RS62884B1

RS62884B1 - Antitela protiv il-22r

Info

Publication number: RS62884B1
Application number: RS20220105A
Authority: RS
Inventors: Christophe Frederic Jerome Blanchetot; Birgitte Ursø; Tine Skak-Nielsen; Malene Bertelsen; Der Woning Sebastian Van; Michael Saunders; Haard Johannes Joseph Wilhelmus De
Original assignee: Argenx Bvba
Priority date: 2016-07-15
Filing date: 2017-07-14
Publication date: 2022-03-31
Also published as: RU2758721C2; EP3484921A1; EP3484921B1; CA3024370A1; SA519400856B1; WO2018011420A1; US20200157207A1; US20230088269A1; JP2019528046A; EP4023674A2; SG11201900128XA; ES2903412T3; DK3484921T3; CN109641966B; HRP20220197T1; US20200216528A1; NZ748737A; AU2017296094B2; MY197821A; RU2019103991A

Description

Opis

OBLAST PRONALASKA

[0001] Ovaj pronalazak se odnosi na antitela i njihove antigen-vezujuće fragmente koji se vezuju za receptor citokina IL-22R, posebno humani IL-22R. Anti-IL-22R antitela i antigen-vezujući fragmenti prema pronalasku pokazuju drugačija svojstva, posebno drugačije kombinacije svojstava, u poređenju sa antitelima protiv IL-22R opisanim u prethodnom stanju tehnike.

OSNOV PRONALASKA

[0002] IL-22R (takođe poznat kao IL-22R1 i IL-22RA) je receptor citokina tipa II selektivno eksprimiran na koži i epitelnim ćelijama. Ovaj receptor posreduje u signalizaciji preko tri citokina: interleukina 22 (IL-22), interleukina 20 (IL-20) i interleukina 24 (IL-24). Prenos signala citokina preko IL-22R zahteva formiranje heterodimernih kompleksa na površini ćelije. Kao što je prikazano na slici 1, IL-22 se vezuje i prenosi signale preko kompleksa koji se sastoji od IL-22R i IL-10Rβ (poznatog i kao IL-10R2), dok se IL-20 i IL-24 vezuju i prenose signale preko heterodimernog kompleksa koji se sastoji od IL-22R i IL-20Rβ (poznatog i kao IL-20R2).

[0003] Interleukin-22 je citokin koji eksprimiraju imunske ćelije, posebno aktivirane dendritske ćelije i T ćelije. Kada ga imunološki sistem proizvede, IL-22 ispoljava svoje biološke efekte vezivanjem i aktiviranjem IL-22R na epitelnim ćelijama. Aktivacija kompleksa IL-22R-IL-10Rβ nishodno od vezivanja IL-22 dovodi do proinflamatornih odgovora, indukcije antimikrobnih proteina koji su kritični za odbranu domaćina od bakterijskih patogena i zaštitnih efekata u nekim organima, kao što su pluća i jetra. IL-22 je takođe uključen u patologiju bolesti, posebno u razvoj inflamatornih poremećaja kao što su psorijaza, psorijazni artritis i atopijski dermatitis (Ma et al. J Clin. Invest. 118: 597-607 (2008); Van Belle et al. J Immunol. Jan 1; 188(1):462-9 (2012); Sabat et al. Nat. Rev. Drug Discov. 13(1): 21-38 (2014)).

[0004] Kristalna struktura IL-22 u kompleksu sa ekstracelularnim domenom IL-22R je određena i pružila je važan uvid u to kako se ovaj ligand povezuje sa svojim receptorom (Jones et al. Structure 16(9): 1333-1344 (2008)). Ekstracelularni region IL-22R uključuje dva domena fibronektina tipa III (FBNIII) (D1 i D2) orijentisana pod približno pravim uglom jedan prema drugom. Pet petlji koje se nalaze na dodirnim površinama ovih domena su prvenstveno odgovorne za angažovanje ostataka IL-22 u kompleksu ligand-receptor. Ostaci IL-22 koji doprinose vezivanju receptora su grupisani na dva mesta u ligandu, mestu 1a i mestu 1b. Poznavanje ključnih ostataka koje obezbeđuju i receptor i ligand otkrilo je načine na koje bi ova interakcija mogla da bude narušena, kako bi se, u vidu terapijske strategije, prekinuo signalni put IL-22.

[0005] Interleukin-20 i interleukin-24 eksprimiraju monociti i keratinociti, i slično kao IL-22, utvrđeno je da ovi citokini imaju ulogu u homeostazi i patologiji kože. Iz toga sledi da strategije za inhibiciju ili smanjenje signalizacije nishodno od IL-22R blokiranjem vezivanja liganada koji aktiviraju ovaj receptor mogu da imaju terapijsku korist, posebno u lečenju stanja kože, kao što su psorijaza i atopijski dermatitis.

[0006] Razvijena su antitela koja se vezuju za IL-22R i blokiraju interakciju između IL-22 i IL-22R. Na primer, WO2011/061119 opisuje humanizovano antitelo protiv IL-22R proizvedeno od mišjeg anti-humanog monoklonskog antitela prvobitno opisanog u WO2006/047249. Pokazalo se da ovo humanizovano antitelo, koje će ovde biti označeno kao "280-346-TSY", inhibira signalni put IL-22 preko IL-22RA u testu proliferacije ćelija, i inhibira IL-23-indukovanu upalu uha na mišjem modelu psorijaze. Anti-IL-22R antitela su takođe opisana u WO2004/085476.

[0007] Dondelinger et al. ((2018) Understanding the significance and implications of antibody numbering and antigen-binding surface/residue definition, Frontiers in Immunology, 9, 2278), opisuje efekat mutacije u regionu okvira antitela koja može da promeni afinitet vezivanja. Rudikoff et al. ((1982) Single amino acid substitution altering antigen-binding specificity, PNAS, 79, 1979-1983), opisuje efekat supstitucije jedne aminokiseline u regionu koji određuje komplementarnost mutantnog fosfoholin-vezujućeg proteina mijeloma.

IZLAGANJE SUŠTINE PRONALASKA

[0008] Ovaj pronalazak donosi poboljšanje u odnosu na stanje tehnike obezbeđivanjem antitela, ili njihovih antigen-vezujućih fragmenata, koji se vezuju za receptor citokina IL-22R, i pokazuju svojstva koja su drugačija od anti-IL-22R antitela opisanih u prethodnom stanju tehnike. Antitela ili njihovi antigen-vezujući fragmenti tipično pokazuju kombinacije osobina koje su drugačije i u određenim slučajevima superiorne u odnosu na svojstva anti-IL-22R antitela iz prethodnog stanja tehnike, posebno humanizovanog anti-IL-22R antitela opisanog u WO2011/061119. Osobine ovih antitela mogu da budu posebno korisne u pogledu upotrebe u humanoj terapiji, posebno za lečenje stanja kao što su psorijaza, psorijazni artritis i atopijski dermatitis.

[0009] Ovaj pronalazak obezbeđuje antitelo ili antigen-vezujući fragment koji se vezuje za IL-22R, pri čemu antitelo ili antigen-vezujući fragment sadrži varijabilni domen teškog lanca i varijabilni domen lakog lanca i gde antitelo ili antigen-vezujući fragment sadrži kombinaciju CDR sekvenci varijabilnog regiona teškog lanca: HCDR3 koji sadrži SEQ ID NO: 6; HCDR2 koji sadrži SEQ ID NO: 36; i HCDR1 koji sadrži SEQ ID NO: 34, i kombinaciju CDR sekvenci varijabilnog regiona lakog lanca: LCDR3 koji sadrži SEQ ID NO: 54; LCDR2 koji sadrži SEQ ID NO: 47; i LCDR1 koji sadrži SEQ ID NO: 16.

[0010] Takođe je ovde uopšteno opisano antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, koji se vezuje za humani IL-22R, pri čemu se antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment vezuje za epitop unutar proteina IL-22R koji ne uključuje Tyr60.

[0011] U određenim primerima izvođenja, antitela ili njihovi antigen-vezujući fragmenti poseduju jedno ili više dodatnih svojstava odabranih od sledećeg:

(i) sposobnost vezivanja epitopa humanog IL-22R koji se nalazi barem delimično u D2 domenu proteina IL-22R;

(ii) sposobnost vezivanja humanog IL-22R sa visokim afinitetom;

(iii) sposobnost blokiranja vezivanja IL-22 za humani IL-22R;

(iv) sposobnost inhibicije IL-22-zavisne aktivacije IL-22R;

(v) sposobnost inhibicije IL-20-zavisne aktivacije IL-22R;

(vi) sposobnost inhibicije IL-22- i IL-20-zavisne aktivacije IL-22R; i

(vii) nedostatak unakrsne reaktivnosti sa mišjim IL-22R.

[0012] Antitela ili antigen-vezujući fragmenti mogu da ispolje visoku homologiju sa antitelima čoveka, kao što je definisano na drugom mestu u ovom dokumentu. U određenim primerima izvođenja, antitela ili njihovi antigen-vezujući fragmenti sadrže varijabilni domen teškog lanca (VH) i varijabilni domen lakog lanca (VL) pri čemu VH i/ili VL domeni ili jedan ili više njihovih regiona koji određuju komplementarnost (CDR) potiču od životinje iz porodice Camelidae, tj. potiču od kamelida. Antitela ili antigen-vezujući fragmenti koji pokazuju visoku homologiju sa humanim antitelom ili imaju najmanje jednu CDR sekvencu, VH i/ili VL domen poreklom od kamelida, mogu da budu varijante VH ili VL domena iz običnih antitela kamelida, koje su humanizovane ili modifikovane prema sekvenci klicine linije, pri čemu su termini "humanizovan" i "modifikovan prema sekvenci klicine linije" definisani na drugom mestu u ovom dokumentu.

[0013] U neograničavajućim primerima, ovde su opisana sledeća antitela, ili njihovi antigenvezujući fragmenti, koji su definisani pozivanjem na specifične strukturne karakteristike, tj. navedene aminokiselinske sekvence bilo CDR (jedna ili više od SEQ ID NO: 2, 4, 6, 9, 11, 13, 34, 36, 41, 43 (CDR regioni teškog lanca) ili SEQ ID NO: 16, 18, 20, 23, 25, 27, 47, 54, 57, 59 (CDR regioni lakog lanca)) ili celih varijabilnih domena (jedna ili više od SEQ ID NO: 29, 31, 63, 65 (varijabilni domeni teškog lanca) ili SEQ ID NO: 30, 32, 62, 64, 66 (varijabilni domeni lakog lanca)). Sva ova antitela se vezuju za humani receptor citokina IL-22R.

[0014] U posebnim primerima izvođenja, antitela definisana sledećim strukturnim karakteristikama mogu da ispolje visoku homologiju sa humanim antitelima, kao što je ovde definisano. Antitela mogu da budu monoklonska antitela proizvedena rekombinantnim putem. CDR sledećih anti-IL-22R antitela mogu da budu potiču od kamelida, tj. da potiču od konvencionalnih antitela dobijenih imunizacijom kamelida (posebno lame). Pronalazak takođe obezbeđuje humanizovane varijante ili varijante modifikovane prema sekvenci klicine linije, afinitetne varijante i varijante koje sadrže konzervativne aminokiselinske supstitucije, kako je ovde definisano.

[0015] Primeri ovde opisanih anti-IL-22R antitela su sada dalje opisani pozivanjem na strukturne karakteristike.

[0016] U jednom ovde opisanom primeru, obezbeđeno je antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, koji se vezuje za receptor citokina IL-22R, navedeno antitelo ili antigen-vezujući fragment sadrži varijabilni domen teškog lanca (VH) koji sadrži CDR3 teškog lanca odabran od:

SEQ ID NO: 6 [VGFSGTYYSES], ili njene varijante sekvence

SEQ ID NO: 13 [PPGPFKAHYNGMKY], ili njene varijante sekvence,

SEQ ID NO: 43 [PPGPFKAHYNGAKY], ili njene varijante sekvence,

pri čemu varijanta sekvence sadrži jednu, dve ili tri aminokiselinske supstitucije (npr. konzervativne supstitucije, humanizujuće supstitucije ili afinitetne varijante) u navedenoj sekvenci.

[0017] Varijabilni domen teškog lanca antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta može alternativno ili dodatno da sadrži CDR2 teškog lanca odabran od:

SEQ ID NO: 4 [SIYNDGSNTAYSDSVKG], ili njene varijante sekvence,

SEQ ID NO: 11 [GIHISGGITYYLDSVKG], ili njene varijante sekvence,

SEQ ID NO: 36 [SIYNDASNTAYSDSVKG], ili njene varijante sekvence,

SEQ ID NO: 41 [GIHISGGITYYTDSVKG], ili njene varijante sekvence,

[0018] Varijabilni domen teškog lanca antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta može alternativno ili dodatno da sadrži CDR1 teškog lanca odabran od:

SEQ ID NO: 2 [SYDMS], ili njene varijante sekvence,

SEQ ID NO: 9 [SYFMS], ili njene varijante sekvence,

SEQ ID NO: 34 [SYDMN], ili njene varijante sekvence,

[0019] Alternativno ili dodatno, antitela ili njihov antigen-vezujući fragment, koji se vezuje za receptor citokina IL-22R, može da sadrži varijabilni domen lakog lanca (VL) koji sadrži CDR3 lakog lanca odabran od:

SEQ ID NO: 20 [QSGSSSANAV], ili njene varijante sekvence,

SEQ ID NO: 27 [ASYRLYADYV], ili njene varijante sekvence,

SEQ ID NO: 54 [QSGSSSSNAV], ili njene varijante sekvence,

[0020] Varijabilni domen lakog lanca antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta može alternativno ili dodatno da sadrži CDR2 lakog lanca odabran od:

SEQ ID NO: 18 [GNNNRPS], ili njene varijante sekvence

SEQ ID NO: 25 [KVNTRSS], ili njene varijante sekvence,

SEQ ID NO: 47 [GQNNRPS], ili njene varijante sekvence,

SEQ ID NO: 59 [EVNKRSS], ili njene varijante sekvence,

[0021] Varijabilni domen lakog lanca antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta može alternativno ili dodatno da sadrži laki lanac CDR1 odabran od:

SEQ ID NO: 16 [QGGYYAH], ili njene varijante sekvence

SEQ ID NO: 23 [TGTSRDIGDYNYVS], ili njene varijante sekvence,

SEQ ID NO: 57 [TGTSSDIGSYNYVS], ili njene varijante sekvence,

[0022] U određenim primerima, opisano je antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, koji se vezuje za receptor citokina IL-22R, gde antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži kombinaciju CDR3 varijabilnog teškog lanca (HCDR3), CDR2 varijabilnog teškog lanca (HCDR2) i CDR1 varijabilnog teškog lanca (HCDR1), pri čemu je kombinacija izabrana iz grupe koja se sastoji od:

(i) HCDR3 koji sadrži SEQ ID NO: 6; HCDR2 koji sadrži SEQ ID NO: 36; HCDR1 koji sadrži SEQ ID NO: 34;

(ii) HCDR3 koji sadrži SEQ ID NO: 43; HCDR2 koji sadrži SEQ ID NO: 41; HCDR1 koji sadrži SEQ ID NO: 9;

(iii) HCDR3 koji sadrži SEQ ID NO: 6; HCDR2 koji sadrži SEQ ID NO: 4; HCDR1 koji sadrži SEQ ID NO: 2; i

(iv) HCDR3 koji sadrži SEQ ID NO: 13; HCDR2 koji sadrži SEQ ID NO: 11; HCDR1 koji sadrži SEQ ID NO: 9.

[0023] Alternativno ili dodatno, antitela ili njihov antigen-vezujući fragment, koji se vezuje za receptor citokina IL-22R, može da sadrži kombinaciju CDR3 varijabilnog lakog lanca (LCDR3), CDR2 varijabilnog lakog lanca (LCDR2) i CDR1 varijabilnog lakog lanca (LCDR1) izabranu iz grupe koja se sastoji od:

(i) LCDR3 koji sadrži SEQ ID NO: 54; LCDR2 koji sadrži SEQ ID NO: 47; LCDR1 koji sadrži SEQ ID NO: 16;

(ii) LCDR3 koji sadrži SEQ ID NO: 27; LCDR2 koji sadrži SEQ ID NO: 59; LCDR1 koji sadrži SEQ ID NO: 57;

(iii) LCDR3 koji sadrži SEQ ID NO: 20; LCDR2 koji sadrži SEQ ID NO: 47; LCDR1 koji sadrži SEQ ID NO: 16;

(iv) LCDR3 koji sadrži SEQ ID NO: 20; LCDR2 koji sadrži SEQ ID NO: 18; LCDR1 koji sadrži SEQ ID NO: 16; i

(v) LCDR3 koji sadrži SEQ ID NO: 27; LCDR2 koji sadrži SEQ ID NO: 25; LCDR1 koji sadrži SEQ ID NO: 23.

[0024] U određenim primerima, ovde su opisana antitela ili njihovi antigen-vezujući fragmenti, koji se vezuju za receptor citokina IL-22R, pri čemu antitela ili antigen-vezujući fragmenti sadrže kombinaciju CDR3 varijabilnog teškog lanca (HCDR3), CDR2 varijabilnog teškog lanca. (HCDR2) i CDR1 varijabilnog teškog lanca (HCDR1), CDR3 varijabilnog lakog lanca (LCDR3), CDR2 varijabilnog lakog lanca (LCDR2) i CDR1 varijabilnog lakog lanca (LCDR1) prema primerima opisanim u nastavku.

[0025] Ovaj pronalazak obezbeđuje antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, koji se vezuje za receptor citokina IL-22R i sadrži kombinaciju CDR sekvenci VH i VL: HCDR3 koji sadrži SEQ ID NO: 6; HCDR2 koji sadrži SEQ ID NO: 36; HCDR1 koji sadrži SEQ ID NO: 34; LCDR3 koji sadrži SEQ ID NO: 54; LCDR2 koji sadrži SEQ ID NO: 47; i LCDR1 koji sadrži SEQ ID NO: 16.

[0026] U jednom primeru, ovde je opisano antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, koji se vezuje za receptor citokina IL-22R i sadrži kombinaciju CDR sekvenci VH i VL: HCDR3 koji sadrži SEQ ID NO: 43; HCDR2 koji sadrži SEQ ID NO: 41; HCDR1 koji sadrži SEQ ID NO: 9; LCDR3 koji sadrži SEQ ID NO: 27; LCDR2 koji sadrži SEQ ID NO: 59; i LCDR1 koji sadrži SEQ ID NO: 57.

[0027] U jednom primeru, ovde je opisano antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, koji se vezuje za receptor citokina IL-22R i sadrži kombinaciju CDR sekvenci VH i VL: HCDR3 koji sadrži SEQ ID NO: 6; HCDR2 koji sadrži SEQ ID NO: 4; HCDR1 koji sadrži SEQ ID NO: 2; LCDR3 koji sadrži SEQ ID NO: 20; LCDR2 koji sadrži SEQ ID NO: 47; i LCDR1 koji sadrži SEQ ID NO: 16.

[0028] U jednom primeru, ovde je opisano antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, koji se vezuje za receptor citokina IL-22R i sadrži kombinaciju CDR sekvenci VH i VL: HCDR3 koji sadrži SEQ ID NO: 6; HCDR2 koji sadrži SEQ ID NO: 4; HCDR1 koji sadrži SEQ ID NO: 2; LCDR3 koji sadrži SEQ ID NO: 20; LCDR2 koji sadrži SEQ ID NO: 18; i LCDR1 koji sadrži SEQ ID NO: 16.

[0029] U jednom primeru, ovde je opisano antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, koji se vezuje za receptor citokina IL-22R i sadrži kombinaciju CDR sekvenci VH i VL: HCDR3 koji sadrži SEQ ID NO: 13; HCDR2 koji sadrži SEQ ID NO: 11; HCDR1 koji sadrži SEQ ID NO: 9; LCDR3 koji sadrži SEQ ID NO: 27; LCDR2 koji sadrži SEQ ID NO: 25; i LCDR1 koji sadrži SEQ ID NO: 23.

[0030] U određenim primerima, ovde su opisana antitela ili njihovi antigen-vezujući fragmenti, koji se vezuju za receptor citokina IL-22R, pri čemu antitela ili antigen-vezujući fragmenti sadrže varijabilni domen teškog lanca (VH) izabran od sledećeg:

(i) VH koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 29 ili 31 (ii) afinitetnu varijantu ili varijantu modifikovanu prema sekvenci humane klicine linije VH koja sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 29 ili 31; ili (iii) VH koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence koja ima najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 29 ili 31.

[0031] Alternativno ili dodatno, antitela ili antigen-vezujući fragmenti mogu da sadrže varijabilni domen lakog lanca (VL) odabran od sledećeg:

(i) VL koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 30, 32 ili 62 (ii) afinitetnu varijantu ili varijantu modifikovanu prema sekvenci humane klicine linije VH koja sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 30, 32 ili 62; ili (iii) VL koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence koja ima najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 30, 32 ili 62.

[0032] Za primere izvođenja u kojima su domeni antitela ili antigen-vezujućih fragmenata definisani određenim procentom identičnosti sekvence sa referentnom sekvencom, VH i/ili VL domeni mogu da zadrže identične CDR sekvence onima prisutnim u referentnoj sekvenci tako da je varijacija prisutna samo unutar regiona okvira.

[0033] U određenim primerima izvođenja, antitela pronalaska mogu da obuhvataju CH1 domen, region zgloba, CH2 domen i CH3 domen humanog antitela, posebno humanog IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4.

[0034] Posebno poželjna antitela ovog pronalaska su opisana u nastavku.

230C9 i srodna antitela

[0035] U određenim primerima, obezbeđeno je izolovano antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, koji specifično vezuje IL-22R, navedeno antitelo ili antigen-vezujući fragment sadrži varijabilni domen teškog lanca gde:

CDR3 sekvenca varijabilnog teškog lanca je SEQ ID NO:6 [VGFSGTYYSES] ili njena varijanta sekvence;

CDR2 sekvenca varijabilnog teškog lanca je SEQ ID NO:36 [SIYNDASNTAYSDSVKG] ili njena varijanta sekvence; i

CDR1 sekvenca varijabilnog teškog lanca je SEQ ID NO:34 [SYDMN] ili njena varijanta sekvence, i

[0036] Antitelo ili antigen-vezujući fragment može dalje da sadrži varijabilni domen lakog lanca gde:

CDR3 sekvenca varijabilnog lakog lanca je SEQ ID NO: 54 [QSGSSSSNAV] ili njena varijanta sekvence;

CDR2 sekvenca varijabilnog lakog lanca je SEQ ID NO: 47 [GQNNRPS] ili njena varijanta sekvence; i

CDR1 sekvenca varijabilnog lakog lanca je SEQ ID NO:16 [QGGYYAH] ili njena varijanta sekvence, i

[0037] U ovom pronalasku, obezbeđeno je izolovano antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, koji specifično vezuje IL-22R, gde navedeno antitelo ili antigen-vezujući fragment sadrži varijabilni domen teškog lanca gde:

CDR3 sekvenca varijabilnog teškog lanca sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO:6 [VGFSGTYYSES];

CDR2 sekvenca varijabilnog teškog lanca sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO:36 [SIYNDASNTAYSDSVKG];

CDR1 sekvenca varijabilnog teškog lanca sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO: 34 [SYDMN];

CDR3 sekvenca varijabilnog lakog lanca sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO: 54 [QSGSSSSNAV];

CDR2 sekvenca varijabilnog lakog lanca sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO: 47 [GQNNRPS]; i

CDR1 sekvenca varijabilnog lakog lanca sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO:16 [QGGYYAH].

[0038] Antitela ili njihovi antigen-vezujući fragmenti mogu da sadrže varijabilni domen teškog lanca (VH) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 63 i opciono varijabilni domen lakog lanca (VL) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO : 64. U određenim primerima izvođenja, ovde su obezbeđena monoklonska antitela ili njihovi antigen-vezujući fragmenti, koji sadrže varijabilni domen teškog lanca i varijabilni domen lakog lanca, pri čemu varijabilni domen teškog lanca sadrži VH sekvencu sa najmanje 85% identičnosti sekvence, ili najmanje 90% identičnosti sekvence, ili najmanje 95% identičnosti sekvence, ili najmanje 97%, 98% ili 99% identičnosti sekvence, sa aminokiselinskom sekvencom prikazanom kao SEQ ID NO:63 i/ili varijabilni domen lakog lanca sadrži VL sa najmanje 85% identičnosti sekvence, ili najmanje 90% identičnosti sekvence, ili najmanje 95% identičnosti sekvence, ili najmanje 97%, 98% ili 99% identičnosti sekvence, sa aminokiselinskom sekvencom prikazanu kao SEQ ID NO: 64. Za primere

1

izvođenja u kojima su domeni antitela ili antigen-vezujućih fragmenata definisani određenim procentom identičnosti sekvence sa referentnom sekvencom, VH i/ili VL domeni mogu da zadrže identične CDR sekvence onima prisutnim u referentnoj sekvenci tako da je varijacija prisutna samo unutar regiona okvira. U određenim primerima izvođenja, antitela ili antigen-vezujući fragmenti koji sadrže varijabilne domene teškog lanca i/ili varijabilne domene lakog lanca definisane kao da imaju određeni procenat identičnosti sa SEQ ID NO: 63, odnosno 64, imaće sledeće CDR sekvence:

CDR3 sekvencu varijabilnog teškog lanca koja sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO:6 [VGFSGTYYSES];

CDR2 sekvencu varijabilnog teškog lanca koja sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO:36 [SIYNDASNTAYSDSVKG];

CDR1 sekvencu varijabilnog teškog lanca koja sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO:34 [SYDMN];

CDR3 sekvencu varijabilnog lakog lanca koja sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO: 54 [QSGSSSSNAV];

CDR2 sekvencu varijabilnog lakog lanca koja sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO: 47 [GQNNRPS]; i

CDR1 sekvencu varijabilnog lakog lanca koja sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO:16 [QGGYYAH].

[0039] Antitela koja specifično vezuju IL-22R mogu da sadrže najmanje jedan teški lanac imunoglobulina pune dužine i/ili najmanje jedan lambda ili kapa laki lanac pune dužine. U određenim primerima izvođenja, antitela sadrže teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 67 i laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 68. U određenim primerima izvođenja, ovde su obezbeđena monoklonska antitela koja sadrže teški lanac sa najmanje 85% identičnosti sekvence, ili najmanje 90% identičnosti sekvence, ili najmanje 95% identičnosti sekvence, ili najmanje 97%, 98% ili 99% identičnosti sekvence, sa aminokiselinskom sekvencom prikazanom kao SEQ ID NO:67 i/ili laki lanac sa najmanje 85% identičnosti sekvence, ili najmanje 90% identičnosti sekvence, ili najmanje 95% identičnosti sekvence, ili najmanje 97%, 98% ili 99% identičnosti sekvence, sa aminokiselinskom sekvencom prikazanom kao SEQ ID NO:68. Kod primera izvođenja u kojima su lanci antitela definisani određenim procentom identičnosti sekvence sa referentnom sekvencom, teški lanac i/ili laki lanac mogu da zadrže identične CDR sekvence onima koje su prisutne u referentnoj sekvenci, tako da je varijacija prisutna samo izvan CDR regiona.

223G5 i srodna antitela

[0040] U određenim primerima, obezbeđeno je izolovano antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, koji specifično vezuje IL-22R, pri čemu navedeno antitelo ili antigen-vezujući fragment sadrži varijabilni domen teškog lanca gde:

CDR3 sekvenca varijabilnog teškog lanca je SEQ ID NO:43 [PPGPFKAHYNGAKY] ili njena varijanta sekvence;

CDR2 sekvenca varijabilnog teškog lanca je SEQ ID NO:41 [GIHISGGITYYTDSVKG] ili njena varijanta sekvence; i

CDR1 sekvenca varijabilnog teškog lanca je SEQ ID NO:9 [SYFMS] ili njena varijanta sekvence, i

[0041] Antitelo ili antigen-vezujući fragment može dalje da sadrži varijabilni domen lakog lanca gde:

CDR3 sekvenca varijabilnog lakog lanca je SEQ ID NO:27 [ASYRLYADYV] ili njena varijanta sekvence;

CDR2 sekvenca varijabilnog lakog lanca je SEQ ID NO:59 [EVNKRSS] ili njena varijanta sekvence; i

CDR1 sekvenca varijabilnog lakog lanca je SEQ ID NO:57 [TGTSSDIGSYNYVS] ili njena varijanta sekvence, i

[0042] U određenim primerima koji su ovde opisani, obezbeđeno je izolovano antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, koji specifično vezuje IL-22R, pri čemu navedeno antitelo ili antigenvezujući fragment sadrži varijabilni domen teškog lanca gde:

CDR3 sekvenca varijabilnog teškog lanca sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO: 43 [PPGPFKAHYNGAKY];

CDR2 sekvenca varijabilnog teškog lanca sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO: 41 [GIHISGGITYYTDSVKG];

CDR1 sekvenca varijabilnog teškog lanca sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO:9 [SYFMS]; CDR3 sekvenca varijabilnog lakog lanca sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO: 27 [ASYRLYADYV];

CDR2 sekvenca varijabilnog lakog lanca sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO: 59 [EVNKRSS]; i

CDR1 sekvenca varijabilnog lanca sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO:57 [TGTSSDIGSYNYVS].

[0043] Antitela ili njihovi antigen-vezujući fragmenti mogu da sadrže varijabilni domen teškog lanca (VH) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 65 i opciono varijabilni domen lakog lanca (VL) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO : 66. U određenim primerima, ovde su opisana monoklonska antitela ili njihovi antigen-vezujući fragmenti, koji sadrže varijabilni domen teškog lanca i varijabilni domen lakog lanca, gde varijabilni domen teškog lanca sadrži VH sekvencu sa najmanje 85% identičnosti sekvence, ili najmanje 90% identičnosti sekvence, ili najmanje 95% identičnosti sekvence, ili najmanje 97%, 98% ili 99% identičnosti sekvence, sa aminokiselinskom sekvencom prikazanom kao SEQ ID NO:65 i/ili gde varijabilni domen lakog lanca sadrži VL sa najmanje 85% identičnosti sekvence, ili najmanje 90% identičnosti sekvence, ili najmanje 95% identičnosti sekvence, ili najmanje 97%, 98% ili 99% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom prikazanom kao SEQ ID NO: 66.

[0044] Kod primera izvođenja u kojima su domeni antitela ili antigen-vezujućih fragmenata definisani određenim procentom identičnosti sekvence sa referentnom sekvencom, VH i/ili VL domeni mogu da zadrže identične CDR sekvence onima prisutnim u referentnoj sekvenci, tako da je varijacija prisutna samo unutar regiona okvira. U određenim primerima, antitela ili antigenvezujući fragmenti koji sadrže varijabilne domene teškog lanca i/ili varijabilne domene lakog lanca definisane kao da imaju određeni procenat identičnosti sa SEQ ID NO: 65, odnosno 66, imaće sledeće CDR sekvence:

CDR3 sekvencu varijabilnog teškog lanca koja sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO:43 [PPGPFKAHYNGAKY];

CDR2 sekvencu varijabilnog teškog lanca koja sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO: 41 [GIHISGGITYYTDSVKG];

CDR1 sekvencu varijabilnog teškog lanca koja sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO:9 [SYFMS];

CDR3 sekvencu varijabilnog lakog lanca koja sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO:27 [ASYRLYADYV];

1

CDR2 sekvencu varijabilnog lakog lanca koja sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO:59 [EVNKRSS]; i

CDR1 sekvencu varijabilnog lakog lanca koja se sastoji od SEQ ID NO: 57 [TGTSSDIGSYNYVS].

[0045] Antitela koja specifično vezuju IL-22R mogu da sadrže najmanje jedan teški lanac imunoglobulina pune dužine i/ili najmanje jedan lambda ili kapa laki lanac pune dužine. U određenim primerima, antitela sadrže teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 69 i laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 70. U određenim primerima, ovde su opisana monoklonska antitela koja sadrže teški lanac sa najmanje 85% identičnosti sekvence, ili najmanje 90% identičnosti sekvence, ili najmanje 95% identičnosti sekvence, ili najmanje 97%, 98% ili 99% identičnosti sekvence, sa aminokiselinskom sekvencom prikazanom kao SEQ ID NO:69 i/ili laki lanac sa najmanje 85% identičnosti sekvence, ili najmanje 90% identičnosti sekvence, ili najmanje 95% identičnosti sekvence, ili najmanje 97%, 98% ili 99% identičnosti sekvence, sa aminokiselinskom sekvencom prikazanom kao SEQ ID NO:70.

[0046] Kod primera izvođenja u kojima su lanci antitela definisani određenim procentom identičnosti sekvence sa referentnom sekvencom, teški lanac i/ili laki lanac mogu da zadrže identične CDR sekvence onima koje su prisutne u referentnoj sekvenci, tako da je varijacija prisutna samo izvan CDR regiona.

[0047] Kada su određena antitela, ili regioni koji se vezuju za antigen, identifikovani kao oni koji sadrže kombinaciju VH domena ili teškog lanca, definisanog referencom na specifičnu aminokiselinsku sekvencu, i VL domena ili lakog lanca, takođe definisanog referencom na specifičnu aminokiselinsku sekvencu, onda za svaku navedenu specifičnu kombinaciju VH/VL ili teškog lanca/lakog lanca (osim ako nije drugačije navedeno), može da se smatra da ova definicija uključuje antitela ili regione koji se vezuju za antigen, formirane kombinacijom VH domena/teškog lanca koji ima najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 97%, ili najmanje 99% identičnosti sekvence sa navedenom aminokiselinskom sekvencom VH/teškog lanca, i VL domena/lakog lanca koji ima najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 97%, ili najmanje 99% identičnosti sekvence sa navedenom aminokiselinskom sekvencom VL/lakog lanca. U svakom slučaju, domeni/lanci definisani procentom identičnosti sekvence sa navedenim aminokiselinskim sekvencama domena/lanca mogu da zadrže identične CDR sekvence onima prisutnim u navedenom VH/VL domenu ili aminokiselinskim sekvencama teškog/lakog lanca, dok pokazuju varijaciju aminokiselinske sekvence unutar regiona okvira ili drugih regiona van CDR regiona.

[0048] Osim ako je drugačije navedeno u ovoj prijavi, procenat identičnosti sekvence između dve aminokiselinske sekvence može da se odredi upoređivanjem ove dve sekvence koje su poravnate na optimalan način i u kojima sekvenca aminokiselina koja se poredi može da sadrži adicije ili delecije u odnosu na referentnu sekvencu za optimalno poravnanje između ove dve sekvence. Procenat identičnosti se izračunava određivanjem broja identičnih pozicija za koje je aminokiselinski ostatak identičan između dve sekvence, deljenjem ovog broja identičnih pozicija sa ukupnim brojem pozicija u prozoru za poređenje i množenjem dobijenog rezultata sa 100 da bi se dobio procenat identičnosti između ove dve sekvence. Na primer, moguće je koristiti program BLAST, "BLAST 2 sequences" (Tatusova et al, "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol Lett. 174:247-250) dostupan na sajtu http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html, pri čemu su korišćeni podrazumevani parametri (posebno za parametre "kazna za otvorenu prazninu": 5 i "kazna za dužinu praznine" : 2; pri čemu je izabrana matrica, na primer, matrica "BLOSUM 62" koju je predložio program), program direktno izračunava procenat identičnosti između dve sekvence koje treba uporediti.

[0049] Anti-IL-22R antitela ili njihovi antigen-vezujući fragmenti koji su ovde dati mogu da ispolje jedno, ili bilo koju kombinaciju, od sledećih svojstava/karakteristika:

- antitelo ili antigen-vezujući fragment može da se veže za epitop unutar proteina humanog IL-22R koji ne uključuje Tyr60;

- antitelo ili antigen-vezujući fragment može da se veže za epitop koji se nalazi barem delimično u D2 domenu proteina humanog IL-22R, pri čemu D2 domen predstavlja aminokiselinske ostatke 125 do 228 u SEQ ID NO: 71;

- antitelo ili antigen-vezujući fragment može da se veže za humani IL-22R sa visokim afinitetom;

- antitelo ili antigen-vezujući fragment može da blokira vezivanje IL-22 za IL-22R;

- antitelo ili antigen-vezujući fragment može da inhibira IL-22-zavisnu aktivaciju IL-22R; - antitelo ili antigen-vezujući fragment može da inhibira IL-20-zavisnu aktivaciju IL-22R; - antitelo ili antigen-vezujući fragment može da inhibira IL-22-zavisnu aktivaciju IL-22R i IL-20-zavisnu aktivaciju IL-22R;

- antitelo ili antigen-vezujući fragment ne može unakrsno da reaguje sa mišjim IL-22R.

[0050] Anti-IL-22R antitela ili njihovi antigen-vezujući fragmenti koji su ovde dati poželjno pokazuju dva ili više od sledećih svojstava/karakteristika:

- antitelo ili antigen-vezujući fragment vezuje se za epitop unutar proteina humanog IL-22R koji ne uključuje Tyr60;

1

- antitelo ili antigen-vezujući fragment vezuje se za humani IL-22R sa visokim afinitetom; - antitelo ili antigen-vezujući fragment inhibira IL-22-zavisnu aktivaciju IL-22R i IL-20-zavisnu aktivaciju IL-22R.

[0051] Anti-IL-22R antitela, ili njihovi antigen-vezujući fragmenti, koji su ovde obezbeđeni, mogu da budu himerna antitela. U određenim primerima izvođenja, antitela ili njihovi antigen-vezujući fragmenti sadrže region zgloba, CH2 domen i/ili CH3 domen humanog IgG. U određenim primerima izvođenja, antitela ili njihovi antigen-vezujući fragmenti pokazuju visoku homologiju sa humanim IgG, poželjno humanim IgG1, pri čemu je "visoka homologija sa humanim antitelom" kao što je definisano na drugom mestu u ovom dokumentu. U određenim primerima izvođenja, antitela ili njihovi antigen-vezujući fragmenti sadrže varijabilni domen teškog lanca (VH) i varijabilni domen lakog lanca (VL) pri čemu VH i/ili VL domeni ili jedan ili više njihovih regiona koji određuju komplementarnost (CDR) potiču od životinje iz porodice Camelidae, tj. potiču od kamelida, gde je poželjno kamelida lama.

[0052] U sledećim aspektima, pronalazak takođe obezbeđuje polinukleotidne molekule koji kodiraju gore navedena antitela i antigen-vezujuće fragmente prema pronalasku, pored ekspresionih vektora koji sadrže polinukleotide, ćelija-domaćina koje sadrže vektore i postupaka za rekombinantnu ekspresiju/proizvodnju antitela pronalaska.

[0053] U sledećem aspektu, pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži anti-IL-22R antitela ili njihove antigen-vezujuće fragmente prema pronalasku, i farmaceutski prihvatljiv nosač ili ekscipijens.

[0054] Sledeći aspekt pronalaska se odnosi na anti-IL-22R antitela ili njihove antigen-vezujuće fragmente prema pronalasku za upotrebu kao lek, posebno u profilaksi i/ili lečenju stanja kao što su psorijaza, psorijazni artritis i atopijski dermatitis.

[0055] Ovi i drugi primeri izvođenja pronalaska biće bolje cenjeni i shvaćeni kada se razmatraju zajedno sa sledećim opisom i pratećim crtežima.

KRATAK OPIS CRTEŽA

[0056]

Slika 1 prikazuje različite komplekse receptora koji posreduju u prenosu signala preko citokina IL-22, IL-20 i IL-24. IL-22R je sposoban da formira heterodimerni kompleks sa dva različita partnera receptora, IL-10Rβ (ili IL-10R2) i IL-20Rβ (ili IL-20R2), i aktivacija ovih različitih kompleksa vezivanjem liganda pokreće signalizaciju preko intracelularnih nishodnih puteva. Slika 2 prikazuje aminokiselinsku sekvencu pune dužine humanog IL-22R (SEQ ID NO: 71).

1

Slika 3 prikazuje nukleotidnu sekvencu pune dužine koja kodira humani IL-22R (SEQ ID NO: 72).

Slika 4 prikazuje inhibiciju IL-22- i IL-20-posredovane signalizacije preko IL-22R u testovima proliferacije na ćelijama. (A) Prikazan je efekat mAb protiv IL-22R na proliferaciju ćelijske linije BW-hIL-22R. Ćelije BW-hIL-22R stabilno eksprimiraju humani IL-22R i rast je inhibiran/zaustavljen kao odgovor na ligand IL-22. Antitela sposobna da blokiraju interakciju između IL-22 i hIL-22R ublažavaju inhibiciju rasta posredovanu vezivanjem ligand-receptor. (B) Prikazan je efekat mAb protiv IL-22R na proliferaciju ćelijske linije Baf3-hIL-22R/IL20Rb. Ćelije Baf3-hIL-22R/IL20Rb stabilno eksprimiraju komponente receptorskog kompleksa IL-22R/IL20Rb tako da ćelije proliferišu u prisustvu IL-20. Antitela sposobna da blokiraju interakciju između IL-20 i ovog receptorskog kompleksa inhibiraju proliferaciju indukovanu vezivanjem liganda.

Slika 5 prikazuje poravnanje ekstracelularnog domena IL-22R različitih vrsta. (A) prikazuje delimične EST sekvence dostupne kod Genbank; (B) prikazuje sekvence određene nakon kloniranja IL-22R cinomolgus i rezus majmuna iz biblioteke cDNK cinomolgusa.

Slika 6 prikazuje rezultate kompetitivnih ELISA eksperimenata sprovedenih da bi se mapirali epitopi mAb protiv IL-22R. Različiti epitopi su identifikovani za antitela VH porodica 1-8, 10, 11, 19 i 22. Epitopi su grupisani prema tome da li su antitela (i) blokirala vezivanje IL-22 in vitro i neutralisala signalizaciju IL-22 u testu na ćelijama (donji levi kvadrant); (ii) blokirala vezivanje IL-22 in vitro, ali nisu imala neutrališuću aktivnost u testu na ćelijama (gornji desni kvadrant); ili (iii) nisu blokirala vezivanje IL-22 in vitro, ali su imala neutrališuću aktivnost u testu na ćelijama (donji desni kvadrant).

Slika 7 prikazuje kristalnu strukturu IL-22R u kompleksu sa IL-22. (A) Domeni D1 i D2 u IL-22R doprinose ostacima dodirnoj površini sa ligandom IL-22. (B) Y60 u domenu D1 je važan ostatak IL-22R koji doprinosi interakciji sa mestom 1A liganda IL-22.

Slika 8 prikazuje inhibiciju IL-20-posredovane signalizacije preko IL-22R u testu proliferacije na ćelijama. Ispitana je sposobnost različitih mAb protiv IL-22R da inhibiraju IL-20-indukovanu proliferaciju ćelija Baf3-hIL-22R/IL20Rb.

Slika 9 prikazuje inhibiciju IL-22- i IL-20-posredovane signalizacije preko IL-22R u testovima na ćelijama. (A) Prikazan je efekat mAb protiv IL-22R na proliferaciju ćelijske linije BW-hIL-22R. Ćelije BW-hIL-22R stabilno eksprimiraju humani IL-22R i rast je inhibiran/zaustavljen kao odgovor na ligand IL-22. Antitela sposobna da blokiraju interakciju između IL-22 i hIL-22R ublažavaju inhibiciju rasta posredovanu vezivanjem ligand-receptor. (B) Prikazan je efekat mAb protiv IL-22R na proliferaciju ćelijske linije Baf3-hIL-22R/IL20Rb. Ćelije Baf3-hIL-22R/IL20Rb

1

stabilno eksprimiraju komponente receptorskog kompleksa IL-22R/IL20Rb tako da ćelije proliferišu u prisustvu IL-20. Antitela sposobna da blokiraju interakciju između IL-20 i ovog receptorskog kompleksa inhibiraju proliferaciju indukovanu vezivanjem liganda.

Slika 10 prikazuje šematski rezultate eksperimenata mapiranja epitopa za antitela modifikovana prema sekvenci klicine linije protiv IL-22R, 230C9 i 223G5. NB "Zymo" je ekvivalentan 280-346-TSY".

Slika 11 prikazuje unakrsnu reaktivnost antitela modifikovanih prema sekvenci klicine linije protiv IL-22R čoveka i cinomolgusa, kao što je utvrđeno FACS analizom. Antitelo 230C9 unakrsno reaguje sa humanim IL-22R i IL-22R cinomolgusa (levi paneli), dok se antitelo 223G5 vezuje za humani IL-22R, ali ne reaguje unakrsno sa IL-22R cinomolgusa (desni paneli).

Slika 12 prikazuje farmakokinetičke podatke za anti-IL-22R antitelo 230C9. Cinomolgus majmunima je ubrizgana intravenski jedna doza antitela od 10 mg/kg. Uzorci su uzeti u različitim vremenskim trenucima i u njima je ispitana koncentracija antitela u plazmi pomoću ELISA testa. Utvrđeno je da antitelo 230C9 ima poluživot od oko 19.4 dana.

Slika 13 prikazuje farmakokinetičke podatke za anti-IL-22R antitelo 230C9 u različitim dozama. Pri višim dozama (≥10 mg/kg) kada je kapacitet za ciljem-posredovanu raspodelu leka (TMDD) zasićen, vrednosti klirensa se približavaju nespecifičnom klirensu putem RES. B. Klirens 230C9-N297Q kod cinomolgusa. Ukupni klirens predstavlja zbir 1) TMDD koji je nelinearan i može da se zasiti i 2) nespecifičnog klirensa koji je linearan i pripisan RES. Poluživot u plazmi ima inverznu vezu sa klirensom, što dovodi do dugog poluživota pri visokim dozama i kraćeg poluživota pri nižim dozama zbog ciljem-posredovanog klirensa.

Slika 14 prikazuje farmakodinamički efekat anti-IL-22R antitela 230C9. Cinomolgus majmun je bio izložen delovanju 230C9 u različitim dozama i procenjeni su efekti na područje kože tretirano sa IMQ i normalno područje kože majmuna. Utvrđeno je da rastuće doze antitela 230C9 normalizuje debljinu epiderma (A) i smanjuje učestalost Ki67-pozitivnih jedara (B) u delu kože tretiranom sa IMQ.

Slika 15 prikazuje efekat anti-IL-22R antitela 230C9 (ARGX-112) na IL-22-regulisane nivoe iRNK FLG2 u biopsijama isečaka kože. Cinomolgus majmunima su date pojedinačne IV infuzije antitela 230C9 u različitim dozama: 1 mg/kg, 5 mg/kg i 30 mg/kg (3 životinje po dozi). Rekombinantni humani IL-22 smanjio je ukupne nivoe iRNK FLG2 u koži, dok je ovaj efekat bio poništen antitelom 230C9. Y osa pokazuje relativnu ekspresiju FLG2 u poređenju sa referentnim genom. Statistička poređenja između grupa su označena linijama na vrhu grafikona sa intervalima poverenja na sledeći način: *p<0.05; **p<0.01; ***p<0.001. Prikazani procenti (60%, 64%, 60%, redom) ukazuju na % inhibicije signala.

1

Slika 16 prikazuje efekat anti-IL-22R antitela 230C9 (ARGX-112) na IL-22-regulisanu ekspresiju gena DEFB4 u ex vivo eksplantima ljudske kože. Eksplanti abdominalne kože tretirani su rastućim koncentracijama antitela 230C9 pre stimulacije sa 20 ng/ml rhIL-22. Antitelo 230C9 je bilo u stanju da preokrene IL-22-posredovano povećanje nivoa iRNK DEFB4 na dozno-zavisan način. Y osa pokazuje relativnu ekspresiju DEFB4 u poređenju sa referentnim genom. LLOQ označava donji nivo kvantifikacije.

Slika 17 prikazuje efekat anti-IL-22R antitela 230C9 (ARGX-112) na IL-22-regulisanu ekspresiju gena FLG2 i LOR u ex vivo eksplantima kože cinomolgus majmuna. Biopsije kože su tretirane rastućim koncentracijama antitela 230C9 pre stimulacije sa 20 ng/ml rhIL-22. Antitelo 230C9 je bilo u stanju da preokrene IL-22 posredovano smanjenje nivoa iRNK FLG2 (A) i nivoa iRNK LOR (B) na dozno-zavisan način. Y ose pokazuju relativnu ekspresiju FLG2 i LOR u poređenju sa referentnim genom.

Slika 18 pokazuje efekat anti-IL-22R antitela 230C9 (ARGX-112) na primarne humane keratinocite. Keratinociti su prethodno tretirani antitelom 230C9, a zatim stimulisani mešavinom IL-4, IL-13, IL-22 i IFN-γ. Kontrolne ćelije su tretirane mešavinom IL-4, IL-13 i IFN- γ. Antitelo 230C9 je pokazalo dozno-zavisnu inhibiciju sekrecije CCL2.

DETALJAN OPIS

A. Definicije

[0057] "Antitelo" ili "imunoglobulin" - Kako se ovde koristi, termin "imunoglobulin" uključuje polipeptid koji ima kombinaciju dva teška i dva laka lanca, bez obzira na to da li poseduje bilo kakvu relevantnu specifičnu imunoreaktivnost. "Antitela" se odnose na takve sklopove koji imaju značajnu poznatu specifičnu imunoreaktivnu aktivnost prema antigenu od interesa (npr. receptor citokina IL-22R). Termin "anti-IL-22R antitela" se ovde koristi da označi antitela koja pokazuju imunološku specifičnost za protein IL-22R, uključujući humani IL-22R i u nekim slučajevima njegove homologe vrsta. Antitela i imunoglobulini sadrže lake i teške lance, sa ili bez međulančane kovalentne veze između njih. Osnovne strukture imunoglobulina u sistemima kičmenjaka su relativno dobro shvaćene.

[0058] Generički termin "imunoglobulin" obuhvata pet različitih klasa antitela koje mogu da se razlikuju biohemijski. Svih pet klasa antitela su u okviru ovog pronalaska. Diskusija u nastavku teksta će uglavnom biti usmerena na IgG klasu molekula imunoglobulina. Kada je u pitanju IgG, imunoglobulini sadrže dva identična laka polipeptidna lanca molekulske težine približno 23 000 Daltona i dva identična teška lanca molekulske težine 53 000-70 000. Četiri lanca su spojena

1

disulfidnim vezama u "Y" konfiguraciji pri čemu laki lanci obuhvataju teške lance počevši od ušća "Y" i nastavljajući se kroz varijabilni region.

[0059] Laki lanci antitela su klasifikovani kao kapa ili kao lambda (κ, λ). Svaka klasa teškog lanca može da bude vezana ili sa kapa ili sa lambda lakim lancem. Uopšteno govoreći, laki i teški lanci su kovalentno vezani jedan za drugi, a "repni" delovi dva teška lanca su međusobno povezani kovalentnim disulfidnim vezama ili nekovalentnim vezama kada imunoglobulini nastaju ili u hibridomima, B-ćelijama ili genetski modifikovanim ćelijama-domaćinima. U teškom lancu, aminokiselinske sekvence se pružaju od N-kraja na račvastim krajevima Y konfiguracije do C-kraja na dnu svakog lanca. Stručnjaci će razumeti da su teški lanci klasifikovani kao gama, mi, alfa, delta ili epsilon, (γ, µ, α, δ, ε) sa njihovim potklasama (npr., γ1- γ4). Priroda ovog lanca određuje "klasu" antitela kao IgG, IgM, IgA, IgD ili IgE, redom. Potklase (izotipovi) imunoglobulina, npr., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, itd., su dobro okarakterisane i poznato je da obezbeđuju funkcionalnu specijalizaciju. Modifikovane verzije svake od ovih klasa i izotipova su lako uočljive stručnjaku u ovoj oblasti u svetlu predmetnog otkrića i, shodno tome, obuhvaćene su obimom ovog pronalaska.

[0060] Kao što je gore navedeno, varijabilni region antitela omogućava antitelu da selektivno prepozna i specifično vezuje epitope na antigenima. To jest, VL domen i VH domen antitela se kombinuju da bi formirali varijabilni region koji definiše trodimenzionalno antigen-vezujuće mesto. Ova kvaternarna struktura antitela formira antigen-vezujuće mesto prisutno na kraju svakog kraka Y. Tačnije, antigen-vezujuće mesto definišu tri regiona koja određuju komplementarnost (CDR) na svakom od VH i VL lanaca.

[0061] "IL-22R" - Kako se ovde koristi, termin "IL-22R" označava receptor citokina tipa II koji posreduje u prenošenju signala preko liganada IL-22, IL-20 i IL-24. IL-22R je sposoban da formira heterodimerne komplekse na površini ćelije sa IL-10R2 i IL-20R2. IL-22R može da se označi i kao IL22R, IL-22R1, IL22R1, IL22RA, IL-22RA, CRF2-9 i Zcytor 11. Termin "IL-22R1" je dovoljno širok da obuhvati humani oblik receptora i homologe vrsta. Aminokiselinska sekvenca humanog IL-22R pune dužine je predstavljena sekvencom SEQ ID NO: 71, a kodirajuća nukleotidna sekvenca je predstavljena sekvencom SEQ ID NO: 72 (videti slike 2 i 3). Ove sekvence odgovaraju sekvencama deponovanim u bazi podataka SwissProt kao podjedinica receptora za humani protein interleukin-22, pristupni broj Q8N6P7.

[0062] "Vezujuće mesto" – Kako se ovde koristi, termin "vezujuće mesto" obuhvata region polipeptida koji je odgovoran za selektivno vezivanje za ciljni antigen od interesa (npr. IL-22R). Vezujući domeni sadrže najmanje jedno vezujuće mesto. Primeri vezujućih domena uključuju

2

varijabilni domen antitela. Molekuli antitela prema pronalasku mogu da sadrže pojedinačno vezujuće mesto ili višestruka (npr. dva, tri ili četiri) vezujuća mesta.

[0063] "Potiče od" - Kako se ovde koristi termin "potiče od" označenog proteina (npr. antitelo kamelida ili njegov antigen-vezujući fragment) odnosi se na poreklo polipeptidne ili aminokiselinske sekvence. U jednom primeru izvođenja, polipeptidna ili aminokiselinska sekvenca koja potiče od određenog polaznog polipeptida je CDR sekvenca ili sekvenca koja je povezana sa njom. U jednom primeru izvođenja, aminokiselinska sekvenca koja potiče od određenog polaznog polipeptida nije neprekidna. Na primer, u jednom primeru izvođenja, jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest CDR potiču od polaznog antitela. U jednom primeru izvođenja, polipeptidna ili aminokiselinska sekvenca koja potiče od određenog polaznog polipeptida ili aminokiselinske sekvence ima aminokiselinsku sekvencu koja je suštinski identična onoj kod polazne sekvence, ili njenom delu, gde se deo sastoji od najmanje 3-5 aminokiselina, najmanje 5-10 aminokiselina, najmanje 10-20 aminokiselina, najmanje 20-30 aminokiselina, ili najmanje 30-50 aminokiselina, ili koju na drugi način stručnjak u ovoj oblasti može da identifikuje kao onu koja potiče od početne sekvence. U jednom primeru izvođenja, jedna ili više CDR sekvenci koje potiču od polaznog antitela su izmenjene da bi proizvele varijante CDR sekvenci, npr. afinitetne varijante, pri čemu varijantne CDR sekvenci zadržavaju aktivnost vezivanja ciljnog antigena.

[0064] "Potiče od kamelida" - U određenim poželjnim primerima izvođenja, antitela prema pronalasku sadrže aminokiselinske sekvence regiona okvira i/ili aminokiselinske sekvence CDR regiona koje potiču od konvencionalnih antitela kamelida dobijenih aktivnom imunizacijom kamelida. Međutim, antitela prema pronalasku koja sadrže aminokiselinske sekvence poreklom od kamelida mogu da budu konstruisana tako da obuhvataju sekvence regiona okvira i/ili konstantnog regiona poreklom od humane aminokiselinske sekvence (tj. humanog antitela) ili drugih vrsta sisara koji nisu kamelide. Na primer, region okvira, deo teškog lanca i/ili deo regiona zgloba humanog antitela ili antitela ne-humanog primata mogu da budu uključeni u predmetna anti-IL-22R antitela. U jednom primeru izvođenja, jedna ili više aminokiselina koje ne potiču od kamelida mogu da budu prisutne u regionu okvira antitela koje "potiče od kamelida", npr. aminokiselinska sekvenca regiona okvira antitela kamelida može da sadrži jednu ili više aminokiselinskih mutacija u kojima je prisutan odgovarajući aminokiselinski ostatak poreklom od čoveka ili ne-humanog primata. Osim toga, VH i VL domeni koji potiču od kamelida, ili njihove humanizovane varijante, mogu da budu povezani sa konstantnim domenima humanih antitela kako bi se dobio himerni molekul, kao što je opisano na drugom mestu u ovom dokumentu.

[0065] "Konzervativna aminokiselinska supstitucija" - "Konzervativna aminokiselinska supstitucija" je ona u kojoj je aminokiselinski ostatak zamenjen aminokiselinskim ostatkom koji ima sličan bočni lanac. Porodice aminokiselinskih ostataka koji imaju slične bočne lance su definisane u tehnici, uključujući bazne bočne lance (npr. lizin, arginin, histidin), kisele bočne lance (npr. asparaginsku kiselinu, glutaminsku kiselinu), nenaelektrisane polarne bočne lance (npr. glicin, asparagin, glutamin, serin, treonin, tirozin, cistein), nepolarne bočne lance (npr. alanin, valin, leucin, izoleucin, prolin, fenilalanin, metionin, triptofan), beta-razgranate bočne lance (npr., treonin, valin, izoleucin) i aromatične bočne lance (npr. tirozin, fenilalanin, triptofan, histidin). Dakle, neesencijalni aminokiselinski ostatak u polipeptidu imunoglobulina može da bude zamenjen drugim aminokiselinskim ostatkom iz iste porodice bočnih lanaca. U drugom primeru izvođenja, niz aminokiselina može da bude zamenjen strukturno sličnim nizom koji se razlikuje po redosledu i/ili sastavu članova porodice bočnih lanaca.

[0066] "Deo teškog lanca" - Kako se ovde koristi, izraz "deo teškog lanca" uključuje aminokiselinske sekvence poreklom iz konstantnih domena teškog lanca imunoglobulina. Polipeptid koji sadrži deo teškog lanca sadrži najmanje jedno od: CH1 domena, domena zgloba (npr. gornjeg, srednjeg i/ili donjeg regiona zgloba), CH2 domena, CH3 domena, ili njihove varijante ili fragmenta. U jednom primeru izvođenja, antitelo ili antigen-vezujući fragment prema pronalasku može da sadrži Fc deo teškog lanca imunoglobulina (npr. region zgloba, CH2 domen i CH3 domen). U drugom primeru izvođenja, antitelu ili antigen-vezujućem fragmentu prema pronalasku može da nedostaje bar deo konstantnog domena (npr. ceo ili deo CH2 domena). U određenim primerima izvođenja, najmanje jedan, a poželjno svi, konstantni domeni potiču iz teškog lanca humanog imunoglobulina. Na primer, u jednom poželjnom primeru izvođenja, deo teškog lanca sadrži potpuno humani domen zgloba. U drugim poželjnim primerima izvođenja, deo teškog lanca sadrži potpuno humani deo Fc (npr. region zgloba, sekvence CH2 i CH3 domena iz humanog imunoglobulina).

[0067] U određenim primerima izvođenja, sastavni konstantni domeni dela teškog lanca potiču iz različitih molekula imunoglobulina. Na primer, deo teškog lanca polipeptida može da sadrži CH2 domen poreklom iz molekula IgG1 i region zgloba poreklom iz molekula IgG3 ili IgG4. U drugim primerima izvođenja, konstantni domeni su himerni domeni koji sadrže delove različitih molekula imunoglobulina. Na primer, region zgloba može da sadrži prvi deo iz molekula IgG1 i drugi deo iz molekula IgG3 ili IgG4. Kao što je gore navedeno, stručnjaku u ovoj oblasti će biti jasno da se konstantni domeni dela teškog lanca mogu modifikovati, tako da se razlikuju po sekvenci aminokiselina od prirodnog (divljeg tipa) molekula imunoglobulina. To jest, polipeptidi pronalaska koji su ovde otkriveni mogu da sadrže izmene ili modifikacije jednog ili više konstantnih domena teškog lanca (CH1, zglob, CH2 ili CH3) i/ili domena konstantnog regiona lakog lanca (CL). Primeri modifikacija uključuju adicije, delecije ili supstitucije jedne ili više aminokiselina u jednom ili više domena.

[0068] "Himerni" - "Himerni" protein sadrži prvu aminokiselinsku sekvencu povezanu sa drugom aminokiselinskom sekvencom sa kojom nije povezana u prirodi. Aminokiselinske sekvence mogu normalno da postoje u odvojenim proteinima koji su spojeni u fuzioni polipeptid ili mogu normalno da postoje u istom proteinu, ali su smeštene u novom rasporedu u fuzionom polipeptidu. Himerni protein može da bude stvoren, na primer, hemijskom sintezom, ili stvaranjem i translacijom polinukleotida u kome su peptidni regioni kodirani u željenom odnosu. Primeri himernih antitela pronalaska obuhvataju fuzione proteine koji sadrže VH i VL domene poreklom od kamelida, ili njihove humanizovane varijante, fuzionisane sa konstantnim domenima humanog antitela, npr. humanog IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4.

[0069] "Varijabilni region" ili "varijabilni domen" - Termini "varijabilni region" i "varijabilni domen" se ovde koriste kao sinonimi i predviđeno je da imaju ekvivalentno značenje. Termin "varijabilni" se odnosi na činjenicu da se određeni delovi varijabilnih domena VH i VL u velikoj meri razlikuju po sekvenci među antitelima i da se koriste u vezivanju i specifičnosti svakog posebnog antitela za njegov ciljni antigen. Međutim, varijabilnost nije ravnomerno raspoređena kroz varijabilne domene antitela. Koncentrisana je u tri segmenta nazvana "hipervarijabilne petlje" u svakom od VL domena i VH domena koji čine deo antigen-vezujućeg mesta. Prva, druga i treća hipervarijabilna petlja domena VLambda lakog lanca su ovde označene kao L1(λ), L2(λ) i L3(λ) i mogu da se definišu time što sadrže ostatke 24-33 (L1(λ), koja se sastoji od 9, 10 ili 11 aminokiselinskih ostataka), 49-53 (L2(λ), koja se sastoji od 3 ostatka) i 90-96 (L3(λ), koja se sastoji od 5 ostataka) u VL domenu (Morea et al., Methods 20:267-279 (2000)). Prva, druga i treća hipervarijabilna petlja domena VKapa lakog lanca se ovde pominju kao L1(κ), L2(κ) i L3(κ) i mogu da se definišu time što sadrže ostatke 25-33 (L1(κ), koja se sastoje od 6, 7, 8, 11, 12 ili 13 ostataka), 49-53 (L2(κ), koja se sastoji od 3 ostatka) i 90-97 (L3(κ), koja se sastoji od 6 ostataka) u VL domenu (Morea et al., Methods 20:267-279 (2000)). Prva, druga i treća hipervarijabilna petlja VH domena se ovde pominju kao H1, H2 i H3 i mogu da se definišu time što sadrže ostatke 25-33 (H1, koja se sastoji od 7, 8 ili 9 ostataka), 52-56 (H2 , koja se sastoji od 3 ili 4 ostatka) i 91-105 (H3, veoma varijabilne dužine) u VH domenu (Morea et al., Methods 20:267-279 (2000)).

[0070] Osim ako nije drugačije naznačeno, termini L1, L2 i L3 redom se odnose na prvu, drugu i treću hipervarijabilnu petlju VL domena, i obuhvataju hipervarijabilne petlje dobijene i iz Vkapa i iz Vlambda izotipa. Termini H1, H2 i H3 redom se odnose na prvu, drugu i treću hipervarijabilnu petlju VH domena i obuhvataju hipervarijabilne petlje dobijene iz bilo kog od poznatih izotipova teškog lanca, uključujući γ, ε, δ, α ili µ.

2

[0071] Svaka od hipervarijabilnih petlji L1, L2, L3, H1, H2 i H3 može da sadrži deo "regiona koji određuje komplementarnost" ili "CDR", kao što je definisano u nastavku. Termini "hipervarijabilna petlja" i "region koji određuje komplementarnost" nisu striktno sinonimi, budući da su hipervarijabilne petlje (HV) definisane na osnovu strukture, dok su regioni koji određuju komplementarnost (CDR) definisani na osnovu varijabilnosti sekvence (Kabat et al. , Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1983) i granice HV i CDR mogu da budu različite u nekim VH i VL domenima.

[0072] CDR VL i VH domena mogu tipično da se definišu kao oni koji sadrže sledeće aminokiseline: ostatke 24-34 (LCDR1), 50-56 (LCDR2) i 89-97 (LCDR3) u varijabilnom domenu lakog lanca, i ostatke 31-35 ili 31-35b (HCDR1), 50-65 (HCDR2) i 95-102 (HCDR3) u varijabilnom domenu teškog lanca; (Kabat et al., Sequences of Proteins of Imunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Dakle, HV mogu da budu sadržane u okviru odgovarajućih CDR i pozivanje na "hipervarijabilne petlje" VH i VL domena u ovom dokumentu treba da se tumači kao da obuhvata i odgovarajuće CDR regione, i obrnuto, osim ako nije drugačije naznačeno.

[0073] Konzervisaniji delovi varijabilnih domena nazivaju se region okvira (FR), kao što je definisano u nastavku. Svaki varijabilni domen nativnih teških i lakih lanaca sadrži četiri FR (FR1, FR2, FR3 i FR4, redom), koji uglavnom zauzimaju konfiguraciju β-naborane ploče, povezana sa tri hipervarijabilne petlje. Hipervarijabilne petlje u svakom lancu se drže zajedno u neposrednoj blizini pomoću FR i, sa hipervarijabilnim petljama iz drugog lanca, doprinose formiranju antigenvezujućih mesta antitela. Strukturna analiza antitela je otkrila vezu između sekvence i oblika vezujućeg mesta formiranog regionima koji određuju komplementarnost (Chothia et al., J. Mol. Biol. 227: 799-817 (1992)); Tramontano et al., J. Mol. Biol, 215:175-182 (1990)). Uprkos njihovoj visokoj varijabilnosti sekvenci, pet od šest petlji zauzimaju samo mali repertoar konformacija glavnog lanca, nazvanih "kanonske strukture". Ove konformacije su pre svega određene dužinom petlji, a zatim prisustvom ključnih ostataka na određenim pozicijama u petljama i u regionima okvira koji određuju konformaciju kroz njihovo pakovanje, stvaranje vodoničnih veza ili sposobnost da se zauzmu neuobičajene konformacije glavnog lanca.

[0074] "CDR" - Kako se ovde koristi, termin "CDR" ili "region koji određuje komplementarnost" označava nekontinuirana mesta kombinovanja antigena koja se nalaze unutar varijabilnog regiona teškog, kao i lakog lanca polipeptida. Ove posebne regione opisali su Kabat et al., J. Biol. Chem.

252, 6609-6616 (1977) i Kabat et al., Sequences of protein of immunological interest. (1991), i Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987) i MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996) gde definicije uključuju preklapanje ili podskupove aminokiselinskih ostataka kada se međusobno upoređuju. Aminokiselinski ostaci koji obuhvataju CDR kao što je definisano svakom od gore citiranih referenci su navedeni za poređenje. Poželjno, termin "CDR" je CDR kako je definisao Kabat na osnovu poređenja sekvenci.

Tabela 1: Definicije CDR

[0075] "Region okvira" – Termin "region okvira" ili "FR region", kako se ovde koristi, uključuje aminokiselinske ostatke koji su deo varijabilnog regiona, ali nisu deo CDR (npr. korišćenjem Kabatove definicije CDR). Prema tome, region okvira varijabilnog regiona je dužine između oko 100-120 aminokiselina, ali uključuje samo one aminokiseline izvan CDR. Za specifičan primer varijabilnog domena teškog lanca i za CDR kako su definisali Kabat et al., region okvira 1 odgovara domenu varijabilnog regiona koji obuhvata aminokiseline 1-30; region okvira 2 odgovara domenu varijabilnog regiona koji obuhvata aminokiseline 36-49; region okvira 3 odgovara domenu varijabilnog regiona koji obuhvata aminokiseline 66-94, a region okvira 4 odgovara domenu varijabilnog regiona od aminokiselina 103 do kraja varijabilnog regiona. Regioni okvira za laki lanac su na sličan način odvojeni svakim od CDR varijabilnog regiona lakog lanca. Slično, koristeći definiciju CDR koju su dali Chothia et al. ili McCallum et al., granice regiona okvira su odvojene odgovarajućim krajevima CDR, kao što je gore opisano. U poželjnim primerima izvođenja CDR su kao što je definisao Kabat.

[0076] U prirodnim antitelima, šest CDR prisutnih na svakom monomernom antitelu su kratke, nekontinuirane sekvence aminokiselina koje su specifično pozicionirane tako da formiraju antigen-vezujuće mesto dok antitelo poprima svoju trodimenzionalnu konfiguraciju u vodenom okruženju. Ostatak varijabilnih domena teškog i lakog lanca pokazuje manju međumolekularnu varijabilnost u sekvenci aminokiselina i nazivaju se regioni okvira. Regioni okvira u velikoj meri

2

zauzimaju konformaciju β-naborane ploče, a CDR regioni formiraju petlje koje povezuju, a u nekim slučajevima čine deo strukture β-naborane ploče. Dakle, ovi regioni okvira deluju tako da formiraju skelu koja obezbeđuje pozicioniranje šest CDR u ispravnoj orijentaciji putem međulančanih, nekovalentnih interakcija. Antigen-vezujuće mesto formirano od pozicioniranih CDR definiše površinu komplementarnu epitopu na imunoreaktivnom antigenu. Ova komplementarna površina podstiče nekovalentno vezivanje antitela za epitop imunoreaktivnog antigena. Stručnjak u datoj oblasti može lako da se identifikuje položaj CDR regiona.

[0077] "Region zgloba" – Kako se ovde koristi, izraz "region zgloba" uključuje deo molekula teškog lanca koji spaja CH1 domen sa CH2 domenom. Ovaj region zgloba sadrži približno 25 ostataka i fleksibilan je, što omogućava da se dva N-terminalna antigen-vezujuća regiona kreću nezavisno. Regioni zgloba mogu da se podele na tri različita domena: gornji, srednji i donji domen zgloba (Roux K.H. et al. J. Immunol. 161:4083-90 1998). Antitela pronalaska koja sadrže "potpuno humani" region zgloba mogu da sadrže jednu od sekvenci regiona zgloba prikazanih u tabeli 2 ispod.

Tabela 2: Sekvence humanog regiona zgloba

[0078] "CH2 domen" - Kako se ovde koristi termin "CH2 domen" uključuje deo molekula teškog lanca koji se pruža, npr. od oko ostatka 244 do ostatka 360 antitela pri upotrebi konvencionalne šeme numerisanja (ostaci 244 do 360, Kabatov sistem numerisanja i rezidue 231-340, sistem numerisanja EU, Kabat EA et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest. Bethesda, US Department of Health and Human Services, NIH, 1991). CH2 domen je jedinstven po tome što nije blisko uparen sa drugim domenom. Umesto toga, dva N-vezana granata lanca ugljenih hidrata su umetnuta između dva CH2 domena intaktnog prirodnog molekula IgG. Takođe je dobro

2

dokumentovano da se CH3 domen pruža od CH2 domena do C-kraja molekula IgG i da sadrži približno 108 ostataka.

[0079] "Fragment" - Termin "fragment", kako se koristi u kontekstu antitela prema pronalasku, odnosi se na deo ili segment antitela ili lanca antitela koji sadrži manje aminokiselinskih ostataka od intaktnog ili kompletnog antitela ili lanca antitela. Termin "antigen-vezujući fragment" odnosi se na polipeptidni fragment imunoglobulina ili antitela koji vezuje antigen ili kompetira sa intaktnim antitelom (tj. sa intaktnim antitelom iz koga potiče) za vezivanje antigena (tj. specifično vezivanje za IL-22R). Kako se ovde koristi, termin "fragment" molekula antitela uključuje antigenvezujuće fragmente antitela, na primer, varijabilni domen lakog lanca antitela (VL), varijabilni domen teškog lanca antitela (VH), jednolančano antitelo (scFv ), F(ab')2 fragment, Fab fragment, Fd fragment, Fv fragment i fragment jednodomenskog antitela (DAb). Fragmenti mogu da se dobiju, na primer, hemijskom ili enzimskom obradom intaktnog ili kompletnog antitela ili lanca antitela ili rekombinantnim putem.

[0080] "Valenca" - Kako se ovde koristi izraz "valenca" se odnosi na broj potencijalnih mesta vezivanja ciljnog molekula u polipeptidu. Svako mesto vezivanja ciljnog molekula specifično vezuje jedan ciljni molekul ili specifično mesto na ciljnom molekulu. Kada polipeptid sadrži više od jednog mesta vezivanja ciljnog molekula, svako mesto vezivanja ciljnog molekula može specifično da veže iste ili različite molekule (npr. može da se vezuje za različite ligande ili različite antigene, ili različite epitope na istom antigenu).

[0081] "Specifičnost" - Termin "specifičnost" se odnosi na sposobnost vezivanja sa (npr. na imunoreakciju sa) datim ciljnim molekulom, npr., IL-22R. Polipeptid može da bude monospecifičan i da sadrži jedno ili više vezujućih mesta koja specifično vezuju ciljni molekul, ili polipeptid može da bude multispecifičan i da sadrži dva ili više vezujućih mesta koja specifično vezuju iste ili različite ciljne molekule.

[0082] "Sintetički" - Kako se ovde koristi, izraz "sintetički" u vezi sa polipeptidima uključuje polipeptide koji sadrže aminokiselinsku sekvencu koja se ne pojavljuje u prirodi. Na primer, polipeptidi koji se ne pojavljuju u prirodi koji su modifikovani oblici polipeptida koji se javljaju u prirodi (npr. koji sadrže mutaciju kao što je adicija, supstitucija ili delecija) ili koji sadrže prvu aminokiselinsku sekvencu (koja može, ali ne mora da bude prirodna) koja je vezana u linearnoj sekvenci aminokiselina sa drugom aminokiselinskom sekvencom (koja može, ali ne mora da bude prirodna) za koju nije vezana u prirodi.

[0083] "Konstruisan" – Kako se ovde koristi izraz "konstruisan" uključuje manipulaciju molekulima nukleinske kiseline ili polipeptida sintetičkim sredstvima (npr. rekombinantnim tehnikama, in vitro sintezom peptida, enzimskim ili hemijskim spajanjem peptida ili nekom

2

kombinacijom ovih tehnika). Poželjno, antitela pronalaska su konstruisana, uključujući, na primer, humanizovana i/ili himerna antitela, i antitela koja su konstruisana kako bi im se poboljšalo jedno ili više svojstava, kao što je vezivanje antigena, stabilnost/poluživot ili efektorska funkcija.

[0084] "Modifikovano antitelo" – Kako se ovde koristi, izraz "modifikovano antitelo" obuhvata sintetičke oblike antitela koji su izmenjeni tako da se ne javljaju u prirodi, npr. antitela koja sadrže najmanje delove dva teška lanca, ali ne i dva potpuna teška lanca (kao što su antitela sa deletiranim domenom ili minitela); multispecifične oblike antitela (npr., bispecifična, trispecifična, itd.) izmenjene tako da se vežu za dva ili više različitih antigena ili za različite epitope na jednom antigenu); molekule teškog lanca spojene sa molekulima scFv i slično. Molekuli scFv su poznati u tehnici i opisani su, npr., u US patentu 5,892,019. Pored toga, termin "modifikovano antitelo" uključuje multivalentne oblike antitela (npr. trovalentna, tetravalentna, itd., antitela koja se vezuju za tri ili više kopija istog antigena). U drugom primeru izvođenja, modifikovano antitelo pronalaska je fuzioni protein koji sadrži bar deo jednog teškog lanca kome nedostaje CH2 domen i koji sadrži vezujući domen polipeptida koji sadrži vezujući deo jednog člana para receptor-ligand.

[0085] Termin "modifikovano antitelo" takođe može ovde da se koristi da označi varijante aminokiselinske sekvence antitela pronalaska, kako je ovde strukturno definisano. Stručnjak u ovoj oblasti će razumeti da antitelo može da se modifikuje tako da se dobije varijanta antitela koja se razlikuje po sekvenci aminokiselina od antitela od koga potiče. Na primer, mogu da se izvrše supstitucije nukleotida ili aminokiselina koje dovode do konzervativnih supstitucija ili promena na "neesencijalnim" aminokiselinskim ostacima (npr. u CDR i/ili ostacima regiona okvira). Aminokiselinske supstitucije mogu da uključuju zamenu jedne ili više aminokiselina prirodnom ili neprirodnom aminokiselinom.

[0086] "Humanizujuće supstitucije" – Kako se ovde koristi, izraz "humanizujuće supstitucije" odnosi se na supstitucije aminokiselina u kojima je aminokiselinski ostatak prisutan na određenoj poziciji u VH ili VL domenu antitela (na primer, anti-IL-22R antitelo poreklom od kamelida) zamenjen aminokiselinskim ostatkom koji se javlja na ekvivalentnoj poziciji u referentnom humanom VH ili VL domenu. Referentni humani VH ili VL domen može da bude VH ili VL domen kodiran humanom klicinom linijom. Humanizujuće supstitucije mogu da se izvrše u regionima okvira i/ili u CDR regionima antitela, ovde definisanim.

[0087] "Humanizovane varijante" - Kako se ovde koristi izraz "humanizovana varijanta" odnosi se na varijantu antitela koja sadrži jednu ili više "humanizujućih supstitucija" u poređenju sa referentnim antitelom, pri čemu deo referentnog antitela (npr. VH domen i/ili VL domen ili njihovi delovi koji sadrže najmanje jedan CDR) ima aminokiselinu poreklom iz vrste koja nije ljudska, i

2

"humanizujuće supstitucije" se javljaju unutar aminokiselinske sekvence poreklom iz vrste koja nije ljudska.

[0088] "Varijante modifikovane prema sekvenci klicine linije" – Termin "varijanta modifikovana prema sekvenci klicine linije" se ovde koristi da posebno označi "humanizovane varijante" u kojima "humanizujuće supstitucije" rezultuju zamenom jednog ili više aminokiselinskih ostataka prisutnih na određenoj poziciji/pozicijama u VH ili VL domenu antitela (na primer, anti-IL-22R antitelo poreklom iz kamelida) aminokiselinskim ostatkom koji se javlja na ekvivalentnoj poziciji u referentnom humanom VH ili VL domenu kodiranom humanom klicinom linijom. Tipično je, da se za bilo koju datu "varijantu modifikovanu prema sekvenci klicine linije" zamenski aminokiselinski ostaci supstituisani u varijantu modifikovanu prema sekvenci klicine linije uzimaju isključivo, ili pretežno, iz jednog domena VH ili VL kodiranog humanom klicinom linijom. Termini "humanizovana varijanta" i "varijanta modifikovana prema sekvenci klicine linije" se ovde često koriste kao sinonimi. Uvođenje jedne ili više "humanizujućih supstitucija" u VH ili VL domen poreklom iz kamelida (npr. iz lame) rezultuje proizvodnjom "humanizovane varijante" VH ili VL domena dobijenog iz kamelida (lame). Ako aminokiselinski ostaci uvedeni putem supstitucije potiču pretežno ili isključivo iz sekvence jednog domena VH ili VL kodirane humanom klicinom linijom, onda rezultat može da bude "varijanta modifikovana prema sekvenci humane klicine linije" VH ili VL domena poreklom iz kamelida (lame).

[0089] "Afinitetne varijante" - Kako se ovde koristi, termin "afinitetna varijanta" se odnosi na varijantu antitela koja pokazuje jednu ili više izmena u sekvenci aminokiselina u poređenju sa referentnim antitelom, pri čemu afinitetna varijanta pokazuje izmenjeni afinitet za ciljni antigen u poređenju sa referentnim antitelom. Na primer, afinitetne varijante će pokazati promenjeni afinitet za IL-22R, u poređenju sa referentnim anti-IL-22R antitelom. Poželjno, afinitetna varijanta će pokazati poboljšani afinitet za ciljni antigen, npr. IL-22R, u poređenju sa referentnim antitelom. Afinitetne varijante tipično pokazuju jednu ili više izmena u sekvenci aminokiselina u CDR regionima, u poređenju sa referentnim antitelom. Takve supstitucije mogu dovesti do zamene originalne aminokiseline prisutne na datoj poziciji u CDR drugim aminokiselinskim ostatkom, koji može da bude aminokiselinski ostatak koji se pojavljuje u prirodi ili aminokiselinski ostatak koji se ne pojavljuje u prirodi. Supstitucije aminokiselina mogu da budu konzervativne ili nekonzervativne.

[0090] "Visoka homologija sa humanim antitelom" – Antitelo koje sadrži varijabilni domen teškog lanca (VH) i varijabilni domen lakog lanca (VL) smatraće se da ima visoku homologiju sa humanim antitelom ako VH domeni i VL domeni, uzeti zajedno, pokazuju najmanje 90% identičnosti aminokiselinske sekvence sa najpodudarnijim VH i VL sekvencama humane klicine

2

linije. Antitela koja imaju visoku homologiju sa humanim antitelom mogu da uključuju antitela koja sadrže VH i VL domene nativnih ne-humanih antitela, koja pokazuju dovoljno visok procenat identičnosti sekvence sa sekvencama humane klicine linije, uključujući na primer antitela koja sadrže VH i VL domene konvencionalnih antitela kamelida, kao i konstruisane, posebno humanizovane ili varijante takvih antitela modifikovane prema sekvenci klicine linije, kao i "potpuno humana" antitela.

[0091] U jednom primeru izvođenja, VH domen antitela sa visokom homologijom sa humanim antitelom može da pokaže identičnost aminokiselinske sekvence ili homologiju sekvence od 80% ili više sa jednim ili više humanih VH domena u regionima okvira FR1, FR2, FR3 i FR4. U drugim primerima izvođenja, identičnost aminokiselinske sekvence ili homologija sekvence između VH domena polipeptida pronalaska i najpodudarnije sekvence VH domena humane klicine linije može da bude 85% ili više, 90% ili više, 95% ili više, 97% ili više, ili do 99% ili čak 100%.

[0092] U jednom primeru izvođenja, VH domen antitela sa visokom homologijom sa humanim antitelom može da sadrži jedno ili više (npr. 1 do 10) nepodudaranja sekvenci aminokiselina u regionima okvira FR1, FR2, FR3 i FR4, u poređenju sa najpodudarnijom humanom VH sekvencom.

[0093] U još jednom primeru izvođenja, VL domen antitela sa visokom homologijom sa humanim antitelom može da pokaže identičnost sekvence ili homologiju sekvence od 80% ili više sa jednim ili više humanih VL domena u regionima okvira FR1, FR2, FR3 i FR4. U drugim primerima izvođenja, identičnost aminokiselinske sekvence ili homologija sekvence između VL domena polipeptida pronalaska i najpodudarnije sekvence VL domena humane klicine linije može da bude 85% ili više, 90% ili više, 95% ili više, 97% ili više, ili do 99% ili čak 100%.

[0094] U jednom primeru izvođenja, VL domen antitela sa visokom homologijom sa humanim antitelom može da sadrži jedno ili više (npr.1 do 10) nepodudaranja aminokiselinske sekvence u regionima okvira FR1, FR2, FR3 i FR4, u poređenju sa najpodudarnijom humanom VL sekvencom.

[0095] Pre analize procentualne identičnosti sekvence između antitela sa visokom homologijom sa humanim antitelom i VH i VL domena humane klicine linije, mogu da se odrede kanonske savijene forme, što omogućava identifikaciju porodice segmenata humane klicine linije sa identičnom kombinacijom kanonskih savijenih formi za H1 i H2 ili L1 i L2 (i L3). Nakon toga, član porodice humane klicine linije koji ima najveći stepen homologije sekvence sa varijabilnim regionom antitela od interesa se bira za ocenjivanje homologije sekvence. Određivanje kanonskih klasa hipervarijabilnih petlji L1, L2, L3, H1 i H2 prema klasifikaciji Chothia može da se izvrši pomoću bioinformatičkih alata koji su javno dostupni na internet stranici www.bioinf.org.uk/abs/chothia.html.page. Rezultat programa pokazuje ključne zahteve za ostatke u datoteci sa podacima. U ovim datotekama sa podacima, prikazane su ključne pozicije ostataka sa dozvoljenim aminokiselinama na svakoj poziciji. Sekvenca varijabilnog regiona antitela od interesa je predstavljena u vidu ulaznih podataka, i prvo je poravnata sa konsenzusnom sekvencom antitela da bi joj se dodelila šema numerisanja po sistemu Kabata. Pri analizi kanonskih savijenih formi koristi se skup matrica ključnih ostataka dobijenih automatizovanim postupkom koju su razvili Martin i Thornton (Martin et al., J. Mol. Biol.263:800-815 (1996)).

[0096] Kada je poznat konkretni V segment humane klicine linije, koji koristi istu kombinaciju kanonskih savijenih formi za H1 i H2 ili L1 i L2 (i L3), može se odrediti najpodudarniji član porodice u smislu homologije sekvence. Pomoću bioinformatičkih alata može da se odredi procentualna identičnost sekvenci između aminokiselinskih sekvenci regiona okvira VH i VL domena antitela od interesa i odgovarajućih sekvenci kodiranih humanom klicinom linijom, ali može da se primeni i ručno poravnavanje sekvenci. Sekvence humanog imunoglobulina mogu da se identifikuju iz nekoliko baza podataka o proteinima, kao što je VBase (http://vbase.mrccpe.cam.ac.uk/) ili baza podataka Pluckthun/Honegger (http://www.bioc.unizh.ch/ antibody/Sequences/Germlines). Da bi se uporedile humane sekvence sa V regionima VH ili VL domena u antitelu od interesa, može da se koristi algoritam za poravnanje sekvenci kakav je dostupan preko veb-sajtova kao što je www.expasy.ch/tools/#align, ali može da se sprovede i ručno poravnanje sa ograničenim skupom sekvenci. Sekvence lakih i teških lanaca humane klicine linije porodica sa istim kombinacijama kanonskih savijenih formi i sa najvišim stepenom homologije sa regionima okvira 1, 2 i 3 svakog lanca se biraju i porede sa varijabilnim regionom od interesa; takođe se FR4 proverava u odnosu na JH i JK ili JL regione humane klicine linije.

[0097] Treba napomenuti da se pri izračunavanju ukupnog procenta homologije sekvence, ostaci FR1, FR2 i FR3 procenjuju korišćenjem najpodudarnije sekvence iz porodice humane klicine linije sa identičnom kombinacijom kanonskih savijenih formi. Ocenjuju se samo ostaci različiti od najpodudarnijih ili drugih članova iste porodice sa istom kombinacijom kanonskih savijenih formi (napomena - isključujući razlike kodirane prajmerom). Međutim, za potrebe humanizacije, ostaci u regionima okvira identičnim članovima drugih familija humane klicine linije, koji nemaju istu kombinaciju kanonskih savijenih formi, mogu se smatrati "humanim", uprkos činjenici da su oni ocenjeni kao "negativni" prema gore opisanim strogim uslovima. Ova pretpostavka je zasnovana na pristupu humanizacije "pomešaj i spoji", u kome se svaki od FR1, FR2, FR3 i FR4 posebno upoređuje sa svojom najpodudarnijom sekvencom humane klicine linije i humanizovani molekul stoga sadrži kombinaciju različitih FR kao što su učinili Qu i kolege (Qu et la., Clin. Cancer Res.

5:3095-3100 (1999)) i Ono i kolege (Ono et al., Mol. Immunol. 36:387-395 (1999)). Granice

1

pojedinačnih regiona okvira mogu da budu dodeljene primenom šeme numeracije IMGT, koja je adaptacija šeme numeracije Chothia (Lefranc et al., NAR 27: 209-212 (1999); imgt.cines.fr).

[0098] Antitela sa visokom homologijom sa humanim antitelom mogu da sadrže hipervarijabilne petlje ili CDR regione koji imaju humane ili kanonske savijene forme slične humanim, kao što je detaljno diskutovano u nastavku.

[0099] U jednom primeru izvođenja, najmanje jedna hipervarijabilna petlja ili CDR u VH domenu ili VL domenu antitela sa visokom homologijom sa humanim antitelom može da se dobije ili izvede iz VH ili VL domena ne-humanog antitela, na primer konvencionalnog antitela koje potiče od vrste familije Camelidae, a da pritom ipak pokazuju predviđenu ili stvarnu kanonsku strukturu savijene forme koja je suštinski identična kanonskoj strukturi savijene forme koja se javlja u humanim antitelima.

[0100] U struci je dobro poznato da iako su primarne aminokiselinske sekvence hipervarijabilnih petlji prisutnih u VH domenima i VL domenima kodirane humanom klicinom linijom, po definiciji, veoma varijabilne, sve hipervarijabilne petlje, osim CDR H3 u VH domenu, zauzimaju samo nekoliko različitih strukturnih konformacija, nazvanih kanonske savijene forme (Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); Tramontano et al. Proteins 6:382-94 (1989)), koje zavise i od dužine hipervarijabilne petlje i od prisustva takozvanih kanonskih aminokiselinskih ostataka (Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). Stvarne kanonske strukture hipervarijabilnih petlji u intaktnim VH ili VL domenima mogu da se odrede strukturnom analizom (npr. rendgenska kristalografija), ali je takođe moguće predvideti kanonsku strukturu na osnovu ključnih aminokiselinskih ostataka koji su karakteristični za određenu strukturu (o kojoj se dalje govori u nastavku). U suštini, specifičan obrazac ostataka koji određuje svaku kanonsku strukturu formira "potpis" koji omogućava da se kanonska struktura prepozna u hipervarijabilnim petljama VH ili VL domena nepoznate strukture; kanonske strukture stoga mogu da se predvide samo na osnovu primarne aminokiselinske sekvence.

[0101] Predviđene kanonske strukture savijene forme za hipervarijabilne petlje bilo koje date VH ili VL sekvence u antitelu sa visokom homologijom sa humanim antitelom mogu da se analiziraju korišćenjem algoritama koji su javno dostupni na www.bioinf.org.uk/abs/chothia.html, www.biochem.ucl.ac.uk/martin/antibodies.html i www.bioc.unizh.ch/antibody/Sequences/ Germlines/Vbase_hVk.html. Ovi alati dozvoljavaju da se VH ili VL sekvence upita poravnaju sa sekvencama humanog VH ili VL domena poznate kanonske strukture, kao i da se napravi predviđanje kanonske strukture za hipervarijabilne petlje sekvence upita.

[0102] U slučaju VH domena, petlje H1 i H2 mogu da se ocene kao one koje imaju kanonsku strukturu savijene forme "suštinski identičnu" kanonskoj strukturi savijene forme za koju je

2

poznato da se javlja u humanim antitelima ako je ispunjen bar prvi, a poželjno oba, od sledećih kriterijuma:

1. Identična dužina, određena brojem ostataka, sa najpodudarnijom humanom kanonskom strukturnom klasom.

2. Najmanje 33% identičnosti, poželjno najmanje 50% identičnosti sa ključnim aminokiselinskim ostacima opisanim za odgovarajuće humane H1 i H2 kanonske strukturne klase.

(treba napomenuti da se, za potrebe prethodne analize, H1 i H2 petlje tretiraju odvojeno i svaka upoređuje sa najpodudarnijom humanom kanonskom strukturnom klasom)

[0103] Prethodna analiza se oslanja na predviđanje kanonske strukture H1 i H2 petlji antitela od interesa. Ako su stvarne strukture H1 i H2 petlji u antitelu od interesa poznate, na primer na osnovu rendgenske kristalografije, onda se H1 i H2 petlje u antitelu od interesa takođe mogu oceniti kao da imaju kanonsku strukturu savijene forme "suštinski identičnu" kanonskoj strukturi savijene forme za koju se zna da se javlja u humanim antitelima, ako se dužina petlje razlikuje od dužine najpodudarnije humane kanonske strukturne klase (obično za ±1 ili ±2 aminokiseline), ali stvarna struktura H1 i H2 petlje u antitelu od interesa odgovara humanoj kanonskoj savijenoj formi.

[0104] Ključne aminokiselinske ostatke koji se nalaze u humanim kanonskim strukturnim klasama za prvu i drugu hipervarijabilnu petlju humanih VH domena (H1 i H2) opisali su Chothia et al., J. Mol. Biol. 227:799-817 (1992). Konkretno, tabela 3 na strani 802 dela Chothia et al., navodi poželjne aminokiselinske ostatke na ključnim mestima za H1 kanonske strukture koje se nalaze u humanoj klicinoj liniji, dok tabela 4 na strani 803 navodi poželjne aminokiselinske ostatke na ključnim mestima za CDR H2 kanonske strukture koje se nalaze u humanoj klicinoj liniji.

[0105] U jednom primeru izvođenja, i H1 i H2 u VH domenu antitela sa visokom homologijom sa humanim antitelom pokazuju predviđenu ili stvarnu kanonsku strukturu savijene forme koja je suštinski identična kanonskoj strukturi savijene forme koja se javlja u humanim antitelima.

[0106] Antitela sa visokom homologijom sa humanim antitelom mogu da sadrže VH domen u kome hipervarijabilne petlje H1 i H2 formiraju kombinaciju kanonskih struktura savijene forme koja je identična kombinaciji kanonskih struktura za koje je poznato da se javljaju u najmanje jednom VH domenu humane klicine linije. Primećeno je da se samo određene kombinacije kanonskih struktura savijene forme na H1 i H2 zapravo javljaju u VH domenima koje kodira humana klicina linija. U jednom primeru izvođenja, H1 i H2 u VH domenu antitela sa visokom homologijom sa humanim antitelom mogu da se dobiju iz VH domena ne-humane vrste, npr. vrste familije Camelidae, pri čemu ipak formiraju kombinaciju predviđenih ili stvarnih kanonskih struktura savijene forme koja je identična kombinaciji kanonskih struktura savijene forme za koje je poznato da se javljaju u humanoj klicinoj liniji ili somatski mutiranom VH domenu. U neograničavajućim primerima izvođenja H1 i H2 u VH domenu antitela sa visokom homologijom sa humanim antitelom mogu da se dobiju iz VH domena ne-humane vrste, npr. vrste familije Camelidae, i čine jednu od sledećih kombinacija kanonskih savijenih formi: 1-1, 1-2, 1-3, 1-6, 1-4, 2-1, 3-1 i 3-5.

[0107] Antitelo sa visokom homologijom sa humanim antitelom može da sadrži VH domen koji pokazuje i visoku identičnost sekvence/homologiju sekvence sa humanim VH, i koji sadrži hipervarijabilne petlje koje pokazuju strukturnu homologiju sa humanim VH.

[0108] Može da bude korisno da kanonske savijene forme prisutne na H1 i H2 u VH domenu antitela sa visokom homologijom sa humanim antitelom, i njihova kombinacija, budu "ispravne" za sekvencu VH humane klicine linije koja je najpodudarnija sa VH domenom antitela sa visokom homologijom sa humanim antitelom u pogledu ukupne identičnosti primarne aminokiselinske sekvence. Na primer, ako je sekvenca najpodudarnija sa VH3 domenom humane klicine linije, onda može da bude korisno da H1 i H2 formiraju kombinaciju kanonskih savijenih formi koja se takođe prirodno javlja u domenu VH3 čoveka. Ovo može da bude posebno važno u slučaju antitela sa visokom homologijom sa humanim antitelom koja potiču od ne-humanih vrsta, npr. antitela koja sadrže VH i VL domene koja potiču od konvencionalnih antitela kamelida, posebno antitela koja sadrže humanizovane VH i VL domene kamelida.

[0109] Prema tome, u jednom primeru izvođenja, VH domen anti-IL-22R antitela sa visokom homologijom sa humanim antitelom može da ima identičnost sekvence ili homologiju sekvence od 80% ili više, 85% ili više, 90% ili više, 95% ili više, 97% ili više, ili do 99% ili čak 100% sa humanim VH domenom u regionima okvira FR1, FR2, FR3 i FR4, a pored toga, H1 i H2 u istom antitelu su dobijeni iz ne-humanog VH domena (npr. potiču iz vrste familije Camelidae), ali formiraju kombinaciju predviđenih ili stvarnih kanonskih struktura savijene forme koja je ista kao kombinacija kanonskih savijenih formi za koju se zna da se prirodno javlja u istom domenu VH kod ljudi.

[0110] U drugim primerima izvođenja, svaki od L1 i L2 u VL domenu antitela sa visokom homologijom sa humanim antitelom je dobijen iz VL domena ne-humane vrste (npr. VL domena poreklom iz kamelida), i svaki ispoljava predviđenu ili stvarnu kanonsku strukturu savijene forme koja je suštinski identična kanonskoj strukturi savijene forme koja se javlja u humanim antitelima.

[0111] Kao i kod VH domena, hipervarijabilne petlje VL domena oba tipa, i VLambda i VKapa, mogu da zauzmu ograničen broj konformacija ili kanonskih struktura, delimično određenih dužinom, a takođe i prisustvom ključnih aminokiselinskih ostataka na određenim kanonskim pozicijama.

4

[0112] Unutar antitela od interesa koje ima visoku homologiju sa humanim antitelom, petlje L1, L2 i L3 dobijene iz VL domena ne-humane vrste, npr. vrste familije Camelidae, mogu da se ocene kao one koje imaju kanonsku strukturu savijene forme "suštinski identičnu" kanonskoj strukturi savijene forme za koju se zna da se javlja u humanim antitelima, ako su ispunjeni bar prvi, a poželjno oba, od sledećih kriterijuma:

2. Najmanje 33% identičnosti, poželjno najmanje 50% identičnosti sa ključnim aminokiselinskim ostacima opisanim za odgovarajuće humane L1 i L2 kanonske strukturne klase, iz VLambda ili VKapa repertoara.

(treba napomenuti da se, za potrebe prethodne analize, L1 i L2 petlje tretiraju odvojeno i svaka upoređuje sa najpodudarnijom humanom kanonskom strukturnom klasom)

[0113] Prethodna analiza se oslanja na predviđanje kanonskih struktura petlji L1, L2 i L3 u VL domenu antitela od interesa. Ako je stvarna struktura petlji L1, L2 i L3 poznata, na primer na osnovu rendgenske kristalografije, onda se petlje L1, L2 ili L3 poreklom iz antitela od interesa takođe mogu da se ocene kao one koje imaju kanonsku strukturu savijene forme "suštinski identičnu" kanonskoj strukturi savijene forme za koju se zna da se javlja u humanim antitelima, ako se dužina petlje razlikuje od one kod najpodudarnije humane kanonske strukturne klase (obično za ±1 ili ±2 aminokiseline), ali stvarna struktura petlji kamelida odgovara humanoj kanonskoj savijenoj formi.

[0114] Ključne aminokiselinske ostatke koji se nalaze u humanim kanonskim strukturnim klasama za CDR regione humanih VLambda i VKapa domena opisali su Morea et al. Methods, 20: 267-279 (2000) i Martin et al., J. Mol. Biol., 263:800-815 (1996). Strukturni repertoar humanog VKapa domena je takođe opisan u Tomlinson et al. EMBO J.14:4628-4638 (1995), a domen VLambda u Williams et al. J. Mol. Biol., 264:220-232 (1996).

[0115] L1 i L2 u VL domenu antitela sa visokom homologijom sa humanim antitelom mogu da formiraju kombinaciju predviđenih ili stvarnih kanonskih struktura savijene forme, koja je identična kombinaciji kanonskih struktura savijene forme za koju se zna da se javlja u VL domenu humane klicine linije. U neograničavajućim primerima izvođenja, L1 i L2 u VLambda domenu antitela sa visokom homologijom sa humanim antitelom (npr. antitelo koje sadrži VL domen poreklom od kamelida ili njegovu humanizovanu varijantu) mogu da formiraju jednu od sledećih kombinacija kanonskih savijenih formi: 11-7, 13-7(A, B, C), 14-7(A, B), 12-11, 14-11 i 12-12 (kako je definisano u Williams et al. J. Mol. Biol. 264:220-32 (1996) i kao što je prikazano na http://www.bioc.uzh.ch/antibody/ Sequences/Germlines/VBase_hVL.html). U neograničavajućim primerima izvođenja L1 i L2 u Vkapa domenu mogu da formiraju jednu od sledećih kombinacija kanonskih savijenih formi: 2-1, 3-1, 4-1 i 6-1 (kao što je definisano u Tomlinson et al. EMBO J.

14: 4628-38 (1995) i kao što je prikazano na http://www.bioc.uzh.ch/antibody/ Sequences/Germlines/ VBase_hVK.html).

[0116] U sledećem primeru izvođenja, sve tri od L1, L2 i L3 u VL domenu antitela sa visokom homologijom sa humanim antitelom mogu da ispolje suštinski humanu strukturu. Poželjno je da VL domen antitela sa visokom homologijom sa humanim antitelom ispoljava i visoku identičnost sekvence/homologiju sekvence sa humanim VL, kao i da hipervarijabilne petlje u VL domenu ispoljavaju strukturnu homologiju sa humanim VL.

[0117] U jednom primeru izvođenja, VL domen anti-IL-22R antitela sa visokom homologijom sa humanim antitelom može da ispolji identičnost sekvence od 80% ili više, 85% ili više, 90% ili više, 95% ili više, 97% ili više, ili do 99% ili čak 100% sa humanim VL domenom u regionima okvira FR1, FR2, FR3 i FR4, a pored toga hipervarijabilna petlja L1 i hipervarijabilna petlja L2 mogu da formiraju kombinaciju predviđenih ili stvarnih kanonskih struktura savijene forme koja je ista kao i kombinacija kanonskih savijenih formi za koju se zna da se prirodno javlja u istom VL domenu čoveka.

[0118] Naravno, predviđeno je da VH domeni koji ispoljavaju visoku identičnost sekvence/homologiju sekvence sa humanim VH, kao i strukturnu homologiju sa hipervarijabilnim petljama humanog VH, budu kombinovani sa VL domenima koji pokazuju visoku identičnost sekvence/homologiju sekvence sa humanim VL, kao i strukturnu homologiju sa hipervarijabilnim petljama humanog VL, kako bi se obezbedila antitela sa visokom homologijom sa humanim antitelom, koja sadrže parove VH/VL (npr. parovi VH/VL poreklom od kamelida) sa maksimalnom homologijom sekvence i strukture sa parovima VH/VL kodiranim humanim sekvencama.

[0119] "scFv" ili "scFv fragment" - scFv ili scFv fragment označava jednolančani varijabilni fragment. ScFv je fuzioni protein VH domena i VL domena antitela povezanih preko linkera.

B. Anti-IL-22R antitela

[0120] Ovaj pronalazak se odnosi na antitela i njihove antigen-vezujuće fragmente koji se specifično vezuju za humani IL-22R. Anti-IL-22R antitela i fragmenti antitela koji su ovde opisani poseduju svojstva, posebno kombinacije svojstava, koje su različite i u određenim slučajevima superiorne u odnosu na anti-IL-22R antitela iz prethodnog stanja tehnike. Ova svojstva i karakteristike će sada biti detaljnije opisane.

Epitopi IL-22R

[0121] Anti-IL-22R antitela i antigen-vezujući fragmenti predmetnog pronalaska vezuju se za epitop unutar humanog proteina IL-22R koji ne uključuje aminokiselinski ostatak tirozin 60 (Tyr60 ili Y60), pri čemu je ova aminokiselinska pozicija definisana pozivanjem na sekvencu IL-22R prikazanu na slici 2 (SEQ ID NO: 71). Ovaj površinski izložen ostatak IL-22R je prethodno identifikovan kao kritičan za vezivanje liganda, i kao što je ovde navedeno (videti posebno primer 8) anti-IL-22R antitelo 280.346.TSY prethodnog stanja tehnike (kao što je opisano u WO2011/061119) se vezuje za epitop uključujući ovaj ostatak. Anti-IL-22R antitela i antigenvezujući fragmenti predmetnog pronalaska iznenađujuće se vezuju za epitop koji ne uključuje ovaj ključni ostatak, a ipak u određenim primerima izvođenja, sposobni su da blokiraju vezivanje IL-22 i/ili inhibiraju IL-22- i/ili IL-20-posredovanu signalizaciju preko IL-22R.

[0122] Dodirna površina vezivanja između ekstracelularnog domena IL-22R i njegovog liganda IL-22 je okarakterisana u Jones et al. (Structure 16(9): 1333-1344 (2008)). Ekstracelularni domen IL-22R se sastoji od pet petlji (L2-L6), čiji su određeni ostaci kritični za posredovanje u interakcijama sa površinski izloženim ostacima na ligandu IL-22. Tirozin 60 se nalazi unutar petlje L2 koju formiraju ostaci u D1 domenu proteina IL-22R. U kompleksu IL-22/rastvorljivi IL-22R, ostatak Tyr60 se ubacuje u malu šupljinu na IL-22 stvorenu unutar mesta 1a liganda. Tačnije, ova šupljina se stvara na preseku spirale F i petlje AB, dve različite sekundarne strukture koje se nalaze u ligandu IL-22. Ostaci Lys162 i Glu166 spirale F na ligandu formiraju vodonične veze sa OH na Tyr60 u IL-22R i stoga je Tyr60 ključni ostatak koji posreduje u interakciji između mesta 1a na ligandu i domena D1 u receptoru.

[0123] Antitela i antigen-vezujući fragmenti koji su ovde opisani vezuju se za epitop koji ne uključuje Tyr60. Kao što je gore navedeno, Tyr60 se nalazi unutar L2 petlje u D1 domenu receptora. U određenim primerima izvođenja, epitop za koji se vezuju anti-IL-22R antitela ili njihovi antigen-vezujući fragmenti nalazi se barem delimično u D2 domenu IL-22R, tj. između ostataka 125 i 228 u SEQ ID NO: 71. U određenim primerima izvođenja, epitop za koji se vezuju anti-IL-22R antitela ili njihovi antigen-vezujući fragmenti obuhvata najmanje jedan, najmanje dva, najmanje tri aminokiselinska ostatka koja se nalaze unutar D2 domena proteina IL-22R.

[0124] Pronalazači veruju da je činjenica da se antitela i antigen-vezujući fragmenti predmetnog pronalaska vezuju za epitop koji ne uključuje Tyr60 relevantna za njihov način delovanja. Veruje se da antitela i njihovi antigen-vezujući fragmenti interaguju sa D2 domenom IL22R, umesto ili kao dodatak interakciji sa D1 domenom. Poznato je da je D2 domen IL-22R uključen u interakciju sa ko-receptorom. Bez želje za vezivanjem za određenu teoriju, pronalazači veruju da molekuli antitela predmetnog pronalaska mogu da imaju dvostruki način delovanja, sprečavajući vezivanje za ligand i sprečavajući interakciju sa ko-receptorom.

[0125] Epitop za koji se vezuju antitela ili antigen-vezujući fragmenti pronalaska može da bude linearni epitop (tj. epitop koji se sastoji od linearne aminokiselinske sekvence unutar ciljnog antigena) ili konformacioni epitop (tj. epitop koji se sastoji od aminokiselina koje nisu obavezno susedne u ciljnom antigenu).

Afinitet vezivanja

[0126] U određenim primerima izvođenja, antitela i antigen-vezujući fragmenti prema pronalasku vezuju se za humani IL-22R sa visokim afinitetom.

[0127] Kako se ovde koristi, termin "afinitet" ili "afinitet vezivanja" treba razumeti na osnovu uobičajenog značenja u struci u kontekstu vezivanja antitela, i on odražava jačinu i/ili stabilnost vezivanja između antigena i vezujućeg mesta na antitelu ili njegovom antigen-vezujućem fragmentu.

[0128] Afinitet vezivanja antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta za njemu odgovarajući antigen može da se odredi eksperimentalno korišćenjem tehnika poznatih u ovoj oblasti. Na primer, BIACORE instrumenti mere afinitet na osnovu imobilizacije ciljnog proteina ili antigena na biosenzorskom čipu, dok se antitelo ili fragment antitela propušta preko imobilizovanog ciljnog molekula pod specifičnim uslovima protoka. Ovi eksperimenti daju merenja koni koff, koja mogu da se prevedu u KDvrednosti, pri čemu je KDravnotežna konstanta disocijacije antigena i antitela ili njegovog fragmenta. Što je manja vrednost KD, to je jača interakcija vezivanja između antitela i njegovog ciljnog antigena. Kao što je gore navedeno, afinitet antitela može da se odredi upotrebom Biacore, na primer korišćenjem protokola opisanog na drugom mestu u ovom dokumenti (videti primer 6). Afinitet antitela ili antigen-vezujućeg fragmenta za humani IL-22R, izmeren pomoću Biacore, može da se odredi korišćenjem rekombinantnog konstrukta IL-22R pune dužine, kao što je opisano, na primer, u primerima 3 i 6.

[0129] Anti-IL-22R antitela ili njihovi antigen-vezujući fragmenti prema pronalasku mogu da imaju konstantu brzine disocijacije (koff) za IL-22R manju od 2 x 10<-3>s<-1>, manju od 1.5 x 10<-3>s<-1>, manju od 1.2 x 10<-3>s<-1>kada se ispituju kao mAb, na primer kada se afinitet varijabilnog domena teškog lanca uparenog sa varijabilnim domenom lakog lanca ispituje u kontekstu molekula IgG1. U poželjnim primerima izvođenja, anti-IL-22R antitela ili njihovi antigen-vezujući fragmenti prema pronalasku imaju konstantu brzine disocijacije (koff) za IL-22R manju od 2.5 x 10<-4>s<-1>, poželjno manje od 1.5 x 10<-4>s<-1>, poželjnije manje od 1 x 10<-4>s<-1>kada se testiraju kao mAb, na primer kada se afinitet varijabilnog domena teškog lanca uparenog sa varijabilnim domenom lakog lanca ispituje u kontekstu molekula IgG1.

[0130] Anti-IL-22R antitela ili njihovi antigen-vezujući fragmenti prema pronalasku mogu da imaju konstantu brzine disocijacije (koff) za IL-22R u opsegu od 1 x 10<-6>s<-1>do 2 x 10<-3>s<-1>, poželjno u opsegu od 1 x 10<-6>s<-1>do 2.5 x 10<-4>s<-1>, poželjnije u opsegu od 1 x 10<-5>s<-1>do 1 x 10<-4>s<-1>.

[0131] Anti-IL-22R antitela ili njihovi antigen-vezujući fragmenti prema pronalasku mogu da imaju KDvrednost manju od 3 x 10<-9>M, manju od 2.5 x 10<-9>M, manju od 1 x 10<-9>M. U poželjnim primerima izvođenja, anti-IL-22R antitela ili njihovi antigen-vezujući fragmenti prema pronalasku imaju KDvrednost manju od 5 x 10<-10>M, poželjno manju od 2 x 10<-10>M, poželjno manju od 1.5 x 10<-10>M.

Inhibicija vezivanja IL-22 i IL-20 i nishodna signalizacija

[0132] U određenim primerima izvođenja, antitela i antigen-vezujući fragmenti prema pronalasku vezuju se za humani IL-22R i inhibiraju vezivanje liganda za ovaj receptor. Ovo je posebno iznenađujuće imajući u vidu da se ovde opisana antitela vezuju za epitop koji ne uključuje Tyr60. Kao što je gore opisano, Tyr60 je identifikovan kao ostatak koji je ključan za vezivanje liganda i zbog toga je sposobnost anti-IL-22R antitela i antigen-vezujućih fragmenata predmetnog pronalaska da inhibiraju vezivanje liganda, i u određenim primerima izvođenja, inhibiraju signalizaciju nishodno od IL- 22R, iznenađujuća.

[0133] Antitela i antigen-vezujući fragmenti mogu da vežu humani IL-22R i inhibiraju vezivanje IL-22 ili inhibiraju vezivanje IL-20. Poželjno, ovde opisana antitela i antigen-vezujući fragmenti inhibiraju vezivanje IL-22 i IL-20 za IL-22R.

[0134] Vezivanje liganda za IL-22R na ćelijama koje eksprimiraju ko-receptor IL-10R2 ili IL-20R2 indukuje konformacionu promenu u kompleksu receptora tako da se aktiviraju signalni putevi nishodno od receptora. Antitela ili njihovi antigen-vezujući fragmenti kao što je ovde opisano mogu da inhibiraju IL-22-zavisnu aktivaciju IL-22R ili mogu da inhibiraju IL-20-zavisnu aktivaciju IL-22R. Kako se ovde koristi, termin "IL-22-zavisna aktivacija IL-22R" treba shvatiti tako da označava lanac signalnih događaja koji se javljaju nishodno od receptorskog kompleksa IL-22R nakon vezivanja liganda IL-22 za kompleks IL-22R/IL-10R2. Kako se ovde koristi, termin "IL-20-zavisna aktivacija IL-22R" treba shvatiti tako da označava lanac signalnih događaja koji se javljaju nishodno od IL-22R nakon vezivanja liganda IL-20 za kompleks IL-22R/IL -20R2.

[0135] IL-22-zavisna aktivacija IL-22R može da se meriti u ćelijama ili ćelijskim linijama koje eksprimiraju i IL-22R i ko-receptor IL-10R2, na primer u ćelijskoj liniji BW-hIL-22R opisanoj u Dumoutier et al., J Biol Chem.2009 Sep 25; 284(39): 26377-84. IL-22 indukuje zaustavljanje rasta u ćelijskoj liniji BW-hIL-22R i stoga IL-22-zavisna aktivacija IL-22R može da se odredi u ovoj ćelijskoj liniji merenjem proliferacije ćelija BW-hIL-22R, na primer kako je opisano u primeru 6.

U određenim primerima izvođenja, ovde opisana antitela ili antigen-vezujući fragmenti ispoljavaju IC50(koncentraciju pri kojoj se postiže 50% inhibicije aktivacije) u IL-22-zavisnom testu proliferacije zasnovanom na ćelijama nižu od 650 pM, poželjno nižu od 600 pM. Test proliferacije zasnovan na ćelijama je poželjno test koji uključuje ćelijsku liniju BW-hIL-22R, kao što je ovde opisano.

[0136] IL-20-zavisna aktivacija IL-22R može da se meri u ćelijama ili ćelijskim linijama koje eksprimiraju i IL-22R i ko-receptor IL-20R2, na primer u ćelijskoj liniji Baf3-hIL-22R/IL20Rb koja je ovde opisana, kao i u Dumoutier et al. J Biol Chem.2009 Sep 25; 284(39): 26377-84. IL-20 indukuje proliferaciju u ćelijskoj liniji Baf3-hIL-22R/IL20Rb i stoga IL-20-zavisna aktivacija IL-22R može da se odredi u ovoj ćelijskoj liniji merenjem proliferacije ćelija Baf3-hIL-22R/IL20Rb, npr. kao što je opisano u primeru 6. U određenim primerima izvođenja, ovde opisana antitela ili antigen-vezujući fragmenti pokazuju IC50(koncentraciju pri kojoj se postiže 50% inhibicije aktivacije) u IL-20-zavisnom testu proliferacije zasnovanom na ćelijama nižu od 1 nM, poželjno nižu od 800 pM. Test proliferacije zasnovan na ćelijama je poželjno test koji uključuje ćelijsku liniju Baf3-hIL-22R/IL20Rb, kao što je ovde opisano.

[0137] Pored gore opisanih testova proliferacije, IL-22- i/ili IL-20-zavisna aktivacija IL-22R može da se meri korišćenjem alternativnih ćelijskih testova, na primer testa fosforilacije STAT3, kao što je opisano u WO2011/061119.

[0138] Antitela ili antigen-vezujući fragmenti ovog pronalaska vezuju se za humani IL-22R i inhibiraju i IL-22-zavisnu aktivaciju IL-22R i IL-20-zavisnu aktivaciju IL-22R. Inhibiciona ili "neutrališuća" aktivnost antitela ili antigen-vezujućih fragmenata podjednako je snažna za aktivaciju zavisnu od IL-22, kao i od IL-20. U drugim ovde opisanim primerima, inhibitorna ili neutrališuća aktivnost antitela ili antigen-vezujućih fragmenata može da bude veća za aktivaciju IL-22R posredovanu jednim od liganda u odnosu na aktivaciju IL-22R posredovanu drugim ligandom. U određenim primerima, antitela ili antigen-vezujući fragmenti prema pronalasku će pokazati snažniju inhibitornu aktivnost za IL-22-zavisnu aktivaciju IL-22R u poređenju sa IL-20-zavisnom aktivacijom IL-22R. Međutim, u takvim primerima, inhibitorna aktivnost antitela ili antigen-vezujućeg fragmenta za IL-22-zavisnu aktivaciju IL-22R će obično biti manje od 5 puta, poželjno manje od 4 puta veća, poželjnije manje od 2 puta veća, od inhibitorne aktivnosti antitela ili antigen-vezujućeg fragmenta za IL-20-zavisnu aktivaciju IL-22R.

4

Unakrsna reaktivnost

[0139] U određenim primerima izvođenja, ovde opisana antitela ili antigen-vezujući fragmenti koji vezuju humani IL-22R mogu unakrsno da reaguju sa jednom ili više homologa vrste IL-22R, na primer sa homolozima IL-22R poreklom od primata.

[0140] U određenim primerima izvođenja, antitela ili antigen-vezujući fragmenti predmetnog pronalaska ne reaguju unakrsno sa mišjim IL-22R. Alternativno ili dodatno, antitela ili antigenvezujući fragmenti mogu da se vežu za jedan ili više homologa IL-22R poreklom od primata, na primer za proteine IL-22R rezus i cinomologus majmuna. Unakrsna reaktivnost sa homolozima drugih vrsta može da bude posebno korisna u razvoju i ispitivanju terapijskih antitela. Na primer, pretkliničko toksikološko ispitivanje terapijskih antitela se često sprovodi na vrstama primata uključujući, ali bez ograničenja rezus i cinomologus majmune. Unakrsna reaktivnost sa homolozima ovih vrsta stoga može da bude posebno korisna za razvoj antitela kao kliničkih kandidata.

Antitela poreklom od kamelida

[0141] U određenim primerima izvođenja pronalaska, ovde opisana antitela ili njihovi antigenvezujući fragmenti mogu da sadrže najmanje jednu hipervarijabilnu petlju ili region koji određuje komplementarnost dobijen iz VH domena ili VL domena vrste iz porodice Camelidae. Konkretno, antitelo ili antigen-vezujući fragment može da sadrži VH i/ili VL domene, ili njihove CDR regione, dobijene aktivnom imunizacijom autbrid kamelida, npr. lama, antigenom IL-22R ili njegovim fragmentom.

[0142] Pod izrazom "hipervarijabilna petlja ili region koji određuje komplementarnost dobijen iz VH domena ili VL domena vrste porodice Camelidae" podrazumeva se da ta hipervarijabilna petlja (HV) ili CDR ima sekvencu aminokiselina koja je identična, ili suštinski identična, sekvenci aminokiselina hipervarijabilne petlje ili CDR koja je kodirana genom imunoglobulina vrste porodice Camelidae. U ovom kontekstu, "imunoglobulinski gen" uključuje gene klicine linije, imunoglobulinske gene koji su prošli rearanžiranje, kao i somatski mutirane gene. Prema tome, aminokiselinska sekvenca HV ili CDR dobijena iz VH ili VL domena vrste porodice Camelidae može da bude identična aminokiselinskoj sekvenci HV ili CDR prisutnoj u zrelom konvencionalnom antitelu vrste porodice Camelidae. Termin "dobijeno iz" u ovom kontekstu implicira strukturni odnos, u smislu da HV ili CDR anti-IL-22R antitela predstavljaju aminokiselinsku sekvencu (ili njene minorne varijante) koja je prvobitno bila kodirana imunoglobulinskim genom vrste porodice Camelidae. Međutim, ovo ne mora da implicira poseban odnos u smislu proizvodnog postupka koji se koristi za pripremu anti-IL-22R antitela.

[0143] Anti-IL-22R antitela poreklom iz kamelida mogu da potiču iz bilo koje vrste kamelida, uključujući, između ostalog, lamu, dromedara, alpaku, vikunju, guanako ili kamilu.

[0144] Anti-IL-22R antitela koja sadrže VH i VL domene, ili njihove CDR regione, poreklom od kamelida tipično su rekombinantno eksprimirani polipeptidi i mogu da budu himerni polipeptidi. Termin "himerni polipeptid" se odnosi na veštački (neprirodan) polipeptid koji je stvoren spajanjem dva ili više peptidnih fragmenata koji se inače ne javljaju u kontinuitetu. U ovu definiciju uključeni su polipeptidi koji su himere "vrsta", stvoreni spajanjem peptidnih fragmenata koje kodiraju dve ili više vrsta, npr. kamelida i čovek.

[0145] CDR regioni poreklom iz kamelida mogu da sadrže jednu od CDR sekvenci prikazanih kao SEQ ID No: 6 i 13 (CDR3 teškog lanca), ili SEQ ID No: 4 i 11 (CDR2 teškog lanca) ili SEQ ID No: 2 i 9 (CDR1 teškog lanca) ili jednu od CDR sekvenci prikazanih kao SEQ ID No: 20 i 27 (CDR3 lakog lanca), ili SEQ ID No: 18, 25 i 47 (CDR2 lakog lanca) ili SEQ ID No: 16 i 23 (CDR1 lakog lanca).

[0146] U jednom primeru izvođenja ceo VH domen i/ili ceo VL domen može da se dobije iz vrste porodice Camelidae. U specifičnim primerima, VH domen poreklom iz kamelida može da sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od SEQ ID No: 29 i 31, dok VL domen poreklom iz kamelida može da sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od SEQ ID No: 30, 32 i 62. VH domen poreklom iz kamelida i/ili VL domen poreklom iz kamelida može tada da bude podvrgnut proteinskom inženjeringu, u kome se jedna ili više aminokiselinskih supstitucija, insercija ili delecija uvode u aminokiselinsku sekvencu kamelida. Ove konstruisane promene poželjno uključuju supstitucije aminokiselina u odnosu na sekvencu kamelida. Takve promene obuhvataju "humanizaciju" ili "modifikovanje prema sekvenci klicine linije", pri čemu se jedan ili više aminokiselinskih ostataka u VH ili VL domenu koji su kodirani genima kamelida zamenjuju ekvivalentnim ostacima iz homolognog VH ili VL domena kodiranog humanim genima. U određenim primerima, VH domen poreklom iz kamelida može da pokaže najmanje 90%, 95%, 97%, 98% ili 99% identičnost sa sekvencom aminokiselina prikazanom kao SEQ ID No: 29 ili 31. Alternativno, ili dodatno, VL domen poreklom iz kamelida može da pokaže najmanje 90%, 95%, 97%, 98% ili 99% identičnost sa sekvencom aminokiselina prikazanom kao SEQ ID No: 30, 32 ili 62.

[0147] Izolovani VH i VL domeni kamelida dobijeni aktivnom imunizacijom kamelida (npr. lame) humanim IL-22R antigenom mogu da se koriste kao osnova za konstruisanje antigen-vezujućih polipeptida prema pronalasku. Polazeći od intaktnih VH i VL domena kamelida, moguće je konstruisati jednu ili više aminokiselinskih supstitucija, insercija ili delecija koje odstupaju od početne sekvence kamelida. U određenim primerima izvođenja, takve supstitucije, insercije ili delecije mogu da budu prisutne u regionima okvira VH domena i/ili VL domena. Svrha takvih promena u primarnoj aminokiselinskoj sekvenci može da bude redukcija verovatno nepovoljnih svojstava (npr. imunogenosti u ljudskom domaćinu (tzv. humanizacija)), mesta potencijalne heterogenosti i/ili nestabilnosti proizvoda (glikozilacija, deamidacija, izomerizacija, itd.) ili poboljšanje nekog drugog povoljnog svojstva molekula (npr. rastvorljivosti, stabilnosti, bioraspoloživosti, itd.) U drugim primerima izvođenja, promene u primarnoj aminokiselinskoj sekvenci mogu da budu konstruisane u jednoj ili više hipervarijabilnih petlji (ili CDR) VH i /ili VL domena kamelida dobijenog aktivnom imunizacijom. Takve promene mogu da se uvedu da bi se poboljšao afinitet i/ili specifičnost vezivanja antigena, ili da bi se redukovala verovatno nepovoljna svojstva, npr. imunogenost kod humanog domaćina (tzv. humanizacija), mesta potencijalne heterogenosti i/ili nestabilnosti proizvoda, glikozilacije, deamidacije, izomerizacije, itd., ili kako bi se poboljšalo neko drugo povoljno svojstvo molekula, npr. rastvorljivost, stabilnost, bioraspoloživost, itd.

[0148] Prema tome, u jednom primeru izvođenja, pronalazak obezbeđuje varijantu anti-IL-22R antitela koja sadrži najmanje jednu aminokiselinsku supstituciju u najmanje jednom regionu okvira ili CDR regionu bilo VH domena ili VL domena, u poređenju sa VH ili VL domenom poreklom iz kamelida. Primeri koji su ovde opisani uključuju, ali nisu ograničeni na VH domene kamelida koji sadrže aminokiselinske sekvence prikazane kao SEQ ID No: 29 i 31, i VL domene kamelida koji sadrže sekvence aminokiselina prikazane kao SEQ ID No: 30, 32 ili 62.

[0149] U drugim primerima izvođenja, obezbeđeni su "himerni" molekuli antitela koji sadrže VH i VL domene poreklom iz kamelida (ili njihove konstruisane varijante) i jedan ili više konstantnih domena iz antitela koje ne potiče iz kamelida, na primer konstantne domene kodirane humanim genima (ili njihove konstruisane varijante). U takvim primerima izvođenja poželjno je da su i VH domen i VL domen dobijeni od iste vrste kamelida, na primer i VH i VL mogu da potiču iz vrste Lama glama ili i VH i VL mogu da potiču iz vrste Lama pacos (pre uvođenja konstruisane varijacije aminokiselinske sekvence). U takvim primerima izvođenja i VH i VL domen mogu da potiču iz jedne životinje, posebno jedne životinje koja je aktivno imunizovana IL-22R antigenom.

[0150] Kao alternativa konstruisanim promenama u primarnoj aminokiselinskoj sekvenci VH i/ili VL domena kamelida, pojedinačne hipervarijabilne petlje ili CDR regioni poreklom iz kamelida, ili njihove kombinacije, mogu da se izoluju iz VH/VL domena kamelida i prenesu u alternativni (tj. onaj koji ne potiče iz kamelida) region okvira, npr. humani region okvira VH/VL, graftovanjem CDR regiona. U posebnim primerima, CDR regioni poreklom iz kamelida mogu da budu izabrani od CDR regiona koji imaju aminokiselinske sekvence prikazane kao SEQ ID No: 6 i 13 (CDR3 teškog lanca), ili SEQ ID No: 4 i 11 (CDR2 teškog lanca) ili SEQ ID No: 2 i 9 (CDR1 teškog

4

lanca) ili jedne od CDR sekvenci prikazanih kao SEQ ID No: 20 i 27 (CDR3 lakog lanca), ili SEQ ID No: 18, 25 i 47 (CDR2 lakog lanca) ili SEQ ID No: 16 i 23 (CDR1 lakog lanca).

[0151] Anti- IL-22R antitela koja sadrže VH i VL domene poreklom iz kamelida, ili njihove CDR regione, mogu da imaju mnoge različite primere izvođenja u kojima su prisutni i VH domen i VL domen. Termin "antitelo" ovde se koristi u najširem smislu i obuhvata, ali nije ograničen na monoklonska antitela (uključujući monoklonska antitela pune dužine), poliklonska antitela, multispecifična antitela (npr. bispecifična antitela), sve dok ona pokazuju odgovarajuću imunološku specifičnost za protein IL-22R. Termin "monoklonsko antitelo", kako se ovde koristi, odnosi se na antitelo dobijeno iz populacije suštinski homogenih antitela, tj. pojedinačna antitela koja čine populaciju su identična osim mogućih prirodnih mutacija koje mogu da budu prisutne u manjim količinama. Monoklonska antitela su visoko specifična i usmerena su protiv jednog antigenskog mesta. Osim toga, za razliku od konvencionalnih (poliklonskih) preparata antitela koji tipično uključuju različita antitela usmerena protiv različitih determinanti (epitopa) na antigenu, svako monoklonsko antitelo je usmereno protiv jedne determinante ili epitopa na antigenu.

[0152] "Fragmenti antitela" obuhvataju deo antitela pune dužine, uglavnom njegov antigenvezujući ili varijabilni domen. Primeri fragmenata antitela uključuju Fab, Fab', F(ab')2, bispecifične Fab' i Fv fragmente, diatela, linearna antitela, jednolančane molekule antitela, jednolančani varijabilni fragment (scFv) i multispecifična antitela formirana od fragmenata antitela (videti Holliger and Hudson, Nature Biotechnol.23:1126-36 (2005)).

[0153] U neograničavajućim primerima izvođenja, anti-IL-22R antitela koja sadrže VH i VL domene poreklom iz kamelida, ili njihove CDR, mogu da sadrže CH1 domene i/ili CL domene, čija je aminokiselinska sekvenca u potpunosti ili suštinski humana. Kada je antigen-vezujući polipeptid prema pronalasku antitelo namenjeno za terapijsku upotrebu kod ljudi, tipično je da ceo konstantni region antitela, ili bar njegov deo, ima u potpunosti ili suštinski humanu aminokiselinsku sekvencu. Prema tome, jedna ili više ili bilo koja kombinacija CH1 domena, regiona zgloba, CH2 domena, CH3 domena i CL domena (i CH4 domena, ako je prisutan) može da bude u potpunosti ili suštinski humana kada je u pitanju njena aminokiselinska sekvenca.

[0154] Pogodno, CH1 domen, region zgloba, CH2 domen, CH3 domen i CL domen (i CH4 domen ako je prisutan) mogu da imaju u potpunosti ili suštinski humanu aminokiselinsku sekvencu. U kontekstu konstantnog regiona humanizovanog ili himernog antitela, ili fragmenta antitela, izraz "suštinski humani" se odnosi na identičnost aminokiselinske sekvence od najmanje 90%, ili najmanje 92%, ili najmanje 95%, ili najmanje 97%, ili najmanje 99% sa humanim konstantnim regionom. Izraz "humana aminokiselinska sekvenca" u ovom kontekstu se odnosi na sekvencu aminokiselina koja je kodirana humanim imunoglobulinskim genom, što uključuje gene klicine linije, preuređene i somatski mutirane gene. Pronalazak takođe razmatra polipeptide koji sadrže konstantne domene "humane" sekvence koji su izmenjeni, jednom ili više aminokiselinskih adicija, delecija ili supstitucija u odnosu na humanu sekvencu, izuzev onih primera izvođenja gde se prisustvo "potpuno humanog" regiona zgloba izričito zahteva.

[0155] Prisustvo "potpuno humanog" regiona zgloba u anti-IL-22R antitelima prema pronalasku može da bude korisno i za minimiziranje imunogenosti i za optimizaciju stabilnosti antitela. Kao što je diskutovano na drugom mestu u ovom dokumentu, smatra se da jedna ili više aminokiselinskih supstitucija, insercija ili delecija mogu da budu napravljene unutar konstantnog regiona teškog i/ili lakog lanca, posebno unutar Fc regiona. Supstitucije aminokiselina mogu da dovedu do zamene supstituisane aminokiseline drugom prirodnom aminokiselinom, ili neprirodnom ili modifikovanom aminokiselinom. Druge strukturne modifikacije su takođe dozvoljene, kao što su na primer promene u obrascu glikozilacije (npr. adicijom ili delecijom N-ili O-vezanih mesta glikozilacije). U zavisnosti od nameravane upotrebe antitela, može da bude poželjno da se antitelo pronalaska modifikuje u pogledu osobina vezivanja za Fc receptore, na primer, kako bi se modifikovala njegova efektorska funkcija. Na primer, cisteinski ostatak/ostaci može da bude uveden u Fc region, čime se omogućava formiranje međulančane disulfidne veze u ovom regionu. Tako generisano homodimerno antitelo može da ima poboljšanu sposobnost internalizacije i/ili povećano ubijanje ćelija posredovano komplementom i ćelijsku citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC). Videti Caron et al., J. Exp. Med. 176:1191-1195 (1992) i Shopes, B.J. Immunol.148:2918-2922 (1992). Ovde su takođe opisani imunokonjugati koji sadrže antitelo kao što je ovde opisano konjugovano sa citotoksičnim agensom kao što je hemoterapijski agens, toksin (npr. enzimski aktivan toksin bakterijskog, gljivičnog, biljnog ili životinjskog porekla ili njihovi fragmenti) ili radioaktivni izotop ( odnosno radiokonjugat). Fc regioni takođe mogu da budu konstruisani za produženje poluživota, kao što su opisali Chan and Carter, Nature Reviews: Immunology, Vol.10, pp.301-316, 2010.

[0156] U još jednom primeru izvođenja, Fc region je modifikovan tako da poveća sposobnost antitela da posreduje u ćelijskoj citotoksičnosti zavisnoj od antitela (ADCC) i/ili da poveća afinitet antitela za receptor Fcγ modifikacijom jedne ili više aminokiselina. U alternativnim primerima izvođenja, Fc region može da bude konstruisan tako da nema efektorske funkcije. Anti-IL-22R antitelo koje nema Fc efektorsku funkciju može da bude posebno korisno kao agens za blokiranje receptora. U određenim primerima izvođenja, antitela prema pronalasku mogu da imaju Fc region koji potiče iz prirodno prisutnih izotipova IgG koji imaju smanjenu efektorsku funkciju, na primer IgG4. Fc regioni koji potiču iz IgG4 mogu dodatno da se modifikuju kako bi se povećala njihova

4

terapijska korisnost, na primer uvođenjem modifikacija koje smanjuju razmenu krakova između molekula IgG4 in vivo.

[0157] U još jednom primeru izvođenja, modifikovana je glikozilacija antitela. Na primer, može da se napravi aglikozilisano antitelo (tj. antitelo kome nedostaje glikozilacija). Glikozilacija može da se izmeni da bi se, na primer, povećao afinitet antitela za ciljni antigen. Takve modifikacije ugljenih hidrata mogu da se postignu pomoću; na primer, menjanja jednog ili više mesta glikozilacije unutar sekvence antitela. Na primer, može da se izvede jedna ili više supstitucija aminokiselina koje rezultuju eliminacijom jednog ili više mesta glikozilacije u regionu okvira varijabilnog regiona da bi se time eliminisala glikozilacija na tom mestu. Takva aglikozilacija može da poveća afinitet antitela za antigen.

[0158] Takođe su predviđena varijantna anti-IL-22R antitela koja imaju izmenjen tip glikozilacije, kao što je hipofukozilisano antitelo koje ima smanjene količine fukozilnih ostataka ili potpuno ili delimično defukozilisano antitelo (kao što su opisali Natsume et al., Drug Design Development and Therapy, Vol.3, pp.7-16, 2009) ili antitelo koje ima povećan broj račvastih struktura GlcNac. Pokazalo se da takvi izmenjeni obrasci glikozilacije povećavaju ADCC aktivnost antitela, proizvodeći tipično 10-struko povećanje ADCC u odnosu na ekvivalentno antitelo koje sadrži "nativni" humani Fc domen. Takve modifikacije ugljenih hidrata mogu da se postignu, na primer, ekspresijom antitela u ćeliji-domaćinu sa izmenjenom enzimskom mašinom za glikozilaciju (kao što je opisano u Yamane-Ohnuki and Satoh, mAbs 1:3, 230-236, 2009). Primeri nefukozilisanih antitela sa poboljšanom ADCC funkcijom su antitela proizvedena korišćenjem tehnologije Potelligent™ kompanije BioWa Inc.

[0159] Pronalazak može, u određenim primerima izvođenja, da obuhvati himerna antitela kamelida/čoveka, a posebno himerna antitela u kojima VH i VL domeni imaju sekvencu koja u potpunosti potiče iz kamelida (npr. lame ili alpake), a ostatak antitela ima u potpunosti humanu sekvencu. Anti-IL-22R antitela mogu da uključuju antitela koja sadrže "humanizovane" varijante ili varijante "modifikovane prema sekvenci klicine linije" VH i VL domena, ili njihovih CDR regiona, poreklom iz kamelida, i himerna antitela kamelida/čoveka, u kojima VH i VL domeni sadrže jednu ili više aminokiselinskih supstitucija u regionima okvira u poređenju sa VH i VL domenima kamelida dobijenim aktivnom imunizacijom kamelida antigenom IL-22R ili njegovim fragmentom. Takva "humanizacija" povećava procenat identičnosti sekvence sa VH ili VL domenima humane klicine linije zamenom pogrešno sparenih aminokiselinskih ostataka u polaznom VH ili VL domenu kamelida ekvivalentnim ostatkom koji se nalazi u VH ili VL domenu kodiranom genima humane klicine linije. Anti-IL-22R antitela takođe mogu da budu antitela sa graftovanim CDR u kojima su CDR regioni (ili hipervarijabilne petlje), koji potiču iz antitela

4

kamelida, ili na su drugi način kodirani genom kamelida, graftovani na humani region okvira VH i VL, pri čemu je ostatak antitela takođe potpuno humanog porekla. Takva CDR-graftovana anti-IL-22R antitela mogu da sadrže CDR koji imaju aminokiselinske sekvence prikazane kao SEQ ID No: 6 i 13 (CDR3 teškog lanca), ili SEQ ID No: 4 i 11 (CDR2 teškog lanca) ili SEQ ID No: 2 i 9 (CDR1 teškog lanca) ili jednu od CDR sekvenci prikazanih kao SEQ ID NO: 20 i 27 (CDR3 lakog lanca), ili SEQ ID NO: 18, 25 i 47 (CDR2 lakog lanca) ili SEQ ID No:16 i 23 (CDR1 lakog lanca).

[0160] Humanizovana, himerična i anti-IL-22R antitela sa graftovanim CDR, kao što je gore opisano, posebno antitela koja sadrže hipervarijabilne petlje ili CDR regione dobijene aktivnom imunizacijom kamelida, mogu lako da se proizvedu korišćenjem konvencionalnih tehnika manipulacije i ekspresije rekombinantne DNK, upotrebom prokariotskih i eukariotskih ćelijadomaćina konstruisanih da proizvode polipeptid od interesa i uključujući, ali ne ograničavajući se na bakterijske ćelije, ćelije kvasca, ćelije sisara, ćelije insekata, ćelije biljaka, od kojih su neke kao što je ovde opisano i ilustrovano u pratećim primerima.

[0161] Anti-IL-22R antitela poreklom iz kamelida obuhvataju varijante u kojima se jedna ili više hipervarijabilnih petlji ili CDR regiona VH domena i/ili VL domena dobijaju iz konvencionalnog antitela kamelide nastalog imunizacijom humanim IL-22R, ali u kojima je najmanje jedna od navedenih hipervarijabilnih petlji ili CDR regiona (poreklom iz kamelida) konstruisana tako da uključuje jednu ili više aminokiselinskih supstitucija, adicija ili delecija u odnosu na sekvencu kodiranu genima kamelida. Takve promene uključuju "humanizaciju" hipervarijabilnih petlji/CDR regiona. HV/CDR regioni poreklom iz kamelida koji su konstruisani na ovaj način mogu još uvek da ispoljavaju aminokiselinsku sekvencu koja je "suštinski identična" aminokiselinskoj sekvenci HV/CDR kodiranoj genima kamelida. U ovom kontekstu, "suštinska identičnost" može da dozvoli ne više od jednog, ili ne više od dva pogrešna sparivanja aminokiselinske sekvence sa HV/CDR kodiranim genima kamelida. Konkretni primeri anti-IL-22R antitela mogu da sadrže humanizovane varijante CDR sekvenci prikazanih kao SEQ ID No: 6 i 13 (CDR3 teškog lanca), ili SEQ ID No: 4 i 11 (CDR2 teškog lanca) ili SEQ ID No: 2 i 9 (CDR1 teškog lanca) ili jednu od CDR sekvenci prikazanih kao SEQ ID No: 20 i 27 (CDR3 lakog lanca), ili SEQ ID No: 18, 25 i 47 (CDR2 lakog lanca) ili SEQ ID No:16 i 23 (CDR1 lakog lanca).

[0162] Ovde data anti-IL-22R antitela poreklom iz kamelida mogu da budu bilo kog izotipa. Antitela namenjena za terapijsku upotrebu kod ljudi će obično biti tipa IgA, IgD, IgE IgG, IgM, često tipa IgG, u kom slučaju mogu da pripadaju bilo kojoj od četiri potklase IgG1, IgG2a i b, IgG3 ili IgG4. Unutar svake od ovih potklasa dozvoljeno je napraviti jednu ili više aminokiselinskih supstitucija, insercija ili delecija unutar Fc dela, ili napraviti druge strukturne modifikacije, na primer da bi se poboljšale ili redukovale funkcije zavisne od Fc.

4

Poželjna anti-IL-22R antitela - 230C9 i 223G5 i njima srodna antitela

[0163] Poželjna anti-IL-22R antitela i njihovi antigen-vezujući fragmenti u skladu sa ovim pronalaskom su humanizovane varijante i varijante modifikovane prema sekvenci klicine linije ovde opisanih antitela poreklom iz kamelida. Humanizovane varijante i varijante modifikovane prema sekvenci klicine linije pokazuju visoku homologiju sa humanim antitelom, i poželjno pokazuju visoku homologiju sa humanim molekulima IgG, poželjnije IgG1. U određenim primerima izvođenja, poželjna anti-IL-22R antitela i antigen-vezujući fragmenti u skladu sa ovim pronalaskom sadrže hipervarijabilne petlje ili CDR regione koji imaju humane kanonske savijene forme ili kanonske savijene forme slične humanim, kao što je opisano na drugom mestu u ovom dokumentu.

[0164] Poželjna anti-IL-22R antitela prema ovom pronalasku mogu da ispolje identičnost aminokiselinske sekvence od 93% ili više sa jednim ili više humanih VH domena, posebno u regionima okvira FR1, FR2, FR3 i FR4. Alternativno ili dodatno, poželjna anti-IL-22R antitela mogu da ispolje identičnost aminokiselinske sekvence od 96% ili više sa jednim ili više humanih VL domena, posebno u regionima okvira FR1, FR2, FR3 i FR4. Poželjna anti-IL-22R antitela u skladu sa ovim pronalaskom mogu da ispoljavaju identičnost aminokiselinske sekvence od 93% ili više sa jednim ili više humanih VH domena, i kombinovanu identičnost aminokiselinske sekvence od 93% ili više sa jednim ili više humanih VH domena i jednim ili više humanih VL domena, posebno tamo gde se identičnost sekvence određuje u okviru regiona okvira.

[0165] Zbog visoke homologije sa humanim antitelom, poželjna anti-IL-22R antitela koja su ovde data, pokazuju nisku imunogenost, kao što je procenjeno pomoću platforme Epibase™ kompanije Lonza (ocena DRB-1) korišćenjem podešavanja "HLA class II - Caucasian v3.0". U određenim primerima izvođenja, anti-IL-22R antitela pronalaska pokazuju ocenu DRB-1 manju od 950, poželjno manju od 850, poželjnije manju od 750, najpoželjnije manju od 650.

[0166] Poželjna anti-IL-22R antitela pronalaska su monoklonska antitela koja sadrže region zgloba, CH2 domen i CH3 domen iz humanog IgG, poželjno IgG1. U određenim primerima izvođenja, Fc region monoklonalnog antitela nema efektorsku funkciju, tj. predstavlja Fc nula. Ovo je posebno korisno za terapijska blokirajuća antitela.

[0167] Poželjna anti-IL-22R antitela i antigen-vezujući fragmenti prema pronalasku pokazuju kombinaciju svojstava koja ih čine superiornim u odnosu na anti-IL-22R antitela opisana u prethodnom stanju tehnike. Poželjna anti-IL-22R antitela i antigen-vezujući fragmenti prema pronalasku mogu da ispoljavaju sledeću kombinaciju svojstava:

(i) vezivanje za epitop unutar proteina IL-22R koji ne uključuje Tyr60;

(ii) vezivanje za epitop koji se nalazi barem delimično u D2 domenu proteina IL-22R;

4

(iii) visok afinitet vezivanja za humani IL-22R;

(iv) inhibicija IL-22-zavisne aktivacije IL-22R i IL-20-zavisne aktivacije IL-22R;

(v) odsustvo unakrsne reaktivnosti sa mišjim IL-22R; i

(vi) unakrsna reaktivnost sa IL-22R rezus i/ili cinomologus majmuna.

[0168] Poželjna anti-IL-22R antitela pronalaska mogu da se vežu za epitop koji ne uključuje kritični ostatak Tyr60. Poželjna anti-IL-22R antitela pronalaska mogu da se vežu za epitop koji se nalazi barem delimično u D2 domenu IL-22R, pri čemu je D2 domen od aminokiseline 125 do aminokiseline 228 u SEQ ID NO: 71. Poželjna anti-IL-22R antitela pronalaska takođe mogu da se vežu za humani IL-22R sa visokim afinitetom, tipično pokazujući konstantu brzine disocijacije (pri čemu se koffmeri primenom Biacore) za humani IL-22R nižu od 2.5 x 10<-4>s<-1>kada se meri kao mAb. U određenim primerima izvođenja, poželjna anti-IL-22R antitela pronalaska vezuju se za humani IL-22R sa visokim afinitetom, pokazujući konstantu brzine disocijacije (pri čemu se koffmeri primenom Biacore) za humani IL-22R u opsegu 1 x 10<-6>s<-1>do 2.5 x 10<-4>s<-1>. U određenim primerima izvođenja, poželjna anti-IL-22R antitela pronalaska vezuju se za humani IL-22R pokazujući KDvrednost manju od 5 x 10<-10>M.

[0169] Poželjna anti-IL-22R antitela mogu takođe da inhibiraju i IL-22- i IL-20-zavisnu aktivaciju IL-22R, i tipično pokazuju inhibitornu aktivnost za IL-20-zavisnu aktivaciju koja je manje od četiri puta veća od inhibitorne aktivnosti pokazane za IL-22-zavisnu aktivaciju. Poželjna anti-IL-22R antitela mogu da se vežu za humani IL-22R sa visokim afinitetom i da unakrsno reaguju sa homolozima vrsta IL-22R rezus i cinomologus majmuna, ali ne reaguju unakrsno sa mišjim IL-22R.

[0170] Antitela i antigen-vezujući fragmenti prema ovom pronalasku sadrže najmanje jedan varijabilni domen teškog lanca (VH) i najmanje jedan varijabilni domen lakog lanca (VL) pri čemu VH domen sadrži:

- CDR3 varijabilnog teškog lanca koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence [VGFSGTYYSES], SEQ ID NO: 6,

- CDR2 varijabilnog teškog lanca koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence [SIYNDASNTAYSDSVKG], SEQ ID NO: 36,

- CDR1 varijabilnog teškog lanca koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence [SYDMN], SEQ ID NO: 34,

4

a VL domen sadrži:

- CDR3 varijabilnog lakog lanca koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence [QSGSSSSNAV], SEQ ID NO: 54,

- CDR2 varijabilnog lakog lanca koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence [GQNNRPS], SEQ ID NO.47,

- CDR1 varijabilnog lakog lanca koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence [QGGYYAH], SEQ ID NO: 16.

[0171] Antitela i antigen-vezujući fragmenti koji imaju CDR sekvence VH i VL domena kao što je gore definisano mogu da sadrže VH domen koji sadrži ili se sastoji od sekvence SEQ ID NO:63 i/ili VL domena koji sadrži ili se sastoji od sekvence SEQ ID NO:64. U određenim primerima izvođenja, ovde su obezbeđena antitela ili njihovi antigen-vezujući fragmenti, koji sadrže varijabilni domen teškog lanca i varijabilni domen lakog lanca, pri čemu varijabilni domen teškog lanca sadrži VH sekvencu sa najmanje 85% identičnosti sekvence, ili najmanje 90% identičnosti sekvence, ili najmanje 95% identičnosti sekvence, ili najmanje 97%, 98% ili 99% identičnosti sekvence, sa sekvencom aminokiselina prikazanom kao SEQ ID NO:63 i/ili varijabilni domen lakog lanca sadrži VL sekvencu sa najmanje 85% identičnosti sekvence, ili najmanje 90% identičnosti sekvence, ili najmanje 95% identičnosti sekvence, ili najmanje 97%, 98% ili 99% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom prikazanom kao SEQ ID NO:64. Za primere izvođenja u kojima su domeni antitela ili antigen-vezujući fragmenti definisani određenim procentom identičnosti sekvence sa referentnom sekvencom, VH i/ili VL domeni mogu da zadrže identične CDR sekvence onima prisutnim u referentnoj sekvenci, tako da je varijacija prisutna samo unutar regiona okvira.

[0172] Antitela i antigen-vezujući fragmenti koji imaju CDR sekvence VH i VL domena kao što je gore definisano mogu da sadrže teški lanac imunoglobulina pune dužine koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 67 i/ili laki lanac imunoglobulina pune dužine koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 68. U određenim primerima izvođenja, ovde su obezbeđena antitela koja sadrže teški lanac sa najmanje 85% identičnosti sekvence, ili najmanje 90% identičnosti sekvence, ili najmanje 95% identičnosti sekvence, ili najmanje 97%, 98% ili 99% identičnosti sekvence, sa sekvencom aminokiselina prikazanom kao SEQ ID NO:67 i/ili laki lanac sa najmanje 85% identičnosti sekvence, ili najmanje 90% identičnosti sekvence, ili najmanje 95% identičnosti sekvence, ili najmanje 97%, 98% ili 99% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom prikazanom kao SEQ ID NO:68.

[0173] U primerima izvođenja u kojima su lanci antitela definisani određenim procentom identičnosti sekvence sa referentnom sekvencom, teški lanac i/ili laki lanac mogu da zadrže identične CDR sekvence onima koje su prisutne u referentnoj sekvenci, tako da je varijacija prisutna samo izvan CDR regiona.

[0174] U određenim primerima, određena antitela i antigen-vezujući fragmenti koji su ovde opisani sadrže najmanje jedan varijabilni domen teškog lanca (VH) i najmanje jedan varijabilni domen lakog lanca (VL) pri čemu VH domen sadrži:

- CDR3 varijabilnog teškog lanca koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence [PPGPFKAHYNGAKY], SEQ ID NO: 43,

- CDR2 varijabilnog teškog lanca koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence [GIHISGGITYYTDSVKG], SEQ ID NO: 41,

- CDR1 varijabilnog teškog lanca koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence [SYFMS], SEQ ID NO: 9,

a VL domen sadrži:

- CDR3 varijabilnog lakog lanca koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence [ASYRLYADYV], SEQ ID NO: 27,

- CDR2 varijabilnog lakog lanca koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence [EVNKRSS], SEQ ID NO.59,

- CDR1 varijabilnog lakog lanca koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence [TGTSSDIGSYNYVS], SEQ ID NO: 57.

[0175] Antitela i antigen-vezujući fragmenti koji imaju CDR sekvence VH i VL domena kao što je gore definisano mogu da sadrže VH domen koji sadrži ili se sastoji od sekvence SEQ ID NO:65 i/ili VL domen koji sadrži ili se sastoji od sekvence SEQ ID NO:66. U određenim primerima, ovde su opisana antitela ili njihovi antigen-vezujući fragmenti, koji sadrže varijabilni domen teškog lanca i varijabilni domen lakog lanca, pri čemu varijabilni domen teškog lanca sadrži VH sekvencu sa najmanje 85% identičnosti sekvence, ili najmanje 90% identičnosti sekvence, ili najmanje 95% identičnosti sekvence, ili najmanje 97%, 98% ili 99% identičnosti sekvence, sa aminokiselinskom sekvencom prikazanom kao SEQ ID NO:65 i/ili varijabilni domen lakog lanca sadrži VL sa najmanje 85% identičnosti sekvence, ili najmanje 90% identičnosti sekvence, ili najmanje 95% identičnosti sekvence, ili najmanje 97%, 98% ili 99% identičnosti sekvence, sa aminokiselinskom sekvencom prikazanom kao SEQ ID NO:66. U primerima izvođenja u kojima su domeni antitela ili antigen-vezujući fragmenti definisani određenim procentom identičnosti sekvence sa referentnom sekvencom, VH i/ili VL domeni mogu da zadrže identične CDR sekvence onima prisutnim u referentnoj sekvenci, tako da je varijacija prisutna samo unutar regiona okvira.

1

[0176] Antitela i antigen-vezujući fragmenti koji imaju CDR sekvence VH i VL domena kao što je gore definisano mogu da sadrže teški lanac imunoglobulina pune dužine koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 69 i/ili laki lanac imunoglobulina pune dužine koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 70. U određenim primerima, ovde su opisana antitela koja sadrže teški lanac sa najmanje 85% identičnosti sekvence, ili najmanje 90% identičnosti sekvence, ili najmanje 95% identičnosti sekvence, ili najmanje 97%, 98% ili 99% identičnosti sekvence, sa sekvencom aminokiselina prikazanom kao SEQ ID NO:69 i/ili laki lanac sa najmanje 85% identičnosti sekvence, ili najmanje 90% identičnosti sekvence, ili najmanje 95% identičnosti sekvence, ili najmanje 97%, 98% ili 99% identičnosti sekvence, sa aminokiselinskom sekvencom prikazanu kao SEQ ID NO:70.

[0177] U primerima izvođenja u kojima su lanci antitela definisani određenim procentom identičnosti sekvence sa referentnom sekvencom, teški lanac i/ili laki lanac mogu da zadrže identične CDR sekvence onima koje su prisutne u referentnoj sekvenci, tako da je varijacija prisutna samo izvan CDR regiona.

Unakrsno kompetitivna antitela

[0178] Takođe su opisana (monoklonska) antitela ili njihovi antigen-vezujući fragmenti koji "unakrsno kompetiraju" sa antitelima ili antigen-vezujućim fragmentima koji su ovde otkriveni.

[0179] Konkretno, ovde su opisana antitela ili njihovi antigen-vezujući fragmenti, koji se vezuju za receptor citokina IL-22R i unakrsno kompetiraju sa antitelima ili njihovim antigen-vezujućim fragmentima, koji sadrže kombinaciju CDR3 varijabilnog teškog lanca (HCDR3), CDR2 varijabilnog teškog lanca (HCDR2) i CDR1 varijabilnog teškog lanca (HCDR1), CDR3 varijabilnog lakog lanca (LCDR3), CDR2 varijabilnog lakog lanca (LCDR2) i CDR1 varijabilnog lakog lanca (LCDR1) pri čemu je kombinacija izabrana iz grupe koja se sastoji od:

(i) HCDR3 koji sadrži SEQ ID NO: 43; HCDR2 koji sadrži SEQ ID NO: 41; HCDR1 koji sadrži SEQ ID NO: 9; LCDR3 koji sadrži SEQ ID NO: 27; LCDR2 koji sadrži SEQ ID NO: 59; LCDR1 koji sadrži SEQ ID NO: 57; i

(ii) HCDR3 koji sadrži SEQ ID NO: 13; HCDR2 koji sadrži SEQ ID NO: 11; HCDR1 koji sadrži SEQ ID NO: 9; LCDR3 koji sadrži SEQ ID NO: 27; LCDR2 koji sadrži SEQ ID NO: 25; LCDR1 koji sadrži SEQ ID NO: 23.

[0180] U određenim primerima, ovde su opisana antitela ili njihovi antigen-vezujući fragmenti, koji se vezuju za receptor citokina IL-22R i unakrsno kompetiraju sa antitelima ili njihovim antigen-vezujućim fragmentima koji sadrže najmanje jedan varijabilni domen teškog lanca (VH) i najmanje jedan varijabilni domen lakog lanca (VL) pri čemu VH domen sadrži:

2

a VL domen sadrži:

[0181] Unakrsno kompetitivna antitela ili njihovi antigen-vezujući fragmenti mogu da kompetiraju sa antitelima ili antigen-vezujućim fragmentima koji imaju VH domen koji sadrži ili se sastoji od sekvence SEQ ID NO:65 i/ili VL domen koji sadrži ili se sastoji od sekvence SEQ ID NO:66. Antitela koja unakrsno kompetiraju ili njihovi antigen-vezujući fragmenti mogu da kompetiraju sa antitelima koja imaju teški lanac imunoglobulina pune dužine koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 69 i/ili laki lanac imunoglobulina pune dužine koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 70.

[0182] Unakrsno kompetitivna antitela su ona koja vezuju IL-22R na jednom ili više mesta koja se preklapaju ili su identična mestu/mestima za koje se vezuju predmetna anti-IL-22R antitela. Kompetitivna (monoklonska) antitela ili njihovi antigen-vezujući fragmenti mogu da se identifikuju, na primer, pomoću testa kompeticije antitela. Na primer, IL-22R antigen ili njegov fragment može da bude vezan za čvrstu podlogu. Zatim se dodaju antitelo ili njegov antigenvezujući fragment prema predmetnom pronalasku i monoklonsko antitelo ili njegov antigenvezujući fragment za koji se predpostavlja da može da kompetira sa antitelom prema ovom pronalasku. Jedan od dva molekula je obeležen. Ako se obeleženo jedinjenje i neobeleženo jedinjenje vezuju za odvojena i posebna mesta na antigenu IL-22R, obeleženo jedinjenje će se vezati na istom nivou bez obzira da li je prisutno ili ne jedinjenje za koje se predpostavlja da je kompetitivno. Međutim, ako su mesta interakcije identična (ili se preklapaju), neobeleženo jedinjenje će kompetirati, i količina obeleženog jedinjenja vezanog za antigen će biti smanjena. Ako je neobeleženo jedinjenje prisutno u višku, vrlo malo, ili nimalo, obeleženog jedinjenja će se vezati. U svrhu ovog pronalaska, kompetitivna monoklonska antitela ili njihovi antigen-vezujući fragmenti su ona koja smanjuju vezivanje predmetnih antitela za IL-22R za oko 50%, oko 60%, oko 70%, oko 80%, oko 85%, oko 90%, oko 95% ili oko 99%. Detalji procedura za izvođenje takvih testova kompeticije su dobro poznati u tehnici i mogu se naći, na primer, u Harlow and Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, pp.567-569, ISBN 0-87969-314-2. Takvi testovi mogu da budu kvantitativni ako se upotrebe prečišćena antitela. Standardna kriva se uspostavlja titriranjem jednog antitela prema samom sebi, tj. isto antitelo se koristi i kao obeleženo antitelo i kao kompetitor. Kapacitet neobeleženog kompetitivnog monoklonskog antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta da inhibira vezivanje obeleženog molekula za ploču se titrira. Rezultati se grafički prikazuju i upoređuju se koncentracije neophodne za postizanje željenog stepena inhibicije vezivanja.

Polinukleotidi koji kodiraju anti-IL-22R antitela

[0183] Pronalazak takođe obezbeđuje molekule polinukleotida koji kodiraju anti-IL-22R antitela pronalaska ili njihove fragmente, kao i ekspresione vektore koji sadrže pomenute nukleotidne sekvence prema pronalasku funkcionalno povezane sa regulatornim sekvencama koje dozvoljavaju ekspresiju antitela ili njihovih fragmenata u ćeliji-domaćinu ili besćelijskom ekspresionom sistemu, i ćeliju-domaćina ili besćelijski ekspresioni sistem koji sadrži ovaj ekspresioni vektor.

[0184] U konkretnim primerima koji su ovde opisani, polinukleotid koji kodira anti-IL-22R antitelo može da sadrži jednu ili više polinukleotidnih sekvenci prikazanih kao SEQ ID NO: 52, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80 ili 81, koje kodiraju VH ili VL domene anti-IL-22R antitela.

[0185] U određenim primerima koji su ovde opisani, polinukleotid koji kodira anti-IL-22R antitelo može da sadrži varijantnu sekvencu koja kodira funkcionalni VH ili VL domen anti-IL-22R antitela, pri čemu pomenuta varijantna sekvenca pokazuje najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 97% ili 99% identičnost sekvence kada je optimalno poravnata sa bilo kojom od SEQ ID NO: 52, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80 ili 81.

[0186] U ovom kontekstu, procenat identičnosti sekvence između dve polinukleotidne sekvence može da se odredi upoređivanjem ove dve sekvence poravnate na optimalan način i gde polinukleotidna sekvenca koja se poredi može da sadrži adicije ili delecije u odnosu na referentnu sekvencu za optimalno poravnanje ove dve sekvence. Procenat identičnosti se izračunava određivanjem broja identičnih pozicija za koje je nukleotidni ostatak identičan za obe sekvence, deljenjem ovog broja identičnih pozicija sa ukupnim brojem pozicija u prozoru za poređenje i množenjem dobijenog rezultata sa 100, kako bi se dobio procenat identičnosti ove dve sekvence.

4

Na primer, moguće je koristiti program BLAST, "BLAST 2 sequences" (Tatusova et al, "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol Lett.

174:247-250) dostupan na sajtu http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ gorf/bl2.html, pri čemu su korišćeni podrazumevani parametri (posebno za parametre "kazna za otvorenu prazninu": 5 i "kazna za dužinu praznine": 2; izabrana matrica je, na primer, matrica "BLOSUM 62" koju je predložio program), a program direktno izračunava procenat identičnosti dve sekvence koje treba uporediti.

[0187] U određenim primerima koji su ovde opisani, varijabilni domen teškog lanca i varijabilni domen lakog lanca anti-IL-22R antitela ili antigen-vezujućih fragmenata kodirani su kombinacijom prve i druge polinukleotidne sekvence, pri čemu se prva i druga polinukleotidna sekvenca biraju od sledećih parova:

(i) prvi polinukleotid koji kodira varijabilni domen teškog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 52 i drugi polinukleotid koji kodira varijabilni domen lakog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 73; (ii) prvi polinukleotid koji kodira varijabilni domen teškog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 74 i drugi polinukleotid koji kodira varijabilni domen lakog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 75; (iii) prvi polinukleotid koji kodira varijabilni domen teškog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 76 i drugi polinukleotid koji kodira varijabilni domen lakog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 77;

(iv) prvi polinukleotid koji kodira varijabilni domen teškog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 78 i drugi polinukleotid koji kodira varijabilni domen lakog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 79; ili

(v) prvi polinukleotid koji kodira varijabilni domen teškog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 80 i drugi polinukleotid koji kodira varijabilni domen lakog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 81.

[0188] Molekuli polinukleotida koji kodiraju antitela pronalaska uključuju, na primer, rekombinantne molekule DNK. Termini "nukleinska kiselina", "polinukleotid" ili "polinukleotidni molekul" ovde se koriste kao sinonimi i odnose se na bilo koji molekul DNK ili RNK, bilo jednolančani ili dvolančani i, ako je jednolančani, molekul njegove komplementarne sekvence. U diskusiji o molekulima nukleinske kiseline, sekvenca ili struktura određenog molekula nukleinske kiseline u ovom dokumentu može da bude opisana u skladu sa uobičajenom konvencijom prikazivanja sekvence u smeru od 5' ka 3'. U nekim primerima izvođenja pronalaska, nukleinske kiseline ili polinukleotidi su "izolovani". Ovaj termin, kada se primenjuje na molekul nukleinske kiseline, odnosi se na molekul nukleinske kiseline koji je odvojen od sekvenci sa kojima se neposredno graniči u prirodnom genomu organizma iz koga potiče. Na primer, "izolovana nukleinska kiselina" može da sadrži molekul DNK ubačen u vektor, kao što je plazmid ili virusni vektor, ili integrisan u genomsku DNK prokariotske ili eukariotske ćelije ili ne-humanog organizma-domaćina. Kada se primenjuje na RNK, termin "izolovani polinukleotid" se prvenstveno odnosi na molekul RNK koji je kodiran izolovanim molekulom DNK kao što je gore definisano. Alternativno, termin može da se odnosi na molekul RNK koji je prečišćen/odvojen od drugih nukleinskih kiselina sa kojima bi bio povezan u svom prirodnom stanju (tj. u ćelijama ili tkivima). Izolovani polinukleotid (bilo DNK ili RNK) može dalje da predstavlja molekul proizveden direktno biološkim ili sintetičkim sredstvima i odvojen od drugih komponenti prisutnih tokom njegove proizvodnje.

[0189] Za rekombinantnu proizvodnju antitela prema pronalasku, rekombinantni polinukleotid koji ga kodira može da se pripremi (upotrebom standardnih tehnika molekularne biologije) i ubaci u vektor koji može da se replikuje za ekspresiju u izabranoj ćeliji-domaćinu, ili u besćelijskom ekspresionom sistemu. Pogodne ćelije-domaćini mogu da budu ćelije prokariota, kvasca ili viših eukariota, posebno ćelije sisara. Primeri korisnih sisarskih linija ćelija-domaćina su CV1 linija bubrega majmuna transformisana virusom SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); humana embrionalna linija bubrega (293 ili 293 ćelije subklonirane za rast u suspenzionoj kulturi, Graham et al., J. Gen. Virol.36:59 (1977)); ćelije bubrega bebe hrčka (BHK, ATCC CCL 10); ćelije jajnika kineskog hrčka/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); mišje sertolijeve ćelije (TM4, Mather, Biol. Reprod.23:243-251 (1980)); ćelije mijeloma miša SP2/0-AG14 (ATCC CRL 1581; ATCC CRL 8287) ili NS0 (kolekcije HPA kultura br.85110503); ćelije bubrega majmuna (CV1 ATCC CCL 70); ćelije bubrega afričkog zelenog majmuna (VERO-76, ATCC CRL-1587); ćelije humanog karcinoma grlića materice (HELA, ATCC CCL 2); ćelije psećeg bubrega (MDCK, ATCC CCL 34); ćelije jetre pacova linije buffalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); ćelije humanih pluća (W138, ATCC CCL 75); ćelije humane jetre (Hep G2, HB 8065); tumor mlečne žlezde miša (MMT 060562, ATCC CCL51); ćelije TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci.383:44-68 (1982)); ćelije MRC 5; ćelije FS4; i linija humanog hepatoma (Hep G2), kao i DSM ćelijska linija PERC-6. Ekspresioni vektori pogodni za upotrebu u svakoj od ovih ćelijadomaćina su takođe opšte poznati u tehnici.

[0190] Treba napomenuti da se izraz "ćelija-domaćin" uopšteno odnosi na kultivisanu ćelijsku liniju. Ljudska bića u koje je uveden ekspresioni vektor koji kodira antigen-vezujući polipeptid prema pronalasku su eksplicitno isključena iz definicije "ćelija-domaćin".

Proizvodnja antitela

[0191] U jednom važnom aspektu, pronalazak takođe obezbeđuje postupak za proizvodnju antitela pronalaska koji obuhvata kultivisanje ćelije-domaćina (ili besćelijskog ekspresionog sistema) koja sadrži polinukleotid (npr. ekspresioni vektor) koji kodira antitelo pod uslovima koji dozvoljavaju ekspresiju antitela, i izdvajanje eksprimiranog antitela. Ovaj postupak rekombinantne ekspresije može da se koristi za proizvodnju antitela velikog obima, uključujući anti-IL-22R antitela prema pronalasku, uključujući monoklonska antitela namenjena za terapijsku upotrebu kod ljudi. Pogodni vektori, ćelijske linije i proizvodni postupci za proizvodnju velikog obima rekombinantnih antitela pogodnih za in vivo terapijsku upotrebu su generalno dostupni u tehnici i biće dobro poznati stručnjaku u datoj oblasti.

Terapijska upotreba anti-IL-22R antitela

[0192] Anti-IL-22R antitela koja su ovde data mogu da se koriste kao lekovi, posebno za upotrebu u lečenju ili profilaksi poremećaja u kojima se patologija može pripisati nepravilno regulisanoj signalizaciji preko kompleksa IL-22R na površini ćelije. Takva nepravilno regulisana signalizacija može da bude povezana sa prekomernom ekspresijom ili prekomernom proizvodnjom bilo kog od citokina IL-22, IL-20 i/ili IL-24.

[0193] Termin "lečenje" ili "tretman" označava usporavanje, narušavanje, prekidanje, kontrolu, zaustavljanje, smanjenje težine simptoma, poremećaja, stanja ili bolesti, ali ne uključuje nužno potpunu eliminaciju svih simptoma povezanih sa bolešću, stanja ili poremećaja. Termin "profilaksa" označava sprečavanje početka poremećaja, stanja ili bolesti ili sprečavanje pojave simptoma povezanih sa poremećajem, stanjem ili bolešću.

[0194] Ligandi koji prenose signale preko IL-22R su uključeni u brojne bolesti, i budući da je IL-22R selektivno eksprimiran na koži i epitelnim ćelijama, ključne bolesti su one koje utiču na kožu i epitel, uključujući, ali bez ograničenja psorijazu, psorijazni artritis i atopijski dermatitis. Visoki nivoi IL-22 su nađeni u humanim psorijaznim plakovima (Boniface et al., Clin Exp Immunol.150: 407-415 (2007)) i učešće ovog citokina u patogenezi psorijaze je eksperimentalno demonstrirano na mišjim modelima inflamacije kože (Ma et al., J Clin Invest.118: 597-607 (2008); Van Belle et al. J Immunol. Jan 1; 188(1):462-9 (2012)).

[0195] Ovde su obezbeđena antitela ili antigeni ovog pronalaska za upotrebu u lečenju ili profilaksi psorijaze, psorijaznog artritisa ili atopijskog dermatitisa. U određenim primerima, ovde su opisani postupci za lečenje inflamatornih oboljenja kože. U određenim primerima, ovde su opisani postupci za lečenje inflamatornih oboljenja kože odabranih od psorijaze, psorijaznog artritisa, kontaktnog dermatitisa ili atopijskog dermatitisa kod ljudi. Postupci obuhvataju davanje pacijentu kome je to potrebno terapijski efikasne količine bilo kog od anti-IL-22R antitela ili antigenvezujućih fragmenata, kao što je definisano na drugom mestu u ovom dokumentu. Svi primeri anti-IL-22R antitela ili antigen-vezujućih fragmenata, kako je ovde opisano, podjednako su primenljivi na ovde opisane postupke lečenja.

[0196] U određenim primerima, ovde su opisani postupci za lečenje Sjorgenovog sindroma, ili kancera odabranih od hepatokarcinoma, liposarkoma, oralnog karcinoma skvamoznih ćelija, kancera debelog creva i kolorektalnog kancera, kancera pankreasa, sitnoćelijskog i krupnoćelijskog kancera pluća, kancera dojke, glioblastoma, kutanog T-ćelijskog limfoma, anaplastičnog krupnoćelijskog limfoma, limfoma ćelija plašta, kod humanog subjekta koji obuhvataju davanje pacijentu kome je to potrebno terapijski efikasne količine bilo kog od anti-IL-22R antitela ili antigen-vezujućih fragmenata kao što je definisano na drugom mestu u ovom dokumentu. Svi primeri anti-IL-22R antitela ili antigen-vezujućih fragmenata, kako je ovde opisano, podjednako su primenljivi na ovde opisane postupke lečenja.

[0197] Za terapijsku upotrebu kod ljudi, ovde opisana anti-IL-22R antitela mogu da se daju humanom subjektu kome je potrebno lečenje u "efikasnoj količini". Izraz "efikasna količina" se odnosi na količinu ili dozu anti-IL-22R antitela koja, nakon jednokratne ili višekratne primene doze kod humanog pacijenta, obezbeđuje terapijsku efikasnost u lečenju bolesti. Terapijski efikasne količine anti-IL-22R antitela mogu da obuhvataju količinu u opsegu od oko 0.1 mg/kg do oko 20 mg/kg po jednoj dozi. Količina antitela koja se primenjuje u bilo kom vremenskom trenutku može da varira tako da se tokom lečenja primene optimalne količine anti-IL-22R antitela, bilo da se koriste samostalno ili u kombinaciji sa bilo kojim drugim terapijskim agensom.

[0198] Takođe je obuhvaćena primena ovde opisanih anti-IL-22R antitela ili farmaceutskih kompozicija koje sadrže takva antitela, u kombinaciji sa bilo kojim drugim pogodnim tretmanom za bolesti koje su identifikovane gore u tekstu, kao kombinovane terapije.

Farmaceutske kompozicije

[0199] Obim pronalaska obuhvata farmaceutske kompozicije, koje sadrže jedno ili kombinaciju anti-IL-22R antitela pronalaska, ili njihove antigen-vezujuće fragmente, formulisane sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih nosača ili ekscipijenasa. Takve kompozicije mogu da uključuju jedno ili kombinaciju (npr. dva ili više različitih) anti-IL-22R antitela. Tehnike formulisanja monoklonskih antitela za humanu terapijsku upotrebu su dobro poznate u tehnici i njihov pregled je dat, na primer, u Wang et al., Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol.96, pp.1-26, 2007.

[0200] U određenim primerima izvođenja, farmaceutske kompozicije su formulisane za davanje subjektu bilo kojim pogodnim putem davanja uključujući, ali bez ograničenja, intramuskularnu, intravensku, intradermalnu, intraperitonealnu injekciju, subkutanu, epiduralnu, nazalnu, oralnu, rektalnu, topikalnu, inhalacionu, bukalnu (npr. sublingvalnu) i transdermalnu primenu. U poželjnim primerima izvođenja, kompozicija je formulisana za subkutanu primenu.

PRIMERI

[0201] Pronalazak će biti bolje shvaćen kada se imaju u vidu sledeći neograničavajući primeri.

Primer 1 Imunizacija lame

[0202] Dve lame su imunizovane mešavinom rekombinantnog humanog proteina IL22R (R&D systems) i humanog Fn14-Fc prema rasporedu imunizacije prikazanom u tabeli 5 ispod. Posle šest nedeljnih injekcija rekombinantnih proteina, sakupljena je krv i serumi imunizovanih lama su korišćeni za merenje humoralnog imunskog odgovora protiv IL22R detekcijom prisustva antitela protiv imunizacionog antigena pre imunizacije i posle imunizacije. Obe lame su proizvele značajan i specifičan imunski odgovor protiv IL22R.

Tabela 5 Raspored imunizacije za svaku lamu

Primer 2 Konstruisanje i selekcija biblioteka

[0203] Posle imunizacije, PBMC su sakupljeni i RNK je ekstrahovana. Urađena je cDNK sinteza sa nasumičnim prajmerima i segmenti gena VHCH1 lame, VλCλ i VκCκ su amplifikovani PCR metodom. Za PCR amplifikaciju lakih lanaca su korišćena dva pristupa. Prvi pristup je koristio primarnu PCR amplifikaciju sa prajmerima bez linkera sa restrikcionim mestima, nakon čega je usledila PCR amplifikacija sa prajmerima označenim restrikcionim mestima (ApaLI i AscI). Kod drugog pristupa, označeni prajmeri su korišćeni za direktnu amplifikaciju cDNK. Biblioteke VHCH1 su napravljene korišćenjem dvostepene PCR metode, u kojoj je sprovedeno 25 ciklusa sa neoznačenim prajmerima, a zatim 10 ciklusa korišćenjem označenih verzija ovih prajmera (koji sadrže restrikciona mesta SfiI i NotI) (videti WO2010/001251).

[0204] PCR-amplifikovani laki lanci su podvrgnuti digestiji delovanjem ApaLI i AscI, dok su PCR-amplifikovani teški lanci podvrgnuti digestiji delovanjem SfiI i NotI, i kombinovani u Fab biblioteku kloniranjem inserta biblioteke lakog lanca u pCB3 vektor biblioteke teškog lanca upotrebom restriktivnih mesta ApaLI i AscI. Utvrđeno je da konačne biblioteke Fab imaju potrebnu raznolikost od >10<9>različitih klonova).

[0205] Nakon konstruisanja biblioteke proizvedeni su fagi i selekcija prikaza na fagu je obavljena na humanom IL22R (Biotechne, 2770-LR). Za selekciju IL22R-specifičnih klonova, humani IL22R je (i) upotrebljen za direktno oblaganje ploče MaxiSorp™ (Nunc); ili (ii) pričvršćen pomoću nekompetitivnog antitela protiv humanog IL22R (MAB2770, R&D systems); ili (iii) pričvršćen pomoću neutravidina nakon biotinilacije. Oblaganje i pričvršćivanje IL22R je obično obavljano u dve različite koncentracije; na primer 5 µg/ml i 0.1 µg/ml.

[0206] Posle prvog kruga selekcije nije primećeno jasno obogaćivanje, ali posle drugog i trećeg kruga, primećeno je dozno-zavisno obogaćivanje u svim bibliotekama; do 100 puta nakon drugog kruga i 10 000 puta nakon trećeg kruga. Utvrđeno je da su obogaćivanja na IL22R pričvršćenom pomoću antitela veća, u odnosu na to kada je ploča direktno obložena sa IL22R. Ovo bi moglo biti zbog činjenice da IL22R ima samo 25 kDa i da direktno oblaganje utiče na njegovu konformaciju ili ograničava dostupnost epitopa. Zbog toga je urađena treća kampanja selekcije korišćenjem biotinilisanog hIL22R.

[0207] Pored gore opisanih selekcija, izvedena su dva dodatna kruga selekcije na biotinilisanom rekombinantnom mišjem IL22R nakon prvog kruga selekcije na humanom IL-22R pričvršćenom pomoću MAB2770. Ova selekcija je urađena da bi se identifikovao Fab koji je unakrsno reaktivan sa mišjim IL22R. Kao pozitivna kontrola za selekcije, paralelno je sprovedena selekcija na humanom IL-22R-biotinu pričvršćenom pomoću neutravidina. Ukupno gledajući, postupak selekcije je bio veoma uspešan sa uočenim značajnim obogaćivanjem za Fab koji se vezuju za IL22R.

Primer 3 Skrining za Fab specifične za IL22R

[0208] Nakon uspešne selekcije pomoću prikaza na fagu, ispitivana je sposobnost Fab prisutnih u periplazmi da blokiraju vezivanje IL-22 za IL22R. Pored toga, sproveden je skrining da bi se identifikovalo vezivanje klona za mišji IL22R1. Razvijen je novi pristup zasnovan na rezonanciji površinskog plazmona (SPR), koji je omogućio ispitivanje u jednom skriningu kompeticije za ligand, afiniteta za humani IL22R i unakrsne reaktivnosti sa mišjim IL22R.

[0209] Različiti kanali Biacore čipa (CM5) su obloženi:

1. Ničim (blank)

2. IL-22 (3000RU) za ispitivanje kompetitivne aktivnosti Fab (kada se IL22R istovremeno ubrizgava)

3. Humanim IL22R (3000RU) za ispitivanje vezivanja za ciljni molekul

4. Mišjim IL22R (2500RU) za ispitivanje unakrsne reaktivnosti

[0210] Da bi se ispitala kompeticija za ligand, niska koncentracija rastvorljivog IL22R1 (0.2 µg/ml) je prethodno pomešana sa periplazmatskim ekstraktima pre ubrizgavanja. Na ovaj način je takođe bilo moguće meriti sposobnost Fab da blokira interakciju ligand-receptor na kanalu 2. Dobijeni periplazmatski ekstrakti su podvrgnuti skriningu za vezivanje za humani IL22R (kanal 3) i mišji IL22R (kanal 4).

[0211] Prednost ove metode u poređenju sa konvencionalnim ELISA testom (vezujućim ili kompetitivnim) je u tome što se nekoliko karakteristika Fab ispituje u isto vreme: 1) vezivanje za ciljni humani IL-22R; 2) kompetitivna aktivnost; i 3) unakrsna reaktivnost. Osim toga, veličina konstanti brzine disocijacije snažno ukazuje na afinitet ispitivanih Fab.

[0212] Upotrebom ovog alternativnog postupka skrininga, Fab sa svim mogućim karakteristikama su identifikovani i raspoređeni u kategorije na osnovu konstante brzine disocijacije:

● Kompetitivni ili nekompetitivni

● Unakrsno reaktivni i oni koji nisu unakrsno reaktivni

● Kompetitivni i unakrsno reaktivni

● Nekompetitivni i unakrsno reaktivni

[0213] Različiti klonovi su zatim prosleđeni na sekvenciranje.

Primer 4 Analiza sekvence IL-22R Fab

[0214] Klonovi identifikovani Biacore analizom (npr. kompeticija za ligand, maksimalno vezivanje, niska konstanta brzine disocijacije ili unakrsna reaktivnost sa mišjim proteinom) su sekvencirani. Klonovi su zatim grupisani na osnovu identičnosti njihovih CDR3 da bi se formirale porodice VH.

[0215] Ukupno je identifikovano 67 različitih VH koji se mogu svrstati u 13 različitih porodica VH. Identifikovano je mnogo više porodica lakih lanaca (više od 80 sekvenci Vlambda i Vkapa). Velika raznolikost u sekvenci i funkciji Fab pokazuje da su imunizacija i selekcija bile veoma uspešne.

[0216] Aminokiselinske sekvence VH i VL domena klonova od posebnog interesa su prikazane u tabelama 6-8 ispod, a polinukleotidne sekvence ovih klonova su prikazane u tabeli 9.

1

b

Fa

b R Fa -22

RIL -22 enaIL om nce gdve o kiln esebrij<a>tidn ova

klece

<n>uven

oli ek

S9P8

a ela elabab T T

Primer 5 Karakterizacija Fab

[0217] Klonovi sa najboljim konstantama brzine disocijacije su ponovo klonirani u pCB4, eksprimirani i prečišćeni pomoću IMAC (Talon kompanije Clonentech). Ovi klonovi su ponovo testirani upotrebom Biacore. Rezultati dalje karakterizacije Fab su prikazani u tabeli 10 ispod.

Tabela 10 Karakterizacija Fab koji se vezuju za IL-22R

4

[0218] U zavisnosti od raznolikosti u porodici VH, kompetitivne aktivnosti i afiniteta (merenih korišćenjem koffdobijene upotrebom Biacore), jedan ili nekoliko klonova iz svake porodice su odabrani i preformatirani u monoklonska antitela (mAb) za dalju karakterizaciju.

Primer 6 Karakterizacija mAb koja vezuju IL-22R

[0219] Kao što je gore navedeno, selektivni klonovi svake porodice VH su proizvedeni kao IgG1. Posle ponovnog kloniranja varijabilnih regiona HC i LC u odvojene ekspresione vektore pUPE koji sadrže humane konstantne domene, HEK293E su prolazno transfektovane pomoću dva plazmida, jednog koji kodira ceo teški lanac, i drugog koji kodira laki lanac. Transfektovane ćelije su ostavljene da eksprimiraju antitela tokom 6-dnevnog perioda kultivacije ćelija. Nakon prečišćavanja antitela iz supernatanta ćelijske kulture korišćenjem perlica sa proteinom A, ispitana je sposobnost prečišćenih antitela da neutrališu signalizaciju humanog i mišjeg IL22R korišćenjem različitih ćelijskih linija, kao što je opisano u nastavku.

- Ćelijska linija BW-hIL22R: potiče iz ćelijske linije BW i ima stabilnu ekspresiju humanog IL22R što dovodi do zaustavljanja rasta zavisnog od IL22. Stoga će ćelije proliferisati samo kada je interakcija IL22-IL22R blokirana. Snažno antitelo će promovisati proliferaciju pri niskoj koncentraciji antitela. Proliferacija se meri ugradnjom timidina.

- Ćelijska linija Baf3-mIL22R: potiče iz ćelijske linije Baf3 i ima stabilnu ekspresiju mišjeg IL22R što dovodi do proliferacije zavisne od IL22. Antitelo koje neutrališe mIL22R blokiraće proliferaciju na način koji zavisi od koncentracije antitela.

- Ćelijska linija Baf3-hIL22R/IL20Rb: potiče iz ćelijske linije Baf3, ali ko-eksprimira hIL22R sa hIL20Rbeta omogućavajući ćelijama da proliferišu u prisustvu IL20. Antitelo koje neutrališe hIL22R blokiraće proliferaciju ćelija stimulisanih sa IL20.

[0220] Rezultati ispitivanja različitih mAb protiv IL22R na ćelijskoj liniji BW-hIL22R i ćelijskoj liniji Baf3-hIL22R/IL20Rb prikazani su na slici 4 i u tabeli 11. Na slici 4A, mogu da se vide efekti antitela koja neutrališu IL22R u obnavljanju proliferacije ćelijske linije BW-hIL22R. Na slici 4B mogu da se vide efekti antitela koja neutrališu IL22R na inhibiciju IL-20 proliferacije ćelijske linije koja eksprimira IL-22R. Anti-IL22R antitelo opisano u WO2011/061119 (280.346.TSY) uključeno je u eksperimente kao standardno ili referentno anti-IL-22R antitelo.

[0221] Pored ocene aktivnosti na ćelijama, merene su in vitro kinetika vezivanja i aktivnost blokiranja prečišćenih antitela u analizi Biacore (3000). Za merenje afiniteta, Biacore čip CM5 je obložen rekombinantnim IL22R pri 200 RU korišćenjem standardnog protokola za oblaganje (IL22R se ubrizgava u koncentraciji od 10 µg/ml u acetatnom puferu pH 4.5). Antitela testirana u opsegu koncentracija i pripremljena u HBSEP puferu na pH 7.4 (Biacore) su ubrizgavana pri 30 µl/min tokom 60 sekundi i ispirana HBSEP puferom na pH 7.4 (Biacore) tokom 10-20 minuta. Dobijeni senzogrami su analizirani softverom BIAevaluation i kinetika je određena primenom standardnog prilagođavanja krivoj (Langmir 1:1 sa prenosom mase).

[0222] Za ocenu aktivnosti blokiranja korišćenjem analize Biacore 3000, čip CM5 je obložen rekombinantnim IL22 (RnD System) pri 2000 RU. Antigen-vezujući domeni (prečišćeni IgG, prečišćeni Fab ili periplazmatski ekstrakt koji sadrži Fab) su prethodno inkubirani sa rekombinantnim humanim IL22R (koncentracija između 0.2 i 1 µg) pre ubrizgavanja u kanal obložen hIL22. Detekcija vezivanja (IL22R:IL22) je ukazala na to da antigen-vezujući domen nije kompetirao, dok je izostanak detektovanog vezivanja (IL22R:IL22) ukazao na to da je antigenvezujući domen blokirao interakciju IL22:IL22R in vitro. Rezultati analize Biacore i testova proliferacije sumirani su u tabeli 11 ispod.

Tabela 11 Sažetak karakteristika panela anti-hIL22R antitela

[0223] Anti-IL22R antitela 157A2 i 166G8 ispoljavaju jačinu na pikomolarnom nivou.

Primer 7 Unakrsna reaktivnost mAb na IL-22R među vrstama

[0224] Ispitivana je unakrsnu reaktivnost među vrstama mAb na IL22R protiv mišjeg IL-22R i IL-22R nehumanih primata.

[0225] cDNK za IL22R cinomolgusa nije bila dostupna i morala je da se ekstrahuje iz biblioteka cDNK cinomolgusa. Prajmeri su dizajnirani na osnovu javne baze podataka NCBI. Nekoliko sekvenci za ECD cinoIL22R bilo je dostupno iz javnih baza podataka (Genbank, NCBI) i sadržale su insercije, delecije, ili oboje (videti sliku 5). Neizvesnost u pogledu prave sekvence IL22R cinomolgusa opravdala je kloniranje iz cDNK cinomolgusa.

[0226] ECD IL22R cinomolgusa je amplifikovan PCR metodom iz biblioteke cDNK i kloniran u okviru čitanja nishodno od signalnog peptida IgGkapa i ushodno od humanog Fc u pUPE vektoru. Iako je korišćena cDNK poreklom od cinomolgusa, sekvenciranje nekoliko klonova je pokazalo da je IL22R rezus majmuna takođe kloniran. ECD IL22R rezus majmuna je okarakterisan odsustvom delecije i insercije koje se javljaju kod cinomolgusa (uokvireno na slici 5) i na osnovu razlike u 2 aminokiseline između IL22R rezusa i cinomolgusa (podebljano na slici 5).

[0227] Nakon proizvodnje i prečišćavanja cyIL22R-Fc i rhIL22R-Fc, specifičnost vezivanja za ECD IL22R cinomolgusa, rezusa i miša svih antitela iz primarne selekcije je ispitana ELISA testom i SPR metodom (Biacore). Monomerni mišji IL22R je nabavljen od R&D Systems (kat. br.

4248-MR). Rezultati su sumirani u tabeli 12.

Tabela 12 Unakrsna reaktivnost mAb na IL-22R među vrstama

Primer 8 Mapiranje epitopa

[0228] Dve metode su korišćene za identifikaciju i poređenje epitopa vezanih za mAb na IL22R: kompetitivna ELISA i FACS.

8.1 Mapiranje epitopa upotrebom kompetitivnog ELISA testa

[0229] Epitopi koje su prepoznala antitela su upoređeni jedan sa drugim kompetitivnim ELISA testom. Najmanje jedan predstavnik mAb svake porodice VH je upotrebljen za oblaganje ploče Maxisorp. Nakon toga, biotinilisani humani IL22R je dodat u prisustvu velikog viška mAb koja se ispituju. Vezivanje biotinilisanog IL22R za obloženo antitelo detektovano je korišćenjem HRP-konjugovanog streptavidina. Izostanak detektovanja biotinilisanog IL22R znači da je rastvorljivo mAb sprečilo vezivanje za obloženo mAb, čime se potvrđuje da se oba mAb vezuju za isti epitop, ili da imaju epitop koji se preklapa. Mapiranje epitopa je dalje precizirano korišćenjem Fab umesto mAb. Manji Fab fragment omogućava izvesno razlikovanje veoma bliskih epitopa.

[0230] Različiti epitopi su identifikovani za antitela porodica VH 1-8, 10, 11, 19 i 22. Mapiranje epitopa pokazuje veoma široku pokrivenost epitopa za tako mali protein (25 kDa). Kao što je prikazano na slici 6, epitopi su grupisani prema tome da li su antitela (i) blokirala vezivanje IL-22 in vitro i neutralisala IL-22 signalizaciju u testu na ćelijama (donji levi kvadrant); (ii) blokirala vezivanje IL-22 in vitro, ali nisu imala neutrališuću aktivnost (gornji desni kvadrant); ili (iii) nisu blokirala vezivanje IL-22 in vitro, ali su imala neutrališuću aktivnost u testu na ćelijama (donji desni kvadrant). Utvrđeno je da je šest epitopa koji se preklapaju, ali mogu da se razlikuju, blokirajuće i neutrališuće (vidi donji levi kvadrant) i od ovih šest epitopa, dva (mAb iz porodice 4 i 22) su preklapala sa standardnim antitelom (280.346.TSY, videti prijavu za patent WO2011/061119). Epitop nije bio identičan onom kod standarda, budući da su ova mAb (iz porodice 4 i 22) bila u stanju da kompetiraju i sa svim mAb iz porodica 1, 5, 6 i 7, iako nisu bila u stanju da kompetiraju sa standardnim antitelom. Uzeti zajedno, ovi podaci sugerišu 2 različite grupe epitopa, jednu koju formira standardno antitelo i jednu koju formiraju mAb iz porodica 1,5,6 i 7 i treću grupu (mAbs iz porodice 4 i 22) koja se preklapa sa obe grupe (slika 6 ).

[0231] Kao što je prikazano u gornjem desnom kvadrantu slike 6, identifikovana su 3 antitela koja se vezuju za IL22R, ali ne blokiraju vezivanje IL22, niti neutrališu aktivnost in vivo. Ova antitela verovatno vezuju regione IL22R koji nisu uključeni u vezivanje liganda ili aktivaciju signalizacije i mogu da se koriste za samu detekciju. Tri antitela prikazana u donjem desnom kvadrantu slike 6 su neobična po tome što neutrališu aktivnost IL22R in vivo, ali ne blokiraju IL22 in vitro, što sugeriše novi funkcionalni epitop i neočekivani način delovanja.

8.2 Mapiranje epitopa upotrebom FACS analize

[0232] Jones et al. (Structure 16(9): 1333-1344 (2008)) izveštava o strukturi IL-22 vezanog za ekstracelularni domen IL22R1. U ovom radu, autori pokazuju da dva domena IL22R, nazvana D1 i D2, stupaju u interakciju sa ligandom IL-22 na mestu 1A, odnosno mestu 1B (videti sliku 7). Dva ključna ostatka u IL22R-D1 uključena u direktnu interakciju sa mestom 1A u IL22 su lizin 58 (K58) i tirozin 60 (Y60). Triptofan 208 (W208) u IL22R-D2 je direktno uključen u interakciju sa mestom 1B u IL22 (vidi sliku 7).

[0233] Ispitivano je vezivanje anti-IL22R antitela i standardnog antitela (280.346.TSY) za ćelije BW koje prekomerno eksprimiraju različite mutante IL22R. Mutanti IL22R sadrže mutacije aminokiselina za koje se zna da su uključene u interakciju IL-22/IL22R. U ovoj postavci eksperimenta, antitela su biotinilisana, dodata ćelijama i vezivanje antitela za IL22R je detektovano obeleženim streptavidinom pomoću protočne citometrije (FACS). U tabeli 13 su rezimirani dobijeni rezultati.

Tabela 13 Vezivanje antitela za ćelije koje eksprimiraju mutante IL22R

[0234] Rezultati FACS jasno pokazuju da standardno antitelo 280.346.TSY interaguje sa ostacima D1 domena (K58 i Y60). Isto važi i za drugo kontrolno anti-IL-22R antitelo, AMR22, iako epitop nije potpuno isti, budući da mutacija R112A utiče na vezivanje AMR22. Kao što se očekivalo na osnovu mapiranja epitopa ELISA testom koje pokazuje da određena antitela lame ne kompetiraju sa 280.346.TSY, na druga ispitivana antitela nisu uticale mutacije koje utiču na vezivanje 280.346.TSY za IL22R. Ovo je potvrdilo da su antitela usmerena na drugi epitop, koji verovatno uključuje ostatke u D2 domenu. Zaista, mutacija A209D u D2 domenu IL22R poništila je vezivanje 198A1 potvrđujući da se 198A1 i antitelo iz porodice 5 vezuju za D2 domen IL22R (videti sliku 7B).

[0235] Iznenađujuće, mutacija A209D ne utiče na antitelo 166G8, koje ima potpuno isti VH kao 198A1, ali ima drugačiji VL, što sugeriše da je VL uključen u interakciju. Pretpostavlja se da VL u 166G8 dozvoljava veliki ostatak na poziciji 209, za razliku od VL u 198A1. Ova hipoteza je potvrđena njihovom specifičnošću vezivanja za IL22R rezus majmuna. Kod rezus majmuna, IL22R ima serin na poziciji 209. Pošto 166G8 dozvoljava veliku aminokiselinu na toj poziciji, može da veže IL22R rezusa, dok 198A1 nije u stanju da veže rhIL22R, jer ne dozvoljava velike ostatke.

Primer 9 Neutralizacija signalnog puta IL20 i IL24 u testu na ćelijama

[0236] Ispitana je sposobnost anti-IL22R antitela da blokiraju IL-20- i IL-24-zavisnu signalizaciju u ćelijama koje ko-eksprimiraju IL22R i IL20Rb. Postoji mehanička razlika između aktivacije receptora zavisne od IL-22, IL-20 i IL-24. Veruje se da IL-22 indukuje signalizaciju tako što se prvo vezuje za IL22R, pokrećući regrutovanje ko-receptora IL10R2 i aktivaciju trimernog kompleksa. U slučaju IL-20, veruje se da se ovaj citokin prvo vezuje za ko-receptor (IL20R2) pre regrutovanja IL22R i aktivacije trimernog kompleksa. Konačno, u slučaju IL-24, nije jasno kako se kompleks receptora regrutuje i aktivira, niti je jasno gde se IL-24 vezuje.

9.1 Signalni put IL-24

[0237] Nekoliko ćelijskih linija je korišćeno za ispitivanje signalizacije zavisne od IL-24, Baf3-hIL22R/20R2 ili Baf3-mIL22R/20R2. IL-24 je indukovao proliferaciju ovih ćelijskih linija sa značajnim prozorom mereno nivoom heksozaminidaze (očitavanje koje se koristi za brojanje ćelija) u rasponu OD od 0.17 do 1.5 za ćelije Baf3-hIL22R/20Rb i u rasponu od 0.15 do 0.8 za ćelije Baf3-mIL22R/20Rb. Nijedno od ispitivanih antitela nije uticalo na proliferaciju indukovanu IL-24. Ovi rezultati sugerišu da ili IL-24 ima potpuno drugačiji način aktivacije IL22R vezivanjem za mesto koje je veoma različito od IL22 i IL-20, ili da IL22R nije uključen u signalni put IL-24 u ispitivanoj ćelijskoj liniji (i test nije prediktivan za aktivnost neutralizacije).

9.2 Signalni put IL-20

[0238] Ćelijska linija Baf3-hIL22R/IL20Rb potiče iz ćelijske linije Baf3, ali ko-eksprimira hIL22R sa hIL20Rβ omogućavajući ćelijama da proliferišu u prisustvu IL-20. Antitelo koje neutrališe hIL22R blokiraće proliferaciju ćelije stimulisane IL-20. Na slici 8 prikazani su rezultati ispitivanja antitela lame, zajedno sa standardnim antitelima 280.346.TSY i AMR22.

[0239] IL-20-zavisna proliferacija u Baf3-hIL22R/IL20Rb je ispitivana paralelno sa analizom IL-22-zavisne proliferacije BW-hIL22R, što je omogućilo adekvatno poređenje dva citokina. Rezultati do tri nezavisna eksperimenta prikazani su u tabeli 14.

Tabela 14 Jačina antitela u blokiranju signalnog puta IL-22 i IL-20 preko IL22R

1

[0240] Može se zaključiti da su sva antitela iz porodica br.1, br.4 i br.5 bila u stanju da blokiraju i IL-20 i IL-22. Teško je uporediti jačinu proliferacije stimulisane putem IL-22 i IL-20 zbog razlike u osetljivosti, koja zavisi od koncentracije citokina, broja receptora i intracelularne biološke varijacije. Međutim, utvrđeno je da je većina antitela jače blokira signalni put IL-22 u poređenju sa blokiranjem signalnog puta IL-20. Interesantan izuzetak je bilo 157A2, koje ispoljava istu jačinu blokiranja IL-22 i IL-20.

Primer 10 Selekcija vodećih antitela i modifikovanje prema sekvenci klicine linije

[0241] Afinitet najinteresantnijih antitela (koja neutrališu signalni put IL22) je dodatno poboljšan mešanjem lakih lanaca. Tokom mešanja lakih lanaca, VHCH1 odabranog antitela se kombinuje sa bibliotekom lakih lanaca iste lame kod koje je pronađen VHCH. Zatim se izvodi nekoliko ciklusa selekcije upotrebom prikaza na fagima prema konstanti brzine disocijacije da bi se identifikovali parovi VHCH:VLCL koji imaju najbolji afinitet. U slučaju antitela 166G8, pronađeno je nekoliko klonova sa poboljšanom kinetikom vezivanja uključujući 198A1, ali nažalost, ovaj klon je izgubio većinu svoje unakrsne reaktivnosti prema rezus majmunima i stoga je 166G8 ostao najatraktivniji kandidat porodice br.5 za razvoj. U slučaju 157A2 (iz porodice br.4), identifikovano je nekoliko Fab (npr.218A7) sa poboljšanim afinitetom u poređenju sa 157A2. Sledeća antitela su izdvojena za dalji razvoj. Ova antitela su odabrana na osnovu jačine delovanja, unakrsne reaktivnosti među vrstama i epitopa ili načina delovanja.

● 218A7 (poboljšana varijanta 157A2, porodica br. 4) – utvrđeno je da ovo antitelo ima veoma dobru jačinu delovanja na IL-22 i IL-20 (na nivou nižem od nM), unakrsno je reaktivno sa IL22R nehumanih primata, ali nije unakrsno reaktivno sa mišjim IL22R. Utvrđeno je da 157A2 ima epitop na IL22R koji je različit, ali se preklapa sa referentnim antitelom 280.346.TSY.

2

● 166G8 (familija br.5) - utvrđeno je da ovo antitelo ima veliku jačinu delovanja (nisko pM) i ima unakrsnu reaktivnost među nekim vrstama, budući da se vezuje za IL22R rezusa (ali ne i IL22R cinomolgusa, niti miša).

[0242] Karakteristike odabranih anti-IL22R antitela sumirane su u tabeli 15 ispod.

Tabela 15 Karakteristike anti-IL22R antitela lame odabranih za modifikovanje prema sekvenci klicine linije

Primer 11 Modifikovanje anti-IL-22R antitela 218A7 i 166G8 prema sekvenci klicine linije

[0243] Modifikovanje prema sekvenci klicine linije je izvedeno kao što je opisano u Međunarodnoj patentnoj prijavi br. WO2011/080350, čiji je sadržaj inkorporiran ovde u celosti. CDR su mutirani da bi se uklonile potencijalne post-translacione modifikacije zajedno sa određenim drugim pozicijama, za koje je utvrđeno da variraju u antitelima iz istih porodica VH i VL sa identičnim sparivanjem. Izvršena je procena identičnosti VH i VL domena antitela modifikovanih prema sekvenci klicine linije proizvedenih od antitela lame 218A7 i 166G8 sa humanim sekvencama. Takođe je napravljeno poređenje sa standardnim antitelom 280.346.TSY. Rezultati su prikazani u tabeli 16 ispod.

Tabela 16 Identičnost anti-IL-22R antitela modifikovanih prema sekvenci klicine linije

dobijenih iz 218A7 i 166G8 sa humanim sekvencama

4

[0244] Antitelo 230C9 je odabrano kao varijanta antitela 218A7 modifikovana prema sekvenci klicine linije, a antitelo 223G5 je odabrano kao varijanta antitela 166G8 modifikovana prema sekvenci klicine linije. Sekvence VH i VL domena antitela 218A7, 230C9 i 223G5 prikazane su u tabelama 17-21 ispod. (Sekvence 166G8 su prikazane u tabelama 6-9 iznad.)

3G , 220C9, 23A718 2 zaena om gdilno<a>brij va ce ven ek S

9

ela1ab T

3G 229iC

30

za2ca

glankola ica angl o

tešk

nce veek S

20 ela ab T

[0245] Osenčeni delovi sekvence predstavljaju konstantne regione teških i lakih lanaca. "Q" ostatak prikazan podebljanim slovima u konstantnom regionu teškog lanca predstavlja mutaciju iz "N ".

0C

3

, 2

A7

18

2

za

ca

glan

ko

la

i

ca

glan

ško

cete

ven

k

/se

a

en

m dogo5 iln Gb23

2rij<a>

va

ce

ven

sek

ju

dira

ko

je

ko

vence

esek

tidn

eo

kl

<n>u

oli

1P

2

ela

ab

TPrimer 12 Karakterizacija antitela 230C9 i 223G5 modifikovanih prema sekvenci klicine linije

12.1 Afinitet vezivanja mAb modifikovanih prema sekvenci klicine linije

[0246] Afinitet antitela 230C9 i 223G5 je meren korišćenjem SPR (Biacore 300). Ukratko, čip CM5 je obložen sa 250 RU humanog IL22R (Biotechne, 2770-LR) korišćenjem standardnih metoda (EDC kuplovanje IL22R u koncentraciji od 2 µg/ml u acetatnom puferu pH 4.5). Zatim su različite koncentracije antitela u HBSEP+ puferu (pH 7.4) ubrizgavane tokom 2 minuta. Vezivanje je takođe praćeno tokom 10-minutnog ispiranja (HBSEP+).

[0247] Afiniteti izračunati korišćenjem softvera BIAevaluation, prema jednačini Langmira 1:1, prikazani su u tabeli 22 ispod.

Tabela 22 Afinitet vezivanja antitela modifikovanih prema sekvenci klicine linije

[0248] Antitela 223G5 i 224C4 (oba varijante 166G8 modifikovane prema sekvenci klicine linije) pokazala su veoma visok afinitet za IL-22R (10-20 pM), dok je antitelo 230C9 imalo afinitet od 0.13 nM. Sva antitela modifikovana prema sekvenci klicine linije su pokazala veći afinitet od standardnog antitela 280.346.TSY (0.69 nM).

[0249] Zbog potencijalnog efekta aviditeta uočenog kada se dvovalentni molekul koristi kao ligand tokom merenja afiniteta, testirana je obrnuta eksperimentalna postavka. U ovoj postavci, antitela su obložena pri 250 RU korišćenjem standardnih postupaka. Monomerni humani IL22R je dodat u različitim koncentracijama, a afiniteti izračunati korišćenjem softvera BIAevaluation prema jednačini Langmira 1:1 prikazani su u tabeli 23 ispod.

Tabela 23 Afinitet vezivanja 230C9 za humani IL-22R

[0250] Nažalost, antitelo 223G5 je inaktivisano postupkom oblaganja i nikakav afinitet nije mogao da se odredi korišćenjem ove eksperimentalne postavke.

2

[0251] Afinitet 230C9 je konzistentan nezavisno od eksperimentalne postavke za merenje afiniteta, što pokazuje da je oblaganje malom količinom agensa, koje se primenjuje u oba eksperimentalna uslova, dovoljno da smanji bilo kakav efekat aviditeta.

12.2 Inhibicija IL-22- i IL-20-zavisne aktivacije i signalizacije putem IL-22R1

[0252] Ispitivana je sposobnost antitela 218A7 (nisu modifikovana prema sekvenci klicine linije) i 230C9 (ekvivalent modifikovan prema sekvenci klicine linije), zajedno sa drugim antitelima modifikovanim prema sekvenci klicine linije, da neutrališu signalizaciju posredovanu IL-22 i IL-20 preko IL-22R1. Ispitivanje je obavljeno korišćenjem testova proliferacije na ćelijama opisanih u primerima 6 i 9.

[0253] Slika 9A pokazuje sposobnost 218A7 i 230C9 da neutrališu IL-22-zavisnu aktivaciju IL-22R1. Slika 9B prikazuje sposobnost različitih serija 230C9 da neutrališu IL-20-zavisnu aktivaciju IL-22R1. Relativne jačine delovanja ispitivanih antitela prikazane su u tabelama 24 i 25 ispod.

Tabela 24 Jačina delovanja antitela 218A7 i 230C9 u blokiranju signalnog puta IL-22 preko IL22R (ćelijska linija BWhIL22R)

Tabela 24 Jačina delovanja antitela 230C9 u blokiranju signalnog puta IL-20 preko IL22R (ćelijska linija Baf3hIL22R/IL20Rb)

12.3 Potvrdno mapiranje epitopa

[0254] Potvrdno mapiranje epitopa za antitela 230C9 i 223G5 modifikovana prema sekvenci klicine linije izvedeno je korišćenjem FACS analize, kao što je opisano u primeru 8.2. Utvrđeno je da antitelo 230C9 kompetira za vezivanje za IL-22R1 sa standardnim antitelom 280.346.TSY, kao i sa 223G5. Antitelo 223G5 ne kompetira za vezivanje za IL-22R1 sa standardnim antitelom 280.346.TSY.

[0255] Rezultati FACS analize su kombinovani sa rezultatima gore opisanih testova proliferacije, a zaključci u vezi sa epitopima su prikazani na slici 10. Kao što je naznačeno, može se zaključiti da se (i) antitelo 230C9 vezuje za epitop koji je različit, ali se preklapa sa epitopima koje vezuje 280.346.TSY; i (ii) antitelo 223G5 vezuje za epitop različit od epitopa za 280.346.TSY.

[0256] FACS analiza je takođe sprovedena kao što je opisano u primeru 8.2 da bi se proučavalo vezivanje antitela modifikovanih prema sekvenci klicine linije za različite mutante IL-22R. Rezultati su prikazani u tabeli 26 ispod.

Tabela 26 Vezivanje antitela za ćelije koje eksprimiraju mutante IL22R

[0257] Ovi rezultati potvrđuju da se antitela 230C9 i 223G5 vezuju za epitop koji ne uključuje Y60. Utvrđeno je da mutacija A209D utiče na vezivanje 223G5, dok na vezivanje antitela lame 166G8 ova promena nije uticala. Ovo verovatno može da se pripiše poteškoćama u otkrivanju osetljivosti 166G8 na mutaciju A209D (166G8 je testiran samo jednom), a verovatno i neznatnim promenama u CDR sekvencama tokom modifikovanja 166G8 prema sekvenci klicine linije. Ovi podaci potvrđuju da se 280.346.TSY vezuje za D1 u IL22R, da se 223G5 vezuje za D2 u IL22R i da 230C9 ima epitop koji se preklapa, ali je različit.

12.4 Unakrsna reaktivnost među vrstama antitela modifikovanih prema sekvenci klicine linije

[0258] Antitelo 230C9 vezuje humani IL-22R, ali ne pokazuje unakrsnu reaktivnost za IL-22R miša, pacova i zeca. Ovo je u skladu sa nalazom da 230C9 ima poseban epitop u poređenju sa standardnim antitelom 280.346.TSY - videti 12.3 iznad.

[0259] Kapacitet antitela da vežu cino-IL22R kada je eksprimiran na ćelijama ispitan je pravljenjem himernih konstrukata ekstracelularnog domena IL22R (ECD) od različitih vrsta spojenih sa humanim transmembranskim (TM) i humanim intracelularnim domenom (ID). Iako

4

efikasnost prolazne transfekcije nije bila velika, FACS analiza je pokazala da se antitelo 230C9-N297Q, ali ne i 223G5-N297Q vezuje za cinoIL22R_ECD-humaniTM_humaniICD, što je primećeno po prisustvu šireg pika na FACS dijagramu (videti sliku 11 sa strelicama koje označavaju šire pikove).

[0260] Osim toga, kada su himerni konstrukti takođe ko-transfektovani sa reporterskim genom STAT3 u ćelije HEK, aktivnost IL22R nakon dodavanja humanog IL22 mogla je da se meri u prisustvu ili odsustvu neutrališućih antitela. Rezultati predstavljeni u tabeli 27 ispod pokazuju da su sva testirana antitela bila u stanju da neutrališu humani IL22R i da su samo antitela unakrsno reaktivna sa primatima (230C9 i 280.346.TSY) bila u stanju da vežu i blokiraju aktivnost cino i rezus himera, što sugeriše da će ova antitela biti funkcionalna u studijama na primatima.

Tabela 27 Unakrsna reaktivnost anti-IL-22R antitela sa IL-22R čoveka, rezus i cinomolgus majmuna

12.5 Analiza imunogenosti

[0261] Imunogenost antitela modifikovanih prema sekvenci klicine linije je procenjena korišćenjem alata za predviđanje. Konkretno, prisustvo potencijalnih imunogenih peptida u varijabilnim domenima je procenjeno korišćenjem platforme Epibase™ kompanije Lonza (ocena DRB-1) korišćenjem podešavanja "HLA klasa II – Caucasian v3.0". Ova platforma analizira specifičnosti vezivanja HLA svih 10-mernih peptida koji potiču iz VH i VL sekvenci. Izrada profila je urađena na nivou alotipa za 15 DRB1, 6 DRB3/4/5, 12 DQ i 7 DP, odnosno ukupno 40 receptora HLA klase II. Identifikovana su antitela koja se jako i srednje jako vezuju za epitope DRB1, DRB3/4/5, kao i ona koja se jako vezuju za epitope DQ i DP. Brojanje epitopa je rađeno odvojeno za antitela koja se vezuju za DRB1 sa jakim i srednjim afinitetom. Peptidi koji se vezuju za više alotipova iste grupe su računati kao jedan. Približan rezultat koji izražava najgori slučaj imunogenog rizika izračunat je na sledeći način: Ocena = Σ (broj epitopa x učestalost alotipa). Drugim rečima, broj epitopa koji utiču na određeni alotip HLA se množi sa frekvencijom alela pogođenog alotipa. Za datu sekvencu, proizvodi su sumirani za sve alotipove DRB1 korišćene u studiji koji su prisutni u 2% ili više, u populaciji kavkaske rase.

[0262] Rezultati su prikazani u tabeli 28 ispod.

Tabela 28 Ocene DRB1 za anti-IL-22R antitela modifikovana prema sekvenci klicine linije u poređenju sa raznim drugim komercijalnim antitelima

[0263] Kao što može da se vidi iz tabele 28, antitelo 230C9 ima veoma nisku ocenu DRB1, znatno ispod drugih komercijalnih antitela, dok 223G5 ima nisku ocenu DRB1 uporedivu sa drugim komercijalno dostupnim humanim ili humanizovanim antitelima. Ovi podaci sugerišu da će 230C9 (i 223G5) imati poželjan profil imunogenosti.

Primer 13 Farmakokinetička (PK) studija antitela 230C9-N297Q kod cinomolgus majmuna

[0264] Obavljena je farmakokinetička analiza klona antitela 230C9. Dva cinomolgus majmuna su intravenski primila jednu dozu od 10 mg/kg antitela ubrizgavanu tokom 2 časa. Uzorci su uzeti u različitim vremenskim trenucima i u njima je ispitana koncentracija mAb u plazmi ELISA testom. Konkretno, mikrotitarska ploča (Maxisorb Nunc) je obložena sa 2 µg/ml rekombinantnog hIL22R (Biotechne; kat. br. 2770-LR) u PBS preko noći na 4 °C. Ploča je isprana 3 puta rastvorom PBS-Tween i blokirana 2 časa sa 250 µl rastvora PBS-1% kazein. Nakon 3 ispiranja rastvorom PBS-Tween, naneti su uzorci. Sva razblaženja su napravljena u 1% puliranoj plazmi (ovo je pul sakupljen od 3 naivna cinomolgus majmuna). Uzorci su ostavljeni da se vežu 2 časa na sobnoj temperaturi. Ploče su zatim isprane 5 puta rastvorom PBS-Tween, a kozja biotinilisana poliklonska antitela protiv teškog i lakog lanca humanog IgG, adsorbovana pomoću imunosorbenta majmuna, kuplovana sa HRP, naneta su u razblaženju 50 000 puta (Bethyl, kat. br.: A80-319P) i ostavljena da se vežu 1 čas na RT. Ploče su zatim isprane 5 puta rastvorom PBS-Tween i dodat je s(HS) oslabljivač TMB (SDT, #sTMB-W). Bojenje je trajalo 10 minuta, a zatim je prekinuto sa 1N H2SO, nakon čega je izmerena optička gustina na 450 nm. Uzorci su analizirani 3 puta i 230C9-N297Q (iz iste serije koja je ubrizgana životinjama) je korišćen za standardnu krivu.

[0265] Relevantni PK parametri za analizu dvokompartmentnog modela IV infuzije prikazani su u tabeli 29. Farmakokinetički profili za antitelo 230C9-N297Q su prikazani grafički na slici 12 (prikazani rezultat je prosečan rezultat za dva majmuna). Ovi podaci jasno pokazuju da antitelo ima dugo srednje vreme zadržavanja (MRT). Zanimljivo, iako antitelo sadrži neglikozilisani Fc region IgG1 bez ikakvih modifikacija za poboljšanje poluživota, poluživot 230C9-N297Q je iznenađujuće dug. Konkretno, 230C9-N297Q ima poluživot od oko 19.4 dana. Dakle, izgleda da je produženi poluživot antitela prema pronalasku posledica svojstava Fab regiona.

Tabela 29 PK parametri

[0266] Dodatna PK studija je sprovedena na cinomolgus majmunima, primenom pojedinačnih IV doza (0.1, 1, 3, 10 i 30 mg/kg) 230C9-N297Q kod ukupno 10 majmuna. Kinetika kod cinomolgus majmuna pokazala je dvokompartmentnu nelinearnu kinetiku. Pri dozama nižim od 10 mg/kg, klirens (CL) se povećavao sa snižavanjem doze, rezultujući više nego dozno-proporcionalnim smanjenjem izloženosti (AUC) sa smanjenjem doze. Ovo je dobro poznata pojava kod monoklonskih antitela (videti tabelu 30 i sliku 13).

Tabela 30 PK parametri na osnovu 2 majmuna/po dozi i 5 grupa doza.

[0267] Skaliranje ovih parametara u cilju predviđanja farmakokinetike kod čoveka rezultuje humanim profilom sličnim onome što se može očekivati na osnovu empirijskih nalaza dobijenih sa drugim humanim molekulima IgG1, uključujući procenu perioda poluživota (T1⁄2) kod čoveka od oko 18 dana, što je u skladu sa rezultatima prethodne studije koja je prikazana iznad.

Primer 14 Farmakodinamički (PD) efekti antitela 230C9 N297Q kod cinomolgus majmuna

[0268] Farmakodinamički efekat antitela 230C9 N297Q (ARGX-112) je analiziran kod majmuna cinomolgus davanjem majmunima IV injekcije 230C9 u različitim dozama (0.3, 1, 3, 10, 30 mg/kg). Isečak kože majmuna je takođe tretiran imikvimodom (IMQ) da bi se procenili efekti 230C9 N297Q na upalu kože. Objavljeno je da IMQ izaziva upalu kože kod miševa (Van Belle et al. 2012, J Immunol. Jan 1;188(1):462-9), a jedan izveštaj takođe pokazuje slične efekte kod nehumanih primata (Poirier et al. , 2016, Exp Dermatol. Mar; 25(3):233-4; Poirier et al, 2016, J Immunol. Jan 1;196(1):274-83), i kod ljudi (Vinter et al, 2015, Br J Dermatol, Feb;172(2):345-53).

[0269] Posle 5 dana IMQ tretmana, uzeta je biopsija sa područja kože koje nije tretirano sa IMQ i sa područja kože tretiranog sa IMQ da bi se procenili efekti 230C9 N297Q na dejstvo koje indukuje IMQ. Efekti su procenjeni upoređivanjem debljine epiderma i učestalosti jedara koja proliferišu u epidermu (učestalost Ki67), a rezultati su prikazani na slici 14. Rastuće doze antitela 230C9 N297Q mogle su da normalizuju debljinu epiderme (slika 14A) i smanje učestalost jedara pozitivnih na Ki67 (slika 14B). EC50je približno iznosila 3 mg/kg.

Primer 15 Odnos serumske PK i PD odgovora eksplanta kože posle jednokratne IV infuzije 230C9 N297Q kod cinomolgus majmuna

[0270] Ispitivana je zahvaćenost ciljne kože kod majmuna cinomolgus kojima je data jednokratna 15-minutna intravenska infuzija (5 ml/kg) antitela 230C9 N297Q. Ženke majmuna su ostavljene ili netretirane ili su izložene 1, 5 ili 30 mg/kg 230C9 prvog dana ispitivanja (tri životinje po grupi). Krv je sakupljena od svih životinja koje su primile dozu (3 x 150 µL) u različitim vremenskim trenucima, a poslednji uzorak je uzet 7. dana. U uzorcima seruma (1% zapr./zapr.) ispitivani su nivoi izloženosti 230C9 N297Q ELISA testom.

[0271] Od svake životinje su uzete biopsije isečaka kože (3 mm) na dan -1 (pre doziranja) i dan 7 i inkubirane u prisustvu (dan -1, dan 7) ili odsustvu (dan 7) rhIL-22 tokom 24h na 37°C u vlažnoj atmosferi vazduh/CO2(95%/5%) pre merenja nivoa iRNK FLG2 qPCR metodom. Rezultati su prikazani na slici 15.

[0272] Stimulacija pomoću rhIL22 je rezultovala 5-strukim smanjenjem ukupnih nivoa iRNK FLG2 u koži. Represija transkripta FLG2 posredovana IL-22 značajno je obnovljena kod životinja tretiranih pomoću 230C9 N297Q, što ukazuje na značajnu izloženost kože u svim grupama doziranja.

Primer 16 Dejstvo 230C9 N297Q u vijabilnim humanim i ex vivo eksplantima kože cinomolgus majmuna

[0273] Za procenu sposobnosti antitela 230C9 N297Q da inhibira nivoe iRNK DEFB4 indukovane pomoću rhIL-22, korišćena je sveže izolovana koža abdomena zdravih humanih davalaca.

[0274] Biopsije isečaka kože (3 mm) su postavljene u uspravnom položaju u pločice za tkivo sa 96 bunarčića i kultivisane na dodirnoj površini vazduha i tečnosti u 100 µL medijuma EpiLife dopunjenog suplementom za rast humanih keratinocita (HKGS) bez hidrokortizona (Invitrogen).

[0275] Uzorci su inkubirani sa rastućim koncentracijama antitela 230C9 N297Q tokom 24h na 37°C u vlažnoj atmosferi vazduh/CO2(95%/5%) pre stimulacije sa 20 ng/ml rhIL-22 (R&D Systems) dodatnih 24h na 37°C. Relativni nivoi ekspresije gena DEFB4 u lizatima kože određeni su kvantitativnom PCR metodom u realnom vremenu (qPCR) korišćenjem validiranih testova za ekspresiju gena (Applied Biosystems) i sistema za detekciju sekvenci ABI PRISM<®>7900HT.

[0276] Slika 16 pokazuje dozno-zavisno smanjenje nivoa iRNK DEFB4 indukovanih pomoću rhIL-22 iz jednog reprezentativnog eksperimenta (EC50[CI95%] = 4 nM [0.5-29 nM]; 4 davaoca). Slična jačina delovanja je dobijena i ako se vreme pre-inkubacije 230C9 N297Q poveća na 48 h, što sugeriše da je postignuta ravnoteža vezivanja IL-22RA. Antitelo izotipske kontrole nije imalo efekta na rhIL-22-posredovano povećanje nivoa iRNK DEFB4.

[0277] U sveže izolovanim biopsijama kože (3 mm) cinomolgus majmuna (Macaca Fascicularis) gen DEFB4 nije regulisan putem rhIL-22. Nasuprot tome, i FLG2 i LOR su nishodno regulisani nakon 24 časa inkubacije sa rhIL-22 upotrebom istog protokola kao što je opisano za postavku eksperimenta sa eksplantima humane kože. Ovi odgovori su potpuno blokirani 24-časovnom preinkubacijom sa antitelom 230C9 N297Q (EC50=11 nM; oba gena) kao što je prikazano na slici 17.

Primer 17 Efikasnost 230C9 N297Q u humanim keratinocitima

[0278] Test je dizajniran da bi se ispitala jačina delovanja anti-IL-22R antitela u funkcionalnom testu u primarnim humanim keratinocitima. Ćelije su stimulisane mešavinom citokina IL-4, IL-13, IL-22 (svi u koncentraciji od 10 ng/mL) i IFN-γ,1 ng/mL tokom 48 časova, a zatim je meren nivo CCL2 u supernatantu kulture upotrebom platforme MSD.

[0279] Keratinociti su suspendovani u medijumu EpiLife (Life Technologies) sa dodatkom sledećih suplemenata za rast: EGF; BPE; insulin; transferin i gentamicin/amfotericin. Ćelije su zasejane u bele proksi ploče sa 384 bunarčića (Perkin Elmer) i inkubirane 2 časa na 37°C, 5% CO2/95% vazduha. Ćelije su zatim tretirane sa 80 nl antitela (u različitim koncentracijama kao što je prikazano na slici 18) ili nosačem. Zatim je dodato 40 µl smeše za stimulaciju (IL-4, IL-13, IL-22 (R&D systems, svi u konačnoj koncentraciji od 10 ng/mL) i IFN-γ (R&D systems, 1 ng/mL konačne koncentracije)) i ploče su inkubirane na 37°C, 5% CO2/95% vazduha tokom 2 dana. Kontrolni bunarčići su tretirani mešavinom IL-4 i IL-13 (oba pri 10 ng/mL) i IFN-γ, 1 ng/mL, i definisana je 100% inhibicija IL-22 signalizacije. Koncentracija CCL2 u supernatantu kulture merena je pomoću kompleta MSD CCL2 (Mesoscale kat. br. K151AYB-2). Vijabilnost ćelija je merena pomoću reagensa PrestoBlue<®>.

[0280] Jačina delovanja 230C9 N297Q je ispitana u 5 eksperimenata i pokazala je dozo-zavisnu inhibiciju nivoa CCL2 sa vrednostima EC50od 0.10 nM [0.042-0.24 nM]. Reprezentativni eksperimentalni rezultati jednog eksperimenta prikazani su na slici 18.

1

2

4

1

11

12

1

14

1

11

12

1

11

12

1

14

1

Claims

Patentni zahtevi

1. Antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji se vezuje za IL-22R, naznačen time, što antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži varijabilni domen teškog lanca i varijabilni domen lakog lanca i gde antitelo ili antigen-vezujući fragment sadrži kombinaciju CDR sekvenci varijabilnog teškog lanca: HCDR3 koji sadrži SEQ ID NO: 6; HCDR2 koji sadrži SEQ ID NO: 36; i HCDR1 koji sadrži SEQ ID NO: 34, i kombinaciju CDR sekvenci varijabilnog lakog lanca: LCDR3 koji sadrži SEQ ID NO: 54; LCDR2 koji sadrži SEQ ID NO: 47; i LCDR1 koji sadrži SEQ ID NO: 16.

2. Antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema patentnom zahtevu 1 naznačen time, što antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži kombinaciju varijabilnog domena teškog lanca (VH) i varijabilnog domena lakog lanca (VL) odabranu od sledećeg: VH koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 63 ili aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 90%, 95%, 97%, 98% ili 99% identična sa njom i VL koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 64 ili aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 90%, 95%, 97%, 98% ili 99% identična sa njom.

3. Antitelo prema patentnom zahtevu 1 koje sadrži najmanje jedan teški lanac i najmanje jedan laki lanac odabran od sledećeg: teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 67 ili aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 90%, 95%, 97%, 98% ili 99% identična sa njom i lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 68 ili aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 90%, 95%, 97%, 98% ili 99% identična sa njom.

4. Antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema bilo kom od patentnih zahteva 1-3 koji sadrži region zgloba, CH2 domen i/ili CH3 domen humanog IgG.

5. Antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1-4 koje ispoljava visoku homologiju sa humanim IgG, poželjno IgG1.

6. Izolovani polinukleotid koji kodira antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema bilo kom od patentnih zahteva 1-5.

7. Ekspresioni vektor koji sadrži polinukleotid prema patentnom zahtevu 6 funkcionalno povezan sa regulatornim sekvencama koje dozvoljavaju ekspresiju antitela, antigen-vezujućeg fragmenta, varijabilnog domena teškog lanca ili varijabilnog domena lakog lanca u ćeliji-domaćinu ili besćelijskom ekspresionom sistemu.

8. Ćelija-domaćin ili besćelijski ekspresioni sistem koji sadrži ekspresioni vektor prema patentnom zahtevu 7.

9. Postupak za proizvodnju rekombinantnog antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta koji obuhvata kultivaciju ćelije-domaćina ili besćelijskog ekspresionog sistema prema patentnom zahtevu 8 pod uslovima koji dozvoljavaju ekspresiju antitela ili antigen-vezujućeg fragmenta i izdvajanje eksprimiranog antitela ili antigen-vezujućeg fragmenta.

10. Farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5 i najmanje jedan farmaceutski prihvatljiv nosač ili ekscipijens.

11. Antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema bilo kom od patentnih zahteva 1-5 ili farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 10 za upotrebu kao lek.

12. Antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema bilo kom od patentnih zahteva 1-5 ili farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 10 za upotrebu u lečenju ili profilaksi psorijaze, psorijaznog artritisa ili atopijskog dermatitisa.

1