RS64317B1 - Polipeptidi sa izmenjenom glikozilacijom i smanjenom efektorskom funkcijom koji sadrže fc - Google Patents

Description

Opis

STANJE TEHNIKE

[0001] Antitela sa smanjenom ili ukinutom Fc-glikozilacijom se koriste za lečenje upalnih i autoimunih bolesti ili poremećaja kako bi se smanjili neželjeni efekti ili toksičnost povezani sa neželjenom efektorskom funkcijom (pogledati, na primer, Chan i Carter, Nat. Reviews Immunology, 2010). Međutim, glikozilacija Fc domena antitela je važna za strukturu, stabilnost, i funkciju antitela, i glikozilacija može rezultovati antitelima sa lošim biofizičkim svojstvima. Shodno tome, u struci postoji potreba za dizajnirane vezujuće proteine sa smanjenom efektorskom funkcijom, ali koji takođe zadržavaju poželjna svojstva glikozilovanog Fc domena.

[0002] WO 2004/099249 odnosi se na optimizovane Fc varijante, postupke za njihovu generaciju i antitela i Fc fuzije koji sadrže optimizovane Fc varijante. Shields R et al., J Biol Chem, 2001, 276(9), 6591-6604 odnosi se na mesto vezivanja ljudskog IgGl za Fc receptore i dizajn IgG 1 varijanti sa poboljšanim vezivanjem za FciR*.

REZIME

[0003] Predmetno obelodanjenje poboljšava stanje tehnike pružanjem antitela i opciono njihovih konjugata lekova, koji sadrže ljudski IgG Fc domen sa izmenjenom glikozilacijom i smanjenom efektorskom funkcijom. Ljudski IgG Fc domen sadrži: glikozilovani asparaginski ostatak na položaju aminokiselina 298, prema EU numeraciji; i ostatak serina ili treonina na položaju aminokiselina 300, prema EU numeraciji. Predmetno obelodanjenje takođe pruža nukleinske kiseline koje kodiraju antitela, rekombinantne vektore eksprimiranja i ćelije domaćine za izradu takvih antitela. Antitela koja su ovde obelodanjena takođe su pružena za upotrebu u lečenju bolesti.

[0004] Pronalazači su iznenađujuće otkrili da antitela predmetnog obelodanjenja pokazuju izmenjene profile glikozilacije koji su povoljni po tome što ukidaju vezivanje antitela na Fcγ receptore, čime se menja efektorska funkcija antitela, i zadržavaju poželjne biofizičke osobine koje se dobijaju glikozilacijom. Osim toga, dizajnirano N-vezano mesto glikozilacije na aminokiselinskom položaju 298 takođe se može koristiti kao mesto za konjugaciju efektorskih delova, kao što su citotoksični lekovi.

[0005] Prema tome, u jednom aspektu pronalazak pruža izolovano antitelo koje sadrži ljudski IgG Fc domen sa izmenjenim glikozilacijom, pri čemu ljudski IgG Fc domen sadrži: glikozilovani ostatak asparagina na položaju aminokiselina 298, prema EU numeraciji; i ostatak serina ili treonina na položaju aminokiselina 300, prema EU numeraciji. U jednom otelotvorenju, antitelo dalje sadrži alaninski ostatak na položaju aminokiselina 299, prema EU numeraciji. U još jednom otelotvorenju, antitelo dalje sadrži glutaminski ostatak na položaju aminokiselina 297, prema EU numeraciji. U jednom otelotvorenju Fc domen je IgG1 Fc domen.

[0006] U jednom aspektu, bočni lanac ostatka asparagina povezan je sa glikanom kroz vezivanje β-glikozilamida. U još jednom otelotvorenju, glikan je biantenarni glikan. U još jednom otelotvorenju, glikan je prirodni glikoform sisara.

[0007] U još jednom otelotvorenju, antitelo ima niži afinitet za Fcγ receptor od antitela koje ima matični Fc domen. U jednom aspektu, Fcγ receptor je FcyRI i/ili FcyRIIIa. U još jednom otelotvorenju, antitelo ima sličan afinitet za FcRn receptor kao antitelo koje ima prirodni Fc domen.

[0008] U još jednom otelotvorenju, glikan sadrži reaktivnu aldehidnu grupu. U još jednom otelotvorenju, glikan sadrži oksidovan saharidni ostatak koji sadrži reaktivnu aldehidnu grupu. U još jednom otelotvorenju, oksidovan saharidni ostatak je terminalna sijalinska kiselina ili galaktoza.

[0009] U još jednom otelotvorenju, glikan je povezan sa efektorskim delom. U još jednom otelotvorenju, efektorski deo je citotoksin. U još jednom otelotvorenju, citotoksin se bira iz grupe citotoksina navedenih u Tabeli 1. U drugom otelotvorenju, efektorski deo je agens za detekciju. U još jednom otelotvorenju, efektorski deo je povezan oksimskom ili hidrazonskom vezom sa saharidnim ostatkom glikana. U još jednom otelotvorenju, saharidni ostatak je terminalna sijalinska kiselina ili galaktozni ostatak glikana. U sledećom otelotvorenju, efektorski deo sadrži pH-osetljiv veznik, disulfidni veznik, enzim-osetljivi veznik ili drugi razdvojivi veznički deo. U sledećom otelotvorenju, efektorski deo sadrži vezničku grupu izabranu iz grupe vezničkih grupa prikazanih u Tabeli 2 ili 14.

[0010] U drugom otelotvorenju, glikozilovani asparaginski ostatak je povezan sa delom efektora leka kako bi se formirao antitelo lek konjugat (ADC).

[0011] U sledećem aspektu, sastav sadrži antitelo iz pronalaska i farmaceutski prihvatljiv nosač ili ekscipijent.

[0012] U drugom aspektu, pronalazak pruža efikasnu količinu gornjeg sastava za upotrebu kao lek.

[0013] U sledećem aspektu, pronalazak pruža izolovani polinukleotid koji kodira antitelo prema pronalasku. U sledećem aspektu, pronalazak pruža vektor koji sadrži polinukleotid ili ćeliju domaćina koja sadrži polinukleotid ili vektor.

[0014] U još jednom aspektu, pronalazak pruža postupak pravljenja antitela koje sadrži eksprimiranje polinukleotida ili vektora u ćeliji.

KRATAK OPIS CRTEŽA

[0015]

Slika 1 je šematska ilustracija sinteze antitelo lek konjugata gde je toksin ostatak povezan sa oksidovanim ostacima sijalinske kiseline glikana antitela korišćenjem oksimske veze.

Slika 2 je obojeni gel Komasi-plavom koji prikazuje eksprimiranje i prečišćavanje mutanata glikozilacije.

Slika 3 prikazuje rezultate eksperimenata površinske plazmonske rezonance koji se koriste za procenu vezivanja mutanata αβTCR HEBE1 IgG antitela na rekombinantni ljudski FcyRIIIa (V158 i F158).

Slika 4 prikazuje rezultate eksperimenata površinske plazmonske rezonance koji se koristi za procenu vezivanja mutanata αβTCR HEBE1 IgG antitela na rekombinantni ljudski FcγRI.

Slika 5 prikazuje profil oslobađanja citokina iz PBMC za TNFa, GM-CSF, IFNy i IL10 u prisustvu mutantnih anti-αβTCR antitela (dan 2).

Slika 6 prikazuje profil oslobađanja citokina iz PBMC za IL6, IL4 i IL2 u prisustvu mutantnih anti-αβTCR antitela (dan 2).

Slika 7 prikazuje profil oslobađanja citokina iz PBMC za TNFa, GM-CSF, IFNy i IL10 u prisustvu mutantnih anti-αβTCR antitela (dan 4).

Figura 8 prikazuje profil oslobađanja citokina iz PBMC za IL6, IL4 i IL2 u prisustvu mutantnih anti-αβTCR antitela (dan 4).

Slika 9 prikazuje rezultate eksperimenata koji istražuju nivo eksprimiranja 2C3 mutanata Western blotovanjem i površinskom plazmonskom rezonancom.

Slika 10 prikazuje rezultate eksperimenata koji istražuju glikozilaciju 2C3 mutanata pre- i posle tretmana PNGazae F.

Slika 11 prikazuju rezultate SDS-PAGE eksperimenata koji istražuju mesta glikozilacije na 2C3 mutantima izolovanim iz ćelijske kulture.

Slika 12 prikazuje rezultate eksperimenata površinske plazmonske rezonance koji se koriste za procenu vezivanja modifikovanog anti-CD52 na rekombinantnu ljudsku FcyRIIIa (V158). Anti-CD52 koji sadrži mutacije S298N/Y300S u domenu Fc korišćeni su za procenu efektorske funkcije modifikovanog molekula. Vezivanje za CD52 peptid (A), vezivanje za FcyRIIIa (V158, B), i kontrolu vezivanja na mišji FcRn (C).

Slika 13 prikazuje rezultate eksperimenata površinske plazmonske rezonance koji istražuju Fc vezujuća svojstva 2C3 mutanata.

Slika 14 prikazuje rezultate eksperimenata površinske plazmonske rezonance koji istražuju vezivanje modifikovanih anti-CD52 na FcyRIIIa (Val158) (kao gore) i FcyRIIIa (Phe158). Anti-CD52 antitela koja sadrže S298N/Y300S mutacije u Fc domenu su korišćena za procenu efektorske funkcije modifikovanog vezivanja molekula na FcyRIIIa (Val158, slika 14A) i FcyRIIIa (Phe58, slika 14B).

Slika 15 prikazuje analizu vezivanja C1q u mutantu S298N/Y300S i WT 2C3 kontroli (A) i rezultate Eliza analize koja potvrđuje ekvivalentno oblaganje komorica.

Slika 16 prikazani su rezultati eksperimenata plazmonske rezonance koji mere vezujuću kinetiku 2C3 mutanata na CD-52 peptid 741.

Slika 17 prikazani su rezultati eksperimenata plazmonske rezonance koji upoređuju afinitet vezivanja WT anti-CD-522C3 antigena i mutanta A114N hiperglikozilacije.

Slika 18 prikazani su rezultati izoelektričnog fokusiranja i eksperimenata za karakterizaciju masenog spektrometra za određivanje glikanskog sadržaja 2C3 mutanata.

Slika 19 prikazuju rezultate koncentracija (oktet) i eksperimenata plazmonske rezonance upoređujući afinitet vezivanja antigena za WT anti-CD-522C3 i mutante.

Slika 20 prikazuje rezultate SDS-PAGE eksperimenata za određivanje glikanskog sadržaja anti-TME1 A114N mutanta.

Slika 21 prikazuje rezultate SDS-PAGE i hidrofobne interakcije hromatografske analize A114N anti-Her2 mutanta.

Slika 22 prikazuje rezultate SDS-PAGE eksperimenata kako bi se demonstrirala konjugacija PEG-a za 2C3 A114N mutant kroz aminooksi vezu.

Slika 23 prikazuje rezultate eksperimenata LC-MS za određivanje glikanskog sadržaja anti-TEM1 A114N mutanta hiperglikozilacije.

Slika 24 prikazuje rezultate eksperimenata LC-MS za određivanje glikanskog sadržaja antitela HER2 divljeg tipa i A114N anti-Her2 mutanta hiperglikozilacije. Slika 25 prikazuje primerni postupak za obavljanje konjugacije specifične za mesto antitela prema postupcima iz ovog pronalaska.

Slika 26 prikazuje sintezu primernih efektorskih delova prema pronalasku: aminooksi-Cys-MC-VC-PABC-MMAE i aminooksi-Cys-MC-VC-PABC-PEG8-Dol10.

Slika 27 prikazuje informacije o karakterizaciji za sijalizovano HER2 antitelo.

Slika 28 prikazuje informacije o karakterizaciji za oksidovana sijalizovana anti-HER 2 antitela.

Slika 29 prikazuje hidrofobne interakcije hromatografije glikokonjugata pripremljene sa tri različita sijalizovana antitela sa dve različite aminooksi grupe.

Slika 30 prikazuje HIC hromatograf antiHer2 A114 glikozilacionog mutantnog konjugata sa AO-MMAE pripremljenim pomoću GAM(+) hemije.

Slika 31 prikazuje poređenje in vitro potencijala anti-HER2 glikokonjugata i tiol konjugata.

Slika 32 prikazuje poređenje in vitro potencijala anti FAP B11 glikokonjugata i tiol konjugata.

Slika 33 prikazuje poređenje in vivo efikasnost anti-HER2 glikokonjugata i tiol konjugata u modelu ksenografta Her2+ tumorskih ćelija.

Slika 34 prikazuju rezultate eksperimenata LC-MS kako bi se odredio sadržaj glikana mutantnog anti-αβTCR antitela koje sadrži S298N/Y300S mutaciju.

Slika 35 prikazuje rezultate eksperimenata kružnog dihroizma kako bi se odredila relativna termička stabilnost anti-αβTCR antitela divljeg tipa i mutantnog anti-αβTCR antitela koje sadrži S298N/Y300S mutaciju.

Slika 36 prikazuju rezultate testa proliferacije ćelija za ADC pripremljenog sa anti-HER antitelom koji nosi A114N hiperglikozilacionu mutaciju i AO-MMAE.

DETALJAN OPIS

[0016] Predmetno obelodanjenje pruža antitela i njihove konjugate lekova, koji sadrže ljudski IgG Fc domen, gde ljudski IgG Fc domen sadrži: glikozilirani ostatak asparagina na položaju aminokiselina 298, prema EU numeraciji; i ostatak serina ili treonina na položaju aminokiselina 300, prema EU numeraciji. Predmetno obelodanjenje takođe pruža nukleinske kiseline koje kodiraju antitela, rekombinantne vektore eksprimiranja i ćelije domaćine za izradu takvih antitela. Antitela koja su ovde obelodanjena takođe su pružena za upotrebu u lečenju bolesti.

I. Definicije

[0017] Kad se ovde koristi, izraz „vezujući polipeptid“ ili „vezujući polipeptid“ odnosi se na polipeptid (npr. antitelo) koji sadrži najmanje jedno mesto vezivanja koje je odgovorno za selektivno vezivanje za ciljani antigen koji je od interesa (npr. ljudski antigen). Primeri mesta vezivanja uključuju varijabilni domen antitela, mesto vezivanja liganda receptora ili mesto vezivanja receptora liganda. U određenim aspektima, vezujući polipeptidi prema pronalasku obuhvataju višestruka (npr., dve, tri, četiri ili više) mesta vezivanja.

[0018] Kad se ovde koristi, izraz „prirodni ostatak“ odnosi se na aminokiselinski ostatak koji se prirodno javlja na određenom aminokiselinskom položaju vezujućeg polipeptida (npr. antitelo ili njegov fragment) i koji nije modifikovan, uveden ili izmenjen od strane čoveka. Kad se ovde koristi, izraz „izmenjen vezujući polipeptid“ ili „izmenjeni vezujući polipeptid“ obuhvata vezujuće polipeptide (npr., antitelo ili njegov fragment) koji sadrže bar jedan veštački (neprirodni) mutirani aminokiselinski ostatak.

[0019] Izraz „specifično vezuje“ kad se ovde koristi, odnosi se na sposobnost antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta da se veže na antigen sa konstantom disociacije (Kd) od najviše oko 1 × 10<-6>M, 1 × 10<-7>M, 1 × 10<-8>M, 1 × 10<-9>M, 1 × 10<-10>M, 1 × 10<-11>M, 1 × 10<-12>M ili manje, i/ili da se veže na antigen sa afinitetom koji je najmanje dvostruko veći od njegovog afiniteta za nespecifični antigen.

[0020] Kad se ovde koristi, izraz „antitelo“ odnosi se na takve sklopove (npr., netaknute molekule antitela, fragmente antitela ili njihove varijante) koje imaju značajno poznatu specifičnu imunoreaktivnu aktivnost za antigen od interesa (npr. antigen povezan sa tumorom). Antitela i imunoglobulini sadrže lake i teške lance, sa ili bez međusobne kovalentne veze između njih. Osnovne strukture imunoglobulina u sistemima kičmenjaka su relativno dobro shvaćeni.

[0021] Kao što će se detaljnije razmotriti u nastavku, generički izraz „antitelo“ sadrži pet različitih klasa antitela koje se mogu biološki razlikovati. Svih pet klasa antitela su jasno u okviru predmetnog obelodanjenja, sledeća diskusija će se generalno usmeriti na IgG klasu molekula imunoglobulina. Što se tiče IgG, imunoglobulini sadrže dva identična laka lanca molekulske težine otprilike 23.000 daltona i dva identična teška lanca molekulske težine 53.000-70.000. Četiri lanca se pridružuju disulfidnim vezama u „Y“ konfiguraciji gde laki lanci drže teške lance počevši od usta „Y“ i nastavljaju kroz varijabilnu regiju.

[0022] Laki lanci imunoglobulina su klasifikovani kao kapa ili lambda (κ, λ). Svaka klasa teškog lanca može biti vezana ili sa kapa ili lambda lakim lancem. U principu, laki i teški lanci su kovalentno vezani jedni prema drugima, a delovi „repa“ dva teška lanca su vezani jedni drugim kovalentnim disulfidnim vezama ili ne-kovalentnim vezama kada imunoglobuline generišu hibridomi, B ćelije ili genetski dizajnirane ćelije domaćine. U teškim lancima, sekvence aminokiselina potiču od N-terminusa na razdvojenim krajevima Y konfiguracije do C-terminusa na dnu svakog lanca. Stručnjaci u ovoj oblasti će ceniti da su teški lanci klasifikovani kao gama, mu, alfa, delta ili epsilon, (γ, μ, α, δ, ε) sa nekim podklasama među njima (npr., γ1-γ4). Priroda ovog lanca određuje „klase“ antitela kao IgG, IgM, IgA IgG ili IgE, respektivno. Podklase izotipskih imunoglobulina (npr., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, itd.) su dobro okarakterisane i poznato je da daju funkcionalnu specijalizaciju. Modifikovane verzije svake od ovih klasa i izotipova lako se prepoznaju od strane stručnjaka u oblasti predmetnog obelodanjenja, i shodno tome su u okviru predmetnog obelodanjenja.

[0023] I laki i teški lanci podeljeni su na regije strukturalne i funkcionalne homologije. Izraz „regija“ odnosi se na deo ili deo lanca imunoglobulina ili antitela i obuhvata konstantnu regiju ili varijabilne regije, kao i više diskretnih delova ili delova pomenutih regija. Na primer, varijabilna regija lakog lanca uključuje „regije koji određuju komplementarnost“ ili „CDR“ koje su podeljeni između „okvirnih regija“ ili „FR“, kako je ovde definisano.

[0024] Regije teškog ili lakog lanca imunoglobulina mogu se definisati kao „konstantne“ (C) ili „varijabilne“ (V) regije, na osnovu relativnog nedostatka varijacije sekvenci unutar područja različitih članova klasa u slučaju „konstantne regije“ ili značajne varijacije unutar regija različitih članova klase u slučaju „varijabilnih regija“. Izrazi „konstantna regija“ i „varijabilna regija“ mogu se takođe koristiti funkcionalno. U tom pogledu, biće prihvaćeno da varijabilne regije imunoglobulina ili antitela određuju prepoznavanje antigena i specifičnost. Nasuprot tome, konstantne regije imunoglobulina ili antitela pružaju važne efektorske funkcije kao što su sekrecija, transplacentalnu mobilnost, vezivanje Fc receptora, vezivanje komplementa i slično. Podjedinične strukture i trodimenzionalne konfiguracije konstantnih regija različitih klasa imunoglobulina su dobro poznate.

[0025] Konstantne i varijabilne regije teških i lakih lanaca imunoglobulina savijaju se u domene. Izraz „domen“ odnosi se na globularnu regiju teškog ili lakog lanca koji sadrži peptidne petlje (npr., sastoji se od 3 do 4 peptidne petlje) stabilizovane, na primer, pomoću βnaboranog lima i/ili intralančane disulfidne veze. Domeni konstantne regije na lakom lancu imunoglobulina nazivaju se međusobno zamenljivo kao „domeni konstantne regije lakog lanca“, „CL regije“ ili „CL domeni“. Domeni konstantne regije na teškom lancu (npr. zglob, CH1, CH2 ili CH3 domeni) se nazivaju međusobno zamenljivo kao „domeni konstantne regije teškog lanca“, domeni „CH“ regije ili „CH domeni“. Varijabilni domeni na lakom lancu nazivaju se međusobno zamenljivo kao „domeni varijabilne regije lakog lanca“, „domeni VL regije“ ili „VL domeni“. Varijabilni domeni teškog lanca se nazivaju međusobno zamenljivo kao „domeni varijabilne regije teškog lanca“, „domeni VH regije“ ili „VH domeni“.

[0026] Konvencijom, numeracija domena varijabilnih konstantnih regija se povećava kada postanu udaljeniji od mesta vezivanja antigena ili amino-terminusa imunoglobulina ili antitela. N-terminus svakog teškog i lakog lanca imunoglobulina je varijabilna regija i na C-terminusu je konstantna regija; CH3 i CL domeni zapravo sadrže karboksi-terminus teškog i lakog lanca, respektivno. Shodno tome, domeni lakog lanca imunoglobulina su raspoređeni u VL-CL orijentaciji, dok su domeni teškog lanca raspoređeni u VH-CH1-zglob-CH2-CH3 orijentaciji.

[0027] Položaji aminokiseline u konstantnoj regiji teškog lanca, uključujući položaje aminokiselina u CH1, zglob, CH2, CH3 i CL domenima, mogu biti numerisane prema Kabatovom sistemu numeracije (pogledati Kabat i dr, u „Sequences of Proteins of Immunological Interest“, U.S. Dept. Health and Human Services, 5. izdanje, 1991).

Alternativno, položaji aminokiselina antitela mogu biti numerisani prema sistemu EU sistemu numeracije (pogledati Kabat i dr, ibidem).

[0028] Kad se ovde koristi, izraz „VH domen“ uključuje amino terminalni varijabilni domen teškog lanca imunoglobulina, a izraz „VL domen“ uključuje amino terminalni varijabilni domen lakog lanca imunoglobulina.

[0029] Kad se ovde koristi, izraz „CH1 domen“ obuhvata prvi (najčešće amino terminalni) domen konstantne regije teškog lanca imunoglobulina koji se proteže, na primer, od približno 114-223 u Kabatovom sistemu numeracije (EU položaji 118-215). CH1 domen je u blizini domena VH i amino terminala u zglobnoj regiji molekula teškog lanca imunoglobulina i ne čini deo Fc regija teškog lanca imunoglobulina.

[0030] Kad se ovde koristi, izraz „zglobna regija“ uključuje deo molekula teškog lanca koji pridružuje domen CH1 za domen CH2. Ova zglobna regija sadrži otprilike 25 ostataka i fleksibilna je, omogućujući tako da se dve regija vezivanja N-terminalnog antigena nezavisno kreću. Zglobne regije mogu se podeliti na tri različita domena: gornji, srednji i donji zglobni domen (Roux i dr. J. Immunol.1998, 161: 4083).

[0031] Kad se ovde koristi, izraz „CH2 domen“ obuhvata deo molekula imunoglobulina teškog lanca koji se proteže, npr., od oko položaja 244-360 u Kabatovom sistemu numeracije (EU položaji 231-340). CH2 domen je jedinstvena po tome što nije blisko uparen sa drugim domenom. Nasuprot tome, dva N-povezana razgranata ugljenohidratna lanca su smeštena između dva CH2 domena netaknutog prirodnog IgG molekula. U jednom otelotvorenju antitelo predmetnog obelodanjenja sadrži CH2 domen izveden iz molekula IgG1 (npr. ljudski IgG1 molekul).

1

[0032] Kad se ovde koristi, izraz „CH3 domen“ obuhvata deo molekula imunoglobulina teškog lanca koji se proteže otprilike 110 ostataka od N-terminusa CH2 domena, npr. od približno položaja 361-476 Kabatovog sistema numeracije (EU položaji 341 -445). CH3 domen obično oblikuje C-terminalni deo antitela. U nekim imunoglobulinima, međutim, dodatni domeni mogu protezati od CH3 domena kako bi se formirao C-terminalni deo molekula (npr. CH4 domen u μ lancu od IgM i e lancu od IgE). U jednom otelotvoremju, antitelo predmetnog obelodanjenja sadrži CH3 domen izveden iz molekula IgG1 (npr. ljudski IgG1 molekul).

[0033] Kad se ovde koristi, izraz „CL domen“ uključuje domen konstantne regije lakog lanca imunoglobulina koji se proteže, npr. od Kabatovog položaja 107A-216. CL domen je pored VL domena. U jednom aspektu, antitelo predmetnog obelodanjenja sadrži CL domen izveden iz kapa lakog lanca (na primer, ljudski kapa laki lanaca).

[0034] Kad se ovde koristi, izraz „Fc regija“ definisan je kao deo konstantne regije teškog lanca koji počinje u zglobnoj regiji neposredno uzvodno od mesta cepanja papaina (tj. ostatak 216 u IgG, uzimajući da je 114 prvi ostatak konstantne regije teškog lanca) i završava se na C-terminusu antitela. Shodno tome, kompletna Fc regija sadrži bar jedan domen zgloba, CH2 domen i CH3 domen.

[0035] Izraz „prirodni Fc“, kad se ovde koristi, odnosi se na molekul koji sadrži sekvencu neantigen vezujućeg fragmenta koji je rezultat digestije antitela ili je proizveden drugim sredstvima, bilo u monomernom ili multimernom obliku, i može sadržati oblast zgloba.

Originalni izvor imunoglobulina prirodnog Fc je poželjno ljudskog porekla i može biti bilo koji od imunoglobulina, iako su IgG1 i IgG2 poželjni. Prirodni Fc molekuli se sastoje od monomernih polipeptida koji se mogu povezati u dimerne ili multimerne oblike pomoću kovalentnih (tj. disulfidnih veza) i ne-kovalentne asocijacije. Broj intermolekularnih disulfidnih veza između monomernih podjedinica prirodnih molekula Fc kreće se od 1 do 4 u zavisnosti od klase (npr. IgG, IgA i IgE) ili podklase (npr. IgG1, IgG2, IgG3, IgA1 i IgGA2). Jedan primer matičnog Fc je disulfidno vezani dimer koji je rezultat digestije papina od strane IgG. Izraz „prirodni Fc“ kad se ovde koristi je generički u monomernim, dimernim i multimernim oblicima.

[0036] Izraz „varijanta Fc“, kad se ovde koristi, odnosi se na molekul ili sekvencu koja je modifikovana iz prirodnog Fc, ali i dalje sadrži vezujuće mesto za receptor za spasavanje, FcRn (neonatalni Fc receptor). Primerne Fc varijante i njihova interakcija sa receptorom za spasavanje su poznati u struci. Prema tome, izraz „varijanta Fc“ može sadržati molekul ili sekvencu koja je humanizovana od ne-ljudskog prirodnog Fc. Osim toga, prirodni Fc sadrži regije koji se mogu ukloniti jer pružaju strukturne osobine ili biološku aktivnost koja nije potrebna za antitela pronalaska. Prema tome, izraz „varijanta Fc“ obuhvata molekul ili sekvencu u kojoj nedostaje jedna ili više prirodnih Fc lokacija ili ostataka, ili u kojima je jedna ili više Fc lokacija ili ostataka modifikovana, koje utiču ili su uključene u: (1) formiranje disulfidne vezu, (2) nekompatibilnost sa izabranom ćelijom domaćina, (3) N-terminalnu heterogenost nakon eksprimiranja u izabranoj ćeliji domaćinu, (4) glikozilaciju, (5) interakciju sa komplementom, (6) vezivanje za Fc receptor koji nije receptor za spašavanje ili (7) ćelijsku citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC).

[0037] Izraz „domen Fc“ kad se ovde koristi obuhvata prirodne Fc varijante i Fc i sekvence definisane gore. Kao i kod varijanti Fc i prirodnih Fc molekula, izraz „Fc domen“ uključuje molekule u monomernom ili multimernom obliku, bilo da se digestiraju iz celog antitela ili proizvode drugim sredstvima.

[0038] Kao što je gore navedeno, varijabilna regije antitela omogućava selektivno prepoznavanje i specifično vezivanje epitopa na antigene. To jest, domen VL i VH domen antitela se kombinuju kako bi se formirala varijabilna regija (Fv) koji definiše trodimenzionalno mesto vezivanja antigena. Ova kvaterarna struktura antitela oblikuje mesto za vezivanje antigena prisutno na kraju svakog kraka Y. Konkretnije, mesto vezivanja antigena je definisano sa tri regije za određivanje komplementarnosti (CDR) na svakoj varijabilnoj regiji teškog i lakog lanca. Kad se ovde koristi, izraz „mesto vezivanja antigena“ obuhvata mesto koje se specifično vezuje (imunoreaguje sa) antigenom (npr., površina ćelije ili rastvorljiv antigen). Mesto za vezivanje antigena obuhvata varijabilnu regiju teškog lanca i lakog lanca imunoglobulina i mesta vezivanja koja formiraju ove varijabilne regije određuju specifičnost antitela. Mesto vezivanja antigena formiraju varijabilne regije koji variraju od jednog antitela do drugog. Izmenjena antitela predmetnog obelodanjenja sadrže najmanje jedno mesto za vezivanje antigena.

[0039] U određenim otelotvorenjima, antitela predmetnog obelodanjenja sadrže najmanje dva antigen-vezujuća domena koja pružaju povezivanje antitela sa izabranim antigenom. Oblici vezivanja antigena ne moraju biti izvedeni iz istog molekula imunoglobulina. U tom pogledu, varijabilna regija može ili biti izvedena od bilo koje vrste životinja koja se može indukovati za postavljanje humoralnog odgovora i stvaranje imunoglobulina protiv željenog antigena. Kao takva, varijabilna regija antitela može biti, na primer, sisarskog porekla npr. Može biti čovek, glodar, pacov, koza, ovca, primat koji nije čoveka (kao što su cinomolgus majmuni, makaki, itd.), lupin ili kameila (npr. od kamila, lama i srodnih vrsta).

[0040] U prirodnim antitelima, šest CDR prisutnih na svakom monomernom antitelu su kratke, ne-susedne sekvence aminokiselina koje su posebno pozicionirane kako bi se formiralo mesto vezivanja antigena, jer antitelo uzima svoju trodimenzionalnu konfiguraciju u vodenoj sredini. Ostatak teških i lakih varijabilnih domena pokazuje manje intermolekularne varijabilnosti u aminokiselinskoj sekvenci i nazivaju se okvirnim regijama. Okvirna regije u velikoj meri usvajaju konformaciju β-listova i CDR formiraju petlje koje povezuju, i u nekim slučajevima su i deo strukture β-listova. Prema tome, ove okvirna regije deluju kako bi formirale skele koje omogućavaju pozicioniranje šest CDR u tačnoj orijentaciji inter-lančanim, ne-kovalentnim interakcijama. Antigen vezujući domen formiran od pozicioniranih CDR definiše površinu komplementarnu epitopu na imunoreaktivnom antigenu. Ova komplementarna površina promoviše ne-kovalentno vezivanje antitela na imunoreaktivni epitop antigena.

[0041] Primeri antitela prema pronalasku uključuju varijante antitela. Kad se ovde koristi, izraz „varijanta antitela“ obuhvata sintetičke i dizajnirane oblike antitela koja se menjaju tako da se ne pojavljuju prirodno, npr. antitela koja sadrže najmanje dva dela teškog lanca, ali ne dva potpuna teška lanca (kao što su antitela sa izbrisanim domenima ili minitela); multispecifični oblici antitela (npr., bispecifični, trispecifični, itd.) izmenjeni da se vezuju za dva ili više različitih antigena ili za različite epitope na jedinstvenom antigenu); molekuli teškog lanca spojeni sa scFv molekulima i slično. Pored toga, izraz „varijanta antitela“ obuhvata multivalentne oblike antitela (npr. trivalentne, tetravalentne, itd., antitela koja se vezuju za tri, četiri ili više kopija istog antigena.

[0042] Kad se ovde koristi, izraz „valenca“ odnosi se na broj potencijalnih mesta za vezivanje cilja u polipeptidu. Svako mesto za vezivanje cilja specifično vezuje jedan ciljani

1

molekul ili specifičnu lokaciju na ciljanom molekulu. Kada polipeptid obuhvata više od jednog mesta za vezivanje cilja, svako mesto za vezivanje cilja može specifično vezati iste ili različite molekule (npr., može se vezati za različite ligande ili različite antigene ili različite epitope na istom antigenu). Pacijentova antitela poželjno imaju najmanje jedno mesto vezivanja specifično za ljudski antigen molekul.

[0043] Izraz „specifičnost“ odnosi se na sposobnost specifičnog vezivanja (npr., imunoreagovanje sa) datog ciljanog antigena (npr., ljudskog ciljanog antigena). Antitelo može biti monospecifično i sadrži jedno ili više mesta vezivanja koja specifično vezuju cilj, ili polipeptid može biti multispecifičan i sadrži dva ili više mesta vezivanja koja specifično vezuju iste ili različite ciljeve. U određenim otelotvorenjima, antitelo prema pronalasku je specifično za dva različita (npr., nepreklapajući) dela istog cilja. U određenim otelotvorenjima, antitelo prema pronalasku je specifično za više od jednog cilja. Primeri antitela koja sadrže mesta vezivanja antigena koji se vezuju za antigene izražene na tumorskim ćelijama su poznati u struci i jedna ili više CDR od takvih antitela mogu biti uključeni u antitelo pronalaska.

[0044] Izraz „vezujući deo“ uključuje grupe koje su sposobne da povezuju efektorski deo sa antitelima koja su ovde prikazana. Vezujući deo može biti izabran tako da se može razdvojiti (npr., enzimatsko razdvojivim ili pH osetljivim) ili da se ne može razdvojiti. Primeri vezujućih delova su prikazani u Tabeli 2.

[0045] Kad se ovde koristi, izraz „efektorski deo“ sadrži dijagnostičke i terapeutske agense (npr. proteini, nukleinske kiseline, lipidi, lekovi i njihovi fragmenti) sa biološkom ili drugom funkcionalnom aktivnošću. Na primer, modifikovano antitelo koje sadrži efektorski deo konjugovan sa antitelom ima najmanje jednu dodatnu funkciju ili svojstvo u poređenju sa nekonjugovanim antitelima. Na primer, konjugacija citotoksičnog leka (npr., efektorski deo) na antitelo rezultuje stvaranjem antitela sa citotoksičnom interakcijom kao drugom funkcijom (tj. pored vezivanja antigena). U drugom primeru, konjugacija drugog antitela na antitelo može dati dodatna svojstva vezivanja. U određenim otelotvorenjima, gde je efektorski deo genetski kodirani terapeutski ili dijagnostički protein ili nukleinska kiselina, efektorski deo može biti sintetisan ili eksprimiran bilo postupcima peptidne sinteze ili rekombinantne DNK koji su dobro poznate u struci. U drugom aspektu, kad je efektor ne-genetski kodirani peptid ili deo leka, efektorski deo može se sintetizovati veštački ili biti prečišćen iz prirodnog izvora. Kad se ovde koristi, izraz „deo leka“ obuhvata antiupalne, antikancerozne, antiinfektivne (npr. anti-gljivične, antibakterijske, anti-parazitske, anti-virusne, itd.) I anestetičke terapeutske agense. U daljem otelotvorenju, deo leka je antikancer ili citotoksični agens. Kompatibilni lekovi mogu takođe sadržati prolekove. Primeri efektora su prikazani u Tabeli 1.

[0046] Kad se ovde koristi, izraz „prolek“ se odnosi na prethodni ili izvedeni oblik farmaceutski aktivnog agensa koji je manje aktivan, reaktivan ili sklon neželjenim efektima u poređenju sa matičnim lekom i sposoban je da bude enzimski aktiviran ili na drugi način pretvoren u aktivniji oblik in vivo. Prolekovi kompatibilni sa sastavima predmetnog obelodanjenja uključuju, ali se ne ograničavaju na, prolekove koji sadrže fosfate, prolekove koji sadrže aminokiselinu, prolekove koji sadrže tiofosfat, prolekove koji sadrže sulfat, prolekove koji sadrže peptid, prolekove koji sadrže β-laktam, opciono supstituisane prolekove koji sadrže fenoksiacetamid ili opciono supstituisane prolekove koji sadrže fenilacetamid, 5-fluorocitozin i ostale 5-fluorouridinske prolekove koji se mogu pretvoriti u aktivni lek bez citotoksičnosti. Stručnjak u oblasti može da napravi hemijske modifikacije željenog dela leka ili njegovog proleka kako bi reakcije tog jedinjenja učinio pogodnijim za potrebe pripreme modifikovanih antitela predmetnog obelodanjenja. Delovi leka takođe uključuju derivate, farmaceutski prihvatljive soli, estre, amide i etre lekova koji su ovde opisani. Derivati uključuju modifikacije lekova koje su ovde identifikovane, a koje mogu poboljšati ili ne značajno smanjiti željenu terapeutsku aktivnost određenog leka.

[0047] Kad se ovde koristi, izraz „antikancerogeni agens“ obuhvata agense koji ometaju rast i/ili proliferaciju neoplastičnih ili tumorskih ćelija i mogu delovati kako bi smanjili, inhibirali ili uništili malignitet. Primeri takvih agensa uključuju, ali bez ograničenja na, citostatičke agense, agense za alkilovanje, antibiotike, citotoksične nukleozide, agense za vezivanje tubulina, hormone, antagoniste hormona, citotoksične agensi i slično. Citotoksični agensi uključuju derivate tomamicina, derivate maitanzina, derivate kriptoficina, derivate antraciklina, derivate bisfosfonata, derivate leptomicina, derivate streptigrina, derivate auristatina i derivate duokarmicina. Svaki agens koji deluje na zaustavljanje ili usporavanje rasta imunoreaktivnih ćelija ili malignih ćelija je u okviru predmetnog obelodanjenja.

1

[0048] Izraz „antigen“ ili „ciljani antigen“, kad se ovde koristi, odnosi se na molekul ili deo molekula koji je sposoban da bude vezan od strane mesta za vezivanje antitela. Ciljani antigen može imati jedan ili više epitop.

II. Antitela

[0049] U jednom aspektu, predmetno obelodanjenje pruža antitela koja sadrže ljudski IgG domen, gde ljudski IgG Fc domen sadrži: glikozilirani ostatak asparagina na položaju aminokiselina 298, prema EU numeraciji; i ostatak serina ili treonina na položaju aminokiselina 300, prema EU numeraciji.

[0050] Fc domeni iz IgG se koriste u ovde obelodanjenim antitelima. U nekim otelotvorenjima, ljudski IgG Fc domen je ljudski IgG1 Fc domen. U slučaju ljudskog IgG1 Fc domena, mutacija aminokiseline divljeg tipa na Kabat položaju 298 na asparaginu i Kabat položaju 300 na serinu ili treoninu dovodi do stvaranja N-povezanog konsenzus mesta glikozilacije (tj. N-X-T/S sekon, gde je X bilo koja aminokiselina osim prolina).

[0051] Antitela opisana ovde obuhvataju bilo koje antitelo koje sadrži Fc domen koji ima N-vezan položaj glikozilacije na položaju 298, prema Kabat numerisanju.

[0052] U određenim otelotvorenjima predmetno obelodanjenje može sadržati antigen vezujući fragment antitela. Izraz „antigen-vezujući fragment“ odnosi se na polipeptidni fragment imunoglobulina ili antitela koji vezuje antigen ili se takmiči sa netaknutim antitelima {tj., sa netaknutim antitelom iz kog je izveden) za vezivanje antigena {tj., specifično vezivanje). Antigen vezujući fragmenti mogu se dobiti rekombinantnim ili biohemijskim postupcima koji su dobro poznati u struci. Primeri fragmenata koji vezuju antigen uključuju Fv, Fab, Fab' i (Fab')2. U poželjnim otelotvorenjima, antigen-vezujući fragment predmetnog obelodanjenja je izmenjen antigen vezujući fragment koji sadrži najmanje jedno dizajnirano mesto glikozilacije. U jednom primerenom otelotvorenju, izmenjen fragment vezivanja antigena predmetnog obelodanjenja obuhvata izmenjeni VH domen opisan supra. U još jednom primernom otelotvorenju, izmenjen fragment vezivanja antigena predmetnog obelodanjenja obuhvata izmenjenu CH1 domen opisan supra.

[0053] U primernim otelotvorenjima, antitelo sadrži sekvencu jednolančane varijabilne regije (ScFv). Sekvence jednolančane varijabilne regije sadrže jedan polipeptid koji ima jedno ili

1

više mesta za vezivanje antigena, npr., VL domen povezan sa fleksibilnim veznikom na VH domen. ScFv molekuli se mogu konstruisati u VH-veznik-VL orijentaciji ili VL-veznik-VH orijentaciju. Fleksibilni zglob koja povezuje VL i VH domene koja čine mesto vezivanja antigena, poželjno sadrži od oko 10 do oko 50 aminokiselinskih ostataka. Povezujući peptide su poznati u struci. Antitelo prema pronalasku može sadržati najmanje jedan scFv i/ili najmanje jednu konstantnu regiju. U jednom aspektu, antitelo predmetnog obelodanjenja može sadržati najmanje jedan scFv povezan ili spojen sa antitelom ili fragmentom koji sadrži domen CH1 (npr. domen CH1 koji sadrži asparaginski ostatak na Kabat položaju 114 i/ili CH2 domen (npr. domen CH2 koji sadrži asparaginski ostatak na EU položaju 298 i ostatak serina ili treonina na EU položaju 300).

[0054] U određenim primernim otelotvorenjima, antitelo predmetnog obelodanjenja je multivalentno (npr., tetravalentno) antitelo koje se proizvodi pomoću fuzionisanja DNK sekvence koja kodira antitelo sa molekulom ScFv (npr., izmenjen ScFv molekul). Na primer, u jednom otelotvorenju ove sekvence su kombinovane tako da je molekul ScFv (npr. izmenjen ScFv molekul) povezan na svom N-terminusu ili C-terminusu na Fc fragment antitela putem fleksibilnog veznika (npr. gly/ser veznik). U još jednom otelotvorenju, tetravalentno antitelo predmetnog obelodanjenja može se napraviti spajanjem ScFv molekula na vezujući peptid koji je spojen sa CH1 domenom (npr. domen CH1 koji sadrži asparaginski ostatak na Kabat položaju 114) za konstrukciju ScFv-Fab tetravalentnog molekula.

[0055] U još jednom otelotvorenju, antitelo predmetnog obelodanjenja je izmenjeno minitelo. Izmenjena minitela predmetnog obelodanjenja su dimerni molekuli sastavljene od dva polipeptidna lanca, od kojih svaki sadrži ScFv molekul (npr., izmenjen ScFv molekul koji sadrži izmenjen VH domen opisan supra) koji je spojen sa CH3 domenom ili njegovim delom putem povezujućeg peptida. Minitela se mogu napraviti konstrukcijom ScFv komponente i povezivanjem peptid-CH3 komponente koristeći postupke opisane u struci (pogledati, npr. US patent 5,837,821 ili WO 94/09817A1). U još jednom otelotvorenju, može se napraviti tetravalentno minitelo. Tetravalentna minitela se mogu konstruisati na isti način kao i minitela, izuzev što su dva ScFv molekula povezana pomoću fleksibilnog veznika. Vezani scFv-scFv konstrukt se zatim pridružuje CH3 domenu.

[0056] U još jednom otelotvorenju, antitelo predmetnog obelodanjenja sadrži dijatelo.

Dijatela su dimerni, tetravalentni molekuli od kojih svaki ima polipeptid sličan scFv

1

molekulima, ali obično ima kratke (manje od 10 i poželjno 1-5) veznike aminokiselinskih ostataka koji povezuju oba varijabilna domena, tako da domeni VL i VH na istom polipeptidnom lancu ne mogu da interaguju. Umesto toga, VL i VH domen jednog polipeptidnog lanca interakuje sa VH i VL domenom (respektivno) na drugom polipeptidnom lancu (pogledati, na primer, WO 02/02781). Dijatela predmetnog obelodanjenja sadrže scFv molekul spojen sa CH3 domenom.

[0057] U drugim otelotvorenjima, antitela prema pronalasku obuhvataju multispecifična ili multivalentna antitela koja sadrže jedan ili više varijabilnih domena u seriji na istom polipeptidnom lancu, npr. tandem varijabilni domen (TVD) polipeptidi. Primeri TVD polipeptida uključuju konfiguraciju „dvostruke glave“ ili „Dual-Fv“ opisanu u U.S. Patent No. 5,989,830. U Dual-Fv konfiguraciji, varijabilni domeni dva različita antitela eksprimirani su u tandemskoj orijentaciji na dva odvojena lanca (jedan teški lanac i jedan laki lanac), pri čemu jedan polipeptidni lanac ima dva puta VH u seriji, odvojene peptidnim veznikom (VH1-veznik-VH2) i drugi polipeptidni lanac sastoji se od komplementarnih VL domena povezanih u seriji pomoću peptidnog veznika (VL1-veznik-VL2). U unakrsnoj konfiguraciji dvostruke glave, varijabilni domeni dva različita antitela eksprimirani su u tandemskoj orijentaciji na dva odvojena polipeptidna lanca (jedan teški lanac i jedan lak lanac), pri čemu jedan polipeptidni lanac ima dva VH u seriji, odvojena peptidnim veznikom (VH1-veznik-VH2) i drugi polipeptidni lanac se sastoji od komplementarnih VL domena povezanih u nizu pomoću peptidnog veznika u suprotnoj orijentaciji (VL2-veznik-VL1). Dodatne varijante antitela zasnovane na formatu „Dual-Fv“ uključuju bispecifično antitelo sa dvostrukim varijabilnim domenom (DVD-IgG) (pogledati U.S. Patent No.7,612,181 i TBTI format (pogledati US 2010/0226923 A1). Dodavanje konstantnih domena u odgovarajuće lance Dual-Fv (CH1-Fc u teški lanac i kapa ili lambda konstantnog domena u laki lanac) dovodi do funkcionalnih bispecifičnih antitela bez potrebe za dodatnim modifikacijama (tj. očigledno dodavanje konstantnog domeni za poboljšanje stabilnosti).

[0058] U još jednom primernom otelotvorenju, antitelo sadrži dvostruko bispecifično antitelo IgG (CODV-IgG) varijabilnog domena zasnovano na konfiguraciji „dvostruke glave“ (pogledati US20120251541 A1. Varijante CODV-IgG antitela imaju jedan polipeptidni lanac sa VL domenima koji su serijski povezani sa CL domenom (VL1-L1-VL2-L2-CL) i drugi polipeptidni lanac sa komplementarnim VH domenima spojenim u nizu u suprotnoj orijentaciji u odnosu na CH1 domen (VH2-L3-VH1-L4-CH1), gde polipeptidni lanci

1

formiraju unakrsni par teškog lanca i lakog lanca. U određenom otelotvorenju, drugi polipeptid može biti dalje povezan sa Fc domenom (VH2-L3-VH1-L4-CH1-Fc). U određenim otelotvorenjima, veznik L3 ima najmanje dvostruku dužine veznika L1 i/ili veznik L4 ima najmanje dvostruku dužinu veznika L2. Na primer, L1 i L2 mogu biti dugački 1-3 aminokiselinska ostatka, L3 može biti dugačak od 2 do 6 aminokiselinskih ostataka, a L4 može biti dugačak 4 do 7 aminokiselinskih ostataka. Primeri pogodnih veznika uključuju jedinstveni ostatak glicina (Gly); diglikinski peptid (Gly-Gly); tripeptid (Gly-Gly-Gly); peptid sa četiri ostatka glicina (Gly-Gly-Gly-Gly); peptid sa pet ostataka glicina (Gly-Gly-Gly-Gly-Gly); peptid sa šestih ostataka glicina (Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly); peptid sa sedam ostataka glicina(Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly); peptid sa osam ostataka glicina (Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly). Druge kombinacije aminokiselinskih ostataka mogu se koristiti kao što su peptid Gly-Gly-Gly-Gly-Ser i peptid Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser.

III. N-vezani glikani

[0059] Fc domen antitela koji je ovde prikazan, je glikoziliran na projektovanom asparaginu na položaju 298 (N298), prema EU numeraciji. N-vezani glikan je uglavnom vezan kroz βglikozilamidnu veza sa azotnom grupom N298 bočnog lanca. Međutim, mogu se koristiti i druge pogodne veze poznate u struci.

[0060] Bilo koji tip prirodnog ili sintetičkog (tj. ne-prirodnog) N-povezanog glikana može se povezati sa N114. Na primer, glikan može biti izvorni glikan ili izajnirani glikan koji sadrži ne-prirodne veze. U određenim otelotvorenjima, glikan sadrži saharid koji se može oksidovati (npr., pomoću tretmana perjodatom) kako bi se dobila grupa koja je pogodna za konjugaciju u efektorski deo (npr., reaktivna aldehidna grupa). Pogodni uključeni oksidabilni saharidi su, bez ograničenja, galaktoza i sijalinska kiselina (npr., N-acetilneuraminska kiselina). U određenim otelotvorenjima, glikan je biantenarni glikan. U određenim otelotvorenjima, glikan je prirodni glikozom sisara.

[0061] Glikozilacija se može postići na bilo koji način poznat u struci. U određenim otelotvorenjima, glikozilacija se postiže eksprimiranjem antitela u ćelijama sposobnim za N-vezanu glikozilaciju. Može se koristiti bilo koja prirodna ili dizajnirana ćelija (npr., prokariotska ili eukariotska). Uopšteno govoreći, ćelije sisara primenjuju se na glikozilaciju. N-glikani koji se proizvode u sisarskim ćelijama obično se nazivaju kompleksnim N-glikanima (pogledati npr. Drickamer K, Taylor ME (2006). Introduction to Glycobiology,

1

2nd ed.). Ovi kompleksni N-glikani imaju strukturu sa tipično dve do šest spoljnih grana sa sijalizaktozaminskom sekvencom vezanom za unutrašnju strukturu jezgra Man3GlcNAc2. Kompleksni N-glikan ima najmanje jednu granu, i poželjno najmanje dva, naizmenična ostatka GlcNAc i galaktoze (Gal) koji se završavaju sa oligosaharidima kao što je, na primer: NeuNAc-; NeuAc α2,6 GalNAc α1-; NeuAc α2,3 Gal β1,3 GalNAc α1-; i NeuAc α2,3/6 Gal β1,4 GlcNAc β 1; Osim toga, mogu se pojaviti estri sulfata na galaktoznim, GalNAc i GlcNAc ostacima, i estri fosfata mogu nastati na ostacima manoze. NeuAc može biti O-acetilovan ili zamenjen pomoću NeuGl (N-glikolilneuraminske kiseline). Kompleksni N-glikani mogu takođe imati unutarlančane zamene bisektirajućeg GlcNAc i jezgra fukoze (Fuc).

[0062] Dodatno ili alternativno, glikozilacija se može postići ili modifikovati putem enzimskih agenasa, in vitro. Na primer, jedna ili više glikoziltransferaza mogu se koristiti za dodavanje specifičnih saharidnih ostataka u N298, a jedna ili više glikozidaza se mogu koristiti za uklanjanje neželjenih saharida iz N-povezanog glikana. Takva enzimska sredstva su dobro poznata u struci (pogledati, npr., WO/2007/005786).

IV. Funkcije imunoloških efektora i Fc modifikacije

[0063] U određenim otelotvorenjima, antitela prema pronalasku mogu da sadrže konstantnu regiju antitela (npr. konstantnu regiju ljudskog IgG, npr., konstantnu regiju ljudskog IgG1 ili IgG4) koja posreduje jednu ili više efektorskih funkcija. Na primer, vezivanje C1 komponente komplementa na konstantnu regiju antitela može aktivirati sistem komplementa. Aktivacija komplementa je važna u opsonizaciji i lizi ćelijskih patogena. Aktivacija komplementa takođe stimuliše upalni odgovor i takođe može biti uključena u autoimunu preosetljivost. Dalje, antitela se vezuju za receptore na različitim ćelijama preko Fc regije, sa Fc receptorskim vezujućim mestom na Fc regiji antitela koja se vezuje za Fc receptor (FcR) na ćeliji. Postoji nekoliko Fc receptora koji su specifični za različite klase antitela, uključujući IgG (gama receptore), IgE (epsilon receptore), IgA (alfa receptore) i IgM (mu receptore). Vezivanje antitela na Fc receptore na ćelijskim površinama pokreće niz važnih i raznovrsnih bioloških odgovora uključujući hvatanje i uništavanje čestica obloženih antitelima, čišćenje imunskih kompleksa, lizu ciljanih ćelija obloženih antitelima od strane ćelija ubica (što se zavisi ćelijski posredovana citotoksičnost zavisna od antitela, ili ADCC), oslobađanje upalnih medijatora, placentni transfer i kontrola proizvodnje imunoglobulina. U poželjnim otelotvorenjima, antitela prema pronalasku se vezuju za Fc-gama receptor. U

2

alternativnim otelotvorenjima, antitela prema pronalasku mogu da sadrže konstantnu regiju koja je lišena jedne ili više efektorskih funkcija (npr. ADCC aktivnost) i/ili nije u stanju da veže Fcγ receptor.

[0064] Određena otelotvorenja pronalaska uključuju antitela u kojima je najmanje jedna aminokiselina u jednom ili više domena konstantne regije izbrisana ili na drugi način izmenjena, kako bi se obezbedile željene biohemijske karakteristike, kao što su smanjenje ili poboljšane efektorske funkcije, sposobnost da se ne-kovalentno dimerizuje, povećanje sposobnosti lokalizacije na mestu tumora, smanjenje poluživota u serumu ili povećanje poluživota u serumu u poređenju sa celim, neizmenjenim antitelom približno iste imunogenosti. Na primer, određena antitela za upotrebu u dijagnostičkim i terapeutskskim koji su ovde opisani su antitela koja sadrže polipeptidni lanac sličan teškom lancu imunoglobulina, ali kom nedostaje barem deo jednog ili više domena teškog lanca. Na primer, u određenim antitelima, jedan ceo domen konstantne regije modifikovanog antitela biće izbrisan, na primer, ceo ili deo CH2 domene će biti izbrisani.

[0065] U nekim drugim otelotvorenjima, antitela sadrže konstantne regije izvedene iz različitih izotipa antitela (npr., konstantne regije od dva ili više ljudskih IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4). U drugim otelotvorenjima, antitela sadrže himerni zglob (tj. zglob koji sadrži delove zgloba izvedene iz zglobnih domena različitih izotipa antitela, npr., gornji zglobni domen od molekula IgG4 i srednji zglobni domen IgG1). U jednom otelotvorenju, antitela sadrže Fc regiju ili njen deo od ljudskog IgG4 molekula i Ser228Pro mutacije (EU numeracije) u jezgru regije zgloba u molekulu.

[0066] U određenim otelotvorenjima, deo Fc može biti mutiran kako bi povećao ili smanjio efektorsku funkciju koristeći tehnike poznate u struci. Na primer, brisanje ili inaktivacija (preko tačaka mutacija ili drugih agenasa) domena konstantne regije može smanjiti vezivanje Fc receptora na cirkulišuće modifikovano antitelo, čime se povećava lokalizacija tumora. U drugim slučajevima može biti da su modifikacije konstantne regija u skladu sa predmetnim pronalaskom umerenog vezivanja komplementa i time smanjuju poluživot u serumu i nespecifičnu asocijaciju konjugovanog citotoksina. Ipak, druge modifikacije konstantne regije mogu se koristiti za modifikaciju disulfidnih veza ili oligosaharidnih ostataka koji omogućavaju poboljšanu lokalizaciju zbog povećane specifičnosti antigena ili fleksibilnosti. Dobijeni fiziološki profil, bioraspoloživost i drugi biohemijski efekti modifikacija, kao što je lokalizacija tumora, biodistribucija i poluživot u serumu, lako se mogu meriti i kvantifikovati koristeći dobro poznate imunološke tehnike bez nepotrebnog eksperimentisanja.

[0067] U određenim otelotvorenjima, Fc domen koji se koristi u antitelu pronalaska je Fc varijanta. Kad se ovde koristi, izraz „varijanta Fc“ se odnosi na Fc domen koji ima najmanje jednu supstituciju aminokiselina u odnosu na Fc domen divljeg tipa iz kog je izveden navedeni Fc domen. Na primer, gde je Fc domen izveden iz ljudskog IgG1 antitela, Fc varijanta navedenog ljudskog IgG1 Fc domena sadrži najmanje jednu supstituciju aminokiselina u odnosu na navedeni Fc domen.

[0068] Supstitucija aminokiselina Fc varijante može biti locirana na bilo kom položaju (tj. bilo kojoj položaju aminokiselina EU konvencije) unutar Fc domena. U jednom otelotvorenju, varijanta Fc sadrži supstituciju na položaju aminokiselina koja se nalazi u domenu zgloba ili njenom delu. U drugom otelotvorenju, Fc varijanta sadrži supstituciju na položaju aminokiselina koja se nalazi u domenu CH2 ili njenom delu. U drugom otelotvorenju, Fc varijanta sadrži supstituciju na položaju aminokiselina koja se nalazi u CH3 domeni ili njenom delu. U drugom otelotvorenju, Fc varijanta sadrži supstituciju na položaju aminokiselina koja se nalazi u CH4 domenu ili njegovom delu.

[0069] Antitela iz ovog pronalaska mogu primeniti bilo koju Fc varijantu poznatu u struci za koju se zna da daje unapređenje (npr. smanjenje ili poboljšanje) u efektoru i/ili FcR vezivanju. Ove Fc varijante mogu uključivati, na primer, bilo koju od aminokiselinskih supstanci obelodanjenih u međunarodnim PCT objavama WO88/07089A1, WO96/14339A1, WO98/05787A1, WO98/23289A1, WO99/51642A1, WO99/58572A1, WO00/09560A2, WO00/32767A1, WO00/42072A2, WO02/44215A2, WO02/060919A2, WO03/074569A2, WO04/016750A2, WO04/029207A2, WO04/035752A2, WO04/063351A2, WO04/074455A2, WO04/099249A2, WO05/040217A2, WO05/070963A1, WO05/077981A2, WO05/092925A2, WO05/123780A2, WO06/019447A1, WO06/047350A2, i WO06/085967A2 ili U.S. Pat. Nos.5,648,260; 5,739,277; 5,834,250; 5,869,046; 6,096,871; 6,121,022; 6,194,551; 6,242,195; 6,277,375; 6,528,624; 6,538,124; 6,737,056; 6,821,505; 6,998,253; i 7,083,784. U jednom primernom otelotvorenju, antitelo prema pronalasku može sadržati Fc varijantu koja sadrži supstituciju aminokiselina na EU položaju 268 (npr., H268D ili H268E). U još jednom primernom otelotvorenju, vezujući polipeptid prema pronalasku može obuhvatiti supstituciju aminokiselina na EU položaju 239 (npr., S239D ili S239E) i/ili EU položaju 332 (npr., I332D ili I332Q).

[0070] U određenim otelotvorenjima, antitelo prema pronalasku može sadržati Fc varijantu koja sadrži aminokiselinsku supstituciju koja menja antigen-nezavisne efektorske funkcije antitela, posebno poluživot antitela u cirkulaciji. Takva antitela pokazuju ili povećanje ili smanjenje vezivanja za FcRn u poređenju sa antitelima koja nemaju ove supstitucije, stoga imaju povećan ili smanjen poluživot u serumu, respektivno. Fc varijante sa poboljšanim afinitetom za FcRn su predviđene da imaju duži poluživot u serumu i takvi molekuli imaju korisne primene u postupcima lečenja sisara u kojima je poželjan dug poluživot primene antitela, npr., za lečenje hroničnog oboljenja ili poremećaja. Nasuprot tome, očekuje se da Fc varijante sa smanjenim FcRn vezivnim afinitetom imaju kraći poluživot, i takvi molekuli su takođe korisni, na primer, za davanje sisaru kod koga skraćeno vreme u cirkulaciji može biti povoljno, npr. za in vivo dijagnostičko snimanje ili u situacijama kada početno antitelo ima toksične neželjene efekte kada su prisutni u cirkulaciji duže vreme. Fc varijante sa smanjenim afinitetom vezivanja FcRn takođe su manje verovatne da prelaze placentu i stoga su korisne i kod lečenju bolesti ili poremećaja kod trudnica. Pored toga, druge primene u kojima se može tražiti smanjen afinitet vezivanja FcRn uključuju one primene u kojima je poželjno mesto mozak, bubreg i/ili jetra. U jednom primernom otelotvorenju, izmenjena vezujuća antitela iz ovog pronalaska pokazuju smanjeni transport preko epitela bubrežnih glomerula iz vaskulature. U drugom otelotvorenju, izmenjena antitela ili njihovi antigen vezujući fragmenti pronalaska pokazuju smanjen transport preko krvno moždane barijere (BBB) iz mozga u vaskularni prostor. U jednom otelotvorenju, antitelo sa izmenjenim vezivanjem FcRn sadrži Fc domen koji ima jednu ili više supstitucija aminokiselina unutar „FcRn vezujuće petlje“ Fc domena. FcRn vezujuća petlja se sastoji od aminokiselinskih ostataka 280-299 (prema EU numeraciji). Primerne aminokiselinske supstitucije koje su promenile aktivnost vezivanja FcRn su otkrivene u Međunarodnoj PCT objavi No. WO05/047327. U određenim primernim otelotvorenjima, antitela ili njihovi antigen vezujući fragmenti ovog pronalaska sadrže Fc domen koji ima jednu ili više od sledećih supstitucija: V284E, H285E, N286D, K290E i S304D (EU numeracija). U još nekim primernim otelotvorenjima, vezujući molekuli pronalaska čine ljudski Fc domen sa dvostrukom mutacijom H433K/N434F (pogledati, npr., US Patent No.8,163,881).

2

[0071] U drugim otelotvorenjima, antitela za upotrebu u postupcima dijagnostike i tretmana koji su ovde opisani, imaju konstantnu regiju, npr. konstantnu regiju teškog lanca IgG1 ili IgG4, koja se menja da smanji ili eliminiše glikozilaciju. Na primer, antitela iz ovog pronalaska mogu takođe sadržati Fc varijantu koja sadrži aminokiselinsku supstituciju koja menja glikozilaciju antitela Fc. Na primer, pomenuta Fc varijanta može imati smanjenu glikozilaciju (npr., N - ili O- vezanu glikozilaciju). U primernim otelotvorenjima, Fc varijanta sadrži smanjenu glikozilaciju N-povezanog glikana koji se normalno nalazi na položaju aminokiselina 297 (EU numeracija). U još jednom otelotvorenju, antitelo ima supstituciju aminokiselina u blizini ili u okviru glikozilacionog motiva, na primer, N-vezanog glikozilacionog motiva koji sadrži aminokiselinsku sekvencu NXT ili NXS. U određenom otelotvorenju, antitelo sadrži Fc varijantu sa aminokiselinskom supstitucijom na položaju aminokiselina 228 ili 299 (EU numeracija). U specifičnim otelotvorenjima, antitelo sadrži konstantnu regiju IgG1 ili IgG4 koji sadrži S228P i T299A mutaciju (EU numeracija).

VIII. Efektorski delovi

[0072] U određenim otelotvorenjima, antitela predmetnog obelodanjenja sadrže efektorske delove. Uopšteno gledano, ovi efektorski delovi su konjugovani (bilo direktno ili preko veznik dela) na N-vezani glikan na antitelu (npr. N-vezani glikan povezan sa N298 (EU numeracija) CH2 domena i/ili N114 (Kabat numeracija) CH1 domena). U određenim otelotvorenjima, antitelo je antitelo pune dužine koje sadrži dva CH1 domena sa glikanom na Kabat položaju 114, pri čemu su oba glikana konjugovana sa jednim ili više efektorskih delova.

[0073] Bilo koji efektorski deo može se dodati antitelima koja se ovde otkrivaju. Delovi efektora poželjno dodaju veštačku (neprirodnu) funkciju izmenjenom antitelu ili njegovim fragmentima, bez značajnog promena unutrašnje aktivnosti antitela. Efektorski deo može biti, na primer, ali bez ograničenja na, terapijski ili dijagnostički agens. Modifikovano antitelo predmetnog obelodanjenja može sadržati jedan ili više efektorskih delova, koji mogu biti isti ili različiti.

[0074] U jednom otelotvorenju, efektorski deo može imati Formulu (I):

H2N-Q-CON-X Formula (I),

gde:

A) Q je NH ili O; i

B) CON je priključni deo; i

C) X je terapeutski agens kako je opisano ovde.

[0075] Priključni deo povezuje terapeutski agens sa H2N-Q-. Priključni deo može uključivati najmanje jednu od pogodnih komponenti poznatih stručnjaku u oblasti, uključujući, na primer, alkilenil komponentu, polietilen glikol komponentu, poli(glicin) komponentu, poli(oksazolin) komponentu, karbonil komponentu, komponentu izvedenu iz cisteinamida, komponentu izvedenu iz valina u kombinaciji sa citrulinom, i komponentu izvedenu iz 4-aminobenzil karbamata, ili bilo koju njihovu kombinaciju.

[0076] U drugom otelotvorenju, efektorski deo Formule (I) može imati Formulu (Ia):

H2N-Q-CH2-C(O)-Z-X Formula (Ia),

gde:

A) Q je NH ili O; i

B) Z je -Cys-(MC)a-(VC)b-(PABC)c-(C16H32O8C2H4)f,

gde

i. Cys je komponenta izvedena iz cisteinamida;

ii. MC je komponenta izvedena iz maleimida;

iii. VC je komponenta izvedena iz valina spojenog sa citrulinom;

iv. PABC je komponenta izvedena iz 4-aminobenzil karbamata;

v. X je terapeutski agens kako je opisano ovde;

vi. je 0 ili 1;

vii. b je 0 ili 1;

viii.c je 0 ili 1; i

ix. f je 0 ili 1

[0077] „Komponenta izvedena iz cisteinamida“ je mesto vezivanja za H2N-Q-CH2-C(O)-. U jednom otelotvorenju, „komponenta izvedena iz cisteinamida“ može da se odnosi na jedan ili više segmenata efektorskog dela, koji ima strukturu:

2

[0078] U jednom otelotvorenju, „Cys“ komponenta efektorskog dela može da uključi jedan takav segment. Na primer, naredna struktura pokazuje efektorski deo sa jednim takvim segmentom (gde je „Cys“ komponenta naznačena kvadratom sa isprekidanom linijom):

[0079] U drugom otelotvorenju, „Cys“ komponenta efektorskog dela može da uključi dva ili više takva segmenta. Na primer, naredni deo sadrži dva takva segmenta:

Kao što može da se vidi iz strukture, svaka „Cys“ komponenta nosi -(MC)a-(VC)b-(PABC)c-(C16H32O8C2H4)f-X grupu.

[0080] U jednom otelotvorenju, izraz „komponenta izvedena iz maleimida“ može da se odnosi na bilo koji segment efektorskog dela, koji ima strukturu:

gde d je ceo broj od 2 do 5. Broj MC komponenti uključen u bilo koju Cys-(MC)a-(VC)b-(PABC)c-(C16H32O8C2H4)f-X grupu u efektorskom delu je naznačen sabskriptom „a,“ i može biti 0 ili 1 U jednom otelotvorenju, a je 1. U drugom otelotvorenju, b je 0.

2

[0081] U jednom otelotvorenju, „Cys“ komponenta može biti povezana sa „MC“ komponentom preko atoma sumpora u „Cys“ komponenti, kako je naznačeno kvadratom sa isprekidanom linijom u strukturi u nastavku:

[0082] U jednom otelotvorenju, izraz „komponenta izvedena iz valina spojenog sa citrulinom“ može da se odnosi na bilo koji segment efektorskog dela sa narednom strukturom:

[0083] Broj VC komponenti uključen u bilo koju Cys-(MC)a-(VC)b-(PABC)c-(C16H32O8C2H4)f-X grupu u efektorskom delu je naznačen sabskriptom „b,“ i može biti 0 ili 1. U jednom otelotvorenju, b je 1. U drugom otelotvorenju, b je 0.

[0084] U jednom otelotvorenju, izraz „komponenta izvedena iz 4-aminobenzil karbamata“ može da se odnosi na bilo koji segment efektorskog dela sa narednom strukturom:

[0085] BrojPABC komponenti uključen u bilo koju Cys-(MC)a-(VC)b-(PABC)c-(C16H32O8C2H4)f-X grupu u efektorskom delu je naznačen sabskriptom „c,“ i može biti 0 ili 1. U jednom otelotvorenju, c je 1. U drugom otelotvorenju, c je 0.

[0086] U jednom otelotvorenju, „C16H32O8C2H4“ se odnosi na narednu strukturu:

2

[0087] Broj C16H32O8jedinica uključen u bilo koju Cys-(MC)a-(VC)b-(PABC)c-(C16H32O8C2H4)f-X grupu u efektorskom delu je naznačen sabskriptom „f,“ U jednom otelotvorenju, f je 1. U drugom otelotvorenju, f je 0.

[0088] U jednom otelotvorenju, je a 1, b je 1, c je 1, i f je 0.

a) Terapeutski efektorski delovi

[0089] U određenim otelotvorenjima, antitela predmetnog obelodanjenja su konjugovana sa efektorskim delom koji sadrži terapeutski agens, npr. deo leka (ili njegov prolek) ili radioaktivno označeno jedinjenje. U jednom otelotvorenju terapeutski agens je citotoksin. Primeri citotoksičnih efektora su prikazani u Tabeli 1.

Tabela 1. Primerni citotoksični efektorski delovi

2

[0090] Sledeći primerni delovi leka uključuju anti-upalne, antikancerogene, antiinfektivne (npr., anti-gljivične, antibakterijske, anti-parazitske, anti-virusne, itd.) i anestetičke terapeutske agense. U daljem otelotvorenju, deo leka je antikancerogeni agens . Primeri antikancerogenih agenasa uključuju, ali bez ograničenja na, citostatike, inhibitore enzima, regulator gena, citotoksični nukleozidi, agense za vezivanje tubulina ili inhibitore tubulina, inhibitore proteazoma, hormone i antagoniste hormona, agense protiv angiogeneze i slično. Primeri citostatičkih antikancerogeniogenih agensa uključuju agense za alkilaciju kao što su antraciklinska porodica lekova (na primer, adriamicin, karminomicin, ciklosporin-A,

2

hlorokin, metopterin, mithramicin, porfiromicin, streptonigrin, porfiromicin, antrakenedion i aziridin). Ostali citostatički antikancerogeni agensi uključuju inhibitore DNK sinteze (npr. metotreksat i dihlorometotreksat, 3-amino-1,2,4-benzotriazin 1,4-dioksid, aminopterin, citozin β-D-arabinofuranozid, 5-fluoro-5'-bromomicin, karboplatin, karmustin, hlorambucil, ciklofosfamid, cis-diamineplatinum(II)dihlorid (cisplatin), melfalan, mitokantron i oksaliplatin) i regulatore DNK-RNK transkripcije (npr. aktinomicin D, daunorubicin, doksorubicin, homoharingtonin i idarubicin). Drugi primerni citostatički agensi koji su kompatibilni sa predmetnim obelodanjenjem obuhvataju ansamicin benzokinone, kinonoidne derivate (npr. kinolone, genistein, baktaciklin), busulfan, ifosfamid, mehloretamin, triazikuon, diazikuon, carbazilkuinon, indolokuinon EO9, diaziridinil-benzokuinon metil DZQ, trietilenfosforamid i jedinjenja nitrozuree (npr. karmustin, lomustin, semustin).

[0091] Primeri citotoksičnih nukleozidnih antikancerogenih agenasa obuhvataju, na primer, adenozin arabinozid, citarabin, citozin arabinozid, 5-fluorouracil, fludarabin, floksuridin, ftorafur i 6-merkaptopurin. Primerni antikancerogenih agenasa za vezivanje tubulina uključuju taksoide (npr. paklitaksel, docetaksel, taksan), nokodazol, rizoksin, dolastatin (npr. Dolastatin-10, -11 ili -15), kolhicin i kolhicinoide (npr. ZD6126), komretretatine (npr.

Kombretastatin A -4, AVE-6032) i vinka alkaloide (npr. vinblastin, vinkristin, vindezin i vinorelbin (navelbin)). Primeri antikancerogenih hormona i hormonskih antagonista uključuju kortikosteroide (npr. prednizon), progestine (npr. hidroksiprogesteron ili medroprogesteron), estrogene (npr. dietilstilbestrol), antiestrogene (npr. tamoksifen), androgene (npr. testosteron), inhibitore aromataze (npr. aminoglutetimid) 17-(alilamino)-17-demetoksigeldanamicin, 4-amino-1,8-naftalimid, apigenin, brefeldin A, cimetidin, dihlorometilen-difosfonska kiselina, leuprolid (leuprorelin), luteinizujući hormonoslobađajući hormon, pifitrin-a, rapamicin, globulin koji vezuje polni hormon i tapsigargin. Primeri antikancerogenih, antiangiogeneznih jedinjenja uključivali su Angiostatin KI-3, DL-a-difluorometil-omitin, endostatin, fumagilin, genistein, minociklin, staurosporin i (±)-talidomid.

[0092] Primerni inhibitora antikancerogenog enzima uključuju, ali bez ograničenja na, S(+)-kamptotecin, curcumin, (-)-deguelin, 5,6-diCH1orobenz-imidazol 1-β-D-ribofuranozid, etopozid, formestan, fostriecin, hispidin, 2-imino-1-imidazolidinsirćetna kiselina (ciklokreatin), mevinolin, trihostatin A, tirfostin AG 34 i tirfostin AG 879.

[0093] Primerni antikancerogeni regulatori gena uključuju 5-aza-2'-deoksicitidin, 5-azacitidin, holekalciferol (vitamin D3), 4-hidroksitamoksifen, melatonin, mifepriston, raloksifen, trans-retinal (vitamin A aldehidi), retinoinska kiselina, vitamin A kiselina, 9-cisretinoinska kiselina, 13-cis-retinoinska kiselina, retinol (vitamin A), tamoksifen i troglitazon.

[0094] Ostale poželjne klase antikancerogenih agenasa uključuju, na primer, pteridinsku porodicu lekova, dininene i podofilotoksine. Posebno korisni članovi ovih klasa uključuju, na primer, metopterin, podofilotoksin ili derivate podofilotoksina kao što su etopozid ili etopozid fosfat, leurosidin, vindezin, leurozin i slično.

[0095] Neki drugi antikancerogeni agensi koji su kompatibilni sa ovim predavanjem uključuju auristatine (npr. Auristatin E i monometilauristan E), geldanamicin, caliheamicin, gramicidin D, maitansanoide (npr. maitanzin), neokarzinostatin, topotekan, taksane, citokalasin B, etidijum bromid, emetin , tenopozid, kolhicin, dihidroksi antracindion, mitoksantron, prokain, tetrakain, lidokain, propranolol, puromicin i njihove analoge ili homologe.

[0096] Još neki drugi antikancerogeni agensi koji su kompatibilni sa ovim predavanjem uključuju derivate tomamicina, derivate maitansina, derivate kriptoficina, derivate antraciklina, derivate bisfosfonata, derivate leptomicina, derivate streptigrina, derivate auristatina i derivate duokarmicina.

[0097] Druga klasa kompatibilnih antikancerogenih agenasa koji se mogu koristiti kao delovi leka su radiosenzibilišući lekovi koji mogu biti efikasno usmereni na tumorske ili imunoreaktivne ćelije. Takvi lekovi povećavaju osetljivost na jonizujuće zračenje, čime povećavaju efikasnost radioterapije. Ne ograničavajući se teorijom, ali antitelo modifikovano sa radiosenzibilišućim delom leka i internalizovano od strane tumorske ćelije, isporučilo bi radiosenzibilator bliže jezgru gde bi radiosenzibilizacija bila maksimalna. Antitela koja gube deo radiosenzibilator biće brzo izbačena iz krvi, lokalizujući preostali radiosenzibilišući agens u ciljanom tumoru i pružajući minimalni uzorak u normalnim tkivima. Posle uklanjanja krvi, dodatna radioterapija može se primeniti spoljašnjim snopom direktno usmerenim na tumor, radioaktivnost koja se direktno implantira u tumor ili sistemska radioimunoterapija sa istim modifikovanim antitelima.

1

[0098] U jednom aspektu terapeutski agens obuhvata radionuklide ili radiooznake sa visokoenergetskim jonizujućim zračenjem sposobne da izazovu višestruke pukotine u nuklearnoj DNK, što dovodi do smrti ćelije. Izuzetno visoki energetski radionuklidi uključuju: 90Y, 125I, 131I, 123I, 111In, 105Rh, 153Sm, 67Cu, 67Ga, 166Ho, 177Lu, 186Re i 188Re. Ovi izotopi obično proizvode visokoenergetske α ili β-čestice koje imaju kratku dužina puta. Takvi radionuklidi ubijaju ćelije koje su u neposrednoj blizini, na primer neoplastične ćelije kojima se konjugat priključio ili je ušao. Imaju malo ili nimalo efekta na ne-lokalizovane ćelije i u suštini nisu imunogeni. Alternativno, visoko tehnološki izotopi mogu se generisati toplotnim zračenjem inače stabilnog izotopa, na primer kao u terapiji hvatanja bora-neutrona (Guan i dr., PNAS, 95: 13206-10, 1998).

[0099] U jednom aspektu, terapeutski agens je odabran od MMAE, MMAF i PEG8-Do 110.

[0100] Primerni terapeutski efektorski delovi uključuju strukture:

2

U jednom otelotvorenju, efektorski deo je izabran od:

[0101] U određenim otelotvorenjima, efektorski deo sadrži više od jednog terapeutskog agensa. Ovi višestruki terapeutski agensi mogu biti isti ili različiti.

i. Dijagnostički efektorski delovi

[0102] U određenim otelotvorenjima, antitela predmetnog obelodanjenja su konjugovani sa efektorskim delom koji sadrži dijagnostički agens. U jednom otelotvorenju, dijagnostički agens je detektabilna oznaka malih molekula, npr. biotin, fluorofor, hromofor, spin rezonantne sonde ili radiooznake. Primeri fluorofora uključuju fluorescentne boje (npr. fluorescein, rodamin i slično) i druge luminescentne molekule (npr. luminal). Fluorofor može biti osetljiv na okruženje tako da se njegova fluorescencija menja ako se nalazi blizu jednog ili više ostataka u modifikovanim antitelima, koji podleže strukturnim promenama nakon vezivanja supstrata (npr. dansil sonde). Primeri radiooznaka uključuju male molekule koji sadrže atome sa jednim ili više jezgara niske osetljivosti (13C, 15N, 2H, 125I, 124I, 123I, 99Tc, 43K, 52Fe, 64Cu, 68Ga, 111In i slično). Poželjno, radionuklid je radionuklid koji emitira gama, foton ili pozitron sa poluživotom pogodnim za omogućavanje aktivnosti ili detekcije nakon isteka vremena između primene i lokalizacije do mesta za snimanje.

[0103] U jednom otelotvorenju, dijagnostički agens je polipeptid. Primeri dijagnostičkih polipeptida obuhvataju enzime sa fluorogenim ili hromogenim aktivnostima, npr. sposobnost uklanjanja supstrata koji formira fluorofor ili hromofor kao proizvod (tj. reporter proteine kao što je luciferaza). Ostali dijagnostički proteini mogu imati intrinzičnu fluorogensku ili hromogenu aktivnost (npr. zelene, crvene i žute fluorescentne bioluminiscentne aekuorin proteine iz bioluminiscencnih morskih organizama) ili mogu sadržati protein koji sadrži jedno ili više niskoenergetskih radioaktivnih jezgara (13C, 15N, 2H, 125I, 124I, 123I, 99Tc, 43K, 52Fe, 64Cu, 68Ga, 111In i slično).

4

[0104] U pogledu upotrebe radioaktivno označenih konjugata u vezi sa predmetnim obelodanjenjem, antitela predmetnog obelodanjenja mogu biti direktno označena (kao što je preko jodinacije) ili se indirektno mogu označiti putem upotrebe helirajućeg agensa. Kad se ovde koristi, izrazi „indirektno označavanje“ i „pristup indirektnog označavanja“ znače da je helirajući agens kovalentno vezan za antitelo, i najmanje jedan radionuklid je povezan sa helirajućim agensom. Takvi helirajući agensi se tipično nazivaju bifunkcionalnim helirajućim agensima jer vezuju kako antitelo tako i radioizotop. Primeri heriajućih agenasa sadrže derivate 1-izotiocikmatobenzil-3-metildioelen triaminepentasirćetne kiseline („MX-DTPA“) i derivate cikloheksil dietilentriamin pentasirćetne kiseline („CHX-DTPA“). Ostali helatirajući agensi sadrže P-DOTA i EDTA derivate. Posebno poželjni radionuklidi za indirektno označavanje uključuju 111In i 90Y. Većina studija slikanja koristi 5 mCi 111In-označeno antitelo, jer je ova doza bezbedna i povećava efikasnost snimanja u poređenju sa nižim dozama, uz optimalno snimanje koje se javlja u tri do šest dana nakon primene antitela.

Pogledati, na primer, Murray, (1985), J. Nuc. Med.26: 3328 and Carraguillo i dr, (1985), J. Nuc. Med.26: 67. Posebno poželjan radionuklid za direktno označavanje je 131I. Stručnjaci u ovoj oblasti će razumeti da se ne-radioaktivni konjugati takođe mogu sastaviti u zavisnosti od izabranog agensa koji treba konjugovati.

[0105] U određenim otelotvorenjima, dijagnostički efektorski deo je FRET (energetski transfer fluorescentne rezonancije) sonda. FRET se koristi za razne dijagnostičke primene, uključujući dijagnostiku raka. FRET sonda može uključivati razdvojivi veznik (enzimski osetljiv ili pH veznik) koji povezuje donatorske i akceptorske delove FRET sonde, pri čemu razdvajanje rezultuje poboljšanom fluorescencijom (uključujući i infracrvenu) (pogledati, npr., A. Cobos-Correa et. al. Membrane-bound FRET probe visualizes MMP12 activity in pulmonary inflammation, Nature Chemical Biology (2009), 5(9), 628-63; S. Gehrig i dr. Spatially Resolved Monitoring of Neutrophil Elastase Activity with Ratiometric Fluorescent Reporters (2012) Angew. Chem. Int. Ed., 51, 6258 -6261).

[0106] U jednom otelotvorenju, efektorski deo je izabran od:

c. Funkcionalizovani efektorski delovi

[0107] U određenim otelotvorenjima, efektorski delovi pronalaska mogu biti funkcionalizovani da sadrže dodatne grupe, pored same efektorskog dela. Na primer, efektorski deo može sadržati razdvojive veznike koji oslobađaju efektorski deo iz antitela pod određenim uslovima. U primernim otelotvorenjima, efektorski deo može uključivati veznik koji se može razdvajati od ćelijskih enzima i/ili je osetljiv na pH. Dodatno ili alternativno, efektorski deo može sadržati disulfidnu vezu koja se odvaja intracelularnim glutationom nakon unošenja u ćeliju. Primeri disulfidnih i pH senzitivnih veznika su navedeni u nastavku:

[0108] U još nekim otelotvorenjima, efektorski deo može uključivati hidrofilne i biokompatibilne delove kao što su poli(glicin), poli (oksazolin) ili delovi PEG. Primerne strukture („Y“) su navedene u nastavku:

R = H, nesupstituisana ili funkcionalna grupa koja sadrži alkil grupe

P i Q = ista ili različita funkcionalna grupa za vezivanje lekova, reporter molekula i proteina

[0109] U određenim otelotvorenjima, efektorski deo sadrži aminooksi grupu koja olakšava konjugaciju na antitelo putem stabilne oksimske veze. Primerni efektorski delovi koji sadrže aminooksi grupe su prikazani u Tabeli 2.

Tabela 2. Primerni aminooksi funkcionalizovani veznik delovi

[0110]

Tabela 2. Primerni aminoksi efektorski delovi (gde X može biti bilo koji veznik, Y je bilo koja razmaknica, i gde su X i/ili Y opcioni)

�

[0111] U drugim otelotvorenjima, efektorski deo sadrži hidrazidnu i/ili N-alkilovanu hidrazinsku grupu kako bi olakšao konjugaciju na antitelo putem stabilne veze hidrazona. Primeri efektorskih delova koji sadrže aminooksi grupe su navedeni u Tabeli 14 ovde.

4

V. Konjugacija efektorskih delova antitela

[0112] U određenim otelotvorenjima, efektorski delovi su konjugovani (bilo direktno ili preko veznik dela) za oksidovan glikana (npr. oksidovanog N-vezan glikana) izmenjenog antitela, (npr., dizajniran glikan na N298 od Fc domena antitela ). Izraz „oksidovani glikan“ znači da je supstituent alkohola oksidovan na glikanu, dajući karbonilni supstituent.

Karbonilni supstituent može reagovati sa odgovarajućim nukleofilom azota kako bi se formirala dvostruka veza ugljenika i azota. Na primer, reakcija karbonilne grupe sa aminooksi grupom ili hidrazin grupom formira oksim ili hidrazin, respektivno. U jednom aspektu, karbonilni supstituent je aldehid. Pogodni oksidovani glikani uključuju oksidovanu galaktozu i oksidovanu sijalinsku kiselinu.

[0113] U jednom otelotvorenju, modifikovano antitelo Formule (II) može imati Formulu (II):

Ab(Gal-C(O)H)x(Gal-Sia-C(O)H)yFormula (II),

gde

A) Ab je antitelo kako je definisano ovde;

B) Gal je komponenta izvedena od galaktoze;

C) Sia je komponenta izvedena od sijalinske kiseline;

D) x je 0 do 5; i

E) y je 0 do 5,

gde barem jedan od x i y nije 0.

[0114] Bilo koja hemija poznata u struci može se koristiti za konjugovanje efektora (npr., efektorski deo koji sadrži veznik deo) na glikan (pogledati npr. Hermanson, G.T., Bioconjugate Techniques. Academic Press (1996)). U određenim otelotvorenjima, saharidni ostatak (npr., sijalinska kiselina ili ostatak galaktoze) glikana se prvo oksiduje (npr., koristeći natrijum perjodat ili tretman oksidaze galaktoze) kako bi se generisala reaktivna aldehidna grupa. Ova aldehidna grupa reaguje sa efektorskim ostacima aminooksi grupe ili hidrazinske grupe, kako bi se formirao oksim ili hidrazonski veznik, respektivno. Primerni postupci koji koriste ovu opštu reakcionu šemu prikazani su u Primerima 10 do 15.

[0115] U određenim otelotvorenjima, prirodni ili konstruisani glikani antitela prvi su prethodno tretirani enzimom glikoziltransferaze in vitro kako bi pružili ostatak terminalnog saharida koji je pogodno reaktivan. Na primer, sijalizacija se prvo može postići koristeći kombinaciju galaktoziltransferaze (Gal T) i sijaliztransferaze (Sial T). U određenim aspektima biantenarni glikani koji nemaju galatozu (G0F ili G0) ili koji sadrže samo jednu galaktozu (G1F ili G1) mogu se pretvoriti u galaktozilovane ili sijalilovane strukture višeg reda, pogodne za konjugaciju (G1F, G1, G2F, G2, G1S1F, G1S1, G2S1F, G2S1, G2S2F ili G2S2).

[0116] Primerna šema konjugacije za proizvodnju sijalizovanih glikokonjugata prikazana je na Slici 25C. Ostaci sijalinske kiseline se unose enzimski i lociraju se specifično u glikanu antitela (npr., dizajnirani glikan na N298 od Fc domena) koristeći kombinaciju galaktoziltransferaze (Gal T) i sijaliztransferaze (Sial T). Uvedeni ostaci sijalinske kiseline se naknadno oksiduju sa niskom koncentracijom natrijum perjodata, dajući reaktivne aldehide sijalinske kiseline koji su pogodno reaktivni sa lek-veznicima (npr., veznici aminoksi lekova) kako bi se proizveli antitelo lek konjugati (ADC) (npr., oksim-vezani ADC). Kontrolom broja glikana i broja sijalinskih ostataka in vitro remodelovanjem, stručnjak može imati preciznu kontrolu lek-antitelo odnosa (DAR) ADC-a. Na primer, ako se ~ 1 sijalinska kiselina dodaje na jedan biantenarni glikan (A1F) u svakom od teških lanaca, antitelo sa DAR od 2 može biti homogeno dobijen.

VI. Modifikovana antitela

[0117] U određenim otelotvorenjima, pronalazak pruža modifikovana antitela koja su proizvod konjugujućih efektorskih delova koji su konjugovani (bilo direktno ili preko veznik dela) za oksidovan glikana (npr. oksidovan N-povezan glikan) izmenjenog antitela (npr., dizajniran glikan na N298 od Fc domena antitela).

[0118] U jednom otelotvorenju, antitelo može imati Formulu (III):

Ab--(Gal-C(H)=N-Q-CON-X)x(Gal-Sia-C(H)=N-Q-CON-X)yFormula (III),

gde:

A) Ab je antitelo kako je definisano ovde;

B) Q je NH ili O;

C) CON je priključni deo kako je definisano ovde; i

D) X je terapeutski ili dijagnostički agens kako je definisano ovde;

E) Gal je komponenta izvedena od galaktoze;

F) Sia je komponenta izvedena od sijalinske kiseline;

G) x je 0 do 5; i

H) y je 0 do 5,

gde barem jedan od x i y nije 0.

[0119] U jednom otelotvorenju, antitelo može imati Formulu (III), može imati Formulu (IIIa):

Ab(Gal-C(H)=N-Q-CH2-C(O)-Z-X)x(Gal-Sia-C(H)=N-Q-CH2-C(O)-Z-X)yFormula (IIIa),

gde:

A) Ab je antitelo;

B) Q je NH ili O;

4

C) Z je Cys-(MC)a-(VC)b-(PABC)c-(C16H32O8C2H4)f-, gde

i. Cys je komponenta izvedena iz cisteinamida;

ii. MC je komponenta izvedena iz maleimida;

iii. VC je komponenta izvedena iz valina spojenog sa citrulinom;

iv. PABC je komponenta izvedena iz 4-aminobenzil karbamata;

v. X je terapeutski ili dijagnostički agens kako je definisano ovde;

vi. je 0 ili 1;

vii. b je 0 ili 1;

viii. c je 0 ili 1; i

ix. f je 0 ili 1;

D) X je terapeutski agens kako je opisano ovde;

E) Gal je komponenta izvedena od galaktoze;

F) Sia je komponenta izvedena od sijalinske kiseline;

G) x je 0 do 5; i

H) y je 0 do 5,

gde barem jedan od x i y nije 0.

[0120] Treba razumeti da Formula (III) nije namenjena da podrazumeva da su antitelo, Gal supstituent, i Gal-Sia supstituent spojeni na lančani način. Radije, kada su takvi supstituenti prisutni, antitelo je direktno povezano sa svakim supstituentom. Na primer, antitelo Formule (III) u kome x je 1 i y je 2 može da ima raspored kako je prikazano u nastavku:

[0121] CON supstituent u Formuli (III) i komponente tu su kako je opisano za Formulu (I) za efektorske delove.

[0122] U jednom otelotvorenju, Q je NH. U drugom otelotvorenju, Q je O.

[0123] U jednom otelotvorenju, x je 0.

[0124] Antitelo Ab Formule (III) može biti bilo koje ovde opisano odgovarajuće antitelo.

[0125] U jednom otelotvorenju, dat je postupak za pripremu antitela Formule (III), gde postupak obuhvata reagovanje efektorskog dela Formule (I):

NH2-Q-CON-X Formula (I),

gde:

A) Q je NH ili O;

B) CON je priključni deo; i

C) X je terapeutski ili dijagnostički agens kako je definisano ovde,

sa modifikovanim antitelom Formule (II)

Ab(OXG)rFormula (II)

gde

A) OXG je oksidovan glikan; i

B) r je izabran od 0 do 4;

[0126] U jednom otelotvorenju, dat je postupak za pripremu antitela Formule (III), gde postupak obuhvata reagovanje efektorskog dela Formule (I):

NH2-Q-CON-X Formula (I),

gde:

A) Q je NH ili O;

B) CON je priključni deo; i

C) X je terapeutski ili dijagnostički agens kako je definisano ovde,

sa modifikovanim antitelom Formule (IIa)

Ab(Gal-C(O)H)x(Gal-Sia-C(O)H)yFormula (IIa),

gde

A) Ab je antitelo kako je opisano ovde;

B) Gal je komponenta izvedena od galaktoze;

4

C) Sia je komponenta izvedena od sijalinske kiseline;

D) x je 0 do 5; i

E) y je 0 do 5,

gde barem jedan od x i y nije 0.

IX. Lečenje sa modifikovanim antitelima

[0127] U jednom aspektu, pronalazak pruža antitelo kao što je ovde navedeno u zahtevima za upotrebu u postupcima za lečenje pacijenta kome je to potrebno.

[0128] Antitela predmetnog obelodanjenja su korisna u različitim primenama. Na primer, u jednom otelotvorenju, antitela pacijenta su korisna za redukciju ili eliminaciju ćelija koje imaju epitop koji prepoznaje vezujući domen antitela. U još jednom otelotvorenju, antitela pacijenta su efikasna u smanjivanju koncentracije ili uklanjanja rastvorljivog antigena u cirkulaciji. U jednom otelotvorenju, antitela mogu smanjiti veličinu tumora, inhibirati rast tumora i/ili produžiti vreme preživljavanja životinja sa tumorom. Shodno tome, ovo obelodanjenje se odnosi na modifikovano antitelo za upotrebu u postupku lečenja tumora kod čoveka ili druge životinje davanjem takvom čoveku ili životinjama efikasne, netoksične količine modifikovanog antitela. Stručnjak u oblasti bi mogao, rutinskim eksperimentisanjem, da utvrdi koja bi efikasna, netoksična količina modifikovanog antitela bila u cilju lečenja maligniteta. Na primer, terapeutski aktivna količina modifikovanog antitela ili njegovih fragmenata može se razlikovati u zavisnosti od faktora kao što je stadijum bolesti (npr. Faza I u odnosu na IV stepen), starost, pol, medicinske komplikacije (npr. Imunosuprimirani uslovi ili bolesti) i težina pacijenta i sposobnost modifikovanog antitela da izazove željeni odgovor u pacijentu. Režim doziranja se može prilagoditi kako bi se obezbedio optimalan terapijski odgovor. Na primer, nekoliko podeljenih doza može se primenjivati dnevno, ili doza može biti proporcionalno smanjena, kao što je pokazano potrebama terapeutske situacije.

[0129] Uopšteno, sastavi koje pruža predmetno obelodanjenje mogu se koristiti za profilaktičko ili terapeutsko tretiranje bilo koje neoplazme koja sadrži antigenski marker koji dozvoljava ciljanje kancerogenih ćelija modifikovanim antitelima.

X. Postupci primene modifikovanih antitela ili njegovih fragmenata

[0130] Postupci pripreme i primene antitela predmetnog obelodanjenja pacijentu su dobro poznati ili se lako određuju od strane stručnjaka. Način primene antitela predmetnog

4

obelodanjenja može biti oralni, parenteralni, inhalacijom ili topikalni. Izraz parenteralni kad se ovde koristi uključuje intravenoznu, intraarterijalnu, intraperitonealno, intramuskularnu, potkožnu, rektalnu ili vaginalnu primenu. Uobičajeni su intravenski, intraarterijalni, potkožni i intramuskularni oblici parenteralne primene. Iako su svi ovi oblici primene jasno razmatrani kao da su u okviru predmetnog obelodanjenja, oblik za primenu bi bio rastvor za injekciju, posebno za intravensku ili intraarterijalnu injekciju ili kapi. Obično, pogodan farmaceutski sastav za injekciju može sadržati pufer (npr. acetat, fosfat ili citratni pufer), surfaktant (npr. polisorbat), opciono agens za stabilizaciju (npr. ljudski albumin) itd. Međutim, u drugim postupcima kompatibilnim sa predavanjem ovde, modifikovana antitela mogu se dostaviti direktno na mesto nepovoljne ćelijske populacije čime se povećava izloženost obolelog tkiva terapijskom agensu.

[0131] U jednom otelotvorenju, antitelo koje je primenjeno je antitelo Formule (III):

Ab(Gal-C(H)=N-Q-CON-X)x(Gal-Sia-C(H)=N-Q-CON-X)yFormula (III),

gde:

A) Ab je antitelo kako je definisano ovde;

B) Q je NH ili O;

C) CON je priključni deo kako je definisano ovde; i

D) X je terapeutski ili dijagnostički agens kako je definisano ovde;

E) Gal je komponenta izvedena od galaktoze;

F) Sia je komponenta izvedena od sijalinske kiseline;

G) x je 0 do 5; i

H) y je 0 do 5,

gde barem jedan od x i y nije 0.

[0132] Sastavi za parenteralnu primenu uključuju sterilne vodene ili ne-vodene rastvore, suspenzije i emulzije. Primeri ne-vodenih rastvarača su propilen glikol, polietilen glikol, biljna ulja kao što je maslinovo ulje i injekcijski organski estri kao što je etil oleat. Vodeni nosači uključuju vodu, alkoholne/vodene rastvore, emulzije ili suspenzije, uključujući fiziološki rastvor i pufer. U sastavima i postupcima predmetnog obelodanjenja, farmaceutski prihvatljivi nosači uključuju, ali bez ograničenja na, 0,01-0,1 M, a poželjno 0,05M fosfatni

4

pufer ili 0,8% fiziološki rastvor. Drugi uobičajeni parenteralni nosači uključuju rastvore natrijum-fosfata, Ringerovu dekstrozu, dekstrozu i natrijum-hlorid, laktatizovana Ringerova ili fiksna ulja. Intravenski nosači uključuju dopunjavače tečnosti i hranljivih materija, dopunjavače elektrolita, poput onih zasnovanih na Ringerovoj dekstrozi i slično. Konzervansi i drugi aditivi mogu takođe biti prisutni, na primer, antimikrobi, antioksidanti, agensi za heliranje, inertni gasovima i slično. Konkretnije, farmaceutski sastavi pogodni za injektibilnu upotrebu uključuju sterilne vodene rastvore (gde je rastvor u vodi) ili disperzije i sterilni prah za sporno pripremanje sterilnih injektibilnih rastvora ili disperzija. U takvim slučajevima, sastav mora biti sterilan i trebalo bi da bude tečan u meri u kojoj je moguće lako korišćenje u špricu. Trebalo bi da bude stabilan u uslovima proizvodnje i skladištenja i poželjno će biti očuvan od kontaminacije mikroorganizama, kao što su bakterije i gljivice. Nosilac može biti rastvarač ili agens za disperziju koji sadrži, na primer, vodu, etanol, poliol (npr., glicerol, propilen glikol i tečni polietilenglikol i slično) i njihove odgovarajuće smeše. Odgovarajuća tečnost se može održavati, na primer, upotrebom prevlake kao što je lecitin, održavanjem potrebne veličine čestica u slučaju disperzije i korišćenjem surfaktanata.

[0133] Sprečavanje delovanja mikroorganizama može se postići različitim antibakterijskim i antifungalnim agensima, na primer, parabeni, hlorobutanol, fenol, askorbinska kiselina, timerosal i slično. U mnogim slučajevima biće poželjnije uključiti izotonične agense, na primer, šećere, polialkohole, kao što su manitol, sorbitol ili natrijum-hlorid u sastavu.

Produžena apsorpcija injektibilnih sastav može se dovesti tako što se u sastav uključi agens koji odlaže apsorpciju, na primer aluminijum-monostearat i želatin.

[0134] U svakom slučaju, sterilni injektabilni rastvori se mogu pripremiti inkorporiranjem aktivnog jedinjenja (npr. modifikovanog antitela samog po sebi ili u kombinaciji sa drugim aktivnim agensima) u potrebnoj količini u odgovarajućem rastvaraču sa jednim ili kombinacijom sastojaka nabrojanih ovde, po potrebi, nakon čega sledi filtrirana sterilizacija. Generalno, disperzije se pripremaju inkorporiranjem aktivnog jedinjenja u sterilni nosač, koji sadrži osnovni disperzioni medijum i potrebne druge sastojke od onih nabrojanih gore. U slučaju sterilnih praškova za pripremu sterilnih injektibilnih rastvora, poželjni postupci pripreme su vakuumsko sušenje i sušenje sa zamrzavanjem, što daje prah aktivnog sastojka plus dodatni željeni sastojak iz ranije sterilnog filtriranog rastvora. Preparati za injekcije se obrađuju, napunjeni u ambalažu kao što su ampule, vreće, bočice, špricevi ili epruvete, i zapečaćeni su u aseptičkim uslovima prema postupcima poznatim u ovoj oblasti. Dalje,

4

preparati mogu biti upakovani i prodati u obliku kompleta kao što su oni opisani u saslušanju U.S.S.N. 09/259,337 i U.S.S.N.09/259,338. Ovakvi predmeti proizvodnje će poželjno imati etikete ili umetke za pakovanje koji ukazuju na to da su pridruženi preparati korisni za lečenje pacijenta koji pati od autoimunih ili neoplastičnih poremećaja.

[0135] Efektivne doze sastava predmetnog obelodanjenja, za tretiranje gore opisanih stanja variraju u zavisnosti od mnogih različitih faktora, uključujući agense za primenu, ciljano mesto, fiziološko stanje pacijenta, bilo ljudskog pacijenta ili životinje, drugih lekova i da li je terapija profilaktička ili terapeutska. Obično je pacijent čovek, ali se takođe mogu lečiti ostali sisari, uključujući transgene sisare. Doze za lečenje mogu se titrirati korišćenjem rutinskih postupaka poznatih stručnjacima kako bi se optimizovala bezbednost i efikasnost.

[0136] Za pasivnu imunizaciju sa antitelom, doziranje može da varira, npr. od oko 0,0001 do 100 mg/kg, a obično 0,01 do 5 mg/kg (npr.0,02 mg/kg, 0,25 mg/kg, 0,5 mg/kg, 0,75 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, itd.), telesne težine domaćina. Na primer, doze mogu biti 1 mg/kg telesne težine ili 10 mg/kg telesne težine ili u opsegu od 1-10 mg/kg, poželjno najmanje 1 mg/kg. Srednje doze u gore navedenom opsegu takođe su namenjene da budu u okviru predmetnog obelodanjenja. Pacijentima se mogu primenjivati takve dozama dnevno, na naizmenične dane, nedeljno ili prema bilo kom drugom rasporedu određenom empirijskom analizom. Primerno lečenje podrazumeva primenu u višestrukim dozama tokom dužeg perioda, na primer, od najmanje šest meseci. Dodatni primeri lečenja podrazumevaju primenu jednom na svake dve nedelje ili jednom mesečno ili jednom na svakih 3 do 6 meseci. Primeri rasporeda doziranja uključuju 1-10 mg/kg ili 15 mg/kg tokom uzastopnih dana, 30 mg/kg na naizmenične dane ili 60 mg/kg nedeljno. U nekim postupcima dva ili više monoklonskih antitela sa različitim specifičnostima vezivanja se primenjuju istovremeno, u kom slučaju doziranje svakog antitela koji se primenjuje spada u opsege koji su naznačeni.

[0137] Antitela predmetnog obelodanjenja mogu se primenjivati u više navrata. Intervali između pojedinačnih doziranja mogu biti nedeljno, mesečno ili godišnje. Intervali takođe mogu biti neregularni, kao što je prikazano merenjem nivoa krvi modifikovanog antitela ili antigena kod pacijenta. U nekim postupcima doziranje se prilagođava kako bi se postigla koncentracija modifikovanog antitela u plazmi od 1-1000 μg/ml, i u nekim postupcima 25-300 μg/ml. Alternativno, antitela mogu se davati kao formulacija sa produženim oslobađanjem, u kom slučaju je neophodna manje česta primena. Za antitela, doza i učestalost

4

variraju zavisno od poluživota antitela kod pacijenta. Generalno, humanizovana antitela pokazuju najduži polu-život, praćena himernim antitelima i neljudskim antitelima.

[0138] Doziranje i učestalost primene mogu se razlikovati u zavisnosti od toga da li je terapija profilaktička ili terapijska. U profilaktičkim primenama, sastavi koje sadrže prisutna antitela ili njihov koktel se daju pacijentu koji nije već bolestan kako bi se poboljšao otpor pacijenta. Takva količina je definisana kao „profilaktička efikasna doza“. U ovoj upotrebi, precizne količine opet zavise od zdravstvenog stanja pacijenta i opšteg imuniteta, ali generalno se kreću od 0,1 do 25 mg po dozi, posebno od 0,5 do 2,5 mg po dozi. Relativno niska doza se primenjuje u relativno niskim intervalima tokom dužeg vremenskog perioda. Neki pacijenti nastavljaju da primaju lečenje do kraja svog života. U terapeutskim primenama relativno visoke doze (npr. od oko 1 do 400 mg/kg antitela po dozama, sa dozama od 5 do 25 mg se češće koriste za radioimunokonjugate i veće doze za antitela modifikovana sa citotoksinom) u relativno kratkim intervalima su ponekad potrebne sve dok se progresija bolesti ne smanji ili prekine, a poželjno dok pacijent ne pokaže delimično ili potpuno poboljšanje simptoma bolesti. Nakon toga, pacijentu se može primeniti profilaktički režim.

[0139] Antitela predmetnog obelodanjenja mogu se opciono primenjivati u kombinaciji sa drugim agensima koji su efikasni u lečenju poremećaja ili stanja u kojima je potreban tretman (npr., profilaktički ili terapeutski). Efektivne doze pojedinačne terapije (tj. terapeutski efikasne količine) modifikovanih antitela označenih sa 90Y kreću se između profilaktični 5 i 75 mCi, poželjnije između oko 10 i oko 40 mCi. Efektivne ne-sržne ablativne doze pojedinačne terapije modifikovanih antitela modifikovanih sa 1311 kreću se između 5 i 70 mCi, još poželjnije između oko 5 i oko 40 mCi. Efektivne ablativne doze pojedinačne terapije (tj., mogu zahtevati autolognu transplantaciju koštane srži) modifikovanih antitela označenih sa 1311 kreću se između od oko 30 do oko 600 mCi, poželjnije između oko 50 i manje od oko 500 mCi. U kombinaciji sa himernim antitelima, zahvaljujući duže poluživotu vis-a-vis mišjeg antitela, efektivna ne-sržna ablativna doza pojedinačne terapije hemernih antitela označenih sa jodom-131 se kreće između oko 5 i oko 40 mCi, poželjnije manje od oko 30 mCi. Kriterijumi za snimanje, npr. oznaka 111In, obično su manje od oko 5 mCi.

[0140] Dok se antitela mogu primenjivati kao što je opisano iznad, mora se naglasiti da se u drugim otelotvorenjima vezujući može davati inače zdravim pacijentima kao terapija prve linije. U takvim otelotvorenjima mogu se davati antitela pacijentima koji imaju normalne ili prosečne rezerve crvene srži i/ili pacijentima koji nisu prošli i ne prolaze, druge terapije. Kad se ovde koristi, primena modifikovanih antitela ili njihovih fragmenata u spoju ili kombinaciji sa dodatnom terapijom podrazumeva sekvencijalnu, istovremenu ili paralelnu primenu terapije i obelodanjenih antitela. Stručnjaci u ovoj oblasti će razumeti da se primena različitih komponenti kombinovanog terapijskog režima može vremenski utvrditi kako bi se poboljšala ukupna efikasnost lečenja. Na primer, hemoterapeutski agensi mogu biti primenjeni u standardnim, dobro poznatim terapijama lečenja koji se nakon nekoliko nedelja prate radioimunokonjugatama predmetnog obelodanjenja. Nasuprot tome, antitela vezana za citotoksin mogu se primenjivati intravenozno praćeni lokalizovanim snopom lokalnog tumora. U još nekim otelotvorenjima, modifikovano antitelo može se primenjivati istovremeno sa jednim ili više odabranih hemoterapeutskih agenasa u jednoj poseti kancelariji. Stručnjak u oblasti (npr. iskusni onkolog) bi lako mogao da prepozna efektivne kombinovane terapeutske režime bez nepotrebnog eksperimentisanja zasnovane na odabranoj dodatnoj terapiji i predavanjem predmetne specifikacije.

[0141] U vezi s tim, biće prihvaćeno da kombinacija antitela i hemoterapeutskog agensa može biti primenjena u bilo kom redosledu i u bilo kom vremenskom okviru koji pruža terapeutsku korist za pacijenta. To znači da se hemoterapeutski agens i antitela mogu primenjivati u bilo kom redosledu ili istovremeno. U odabranim otelotvorenjima antitela predmetnog obelodanjenja će se davati pacijentima koji su ranije prošli hemoterapiju. U još nekim otelotvorenjima, antitela i hemoterapeutski tretman će se primenjivati u suštini istovremeno ili paralelno. Na primer, pacijentu se mogu dati antitela dok prima hemoterapiju. U poželjnim otelotvorenjima modifikovano antitelo će biti primenjeno u roku od jedne godine od bilo kog hemoterapeutskog agensa ili tretmana. U drugim poželjnim otelotvorenjima antitela će se primenjivati u roku od 10, 8, 6, 4 ili 2 meseca od bilo kojih hemoterapeutskih agenasa ili tretmana. U još nekim drugim poželjnim otelotvorenjima, antitelo će se primenjivati u roku od 4, 3, 2 ili 1 nedelja od bilo kojih hemoterapeutskih agenasa ili tretmana. U još nekim otelotvorenjima antitela će se davati u roku od 5, 4, 3, 2 ili 1 dana od izabranog hemoterapeutskog agensa ili tretmana. Dalje će se razumeti da se dva agensa ili tretmani mogu davati pacijentu u roku od nekoliko sati ili minuta (tj. u suštini istovremeno).

[0142] Dalje će se razumeti da se antitela predmetnog obelodanjenja mogu koristiti u spoju ili kombinaciji sa bilo kojim hemoterapeutskim agensom ili agensima (npr. kako bi se

1

obezbedio kombinovani terapijski režim) koji eliminiše, smanjuje, inhibira ili kontroliše rast neoplastičnih ćelija in vivo. Primeri hemoterapeutskih agenasa koji su kompatibilni sa predmetnim obelodanjenjem uključuju agense za alkilaciju, vinka alkaloide (npr., vinkristin i vinblastin), procarbazin, metotreksat i prednizon. MOPP kombinacija četiri leka (mehlethamin (azotni mustard), vinkristin (Oncovin), prokarbazin i prednizon) veoma je efikasna u lečenju različitih tipova limfoma i obuhvata poželjno otelotvorenje predmetnog obelodanjenja. Kod pacijenata rezistentnih na MOPP, koriste se kombinacije ABVD (npr. adriamicin, bleomicin, vinblastin i dakarbazin), ChIVPP (CH1orambucil, vinblastin, prokarbazin i prednizon), CABS (lomustin, doksorubicin, bleomicin i streptozotocin), MOPP plus ABVD, MOPP plus ABV (doksorubicin , bleomicin i vinblastin) ili kombinacije BCVPP (karmustin, ciklofosfamid, vinblastin, prokarbazin i prednizon). Arnold S. Freedman i Lee M. Nadler, Malignant Lymphomas, u HARRISON'S PRINCIPLES OF INTERNAL MEDICINE 1774-1788 (Kurt J. Isselbacher i dr, eds., 13th ed.1994) i V. T. DeVita i dr, (1997) i reference koje se tamo navode za standardno doziranje i raspored. Ove terapije mogu se koristiti nepromenjene ili izmenjene po potrebi za određenog pacijenta, u kombinaciji sa jednim ili više antitela predmetnog obelodanjenja kao što je ovde opisano.

[0143] Dodatni režimi koji su korisni u kontekstu predmetnog obelodanjenja uključuju upotrebu jedinstvenih agenasa za alkilaciju kao što su ciklofosfamid ili hlorambucil ili kombinacije kao što su CVP (ciklofosfamid, vinkristin i prednizon), CHOP (CVP i dokorubicin), C-MOPP (ciklofosfamid, vakcristin, prednizon i prokarbazin), CAP-BOP (CHOP plus procarbazin i bleomicin), m-BACOD (CHOP plus metotreksat, bleomicin i leucovorin), ProMACE- MOPP (prednizon, metotreksat, doksorubicin, ciklofosfamid, etopozid i leucovorin plus standardni MOPP) , ProMACE-CitaBOM (prednizon, doksorubicin, ciklofosfamid, etopozid, citarabin, bleomicin, vinkristin, metotreksat i leukovorin) i MACOP-B (metotreksat, doksorubicin, ciklofosfamid, vinkristin, fiksni dozni prednizon, bleomicin i leucovorin). Stručnjaci u oblasti će lako moći da odrede standardne doze i raspored za svaki od ovih režima. CHOP se takođe kombinuje sa bleomicinom, metotreksatom, prokarbazinom, azotnim mustardom, citozin arabinozidom i etopozidom. Ostali kompatibilni hemoterapeutski agensi uključuju, ali bez ograničenja na, 2-CH1orodeoksiadenozin (2-CDA), 2'-deoksiksformicin i fludarabin.

[0144] Kod pacijenata sa srednjim i visokim NHL, koji ne dosegnu remisiju ili recidiv, koristi se terapija spasavanja. Terapije spasavanja koriste lekove kao što su citozin arabinozid,

2

karboplatin, cisplatin, etoposid i ifosfamid dati sami ili u kombinaciji. Kod ponovljenih ili agresivnih oblika određenih neoplastičnih poremećaja često se koriste sledeći protokoli: IMVP-16 (ifosfamid, metotreksat i etopozid), MIME (metil-gag, ifosfamid, metotreksat i etopozid), DHAP (deksametazon, visoki dozni citarabin i cisplatin) , ESHAP (etopozid, metilpredizolon, HD citarabin, cisplatin), CEPP (B) (ciklofosfamid, etopozid, prokarbazin, prednizon i bleomicin) i CAMP (lomustin, mitokantron, citarabin i prednizon) svaka sa poznatim brzinama doziranja i rasporedima.

[0145] Količina hemoterapeutskog agensa koja se koristi u kombinaciji sa modifikovanim antitelima predmetnog obelodanjenja može varirati prema pacijentu ili se može primenjivati prema onome što je poznato u struci. Pogledati, na primer, Bruce A. Chabner i dr, Antineoplastic Agents, in GOODMAN & GILMAN'S THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS 1233-1287 (Joel G. Hardman i dr., eds., 9th ed.1996).

[0146] Kao što je ranije rečeno, antitela predmetnog obelodanjenja, imunoreaktivni fragmenti ili njihovi rekombinanti mogu se davati u farmaceutski efikasnoj količini za in vivo tretman poremećaja sisara. U vezi s tim, biće prihvaćeno da će obelodanjena antitela biti formulisani da bi olakšali primenu i promovisali stabilnost aktivnog agensa.

[0147] Poželjno, farmaceutski sastavi u skladu sa predmetnim obelodanjenjem obuhvataju farmaceutski prihvatljiv, netoksičan, sterilni nosač, kao što je fiziološki rastvor, netoksični puferi, konzervansi i slično. U svrhu predmetne prijave, farmaceutski efikasna količina modifikovanog antitela, imunoreaktivnog fragmenta ili njegovog rekombinanta, konjugovanog ili nekonjugovanog sa terapeutskim agensom, smatra se količinom koja je dovoljna da se postigne efektivno vezivanje za antigen i da se postigne korist, na primer, za ublažavanje simptoma bolesti ili poremećaja ili za detektovanje supstance ili ćelije. U slučaju tumorskih ćelija, modifikovano antitelo biće poželjno u interakciji sa odabranim imunoreaktivnim antigenom na neoplastičnim ili imunoreaktivnim ćelijama i obezbediti povećanje smrti tih ćelija. Naravno, farmaceutski sastavi predmetnog obelodanjenja mogu se primenjivati u pojedinačnim ili višestrukim dozama kako bi se obezbedila farmaceutski efikasna količina modifikovanog antitela.

[0148] U skladu sa obimom predmetnog obelodanjenja, antitela obelodanjenja mogu se davati ljudima ili drugim životinjama u skladu s gore navedenim postupcima lečenja u količini koja je dovoljna da proizvede terapeutski ili profilaktički efekat. Antitela obelodanjenja mogu se primenjivati na takvu ljudsku ili drugu životinju u konvencionalnom doznom obliku, pripremljenim kombinovanjem antitela obelodanjenja sa konvencionalnim farmaceutski prihvatljivim nosačem ili diluentom prema poznatim tehnikama. Stručnjaku će biti poznato da oblik i karakter farmaceutski prihvatljivog nosača ili razblaživača diktiraju količina aktivnog sastojka sa kojim se kombinuje, način primene i druge dobro poznate varijable. Stručnjaci u ovoj oblasti dalje će ceniti da posebno može biti efikasan koktel koji sadrži jednu ili više vrsta antitela opisanih u predmetnom obelodanjenju.

V. Eksprimiranje antitela

[0149] U jednom aspektu, pronalazak pruža polinukleotide koji kodiraju antitela koja su ovde patentni zahtev. Takođe je obezbeđen postupak za pravljenje antitela koje sadrži eksprimiranje ovih polinukleotida.

[0150] Polinukleotidi koji kodiraju antitela koja su ovde obelodanjena, obično se ubacuju u vektor eksprimiranja za uvođenje u ćelije domaćine koji se mogu koristiti za proizvodnju željene količine navedenih antitela ili njihovih fragmenata. Shodno tome, u određenim aspektima, pronalazak pruža vektore eksprimiranja koji sadrže polinukleotide koji su ovde prikazani i ćelije domaćine koje sadrže ove vektore i polinukleotide.

[0151] Izraz „vektor“ ili „vektor eksprimiranja“ ovde se koristi u svrhe specifikacije i patentnih zahteva, da označi vektore koji se koriste u skladu sa ovim pronalaskom kao agens za uvođenje i eksprimiranje željenog gena u ćeliji. Kao što je poznati stručnjacima, takvi vektori mogu se lako izabrati iz grupe koja se sastoji od plazmida, faga, virusa i retrovirusa. Generalno, vektori koji su kompatibilni sa predmetnim pronalaskom će sadržati selekcioni marker, odgovarajuća mesta za ograničavanje kako bi se olakšalo kloniranje željenog gena i sposobnost ulaza i/ili replikacije u eukariotskim ili prokariotskim ćelijama.

[0152] Za svrhe ovog pronalaska mogu se koristiti brojni sistemi vektora eksprimiranja. Na primer, jedna klasa vektora koristi DNK elemente koji su izvedeni iz životinjskih virusa kao što su virus goveđi papiloma virus, virus polioma, adenovirus, virus vakcinije, bakulovirus, retrovirusi (RSV, MMTV ili MOMLV) ili SV40 virus. Drugi uključuju upotrebu policistronskih sistema sa unutrašnjim mestima vezivanja ribozoma. Pored toga, ćelije koje su integrisale DNK u njihove hromozome mogu se odabrati uvođenjem jednog ili više

4

markera koji omogućavaju selekciju transfektovanih ćelija domaćina. Marker može obezbediti prototrofiju auksotrofnom domaćinu, otpornost na biocide (npr. antibiotike) ili otpornost na teške metale kao što je bakar. Selektivni markerski gen može biti direktno povezan sa DNK sekvencama koje se eksprimiraju ili se unose u istu ćeliju pomoću kotransformacije. Dodatni elementi mogu biti potrebni za optimalnu sintezu mRNK. Ovi elementi mogu uključivati signalne sekvence, signale vezivanja, kao i promotere transkripcije, pojačivače i signale zaključivanja. U posebno poželjnim otelotvorenjima geni klonirane varijabilne regije ubacuju se u vektor eksprimiranja zajedno sa sintetičkim genom konstantne regije teškog i lakog lanca (poželjno ljudski) sintetički kao što je gore opisano.

[0153] U drugim poželjnim otelotvorenjima antitela prema pronalasku mogu se eksprimirati korišćenjem polikistronskih konstrukata. U takvim sistemima eksprimiranja, višestruki proizvodi gena koji su od interesa, kao što su teški i lakni lanci antitela, mogu se proizvoditi iz jednog polikistronskog konstrukta. Ovi sistemi poželjno koriste unutrašnje mesto za unos ribozoma (IRES) kako bi se obezbedili relativno visoki nivoi antitela iz ovog pronalaska u eukariotskim ćelijama domaćina. Kompatibilne IRES sekvence su obelodanjene u U.S. Pat. No. 6,193,980. Stručnjaci u oblasti će ceniti da se takvi sistemi eksprimiranja mogu koristiti za efikasno proizvodnju čitavog spektra antitela koja su otkriveni u predmetnoj prijavi.

[0154] Uglavnom, kada se pripremi vektor ili DNK sekvenca koja kodira antitelo ili njegov fragment, vektor eksprimiranja se može uneti u odgovarajuću ćeliju domaćina. To znači da se ćelije domaćine mogu transformisati. Uvođenje plazmida u ćeliju domaćina može se postići različitim tehnikama koje su dobro poznate stručnjacima. Ovo uključuje, ali nije ograničeno na, transfekciju (uključujući elektroforezu i elektroporaciju), fuziju protoplasta, taloženje kalcijum fosfata, fuziju ćelija sa obmotanom DNK, mikroinjekciju i infekciju sa netaknutim virusom. Pogledati, Ridgway, A. A. G. „Mammalian Expression Vectors“ Chapter 24.2, pp.

470-472 Vectors, Rodriguez and Denhardt, Eds. (Butterworths, Boston, Mass.1988).

Najpoželjnije, uvođenje plazmida u domaćinstvo je putem elektroporacije. Transformisane ćelije se uzgajaju pod uslovima koji su pogodni za proizvodnju lakih lanaca i teških lanaca i analizirane su za sintezu proteina teških i lakih lanaca. Primerne tehnike ispitivanja uključuju analizu imunosorbent-vezanih enzima (ELISA), radioimunotest (RIA) ili analizu ćelijskog sortera aktiviranog fluorescencijom (FACS), imunohistohemiju i slično.

[0155] Kad se ovde koristi, izraz „transformacija“ će se koristiti u širem smislu kako bi se odnosila na uvođenje DNK u ćeliju domaćina primaoca koji menja genotip i stoga rezultuje promenom ćelije primaoca.

[0156] Po istom principu, „ćelije domaćini“ odnose se na ćelije koje su transformisane pomoću vektora konstruiranih pomoću tehnike rekombinantne DNK i kodiranja najmanje jednog heterolognog gena. U opisima procesa za izolaciju antitela iz rekombinantnih domaćina, termini „ćelija“ i „ćelijska kultura“ koriste se međusobno zamenljivo kako bi označili izvor antitela, osim ako nije jasno naznačeno drugačije. Drugim rečima, uzimanje antitela iz „ćelija“ može značiti bilo da se izbace iz celih ćelija ili iz ćelijske kulture koja sadrži i medijum i suspendovane ćelije.

[0157] U jednom otelotvorenju, linija ćelija domaćina korišćena za eksprimiranje antitela je sisarskog porekla; stručnjaci u oblasti mogu odrediti određene linije ćelija domaćina koje su najpogodnije za željeni genski proizvod koji će biti izražen u njemu. Primerne linije ćelija domaćina uključuju, ali nisu ograničene na, DG44 i DUXB11 (Linije jajnika kineskog hrčka, DHFR minus), HELA (ljudski karcinom grlića materice), CVI (linija bubrega majmuna), COS (derivat CVI sa SV40 T antigenom), R1610 (fibroblast kineskog hrčka), BALBC/3T3 (mišji fibroblast), HAK (linija bubrega hrčka), SP2/O (mišji mijelom), BFA-1c1BPT (goveđe endotelne ćelije), RAJI (ljudski limfocit), 293 (ljudski bubreg). U jednom aspektu, ćelijska linija pruža izmenjenu glikozilaciju, na primer, afkoosilaciju, antitela koje je iz njega eksprimirano (npr. PER.C6.RTM. (Crucell) ili FUT8-knock-out CHO ćelijske linije (Potelligent.RTM. Cells) (Biowa, Princeton, N.J.)). U jednom otelotvorenju mogu se koristiti NS0 ćelije. CHO ćelije su posebno poželjne. Linije ćelija domaćina su obično dostupne od komercijalnih provajdera, od American Tissue Culture Collection, ili iz objavljene literature.

[0158] In vitro proizvodnja dozvoljava povećanje količine željenih antitela. Tehnike za kultivaciju ćelija sisara u uslovima tkivne kulture su poznate u struci i uključuju homogenu kulturu suspenzije, npr. u vazdušnom reaktoru ili u reaktoru sa stalnim mešanjem, ili imobilisanu ili uvezanu ćelijsku kulturu, npr. u šupljim vlaknima, mikrokapsulama, agaroznim mikrobadama ili keramičkim kertridžima. Ako je neophodno i/ili poželjno, rastvori antitela mogu biti prečišćeni pomoću uobičajenih postupaka hromatografije, na primer filtracije gelom, jonizujuće hromatografije, hromatografije preko DEAE-celuloze i/ili (imuno-) afinitetne hromatografije.

[0159] Geni koji kodiraju antitela iz ovog pronalaska mogu takođe biti eksprimirane nesisarske ćelije kao što su bakterije ili kvasac ili biljne ćelije. U tom smislu biće prihvaćeno da se različiti jednoćelijski ne-sisarski mikroorganizmi, kao što su bakterije, takođe mogu transformisati; tj. oni koji se mogu gajiti u kulturi ili fermentaciji. Bakterije, koje su podložne transformaciji, uključuju članove enterobakterija, kao što su linije Escherichia coli ili Salmonella; Bacillaceae, kao što je Bacillus subtilis; Pneumococcus; Streptococcus i Haemophilus influenzae. Dalje će se razumeti da, kada se eksprimiraju u bakterijama, antitela mogu postati deo inkluzionih tela. Antitela moraju biti izolovana, prečišćena i zatim sastavljena u funkcionalne molekule.

[0160] Pored prokariota, mogu se koristiti i eukariotski mikrobi. Saccharomyces cerevisiae, ili uobičajeni pekarski kvasac, najčešće se koristi među eukariotskim mikroorganizmima, iako su mnoge druge linije uobičajeno dostupne. Za eksprimiranje u Saccharomyces, na primer, obično se koristi plazmid IRp7 (Stinchcomb i dr., Nature, 282:39 (1979); Kingsman i dr., Gene, 7:141 (1979); Tschemper i dr., Gene, 10:157 (1980)). Ovaj plazmid već sadrži TRP1 gen koji daje selekcioni marker za mutantnu liniju kvasaca koja nema sposobnost da raste u triptofanu, na primer ATCC No.44076 ili PEP4-1 (Jones, Genetics, 85:12 (1977)). Prisustvo trpl lezije kao karakteristika genoma domaćina ćelija potom pruža efektivno okruženje za detektovanje transformacije rastom u odsustvu triptofana.

PRIMERI

[0161] Ovaj pronalazak se dalje ilustruje sledećim primerima.

Primer 1. Dizajn, priprema i karakterizacija 2C3 anti-CD-52 hiperglikozilacionih mutanat antitela

[0162] Višestruke hiperglikozilacione mutacije su dizajnirane u teškim lancima anti-CD-52 antitela, 2C3, sa ciljem dodavanja glomazne grupe interfejsu interakcije (npr. FcRn mesta vezivanja za modulaciju farmakokinetike antitela), za moduliranje funkcije efektora antitela izmenom njegove interakcije sa FcyRs ili uvođenjem nove hemijske modifikacije podsekvence unakrsno povezanog mesta za efektorski deo, uključujući, ali bez ograničenja na, lekove, toksine, citotoksične agense i radionukleotide. Hiperglikozilovani 2C3 mutanti su navedeni u Tabeli 3.

Tabela 3. Hiperglikozilovani 2C3 anti-CD-52 mutanti

1A. Kreiranje 2C3 anti-CD-52 antitelo mutanata hiperglikozilacionih

[0163] Mutacija A114N, označena na osnovu Kabatovog sistema numeracije, uvedena je u CH1 domen 2C3 mutagenim PCR. Za stvaranje antitela pune dužini, VH domen plus mutirani ostatak A114N ubačen je kloniranjem nezavisno od ligacije (LIC) u pENTR-LIC-IgG1 vektor koji kodira CH domene 1-3 antitela. Sve ostale mutacije su uvedene na pENTR-LIC-IgG1 putem usmerene mutageneze QuikChange kompletom usmerene mutageneze (Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA, USA). WT 2C3 VH je kloniran u mutirane vektore od strane LIC. Mutanti pune dužine klonirani su u pCEP4(-E+I)Dest vektor eksprimiranja Gateway kloniranjem. Fc mutacije su određene na osnovu EU numeracije. Mutacije su potvrđene sekvenciranjem DNK. Aminokiselinske sekvence teških i lakih lanaca WT 2C3 i mutirani teški lanci 2C3 prikazani su u Tabeli 4. Mutirane aminokiseline su označene sivom, i podvučene su konsenzus ciljane mesta glikozilacije nastala mutacijom.

Tabela 4. Aminokiselinske sekvence 2C3 anti-CD-52 antitela

[0164] Mutanti i WT kontrola transfektovani su u HEK293-EBNA ćelije u formatu 6-okomorične ploče. Kao što je prikazano na Slici 9, utvrđeno je da je nivo eksprimiranja ~0,1 μg/ml, kako je analizirano SDS-PAGE i Western blot. Eksprimiranje mutanata u kondicioniranim medijumima takođe je mereno hvatanjem proteina A na Biacore.

Koncentracija je određena korišćenjem odgovora disocijacije 6 minuta nakon injekcije u imobilizovan Protein A. Kao standardna kriva korišćena je WT 2C3 proizvedena od CHO

1

serijski razređena u medijumima od 90μg/mL do 1,5ng/mL. Koncentracije su izračunate na ~ 0,2μg/mL kalibracionom krivom koristeći 4-parametarsko uklapanje. Kao što je prikazano na Slici 9, nivoi relativnih eksprimiranja bili su niski i uglavnom su odgovarali rezultatima Western blot.

1B. Verifikacija hiperglikozilacije

[0165] kako bi se utvrdilo da li su dodatna mesta glikozilacije uvedena mutacijama, 2C3 mutant i proteini divljih vrsta tretirani su univerzalnim deglikozilnim enzimom PNGaza F i uzorci proteina analizirani su sa SDS-PAGE i Western blot. Kao što je prikazano na Slici 10, samo A114N mutant je imao povećanu molekulsku težinu, što ukazuje na prisustvo dodatnog N-povezanog ugljenog hidrata.

[0166] Pripreme antitela malih razmera su proizvedene da prečiste 2C3 mutante za dalju verifikaciju uvođenja mesta glikozilacije. Kao što je prikazano na Slici 11, potvrđeno je sa SDS-PAGE da je samo A114N mutant imao dodatna mesta glikozilacije.

1C. Svojstva vezivanja 2C3 anti-CD-52 mutanta

[0167] Biacore je korišćen za upoređivanje svojstava vezivanja prečišćenih proteina. Mišji i SEC-prečišćeni ljudski FcRn-HPC4 su imobilisani na CM5 čipu pomoću aminskog spajanja. Svako antitelo je razređeno na 200, 50 i 10nM i injektirano preko imobilizovanih Fc receptora. Campath, CHO-proizvedeni WT 2C3 i CAMAP tretiran sa DEPC uključeni su kao pozitivne i negativne kontrole. Kao što je prikazano na Slici 13, mutant I436S je pokazao oko 2 puta smanjenje vezivanja za ljudski FcRn. Interesantno, nije bilo uticaja na vezivanje ovog mutanta za mišji FcRn. Nijedna druga 2C3 mutacija nije imala značajan uticaj na vezivanje za ljudski ili mišji FcRn.

[0168] Biacore je korišćen za upoređivanje karakteristika vezivanja antigena pročišćenih proteina korišćenjem testa vezivanja Biacore peptida CD-52 peptida 741. CD-52 peptid 741 i kontrolni peptid 777 su imobilisani na CM5 čip. Antitela su serijski razblažena dvostruko od 60 do 0,2nM u HBS-EP i injektirana u duplikatu tokom 3 minuta, nakon čega je došlo do 5 minuta disocijacije u puferu sa brzinom protoka od 50μL/min. GLD52 lot 17200-084 je uključen kao kontrola. Površina je regenerisana sa 1 pulsom od 40mM HCl. Model vezivanja 1:1 je korišćen da se uklopi 7,5 do 0,2 nM krive. Kao što je prikazano na Slici 16, mutant A114N imao je nešto niži afinitet vezivanja CD-52, dok je NGT mutant imao nešto veći

2

afinitet od ostalih mutanata u ovom testu. Test vezivanja CD-52 peptida 741 Biacore je ponovljen sa proteinom prečišćenom iz veće količine pripreme kao što je prikazano na Slici 17, A114N mutant prikazuje vezivanje CD-52 peptida koji je uporediv sa WT 2C3.

1D. Opis karakterizacije A114N mutanta

[0169] Izoelektrično fokusiranje (IEF) je izvršeno za karakterizaciju naelektrisanja 2C3 mutanata. Pročišćeni protein je korišćen na imobilizovanom pH gradijentu (pH3-10) akrilamidu (IPG) gelu. Kao što je prikazano na Slici 18A, pronađeno je da A114N ima više negativnih uticaja, verovatno zbog ostataka sijalinske kiseline. Neaktivni MS podaci potvrđuju složenu strukturu sijalinskih kiselina na mutantu A114N. Nasuprot tome, za WT 2C3 je pokazano da su G0F i G1F kao dominantne vrste glikozilacije (sl.18C i 18D, respektivno).

Primer 2. Priprema mutanata hiperglikozilacije u nekoliko kičmi antitela

[0170] Pored 2C3 anti-CD-52 antitela, A114N mutacija je dizajnirana u nekoliko drugih kičmi antitela kako bi se potvrdilo da jedinstveno mesto hiperglikozilacije može da se uvede u sekvence varijabilnog domena teških lanaca. Hiperglikozilovani anti-TEM1, anti-FAP i anti-Her2 mutanti su navedeni u Tabeli 5.

Tabela 5. A114N i/ili S298N mutanti dizajnirani na nekoliko nepovezanih kičmi antitela

2A. Stvaranje mutantnih hiperglikozilacionih anti-TEM1 i anti-FAP antitela [0171] Mutacija A114N, označena na osnovu Kabatovog sistema numeracije, uvedena je u CH1 domen anti-TEM1 i anti-FAP sa mutagenim PCR. Za stvaranje antitela pune dužine, mutirani VH plus ostatak 114 ubačeni su kloniranjem nezavisno od ligacije (LIC) u pENTR-LIC-IgG1 vektor koji kodira antitela CH domena 1-3. Mutanti pune dužine su zatim klonirani pCEP4(-E+I)Dest vektor eksprimiranja pomoću Gateway kloniranja. Mutacije su potvrđene sekvenciranjem DNK. Amino-kiselinske sekvence divljeg tipa anti-TEM1 i mutirani teški i laki lanci su prikazani u Tabeli 6. Mutirane aminokiseline su označene sivom bojom, a podvučena su konsenzusna ciljana mesta glikozilacije nastala mutacijom.

Tabela 6. Aminokiselinske sekvence anti-TEM1 i anti-FAP antitela

4

[0172] Mutanti i kontrola divljeg tipa transfektovani su u HEK293-EBNA ćelije u formatu trostruke boce i prečišćeni na kolonama HiTrap proteina A (GE Healthcare Biosciences, Pittsburgh, PA, SAD). Kao što je analizirano pomoću A280 na NanoDrop spektrofotometru, eksprimiranje anti-FAP A114N i anti-FAP A114C bilo je oko 3μg/ml i oko 1μg/ml, respektivno. Eksprimiranje anti-TEM1 A114N bilo je oko 0,04 μg/ml.

2B. Verifikacija hiperglikozilacije

[0173] Kako bi se potvrdilo da je dodatni položaj glikozilacije uveden u A114N mutante, pročišćeni protein iz A114N mutanata analiziran je na redukujućem SDS-PAGE zajedno sa kontrolnim proteinom divljeg tipa. Jedna dodatna lokacija glikozilacije bi dodala 2000-3000 daltona molekulskoj težini teškog lanca. Kao što je prikazano na Slici 20, SDS-PAGE je pokazala da su anti-FAP i anti-TEM1 A114N mutanti u teškim lancima povećali očiglednu molekulsku težinu, u skladu sa uspešnim uvođenjem dodatnih mesta glikozilacije na oba antitela.

2C. Stvaranje mutanata hiperglikozilacije anti-Her2 antitela

[0174] Her-2 A114N, Her-2 A114N/NNAS i WT Her-2 antitela stvorena su kloniranjem nezavisno od ligacije. VH domen Herceptina sintetizovan je i PCR-amplifikovan sa dva LIC-kompatibilna skupa prajmera, bilo WT ili sa A114N mutacijom. Za dobijanje antitela pune dužine, amplifikovani VH inserti (WT ili A114N) su klonirani u dva pENTR vektora koji kodiraju CH 1-3 domene, pENTR-LIC-IgG1 WT i pENTR-LIC-IgG1 NNAS, što rezultuje u tri mutanta pune dužine (A114N, NNAS, A114N/NNAS) i WT kontrolom kao ulaznim klonovima na pENTR. Ovi mutanti su klonirani u pCEP4(-E+I)Dest vektorom eksprimiranja, pomoću Gateway kloniranja. Mutacije su potvrđene sekvenciranjem DNK. Amino-kiselinske sekvence anti-Her-2 divljeg tipa i mutirani teški i laki lanci navedeni su u Tabeli 7. Mutirane aminokiseline su istaknute sivom bojom, a podvučena su konsenzusna ciljana mesta glikozilacije nastala mutacijom.

Tabela 7. Aminokiselinske sekvence anti-Her-2 antitela

2D. Eksprimiranje mutanta hiperglikozilacije A114N anti-Her2 antitela

[0175] A114N anti-Her2 i konstrukti divljeg tipa transfektovani su sa Lipofektaminom-2000 (2,5:1 odnos reagensa i DNK) i XtremeGene HP (3:1 odnos reagensa i DNK) u HEK293-EBNA ćelije u 12 trostrukih boca. Oktetno merenje alikvota od 3 kondicionirana medijuma (CM) pokazalo je da je eksprimiranje proteina bila konzistentna za 6 boca za Lipofektamin-2000 i XtremeGene HP. Kao što je prikazano u Tabeli 8, ukupna efikasnost transfekcije je bila oko 30% veća kod XtremeGene HP. Kondicioniran medijum prikupljen dana 3 bio je skupljen za obe stanja transfekcije i prečišćen protein A kolonom. Oktetno merenje pokazalo je 1,8 ug/ml antitela u serumu koji su sadržali lažne medijume u odnosu na 0 ug/ml u neserumskim lažnim medijumima.

Tabela 8. Eksprimiranje A114N anti-Her2 mutanta hiperglikozilacije

[0176] Kondicioniran medijum od dana 6 sakupljen je i prečišćen odvojeno za svako stanje transfekcije. Oba eluata su izmenjena u puferu zasebno u PBS, pH 7,2 i koncentrisana ~ 15 puta, koristeći Amicon-4 (50 kD cut-off) kolone. Dan 6 CM je pokazao veći nivo eksprimiranja u odnosu na dan 3 CM. Kao što je prikazano u Tabeli 8, ukupno 3 mg Herceptin A114N 15,59 mg/ml (od transfekcije Lipofektamina) i 6 mg Herceptina A114N 16,86 mg/ml (iz transfekcije XtremeGene HP) proizvedeno je od kondicioniranih medijuma dana 6 za dodatne nizvodne primene, kao što je konjugacija antitela i leka.

2E. SDS-PAGE i HIC analiza A114N anti-Her2 mutanta

[0177] Pre konjugacije, prečišćeni A114N Herceptin je karakterisan sa SDS-PAGE i HIC (hidrofobna interakciona hromatografija). Kao što je prikazano na Slici 21, utvrđeno je da je kvalitet prečišćenog A114N Herceptina pogodan za dalje nizvodne primene.

2F. Konjugacija za ugrađenu glikozilaciju

[0178] Pokazalo se: a) mesto glikozilacije je uvedeno na Kabat položaju 114 na anti-TEM1; b) mutant A114N imao je hiperglikozilaciju na teškom lancu sa redukujućim SDS-PAGE; i c) hiperglikozilovani mutant A114N imao je složenu strukturu ugljenih hidrata u intenzitetu LC/MS, uključujući terminalne sijalinske kiseline i galaktozu, koji su idealni za konjugaciju SAM i GAM. kako bi se potvrdilo da je dizajnirano mesto glikozilacije pogodno za konjugaciju, anti-TEM1 A114N je konjugovan sa 5kDa PEG putem aminookisi hemije. Kao što je prikazano na Slici 22, PEG je uspešno konjugovan sa anti-TEM1 A114N putem aminooksi veze. Ovaj mutant je takođe uspešno pripremljen na anti-FAP i anti-CD-52 2C3 kičmama (nije prikazano). Ovi podaci pokazuju da je mesto glikozilacije na N114 korisno za konjugaciju efektora.

Primer 3: Generisanje mutacija S298N/Y300S Fc

[0179] Dizajnirane i proizvedene Fc varijante su dizajnirane i generisane tako da je uvedeno novo mesto glikozilacije na EU položaju Ser 298, pored prirodnog mesta Asn297.

Glikozilacija na Asn297 je bilo održavana ili ablatovana mutacijom. Mutacije i željeni rezultati glikozilacije su prikazani u Tabeli 9.

Tabela 9: Stanja glikozilacije različitih varijanti antitela

3A. Stvaranje promenjenih varijanti glikozilacije H66 αβ-TCR antitela

[0180] Mutacije su izvedene na teškim lancima αβ T-ćelijskog receptora klona # 66 antitela pomoću Quikchange koristeći pENTR_LIC_IgG1 šablon. VH domen od HEBE1 Δab IgG1 # 66 je pojačan sa LIC prajmerima pre nego što je kloniran u mutirani ili divlji tip pENTR_LIC_IgG1 od strane LIC kako bi se stvorila antitela pune dužine ili antitela divljeg tipa. Subkloniranje je potvrđeno pomoću DraIII/XhoI dvostrukog digestiranja, koji proizvodi približno 1250 bp veličine u uspešnim klonovima. Ovi mutanti pune dužine su zatim klonirani u vektor eksprimiranja, pCEP4(-E+I)Dest, putem Gateway kloniranja. Mutacije su potvrđene sekvencioniranjem DNK. Amino-kiselinske sekvence WT H66 anti-αβTCR težih i lakih lanaca i mutirani H66 teški lanci su prikazane u Tabeli 10. Mutirane aminokiseline su označene sivom bojom, a podvučena su konsenzusna ciljana mesta glikozilacije nastala mutacijom.

Tabela 10: Aminokiselinske sekvence H66 anti-αβTCR antitela

1

[0181] Mutantni, divlji tip i dve aglikozilovane kontrole (HEBE1 Agly IgG4 i HEBE1 Δab IgG1 u pCEP4) konstrukti su transfektovani u HEK293-EBNA ćelije u trostrukim bocama za eksprimiranje. Proteini su prečišćeni od 160 ml kondicioniranog medijuma (CM) sa 1 ml HiTrap proteina A kolonama (GE) koristeći višekanalnu peristaltičku pumpu. Pet mikrograma svakog dobijenog supernatanta analizirano je na 4-20% Tris-Glicin redukujućim i neredukujućim SDS-PAGE gelovima (pogledati Sliku 2). Teški lanci aglikozilovanih mutanata (N297Q, T299A i Agly kontrola) su se dalje migrirali (strelica), u skladu sa gubitkom glikana u ovim antitelima. Teški lanci ugrađenih glikozilovanih antitela (NSI, STI, SI, Δab i wt kontrola, strelice), međutim, migriraju slično kontrolama divljeg tipa. Ovaj rezultat je u skladu sa postojanjem dizajniranog mesta glikozilacije na EU položaju 298. SEC-HPLC analiza pokazala je da su svi mutanti eksprimirani kao monomeri.

2

3B. Analiza glikozilacije pomoću LC-MS

[0182] Dizajnirane H66 IgG1 Fc varijante delimično su redukovane sa 20mM DTT na 37°C tokom 30 minuta. Uzorci su zatim analizirani kapilarnim LC/MS na Agilent 1100 kapilarnom HPLC sistemu zajedno sa KSTAR qq TOF hibridnim sistemom (Applied Biosystems). Za analizu podataka korišćena je rekonstrukcija Bayesian proteina sa korekcijom početne vrednosti i kompjuterskim modeliranjem Analist QS 1.1 (Applied Biosystems). U S298N/T299A/Y300S H66 mutantu antitela primećeno je jedno mesto glikozilacije kod aminokiseline 298 sa biantenarnim i triantenarnim glikanima kompleksnog tipa koji su detektovani kao glavna vrsta uz G0F, G1F i G2F (pogledati Sliku 34). Ovaj izmenjen profil glikozilacije je dosledan sa pomerenom glikozilacijom na N298 umesto sa mestom glikozilacije divljeg tipa na N297.

3C. Karakteristike vezivanja mutacija αβTCR antitela na ljudske FcyRIIIa i FcyRI koristeći Biacore

[0183] Biacore je korišćen za procenu vezivanja za rekombinantnu ljudsku FcyRIIIa (V158 & F158) i FcyRI. Sva četiri protokola CM5 čipa su imobilisana sa anti-HPC4 antitelima putem standardne procedure aminskog spajanja koju je pružio Biacore. Antitelo protiv HPC4 je razblaženo do 50μg/mL u 10mM natrijum acetatu pH 5,0 za reakciju kuplovanja i injektirano je 25 minuta na 5μL/min. Otprilike 12.000 RU antitela je imobilisano na površinu čipa. Rekombinantni ljudski FcγRIIIa-V158 i FcyRIIIa-F158 su razređeni do 0,6μg/mL u puferu za vezivanje (HBS-P sa 1mM CaCl2) i injektirani u protočne ćelije 2 i 4, respektivno, u trajanju od 3 min na 5μL/min, kako bi se uhvatili 300-400 RU receptori na anti-HPC4 čipu. Kako bi se razlikovalo između niskih veznika, tri puta više rhFcyRIIIa je zarobljeno na površini anti-HPC4 nego što se obično koristi u ovom testu. Protočne ćelije 1 i 3 su korišćene kao referentne kontrole. Svako antitelo je razblaženo do 200nM u puferu za vezivanje i injektirano preko sva četiri protokola u trajanju od 4 minuta, nakon čega je usledilo 5 minuta disocijacije u puferu. Površine su regenerisane sa 10mM EDTA u HBS-EP puferu u trajanju od 3 min na 20μL/min. Rezultati ovih eksperimenata su prikazani na Slici 3.

[0184] Biacore je takođe korišćen za upoređivanje vezivanja FcyRI. Anti-tetra His antitelo je puferom izmenjeno u 10mM natrijum acetatu pH 4,0 upotrebom Zeba Desalting kolone i razblaženo do 25μg/mL u acetatnom puferu za amino spajanje. Dve protočne ćelije CM5 čipa su imobilisane sa ~ 9000 RU od anti-Tetra-His antitela nakon 20 minuta ubrizgavanja na 5μL/min. Kao i u prethodnom eksperimentu, deset puta više FcyRI je uhvaćeno na površinu anti-tetra-His kako bi se uporedili uzorci sa slabim vezivanjem. Rekombinantni ljudski FcyRI je razblažen u 10μg/mL u HBS-EP vezujućem puferu i injektiran u tečnost 2 u trajanju od 1 min na 5μL/min, kako bi zauzeo ~ 1000 RU receptora na anti-tetra-His čip. Jedna koncentracija antitela, 100nM, ubrizgana je 3 min na 30μL/min preko zarobljene receptorske i kontrolne površine. Kasnije, disocijacija je nadgledana tri minuta. Površina je zatim regenerisana sa dve 30-sekundne injekcije od 10mM glicina pH 2,5 na 20μL/min. Rezultati ovih eksperimenata su prikazani na Slici 4.

[0185] Ovi rezultati pokazuju zapanjujuće smanjenje vezivanja glikoprojektovanog mutanta na FcyRIIIa ili FcyRI. Posebno je H66 S298N/T299A/Y300S gotovo potpuno ukinuo vezivanje za oba receptora. Ovaj mutant je izabran za detaljniju analizu.

3D. Karakterizacija stabilnosti pomoću kružnog dihroizma (CD)

[0186] Stabilnost mutanta antitela S298N/T299A/Y300S kontrolisana je eksperimentom Far-UV CD termičko topljenja, u kome se CD signal na 216nm i 222nm prati kao rastuća temperatura koja vodi do otvaranja antitela (denaturacija).

[0187] Temperaturu je kontrolisao termoelektrični peltier (Jasco model AWC100) i povećana je brzinom od 1°C/min od 25-89°C. CD spektri su sakupljeni na Jasco 815 spektrofotometru pri koncentraciji proteina od otprilike 0,5 mg/mL u PBS puferu u kvarcnoj kiveti (Hellma, Inc) dužine puta od 10 mm. Brzina skeniranja je iznosila 50 nm/min i tačnost podataka od 0,5 nm. Korišćen je propusni opseg od 2,5 nm sa osetljivošću medijuma. CD signal i HT napon su prikupljeni od 210-260 nm sa intervalima podataka od 0,5 nm, i intervalima temperature od 1°C, a za svaki uzorak su izvedena četiri replikata. Rezultati pokazuju da i delta AB H66 i S298N/T299A/Y300S H66 mutant pokazuju slična termička ponašanja i imaju približno istu temperaturu za degradaciju (oko 63°C) (Slika 35), dalje sugerišući da imaju uporedivu stabilnost.

Primer 4: Funkcionalna analiza Fc-dizajniranih mutanata

[0188] Fc-dizajnirani mutanti su procenjivani putem PBMC testa proliferacije i testa oslobađanja citokina. U analizi PBMC proliferacije, ljudski PBMC su kultivisani sa rastućim koncentracijama terapijskog antitela 72 sata, dodat je<3>H-timidin, a ćelije su sakupljene 18 sati kasnije. Za analizu ispuštanja T ćelija/oslobađanja citokina, ljudski PBMC su kultivisani sa rastućim koncentracijama terapijskog antitela i svakodnevno su analizirani za broj ćelija i

4

preživljavanje (Vi-Cell, Beckman Coulter) do dana 7. Ćelijski supernatanti su takođe prikupljeni, čuvani na -20°C i analizirani na 8-pleks citokin panelu (Bio-Rad).

[0189] Normalni donor PBMC se odmrzava i tretira pod sledećim uslovima (sve u medijumima koje sadrže komplement): Netretirani; BMA031, moIgG2b 10g/mL; OKT3, moIgG2a 10g/ml; H66, huIgG1 deltaAB 10g/ml, 1g/ml i 0.1g/ml; H66, huIgG1 S298N/T299A/Y300S 10g/ml, 1ug/ml i 0.1ug/ml.

[0190] Citokini su sakupljeni na dan 2 (D2) i dan 4 (D4) za Bioplex analizu (IL2, IL4, IL6, IL8, IL10, GM-CSF, IFNg, TNFa). Ćelije su obojaee u D4 za CD4, CD8, CD25 i abTCR eksprimiranje.

[0191] Rezultati, prikazani na Slikama 5-8, pokazuju da se H66 S298N/T299A/Y300S ponašao slično H66 deltaAB u svim testovima baziranim na ćelijama, pokazujući minimalnu T-ćelijsku aktivaciju pomoću CD25 eksprimiranja, vezivanje za abTCR (sa neznatno različitom kinetikom do deltaAB) i minimalno oslobađanje citokina na vremenskim tačkama D2 i D4. S298N/T299A/Y300S mutant time eliminiše efektorsku funkciju efektivno kao i deltaAB mutacija.

Primer 5: Priprema i karakterizacija dizajnirane Fc varijante u kičmi anti-CD52 antitela.

[0192] Pored H66 anti-αβTCR antitela, S298N/Y300S mutacija je takođe napravljena u kičmi anti-CD52 antitela (klon 2C3). Ovaj mutant je zatim ispitivan kako bi se utvrdilo da li je posmatrana efektorska funkcija modulacije koja se vidi u S298N/Y300S H66 anti-αTCR antitelu bila konzistentna u drugoj kičmi antitela.

5A. Stvaranje izmenjenih varijanti glikozilacije 2C3 anti-CD52 antitela

[0193] Prvo, S298N/Y300S 2C3 varijanta DNK je pripremljena mutacijom brze promene pomoću pENTR_LIC_IgG1, i WT 2C3 VH je kloniran u mutirani vektor pomoću LIC.

Mutanti pune dužine klonirani su u pCEP4(-E+I)Dest vektor eksprimiranja pomoću Gateway tehnologije. Mutacije su potvrđene sekvencionisanjem DNK, a sekvence su prikazane u Tabeli 11. Mutanti su tada transfektovani u HEK293-EBNA ćelije u formatu ploče sa 6 komorica i protein je prečišćen iz kondicioniranog medijuma. Anti-CD522C3 antitelo divljeg tipa proizvedeno je paralelno kao kontrola. Utvrđeno je da je nivo eksprimiranja 0,1 μg/mL korišćenjem SD-PAGE i Western blot analize (Slika 9A). Eksprimiranje mutanata u urednim kondicioniranim medijumima takođe je mereno hvatanjem proteina A na Biacore.

Koncentracija je utvrđena korišćenjem reakcije disocijacije nakon injekcije u trajanju od šest minuta na imobilizovani protein A. Korišćen je WT 2C3 proizveden od CHO serijski razblažen u medijumima od 90 μg/mL do 1,5ng/mL kao standardna kriva. Koncentracije su izračunate u unutar približno 0,2 μg/mL kalibracionom krivom koristeći 4-parametarsko uklapanje. Relativni nivoi eksprimiranja bili su niski i generalno se slažu sa Western Blot podacima (Slika 9B).

Tabela 11: Sekvence anti-CD52 klon 2C3 antitela

5B. Analiza glikozilacije koristeći PNGazuF

[0194] Za procenu dodatnih glikozilacionih mesta uvedenih mutacijom, obogaćen mutant S298N/Y300S bio je de-glikoziliran sa PNGazom F. Nije pokazao nikakvu vidljivu promenu u molekulskoj težini, što ukazuje na to da nema dodatnih ugljenih hidrata (Slika 10).

Pripreme malih razmera su izvedene kako bi se ovi mutanti pročistili za dalju karakterizaciju i rezultati su potvrdili da nije bilo dodatnih ugljenih hidrata prisutnih na mutantu S298N/Y300S (Slika 11).

5C. Karakteristike vezivanja mutacija 2C3 anti-CD52 antitela na ljudski FcγRIIIa koristeći Biacore

[0195] Biacore se takođe koristi za karakterizaciju svojstava vezivanja antigen, FcyRIII i vezivanja prečišćenih antitela (pogledati Slike 12, 13 i 14). S298N/Y300S 2C3 varijanta vezana za CD52 peptid čvrsto i senzor vezivanja nije se razlikovao od kontrole divljeg tipa, što prikazuje da ova mutacija ne utiče na njegovo vezivanje antigena (Slika 12A).

[0196] Kako bi se analizirala Fc efektorska funkcija, FcγRIII receptor (Val158) je korišćen u studijama vezivanja. Mutantno i kontrolno antitelo divljeg tipa razređeni su do 200nM i injektirani u FcyRIIIa uhvaćen HPC4-oznakom. Vezivanje FcγRIII je bilo skoro neprimetno za mutaciju S298N/Y300S, što ukazuje na gubitak efektorske funkcije ove varijante (Slika 12B i Slika 14A). Za dalje ispitivanje Fc efektorske funkcije, FcγRIII receptor (Phe158) takođe je korišćen u studijama vezivanja. Mutantna i kontrolna antitela divljeg tipa su razređena na 200nM i ubrizgana u FcyRIIIa uhvaćen HPC4-oznakom. Vezivanje FcγRIII je bilo skoro neprimetno za S298N/Y300S mutantom, što ukazuje na gubitak efektorske funkcije sa varijantom Phe158 (Slika 14B). Na kraju, Biacore je korišćen za poređenje FcRn veznih svojstava pročišćenih proteina. Mišji i SEC-prečišćeni ljudski FcRn-HPC4 su imobilisani na CM5 čipu preko aminskog spajanja. Svako antitelo je razređeno na 200, 50 i 10 nM i injektirano preko receptora. Campath, CHO-proizvedeni WT 2C3 i CAMAP tretirani sa DEPC uključeni su kao pozitivne i negativne kontrole. Ovi podaci pokazuju da se mutant vezuje i za FcRn receptore čoveka i miševa sa istim afinitetom kao kontrolna antitela divljeg tipa i da verovatno nema promenu u poluživotu u cirkulaciji ili drugim farmakokinetičkim osobinama (pogledati Sliku 12C, Sliku 13A i B). Shodno tome, mutacija S298N/Y300S primenjuje se na antitela uopšte, kako bi se smanjila ili eliminisala neželjena Fc efektorska funkcija, na primer putem angažovanja ljudskih Fcγ receptora.

Primer 6: Detekcija imunog kompleksa u cirkulaciji u S298N/Y300S mutantu.

[0197] Detekcija imunog kompleksa u cirkulaciji takođe je istražena pomoću testa vezivanja C1q za mutaciju S298N/Y300S i WT kontrole. Visoko vezujuće Costar 96-komorične ploče obložene su preko noći na 4°C sa 100μl dvostrukog serijskog razblaženog 2C3 Abs u koncentracijama u rasponu od 10 – 0,001 μg/ml u puferu za premazivanje (0,1M NaHO3 pH 9,2). ELISA analiza pokazala je da je vezivanje C1q smanjeno za S298N/Y300S mutant u poređenju sa WT (Slika 15A). Vezivanje anti-Fab Ab na obloženi 2C3 Abs potvrdilo je ekvivalentno premazivanje bunara (Slika 15B).

Primer 7: Separacija i analiza mutanta S298N/Y300S koristeći izoelektrično fokusiranje.

[0198] Za karakterizaciju S298N/Y300S mutanata korišćeno je pH 3-10 izoelektrično fokusiranje (IEF). Za S298/Y300S se pokazao da imaju više negativnih naelektrisanja, a samim tim i verovatno više molekula sijalinske kiseline (Slika 18A). I S298N/Y300S mutanti i WT 2C3 pokazali su neoštećenim MS da imaju G0F i G1F kao dominantnu vrstu glikozilacije (Slika 18 B i D, respektivno).

Primer 8: Afinitet vezivanja antigena za S298N/Y300S.

[0199] Biacore je korišćen za upoređivanje afiniteta vezivanja antigena WT anti-CD522C3 Ab i S298N/Y300S mutanta koji su pripremljeni i prečišćeni i manjim (Slika 16) i većim (Slika 17) eksprimiranjem. CM5 čipovi imobilisani sa CD52 peptidom 741 i kontrolnim peptidom 777. Antitela su serijski razblažena dvostruko od 60 do 0,2nM u HBS-EP i zatim su ubrizgana preko površine čipova u trajanju od 3 min, nakon čega je došlo do 5 minuta disocijacije u puferu sa brzinom protoka od 50μl/min. Površina je zatim regenerisana impulsom od 40mM HCl. Ove analize su izvedene u duplikatu i pokazuju da antitela S298N/Y300S i WT 2C3 pokazuju uporedivo vezivanje CD52 peptida.

[0200] Platforma za prikazivanje medijuma je dizajnirana da testira funkcionalna svojstva vezivanja pre prečišćavanja, kako bi se prikazala antitela nastala tokom malih transfekcija. Ovi testovi su izvedeni koristeći oktet (Slika 19A) kako bi se odredila koncentracija i korišćeni su biosenzori proteina A i GLD52 standardna kriva. Uzorci su razblaženi na 7,5 i 2nM u HBS-Ep za poređenje vezivanja CD52 koristeći Biacore (Slika 19B). Rezultati testa vezivanja peptida pokazali su da i mutacija S298N/Y300S i VT2C3 antitela imaju uporedivo vezivanje CD52 peptida. Štaviše, ove analize pokazuju da Octet i Biacore dobro rade kako bi predvideli vezivanje antigena putem antitela iz malih transfekcija.

Primer 9: Priprema S298N/Y300S, S298N/T299A/Y300S i N297Q/S298N/Y300S mutanta promenjene glikozilacije u dodatnim antitelima.

[0201] Pored anti-αβ-TCR antitela i 2C3 anti-CD-52 antitela, mutacije S298/Y300S, S298N/T299A/Y300S i N297Q/S298N/Y300S su dizajnirane u drugim kičmama antitela kako bi potvrdili da dodatna tandemska mesta glikozilacije mogu biti uvedene u sekvence varijabilnog domena teških lanaca. Alternativno glikozilovani anti-CD-5212G6 i anti-Her2 mutanti su navedeni u Tabelama 12 i 13.

Tabela 12: Sekvence anti-CD52 klona 12G6 antitela

Tabela 13: Sekvence anti-Her2 antitelo

Primer 10. Generisanje izmenjenih antitela koja sadrže reaktivne glikanske grupe [0202] U cilju generisanja antitela koja sadrže glikanske grupe koje su sposobne za reagovanje sa derivatizovanim efektorskim delovima, anti-HER antitelo je prvo glikozilovano in vitro koristeći glikoziltransferazu i relevantne donatore UDP šećera. Na primer, za uvođenje ostataka sijalinske kiseline, donatorska antitela su prvo glikozilovana sa βgalaktoziltransferazom, praćena sijalilacijom sa α2,6-sijaliztransferazom prema postupcima Kaneko i dr. (Kaneko, Y., Nimmerjahn, F., and Ravetch, J. V. (2006) Anti-inflammatory

1

activity of immunoglobulin G resulting from Fc sialylation. Science 313, 670-3). Reakcija je izvedena u koraku sinteze u jednoj poseti koristeći β-galaktoziltransferazu (50mU/mg, Sigma) i α2,6-sijaliztranafreazu (Sug/mg, R & D sistem) sa nukleotidnim substratima donora šećera, UDP-galaktozom (10mM) i CMP -sijalinskom kiselinom (10mM) u 50mM MES puferu (pH 6,5) koji sadrži 5mM MnCl2. Reakciona smeša koja sadrži 5 mg/ml anti-HER2 antitela je inkubirana tokom 48 sati na 37°C. Sijalizacija je potvrđena korišćenjem MALDI-TOF MS analize permetiliranih glikana koji se oslobađaju iz antitela sa analizom sadržaja sijalinske kiseline PNGaza F, pomoću Dionex HPLC i lektinskog blotiranja sa SNA, lektinom specifičnim za α2,6-sijalinsku kiselinu.

[0203] MALDI-TOF analiza glikana oslobođenih od strane PNGaze F tretmanom sijaliziranog anti-HER2 antitela pokazala je da su prirodni glikani potpuno remodelirani uglavnom monosijalizovanom biantenarnom strukturom, A1F (Slika 27A) zajedno sa malom količinom disijalizovanih vrsta. Tretman antitela sa većim količinama α2,6-sijaliztransferaze proizveo je više homogenih populacija A1F glikoforma, što ukazuje na to da ili aktivnost enzima ili lokalna glikanska stanica mogu sprečiti potpunu sijalilaciju. Sadržaj sijalinske kiseline je određen da je ~ 2 mol na mol antitela, što je u skladu sa A1F glikanom kao glavnom glikoformom vrstom (Slika 27B). Lektin blotovanje sa SAN lektinom, Sambucus nigra agglutinin specifična za α2,6-vezanu sijalinsku kiselinu, potvrdila je da je sijalinska kiselina prisutna u konfiguraciji α2,6-veze (Slika 27C).

[0204] Kao zaključak, iako su izvorni proteinski glikani donekle heterogeni, remodeliranje kroz galaktozil i sijalil transferaze daje skoro homogeno antitelo sa monosijalizovanim ali potpuno galaktoziliranim biantenarnim glikanom (A1F). Uvođenje samo ~ 1 sijalinske kiseline na dva galaktozna akceptora na svakom razgranatom glikanu može biti zbog ograničene dostupnosti jedne od galaktoza iz glikana koji se često zakopavaju u antitelo ili ne-kovalentne interakcije glikana sa površinom proteina.

Primer 11. Oksidacija izmenjenih antitela koja sadrže reaktivne glikanske delove [0205] Kada je sijalizacija potvrđena, ispitivana je oksidacija sijalizovanog anti-HER2 antitela u toku procesa sa različitim koncentracijama perjodata (0,25 do 2mM). Sijalizovano antitelo je prvo izmenjivano u puferu u 25mM Tris-HCl (pH 7,5), koji sadrži 5mM EDTA, nakon čega sledi razmena puferom sa PBS puferom. Zatim je smeša antitela primenjena na proteina A Sefaroza kolonu koja je prethodno usaglašena sa PBS puferom. Nakon što je

2

kolona isprana sa 15 kolonskih zapremina PBS, 15 kolonskih zapremina PBS koji sadrži 5 mM EDTA i 30 kolonskih zapremina PBS, tada je eluirano sa 25 mM citratnog fosfatnog pufera (pH 2,9). Eluati su odmah neutralisani dibaznim puferom fosfata i antitelo koncentrovano pomoću Amicon ultra od Millipore. Posle prečišćavanja, sijalizovano anti-HER2 antitelo potom je oksidovano natrijum-perjodatom (Sigma) u 100mM natrijumacetatnom puferu (pH 5,6) na ledu u mraku tokom 30 minuta, a reakcija je ugašena sa 3% glicerola na ledu za 15 minuta. Proizvod je desaliran i razmenjen u 100mM natrijum acetatu (pH 5,6) sa 5 krugova ultrafiltracije preko 50kDa Amicons. Slika 28A prikazuje analizu sadržaja sijalinske kiseline sijalizovanih antitela titriranih različitim količinama perjodata. Kompletna oksidacija ostataka sijalinske kiseline postignuta je u perjodnoj koncentraciji iznad 0,5 mM. Zaista, perjodna koncentracija niža od 0,5 mM bila je dovoljna kako bi se u potpunosti oksidirala uvedena sijalinska kiselina. Shodno tome, odabrana je 1mM koncentracija perjodata za oksidaciju sijalizovanog konjugaciju leka i antitela.

[0206] Oksidacija može imati negativne efekte na integritet antitela. Za oksidaciju ostataka metionina, uključujući Met-252 i Met-428, locirane u Fc CH3 regiji, blizu mesta vezivanja FcRn, poznato je da utiču na vezivanje FcRn koje je kritično za produžavanje poluživota serumskih antitela (Wang, W., i dr. (2011) Impact of methionine oxidation in human IgG1 Fc on serum half-life of monoclonal antibodies. Mol Immunol 48, 860-6). Shodno tome, kako bi se ispitali potencijalni neželjeni efekti oksidacije perjodata na ostatke metionina (npr., Met-252) koji su kritični za FcRn interakciju, stanje oksidacije sijalizovanog antitela je određeno pomoću LC/MS analize digestije tripsin peptida. Ova analiza otkriva ~30% oksidaciju Met-252 i <10% oksidaciju Met-428 posle tretmana sijalizovanog trastuzumaba sa 1mM perjodatom. kako bi se utvrdio uticaj ovog stepena oksidacije metionina na FcRn vezu, kinetika vezivanja FcRn za svako antitelo ocenjivana je površinskom plazmonskom rezonancom (BIACORE). Ova analiza je otkrila da je oksidaciono stanje korelirano sa manjim gubitkom vezivanja FcRn (12% i 26% redukcija Ka za mišji i ljudski FcRn, pogledati Slike 28B i 28C respektivno). Zabeleženo je smanjenje od ~ 25% u odnosu na Ka za ljudsku FcRn, koji nema efekta na polu-život u serumu kod ljudskog FcRn transgenskog miša, pošto jedna jedinstveno netaknuto mesto FcRn na svakom antitelu dovoljno da obezbedi funkcionalnost i PK prednost (Wang i dr., Id).

[0207] Ukratko, ovi podaci ukazuju na to da uvođenje ostataka sijalinske kiseline osetljive na perjodant pomoću sijaliztransferaze omogućava korišćenje mnogo niže koncentracije perjodata, što rezultuje minimalnim neželjenim efektima na interakcije antitela-FcRn i integritet antitela, kao što je procenjeno agregacijom (≤1% ). Prema tome, upotreba sijalizovanih antitela prema postupcima iz ovog pronalaska pruža se širi prozor oksidacionih uslova koji omogućavaju ponovljivu generaciju aktivnih glikokonjugata bez uticaja na poluživot u serumu.

[0208] Galaktoza u mutantu hiperglikozilovanog antitela takođe se može oksidisati specifično koristeći oksidazu galaktoze kako bi se generisala aldehidna grupa za konjugaciju. Za potvrđivanje ovog pristupa, A114N anti-TEM1 antitelo je koncentrovano do 13-20 mg/ml, a zatim se tretira sa 20mU/mg sialidaze u PBS tokom 6 sati na 37°C. Desializovani proizvod je potom oksidovan sa oksidazom galaktoze („GAO“), prvo sa 5 ug GA/mg proteinom preko noći na 37°C, nakon čega sledi dodavanje 2 ug GAO/mg proteina i inkubacija dodatnih 5 sati. Dodat je natrijum acetat kako bi se pH podesio na 5,6 (0,1V/v, pH5.6), i DMSO je dodat da se postigne konačna koncentracija reakcije od 16%, dodata su pre konjugacije. Slično je desijalizovan mutant hiperglikozilacije A114N anti-HER antitela (15mg/ml) sa sialidazom (20mU/mg) i oksidovana sa 5ug GAO po mg proteina u jednoj reakciji preko noći na 37°C.

Primer 12. Sinteza reaktivnih efektorskih delova

[0209] Kako bi se olakšalo konjugovanje sa glikoformima antitela izvedenih od aldehida iz ovog pronalaska, kandidati za efektorske delove leka (npr. Momomethyl Auristatin E (MMAE) and Dolastatin 10 (Dol10)) su izvedeni sa aminooksi-cistamidom da bi sadržali funkcionalne grupe (npr., aminooksi-cis) posebno reaktivne sa aldehidom.

[0210] Ukratko, za stvaranje aminokisi-cistamida kao početnog materijala, dodat je S-Tritil-L-cisteinamid (362 mg, 1 mmol) u 3 mL DMF rastvora t-BOC-aminooksisirćetna kiselina N-hidroksisukcinimid estra (289 mg, 1 mmol). Reakcija je završena nakon 3 sata, što se vidi iz HPLC analize. Reakciona smeša je naknadno razblažena sa 30 mL dihlorometana i isprana je sa 0,1 M rastvorom natrijum bikarbonata (2 x 20 mL), vode (2 x 20 mL) i slanim rastvorom (2 x 20 mL). Rastvor je osušen iznad anhidrovanog natrijum sulfata, filtriran i koncentrisan do suvog. Ovom osušenom ostatku dodato je 3 mL TFA, nakon čega sledi 150 µL trietilsilana. Dobijeni rastvor se taloži iz t-butil metil etra i proces se ponavlja tri puta. Nakon filtracije, ostatak je osušen pod sniženim pritiskom, dajući 205 mg bele čvrste supstance (67% prinosa). Jedinjenje je korišćeno za sledeći korak bez daljeg prečišćavanja.

4

[0211] Kako bi se generisao amoksio-derivatizovan MMAE (aminooksi-Cys-MC-VC-PABC-MMAE), 30,1 mg aminokis-cistamida (0,098 mmol, 2 ekvivalent) je kombinovano sa 64,6 mg MC-VC-PABC-MMAE (0,049 mmol) i 100 μL trietilamina u 3 mL DMF. Dobijena reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi 15 minuta, čime je reakcija završena prema HPLC analizi. Jedinjenje je prečišćeno preparativnom HPLC, dajući 45 mg (62%) željenog proizvoda u obliku čvrste supstance bele boje. HPLC analiza sa reverznom fazom predložila je čistoću jedinjenja da bude> 96%. ESI je izračunat za C73H116N14O18S (MH)<+>1509,8501; pronađeno, m/z 1509,8469.

[0212] Za generisanje aminokis-derivatizovanog Dol10 (aminooksi-Cys-MC-VC-PABC-PEG8-Dol10), 7.4 mg (0.024 mmol, 3 ekv.) Aminokis-cistamida, 12 mg (0.008 mmol) MC-VC-PABC- PEG8-Dol10 i 30 μL trietilamina su kombinovani u 3 mL DMF. Reakcija je završena u roku od 15 minuta prema HPLC analizi. Priprema HPLC prečišćavanja rezultirala je 6.2 mg (46%) željenog proizvoda kao čvrsta supstanca bele boje. Analiza HPLC analize sa reverznom fazom ukazuje na čistoću jedinjenja od> 96%. ESI izračunato za C80H124N16O19S2 (MH)+ 1678.0664; našao, m/z 1678.0613.

Primer 13. Konjugacija reaktivnih efektorskih delova posredovana sijalinskom kiselinom (SAM)

[0213] Nakon desalinizacije, lek-veznici iz Primera 11 su kombinovani sa oksidovanim, sijalizovanim antitelima iz Primera 10 u 75% DMSO u koncentraciji od 25 mM kako bi se postigao molarni odnos od 24:1 molekul-veznika i antitela, i konačna koncentracija antitela na 5 mg/ml. Smeša je inkubirana preko noći na sobnoj temperaturi. Neuključeni lekoviveznici i bilo koji besplatni lekovi su uklonjeni koristeći BioBeads. Proizvod je bio zamenjen puferom u Histidin-Tween puferu korišćenjem PD-10 kolona i sterilnom filtriranom.

Utvrđeni su nivoi endotoksina i postignut je manje od 0,1EU/mg ADC za in vivo ispitivanje.

[0214] Slika 29A-C prikazuje hromatograf hidrofobne interakcije (HIC) različitih sijalizovanih antitela (anti FAP B11 i G11 i anti-HER2 antitela iz primera 11) glikonjugovano na AO-MMAE. Sijalizovano HER2 antitelo je takođe konjugovano sa lekom-veznikom, AO-Cys-MC-VC-PABC-PEG8-Dol10 (Slika 29D). Ova analiza otkriva da su uglavnom jedan ili dva konjugata leka po antitelu sa lek-antitelo (DAR) odnosom u rasponu od 1,3-1,9. Povećano vreme zadržavanja Dol10 glikokonjugata (Slika 29D) u poređenju sa MMAE glikokonjugatom (Slika 29C) verovatno zbog veće hidrofobnosti Dol10.

[0215] LC-MS analiza je takođe sprovedena sa anti-HER antitelom konjugovanim sa dva različita lek-veznika (AO-MMAE ili AO-PEG8-Dol10) na skali od 30mg. Ova analiza pokazala je slične vrednosti DAR od 1,7 i 1,5 posle konjugacije, što je uporedivo sa HIC analizom. Hromatografija za isključivanje veličine (SEC) pokazala je vrlo nizak nivo (1%) agregata u ovim konjugatima.

Primer 14. Konjugacija reaktivnih efektorskih delova posredovana sa galaktozom (GAM)

[0216] Galaktoza aldehid, generisan sa oksidazom galaktoze na A114N antiTEM1 hiperglikozilacionom mutantnom antitelu kao što je opisano u Primeru 11, je konjugovan sa 24 molarnim višak aminooksi-MC-VC-PABC-MMAE lek-veznika preko antitela sa inkubacijom preko noći na 25°C, dajući ADC konjugat sa DAR od 1,72.

U antiHER antitelo tretirano sa oksidazom galaktoze, pripremljenim kao što je opisano u Primeru 11, dodata je jedna desetina zapremine reakcije 1M natrijum acetata, pH5,6, je dodat da se pH podesi na 5,6, i DMSO je dodat dodaje se napravi finalna koncentracija od 14% pre dodavanja 24 ekvialenta aminooksi MC-VC-PABC-MMAE lek veznika. Reakcije su inkubirane tokom noći na sobnoj temperaturi. Slobodni lek i lek-veznik su uklonjeni sa Biobeads i proizvodni pufer je razmenjen od strane SEC (65% prinosa). Konjugat proizvoda analiziran je pomoću HIC. Kao što je prikazano na Slici 30, AO-MMAE je bio konjugovan do ~ 60% molekula.

Primer 15. In vitro ADC analiza proliferacije ćelija

[0217] The in vitro aktivnost anti-HER i anti-FAP glikokonjugatnih molekula iz ovog pronalaska takođe su upoređivani sa odgovarajućim konjugatom tiola koji sadrži istu grupu lekova povezanih preko tiolnih veza sa zglobnim regijama cisteina istog donorskog antitela. Konjugati tiola sadržali su otprilike dva puta veći broj lekova po antitelu (DAR) nego glikokonjugati. Konjugacija zasnovana na tiolu je izvedena kao što je opisano kod Stefano i dr (Methods in Molecular Biology 2013, in press). Her2+ SK-BR-3 i Her2- MDA-MB-231 ćelijske linije su zatim korišćene za procenu relativne efikasnosti svakog ADC. Rezultati ove analize prikazani su u Tabeli 15 u nastavku.

Tabela 15. EC50 poređenje glikokonjugata i tiol konjugata

[0218] Slika 31 prikazuje upoređivanje potencijala in vitro anti-HER glikokonjugata i njegovog konjugata tiola kola. Važnost ćelija je utvrđena posle 72 sata izlaganja konjugata Her2 antigen eksprimirajućim (SK-BR-3) ćelijama (Slika 31A i C) ili ne-ekspresivnih (MDA-MB-231) ćelija (Slika 31B i D). ADC su sadržali ili MMAE ili PEG8-Dol10 koji su povezani sa glikanom („gliko“) ili konvencionalnom hemijom u cilju kretanja u regiju („tiol“). Kao što je prikazano na Slikama 30A i C, ~ 2 puta niži EC50je primećen za konjugate tiola u poređenju sa glikokonjugatima, što je u skladu sa dvostrukim višim DAR u odnosu na druge. Nije bilo toksičnosti sa Her2-ćelijskom linijom sa bilo kojim antitelom do 100g/ml.

[0219] Slični trendovi su takođe primećeni u proliferaciji ćelija za ADC pripremljenog sa antitelima protiv tumora antigena (FAP) koji je visoko izražen reaktivnim stromalnim fibroblastima kod epitelnih karcinoma, uključujući rak debelog creva, pankreas i rak dojke (Teicher, B. A. (2009) Antibody-drug conjugate targets. Curr Cancer Drug Targets 9, 982-1004). Ovi konjugati su ponovo pripremljeni konjugovanjem ili aminooksi MMAE lekveznika ili maleimido MMAE lek-veznik za glikane ili grupu tiola. Testovi proliferacije ćelija ovih konjugata pokazali su da EC50konjugata tiola ima ~100 puta veću potenciju na CHO ćelijama transfektovanim sa ljudskim FAP nego što su iste ćelije koje nemaju FAP izraz kao što je prikazano na Slici 32, što prikazuje poređenje in vitro potencije anti FAP B11 glikokonjugata i tiol konjugata. Važnost ćelija je utvrđena nakon izlaganja konjugata CHO ćelijama transfektovanim sa ili bez FAP antigena. ADC sadrže MMAE vezan za glikane („gliko“) ili konvencionalnom hemijom za zglobne regije cisteina („tiol“). Imaite na umu da je ~ 2-puta niži EC50za tiol u poređenju sa glikokonjugatima konzistentan sa relativnim količinama isporučenog leka po antitelu uz pretpostavku slične efikasnosti za vezivanje cilja i interniranje kod antigena koji eksprimiraju CHO ćelije. Paralelno je analiziran glikokonjugat anti FAP (B11) ADC sa DAR od 1,5 kao što je prethodno opisano i pokazao je ~ 2-puta veći EC50nego komparator tiol konjugata (DAR 3.3).

[0220] Kao što je prikazano na Slici 36, slični trendovi su primećeni u analizi proliferacije ćelija za ADC, pripremljenoj sa anti-HER antitelom koje nosi A114N hiperglikozilacionu mutaciju i AO-MMAE kao što je opisano u Primeru 14, kada se analiziraju na ćelijama koje eksprimiraju SK-BR-3 ili MDA-MB-231 ćelije. A114N glikokonjugat jasno pokazuje pojačanu toksičnost ćelija protiv ćelijske linije koja eksprimira Her2 u odnosu na onu koja ga neeksprimira. Relativna toksičnost u odnosu na SialT glikokonjugat pripremljen sa istim antitelom je u skladu sa manjim opterećenjem lekom ovog preparata.

[0221] Analiza proliferacije ćelije takođe je izvedena za ADC pripremljenog sa anti-TEM1 antitelom koji nosi A114N hiperglikozilacionu mutaciju i AO-MMAE pripremljen kao što je opisano u Primeru 14. Viša toksičnost je primećena sa ćelijskim linijama SJSA-1 i A673 koje eksprimiraju TEM1 u poređenju sa ćelijskom linijom MDA-MB-231 koja ga ne eksprimira. Nivo toksičnosti u poređenju sa konvencionalnim konjugatom tiola sa istim antitelom bio je u skladu sa opterećenjem leka (DAR) ovog preparata.

[0222] Ukratko, konjugacija lekova specifična za mesto kroz glikane sa rastvorljivim veznicima stvara ADC sa toksičnostima i in vitro efikasnošću koje su ekvivalentne konvencionalnim konjugatima na bazi tiola, što se pokazalo korišćenjem različitih antitela i različitih lek-veznika. Osim toga, ispod 2mM perjodata, nivo konjugacije lekova korelira sa smanjenjem sijalinske kiseline. Povećanje koncentracije perjodata iznad 2mM daje malo koristi, kako se očekuje od potpune konverzije sijalinske kiseline u oksidovan oblik.

Međutim, pod svim uslovima, broj lekova po antitelu bio je nešto niži od sadržaja sijalinske kiseline, što ukazuje na to da neke od oksidovanih sijalinskih kiselina slično nisu dostupne za spajanje, bilo zbog skrivenosti ili iz drugog razloga zahvaljujući steričnoj prepreci koja proizilazi iz najvećeg dela lek-veznika.

Primer 16. In vivo karakterizacija antitelo lek konjugata

[0223] Efikasnost anti-HER glikokonjugata takođe je procenjena u režimu ksenografta tumorskih ćelija Her2+ i upoređena je sa uporednicima konjugata tiola sa ~ 2 puta većom DAR. Beige/SCID miševi su implantirani sa SK-OV-3 Her2+ tumorskim ćelijama kojima je dozvoljeno da uspostave tumore - 150 mm<3>pre početka lečenja. ADC u dozi od 3 ili 10 mg/kg su injektirani kroz repnu venu na dane 38, 45, 52 i 59. Bilo je ~ 10 miševa po grupi. Izmerena je tumorska zapremina miševa u različitim grupama i zabeležen je njihov opstanak. Kriva preživljavanja je iscrtana na osnovu Kaplan-Majer postupka.

[0224] Slika 33 prikazuje poređenje efikasnosti in vivo anti-HER glikokonjugata i tiol konjugata u modelu ksenografta Her2+ tumorskih ćelija. Beige/SCID miševi implantirani sa SK-OV-3 Her2+ tumorskim ćelijama dozirani su MMAE (Slika 33 A i B) i PEG8-Dol10 (Slika 33 C i D) koji sadrže glikokonjugate ili uporedne konjugate tiola sa ~ 2 puta većim DAR. Kinetika rasta tumora konjugata MMAE je prikazana u Slici 33A. U ovom slučaju, glikokonjugat je pokazao značajno veću efikasnost od samog gola antitela (crno), ali manje od uporednog konjugata tiola koji ima ~ 2 puta veći DAR (zeleno). Glikokonjugat MMAE pokazao je značajnu regresiju tumora i kašnjenje rasta tumora za ~ 20 dana (Slika 33A) i ~ 2 puta povećanje preživljavanja od prve doze (Slika 33B). Tiol MMAE konjugat je pokazao skoro potpuno suzbijanje tumora kod iste doze ADC (10 mg/kg).

[0225] Takođe je utvrđena in vivo efikasnost PEG8-Dol10 glikokonjugata („Glico Dol10“) i komparator konjugata tiola sa ~ 2-puta većim DAR („Tiol Dol10“) u istom modelu ksenografta Her2+ tumorskih ćelija. Oba konjugata su pokazala manju efikasnost nego MMAE konjugati kao što je prethodno opisano. Međutim, aminooksi-PEG8-Dol10 glikokonjugat („Gliko Dol10“) na 10 mg/kg pokazao je 15-dnevno odlaganje rasta tumora (Slika 33C) i ~ 20 dana (1,7 puta) povećanje preživljavanja nakon prve primene (Slika 33D). Konjugat tiola je bio efikasniji u istoj dozi, što pokazuje dvostruko povećanje preživljavanja. U nižim dozama (3 mg/kg), konjugat tiola pokazao je manju efikasnost od glikokonjugata na 10 mg/kg. Ova doza odgovara dozi od 80 umol PEG8-Dol10 po kg, u poređenju sa 110 umol PEG8-Dol10 leka na kg doze za glikokonjugat.

[0226] Ovi podaci pokazuju da konjugacija specifičnih lokacija na sijalinskoj kiselini glikana antitela daje molekule sa istim potencijalom kao što su ADCi generisani putem hemije na bazi tiola. Donekle niža in vivo efikasnost verovatno proističe iz manjeg broja lekova koje svako antitelo prenosi u tumorske ćelije pomoću internalizacije svakog antitelom vezanog antigena. Iako nismo upoređivali ove glikokonjugate sa tiol konjugatima istog DAR, efikasnost koja je primećena u različitim dozama dva ADC-a koja predstavljaju uporedive nivoe primenjenog leka pokazuju da glikokonjugati imaju uporedivu intrinsičnu efikasnost kao njihovi tiol uporedni parovi, što ukazuje na štetan efekat konjugacije na ovom mestu. Štaviše, doza od 10 mg/kg Dol10 glikokonjugata koji je uveo samo 28% više lekova obezbedio je dvostruki porast preživljavanja preko konjugata tiola (na 3 mg/kg), što ukazuje na to da ovi konjugati čak mogu pružiti superiorne efikasnosti na istom DAR. S obzirom na očigledno ograničenje u inkorporaciji sijalinske kiseline kod domaćih glikana, veće opterećenje lekova može se postići velikom brojem različitih strategija uključujući upotrebu razgranatih lančanih veznika ili uvođenje dodatnih mesta glikozilacije i korišćenjem istog postupka.

Claims (23)

1. Patentni zahtevi 1. Izolovano antitelo koje sadrži ljudski IgG Fc domen, gde ljudski IgG Fc domen sadrži: glikozilovan asparaginski ostatak na aminokiselinskom položaju 298, prema EU numeraciji; i ili serinski ili treoninski ostatak na aminokiselinskom položaju 300, prema EU numeraciji.
2. 2. Antitelo patentnog zahteva 1, koje dalje sadrži alaninski ostatak na aminokiselinskom položaju 299, prema EU numeraciji.
3. 3. Antitelo patentnog zahteva 1, koje dalje sadrži glutaminski ostatak na aminokiselinskom položaju 297, prema EU numeraciji.
4. 4. Antitelo bilo kog od prethodnih patentnih zahteva, gde je bočni lanac asparaginskog ostatka povezan za glikan kroz β-glikosilamidnu vezu;
5. 5. Antitelo patentnog zahteva 4, gde glikan je biantenarni glikan.
6. 6. Antitelo patentnog zahteva 4 ili 5, gde glikan je prirodni sisarski glikoform;
7. 7. Antitelo bilo kog patentnog zahteva 4-6, gde glikan sadrži reaktivnu aldehidnu grupu;
8. 8. Antitelo bilo kog patentnog zahteva 4-6, gde glikan sadrži oksidovan saharidni ostatak koji sadrži reaktivnu aldehidnu grupu.
9. 9. Antitelo patentnog zahteva 8, gde oksidovan saharidni ostatak je terminalna sijalinska kiselina ili galaktoza.
10. 10. Antitelo bilo kog patentnog zahteva 4-6, gde je glikan povezan na efektorski deo.
11. 11. Antitelo patentnog zahteva 10, gde efektorski deo je citotoksin.
12. 12. Antitelo patentnog zahteva 11, gde je citotoksin izabran iz grupe citotoksina koju čine:

    gde R1je alkil, aril, alkoksi ili ariloksi; R2i R3su alkil ili aril.
13. 13. Antitelo patentnog zahteva 10, gde efektorski deo je agens za detekciju
14. 14. Antitelo bilo kog od patentnih zahteva 10-13, gde je efektorski deo vezan preko oksimske ili hidrazonske veze za saharidni ostatak glikana.
15. 15. Antitelo patentnog zahteva 14, gde je saharidni ostatak terminalna sijalinska kiselina ili galaktozni ostatak glikana.
16. 16. Antitelo bilo kog od patentnih zahteva 10-15, gde efektorski deo sadrži pH-osetljiv veznik, disulfidni veznik, enzimski-osetljiv veznik ili drugi razdvojivi veznik.
17. 17. Antitelo patentnog zahteva 1, gde glikozilovan asparaginski ostatak je povezan na efektorski deo leka radi formiranja konjugata antitelo lek (ADC).
18. 18. Sastav koji sadrži antitelo bilo kog od prethodnih patentnih zahteva i farmaceutski prihvatljiv nosač ili ekscipijent.
19. 19. Efikasnu količinu sastava patentnog zahteva 18 za primenu kao lek.
20. 20. Izolovan polinukleotid koji kodira antitelo bilo kog patentnog zahteva 1-9.
21. 21. Vektor koji sadrži polinukleotid patentnog zahteva 20.
22. 22. Ćelija domaćin koja sadrži polinukleotid ili vektor patentnih zahteva 20 ili 21.
23. 23. Postupak pravljenja antitela koje sadrži eksprimiranje polinukleotida patentnog zahteva 20 ili vektora patentnog zahteva 21 u ćeliji.