RS62610B1 - Probiotski sojevi koji imaju sposobnost apsorpcije holesterola, postupci i njihove upotrebe - Google Patents

Description

Opis

OBLAST PRONALASKA

[0001] Pronalazak se odnosi na oblast probiotskih sojeva, konkretnije, na oblast probiotskih sojeva koji imaju sposobnost apsorpcije holesterola i njihove terapijske upotrebe. Pronalazak se takođe odnosi na lečenje dislipidemija upotrebom probiotskih sojeva.

OSNOV PRONALASKA

[0002] Hiperholesterolemija je najvažniji faktor rizika za kardiovaskularne bolesti i smatra se jednim od glavnih uzroka smrti i invaliditeta u mnogim zemljama. Pokazalo se da smanjenje koncentracije holesterola u serumu za 1% može da smanji rizik od koronarne bolesti srca za 2-3%. Terapija lekovima za hiperholesterolemiju ima neželjena sporedna dejstva koja izazivaju zabrinutost u pogledu njihove terapijske upotrebe. Stoga je potreban prirodniji postupak za smanjenje koncentracije holesterola u serumu kod ljudi.

[0003] Laktobacili i druge bakterije koje proizvode mlečnu kiselinu imaju važne uloge u balansiranju digestivnih funkcija i pomažu u uklanjanju holesterola, iako istraživanja još nisu utvrdila odnos doze i efekta. Zbog njihove sposobnosti da izvrše dekonjugaciju žučnih soli, poslednjih godina postoji interesovanje za mogućnost upotrebe bakterija mlečne kiseline kao bioloških hipoholesterolemičnih agenasa. U nekoliko studija predloženo je postojanje veze između konzumiranja bakterija mlečne kiseline i smanjenja koncentracija holesterola u krvi ljudi, pacova i pilića. Prisustvo hidrolaze žučnih soli (BSH) ima selektivnu prednost za ovu bakteriju u sredinama bogatim žučnim solima. Aktivnost BSH koristi bakteriji tako što povećava njenu otpornost na konjugovane žučne soli i povećava njeno preživljavanje u gastrointestinalnom traktu, a time i njenu sposobnost da ga kolonizuje. Studije o dekonjugaciji žučnih soli i sposobnosti laktobacila da redukuju holesterol uglavnom su sprovedene na sojevima izolovanim iz organizma ljudi, svinja i iz preparata od fermentisanog mleka.

[0004] Objavljeno je da sojevi Lactobacillus acidophilus i bifidobakterija asimiluju holesterol iz laboratorijskih medijuma. Dakle, obe vrste bakterija bi mogle da imaju potencijal za snižavanje nivoa holesterola u serumu ljudi. Učinjeno je mnogo pokušaja da se razjasni mehanizam uključen u hipoholesterolemijsko delovanje sojeva bakterija mlečne kiseline. Jedan od predloženih mehanizama je snižavanje holesterola na račun ćelijskog zida tokom rasta bakterije.

Drugi mogući mehanizam je dekonjugacija žučnih soli bakterijama koje proizvode BSH. Međutim, ovi mehanizmi zahtevaju da bakterije budu žive da bi uspešno redukovale holesterol u serumu.

[0005] Miremandi F. et al (J. Func. Foods 2014, 9, 295-305) procenjuje sposobnost 14 probiotskih sojeva laktobacila i bifidobakterija, bilo rastućih ili nerastućih (u fazi mirovanju ili ubijenih toplotom), da uklone holesterol. Utvrđeno je da svi sojevi asimiluju holesterol u različitom stepenu. Sposobnost ćelija u mirovanju i mrtvih ćelija da uklanjaju holesterol potvrdila je da njihove ćelijske membrane još uvek imaju sposobnost da vežu holesterol.

[0006] Yoon HS et al (Int. J. Food Sci. Nutrit. 2013, 1, 44-52) pokazuje smanjenje apsorpcije holesterola kod enterocita Caco-2 tretiranih sa dva specifična probiotska soja Lactobacillusa, respektivno. Ćelije ubijene toplotom i frakcije ćelijskog zida navedenih probiotskih sojeva imale su isti efekat kao žive ćelije.

[0007] Tok E et al (Microbiology and Immunology, 1 mart 2010 XP055194816) pokazuje korelaciju između uklanjanja holesterola i proizvodnje egzopolisaharida (EPS) u sojevima Lactobacillusa. Sojevi koji proizvode više EPS bili su u stanju da uklone više holesterola iz medijuma. Ćelije u mirovanju, kao i ćelije ubijene toplotom su takođe uklanjale holesterol.

[0008] Bordoni A et al opisuje skrining bifidobakterija na apsorpciju holesterola, i upotrebu jednog soja koji apsorbuje holesterol u probiotskoj mešavini za ishranu pacova sa hiperholesterolemijom.

[0009] Dakle, još uvek postoji potreba u struci da se obezbede terapije zasnovane na probioticima koje su efikasne za lečenje dislipidemija, posebno hiperholesterolemije.

KRATAK OPIS PRONALASKA

[0010] U prvom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na probiotski soj odabran od Lactobacillus reuteri V3401 sa pristupnim brojem CECT 8605 i Bifidobacterium breve BT820 sa pristupnim brojem CECT 8606.

[0011] U drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na biološki čistu kulturu koja sadrži probiotski soj prema pronalasku.

[0012] U još jednom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na kompoziciju koja sadrži probiotski soj prema pronalasku.

[0013] U još jednom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na farmaceutski proizvod koji sadrži probiotski soj prema pronalasku.

[0014] U još jednom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na nutritivni proizvod koji sadrži probiotski soj prema pronalasku.

[0015] U još jednom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na hranivo koje sadrži probiotski soj prema pronalasku.

[0016] U još jednom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na frakciju, obogaćenu ćelijskom membranom ili ćelijskim zidom probiotskog soja prema pronalasku.

[0017] U još jednom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na postupak za dobijanje probiotskog soja odabranog od Lactobacillus reuteri V3401 sa pristupnim brojem CECT 8605 i Bifidobacterium breve BT820 sa pristupnim brojem CECT 8606 sa povećanom sposobnošću apsorpcije holesterola koji obuhvata korak inaktivacije ćelija.

[0018] U još jednom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na postupak za dobijanje probiotskog soja odabranog od Lactobacillus reuteri V3401 sa pristupnim brojem CECT 8605 i Bifidobacterium breve BT820 sa pristupnim brojem CECT 8606 sa povećanom sposobnošću apsorpcije holesterola koji obuhvata korak kultivacije ćelija na pH između 6 i 9 tokom njihove eksponencijalne faze rasta.

[0019] U još jednom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na postupak za dobijanje mikroorganizma sa povećanom sposobnošću apsorpcije holesterola koji obuhvata dovođenje u kontakt mikroorganizma koji ima sposobnost apsorpcije holesterola sa kompozicijom koja sadrži aktivnost peptidoglikan-hidrolaze, pri čemu kompozicija koja sadrži aktivnost peptidoglikanhidrolaze predstavlja proteinski sadržaj ćelije soja CECT 8605 L. reuteri V3401 i gde je mikroorganizam koji ima sposobnost apsorpcije holesterola soj CECT 8606 B. breve BT820.

[0020] U još jednom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na probiotski soj ili hranivo ili nutritivni proizvod prema pronalasku za upotrebu kao lek.

[0021] U još jednom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na probiotski soj ili hranivo ili nutritivni proizvod prema pronalasku za upotrebu u lečenju i/ili prevenciji bolesti ili stanja odabranog iz grupe koja se sastoji od dislipidemije, insulinske rezistencije i metaboličkog sindroma.

KRATAK OPIS SLIKA

[0022]

Slika 1: Prosečna relativna ćelijska fluorescencija (%) enterocita H-T29 inkubiranih sa fluoresterolom (- kontrola) i sa ezetimibom (+ kontrola), bakterijskim suspenzijama L. reuteri V3401 ili B. breve BT820.

Slika 2: Prosečna relativna ćelijska fluorescencija (%) enterocita H-T29 inkubiranih sa fluoresterolom (- kontrola) i sa ezetimibom (+ kontrola) ili suspenzijama inaktiviranih bakterija. A, L. reuteri V3401. B, B. breve BT820.

Slika 3: RAPD obrasci sojeva L. reuteri generisani pomoću prajmera (gtg)5 (levi panel) i OPL1 (desni panel). Levi panel: trake s leva na desno: traka 1, marker molekulske težine od 100 bp; traka 2, L. reuteri V3401; traka 3, LR35; traka 4, LR20; traka 5, LR01; traka 6, CECT925; traka 7, DSM 19738; traka 8, kontrola bez matrice (NTC); traka 9, marker molekulske težine od 100 bp i traka 10, marker molekulske težine od 1 kb. Desni panel: traka 1, V3401; traka 2, LR35; traka 3, LR20; traka 4, marker molekulske težine od 100 bp.

Slika 4: (gtg)5 RAPD profil soja B. breve BT820 i drugih sojeva B. breve i soja Bifidobacterium longum. Traka 1, marker molekulske težine od 1 kb. Traka 2, marker molekulske težine od 100 bp. Traka 3, B. breve BT820. Traka 4, BB26. Traka 5, DSM20091. Traka 6, CECT4839. Traka 7, BB69. Traka 8, B. longum ATCC15707. Slika 5: Relativna fluorescencija (geometrijska sredina) enterocita HT-29 inkubiranih sa micelama fluoresterola (kontrola), ezetimibom (300 µM), toplotno inaktiviranim suspenzijama ćelija (5·10<8>bakterija/mL) L. reuteri V3401, B. breve BT820 i enterociti ko-inkubirani sa ezetimom i svakim mikroorganizmom.

Slika 6: Neto fluorescencija (proizvoljne jedinice) uzoraka L. reuteri V3401, B. breve BT820 i negativne kontrole (nasumično odabrane) inkubiranih sa fluoresterolom i izmerenih fluorofotometrijom.

Slika 7: Fluorescencija (geometrijska sredina) po bakterijama u suspenzijama L. reuteri V3401, B. breve BT820 i nasumično odabranoj negativnoj kontroli, određena protočnom fluorocitometrijom.

Slika 8: A, Koncentracija živih bakterija u kulturama L. reuteri V3401 dobijenim u medijumu za rast A pH 6 i medijumu B pH 5. B, Prosečna relativna ćelijska fluorescencija (%) enterocita H-T29 inkubiranih sa fluoresterolom (- kontrola), ezetimibom (+ kontrola) ili suspenzijama toplotno inaktiviranog L. reuteri V3401 uzgajanog u opisanim uslovima.

Slika 9: Prosečna relativna ćelijska fluorescencija (%) enterocita H-T29 inkubiranih sa fluoresterolom (- kontrola), ezetimibom (+ kontrola) ili suspenzijama toplotno inaktiviranog L. reuteri V3401 uzgajanog u različitim medijumima i pH kultivacije. A, medijum B pH 5 plus glukoza. B, medijum B pH 5 plus kalijum fosfat. C, medijum B pH 5 niska koncentracija ekstrakta kvasca. D, medijum B pH 5 plus kalijum fosfat i niska koncentracija ekstrakta kvasca. E, standardni medijum B pH 5. F, medijum B pH 6. G, medijum A pH 6. H, medijum A pH 5.

Slika 10: Prosečna relativna ćelijska fluorescencija (%) enterocita H-T29 inkubiranih sa fluoresterolom (- kontrola), ezetimibom (+ kontrola) ili suspenzijama toplotno inaktiviranog L. reuteri V3401 uzgajanog u medijumu B na različitim pH vrednostima kultivacije.

Slika 11: Prosečna relativna ćelijska fluorescencija (%) enterocita H-T29 inkubiranih sa fluoresterolom i bakterijskim suspenzijama toplotno inaktiviranog L. reuteri V3401 uzgajanog u medijumu B na pH 5 tokom 14 h, inkubiranih na pH 6 tokom 24 h i sakupljenih u različitim vremenskim intervalima.

Slika 12: Relativne vrednosti genske ekspresije litičkog enzima u medijumu B i medijumu A merene qPCR metodom.

Slika 13: Zimogram (A) i SDS-PAGE (B) proteinskih ekstrakata dobijenih iz L. reuteri V3401 uzgajanih u medijumu B na pH 4 (trake 1-2), pH 5 (3-4), pH 6 (5-6), pH 7 (7-8) i medijumu A na pH 6 (9-10).

Slika 14: Slike transmisione elektronske mikroskopije L. reuteri V3401 uzgajanog u medijumu A na pH 6 (A, B) i medijumu B na pH 5 (C, D).

Slika 15: Prosečna relativna ćelijska fluorescencija (%) enterocita H-T29 inkubiranih sa fluoresterolom i toplotno inaktiviranim bakterijskim suspenzijama uzgajanim u medijumu A pH 6 i medijumu B pH 5. A, L. reuteri LR01. B, B. breve BB16. C, L. fermentum CECT5716. D, L. reuteri LR35. E, L. reuteri LR20. F, Lactococcus lactis LL18. F, Leuconostoc mesenteroides LM37. H, Pediococcus pentosaceus PP02.

Slika 16: Relativna ekspresija gena litičkog enzima u sojevima L. reuteri V3401 i LR20 uzgajanim u medijumu A pH6 i medijumu B pH5 kvantifikovana qPCR metodom.

Slika 17: Relativna fluorescencija (%) po enterocitu HT-29 inkubiranom sa micelama fluoresterola i bez bakterijskog uzorka (- kontrola), ezetimibom (+ kontrola) i toplotno inaktiviranim suspenzijama L. reuteri LR35, L. plantarum LP18 i B. breve BT820 (C) i inkubiranom sa proteinskim ekstraktom iz L. reuteri V3401 (T).

Slika 18: Intenzitet fluorescencije po ćeliji (geometrijska sredina) meren protočnom fluorocitometrijom. C: toplotno inaktivirani bakterijski uzorci bez fluoresterola (kontrola autofluorescencije). F: toplotno inaktivirane bakterije inkubirane sa fluoresterolom. TF: bakterijski uzorci tretirani proteinskim ekstraktom L. reuteri V3401, toplotno inaktivirani i inkubirani sa micelama fluoresterola.

Slika 19: Holesterol u serumu izmeren kod 6 grupa životinja, posle 57 dana. Stubići greške označavaju standardnu grešku srednje vrednosti. A, Zdrava kontrolna grupa; B, Hiperholesterolemična kontrolna grupa; C Grupa tretirana živim L. reuteri V3401; D.

Grupa tretirana toplotno inaktiviranim L. reuteri V3401; E, Grupa tretirana živim B. breve BT820; F, Grupa tretirana toplotno inaktiviranim B. breve BT820.

Slika 20: HDL-holesterol (A), LDL-holesterol (B) i odnos LDL-C/HDL-C (C) izmeren kod šest grupa životinja, posle 57 dana. Stubići greške označavaju standardnu grešku srednje vrednosti. Naznačene su značajne razlike (t-studentov test, α=0,05 i p<0,5) u odnosu na kontrolnu grupu A (<#>) i u odnosu na hiperholesterolemičnu grupu B(*). ;Slika 21: Nivoi triglicerida (A) i fosfolipida (B) u plazmi kod 6 grupa životinja, posle 57 dana. Stubići greške označavaju standardnu grešku srednje vrednosti. ;Slika 22: Vrednosti glukoze u plazmi kod 6 grupa životinja, posle 57 dana. Stubići greške označavaju standardnu grešku srednje vrednosti. Pokazane su značajne razlike (tstudentov test, α=0,05 i p<0,5) u odnosu na kontrolnu grupu A (<#>) i u odnosu na hiperholesterolemičnu grupu B (*).

DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0023] U nastavku, delovi opisa koji se odnose na "prikaz" ne opisuju pronalazak.

[0024] Autori predmetnog pronalaska su identifikovali dva probiotska soja Lactobacillus reuteri V3401 (pristupni broj CECT 8605) i Bifidobacterium breve BT820 (pristupni broj CECT 8606), koji uspešno smanjuju apsorpciju fluoresterola, fluorescentnog analoga holesterola, i holesterola od strane crevnih epitelnih ćelija u in vitro i in vivo ogledima. Mehanizam kojim oni ostvaruju dejstvo zasniva se na njihovoj sposobnosti da apsorbuju holesterol, čime sekvestriraju holesterol iz crevnog trakta i smanjuju količinu koja je dostupna za apsorpciju crevnim epitelom. Dalje, autori pronalaska su utvrdili da sposobnost sojeva da apsorbuju holesterol može iznenađujuće da se indukuje povećanjem litičke aktivnosti koja je, izgleda, specifična za soj L. reuteri V3401 (CECT 8605). Ovo neočekivano otkriće omogućava aktivaciju funkcije apsorpcije holesterola kod mikroorganizama sa postojećom navedenom funkcijom.

Sojevi i kultura

[0025] U prvom aspektu, pronalazak se odnosi na probiotski soj odabran od Lactobacillus reuteri V3401 sa pristupnim brojem CECT 8605 i Bifidobacterium breve BT820 sa pristupnim brojem CECT 8606 koji imaju sposobnost apsorpcije holesterola, u nastavku označeni kao "probiotski soj pronalaska".

[0026] Pojam "soj", kako se ovde koristi, odnosi se na genetičku varijantu ili podtip vrste mikroorganizma, poželjno bakterijske vrste. Pojam "probiotski soj", kako se ovde koristi, odnosi se na živi soj mikroorganizma, poželjno bakterije, koji, kada se primeni u adekvatnim količinama, doprinosi zdravlju domaćina. Domaćini pogodni u kontekstu pronalaska uključuju bilo kog sisara, poželjno primate, kao što su ljudi i šimpanze, svinje, konje, krave, koze, ovce, pse, mačke, pacove i miševe; poželjnije ljude. Ostali pogodni domaćini uključuju ptice, poželjno kokoške, patke, guske, labudove, fazane, golubove, gugutke i nojeve.

[0027] Predmetni pronalazak razmatra probiotski soj odabran od:

• soj Lactobacillus reuteri V3401, deponovan u Španskoj kolekciji tipova kultura (CECT) sa pristupnim brojem CECT 8605, ili njegovu varijantu koja ima sposobnost apsorpcije holesterola, i

• Bifidobacterium breve BT820, deponovan u CECT sa pristupnim brojem CECT 8606, ili njegovu varijantu koja ima sposobnost apsorpcije holesterola.

[0028] Prema tome, predmetni prikaz takođe se odnosi na varijante soja L. reuteri V3401 i soja B. breve BT820 koji imaju sposobnost apsorpcije holesterola. Kako se ovde koristi, pojam "varijanta" ili "mutant" soja odnosi se na bilo koji prirodni ili specifično razvijeni soj dobijen iz referentnog soja X, uglavnom mutacijom, koji zadržava sposobnost apsorpcije holesterola referentnog soja, tj. soja CECT 8605 L. reuteri V3401 ili soja CECT 8606 B. breve BT820.

[0029] Varijante mogu, ali ne moraju da imaju iste identifikacione biološke karakteristike specifičnih sojeva koje su ovde ilustrovane, pod uslovom da imaju slična pogodna svojstva u smislu sposobnosti apsorpcije holesterola kao referentni soj. Na primer, sekvence gena 16S rRNK "varijante" soja, kao što je ovde razmatrano, mogu da imaju oko 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sa sekvencama ovde prikazanog soja.

[0030] U još jednom prikazu, varijanta sojeva odnosi se na bilo koji soj čiji genom hibridizuje pod strogim uslovima sa genomom bilo kog od sojeva CECT 8605 L. reuteri V3401 ili CECT 8606 B. breve BT820. Uopšteno, reakcija hibridizacije pod uslovima niske strogosti sprovodi se na oko 40 stepeni celzijusa u 10xSSC ili u rastvoru ekvivalentne jonske jačine/temperature. Hibridizacija pod uslovima umerene strogosti tipično se izvodi na oko 50 stepeni celzijusa u 6xSSC, a reakcija hibridizacije pod uslovima visoke strogosti uglavnom se sprovodi na oko 60 stepeni celzijusa u 1xSSC.

[0031] U još jednom prikazu, stepen srodnosti između varijantnog i parentalnog soja određuje se kao prosečna nukleotidna identičnost (ANI), koja detektuje konzerviranost DNK osnovnog genoma (Konstantinidis K and Tiedje JM, 2005, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 2567-2592). U nekim prikazima, ANI između varijantnog i parentalnog soja je oko 95%, oko, 96%, oko 97%, oko 98%, oko 99%, oko 99,1%, oko 99,5%, oko 99,6%, oko 99,7%, oko 99,8%, oko 99,9%, oko 99,99%, oko 99,999%, oko 99,9999%, oko 99,99999%, oko 99,999999% ili više, ali manje od 100%.

[0032] U još jednom prikazu, stepen srodnosti između varijantnog i parentalnog soja određuje se kao Koeficijent korelacije učestalosti tetranukleotidnog profila, koji se zasniva na učestalosti oligonukleotida (Bohlin J. et al. 2008, BMC Genomics, 9:104). U nekim prikazima, koeficijent korelacije učestalosti tetranukleotidnog profila između varijantnog i parentalnog soja je oko 0,99, 0,999, 0,9999, 0,99999, 0,999999, 0,999999 ili više, ali manje od 1.

[0033] U još jednom prikazu, stepen srodnosti između varijantnog i parentalnog soja određuje se kao stepen sličnosti dobijen analizom genoma parentalnog i varijantnog soja gel elektroforezom u pulsnom polju (PFGE) primenom jedne ili više restrikcionih endonukleaza. Stepen sličnosti dobijen metodom PFGE može da se meri Dajsovim koeficijentom sličnosti. U nekim primerima izvođenja, Dajsov koeficijent sličnosti između varijantnog i parentalnog soja je oko 95%, oko, 96%, oko 97%, oko 98%, oko 99%, oko 99,1%, oko 99,5%, oko 99,6%, oko 99,7%, oko 99,8%, oko 99,9%, oko 99,99%, oko 99,999%, oko 99,9999%, oko 99,99999%, oko 99,999999% ili više, ali manje od 100%.

[0034] U još jednom prikazu soj se smatra varijantom datog parentalnog soja kada oba soja imaju isti ribotip, utvrđeno upotrebom bilo kog od postupaka poznatih u stanju tehnike i opisanih, na primer, kod Bouchet et al. (Clin. Microbiol. Rev., 2008, 21:262-273).

[0035] U još jednom prikazu, stepen srodnosti između varijantnog i parentalnog soja je Pirsonov koeficijent korelacije dobijen poređenjem genetskih profila oba soja dobijenih PCR reakcijom zasnovanom na repetitivnim ekstragenim palindromskim elementima (REP-PCR) (videti npr. Chou and Wang, Int J Food Microbiol. 2006, 110:135-48). U nekim primerima izvođenja, Pirsonov koeficijent korelacije između varijantnog i parentalnog soja dobijen poređenjem profila REP-PCR je oko 0,99, 0,999, 0,9999, 0,99999, 0,999999, 0,999999 ili više, ali manje od 1.

[0036] U još jednom prikazu, stepen srodnosti između varijantnog i parentalnog soja je genetička distanca među njima, dobijena poređenjem genetskih profila oba soja dobijenih multilokusnom tipizacijom sekvence (MLST) (videti npr. Maiden, M. C., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:3140-3145). U nekim prikazima, genetička distanca između varijantnog i parentalnog soja dobijena metodom MLST je oko 0,99, 0,999, 0,9999, 0,99999, 0,999999, 0,999999 ili više, ali manje od 1.

[0037] U poželjnom prikazu, varijanta i parentalni soj pripadaju istom rodu. U još poželjnijem prikazu, varijanta i parentalni soj pripadaju istoj vrsi ili podvrsti.

[0038] Pojam "sposobnost apsorpcije holesterola", kako se ovde koristi, odnosi se na svojstvo na osnovu koga je soj sposoban da veže holesterol i ugradi ga u strukturu svoje bakterijske ćelije.

Stručnjak u ovoj oblasti će znati da u stanju tehnike postoje brojne tehnologije pogodne za utvrđivanje sposobnosti ćelije da apsorbuje holesterol. Ovo uključuje, bez ograničenja, postupak opisan u odeljku Primeri predmetne patentne prijave, koji se zasniva na fluorometrijskoj ili fluorocitometrijskoj detekciji ugradnje fluoresterola ili NBD-holesterola, koji predstavlja analog holesterola formule (I), iz micela u bakterije.

[0039] Varijante pogodne za upotrebu u ovom dokumentu uključuju one varijante koje imaju najmanje 40%, najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99%, najmanje 100%, najmanje 110%, najmanje 120%, najmanje 130%, najmanje 140%, najmanje 150% ili više sposobnosti apsorpcije holesterola u odnosu na sposobnost apsorpcije holesterola soja od koga potiču.

[0040] U konkretnom primeru izvođenja, probiotski soj pronalaska je u obliku vijabilnih ćelija. U još jednom konkretnom primeru izvođenja, probiotski soj pronalaska je u obliku nevijabilnih ćelija. Pojam "vijabilnost", kako se ovde koristi, odnosi se na sposobnost ćelije da se održi ili povrati svoje potencijale i preživi dok ne bude u stanju da se podeli. Dakle, vijabilna ćelija označava ćeliju koja je sposobna da preživi i podeli se; obrnuto, nevijabilna ćelija označava ćeliju koja nije u stanju da preživi i podeli se. Jasno je da nevijabilne ćelije uključuju mrtve ćelije.

[0041] Vijabilnost može da se odredi brojnim ogledima uobičajenim u stanju tehnike. Takvi ogledi uključuju analizu citolize ili curenja membrane, kao što je ogled sa laktat dehidrogenazom, ogled sa propidijum jodidom, ogled sa tripan plavim i ogled sa 7-aminoaktinomicinom D, kao i genomske i proteomske oglede koji ispituju aktivaciju kaskada odgovora na stres upotrebom DNK-mikročipova i proteinskih čipova.

[0042] Probiotski soj pronalaska ima vijabilnost od 0%, ili najmanje 5%, ili najmanje 10%, ili najmanje 15%, ili najmanje 20%, ili najmanje 25%, ili najmanje 30%, ili najmanje 35%, ili najmanje 40%, ili najmanje 45%, ili najmanje 50%, ili najmanje 55%, ili najmanje 60%, ili najmanje 65%, ili najmanje 70%, ili najmanje 75%, ili najmanje 80%, ili najmanje 85%, ili najmanje 90%, ili najmanje 95%, ili 100%. Procenat ćelijske vijabilnosti odražava procenat

1

ćelija koje imaju sposobnost da se održavaju ili obnove svoje potencijale i prežive dok ne budu mogle da se podele. Obrnuto, probiotski soj pronalaska ima ne-vijabilnost od 100%, ili najmanje 95%, ili najmanje 90%, ili najmanje 85%, ili najmanje 80%, ili najmanje 75%, ili najmanje 70%, ili najmanje 65%, ili najmanje 60%, ili najmanje 55%, ili najmanje 50%, ili najmanje 45%, ili najmanje 40%, ili najmanje 35%, ili najmanje 30%, ili najmanje 25%, ili najmanje 20%, ili najmanje 15%, ili najmanje 10%, ili najmanje 5%, ili 0%. Procenat ćelijske ne-vijabilnosti odražava procenat ćelija koje ne mogu da se održe ili obnove svoje potencijale i prežive dok ne budu mogle da se podele.

[0043] U još jednom aspektu, pronalazak se odnosi na biološki čistu kulturu probiotskog soja pronalaska.

[0044] Pojam "biološki čista kultura", kako se ovde koristi, odnosi se na kulturu u kojoj se bakterije pronalaska nalaze u odnosu od 90% ili više, na primer 95 % ili više, 96% ili više, 97% ili više, 98% ili više, 99% ili više ili 100%, u poređenju sa drugim organizmima prisutnim u kulturi. Pojam "kultura", kako se ovde koristi, odnosi se na populaciju bakterija pronalaska. Kultura može da sadrži druge elemente osim bakterija pronalaska, kao što je medijum za kulturu ili bilo koju drugu supstancu koja bi mogla da se doda u medijum za kulturu korisnu za rast ili održavanje kulture. Pojam "medijum za kulturu" ili "medijum" je poznat u stanju tehnike, i odnosi se uopšteno na bilo koju supstancu ili preparat koji se koristi za kultivaciju živih ćelija. Pojam "medijum", kako se koristi u vezi sa ćelijskom kulturom, uključuje komponente ćelijskog okruženja. Medijum može da bude čvrst, tečan, gasovit ili smeša faza i materijala. Medijumi uključuju tečne medijume za rast kao i tečne medijume koji ne podržavaju rast ćelija. Medijumi takođe uključuju želatinozne medijume kao agar, agaroza, želatinozne i kolagenske matrice. Primeri gasovitih medijuma uključuju gasnu fazu kojoj su ćelije koje rastu na Petri šolji ili drugoj čvrstoj ili polu-čvrstoj podlozi izložene. Pojam "medijum" se takođe odnosi na materijal koji je namenjen upotrebi u kulturi ćelija, čak iako još nije doveden u kontakt sa ćelijama. Drugim rečima, tečnost bogata hranljivim materijama pripremljena za bakterijsku kulturu je medijum. Slično, praškasta smeša koja kada se pomeša sa vodom ili drugom tečnošću postaje pogodna za kulturu ćelija može se nazvati "medijum u prahu". "Definisani medijum" se odnosi na medijume koji su napravljeni od hemijski definisanih (obično prečišćenih) komponenti. "Definisani medijumi" ne sadrže slabo okarakterisane biološke ekstrakte kao što su ekstrakt kvasca i goveđi bujon. "Bogati medijum" uključuje medijume koji su dizajnirani da podrže rast većine ili svih vijabilnih oblika određene vrste. Bogati medijumi često uključuju složene biološke ekstrakte. U predmetnom pronalasku može da se koristi bilo koji konvencionalni medijum za kulturu prikladan za kulturu mlečnokiselinskih bakterija ili bifidobakterija poznat u struci, kao što je, na primer, MRS medijum, HANK'S medijum, APT medijum, RCM medijum, LM17 medijum, BSM medijum i Ellikerov medijum.

[0045] U još jednom aspektu, pronalazak se odnosi na frakciju, obogaćenu ćelijskom membranom ili ćelijskim zidom probiotskog soja prema pronalasku.

[0046] Pojam "frakcija obogaćena ćelijskom membranom", kako se ovde koristi, odnosi se na preparat, nastao procedurama frakcionisanja ćelija, koji uključuje sadržaj ćelijske membrane viši od onog u nefrakcionisanim ćelijama. Slično tome, pojam "frakcija obogaćena ćelijskim zidom", kako se ovde koristi, odnosi se na preparat, nastao procedurama frakcionisanja ćelija, koji uključuje sadržaj ćelijskog zida viši od onog u nefrakcionisanim ćelijama. Tehnike dobijanja frakcija obogaćenih ćelijskom membranom i frakcija obogaćenih ćelijskim zidom su dobro poznate i uobičajene u stanju tehnike, i uključuju kombinaciju homogenizacije, kao što je osmotska homogenizacija ili fizička homogenizacija upotrebom avana, tučkova, blendera ili ultrazvuka, i tehnika frakcionisanja, kao što je centrifugiranje.

Postupci za povećanje sposobnosti mikroorganizama da apsorbuju holesterol

[0047] Autori predmetnog pronalaska su takođe utvrdili da, neočekivano, sposobnost soja CECT 8605 L. reuteri V3401 i soja CECT 8606 B. breve BT820 da apsorbuju holesterol može da se indukuje ili poveća podvrgavanjem ćelija ćelijskoj inaktivaciji (primer 3). Alternativno, isti efekat je zapažen kada su ćelije gajene na pH 6 ili više (primer 4).

[0048] Prema tome, u još jednom aspektu, pronalazak se odnosi na postupak za dobijanje probiotskog soja odabranog od L. reuteri V3401 sa pristupnim brojem CECT 8605 i B. breve BT820 sa pristupnim brojem CECT 8606, sa povećanom sposobnošću apsorpcije holesterola, u nastavku označen kao "prvi postupak pronalaska", koji obuhvata korak inaktivacije ćelija navedenog probiotskog soja ili korak kultivacije ćelija navedenog probiotskog soja na pH između 6 i 9 tokom faze njihovog aktivnog rasta.

[0049] Pojmovi "sposobnost apsorpcije holesterola", "probiotski soj", "L. reuteri V3401 sa pristupnim brojem CECT 8605", "B. breve BT820 sa pristupnim brojem CECT 8606" i "varijanta" detaljno su opisani u kontekstu probiotskog soja pronalaska, i njihove definicije i primeri izvođenja su ovde uključeni referencom.

[0050] Prvi postupak pronalaska obuhvata korak inaktivacije ćelija. Stručnjaku u ovoj oblasti biće jasno da ovaj korak može da se izvede na kulturi probiotskog soja pronalaska ili na izolovanim ćelijama. Pojam "ćelijska inaktivacija", kako se ovde koristi, odnosi se na postupak transformacije ćelije iz vijabilne u nevijabilnu. Postoje različiti postupci za utvrđivanje da li je ćelija vijabilna ili nevijabilna, koji su opisani u kontekstu soja pronalaska. Rezultujuće ćelije se sastoje od 0% vijabilnih ćelija i 100% nevijabilnih ćelija, ili najmanje 1% vijabilnih ćelija i 99% nevijabilnih ćelija, ili najmanje 5% vijabilnih ćelija i 95% nevijabilnih ćelija, ili najmanje 10% vijabilnih ćelija i 90% nevijabilnih ćelija, ili najmanje 15% vijabilnih ćelija i 85% nevijabilnih ćelija, ili najmanje 20% vijabilnih ćelija i 80% nevijabilnih ćelija, ili najmanje 25% vijabilnih ćelija i 75% nevijabilnih ćelija, ili najmanje 30% vijabilnih ćelija i 70% nevijabilnih ćelija, ili najmanje 35% vijabilnih ćelija i 65% nevijabilnih ćelija, ili najmanje 40% vijabilnih ćelija i 60% nevijabilnih ćelija, ili najmanje 45% vijabilnih ćelija i 55% nevijabilnih ćelija, ili najmanje 50% vijabilnih ćelija i 50% nevijabilnih ćelija, ili najmanje 55% vijabilnih ćelija i 45% nevijabilnih ćelija, ili najmanje 60% vijabilnih ćelija i 40% nevijabilnih ćelija, ili najmanje 65% vijabilnih ćelija i 35% nevijabilnih ćelija, ili najmanje 70% vijabilnih ćelija i 30% nevijabilnih ćelija, ili najmanje 75% vijabilnih ćelija i 25% nevijabilnih ćelija, ili najmanje 80% vijabilnih ćelija i 20% nevijabilnih ćelija, ili najmanje 85% vijabilnih ćelija i 15% nevijabilnih ćelija, ili najmanje 90% vijabilnih ćelija i 10% nevijabilnih ćelija, ili najmanje 95% vijabilnih ćelija i 5% nevijabilnih ćelija, ili najmanje 99% vijabilnih ćelija i 1% nevijabilnih ćelija.

[0051] Postoje različiti postupci za inaktivaciju ćelija dostupni u stanju tehnike, uključujući toplotnu inaktivaciju, inaktivaciju mikrotalasima, inaktivaciju pritiskom, inaktivaciju kiselinom, inaktivaciju bazom, inaktivaciju alkoholom i inaktivaciju peroksidom.

[0052] U konkretnom primeru izvođenja prvog postupka pronalaska, inaktivacija je odabrana iz grupe koja se sastoji od toplotne inaktivacije, inaktivacije mikrotalasima, inaktivacije pritiskom, inaktivacije kiselinom, inaktivacije bazom, inaktivacije alkoholom i inaktivacije peroksidom.

[0053] Pojam "toplotna inaktivacija", kako se ovde koristi, odnosi se na inaktivaciju ćelija upotrebom visokih temperatura. Obično, ovo se postiže povećanjem temperature ćelija ili medijuma koji ih sadrži na iznad 50 °C. Postupci pogodni za toplotnu inaktivaciju su dobro poznati u stanju tehnike i uključuju, bez ograničenja, postupak opisan u odeljku Primeri, koji se sastoji od inkubacije kulture koja sadrži probiotski soj pronalaska na 120°C tokom 20 min i ostavljanja kulture da se ohladi do sobne temperature.

[0054] Pojam "inaktivacija mikrotalasima", kako se ovde koristi, odnosi se na inaktivaciju ćelija upotrebom mikrotalasa. Postupci pogodni za inaktivaciju mikrotalasima su dobro poznati u stanju tehnike i uključuju, bez ograničenja, podvrgavanje ćelija ili medijuma koji sadrži probiotski soj pronalaska mikrotalasima upotrebom laboratorijskog mikrotalasnog aparata. Na primer, inaktivacija može da se postigne postepenim povećanjem tokom 3 min snage aparata do 300 W, i održavanjem ovih uslova tokom dodatnih 5 min.

1

[0055] Pojam "inaktivacija pritiskom", kako se ovde koristi, odnosi se na inaktivaciju ćelija upotrebom pritiska. Postupci pogodni za inaktivaciju pritiskom su dobro poznati u stanju tehnike i uključuju, bez ograničenja, homogenizaciju, na primer upotrebom homogenizera ili francuske prese. Na primer, ćelijska inaktivacija može da se ostvari upotrebom homogenizera visokog pritiska na pritisku od 1500-2000 bara i 15-20 pulseva/min tokom 10 min.

[0056] Pojam "inaktivacija kiselinom", kako se ovde koristi, odnosi se na inaktivaciju ćelija snižavanjem pH. Ovo se obično postiže dodavanjem kiseline u ćelije ili u medijum koji ih sadrži i naknadnom neutralizacijom ćelija ili medijuma. U svrhu inaktivacije ćelija poželjne su jake kiseline, uključujući, bez ograničenja, hlorovodoničnu kiselinu (HCl), jodovodoničnu kiselinu (HI), bromovodoničnu kiselinu (HBr), perhlornu kiselinu (HClO4), azotnu kiselinu (HNO3) i sumpornu kiselinu (H2SO4). Jačina kiseline odnosi se na njenu sposobnost ili tendenciju da otpusti proton. Na primer, inaktivacija može da se ostvari dodavanjem H2SO4u ćelije dok se ne dostigne koncentracija od 80 mM, inkubacijom ćelija na 55°C tokom 4 h, i neutralizacijom dodavanjem 10 M NaOH dok pH ne bude 7.

[0057] Analogno, pojam "inaktivacija bazom", kako se ovde koristi, odnosi se na inaktivaciju ćelija upotrebom povećanja pH. Ovo se obično postiže dodavanjem baze u ćelije ili medijum koji ih sadrži i naknadnom neutralizacijom ćelija ili medijuma. U svrhu inaktivacije ćelija poželjne su jake baze, uključujući, bez ograničenja, kalijum hidroksid (KOH), barijum hidroksid [Ba(OH)2], cezijum hidroksid (CsOH), natrijum hidroksid (NaOH), stroncijum hidroksid [Sr(OH)2], kalcijum hidroksid [Ca(OH)2], litijum hidroksid (LiOH) i rubidijum hidroksid (RbOH). Jačina baze odnosi se na njenu sposobnost da deprotonizuje kiselinu. Na primer, inaktivacija može da se ostvari dodavanjem NaOH u ćelije dok se ne dostigne koncentracija od 80 mM, inkubacijom ćelija na 55°C tokom 4 h, i neutralizacijom dodavanjem 96% H2SO4dok pH ne bude 7.

[0058] Pojam "inaktivacija peroksidom", kako se ovde koristi, odnosi se na inaktivaciju ćelija upotrebom peroksida. Peroksid je jedinjenje koje sadrži jednostruku vezu kiseonik―kiseonik ili peroksidni anjon, O2<2->, i uključuje vodonik peroksid (H2O2), superokside, dioksigenile, ozone i ozonide. Na primer, ćelijska inaktivacija može da se ostvari inkubacijom ćelija u 1,5% (zapr./zapr.) H2O2na 37°C tokom 1 h. Zatim, H2O2se uklanja tretiranjem ćelija katalazom.

[0059] Pojam "inaktivacija alkoholom", kako se ovde koristi, odnosi se na inaktivaciju ćelija upotrebom alkohola. Alkohol je organsko hidroksilno jedinjenje sa -OH funkcionalnom grupom vezanom za zasićeni atom ugljenika, i uključuje etanol, metanol, izopropanol, butanol. Na primer, ćelijska inaktivacija može da se ostvari pravljenjem razblaženja 1:1 ćelijske kulture sa 96% etanolom, i inkubacijom na 37°C tokom 1 h. Zatim, etanol se uklanja uparavanjem na rotacionom uparivaču ili uređaju Rotavap.

[0060] U poželjnom primeru izvođenja, inaktivacija je toplotna inaktivacija.

[0061] Kao rezultat koraka inaktivacije, ćelije probiotskog soja pronalaska postaju nevijabilne, ili čak mrtve.

[0062] Alternativno, prvi postupak pronalaska obuhvata korak kultivacije ćelija na pH između 6 i 9 tokom faze njihovog aktivnog rasta.

[0063] Kako bi se ćelije gajile prema ovoj alternativi prvog postupka pronalaska, neophodno je da medijum za kulturu ima pH između 6 i 9, poželjno između 6 i 8,5, poželjnije između 6 i 8, čak poželjnije između 6 i 7,5, čak poželjnije između 6 i 7, ili čak poželjnije između 6 i 6,5. U konkretnom primeru izvođenja, pH je 6.

[0064] Stručnjak u ovoj oblasti, koristeći uobičajeno opšte znanje, odmah će razumeti da pH između 6 i 9 može da se dobije upotrebom medijuma sa tom pH vrednošću. Medijumi sa pH unutar ovog opsega su dobro poznati u stanju tehnike, ali pH između 6 i 9 može takođe da se dobije u bilo kom medijumu podešavanjem pH pogodnom kiselinom, kao što je HCl, ili bazom, kao što je NaOH.

[0065] U još jednom konkretnom primeru izvođenja, prvi postupak pronalaska obuhvata korak kultivacije ćelija na pH od 6 do 9, i dodatno obuhvata korak inaktivacije navedenih ćelija.

[0066] Pojam "faza aktivnog rasta", kako se ovde koristi, odnosi se na stadijum bakterijskog rasta koji se karakteriše povećanjem ukupne biomase ili broja ćelija. Bakterijski rast može da se izrazi u obliku krive rasta, koja obično grafički predstavlja log broja ćelija u zavisnosti od vremena. Rast bakterija u šaranoj kulturi može se modelovati sa četiri različite faze:

• Lag faza, tokom koje se bakterije prilagođavaju uslovima rasta i brzina povećanja broja ćelija je minimalna.

• Log faza ili eksponencijalna faza, koju karakteriše brzina rasta koja se postepeno povećava (rana log/eksponencijalna faza) sve dok ne bude konstantna i maksimalna za konkretne uslove kultivacije.

• Stacionarna faza, koju karakteriše brzina rasta koja opada (rana stacionarna faza) i na kraju dostiže nulu.

• Faza smrti, tokom koje broj vijabilnih ćelija u kulturi opada.

[0067] Prema tome, stručnjak u ovoj oblasti će odmah shvatiti da se faza aktivnog rasta proteže od rane log/eksponencijalne faze do rane stacionarne faze.

[0068] Rast bakterija se može meriti praćenjem broja ćelija, merenjem povećanja suve težine biomase formirane u datom vremenskom intervalu, praćenjem preuzimanja i metabolizma (ili oslobađanja) određenih supstanci, i merenjem količine radioaktivnog metabolita ugrađenog u biomasu u datom vremenu. Tipično, broj ćelija se meri određivanjem koncentracije bakterija u

1

suspenziji merenjem optičke gustine u spektrofotometru; za ovu svrhu uglavnom se koristi OD600.

[0069] Ćelije koje nastaju kao rezultat prvog postupka pronalaska imaju sposobnost apsorpcije holesterola koja je povećana u odnosu na ćelije koje nisu podvrgnute inaktivaciji.

[0070] Pojam "povećana sposobnost apsorpcije holesterola", kako se ovde koristi, odnosi se na sposobnost apsorpcije holesterola koja je najmanje 101%, najmanje 105%, najmanje 110%, najmanje 120%, najmanje 130%, najmanje 140%, najmanje 150%, najmanje 160%, najmanje 170%, najmanje 180%, najmanje 190%, najmanje 200%, najmanje 250%, najmanje 300%, najmanje 500%, najmanje 1000% ili više od one koju ispoljava ćelija koja nije podvrgnuta inaktivaciji. Postupci pogodni za određivanje sposobnosti apsorpcije holesterola ćelije uključuju postupak opisan u odeljku Primeri ove prijave patenta, koji se zasnivaju na detekciji ugradnje fluoresterola iz micela u bakterije fluorometrijom ili fluorocitometrijom.

[0071] Ovaj dokument takođe razmatra ćeliju dobijenu prvim postupkom pronalaska.

[0072] Prema tome, prikaz se odnosi na ćeliju koja može da se dobije postupkom za povećanje sposobnosti apsorpcije holesterola probiotskog soja odabranog od L. reuteri V3401 sa pristupnim brojem CECT 8605 i B. breve BT820 sa pristupnim brojem CECT 8606, ili varijante navedenog soja koji ima sposobnost apsorpcije holesterola, koji obuhvata korak inaktivacije ćelija.

[0073] Prikaz se takođe odnosi na ćeliju koja može da se dobije postupkom za povećanje sposobnosti apsorpcije holesterola probiotskog soja odabranog od L. reuteri V3401 sa pristupnim brojem CECT 8605 i B. breve BT820 sa pristupnim brojem CECT 8606, ili varijante navedenog soja koja ima sposobnost apsorpcije holesterola, koji obuhvata korak kultivacije ćelija na pH 6 ili više.

[0074] Iznenađujuće, autori pronalaska su takođe primetili da ćelije sa postojećom sposobnošću da apsorbuju holesterol mogu da budu modifikovane kako bi se povećala njihova sposobnost apsorpcije holesterola. Navedena modifikacija se vrši inkubacijom ćelija sa ćelijskim ekstraktom dobijenim iz soja CECT 8605 L. reuteri V3401, kao što je pokazano u primeru 7. Agens koji izaziva ovo povećanje aktivnosti apsorpcije holesterola je identifikovan kao enzim sa aktivnošću murein-hidrolaze. Bez želje za vezivanjem za bilo kakvu teoriju, smatra se da peptidoglikanhidrolaza ima ulogu u permeabilizaciji ćelijskog zida mikroorganizma koji ima sposobnost apsorpcije holesterola, ili u povećanju afiniteta njegovog ćelijskog zida za micele koje sadrže holesterol. To bi rezultiralo povećanom količinom holesterola koju apsorbuje mikroorganizam. Štaviše, izgleda da je ovaj efekat specifičan za peptidoglikan-hidrolazu koju eksprimira soj CECT 8605 L. reuteri V3401.

1

[0075] Prema tome, u još jednom aspektu, pronalazak se odnosi na postupak za dobijanje mikroorganizma sa povećanom sposobnošću apsorpcije holesterola, u nastavku označen kao "drugi postupak pronalaska", koji obuhvata dovođenje u kontakt mikroorganizma koji ima sposobnost apsorpcije holesterola sa kompozicijom koja sadrži enzim sa aktivnošću peptidoglikan-hidrolaze, pri čemu kompozicija koja sadrži aktivnost peptidoglikan-hidrolaze predstavlja proteinski sadržaj ćelije soja CECT 8605 L. reuteri V3401 i pri čemu je mikroorganizam koji ima sposobnost apsorpcije holesterola soj CECT 8606 B. breve BT820.

[0076] Pojmovi "sposobnost apsorpcije holesterola" i "povećana sposobnost apsorpcije holesterola" su detaljno opisani u kontekstu probiotskog soja pronalaska i prvog postupka pronalaska, i njihove definicije i primeri izvođenja su ovde uključeni referencom.

[0077] Drugi postupak pronalaska obuhvata korak dovođenja u kontakt mikroorganizma koji ima sposobnost apsorpcije holesterola sa kompozicijom koja sadrži peptidoglikan-hidrolazu.

[0078] Pojam "mikroorganizam", kako se ovde koristi, odnosi se na mikroskopski organizam, koji može da bude pojedinačna ćelija ili višećelijski organizam, i može takođe da bude prokariotski ili eukariotski organizam sa sposobnošću apsorpcije holesterola. Postupci za određivanje da li mikroorganizam poseduje sposobnost da apsorbuje holesterol detaljno su opisani u kontekstu probiotskog soja pronalaska i ovde su uključeni referencom. Mikroorganizam koji ima sposobnost apsorpcije holesterola je prokariotski. U još jednom konkretnom primeru izvođenja, mikroorganizam koji ima sposobnost apsorpcije holesterola je eukariotski.

[0079] U prikazu, mikroorganizam koji ima sposobnost apsorpcije holesterola je bakterija soja CECT 8605 L. reuteri V3401. U još jednom poželjnom primeru izvođenja, mikroorganizam koji ima sposobnost apsorpcije holesterola je bakterija soja CECT 8606 B. breve BT820.

[0080] Za potrebe pronalaska, kompozicija koja dolazi u kontakt sa mikroorganizmom koji ima sposobnost apsorpcije holesterola sadrži peptidoglikan-hidrolazu. Pojam "peptidoglikanhidrolaza" ili "murein-hidrolaza", kako se ovde koristi, odnosi se na enzim koji katalizuje hidrolizu peptidoglikana, odnosno enzim sposoban da cepa kovalentne veze u peptidoglikanskom sakulusu ili njegovim fragmentima. Fiziološke funkcije ovih enzima uključuju regulaciju rasta ćelijskog zida, odvajanje ćerki ćelija tokom deobe ćelija i autolizu, i metabolički obrt peptidoglikana tokom rasta, gde proizvodi metaboličkog obrta služe kao signalni molekuli za prepoznavanje bakterija od strane drugih organizama i, kod nekih bakterija, za indukciju β-laktamaze. Specijalizovane hidrolaze proširuju pore u peptidoglikanu za sklapanje velikih kompleksa koji prolaze kroz omotač (pili, flagele, sistemi sekrecije), ili specifično cepaju peptidoglikan tokom sporulacije ili klijanja spora. Osim toga, peptidoglikan-hidrolaze su

1

uključene u fenomene lize kao što su fratricid ili razvojna liza koji se javljaju u bakterijskim populacijama.

[0081] Aktivnost peptidoglikan-hidrolaze se odnosi na hidrolizu amidnih, peptidnih i glikozidnih veza u peptidoglikanu. Različite peptidoglikan-hidrolaze kao i njihova odgovarajuća mesta cepanja su opisani u Vollmer et al., 2008 (Vollmer et al., 2008, FEMS Microbiol Rev 32:259-86). Ukratko, peptidoglikan-hidrolaze uključuju sledeće:

• N-Acetilmuramil-L-alanin amidaze, koje hidrolizuju amidnu vezu između MurNAc i N-terminalne rezidue L-alanina matičnog peptida. One uključuju neke amidaze (anhAmi) koje specifično cepaju rezidue 1,6-anhidroMurNAc.

• Karboksipeptidaze koje hidrolizuju peptidne veze za uklanjanje C-terminalnih D- ili L-aminokiselina. One uključuju DD-karboksipeptidazu, LD-karboksipeptidazu i DL-karboksipeptidazu.

• Endopeptidaze, koje cepaju amidne veze u peptidima. One uključuju DD-endopeptidazu, LD-endopeptidazu, i DL-endopeptidazu.

• Glikozidaze, koje cepaju lance glikana. Postoje tri tipa glikozidaza:

a) N-acetilglukozaminidaze, koje hidrolizuju glikozidnu vezu između N-acetil-β-D-glukozaminskih rezidua i susednih monosaharida,

b) lizozimi i

c) litičke transglikozilaze,

Lizozimi i litičke transglikozilaze su takođe zajedno poznate kao N-acetil-β-D-muramidaze (muramidaze) i cepaju istu glikozidnu vezu, tj. β1,4-glikozidnu vezu između rezidua MurNAc i GlcNAc u peptidoglikanu (sl.1B).

[0082] Aktivnost peptidoglikan-hidrolaze je često specifična za određeni tip peptidoglikana, za prisustvo ili odsustvo sekundarnih modifikacija, ili za peptidoglikan visoke molekulske težine ili za male fragmente. Dakle, peptidoglikan-hidrolaza je odabrana iz grupe koja se sastoji od N-acetilmuramil-L-alanin amidaze, karboksipeptidaze, endopeptidaze ili glikozidaze.

[0083] U konkretnom primeru izvođenja, peptidoglikan-hidrolaza je N-acetilmuramil-L-alanin amidaza. U još jednom konkretnom primeru izvođenja, peptidoglikan-hidrolaza je karboksipeptidaza. U još jednom konkretnom primeru izvođenja, peptidoglikan-hidrolaza je endopeptidaza. U još jednom konkretnom primeru izvođenja, peptidoglikan-hidrolaza je glikozidaza odabrana iz grupe koja se sastoji od N-acetilglukozaminidaze, lizozima i litičke transglikozilaze.

1

[0084] U poželjnom primeru izvođenja, glikozidaza je N-acetilglukozaminidaza. U još jednom poželjnom primeru izvođenja, glikozidaza je lizozim. U još jednom poželjnom primeru izvođenja, glikozidaza je litička transglikozilaza.

[0085] Peptidoglikan-hidrolaza je peptidoglikan-hidrolaza specifična za soj CECT 8605 L. reuteri V3401.

[0086] Da bi peptidoglikan-hidrolaza ispoljila dejstvo na povećanje sposobnosti mikroorganizma koji ima sposobnost apsorpcije holesterola da apsorbuje holesterol, peptidoglikan-hidrolaza treba da bude dovedena u kontakt sa navedenim organizmom. Stručnjak u ovoj oblasti će lako razumeti da korak dovođenja u kontakt može da se sprovede na različite načine. Jedan od tih načina je rekombinantna ekspresija peptidoglikan-hidrolaze u navedenom organizmu.

[0087] Prema tome, kompozicija koja sadrži peptidoglikan-hidrolazu predstavlja proteinski sadržaj ćelije soja CECT 8605 L. reuteri V3401.

[0088] Rekombinantna ekspresija peptidoglikan-hidrolaze može se izvesti primenom postupaka koji su uobičajeni u stanju tehnike. Poželjno, nukleotidna sekvenca koja kodira peptidoglikanhidrolazu takođe kodira bilo koji prirodni signalni peptid koji enzim može da sadrži. Na primer, nukleotidna sekvenca može da bude funkcionalno vezana za sekvence koje regulišu ekspresiju, čime se formira genski konstrukt ili ekspresiona kaseta. Kako se ovde koristi, pojam "funkcionalno povezan" znači da je peptidoglikan-hidrolaza kodirana nukleotidnom sekvencom eksprimirana u ispravnom okviru čitanja pod kontrolom kontrolne sekvence ili sekvence koja reguliše ekspresiju. Ekspresiona kaseta pronalaska može se dobiti tehnikama molekularne biologije koje su dobro poznate u stanju tehnike. Kontrolne sekvence su sekvence koje kontrolišu i regulišu transkripciju i, gde je primenljivo, translaciju navedene peptidoglikanhidrolaze, i uključuju sekvence promotora, sekvence koje kodiraju regulatore transkripcije, sekvence vezivanja ribozoma (RBS) i/ili sekvence terminatora transkripcije. Promotori pogodni u kontekstu pronalaska uključuju, bez ograničenja, inducibilne i konstitutivne promotore. Ekspresiona kaseta može dalje da uključuje pojačivač, koji može biti susedan ili udaljen od sekvence promotora i može da funkcioniše tako što povećava transkripciju. U konkretnom primeru izvođenja, navedena kontrolna sekvenca ekspresije je funkcionalna u prokariotskim ćelijama. U još jednom konkretnom primeru izvođenja, navedena kontrolna sekvenca ekspresije je funkcionalna u eukariotskim ćelijama.

[0089] Povoljno, ekspresiona kaseta dalje sadrži marker ili gen koji kodira motiv ili fenotip koji omogućava selekciju ćelije domaćina transformisane navedenom ekspresionom kasetom. Ilustrativni primeri navedenih markera koji bi mogli da budu prisutni u ekspresionoj kaseti

1

pronalaska uključuju gene otpornosti na antibiotike, gene otpornosti na toksična jedinjenja, i, uopšteno, sve one koji omogućavaju selekciju genetski transformisanih ćelija.

[0090] Ekspresiona kaseta može da se umetne u odgovarajući vektor. Izbor vektora zavisiće od ćelije domaćina u koju će naknadno biti uveden, tj., od mikroorganizma koji ima sposobnost apsorpcije holesterola. Za ilustrativne svrhe, vektor u koji se uvodi navedena sekvenca nukleinske kiseline može da bude plazmid ili vektor koji, kada se unese u ćeliju domaćina, jeste ili nije integrisan u genom navedene ćelije. Dobijanje navedenog ekspresionog vektora može da se sprovede uobičajenim postupcima poznatim stručnjacima u ovoj oblasti. U konkretnom primeru izvođenja, navedeni rekombinantni vektor je vektor koristan za transformaciju prokariotskih ćelija. U konkretnom primeru izvođenja, navedeni rekombinantni vektor je vektor koristan za transformaciju eukariotskih ćelija.

[0091] Vektor koji sadrži sekvencu koja kodira peptidoglikan-hidrolazu može da se koristi za transformaciju, transfekciju ili infekciju ćelija mikroorganizma koji ima sposobnost apsorpcije holesterola. Transformisane, transfektovane ili inficirane ćelije mogu da se dobiju uobičajenim postupcima poznatim stručnjacima u ovoj oblasti. Takve ćelije mogu da budu prokariotske ili eukariotske. Dakle, rezultujuća transformisana, transfektovana ili inficirana ćelija sadrži sekvencu koja kodira peptidoglikan-hidrolazu.

[0092] Konstrukt gena, ekspresiona kaseta i vektor koji sadrži sekvencu koja kodira peptidoglikan-hidrolazu su takođe aspekti predmetnog pronalaska.

[0093] Jednom kada mikroorganizam koji ima sposobnost apsorpcije holesterola sadrži ekspresioni vektor koji sadrži peptidoglikan-hidrolazu, navedena peptidoglikan-hidrolaza može da bude rekombinantno eksprimirana postupcima koji su uobičajeno poznati stručnjacima u ovoj oblasti. Na primer, rekombinantna ekspresija peptidoglikan-hidrolaze može da bude inducibilna ili konstitutivna. Poželjno, rekombinantno eksprimirana peptidoglikan-hidrolaza se izlučuje.

[0094] Prema tome, rezultujuća rekombinantno eksprimirana peptidoglikan-hidrolaza čini deo kompozicije, poželjno vanćelijske, koja je u kontaktu sa mikroorganizmom koji ima sposobnost apsorpcije holesterola, čime vrši svoju funkciju u povećanju navedene sposobnosti apsorpcije holesterola.

[0095] Budući da se, kako izgleda, peptidoglikan-hidrolaza odgovorna za povećanje kapaciteta apsorpcije holesterola mikroorganizma koji ima sposobnost apsorpcije holesterola specifično eksprimira u soju CECT 8605 L. reuteri V3401, drugi postupak pronalaska se sprovodi primenom proteinskog ekstrakta dobijenog iz navedenog soja.

2

[0096] Dakle, kompozicija koja sadrži peptidoglikan-hidrolazu je proteinski ekstrakt soja CECT 8605 L. reuteri V3401. Poželjno, ćelije soja CECT 8605 L. reuteri V3401 se uzgajaju na pH od 6 ili više.

[0097] Pojam "proteinski ekstrakt", kako se ovde koristi, odnosi se na proteinski sadržaj ćelije. U nekim primerima izvođenja, proteinski ekstrakt se odnosi na "ukupni proteinski ekstrakt" ili "sirovi proteinski ekstrakt", koji se odnosi na kolekciju proteina poreklom iz sojeva prema predmetnom pronalasku i skoro bez fragmenata ili ostataka ćelijskih zidova i velikih organela. U skladu sa jednim ilustrativnim primerom izvođenja, ukupni proteinski ekstrakt tkiva može se dobiti dodavanjem bakterija u pufer za lizu, ali predmetni pronalazak nije ograničen na to. Međutim, ukupni proteinski ekstrakt može da se ekstrahuje bilo kojim postupkom ekstrakcije poznatim u stanju tehnike.

[0098] Postupci za dobijanje proteinskog ekstrakta su uobičajeni i dobro poznati stručnjacima. Obično se proteini uvode u rastvor razbijanjem ćelija koje ih sadrže. Postoji nekoliko postupaka da se to postigne, kao što su ponovljeno zamrzavanje i odmrzavanje, sonikacija, homogenizacija visokim pritiskom, filtracija, ili permeabilizacija organskim rastvaračima.

[0099] U nekim primerima izvođenja, proteinski ekstrakt se najmanje delimično frakcioniše kako bi se obogatila peptidoglikan-hidrolazna aktivnost, čime se dobija "ekstrakt obogaćen peptidoglikan-hidrolazom". Za dobijanje ekstrakta obogaćenog peptidoglikan-hidrolazom može da se koristi bilo koji odgovarajući postupak poznat u stanju tehnike, kao što je afinitetna hromatografija, jonoizmenjivačka hromatografija, filtracija, ultrafiltracija, gel filtracija, elektroforeza, precipitacija solima, i dijaliza itd., koje se pogodno odabiraju i kombinuju da bi se omogućilo razdvajanje i prečišćavanje peptida. Stepen obogaćivanja aktivnošću peptidoglikanhidrolaze može se utvrditi merenjem specifične aktivnosti peptidoglikan-hidrolaze u obogaćenom ekstraktu (tj. jedinica aktivnosti peptidoglikan-hidrolaze po mg proteina), pri čemu povećanje u odnosu na aktivnost u sirovom ekstraktu ukazuje na to da je ekstrakt obogaćen aktivnošću peptidoglikan-hidrolaze. U poželjnom primeru izvođenja, ekstrakt obogaćen peptidoglikan-hidrolazom sadrži aktivnost peptidoglikan hidrolaze koja iznosi najmanje 5%, najmanje 10%, najmanje 20%, najmanje 30%, najmanje 40%, najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90% ili najmanje 100% aktivnosti pronađene u sirovom ekstraktu. U drugom primeru izvođenja, ekstrakt obogaćen peptidoglikan-hidrolazom sadrži aktivnost peptidoglikan hidrolaze koja je najmanje 2 puta, 3 puta, 4 puta, 5 puta, 6 puta, 7 puta, 8 puta, 9 puta, 10 puta, 100 puta, 1000 puta, 10000 puta ili više veća od aktivnosti u sirovom ekstraktu.

[0100] Korak dovođenja u kontakt drugog postupka pronalaska zahteva da kompozicija koja sadrži peptidoglikan-hidrolazu bude u kontaktu sa mikroorganizmom koji ima sposobnost apsorpcije holesterola onoliko vremena, koliko je dovoljno da se peptidoglikan otcepi. Korak dovođenja u kontakt traje najmanje 1 s, najmanje 10 s, najmanje 30 s, najmanje 1 min, najmanje 5 min, najmanje 10 min, najmanje 30 min, najmanje 1 h, najmanje 2 h, najmanje 4 h, najmanje 6 h, najmanje 8 h, najmanje 10 h, najmanje 12 h, najmanje 24 h, ili duže.

[0101] Stručnjak u stanju tehnike će znati da je, da bi se utvrdilo da li je mikroorganizmu povećana sposobnost apsorpcije holesterola, potrebno utvrditi sposobnost apsorpcije holesterola i uporediti je sa sposobnošću apsorpcije holesterola istog mikroorganizma koji nije bio podvrgnut drugom postupku pronalaska. Postupci za određivanje sposobnosti apsorpcije holesterola kod ćelija opisani su u kontekstu probiotskog soja pronalaska, i ovde su uključeni referencom.

[0102] Ovaj dokument takođe razmatra ćeliju dobijenu drugim postupkom pronalaska.

[0103] Prema tome, ćelija koja može da se dobije postupkom za povećanje sposobnosti apsorpcije holesterola kod mikroorganizma koji ima sposobnost apsorpcije holesterola, koji obuhvata dovođenje u kontakt navedenog mikroorganizma sa kompozicijom koja sadrži peptidoglikan-hidrolazu, predstavlja deo predmetnog prikaza.

Kompozicije i hraniva ili nutritivni proizvodi

[0104] Stručnjak u ovoj oblasti će odmah shvatiti da je probiotski soj pronalaska posebno koristan kao deo kompozicije, hraniva ili nutritivnog proizvoda.

[0105] Prema tome, u još jednom aspektu, pronalazak se odnosi na kompoziciju koja sadrži probiotski soj odabran od Lactobacillus reuteri V3401 sa pristupnim brojem CECT 8605 i Bifidobacterium breve BT820 sa pristupnim brojem CECT 8606.

[0106] Pojmovi "probiotski soj", "L. reuteri V3401 sa pristupnim brojem CECT 8605", "B. breve BT820 sa pristupnim brojem CECT 8606", "varijanta" i "sposobnost apsorpcije holesterola", su detaljno opisani u kontekstu probiotskog soja pronalaska, i njihove definicije i primeri izvođenja su ovde uključeni referencom.

[0107] U konkretnom primeru izvođenja, kompozicija sadrži smešu probiotskih sojeva pronalaska.

[0108] Poželjno, kompozicija sadrži najmanje 2, najmanje 3, najmanje 4, ili više sojeva pronalaska, pri čemu je svaki od sojeva zastupljen u kompoziciji u proporciji od 0,1% do 99,9%, poželjno od 1% do 99%, poželjnije od 10% do 90%. U još jednom primeru izvođenja, kompozicija sadrži bilo koji od bakterijskih sojeva pronalaska zajedno sa drugim sojem ili smešom sojeva pri čemu je svaki od sojeva zastupljen u kompoziciji u proporciji od 0,1% do 99,9%, poželjno od 1% do 99%, poželjnije od 10% do 90%. U još jednom primeru izvođenja, pronalazak obezbeđuje kompoziciju koja sadrži supernatant kulture jednog ili većeg broja sojeva prema pronalasku. Poželjno, supernatant je zastupljen u kompoziciji u proporciji od 0,1% do 99,9%, poželjnije od 1% do 99% i čak poželjnije od 10% do 90%.

[0109] U još jednom konkretnom primeru izvođenja, pronalazak se takođe odnosi na kompozicije sojeva ovog pronalaska u liofilizovanom obliku, obliku osušenom zamrzavanjem ili osušenom obliku, koji mogu da se dobiju bilo kojim uobičajenim postupkom poznatim u stanju tehnike.

[0110] U još jednom konkretnom primeru izvođenja, probiotski soj ili njegova smeša je u obliku nevijabilnih ćelija.

[0111] U još jednom aspektu, pronalazak se odnosi na hranivo ili nutritivni proizvod koji sadrži probiotski soj odabran od Lactobacillus reuteri V3401 sa pristupnim brojem CECT 8605 i Bifidobacterium breve BT820 sa pristupnim brojem CECT 8606 koji imaju sposobnost apsorpcije holesterola.

[0112] Pojmovi "probiotski soj", "L. reuteri V3401 sa pristupnim brojem CECT 8605", "B. breve BT820 sa pristupnim brojem CECT 8606", "varijanta" i "sposobnost apsorpcije holesterola", su detaljno opisani u kontekstu probiotskog soja pronalaska, i njihove definicije i primeri izvođenja su ovde uključeni referencom.

[0113] U konkretnom primeru izvođenja, hranivo ili nutritivni proizvod sadrži smešu probiotskih sojeva pronalaska.

[0114] Poželjno, hranivo ili nutritivni proizvod sadrži najmanje 2, najmanje 3, najmanje 4, ili više sojeva pronalaska, pri čemu je svaki od sojeva zastupljen u kompoziciji u proporciji od 0,1% do 99,9%, poželjno od 1% do 99%, poželjnije od 10% do 90%. U još jednom primeru izvođenja, hranivo ili nutritivni proizvod sadrži bilo koji od bakterijskih sojeva pronalaska zajedno sa drugim sojem ili smešom sojeva pri čemu je svaki od sojeva zastupljen u kompoziciji u proporciji od 0,1% do 99,9%, poželjno od 1% do 99%, poželjnije od 10% do 90%. U još jednom primeru izvođenja, pronalazak obezbeđuje hranivo ili nutritivni proizvod koji sadrži supernatant kulture jednog ili većeg broja sojeva prema pronalasku. Poželjno, supernatant je zastupljen u hranivu ili nutritivnom proizvodu u proporciji od 0,1% do 99,9%, poželjnije od 1% do 99% i čak poželjnije od 10% do 90%.

[0115] Neograničavajući primeri odgovarajućih namirnica koje se mogu koristiti u predmetnom pronalasku su mleko, jogurt, sir, surutka, fermentisana mleka, fermentisani proizvodi na bazi mleka, proizvodi na bazi fermentisanih žitarica, proizvodi od fermentisanog mesa, drugi

2

praškovi na bazi mleka ili žitarica, formula za kliničku ishranu, sladoledi, sokovi, hleb, kolači ili bombone, formulacije životinjskog hraniva, polu- ili sintetičke dijetetske formulacije, formule za odojčad, formule kliničke ishrane, sladoledi, sokovi, brašna, hleb, kolači, bombone ili žvake.

[0116] U još jednom primeru izvođenja, hranivo ili nutritivni proizvod koji sadrži probiotski soj pronalaska je u liofilizovanom obliku, obliku osušenom zamrzavanjem ili osušenom obliku, koji mogu da se dobiju bilo kojim uobičajenim postupkom poznatim u stanju tehnike.

[0117] U još jednom primeru izvođenja hraniva ili nutritivnog proizvoda, probiotski soj ili njegova smeša je u obliku nevijabilnih ćelija.

Terapijske upotrebe

[0118] Pronalazači su pokazali da probiotski sojevi pronalaska mogu da smanje apsorpciju fluoresterola ćelija HT-29, enterocitne ćelijske linije, kada se ko-kultivišu u prisustvu micela koje sadrže fluoresterol, kao što je pokazano u primeru 1. Ovo je bio rezultat kompeticije probiotskih ćelija sa ćelijama HT-29 za hvatanje micela (videti primer 2). Ovaj efekat može da se iskoristi u lečenju bolesti kod kojih nivo holesterola u plazmi ima ulogu, kao na primer kod dislipidemija. Pronalazači su pokazali da unošenje probiotskih sojeva pronalaska snižava ukupni holesterol u plazmi, indeks LDL/HDL, i nivo glikemije u in vivo modelu hiperholesterolemije (videti primer 8).

[0119] Prema tome, u još jednom aspektu, pronalazak se odnosi na probiotski soj odabran od Lactobacillus reuteri V3401 sa pristupnim brojem CECT 8605 i Bifidobacterium breve BT820 sa pristupnim brojem CECT 8606 za upotrebu kao lek.

[0120] U još jednom aspektu, pronalazak se odnosi na probiotski soj odabran od Lactobacillus reuteri V3401 sa pristupnim brojem CECT 8605 i Bifidobacterium breve BT820 sa pristupnim brojem CECT 8606 za upotrebu u lečenju i/ili prevenciji dislipidemije.

[0121] Pojmovi "probiotski soj", "L. reuteri V3401 sa pristupnim brojem CECT 8605", "B. breve BT820 sa pristupnim brojem CECT 8606", "varijanta" i "sposobnost apsorpcije holesterola", su detaljno opisani u kontekstu probiotskog soja pronalaska, i njihove definicije i primeri izvođenja su ovde uključeni referencom.

[0122] Pojam "lečenje" ili "terapija", kako se ovde koristi, uključuje bilo koji proces, radnju, primenu, terapiju, ili slično, pri čemu se subjektu (ili pacijentu), uključujući ljudsko biće, pruža medicinska pomoć sa ciljem poboljšanja stanja subjekta, direktno ili indirektno, ili usporavanja napredovanja stanja ili poremećaja kod subjekta, ili ublažavanje najmanje jednog simptoma bolesti ili poremećaja koji se leči. Konkretno, pojam lečenje se odnosi na primenu probiotskog soja odabranog od Lactobacillus reuteri V3401 sa pristupnim brojem CECT 8605 i Bifidobacterium breve BT820 sa pristupnim brojem CECT 8606, ili varijante navedenog soja koja ima sposobnost apsorpcije holesterola kod subjekta kome je dijagnostikovana dislipidemija.

[0123] Pojam "prevencija", "sprečavanje" ili "sprečiti", kako se ovde koristi, odnosi se na primenu probiotskog soja odabranog od Lactobacillus reuteri V3401 sa pristupnim brojem CECT 8605 i Bifidobacterium breve BT820 sa pristupnim brojem CECT 8606, ili varijante navedenog soja koja ima sposobnost apsorpcije holesterola kod subjekta kome nije dijagnostikovana dislipidemija, ali kod koga bi se normalno očekivao razvoj navedene bolesti ili koji je pod povećanim rizikom od navedene bolesti. Prevencijom se teži da se izbegne pojava dislipidemije. Prevencija može da bude potpuna (npr. potpuno odsustvo bolesti). Prevencija takođe može da bude delimična, tako da je na primer pojava bolesti kod subjekta manja od one koja bi se javila bez primene inhibitora predmetnog pronalaska. Prevencija se takođe odnosi na smanjenu osetljivost na kliničko stanje.

[0124] Pojam "subjekt", kako se ovde koristi, odnosi se na sve životinje klasifikovane kao sisari i ptice i uključuje, ali nije ograničen na, domaće i životinje sa farme, primate i ljude, npr. ljudska bića, nehumane primate, krave, konje, svinje, ovce, koze, pse, mačke, glodare, kokoške, patke, guske, labudove, fazane, golubove, gugutke, ili nojeve. Poželjno, pacijent je muškarac ili žena bilo koje starosti ili rase.

[0125] Pojam "dislipidemija", kako se ovde koristi, odnosi se na abnormalnu količinu lipida i lipidnih proteina u krvi, odnosno količinu lipida koja je povećana ili smanjena u odnosu na normalne vrednosti. Lipidi i lipidni proteini mogu biti:

• Holesterol, koji u abnormalnim količinama može da izazove hiperholesterolemiju, uključujući porodičnu hiperholesterolemiju zbog defekta na hromozomu 19 (19p13.1-13.3), i hipoholesterolemiju.

• Gliceridi, kao što su triliceridi, koji u abnormalnim količinama mogu da izazovu hipertrigliceridemiju i hipotrigliceridemiju.

• Lipoproteini, kao što su LDL i HDL, koji u abnormalnim količinama mogu da izazovu hiperlipoproteinemiju i hipolipoproteinemiju.

[0126] Probiotski soj pronalaska, zbog svoje sposobnosti da apsorbuje holesterol, posebno je pogodan za lečenje dislipidemije koju karakterišu povećani nivoi lipida ili lipidnih proteina.

[0127] Prema tome, u konkretnom primeru izvođenja dislipidemija je hiperholesterolemija. Pojam "hiperholesterolemija", kako se ovde koristi, odnosi se na bilo koje zdravstveno stanje u kome su nivoi holesterola u krvi povišeni iznad klinički preporučenih nivoa. Na primer, ako se holesterol meri upotrebom lipoproteina niske gustine (LDL), hiperholesterolemija može da postoji ako su izmereni nivoi LDL iznad, na primer, približno 70 mg/dl. Alternativno, ako se

2

holesterol meri upotrebom slobodnog holesterola u plazmi, hiperholesterolemija može da postoji ako su izmereni nivoi slobodnog holesterola iznad, na primer, približno 200-220 mg/dl.

[0128] U još jednom konkretnom primeru izvođenja dislipidemija je hipertrigliceridemija. Pojam "hipertrigliceridemija", kako se ovde koristi, odnosi se na visoke nivoe triglicerida u krvi. Na osnovu nivoa natašte, blaga i umerena hipertrigliceridemija se dijagnostikuje pri nivoima triglicerida od 150-999 mg/dl, a teška i veoma teška hipertrigliceridemija se dijagnostikuje pri nivoima triglicerida višim od 1000 mg/dl.

[0129] U još jednom konkretnom primeru izvođenja dislipidemija je hiperlipoproteinemija. Pojam "hiperlipoproteinemija", kako se ovde koristi, odnosi se na abnormalno povišene nivoe bilo kog lipoproteina u krvi. Lipoproteini uključuju hilomikrone, VLDL, LDL i IDL. Visoki nivoi lipoproteina su povezani sa aterosklerozom. Hiperlipoproteinemija se deli na sledećih pet tipova:

• Tip I: Hiperlipidemija izazvana mastima ili idiopatska porodična hiperlipidemija, što je retko stanje uzrokovano nedostatkom ili abnormalnom lipazom, koje karakteriše nivo triglicerida od 1000-10000 mg/dl i više.

• Tip II: Porodična hiperbetalipoproteinemija i esencijalna porodična hiperholesterolemija uzrokovana deficijentnim površinskim receptorima ćelije, koju karakteriše povišen holesterol i trigliceridi, povišeni lipoproteini niske gustine (LDL) i lipoproteini veoma niske gustine (VLDL).

• Tip III: Porodična "široka-beta" bolest tuberoznog ksantoma uzrokovana deficijentnim receptorima lipoproteina niske gustine, koju karakteriše povišen holesterol i trigliceridi; povišeni lipoproteini intermedijarne gustine.

• Tip IV: Endogena hipertrigliceridemija i hiperbetalipoproteinemija sa idiopatskim uzrokom, koju karakterišu nivoi triglicerida niži od 1000 mg/dL, normalan holesterol, povišeni VLDL.

• Tip V: Mešovita hipertrigliceridemija zbog nepravilnog klirensa triglicerida, koju karakterišu nivoi triglicerida viši od 1000 mg/dL, povišeni holesterol, normalni LDL.

[0130] Budući da su različite dislipidemije uključene u insulinsku rezistenciju, verovatno zbog niskih nivoa HDL u krvi, probiotski soj pronalaska je takođe koristan u lečenju insulinske rezistencije ili metaboličkog sindroma.

[0131] Prema tome, u još jednom aspektu, pronalazak se odnosi na probiotski soj odabran od Lactobacillus reuteri V3401 sa pristupnim brojem CECT 8605 i Bifidobacterium breve BT820 sa pristupnim brojem CECT 8606 za upotrebu u lečenju i/ili prevenciji metaboličkog sindroma. Pojam "metabolički sindrom" ili "sindrom insulinske rezistencije" ili "metabolički sindrom X" ili

2

"kardiometabolički sindrom" ili "sindrom X", kako se ovde koristi, odnosi se na poremećaj korišćenja i skladištenja energije, dijagnostikovan istovremenom pojavom tri od pet sledećih zdravstvenih stanja: abdominalna (centralna) gojaznost, povišen krvni pritisak, povišena glukoza u plazmi natašte, hipertrigliceridemija, i niski nivoi holesterola visoke gustine (HDL). Metabolički sindrom povećava rizik od razvoja kardiovaskularne bolesti, posebno srčane insuficijencije i dijabetesa.

[0132] U još jednom aspektu, ovaj dokument se odnosi na upotrebu probiotskog soja odabranog od Lactobacillus reuteri V3401 sa pristupnim brojem CECT 8605 i Bifidobacterium breve BT820 sa pristupnim brojem CECT 8606, ili varijante navedenog soja koja ima sposobnost apsorpcije holesterola kao hipoholesterolemijskog agensa.

[0133] Pojam "hipoholesterolemijski agens", kako se ovde koristi, odnosi se na agens koji izaziva snižavanje nivoa holesterola u krvi.

[0134] U još jednom aspektu, pronalazak se odnosi na kompoziciju koja sadrži probiotski soj odabran od Lactobacillus reuteri V3401 sa pristupnim brojem CECT 8605 i Bifidobacterium breve BT820 sa pristupnim brojem CECT 8606, za upotrebu kao lek.

[0135] U još jednom aspektu, pronalazak se odnosi na kompoziciju koja sadrži probiotski soj odabran od Lactobacillus reuteri V3401 sa pristupnim brojem CECT 8605 i Bifidobacterium breve BT820 sa pristupnim brojem CECT 8606, za upotrebu u lečenju i/ili prevenciji dislipidemije.

[0136] U još jednom aspektu, pronalazak se odnosi na kompoziciju koja sadrži probiotski soj odabran od Lactobacillus reuteri V3401 sa pristupnim brojem CECT 8605 i Bifidobacterium breve BT820 sa pristupnim brojem CECT 8606, za upotrebu u lečenju i/ili prevenciji metaboličkog sindroma.

[0137] U još jednom aspektu, ovaj dokument se odnosi na upotrebu kompozicije koja sadrži probiotski soj odabran od Lactobacillus reuteri V3401 sa pristupnim brojem CECT 8605 i Bifidobacterium breve BT820 sa pristupnim brojem CECT 8606, ili varijante navedenog soja koja ima sposobnost apsorpcije holesterola, kao hipoholesterolemijskog agensa.

[0138] Pojmovi "probiotski soj", "L. reuteri V3401 sa pristupnim brojem CECT 8605", "B. breve BT820 sa pristupnim brojem CECT 8606", "varijanta", "sposobnost apsorpcije holesterola", "dislipidemija", "metabolički sindrom" i "hipoholesterolemijski agens" prethodno su detaljno opisani i njihove definicije i primeri izvođenja su ovde uključeni referencom.

[0139] U još jednom aspektu, pronalazak se odnosi na hranivo ili nutritivni proizvod koji sadrži probiotski soj odabran od Lactobacillus reuteri V3401 sa pristupnim brojem CECT 8605 i Bifidobacterium breve BT820 sa pristupnim brojem CECT 8606, za upotrebu kao lek.

2

[0140] U još jednom aspektu, pronalazak se odnosi na hranivo ili nutritivni proizvod koji sadrži probiotski soj odabran od Lactobacillus reuteri V3401 sa pristupnim brojem CECT 8605 i Bifidobacterium breve BT820 sa pristupnim brojem CECT 8606, za upotrebu u lečenju i/ili prevenciji dislipidemije.

[0141] U još jednom aspektu, pronalazak se odnosi na hranivo ili nutritivni proizvod koji sadrži probiotski soj odabran od Lactobacillus reuteri V3401 sa pristupnim brojem CECT 8605 i Bifidobacterium breve BT820 sa pristupnim brojem CECT 8606, za upotrebu u lečenju i/ili prevenciji metaboličkog sindroma.

[0142] U još jednom aspektu, ovaj dokument se odnosi na upotrebu hraniva ili nutritivnog proizvoda koji sadrži probiotski soj odabran od Lactobacillus reuteri V3401 sa pristupnim brojem CECT 8605 i Bifidobacterium breve BT820 sa pristupnim brojem CECT 8606, ili varijante navedenog soja koja ima sposobnost apsorpcije holesterola, kao hipoholesterolemijskog agensa.

[0143] Pojmovi "probiotski soj", "L. reuteri V3401 sa pristupnim brojem CECT 8605", "B. breve BT820 sa pristupnim brojem CECT 8606", "varijanta", "sposobnost apsorpcije holesterola", "dislipidemija", "metabolički sindrom" i "hipoholesterolemijski agens" su prethodno detaljno opisani i njihove definicije i primeri izvođenja su ovde uključeni referencom.

Farmaceutski proizvodi

[0144] Stručnjak u ovoj oblasti će odmah shvatiti da je probiotski soj pronalaska posebno koristan kao deo farmaceutskog proizvoda.

[0145] Prema tome, u još jednom aspektu, pronalazak se odnosi na farmaceutski proizvod koji sadrži terapijski efektivnu količinu probiotskog soja odabranog od Lactobacillus reuteri V3401 sa pristupnim brojem CECT 8605 i Bifidobacterium breve BT820 sa pristupnim brojem CECT 8606.

[0146] Pojmovi "probiotski soj", "L. reuteri V3401 sa pristupnim brojem CECT 8605", "B. breve BT820 sa pristupnim brojem CECT 8606", "varijanta" i "sposobnost apsorpcije holesterola", detaljno su opisani u kontekstu probiotskog soja pronalaska, i njihove definicije i primeri izvođenja su ovde uključeni referencom.

[0147] Pojam "terapijski efektivna količina", kako se ovde koristi, odnosi se na količinu probiotskog soja pronalaska potrebnu za postizanje prevencije, izlečenja, odlaganja, smanjenja težine ili ublažavanja jednog ili više uočljivih simptoma dislipidemije, insulinske rezistencije ili metaboličkog sindroma. Termini dislipidemija, insulinska rezistencija i metabolički sindrom su

2

detaljno opisani u kontekstu terapijskih upotreba pronalaska, a njihova definicija i posebnosti su takođe ovde uključeni referencom. Terapijski efektivna količina probiotskog soja prema pronalasku može da se odredi postupcima uobičajenim u stanju tehnike.

[0148] U konkretnom primeru izvođenja, farmaceutski proizvod sadrži smešu probiotskih sojeva pronalaska.

[0149] Poželjno, farmaceutski proizvod sadrži najmanje 2, najmanje 3, najmanje 4, ili više sojeva pronalaska, pri čemu je svaki od sojeva zastupljen u kompoziciji u proporciji od 0,1% do 99,9%, poželjno od 1% do 99%, poželjnije od 10% do 90%. U još jednom primeru izvođenja, kompozicija sadrži bilo koji od bakterijskih sojeva pronalaska zajedno sa još jednim sojem ili smešom sojeva gde je svaki od sojeva zastupljen u kompoziciji u proporciji od 0,1% do 99,9%, poželjno od 1% do 99%, poželjnije od 10% do 90%. U još jednom primeru izvođenja, pronalazak obezbeđuje farmaceutski proizvod koji sadrži supernatant kulture jednog ili većeg broja sojeva prema pronalasku. Poželjno, supernatant je zastupljen u farmaceutskom proizvodu u proporciji od 0,1% do 99,9%, poželjnije od 1% do 99% i čak poželjnije od 10% do 90%.

[0150] U konkretnom primeru izvođenja, farmaceutski proizvod sadrži smešu probiotskih sojeva pronalaska.

[0151] Farmaceutski proizvodi ili kompozicije obezbeđene predmetnim pronalaskom mogu da se primene kod subjekta za lečenje dislipidemije, insulinske rezistencije ili metaboličkog sindroma. Pojmovi dislipidemija, insulinska rezistencija i metabolički sindrom su detaljno opisani u kontekstu terapijskih upotreba pronalaska, i njihove definicije i osobenosti su ovde takođe uključene referencom.

[0152] U još jednom konkretnom primeru izvođenja, farmaceutski proizvod ili kompozicija dodatno sadrži jedan ili više nosača, ekscipijenasa, ili farmaceutski prihvatljivih rastvarača.

[0153] Pojam "farmaceutski prihvatljiv nosač" ili "farmaceutski prihvatljiv rastvarač" ili "farmaceutski prihvatljiv ekscipijens", u kontekstu predmetnog pronalaska, namenjen je da uključuje bilo koji i sve rastvarače, disperzione medijume, premaze i antifungalne agense, i slično, kompatibilne sa farmaceutskom primenom. Upotreba ovakvih nosača i vehikuluma za farmaceutski aktivne supstance je dobro poznata u stanju tehnike, osim ukoliko je bilo koji konvencionalni nosač nekompatibilan sa probiotskim sojem pronalaska. Stabilizatori su prihvatljivi nosači, ekscipijensi, ili rastvarači koji su netoksični za subjekta u korišćenim dozama i koncentracijama, i uključuju pufere kao što su fosfat, citrat, i druge organske kiseline; antioksidanse uključujući askorbinsku kiselinu i metionin; konzervanse (kao što su oktadecildimetilbenzil amonijum hlorid, heksametonijum hlorid, benzalkonijum hlorid, benzetonijum hlorid, fenol, butil ili benzil alkohol, alkil parabeni kao što su metil ili propil

2

paraben, katehol, rezorcinol, cikloheksanol, 3-pentanol i m-krezol); polipeptide male molekulske težine (manje od oko 10 aminokiselina); proteine kao što su serumski albumin, želatin, ili imunoglobulini; hidrofilne polimere kao što je polivinilpirolidon; aminokiseline kao što su glicin, glutamin, asparagin, histidin, arginin ili lizin; monosaharide, disaharide i druge ugljene hidrate uključujući glukozu, manozu, ili dekstrine; helirajuće agense kao što je EDTA; šećere kao što su saharoza, manitol, trehaloza ili sorbitol; protivjone koji formiraju soli kao natrijumove; metalne komplekse (npr. kompleksi Zn-proteina); i/ili nejonske surfaktante kao što su TWEEN™, PLURONICS™ ili polietilen glikol (PEG).

[0154] Farmaceutski proizvodi ili kompozicije koje obezbeđuje predmetni pronalazak mogu da budu uključeni u kontejner, pakovanje, ili dozator zajedno sa uputstvom za primenu.

[0155] Farmaceutski preparat može da ima oblik tableta, kapsula, tečnih bakterijskih suspenzija, suvih oralnih suplemenata, vlažnih oralnih suplemenata, ishrane za primenu suvom cevčicom ili ishrane za primenu vlažnom cevčicom. Poželjno, probiotik, kompozicija koja sadrži probiotik ili kompozicija koja sadrži supernatant i farmaceutski proizvod je usmeren na oralnu, gastričnu i/ili intestinalnu sluzokožu; međutim, takođe može da bude usmeren na nazofaringealnu, respiratornu, reproduktivnu ili žlezdanu sluzokožu, i može da se daje subjektu oralnim, nazalnim, okularnim, rektalnim, lokalnim i/ili vaginalnim putem.

[0156] Potrebna dozna količina probiotskih sojeva u kompoziciji, hranivu ili nutritivnom proizvodu, ili kompoziciji farmaceutskog proizvoda kao što je prethodno opisano variraće u skladu sa prirodom poremećaja ili preporučenom upotrebom kompozicije, i tipom organizma koji je uključen.

[0157] Bilo koja pogodna doza probiotika ili njihovih kombinacija može da se upotrebi u predmetnom pronalasku pod uslovom da toksična dejstva ne prevazilaze terapijska dejstva. Terapijska efikasnost i toksičnost mogu da se odrede standardnim farmaceutskim procedurama sa eksperimentalnim životinjama, kao što je izračunavanje ED (doza koja je terapijski efektivna u 50% populacije) ili LD (doza smrtonosna za 50% populacije) statistike. Odnos doze toksičnog i terapijskog dejstva je terapijski indeks, koji može da se izrazi kao odnos LD/ED. Ipak, aktivnost novih sojeva kod pojedinca prirodno zavisi od doze. Odnosno, što se više novih sojeva unosi gutanjem ili primenom navedenog prehrambenog materijala ili farmaceutske kompozicije, to je veća zaštitna i/ili terapijska aktivnost sojeva. Budući da sojevi ovog pronalaska nisu štetni za ljude i životinje, oni mogu da se unose u velikoj količini, tako da će suštinski veliki deo sluzokože pojedinca biti kolonizovan novim sojevima. Poželjne su kompozicije koje pokazuju velike terapijske indekse. Podaci dobijeni iz studija na životinjama se koriste za formulisanje raspona doza za upotrebu kod ljudi ili životinja. Doziranje koje sadrže takve kompozicije poželjno je u opsegu cirkulišućih koncentracija koje uključuju ED, sa malo ili nimalo toksičnosti. Doziranje varira unutar ovog opsega u zavisnosti od primenjenog doznog oblika, osetljivosti pacijenta, i načina primene. Tačnu dozu će odrediti lekar, u svetlu faktora koji se odnose na subjekt koji zahteva lečenje. Na primer, za pripremu kompozicije hrane prema predmetnom pronalasku, probiotski soj predmetnog pronalaska je inkorporisan u odgovarajuću podlogu, u količini od 10<5>cfu/g do oko 10<12>cfu/g pomoćnog materijala, poželjno od oko 10<6>cfu/g do oko 10<11>cfu/g pomoćnog materijala, poželjnije od oko 10<6>cfu/g do oko 10<10>cfu/g pomoćnog materijala.

[0158] U slučaju farmaceutskog proizvoda ili kompozicije, doza probiotskog soja treba da bude od oko 10<5>cfu/g do oko 10<14>cfu/g pomoćnog materijala, poželjno od oko 10<6>cfu/g do oko 10<13>cfu/g pomoćnog materijala, poželjnije from oko 10<7>cfu/g do oko 10<12>cfu/g pomoćnog materijala. U svrhu predmetnog pronalaska skraćenica cfu označava "jedinicu formiranja kolonija" koja je definisana kao broj bakterijskih ćelija utvrđen mikrobiološkim prebrojavanjem na pločama agara.

[0159] Doza i primena se prilagođavaju tako da obezbede dovoljne nivoe aktivnog fragmenta ili da održe željeno dejstvo. Faktori koji se mogu uzeti u obzir uključuju ozbiljnost stanja bolesti, opšte zdravstveno stanje subjekta, starost, težinu i pol subjekta, vreme i učestalost primene, kombinaciju(e) lekova, reakcije osetljivosti i odgovor na terapiju. Kompozicije dugog dejstva mogu da se primenjuju svaki dan, svaka 3 do 4 dana, svake nedelje, ili na dve nedelje, u zavisnosti od poluživota i stope klirensa određene formulacije.

[0160] U još jednom primeru izvođenja, pronalazak se takođe odnosi na farmaceutski proizvod ili kompoziciju sojeva ovog pronalaska u liofilizovanom obliku, obliku osušenom zamrzavanjem ili osušenom obliku, koji može da se dobije bilo kojim uobičajenim postupkom poznatim u stanju tehnike.

[0161] U još jednom primeru izvođenja farmaceutskog proizvoda ili kompozicije, probiotski soj ili njegova smeša je u obliku nevijabilnih ćelija.

DEPONOVANI BIOLOŠKI MATERIJALI

[0162] Lactobacillus reuteri V3401 je deponovan u Španskoj kolekciji tipova kultura (eng. Type Culture Spanish Collection, CECT) (Edificio 3 CUE, Pare Científic Universitat de Valencia, Catedrático Agustín Escardino 9, 46980 Paterna, Španija) pod uslovima predviđenim Budimpeštanskim ugovorom. Deponovan je 25. septembra 2014, i broj dodeljen navedenom deponovanom materijalu je CECT 8605.

1

[0163] Bifidobacterium breve BT820 je deponovan u Španskoj kolekciji tipova kultura (eng. Type Culture Spanish Collection, CECT) (Edificio 3 CUE, Pare Científic Universitat de Valencia, Catedrático Agustín Escardino 9, 46980 Paterna, Španija) pod uslovima predviđenim Budimpeštanskim ugovorom. Deponovan je 25. septembra 2014, i broj dodeljen navedenom deponovanom materijalu je CECT 8606.

[0164] Primeri koji slede služe da ilustruju pronalazak i ne treba ih shvatiti kao ograničavajuće za njegov obim.

PRIMERI

Materijali i metode

Bakterijski sojevi i uslovi kultivacije

[0165] Lactobacillus reuteri V3401 i druge vrste roda Lactobacillus rutinski su gajene u medijumu MRS (Oxoid) na 37°C pod anaerobnim uslovima. Bifidobacterium breve BT820 i druge bifidobakterije su gajene u medijumu MRS-cistein (0,1% tež./zapr.) takođe na 37 °C i anaerobno. Ćelijske suspenzije za procedure inaktivacije i za ispitivanje aktivnosti gajene su u standardnim medijumima za rast u fermentorima Biostat B od 5 L (B. Braun) tokom 8-24 h. Konkretno, upotrebljeni su medijum A i medijum B na različitim pH. Biomasa je koncentrovana (10x) centrifugiranjem na 8000 g i skladištena na -20 °C do upotrebe.

[0166] Sposobnost L. reuteri V3401 da raste koristeći različite izvore ugljenika ispitana je upotrebom testa API 50 CH test (Biomerieux) prema uputstvima dobavljača. Fermentacione trake su analizirane na 24 i 48 h inkubacije.

Procedure za inaktivaciju bakterija

[0167] Za pripremu uzoraka inaktivisanih bakterija sprovedene su sledeće procedure: toplotna inaktivacija urađena je u standardnom laboratorijskom autoklavu na 120°C tokom 20 min. Inaktivacija mikrotalasima postignuta je upotrebom aparata Milestone Ethos One u kome su uzorci bakterija podvrgnuti tokom 3 min postepenom porastu snage do 300 W, i finalnoj inkubaciji od 5 min na ovoj snazi. Inaktivacija pritiskom sprovedena je pomoću 15-20 pulseva/min tokom 10 min na 1500-2000 bara u homogenizeru Microfluidics M-110P. Inkubacija u 80 mM H2SO4tokom 4 h na 55 °C i naknadna neutralizacija (do pH 7) sa 10 M NaOH bili su uslovi za inaktivaciju kiselinom. Ista procedura, ali upotrebom prvo 80 mM NaOH

2

i 96% H2SO4za neutralizaciju alkalnosti, primenjena je za inaktivaciju bazom. Hemijska inaktivacija sprovedena je inkubacijom bakterijskih uzoraka sa 1,5% (zapr./zapr.) H2O2ili 50% (zapr./zapr.) etanola tokom 1 h na 37 °C. Hemijski agensi su uklonjeni enzimskim tretmanom katalazom, odnosno uparavanjem.

Kulture enterocita

[0168] Enterociti HT-29 su nabavljeni od CIC Univerziteta u Granadi (Španija) i gajeni u medijumu DMEM obogaćenom sa 10% (zapr./zapr.) FBS, neesencijalnim aminokiselinama i 2 mM L-glutamina; na 37 °C i 5% (zapr./zapr.) CO2. Kulture za apsorpciju fluoresterola su gajene 14 dana upotrebom ploča sa 96 bunarčića, inkubirane 3-4 h sa micelama fluoresterola i bakterijskim suspenzijama pri koncentraciji 5·10<8>bakterija/mL, ili 150 µM ezetimiba (MSD-SP Ltd) kao pozitivnom kontrolom. Pre fluorocitometrijskih ogleda, kulture HT-29 su podvrgnute dezagregaciji tripsinom, medijum i slobodne micele fluoresterola su uklonjene centrifugiranjem i enterociti su suspendovani u puferu PBS.

Analiza apsorpcije fluoresterola

[0169] Micele fluoresterola, koje sadrže 10 mM natrijum tauroholata, 6 mM fosfatidilholina i 0,2 mM fluoresterola pripremljene su kao što je opisano kod Sparrow i sar. (Sparrow et al., 1999, J Lipid Res 40:1747-57). Bakterijska apsorpcija fluoresterola analizirana je inkubiranjem bakterijskih suspenzija (5·10<8>bakterija/mL) sa micelama (0,1 mg/mL fluoresterola) u puferu PBS na 37 °C. Posle 2 h inkubacije, smeša je centrifugirana na 5000 g tokom 5 min, supernatant je odbačen i bakterijski talog je resuspendovan u 0,1 mL PBS. Ova procedura je ponovljena 3 puta kako bi se uklonile slobodne micele fluoresterola. Najzad, fluorescencija povezana sa bakterijama određena je u čitaču mikroploča Tecan Genius (ekscitacioni filter od 485 nm, emisioni filter od 535 nm) ili u protočnom citometru Beckton Dickinson FACScalibur. Kada je korišćena tehnika protočne citometrije, bakterije su takođe obojene etidijum bromidom (10 µg/mL) u boratnom puferu (20 mM natrijum borata; 12 mM EDTA; 0,01% formaldehida i 0,01 Tritona X-100) kako bi se identifikovala njihova populacija (očitavanje fluorescencije na talasnim dužinama od 488 nm i 661 nm za ekscitaciju, odnosno emisiju). Apsorbovani fluoresterol je kvantifikovan na osnovu podataka o fluorescenciji (λex: 488 nm; λem: 530 nm) po ćeliji dobijenih iz 2000 događaja u svakom uzorku.

[0170] Fluoresterol koji su apsorbovali enterociti HT-29 kvantifikovan je samo protočnom citometrijom, upotrebom pomenute opreme i istih podešavanja lasera, ali bojenje etidijum bromidom nije bilo neophodno za identifikovanje populacije eukariotskih ćelija. U svakom ogledu, podaci za negativne kontrole (enterociti inkubirani sa micelama fluoresterola) su upotrebljene kao referentna vrednost za izračunavanje relativne (%) apsorpcije u ispitivanim uzorcima.

Mikroskopija

[0171] Slike transmisione elektronske mikroskopije L. reuteri V3401 gajene u medijumu A pH 6 i medijumu B pH 5 snimljene su pomoću mikroskopa Carl Zeiss Libra 120 Plus.

Proteinski ekstrakti L. reuteri V3401 i elektroforeza proteina

[0172] Bakterijske ćelije soja L. reuteri V3401 su resuspendovane pri koncentraciji 0,2 g/mL (vlažne težine) u ledeno hladnom 50 mM kalijum fosfatu, 1 mM puferu EDTA na pH 6 koji sadrži 0,1-0,2 g/mL staklenih perli (0,25-0,5 mm) opranih kiselinom. Fizičko razaranje ćelija sprovedeno je mućkanjem u vorteksu tokom deset perioda od 20 sekundi sa intervalima hlađenja na ledu od 20 sekundi. Posle centrifugiranja na 14000 g tokom 15 min na 4 °C, ćelijski debris je odbačen i supernatant bogat proteinom je kvantifikovan metodom po Bradfordu.

[0173] B. breve BT820 i druge bakterije su inkubirane (5·10<9>bakterija/mL) sa 0,1-0,2 mg/mL proteinskih ekstrakata L. reuteri V3401, u 50 mM kalijum fosfatnom puferu pH 6, tokom 8-12 h na 37 °C u "aktivacionim" eksperimentima. Posle inkubacije, proteinski ekstrakt je uklonjen centrifugiranjem i pranjem puferom PBS.

[0174] Denaturišuća SDS-PAGE je sprovedena u 8% (tež./zapr.) gelovima i elektroforetske trake su vizualizovane Komazi-bojom. Zimogrami za detekciju litičkih enzima su analizirani na 8% SDS-PAGE semi-nativnim gelovima koji sadrže 10 mg/mL autoklaviranih ćelija Micrococcus luteus. Posle elektroforeze proteinskih uzoraka (15-20 µg) gelovi su inkubirani preko noći na 37 °C u 50 mM kalijum fosfatnom puferu pH 6, 0,1% (zapr./zapr.) Triton X-100. Proteinske trake sa litičkom aktivnošću su detektovane bojenjem metilen plavim (0,1 % tež./zapr. u 0,01 % tež./zapr. KOH) tokom 1-2 min i intenzivnim pranjem vodom.

Ispitivanje hidrolize žučnih soli

4

[0175] Hidroliza žučnih soli uzorcima bakterija ispitivana je na sledeći način: 5·10<8>cfu/mL bakterija (živih) inkubirano je sa 1 mg/mL žučnih soli svinje u 1 M boratnom puferu pH 10 tokom 2 h na 37 °C: taurin oslobođen delovanjem hidrolaza kvantifikovan je mešanjem 10 µL enzimske reakcije sa 100 µL o-ftalaldehidnog (OPA) reagensa. Najzad, dodato je 2 mL 0,5 M NaOH i analizirana je fluorescencija (λeks340nm/λem465nm) u čitaču mikroploča Tecan Genius. Koncentracija taurina je izračunata pomoću kalibracione krive konstruisane sa poznatim koncentracijama ove organske kiseline.

Aktivnost holesterol esteraze

[0176] Kinetika holesterol esteraze analizirana je spektrofotometrijski, na 415 nm; 10 min na 37 °C u čitaču mikroploča Tecan Genius, kako bi se ispitalo da li su L. reuteri V3401 ili B. breve BT820 sposobni da inhibiraju ovaj enzim. Kao hromogeni supstrat upotrebljen je 4-nitrofenil butirat (2,5 mM) rastvoren u 100 mM natrijum fosfatnog pufera pH 7, 100 mM NaCl, 0,5 mM natrijum tauroholata. Bakterijski uzorci (5·10<8>bakterija/mL) su ko-inkubirani u reakcionoj smeši sa 0,04 U/mL enzima i nagib prave linije (A415nmu odnosu na vreme) je upotrebljen za određivanje i upoređivanje enzimske aktivnosti.

Prečišćavanje, amplifikacija i sekvenciranje DNK

[0177] Genomska DNK iz bakterijskih uzoraka prečišćena je upotrebom kompleta QIAamp DNA Mini Kit (QIAgen) prema uputstvima za Gram-pozitivne bakterije. DNK je upotrebljena kao matrica u testovima PCR amplifikacije za prečišćavanje gena 16S (QIAquick gel Extraction Kit, QIAgen) i sekvenciranje (Sistemas Genomicos, S.L. Španija), dobijanje profila RAPD i detekciju specifičnih DNK sekvenci. PCR reakcije su sprovedene u termocikleru Eppendorf Mastercyler<®>, upotrebom oligonukleotida (Eurofins Genomics) navedenih u tabeli 1 kao prajmera i reakcionih komponenata sadržanih u kompletu MasterTaq (5 Prime GmbH) PCR kit. DNK fragmenti su razdvojeni i vizualizovani standardnim tehnikama elektroforeze na agaroznom gelu.

Izolacija RNK i analiza genske ekspresije

[0178] Uzorci RNK prokariota i enterocita HT-29 izolovani su primenom metode TRIzol (Chomczynski and Sacchi, 1987, Anal Biochem 162:156-159). Polazni uzorci biomase dobijeni su iz kultura od 10 mL u kasnoj log-fazi za laktobacile i iz ploča sa 24 bunarčića (jedan bunarčić po uzorku) inkubiranih 14 dana za enterocite. Uzorci ukupne RNK inkubirani su sa DNazom I i ekstrakcija metodom TRIzol je ponovljena da bi se uklonila nukleaza. Koncentracija, integritet i čistoća RNK su potvrđeni elektroforezom na agaroznom gelu i UV spektrofotometrijom.

[0179] Za ispitivanje ekspresije gena pomoću qPCR sprovedena je dvostepena sinteza cDNK putem reverzne transkripcije. Prvo, cDNK je sintetisana upotrebom oligo d(T)15 i nasumičnih heksamera kao prajmera za reverznu transkripciju, za uzorke eukariotske, odnosno prokariotske RNK, i kompleta za sintezu cDNK AffinityScript QPCR (Agilent) prema uputstvima proizvođača. U drugom koraku, specifični fragmenti cDNK su amplifikovani u termocikleru Stratagene MX3005P upotrebom SYBR® zelene (Brilliant III Ultra-Fast SYBR Green, Agilent) kao fluorofora. Vrednosti Ct iz reakcija kontrolnog gena (GADPH) i ispitivanih gena (NPC1L1 ili geni litičkih enzima) upotrebljeni su za izračunavanje genske ekspresije, prema metodi ΔΔCt i preporukama Willems et al. (Willems et al., 2008; Anal Biochem 379:127-9) za normalizaciju podataka.

Suptraktivna hibridizacija

[0180] Bakterijska supresivna suptraktivna hibridizacija (SSH) je sprovedena prema korisničkom uputstvu kompleta za suptrakciju cDNK PCR-Select™ (Clontech Laboratories, Inc., SAD), osim što su nasumični prajmeri upotrebljeni u sintezi prvog lanca cDNK. L. reuteri V3401 uzgajan u medijumu A je upotrebljen kao ispitivački uzorak (eng. tester), a L. reuteri V3401 uzgajan u medijumu B kao pokretački uzorak (eng. driver) u eksperimentu supresivne suptraktivne hibridizacije.

[0181] Fragmenti cDNK podvrgnuti suptrakciji su klonirani u vektor pGEM-T (Promega), amplifikovani upotrebom oligonukleotida T7 i SP6 kao prajmera i sekvencirani pomoću Sistemas Genómicos, S. L (Španija). Dobijene nukleotidne sekvence su identifikovane u bazi podataka nukleotida upotrebom programa Blastn na početnoj stranici NCBI.

Grupe životinja i ishrana

[0182] Šezdeset ženki Wistar pacova, težine oko 200 g, kupljeno je od laboratorija Janvier Labs (Francuska). Pacovi su pojedinačno smešteni u kaveze i držani na konstantnoj temperaturi (23 ± 2 °C) i vlažnosti (55 ± 5%) i izloženi 12-časovnom ciklusu svetlost/mrak.

[0183] Posle 2-nedeljnog adaptivnog perioda na normalnoj ishrani (2014 Teklad Global 14% Protein Rodent Maintenance Diet, Harlan), 60 pacova je podeljeno u 6 grupa od po 10 pacova. Šest grupa je dobijalo ishranu na sledeći način: (A) Kontrolna grupa, sa normalnom ishranom, nije primila ni bakterijske uzorke ni ishranu sa visokim sadržajem holesterola; (B) Pozitivna kontrola, sa ishranom sa visokim sadržajem holesterola. Ostalim grupama je, pored ishrane sa visokim sadržajem holesterola, davana i dnevna doza bakterijskog uzorka (2 x 10<9>bakterija po životinji dnevno) u vodi za piće: (C) L. reuteri V3401, živ; (D) L. reuteri V3401, toplotno inaktiviran; (E) B. breve BT820, živ; (F) B. breve BT820, toplotno inaktiviran. Dijeta sa visokim sadržajem holesterola je sadržala 1% (tež./tež.) holesterola u standardnoj ishrani (2014 Teklad Global 14% Protein Rodent Maintenance Diet, Harlan). Pacovi su hranjeni 57 dana i beležena je njihova telesna težina. Nakon ovog perioda, pacovi su eutanazirani.

Test indeksa krvnih seruma

[0184] Uzorci krvi su sakupljani iz repne vene na svakih 7-10 dana za određivanje serumskog holesterola upotrebom kompleta Cholesterol kit kompanije BioSystems. Do kraja eksperimentalnog perioda (57 dana), nakon 12 časova gladovanja, od svakog pacova uzeto je oko 5 mL uzoraka krvi srčanom punkcijom. Ukupni holesterol u serumu (TCH), lipoprotein visoke gustine - holesterol (HDL-C), lipoprotein niske gustine - holesterol (LDL-C), trigliceridi, fosfolipidi i glukoza mereni su automatskim hemijskim analizatorom Mindray BS200.

Primer 1: Skrining bakterijskih sojeva sa sposobnošću da inhibiraju apsorpciju holesterola u humanim enterocitima

[0185] Da bi se izvršio ovaj zadatak, razvijen je postupak zasnovan na kulturama humanih enterocita HT-29 i fluorescentnom analogu holesterola, fluoresterolu.

[0186] Apsorpcija fluoresterola, rastvorenog u micelama fosfatidilholina i natrijum tauroholata, od strane enterocita HT-29, može da se kvantifikuje protočnom citometrijom. Kulture ćelija HT-29 su inkubirane u prisustvu micela fluoresterola najmanje 3 h, a nakon dezagregacije kulture, pomenutom tehnikom je određena fluorescencija populacije ćelija. Ćelijska fluorescencija je proporcionalna količini apsorbovanog fluoresterola. Postupak je validiran ispitivanjem leka za smanjenje holesterola ezetimiba (u koncentraciji od 150 µM) u opisanom in vitro modelu.

[0187] Ovim postupkom određivana je sposobnost bakterijske kolekcije od više od 400 uzoraka da smanji apsorpciju fluoresterola. Ćelijske kulture su inkubirane sa micelama fluoresterola i suspenzijama (5·10<8>cfu/mL) vijabilnih ili inaktiviranih bakterija. Biblioteka nevijabilnih uzoraka dobijena je različitim postupcima za inaktivaciju: toplotom, visokim pritiskom, mikrotalasima i inkubacijom sa kiselinom, bazom, alkoholom i vodonik peroksidom.

[0188] Upoređivanje podataka o prosečnoj fluorescenciji ćelija negativnih kontrolnih kultura (bez bakterijskih uzoraka) sa vrednostima dobijenim za kulture inkubirane sa bakterijskim suspenzijama omogućava identifikaciju dve bakterijske vrste sposobne da smanje apsorpciju fluoresterola za više od 25%: Lactobacillus reuteri V3401 i Bifidobacterium breve BT820 (sl.1).

[0189] Oba bakterijska soja pokazala su aktivnost kada su različitim postupcima ispitivane žive i inaktivirane bakterije (sl.2).

Primer 2: Karakterizacija bakterijskih sojeva

2.1 Lactobacillus reuteri V3401

[0190] Lactobacillus reuteri V3401 je izolovan iz sirovog kravljeg mleka na MRS medijumu. Njegova identifikacija je izvršena amplifikacijom i sekvenciranjem ribozomskog gena 16S. Dobijena delimična sekvenca ribozomskog gena 16S (SEQ ID NO: 1) pokazala je 100% sličnosti sa sekvencama gena 16S iz nekoliko unosa EMBL koji odgovaraju sojevima L. reuteri (I5007, BCS159, NM94-6 i TB-B11).

[0191] Diferencijacija L. reuteri V3401 je sprovedena pomoću analize profila RAPD (nasumična amplifikacija polimorfne DNK) upotrebom genomske DNK iz L. reuteri V3401 i pet drugih sojeva L. reuteri kao matrice (sl.3). Kao prajmeri su upotrebljeni oligonukleotidi (gtg)5 i OPL1 (tabela 1).

Tabela 1. Oligonukleotidi korišćeni kao prajmeri u PCR testovima Prajmeri Cilj Sekvenca (5'-3')

[0192] Profili (gtg)5 i OPL-1 RAPD su omogućili podnosiocima prijave da razlikuju L. reuteri V3401 od ostalih 5 ispitivanih sojeva. Obrazac traka prajmera (gtg)5 bio je specifičan za V3401 i LR20 sojeve L. reuteri, zbog čega je za razlikovanje V3401 i LR20 sojeva L. reuteri bila neophodna dodatna RAPD analiza sa prajmerom OPL-1.

[0193] Pored toga, L. reuteri V3401 je okarakterisan na osnovu svog biohemijskog profila upotrebom testa fermentacije ugljenih hidrata API CH50 (BioMerieux). Rezultati su navedeni u tabeli 2.

Tabela 2. Profil fermentacije ugljenih hidrata koji ispoljava L. reuteri V3401 nakon 24 h i 48 h inkubacije, testiran sistemom API CH 50.

4

2.2. Bifidobacterium breve BT820

[0194] Ovaj mikroorganizam je izolovan iz majčinog mleka na MRS-cistein agaroznom medijumu. Bifidobacterium breve BT820 je identifikovan na nivou vrste amplifikacijom i sekvenciranjem ribozomskog gena 16S. Dobijena delimična sekvenca ribozomskog gena 16S (SEQ ID NO: 14) otkrila je značajnu sličnost (između 98,6-100%) sa sekvencama gena 16S gena iz nekoliko sojeva B. breve (BR2, BGM6, 689b, 875 i JCM1273) deponovanih u bazi podataka DNK EMBL.

[0195] Na isti način kao kod L. reuteri V3401, izvršena je dalja analiza da bi se B. breve BT820 razlikovao od bakterijskih sojeva koji pripadaju istoj vrsti ili rodu. Urađena je analiza RAPD profila korišćenjem genomske DNK iz B. breve BT820, četiri soja B. breve i soja B. longum, upotrebom (gtg)5 oligonukleotida kao prajmera. Rezultati koje su dobili podnosioci prijave, dati na slici 4 i u tabeli 3, pokazali su da se B. breve BT820 može razlikovati od drugih sojeva Bifidobacterium na osnovu svog specifičnog (gtg)5 RAPD profila.

Tabela 3. DNK fragmenti otkriveni u (gtg)5-RAPD testu sprovedenom sa sojevima

Bifidobacterium.

Primer 3: Mehanizam delovanja

[0196] Da bi se saznalo kako oba bakterijska sojeva smanjuju apsorpciju fluoresterola u enterocitima HT-29, urađeno je nekoliko ogleda. Prvo, postavljena je hipoteza da dekonjugacija žučnih soli može da doprinese nižim nivoima fluoresterola. Hidrolaze žučnih soli su enzimi odgovorni za ovu reakciju, a glicin i taurin su proizvodi ove hidrolize. Da bi se procenila ova enzimska aktivnost kod L. reuteri V3401 i B. breve BT820, oba soja su inkubirana sa žučnim solima (10 mg/mL) 2 h i određen je oslobođeni taurin. Rezultati su pokazali da ni L. reuteri V3401 ni B. breve BT820 nisu izazvali hidrolizu žučnih soli u primenjenim eksperimentalnim uslovima.

[0197] Drugi mogući mehanizam podrazumevao bi da bakterijski sojevi metabolišu ili razgrađuju fluoresterol, izazivajući degradaciju fluorofora, što bi objasnilo smanjenje fluorescencije povezane sa ćelijama HT-29. L. reuteri V3401 i B. breve BT820 su inkubirani sa micelama fluoresterola tokom 24 h i fluorescencija je merena u različitim vremenskim intervalima. Rezultati su pokazali da se ukupna fluorescencija nije smanjila više od negativne kontrole fluoresterola, bez bakterijskih uzoraka i, zbog toga je hipoteza o degradaciji i/ili metabolizmu fluoresterola mogla da bude odbačena.

[0198] L. reuteri V3401 i B. breve BT820 mogu da inhibiraju apsorpciju fluoresterola u enterocitima HT-29 interakcijom sa eukariotskim membranskim receptorom NPC1L1. Čini se da je ovaj receptor uključen u transport holesterola kroz membranu enterocita kod sisara i on je molekularna meta ezetimiba. Podnosioci prijave su dizajnirali indirektni test da bi pokušali da utvrde da li L. reuteri V3401 i B. breve BT820 inhibiraju transport holesterola blokirajući membranski protein NPC1L1. Enterociti HT-29 su inkubirani sa fluoresterolom, bakterijskim uzorcima i sa ezetimibom u maksimalnoj efektivnoj koncentraciji (300 µM) uočenoj u in vitro modelu podnosilaca prijave, koja indukuje 40% inhibiciju apsorpcije fluoresterola. Podnosioci prijave su pretpostavili da pod ovim uslovima ezetimib potpuno inhibira receptor NPC1L1 i da će time maskirati moguće dejstvo bakterija, ako je njihovo ciljno mesto isti transporter holesterola. Nasuprot tome, aditivni efekat leka i bakterijskih uzoraka bi mogao da se tumači kao dokaz da oni deluju različitim mehanizmima. Eksperimentalni rezultati koje su dobili podnosioci prijave su pokazali povećanje inhibicije apsorpcije fluoresterola u onim kulturama HT-29 koje su inkubirane sa ezetimibom i L. reuteri V3401 ili B. breve BT820 (sl.5). Stoga, podnosioci prijave smatraju da ni jedan od ova dva mikroorganizma ne smanjuje apsorpciju fluoresterola blokirajući receptor NPC1L1.

[0199] Još jedna mogućnost je da L. reuteri V3401 i B. breve BT820 vrše represiju sinteze NPC1L1 na genetskom nivou. Ova hipoteza je proučavana kvantifikovanjem relativne koncentracije iRNK u enterocitima HT-29 koji su, ili nisu, inkubirani sa bakterijama. Nakon prečišćavanja RNK i reverzne transkripcije, ekspresija gena NPC1L1 je određena metodom qPCR upotrebom gena GAPDH kao referentne vrednosti za normalizaciju podataka. Rezultati koje su dobili podnosioci prijave nisu otkrili promene u nivou ekspresije NCP1L1 u HT-29 usled inkubacije u prisustvu L. reuteri V3401 ili B. breve BT820.

[0200] Holesterol-esteraza pankreasa je enzim uključen u hidrolizu estara holesterola u digestivnom traktu. Ova hidroliza ima suštinsku ulogu u regulaciji procesa apsorpcije holesterola. Iako ovaj fiziološki korak nije mogao biti odgovoran za inhibiciju apsorpcije fluoresterola u in vitro modelu podnosilaca prijave zasnovanom na enterocitima HT-29, podnosioci prijave su odlučili da procene da li L. reuteri V3401 i B. breve BT820 mogu da inhibiraju ovaj enzim, budući da bi ovaj efekat mogao da bude uključen u in vivo hipoholesterolemijsku aktivnost sojeva. Aktivnost holesterol-esteraze pankreasa merena je spektrofotometrijski u prisustvu bakterijskih uzoraka i rezultati su pokazali da se kinetika enzima ne menja u odnosu na kontrolne reakcije bez bakterijskih uzoraka.

4

[0201] Izvedena su tri različita eksperimenta da se ispita da li su L. reuteri V3401 i B. breve BT820 u stanju da apsorbuju fluoresterol. Prvo, oba soja (toplotno inaktivirana) su inkubirana sa micelama fluoresterola 3 h i, nakon intenzivnog ispiranja, fluorescencija povezana sa bakterijskim ćelijama određena je fluorospektrofotometrijom. Rezultati ovih ogleda su dati na slici 6.

[0202] Rezultati koje su dobili podnosioci prijave pokazuju da L. reuteri V3401 i B. breve BT820 ugrađuju fluoresterol u svoje ćelije. Uzorci bakterija iz pomenutih sojeva, tretirani na isti način kao što je prethodno opisano, analizirani su protočnom citometrijom dajući slične rezultate. Ova tehnika omogućava razlikovanje fluorescencije povezane sa bakterijskim ćelijama i fluorescencije koja odgovara rezidualnim micelama fluoresterola, što je čini preciznijom tehnikom. Ponovo su oba bakterijska soja bila u stanju da apsorbuju fluoresterol (sl.7).

[0203] Da bi se potvrdili rezultati dobijeni u prethodnim ogledima, toplotno inaktivirani uzorci L. reuteri V3401 i B. breve BT820 inkubirani sa micelama fluoresterola, analizirani su konfokalnom laserskom mikroskopijom. Rezultati su pokazali da je ćelijska struktura L. reuteri V3401 i B. breve BT820 obojena fluoresterolom. Slike potvrđuju da su oba soja sposobna da apsorbuju fluoresterol i mogu da kompetiraju sa enterocitima HT-29 u ogledima na ćelijama, redukujući na taj način fluoresterol koji je dostupan humanim ćelijama za apsorpciju.

Primer 4: Lactobacillus reuteri V3401 može da se uzgaja u specifičnim uslovima rasta kako bi se povećala njegova sposobnost smanjivanja apsorpcije fluoresterola u humanim enterocitima

[0204] U postupku optimizacije uslova kultivacije L. reuteri V3401 analizirano je nekoliko medijuma za rast i fizičko-hemijskih varijabli, u cilju povećanja koncentracije bakterija. Uzorci L. reuteri V3401 čiji su rezultati izneti, dobijeni su sa medijumom za kultivaciju pod nazivom medijum A sa pH podešenim na 6. Rezultati eksperimenata optimizacije omogućili su dizajniranje efikasnijeg proizvodnog postupka (sl. 8A) koji koristi medijum za kultivaciju pod nazivom medijum B sa pH vrednošću 5. Međutim, nakon toplotne inaktivacije bakterijskih uzoraka, dobijenih ovim postupkom kultivacije, L. reuteri V3401 nije imao sposobnost da na istom nivou kao uzorci dobijeni u medijumu A na pH 6 smanji apsorpciju fluoresterola u kulturi enterocita HT-29 (sl.8B).

[0205] Da bi se odredio faktor odgovoran za ovu promenu aktivnosti kod L. reuteri V3401, proučavan je efekat sastava medijuma za kulturu i pH kultivacije. Uzorci bakterija, toplotno inaktivirani, dobijeni u različitim uslovima kultivacije, ispitani su na enterocitima HT-29 i utvrđena je njihova sposobnost smanjenja apsorpciju fluoresterola. Rezultati ovih testova dati su na slici 9.

[0206] Rezultati koje su dobili podnosioci prijave su izgleda ukazivali na to da ekstracelularni pH može da predstavlja ključni faktor u procesu aktivacije sposobnosti L. reuteri V3401 da smanji apsorpciju fluoresterola u humanim enterocitima. Da bi se potvrdila ova hipoteza, L. reuteri V3401 je uzgajan u medijumu B na različitim vrednostima ekstracelularnog pH. Još jednom, nakon što su bakterijske suspenzije dobijene i inaktivirane toplotom, ispitana je njihova sposobnost da smanje apsorpciju fluoresterola u enterocitima HT-29. Rezultati ovog eksperimenta su pokazali da pH vrednosti kultivacije jednake ili veće od 6 povećavaju sposobnost L. reuteri V3401 da inhibira unos fluoresterola u humane enterocite HT-29 (sl.10).

[0207] Urađen je novi ogled da bi se znalo da li ekstracelularni pH može da aktivira L. reuteri V3401 u kratkom vremenskom periodu. U tom cilju, mikroorganizam je kultivisan u medijumu B na pH 5 tokom 14 h. Zatim je ekstracelularni pH promenjen na 6 tokom 24 h. Uzorci bakterija su sakupljeni u različitim vremenskim intervalima, inaktivirani toplotom i njihova biološka aktivnost je ispitana u kulturama enterocita HT-29. Kao što je dato na slici 11, L. reuteri V3401 uzgajan u opisanim uslovima nije bio u stanju da smanji apsorpciju fluoresterola u HT-29. Čini se da ovi podaci ukazuju na to da proces aktivacije L. reuteri V3401 zahteva da se inkubacija na pH 6 obavlja tokom faze aktivnog rasta.

Primer 5: Karakterizacija procesa aktivacije

[0208] U cilju proučavanja molekularnih događaja odgovornih za aktivaciju L. reuteri V3401 kada se uzgaja na pH 6 u odnosu na pH 5, izveden je ogled suptraktivne hibridizacije korišćenjem cDNK biblioteka izolovanih iz L. reuteri V3401 uzgajanog u medijumu A na pH 6 (ispitivački uzorak) i istog soja uzgajanog u medijumu B na pH 5 (pokretački uzorak). Ovaj eksperiment je dizajniran da identifikuje one gene koji su prekomerno eksprimirani pod prvim uslovom kultivacije.

[0209] Rezultati ovog eksperimenta su omogućili identifikaciju nekoliko gena sa višim nivoom ekspresije u medijumu A na pH 6. Jedan od ovih gena je bio gen koji kodira litički enzim (identifikacija zasnovana na sličnosti sekvenci) koji je mogao biti uključen u proces modifikacije ćelijskog zida L. reuteri V3401, povećavajući njegov afinitet i/ili permeabilnost prema micelama fluoresterola. Prekomerna ekspresija ovog gena u medijumu A na pH 6 potvrđena je qPCR metodom upotrebom specifičnih prajmera (tabela 1) i gadph kao kontrole za normalizaciju podataka o ekspresiji gena (sl.12).

4

[0210] S druge strane, elektroforetska traka proteina je identifikovana na biohemijskom nivou na polu-nativnim SDS-PAGE gelovima (zimogrami). Proteinski ekstrakti su prečišćeni iz L. reuteri V3401, uzgajanog u medijumu B na različitom pH, i razdvojeni na SDS-PAGE gelovima koji sadrže Micrococcus luteus. Nakon bojenja metil plavim, litički enzim je mogao da bude detektovan u uzorcima dobijenim iz L. reuteri V3401 uzgajanog na višim pH vrednostima (sl.

13).

[0211] Ne može se zaključiti da je biohemijski identifikovani litički enzim kodiran genom identifikovanim u ogledima suptraktivne hibridizacije, iako postoji korelacija između ekspresije navedenog gena i enzimske aktivnosti detektovane na zimogramima.

[0212] Čini se da ovi rezultati ukazuju na to da kultura L. reuteri V3401 u medijumu A ili medijumu B na pH 6, indukuje aktivnost litičkog enzima koja bi mogla da bude uključena u permeabilizaciju bakterijskog omotača. U cilju proučavanja integriteta ćelijskog zida, uzorci L. reuteri V3401 uzgajanog u medijumu A na pH 6 i u medijumu B na pH 5 analizirani su transmisionom elektronskom mikroskopijom (sl. 14). Dobijeni snimci pokazuju bakterije sa difuznim ćelijskim omotačem u uzorcima L. reuteri V3401 uzgajane u medijumu A na pH 6 (sl.

14 A i B), što može da se objasni delimičnom hidrolizom ćelijskog zida. Nasuprot tome, uzorci L. reuteri V3401 uzgajanog u medijumu B na pH 5 (sl.14C i D) pokazuju bakterije definisanog oblika veće elektronske gustine.

Primer 6: Specifičnost mehanizma aktivacije

[0213] Uticaj medijuma za kulturu na aktivnost preuzimanja fluoresterola analiziran je u drugim bakterijskim sojevima, u pokušaju da se otkrije koliko specifičan može da bude efekat primećen kod L. reuteri V3401. Prvo je analizirana aktivnost nekoliko vrsta bakterija koje su uzgajane u medijumu A na pH 6 i u medijumu B na pH 5 pomoću ogleda sa enterocitima H-T29 (sl.15).

[0214] Rezultati su pokazali da nijedna od analiziranih bakterija nije smanjila apsorpciju fluoresterola u enterocitima HT-29, bez obzira na korišćeni medijum za rast.

[0215] Kao što je ranije pomenuto, čini se da je aktivacija L. reuteri V3401 posredovana, bar delimično, povećanjem ekspresije litičkog enzima. Pored toga, gen koji kodira litički enzim identifikovan je u eksperimentima suptraktivne hibridizacije koje su sproveli podnosioci prijave i prisutan je i kod drugih sojeva L. reuteri čiji je genom objavljen u naučnoj literaturi. Odlučeno je da se prouči da li je ovaj gen prisutan i kod drugih sojeva L. reuteri dostupnih u kompaniji podnosilaca prijave, upotrebom specifičnih prajmera (tabela 1) za izvođenje PCR eksperimenta korišćenjem genomske DNK navedenih sojeva L. reuteri. Rezultati pokazuju da je ovaj gen

4

prisutan u L. reuteri LR20, ali ne i u LR35. Ovi sojevi nisu pokazali sposobnost da smanje apsorpciju fluoresterola u ogledu koji su podnosioci prijave sproveli na enterocitima. Odlučeno je da se utvrdi da li je gen za litički enzim prisutan u L. reuteri LR20 aktivno eksprimiran. Ekspresija gena je kvantifikovana qPCR metodom, a enzim je detektovan zimogramima, upotrebom uzoraka RNK i proteinskih ekstrakata prečišćenih iz biomase uzgajane u medijumu A na pH 6 i medijumu B na pH 5.

[0216] Ovi rezultati pokazuju da, za razliku od L. reuteri V3401, kod L. reuteri LR20 gen za litički enzim ne menja nivo ekspresije u zavisnosti od medijuma za kulturu, i niži je od onih kvantifikovanih u L. reuteri V3401 (sl.16).

[0217] Ukratko, čini se da ovi podaci ukazuju na to da je, iako je gen koji kodira litički enzim prisutan u drugim sojevima L. reuteri, mehanizam aktivacije koji poboljšava unos fluoresterola u L. reuteri V3401 putem indukcije litičkog enzima, specifičan za soj.

Primer 7: Aktivacija drugih bakterijskih sojeva

[0218] Kao što je gore pomenuto, čini se da su optimalni uslovi rasta koji omogućavaju apsorpciju fluoresterola od strane L. reuteri V3401, specifični za soj. Deo molekularnog mehanizma ovog procesa zasniva se na aktivaciji litičkog enzima koji verovatno digestira ćelijski zid i povećava permeabilnost ćelija. Aktivacija ovim enzimom ispitivana je i kod drugih bakterija, i analiziran je njihov kapacitet apsorpcije fluoresterola.

[0219] Proteinski ekstrakt L. reuteri V3401 dobijen je uzgajanjem ovog mikroorganizma u medijumu A na pH 6 i inkubiran sa sledećim bakterijskim sojevima: L. reuteri LR35, L. plantarum LP18 i B. breve BT820. Nakon inkubacije, bakterijske suspenzije ovih mikroorganizama su toplotno inaktivirane i ispitane u ogledu apsorpcije fluoresterola na HT-29 (sl. 17). Rezultati su pokazali da ni L. reuteri LR35 ni L. plantarum LP18 ne smanjuju apsorpciju fluoresterola u enterocitima; neobrađenim ili inkubiranim sa proteinskim ekstraktom. Nasuprot tome, kod B. breve BT820 je potvrđena sposobnost snižavanja fluoresterola, otkrivena u prethodnim ogledima, pri čemu je aktivnost bila veća u bakterijskim uzorcima inkubiranim sa proteinskim ekstraktom L. reuteri V3401 (sl.17).

[0220] Preuzimanje fluoresterola od strane bakterijskih suspenzija potvrdilo je rezultate zapažene na ćelijama HT-29. Ni L. reuteri LR35 ni L. plantarum LP18 nisu pokazali sposobnost apsorpcije fluoresterola. Oba soja su ispitana sa i bez inkubacije sa proteinskim ekstraktom L. reuteri V3401. Nasuprot tome, B. breve BT820 je ispoljio veće vrednosti fluorescencije po ćeliji

4

u onim uzorcima koji su inkubirani sa proteinskim ekstraktom L. reuteri V3401, u odnosu na netretirane bakterijske uzorke (sl.18).

Primer 8: In vivo aktivnost u životinjskom modelu hiperholesterolemije

[0221] Odlučeno je da se ispita da li se in vitro efekat L. reuteri V3401 i B. breve BT820 na apsorpciju fluoresterola u humanim enterocitima može demonstrirati in vivo. U tom cilju urađena je analiza na životinjskom modelu hiperholesterolemije. Ogled se sastojao od šest grupa (n=10) ženki Wistar pacova, težine približno 200 g, hranjenih ishranom sa visokim sadržajem holesterola koja sadrži 1% (tež./tež.) holesterola. Uzorci bakterija su davani (2·10<9>bakterija po životinji dnevno) u vodi za piće (tabela 5).

Tabela 5. Grupe životinja i ishrana ispitivane u in vivo ogledu.

u)

[0222] Uzorci krvi su sakupljeni iz repne vene svakih 7-10 dana; u cilju određivanja serumskog holesterola. Nakon 57 dana, hiperholesterolemična kontrolna grupa (grupa B) pokazala je značajno veće vrednosti holesterola u serumu u poređenju sa grupom hranjenom standardnom ishranom (kontrolna grupa A). U ovom trenutku, pacovi su žrtvovani i izmereni su ukupni holesterol u serumu (TCH), lipoprotein visoke gustine - holesterol (HDL-C), lipoprotein niske gustine - holesterol (LDL-C), trigliceridi, fosfolipidi i glukoza.

[0223] Rezultati su pokazali niže vrednosti TCH u četiri grupe životinja koje su konzumirale probiotske uzorke (sl. 19). Dodatak ishrani sa bilo kojim od četiri uzorka bio je efikasan u smanjenju holesterola u serumu u poređenju sa serumom pacova hranjenih istom ishranom sa visokim sadržajem holesterola (kontrolna grupa B).

[0224] Osim toga, pacovi hranjeni ishranom sa visokim sadržajem holesterola i uzorcima probiotika (grupe C-F) pokazali su slične nivoe HDL-C kao i kontrolna grupa (grupa A), za

4

razliku od hiperholesterolemične kontrole (grupa B), koja je pokazala značajno smanjene nivoe HDL-C ( sl. 20A). Odnos LDL-C/HDL-C se koristi za predviđanje kardiovaskularnog rizika, i smatra se korisnijim od apsolutnih vrednosti serumskog holesterola i/ili LDL-C. Kada su vrednosti LDL-C (sl. 20B) korišćene da bi se izračunao ovaj odnos (sl. 20C), potvrđeno je da unos probiotika ishranom snižava odnos LDL-C/HDL-C na slične vrednosti kao u zdravoj grupi ( grupa A).

[0225] Ostali proučavani parametri su bili nivoi triglicerida i fosfolipida u plazmi. Kontrolne životinje hranjene visokim sadržajem holesterola (grupa B) pokazale su veće vrednosti od kontrolne grupe (grupa A), za razliku od pacova hranjenih ishranom sa visokim sadržajem holesterola i uzorcima probiotika (grupe C-F) koji su pokazali slične nivoe triglicerida kao zdrava kontrolna grupa A. Međutim, ove razlike nisu bile statistički značajne (sl. 21A). Takođe, nisu nađene razlike između nivoa fosfolipida u plazmi nađenih u 6 eksperimentalnih grupa (sl.

21B).

[0226] Takođe su uočene razlike između podataka grupe životinja u nelipidnom parametru. Prosečan nivo glukoze u plazmi pacova hranjenih visokim sadržajem holesterola (grupa B) bio je viši nego u zdravoj kontrolnoj grupi (grupa A). Moguće je da je ovaj porast povezan sa insulinskom rezistencijom, uopšteno povezanom sa hiperholesterolemijom i niskim nivoima HDL-C. 4 grupe životinja hranjene uzorcima probiotika pokazale su glikemijske vrednosti slične zdravoj kontrolnoj grupi (grupa A). Ovaj rezultat bi se mogao objasniti reverzijom insulinske rezistencije verovatno izazvanom visokim nivoima HDL-C otkrivenim u hiperholesterolemičnoj kontrolnoj grupi B, što nije primećeno u grupama koje su hranjene probioticima (sl.22).

4

1

2

Claims (12)

Patentni zahtevi

1. Probiotski soj odabran od Lactobacillus reuteri V3401 sa pristupnim brojem CECT 8605 i Bifidobacterium breve BT820 sa pristupnim brojem CECT 8606.

2. Probiotski soj prema patentnom zahtevu 1, naznačen time, što je navedeni probiotski soj u obliku vijabilnih ćelija ili nevijabilnih ćelija.

3. Biološki čista kultura, ili kompozicija, ili farmaceutski proizvod, ili hranivo ili nutritivni proizvod koji sadrži probiotski soj prema bilo kom od patentnih zahteva 1 ili 2, ili frakcija obogaćena ćelijskom membranom ili ćelijskim zidom probiotskog soja prema bilo kom od patentnih zahteva 1 ili 2.

4. Postupak za dobijanje probiotskog soja odabranog od Lactobacillus reuteri V3401 sa pristupnim brojem CECT 8605 i Bifidobacterium breve BT820 sa pristupnim brojem CECT 8606 sa povećanom sposobnošću apsorpcije holesterola koji obuhvata korak inaktivacije ćelija navedenog probiotskog soja ili korak kultivacije ćelija navedenog probiotskog soja na pH između 6 i 9 tokom njihove aktivne faze rasta.

5. Postupak prema patentnom zahtevu 4, naznačen time, što je inaktivacija odabrana iz grupe koja se sastoji od toplotne inaktivacije, inaktivacije mikrotalasima, inaktivacije pritiskom, inaktivacije kiselinom, inaktivacije bazom, inaktivacije etanolom i inaktivacije peroksidom.

6. Postupak prema patentnom zahtevu 5, naznačen time, što je inaktivacija toplotna inaktivacija.

7. Postupak prema patentnom zahtevu 4, naznačen time, što je pH 6.

8. Postupak za dobijanje mikroorganizma sa povećanom sposobnošću apsorpcije holesterola koji obuhvata dovođenje u kontakt mikroorganizma koji ima sposobnost apsorpcije holesterola sa kompozicijom koja sadrži aktivnost peptidoglikan-hidrolaze, naznačen time, što je kompozicija koja sadrži aktivnost peptidoglikan-hidrolaze proteinski sadržaj ćelije soja CECT 8605 L. reuteri V3401 i gde je mikroorganizam koji ima sposobnost apsorpcije holesterola soj CECT 8606 B. breve BT820.

4

9. Postupak prema patentnom zahtevu 8, naznačen time, što je navedena peptidoglikan-hidrolaza odabrana iz grupe koja se sastoji od N-Acetilmuramil-L-alanin amidaze, karboksipeptidaze, endopeptidaze, ili glikozidaze.

10. Probiotski soj prema bilo kom od patentnih zahteva 1 ili 2 ili hranivo ili nutritivni proizvod prema patentnom zahtevu 3 za upotrebu kao lek.

11. Probiotski soj prema bilo kom od patentnih zahteva 1 ili 2 ili hranivo ili nutritivni proizvod prema patentnom zahtevu 3 za upotrebu u lečenju i/ili prevenciji bolesti ili stanja odabranog iz grupe koja se sastoji od dislipidemije, insulinske rezistencije i metaboličkog sindroma.

12. Probiotski soj, ili hranivo ili nutritivni proizvod za upotrebu prema patentnom zahtevu 11, naznačen time, što je dislipidemija hiperholesterolemija.