ES2950509T3

ES2950509T3 - Polipéptidos que contienen Fc con glicosilación alterada y función efectora reducida

Info

Publication number: ES2950509T3
Application number: ES18166377T
Authority: ES
Inventors: Clark Pan; Huawei Qiu
Original assignee: Genzyme Corp
Current assignee: Genzyme Corp
Priority date: 2012-09-12
Filing date: 2013-09-12
Publication date: 2023-10-10
Anticipated expiration: 2033-09-12
Also published as: ECSP15014133A; EP4223783A2; PL2895513T3; IL276866B; IL286766A; EA201590545A1; PH12015500528A1; MA37949A1; EP4223783A3; HUE039337T2; CR20150147A; SI3366705T1; CN104797601A; DK2895513T3; HRP20181354T1; EP2895513B1; FI3366705T3; KR102185151B1; EP3366705A1; AU2013315499A1

Abstract

Se proporcionan polipéptidos de unión (por ejemplo, anticuerpos) y conjugados de fármacos de los mismos, que comprenden un dominio Fc con un perfil de glicosilación alterado y una función efectora reducida. En una realización particular, el dominio Fc comprende: un residuo de asparagina en la posición del aminoácido 298, según la numeración UE; y un residuo de serina o treonina en la posición del aminoácido 300, según la numeración UE. También se proporcionan ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos de unión a antígeno, vectores de expresión recombinantes y células huésped para producir dichos polipéptidos de unión a antígeno. También se proporcionan métodos para usar los polipéptidos de unión a antígenos descritos en el presente documento para tratar enfermedades. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Polipéptidos que contienen Fc con glicosilación alterada y función efectora reducida

Antecedentes

Los anticuerpos con la glicosilación de la Fc reducida o suprimida se han empleado para el tratamiento de enfermedades o trastornos inflamatorios y autoinmunes con el fin de reducir los efectos secundarios o la toxicidad asociada con la función efectora no deseada (véase, p. ej., Chan y Carter, Nat. Reviews Immunology, 2010). Sin embargo, la glicosilación del dominio Fc de anticuerpos es importante para la estructura, la estabilidad y la función de los anticuerpos, y la aglicosilación puede dar como resultado anticuerpos con malas propiedades biofísicas. En consecuencia, hay una necesidad en la técnica de proteínas de unión modificada por ingeniería genética con función efectora reducida, pero que también conservan las propiedades deseables de un dominio Fc glicosilado.

El documento de patente WO 2004/099249 se refiere a variantes de la Fc optimizadas, a procedimientos para su generación, y a anticuerpos y fusiones de la Fc que comprenden variantes de la Fc optimizadas. Shields R et al., J Biol Chem, 2001, 276(9), 6591-6604 se refiere al sitio de unión de IgG1 humana por receptores de la Fc y al diseño de las variantes de IgG1 con unión mejorada a FcyR*.

Compendio

La presente divulgación mejora la técnica anterior proporcionando anticuerpos y, opcionalmente, conjugados de los mismos con fármacos, que comprenden un dominio Fc de IgG humana con glicosilación alterada y función efectora reducida. El dominio Fc de IgG humana comprende: un residuo asparagina glicosilado en la posición 298 de aminoácido, según la numeración de la UE; y un residuo serina o treonina en la posición 300 de aminoácido, según la numeración de la UE. La presente divulgación también proporciona ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos, vectores de expresión recombinante y células anfitrionas para preparar tales anticuerpos. También se proporcionan los anticuerpos divulgados en el presente documento para tratar una enfermedad.

Los autores de la invención han encontrado sorprendentemente que los anticuerpos de la presente divulgación muestran perfiles de la glicosilación alterada que son ventajosos en que suprimen la unión del anticuerpo a los receptores Fcy, alterando así la función efectora del anticuerpo mientras conserva las deseables propiedades biofísicas que son otorgadas por la glicosilación. Por otra parte, el sitio de la glicosilación ligada a N modificada por ingeniería genética en la posición 298 de aminoácido se puede utilizar también como un sitio para la conjugación de restos efectores, tal como fármacos citotóxicos.

En consecuencia, en un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo aislado que comprende un dominio Fc de IgG humana con glicosilación alterada, en donde el dominio Fc de IgG humana comprende: un residuo asparagina glicosilado en la posición 298 d°e aminoácido, según la numeración de la UE; y un residuo serina o treonina en la posición 300 de aminoácido, según la numeración de la UE. En una realización, el anticuerpo comprende además un residuo alanina en la posición 299 de aminoácido, según la numeración de la UE. En otra realización, el anticuerpo comprende, además, un residuo glutamina en la posición 297 de aminoácido, según la numeración de la UE. En una realización, el dominio Fc es un dominio IgG1 Fc.

En una realización, la cadena lateral del residuo asparagina está ligado a un glicano a través de un acoplamiento pglicosilamida. En otra realización, el glicano es un glicano biantenario. En otra realización, el glicano es una glicoforma de mamífero de origen natural.

En otra realización, el anticuerpo tiene una menor afinidad por un receptor Fcγ que un anticuerpo que tiene un dominio Fc nativo. En una realización, el receptor Fcy es FcyRI y/o FcYRIIIa. En otra realización, el anticuerpo tiene una afinidad similar por un receptor FcRn como un anticuerpo que tiene un dominio Fc nativo.

En otra realización, el glicano comprende un grupo aldehído reactivo. En otra realización, el glicano comprende un residuo sacárido oxidado que comprende un grupo aldehído reactivo. En otra realización, el residuo sacárido oxidado es un ácido siálico o galactosa terminales.

En otra realización, el glicano está ligado a un resto efector. En otra realización, el resto efector es una citotoxina. En otra realización, la citotoxina se selecciona del grupo de citotoxinas enumeradas en la Tabla 1. En otra realización, el resto efector es un agente de detección. En otra realización, el resto efector está ligado a través de un acoplamiento oxima o hidrazona a un residuo sacárido del glicano. En otra realización, el residuo sacárido es un residuo terminal de ácido siálico o galactosa del glicano. En otra realización, el resto efector comprende un enlazador sensible al pH, un enlazador disulfuro, un enlazador sensible a enzimas u otro resto enlazador escindible. En otra realización, el resto efector comprende un resto enlazador seleccionado del grupo de restos enlazadores representados en las Tablas 2 o 14.

En otra realización, el residuo asparagina glicosilado está ligado a un resto efector fármaco para formar un conjugado de fármaco anticuerpo (ADC).

En otro aspecto, una composición comprende un anticuerpo de una cualquiera de la invención y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.

En otro aspecto, la invención proporciona una cantidad efectiva de la composición anterior para su uso como un medicamento.

En otro aspecto, la invención proporciona un polinucleótido aislado que codifica el anticuerpo de la invención. En otro aspecto, la invención proporciona un vector que comprende el polinucleótido o una célula anfitriona que comprende el polinucleótido o vector.

En otro aspecto más, la invención proporciona un procedimiento de preparar un anticuerpo que comprende la expresión del polinucleótido o vector en una célula.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 es una ilustración esquemática de la síntesis de un conjugado de fármaco anticuerpo donde un resto toxina está enlazado a un residuo de ácido siálico oxidado del anticuerpo glicano mediante un acoplamiento oxima.

La figura 2 es un gel teñido de Coomassie-azul que muestra la expresión y purificación de los mutantes de glicosilación.

La figura 3 muestra los resultados de experimentos de resonancia de plasmón superficial utilizados para evaluar la unión de los mutantes de anticuerpos apTCR HEBE1 IgG a la FcYRIIIa humana recombinante (V158 y F158).

La figura 4 muestra los resultados de los experimentos de resonancia de plasmón superficial utilizados para evaluar la unión de los mutantes de anticuerpos apTCR HEBE1 IgG a los F^cyRI humanos recombinantes.

La figura 5 muestra el perfil de liberación de citocinas a partir de PBMCs para TNFα, GM-CSF, IFNg e IL10 en presencia de anticuerpos anti-apTCR mutantes (día 2).

La figura 6 muestra el perfil de liberación de citocinas a partir de PBMCs para IL6, IL4 e IL2 en presencia de anticuerpos anti-apTCR mutantes (día 2).

La figura 7 muestra el perfil de liberación de citocinas a partir de PBMCs para TNFα, GM-CSF, IFNg e IL10 en presencia de anticuerpos anti-apTCR mutantes (día 4).

La figura 8 muestra el perfil de liberación de citocinas de PBMCs para IL6, IL4 e IL2 en presencia de anticuerpos antiapTCR mutantes (día 4).

La figura 9 muestra los resultados de los experimentos que investigan el nivel de expresión de los mutantes 2C3 por inmunotransferencia y resonancia de plasmón superficial.

La figura 10 muestra los resultados de los experimentos que investigan la glicosilación de los mutantes 2C3 antes y después del tratamiento con PNGasa F.

La figura 11 muestra los resultados de los experimentos en SDS-PAGE que investigan sitios de glicosilación sobre mutantes 2C3 aislados del cultivo celular.

La figura 12 muestra los resultados de experimentos de resonancia de plasmón superficial utilizados para evaluar la unión de los anti-CD52 modificado con FcYRIIIa humana recombinante (V158). El anti-CD52 que comprende mutaciones S298N/Y300S en el dominio Fc se utilizaron para evaluar la función efectora de la molécula modificada, la unión al péptido CD52 (A), la unión a FcYRIIIa (V158, B), y la unión de control con FcRn de ratón (C).

La figura 13 muestra los resultados de experimentos de resonancia de plasmón superficial que investigan las propiedades de unión a Fc de los mutantes 2C3.

La figura 14 muestra los resultados de experimentos de resonancia de plasmón superficial que investigan la unión de anti-CD52 modificados tanto con FcYRIIIa (Val158) (como antes) como con FcYRIIIa (Phe158). Los anticuerpos anti-CD52 que comprenden mutaciones S298N/Y300S en el dominio Fc se utilizaron para evaluar la función efectora de la molécula modificada que se une a FcYRIIIa (Val158, Fig. 14a) y FcgRIIIa (Phe58, Fig. 14B).

La figura 15 muestra el análisis de unión de C1 q en el mutante S298N/Y300S y el control WT 2C3 (A) y los resultados de un análisis de Elisa que confirmaba la capa equivalente de los pocillos.

La figura 16 muestra los resultados de experimentos de resonancia plasmón que miden la cinética de unión de los mutantes 2C3 al péptido 741 del CD-52.

La figura 17 muestra los resultados de experimentos de resonancia de plasmón que comparan la afinidad de unión a antígeno de WT 2C3 anti-CD-52 y el mutante de hiperglicosilación A114N.

La figura 18 muestra los resultados de los experimentos de caracterización de carga por isoelectroenfoque y espectrometría de masas para determinar el contenido de glicano de los mutantes 2C3.

La figura 19 muestra los resultados de concentración (Octet) y experimentos de resonancia de plasmón que comparan la afinidad de unión a antígeno de WT 2C3 anti-CD-52 y mutantes.

La figura 20 muestra los resultados de experimentos en SDS-PAGE para determinar el contenido de glicano del mutante A114N anti-TME1.

La figura 21 muestra los resultados en SDS-PAGE y el análisis de cromatografía de interacción hidrófoba del mutante A114N anti-Her2.

La figura 22 muestra los resultados de los experimentos en SDS-PAGE para demostrar la conjugación de PEG al mutante A114N 2C3 a través de un acoplamiento aminooxi.

La figura 23 muestra los resultados de experimentos de LC-MS para determinar los contenidos de glicano del mutante de hiperglicosilación A114N anti-TEM1.

La figura 24 muestra los resultados de los experimentos de LC-MS para determinar los contenidos de glicano de un anticuerpo HER2 de tipo salvaje y un mutante de hiperglicosilación A114N anti-Her2.

La figura 25 muestra un procedimiento de ejemplo para realizar la conjugación específica en el sitio de un anticuerpo según los procedimientos de la invención.

La figura 26 muestra una síntesis de restos efectores de ejemplo de la invención: aminooxi-Cys-MC-VC-PABC-MMAE y aminooxi-Cys-MC-VC-PABC-PEG8-Dol10.

La figura 27 muestra la información de caracterización para un anticuerpo HER2 sialilado.

La figura 28 muestra la información de caracterización para anticuerpo anti-HER2 sialilado oxidado.

La figura 29 muestra cromatogramas de interacción hidrófoba de glicoconjugados preparados con tres diferentes anticuerpos sialilados con dos diferentes grupos aminooxi.

La figura 30 muestra un cromatograma de HIC del conjugado mutante de glicosilación A114 anti-Her2 con AO-MMAE preparado mediante química GAM(+).

La figura 31 muestra una comparación de la potencia in vitro de un glicoconjugado anti-HER2 y conjugado tiol. La figura 32 muestra una comparación de la potencia in vitro de un glicoconjugado anti FAP B11 y conjugado tiol. La figura 33 muestra una comparación de la eficacia in vivo de los glicoconjugados anti-HER2 y conjugados tiol en un modelo de xenoinjerto de células tumorales Her2+.

La figura 34 muestra los resultados de los experimentos de LC-MS para determinar el contenido de glicano de un anticuerpo anti-apTCR mutante que contiene la mutación S298N/Y300S.

La figura 35 muestra los resultados de experimentos de dicroísmo circular para determinar la estabilidad térmica relativa de un anticuerpo anti-apTCR de tipo salvaje y anticuerpo anti-apTCR mutante que contiene la mutación S298N/Y300S.

La figura 36 muestra los resultados de un ensayo de proliferación celular para ADC preparada con el anticuerpo anti-HER que lleva la mutación de hiperglicosilación A114N y AO-MMAE.

Descripción detallada

La presente divulgación proporciona anticuerpos y conjugados de los mismos con fármacos, que comprenden un dominio Fc de IgG humana, en donde el dominio Fc de IgG humana comprende: un residuo asparagina glicosilado en la posición 298 de aminoácido, según la numeración de la UE; y un residuo serina o treonina en la posición 300 de aminoácido, según la numeración de la UE. La presente divulgación proporciona también ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos, los vectores de expresión recombinante y las células anfitrionas para preparar tales anticuerpos. Los anticuerpos divulgados en el presente documento también se proporcionan para uso para tratar una enfermedad.

I. Definiciones

Como se usa en el presente documento, el término "polipéptido enlazante" o "anticuerpo" se referirá a un polipéptido (p. ej., un anticuerpo) que contiene al menos un sitio de unión que es responsable de unirse selectivamente a un antígeno diana de interés (p. ej., un antígeno humano). Los sitios de unión de ejemplo incluyen un dominio variable de anticuerpo, un sitio de unión del ligando de un receptor, o un sitio de unión del receptor de un ligando. En algunos aspectos, los polipéptidos de unión de la invención comprenden múltiples (p. ej., dos, tres, cuatro o más) sitios de unión.

Como se usa en el presente documento, el término "residuo nativo" se referirá a un residuo de aminoácido que aparece de forma natural en una posición de aminoácido particular de un anticuerpo (p. ej., un anticuerpo o fragmento de éste) y que no haya sido modificado, introducido o alterado por la mano del hombre. Como se usa en el presente documento, el término "polipéptido enlazante alterado" o "anticuerpo alterado" incluye polipéptidos de unión (p. ej., un anticuerpo o fragmento de ellos) que comprende al menos un residuo del aminoácido mutado no nativo.

El término "se une específicamente" usado en el presente documento, se refiere a la capacidad de un anticuerpo o de un fragmento de unión a antígeno del mismo para unirse a un antígeno con una constante de disociación (Kd) de como máximo aproximadamente 1 x 10-6 M, 1 x 10-7 M, 1 x 10-8 M, 1 x 10-9 M, 1 x 10-10 M, 1 x 10-11 M, 1 x 10-12 M, o menos, y/o para unirse a un antígeno con una afinidad que es al menos dos veces mayor que su afinidad por un antígeno no específico.

Como se usa en el presente documento, el término "anticuerpo " se refiere a tales ensamblajes (p. ej., moléculas de anticuerpos intactos, fragmentos de anticuerpos o variantes de los mismos) que tienen una actividad significativa inmunorreactiva específica muy conocida por un antígeno de interés (p. ej., un antígeno asociado a un tumor). Los anticuerpos y las inmunoglobulinas comprenden cadenas ligeras y pesadas, con o sin un acoplamiento covalente intercadenas entre ellos. Las estructuras básicas de la inmunoglobulina en sistemas vertebrados son relativamente bien entendidas.

Como se discutirá con más detalle a continuación, el término genérico "anticuerpo" comprende cinco clases distintas de anticuerpos que se pueden distinguir bioquímicamente. Las cinco clases de anticuerpos están claramente dentro del alcance de la presente divulgación, la discusión siguiente se referirá generalmente a la clase IgG de moléculas de inmunoglobulina. Con respecto a IgG, las inmunoglobulinas comprenden dos cadenas ligeras idénticas de peso molecular de aproximadamente 23.000 Dalton, y dos cadenas pesadas idénticas de peso molecular 53.000-70.000. Las cuatro cadenas están unidas por enlaces disulfuro en una configuración de "Y" en donde las cadenas ligeras agrupan las cadenas pesadas comenzando en la boca de la "Y" y continuando a través de la región variable.

Las cadenas ligeras de inmunoglobulina se clasifican como kappa o lambda (^k, A). Cada clase de cadena pesada puede estar unida con una cadena ligera kappa o lambda. En general, las cadenas ligeras y pesadas están covalentemente unidas entre sí, y las partes de "cola" de las dos cadenas pesadas se unen entre sí por enlaces disulfuro covalentes o enlaces no covalentes cuando las inmunoglobulinas son generadas por hibridomas, células B, o células anfitrionas modificadas por ingeniería genética. En la cadena pesada, las secuencias de aminoácidos funcionan de un N-terminal en los extremos bifurcados de la configuración de Y al C-terminal en la parte inferior de cada cadena. Los expertos en la técnica comprenderán que las cadenas pesadas se clasifican como gamma, mu, alfa, delta, o épsilon (y, m, a, 5, e) con algunas subclases entre ellas (p. ej., y1-y4). Es la naturaleza de esta cadena la que determina la "clase" del anticuerpo como IgG, IgM, IgA IgG, o IgE, respectivamente. Las subclases de isotipo de inmunoglobulina (p. ej., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, etc.) están bien caracterizadas y se sabe que confieren una especialización funcional. Las versiones modificadas de cada una de estas clases y los isotipos son fácilmente discernibles para el experto en la técnica en vista de la presente divulgación y, por consiguiente, están dentro del alcance de la presente divulgación.

Tanto las cadenas ligeras como las pesadas se dividen en regiones de homología estructural y funcional. El término "región" se refiere a una parte o porción de una cadena de inmunoglobulina o anticuerpo e incluye región constante o regiones variables, así como partes o porciones más discretas de dichas regiones. Por ejemplo, las regiones variables de cadena ligera incluyen "regiones determinantes de complementariedad" o "CDRs" intercaladas entre "regiones de entramado" o "FRs", tal como se define en el presente documento.

Las regiones de una cadena pesada o ligera de la inmunoglobulina se pueden definir como región "constante " (C) o regiones "variables" (V), basándose en la relativa falta de variación de la secuencia dentro de las regiones de varios miembros de la clase en el caso de una "región constante", o la variación significativa dentro de las regiones de varios miembros de la clase en el caso de "regiones variables". Los términos "región constante" y "región variable" también se pueden utilizar de forma funcional. En este sentido, se comprenderá que las regiones variables de una inmunoglobulina o anticuerpo determinan el reconocimiento y especificidad del antígeno. A la inversa, las regiones constantes de una inmunoglobulina o anticuerpo confieren funciones efectoras importantes tales como secreción, movilidad transplacentaria, unión del receptor Fc, unión del complemento, y similares. Las estructuras de la subunidad y configuraciones tridimensionales de las regiones constantes de las varias clases de la inmunoglobulina son bien conocidas.

Las regiones constantes y variables de las cadenas pesadas y ligeras de la inmunoglobulina están plegadas en dominios. El término "dominio" se refiere a una región globular de una cadena pesada o ligera que comprende bucles de péptidos (p. ej., comprendiendo bucles de 3 a 4 péptidos) estabilizados, por ejemplo, por la hoja p-plisada y/o el enlace disulfuro intracadena. Los dominios de la región constante de la cadena ligera de una inmunoglobulina se denominan indistintamente "dominios de la región constante de la cadena ligera", "regiones CL" o "dominios CL". Los dominios constantes en la cadena pesada (p. ej., dominios de bisagra, CH1, CH₂o CH₃) se denominan indistintamente "dominios de la región constante de la cadena pesada ", dominios de la región "CH" o "dominios CH". Los dominios variables de la cadena ligera se denominan indistintamente "dominios de la región variable de la cadena ligera", "dominios de la región VL" o "dominios VL". Los dominios variables de la cadena pesada se denominan indistintamente "dominios de la región de la cadena pesada", "dominios de la región VH" o "dominios VH".

Por convenio, la numeración de los dominios de región constante y variable aumenta a medida que se vuelven más distales del sitio de unión a antígeno o del término amino de la inmunoglobulina o anticuerpo. El N-terminal de cada cadena pesada y ligera de la inmunoglobulina es una región variable y en el C-terminal es una región constante; los dominios CH₃y CL comprenden en realidad el carboxi-terminal de la cadena pesada y ligera, respectivamente. Por consiguiente, los dominios de una inmunoglobulina de cadena ligera se disponen en una orientación VL-CL, mientras que los dominios de la cadena pesada se disponen en la orientación VH-CH1-bisagra-CH₂-CH₃.

Las posiciones de aminoácidos en una región constante de la cadena pesada, incluyendo posiciones del aminoácido en los dominios CH1, bisagra, CH₂, CH₃, y CL, se pueden numerar según el sistema de numeración del índice de Kabat (véase Kabat y col., en "Sequences of Proteins of Immunological Interest", Dept. Health and Human Services de los EE.UU., 5a edición, 1991). Como alternativa, las posiciones de aminoácidos de anticuerpos pueden numerarse según el sistema de numeración del índice de la UE (véase Kabat y col., ibid).

Como se usa en el presente documento, el término "dominio de VH" incluye el dominio variable de terminal amino de una cadena pesada de inmunoglobulina, y el término "dominio de VL” incluye el dominio variable de terminal amino de una cadena ligera de inmunoglobulina.

Como se usa en el presente documento, el término "dominio de CH1" incluye el primer dominio de la región constante (la mayor parte de amino terminal) de una cadena pesada de inmunoglobulina que se extiende, p. ej., desde aproximadamente las posiciones 114-223 en el sistema de numeración de Kabat (posiciones 118-215 de la UE). El dominio CH1 es adyacente al dominio de VH y el terminal amino a la región bisagra de una molécula de cadena pesada de la inmunoglobulina, y no forma una parte de la región de Fc de una cadena pesada de la inmunoglobulina.

Como se usa en el presente documento, el término "región bisagra" incluye la porción de una molécula de cadena pesada que une el dominio CH1 al dominio CH₂. Esta región bisagra comprende aproximadamente 25 residuos y es flexible, permitiendo así que las dos regiones de unión a antígeno N-terminal se muevan independientemente. Las regiones bisagra pueden subdividirse en tres dominios distintos: los dominios bisagra superior, medio e inferior (Roux y col., J. Immunol. 1998, 161:4083).

Como se usa en el presente documento, el término "dominio CH₂" incluye la porción de una molécula de inmunoglobulina de cadena pesada que se extiende, p. ej., desde aproximadamente las posiciones 244-360 en el sistema de numeración de Kabat (posiciones 231-340 de la UE). El dominio CH₂es único en que no está estrechamente emparejado con otro dominio. Más bien, dos cadenas de carbohidratos ramificadas N-ligadas se interponen entre los dos dominios CH₂de una molécula de IgG nativa intacta. En una realización, un anticuerpo de la presente divulgación comprende un dominio CH₂derivado de una molécula de IgG1 (p. ej., una molécula de IgG1 humana).

Como se usa en el presente documento, el término "dominio CH₃" incluye la porción de una molécula de inmunoglobulina de cadena pesada que se extiende aproximadamente 110 residuos desde el N-terminal del dominio CH₂, p. ej., desde aproximadamente las posiciones 361-476 del sistema de numeración Kabat (posiciones 341-445 de la UE). El dominio CH₃forma típicamente la porción C-terminal del anticuerpo. En algunas inmunoglobulinas, sin embargo, dominios adicionales pueden extenderse desde el dominio CH₃para formar la porción C-terminal de la molécula (p. ej., el dominio CH4 en la cadena g de IgM y la cadena e de IgE). En una realización, un anticuerpo de la presente divulgación comprende un dominio CH₃derivado de una molécula de IgG1 (p. ej., una molécula de IgG1 humana).

Como se usa en el presente documento, el término "dominio CL" incluye el dominio de la región constante de una cadena ligera de inmunoglobulina que se extiende, p. ej., desde aproximadamente la posición 107A-216 de Kabat. El dominio CL es adyacente al dominio VL. En una realización, un anticuerpo de la presente divulgación comprende un dominio CL derivado de una cadena ligera kappa (p. ej., una cadena ligera kappa humana).

Como se usa en el presente documento, el término "región Fc" se define como la porción de una región constante de cadena pesada que comienza en la región bisagra justo aguas arriba del sitio de escisión con papaína (es decir, el residuo 216 en la IgG, tomando el primer residuo la región constante cadena pesada para ser 114) y que termina en el C-terminal del anticuerpo. En consecuencia, una región Fc completa comprende al menos un dominio bisagra, un dominio CH₂y un dominio CH₃.

El término "Fc nativo" como se usa en el presente documento se refiere a una molécula que comprende la secuencia de un fragmento que no se une al antígeno resultante de la digestión de un anticuerpo o producida por otros medios, ya sea en forma monomérica o multimérica, y puede contener la región bisagra. La fuente original de inmunoglobulina del Fc nativo es preferiblemente de origen humano y puede ser cualquiera de las inmunoglobulinas, aunque se prefieren IgG1 e IgG2. Las moléculas de Fc nativa están compuestas de polipéptidos monoméricos que se pueden ligar en formas diméricas o multiméricas mediante asociación covalente (es decir, enlaces disulfuro) y no covalentes. El número de enlaces disulfuro intermoleculares entre subunidades monoméricas de moléculas Fc nativa varía de 1 a 4 según la clase (p. ej., IgG, IgA e IgE) o subclase (p. ej., IgG1, IgG2, IgG3, IgA1 e IgGA2). Un ejemplo de un Fc nativo es un dímero unido por disulfuro que resulta de la digestión con papaína de una IgG. El término "Fc nativo" usado en el presente documento es genérico para las formas monoméricas, diméricas y multiméricas.

El término "variante de Fc" usado en el presente documento se refiere a una molécula o secuencia que está modificada a partir de una Fc nativa pero aún comprende un sitio de unión para el receptor de rescate, FcRn (receptor Fc neonatal). Son conocidas en la técnica las variantes de Fc de ejemplo, y su interacción con el receptor de rescate. Por ello, el término "variante de Fc" puede comprender una molécula o secuencia que se humaniza a partir de un Fc nativo no humano. Además, un Fc nativo comprende regiones que se pueden eliminar porque proporcionan características estructurales o actividad biológica que no son requeridas para los anticuerpos de la invención. Por ello, el término "variante de Fc" comprende una molécula o secuencia que carece de uno o más sitios o residuos Fc nativos, o en la que uno o más sitios o residuos Fc han sido modificados, que afectan o están involucrados en: (1) formación de enlace disulfuro, (2) incompatibilidad con una célula anfitriona seleccionada, (3) heterogeneidad N-terminal tras la expresión en una célula anfitriona seleccionada, (4) glicosilación, (5) interacción con complemento, (6) unión a un receptor Fc distinto de un receptor de rescate, o (7) citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC).

El término "dominio Fc" usado en el presente documento abarca Fc nativo y variantes de Fc y secuencias como se definió anteriormente. Como con las variantes de Fc y las moléculas de Fc nativas, el término "dominio Fc" incluye moléculas en forma monomérica o multimérica, ya sean digeridas a partir de anticuerpos completos o producidas por otros medios.

Como se indicó anteriormente, las regiones variables de un anticuerpo le permiten reconocer selectivamente y unir específicamente epítopos a antígenos. Es decir, el dominio VL y el dominio VH de un anticuerpo se combinan para formar la región variable (Fv) que define un sitio de unión a antígeno tridimensional. Esta estructura de anticuerpo cuaternario forma el sitio de unión a antígeno presente en el extremo de cada brazo de la Y. Más específicamente, el sitio de unión a antígeno se define por tres regiones determinantes complementarias (CDRs) en cada una de las regiones variables de cadena pesada y ligera. Como se usa en el presente documento, la expresión "sitio de unión a antígeno" incluye un sitio que se une específicamente (inmunorreacciona con) un antígeno (p. ej., una superficie celular o antígeno soluble). El sitio de unión a antígeno incluye una región variable de la cadena pesada y de la cadena ligera de inmunoglobulina y el sitio de unión formado por estas regiones variables determina la especificidad del anticuerpo. Un sitio de unión a antígeno está formado por regiones variables que varían de un anticuerpo a otro. Los anticuerpos alterados de la presente divulgación comprenden al menos un sitio de unión a antígeno.

En algunas realizaciones, los anticuerpos de la presente divulgación comprenden al menos dos dominios de unión a antígeno que proporcionan la asociación del anticuerpo con el antígeno seleccionado. Los dominios de unión a antígeno no necesitan derivarse de la misma molécula de inmunoglobulina. A este respecto, la región variable puede derivarse de cualquier tipo de animal que pueda inducirse para montar una respuesta humoral y generan inmunoglobulinas contra el antígeno deseado. Como tal, la región variable del anticuerpo puede ser, por ejemplo, de origen mamífero, p. ej., puede ser humano, murino, de rata, de cabra, de oveja, de primate no humano (tal como monos cynomolgus, macacos, etc.), lupino o camélido (p. ej., de camellos, llamas y especies relacionadas).

En los anticuerpos de origen natural, las seis CDRs presentes en cada anticuerpo monomérico son secuencias cortas, no contiguas, de aminoácidos que están colocadas específicamente para formar el sitio de unión a antígeno como el anticuerpo asume su configuración tridimensional en un entorno acuoso. El resto de los dominios variables pesado y ligero muestran una menor variabilidad intermolecular en la secuencia de aminoácidos y se denominan regiones de entramado. Las regiones de entramado adoptan en gran parte una conformación de hoja p y las CDRs forman bucles que conectan, y en algunos casos forman parte, de la estructura de hoja p. Por lo tanto, estas regiones de entramado actúan para formar un andamiaje que proporciona el posicionamiento de seis CDRs en la orientación correcta mediante interacciones entre cadenas, no covalentes. El dominio de unión a antígeno formado por las CDRs posicionadas define una superficie complementaria al epítopo en el antígeno inmunorreactivo. Esta superficie complementaria promueve la unión no covalente del anticuerpo al epítopo del antígeno inmunorreactivo.

Los anticuerpos de ejemplo de la invención incluyen variantes de anticuerpos. Como se usa en el presente documento, el término "variante de anticuerpo" incluye formas de anticuerpos sintéticas y de ingeniería que están alteradas de forma que no son de origen natural, p. ej., anticuerpos que comprenden al menos dos porciones de cadena pesada pero no dos cadenas pesadas completas (tal como anticuerpos de dominio deprimido o minicuerpos); formas multiespecíficas de anticuerpos (p. ej., biespecíficas, triespecíficas, etc.) alteradas para unirse a dos o más antígenos diferentes o a epítopos diferentes en un único antígeno); moléculas de cadena pesada unidas a moléculas scFv y similares. Además, el término "variante de anticuerpo" incluye formas multivalentes de anticuerpos (p. ej., anticuerpos trivalentes, tetravalentes, etc., que se unen a tres, cuatro o más copias del mismo antígeno.

Como se usa en el presente documento, el término "valencia" se refiere al número de sitios potenciales de unión a diana en un polipéptido. Cada sitio de unión a diana se une específicamente a una molécula diana o sitio específico en una molécula diana. Cuando un polipéptido comprende más de un sitio de unión a diana, cada sitio de unión a diana puede unirse específicamente a moléculas iguales o diferentes (p. ej., puede unirse a diferentes ligandos o diferentes antígenos, o diferentes epítopos en el mismo antígeno). Los anticuerpos referidos tienen preferiblemente al menos un sitio de unión específico para una molécula de antígeno humano.

El término "especificidad" se refiere a la capacidad de unirse específicamente (p. ej., inmunorreaccionar con) un antígeno diana dado (p. ej., un antígeno diana humano). Un anticuerpo puede ser monoespecífico y contener uno o más sitios de unión que se unen específicamente a una diana, o un polipéptido puede ser multiespecífico y contener dos o más sitios de unión que se unen específicamente a la misma o diferentes dianas. En algunas realizaciones, un anticuerpo de la invención es específico para dos porciones diferentes (p. ej., no superpuestas) de la misma diana. En algunas realizaciones, un anticuerpo de la invención es específico para más de una diana. Los anticuerpos de ejemplo que comprenden sitios de unión a antígeno que se unen a antígenos expresados en células tumorales son conocidos en la técnica y uno o más CDRs de tales anticuerpos se pueden incluir en un anticuerpo de la invención.

El término "resto de enlace" incluye restos que son capaces de enlazar el resto efector con los anticuerpos descritos en el presente documento. El resto de enlace puede seleccionarse de manera que sea escindible (p. ej., escindible enzimáticamente o sensible al pH) o no escindible. Los restos de enlace de ejemplo se muestran en la Tabla 2 del presente documento.

Como se usa en el presente documento, la expresión "resto efector" comprende agentes de diagnóstico y terapéuticos (p. ej., proteínas, ácidos nucleicos, lípidos, restos fármacos y fragmentos de los mismos) con actividad biológica u otra actividad funcional. Por ejemplo, un anticuerpo modificado que comprende un resto efector conjugado con un anticuerpo tiene al menos una función o propiedad adicional en comparación con el anticuerpo no conjugado. Por ejemplo, la conjugación de un fármaco citotóxico (p. ej., un resto efector) con el anticuerpo da como resultado la formación de un anticuerpo con citotoxicidad del fármaco como segunda función (es decir, además de la unión a antígeno). En otro ejemplo, la conjugación de un segundo anticuerpo con el anticuerpo puede conferir propiedades de unión adicionales. En algunas realizaciones, cuando el resto efector es una proteína o ácido nucleico terapéutico o de diagnóstico codificado genéticamente, el resto efector se puede sintetizar o expresar mediante síntesis peptídica o procedimientos de ADN recombinante que son bien conocidos en la técnica. En otro aspecto, cuando el efector es un péptido no codificado genéticamente, o un resto fármaco, el resto efector puede sintetizarse artificialmente o purificarse a partir de una fuente natural. Como se usa en el presente documento, el término "resto fármaco" incluye agentes terapéuticos antiinflamatorios, anticancerígenos, antiinfecciosos (p. ej., antifúngicos, antibacterianos, antiparasitarios, antivíricos, etc.) y anestésicos. En una realización adicional, el resto fármaco es un agente anticancerígeno o citotóxico. Los restos fármacos compatibles también pueden comprender profármacos. Ejemplos de restos efectores se muestran en la Tabla 1 del presente documento.

Como se usa en el presente documento, el término "profármaco" se refiere a un precursor o forma derivada de un agente farmacéuticamente activo que es menos activo, reactivo o propenso a efectos secundarios en comparación con el fármaco original y puede activarse enzimáticamente o de otro modo transformarse en una forma más activa in vivo. Los profármacos compatibles con las composiciones de la presente divulgación incluyen, pero no se limitan a, profármacos que contienen fosfatos, profármacos que contienen aminoácidos, profármacos que contienen tiofosfatos, profármacos que contienen sulfato, profármacos que contienen péptido, profármacos que contienen p-lactámicos, profármacos que contienen fenoxiacetamida opcionalmente sustituida o profármacos que contienen fenilacetamida opcionalmente sustituida, 5-fluorocitosina y otros profármacos de 5-fluorouridina que se pueden transformar en el fármaco libre citotóxico más activo. Un experto en la técnica puede realizar modificaciones químicas en el resto del fármaco deseado o en su profármaco con el fin de hacer que las reacciones de ese compuesto sean más convenientes para los fines de preparar anticuerpos modificados de la presente divulgación. Los restos fármacos incluyen también derivados, sales, ésteres, amidas y éteres, farmacéuticamente aceptables, de los restos de fármacos descritos en el presente documento. Los derivados incluyen modificaciones a fármacos identificados en el presente documento que pueden mejorar o no reducir significativamente una actividad terapéutica deseada de un fármaco particular.

Como se usa en el presente documento, la expresión "agente anticancerígeno" incluye agentes que son perjudiciales para el crecimiento y/o la proliferación de células neoplásicas o tumorales y puede actuar para reducir, inhibir o destruir la malignidad. Los ejemplos de tales agentes incluyen, pero sin limitación, agentes citostáticos, agentes alquilantes, antibióticos, nucleósidos citotóxicos, agentes de unión a tubulina, hormonas, antagonistas de hormonas, agentes citotóxicos y similares. Los agentes citotóxicos incluyen derivados de tomaimicina, derivados de maitansina, derivados de criptoficina, derivados de antraciclina, derivados de bisfosfonato, derivados de leptomicina, derivados de estreptonigrina, derivados de auristatina y derivados de duocarmicina. Cualquier agente que actúa retardando o ralentizando el crecimiento de células inmunorreactivas o células malignas está dentro del alcance de la presente divulgación.

El término "antígeno" o "antígeno diana", como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula o una porción de una molécula que puede unirse al sitio de unión de un anticuerpo. Un antígeno diana puede tener uno o más epítopos.

II. Anticuerpos

En un aspecto, la presente divulgación proporciona anticuerpos que comprenden un dominio Fc de IgG humana, en donde el dominio Fc de IgG humana comprende: un residuo asparagina glicosilado en la posición 298 de aminoácido, según la numeración de la UE; y un residuo serina o treonina en la posición 300 de aminoácido, según la numeración de la UE.

Los dominios Fc de IgG se usan en los anticuerpos descritos en el presente documento. En ciertas realizaciones, el dominio Fc de IgG humana es un dominio Fc de IgG1 humana. En el caso de un dominio Fc de IgG1 humana, la mutación del aminoácido de tipo salvaje en la posición 298 de Kabat para una asparagina y la posición 300 de Kabat para una serina o treonina da como resultado la formación de un sitio de consenso de glicosilación ligada a N (es decir, el sequon N-X-T/S, donde X es cualquier aminoácido excepto prolina).

Los anticuerpos descritos en el presente documento abarcan cualquier anticuerpo que comprende un dominio Fc que tiene un sitio de glicosilación ligado a N en la posición 298, según la numeración de Kabat.

En ciertas realizaciones la presente divulgación puede comprender un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo. El término "fragmento de unión a antígeno" se refiere a un fragmento polipeptídico de una inmunoglobulina o anticuerpo que se une al antígeno o compite con el anticuerpo intacto (es decir, con el anticuerpo intacto del que derivaban) para la unión a antígeno (es decir, unión específica). Los fragmentos de unión a antígeno se pueden producir por procedimientos recombinantes o bioquímicos que son bien conocidos en la técnica. Ejemplos de fragmentos de unión a antígeno incluyen Fv, Fab, Fab' y (Fab')₂. En realizaciones preferidas, el fragmento de unión a antígeno de la presente divulgación es un fragmento de unión a antígeno alterado que comprende al menos un sitio de glicosilación modificado por ingeniería genética. En una realización de ejemplo, un fragmento de unión a antígeno alterado de la presente divulgación comprende un dominio de VH alterado descrito anteriormente. En otra realización de ejemplo, un fragmento de unión a antígeno alterado de la presente divulgación comprende un dominio de CH1 alterado descrito anteriormente.

En realizaciones de ejemplo, el anticuerpo comprende una secuencia de región variable de cadena sencilla (ScFv). Las secuencias de región variable de cadena sencilla comprenden un único polipéptido que tiene uno o más sitios de unión a antígeno, p. ej., un dominio VL ligado mediante un enlazador flexible a un dominio VH. Las moléculas de ScFv se pueden construir en una orientación VH-enlazador-VL o una orientación VL-enlazador-VH. La bisagra flexible que liga los dominios VL y VH que constituyen el sitio de unión a antígeno comprende preferiblemente de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 residuos de aminoácidos. Los péptidos de conexión son conocidos en la técnica. El anticuerpo de la invención puede comprender al menos una scFv y/o al menos una región constante. En una realización, un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender al menos una scFv unido o fusionado a un anticuerpo o fragmento que comprende un dominio CH1 (p. ej., un dominio CH1 que comprende un residuo asparagina en la posición 114 de Kabat) y/o dominio CH₂(p. ej., un dominio CH₂que comprende un residuo asparagina en la posición 298 de la UE, y un residuo serina o treonina en la posición 300 de la UE).

En algunas realizaciones de ejemplo, un anticuerpo de la presente divulgación es un anticuerpo multivalente (p. ej., tetravalente) que se produce fusionando una secuencia de ADN que codifica un anticuerpo con una molécula de ScFv (p. ej., una molécula de ScFv alterada). Por ejemplo, en una realización, estas secuencias se combinan de manera que la molécula de ScFv (p. ej., una molécula de ScFv alterada) se enlaza en su N-terminal o en su C-terminal a un fragmento Fc de un anticuerpo a través de un enlazador flexible (p. ej., un enlazador gly/ser). En otra realización, se puede preparar un anticuerpo tetravalente de la presente divulgación fusionando una molécula de ScFv a un péptido de conexión, que se fusiona con un dominio CH1 (p. ej., un dominio CH1 que comprende un residuo asparagina en la posición 114 de Kabat) para construir una molécula tetravalente ScFv-Fab.

En otra realización, un anticuerpo de la presente divulgación es un minicuerpo alterado. Los minicuerpos alterados de la presente divulgación son moléculas diméricas formadas por dos cadenas polipeptídicas comprendiendo cada una a una molécula ScFv (p. ej., una molécula ScFv alterada que comprende un dominio VH alterado descrito anteriormente) que se fusiona con un dominio CH₃o una porción del mismo a través de un péptido de conexión. Los minicuerpos pueden prepararse construyendo un componente ScFv y componente CH₃de péptido de conexión utilizando procedimientos descritos en la técnica (véase, p. ej., la patente de EE.UU. 5.837.821 o el documento WO 94/09817A1). En otra realización, se puede construir un minicuerpo tetravalente. Los minicuerpos tetravalentes se pueden construir de la misma manera que los minicuerpos, excepto que dos moléculas de ScFv se enlazan utilizando un enlazador flexible. La construcción scFv-scFv enlazada se une luego a un dominio CH₃.

En otra realización, un anticuerpo de la presente divulgación comprende un diacuerpo. Los diacuerpos son moléculas diméricas, tetravalentes, teniendo cada una un polipéptido similar a las moléculas scFv, pero que habitualmente tienen enlazadores de residuo de aminoácido corto (menos de 10 y preferiblemente de 1- 5) que conectan ambos dominios variables, de manera que los dominios VL y VH en la misma cadena polipeptídica no pueden interactuar. En cambio, el dominio VL y VH de una cadena polipeptídica interactúa con el dominio VH y VL (respectivamente) en una segunda cadena polipeptídica (véase, por ejemplo, el documento WO 02/02781). Los diacuerpos de la presente divulgación comprenden una molécula scFv fusionada a un dominio CH₃.

En otras realizaciones, los anticuerpos de la invención comprenden anticuerpos multiespecíficos o multivalentes que comprenden uno o más dominios variables en serie en la misma cadena polipeptídica, p. ej., polipéptidos de dominio variable en tándem (TVD). Los polipéptidos de TVD de ejemplo incluyen la configuración de "doble cabeza" o "Dual-Fv" descrita en la patente de los EE.UU. N.° 5.989.830. En la configuración Dual-Fv, los dominios variables de dos anticuerpos diferentes se expresan en una orientación en tándem en dos cadenas separadas (una cadena pesada y una cadena ligera), en donde una cadena polipeptídica tiene dos veces una VH en serie separada por un enlazador peptídico (VH1-enlazador-VH₂) y la otra cadena polipeptídica consiste en dominios VL complementarios conectados en serie por un enlazador peptídico (VL1-enlazador-VL2). En la configuración cruzada de doble cabeza, los dominios variables de dos diferentes anticuerpos se expresan en una orientación en tándem en dos cadenas polipeptídicas separadas (una cadena pesada y una cadena ligera), en donde una cadena polipeptídica tiene dos VH en serie separadas por un enlazador peptídico (VH1-enlazador-VH₂) y la otra cadena polipeptídica consiste en dominios VL complementarios conectados en serie por un enlazador peptídico en la orientación opuesta (VL2-enlazador-VL1). Variantes de anticuerpos adicionales basadas en el formato "Dual-Fv" incluyen el anticuerpo biespecífico de IgG de Dominio Variable Dual (DVD-IgG) (véase la patente de EE.UU. N.° 7.612.181 y el formato TBTI (véase el documento US 2010/0226923 A1). La adición de dominios constantes a cadenas respectivas de Dual-Fv (CH1-Fc a la cadena pesada y dominio constante kappa o lambda a la cadena ligera) conduce a anticuerpos biespecíficos funcionales sin necesidad de modificaciones adicionales (es decir, la adición obvia de dominios constantes para potenciar la estabilidad).

En otra realización de ejemplo, el anticuerpo comprende un anticuerpo biespecífico de IgG de dominio variable dual cruzado (CODV-IgG) basado en una configuración de "doble cabeza" (véase el documento US20120251541 A1). Las variantes del anticuerpo CODV-IgG tienen una cadena polipeptídica con dominios VL conectados en serie a un dominio CL (VL1 -L1-VL2-L2-CL) y una segunda cadena polipeptídica con dominios VH complementarios conectados en serie en la orientación opuesta a un dominio CH1 (VH₂-L3-VH1-L4-CH1), donde las cadenas polipeptídicas forman un par cruzado de cadena pesada y cadena ligera. En cierta realización, el segundo polipéptido puede estar conectado además a un dominio Fc (VH₂-L3-VH1-L4-CH1-Fc). En algunas realizaciones, el enlazador L3 es al menos dos veces la longitud del enlazador L1 y/o el enlazador L4 es al menos dos veces la longitud del enlazador L2. Por ejemplo, L1 y L2 pueden tener una longitud de 1-3 residuos de aminoácidos, L3 puede tener una longitud de 2 a 6 residuos de aminoácidos, y L4 puede tener una longitud de 4 a 7 residuos de aminoácidos. Los ejemplos de enlazadores adecuados incluyen un único residuo glicina (Gly); un péptido de diglicina (Gly-Gly); un tripéptido (Gly-Gly-Gly); un péptido con cuatro residuos glicina (Gly-Gly-Gly-Gly); un péptido con cinco residuos glicina (Gly-Gly-Gly-Gly-Gly); un péptido con seis restos de glicina (Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly); un péptido con siete residuos glicina (Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly); un péptido con ocho residuos glicina (Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly). Se pueden usar otras combinaciones de residuos de aminoácidos tales como el péptido Gly-Gly-Gly-Gly-Ser y el péptido Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser.

III. Glicanos ligados a N

El dominio Fc de los anticuerpos descritos en el presente documento está glicosilado en la asparagina modificada por ingeniería genética en la posición 298 (N298), según la numeración de la UE. El glicano ligado a N generalmente se enlaza mediante un acoplamiento p-glicosilamida al grupo nitrógeno de la cadena lateral N298. Sin embargo, también se pueden emplear otros acoplamientos adecuados reconocidos en la técnica.

Cualquier tipo de glicano ligado a N de origen natural o sintético (es decir, no natural) se puede ligar a N114. Por ejemplo, el glicano puede ser un glicano nativo o un glicano modificado por ingeniería genética que contiene acoplamientos no nativos. En algunas realizaciones, el glicano comprende un sacárido que se puede oxidar (p. ej., mediante tratamiento con peryodato) para producir un grupo adecuado para la conjugación con un resto efector (p. ej., un grupo aldehído reactivo). Los sacáridos oxidables adecuados incluían, sin limitación, galactosa y ácido siálico (p. ej., ácido N-acetilneuramínico). En algunas realizaciones, el glicano es un glicano biantenario. En algunas realizaciones, el glicano es una glicoforma de mamífero de origen natural.

La glicosilación se puede lograr a través de cualquier medio conocido en la técnica. En algunas realizaciones, la glicosilación se consigue mediante la expresión de los anticuerpos en células capaces de glicosilación ligada a N. Se puede emplear cualquier célula natural o modificada por ingeniería genética (p. ej., procariota o eucariota). En general, las células de mamífero se emplean para efectuar la glicosilación. Los N-glicanos que se producen en células de mamífero se denominan habitualmente N-glicanos complejos (véase, por ejemplo, Drickamer K, Taylor ME (2006). Introduction to Glycobiology, 2a ed.). Estos N-glicanos complejos tienen una estructura con típicamente dos a seis ramificaciones externas con una secuencia de sialil-lactosamina enlazada a una estructura central interna Man³GlcNAc². Un N-glicano complejo tiene al menos una ramificación, y preferiblemente al menos dos, de residuos GlcNAc y galactosa (Gal) alternantes que terminan en oligosacáridos tales como, por ejemplo: NeuNAc-; NeuAc a2,6 GalNAc a1-; NeuAc a2,3 Gal p 1,3 GalNAc a1-; y NeuAc a2,3/6 Gal p 1,4 GlcNAc p1. Además, los ésteres de sulfato pueden aparecer en los residuos galactosa, GalNAc y GlcNAc, y los ésteres de fosfato pueden aparecer en los residuos manosa. NeuAc puede ser O-acetilado o reemplazado por NeuGl (ácido N-glicolilneuramínico). Los N-glicanos complejos pueden tener también sustituciones intracadena de GlcNAc bisecante y fucosa central (Fuc).

De forma adicional o como alternativa, la glicosilación se puede lograr o modificar a través de medios enzimáticos, in vitro. Por ejemplo, se pueden emplear una o más glicosiltransferasas para añadir residuos de sacáridos específicos para N298, y se pueden emplear una o más glicosidasas para eliminar sacáridos no deseados del glicano ligado a N. Dichos medios enzimáticos son bien conocidos en la técnica (véase, p. ej., el documento WO/2007/005786).

IV. Funciones electoras inmunológicas y modificaciones Fc

En ciertas realizaciones, los anticuerpos de la invención pueden comprender una región constante de anticuerpo (p. ej., una región constante de IgG humana, p. ej., una región constante de IgG1 o IgG4 humana) que media una o más funciones efectoras. Por ejemplo, la unión del componente C1 del complemento a una región constante del anticuerpo puede activar el sistema complemento. La activación del complemento es importante en la opsonización y lisis de los patógenos celulares. La activación del complemento también estimula la respuesta inflamatoria y puede estar involucrada también en la h i pe rsensibilid ad autoinmune. Además, los anticuerpos se unen a receptores en diversas células a través de la región Fc, con un sitio de unión al receptor Fc en la región Fc del anticuerpo que se une a un receptor Fc (FcR) en una célula. Hay varios receptores Fc que son específicos de diferentes clases de anticuerpo, que incluyen IgG (receptores gamma), IgE (receptores épsilon), IgA (receptores alfa) e IgM (receptores mu). La unión del anticuerpo a los receptores Fc en las superficies celulares desencadena una serie de importantes y diversas respuestas biológicas que incluyen el envolvimiento y la destrucción de partículas recubiertas de anticuerpos, la eliminación de complejos inmunes, la lisis mediante células asesinas de células diana recubiertas de anticuerpos (denominada citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos, o ADCC), liberación de mediadores inflamatorios, transferencia placentaria y control de la producción de inmunoglobulinas. En realizaciones preferidas, los anticuerpos de la invención se unen a un receptor Fc-gamma. En realizaciones alternativas, los anticuerpos de la invención pueden comprender una región constante que está desprovista de una o más funciones efectoras (p. ej., actividad ADCC) y/o es incapaz de unirse al receptor Fcy.

Algunas realizaciones de la invención incluyen anticuerpos en los que al menos un aminoácido en uno o más de los dominios de la región constante se ha eliminado o, si no, alterado para proporcionar características bioquímicas deseadas tales como funciones efectoras reducidas o potenciadas, la capacidad para dimerizar de forma no covalente, capacidad aumentada para localizarse en el sitio de un tumor, semivida en suero reducida o semivida en suero aumentada cuando se compara con un anticuerpo completo, inalterado, de aproximadamente la misma inmunogenicidad. Por ejemplo, algunos anticuerpos para uso en los procedimientos de diagnóstico y tratamiento descritos en el presente documento son anticuerpos suprimidos en el dominio que comprenden una cadena polipeptídica similar a una cadena pesada de inmunoglobulina, pero que carecen al menos de una porción de uno o más dominios de cadena pesada. Por ejemplo, en algunos anticuerpos, se eliminará un dominio completo de la región constante del anticuerpo modificado, por ejemplo, se suprimirá todo o parte del dominio CH₂.

En algunas otras realizaciones, los anticuerpos comprenden regiones constantes derivadas de diferentes isotipos de anticuerpos (p. ej., regiones constantes de dos o más de una IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4). humana). En otras realizaciones, los anticuerpos comprenden una bisagra quimérica (es decir, una bisagra que comprende porciones de bisagra derivadas de dominios de bisagra de diferentes isotipos de anticuerpo, p. ej., un dominio de bisagra superior de una molécula de IgG4 y un dominio de bisagra medio de IgG1). En una realización, los anticuerpos comprenden una región Fc o una porción de la misma a partir de una molécula de IgG4 humana y una mutación Ser228Pro (numeración de la UE) en la región de bisagra central de la molécula.

En algunas realizaciones, la porción Fc puede ser mutada para aumentar o disminuir la función efectora utilizando técnicas conocidas en la técnica. Por ejemplo, la eliminación o inactivación (a través de mutaciones puntuales u otros medios) de un dominio de región constante puede reducir la unión del receptor Fc del anticuerpo modificado circulante, aumentando así la localización del tumor. En otros casos, puede ser que las modificaciones de la región constante consistentes con la presente invención moderen la unión al complemento y, por ello, reduzcan la semivida en suero y la asociación inespecífica de una citotoxina conjugada. Aún otras modificaciones de la región constante se pueden usar para modificar acoplamientos de disulfuro o restos de oligosacáridos que permitan una localización potenciada debido a una mayor especificidad o flexibilidad del antígeno. El perfil fisiológico resultante, la biodisponibilidad y otros efectos bioquímicos de las modificaciones, tales como la localización del tumor, la biodistribución y la semivida en suero, pueden medirse y cuantificarse fácilmente y usando técnicas inmunológicas bien conocidas sin una excesiva experimentación.

En algunas realizaciones, un dominio Fc empleado en un anticuerpo de la invención es una variante de Fc. Como se usa en el presente documento, el término "variante de Fc" se refiere a un dominio Fc que tiene al menos una sustitución de aminoácido en relación con el dominio Fc de tipo salvaje del que se deriva dicho dominio Fc. Por ejemplo, en donde el dominio Fc se deriva de un anticuerpo IgG1 humano, la variante de Fc de dicho dominio Fc IgG1 humano comprende al menos una sustitución de aminoácido relativa a dicho dominio Fc.

La sustitución o sustituciones de aminoácidos de una variante de Fc se puede localizar en cualquier posición (es decir, cualquier posición de aminoácido de la convención de la UE) dentro del dominio Fc. En una realización, la variante de Fc comprende una sustitución en una posición de aminoácido situada en un dominio de bisagra o porción del mismo. En otra realización, la variante de Fc comprende una sustitución en una posición de aminoácido situada en un dominio CH₂o porción del mismo. En otra realización, la variante de Fc comprende una sustitución en una posición de aminoácido situada en un dominio CH₃o porción del mismo. En otra realización, la variante de Fc comprende una sustitución en una posición de aminoácido situada en un dominio CH4 o porción del mismo.

Los anticuerpos de la invención pueden emplear cualquier variante de Fc reconocida en la técnica que se sabe que comunica una mejora (p. ej., reducción o potenciación) en la función efectora y/o unión a FcR. Dichas variantes de Fc pueden incluir, por ejemplo, una cualquiera de las sustituciones de aminoácidos descritas en las publicaciones PCT internacionales WO88/07089A1, WO96/14339A1, WO98/05787A1, WO98/23289A1, WO99/51642A1, WO99/58572A1, WO00/09560A2, WO00/32767A1, WO00/42072A2, WO02/44215A2, WO02/060919A2, WO03/074569A2 WO04/016750A2 WO04/029207A2, WO04/035752A2, WO04/063351A2, WO04/074455A2, WO04/099249A2 WO05/040217A2 WO05/070963A1, WO05/077981A2, WO05/092925A2, WO05/123780A2, WO06/019447A1 WO06/047350A2, y WO06/085967A2 o en las patentes de EE.UU. N.25.648.260 5.739.277; 5.834.250; 5.869.046; 6.096.871; 6.121.022; 6.194.551; 6.242.195; 6.277.375; 6.528.624; 6.538.124; 6.737.056; 6.821.505; 6.998.253; y 7.083.784. En una realización de ejemplo, un anticuerpo de la invención puede comprender una variante de Fc que comprende una sustitución de aminoácido en la posición 268 de la UE (p. ej., H268D o H268E). En otra realización de ejemplo, un polipéptido de unión de la invención puede comprender una sustitución de aminoácido en la posición 239 de la UE (p. ej., S239D o S239E) y/o la posición 332 de la UE (p. ej., I332D o I332Q).

En algunas realizaciones, un anticuerpo de la invención puede comprender una variante de Fc que comprende una sustitución de aminoácido que altera las funciones efectoras del anticuerpo independientes del antígeno, en particular la semivida circulante del anticuerpo. Dichos anticuerpos muestran una unión aumentada o disminuida a FcRn cuando se comparan con los anticuerpos que carecen de estas sustituciones, por lo tanto, tienen una semivida aumentada o disminuida en suero, respectivamente. Se anticipa que las variantes de Fc con afinidad mejorada por FcRn tienen semividas en suero de mayor duración, y tales moléculas tienen aplicaciones útiles en procedimientos de tratamiento de mamíferos donde se desea una semivida de mayor duración del anticuerpo administrado, p. ej., para tratar una enfermedad o trastorno crónico. Por el contrario, se espera que las variantes de Fc con afinidad de unión a FcRn disminuida tengan semivida de menor duración, y tales moléculas también son útiles, por ejemplo, para su administración a un mamífero cuando puede ser ventajoso un tiempo de circulación acortado, p. ej., para imágenes de diagnóstico in vivo o en situaciones cuando el anticuerpo de partida tiene efectos secundarios tóxicos cuando está presente en la circulación durante períodos prolongados. Las variantes de Fc con afinidad de unión a FcRn disminuida también tienen menos probabilidades de atravesar la placenta y, por ello, también son útiles en el tratamiento de enfermedades o trastornos en mujeres embarazadas. Además, otras aplicaciones en las que puede desearse una afinidad de unión a FcRn reducida incluyen aquellas aplicaciones en las que se desea la localización en cerebro, riñón y/o hígado. En una realización de ejemplo, los anticuerpos de unión alterados de la invención muestran un transporte reducido a través del epitelio de los glomérulos renales de la vasculatura. En otra realización, los anticuerpos alterados o fragmentos de los mismos de unión a antígeno de la invención muestran un transporte reducido a través de la barrera hematoencefálica (BBB) desde el cerebro hacia el espacio vascular. En una realización, un anticuerpo con unión a FcRn alterada comprende un dominio Fc que tiene una o más sustituciones de aminoácidos dentro del "bucle de unión a FcRn" de un dominio Fc. El bucle de unión a FcRn está compuesto por los residuos de aminoácidos 280-299 (según la numeración de la UE). Ejemplos de sustituciones de aminoácidos con actividad de unión a FcRn alterada se describen en la publicación internacional PCT N.° WO05/047327. En algunas realizaciones de ejemplo, los anticuerpos o fragmentos de los mismos de unión a antígeno de la invención comprenden un dominio Fc que tiene una o más de las siguientes sustituciones: V284E, H285E, N286D, K₂90E y S304D (numeración de la U^e). Todavía en otros ejemplos de realizaciones, las moléculas de unión de la invención comprenden un dominio de Fc humano con la doble mutación H433K/N434F (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. N.° 8.163.881).

En otras realizaciones, los anticuerpos, para uso en los procedimientos de diagnóstico y tratamiento descritos en el presente documento tienen una región constante, p. ej., una región constante de cadena pesada de IgG1 o IgG4, que es alterada para reducir o eliminar la glicosilación. Por ejemplo, los anticuerpos de la invención también pueden comprender una variante de Fc que comprende una sustitución de aminoácido que altera la glicosilación del anticuerpo Fc. Por ejemplo, dicha variante de Fc puede tener glicosilación reducida (p. ej., glicosilación ligada a N o a O). En realizaciones de ejemplo, la variante de Fc comprende glicosilación reducida del glicano ligado a N encontrado normalmente en la posición de aminoácido 297 (numeración de la UE). En otra realización, el anticuerpo tiene una sustitución de aminoácido cerca o dentro de un motivo de glicosilación, por ejemplo, un motivo de glicosilación ligado a N que contiene la secuencia de aminoácidos NXT o NXS. En una realización particular, el anticuerpo comprende una variante de Fc con una sustitución de aminoácido en la posición de aminoácido 228 o 299 (numeración de la UE). En realizaciones más particulares, el anticuerpo comprende una región constante de IgG1 o IgG4 que comprende una mutación S228P y una mutación T299A (numeración de la UE).

VIII. Restos electores

En algunas realizaciones, los anticuerpos de la presente divulgación comprenden restos efectores. En general estos restos efectores están conjugados (o directamente o a través de un resto enlazador) a un glicano ligado a N en el anticuerpo (p. ej., un glicano ligado a N enlazado a N298 (numeración de la UE) del dominio CH₂y/o N114 (numeración Kabat) de un dominio CH1). En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo de longitud completa que comprende dos dominios CH1 con un glicano en la posición 114 de Kabat, en donde ambos glicanos están conjugados con uno o más restos efectores.

Se puede añadir cualquier resto efector a los anticuerpos divulgados en el presente documento. Los restos efectores añaden preferiblemente una función no natural a un anticuerpo alterado o a fragmentos del mismo, sin alterar significativamente la actividad intrínseca del anticuerpo. El resto efector puede ser, por ejemplo, pero no se limita a, un agente terapéutico o de diagnóstico. Un anticuerpo modificado de la presente divulgación puede comprender uno o más restos efectores, que pueden ser iguales o diferentes.

En una realización, el resto efector puede ser de Fórmula (I):

H²N-Q-CON-X

Fórmula (I),

en donde:

A) Q es NH u O; y

B) CON es un resto conector; y

C) X es un agente terapéutico como se define en el presente documento.

El resto conector conecta el agente terapéutico a H²N-Q-. El resto conector puede incluir al menos uno de cualquiera de los componentes adecuados conocidos por los expertos en la técnica, que incluyen, por ejemplo, un componente alquilenilo, un componente polietilenglicol, un componente poli(glicina), un componente poli(oxazolina), un componente carbonilo, un componente derivado de cisteinamida, un componente derivado de valina acoplada con citrulina, y un componente derivado de 4-aminobencilcarbamato, o cualquier combinación de los mismos.

En otra realización, el resto efector de Fórmula (I) puede ser de Fórmula (Ia):

H₂N-Q-CH₂-C(O)-Z-X

Fórmula (Ia),

en donde:

A) Q es NH u O; y

B) Z es -Cys-(MC)a-(VC)b-(PABC)c-(C16H3₂O8C2H4)f,

en donde

i. Cys es un componente derivado de cisteinamida;

ii. MC es un componente derivado de maleimida;

iii. VC es un componente derivado de valina acoplada con citrulina;

iv. PABC es un componente derivado de 4-aminobencilcarbamato;

v. X es un agente terapéutico como se define en el presente documento;

vi. a es 0 o 1;

vii. b es 0 o 1;

viii. c es 0 o 1; y

ix. f es 0 o 1

El "componente derivado de cisteinamida" es el punto de unión a H²N-Q-CH²-C(O)-. En una realización, el "componente derivado de cisteinamida" puede referirse a una o más porciones del resto efector que tiene la estructura:

En una realización, el componente "Cys" de un resto efector puede incluir una de dichas porciones. Por ejemplo, la siguiente estructura muestra un resto efector con una de dichas porciones (en donde el componente "Cys" se indica con el recuadro de la línea de puntos):

En otra realización, el componente "Cys" de un resto efector puede incluir dos o más de dichas porciones. Por ejemplo, el siguiente resto contiene dos de dichas porciones:

Como puede verse a partir de la estructura, cada componente "Cys" lleva un grupo -(M C M V C M P A B C M C ¹⁶H³²O⁸C²H⁴EX.

En una realización, la frase "componente derivado de maleimida" puede referirse a cualquier porción del resto efector que tiene la estructura:

en donde d es un número entero de 2 a 5. El número de componentes de MC incluidos en cualquier grupo Cys-(MC)a-(VC)b-(PABC)c-(C16H3₂O8C2H4)f-X en el resto efector está indicado por subíndice "a", y puede ser 0 o 1. En una realización, a es 1. En otra realización, b es 0.

En una realización, el componente "Cys" se puede conectar al componente "MC" a través del átomo de azufre en el componente "Cys", como se indica con el recuadro de líneas de puntos en la estructura siguiente:

En una realización, la frase "componente derivado de valina acoplada con citrulina" puede referirse a cualquier porción del resto efector con la siguiente estructura:

El número de componentes de VC incluidos en cualquier grupo Cys-(MC)^a-(VC)^b-(PABC)^c-(C ^{i 6}H³²O⁸C²H⁴)^f-X en el resto efector se indica mediante el subíndice "b", y puede ser 0 o 1. En una realización, b es 1. En otra realización, b es 0.

En una realización, la frase "componente derivado de 4-aminobencilcarbamato" puede referirse a cualquier porción del resto efector con la siguiente estructura:

El número de componentes PABC incluidos en cualquier grupo Cys-(MC)^a-(VC)^b-(PABC)^c-(C¹⁶H³²O⁸C²H⁴)^f-X en el resto efector se indica mediante el subíndice "c", y puede ser 0 o 1. En una realización, c es 1. En otra realización, c es 0.

En una realización, "C¹⁶H³²O⁸C²H⁴" se refiere a la siguiente estructura:

El número de unidades C¹⁶H³²O⁸incluidas en cualquier grupo Cys-(MC)^a-(VC)^b-(PABC)^c-(C¹⁶H³²O⁸C²H⁴)^f-X en el resto efector se indica mediante el subíndice "f". En una realización, f es 1. En otra realización, f es 0.

En una realización, a es 1, b es 1, c es 1 y f es 0.

a) Restos efectores terapéuticos

En algunas realizaciones, los anticuerpos de la presente divulgación se conjugan con un resto efector que comprende un agente terapéutico, p. ej., un resto fármaco (o profármaco del mismo) o compuesto radiomarcado. En una realización, el agente terapéutico es una citotoxina. Ejemplos de restos efectores citotóxicos se muestran en la Tabla 1 en el presente documento.

Otros ejemplos de restos fármacos incluyen agentes terapéuticos antiinflamatorios, anticancerígenos, antiinfecciosos (p. ej., antifúngicos, antibacterianos, antiparasitarios, antivíricos, etc.) y anestésicos. En una realización adicional, el resto fármaco es un agente anticancerígeno. Los ejemplos de agentes anticancerígenos incluyen, pero no se limitan a, citostáticos, inhibidores de enzimas, reguladores de genes, nucleósidos citotóxicos, agentes de unión a tubulina o inhibidores de tubulina, inhibidores de proteasoma, hormonas y antagonistas de hormonas, agentes antiangiogénicos y similares. Los ejemplos de agentes anticancerígenos citostáticos incluyen agentes alquilantes tales como la familia de fármacos antraciclina (p. ej., adriamicina, carminomicina, ciclosporina A, cloroquina, metopterina, mitramicina, porfiromicina, estreptonigrina, porfiromicina, antracenodionas y aziridinas). Otros agentes anticancerígenos citostáticos incluyen inhibidores de la síntesis de ADN (p. ej., metotrexato y diclorometotrexato, 1,4-dióxido de 3-amino-1,2,4-benzotriazina, aminopterina, citosina p-D-arabinofuranosida, 5-fluoro-5'-desoxiuridina, 5-fluorouracilo, ganciclovir, hidroxiurea, actinomicina-D y mitomicina C), intercaladores de ADN o reticuladores (p. ej., bleomicina, carboplatino, carmustina, clorambucilo, ciclofosfamida, dicloruro de cis-diaminoplatino(II) (cisplatino), melfalán, mitoxantrona y oxaliplatino) y reguladores de la transcripción de ADN-ARN (p. ej., actinomicina D, daunorrubicina, doxorrubicina, homoharringtonina e idarrubicina). Otros ejemplos de agentes citostáticos que son compatibles con la presente divulgación incluyen los compuestos de ansamicin-benzoquinonas, derivados quinonoides (p. ej., quinolonas, genisteína, bactaciclina), busulfano, ifosfamida, mecloretamina, triazicuona, diazicuona, carbazilquinona, indoloquinona EO9, diaziridinil-metilbenzoquinona DZQ, trietilenfosforamida y nitrosourea (p. ej., carmustina, lomustina y semustina).

Los ejemplos de agentes anticancerígenos nucleósidos citotóxicos incluyen, por ejemplo, arabinosida de adenosina, citarabina, arabinosida de citosina, 5-fluorouracilo, fludarabina, floxuridina, ftorafur y 6-mercaptopurina. Los ejemplos de agentes de unión a tubulina anticancerígenos incluyen taxoides (p. ej., paclitaxel, docetaxel y taxano), nocodazol, rizoxina, dolastatinas (p. ej., Dolastatin-10, -11, o -15), colchicina y colchicinoides (p. ej., ZD6126), combretastatinas (p. ej., Combretastatina A-4, AVE-6032) y alcaloides de la vinca (p. ej., vinblastina, vincristina, vindesina y vinorelbina (navelbina)). Ejemplos de hormonas y antagonistas de hormonas anticancerígenas incluyen corticosteroides (p. ej., prednisona), progestinas (p. ej., hidroxiprogesterona o medroprogesterona), estrógenos (p. ej., dietilestilbestrol), antiestrógenos (p. ej., tamoxifeno), andrógenos (p. ej., testosterona), inhibidores de aromatasa (p. ej., aminoglutetimida), 17-(alilamino)-17-demetoxigeldanamicina, 4-amino-1,8-naftalimida, apigenina, brefeldina A, cimetidina, ácido diclorometilen-difosfónico, leuprolida (leuprorelina), hormona liberadora de hormona luteinizante, pifitrina-a, rapamicina, globulina de unión a hormona sexual, y tapsigargina. Los ejemplos de compuestos anticancerígenos y antiangiogénicos incluían Angiostatina K1-3, DL-a-difluorometil-ornitina, endostatina, fumagilina, genisteína, minociclina, estaurosporina y (±)-talidomida.

Ejemplos de inhibidores de enzimas anticancerígenas incluyen, pero no se limitan a, S(+)-camptotecina, curcumina, (-)-deguelina, 1-p-D-ribofuranosida de 5,6-diclorobenz-imidazol, etopósido, formestano, fostriecina, hispidina, ácido 2-imino-1 -imidazolidinacético (ciclocreatina), mevinolina, tricostatina A, tirfostina AG 34 y tirfostina AG 879.

Ejemplos de reguladores génicos anticancerígenos incluyen 5-aza-2'-desoxicitidina, 5-azacitidina, colecalciferol (vitamina D3), 4-hidroxitamoxifeno, melatonina, mifepristona, raloxifeno, trans-retinal (aldehídos de la vitamina A), ácido retinoico, ácido de vitamina A, ácido 9-cis-retinoico, ácido 13-cis-retinoico, retinol (vitamina A), tamoxifeno y troglitazona.

Otras clases preferidas de agentes anticancerígenos incluyen, por ejemplo, la familia de fármacos de pteridinas, diynenes y podofilotoxinas. Miembros particularmente útiles de esas clases incluyen, por ejemplo, derivados de metopterina, podofilotoxina o derivados podofilotoxina tales como etopósido o fosfato de etopósido, leurosidina, vindesina, leurosina y similares.

Todavía otros agentes anticancerígenos que son compatibles con las enseñanzas en el presente documento incluyen auristatinas (p. ej., auristatina E y monometilauristán E), geldanamicina, calicheamicina, gramicidina D, maitansanoides (p. ej., maitansina), neocarcinostatina, topotecán, taxanos, citocalasina B, bromuro de etidio, emetina, tenopósido, colchicina, dihidroxi-antracindiona, mitoxantrona, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol, puromicina y análogos u homólogos de los mismos.

Todavía otros agentes anticancerígenos que son compatibles con las enseñanzas del presente documento incluyen derivados de tomaimicina, derivados de maitansina, derivados de criptoficina, derivados de antraciclina, derivados de bisfosfonato, derivados de leptomicina, derivados de estreptonigrina, derivados de auristatina y derivados de duocarmicina.

Otra clase de agentes anticancerígenos compatibles que se pueden usar como restos fármacos son fármacos radiosensibilizantes que pueden dirigirse de manera eficaz a células tumorales o inmunorreactivas. Dichos restos fármacos potencian la sensibilidad a la radiación ionizante, aumentando de ese modo la eficacia de la radioterapia. No debe estar limitado por la teoría, pero un anticuerpo modificado con un resto fármaco radiosensibilizante e internalizado por la célula tumoral entregaría el radiosensibilizador más cerca del núcleo donde la radiosensibilización sería máxima. Los anticuerpos que pierden el resto radiosensibilizador se limpiarían rápidamente de la sangre, localizando el agente de radiosensibilización restante en el tumor diana y proporcionando una absorción mínima en los tejidos normales. Después de la limpieza de la sangre, la radioterapia adjunta podría administrarse mediante radiación de haz externo dirigido específicamente al tumor, radioactividad directamente implantada en el tumor o radioinmunoterapia sistémica con el mismo anticuerpo modificado.

En una realización, el agente terapéutico comprende radionucleidos o radiomarcadores con radiación ionizante de alta energía que son capaces de causar múltiples roturas de cadena en el ADN nuclear, lo que conduce a la muerte celular. Ejemplos de radionucleidos de alta energía incluyen: 90Y, 125I, 131I, 123I, 111In, 105Rh, 153Sm, 67Cu, 67Ga, 166Ho, 177Lu, 186Re y 188Re. Estos isótopos producen típicamente partículas a o p de alta energía que tienen un camino óptico corto. Dichos radionucleidos destruyen las células a las que se encuentran muy próximos, por ejemplo, las células neoplásicas a las que se ha unido o ha entrado el conjugado. Tienen poco o ningún efecto sobre las células no localizadas y son esencialmente no inmunogénicos. Como alternativa, se pueden generar isótopos de alta energía mediante irradiación térmica de un isótopo que, de otro modo, sería estable como, por ejemplo, en la terapia por captura de neutrones de boro (Guan y col., ^pN^aS, 95: 13206-10, 1998).

En una realización, el agente terapéutico se selecciona de MMAE, MMAF y PEG8-Dol10.

Ejemplos de restos efectores terapéuticos incluyen las estructuras:

En una realización, el resto efector se selecciona de:

En algunas realizaciones, el resto efector contiene más de un agente terapéutico. Estos agentes terapéuticos múltiples pueden ser iguales o diferentes.

i. Restos efectores de diagnóstico

En algunas realizaciones, los anticuerpos de la presente divulgación están conjugados con un resto efector que comprende un agente de diagnóstico. En una realización, el agente de diagnóstico es un marcador detectable de molécula pequeña, p. ej., biotina, fluoróforos, cromóforos, sondas de resonancia de espín o radiomarcadores. Ejemplos de fluoróforos incluyen colorantes fluorescentes (p. ej., fluoresceína, rodamina y similares) y otras moléculas luminiscentes (p. ej., luminal). Un fluoróforo puede ser ambientalmente sensible de modo que su fluorescencia cambie si se encuentra cerca de uno o más residuos en el anticuerpo modificado que experimente cambios estructurales al unirse a un sustrato (p. ej., sondas de dansilo). Ejemplos de radiomarcadores incluyen moléculas pequeñas que contienen átomos con uno o más núcleos de baja sensibilidad (13C, 15N, 2H, 125I, 124I, 123I, 99Tc, 43K, 52Fe, 64Cu, 68Ga, 111In y similares). Preferiblemente, el radionucleido es un radionucleido emisor de rayos gamma, fotones o positrones con una semivida adecuada para permitir la actividad o detección después del tiempo transcurrido entre la administración y la localización en el sitio de formación de imágenes.

En una realización, el agente de diagnóstico es un polipéptido. Ejemplos de polipéptidos de diagnóstico incluyen enzimas con actividad fluorogénica o cromogénica, p. ej., la capacidad para escindir un sustrato que forma un fluoróforo o cromóforo como un producto (es decir, proteínas informadoras tales como luciferasa). Otras proteínas de diagnóstico pueden tener actividad fluorogénica o cromogénica intrínseca (p. ej., proteínas de aecuorinas bioluminiscentes fluorescentes verdes, rojas y amarillas de organismos marinos bioluminiscentes) o pueden comprender una proteína que contiene uno o más núcleos radiactivos de baja energía (13C, 15N, 2H, 125I, 124I, 123I, 99Tc, 43K, 52Fe, 64Cu, 68Ga, 111In y similares).

Con respecto al uso de conjugados radiomarcados junto con la presente divulgación, los anticuerpos de la presente divulgación pueden marcarse directamente (tal como por yodación) o pueden marcarse indirectamente mediante el uso de un agente quelante. Como se usa en el presente documento, las frases "marcaje indirecto" y "planteamiento de marcaje indirecto" significan que un agente quelante se une covalentemente a un anticuerpo y al menos un radionucleido está asociado con el agente quelante. Dichos agentes quelantes se denominan típicamente agentes quelantes bifuncionales ya que se unen tanto al anticuerpo como al radioisótopo. Ejemplos de agentes quelantes comprenden derivados de ácido 1-isotiocianatobencil-3-metildietilen-triaminopentaacético ("MX-DTPA") y de ácido ciclohexil-dietilentriamino-pentaacético ("CHX-DTPA"). Otros agentes quelantes comprenden derivados de P-DOTA y AEDT. Radionucleidos particularmente preferidos para el marcado indirecto incluyen 111In y 90Y. La mayoría de los estudios de imagen utilizan 5 mCi de anticuerpo marcado con 111In, porque esta dosis es segura y tiene una mayor eficiencia de imagen en comparación con dosis más bajas, y la óptima formación de imágenes que se produce entre tres y seis días después de la administración del anticuerpo. Véase, por ejemplo, Murray, (1985), J. Nuc. Med. 26: 3328 y Carraguillo y col. (1985), J. Nuc. Med. 26:67. Un radionucleido particularmente preferido para el marcado directo es 1311. Los expertos en la técnica comprenderán que conjugados no radiactivos también se pueden ensamblar dependiendo del agente seleccionado para conjugarse.

En algunas realizaciones, el resto efector de diagnóstico es una sonda FRET (Transferencia de Energía de Resonancia de Fluorescencia). FRET se ha utilizado para una variedad de aplicaciones de diagnóstico, incluido el diagnóstico del cáncer. Una sonda FRET puede incluir un enlazador escindible (enlazador enzimático o sensible al pH) que conecta los restos dador y aceptor de la sonda FRET, en donde la escisión da como resultado un aumento de la fluorescencia (que incluye el infrarrojo cercano) (véase, por ejemplo, A. Cobos-Correa y col., Membrane-bound FRET probe visualizes MMP12 activity in pulmonary inflammation, Nature Chemical Biology (2009), 5(9), 628-63; S. Gehrig y col., Spatially Resolved Monitoring of Neutrophil Elastase Activity with Ratiometric Fluorescent Reporters (2012) Angew. Chem. Int. Ed., 51,6258 - 6261).

En una realización, el resto efector se selecciona de:

En algunas realizaciones, los restos efectores de la invención se pueden funcionalizar para que contengan grupos adicionales además del resto efector en sí. Por ejemplo, el resto efector puede contener enlazadores escindibles que liberen el resto efector del anticuerpo en condiciones particulares. En realizaciones de ejemplo, el resto efector puede incluir un enlazador que sea escindible por enzimas celulares y/o sea sensible al pH. Además, o alternativamente, el resto efector puede contener un enlace disulfuro que sea escindido mediante glutatión intracelular tras la incorporación en la célula. Ejemplos de enlazadores de disulfuro y sensibles al pH se proporcionan a continuación:

R1-4 = H o CH3 o C2H6 u otros alifáticos

R=H o grupos alquilo y alquilarilo sustituidos o no sustituidos

En aún otras realizaciones, el resto efector puede incluir restos hidrófilos y biocompatibles tales como poli(glicina), poli(oxazolina) o restos de PEG. Las estructuras de ejemplo ("Y") se proporcionan a continuación:

P y Q = grupos funcionales iguales o diferentes para unir fármacos, moléculas informadoras y proteínas

En algunas realizaciones, el resto efector contiene un grupo aminooxi que facilita la conjugación con un anticuerpo a través de un acoplamiento oxima estable. Ejemplos de restos efectores que contienen grupos aminooxi se muestran en la Tabla 2 del presente documento.

Tabla 2. Ejemplos de restos enlazadores funcionalizados aminooxi

Tabla 2. Ejemplos de restos efectores aminooxi (en donde X puede ser cualquier enlazador, Y es cualquier espaciador, y en donde X y/o Y son opcionales)

En otras realizaciones, el resto efector contiene un grupo hidrazida y/o hidrazina N-alquilada para facilitar la conjugación con un anticuerpo a través de un acoplamiento de hidrazona estable. Ejemplos de restos efectores que contienen grupos aminooxi se muestran en la Tabla 14 en el presente documento.

Tabla 14. Hidrazina de ejemplo y/o restos efectores hidrazida

V. Conjugación de restos efectores con anticuerpos

En algunas realizaciones, los restos efectores se conjugan (directamente o a través de un resto enlazador) a un glicano oxidado (p. ej., un glicano, ligado a N, oxidado) de un anticuerpo alterado (p. ej., un glicano modificado por ingeniería genética en N298 de un dominio Fc de anticuerpo). La expresión "glicano oxidado" significa que se ha oxidado un sustituyente alcohol en el glicano, proporcionando un sustituyente carbonilo. El sustituyente carbonilo puede reaccionar con un adecuado nucleófilo de nitrógeno para formar un doble enlace carbono-nitrógeno. Por ejemplo, la reacción del grupo carbonilo con un grupo aminooxi o un grupo hidrazina formaría una oxima o hidrazina, respectivamente. En una realización, el sustituyente carbonilo es un aldehído. Los glicanos oxidados adecuados incluyen galactosa oxidada y ácido siálico oxidado.

En una realización, el anticuerpo modificado de Fórmula (II) puede ser de la Fórmula (II):

Ab(Gal-C(O)H)^x(Gal-Sia-C(O)H)^y

Fórmula (II),

en donde

A) Ab es un anticuerpo como se define en el presente documento;

B) Gal es un componente derivado de galactosa;

C) Sia es un componente derivado de ácido siálico;

D) x es 0 a 5; y

E) y es 0 a 5,

en donde al menos uno de entre x e y no es 0.

Se puede emplear cualquier química reconocida en la técnica para conjugar un resto efector (p. ej., un resto efector que comprende un resto enlazador) con un glicano (véase, p. ej., Hermanson, G.T., Bioconjugate Techniques, Academic Press (1996)). En algunas realizaciones, un residuo sacárido (p. ej., un residuo de ácido siálico o galactosa) del glicano es primero oxidado (p. ej., utilizando peryodato de sodio o tratamiento con galactosa oxidasa) para generar un grupo aldehído reactivo. Este grupo aldehído se hace reaccionar con un resto efector de un grupo aminooxi o un grupo hidrazina para formar un enlazador de oxima o hidrazona, respectivamente. Ejemplos de procedimientos que emplean este esquema de reacción general se muestran en los Ejemplos 10 a 15.

En algunas realizaciones, los glicanos nativos o modificados por ingeniería genética de un anticuerpo se pretratan primero con una enzima glicosiltransferasa in vitro para proporcionar un residuo sacárido terminal que sea adecuadamente reactivo. Por ejemplo, la sialilación puede lograrse primero utilizando una combinación de galactosiltransferasa (Gal T) y sialiltransferasa (Sial T). En algunas realizaciones, los glicanos biantenarios que carecen de galatosa (G0F o G0) o que contienen solo una galactosa (G1F o G1) pueden transformarse en estructuras galactosiladas o sialiladas de orden superior adecuadas para la conjugación (G1F, G1, G2F, G2, G1S1F, G1S1, G2S1 F, G2S1, G2S2F o G2S2).

Un ejemplo de esquema de conjugación para producir glicoconjugados sialilados se muestra en la Figura 25C. Los residuos de ácido siálico se introducen enzimáticamente y se localizan específicamente en el glicano de un anticuerpo (p. ej., un glicano modificado por ingeniería genética en el N298 del dominio Fc) utilizando una combinación de galactosiltransferasa (Gal T) y sialiltransferasa (Sial T). Los residuos de ácido siálico introducidos se oxidan posteriormente con una baja concentración de peryodato de sodio para producir aldehídos de ácido siálico reactivos adecuadamente reactivos con enlazadores de fármacos (p. ej., enlazadores de fármaco aminooxi) para generar conjugados fármaco anticuerpo (ADC) (p. ej., ADCs ligados a oxima). Controlando el número de glicanos y el número de residuos siálicos con remodelación in vitro, el experto en la técnica puede tener un control preciso sobre la relación fármaco-anticuerpo (DAR) de los ADCs. Por ejemplo, si se agrega ~1 ácido siálico sobre un único glicano biantenario (A1F) en cada una de las cadenas pesadas, se puede obtener de forma homogénea un anticuerpo con un DAR de 2.

VI. Anticuerpos modificados

En algunas realizaciones, la invención proporciona anticuerpos modificados que son el producto de los restos efectores de conjugación que están conjugados (directamente o a través de un resto enlazador) a un glicano oxidado (p. ej., un glicano oxidado ligado a N) de un anticuerpo alterado (p. ej., un glicano modificado por ingeniería genética en N298 de un dominio Fc de anticuerpo).

En una realización, el anticuerpo puede ser de Fórmula (III):

Ab--(Gal-C(H)=N-Q-CON-X)^x(Gal-Sia-C(H)=N-Q-CON-X)^y

Fórmula (III),

en donde:

A) Ab es un anticuerpo como se define en el presente documento;

B) Q es NH u O;

C) CON es un resto conector como se define en el presente documento; y

D) X es un agente terapéutico o de diagnóstico como se define en el presente documento;

E) Gal es un componente derivado de galactosa;

F) Sia es un componente derivado del ácido siálico;

G) x es 0 a 5; y

H) y es 0 a 5,

en donde al menos uno de entre x e y no es 0.

En una realización, el anticuerpo que puede ser de Fórmula (III) puede ser de Fórmula (IIIa):

Ab(Gal-C(H)=N-Q-CH²-C(O)-Z-X)^x(Gal-Sia-C(H)=N-Q-CH²-C(O)-Z-X)^y

Fórmula (IIIa),

en donde:

A) Ab es un anticuerpo;

B) Q es NH u O;

C) Z es Cys-(MC)a-(VC)b-(PABC)c-(Ci6H3₂OeC2H4)f-, en donde

i. Cys es un componente derivado de cisteinamida;

ii. MC es un componente derivado de maleimida;

iii. VC es un componente derivado de valina junto con citrulina;

iv. PABC es un componente derivado del 4-aminobencilcarbamato;

v. X es un agente terapéutico o de diagnóstico como se define en el presente documento; vi. a es 0 o 1;

vii. b es 0 o 1;

viii. c es 0 o 1; y

ix. f es 0 o 1;

D) X es un agente terapéutico como se define en el presente documento;

E) Gal es un componente derivado de galactosa;

F) Sia es un componente derivado del ácido siálico;

G) x es 0 a 5; y

H) y es 0 a 5,

en donde al menos uno de entre x e y no es 0.

Debe entenderse que la Fórmula (III) no pretende implicar que el anticuerpo, el sustituyente Gal y el sustituyente Gal-Sia estén conectados de una manera similar a una cadena. Por el contrario, cuando tales sustituyentes están presentes, el anticuerpo está conectado directamente a cada sustituyente. Por ejemplo, un anticuerpo de Fórmula (III) en el que x es 1 e y es 2 podría tener la disposición mostrada a continuación:

Fórmula (III)

El sustituyente CON en la Fórmula (III) y sus componentes en dicho lugar son como se describen con respecto a la Fórmula (I) para restos efectores.

En una realización, Q es NH. En otra realización, Q es O

En una realización, x es 0.

El anticuerpo Ab de Fórmula (III) puede ser cualquier anticuerpo adecuado como se describe en el presente documento.

En una realización, se proporciona un procedimiento para preparar el anticuerpo de Fórmula (III), comprendiendo el procedimiento hacer reaccionar un resto efector de Fórmula (I):

NH₂-Q-CON-X

Fórmula (I),

en donde:

A) Q es NH u O;

B) CON es un resto conector; y

C) X es un agente terapéutico o de diagnóstico como se define en el presente documento, con un anticuerpo modificado de Fórmula (II)

Ab(OXG)^r

Fórmula (II)

en donde

A) OXG es un glicano oxidado; y

B) r se selecciona de 0 a 4;

NH²-Q-CON-X

Fórmula (I),

en donde:

A) Q es NH u O;

B) CON es un resto conector; y

C) X es un agente terapéutico o de diagnóstico como se define en el presente documento, con un anticuerpo modificado de Fórmula (IIa)

Ab(Gal-C(O)H)x(Gal-Sia-C(O)H)y

Fórmula (IIa),

en donde

A) Ab es un anticuerpo como se describe en el presente documento;

B) Gal es un componente derivado de galactosa;

C) Sia es un componente derivado de ácido siálico;

D) x es 0 a 5; y

E) y es 0 a 5,

en donde al menos uno de entre x e y no es 0.

IX. Tratamiento con anticuerpos modificados

En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo como se reivindica en el presente documento para su uso de en los procedimientos de tratamiento de un paciente en necesidad del mismo.

Los anticuerpos de la presente divulgación son útiles en varias aplicaciones diferentes. Por ejemplo, en una realización, los anticuerpos referidos son útiles para reducir o eliminar células que llevan un epítopo reconocido por el dominio de unión del anticuerpo. En otra realización, los anticuerpos referidos son eficaces para reducir la concentración de antígeno soluble en la circulación o eliminarlo. En una realización, los anticuerpos pueden reducir el tamaño del tumor, inhibir el crecimiento del tumor y/o prolongar el tiempo de supervivencia de los animales portadores del tumor. Por consiguiente, esta divulgación se refiere también a un anticuerpo modificado para su uso en un procedimiento para tratar tumores en un humano u otro animal administrando a tal ser humano o animal una cantidad efectiva, no tóxica de anticuerpo modificado. Un experto en la materia podría, mediante experimentación de rutina, determinar qué cantidad efectiva de anticuerpo modificado sería no tóxica para tratar tumores malignos. Por ejemplo, una cantidad terapéuticamente activa de un anticuerpo modificado o sus fragmentos puede variar según factores tales como la fase de la enfermedad (p. ej., fase I frente a fase IV), edad, sexo, complicaciones médicas (p. ej., afecciones o enfermedades inmunodeprimidas) y peso del sujeto, y la capacidad del anticuerpo modificado para provocar una respuesta deseada en el sujeto. El régimen de dosificación puede ajustarse para proporcionar la respuesta terapéutica óptima. Por ejemplo, varias dosis divididas pueden administrarse diariamente, o la dosis puede reducirse proporcionalmente según lo indicado por las exigencias de la situación terapéutica.

En general, las composiciones proporcionadas en la presente divulgación se pueden usar para tratar profiláctica o terapéuticamente cualquier neoplasma que comprenda un marcador antigénico que tenga en cuenta el direccionamiento de las células cancerosas mediante el anticuerpo modificado.

X. Procedimientos de administración de anticuerpos modificados o de fragmentos de los mismos

Los procedimientos para preparar y administrar anticuerpos de la presente divulgación a un sujeto son bien conocidos o están fácilmente determinados por los expertos en la técnica. La ruta de administración de los anticuerpos de la presente divulgación puede ser oral, parenteral, por inhalación o tópica. El término parenteral como se usa en el presente documento incluye administración intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, rectal o vaginal. Las formas generalmente preferidas son intravenosa, intraarterial, subcutánea e intramuscular de administración parenteral. Si bien todas estas formas de administración se contemplan claramente dentro del alcance de la presente divulgación, una forma de administración sería una solución para inyección, en particular para inyección o goteo intravenoso o intraarterial. Habitualmente, una composición farmacéutica adecuada para inyección puede comprender un tampón (p. ej., tampón de acetato, fosfato o citrato), un tensioactivo (p. ej., polisorbato), opcionalmente un agente estabilizador (p. ej., albúmina humana), etc. Sin embargo, en otros procedimientos compatibles con las enseñanzas del presente documento, los anticuerpos modificados pueden administrarse directamente en el sitio de la población celular desfavorable, aumentando de ese modo la exposición del tejido enfermo al agente terapéutico.

En una realización, el anticuerpo que se administra es un anticuerpo de Fórmula (III):

Ab(Gal-C(H)=N-Q-CON-X)^x(Gal-Sia-C(H)=N-Q-CON-X)^y

Fórmula (III),

en donde:

A) Ab es un anticuerpo como se define en el presente documento;

B) Q es NH u O;

C) CON es un resto conector como se define en el presente documento; y

E) Gal es un componente derivado de galactosa;

F) Sia es un componente derivado de ácido siálico;

G) x es 0 a 5; y

H) y es 0 a 5,

en donde al menos uno de entre x e y no es 0.

Las preparaciones para administración parenteral incluyen soluciones, suspensiones y emulsiones, acuosas o no acuosas, estériles. Ejemplos de disolventes no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales tales como aceite de oliva y ésteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. Los vehículos acuosos incluyen agua, soluciones alcohólicas/acuosas, emulsiones o suspensiones, que incluyen soluciones salinas y medios tamponados. En las composiciones y procedimientos de la presente divulgación, los portadores farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no están limitados a, 0,01-0,1 M y preferiblemente 0,05 M de tampón de fosfato o 0,8 % de solución salina. Otros vehículos parenterales comunes incluyen soluciones de fosfato de sodio, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro de sodio, solución lactada de Ringer, o aceites fijos. Los vehículos intravenosos incluyen reabastecedores de fluidos y nutrientes, reabastecedores de electrolitos, tales como los basados en dextrosa de Ringer y similares. También pueden estar presentes conservantes y otros aditivos tales como, por ejemplo, agentes antimicrobianos, antioxidantes, quelantes, y gases inertes y similares. Más particularmente, composiciones farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones acuosas estériles (cuando son solubles en agua) o dispersiones y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. En tales casos, la composición debe ser estéril y debe ser fluida en la medida en que exista facilidad de inyección. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y se conservará preferiblemente frente a la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (p. ej., glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido, y similares), y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de la dispersión y mediante el uso de tensioactivos.

La prevención de la acción de microorganismos se puede lograr mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos en la composición, por ejemplo, azúcares, polialcoholes, tales como manitol y sorbitol, o cloruro de sodio. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede facilitarse incluyendo en la composición un agente que retrase la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

En cualquier caso, las soluciones inyectables estériles se pueden preparar incorporando un compuesto activo (p. ej., un anticuerpo modificado por sí mismo o en combinación con otros agentes activos) en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una combinación de ingredientes enumerados en el presente documento, según se requiera, seguido de esterilización filtrada. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril, que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los procedimientos preferidos de preparación son secados en vacío y liofilización, que produce un polvo de un ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional a partir de una solución filtrada previamente estéril del mismo. Las preparaciones para inyecciones se procesan, se introducen en recipientes tales como ampollas, bolsas, botellas, jeringas o viales, y se sellan en condiciones asépticas según procedimientos conocidos en la técnica. Además, las preparaciones se pueden envasar y vender en forma de un kit tal como los descritos en los documentos U.S.S.N.

09/259.337 y U.S.S.N. 09/259,338, en trámite junto con la presente. Dichos artículos de fabricación tendrán preferiblemente etiquetas o prospectos indicando que las composiciones asociadas son útiles para tratar a un sujeto que padece o está predispuesto a trastornos autoinmunes o neoplásicos.

Las dosis efectivas de las composiciones de la presente divulgación, para el tratamiento de las afecciones descritas anteriormente varían dependiendo de muchos diferentes factores, que incluyen medios de administración, sitio diana, estado fisiológico del paciente, si el paciente es humano o un animal, otros medicamentos administrados y si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. Habitualmente, el paciente es un ser humano, pero también pueden ser tratados los mamíferos no humanos, incluidos los que incluyen mamíferos transgénicos. Las dosis de tratamiento se pueden titular utilizando procedimientos de rutina conocidos por los expertos en la técnica para optimizar la seguridad y la eficacia.

Para la inmunización pasiva con un anticuerpo, la dosificación puede variar, p. ej., de aproximadamente 0,0001 a 100 mg/kg, y más habitualmente de 0,01 a 5 mg/kg (p. ej., 0,02 mg/kg, 0,25 mg/kg, 0,5 mg/kg, 0,75 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, etc.), del peso corporal del anfitrión. Por ejemplo, las dosificaciones pueden ser de 1 mg/kg de peso corporal o de 10 mg/kg de peso corporal o dentro del intervalo de 1-10 mg/kg, preferiblemente de al menos 1 mg/kg. También se pretende que las dosis intermedias en los intervalos anteriores estén dentro del alcance de la presente divulgación. A los sujetos se les pueden administrar tales dosis diariamente, en días alternos, semanalmente o según cualquier otro programa determinado por análisis empírico. Un ejemplo de tratamiento implica la administración en múltiples dosis durante un período prolongado, por ejemplo, de al menos seis meses. Ejemplos adicionales de regímenes de tratamiento implican la administración una vez cada dos semanas o una vez al mes o una vez cada 3 a 6 meses. Ejemplos de programas de dosificación incluyen 1-10 mg/kg o 15 mg/kg en días consecutivos, 30 mg/kg en días alternos o 60 mg/kg semanalmente. En algunos procedimientos, se administran simultáneamente dos o más anticuerpos monoclonales con diferentes especificidades de unión, en cuyo caso la dosificación de cada anticuerpo administrado se encuentra dentro de los intervalos indicados.

Los anticuerpos de la presente divulgación se pueden administrar en múltiples ocasiones. Los intervalos entre dosis únicas pueden ser semanales, mensuales o anuales. Los intervalos pueden ser también irregulares, como se indica al medir los niveles sanguíneos de anticuerpo modificado o antígeno en el paciente. En algunos procedimientos, la dosificación se ajusta para lograr una concentración en plasma del anticuerpo modificado de 1-1.000 gg/ml y, en algunos procedimientos, 25-300 gg/ml. Como alternativa, los anticuerpos se pueden administrar como una formulación de liberación sostenida, en cuyo caso se requiere una administración menos frecuente. Para los anticuerpos, la dosificación y la frecuencia varían dependiendo de la semivida del anticuerpo en el paciente. En general, los anticuerpos humanizados muestran la semivida más larga, seguida por los anticuerpos quiméricos y por los anticuerpos no humanos.

La dosificación y la frecuencia de administración pueden variar dependiendo de si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. En aplicaciones profilácticas, las composiciones que contienen los presentes anticuerpos o un cóctel de los mismos se administran a un paciente que aún no se encuentra en estado patológico para potenciar la resistencia del paciente. Dicha cantidad se define como una "dosis efectiva profiláctica". En este uso, las cantidades exactas dependen nuevamente del estado de salud e inmunidad general del paciente, pero generalmente varían de 0,1 a 25 mg por dosis, especialmente de 0,5 a 2,5 mg por dosis. Se administra una dosificación relativamente baja a intervalos relativamente ocasionales durante un largo período de tiempo. Algunos pacientes continúan recibiendo tratamiento durante el resto de sus vidas. En aplicaciones terapéuticas, a veces se requiere una dosis relativamente alta (p. ej., de aproximadamente 1 a 400 mg/kg de anticuerpo por dosis, siendo las dosis de 5 a 25 mg más frecuentemente usadas para radioinmunoconjugados y las dosis más altas para anticuerpos modificados con fármaco-citotoxina) a intervalos relativamente cortos hasta que la progresión de la enfermedad se reduce o finaliza, y preferiblemente hasta que el paciente muestra una mejoría parcial o completa de los síntomas de la enfermedad. A partir de entonces, al paciente se le puede administrar un régimen profiláctico.

Los anticuerpos de la presente divulgación se pueden administrar, opcionalmente, en combinación con otros agentes que sean eficaces en el tratamiento del trastorno o afección que necesiten tratamiento (p. ej., profiláctico o terapéutico).

Las dosificaciones efectivas de tratamiento único (es decir, cantidades terapéuticamente eficaces) de anticuerpos modificados marcados con 90Y de la presente divulgación varían de entre aproximadamente 5 y aproximadamente 75 mCi, más preferiblemente entre aproximadamente 10 y aproximadamente 40 mCi. Las dosis ablativas eficaces no medulares de tratamiento único con anticuerpos modificados con 1311 varían entre aproximadamente 5 y aproximadamente 70 mCi, más preferiblemente entre aproximadamente 5 y aproximadamente 40 mCi. Las dosis ablativas eficaces de tratamiento único (es decir, que pueden requerir trasplante de médula ósea autóloga) de anticuerpos marcados con 1311 varían de entre aproximadamente 30 y aproximadamente 600 mCi, más preferiblemente entre aproximadamente 50 y menos que aproximadamente 500 mCi. Junto con un anticuerpo quimérico, debido a la semivida circulante más larga frente a anticuerpos murinos, las dosis ablativas eficaces no medulares de tratamiento único de anticuerpos quiméricos marcados con yodo-131 varía de entre aproximadamente 5 y aproximadamente 40 mCi, más preferiblemente menos que aproximadamente 30 mCi. Los criterios de imagen para, p. ej., el marcado con 111In, son típicamente menores que aproximadamente 5 mCi.

Aunque los anticuerpos pueden administrarse como se describió inmediatamente antes, conviene subrayarse que en otras realizaciones la unión se puede administrar a pacientes, por lo demás, sanos como una terapia de primera línea. En tales realizaciones, los anticuerpos pueden ser administrados a pacientes que tienen reservas de médula roja, normales o medias, y/o a pacientes que no se han sometido, y no se están sometiendo a otras terapias. Como se utiliza en el presente documento, la administración de anticuerpos modificados o fragmentos de los mismos junto con o en combinación con una terapia adjunta quiere decir la administración o aplicación secuencial, simultánea, coextensiva, concurrente, concomitante o contemporánea de la terapia y de los anticuerpos descritos. Los expertos en la técnica comprenderán que la administración o aplicación de los diversos componentes del régimen terapéutico combinado se puede programar para potenciar la eficacia global del tratamiento. Por ejemplo, los agentes quimioterapéuticos podrían administrarse en planes de tratamiento estándares, bien conocidos, seguidos en unas pocas semanas por radioinmunoconjugados de la presente divulgación. En cambio, los anticuerpos asociados a citotoxinas podrían administrarse por vía intravenosa seguido de radiación de haz externo localizada hacia el tumor. Todavía en otras realizaciones, el anticuerpo modificado puede administrarse simultáneamente con uno o más agentes quimioterapéuticos seleccionados en una única visita a la clínica. Un experto en la técnica (p. ej., un oncólogo con experiencia) podría ser capaz de discernir fácilmente regímenes terapéuticos combinados efectivos sin una experimentación excesiva basándose en la terapia adjunta seleccionada y las enseñanzas de la presente memoria descriptiva.

A este respecto, se comprenderá que la combinación de los anticuerpos y el agente quimioterapéutico se puede administrar en cualquier orden y dentro de cualquier marco de tiempo que proporcione un beneficio terapéutico al paciente. Es decir, el agente quimioterapéutico y los anticuerpos se pueden administrar en cualquier orden o concurrentemente. En realizaciones seleccionadas, los anticuerpos de la presente divulgación se administrarán a pacientes que se han sometido previamente a quimioterapia. Todavía en otras realizaciones, los anticuerpos y el tratamiento quimioterapéutico se administrarán de forma sustancialmente simultánea o concurrentemente. Por ejemplo, al paciente se le pueden administrar los anticuerpos mientras se somete a un plan de quimioterapia. En realizaciones preferidas, el anticuerpo modificado se administrará dentro de un año de cualquier agente o tratamiento quimioterapéutico. En otras realizaciones preferidas, los anticuerpos se administrarán dentro de 10, 8, 6, 4 o 2 meses de cualquier agente o tratamiento quimioterapéutico. Aún en otras realizaciones preferidas, el anticuerpo se administrará dentro de 4, 3, 2 o 1 semana de cualquier agente o tratamiento quimioterapéutico. Todavía en otras realizaciones, los anticuerpos se administrarán dentro de 5, 4, 3, 2 o 1 días del agente o tratamiento quimioterapéutico seleccionado. Se comprenderá además que los dos agentes o tratamientos se pueden administrar al paciente con diferencia de horas o minutos (es decir, de forma sustancialmente simultánea).

Se comprenderá además que los anticuerpos de la presente divulgación se pueden usar junto con o en combinación con cualquier agente o agentes quimioterapéuticos (p. ej., para proporcionar un régimen terapéutico combinado) que elimina, reduce, inhibe o controla el crecimiento de células neoplasias in vivo. Ejemplos de agentes quimioterapéuticos que son compatibles con la presente divulgación incluyen agentes alquilantes, alcaloides de la vinca (p. ej., vincristina y vinblastina), procarbazina, metotrexato y prednisona. La combinación MOPP de cuatro fármacos (mecloretamina (mostaza nitrogenada), vincristina (Oncovin), procarbazina y prednisona) es muy eficaz en el tratamiento de varios tipos de linfoma y comprende una realización preferida de la presente divulgación. En pacientes resistentes a MOPP, pueden usarse combinaciones de ABVD (p. ej., adriamicina, bleomicina, vinblastina y dacarbazina), ChIVPP (clorambucilo, vinblastina, procarbazina y prednisona), CABS (lomustina, doxorrubicina, bleomicina y estreptozotocina), MOPP más ABVD, MOP^pmás ABV (doxorrubicina), bleomicina y vinblastina) o BCVPP (carmustina, ciclofosfamida, vinblastina, procarbazina y prednisona). Arnold S. Freedman y Lee M. Nadler, Malignant Lymphomas, en HARRISON'S PRINCIPLES OF INTERNAL MEDICINE 1774-1788 (Kurt J. Isselbacher y col., eds., 13a ed., 1994) y V. T. DeVita y col. (1997) y las referencias citadas allí para dosificación y programación estándares. Estas terapias pueden usarse sin modificaciones, o alteradas según sea necesario para un paciente particular, en combinación con uno o más anticuerpos de la presente divulgación como se describe en el presente documento.

Los regímenes adicionales que son útiles en el contexto de la presente divulgación incluyen el uso de agentes alquilantes individuales tales como ciclofosfamida o clorambucilo, o combinaciones tales como CVP (ciclofosfamida, vincristina y prednisona), CHOP (CVP y doxorrubicina), C-MOPP (ciclofosfamida, vincristina, prednisona y procarbazina), CAP-BOP (CHOP más procarbazina y bleomicina), m-BACOD (CHOP más metotrexato, bleomicina y leucovorina), ProMACE-MOPP (prednisona, metotrexato, doxorrubicina, ciclofosfamida, etopósido y leucovorina más MOPP estándar), ProMACE-CytaBOM (prednisona, doxorrubicina, ciclofosfamida, etopósido, citarabina, bleomicina, vincristina, metotrexato y leucovorina) y MACOP-B (metotrexato, doxorrubicina, ciclofosfamida, vincristina, dosis fija de prednisona, bleomicina y leucovorina). Los expertos en la técnica podrán determinar fácilmente las dosificaciones estándares y la programación de cada uno de estos regímenes. CHOP también se ha combinado con bleomicina, metotrexato, procarbazina, mostaza nitrogenada, arabinósido de citosina y etopósido. Otros agentes quimioterapéuticos compatibles incluyen, pero no se limitan a, 2-clorodesoxiadenosina (2-CDA), 2'-desoxicoformicina y fludarabina.

Para pacientes con NHL de grado intermedio y alto, que no logran la remisión o recaída, se usa la terapia de rescate. Las terapias de rescate emplean fármacos como arabinósido de citosina, carboplatino, cisplatino, etopósido e ifosfamida administrados solos o en combinación. En las formas recidivantes o agresivas de algunos trastornos neoplásicos, a menudo se usan los siguientes protocolos: IMVP-16 (ifosfamida, metotrexato y etopósido), MIME (metilgag, ifosfamida, metotrexato y etopósido), DHAP (dexametasona, dosis altas de citarabina y cisplatino), ESHAP (etopósido, metilpredisolona, citarabina HD y cisplatino), CEPP(B) (ciclofosfamida, etopósido, procarbazina, prednisona y bleomicina) y CAMP (lomustina, mitoxantrona, citarabina y prednisona) cada uno con tasas de dosificación y programas bien conocidos.

La cantidad de agente quimioterapéutico a usar en combinación con los anticuerpos modificados de la presente divulgación puede variar según el sujeto o se puede administrar según lo que se conoce en la técnica. Véase, por ejemplo, Bruce A. Chabner y col., Antineoplastic Agents, en GOODMAN & GILMAN'S THE PHARMACOLOGICAL BASIS O^fTHERAPEUTICS 1233-1287 (Joel G. Hardman y col., eds., 9a edición, 1996).

Como se discutió previamente, los anticuerpos de la presente divulgación, fragmentos inmunorreactivos o recombinantes de los mismos pueden administrarse en una cantidad farmacéuticamente eficaz para el tratamiento in vivo de trastornos de mamíferos. A este respecto, se comprenderá que los anticuerpos divulgados se formularán para facilitar la administración y promover la estabilidad del agente activo.

Preferiblemente, las composiciones farmacéuticas según la presente divulgación comprenden un vehículo estéril, no tóxico y farmacéuticamente aceptable tal como solución salina fisiológica, tampones no tóxicos, conservantes y similares. Para los fines de la presente aplicación, una cantidad farmacéuticamente eficaz del anticuerpo modificado, fragmento inmunorreactivo o recombinante del mismo, conjugado o no conjugado con un agente terapéutico, debe considerarse como una cantidad suficiente para lograr la unión efectiva a un antígeno y lograr un beneficio, p. ej., para mejorar los síntomas de una enfermedad o trastorno o para detectar una sustancia o una célula. En el caso de las células tumorales, el anticuerpo modificado será preferiblemente capaz de interactuar con antígenos inmunorreactivos seleccionados sobre células neoplásicas o inmunorreactivas y proporciona un aumento en la muerte de esas células. Por supuesto, las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación se pueden administrar en dosis únicas o múltiples para proporcionar una cantidad farmacéuticamente eficaz del anticuerpo modificado.

Según el alcance de la presente divulgación, los anticuerpos de la divulgación pueden administrarse a un ser humano u otro animal según los procedimientos de tratamiento mencionados anteriormente en una cantidad suficiente para producir un efecto terapéutico o profiláctico. Los anticuerpos de la divulgación se pueden administrar a dicho ser humano u otro animal en una forma de dosificación convencional preparada combinando el anticuerpo de la divulgación con un portador o diluyente convencional farmacéuticamente aceptable según técnicas conocidas. Un experto en la técnica admitirá que la forma y el carácter del portador o diluyente farmacéuticamente aceptable viene dictada por la cantidad de ingrediente activo con el que se va a combinar, la vía de administración y otras variables bien conocidas. Los expertos en la materia comprenderán además que un cóctel que comprende una o más especies de anticuerpos descritos en la presente divulgación puede demostrar ser particularmente eficaz.

V. Expresión de anticuerpos

En un aspecto, la invención proporciona polinucleótidos que codifican los anticuerpos reivindicados en el presente documento. También se proporciona un procedimiento para preparar un anticuerpo que comprende expresar estos polinucleótidos.

Los polinucleótidos que codifican los anticuerpos descritos en el presente documento se insertan típicamente en un vector de expresión para la introducción en células anfitrionas que puedan usarse para producir la cantidad deseada de los anticuerpos reivindicados, o fragmentos de los mismos. Por consiguiente, en algunos aspectos, la invención proporciona vectores de expresión que comprenden polinucleótidos divulgados en el presente documento y células anfitrionas que comprenden estos vectores y polinucleótidos.

El término "vector" o "vector de expresión" se usa en el presente documento para los fines de la memoria descriptiva y las reivindicaciones, para referirse a vectores usados según la presente invención como vehículo para introducir un gen deseado en una célula y expresarlo. Como saben los expertos en la técnica, tales vectores se pueden seleccionar fácilmente del grupo que consiste en plásmidos, fagos, virus y retrovirus. En general, los vectores compatibles con la presente invención comprenderán un marcador de selección, sitios de restricción apropiados para facilitar la clonación del gen deseado y la capacidad de entrar y/o replicarse en células eucariotas o procariotas.

Se pueden emplear numerosos sistemas de vectores de expresión para los fines de esta invención. Por ejemplo, una clase de vector utiliza elementos de ADN que se derivan de virus animales tales como virus del papiloma bovino, virus del polioma, adenovirus, virus de la vacuna, baculovirus, retrovirus (RSV, MMTV o MOMLV) o virus SV40. Otros implican el uso de sistemas policistrónicos con sitios de unión a ribosomas internos. Además, las células que han integrado el ADN en sus cromosomas se pueden seleccionar introduciendo uno o más marcadores que permitan la selección de células anfitrionas transfectadas. El marcador puede proporcionar prototrofía a una anfitriona auxotrófica, resistencia a biocidas (p. ej., antibióticos) o resistencia a metales pesados tales como cobre. El gen marcador seleccionable se puede enlazar directamente a las secuencias de ADN que se van a expresar, o introducirse en la misma célula mediante cotransformación. También se pueden necesitar elementos adicionales para la síntesis óptima de ARNm. Estos elementos pueden incluir secuencias de señal, señales de empalme, así como promotores transcripcionales, potenciadores y señales de terminación. En realizaciones particularmente preferidas, los genes de la región variable clonada se insertan en un vector de expresión junto con los genes de la región constante de cadena pesada y ligera (preferiblemente humanos) sintéticos como se discutió anteriormente.

En otras realizaciones preferidas, los anticuerpos de la invención se pueden expresar utilizando construcciones policistrónicas. En tales sistemas de expresión, pueden producirse múltiples productos génicos de interés, tales como cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos, a partir de una única construcción policistrónica. Estos sistemas usan ventajosamente un sitio de entrada al ribosoma interno (IRES) para proporcionar niveles relativamente altos de anticuerpos de la invención en células anfitrionas eucariotas. Las secuencias de IRES compatibles se describen en la patente de EE.UU. N.° 6.193.980. Los expertos en la técnica comprenderán que tales sistemas de expresión se pueden usar para producir de forma efectiva la gama completa de anticuerpos divulgados en la presente aplicación.

Más generalmente, una vez que se ha preparado un vector o secuencia de ADN que codifica un anticuerpo, o un fragmento del mismo, el vector de expresión se puede introducir en una célula anfitriona apropiada. Es decir, las células anfitrionas se pueden transformar. La introducción del plásmido en la célula anfitriona se puede llevar a cabo mediante diversas técnicas bien conocidas por los expertos en la técnica. Estos incluyen, pero no se limitan a, transfección (que incluye electroforesis y electroporación), fusión de protoplastos, precipitación con fosfato de calcio, fusión celular con ADN con envoltura, microinyección e infección con virus intactos. Véase, Ridgway, A. A. G. "Mammalian Expression Vectors" Capítulo 24.2, pág. 470-472 Vectors, Rodriguez y Denhardt, Eds. (Butterworths, Boston, Mass. 1988). Lo más preferible es que la introducción del plásmido en la anfitriona sea por electroporación. Las células transformadas se cultivan en condiciones apropiadas para la producción de cadenas ligeras y cadenas pesadas, y se ensayan para la síntesis de proteínas de cadena pesada y/o ligera. Ejemplos de técnicas de ensayo incluyen ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), radioinmunoensayo (RIA) o análisis de clasificador de células activadas por fluorescencia (FACS), inmunohistoquímica y similares.

Como se usa en el presente documento, el término "transformación" se usará en un sentido amplio para referirse a la introducción de ADN en una célula anfitriona receptora que cambie el genotipo y, en consecuencia, dé como resultado un cambio en la célula receptora.

En estas mismas líneas, "células anfitrionas" se refiere a células que se han transformado con vectores construidos utilizando técnicas de ADN recombinante y que codifican al menos un gen heterólogo. En las descripciones de procesos para el aislamiento de anticuerpos a partir de anfitrionas recombinantes, el término "célula" y la expresión "cultivo celular" se usan indistintamente para indicar la fuente de anticuerpo a menos que se especifique claramente lo contrario. En otras palabras, la recuperación de anticuerpos a partir de las "células" puede significar tanto a partir de células enteras centrifugadas, como a partir del cultivo celular que contiene tanto el medio como las células suspendidas.

En una realización, la línea celular anfitriona utilizada para la expresión del anticuerpo es de origen mamífero; los expertos en la técnica pueden determinar líneas celulares anfitrionas particulares que son las más adecuadas para que el producto génico deseado se exprese en ellas. Ejemplos de líneas celulares anfitrionas incluyen, pero no están limitadas a, DG44 y DUXB11 (líneas de ovario de hámster chino, DHFR-), HELA (carcinoma de cuello uterino humano), CVI (línea de riñón de mono), COS (un derivado de CVI con antígeno T de SV40), R1610 (fibroblasto de hámster chino) BALBC/3T3 (fibroblastos de ratón), HAK (línea de riñón de hámster), SP2/O (mieloma de ratón), BFA-1c1BPT (células endoteliales bovinas), RAJI (linfocito humano), 293 (riñón humano). En una realización, la línea celular proporciona una glicosilación alterada, p. ej., afucosilación, del anticuerpo expresado de la misma (p. ej., líneas celulares de CHO PER.C6® (Crucell) o inactivado en FUT8 (Potelligent® Cells) (Biowa, Princeton, N. J.)). En una realización, se pueden usar células NS0. Las células de CHO son particularmente preferidas. Por lo general, las líneas celulares anfitrionas están disponibles típicamente de los servicios comerciales, la American Tissue Culture Collection o de la documentación publicada.

La producción in vitro permite el escalamiento para administrar grandes cantidades de los anticuerpos deseados. Las técnicas para el cultivo de células de mamífero en condiciones de cultivo de tejidos son conocidas en la técnica e incluyen un cultivo en suspensión homogénea, p. ej., en un reactor de transporte aéreo o en un reactor de agitación continua, o cultivo celular inmovilizado o atrapado, p. ej., en fibras huecas, microcápsulas, microesferas de agarosa o cartuchos cerámicos. Si es necesario y/o se desea, las soluciones de anticuerpos pueden purificarse mediante procedimientos de cromatografía habituales, por ejemplo, filtración en gel, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía sobre DEAE-celulosa y/o cromatografía de (inmuno-) afinidad.

Los genes que codifican los anticuerpos de la invención también se pueden expresar células de no mamífero tales como bacterias o levaduras o células vegetales. A este respecto, se comprenderá que también pueden transformarse diversos microorganismos unicelulares no mamíferos, tales como bacterias; es decir, aquellos capaces de ser desarrollados en cultivos o fermentación. Las bacterias, que son susceptibles de transformación, incluyen miembros de las enterobacteriáceas, tales como cepas de Escherichia coli o Salmonella; Bacillaceae, tal como Bacillus subtilis; Neumococo; Estreptococo y Haemophilus influenzae. Se comprenderá además que, cuando se expresan en bacterias, los anticuerpos pueden llegar a ser parte de los cuerpos de inclusión. Los anticuerpos se deben aislar, purificar y luego ensamblar en moléculas funcionales.

Además de procariotas, también se pueden usar microbios eucariotas. Saccharomyces cerevisiae, o levadura normal de panadería, es el más frecuentemente utilizado entre los microorganismos eucariotas, aunque otras diversas cepas están comúnmente disponibles. Para la expresión en Saccharomyces, se usa normalmente el plásmido YRp7, por ejemplo, (Stinchcomb y col., Nature, 282: 39 (1979); Kingsman y col., Gene, 7: 141 (1979); Tschemper y col., Gene, 10: 157 (1980)). Este plásmido ya contiene el gen TRP1 que proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura que carece de la capacidad de crecer en triptófano, por ejemplo, ATCC N.° 44076 o PEP4-1 (Jones, Genetics, 85:12 (1977)). La presencia de la lesión trp1 como una característica del genoma de la célula anfitriona de levadura proporciona entonces un entorno eficaz para detectar la transformación por crecimiento en ausencia de triptófano.

Ejemplos

La presente invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos.

Ejemplo 1. Diseño, preparación y caracterización de mutantes de anticuerpo de hiperglicosilación 2C3 anti-CD-52

Se diseñaron múltiples mutaciones de hiperglicosilación en la cadena pesada del anticuerpo anti-CD-52, 2C3, con el fin de añadir un grupo voluminoso a una interfaz de interacción (p. ej., el sitio de unión a FcRn para modular la farmacocinética de anticuerpos), para modular la función efectora de anticuerpos cambiando su interacción con FcgRs, o para introducir una nueva modificación química de la subsecuencia del sitio de entrecruzamiento para la conjugación del resto efector, que incluye, pero no se limita a, fármacos, toxinas, agentes citotóxicos y radionucleótidos. Los mutantes de 2C3 hiperglicosilados se muestran en la Tabla 3.

Tabla 3. Mutantes 2C3 anti-CD-52 hiperglicosilados

1A. Creación de mutantes de hiperglicosilación de anticuerpos 2C3 anti-CD-52

La mutación A114N, designada basada en el sistema de numeración de Kabat, se introdujo en el dominio CH1 de 2C3 mediante PCR mutagénica. Para crear el anticuerpo de longitud completa, el dominio VH más el residuo A114N mutado se insertó por clonación independiente de ligadura (LIC) en el vector pENTR-LIC-IgG1 que codifica los dominios de CH 1-3 del anticuerpo. Todas las demás mutaciones se introdujeron en pENTR-LIC-IgG1 mediante mutagénesis dirigida al sitio con un kit de mutagénesis dirigida al sitio QuikChange (Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA, EE. UU.). La VH 2C3 WT se clonó en vectores mutados por LIC. Los mutantes de longitud completa se clonaron en el vector de expresión pCEP4(-E+I)Dest mediante clonación de Gateway. Las mutaciones Fc se designaron basadas en el sistema de numeración de la UE. Las mutaciones se confirmaron por secuenciación de ADN. Las secuencias de aminoácidos de las cadenas pesada y ligera de 2C3 WT y las cadenas pesadas de 2C3 mutadas se muestran en la Tabla 4. Los aminoácidos mutados están resaltados en gris y los sitios diana de glicosilación de consenso, creados por la mutación, están subrayados.

Tabla 4. Secuencias de aminoácidos de anticuerpos 2C3 anti-CD-52

Los mutantes y el control WT se transfectaron en células HEK₂93-EBNA en un formato de placa de 6 pocilios. Como se muestra en la Figura 9, se encontró que el nivel de expresión era ~0,1 μg/ml, según se analizó mediante SDS-PAGE e inmunotransferencia. La expresión de mutantes en medios acondicionados se midió también mediante captura de proteína A en Biacore. La concentración se determinó utilizando la respuesta de disociación 6 minutos después de la inyección en proteína A inmovilizada. Como curva patrón se usó 2C3 WT producido en CHO con series de diluciones en medios desde 90 μg/ml hasta 1,5 ng/ml. Las concentraciones se calcularon hasta ~0,2 μg/ml mediante una curva de calibración utilizando un ajuste de 4 parámetros. Como se muestra en la Figura 9, los niveles de expresiones relativas fueron bajos y se correspondieron, generalmente, con los resultados de inmunotransferencia.

1B. Verificación de hiperglicosilación

Para determinar si se introdujeron sitios de glicosilación adicionales mediante mutación, se trataron proteínas 2C3 mutantes y de tipo salvaje con la enzima desglicosilante universal PNGasa F y se analizaron muestras de proteínas mediante SDS-PAGE e inmunotransferencia. Como se muestra en la Figura 10, solo el mutante A114N tenía un peso molecular aparente incrementado, lo que indica la presencia de un carbohidrato adicional ligado a N.

Se produjeron preparaciones de anticuerpos a pequeña escala para purificar los mutantes 2C3 para una verificación adicional de la introducción en el sitio de glicosilación. Como se muestra en la Figura 11, se confirmó por SDS-PAGE que solo el mutante A114N tenía sitios de glicosilación adicionales introducidos.

1C. Propiedades de unión de mutantes 2C3 anti-CD-52

Se usó Biacore para comparar las propiedades de unión de las proteínas purificadas. FcRn-HPC4 de ratón y humano purificado en SEC se inmovilizaron en un chip CM5 mediante acoplamiento de amina. Cada anticuerpo se diluyó a 200, 50 y 10 nM y se inyectó sobre los receptores Fc inmovilizados. Campath, 2C3 WT producido en CHO y Campath tratado con DEPC se incluyeron como controles positivos y negativos. Como se muestra en la Figura 13, el mutante Y436S mostró aproximadamente una disminución de 2 veces en la unión a FcRn humano. Curiosamente, la unión de este mutante a FcRn de ratón no se vio afectada. Ninguna de las otras mutaciones 2C3 tuvo ningún efecto considerable sobre la unión de FcRn humano o de ratón.

Se usó Biacore para comparar las propiedades de unión a antígeno de las proteínas purificadas utilizando el ensayo de unión en Biacore del péptido 741 de CD-52. El péptido 741 de CD-52 y el péptido 777 de control se inmovilizaron en un chip CM5. Los anticuerpos se diluyeron en serie 2 veces desde 60 a 0,2 nM en HBS-EP y se inyectaron por duplicado durante 3 minutos seguido de una disociación de 5 minutos en tampón a un caudal de 50 μl/min. El lote 17200-084 GLD52 se incluyó como control. La superficie se regeneró con 1 pulso de HCl 40 mM. Se usó un modelo de unión 1:1 para ajustar las curvas de 7,5 a 0,2 nM. Como se muestra en la Figura 16, el mutante A114N tenía una afinidad de unión a CD-52 ligeramente menor, mientras que el mutante NGT tenía una afinidad ligeramente superior que el resto de los mutantes en este ensayo. El ensayo de unión en Biacore del péptido 741 de CD-52 se repitió con la proteína purificada a partir de una prep. a mayor escala. Como se muestra en la Figura 17, el mutante A114N exhibía unión peptídica a CD-52 que era comparable a 2C3 WT.

1D. Caracterización de la carga del mutante A114N

Se realizó el enfoque isoeléctrico (IEF) para caracterizar la carga de los mutantes 2C3. La proteína purificada se ejecutó en geles de acrilamida (IPG) con gradiente de pH inmovilizado (pH 3-10). Como se muestra en la Figura 18A, se encontró que A114N tenía más cargas negativas, probablemente debido a residuos de ácido siálico. Los datos de MS intactos confirmaron la estructura compleja con ácidos siálicos en el mutante A114N. Por el contrario, se demostró que 2C3 WT tiene G0F y G1F como las especies de glicosilación dominantes (Figuras 18C y 18D, respectivamente).

Ejemplo 2. Preparación de mutantes de hiperglicosilación en varias cadenas principales de anticuerpos

Además del anticuerpo 2C3 anti-CD-52, la mutación A114N se modificó por ingeniería genética en otras diversas cadenas principales de anticuerpos para confirmar que el único sitio de hiperglicosilación podría introducirse en secuencias de dominio variable de cadena pesada no relacionadas. Los mutantes anti-TEM1, anti-FAP y anti-Her2 hiperglicosilados se muestran en la Tabla 5.

Tabla 5. Mutantes A114N y/o S298N designados en varios anticuerpos no relacionados

2A. Creación de mutantes de hiperglicosilación de anticuerpos anti-TEM1 y anti-FAP

La mutación A114N, designada basada en el sistema de numeración de Kabat, se introdujo en el dominio CH1 de anti-TEM1 y anti-FAP mediante PCR mutagénica. Para crear el anticuerpo de longitud completa, el VH mutado más residuo 114 se insertó por clonación independiente de ligadura (LIC) en el vector pENTR-LIC-IgG1 que codifica los dominios de CH 1-3 del anticuerpo. Los mutantes de longitud completa se clonaron luego en el vector de expresión pCEP4(-E+I)Dest mediante clonación de Gateway. Las mutaciones se confirmaron por secuenciación de ADN. Las secuencias de aminoácidos de las cadenas pesada y ligera del tipo salvaje y mutadas anti-TEM1 se muestran en la Tabla 6. Los aminoácidos mutados están resaltados en gris y los sitios diana de glicosilación de consenso, creados por la mutación, están subrayados.

Tabla 6. Secuencias de aminoácidos de anticuerpos anti-TEM1 y anti-FAP

Los mutantes y el control de tipo salvaje se transfectaron en células HEK₂93-EBNA en un formato de matraz triple y se purificaron en columnas de proteína A HiTrap (GE Healthcare Biosciences, Pittsburgh, PA, EE.UU.). Analizado mediante A280 en un espectrofotómetro NanoDrop, la expresión de A114N anti-FAP y A114C anti-FAP fue de aproximadamente 3 μg/ml y aproximadamente 1 μg/ml, respectivamente. La expresión de A114N anti-TEM1 fue de aproximadamente 0,04 μg/ml.

2B. Verificación de hiperglicosilación

Para confirmar que el sitio de glicosilación adicional se introdujo en los mutantes A114N, la proteína purificada a partir de los mutantes A114N se analizó en SDS-PAGE con reducción junto con proteína de control de tipo salvaje. Un sitio de glicosilación adicional agregaría 2.000-3.000 Dalton al peso molecular de la cadena pesada. Como se muestra en la Figura 20, SDS-PAGE indicó que las bandas de cadena pesada del mutante A114N de anti-FAP y de anti-TEM1 tenían un peso molecular aparente incrementado, congruente con la introducción satisfactoria de un sitio de glicosilación adicional para ambos anticuerpos.

2C. Creación de mutantes de hiperglicosilación del anticuerpo anti-Her2

Los anticuerpos A114N Her-2, A114N/NNAS Her-2 y WT Her-2 se crearon por clonación independiente de ligadura. El dominio VH de Herceptina se sintetizó y se amplificó por PCR con dos juegos de cebadores compatibles con LIC, bien WT o que transportan la mutación A114N. Para obtener un anticuerpo de longitud completa, se clonaron insertos de VH amplificados (WT o A114N) en dos vectores pENTR que codifican dominios de CH 1-3, pENTR-LIC-IgG1 WT y pENTR-LIC-IgG1 NⁿAS, dando como resultado tres mutantes de longitud completa (A114N, NⁿAS, A114N/NNAS) y control WT como clones de entrada en pENTR. Estos mutantes se clonaron en el vector de expresión pCEP4(-E+I)Dest, mediante clonación de Gateway. Las mutaciones se confirmaron por secuenciación de ADN. Las secuencias de aminoácidos de las cadenas pesada y ligera de tipo salvaje y mutadas anti-Her-2 se muestran en la Tabla 7. Los aminoácidos mutados están resaltados en gris y los sitios diana de glicosilación de consenso, creados por la mutación, están subrayados.

Tabla 7. Secuencias de aminoácidos de anticuerpos anti-Her-2

2D. Expresión del mutante de hiperglicosilación del anticuerpo A114N anti-Her2

Las construcciones A114N anti-Her2 y de tipo salvaje se transfectaron con Lipofectamine-2000 (proporción de 2,5:1 de reactivo frente a ADN) y XtremeGene ^hP (proporción 3:1 de reactivo frente a ADN) en células HEK₂93-EBNA en 12 matraces triples. La medición en Octet de alícuotas a partir de medios acondicionados (CM) del día 3 mostró que la expresión de proteínas fue constante en 6 matraces tanto para Lipofectamine-2000 como para XtremeGene HP. Como se muestra en la Tabla 8, la eficacia de transfección global fue aproximadamente un 30 % mayor con XtremeGene HP. Los medios acondicionados recogidos el día 3 se combinaron para las dos condiciones de transfección y se purificaron mediante una columna de proteína A. La medición en Octet mostró 1,8 gg/ml de anticuerpo en el medio simulado que contiene suero frente a 0 gg/ml en un medio simulado que no tenía suero.

Tabla 8. Expresión mutante de hiperglicosilación de A114N anti-Her2

El medio acondicionado del Día 6 se recogió y se purificó por separado para cada condición de transfección. Ambos eluatos se intercambiaron con tampón por separado en PBS, pH 7,2, y se concentraron ~15 veces utilizando columnas Amicon-4 (corte de 50 kDa). El CM del día 6 mostró un nivel de expresión más alto en comparación con el CM del día 3. Como se muestra en la Tabla 8, se produjeron un total de 3 mg de A114N Herceptina 15,59 mg/ml (de transfección con Lipofectamina) y 6 mg de A114N Herceptina 16,86 mg/ml (de la transfección XtremeGene HP) a partir del día 6 de medios acondicionados para aplicaciones posteriores adicionales, como la conjugación anticuerpo-fármaco.

2E. Análisis en SDS-PAGE e HIC del mutante A114N anti-Her2

Antes de la conjugación, A114N Herceptina purificado se caracterizó por SDS-PAGE e HIC (cromatografía de interacción hidrófoba). Como se muestra en la Figura 21, se determinó que la calidad de A114N Herceptina purificado era adecuada para posteriores aplicaciones adicionales.

2F. Conjugación con glicosilación modificada por ingeniería genética

Se demostró que: a) un sitio de glicosilación se introdujo en el sitio de la posición 114 de Kabat en anti-TEM1; b) el mutante A114N tenía hiperglicosilación en la cadena pesada por reducción en SDS-PAGE; y c) el mutante hiperglicosilado A114N tenía una estructura de carbohidrato compleja mediante LC/MS intacta, incluidos ácidos siálicos y galactosa terminales, que son ideales para la conjugación SAM y GAM. Para confirmar que el sitio de glicosilación modificado por ingeniería genética era adecuado para la conjugación, se conjugó A114N anti-TEM1 con un PEG de 5 kDa mediante química aminooxi. Como se muestra en la Figura 22, el PEG se conjugó satisfactoriamente con A114N anti-TEM1 mediante un acoplamiento aminooxi. Este mutante se preparó también satisfactoriamente en las cadenas principales 2C3 anti-FAP y anti-CD-52 (no se muestra). Estos datos demuestran que el sitio de glicosilación en N114 es útil para la conjugación de restos efectores.

Ejemplo 3: Generación de mutantes Fc S298N/Y300S

Se diseñaron y generaron variantes de Fc modificadas por ingeniería genética en las que se introdujo un nuevo sitio de glicosilación en la posición Ser 298 según la UE, junto al sitio Asn297 de origen natural. La glicosilación en Asn297 se mantuvo o se eliminó por mutación. Las mutaciones y los resultados de glicosilación deseados se muestran en la Tabla 9.

Tabla 9: Estados de glicosilación de diversas variantes de anticuerpo

3A. Creación de variantes de glicosilación alterada por el anticuerpo aB-TCR H66

Se realizaron mutaciones en la cadena pesada del clon n.° 66 del anticuerpo receptor de células T ap mediante Quikchange utilizando una plantilla pENTR_LIC_IgG1. El dominio VH de HEBE1 Aab IgG 1 n.° 66 se amplificó con cebadores LIC antes de ser clonado en pENTR_LIC_IgG1 mutado o de tipo salvaje por LIC para crear anticuerpos de longitud completa mutantes o de tipo salvaje. La subclonación se verificó con doble digestión DraIII/XhoI, produciendo un inserto de aproximadamente 1250 pb de tamaño en los clones satisfactorios. Esos mutantes de longitud completa se clonaron a continuación en un vector de expresión, pCEP4(-E+I)Dest, mediante clonación de Gateway. Las mutaciones se confirmaron mediante secuenciación de ADN. Las secuencias de aminoácidos de las cadenas pesadas y ligeras WT H66 anti-apTCR y las cadenas pesadas H66 mutadas se muestran en la Tabla 10. Los aminoácidos mutados están resaltados en gris y los sitios diana de glicosilación de consenso, creados por la mutación, están subrayados.

Tabla 10: Secuencias de aminoácidos de anticuerpos H66 anti-apTCR

Las construcciones de muíante, tipo salvaje y dos controles aglicosilados (HEBE1 Agly IgG4 y HEBE1 Aab IgG1 en pCEP4) se transfectaron en células HEK₂93-EBNA en matraces triples para expresión. Las proteínas se purificaron a partir de 160 ml de medio acondicionado (CM) con columnas de proteína A de 1 ml HiTrap (GE) utilizando una bomba peristáltica multicanal. Cinco microgramos de cada sobrenadante resultante se analizaron en geles de SDS-PAGE con reducción y sin reducción con Tris-Glicina al 4-20 % (véase la Figura 2). Las cadenas pesadas de los mutantes aglicosilados (N297Q, T299A y controles Agly) han migrado más (punta de flecha), lo que concuerda con la pérdida de los glicanos en estos anticuerpos. Las cadenas pesadas de los anticuerpos glicosilados modificados por ingeniería genética (NSY, STY, SY, Aab, y el control wt, flechas), sin embargo, migran de manera similar al control de tipo salvaje. Este resultado concuerda con la existencia de un sitio de glicosilación modificado por ingeniería genética en la posición 298 según la UE. El análisis SEC-HPLC indicaba que todos los mutantes eran expresados como monómeros.

3B. Análisis de glicosilación por LC-MS

Las variantes H66 IgG1 Fc modificadas por ingeniería genética se redujeron parcialmente con DTT 20 mM a 37 °C durante 30 min. Las muestras se analizaron luego mediante LC/MS capilar en un sistema de HPLC capilar Agilent 1100 acoplado con un sistema híbrido QSTAR qq TOF (Applied Biosystems). Para análisis de los datos se usó una reconstrucción Bayesiana de la proteína con corrección de la línea de referencia y modelado por ordenador en Analyst QS 1.1 (Applied Bisoystem). En el mutante del anticuerpo H66 S298N/T299NY300S, se observó un sitio de glicosilación en el aminoácido 298 con glicanos de tipo complejo biantenario y triantenario detectados como la especie principal junto con G0F, G1F y G2F (véase la Figura 34). Este perfil de glicosilación alterado concuerda con una glicosilación desplazada a N298 en lugar de al sitio de glicosilación de tipo salvaje en N297.

3C. Propiedades de unión de mutantes del anticuerpo aBTCR a FcvRIIIa y FcvRI humanos utilizando Biacore.

Se usó Biacore para evaluar la unión a FcyRIIIa humana recombinante (V158 y F158) y FcyRI. Las cuatro células de flujo de un chip CM5 se inmovilizaron con anticuerpo anti-HPC4 a través del procedimiento de acoplamiento de amina estándar proporcionado por Biacore. El anticuerpo anti-HPC4 se diluyó a 50 μg/ml en acetato de sodio 10 mM a pH 5,0 para la reacción de acoplamiento y se inyectó durante 25 minutos a 5 μl/min. Aproximadamente 12.000 UR (unidades reactivas) de anticuerpo se inmovilizaron en la superficie del chip. Las FcyRIIIa-V158 y FcyRIIIa-F158 humanas recombinantes se diluyeron a 0,6 μg/ml en tampón de unión (HBS-P con CaCl²1 mM) y se inyectaron en las células de flujo 2 y 4, respectivamente, durante 3 min a 5 μl/min para capturar 300-400 UR de receptor en el chip anti-HPC4. Con el fin de distinguir entre los poco ligantes, se capturó tres veces más rh FcyRI IIa en la superficie anti-HPC4 de lo que se solía capturar habitualmente en este ensayo. Las celdas de flujo 1 y 3 se usaron como controles de referencia. Cada anticuerpo se diluyó a 200 nM en tampón de unión y se inyectó sobre las cuatro células de flujo durante 4 minutos, seguido de 5 minutos de disociación en tampón. Las superficies se regeneraron con AEDT 10 mM en tampón HBS-EP durante 3 min a 20 μl/min. Los resultados de estos experimentos se muestran en la Figura 3.

Biacore se usó también para comparar la unión de FcyRI. El anticuerpo His anti-tetra se intercambió con tampón en acetato de sodio 10 mM a pH 4,0 utilizando una columna de desalación Zeba y se diluyó a 25 μg/ml en el tampón acetato para el acoplamiento de aminas. Dos células de flujo de un chip CM5 se inmovilizaron con ~9.000 UR del anticuerpo anti-Tetra-His después de una inyección de 20 min a 5 μl/min. Como en el experimento anterior, se capturó diez veces más FcyRI en la superficie anti-tetra-His para comparar muestras con unión débil. FcyRI humano recombinante se diluyó a 10 μg/ml en tampón de unión HBS-EP y se inyectó a las 2 celdas de flujo durante 1 minuto a 5 μl/min para capturar ~1.000 UR de receptor en el chip anti-tetra-His. Se inyectó una concentración única de anticuerpo, 100 nM, durante 3 min a 30 μl/min sobre el receptor capturado y la superficie de control. Posteriormente, se controló la disociación durante tres minutos. La superficie se regeneró luego con dos inyecciones de 30 segundos de glicina 10 mM a pH 2,5 a 20 μl/min. Los resultados de estos experimentos se muestran en la Figura 4.

Estos resultados demuestran una notable disminución en la unión de los mutantes de glicoingeniería a las FcYRIIIa o F^cyRI. H66 S298N/T299NY300S en particular ha eliminado casi por completo la unión a ambos receptores. Este mutante fue elegido para un análisis más detallado.

3D. Caracterización de la estabilidad utilizando Dicroísmo Circular (CD)

La estabilidad del mutante de anticuerpo S298N/T299NY300S se controló mediante un experimento de fusión térmica CD Far-UV en donde se controló la señal de CD a 216 nm y 222 nm a medida que el aumento de temperatura conducía al despliegue del anticuerpo (desnaturalización).

La temperatura se controló mediante un peltier termoeléctrico (Jasco modelo AWC100) y se incrementó a una velocidad de 1 °C/min desde 25-89 °C. Los espectros de CD se recogieron en un espectrofotómetro Jasco 815 a una concentración de proteína de aproximadamente 0,5 mg/ml en tampón PBS en una cubeta de cuarzo (Hellma, Inc.) con un camino óptico de 10 mm. La velocidad de exploración fue de 50 nm/min y un paso de datos de 0,5 nm. Se utilizó un ancho de banda de 2,5 nm con un ajuste de sensibilidad del medio. La señal de CD y el voltaje HT se recogieron a 210-260 nm con intervalos de datos de 0,5 nm y a intervalos de temperatura de 1 °C y se realizaron cuatro exploraciones replicadas para cada muestra. Los resultados demuestran que tanto delta AB H66 como el mutante S298N/T299NY300S H66 muestran comportamientos térmicos similares y tienen aproximadamente la misma temperatura de inicio de la degradación (alrededor de 63 °C) (Figura 35), sugiriendo además que tienen una estabilidad comparable.

Ejemplo 4: Análisis funcional de mutantes modificados por ingeniería genética con Fc

Se evaluaron los mutantes modificados por ingeniería genética con Fc a través de un ensayo de proliferación de PBMC y un ensayo de liberación de citocina. En el ensayo de proliferación de PBMC, se cultivaron PBMC humanas con concentraciones crecientes de anticuerpo terapéutico durante 72 horas, se añadió 3H-timidina y las células se recogieron 18 horas más tarde. Para el ensayo de eliminación de células T/liberación de citocina, se cultivaron PBMC humanas con concentraciones crecientes de anticuerpo terapéutico y se analizaron diariamente para recuentos de células y viabilidad (Vi-C₆ll, Beckman Coulter) hasta el día 7. Los sobrenadantes de células también se recogieron, se almacenaron a -20 °C y se analizaron en un panel de citocina de 8 plex (Bio-Rad).

Las PBMC de donante normal se descongelaron y se trataron en las siguientes condiciones (todas en medios que contienen complemento): No tratadas; BMA031, moIgG2b 10 ug/ml; OKT3, moIgG2a 10ug/ml; H66, huIgG1 deltaAB 10 ug/ml, 1 ug/ml y 0,1 ug/ml; H66, huIgG1 S298N/T299NY300S 10 ug/ml, 1 ug/ml y 0,1 ug/ml.

Se recogieron las citocinas el día 2 (D2) y el día 4 (D4) para Análisis Bioplex (IL2, IL4, IL6, IL8, IL10, GM-CSF, I FNg, TNFα). Las células se tiñeron en D4 para la expresión de CD4, CD8, CD25 y abTCR.

Los resultados, mostrados en las Figuras 5-8, demuestran que H66 S298N/T299NY300S se comportaba de manera similar al H66 deltaAB en todos los ensayos basados en células realizados, mostrando una mínima activación de las células T por expresión de CD25, unión a abTCR (con cinética ligeramente diferente a deltaAB), y una mínima liberación de citocinas en los puntos temporales tanto D2 como D4. El mutante S298N/T299NY300S eliminó así la función efectora tan eficazmente como la mutación deltaAB.

Ejemplo 5: Preparación y caracterización de una variante de Fc modificada por ingeniería genética en la cadena principal del anticuerpo anti-CD52.

Además del anticuerpo H66 anti-apTCR, la mutación S298N/Y300S también se modificó por ingeniería genética en una cadena principal del anticuerpo anti-CD52 (clon 2C3). Este mutante se examinó luego con el fin de determinar si la modulación de la función efectora observada vista en el anticuerpo S298N/Y300S H66 anti-aTCR era consistente con la de otra cadena principal del anticuerpo.

5A. Creación de variantes de glicosilación alterada con anticuerpo 2C3 anti-CD52

En primer lugar, se preparó ADN de la variante 2C3 S298N/Y300S mediante mutagénesis de cambio rápido utilizando pENTR_LIC_IgG1, y se clonó VH 2C3 WT en el vector mutado por LIC. Los mutantes de longitud completa se clonaron en el vector de expresión pCEP4(-E+I)Dest utilizando tecnología Gateway. Las mutaciones se confirmaron posteriormente mediante secuenciación del ADN y las secuencias se muestran en la Tabla 11. Los mutantes se transfectaron luego en células HEK₂93-EBNA en un formato de placa de 6 pocillos y la proteína se purificó a partir de medios acondicionados. El anticuerpo 2C3 anti-CD52 de tipo salvaje se produjo en paralelo como control. Se encontró que el nivel de expresión era 0,1 μg/ml utilizando SD-PAGE y análisis de inmunotransferencia (Figura 9A). La expresión de mutantes en medios acondicionados puros se midió también mediante captura de proteína A en Biacore.

La concentración se determinó utilizando la respuesta de disociación después de una inyección de seis minutos con proteína A inmovilizada. Como curva patrón se utilizaron diluciones seriadas de 2C3 WT producido en CHO en medios desde 90 μg/ml hasta 1,5 ng/ml. Las concentraciones se calcularon dentro de aproximadamente 0,2 μg/ml mediante una curva de calibración utilizando un ajuste de 4 parámetros. Los niveles de expresión relativa fueron bajos y, en general, de acuerdo con los datos de inmunotransferencia (Figura 9B).

Tabla 11: Secuencias de anticuerpo 2C3 clon anti-CD52

5B. Análisis de glicosilación utilizando PNGasa F

Para evaluar los sitios de glicosilación adicionales introducidos por la mutación, el mutante S298N/Y300S enriquecido se desglicosiló con PNGasa F. No mostró ningún cambio aparente en el peso molecular, lo que indica que no estaba presente ningún carbohidrato adicional (Figura 10). Se realizaron preparaciones a pequeña escala para purificar estos mutantes para una caracterización adicional y los resultados confirmaron nuevamente que no había un carbohidrato adicional presente en el mutante S298N/Y300S (Figura 11).

5C. Propiedades de unión de mutantes de anticuerpo 2C3 anti-CD52 a FcvRIIIa humana utilizando Biacore

También se usó Biacore para caracterizar la unión a antígeno, FcyRIII, y las propiedades de unión de los anticuerpos purificados (véanse las Figuras 12, 13 y 14). La variante 2C3 S298N/Y300S se unió fuertemente al péptido CD52 y el sensorgrama de unión fue indistinguible del control de tipo salvaje, demostrando que esta mutación no afecta a su unión a antígeno (Figura 12A).

Para el ensayo de la función efectora de Fc, se usó el receptor FcyRIII (Val158) en estudios de unión. Los anticuerpos mutante y control de tipo salvaje se diluyeron a 200 nM y se inyectaron a FcyRIIIa capturado con etiqueta HPC4. La unión a FcyRIII era casi indetectable para el mutante S298N/Y300S, lo cual indicaba una pérdida de la función efectora por esta variante (Figura 12B y Figura 14A). Para un ensayo adicional de la función efectora de Fc, el receptor FcyRIII (Phe158) se usó también en estudios de unión. Los anticuerpos mutante y control de tipo salvaje se diluyeron a 200 nM y se inyectaron a FcyRIMa capturado con la etiqueta HPC4. La unión de FcyRIII era casi indetectable para el mutante S298N/Y300S, lo cual indica una pérdida de la función efectora con la variante Phe158 (Figura 14B). Por último, se usó Biacore para comparar las propiedades de unión a FcRn de las proteínas purificadas. La FcRn-HPC4 de ratón y humana purificada con SEC se inmovilizaron en un chip CM5 mediante acoplamiento de amina. Cada anticuerpo se diluyó a 200, 50 y 10 nM y se inyectó en los receptores. Campath, 2C3 WT producido en CHO, y Campath tratado con DEPC se incluyeron como controles positivo y negativo. Estos datos muestran que el mutante se une al receptor FcRn tanto humano como murino con la misma afinidad que el control de anticuerpo de tipo salvaje y que probablemente no presenta alteraciones en su semivida de circulación u otras propiedades farmacocinéticas (véase la Figura 12C, Figura 13A y B). Por consiguiente, la mutación S298N/Y300S es aplicable a anticuerpos en general, para reducir o eliminar la función efectora de Fc no deseada, por ejemplo a través de la implicación de receptores F^cyhumanos.

Ejemplo 6: Detección de complejo inmunitario circulante en el mutante S298N/Y300S.

La detección del complejo inmunitario circulante se investigó también utilizando un ensayo de unión C1q para el mutante S298N/Y300S y el control WT. Se recubrieron placas Costar de 96 pocillos de alta unión toda la noche a 4 °C con 100 μl de Abs 2C3 utilizando diluciones seriadas 2 veces a concentraciones que varían de 10 a 0,001 μg/ml en tampón de recubrimiento (NaCHO³0,1 M pH 9,2). El análisis de ELISA mostró que la unión de C1q se reduce para el mutante S298N/Y300S en comparación con WT (Figura 15A). La unión de Ab anti-Fab con el Abs 2C3 revestido confirmó el revestimiento equivalente de los pocillos (Figura 15B).

Ejemplo 7: Separación y análisis del mutante S298N/Y300S utilizando Isoelectroenfoque.

Se ejecutó un gel de enfoque isoeléctrico (IEF) de pH 3-10 para caracterizar los mutantes S298N/Y300S. Se encontró que S298/Y300S tenía más cargas negativas y, por lo tanto, probablemente más moléculas de ácido siálico (Figura 18A). Tanto el mutante S298N/Y300S como el ²C³WT se mostraron por MS intacta que tenían G0F y G1F como las especies de glicosilación dominantes (Figuras 18B y D, respectivamente).

Ejemplo 8: Afinidad de unión a antígeno de S298N/Y300S.

Se usó Biacore para comparar la afinidad de unión a antígeno de Ab 2C3 anti-CD52 WT y el mutante S298N/Y300S que se había preparado y purificado a partir de expresiones de escala tanto menor (Figura 16) como mayor (Figura 17). Se obtuvieron chips de CM5 inmovilizados con péptido 741 CD52 y péptido 777 control. Los anticuerpos se sometieron a diluciones en serie 2 veces desde 60 hasta 0,2 nM en HBS-EP y luego se inyectaron sobre la superficie del chip durante 3 minutos seguido de una disociación de 5 minutos en tampón a un caudal de 50 μl/min. La superficie se regeneró luego con un pulso de HCl 40 mM. Estos análisis se realizaron por duplicado y demuestran que el mutante S298N/Y300S y los anticuerpos 2C3 WT muestran una unión peptídica CD52 comparable.

Una plataforma de cribado del medio se diseñó para probar las propiedades de unión funcionales antes de la purificación con el fin de cribar anticuerpos creados durante transfecciones a pequeña escala. Estas pruebas se realizaron utilizando Octet (Figura 19A) para determinar la concentración y usaron biosensores de Proteína A y una curva patrón GLD52. Las muestras se diluyeron a 7,5 y 2 nM en HBS-Ep para una comparación de unión a CD52 utilizando Biacore (Figura 19B). Los resultados del ensayo de unión a péptidos mostraron que tanto el mutante S298N/Y300S como los anticuerpos 2C3 WT tienen una unión al péptido CD52 comparable. Además, estos análisis muestran que Octet y Biacore funcionan bien para predecir la unión a antígeno por anticuerpos de transfecciones a pequeña escala.

Ejemplo 9: Preparación de mutantes de glicosilación alterada S298N/Y300S, S298N/T299NY300S y N297Q/S298N/Y300S en las cadenas principales de anticuerpos adicionales.

Además del anticuerpo anti-ap-TCR y el anticuerpo 2C3 anti-CD-52, las mutaciones S298/Y300S, S298N/T299NY300S y N297Q/S298N/Y300^sse modificaron por ingeniería genética en otras cadenas principales de anticuerpos para confirmar que el sitio de glicosilación en tándem adicional podría ser introducido en secuencias de dominio variable de cadena pesada no relacionadas. Los mutantes anti-CD-52 12G6 y anti-Her2 glicosilados alternativamente se muestran en las Tablas 12 y 13.

Tabla 12: Secuencias de anticuerpo 12G6 de clon anti-CD52

Tabla 13: Secuencias de anticuerpos anti-Her2

Ejemplo 10. Generación de anticuerpos alterados que contienen restos de glicanos reactivos

Con el fin de generar anticuerpos que contengan restos de glicano capaces de reaccionar con restos efectores derivados, un anticuerpo anti-HER se glicosiló en primer lugar in vitro utilizando glicosiltransferasa y donantes de azúcares UDP relevantes. Por ejemplo, para introducir los residuos de ácido siálico, los anticuerpos del donante se galactosilaron primero con p-galactosiltransferasa, seguido de sialilación con a2,6-sialiltransferasa según los procedimientos de Kaneko y col. (Kaneko, Y., Nimmerjahn, F., y Ravetch, J. V. (2006), Anti-inflammatory activity of immunoglobulin G resulting from Fc sialylation. Science 313, 670-3). La reacción se realizó en una etapa de síntesis de un solo recipiente utilizando p-galactosiltransferasa (50 mU/mg, Sigma) y a2,6-sialiltransferasa (5 ug/mg, R&D system) con sustratos de nucleótidos de azúcar donantes, UDP-galactosa (10 mM) y CMP-ácido siálico (10 mM) en tampón MES 50 mM (pH 6,5) que contiene MnCb 5 mM. La mezcla de reacción que contenía 5 mg/ml de anticuerpo anti-HER2 se incubó durante 48 horas a 37 °C. La sialilación se verificó utilizando análisis MALDI-TOF MS de glicanos permetilados liberados del anticuerpo con PNGasa F, análisis de contenido de ácido siálico utilizando Dionex HPLC y transferencia de lectina con SNA, una lectina específica para el ácido a2,6-siálico.

El análisis MALDI-TOF de glicanos liberados mediante tratamiento con PNGasa F del anticuerpo anti-HER2 sialilado indicó que los glicanos nativos se habían remodelado por completo con una estructura biantenaria principalmente monosialilada, A1F (Figura 27A) junto con una pequeña cantidad de especies disialiladas. El tratamiento del anticuerpo con mayores cantidades de a2,6-sialiltransferasa produjo poblaciones más homogéneas de la glicoforma A1F, lo que sugiere que la actividad de la enzima o la localización del glicano pueden evitar la sialilación total. Se determinó que el contenido de ácido siálico era ~2 mol por mol de anticuerpo, lo que es consistente con glicano A1F como la principal especie de glicoforma (Figura 27B). La transferencia de lectina con una lectina SAN, Sambucus nigra agglutinin, específica para el ácido siálico ligado a a2,6, confirmó que el ácido siálico estaba presente en una configuración de acoplamiento a2,6 (Figura 27C).

En conclusión, aunque los glicanos de proteína nativa son algo heterogéneos, la remodelación a través de galactosily sialil-transferasas produce un anticuerpo casi homogéneo con glicanos biantenarios monosialilados pero completamente galactosilados (A1F). La introducción de solo ~1 ácido siálico en los dos aceptores de galactosa en cada glicano ramificado puede deberse a accesibilidad limitada de una de las galactosas a partir de glicanos que a menudo están enterradas en el anticuerpo o interacciones no covalentes de los glicanos con la superficie de la proteína.

Ejemplo 11. Oxidación de anticuerpos alterados que contienen restos de glicanos reactivos

Una vez que se verificó la sialilación, se investigó la oxidación en proceso del anticuerpo anti-HER2 sialilado con diversas concentraciones de peryodato (0,25 a 2 mM). El anticuerpo sialilado en primer lugar se intercambió con tampón en Tris-HCl 25 mM (pH 7,5) que contenía AEDT 5 mM seguido de intercambio de tampón con tampón PBS. La mezcla de anticuerpo tamponada se aplicó luego a la columna de proteína A Sepharose equilibrada previamente con tampón PBS. Después de lavar la columna con 15 volúmenes de columna de PBS, 15 volúmenes de columna de PBS que contienen AEDT 5 mM y 30 volúmenes de columna de PBS, se eluyó a continuación con tampón citrato fosfato 25 mM (pH 2,9). Los eluatos se neutralizaron inmediatamente con tampón de fosfato dibásico y el anticuerpo se concentró utilizando Amicon ultra de Millipore. Después de la purificación, el anticuerpo sialilado anti-HER2 se oxidó luego con peryodato de sodio (Sigma) en tampón de acetato de sodio 100 mM (pH 5,6) en hielo en la oscuridad durante 30 minutos y la reacción se inactivó con glicerol al 3 % en hielo durante 15 minutos. El producto se desaló e intercambió en acetato de sodio 100 mM (pH 5,6) mediante 5 rondas de ultrafiltración sobre Amicons de 50 kDa. La Figura 28A muestra el análisis del contenido de ácido siálico del anticuerpo sialilado titulado con diversas cantidades de peryodato. La oxidación completa de los residuos de ácido siálico se logró a una concentración de peryodato superior a 0,5 mM. De hecho, una concentración de peryodato tan baja como 0,5 mM fue suficiente para oxidar completamente el ácido siálico introducido. De ahí, se eligió una concentración 1 mM de peryodato para la oxidación del anticuerpo sialilado para la conjugación del fármaco.

La oxidación puede tener efectos adversos sobre la integridad de un anticuerpo. Para, la oxidación de residuos metionina, incluidos Met-252 y Met-428, situados en la región CH₃de Fc, cerca del sitio de unión de FcRn, se sabe que afectan la unión de FcRn que es crítica para prolongar la semivida en suero del anticuerpo (Wang, W., y col. (2011) Impact of methionine oxidation in human IgG1 Fc on serum half-life of monoclonal antibodies. Mol Immunol 48, 860-6). Por consiguiente, para examinar los posibles efectos secundarios de la oxidación con peryodato en residuos metionina (p. ej., Met-252) críticos para la interacción de FcRn, el estado de oxidación del anticuerpo sialilado se determinó mediante análisis LC/MS de una digestión de péptido con tripsina. Este análisis reveló ~30 % de oxidación de Met-252 y <10 % de oxidación de Met-428 después del tratamiento del trastuzumab sialilado con peryodato 1 mM. Para determinar el impacto de este grado de oxidación de metionina sobre la unión de FcRn, se evaluó la cinética de unión de FcRn para cada anticuerpo utilizando resonancia de plasmón superficial (BIACORE). Este análisis reveló que el estado de oxidación se correlacionaba con una pérdida menor en la unión de FcRn (reducción del 12 % y 26 % en la Ka para FcRn de ratón y humano, véanse las Figuras 28B y 28C, respectivamente). En particular, se ha informado que una reducción de ~25 % en la Ka para FcRn humano no tiene efecto sobre la semivida en suero en un ratón transgénico con FcRn humano, ya que un solo sitio FcRn intacto en cada anticuerpo es suficiente para proporcionar funcionalidad y ventaja farmacocinética (PK) (Wang y col., Id).

En resumen, estos datos indican que la introducción de residuos de ácido siálico sensibles al peryodato por tratamiento con sialiltransferasa permite el uso de concentraciones de peryodato mucho más bajas, dando como resultado mínimos efectos secundarios sobre las interacciones anticuerpo-FcRn y la integridad del anticuerpo evaluada por agregación (≤1 %). Así, el uso de anticuerpos sialilados según los procedimientos de la invención proporciona una ventana más amplia de las condiciones de oxidación que se emplearán, permitiendo la generación reproducible de glicoconjugados activos sin un efecto sobre la semivida en suero.

La galactosa en un mutante de anticuerpo hiperglicosilado se puede también oxidar específicamente utilizando galactosa oxidasa para generar un grupo aldehído por conjugación. Para confirmar este enfoque, se concentró un anticuerpo anti-TEM1 A114N a 13-20 mg/ml y luego se trató con 20 mU/mg de sialidasa en PBS durante ⁶horas a 37 °C. El producto desalado se oxidó luego con galactosa oxidasa ("GAO"), primero con 5 ug de GAO/mg de proteína toda la noche a 37 °C, seguido de la adición de 2 ug de GAO/mg de proteína y la incubación durante 5 horas adicionales. Se añadió acetato de sodio para ajustar el pH a 5,6 (0,1 v/v, pH 5,6) y se añadió DMSO para lograr una concentración final de la reacción del 16 %, se añadieron antes de la conjugación. El anticuerpo A114N anti-HER mutante de hiperglicosilación (15 mg/ml) se desialiló de forma similar con sialidasa (20 mU/mg) y se oxidó con 5 ug de GAO por mg de proteína en una sola reacción toda la noche a 37 °C.

Ejemplo 12. Síntesis de restos efectores reactivos

Para facilitar la conjugación con las glicoformas de anticuerpo derivado con aldehído de la invención, los restos efectores de fármaco candidato (p. ej., Monometil Auristatin E (MMAE) y Dolastatin 10 (Dol10)) se derivaron con aminooxi-cistamida para contener grupos funcionales (p. ej., aminooxi-cys) específicamente reactivo con el aldehído.

En resumen, para generar aminooxi-cistamida como material de partida, se añadió S-Tritil-L-cisteinamida (362 mg, 1 mmol) a 3 ml de una solución de DMF de éster N-hidroxisuccinimida del ácido t-BOC-aminooxiacético (289 mg, 1 mmol). La reacción se completó después de 3 h como se evidencia del análisis mediante HPLC. La mezcla de reacción se diluyó posteriormente con 30 ml de diclorometano y se lavó con una solución de bicarbonato sódico 0,1 M (2 x 20 ml), agua (2 x 20 ml) y salmuera (2 x 20 ml). La solución se secó sobre sulfato de sodio anhidro, se filtró y se concentró hasta sequedad. A este residuo seco se añadieron 3 ml de TFA seguido de 150 μl de trietilsilano. La solución resultante se precipitó en el seno de t-butil-metil-éter y el proceso se repitió tres veces. Después de la filtración, el residuo se secó a presión reducida produciendo 205 mg de un sólido blancuzco (67 % de rendimiento). El compuesto se usó en la siguiente etapa sin purificación adicional.

Para generar MMAE derivado con aminooxi (Aminooxi-Cys-MC-VC-PABC-MMAE), se combinaron 30,1 mg de aminooxi-cistamida (0,098 mmol, 2 eq.) con 64,6 mg de MC-VC-PABC-MMAE (0,049 mmol) y 100 μl de trietilamina en 3 ml de DMF. La mezcla de reacción resultante se agitó a temperatura ambiente durante 15 minutos, tiempo en el que la reacción se completó según el análisis por HPLC. El compuesto se purificó por HPLC preparativa produciendo 45 mg (62 %) del producto deseado como un sólido blancuzco. El análisis de HPLC de fase inversa sugirió que la pureza del compuesto era >96 %. ESI calculado para C⁷³H¹¹⁶N¹⁴O¹⁸S (MH)+ 1.509,8501; encontrado, m/z 1.509,8469.

Para generar Dol10 derivado con aminooxi (Aminooxi-Cys-MC-VC-PABC-PEG8-Dol10), 7,4 mg (0,024 mmol, 3 eq.) de aminooxi-cistamida, 12 mg (0,008 mmol) de MC-VC-PABC-PEG8-Dol10 y 30 μl de trietilamina se combinaron en 3 ml de DMF. La reacción se completó en 15 minutos según el análisis por HPLC. La purificación por HPLC preparativa dio como resultado 6,2 mg (46 %) del producto deseado como un sólido blancuzco. El análisis por HPLC en fase inversa sugiere que la pureza del compuesto es >96 %. ESI calculado para C⁸⁰H¹²⁴N¹⁶O¹⁹S²(MH)+ 1.678,0664; encontrado, m/z 1.678,0613.

Ejemplo 13. Conjugación mediada por ácido siálico (SAM) de restos efectores reactivos

Después de la desalación, se combinaron los enlazadores de fármacos del Ejemplo 11 con los anticuerpos sialilados oxidados del Ejemplo 10 en DMSO al 75 % a una concentración de 25 mM para lograr una relación molar de 24:1 de enlazador de fármaco frente a anticuerpo y una concentración final de anticuerpo de 5 mg/ml. La mezcla se incubó toda la noche a temperatura ambiente. Los enlazadores de fármacos no incorporados y cualquiera de los fármacos libres fueron eliminados utilizando BioBeads. El producto se intercambió con tampón en tampón Histidina-Tween utilizando columnas PD-10 y se filtró en condiciones estériles. Se determinaron los niveles de endotoxinas y se logró menos de 0,1 UE/mg de ADC en el estudio in vivo.

La Figura 29A-C muestra un cromatógrafo de interacción hidrófoba (HIC) de diferentes anticuerpos sialilados (anti FAP B11 y G11 y el anticuerpo anti-HER2 del Ejemplo 11) glicoconjugados con AO-MMAE. El anticuerpo HER2 sialilado también se conjugó con el enlazador del fármaco, AO-Cys-MC-VC-PABC-PEG8-Dol10 (Figura 29D). Este análisis revela que hay principalmente uno o dos conjugados de fármaco por anticuerpo con una relación de fármaco frente a anticuerpo (DAR) que varía de 1,3-1,9. El mayor tiempo de retención del glicoconjugado Dol10 (Figura 29D) en comparación con el glicoconjugado MMAE (Figura 29C) es probablemente debido a la mayor hidrofobicidad de Dol10.

El análisis de LC-MS también se realizó con un anticuerpo anti-HER conjugado con dos diferentes enlazadores de fármacos (AO-MMAE o AO-PEG8-Dol10) a una escala de 30 mg. Este análisis mostró valores de DAR similares de 1,7 y 1,5 después de la conjugación, que es comparable al análisis del HIC. La cromatografía de exclusión por tamaños (SEC) mostró niveles muy bajos (1 %) de agregados en estos conjugados.

E je m p lo 14. C o n ju g a c ió n m e d ia d a por g a la c to s a (G A M ) d e re s to s e fe c to re s re a c tiv o s

El aldehido de galactosa generado con galactosa oxidasa en el anticuerpo mutante de hiperglicosilación A114N antiTEMI como se describe en el Ejemplo 11 se conjugó con un exceso 24 molar de enlazador de fármaco aminooxi-MC-VC-PABC-MMAE sobre el anticuerpo incubando toda la noche a 25 °C, produciendo un conjugado ADC con un DAR de 1,72.

Al anticuerpo antiHER tratado con galactosa oxidasa preparado como se describe en el Ejemplo 11, se añadió un décimo del volumen de reacción de acetato de sodio 1 M, pH 5,6, para ajustar el pH a 5,6, y se añadió DMSO para obtener la concentración final del 14 % antes de agregar 24 equiv. de enlazador de fármaco aminooxi-MC-VC-PABC-MMAE. Las reacciones se incubaron toda la noche a temperatura ambiente. El fármaco y el enlazador de fármacos libres se eliminaron con Biobeads y el tampón del producto se intercambió mediante SEC (65 % de rendimiento). El producto conjugado fue analizado por HIC. Como se muestra en la F ig u ra 30 , AO-MMAE se había conjugado con ~60 % de las moléculas.

^{E je m p lo 15. E n sayo s d e p ro life ra c ió n d e c é lu la s A D C} in vitro

La actividad in vitro de las moléculas de glicoconjugado anti-HER y anti-FAP de la invención se compararon también con conjugados de tiol correspondientes que contienen el mismo resto fármaco enlazado a través de acoplamientos tiol a cisteinas de la región bisagra del mismo anticuerpo donante. Los conjugados de tiol contenían aproximadamente el doble del número de fármacos por anticuerpo (DAR) que los glicoconjugados. La conjugación basada en tiol se realizó según lo descrito por Stefano y col. (Methods in Molecular Biology 2013, en prensa). Después se emplearon lineas celulares Her2+ SK-BR-3 y Her2- MDA-MB-231 para evaluar la eficacia relativa de cada ADC. Los resultados de este análisis se presentan en la Tabla 15 a continuación.

T a b la 15. C o m p a ra c ió n d e C E 50 d e g lic o c o n ju g a d o s y c o n ju g a d o s d e tio l

Nota: * DAR determinado por LC-MS; ** DAR determinado por HIC

La F ig u ra 31 muestra una comparación de la potencia in vitro del glicoconjugado anti-HER y su conjugado tiol homólogo. La viabilidad celular se determinó después de 72 horas de exposición de los conjugados a las células (SK-BR-3) que expresan el antigeno Her2 (F ig u ra s 31 A y C ) o las células (MDA-MB-231) que no expresan (F ig u ra s 31B y D ) . Los ADCs contenían MMAE o PEG8-Dol10 ligado a los glicanos ("glico") o por química convencional a las cisteinas de la región de bisagra ("tiol"). Como se muestra en las Figuras 30A y C, se observó una EC⁵⁰~2 veces menor para los conjugados tiol en comparación con los glicoconjugados, lo que es consistente con un DAR 2 veces mayor en los primeros que en los últimos. No se observó toxicidad con la linea de células Her2- con ningún anticuerpo hasta 100 ug/ml.

Tendencias similares se observaron también en la proliferación celular para ADC preparada con anticuerpos contra un antigeno tumoral (FAP) que es altamente expresado por fibroblastos estromales reactivos en cánceres epiteliales incluidos cáncer de colon, pancreático y de mama (Teicher, B. A. (2009) Antibody-Drug conjugate targets. Curr Cáncer Drug Targets 9, 982-1004). Estos conjugados se prepararon nuevamente conjugando bien el enlazador de fármaco MMAE aminooxi o el enlazador de fármaco MMAE maleimido con glicanos o un grupo tiol. Los ensayos de proliferación celular de estos conjugados mostraron que EC⁵⁰del conjugado de tiol tenía ~100 veces mayor potencia en las células CHO transfectadas con FAP humano que las mismas células que carecían de expresión con FAP como se representa en la Figura 32, que muestra una comparación de la potencia in vitro de glicoconjugado anti-FAP B11 y tiol conjugado. La viabilidad celular se determinó después de la exposición de los conjugados a células de CHO transfectadas con o sin antígeno FAP. Los ADCs contenían MMAE ligado a los glicanos ("glico") o mediante química convencional a cisteínas de la región de bisagra ("tiol"). Obsérvese que la EC⁵⁰~2 veces menor para el tiol en comparación con los glicoconjugados es consistente con las cantidades relativas de fármaco liberado por anticuerpo suponiendo eficacias similares para la unión diana y la internalización en células CHO que expresan antígeno. Paralelamente, se ensayó un glicoconjugado de ADC anti FAP (B11) con un DAR de 1,5 como se describió previamente y mostró una EC⁵⁰~2 veces mayor que el conjugado tiol de comparación (DAR 3,3).

Como se muestra en la Figura 36, se observaron tendencias similares en el ensayo de proliferación celular para ADC preparado con el anticuerpo anti-HER que porta la mutación de hiperglicosilación A114N y AO-MMAE como se describe en el Ejemplo 14, cuando se ensayó en células que expresan SK-BR-3 o en células MDA-MB-231. El glicoconjugado A114N muestra claramente una toxicidad celular potenciada contra la línea celular que expresa Her2 sobre la línea que no expresa. La toxicidad relativa en comparación con el glicoconjugado SialT preparado con el mismo anticuerpo es consistente con la menor carga de fármaco de esta preparación.

También se realizó un ensayo de proliferación celular para ADC preparado con el anticuerpo anti-TEM1 que porta la mutación de hiperglicosilación A114N y AO-MMAE preparado como se describe en el Ejemplo 14. Se observó una toxicidad más alta con las líneas celulares SJSA-1 y A673 que expresan TEM1 en comparación con la línea MDA-MB-231 que no expresa. El nivel de toxicidad comparado con un conjugado de tiol convencional con el mismo anticuerpo estaba en consonancia con la carga de fármaco (DAR) de esta preparación.

En resumen, la conjugación específica del sitio de los fármacos a través de glicanos con enlazadores escindibles produce ADCs con toxicidades y eficacia in vitro que son equivalentes a los conjugados convencionales basados en tiol, como se demuestra utilizando diferentes anticuerpos y diferentes enlazadores de fármacos. Además, por debajo del peryodato 2 mM, el nivel de conjugación del fármaco se correlaciona con la reducción del ácido siálico. El aumento de la concentración de peryodato por encima de 2 mM produce pocos beneficios, como se esperaba de la conversión completa del ácido siálico a la forma oxidada. Sin embargo, en todas las condiciones, el número de fármacos por anticuerpo fue ligeramente menor que el contenido de ácido siálico, lo que indica que algunos de los ácidos siálicos oxidados pueden no estar disponibles, de forma similar, para el acoplamiento, ya sea por estar enterrados o, si no, debido al impedimento estérico derivado del mayor volumen del enlazador de fármaco.

Ejemplo 16. Caracterización in vivo de conjugados de fármaco de anticuerpo

La eficacia de los glicoconjugados anti-HER se evaluó también en un modo de xenoinjerto de células tumorales Her2+ y se comparó con los comparadores de conjugado tiol que tenían DAR ~2 veces mayor. Los ratones Beige/SCID fueron implantados con células tumorales SK-OV-3 Her2+ a las que se les permitió establecer tumores de ~ 150 mm3 antes del inicio del tratamiento. Los ADCs a dosis de 3 o 10 mg/kg se inyectaron a través de la vena de la cola los días 38, 45, 52 y 59. Había ~10 ratones por grupo. El volumen tumoral de los ratones en diferentes grupos se midió y se registró su supervivencia. La curva de supervivencia se trazó con base en el procedimiento de Kaplan-Meier.

La Figura 33 muestra una comparación de la eficacia in vivo de los glicoconjugados anti-HER y los conjugados tiol en un modelo de xenoinjerto de células tumorales Her2+. Los ratones beige/SCID implantados con células tumorales SK-OV-3 Her2+ se dosificaron con MMAE (Figura 33A y B) y PEG8-Dol10 (Figura 33C y D) conteniendo glicoconjugados o comparadores de conjugado tiol con ~2 veces más DAR. La cinética de crecimiento tumoral de los conjugados de MMAE se muestra en la Figura 33A. En este caso, el glicoconjugado mostró una eficacia significativamente mayor que el anticuerpo sin sistema inmunitario en solitario (negro) pero menos que un comparador de conjugado tiol que tiene un DAR ~2 veces mayor (verde). El glicoconjugado de MMAE mostró una regresión tumoral significativa y un retraso de ~20 días en el crecimiento tumoral (Figura 33A) y un aumento de ~2 veces en el tiempo de supervivencia desde la primera dosis (Figura 33B). El conjugado de tiol MMAE mostró una supresión tumoral casi completa a la misma dosis de ADC (10 mg/kg).

La eficacia in vivo de un glicoconjugado PEG8-Dol10 ("Glico Dol10") y un comparador de conjugado tiol con DAR ~2 veces mayor ("Tiol Dol10") se determinó también en el mismo modelo de xenoinjerto de células tumorales Her2+. Ambos conjugados mostraron una menor eficacia que los conjugados de MMAE como se describió anteriormente. Sin embargo, el glicoconjugado aminooxi-PEG8-Dol10 ("Glico Dol10") a 10 mg/kg mostró un retraso de 15 días en el crecimiento tumoral (Figura 33C) y un aumento de ~20 días (1,7 veces) en el tiempo de supervivencia después de la primera administración (Figura 33D). El conjugado de tiol fue más eficaz a la misma dosis, mostrando un aumento de la supervivencia de 2 veces. A una dosis más baja (3 mg/kg), el conjugado de tiol mostró una menor eficacia que el glicoconjugado a 10 mg/kg. Esta dosis corresponde a 80 umol de fármaco PEG8-Dol10 por kg de dosis, en comparación con 110 umol de fármaco PEG8-Dol10 por kg de dosis para el glicoconjugado.

Estos datos demuestran que la conjugación específica del sitio de fármacos sobre ácido siálico de glicanos de anticuerpos produce moléculas con potencia comparable como ADCs generados a través de química basada en tiol. La eficacia in vivo algo menor probablemente se deriva del menor número de fármacos que son transportados por cada anticuerpo a las células tumorales mediante la internalización de cada antígeno ligado a anticuerpo. Aunque no se han comparado estos glicoconjugados con conjugados de tiol del mismo DAR, la eficacia observada a diferentes dosis de los dos ADCs que representan niveles comparables de fármaco administrado muestra que los glicoconjugados tienen una eficacia intrínseca comparable a la de sus homólogos de tiol, lo que indica que no hay efecto perjudicial de conjugación en este sitio. Además, una dosis de 10 mg/kg del glicoconjugado Dol10 que introdujo solo un 28 % más de fármaco proporcionó un aumento de 2 veces en la supervivencia sobre el conjugado de tiol (a 3 mg/kg), sugiriendo que estos conjugados pueden proporcionar eficacias incluso superiores del mismo DAR. Dada la aparente limitación en la incorporación de ácido siálico en glicanos nativos, se podría lograr una mayor carga de fármaco mediante varias estrategias diferentes que incluyen el uso de enlazadores de fármacos ramificados o la introducción de sitios de glicosilación adicionales y el uso del mismo procedimiento.

Claims

REIVINDICACIONES

I. Un anticuerpo aislado que comprende un dominio Fc de IgG1 humana, en donde el dominio Fc de IgG humana comprende: un residuo asparagina glicosilada en la posición 298 de aminoácido, según la numeración de la UE; y un residuo serina o treonina en la posición 300 de aminoácido, según la numeración de la UE.

2. El anticuerpo de la reivindicación 1, que comprende además un residuo alanina en la posición 299 de aminoácido, según la numeración de la UE.

3. El anticuerpo de la reivindicación 1, que comprende además un residuo glutamina en la posición 297 de aminoácido, según la numeración de la UE.

4. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la cadena lateral del residuo asparagina está enlazada a un glicano a través de un acoplamiento de p-glicosilamida.

5. El anticuerpo de la reivindicación 4, en donde el glicano es un glicano biantenario.

6. El anticuerpo de la reivindicación 4 o 5, en donde el glicano es una glicoforma de mamífero de origen natural. 7. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 4-6, en donde el glicano comprende un grupo aldehído reactivo.

8. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 4-6, en donde el glicano comprende un residuo sacárido oxidado que comprende un grupo aldehído reactivo.

9. El anticuerpo de la reivindicación 8, en donde el residuo sacárido oxidado es un ácido siálico o galactosa terminales.

10. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 4-6, en donde el glicano está unido a un resto efector. I I . El anticuerpo de la reivindicación 10, en donde el resto efector es una citotoxina.

12. El anticuerpo de la reivindicación 11, en donde la citotoxina se selecciona del grupo de citotoxinas que consiste en:

en donde Ri es un alquilo, arilo, alcoxi o ariloxi; R²y R³son un alquilo o arilo.

13. El anticuerpo de la reivindicación 10, en donde el resto efector es una agente de detección.

14. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 10-13, en donde el resto efector está ligado mediante un enlace de oxima o hidrazona con un residuo de sacárido del glicano.

15. El anticuerpo de la reivindicación 14, en donde el residuo de sacárido es un residuo de ácido siálico terminal o residuo de galactosa del glicano.

16. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 10-15, en donde el resto efector comprende un enlazador sensible al pH, un enlazador disulfuro, un enlazador sensible a enzima u otro resto enlazador escindible.

17. El anticuerpo de la reivindicación 1, en donde el residuo asparagina glicosilado está ligado a un resto efector fármaco para formar un conjugado de fármaco anticuerpo (ADC).

18. Una composición que comprende el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.

19. Una cantidad efectiva de la composición de la reivindicación 18 para su uso como un medicamento.

20. Un polinucleótido aislado que codifica el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -9.

21. Un vector que comprende el polinucleótido de la reivindicación 20.

22. Una célula anfitriona que comprende el polinucleótido o el vector de las reivindicaciones 20 o 21.

23. Un procedimiento de preparar un anticuerpo que comprende la expresión del polinucleótido de la reivindicación 20 o el vector de la reivindicación 21 en una célula.