, M., Rodriguez-Alvarez, M.KX, Cadarso-Suarez, C. i Gude-Sampedro, F. (2014). Optimalne granične tačke: R paket za odabir optimalnih graničnih tačaka u dijagnostičkim testovima. Časopis za statistički softver 61 (8), 1-36.

[0041] Antitela specifična za CD19 su takođe testirana pretklinički u kombinaciji sa drugim lekovima. Na primer, MOR00208 je testiran u kombinaciji sa azotnom senfom, analozima purina, analogima talidomida, inhibitorom 3-kinaze fosfoi-nositi, BCL-2 inhibitorima brutonove tirozin kinaze (BTK).

[0042] "Azotni iperit" je nespecifično sredstvo za alkilovanje DNK koje se koristi kao hemoterapija. Sredstva za alkilovanje dodaju alkil grupu (CnH2n 1) u baze nukleinskih kiselina, npr. dodavanjem alkil grupe u gvaninsku bazu DNK na atomu azota broj 7 prstena imidazola. Koraci alkilacije rezultiraju stvaranjem međuslojnih unakrsnih veza (ICL). Ove ICL su visoko citotoksične, jer blokiraju osnovne metaboličke procese kao što su replikacija i transkripcija. Azotni iperit uključuje ciklofosfamid, hlorambucil, uramustin, ifosfamid, melfalan i bendamustin.

[0043] Bendamustin se prodaje pod imenima Ribomustin® i Treanda®, a poznat je i pod nazivom SDKS-105, od strane Mundipharma International Corporation Limited (imalac licence kompanije Astellas Pharma GmbH) i Cephalon za lečenje hronične limfocitne leukemije (CLL), indolentnog B-c ́elijskog ne-Hodgkinovog limfoma (NHL) i drugih limfoma. Bendamustin ima sledeću strukturu:

[0044] Analog purina je antimetabolit, koji oponaša strukturu metaboličkih purina, ometajuc ́i tako sintezu nukleinskih kiselina. Na primer, fludarabin se može ugraditi u RNK i DNK zamenom nukleotida purina, adenina i gvanina. Analozi purina inhibiraju rast brzo proliferirajuc ́ih c ́elija pojedinca, npr. c ́elije karcinoma, c ́elije koštane srži ili c ́elije prisutne u gastrointestinalnom traktu. Analozi purina uključuju merkaptopurin, azatioprin, tioguanin i fludarabin. Fludarabin ili fludarabin fosfat (Fludara®) je hemoterapijski lek koji se koristi u lečenju hronične limfocitne leukemije i indolentnih ne-Hodgkinsovih limfoma. Fludarabin je analog purina. Fludarabin inhibira sintezu DNK ometajuc ́i ribonukleotid reduktazu i DNK polimerazu i specifičan je za S fazu (obzirom da su ovi enzimi veoma aktivni tokom replikacije DNK). Fludarabin ima sledec ́u strukturu:

[0045] "Analog talidomida" uključuje, ali nije ograničen na, sam talidomid, lenalidomid (CC-5013, RevlimidTM), Pomalidomid (CC4047, ActimidTM) i jedinjenja otkrivena u WO2002068414 i WO2005016326. Termin se odnosi na sintetičko hemijsko jedinjenje koje koristi strukturu talidomida kao okosnicu (npr. dodate su bočne grupe ili su takve grupe izbrisane iz matične strukture). Analog se razlikuje u strukturi od talidomida i njegovih metabolitnih jedinjenja, kao što je razlika u dužini alkilnog lanca, molekularnog fragmenta, za jednu ili više funkcionalnih grupa ili promena u jonizaciji. Termin „analog talidomida“ takođe uključuje metabolite talidomida. Analozi talidomida uključuju racemsku smešu S- i R-enantiomera određenog jedinjenja i S-enantiomera ili R-enantiomera pojedinačno. Poželjna je racemska smeša.

[0046] Analozi talidomida uključuju jedinjenja sledec ́ih struktura: (A) Lenalidomid

[0047] „Inhibitor fosfoinozitid 3-kinaze“ je klasa medicinskog leka koji deluje inhibirajuc ́i jedan ili više enzima fosfoinozitid 3-kinaze, koji su deo PI3K/AKT/mTOR, važnog signalnog puta za mnoge c ́elijske funkcije kao što su kontrola rasta, metabolizam i iniciranje translacije.

[0048] Postoji niz različitih klasa i izoforma PI3K. PI3K klase 1 imaju katalitičku podjedinicu poznatu kao p110, sa četiri tipa (izoforme) - p110 alfa, p110 beta, p110 gama i p110 delta. Inhibitori struje koji se proučavaju inhibiraju jedan ili više izoformi klase I PI3K.

[0049] Inhibitori fosfoinozitid 3-kinaze uključuju najmanje Idelalisib, Duvelisib i Kopanlisib. Idelalisib prodaje Gilead Sciences, Inc. (trgovačko ime Zidelig, takođe nazvano GS-1101 ili CAL-101). Idelalisib je trenutno u upotrebi za lečenje recidivne hronične limfocitne leukemije (HLL), u kombinaciji sa rituksimabom, kod pacijenata za koje bi se sam rituksimab smatrao odgovarajuc ́om terapijom zbog drugih istovremenih morbiditeta; relapsi folikularnog B-c ́elijskog ne-Hodgkinovog limfoma (FL) kod pacijenata koji su primili najmanje dve prethodne sistemske terapije; relapsa malog limfocitnog limfoma (SLL) kod pacijenata koji su primili najmanje dve prethodne sistemske terapije. Supstanca deluje kao inhibitor fosfoinozitid 3-kinaze; tačnije, blokira P110d, delta izoformu enzima fosfoinozitid 3-kinaze.

[0050] Formula Idelalisiba je:

[0051] „Inhibitor Brutonove tirozin kinaze (BTK)“ je klasa lekova koja deluje inhibiranjem proteina tirozinenzim BTK kinaze, koji igra važnu ulogu u razvoju B-c ́elija. Konkretno, BTK sadrži PH domen koji vezuje fosfatidilinozitol (3,4,5) -trifosfat (PIP3). Vezivanje PIP3 indukuje Btk za fosforilaciju fosfolipaze C, koja zauzvrat hidrolizuje PIP2, fosfatidilinozitol, u dva druga prenosnika, inositol trifosfat (IP3) i diacilglicerol (DAG), koji zatim moduliraju aktivnost proteina tokom signalizacije B-c ́elija.

[0052] Inhibitori Brutonove tirozin kinaze (BTK) uključuju Ibrutinib. Ibrutinib prodaju Pharmacyclics, Inc i Johnson & Johnson’s Janssen Pharmaceutical (trgovačko ime Imbruvica, takođe nazvano PCI-32765). Ibrutinib je trenutno u upotrebi za lečenje pacijenata sa limfomom mantilnih ćelija (MCL) koji su primili najmanje jednu prethodnu terapiju, hroničnom limfocitnom leukemijom (CLL) koji su primili najmanje jednu prethodnu terapiju, hroničnom limfocitnom leukemijom sa delecijom 17p i Valdenstromovom makroglobulinemijom. Formula Ibrutiniba je 1 - [(3R) -3- [4-amino-3- (4-fenoksifenil) -lH-pirazolo [3,4-d] pirimidin-1-il] -1-piperidinil] -2 -propen-1-one i ima sledec ́u strukturu:

[0053] "BCL-2 inhibitor" je klasa lekova koja deluje inhibicijom antiapoptotičnog B-c ́elijskog limfoma-2 (Bcl-2) proteina, što dovodi do programirane c ́elijske smrti c ́elija. Inhibitor BCL-2 uključuje venetoklaks. Venetoklaks prodaju Abbvie i Genentech (trgovačko ime VENCLEKSTATM, takođe poznato kao GDC-0199, ABT-199 i RG7601). Venetoklaks je trenutno u upotrebi za lečenje pacijenata sa hroničnom limfocitnom leukemijom (CLL) sa delecijom 17p, kako je utvrđeno testom odobrenim od strane FDA, koji su primili najmanje jednu prethodnu terapiju. Formula venetoklaksa je 4- (4 - {[2- (4-hlorofenil) -4,4-dimetil-1-cikloheksen-1-il] metil} -1-piperazinil) -N - ({3-nitro- 4 - [(tetrahidro-2H-piran-4-ilmetil) amino] fenil} sulfonil) -2- (1H-pirolo [2,3-b] piridin-5-iloksi) benzamid i ima sledec ́u strukturu:

[0054] "Venetoklaks", "ABT" i "ABT-199" se ovde koriste kao sinonimi.

Izvođenja

[0055] Aspekt je metoda identifikacije subjekta koji ima hroničnu limfocitnu leukemiju (CLL) ili akutnu limfoblastnu leukemiju (ALL) koji reaguje na lečenje anti-CD19 antitelom, navedeni metod obuhvata:

a. obezbeđivanje uzorka dobijenog od navedenog subjekta pre lečenja navedenim anti-CD19 antitelom,

b. određivanje nivoa najmanje jednog biomarkera u navedenom uzorku odabranom iz grupe koju čine:

i. broj perifernih NK c ́elija i

ii. nivoi ekspresije CD16 na perifernim NK c ́elijama,

c. upoređivanje nivoa navedenog najmanje jednog biomarkera u navedenom uzorku sa unapred određenim graničnim nivoom,

pri čemu nivoi navedenog najmanje jednog biomarkera na ili iznad unapred određenog graničnog nivoa ukazuju na subjekta koji bi imao koristi od tretmana sa anti-CD19 antitelom.

[0056] U realizacijama, navedeni uzorak sadrži periferne NK c ́elije.

[0057] U realizacijama, unapred određeni nivo navedenog biomarkera je osnovni broj perifernih NK c ́elija od najmanje 50 ć elija/µl, najmanje 75 ć elija/µl, najmanje 100 ć elija/µl, najmanje 125 ć elija/µl, najmanje 150 ćelija/µl, najmanje 175 ćelija/µl, najmanje 200 ćelija/µl, najmanje 225 ćelija/µl ili najmanje 250 ćelija/µl. U realizacijama, unapred određeni nivoi navedenog biomarkera su početni nivoi ekspresije CD16 na perifernim NK c ́elijama od najmanje 45 000 ABC, najmanje 60 000 ABC, najmanje 75 000 ABC ili najmanje 90000 ABC.

[0058] U realizacijama, unapred određeni nivo navedenog biomarkera je:

1

a. osnovni broj perifernih NK c ́elija od najmanje 50 ćelija/µl, ili

b. početni nivo ekspresije CD16 na perifernim NK c ́elijama od najmanje 60000 (ABC).

[0059] U realizacijama, unapred određeni nivo navedenog biomarkera je:

a. osnovni broj perifernih NK c ́elija od najmanje 50 ćelija/µl, i

b. početni nivo ekspresije CD16 na perifernim NK c ́elijama od najmanje 60000 (ABC).

[0060] U realizacijama, unapred određeni nivo baznog broja perifernih NK c ́elija od najmanje 50 ćelija/µl. U realizacijama, unapred određeni nivo navedenog biomarkera je osnovni nivo ekspresije CD16 na perifernim NK c ́elijama od najmanje 60000 (ABC).

[0061] U realizacijama, unapred određeni nivo navedenog biomarkera je:

a. osnovni broj perifernih NK c ́elija od najmanje 70 ćelija/µl ili

b. početni nivo ekspresije CD16 na perifernim NK c ́elijama od najmanje 60000 (ABC).

[0062] U realizacijama, unapred određeni nivo navedenog biomarkera je:

a. osnovni broj perifernih NK c ́elija od najmanje 70 ćelija/µl, i

b. početni nivo ekspresije CD16 na perifernim NK c ́elijama od najmanje 60000 (ABC).

[0063] U realizacijama, unapred određeni nivo osnovnog broja perifernih NK c ́elija od najmanje 70 ćelija/µl. U realizacijama, unapred određeni nivo navedenog biomarkera je osnovni nivo ekspresije CD16 na perifernim NK c ́elijama od najmanje 60000 (ABC).

[0064] U realizacijama, unapred određeni nivo navedenog biomarkera je:

a. osnovni broj perifernih NK c ́elija od najmanje 80 ćelija/µl, ili

b. početni nivo ekspresije CD16 na perifernim NK c ́elijama od najmanje 60000 (ABC).

[0065] U realizacijama, unapred određeni nivo navedenog biomarkera je:

a. osnovni broj perifernih NK c ́elija od najmanje 80 ćelija/µl, i

b. početni nivo ekspresije CD16 na perifernim NK c ́elijama od najmanje 60000 (ABC).

[0066] U realizacijama, unapred određeni nivo odseka baznog broja perifernih NK c ́elija od najmanje 80 ćelija/µl. U realizacijama, unapred određeni nivo navedenog biomarkera je osnovni nivo ekspresije CD16 na perifernim NK c ́elijama od najmanje 60000 (ABC).

[0067] U realizacijama, unapred određeni nivo navedenog biomarkera je:

a. osnovni broj perifernih NK c ́elija od najmanje 90 ćelija/µl, ili

b. početni nivo ekspresije CD16 na perifernim NK c ́elijama od najmanje 60000 (ABC).

[0068] U realizacijama, unapred određeni nivo navedenog biomarkera je:

a. osnovni broj perifernih NK c ́elija od najmanje 90 ćelija/µl, i

b. početni nivo ekspresije CD16 na perifernim NK c ́elijama od najmanje 60000 (ABC).

[0069] U realizacijama, unapred određeni nivo baznog broja perifernih NK c ́elija od najmanje 90 ćelija/µl. U realizacijama, unapred određeni nivo navedenog biomarkera je osnovni nivo ekspresije CD16 na perifernim NK c ́elijama od najmanje 60000 (ABC).

[0070] U realizacijama, unapred određeni nivo navedenog biomarkera je:

a. osnovni broj perifernih NK c ́elija od najmanje 100 ćelija/µl, ili

b. početni nivo ekspresije CD16 na perifernim NK c ́elijama od najmanje 60000 (ABC).

[0071] U realizacijama, unapred određeni nivo navedenog biomarkera je:

a. osnovni broj perifernih NK c ́elija od najmanje 100 ćelija/µl, i

b. početni nivo ekspresije CD16 na perifernim NK c ́elijama od najmanje 60000 (ABC).

[0072] U realizacijama, unapred određeni nivo baznog broja perifernih NK c ́elija od najmanje 100 ćelija/µl. U realizacijama, unapred određeni nivo navedenog biomarkera je osnovni nivo ekspresije CD16 na perifernim NK c ́elijama od najmanje 60000 (ABC).

[0073] Aspekt je metod identifikacije subjekta koji ima hroničnu limfocitnu leukemiju (CLL) ili akutnu limfoblastnu leukemiju (ALL) koji reaguje na lečenje anti-CD19 antitelom, navedeni metod obuhvata:

a. obezbeđivanje uzorka krvi dobijenog od navedenog subjekta pre lečenja navedenim anti-CD19 antitelom,

b. određivanje nivoa najmanje jednog biomarkera u navedenom uzorku odabranom iz grupe koju čine:

i. broj perifernih NK c ́elija i

ii. nivoi ekspresije CD16 na perifernim NK c ́elijama,

c. upoređivanje nivoa navedenog najmanje jednog biomarkera u navedenom uzorku sa unapred određenim nivoom,

pri čemu je osnovni broj perifernih NK c ́elija najmanje 50 ćelija/µl, najmanje 60 ćelija/µl, najmanje 70 ćelija/µl, najmanje 80 ćelija/µl, najmanje 90 ćelija/µl ili najmanje 100 ćelija/µl i osnovni nivo ekspresije CD16 na perifernim NK c ́elijama je najmanje 60000 (ABC), a gde anti-CD19 antitelo sadrži HCDR1 region koji sadrži sekvencu SYVMH (SEK ID BR: 1), HCDR2 region koji sadrži sekvencu NPYNDG (SEK ID BR: 2), HCDR3 region koji sadrži sekvencu GTYYYGTRVFDY (SEK ID BR: 3), LCDR1 region koji sadrži sekvencu RSSKSLQN-VNGNTYLY (SEK ID BR: 4), LCDR2 region koji sadrži sekvencu RMSNLNS (SEK ID BR: 5) i LCDR3 region koji sadrži sekvencu MQHLEIPIT (SEK ID BR: 6).

[0074] Aspekt je metod identifikacije subjekta koji ima hroničnu limfocitnu leukemiju (CLL) ili akutnu limfoblastnu leukemiju (ALL) koji reaguje na lečenje anti-CD19 antitelom, navedeni metod obuhvata:

a. obezbeđivanje uzorka krvi dobijenog od navedenog subjekta pre lečenja navedenim anti-CD19b antitelom,

b. određivanje nivoa najmanje jednog biomarkera u navedenom uzorku odabranom iz grupe koju čine:

i. broj perifernih NK c ́elija i

ii. nivoi ekspresije CD16 na perifernim NK c ́elijama,

c. upoređivanje nivoa navedenog najmanje jednog biomarkera u navedenom uzorku sa unapred određenim nivoom,

pri čemu je osnovni broj perifernih NK c ́elija najmanje 100 ćelija/µl, ili je osnovni nivo ekspresije CD16 na perifernim NK c ́elijama najmanje 60 000 (ABC), pri čemu anti-CD19 antitelo sadrži HCDR1 region koji sadrži sekvencu SYVMH (SEK ID BR: 1), HCDR2 region koji sadrži sekvencu NPYNDG (SEK ID BR: 2), HCDR3 region koji sadrži sekvencu GTYYYGTRVFDY (SEK ID BR: 3), LCDR1 region koji sadrži sekvencu RSSKSLQNVNGNTYLY (SEK ID BR: 4) , LCDR2 region koji sadrži sekvencu RMSNLNS (SEK ID BR: 5), i LCDR3 region koji sadrži sekvencu MQHLEIPIT (SEK ID BR: 6).

[0075] U realizacijama, unapred određeni NIVO navedenog biomarkera je:

a. osnovni broj perifernih NK c ́elija od najmanje 100 ćelija/µl, i

b. početni nivo ekspresije CD16 na perifernim NK c ́elijama od najmanje 60000 (ABC).

[0076] U realizacijama, unapred određeni nivo navedenog biomarkera je osnovni broj perifernih NK c ́elija od najmanje 50 ć elija/µl, najmanje 75 ć elija/µl, najmanje 100 ć elija/µl, najmanje 125 ć elija/µl, najmanje 150 ćelija/µl, najmanje 175 ćelija/µl, najmanje 200 ćelija/µl, najmanje 225 ć elija/µl ili najmanje 250 ćelija/µl. U realizacijama, unapred određeni nivo navedenog biomarkera je osnovni nivo ekspresije CD16 na perifernim NK c ́elijama od najmanje 45 000 ABC, najmanje 60 000 ABC, najmanje 75 000 ABC ili najmanje 90000 ABC.

[0077] Takođe je otkriven metod lečenja pacijenta koji ima hroničnu limfocitnu leukemiju (CLL), ne-Hodgkinov limfom (NHL), akutnu limfoblastnu leukemiju (ALL) ili mali limfocitni limfom (SLL) sa anti-CD19 antitelom, metod koji obuhvata

a. dobijanje osnovnog broja perifernih NK c ́elija kod pacijenta ili osnovnog nivoa ekspresije CD16 na perifernom uređaju NK c ́elije pacijenta i

b. davanje efikasne količine antitela na CD19 pacijentu koji ima početni broj perifernih NK c ́elija od najmanje 50 ćelija/µl, najmanje 60 ćelija/µl, najmanje 70 ćelija/µl, najmanje 80 ćelija/µl, u najmanje 90 ćelija/µl ili najmanje 100 ćelija/µl ili osnovni nivo ekspresije CD16 na perifernim NK c ́elijama od najmanje 60000 (ABC).

[0078] Takođe je otkriven postupak lečenja pacijenta koji ima hroničnu limfocitnu leukemiju (CLL), ne-Hodgkinov limfom (NHL), akutnu limfoblastnu leukemiju (ALL) ili mali limfocitni limfom (SLL) sa anti-CD19 antitelom, postupak obuhvata:

a. dobijanje osnovnog broja perifernih NK c ́elija kod pacijenta ili osnovnog nivoa ekspresije CD16 na perifernim NK c ́elijama pacijenta, i

b. davanje efektivne količine anti-CD19 antitela pacijentu koji ima početni broj perifernih NK c ́elija od najmanje 100 ćelija/µl ili početni nivo ekspresije CD16 na perifernim NK c ́elijama od najmanje 60.000 (ABC).

[0079] Postupak lečenja pacijenta sa hroničnom limfocitnom leukemijom (CLL), ne-Hodgkinovim limfomom (NHL), akutnom limfoblastnom leukemijom (ALL) ili malim limfocitnim limfomom (SLL) sa anti-CD19 antitelom, može da sadrži:

a. dobijanje osnovnog broja perifernih NK c ́elija kod pacijenta i

b. davanje efikasne količine antitela na CD19 pacijentu koji ima broj NK c ́elija od najmanje 50 ćelija/µl, najmanje 60 ć elija/µl, najmanje 70 ć elija/µl, najmanje 80 ć elija/µl, najmanje 90 ćelija/µl ili najmanje 100 ćelija/µl.

[0080] Postipak lečenja pacijenta sa hroničnom limfocitnom leukemijom (CLL), ne-Hodgkinovim limfomom (NHL), akutnom limfoblastnom leukemijom (ALL) ili malim limfocitnim limfomom (SLL) sa anti-CD19 antitelom, može da sadrži:

a. dobijanje osnovnog broja perifernih NK c ́elija kod pacijenta i

b. davanje efikasne količine antitela na CD19 pacijentu koji ima broj NK c ́elija od najmanje 50 ćelija/µl, najmanje 60 ć elija/µl, najmanje 70 ć elija/µl, najmanje 80 ć elija/µl, najmanje 90 ćelija/µl ili najmanje 100 ćelija/µl.

[0081] Postupak lečenja hronične limfocitne leukemije pacijenta (CLL), ne-Hodgkinovog limfoma (NHL), akutne limfoblastne leukemije (ALL) ili malog limfocitnog limfoma (SLL) sa anti-CD19 antitelom, može da sadrži:

a. dobijanje osnovnog broja perifernih NK c ́elija kod pacijenta i

b. davanje efektivne količine anti-CD19 antitela pacijentu sa brojem NK c ́elija od najmanje 100 ćelija/µl.

[0082] Postupak lečenja pacijenta koji ima hroničnu limfocitnu leukemiju (CLL), ne-Hodgkinov limfom (NHL), akutnu limfoblastnu leukemiju (ALL) ili mali limfocitni limfom (SLL) sa anti-CD19 antitelom, može da sadrži:

a. dobijanje početnih nivoa ekspresije CD16 na perifernim NK c ́elijama pacijenta i

b. davanje efikasne količine anti-CD19 antitela pacijentu sa nivoom CD16 na NK c ́elijama od najmanje 60.000 (ABC).

[0083] Kao što je pomenuto na drugom mestu ovde, pronalazak obezbeđuje anti-CD19 antitelo za upotrebu u lečenju pacijenata koji boluju od hronične limfocitne leukemije (CLL) ili akutne limfoblastne leukemije (ALL), pri čemu je pacijent identifikovan prema metodu pronalaska.

[0084] U realizacijama, anti-CD19 antitelo se daje pacijentima koji imaju i osnovni broj perifernih NK c ́elija od najmanje 50 ćelija/µl, najmanje 60 ćelija/µl, najmanje 70 ćelija/µl, najmanje 80 ćelija/µl, najmanje 90 ćelija/µl ili najmanje 100 ćelija/µl i početni nivo ekspresije CD16 na perifernim NK c ́elijama od najmanje 60000 (ABC).

1

[0085] U realizacijama, anti-CD19 antitelo se daje pacijentima koji imaju i osnovni broj perifernih NK c ́elija od najmanje 100 ćelija/µl, i početni nivo ekspresije CD16 na perifernim NK c ́elijama od najmanje 60 000 (ABC).

[0086] U realizacijama, anti-CD19 antitelo se daje pacijentima koji imaju početni broj perifernih NK c ́elija od najmanje 50 ćelija/µl, najmanje 75 ćelija/µl, najmanje 100 ćelija/µl, najmanje 125 ćelija/µl, najmanje 150 ćelija/µl, najmanje 175 ćelija/µl, najmanje 200 ćelija/µl, najmanje 225 ćelija/µl ili najmanje 250 ćelija/µl. U izvođenjima, anti-CD19 antitelose daje pacijentima koji imaju početne nivoe ekspresije CD16 na perifernim NK c ́elijama od najmanje 45.000 ABC, najmanje 60.000 ABC, najmanje 75.000 ABC ili najmanje 90.000 ABC.

[0087] Takođe je otkriven postupak lečenja pacijenta koji ima hroničnu limfocitnu leukemiju (CLL), ne-Hodgkinov limfom (NHL), akutnu limfoblastnu leukemiju (ALL) ili mali limfocitni limfom (SLL) sa anti-CD19 antitelom, pri čemu navedeni postupak obuhvata:

a. obezbeđivanje uzorka dobijenog od navedenog subjekta pre lečenja navedenim anti-CD19 antitelom,

b. određivanje nivoa najmanje jednog biomarkera u navedenom uzorku odabranom iz grupe koju čine:

i. broj perifernih NK c ́elija i

ii. nivoi ekspresije CD16 na perifernim NK c ́elijama,

c. upoređivanje nivoa navedenog najmanje jednog biomarkera u navedenom uzorku sa unapred određenim nivoom,

d. davanje efikasne količine antitela na CD19 pacijentu koji ima periferni broj NK c ́elija od najmanje 100 ćelija/µl ili nivo ekspresije CD16 na perifernim NK c ́elijama od najmanje 60 000 (ABC).

[0088] Takođe je otkriven postupak lečenja pacijenta sa hroničnom limfocitnom leukemijom (CLL), ne-Hodgkinovim limfomom (NHL), akutnom limfoblastnom leukemijom (ALL) ili malim limfocitnim limfomom (SLL), koji uključuje primenu efikasne količine anti-CD19 antitela na pacijenta ukoliko je:

a. osnovni broj perifernih NK c ́elija pacijenta je najmanje 100 ćelija/µl ili

b. osnovni nivo ekspresije CD16 na perifernim NK c ́elijama je najmanje 60000 (ABC).

[0089] Takođe je otkriven postupak lečenja pacijenta koji ima hroničnu limfocitnu leukemiju (CLL), ne-Hodgkinov limfom (NHL), akutnu limfoblastnu leukemiju (ALL) ili mali limfocitni limfom (SLL) koji sadrži:

a. dobijanje broja perifernih NK c ́elija pacijenta,

b. davanje efikasne količine antitela na CD19 pacijentima koji imaju periferni broj NK c ́elija od najmanje 100 ćelija/µl.

[0090] Takođe je otkriven postupak lečenja pacijenta koji ima hroničnu limfocitnu leukemiju (CLL), ne-Hodgkinov limfom (NHL), akutnu limfoblastnu leukemiju (ALL) ili mali limfocitni limfom (SLL) koji sadrži:

a. dobijanje nivoa ekspresije CD16 na perifernim NK c ́elijama pacijenta,

b. davanje efikasne količine antitela na CD19 pacijentima koji imaju nivoe ekspresije CD16 na perifernim NK c ́elijama od najmanje 60.000 (ABC).

[0091] Kao što je navedeno na drugom mestu ovde, pronalazak obezbeđuje anti-CD19 antitelo za upotrebu u lečenju pacijenata koji boluju od hronične limfocitne leukemije (CLL) ili akutne limfoblastne leukemije (ALL), pri čemu je pacijent identifikovan prema metodu pronalaska.

[0092] U realizacijama, anti-CD19 antitelo se daje pacijentima koji imaju i osnovni broj perifernih NK c ́elija od najmanje 100 ćelija/µl i osnovni nivo ekspresije CD16 na perifernim NK c ́elijama od najmanje 60 000 (ABC). U realizacijama, anti-CD19 antitelo se daje pacijentima koji imaju početni broj perifernih NK c ́elija od najmanje 50 ćelija/µl, najmanje 75 ćelija/µl, najmanje 100 ćelija/µl, najmanje 125 ćelija/µl, najmanje 150 ćelija/µl, najmanje 175 ćelija/µl, najmanje 200 ćelija/µl, najmanje 225 ćelija/µl ili najmanje 250 ćelija/µl. U izvođenjima, anti-CD19 antitelo se daje pacijentima koji imaju početne nivoe ekspresije CD16 na perifernim NK c ́elijama od najmanje 45.000 ABC, najmanje 60.000 ABC, najmanje 75.000 ABC ili najmanje 90.000 ABC.

[0093] U realizacijama, osnovni broj perifernih NK c ́elija ili početni nivo CD16 (ABC) na perifernim NK c ́elijama se dobija iz uzorka krvi uzetog od pacijenta. U realizacijama, periferni broj NK c ́elija i/ili nivoi ekspresije CD16 se mere pre administracije anti-CD19 antitela.

[0094] U realizacijama, specifično anti-CD19 antitelo sadrži HCDR1 region koji sadrži sekvencu SYVMH (SEK ID BR: 1), HCDR2 region koji sadrži sekvencu NPYNDG (SEK ID BR: 2), HCDR3 region koji sadrži sekvencu GTYYYGTRVFDY (SEK ID BR: 3), LCDR1 region koji sadrži sekvencu RSSKSLQNVNGNTYLY (SEK ID BR: 4), LCDR2 region koji sadrži sekvencu RMSNLNS (SEK ID BR: 5) i LCDR3 region koji sadrži sekvencu MQHLEIPIT (SEK ID BR: 6).

[0095] U izvođenjima, osnovni broj perifernih NK c ́elija ili početni nivo ekspresije CD16 na perifernim NK c ́elijama se dobija iz uzorka krvi uzetog od pacijenta.

[0096] U jednom rešenju, pacijent ima hroničnu limfocitnu leukemiju. U jednom rešenju, pacijent ima akutnu limfoblastnu leukemiju.

[0097] U izvođenjima, tretman rezultira terapeutskim efektom odabranim iz grupe koja se sastoji od stope kontrole bolesti (DCR) i dužeg trajanja preživljavanja bez progresije bolesti.

[0098] U realizacijama, tretman dalje uključuje davanje efikasne količine azotne senfa. U jednom ostvarenju, azotna gorčica je bendamustin. U realizacijama, tretman dalje uključuje davanje efikasne količine analoga purina. U realizacijama, analog purina je fludarabin. U realizacijama, tretman dalje uključuje primenu efikasne količine inhibitora Brutonove tirozin kinaze (BTK). U realizacijama, inhibitor Brutonove tirozin kinaze (BTK) je ibrutinib. U realizacijama, tretman dalje uključuje primenu efikasne količine inhibitora fosfoinozitid 3-kinaze. U jednom izvođenju inhibitor fosfoinozitid 3-kinaze je idelalizib. U realizacijama, tretman dalje uključuje primenu efikasne količine analoga talidomida. U jednom izvođenju, analog talidomida je lenalidomid. U realizacijama, tretman dalje uključuje primenu efikasne količine inhibitora BCL-2. U jednoj realizaciji, BCL-2 inhibitor je venetoklaks.

[0099] Kako se primereno anti-CD19 antitelo i druga anti-CD19 antitela vezuju za CD19, veruje se da se slični rezultati mogu videti i kod drugih anti-CD19 antitela. Ostala anti-CD19 antitela su opisana u US 12/377,251 (Xencor), WO2005012493, WO2010053716 (Immunomedics); WO2007002223 (Medarek); WO2008022152 (Xencor); WO2008031056 (Medimmune); WO 2007/076950 (Merck Patent GmbH); WO 2009/052431 (Seattle Genetics); i WO2010095031 (Glenmark Pharmaceuticals).

[0100] U realizacijama, specifično anti-CD19 antitelo sadrži antitelo koje se unakrsno nadmec ́e sa antitelom koje sadrži HCDR1 region koji sadrži sekvencu SYVMH (SEK ID BR: 1), HCDR2 region koji sadrži sekvencu NPYNDG (SEK ID BR: 2), HCDR3 region koji sadrži sekvencu GTYYYGTRVFDY (SEK ID BR: 3), LCDR1 region koji sadrži sekvencu RSSKSLQNVNGNTYLY (SEK ID BR: 4), LCDR2 region koji sadrži sekvencu RMSNLNS (SEK ID BR: 5) i LCDR3 region koji sadrži sekvencu MQHLEIPIT (SEK ID BR: 6).

[0101] U realizacijama, specifično anti-CD19 antitelo sadrži antitelo koje se vezuje za isti epitop kao antitelo koje sadrži HCDR1 region koji sadrži sekvencu SYVMH (SEK ID BR: 1), HCDR2 region koji sadrži sekvencu NPYNDG (SEK ID BR: 2), HCDR3 region koji sadrži sekvencu GTYYYGTRVFDY (SEK ID BR: 3), LCDR1 region koji sadrži sekvencu RSSKSLQNVNGNTYLY (SEK ID BR: 4), LCDR2 region koji sadrži sekvencu RMSNLNS (SEK ID BR: 5), i LCDR3 region koji sadrži sekvencu MQHLEIPIT (SEK ID BR: 6).

[0102] U realizacijama, specifično anti-CD19 antitelo sadrži HCDR1 region sekvence SYVMH (SEK ID BR: 1), HCDR2 region sekvence NPYNDG (SEK ID BR: 2), HCDR3 region sekvence GTYYYGTRVFDY (SEK ID BR: 3), LCDR1 region sekvence RSSKSLQNVNGNTYLY (SEK ID BR: 4), LCDR2 region sekvence RMSNLNS (SEK ID BR: 5) i LCDR3 region sekvence MQHLEIPIT (SEK ID BR: 6).

[0103] U realizacijama, specifično anti-CD19 antitelo sadrži promenljivi teški lanac sekvence

1

[0104] U jednom rešenju, navedeno antitelo sadrži konstantni domen teškog lanca sekvence

[0105] U jednom izvođenju, antitelo specifično za CD19 sadrži konstantni domen lakog lanca sekvence

[0106] U jednom izvođenju, specifično anti-CD19 antitelo sadrži teški lanac koji ima sekvencu

[0107] U jednom izvođenju, specifično anti-CD19 antitelo sadrži laki lanac koji ima sekvencu

[0108] Ovde je takođe otkrivena farmaceutska kompozicija. Kompozicija može sadržati prihvatljiv nosač. Kompozicija se može davati u efikasnoj količini.

Primeri

Primer 1: Brojanje T c ́elija i NK c ́elija

[0109] Obim kliničke studije MOR00208C201 obuhvatao je procenu nekoliko istraživačkih biomarkera. Kao deo ove inicijative izvršeno je osnovno brojanje perifernih T i NK c ́elija na kliničkim mestima.

1

[0110] T c ́elije su vrsta limfocita (podtip belih krvnih zrnaca) koji igraju centralnu ulogu u c ́elijski posredovanom imunitetu. Oni se mogu razlikovati od ostalih limfocita, kao što su B c ́elije i NK c ́elije, prisustvom receptora za T-c ́elije na površini c ́elije.

[0111] Prirodne c ́elije ubice ili NK c ́elije su vrsta citotoksičnih limfocita kritičnih za urođeni imuni sistem. NK c ́elije pružaju brze odgovore na virusno zaražene c ́elije, delujuc ́i otprilike 3 dana nakon infekcije, i odgovaraju na stvaranje tumora. Tipično, imune c ́elije otkrivaju glavni kompleks histokompatibilnosti (MHC) koji se nalazi na zaraženim c ́elijskim površinama, što pokrec ́e oslobađanje citokina, uzrokujuc ́i lizu ili apoptozu. NK c ́elije su jedinstvene, s obzirom da imaju sposobnost prepoznavanja c ́elija pod pritiskom u odsustvu antitela i MHC, što omoguc ́ava mnogo bržu imunološku reakciju.

Materijali i metode

[0112] TriTest CD3 FITC/CD16 CD56 PE/CD45 PerCP (sa TruCOUNT epruvetama), BD Biosciences, Cat: 340403 (SAD); 342442 (Evropa). Pipetori i vrhovi pipeta su sposobni da isporuče 20 µl, 50 µl i 450 µl, Gilson Inc. FACS Lising Solutions, BD Biosciences, Cat: 349202.

Instrumenti: Protočna citometrija, Vorteks

Pozadina protočne citometrije:

[0113] Cela krv je obojena antitelima obeleženim fluorohromom (reagensi TriTEST) koji se specifično vezuju za površinske antigene leukocita. C ́elije putuju pored laserskog zraka i rasejavaju lasersku svetlost. Obojene c ́elije fluoresciraju. Ovi raspršeni i fluorescentni signali, koje instrument otkriva, pružaju informacije o veličini c ́elije, unutrašnjoj složenosti i relativnom intenzitetu fluorescencije. TriTEST reagensi koriste aktiviranje fluorescencije, omoguc ́avajuc ́i direktno fluoroscentno getiranje populacije NK-i T-c ́elijskih limfocita kako bi se smanjila kontaminacija neliziranih ili nukleiranih crvenih krvnih zrnaca na izlazu.

Bojenje

[0114] Za svaki uzorak pacijenta, TruCOUNT epruveta je označena identifikacionim brojem uzorka. Na dno epruvete pipetirano je 20 µL TriTEST CD3/CD16 CD56/CD45 reagensa. Na dno epruvete pipetirano je 50 µ L dobro pomešane, antikoagulirane cele krvi. Antikoagulirana krv (EDTA) č uvana na sobnoj temperaturi (20-25°C) mora se bojiti u roku od 24 sata od izvlačenja i analizirati u roku od 6 sati od bojenja (čuvati na sobnoj temperaturi i zaštititi od svetlosti). Epruveta je lagano vorteksovana da bi se mešala. Epruveta je inkubirana 15 minuta u mraku na sobnoj temperaturi (20-25°C). 450 µ L 1X FACS rastvora za liziranje je dodato u epruvetu. Epruveta je vorteksirana i ponovo inkubirana 15 minuta u mraku na sobnoj temperaturi (20-25°C).

[0115] Koristec ́i TruCOUNT epruvete, poznati volumen uzorka se direktno boji u TruCOUNT epruveti. Liofilizovana kuglica u cevi se rastvara, oslobađajuc ́i poznati broj fluorescentnih zrnaca. Tokom analize, apsolutni broj (c ́elija/µl) pozitivnih c ́elija u uzorku može se odrediti upoređivanjem c ́elijskih aktivnosti sa zrncima.

Protočna citometrija

[0116] C ́elije su temeljito vorteksovane (pri maloj brzini) da bi se smanjila agregacija pre pokretanja na protočnom citometru.

Analize podataka

[0117] CD45 vs SSC tačkasti prikaz je vizuelno pregledan. Limfociti se pojavljuju kao svetla, kompaktna c ́elijska populacija sa niskim do umerenim SSC. Monociti (M) i granulociti (G) pojavljuju se kao različite populacije. Analiza je završena kada su c ́elijske populacije monocita i limfocita pokazale jasno razdvajanje.

[0118] Limfociti su prvo postavljeni kao CD45 pozitivni, sa niskom populacijom SSC c ́elija. CD16/CD56 vs CD3 su unapred izabrani. T-c ́elije (T) treba da se pojave kao kompaktni svetli CD3 pozitivni klaster. NK-c ́elije (NK) treba da se pojave kao kompaktna svetla CD16/CD56 pozitivna grupa. Zatvaranje je završeno i prebrojane su T i NK c ́elije.

[0119] Brojanje aktivnosti perlica urađeno je korišc ́enjem dijagrama CD16/CD56 vs CD3 bez ikakvih unapred izabranih izlaza. Zrnca bi trebalo da se pojave kao PE/FITC dvostruko pozitivna grupa.

1

Izračunavanje apsolutnih brojeva

[0120] Apsolutni broj (c ́elija/µl krvi) T c ́elija ili NK c ́elija u uzorku je određen upoređivanjem c ́elijskih događaja sa zrncima. Napravljena je ili analiza podataka MultiSET softvera ili ručna (koristec ́i CellQuest ili drugi softver). Za ručno brojanje, broj (#) pozitivnih c ́elijskih stečenih aktivnosti podeljen je sa brojem (#) stečenih zrnaca, zatim pomnožen sa (ukupnim brojem zrnaca TruCOUNT (zavisno od serije) podeljenim sa zapreminom uzorka cele krvi od 50 µL) . Rezultat su apsolutni brojevi c ́elija po mikrolitru.

Jednačina:

Primer:

[0121]

Primer 2: Kvantifikacija CD16 na NK c ́elijama

[0122] Kao deo kliničke studije MOR00208C201, CD16 (istraživački biomarker) je kvantifikovan na perifernim NK c ́elijama centralno od strane ICON Central Laboratories (Farmingdale, New York).

Materijali i metode

[0123] Antitela: CD45 AmCyan (Klon 2D1, BD Biosciences, Cat # 339192); CD3 FITC (Klon UCHT1, BioLegend, Cat # 300406); Mišji IgG FITC (Klon MOPC-21, BioLegend, Cat # 400110); CD16 PE (Klon 3G8, BioLegend, Cat # 302008); MOR00208; Mišji IgG PE (Klon MOPC-21, BioLegend, Cat # 400114); CD56 PerCP-Ci5.5 (Klon HCD56, BioLegend, Cat # 318322); i mišji IgG PerCP-Ci5.5 (Klon MOPC-21, BioLegend, Cat # 400150).

[0124] Materijal: PharmaTherm izolovani otpremnici (Intelsius, katalog # PHT014); BD Vacutainer® CPT<TM>monobistra cev za pripremu c ́elija - natrijum heparin (16x125 mm/8µL) (BD, kataloški broj 362753); BD Falcon<TM>cevi sa okruglim dnom 12x75 mm (BD, Kataloški broj # 352052); CS&T perle (BD Biosciences Cat # 642212); Fetalni goveđi serum (FBS), toplotno inaktiviran (Sigma F4135, ili ekvivalent); Dulbeccov PBS bez Ca<++>i Mg<++>(Gibco, Cat # 14190, ili ekvivalent); BD Falcon, cediljka za c ́elije, 100 mm, žuto (BD Bioscience, Cat # 352360); FACS pufer, 3 % toplotno inaktiviranog FBS u 1x DPBS; Dejonizovana voda, laboratorijske zalihe; Smrvljeni (mokri) led; Kanta za led; Aluminijumska folija; Konusne cevi, 50 µl; Konusne cevi, 15 µl; Sterilni vrhovi pipete za filtriranje; Pufer za liziranje BD Pharm Lise (BD Biosciences, Cat # 555899); ViViD LIVE/DEAD®, Fiksni komplet za mrlje od ljubičastih mrtvih c ́elija, za pobudu od 405 nm (Life Technologies, Cat # L34955); ArC amin reaktivna zrnca (Life Technologies, Cat # A10346); BD KuantiBRITE zrnca (BD Biosciences, Cat # 340495); i najlonske mreže od 52 µm (Miami Aqua Culture, za mačku: najlon 52 µm, 32 % otvorene površine utkane u materijal).

[0125] Oprema: centrifuga (hladnjača); mešanje u laboratoriji (cev za ljuljanje); vorteks mikser; aspirator za laminarni protok; inkubator (podešen na 37°C, 5 % CO2); Advia (brojač c ́elija); protočni citometar BD FACSCANTO II; posuda Desi-VacTM, 1,5 litra (VWR, Cat # 62344-930); indikacija vlažnosti sunđera<TM>(VWR, Cat # 61161-319); i sledljiva vlažnost na kartici (VWR, Cat # 15551-012).

1

Tabela 1. CD16 Panel za test kvantifikacije za PBMC (mononuklearna c ́elija periferne krvi)

Postupci pripreme i obeležavanja PBMC

[0126] Pacijentova periferna krv je sakupljena u CPT epruvete i isporučena preko noc ́i sa kliničkih mesta u centralnu laboratoriju u izolovanim posudama. CPT epruvete su centrifugirane tokom 25 minuta na 1800 x g na RT sa uključenom kočnicom. Posle centrifugiranja, CPT epruvete su odmah obrnute i stavljene na 10 minuta na laboratorijsko mešanje da bi se resuspendovao PBMC sloj u autolognoj plazmi i otpustila vec ́ina formiranih c ́elijskih agregata. Pod sterilnim uslovima, homogenizovana suspenzija PBMC/plazme se polako dekantira u centar 100 µm c ́elijskog cedila naslonjenog na sterilnu konusnu epruvetu od 50 mL. Jednaka zapremina 1X DPBS dodata je u suspenziju PBMC/plazme (približno 4 mL) u konusnoj epruveti od 15 mL. Epruvete su centrifugirane na 300 x g tokom 10 minuta na 4°C i supernatant je uklonjen. Epruvete su vorteksovane da resuspendiraju c ́elijske pelete. Kuglica c ́elija je isprana DBPS, centrifugirana, supernatant uklonjen i resuspendovan vorteksom. Oprana PBMC suspenzija je dodata u epindorf-epruvetu koja sadrži 1 mL osnovnog rastvora ViViD; inkubirano 15 minuta na ledu i držalo se u mraku (pokriti aluminijumskom folijom). Obojeni ViViD PBMC su premešteni u novu označenu konusnu cev, a zatim je dodat ledeno hladni FACS pufer. C ́elije su centrifugirane i ponovo vorteksovane za resuspenziju. Cevi od polistirenskih čestica obeležene su za svaki uzorak (Tabela 1). Antitela ili antitela za kontrolu izotipa su dodata u odgovarajuc ́e epruvete. Alikvot PBMC obojenih ViViD-om je dodat u svaku epruvetu (Tabela 1). Epruvete su vorteksirane i inkubirane. Dodat je FACS pufer i c ́elije su ponovo centrifugirane i vorteksovane za resuspenziju. Dodat je pufer za liziranje BD farmalize, i c ́elije su vorteksovane, centrifugirane i aspirirane da se ukloni supernatant i ponovo vorteksovane da se resuspenduju. Ponovo je dodat FACS pufer i c ́elije su centrifugirane i ponovo vorteksovane za resuspenziju. Zatim su uzorci dobijeni na FACSCanto II citometru i procenjeni su ABC (vezana antitela po c ́eliji) iz standardizovanog MFI kako je opisano u Iier S, et al., Ekspresija CD69 na aktiviranim T c ́elijama primenom zrnaca obeleženih R-fikoeritrinom, Citometri, 1996; # AC78 (Suppl.8): 113 i Iier S., et al., QuantiBRITE: Novi standard za fluorescentnu kvantitaciju, Becton Dikinson imunocitometrijski sistemi, San Jose, CA. 1997. Bela knjiga.

Primer 3: ocena NHL

[0127] Studija Fc-optimizovanog anti-CD19 antitela (MOR00208) za lečenje ne-Hodgkinovog limfoma (NHL) ClinicalTrials.gov Identifikator: NCT01685008 više se ne izvodi.

[0128] Kriterijumi za uključivanje su bili sledec ́i:

1. Muški ili ženski pacijenti stariji sa i od 18 godina.

2. Histološki potvrđena dijagnoza prema klasifikaciji REAL/WHO sledec ́ih β-c ́elijskih limfoma: a.FL, b.MCL, c.DLBCL, d.drugi indolentni NHL (npr. MZL/MALT).

3. NHL pacijenata mora da je napredovao nakon najmanje 1 prethodne terapije koja sadrži rituksimab.

4. Jedno mesto merljive bolesti slikanjem magnetne rezonance (MRI) ili računarskom tomografijom (CT) definisano kao najmanje jedna lezija koja meri najmanje 1,5 x 1,5 cm, sa izuzetkom: Samo za pacijente sa MCL, pacijente sa nemerljivom bolešc ́u ali mesta koja se mogu proceniti (koštana srž, slezina, periferna krv, gastrointestinalni trakt) mogu biti ubeležena.

5. Pacijenti koji su prethodno primili autolognu transplantaciju matičnih c ́elija moraju da prođu najmanje 4 nedelje posle transplantacije pre primene ispitivanog leka i moraju imati puni hematološki oporavak.

6. Prekinuta prethodna terapija monoklonskim antitelima (osim rituksimaba) ili primena radioimunoterapije najmanje 60 dana pre primene ispitivanog leka.

7. Isključen rituksimab najmanje 14 dana pre kontrole i potvrda da nema odgovora ili da bolest napreduje nakon lečenja rituksimabom.

8. Pacijenti sa DLBCL koji su imali pozitivnu [18F] fluorodeoksiglukozu-pozitronsku emisionu tomografiju (FDG-PET) na početku (Cheson kriterijumi odgovora).

9. Očekivano trajanje života > 3 meseca.

1

10. ECOG status performansi < 3.

11. Laboratorijski kriterijumi pri skriningu: a) Apsolutni broj neutrofila (ANC) ≥ 1,0 (1000/mm<3>) b) Broj trombocita ≥ 75 x 109/L bez prethodne transfuzije u roku od 10 dana od prve studije leka. c) Hemoglobin ≥ 8,0 g/dL (možda je transfuziran), d) Kreatinin u serumu < 2,0 x gornja granica normale (ULN). e) Ukupni bilirubin ≤ 2,0 x ULN. f) Alanin transaminaza (ALT) i aspartat aminotransferaza (AST) ≤ 2,5 x ULN.

12. Ako je žena u rodnoj dobi, mora se potvrditi negativni test trudnoc ́e pre upisa i upotrebe dvostruke barijerne kontracepcije, oralne kontracepcije i barijerne kontracepcije ili potvrde da je prošla klinički dokumentovanu totalnu histerektomiju i/ili oforektomiju, ligaciju jajovoda.

13. Ako je muškarac, tokom studije i tokom 3 meseca nakon poslednje doze mora se koristiti efikasna barijerna metoda kontracepcije, ako je pacijent seksualno aktivan sa ženom reproduktivnog potencijala.

14. Sposobnost da se pridržava svih procedura povezanih sa studijama, upotrebe lekova i procena.

15. Sposobnost da razume i da pismeno informisani pristanak i da se pridržava protokola studije.

[0129] Kriterijumi za izuzec ́e bili su sledec ́i:

1. Prethodni tretman citotoksičnom hemoterapijom, imunoterapijom, radioterapijom ili drugom specifičnom terapijom za limfom u roku od 14 dana pre kontrole ili se pacijent nije oporavio od neželjenih efekata prethodne terapije specifične za limfome.

2. Lečenje sistemskim sredstvom za ispitivanje u roku od 28 dana pre kontrole.

3. Prethodni tretman anti-CD19 antitelom ili fragmentima.

4. Prethodna alogenska transplantacija matičnih c ́elija.

5. Utvrđena ili sumnja na preosetljivost na pomoc ́ne supstance sadržane u formulaciji ispitivanog leka.

6. Klinički značajne kardiovaskularne bolesti ili srčana insuficijencija, kardiomiopatija, postojec ́a klinički značajna aritmija, akutni infarkt miokarda u roku od 3 meseca od dana upisa, angina pektoris u roku od 3 meseca od upisa.

7. Klinički ili laboratorijski dokazi o aktivnom hepatitisu B ili hepatitisu C.

8. Istorija HIV infekcije.

9. Svaka aktivna sistemska infekcija (virusna, gljivična ili bakterijska) koja zahteva aktivnu parenteralnu antibiotsku terapiju u roku od 4 nedelje od primene ispitivanog leka.

10. Trenutni tretman imunosupresivnim agensima kojim nisu propisani kortikosteroidi (ne više od 10 mg ekvivalenta prednizona).

11. Velika operacija ili terapija zračenjem u roku od 4 nedelje pre prve studije leka.

12. Sistemske bolesti (kardiovaskularne, bubrežne, jetre, itd.) koje bi po mišljenju pronalazača sprečile lečenje u studiji.

13. Istorija ili klinički dokazi o bolesti centralnog nervnog sistema (CNS), meningealnoj ili epiduralnoj bolesti, uključujuc ́i metastaze u mozgu.

14. Aktivno lečenje/hemoterapija za još jedan primarni malignitet u poslednjih 5 godina.

15. Trudnoc ́a ili dojenje kod žena i žena u rodnoj dobi koje ne koriste prihvatljiv metod kontrole rađanja.

16. Istorija nepridržavanja medicinskih režima ili pacijenata koji se smatraju potencijalno nepouzdanim i koji ne sarađuju.

[0130] Pacijenti su lečeni MOR00208 kako sledi. Pacijenti su lečeni sa dva 28-dnevna ciklusa, gde je MOR00208 davan u dozi od 12 mg/kg 1., 8., 15. i 22. dana. Na kraju dva ciklusa, pacijenti koji imaju stabilnu bolest ili poboljšanje lečeni su trec ́i 28-dnevni ciklus primenom istog doziranja i rasporeda kao i prva dva ciklusa. Na kraju trec ́eg ciklusa, pacijenti koji su imali delimični odgovor ili su prešli na održavanje. U međuvremenu, MOR00208 je davan u dozi od 12 mg/kg svakih 14 ili 28 dana do progresije bolesti.

[0131] Na kraju studije, karakteristike pacijenta bile su sledec ́e:

2

Tabela 2:

[0132] Drugi iNHL označava heterogenu grupu dalje nenavedenih indolentnih, ne agresivnih, NHL tipova, npr. limfom marginalnih c ́elija, limfom marginalne zone i limfom povezan sa mukozom (MALT).

[0133] Ključne primarne i sekundarne krajnje tačke su sledec ́e:

• Primarni: Ukupna stopa odgovora (ORR) = CR PR

• Sekundarni:

• Stopa kontrole bolesti (DCR) = CR PR SD

• Preživljavanje bez progresije bolesti (PFS)

Tabela 3:

[0134] Kriterijumi za odgovor u ovoj studiji su oni definisani u tabeli 4. Svi oni se zasnivaju na kriterijumima odgovora međunarodne radne grupe (2007).

Tabela 4: Kriterijumi odgovora

[0135] DCR (CR+PR SD) se smatrao najrelevantnijom krajnjom tačkom efikasnosti u analizi karakteristika

2

pacijenta i biomarkera u ovom ispitivanju, jer je vec ́ina pacijenata sa SD imala značajno smanjenje ciljne lezije, ali prema planu studije nisu tretirani dalje od ciklusa 3. Shodno tome, pacijenti koji imaju SD su uključeni u analizu.

[0136] Procenjene su najmanje sledec ́e karakteristike pacijenata da bi se utvrdilo da li postoji korelacija između karakteristike i posmatrane DCR pacijenata lečenih anti-CD19 antitelom: a) starost, b) pol, c) da li su pacijenti primali doza ritukimaba u poslednjih 6 meseci, d) da li su pacijenti bili rezistentni na ritukimab, e) da li pacijenti imaju alel FCgammaRllla visokog ili niskog afiniteta, f) da li pacijenti imaju alel FCgammaRIIa visokog ili niskog afiniteta, g) da li su pacijenti imali trajanje odgovora na prethodni tretman duže od 12 meseci, h) osnovni broj perifernih T c ́elija (c ́elije/µl), i) bazni broj perifernih NK c ́elija (c ́elije/µl) i j) početnu ekspresiju CD16 na perifernim NK c ́elijama (vezana antitela po c ́elijama -ABC).

[0137] Primer 1 i primer 2 su korišc ́eni za procenu osnovnog broja perifernih NK c ́elija, broja T c ́elija i osnovne ekspresije CD16 na perifernim NK c ́elijama. Podaci su prikazani u tabeli 2.

[0138] Analiza specifičnih karakteristika prijemnika (ROC) je korišc ́ena za analizu predvidljivosti, specifičnosti i osetljivosti i za određivanje graničnih vrednosti za potencijalne biomarkere broja NK c ́elija, broja T c ́elija i ekspresije CD16 (ABC) na perifernim NK c ́elijama. ROC grafikon prikazuje performanse binarne metode klasifikacije sa kontinuiranim ili diskretnim rednim izlazom. Prikazuje osetljivost (udeo tačno klasifikovanih pozitivnih zapažanja) i specifičnost (udeo tačno klasifikovanih negativnih zapažanja) dok se izlazni prag pomera u opsegu svih moguc ́ih vrednosti. Videti Swets JA: Relativna operativna karakteristika u psihologiji. Science 1973, 182: 990-1000, i Pepe MS: Statistička procena medicinskih testova za klasifikaciju i predviđanje. Oksford: Oksford University Press; 2003. U kontekstu ROC, područje ispod krive (AUC) meri performanse klasifikatora i često se primenjuje za upoređivanje metoda. Veća AUC znači bolju klasifikaciju. AUC za periferni broj NK/T c ́elija i za ekspresiju CD16 na NK c ́elijama je 0,66, 0,53 i 0,61, respektivno (slike 3, 4 i 5).

[0139] Generalno, određivanje granične vrednosti zavisi od cilja na koji je odgovarajuc ́i postupak usmeren. Razni kriterijumi poput maksimalne tačnosti, maksimalnog odnosa dijagnostičkih šansi, minimalne stope grešaka, maksimalne osetljivosti i/ili maksimalne specifičnosti doveli bi do drugačijeg određivanja granične vrednosti. Pored toga, ravnoteža između više takvih kriterijuma, npr. osetljivost i specifičnost takođe bi doveli do određenog određivanja granične vrednosti.

[0140] Stoga postoji nekoliko postupaka ili kriterijuma za odabir optimalnih graničnih vrednosti, uključujuc ́i postupke koje maksimiziraju tačnost, osetljivost+ specifičnost, prediktivne vrednosti, dijagnostičke odnose verovatnoc ́e ili prevalenciju. Zbog asimetrije krive ekspresije CD16-ROC (vidi sliku 4), vec ́ina postupaka rezultira presekom od 60 000 ABC (tačke sa najvec ́om udaljenostom između ROC krive i linije koja ih deli), dok simetrija NK ROC krive broja c ́elija (vidi sliku 3) objašnjava zašto se različite vrednosti za najbolji presek mogu dobiti pri primeni različitih postupaka. U ovoj konkretnoj studiji, za oba biomarkera vec ́a težina je dodeljena osetljivosti, pa su stoga 100 NK c ́elija/µl i nivo ekspresije CD16 od 60.000 ABC izabrani kao granične vrednosti za analizu DCR i PFS unutar podgrupa. Za periferni broj T c ́elija, AUC je 0,53, a ROC kriva je blizu bisektrix pri bilo kojoj vrednosti specifičnosti i osetljivosti, pa čak i odabir različitog odseka od 500 c ́elija/µl nije imao uticaja na negativne rezultate DCR i analiza PFS podgrupe.

[0141] Određivanje granične vrednosti može se uravnotežiti bilo u korist osetljivosti ili specifičnosti. Ako se osetljivosti dodeli još vec ́a težina za utvrđivanje optimalnog graničnog prekida, postupak bi bio drugačiji i predviđala bi se niža granična vrednost za broj NK c ́elija. U tom slučaju se određuje granična vrednost od najmanje 50 NK c ́elija/µl. Alternativno, nivo od najmanje 60 NK c ́elija/µl, najmanje 70 NK c ́elija/µl, najmanje 80 NK c ́elija/µl, najmanje 90 NK c ́elija/µl ili najmanje 100 NK c ́elija/µl.

[0142] Da bi se maksimizirala specifičnost prikazanog postupka, granična vrednost za broj NK c ́elija se povec ́ava i određuje se između od najmanje 100 NK c ́elija/µl do najmanje 150 NK c ́elija/µl. Zbog toga je za maksimiziranje specifičnosti određen nivo od najmanje 100 NK ćelija/µl, najmanje 110 NK c ́elija/µl, najmanje 120 NK c ́elija/µl, najmanje 130 NK c ́elija/µl, najmanje 140 NK c ́elija/µl ili je izabrano najmanje 150 NK c ́elija/µl.

[0143] Granične vrednosti određene u ovoj konkretnoj studiji (100 NK c ́elija/µl i nivo ekspresije CD16 od 60.000 ABC) korišc ́ene su za sledec ́u statističku analizu.

[0144] Šumske parcele su korišc ́ene za analizu svih karakteristika pacijenta i biomarkera kako bi se utvrdila korelacija pojedinačnih karakteristika sa DCR. Rezultati su prikazani na slici 7. Na osnovu analize šumskih parcela različitih karakteristika pacijenta i njihove korelacije sa DCR-om, kod DLBCL i iNHL pacijenata sledec ́e karakteristike su pokazale statistički značajne razlike: 1) osnovni broj perifernih NK c ́elija od najmanje 100 c ́elija/µl i početna ekspresija CD16 na perifernim NK c ́elijama od najmanje 60 000ABC (X<2>neprilagođena p vrednost = 0,029/0,003) (slika 7).

[0145] Da bi se osiguralo da ekspresija CD16 i broj NK c ́elija budu nezavisne karakteristike, koje nisu uticale jedna na drugu, urađena je parametarska i neparametrijska korelaciona analiza. Podaci o ekspresiji CD16 i broju NK c ́elija bili su dostupni za 51 pacijenta. Pearsonov r je bio 0,019 sa dvostranom p vrednošc ́u = 0,9, a Spearmanov r 0,036 sa dvostranom p vrednosti = 0,8. Rezultati su grafički predstavljeni na slici 6. U zaključku, ekspresija CD16 i broj NK c ́elija na utvrđenim pragovima nisu u korelaciji, stoga se smatraju potpuno nezavisnim prediktorima verovatnoc ́e da pacijent dobije korist od lečenja MOR00208.

[0146] Nije utvrđeno da sledec ́e karakteristike predviđaju DCR: a) starost, b) pol, c) ako su pacijenti primili dozu ritukimaba u poslednjih 6 meseci, d) da li su pacijenti bili rezistentni na ritukimab, e) da li pacijenti imaju FCgammaRllla alel visokog ili niskog afiniteta, f) da li pacijenti imaju FCgammaRIIa alel visokog ili niskog afiniteta, g) da li su pacijenti imali trajanje odgovora na lečenje duže od 12 meseci ili h) osnovni broj perifernih T c ́elija. Pogledajte sliku 7.

[0147] I 1) osnovni broj perifernih NK c ́elija i 2) početna ekspresija CD16 na perifernim NK c ́elijama pokazali su jasne korelacije sa odgovorom pacijenta sa terapijom MOR00208. Preciznije, pacijenti sa početnim brojem NK c ́elija od najmanje 100 c ́elija/µl korelirali su sa višom stopom kontrole bolesti (DCR). DCR uključuje pacijente koji imaju potpuni odgovor (CR)<+>delimični odgovor (PR)<+>stabilnu bolest (SD). Pored toga, pacijenti koji imaju početnu ekspresiju CD16 na perifernim NK c ́elijama od najmanje 60 000 ABC korelirali su sa vec ́om stopom kontrole bolesti (DCR).

[0148] Preživljavanje bez progresije bolesti (PFS) predstavlja dužinu vremena tokom i posle lečenja bolesti u kojoj pacijent živi sa bolešc ́u, ali se ona ne pogoršava. Ovo je dodatna važna krajnja tačka kliničkog ispitivanja i pokazatelj efikasnosti kod pacijenata. PFS je upoređen u okviru sledećih karakteristika pacijenta: a) osnovni broj perifernih NK c ́elija od najmanje 100 c ́elija/µl ili manje, b) bazna ekspresija CD16 na perifernim NK c ́elijama od najmanje 60.000 ABC ili manje, i c) osnovna periferna T c ́elija broji najmanje 500 c ́elija/µl ili manje. Rezultati su prikazani na slikama 8-10. PFS upoređujuc ́i pacijente sa brojem NK c ́elija koji imaju najmanje 100 c ́elija/µl u poređenju sa pacijentima sa nižim brojem NK c ́elija pokazao je statistički značajnu razliku sa HR od 0,1561 (neprilagođena log-rank vrednost p = 0,0003). Ovo dalje potvrđuje prediktivnost broja NK c ́elija u odgovoru pacijenata lečenih MOR00208 odnosno onih pacijenata koji imaju CLL, NHL, ALL ili SLL.

2

Claims (13)

1. Patentni zahtevi 1. Metod identifikacije subjekta koji ima hroničnu limfocitnu leukemiju (CLL) ili akutnu limfoblastnu leukemiju (ALL) koji reaguje na tretman sa anti-CD19 antitelom, navedeni metod obuhvata: a. obezbeđivanje uzorka krvi dobijenog od navedenog subjekta pre tretmana sa navedenim anti-CD19 antitelom, b. određivanje nivoa najmanje jednog biomarkera u navedenom uzorku izabranom iz grupe koju čine: i. broj perifernih NK c ́elija, i ii. nivoi ekspresije CD16 na perifernim NK c ́elijama, c. upoređivanje nivoa navedenog najmanje jednog biomarkera u navedenom uzorku sa unapred određenim graničnim nivoom, pri čemu nivoi navedenog najmanje jednog biomarkera na ili iznad unapred određenog graničnog nivoa ukazuju na subjekta koji bi imao koristi od tretmana sa anti-CD19 antitelom.
2. 2. Metod prema patentom zahtevu 1, pri čemu je unapred određeno odsecanje navedenog biomarkera: a. osnovni broj NK c ́elija unutar najmanje 50 c ́elija/µl, ili b. osnovni nivoi ekspresije CD16 na perifernim NK c ́elijama od najmanje 60.000 ABC.
3. 3. Metod prema patentnom zahtevu 1 ili 2, pri čemu unapred određeno odsecanje navedenog biomarkera je broj osnovnih perifernih NK c ́elija od najmanje 60 c ́elija/µl.
4. 4. Metod prema bilo kojem od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu unapred određeno odsecanje navedenog biomarkera je osnovni broj perifernih NK c ́elija od najmanje 70 c ́elija/µl.
5. 5. Metod prema bilo kojem od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu unapred određeno odsecanje navedenog biomarkera je osnovni broj perifernih NK c ́elija od najmanje 80 c ́elija/µl.
6. 6. Metod prema bilo kojem od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu unapred određeno odsecanje navedenog biomarkera je osnovni broj perifernih NK c ́elija od najmanje 100 c ́elija/µl.
7. 7. Metod prema bilo kojem od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu unapred određeno odsecanje navedenog biomarkera je osnovni nivo ekspresije CD16 na perifernim NK c ́elijama od najmanje 60.000 ABC.
8. 8. Metod prema bilo kojem od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu anti-CD19 antitelo sadrži HCDR1 region koji sadrži sekvencu SYVMH (SEK ID BR: 1), HCDR2 region koji sadrži sekvencu NPYNDG (SEK ID BR: 2), HCDR3 region koji sadrži sekvencu GTYYYGTRVFDY (SEK ID BR: 3), LCDR1 region koji sadrži sekvencu RSSKSLQNVNGNTYLY (SEK ID BR: 4), LCDR2 region koji sadrži sekvencu RMSNLNS (SEK ID BR: 5) i LCDR3 region koji sadrži sekvenca MQHLEYPIT (SEK ID BR: 6).
9. 9. Metod prema bilo kojem od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu anti-CD19 antitelo sadrži varijabilni teški lanac sekvence EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGYTFTSYVMHWVRQAPGKGLEWIGYIN PYNDGTKYNEKFQGRVTISSDKSISTAYMELSSLRSEDTAMYYCARGTYYYGT RVFDYWGQGTLVTVSS (SEK ID BR: 10) i varijabilni laki lanac sekvence

   2
10. 10. Metod prema bilo kojem od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu anti-CD19 antitelo sadrži teški lanac koji ima sekvencu EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGYTFTSYVMHWVRQAPGKGLEWIGYIN PYNDGTKYNEKFQGRVTISSDKSISTAYMELSSLRSEDTAMYYCARGTYYYGT RVFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPV TVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPS NTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTC VVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQD WLNGKEYKCKVSNKALPAPEEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSL TCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHN-HYTQKSLSLSPGK (SEK ID BR: 8) i laki lanac koji ima sekvencu
11. 11. Metod prema bilo kojem od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu navedeni subjekt ima hroničnu limfocitnu leukemiju.
12. 12. Metod prema bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 10, pri čemu navedeni subjekt ima akutnu limfoblastnu leukemiju.
13. 13. Anti-CD19 antitelo za upotrebu u lečenju pacijenata koji boluju od hronične limfocitne leukemije (CLL) ili akutne limfoblastne leukemije (ALL), pri čemu je pacijent identifikovan prema metodu prema bilo kojem od prethodnih patentnih zahteva.