ES2899185T3

ES2899185T3 - Cepas probióticas que tienen capacidad de absorción de colesterol, procedimientos y usos de las mismas

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Publication number: ES2899185T3
Application number: ES15808180T
Authority: ES
Inventors: Otero Ana Isabel Sanudo; Garcia Raquel Criado; Nogales Alba Rodriguez; Domech Alberto Garach; Martin Mónica Olivares; Peralta Julio Juan Galvez; La Escalera Hueso Santiago De; Perez Juan Manuel Duarte; Zurita Antonio Zarzuelo; Hortigüela Oscar Banuelos
Original assignee: Biosearch SA
Current assignee: Biosearch SA
Priority date: 2014-12-10
Filing date: 2015-12-10
Publication date: 2022-03-10
Anticipated expiration: 2035-12-10
Also published as: EP3031930A1; RS62610B1; RU2017121227A3; CA2970602A1; AU2015359382A1; EP3230479B1; CN107438664B; US11058734B2; CA2970602C; EP3230479A1; ES2899185T8; WO2016092032A1; CN107438664A; JP2018503367A; PL3230479T3; MX383749B; RU2722038C2; HUE057081T2; MX2017007654A; AU2015359382B2

Abstract

Una cepa probiótica seleccionada de entre Lactobacillus reuteri V3401 con número de acceso CECT 8605 y Bifidobacterium breve BT820 con número de acceso CECT 8606.

Description

DESCRIPCIÓN

Cepas probióticas que tienen capacidad de absorción de colesterol, procedimientos y usos de las mismas

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La invención se refiere al campo de las cepas probióticas, más en particular al campo de las cepas probióticas con capacidad de absorción de colesterol y usos terapéuticos de las mismas. La invención también se refiere al tratamiento de dislipidemias utilizando cepas probióticas.

ANTECEDENTES

La hipercolesterolemia es el factor de riesgo más importante de enfermedades cardiovasculares y se considera una de las principales causas de muerte y discapacidad en muchos países. Se ha demostrado que una reducción de un 1 % de la concentración de colesterol sérico puede reducir el riesgo de enfermedad coronaria en un 2-3 %. El tratamiento con medicamentos para la hipercolesterolemia tiene efectos secundarios indeseables que han suscitado preocupaciones sobre su uso terapéutico. Por lo tanto, se requiere un procedimiento más natural para disminuir la concentración de colesterol en suero en humanos.

Los lactobacilos y otras bacterias productoras de ácido láctico cumplen una función importante en el equilibrio de las funciones digestivas y ayudan a eliminar el colesterol, aunque la investigación aún no ha establecido una relación entre la dosis y el efecto. Debido a su capacidad para desconjugar las sales biliares, en los últimos años ha surgido interés en la posibilidad de utilizar bacterias del ácido láctico como agentes hipocolesterolémicos biológicos. Varios estudios han propuesto una relación entre el consumo de bacterias del ácido láctico y la reducción de las concentraciones de colesterol en sangre de humanos, ratas y pollos. La presencia de hidrolasa de sales biliares (BSH, del inglés bile salt hydrolase) tiene una ventaja selectiva para esta bacteria en ambientes ricos en sales biliares. La actividad de BSH beneficia a la bacteria al mejorar su resistencia a las sales biliares conjugadas y aumentar su supervivencia en el tracto gastrointestinal y, por lo tanto, su capacidad para colonizarlo. Los estudios sobre la desconjugación de las sales biliares y la capacidad de los lactobacilos para reducir el colesterol se han realizado principalmente en cepas aisladas de seres humanos, cerdos y preparados de leche fermentada.

Se ha informado que cepas de Lactobacillus acidophilus y bifidobacterias asimilan el colesterol de los medios de laboratorio. Por tanto, ambos tipos de bacterias pueden tener el potencial de reducir el colesterol sérico en humanos. Se han realizado muchos intentos para dilucidar el mecanismo implicado en la acción hipocolesterolémica de las cepas bacterianas del ácido láctico. Un mecanismo propuesto es la reducción del colesterol por la pared celular durante el crecimiento. Otro posible mecanismo es la desconjugación de las sales biliares por las bacterias productoras de BSH. Sin embargo, estos mecanismos requieren que las bacterias estén vivas para reducir con éxito el colesterol sérico.

Miremandi F. y col. (J. Func. Foods 2014, 9, 295-305) evalúa la capacidad de 14 cepas probióticas de lactobacilos y bifidobacterias, ya sea en crecimiento o no (en reposo o muertas por calor), para eliminar el colesterol. Se encontró que todas las cepas asimilan el colesterol en distintos grados. La eliminación del colesterol por las células muertas y en reposo confirmó que sus membranas celulares todavía tenían la capacidad de unirse al colesterol.

Yoon HS y col. (Int. J. Food Sci. Nutrit. 2013, 1, 44-52) muestra una reducción de la absorción de colesterol en los enterocitos Caco-2 tratados con dos cepas probióticas específicas de Lactobacillus, respectivamente. Las células muertas por calor y las fracciones de la pared celular de dichas cepas probióticas tuvieron el mismo efecto que las células vivas.

Tok E y col. (Microbiology and Immunology, 1 de marzo de 2010 XP055194816) muestra una correlación entre la eliminación del colesterol y la producción de exopolisacáridos (EPS) por las cepas de Lactobacillus. Las cepas que producían más EPS pudieron eliminar más colesterol del medio. También las células en reposo y muertas por calor eliminaron colesterol.

Bordoni A y col. describen el cribado de bifidobacterias para la absorción de colesterol y el uso de una cepa absorbente de colesterol en una mezcla de probióticos para alimentar a ratas hipercolesterolémicas.

Por tanto, todavía existe la necesidad en la técnica de proporcionar tratamientos basados en probióticos que sean eficaces para el tratamiento de dislipidemias, en particular hipercolesterolemia.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

En un primer aspecto, la presente invención se refiere a una cepa probiótica seleccionada de entre Lactobacillus reuteri V3401 con número de acceso CECT 8605 y Bifidobacterium breve BT820 con número de acceso CECT 8606.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un cultivo biológicamente puro que comprende una cepa probiótica según la invención.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a una composición que comprende una cepa probiótica según la invención.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un producto farmacéutico que comprende una cepa probiótica según la invención.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un producto nutricional que comprende una cepa probiótica según la invención.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un alimento que comprende una cepa probiótica según la invención.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a una fracción enriquecida en la pared celular o en la membrana celular de una cepa probiótica según la invención.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un procedimiento para obtener una cepa probiótica seleccionada de entre Lactobacillus reuteri V3401 con número de acceso CECT 8605 y Bifidobacterium breve BT820 con número de acceso CECT 8606 con capacidad de absorción de colesterol aumentada que comprende una etapa de inactivación de las células.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un procedimiento para obtener una cepa probiótica seleccionada de entre Lactobacillus reuteri V3401 con número de acceso CECT 8605 y Bifidobacterium breve BT820 con número de acceso CECT 8606 con capacidad de absorción de colesterol aumentada que comprende una etapa de cultivo de las células a un pH comprendido entre 6 y 9 durante su fase exponencial.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un procedimiento para obtener un microorganismo con capacidad de absorción de colesterol aumentada que comprende poner en contacto un microorganismo que tiene actividad de absorción de colesterol con una composición que comprende una actividad de peptidoglicano hidrolasa, donde la composición que comprende una actividad de peptidoglicano hidrolasa es el contenido de proteína de una célula de la cepa CECT 8605 L. reuteri V3401 y donde el microorganismo que tiene capacidad de absorción de colesterol es la cepa CECT 8606 B. breve BT820.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a una cepa probiótica o un alimento o producto nutricional según la invención para su uso como medicamento.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a una cepa probiótica o alimento o producto nutricional según la invención para su uso en el tratamiento y/o prevención de una enfermedad o afección seleccionada de entre el grupo que consiste en dislipidemia, resistencia a la insulina y síndrome metabólico.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1: promedio de fluorescencia celular relativa (%) de enterocitos H-T29 incubados con fluoresterol (control -) y con ezetimiba (control ), suspensiones bacterianas de L. reuteri V3401 o B. breve BT820.

Figura 2: promedio de fluorescencia celular relativa (%) de enterocitos H-T29 incubados con fluoresterol (control -) y con ezetimiba (control ) o suspensiones de bacterias inactivadas. A, L. reuteri V3401. B, B. breve BT820.

Figura 3: patrones RAPD de cepas de L. reuteri generados por cebadores (gtg)5 (panel izquierdo) y OPL1 (panel derecho). Panel izquierdo: carriles de izquierda a derecha: carril 1, marcador de peso molecular de 100 pb; carril 2, L. reuteri V3401; carril 3, LR35; carril 4, LR20; carril 5, LR01; carril 6, CECT925; carril 7, DSM 19738; carril 8, sin control de plantilla (NTC); carril 9, marcador de peso molecular de 100 pb y carril 10, marcador de peso molecular de 1 kb. Panel derecho: carril 1, V3401; carril 2, LR35; carril 3, LR20; carril 4, marcador de peso molecular de 100 pb.

Figura 4: huella digital RAPD (gtg)5 de B. breve BT820 y otras cepas de B. breve y una cepa de Bifidobacterium longum. Carril 1, marcador de tamaño molecular 1 kb. Carril 2, marcador de tamaño molecular 100 pb. Carril 3, B. breve BT820. Carril 4, BB26. Carril 5, DSM20091. Carril 6, CECT4839. Carril 7, BB69. Carril 8, B. longum ATCC15707.

Figura 5: fluorescencia relativa (media geométrica) de enterocitos HT-29 incubados con micelas de fluoresterol (control), ezetimiba (300 |jM), suspensiones de células inactivadas por calor (5108 bacteria/ml) de L. reuteri V3401, B. breve BT820 y enterocitos coincubados con ezetimiba y cada microorganismo.

Figura 6: fluorescencia neta (unidades arbitrarias) de muestras de L. reuteri V3401, B. breve BT820 y un control negativo (seleccionado al azar) incubado con fluoresterol y medido por fluorofotometría.

Figura 7: fluorescencia (media geométrica) por bacteria en suspensiones de L. reuteri V3401, B. breve BT820 y un control negativo seleccionado al azar, determinado por fluorocitometría de flujo.

Figura 8: A, Concentración de bacterias viables de cultivos de L. reuteri V3401 obtenidos en medio de crecimiento medio A pH 6 y medio B pH 5. B, Promedio de fluorescencia celular relativa (%) de enterocitos H-T29 incubados con fluoresterol (control -), ezetimiba (control ) o suspensiones de L. reuteri V3401 inactivado por calor cultivado en las condiciones descritas.

Figura 9: promedio de fluorescencia celular relativa (%) de enterocitos H-T29 incubados con fluoresterol (control -), ezetimiba (control ) o suspensiones de L. reuteri V3401 inactivado por calor cultivado en distintos medios y pH de crecimiento. A, medio B pH 5 más glucosa. B, medio B pH 5 más fosfato de potasio. C, medio B pH 5 baja concentración de extracto de levadura. D, medio B pH 5 más fosfato de potasio y baja concentración de extracto de levadura. E, medio B estándar pH 5. F, medio B pH 6. G, medio A pH 6. H, medio A pH 5.

Figura 10: promedio de fluorescencia celular relativa (%) de enterocitos H-T29 incubados con fluoresterol (control -), ezetimiba (control ) o suspensiones de L. reuteri V3401 inactivado por calor cultivado en medio B a distintos valores de pH de crecimiento.

Figura 11: promedio de fluorescencia celular relativa (%) de enterocitos H-T29 incubados con fluoresterol y suspensiones bacterianas de L. reuteri V3401 inactivado por calor cultivado en medio B a pH 5 durante 14 h, incubado a pH 6 durante 24 h y recogido a distintos intervalos de tiempo.

Figura 12: valores de expresión génica relativa de la enzima lítica en el medio B y el medio A medidos por qPCR. Figura 13: zimograma (A) y SDS-PAGE (B) de extractos de proteínas obtenidos de L. reuteri V3401 cultivado en medio B a pH 4 (carriles 1-2), pH 5 (3-4), pH 6 (5-6), pH 7 (7-8) y medio A a pH 6 (9-10) .

Figura 14: imágenes de microscopía electrónica de transmisión de L. reuteri V3401 cultivado en medio A a pH 6 (A, B) y medio B a pH 5 (C, D)

Figura 15: promedio de fluorescencia celular relativa (%) de enterocitos H-T29 incubados con fluoresterol y suspensiones bacterianas inactivadas por calor cultivadas en medio A pH 6 y medio B pH 5. A, L. reuteri LR01. B, B. breve BB16. C, L. fermentum CECT5716. D, L. reuteri LR35. E, L. reuteri LR20. F, Lactococcus lactis LL18. F, Leuconostoc mesenteroides LM37. H, Pediococcus pentosaceus PP02.

Figura 16: expresión relativa del gen de la enzima lítica en cepas de L. reuteri V3401 y LR20 cultivadas en medio A pH6 y medio B pH5 cuantificado por qPCR.

Figura 17: fluorescencia relativa (%) por enterocito HT-29 incubado con micelas de fluoresterol y sin muestra de bacterias (control -), ezetimiba (control ) y suspensiones de L. reuteri LR35, L. plantarum LP18 y B. breve BT820 inactivadas por calor (C) e incubadas con extracto de proteína de L. reuteri V3401 (T).

Figura 18: intensidad de fluorescencia por celda (media geométrica) medida por fluorocitometría de flujo. C: muestras bacterianas inactivadas por calor sin fluoresterol (control de autofluorescencia). F: bacterias inactivadas por calor incubadas con fluoresterol. TF: muestras bacterianas tratadas con extracto de proteína de L. reuteri V3401, inactivadas por calor e incubadas con micelas de fluoresterol.

Figura 19: colesterol sérico medido en los 6 grupos de animales, después de 57 días. Las barras de error representan el error estándar de la media. A, grupo de control sano; B, grupo de control hipercolesterolémico; C grupo de L. reuteri V3401 vivos; D, grupo de L. reuteri V3401 inactivado por calor; E, grupo de B. breve BT820 vivos; F, grupo de B. breve BT820 inactivado por calor.

Figura 20: relación HDL-colesterol (A), LDL-colesterol (B) y LDL-C/HDL-C (C) medida en los seis grupos de animales, después de 57 días. Las barras de error representan el error estándar de la media. Se indican diferencias significativas (t Student a = 0,05 y P < 0,5) respecto al grupo control A (#) y respeto al grupo hipercolesterolémico B(*).

Figura 21: niveles de triglicéridos (A) y fosfolípidos (B) en plasma en los 6 grupos de animales, después de 57 días. Las barras de error representan el error estándar de la media.

Figura 22: valores de glucosa en plasma en los 6 grupos de animales, después de 57 días. Las barras de error representan el error estándar de la media. Se indican diferencias significativas (t Student a = 0,05 y P < 0,5) grupo control A (#) y respeto al grupo hipercolesterolémico B(*).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

A continuación, las partes de la descripción que se refieren a la «descripción» no describen la invención.

Los autores de la presente invención han identificado dos cepas probióticas Lactobacillus reuteri V3401 (número de acceso CECT 8605) y Bifidobacterium breve BT820 (número de acceso CECT 8606), que reducen con éxito la absorción de fluoresterol, un análogo del colesterol fluorescente, y el colesterol por las células epiteliales intestinales en ensayos in vitro e in vivo. El mecanismo por el cual ejercen su efecto se basa en su capacidad para absorber colesterol, de manera que secuestran el colesterol del tracto intestinal y reducen la cantidad disponible para que lo absorba el epitelio intestinal. Además, los autores de la invención han determinado que la capacidad de absorción de colesterol de las cepas puede inducirse sorprendentemente mediante un aumento de una actividad lítica que parece ser específica de la cepa L. reuteri V3401 (CECT 8605). Este hallazgo inesperado permite la activación de la función absorbente del colesterol en microorganismos con dicha función existente.

Cepas y cultivo

En un primer aspecto, la invención se refiere a una cepa probiótica seleccionada de entre Lactobacillus reuteri V3401 con número de acceso CECT 8605 y Bifidobacterium breve BT820 con número de acceso CECT 8606 con capacidad de absorber colesterol, en adelante «la cepa probiótica de la invención».

El término «cepa», como se usa en esta invención, se refiere a una variante o subtipo genético de una especie de microorganismo, preferentemente una especie bacteriana. El término «cepa probiótica». como se usa en esta invención, se refiere a una cepa viva de un microorganismo, preferentemente una bacteria, que, cuando se administra en cantidades adecuadas, confiere un beneficio para la salud del huésped. Los hospedadores adecuados en el contexto de la invención incluyen cualquier mamífero, preferentemente primates, tales como seres humanos y chimpancés, cerdos, caballos, vacas, cabras, ovejas, perros, gatos, ratas y ratones; más preferentemente seres humanos. Otros huéspedes adecuados incluyen aves, preferentemente pollos, patos, gansos, cisnes, faisanes, palomas, palomas y avestruces.

La presente invención contempla una cepa probiótica seleccionada de entre:

• cepa de Lactobacillus reuteri V3401, depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) con el número de acceso CECT 8605, o una variante de la misma con capacidad de absorción de colesterol, y

• Bifidobacterium breve BT820, depositada en el CECT con número de acceso CECT 8606, o una variante de la misma con capacidad de absorción de colesterol.

Por tanto, la presente descripción también se refiere a variantes de L. reuteri V3401 y de la cepa B. breve BT820 con capacidad de absorción de colesterol. Como se usa en esta invención, el término «variante» o «mutante» de una cepa se refiere a cualquier cepa natural o desarrollada específicamente obtenida a partir de la cepa de referencia X, principalmente por mutación, que mantenga la capacidad de absorción de colesterol de la cepa de referencia, es decir de la cepa CECT 8605 L. reuteri V3401 o de la cepa CECT 8606 B. breve BT820.

Las variantes pueden tener o no las mismas características biológicas de identificación de las cepas específicas ejemplificadas en esta invención, siempre que compartan propiedades ventajosas similares en términos de su capacidad de absorción de colesterol de la cepa de referencia. Por ejemplo, los genes de ARNr 16S de una cepa «variante» como se contempla en esta invención pueden compartir aproximadamente un 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con una cepa descrita en la presente invención.

En otra descripción, una variante de las cepas se refiere a cualquier cepa cuyo genoma hibrida en condiciones estrictas con el genoma de cualquiera de las cepas CECT 8605 L. reuteri V3401 o de la cepa CECT 8606 B. breve BT820. En general, se lleva a cabo una reacción de hibridación de baja rigurosidad a aproximadamente 40 grados centígrados en 10xSSC o una disolución con una relación entre fuerza iónica y temperatura equivalente. Una hibridación de rigurosidad moderada se realiza normalmente a aproximadamente 50 grados centígrados en 6xSSC, y una reacción de hibridación de rigurosidad alta se realiza por lo general a aproximadamente 60 grados centígrados en 1xSSC.

En otra descripción, el grado de parentesco entre la variante y las cepas parentales se determina como la identidad de nucleótidos promedio (ANI), que detecta la conservación del ADN del genoma central (Konstantinidis K and Tiedje JM, 2005, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 2567-2592) En algunas descripciones, el ANI entre la variante y la cepa parental es de aproximadamente un 95 %, aproximadamente un 96 %, aproximadamente un 97 %, aproximadamente un 98 %, aproximadamente un 99 %, aproximadamente un 99,1 %, aproximadamente un 99,5 %, de aproximadamente un 99,6 %, de aproximadamente un 99,7 %, de aproximadamente un 99,8 %, de aproximadamente un 99,9 %, de aproximadamente un 99,99 %, de aproximadamente un 99,999 %, de aproximadamente un 99,9999 %, de aproximadamente un 99,99999 %, de aproximadamente un 99,999999 % o más, pero menos del 100 %.

En otra descripción, el grado de relación entre la variante y las cepas parentales se determina como el coeficiente de correlación de frecuencia de firma de tetranucleótidos, que se basa en frecuencias de oligonucleótidos (Bohlin J. et al. 2008, BMC Genomics, 9:104). En algunas divulgaciones, el coeficiente de correlación de frecuencia de firma de tetranucleótidos entre la variante y la cepa parental es de aproximadamente 0,99, 0,999, 0,9999, 0,99999, 0,999999, 0,999999 o más, pero menos de 1.

En otra descripción, el grado de relación entre la variante y las cepas parentales se determina como el grado de similitud obtenido al analizar los genomas de la cepa parental y de la variante mediante electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE) utilizando una o más endonucleasas de restricción. El grado de similitud obtenido por PFGE se puede medir mediante el coeficiente de similitud de Dice. En algunas realizaciones, el coeficiente de similitud de Dice entre la variante y la cepa parental es de aproximadamente un 95 %, aproximadamente un 96 %, aproximadamente un 97 %, aproximadamente un 98 %, aproximadamente un 99 %, aproximadamente un 99,1 %, aproximadamente un 99,5 %, de aproximadamente un 99,6 %, de aproximadamente un 99,7 %, de aproximadamente un 99,8 %, de aproximadamente un 99,9 %, de aproximadamente un 99,99 %, de aproximadamente un 99,999 %, de aproximadamente un 99,9999 %, de aproximadamente un 99,99999 %, de aproximadamente un 99,999999 % o más, pero menos del 100 %.

En otra descripción, una cepa se considera una variante de una cepa parental dada cuando ambas cepas tienen el mismo ribotipo, obtenido usando cualquiera de los procedimientos conocidos en la técnica y descritos, por ejemplo, por Bouchet et al. (Clin. Microbiol. Rev., 2008, 21:262-273).

En otra descripción, el grado de relación entre la variante y las cepas parentales es el coeficiente de correlación de Pearson obtenido al comparar los perfiles genéticos de ambas cepas obtenidos por PCR repetitiva extragénica basada en elementos palindrómicos (REP-PCR) (véase, p. ej., Chou and Wang, Int J Food Microbiol. 2006, 110:135-48). En algunas realizaciones, el coeficiente de correlación de Pearson obtenido al comparar los perfiles de REP-PCR de la variante y la cepa parental es de aproximadamente 0,99, 0,999, 0,9999, 0,99999, 0,999999, 0,999999 o más, pero menos que 1.

En otra descripción, el grado de parentesco entre la variante y las cepas parentales es la distancia de ligamiento obtenida al comparar los perfiles genéticos de ambas cepas obtenidos por tipificación de secuencia multilocus (MLST) (véase, p. ej., Maiden, M. C., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:3140-3145). En algunas divulgaciones, la distancia de enlace obtenida por MLST de la variante y la cepa parental es de aproximadamente 0,99, 0,999, 0,9999, 0,99999, 0,999999, 0,999999 o más pero menos de 1.

En una descripción preferida, la variante y la cepa parental son del mismo género. En una descripción aún más preferida, la variante y la cepa parental son de la misma especie o subespecie.

El término «capacidad de absorción de colesterol», como se usa en esta invención, se refiere a la propiedad por la cual una cepa es capaz de capturar colesterol e incorporarlo a su estructura celular bacteriana. El experto en la materia reconocerá que existen varias tecnologías en la técnica adecuadas para determinar la capacidad de absorción de colesterol de una célula. Esto incluye, sin limitación, el procedimiento descrito en la sección de Ejemplos de la presente solicitud de patente, que se basa en la detección por fluorometría o fluorocitometría de la incorporación de fluoresterol o NBD-colesterol, que es un análogo del colesterol de fórmula (I), de las micelas a las bacterias.

Las variantes adecuadas para su uso en la presente invención incluyen aquellas variantes que tienen al menos un 40 %, al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 %, al menos un 100 %, al menos un 110 %, al menos un 120 %, al menos un 130 %, al menos un 140 %, al menos un 150 % o más de capacidad de absorción de colesterol con respecto a la capacidad de absorción de colesterol de la cepa de la que derivan.

En una realización particular, la cepa probiótica de la invención está en forma de células viables. En otra realización particular, la cepa probiótica de la invención está en forma de células inviables. El término «viabilidad», como se usa en esta invención, se refiere a la capacidad de una célula para mantenerse o recuperar sus potencialidades y sobrevivir hasta que sea capaz de dividirse. Por tanto, una célula viable indica que la célula puede sobrevivir y dividirse; a la inversa, una célula que no es viable indica que la célula no puede sobrevivir y dividirse. Se apreciará que las células inviables incluyen células muertas.

La viabilidad se puede determinar mediante varios ensayos que son convencionales en la técnica. Estos incluyen ensayos de citólisis o de fuga de membrana, como el ensayo de lactato deshidrogenasa, el ensayo de yoduro de propidio, el ensayo de azul de tripán y el ensayo de 7-aminoactinomicina D, así como ensayos genómicos y proteómicos que prueban la activación de vías de estrés utilizando microarrays de ADN y chips de proteína.

La cepa probiótica de la invención tiene una viabilidad de un 0 %, o al menos un 5 %, o al menos un 10 %, o al menos un 15 %, o al menos un 20 %, o al menos un 25 %, o al menos un 30 %, o al menos un 35 %, o al menos un 40 %, o al menos un 45 %, o al menos un 50 %, o al menos un 55 %, o al menos un 60 %, o al menos un 65 %, o al menos un 70 %, o al menos un 75 %, o al menos un 80 %, o al menos un 85 %, o al menos un 90 %, o al menos un 95 %, o un 100 %. El porcentaje de viabilidad celular refleja el porcentaje de células que son capaces de mantenerse o recuperar sus potencialidades y sobrevivir hasta que son capaces de dividirse. En cambio, la cepa probiótica de la invención tiene una no viabilidad de un 100 %, o al menos un 95 %, o al menos un 90 %, o al menos un 85 %, o al menos un 80 %, o al menos un 75 %, o al menos un 70 %, o al menos un 65 %, o al menos un 60 %, o al menos un 55 %, o al menos un 50 %, o al menos un 45 %, o al menos un 40 %, o al menos un 35 %, o al menos un 30 %, o al menos un 25 %, o al menos un 20 %, o al menos un 15 %, o al menos un 10 %, o al menos un 5 %, o un 0 %. El porcentaje de no viabilidad celular refleja el porcentaje de células que no son capaces de mantenerse o recuperar sus potencialidades y sobrevivir hasta que son capaces de dividirse.

En otro aspecto, la invención se refiere a un cultivo biológicamente puro de la cepa probiótica de la invención.

El término «cultivo biológicamente puro», como se usa en la presente invención, se refiere a un cultivo donde la bacteria de la invención se encuentra en una proporción de un 90 % o más, por ejemplo, un 95 % o más, un 96 % o más, un 97 % o más, un 98 % o más, un 99 % o más o un 100 %, en comparación con otros organismos presentes en el cultivo. El término «cultivo», como se usa en esta invención, se refiere a una población de bacterias de la invención. Un cultivo puede comprender otros elementos distintos a las bacterias de la invención, como el medio de cultivo o cualquier otra sustancia que se pueda añadir al medio de cultivo beneficiosa para el crecimiento o mantenimiento del cultivo. El término «medio de cultivo» o «medio» se reconoce en la técnica y se refiere por lo general a cualquier sustancia o preparación utilizada para el cultivo de células vivas. El término «medio», según su uso en referencia a un cultivo celular, incluye los componentes del entorno que rodea a las células. Los medios pueden ser sólidos, líquidos, gaseosos o una combinación de fases y materiales. Los medios incluyen medios de crecimiento líquido, así como también medios que no sostienen el crecimiento celular. Los medios también incluyen medios gelatinosos como agar, agarosa, gelatina y matrices de colágeno. Los medios gaseosos a modo de ejemplo incluyen la fase gaseosa a la que se exponen las células que crecen en una placa de petri u otro soporte sólido o semisólido. El término "medio" también hace referencia al material cuya utilización se pretende en un cultivo celular, incluso si aún no ha estado en contacto con las células. En otras palabras, un líquido rico en nutrientes preparado para el cultivo bacteriano es un medio. De manera similar, una mezcla de polvo que, al mezclarse con agua u otro líquido, se convierte en adecuada para el cultivo celular puede denominarse como «medio en polvo». «Medio definido» se refiere a medios que están hechos de componentes químicamente definidos (normalmente purificados). Los «medios definidos» no contienen extractos biológicos mal caracterizados como el extracto de levadura y el caldo de res. «Medio rico» incluye medios que están diseñados para apoyar el crecimiento de la mayoría o todas las formas viables de una especie en particular. Los medios enriquecidos a menudo incluyen extractos biológicos complejos. En la presente invención se puede utilizar cualquier medio de cultivo convencional apropiado para el cultivo de bacterias del ácido láctico o bifidobacterias conocido en la técnica, como, por ejemplo, medio MRS, medio HANK'S, medio APT, medio RCM, medio LM17, medio BSM y medio Elliker.

En otro aspecto, la invención se refiere a una fracción enriquecida en la pared celular o en la membrana celular de una cepa probiótica de la invención.

El término «fracción enriquecida en membrana celular», como se usa en esta invención, se refiere a la preparación resultante de procedimientos de fraccionamiento celular que contiene un contenido de membrana celular mayor que el de las células no fraccionadas. De manera similar, el término «fracción enriquecida en pared celular», como se usa en esta invención, se refiere a la preparación resultante de procedimientos de fraccionamiento celular que contiene un contenido de pared celular mayor que el de las células no fraccionadas. Las técnicas para obtener fracciones enriquecidas en membranas celulares y fracciones enriquecidas en paredes celulares son bien conocidas y convencionales en la técnica e incluyen una combinación de homogeneización, como homogeneización osmótica u homogeneización física utilizando morteros, majas, mezcladores o ultrasonidos, y técnicas de fraccionamiento, como la centrifugación.

Procedimientos para aumentar la capacidad de absorción de colesterol de los microorganismos

Los autores de la presente invención también han determinado que, inesperadamente, la capacidad de absorber colesterol de la cepa CECT 8605 L. reuteri V3401 y la cepa CECT 8606 B. breve BT820 puede inducirse o incrementarse sometiendo las células a inactivación celular (Ejemplo 3). Alternativamente, se observó el mismo efecto cuando las células crecieron a un pH de 6 o superior (Ejemplo 4).

Así, en otro aspecto, la invención se refiere a un procedimiento para la obtención de una cepa probiótica seleccionada de entre L. reuteri V3401 con número de acceso CECT 8605 y B. breve BT820 con número de acceso CECT 8606, con mayor capacidad de absorción de colesterol, en adelante «el primer procedimiento de la invención», que comprende una etapa de inactivación de las células de dicha cepa probiótica o una etapa de cultivo de las células de dicha cepa probiótica a un pH entre 6 y 9 durante su fase de crecimiento activo.

Los términos «capacidad de absorción de colesterol», «cepa probiótica», «L. reuteri V3401 con número de acceso CECT 8605», «B. breve BT820 con número de acceso CECT 8606» y «variante» se han descrito en detalle en el contexto de la cepa probiótica de la invención, y sus definiciones y realizaciones se incluyen aquí como referencia.

El primer procedimiento de la invención comprende una etapa de inactivación de las células. Resultará evidente para el experto en la materia que esta etapa se puede realizar en un cultivo de la cepa probiótica de la invención o en células aisladas. El término «inactivación celular», como se usa en esta invención, se refiere a un procedimiento de transformación de una célula de viable a inviable. Existen distintos procedimientos para determinar si una célula es viable o inviable, que se han descrito en el contexto de la cepa de la invención. Las celdas resultantes consisten en un 0 % de células viables y un 100 % de células inviables, o al menos un 1 % de células viables y un 99 % de células inviables, o al menos un 5 % de células viables y un 95 % de células inviables, o al menos un 10 % de células viables y un 90 % de células inviables, o al menos un 15 % de células viables y un 85 % de células inviables, o al menos un 20 % de células viables y un 80 % células inviables, o al menos un 25 % de células viables y un 75 % de células inviables, o al menos un 30 % de células viables y un 70 % de células inviables, o al menos un 35 % de células viables y un 65 % de células inviables, o al menos un 40 % de células viables y un 60 % de células inviables, o al menos un 45 % de células viables y un 55 % de células inviables, o al menos un 50 % de células viables y un 50 % de células inviables, o al menos un 55 % células viables y un 45 % de células inviables, o al menos un 60 % de células viables y un 40 % de células inviables, o al menos un 65 % de células viables y un 35 % de células inviables, o al menos un 70 % de células viables y un 30 % de células inviables, o al menos un 75 % de células viables y un 25 % de células inviables, o al menos un 80 % de células viables y un 20 % de células inviables, o al menos un 85 % de células viables y un 15 % de células inviables, o al menos un 90 % de células viables y un 10 % de células inviables, o al menos un 95 % de células viables y un 5 % de células inviables, o al menos un 99 % de células viables y un 1 % de células inviables.

Existen distintos procedimientos de inactivación de células que están disponibles en la técnica, que incluyen inactivación térmica, inactivación por microondas, inactivación por presión, inactivación ácida, inactivación básica, inactivación por alcohol e inactivación por peróxido.

En una realización particular del primer procedimiento de la invención, la inactivación se selecciona de entre el grupo que consiste en inactivación térmica, inactivación por microondas, inactivación por presión, inactivación ácida, inactivación básica, inactivación por alcohol e inactivación por peróxido.

El término «inactivación térmica», como se usa en esta invención, se refiere a la inactivación de células usando altas temperaturas. Por lo general, esto se logra aumentando la temperatura de las células o el medio que las contiene a más de 50 °C. Los procedimientos adecuados para la inactivación térmica son bien conocidos en la técnica e incluyen, sin limitación, el procedimiento descrito en la sección de Ejemplos, que consiste en incubar un cultivo que contiene la cepa probiótica de la invención a 120 °C durante 20 min y permitir que el cultivo se enfríe a temperatura ambiente.

El término «inactivación por microondas», como se usa en esta invención, se refiere a la inactivación de células usando microondas. Los procedimientos adecuados para la inactivación por microondas son bien conocidos en la técnica e incluyen, sin limitación, someter las células o el medio que las contiene o que contiene la cepa probiótica de la invención a microondas utilizando un aparato de microondas de laboratorio. Por ejemplo, la inactivación se puede lograr aumentando gradualmente durante 3 min la potencia del aparato hasta 300 W y manteniendo estas condiciones durante 5 min más.

El término «inactivación por presión», como se usa en esta invención, se refiere a la inactivación de células usando presión. Los procedimientos adecuados para la inactivación por presión son bien conocidos en la técnica e incluyen, sin limitación, homogeneización, por ejemplo, usando un homogeneizador o una prensa francesa. Por ejemplo, la inactivación celular se puede lograr usando un homogeneizador de alta presión a una presión de 1.500-2.000 bar y 15-20 pulsos/min durante 10 min.

El término «inactivación ácida», como se usa en esta invención, se refiere a la inactivación de células reduciendo el pH. Esto se consigue normalmente añadiendo un ácido a las células o al medio que las contiene y posteriormente neutralizando las células o el medio. Se prefieren los ácidos fuertes para inactivar las células e incluyen, sin limitación, ácido clorhídrico (HCl), ácido yodhídrico (HI), ácido bromhídrico (HBr), ácido perclórico (HClO⁴), ácido nítrico (HNO³) y ácido sulfúrico (H²SO⁴). La fuerza de un ácido se refiere a su capacidad o tendencia a perder un protón. Por ejemplo, la inactivación se puede lograr agregando H²SO⁴a las células hasta que se alcance una concentración de 80 mM, incubando las células a 55 °C durante 4 horas y neutralizando agregando NaOH 10 M hasta que el pH sea 7.

Análogamente, el término «inactivación básica», como se usa en esta invención, se refiere a la inactivación de células aumentando el pH. Esto se consigue normalmente añadiendo una base a las células o al medio que las contiene y posteriormente neutralizando las células o el medio. Se prefieren las bases fuertes con el propósito de inactivar las células e incluyen, sin limitación, hidróxido de potasio (KOH), hidróxido de bario. , hidróxido de cesio (CsOH), hidróxido de sodio (NaOH), hidróxido de estroncio , hidróxido de calcio , hidróxido de litio (LiOH) e hidróxido de rubidio (RbOH). La fuerza de una base se refiere a su capacidad para desprotonar un ácido. Por ejemplo, la inactivación se puede lograr agregando NaOH a las células hasta que se alcance una concentración de 80 mM, incubando las células a 55 °C durante 4 horas y neutralizando agregando H²SO⁴al 96 % hasta que el pH sea 7.

El término «inactivación por peróxido», como se usa en esta invención, se refiere a la inactivación de células usando un peróxido. Un peróxido es un compuesto que contiene un enlace simple oxígeno-oxígeno o el anión peróxido, O^22", e incluye peróxido de hidrógeno (H²O²), superóxidos, dioxigenilos, ozonos y ozónidos. Por ejemplo, la inactivación celular se puede lograr incubando las células en H²O²(v/v) al 1,5 % a 37 °C durante 1 h. Posteriormente, e1H²O²se elimina tratando las células con catalasa.

El término «inactivación por alcohol», como se usa en esta invención, se refiere a la inactivación de células usando un alcohol. Un alcohol es un compuesto de hidroxilo orgánico con el grupo -OH funcional unido a un átomo de carbono saturado, e incluye etanol, metanol, isopropanol, butanol. Por ejemplo, la inactivación celular se puede lograr haciendo una dilución 1:1 del cultivo celular con etanol al 96 % e incubación a 37 °C durante 1 h. Posteriormente, el etanol se elimina por evaporación en un evaporador giratorio o rotavap.

En una realización preferida de la invención, la inactivación es inactivación térmica.

Como resultado de la etapa de inactivación, las células de la cepa probiótica de la invención se vuelven inviables o incluso mueren.

Alternativamente, el primer procedimiento de la invención comprende una etapa de cultivo de las células a un pH entre 6 y 9 durante su fase de crecimiento activo.

Para cultivar las células según esta alternativa del primer procedimiento de la invención, es necesario que el medio de cultivo tenga un pH entre 6 y 9, preferentemente entre 6 y 8,5, más preferentemente entre 6 y 8, incluso más preferentemente entre 6 y 7,5, incluso más preferentemente entre 6 y 7, o incluso más preferentemente entre 6 y 6,5. En una realización particular, el pH es 6.

El experto en la materia, utilizando el conocimiento general habitual, comprenderá inmediatamente que se puede obtener un pH entre 6 y 9 utilizando un medio con ese pH. Los medios con un pH dentro de este intervalo son bien conocidos en la técnica, pero también se puede obtener un pH entre 6 y 9 en cualquier medio ajustando el pH con un ácido adecuado, como HCl, o una base, como NaOH.

En otra realización particular, el primer procedimiento de la invención comprende una etapa de cultivo de las células a un pH de entre 6 y 9, y además comprende una etapa de inactivación de dichas células.

El término «fase de crecimiento activo», como se usa en esta invención, se refiere a la etapa de crecimiento bacteriano caracterizada por un aumento en la biomasa total o en el número de células. El crecimiento bacteriano se puede expresar en forma de una curva de crecimiento, que por lo general representa el logaritmo del número de células frente al tiempo. El crecimiento de bacterias en cultivo por lotes se puede modelar con cuatro fases distintas:

• Fase de retraso, durante la cual las bacterias se adaptan a las condiciones de crecimiento y la tasa de aumento en el número de células es mínima.

• Fase logarítmica o fase exponencial, caracterizada por una tasa de crecimiento que aumenta gradualmente (fase logarítmica/exponencial temprana) hasta que sea constante y máxima para las condiciones particulares de crecimiento.

• Fase estacionaria, caracterizada por una tasa de crecimiento que disminuye (fase estacionaria temprana) y finalmente llega a cero.

• Fase de muerte, durante la cual disminuye el número de células viables en el cultivo.

Así, el experto en la materia se dará cuenta inmediatamente de que la fase de crecimiento activo se expande desde la fase logarítmica/exponencial temprana hasta la fase estacionaria temprana.

El crecimiento bacteriano se puede medir controlando el número de células, midiendo el aumento en el peso seco de la biomasa formada en un intervalo de tiempo determinado, controlando la absorción y el metabolismo (o liberación) de sustancias particulares y midiendo la cantidad de un metabolito radiactivo incorporado a la biomasa en un tiempo determinado. Normalmente, el número de células se mide determinando la concentración de bacterias en una suspensión midiendo la densidad óptica en un espectrofotómetro; OD600 se utiliza por lo general para este propósito.

Las células resultantes del primer procedimiento de la invención presentan una capacidad de absorción de colesterol aumentada en comparación con las células que no han sufrido inactivación.

El término «capacidad de absorción de colesterol aumentada», como se usa en esta invención, se refiere a una capacidad para absorber colesterol que es al menos de un 101 %, al menos un 105 %, al menos un 110 %, al menos un 120 %, al menos un 130 %, al menos un 140 %, al menos un 150 %, al menos un 160 %, al menos un 170 %, al menos un 180 %, al menos un 190 %, al menos un 200 %, al menos un 250 %, al menos un 300 %, al menos un 500 %, al menos un 1000 % o más de lo mostrado por una célula que no ha sido sometida a inactivación. Los procedimientos adecuados para determinar la capacidad de absorción de colesterol de una célula incluyen el procedimiento descrito en la sección de Ejemplos de la presente solicitud de patente, que se basan en la detección por fluorometría o fluorocitometría de la incorporación de fluoresterol de micelas a las bacterias.

La presente invención también contempla la celda obtenida por el primer procedimiento de la invención.

Por lo tanto, la descripción se refiere a una célula obtenible mediante un procedimiento para aumentar la capacidad de absorción de colesterol de una cepa probiótica seleccionada de entre L. reuteri V3401 con número de acceso CECT 8605 y B. breve BT820 con número de acceso CECT 8606, o una variante de dicho cepa que tiene capacidad para absorber colesterol, que comprende una etapa de inactivación de las células.

La descripción también se refiere a una célula obtenible mediante un procedimiento para aumentar la capacidad de absorción de colesterol de una cepa probiótica seleccionada de entre L. reuteri V3401 con número de acceso CECT 8605 y B. breve BT820 con número de acceso CECT 8606, o una variante de dicho cepa que tiene capacidad para absorber colesterol, que comprende una etapa de cultivar las células a un pH de 6 o superior.

Sorprendentemente, los autores de la invención también han observado que las células con capacidad existente para absorber colesterol pueden modificarse para aumentar su capacidad de absorción de colesterol. Dicha modificación se lleva a cabo incubando las células con un extracto celular obtenido a partir de la cepa CECT 8605 L. reuteri V3401, como se muestra en el Ejemplo 7. El agente que provoca este aumento en la absorción de la actividad absorbente del colesterol se identificó como una enzima con actividad mureína hidrolasa. Sin desear estar ligado a ninguna teoría, se sospecha que la peptidoglicano hidrolasa juega un papel en la permeabilización de la pared celular del microorganismo que tiene capacidad de absorber colesterol, o en el aumento de la afinidad de su pared celular por las micelas que contienen colesterol. Esto daría lugar a que el microorganismo absorbiera una mayor cantidad de colesterol. Además, este efecto parece ser específico de una peptidoglicano hidrolasa expresada por la cepa CECT 8605 L. reuteri V3401.

Así, en otro aspecto, la invención se refiere a un procedimiento para obtener un microorganismo con capacidad de absorción de colesterol aumentada, en adelante «el segundo procedimiento de la invención», que comprende poner en contacto un microorganismo con capacidad de absorción de colesterol con una composición que comprende una enxima con actividad de peptidoglicano hidrolasa, donde la composición que comprende una actividad de peptidoglicano hidrolasa es el contenido de proteína de una célula de la cepa CECT 8605 L. reuteri V3401 y donde el microorganismo que tiene capacidad de absorción de colesterol es la cepa CECT 8606 B. breve BT820.

Los términos «capacidad de absorción de colesterol» y «capacidad de absorción de colesterol aumentada» se han descrito en detalle en el contexto de la cepa probiótica de la invención y el primer procedimiento de la invención, y sus definiciones y realizaciones se incluyen aquí como referencia.

El segundo procedimiento de la invención comprende una etapa de poner en contacto un microorganismo que tiene capacidad de absorber colesterol con una composición que comprende una peptidoglicano hidrolasa.

El término «microorganismo», como se usa en esta invención, se refiere a un organismo microscópico, que puede ser un organismo unicelular o multicelular, y también puede ser organismos procariotas o eucariotas con capacidad de absorber colesterol. Los procedimientos para determinar si un microorganismo posee capacidad para absorber colesterol se han descrito en detalle en el contexto de la cepa probiótica de la invención y se incluyen aquí como referencia. El microorganismo que tiene capacidad para absorber colesterol es procariota. En otra realización particular, el microorganismo que tiene capacidad de absorción de colesterol es eucariota.

En una descripción, el microorganismo que tiene capacidad para absorber colesterol es una bacteria de la cepa CECT 8605 L. reuteri V3401. En otra realización preferida, el microorganismo que tiene capacidad de absorber colesterol es una bacteria de la CECT 8606 de la cepa B.Breve BT820.

En el sentido de la invención, la composición que se pone en contacto con un microorganismo con capacidad de absorción de colesterol comprende una peptidoglicano hidrolasa. El término «peptidoglicano hidrolasa» o «mureina hidrolasa», como se usa en esta invención, se refiere a una enzima que cataliza la hidrólisis de peptidoglicanos, es decir, una enzima capaz de escindir enlaces covalentes en péptidoglicanos sacculi o sus fragmentos. Las funciones fisiológicas de estas enzimas incluyen la regulación del crecimiento de la pared celular, la separación de las células hijas durante la división celular y la autólisis, y el recambio de peptidoglicano durante el crecimiento, donde los productos de recambio sirven como moléculas de señalización para el reconocimiento de bacterias por otros organismos y, en algunas bacterias, para la inducción de plactamasa. Las hidrolasas especializadas agrandan los poros del peptidoglicano para el ensamblaje de grandes complejos trans-envolventes (pili, flagelos, sistemas de secreción), o escinden específicamente el peptidoglicano durante la esporulación o la germinación de las esporas. Además, las hidrolasas de peptidoglicano están implicadas en fenómenos de lisis como el fratricida o la lisis del desarrollo que se producen en poblaciones bacterianas.

La actividad de peptidoglicano hidrolasa se refiere a la hidrólisis de enlaces amida, peptidicos y glicosidicos en peptidoglicano. Las distintas peptidoglicanos hidrolasas, asi como sus respectivos sitios de escisión, se describen en Vollmer y col., 2008 (Vollmer et al., 2008, FEMS Microbiol Rev 32:259-86). Brevemente, las hidrolasas de peptidoglicano incluyen las siguientes:

• N-acetilmuramil-L-alanina amidasas, que hidrolizan el enlace amida entre MurNAc y el residuo de L-alanina N-terminal del péptido madre. Estas incluyen algunas amidasas (anhAmi) que se escinden especificamente en los residuos 1,6-anhidroMurNAc.

• Carboxipeptidasas que hidrolizan enlaces peptidicos para eliminar D- o L-aminoácidos C-terminales. Estas incluyen DD-carboxipeptidasa, LD-carboxipeptidasa y DL-carboxipeptidasa.

• Endopeptidasas, que escinden los enlaces amida en los péptidos. Estas incluyen DD-endopeptidasa, LD-endopeptidasa y DL-endopeptidasa.

• Glucosidasas, que escinden las hebras de glucanos. Hay tres tipos de glicosidasas:

a) N-acetilglucosaminidasas, que hidrolizan el enlace glicosidico entre los residuos de N-acetil-p-D-glucosamina y los monosacáridos adyacentes,

b) lisozimas, y

c) transglicosilasas liticas,

las lisozimas y las transglicosilasas liticas también se conocen colectivamente como N-acetil-p-D-muramidasas (muramidasas) y escinden el mismo enlace glicosidico, es decir, el enlace pi,4-glicosidico entre los residuos de MurNAc y GlcNAc en el peptidoglicano (figura 1B).

La actividad de una hidrolasa de peptidoglicano es a menudo especifica para un cierto tipo de peptidoglicano, para la presencia o ausencia de modificaciones secundarias, o para el peptidoglicano de alto peso molecular o fragmentos pequeños. Por tanto, la peptidoglicano hidrolasa se selecciona de entre el grupo que consiste en una N-acetilmuramil-L-alanina amidasa, una carboxipeptidasa, una endopeptidasa o una glicosidasa.

En una realización particular, la peptidoglicano hidrolasa es una N-acetilmuramil-L-alanina amidasa. En otra realización particular, la peptidoglicano hidrolasa es una carboxipeptidasa. En otra realización particular, la peptidoglicano hidrolasa es una endopeptidasa. En otra realización particular, la peptidoglicano hidrolasa es una glicosidasa seleccionada de entre el grupo que consiste en una N-acetilglucosaminidasa, una lisozima y una transglicosilasa litica.

En una realización preferida, la glicosidasa es una N-acetilglucosaminidasa. En otra realización preferida, la glicosidasa es una lisozima. En otra realización preferida, la glicosidasa es una transglicosilasa litica.

La peptidoglicano hidrolasa es una peptidoglicano hidrolasa especifica de la cepa CECT 8605 L. reuteri V3401.

Para que la peptidoglicano hidrolasa ejerza su efecto de incrementar la capacidad de absorber colesterol en un microorganismo con capacidad de absorber colesterol, es necesario poner en contacto la peptidoglicano hidrolasa con dicho organismo. El experto en la materia comprenderá fácilmente que la etapa de puesta en contacto se puede realizar de distintas formas. Una de estas formas es la expresión recombinante de la peptidoglicano hidrolasa en dicho organismo.

Por tanto, la composición que comprende una peptidoglicano hidrolasa es el contenido de proteína de una célula de la cepa CECT 8605 L. reuteri V3401.

La expresión recombinante de la peptidoglicano hidrolasa se puede realizar usando procedimientos que son convencionales en la técnica. preferentemente, la secuencia de nucleótidos que codifica la peptidoglicano hidrolasa también codifica cualquier péptido señal de origen natural que la enzima pueda contener. Por ejemplo, la secuencia de nucleótidos puede unirse operativamente a secuencias reguladoras de la expresión, de manera que forman una construcción génica o un casete de expresión. Como se usa en la presente invención, el término «unido operativamente» significa que la peptidoglicano hidrolasa codificada por la secuencia de nucleótidos se expresa en el marco de lectura correcto bajo el control de la secuencia de control o la secuencia reguladora de la expresión. El casete de expresión de la invención se puede obtener mediante técnicas de biología molecular que son bien conocidas en la técnica. Las secuencias de control son secuencias que controlan y regulan la transcripción y, en su caso, la traducción de dicha peptidoglicano hidrolasa, e incluyen secuencias promotoras, secuencias que codifican reguladores transcripcionales, secuencias de unión a ribosomas (RBS) y/o secuencias terminadoras de la transcripción. Los promotores adecuados en el contexto de la invención incluyen, sin limitación, promotores inducibles y constitutivos. El casete de expresión puede incluir además un potenciador, que puede ser adyacente o distante a la secuencia promotora y puede funcionar aumentando la transcripción. En una realización particular, dicha secuencia de control de la expresión es funcional en células procariotas. En otra realización particular, dicha secuencia de control de la expresión es funcional en células eucariotas.

Ventajosamente, el casete de expresión comprende además un marcador o gen que codifica un motivo o fenotipo que permite seleccionar la célula huésped transformada con dicho casete de expresión. Ejemplos ilustrativos de dichos marcadores que podrían estar presentes en el casete de expresión de la invención incluyen genes de resistencia a antibióticos, genes resistentes a compuestos tóxicos y, en general, todos aquellos que permitan seleccionar las células transformadas genéticamente.

El casete de expresión puede insertarse en un vector apropiado. La elección del vector dependerá de la célula huésped donde se introduzca posteriormente, es decir, del microorganismo con capacidad de absorción de colesterol. Con fines ilustrativos, el vector donde se introduce dicha secuencia de ácido nucleico puede ser un plásmido o un vector que, cuando se introduce en una célula huésped, se integra o no en el genoma de dicha célula. La obtención de dicho vector de expresión puede realizarse mediante procedimientos convencionales conocidos por los expertos en la técnica. En una realización particular, dicho vector recombinante es un vector útil para transformar células procariotas. En una realización particular, dicho vector recombinante es un vector útil para transformar células eucariotas.

El vector que comprende la secuencia que codifica la peptidoglicano hidrolasa puede usarse para transformar, transfectar o infectar células del microorganismo que tiene capacidad de absorber colesterol. Las células transformadas, transfectadas o infectadas pueden obtenerse mediante procedimientos convencionales conocidos por los expertos en la técnica. Estas células pueden ser procariotas o eucariotas. Por tanto, la célula transformada, transfectada o infectada resultante comprende la secuencia que codifica la peptidoglicano hidrolasa.

La construcción génica, el casete de expresión y el vector que contienen la secuencia que codifica la peptidoglicano hidrolasa también son aspectos de la presente invención.

Una vez que el microorganismo que tiene capacidad de absorción de colesterol contiene el vector de expresión que comprende la peptidoglicano hidrolasa, dicha peptidoglicano hidrolasa puede expresarse de forma recombinante mediante procedimientos convencionales conocidos por el experto en la materia. Por ejemplo, la expresión recombinante de la peptidoglicano hidrolasa puede ser inducible o constitutiva. Preferentemente, se secreta la peptidoglicano hidrolasa expresada de forma recombinante.

Así, la peptidoglicano hidrolasa resultante expresada de forma recombinante forma parte de una composición, preferentemente extracelular que está en contacto con el microorganismo que tiene capacidad de absorción de colesterol, de manera que ejerce su función de incrementar dicha capacidad de absorción de colesterol.

Dado que la peptidoglicano hidrolasa responsable de incrementar la capacidad de absorción de colesterol de un microorganismo con capacidad de absorción de colesterol parece expresarse específicamente en la cepa CECT 8605 L. reuteri V3401, el segundo procedimiento de la invención se realiza aplicando un extracto proteico obtenido de dicha cepa.

Por tanto, la composición que comprende una peptidoglicano hidrolasa es un extracto de proteína de la cepa CECT 8605 L. reuteri V3401. Preferentemente, las células de la cepa CECT 8605 L. reuteri V3401 se cultivan a un pH de 6 o superior.

El término «extracto de proteína», como se usa en esta invención, se refiere al contenido de proteína de una célula. En algunas realizaciones, el extracto de proteína se refiere a un «extracto de proteína total» o «extracto de proteína bruta», que se refiere a la colección de proteínas originadas a partir de las cepas según la presente invención y casi sin fragmentos o restos de paredes celulares y orgánulos grandes. Según una realización ejemplar, el extracto de proteína tisular total puede obtenerse añadiendo bacterias a un tampón de lisis, pero la presente invención no se limita a ello. Sin embargo, el extracto de proteína total puede extraerse usando cualquier procedimiento de extracción conocido en la técnica.

Los procedimientos para obtener un extracto de proteína son convencionales y bien conocidos por los expertos. Normalmente, las proteínas se disuelven rompiendo las células que las contienen. Existen varios procedimientos para lograrlo, como la congelación y descongelación repetidas, la sonicación, la homogeneización por alta presión, la filtración o la permeabilización por disolventes orgánicos.

En algunas realizaciones, el extracto de proteína se fracciona al menos parcialmente para enriquecerse en la actividad peptidoglicano hidrolasa, de manera que se obtiene un «extracto enriquecido con peptidoglicano hidrolasa». Se puede usar cualquier procedimiento adecuado conocido en la técnica para obtener el extracto enriquecido con peptidoglicano hidrolasa, tal como cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio iónico, filtración, ultrafiltración, filtración en gel, electroforesis, precipitación de sal y diálisis, etc. para permitir la separación y purificación del péptido. El grado de enriquecimiento en la actividad peptidoglicano hidrolasa se puede determinar midiendo la actividad peptidoglicano hidrolasa específica en el extracto enriquecido (es decir, unidades de actividad peptidoglicano hidrolasa por mg de proteína), donde un aumento con respecto a la actividad en el extracto bruto es indicativo de que el extracto se ha enriquecido en actividad peptidoglicano hidrolasa. En una realización preferida, el extracto enriquecido con peptidoglicano hidrolasa contiene una actividad peptidoglicano hidrolasa que es al menos un 5 %, al menos un 10 %, al menos un 20 %, al menos un 30 %, al menos un 40 %, al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos en un 90 % o al menos el 100% de la actividad encontrada en el extracto bruto. En otra realización, el extracto enriquecido con peptidoglicano hidrolasa contiene una actividad peptidoglicano hidrolasa que es al menos 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces, 10 veces, 100 veces, 1000 veces, 10000 veces o más con respecto a la actividad en el extracto bruto.

La etapa de contacto del segundo procedimiento de la invención requiere que la composición que contiene la peptidoglicano hidrolasa se ponga en contacto con el microorganismo que tiene capacidad de absorber colesterol durante un tiempo suficiente como para permitir la escisión del peptidoglicano. La etapa de contacto es de al menos 1 s, al menos 10 s, al menos 30 s, al menos 1 min, al menos 5 min, al menos 10 min, al menos 30 min, al menos 1 h, al menos 2 h, al menos 4 h, al menos 6 h, al menos 8 h, al menos 10 h, al menos 12 h, al menos 24 h, o más.

Para determinar si un microorganismo ha tenido su capacidad de absorción de colesterol aumentada, el experto en la materia reconocerá que es necesario determinar la capacidad de absorción de colesterol y compararla con la capacidad de absorción de colesterol del mismo microorganismo que no haya sido sometido al segundo procedimiento de la invención. Los procedimientos para determinar la capacidad de absorción de colesterol de una célula se han descrito en el contexto de la cepa probiótica de la invención y se incluyen aquí como referencia.

La presente invención también contempla la celda obtenida por el segundo procedimiento de la invención.

Por tanto, una célula obtenible mediante un procedimiento para aumentar la capacidad de absorción de colesterol de un microorganismo que tiene capacidad de absorción de colesterol, que comprende poner en contacto dicho microorganismo con una composición que comprende una peptidoglicano hidrolasa, es parte de la presente descripción.

Composiciones y alimentos o productos nutricionales

El experto en la materia apreciará inmediatamente que la cepa probiótica de la invención es en particular útil como parte de una composición, un alimento o un producto nutricional.

Así, en otro aspecto, la invención se refiere a una composición que comprende una cepa probiótica seleccionada de entre Lactobacillus reuteri V3401 con número de acceso CECT 8605 y Bifidobacterium breve BT820 con número de acceso CECT 8606.

Los términos «cepa probiótica», «L. reuteri V3401 con número de acceso CECT 8605», «B. breve BT820 con número de acceso CECT 8606», «variante» y «capacidad de absorción de colesterol» se han descrito en detalle en el contexto de la cepa probiótica de la invención, y sus definiciones y realizaciones se incluyen aquí como referencia.

En una realización particular, la composición comprende una mezcla de cepas probióticas de la invención.

Preferentemente, la composición comprende al menos 2, al menos 3, al menos 4 o más de las cepas de la invención, y donde cada una de las cepas está representada en la composición en una proporción comprendida entre un 0,1 % y un 99,9 %, preferentemente entre un 1 % y un 99 %, más preferentemente entre un 10 % y un 90 %. En otra realización, la composición comprende cualquiera de las cepas bacterianas de la invención junto con otra cepa o mezcla de cepas y donde cada una de las cepas está representada en la composición en una proporción comprendida entre 0,1 % y 99,9 %, preferentemente entre un 1 % y un 99 %, más preferentemente entre un 10 % y un 90 %. En otra realización, la invención proporciona una composición que comprende un sobrenadante de un cultivo de una o más de las cepas según la invención. Preferentemente, el sobrenadante está representado en la composición en una proporción comprendida entre un 0,1 % y un 99,9 %, más preferentemente entre un 1 % y un 99 % e incluso más preferentemente entre un 10 % y un 90 %.

En otra realización particular, la invención también se refiere a composiciones de las cepas de esta invención en forma liofilizada o secada, que se pueden obtener mediante cualquier procedimiento convencional conocido en la técnica.

En otra realización particular, la cepa probiótica o la mezcla de las mismas está en forma de células inviables.

En otro aspecto, la invención se refiere a un alimento o producto nutricional que comprende una cepa probiótica seleccionada de entre Lactobacillus reuteri V3401 con número de acceso CECT 8605 y Bifidobacterium breve BT820 con número de acceso CECT 8606 que tiene capacidad para absorber colesterol.

En una realización particular, el alimento o producto nutricional comprende una mezcla de cepas probióticas de la invención.

Preferentemente, el alimento o producto nutricional comprende al menos 2, al menos 3, al menos 4 o más de las cepas de la invención, y donde cada una de las cepas está representada en la composición en una proporción comprendida entre un 0,1 % y un 99,9 %, preferentemente entre un 1 % y un 99 %, más preferentemente entre un 10 % y un 90 %. En otra realización, el alimento o producto nutricional comprende cualquiera de las cepas bacterianas de la invención junto con otra cepa o mezcla de cepas y donde cada una de las cepas está representada en la composición en una proporción comprendida entre 0,1 % y 99,9 %, preferentemente entre un 1 % y un 99 %, más preferentemente entre un 10 % y un 90 %. En otra realización, la invención proporciona un alimento o producto nutricional que comprende un sobrenadante de un cultivo de una o más de las cepas según la invención. Preferentemente, el sobrenadante está representado en el alimento o producto nutricional en una proporción comprendida entre un 0,1 % y un 99,9 %, más preferentemente entre un 1 % y un 99 % e incluso más preferentemente entre un 10 % y un 90 %.

Ejemplos no limitativos de productos alimenticios adecuados que se pueden usar en la presente invención son leche, yogur, queso, cuajada, leches fermentadas, productos fermentados a base de leche, productos a base de cereales fermentados, productos cárnicos fermentados, otros polvos a base de leche o cereales, preparados nutricionales clínicos, helados, zumos, pan, pasteles o caramelos, preparados para piensos, preparados dietéticos semisintéticos o sintéticos, preparados para bebés, preparados nutricionales clínicos, helados, zumos, harinas, pan, tortas, caramelos o chicles.

En otra realización, el alimento o producto nutricional que comprende una cepa probiótica de la invención está en forma liofilizada o seca, la cual puede obtenerse mediante cualquier procedimiento convencional conocido en la técnica.

En otra realización del alimento o producto nutricional, la cepa probiótica o la mezcla de las mismas está en forma de células inviables.

Usos terapéuticos

Los inventores han demostrado que las cepas probióticas de la invención son capaces de reducir la absorción de fluoresterol de las células HT-29, una línea celular de enterocitos, cuando se cultivan conjuntamente en presencia de micelas que contienen fluoresterol, como se muestra en el Ejemplo 1. Este fue el resultado de la competencia de las células probióticas con las células HT-29 por capturar las micelas (ver Ejemplo 2). Este efecto puede aprovecharse en el tratamiento de enfermedades donde el nivel de colesterol en plasma cumple una función, como en las dislipidemias. Los inventores han demostrado que la ingesta de las cepas probióticas de la invención reduce el colesterol plasmático total, el índice LDL/HDL, y el nivel de glucemia en un modelo in vivo de hipercolesterolemia (véase el Ejemplo 8).

Así, en otro aspecto, la invención se refiere a una cepa probiótica seleccionada de entre Lactobacillus reuteri V3401 con número de acceso CECT 8605 y Bifidobacterium breve BT820 con número de acceso CECT 8606 para uso como medicamento.

En otro aspecto, la invención se refiere a una cepa probiótica seleccionada de entre Lactobacillus reuteri V3401 con número de acceso CECT 8605 y Bifidobacterium breve BT820 con número de acceso CECT 8606 para su uso en el tratamiento y/o la prevención de la dislipidemia.

El término «tratamiento» o «terapia», como se usa en esta invención, incluye cualquier procedimiento, acción, aplicación, tratamiento o similar, donde un sujeto (o paciente), incluido un ser humano, reciba ayuda médica con el objeto de mejorar la afección del sujeto, directa o indirectamente, o ralentizar la progresión de una afección o trastorno en el sujeto, o mejorar al menos un síntoma de la enfermedad o trastorno bajo tratamiento. En particular, el término tratamiento se refiere a la administración de una cepa probiótica seleccionada de entre Lactobacillus reuteri V3401 con número de acceso CECT 8605 y Bifidobacterium breve BT820 con número de acceso CECT 8606, o una variante de dicha cepa que tiene capacidad de absorción de colesterol a un sujeto que ha sido diagnosticado con una dislipidemia.

El término «prevención», «impedir» o «prevenir», como se usa en esta invención, se refiere a la administración de una cepa probiótica seleccionada de entre Lactobacillus reuteri V3401 con número de acceso CECT 8605 y Bifidobacterium breve BT820 con número de acceso CECT 8606, o una variante de dicha cepa que tenga capacidad de absorber colesterol para un sujeto que no ha sido diagnosticado con una dislipidemia, pero que normalmente se esperaría que desarrollara dicha enfermedad o tuviera un mayor riesgo de dicha enfermedad. La prevención pretende evitar la aparición de la dislipidemia. La prevención puede ser completa (por ejemplo, la ausencia total de una enfermedad). La prevención también puede ser parcial, de modo que, por ejemplo, la aparición de una enfermedad en un sujeto sea menor que la que habría ocurrido sin la administración del inhibidor de la presente invención. La prevención también se refiere a la susceptibilidad reducida a un trastorno clínico.

El término «sujeto», como se usa en esta invención, se refiere a todos los animales clasificados como mamíferos y aves e incluye, pero no se limita a, animales domésticos y de granja, primates y humanos, por ejemplo, seres humanos, primates no humanos, vacas, caballos, cerdos, ovejas, cabras, perros, gatos, roedores, pollos, patos, gansos, cisnes, faisanes, palomas o avestruces. Preferentemente, el paciente es un ser humano masculino o femenino de cualquier edad o raza.

El término «dislipidemia», como se usa en esta invención, se refiere a una cantidad anormal de lípidos y proteínas lipídicas en la sangre, es decir, una cantidad de lípidos que aumenta o disminuye con respecto a los valores normales. Los lípidos y las proteínas lipídicas pueden ser:

• colesterol, que en cantidades anormales puede provocar hipercolesterolemia, incluida la conocida hipercolesterolemia debida a un defecto en el cromosoma 19 (19p13.1-13.3) e hipocolesterolemia.

• glicéridos, como los triglicéridos, que en cantidades anormales pueden provocar hipertrigliceridemia e hipotrigliceridemia.

• lipoproteínas, como LDL y HDL, que en cantidades anormales pueden provocar hiperlipoproteinemia e hipolipoproteinemia.

La cepa probiótica de la invención, debido a su capacidad para absorber colesterol, es en particular adecuada para el tratamiento de una dislipidemia caracterizada por niveles elevados de lípidos o proteínas lipídicas.

Por tanto, en una realización particular, la dislipidemia es hipercolesterolemia. El término «hipercolesterolemia», como se usa en esta invención, se refiere a cualquier afección médica donde los niveles de colesterol en sangre se eleven por encima de los niveles clínicamente recomendados. Por ejemplo, si el colesterol se mide utilizando lipoproteínas de baja densidad (LDL), puede existir hipercolesterolemia si los niveles de LDL medidos están por encima de, por ejemplo, aproximadamente 70 mg/dl. Alternativamente, si el colesterol se mide usando colesterol plasmático libre, puede existir hipercolesterolemia si los niveles de colesterol libre medidos están por encima de, por ejemplo, aproximadamente 200-220 mg/dl.

En otra realización particular, la dislipidemia es hipertrigliceridemia. El término «hipertrigliceridemia», como se usa en este documento, se refiere a niveles altos de triglicéridos en sangre. Basado en los niveles en ayunas, la hipertrigliceridemia leve y moderada se diagnostica con niveles de triglicéridos de 150-999 mg/dl, y la hipertrigliceridemia grave y muy grave se diagnostica con niveles de triglicéridos superiores a 1.000 mg/dl.

En otra realización particular, la dislipidemia es hiperlipoproteinemia. El término «hiperlipoproteinemia», como se usa en esta invención, se refiere a niveles anormalmente elevados de cualquier lipoproteína en sangre. Las lipoproteínas incluyen quilomicrones, VLDL, LDL e IDL. Los altos niveles de lipoproteínas están asociados con la aterosclerosis. La hiperlipoproteinemia se divide en los siguientes cinco tipos:

• Tipo I: hiperlipidemia inducida por grasas o hiperlipidemia familiar idiopática, que es una enfermedad poco frecuente provocada por una lipasa deficiente o anómala, caracterizada por un nivel de triglicéridos de 1.000 10.000 mg/dl y más.

• Tipo II: hiperbetalipoproteinemia familiar e hipercolesterolemia familiar esencial debido a receptores de superficie celular deficientes, caracterizada por colesterol y triglicéridos elevados, lipoproteínas de baja densidad (LDL) elevadas y lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL).

• Tipo III: enfermedad familiar de beta ancha o xantoma tuberoso provocado por un receptor de lipoproteínas de baja densidad deficiente, caracterizado por colesterol y triglicéridos elevados; lipoproteínas de densidad intermedia elevadas.

• Tipo IV: Hipertrigliceridemia e hiperbetalipoproteinemia endógena de causa idiopática, caracterizada por niveles de triglicéridos inferiores a 1.000 mg/dl, colesterol normal, VLDL elevado.

• Tipo V: hipertrigliceridemia mixta por aclaramiento defectuoso de triglicéridos, caracterizada por niveles de triglicéridos superiores a 1000 mg/dl, colesterol elevado, LDL normal.

Dado que las diversas dislipidemias están implicadas en la resistencia a la insulina, probablemente debido a niveles bajos de HDL en sangre, la cepa probiótica de la invención también es útil en el tratamiento de la resistencia a la insulina o el síndrome metabólico.

Así, en otro aspecto, la invención se refiere a una cepa probiótica seleccionada de entre Lactobacillus reuteri V3401 con número de acceso CECT 8605 y Bifidobacterium breve BT820 con número de acceso CECT 8606 para su uso en el tratamiento y/o la prevención del síndrome metabólico. El término «síndrome metabólico» o «síndrome de resistencia a la insulina» o «síndrome metabólico X» o «síndrome cardiometabólico» o «síndrome X», como se usa en esta invención, se refiere a un trastorno de la utilización y almacenamiento de energía, diagnosticado por una coocurrencia de tres de cada cinco de los trastornos médicos siguientes: obesidad abdominal (central), presión arterial elevada, glucosa plasmática en ayunas elevada, hipertrigliceridemia y niveles bajos de colesterol de alta densidad (HDL). El síndrome metabólico aumenta el riesgo de desarrollar enfermedades cardiovasculares, en particular insuficiencia cardíaca y diabetes.

En otro aspecto, el presente documento se refiere al uso de una cepa probiótica seleccionada de entre Lactobacillus reuteri V3401 con número de acceso CECT 8605 y Bifidobacterium breve BT820 con número de acceso CECT 8606, o una variante de dicha cepa que tiene capacidad de absorción de colesterol como agente hipocolesterolémico.

El término «agente hipocolesterolémico», como se usa en esta invención, se refiere a un agente que provoca una reducción en los niveles de colesterol en sangre.

En otro aspecto, la invención se refiere composición a una composición que comprende una cepa probiótica seleccionada de entre Lactobacillus reuteri V3401 con número de acceso CECT 8605 y Bifidobacterium breve BT820 con número de acceso CECT 8606 para uso como medicamento.

En otro aspecto, la invención se refiere composición a una composición que comprende una cepa probiótica seleccionada de entre Lactobacillus reuteri V3401 con número de acceso CECT 8605 y Bifidobacterium breve BT820 con número de acceso CECT 8606 para su uso en el tratamiento y/o la prevención de la dislipidemia.

En otro aspecto, la invención se refiere composición a una composición que comprende una cepa probiótica seleccionada de entre Lactobacillus reuteri V3401 con número de acceso CECT 8605 y Bifidobacterium breve BT820 con número de acceso CECT 8606 para su uso en el tratamiento y/o la prevención del síndrome metabólico.

En otro aspecto, el presente documento se refiere al uso de una composición que comprende una cepa probiótica seleccionada de entre Lactobacillus reuteri V3401 con número de acceso CECT 8605 y Bifidobacterium breve BT820 con número de acceso CECT 8606, o una variante de dicha cepa que tiene capacidad de absorción de colesterol como agente hipocolesterolémico.

Los términos «cepa probiótica», «L reuteri V3401 con número de acceso CECT 8605», «B. breve BT820 con número de acceso CECT 8606», «variante», «capacidad de absorción de colesterol», «dislipidemia», «síndrome metabólico», y «agente hipocolesterolémico» se han descrito en detalle anteriormente y sus definiciones y realizaciones se incluyen aquí como referencia.

En otro aspecto, la invención se refiere composición a un alimento o producto nutricional que comprende una cepa probiótica seleccionada de entre Lactobacillus reuteri V3401 con número de acceso CECT 8605 y Bifidobacterium breve BT820 con número de acceso CECT 8606 para uso como medicamento.

En otro aspecto, la invención se refiere composición a un alimento o producto nutricional que comprende una cepa probiótica seleccionada de entre Lactobacillus reuteri V3401 con número de acceso CECT 8605 y Bifidobacterium breve BT820 con número de acceso CECT 8606 para su uso en el tratamiento y/o la prevención de la dislipidemia.

En otro aspecto, la invención se refiere composición a un alimento o producto nutricional que comprende una cepa probiótica seleccionada de entre Lactobacillus reuteri V3401 con número de acceso CECT 8605 y Bifidobacterium breve BT820 con número de acceso CECT 8606 para su uso en el tratamiento y/o la prevención del síndrome metabólico.

En otro aspecto, el presente documento se refiere al uso de un alimento o producto nutricional que comprende una cepa probiótica seleccionada de entre Lactobacillus reuteri V3401 con número de acceso CECT 8605 y Bifidobacterium breve BT820 con número de acceso CECT 8606, o una variante de dicha cepa que tiene capacidad de absorción de colesterol como agente hipocolesterolémico.

Productos farmacéuticos

El experto en la materia apreciará inmediatamente que la cepa probiótica de la invención es en particular útil como parte de producto farmacéutico.

Así, en otro aspecto, la invención se refiere a un producto farmacéutico que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de una cepa probiótica seleccionada de entre Lactobacillus reuteri V3401 con número de acceso CECT 8605 y Bifidobacterium breve BT820 con número de acceso CECT 8606.

El término «cantidad terapéuticamente efectiva», como se usa en esta invención, se refiere a la cantidad de la cepa probiótica de la invención necesaria para lograr una prevención, curar, retrasar, reducir la gravedad o mejorar uno o más síntomas notables de una dislipidemia, resistencia a la insulina o síndrome metabólico. Los términos dislipidemia, resistencia a la insulina y síndrome metabólico se han descrito en detalle en el contexto de los usos terapéuticos de la invención, y su definición y particularidades también se incluyen aquí como referencia. La cantidad terapéuticamente efectiva de una cepa probiótica según la invención puede determinarse mediante procedimientos convencionales en la técnica.

En una realización particular, el producto farmacéutico comprende una mezcla de cepas probióticas de la invención.

Preferentemente, el producto farmacéutico comprende al menos 2, al menos 3, al menos 4 o más de las cepas de la invención, y donde cada una de las cepas está representada en la composición en una proporción comprendida entre un 0,1 % y un 99,9 %, preferentemente entre un 1 % y un 99 %, más preferentemente entre un 10 % y un 90 %. En otra realización, la composición comprende cualquiera de las cepas bacterianas de la invención junto con otra cepa o mezcla de cepas y donde cada una de las cepas está representada en la composición en una proporción comprendida entre 0,1 % y 99,9 %, preferentemente entre un 1 % y un 99 %, más preferentemente entre un 10 % y un 90 %. En otra realización, la invención proporciona un producto farmacéutico que comprende un sobrenadante de un cultivo de una o más de las cepas según la invención. Preferentemente, el sobrenadante está representado en el producto farmacéutico en una proporción comprendida entre un 0,1 % y un 99,9 %, más preferentemente entre un 1 % y un 99 % e incluso más preferentemente entre un 10 % y un 90 %.

Los productos o composiciones farmacéuticas proporcionados por la presente invención pueden administrarse a un sujeto para tratar una dislipidemia, resistencia a la insulina o síndrome metabólico. Los términos dislipidemia, resistencia a la insulina y síndrome metabólico se han descrito en detalle en el contexto de los usos terapéuticos de la invención, y su definición y particularidades también se incluyen aquí como referencia.

En otra realización particular, el producto o composición farmacéutica comprende además uno o más vehículos, excipientes o disolventes farmacéuticamente aceptables.

El término «vehículo farmacéuticamente aceptable» o «disolvente farmacéuticamente aceptable» o «excipiente farmacéuticamente aceptable», en el contexto de la presente invención, pretende incluir todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos y agentes antifúngicos y similares compatibles con la administración farmacéutica. El uso de tales portadores y vehículos para sustancias farmacéuticamente activas es bien conocido en la técnica, excepto en la medida en que cualquier portador convencional sea incompatible con la cepa probiótica de la invención. Los estabilizadores son vehículos, excipientes o estabilizadores aceptables que no son tóxicos para el sujeto a las dosificaciones y concentraciones empleadas e incluyen tampones tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico bencílico; alquilparabenos, tales como metilparabeno o propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 aminoácidos); proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos que incluyen glucosa, manosa, maltosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azúcares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sales de sodio; complejos metálicos (por ej., complejos de Zn-proteína) y/o tensioactivos no iónicos tales como TWEEN™, PLURONICS™ o polietilenglicol (Pe G).

Las composiciones farmacéuticas pueden incluirse en un recipiente, envase o dispensador, junto con las instrucciones para su administración.

La preparación farmacéutica puede tomar la forma de comprimidos, cápsulas, suspensiones bacterianas líquidas, suplementos orales secos, suplementos orales húmedos, alimentación por sonda seca o alimentación por sonda húmeda. Preferentemente, el probiótico, la composición que contiene probiótico o que contiene sobrenadante y el producto farmacéutico están dirigidos a la vía oral, gástrica y/o a la superficie de la mucosa intestinal; sin embargo, también podrían dirigirse a la mucosa nasofaríngea, respiratoria, reproductiva o glandular, y pueden administrarse a un sujeto por vía oral, nasal, ocular, rectal, tópica y/o vía vaginal.

La cantidad de dosificación necesaria de las cepas probióticas en la composición, alimento o producto nutricional, o composición de producto farmacéutico descrita anteriormente variará según la naturaleza de la afección o el uso propuesto de la composición y el tipo de organismo involucrado.

En la presente invención se puede utilizar cualquier dosis adecuada de probióticos o combinaciones de los mismos, siempre que los efectos tóxicos no superen los efectos terapéuticos. La eficacia terapéutica y toxicidad de tales compuestos se pueden determinar por procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o animales experimentales, por ejemplo, ED (la dosis terapéuticamente efectiva en el 50 % de la población) y LD (la dosis letal para el 50 % de la población). La relación de la dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico y puede expresarse como la relación LD/ED. Sin embargo, la actividad de las nuevas cepas en el individuo depende naturalmente de la dosis. Es decir, cuanto más se incorporan las nuevas cepas mediante la ingestión o administración del material alimenticio anterior o la composición farmacéutica, mayor será la protección y/o actividad terapéutica de las cepas. Dado que las cepas de esta invención no son perjudiciales para las personas ni los animales, se puede incorporar una gran cantidad de las mismas de modo que esencialmente una alta proporción de la mucosa del individuo sea colonizada por las nuevas cepas. Se prefieren compuestos que presenten índices terapéuticos considerables. Los datos obtenidos de dichos ensayos de cultivos celulares y/o estudios en animales se pueden usar para formular un intervalo de dosificación para uso en humanos u otros mamíferos. La dosificación de tales compuestos se encuentra preferentemente dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluyen la ED con poca o ninguna toxicidad. La dosifiación puede variar dentro de este intervalo en función de la forma de dosificación empleada y la vía de administración utilizada. La dosis exacta la determinará el médico, a la luz de los factores relacionados con el sujeto que requiera tratamiento. Por ejemplo, para preparar una composición alimenticia según la presente invención, la cepa probiótica de la presente invención se incorpora en un soporte adecuado, en una cantidad de material de soporte de entre 105 UCF/g y aproximadamente 1012 UCF/g, preferentemente de entre aproximadamente 106 UCF/g y aproximadamente 1011 UCF/g de material de soporte, más preferentemente de entre aproximadamente 106 UCF/g y aproximadamente 1010 UCF/g de material de soporte.

En el caso de un producto o composición farmacéutica, la dosis de la cepa probiótica debe ser de aproximadamente de entre 105 UCF/g y aproximadamente 1014 UCF/g de material de soporte, preferentemente de entre aproximadamente 106 UCF/g y aproximadamente 1013 UCF/g de material de soporte, más preferentemente de entre aproximadamente 107 UCF/g y aproximadamente 1012 UCF/g de material de soporte. A los efectos de la presente invención, la abreviatura UCF designará una «unidad formadora de colonias», que se define como el número de células bacterianas reveladas por recuentos microbiológicos en placas de agar.

La dosis y la administración se ajustan para proporcionar niveles suficientes del resto activo o para mantener el efecto deseado. Los factores que pueden tenerse en cuenta incluyen la gravedad del estado de la enfermedad, la salud general del sujeto, la edad, el peso y el sexo del sujeto, el tiempo y la frecuencia de administración, las combinaciones de fármacos, las sensibilidades de reacción y la respuesta al tratamiento. Las composiciones de acción prolongada se pueden administrar todos los días, cada 3 a 4 días, cada semana o cada dos semanas, en función de la vida media y la tasa de aclaramiento de la formulación particular.

En otra realización, la invención también se refiere a un producto o composición farmacéutica de las cepas de esta invención en forma liofilizada o secada, que se pueden obtener mediante cualquier procedimiento convencional conocido en la técnica.

En otra realización del producto o composición farmacéutica, la cepa probiótica o la mezcla de las mismas está en forma de células inviables.

DEPÓSITO DE MATERIALES BIOLÓGICOS

El Lactobacillus reuteri V3401 se depositó en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) (Edificio 3 CUE, Pare Científic Universitat de Valencia, Catedrático Agustín Escardino 9, 46980 Paterna, España) en las condiciones estipuladas en el Tratado de Budapest. Se depositó el 25 de septiembre de 2014, y el número asignado a dicho depósito fue CECT 8605.

El Bifidobacterium breve BT820 se depositó en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) (Edificio 3 CUE, Pare Científic Universitat de Valencia, Catedrático Agustín Escardino 9, 46980 Paterna, España) en las condiciones estipuladas en el Tratado de Budapest. Se depositó el 25 de septiembre de 2014, y el número asignado a dicho depósito fue CECT 8606.

Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar la invención descrita, pero no deben interpretarse como limitantes de su alcance.

EJEMPLOS

Materiales y procedimientos

Cepas bacterianas y condiciones de crecimiento

Lactobacillus reuteri V3401 y otras especies de Lactobacillus se cultivaron de forma rutinaria en medio MRS (Oxoid) a 37 °C en condiciones anaeróbicas. Bifidobacterium breve BT820 y otras bifidobacterias se cultivaron en medio MRS-cisteína (0,1 % p/v) también a 37 °C y anaeróbicamente. Las suspensiones celulares para los procedimientos de inactivación y para los ensayos de actividad se cultivaron en medio de crecimiento estándar en fermentadores Biostat B 5 L (B. Braun) durante 8 24 h. En particular, se utilizaron medio A y medio B a distintos pH. La biomasa se concentró (10x) mediante centrifugación a 8.000 g y se almacenó a -20 °C hasta su uso.

La capacidad de L. reuteri V3401 para crecer utilizando distintas fuentes de carbono se probó utilizando la prueba API 50 CH (Biomerieux) siguiendo las instrucciones del proveedor. Las tiras de fermentación se analizaron a las 24 y 48 h de incubación.

Procedimientos para la inactivación de bacterias.

Cuando se prepararon muestras de bacterias inactivadas, se llevaron a cabo los procedimientos siguientes: la inactivación por calor se realizó en un autoclave de laboratorio estándar a 120 °C durante 20 min. La inactivación por microondas se logró mediante el uso de un aparato Milestone Ethos One donde las muestras bacterianas se sometieron a una rampa de potencia de 3 min, hasta 300 W, y una incubación final de 5 min a este valor de potencia. La inactivación por presión se realizó mediante 15-20 pulsos/min durante 10 min a 1.500-2.000 bar en un homogeneizador Microfluidics M-110P. La incubación en H²SO⁴80 mM durante 4 h a 55 °C y la neutralización posterior (hasta pH 7) con NaOH 10 M fueron las condiciones para la inactivación ácida. El mismo procedimiento, pero usando NaOH 80 mM primero y H²SO⁴al 96 % para la neutralización con álcalis, se siguió para la inactivación de la base. La inactivación química se llevó a cabo mediante la incubación de muestras bacterianas con H²O²(v/v) al 1,5 % o etanol (v/v) al 50 % durante 1 h a 37 °C. Los agentes químicos se eliminaron mediante tratamiento enzimático con catalasa o evaporación respectivamente.

Cultivos de enterocitos

Los enterocitos HT-29 se obtuvieron del CIC de la Universidad de Granada (España) y se cultivaron en medio DMEM suplementado con un 10 % (v/v) de FBS, aminoácidos no esenciales y L-glutamina 2 mM; a 37 °C y CO²(v/v) al 5 %. Los cultivos para la absorción de fluoresterol se cultivaron durante 14 días utilizando placas de 96 pocillos, se incubaron durante 3-4 h con micelas de fluoresterol y suspensiones bacterianas a 510⁸bacteria/ml, o ezetimiba 150 |jM (MSD-SP Ltd) como control positivo. Antes de los ensayos fluorocitométricos, los cultivos de HT-29 se desagregaron mediante tratamiento con tripsina, el medio y las micelas libres de fluoresterol se eliminaron por centrifugación y los enterocitos se suspendieron en tampón PBS.

Análisis de absorción de fluoresterol

Se prepararon micelas de fluoresterol, que contenían taurocolato de sodio 10 mM, fosfatidilcolina 6 mM y fluoresterol 0,2 mM como describen Sparrow y col. (Sparrow et al., 1999, J Lipid Res 40:1747-57). Se analizó la absorción de fluoresterol por bacterias incubando suspensiones bacterianas (510⁸bacteria/ml) con micelas (0,1 mg/ml fluoresterol) en tampón PBS a 37 °C. Después de 2 h de incubación, la mezcla se centrifugó a 5.000 g durante 5 min, el sobrenadante se descartó y el sedimento bacteriano se resuspendió en 0,1 ml de PBS. Este procedimiento se repitió 3 veces para eliminar las micelas de fluoresterol libres. Finalmente, se determinó la fluorescencia asociada a bacterias en un lector de microplacas Tecan Genius (excitación de 485 nm, filtros de emisión de 535 nm) o en un citómetro de flujo Beckton Dickinson FACScalibur. Cuando la citometría de flujo fue la técnica utilizada, las bacterias también se tiñeron con bromuro de etidio (10 jg/ml) en tampón de borato (borato de sodio 20 mM; EDTA 12 mM; formaldehído al 0,01 % y Triton X-100 0,01) para identificar su población (lectura de fluorescencia a longitudes de onda de excitación y emisión de 488 nm y 661 nm respectivamente). El fluoresterol absorbido se cuantificó basándose en los datos de fluorescencia (A^ex: 488 nm; A^em: 530 nm) por célula obtenidos de 2.000 eventos en cada muestra.

El fluoresterol absorbido por los enterocitos HT-29 se cuantificó solo mediante citometría de flujo, utilizando el equipo mencionado y los mismos ajustes de láser, pero la tinción con bromuro de etidio no fue necesaria para identificar la población de células eucariotas. En cada ensayo, los datos de los controles negativos (enterocitos incubados con micelas de fluoresterol) se utilizaron como referencia para calcular la absorción (%) relativa en las muestras del problema.

Microscopía

Se tomaron imágenes de microscopía electrónica de transmisión de L. reuteri V3401 cultivada en medio A pH 6 y medio B pH 5 en un microscopio Carl Zeiss Libra 120 Plus.

Extractos de proteínas de L. reuteri V3401 y electroforesis de proteínas

Las células bacterianas de L. reuteri V3401 se resuspendieron a 0,2 g/ml (peso húmedo) en fostato de potasio 50 mM helado, tampón EDTA 1 mM a pH 6 que contiene 0,1-0,2 g/ml de perlas de vidrio lavadas con ácido (0,25-0,5 mm). La rotura física de las células se llevó a cabo mediante agitación en un agitador de vórtice durante diez períodos de 20 segundos con intervalos de enfriamiento de 20 segundos en hielo. Después de la centrifugación a 14.000 g durante 15 min a 4 °C, se descartaron los restos celulares y se cuantificó el sobrenadante rico en proteínas siguiendo el procedimiento de Bradford.

Se incubaron B. breve BT820 y otras bacterias (5 ■ 10⁹bacterias/ml) con 0,1-0,2 mg/ml de extractos de proteína de L. reuteri V3401, en tampón fosfato de potasio 50 mM pH 6, durante 8 -12 h a 37 °C en los experimentos de «activación». Después de la incubación, se eliminó el extracto de proteína mediante centrifugación y lavado con tampón PBS.

La desnaturalización de SDS-PAGE se realizó en geles (p/v) al 8 % y bandas electroforéticas visualizadas mediante tinción de Coomasie. Se ejecutaron zimogramas para la detección de enzimas líticas en geles seminativos SDS-PAGE al 8 % que contienen 10 mg/ml de células de Micrococcus luteus esterilizadas en autoclave. Después de la electroforesis de las muestras de proteína (15-20 jg), se incubaron los geles a 37 °C en tampón fostato de potasio 50 mM pH 6, Triton X-100 (v/v) al 0,1 %. Las bandas de proteínas con actividad lítica se detectaron mediante tinción con azul de metileno (0,1 % p/v en 0,01 % p/v KOH) durante 1-2 min y lavado extenso con agua.

Ensayo de hidrólisis de sales biliares

La hidrólisis de sales biliares por muestras bacterianas se analizó de la siguiente manera: 510 ⁸UCF/ml de bacterias (vida) se incubaron con 1 mg/ml de sales biliares porcinas en tampón borato 1 M pH 10 durante 2 h a 37 °C: se cuantificó la taurina liberada por hidrolasas mezclando 10 j l de la reacción enzimática con 100 j l de reactivo o-ftalaldehído (OPA). Finalmente, se agregaron 2 ml de NaOH 0,5 M y la fluorescencia (A^ex340 nm / A^em465 nm) se analizó en un lector de microplacas Tecan Genius. La concentración de taurina se calculó mediante una curva de calibrado realizada con concentraciones conocidas de este ácido orgánico.

Actividad de la colesterol esterasa

La cinética de la colesterol esterasa se analizó espectrofotométricamente, a 415 nm; durante 10 min a 37 °C en un lector de microplacas Tecan Genius, para estudiar si L. reuteri V3401 o B. breve BT820 fueron capaces de inhibir esta enzima. Se utilizó butirato de 4-nitrofenilo (2,5 mM) como sustrato cromogénico disuelto en tampón fosfato de sodio 100 mM pH 7, NaCl 100 mM, taurocolato de sodio 0,5 mM. Muestras bacterianas (5108 bacteria/ml) se coincubaron en la mezcla de reacción con 0,04 U/ml de enzima y la pendiente de la línea recta (A⁴¹⁵nm frente al tiempo) utilizada para determinar y comparar la actividad enzimática.

Purificación, amplificación y secuenciación de ADN

El ADN genómico de las muestras bacterianas se purificó utilizando el QlAamp DNA Mini Kit (QIAgen) siguiendo las instrucciones para las bacterias grampositivas. El ADN se utilizó como molde en ensayos de amplificación por PCR para la purificación del gen 16S (QIAquick gel Extraction Kit, QIAgen) y secuenciación (Sistemas Genomicos, SL España), generación de perfiles RAPD y detección de secuencias específicas de ADN. Las reacciones de PCR se realizaron en un termociclador Mastercyler Eppendorf®, usando como cebadores los oligonucleótidos (Eurofins Genómica) presente en la Tabla 1 y los componentes de reacción incluidos en el kit de PCR MasterTaq (5 Prime GmbH). Los fragmentos de ADN se resolvieron y visualizaron mediante técnicas estándar de electroforesis en gel de agarosa.

Aislamiento de ARN y análisis de expresión génica

Se aislaron muestras de ARN de enterocitos procarióticos y HT-29 siguiendo el procedimiento TRIzol (Chomczynski and Sacchi, 1987, Anal Biochem 162:156-159). Las muestras de biomasa iniciales se obtuvieron de cultivos de 10 ml en la fase logarítmica tardía para los lactobacilos y de placas de 24 pocillos (un pocillo por muestra) incubadas durante 14 días para los enterocitos. Las muestras de ARN total se incubaron con DNasa I y se repitió la extracción de TRlzol para eliminar la nucleasa. La concentración, integridad y pureza del ARN se confirmaron mediante electroforesis en gel de agarosa y espectrofotometría UV.

Para los estudios de expresión génica de qPCR, se llevó a cabo la síntesis de ADNc de retrotranscripción en dos etapas. En primer lugar, se sintetizó ADNc utilizando oligo d(T)15 y hexámeros aleatorios como cebadores de retrotranscripción, para muestras de ARN eucariotas y procariotas respectivamente, y el kit de síntesis de ADNc AffinityScript QPCR (Agilent) siguiendo las instrucciones del fabricante. En la segunda etapa, se amplificaron fragmentos de ADNc específicos en un termociclador Stratagene MX3005P utilizando SYBR® green (Brilliant III Ultra-Fast SYBR Green, Agilent) como fluoróforo. Para el cálculo de la expresión génica se utilizaron valores de Ct de reacciones de genes de control (GADPH) y genes analizados (NPC1L1 o genes de enzimas líticas), siguiendo el procedimiento AACt y las recomendaciones de Willems y col. (Willems et al., 2008; Anal Biochem 379:127-9) para la normalización de los datos.

Hibridación sustractiva

La hibridación sustractiva supresora bacteriana (SSH) se realizó siguiendo los manuales de usuario del kit de sustracción de ADNc PCR-Select™ (Clontech Laboratories, Inc., EE. UU.), con la excepción de que se usaron cebadores aleatorios en la síntesis de ADNc de la primera hebra. Se usó L. reuteri V3401 cultivado en medio A como muestra de ensayo y L. reuteri V3401 cultivado en medio B como impulsor en el experimento de hibridación sustractiva supresiva.

Los fragmentos de ADNc sustraídos se clonaron en el vector pGEM-T (Promega), se amplificaron utilizando oligonucleótidos T7 y SP6 como cebadores y fueron secuenciados por Sistemas Genómicos, S. L. (España). Las secuencias de nucleótidos obtenidas se identificaron en la base de datos de nucleótidos utilizando el programa Blastn en la página de inicio del NCBI.

Grupos de animales y dietas

Se compraron sesenta ratas Wistar hembras, con un peso aproximado de 200 g, de Janvier Labs (Francia). Las ratas se alojaron individualmente en jaulas y se mantuvieron a temperatura (23 ± 2 °C) y humedad (55 ± 5 %) constantes y se expusieron a un ciclo de 12 h de luz/oscuridad.

Después de un período de adaptación de 2 semanas con una dieta normal (2014 Teklad Global 14 % Protein Rodent Maintenance Diet, Harlan), las 60 ratas se dividieron en 6 grupos de 10 ratas cada uno. A los seis grupos se les asignaron dietas de la siguiente manera: (A) Grupo de control, con dieta normal que no recibió muestras bacterianas ni dieta alta en colesterol; (B) Control positivo, con dieta alta en colesterol. El resto de los grupos se les dio, además de la dieta alta en colesterol, una dosis diaria de la muestra bacteriana (2 x 109 bacterias por animal y día) en el agua potable: (C) L. reuteri V3401 vivo; (D) L. reuteri V3401 inactivado por calor; (E) B. breve BT820 vivo; (F) B. breve BT820 inactivado por calor. La dieta alta en colesterol contenía colesterol (w/w) al 1 % en una dieta estándar (2014 Teklad Global 14 % Protein Rodent Maintenance Diet, Harlan). Las ratas se alimentaron durante 57 días y se registró el peso corporal. Después de este período se sacrificó a las ratas.

Ensayo de índices de suero sanguíneo

Se recolectaron muestras de sangre de la vena de la cola cada 7-10 días para determinar el colesterol sérico utilizando el kit de colesterol de BioSystems. Al final del período del experimento (57 días), después de una privación de alimento durante 12 horas, se recolectaron muestras de sangre de aproximadamente 5 ml de cada rata mediante punción cardíaca. El colesterol total sérico (TCH), el colesterol unido a lipoproteínas de alta densidad (HDL-C), el colesterol unido a lipoproteínas de baja densidad (LDL-C), los triglicéridos, los fosfolípidos y la glucosa se midieron con un analizador químico automático Mindray BS200.

Ejemplo 1: Detección de cepas bacterianas con capacidad para inhibir la absorción de colesterol de los enterocitos humanos

Para llevar a cabo esta tarea, se desarrolló un procedimiento basado en cultivos de enterocitos humanos HT-29 y un análogo de colesterol fluorescente, fluoresterol.

La absorción de fluoresterol, disuelto en micelas de fosfatidilcolina y taurocolato de sodio, por los enterocitos HT-29, puede cuantificarse mediante citometría de flujo. Los cultivos de células HT-29 se incubaron en presencia de micelas de fluoresterol durante al menos 3 h, y después de la desagregación del cultivo, se determinó la fluorescencia de la población celular mediante la técnica mencionada. La fluorescencia celular es proporcional a la cantidad de fluoresterol absorbido. El procedimiento se validó analizando el fármaco reductor de colesterol ezetimiba (a una concentración de 150 |jM) en el modelo in vitro descrito.

Mediante este procedimiento se determinó la capacidad de una colección bacteriana de más de 400 muestras para reducir la absorción de fluoresterol. Los cultivos celulares se incubaron con micelas de fluoresterol y suspensiones (5108 UCF/ml) de bacterias viables o inactivadas. La biblioteca de muestras inviables se obtuvo mediante distintos procedimientos de inactivación: calor, alta presión, microondas e incubación con ácido, base, alcohol y peróxido de hidrógeno.

La comparación de los datos de fluorescencia celular promedio de cultivos de control negativo (sin muestras bacterianas) con los valores obtenidos de cultivos incubados con suspensiones bacterianas nos permite identificar dos especies bacterianas capaces de reducir la absorción de fluoresterol más de un 25 %: Lactobacillus reuteri V3401 y Bifidobacterium breve BT820 (figura 1).

Ambas cepas bacterianas mostraron actividad cuando fueron analizadas vivas e inactivadas por distintos procedimientos (figura 2).

Ejemplo 2: Caracterización de cepas bacterianas

2.1 Lactobacillus reuteri V3401

Se aisló Lactobacillus reuteri V3401 de leche cruda de vaca en medio MRS. Su identificación se realizó mediante amplificación y secuenciación del gen ribosómico 16S. La secuencia del gen 16S ribosómico parcial obtenida (SEQ ID NO: 1) mostró un 100 % de similitud con secuencias de genes 16S a partir de varias entradas EMBL correspondientes a cepas L. reuteri (I5007, BCS159, NM94-6 y TB-B11).

La diferenciación de L. reuteri V3401 se llevó a cabo con la prueba de huellas dactilares RAPD (amplificación aleatoria de ADN polimórfico) utilizando como plantilla ADN genómico de L. reuteri V3401 y otras cinco cepas de L. reuteri (figura 3). Se usaron oligonucleótidos de (gtg)5 y OPL1 como cebadores (Tabla 1).

T abla 1. Oli onucleótidos utilizados como cebadores en ensa os de PCR

Los perfiles (gtg)5 y OPL-1 RAPD nos permitieron diferenciar L. reuteri V3401 de las otras 5 cepas probadas. El cebador de patrón de banda (gtg)5 fue específico de las cepas de L. reuteri V3401 y LR20, por lo que fue necesario un análisis RAPD adicional con el cebador OPL-1 para diferenciar entre las cepas de L. reuteri V3401 y LR20.

Además, L. reuteri V3401 se caracterizó en base a su perfil bioquímico utilizando la prueba de fermentación de carbohidratos API CH50 (BioMerieux). Los resultados se muestran en la Tabla 2.

Tabla 2. Perfil de fermentación de carbohidratos mostrado por L.reuteri V3401 después de 24 h y 48 h de incubación, probado con el sistema API CH 50.

2,2. Bifidobacterium breve BT820

Este microorganismo se aisló de la leche materna humana en medio de agar MRS-cisteína. Bifidobacterium breve BT820 se identificó a nivel de especie mediante amplificación y secuenciación del gen ribosómico 16S. La secuencia del gen 16S ribosómico parcial obtenida (SEQ ID NO: 14) reveló una similitud significativa (entre 98,6 y 100 %) con secuencias del gen 16S de varios B. breve (BR2, BGM6, 689b, 875 y JCM1273) depositadas en la base de datos de a Dn EMBL.

De la misma manera que L. reuteri V3401, se llevó a cabo un análisis adicional para distinguir B. breve BT820 de cepas bacterianas pertenecientes a la misma especie o género. Se realizó una prueba de huellas dactilares RAPD utilizando ADN genómico de B. breve B T820, cuatro cepas B. breve y una cepa B. longum empleando el oligonucleótido (gtg)5 como cebador. Nuestros resultados, mostrados en la figura 4 y la Tabla 3, demostraron que B. breve BT820 se puede diferenciar de otras cepas de Bifidobacterium en función de su perfil específico RAPD (gtg)5.

Tabla 3. Fra mentos de ADN detectados en el ensa o t 5-RAPD realizado con cepas de Bifidobacterium.

Ejemplo 3: Mecanismo de acción

Para saber cómo ambas cepas bacterianas reducen la absorción de fluoresterol en los enterocitos HT-29, se realizaron varios ensayos. En primer lugar, se planteó la hipótesis de que la desconjugación de las sales biliares podría contribuir a reducir los niveles de fluoresterol. Las hidrolasas de sales biliares son las enzimas responsables de esta reacción y la glicina y la tarurina los productos de esta hidrólisis. Para evaluar esta actividad enzimática en L. reuteri V3401 y B. breve BT820, ambas cepas se incubaron con sal biliar (10 mg/ml) durante 2 h y se determinó la taurina liberada. Los resultados mostraron que ni L. reuteri V3401 ni B. breve BT820 indujeron la hidrólisis de sales biliares en nuestras condiciones experimentales.

Otra posibilidad podría ser que el fluoresterol sea metabolizado o degradado por las cepas bacterianas, lo que provocaría la degradación del fluoróforo y explicaría que la fluorescencia asociada a las células HT-29 disminuyese. L. reuteri V3401 y B. breve BT820 se incubaron con micelas de fluoresterol durante 24 h y se midió la fluorescencia en distintos intervalos de tiempo. Los resultados demostraron que la fluorescencia total no decayó más que el control negativo de fluoresterol, sin muestras bacterianas y, por tanto, la hipótesis del metabolismo y/o degradación del fluoresterol podría rechazarse.

L. reuteri V3401 y B. breve BT820 podrían inhibir la absorción de fluoresterol en los enterocitos HT-29 mediante la interacción con el receptor de membrana eucariota NPC1L1. Este receptor parece estar involucrado en el transporte de colesterol a través de la membrana de los enterocitos en mamíferos y es la diana molecular de la ezetimiba. Se diseñó un ensayo indirecto para tratar de ver si L. reuteri V3401 y B. breve BT820 inhibían el transporte de colesterol bloqueando la proteína de membrana NPC1L1. Los enterocitos HT-29 se incubaron con fluoresterol y las muestras bacterianas con ezetimiba a la concentración máxima efectiva (300 |jM) observada en nuestro modelo in vitro, que induce una inhibición del 40 % de la absorción de fluoresterol. Asumimos que bajo estas condiciones, la ezetimiba inhibe completamente el receptor NPC1L1 y enmascara el posible efecto de la bacteria si su diana es el mismo transportador de colesterol. Por el contrario, un efecto aditivo del fármaco y las muestras bacterianas podría interpretarse como evidencia de que actúan mediante distintos mecanismos. Nuestros resultados experimentales mostraron un aumento en la inhibición de la absorción de fluoresterol en aquellos cultivos de HT-29 incubados con ezetimiba y L. reuteri V3401 o B. breve BT820 (figura 5). Por tanto, pensamos que ninguno de los dos microorganismos reduce la absorción de fluoresterol bloqueando el receptor NPC1L1.

Otra posibilidad es que L. reuteri V3401 y B. breve BT820 repriman la síntesis de NPC1L1 a nivel genético. Esta hipótesis se estudió cuantificando la concentración relativa de ARNm en enterocitos HT-29 incubados o no con la bacteria. Después de la purificación y retrotrancripción del ARN, la expresión del gen NPC1L1 se determinó mediante qPCR utilizando el gen GAPDH como referencia para la normalización de datos. Nuestros resultados no revelaron cambios en el nivel de expresión de NCP1L1 en HT-29 debido a la incubación en presencia de L. reuteri V3401 o B. breve BT820.

La colesterol esterasa pancreática es una enzima involucrada en la hidrólisis de los ésteres de colesterol en el tracto digestivo. Esta hidrólisis cumple una función fundamental en la regulación del procedimiento de absorción del colesterol. Aunque este paso fisiológico no podría ser responsable de la inhibición de la absorción de fluoresterol en nuestro modelo in vitro basado en enterocitos HT-29, decidimos evaluar si L. reuteri V3401 y B. breve BT820 pudieron inhibir esta enzima, ya que este efecto podría estar involucrado en la actividad hipocolesterolémica in vivo de las cepas. La actividad de la colesterol esterasa pancreática se midió espectrofotométricamente en presencia de muestras bacterianas y los resultados mostraron que la cinética enzimática no cambia con respecto a las reacciones de control sin muestras bacterianas.

Se realizaron tres experimentos diferentes para estudiar si L. reuteri V3401 y B. breve BT820 fueron capaces de captar fluoresterol. Primero, ambas cepas (inactivadas por calor) se incubaron con micelas de fluoresterol durante 3 horas y, después de un lavado extenso, se determinó la fluorescencia asociada a las células bacterianas mediante fluoroespectrofotometría. Los resultados de estos ensayos se muestran en la figura 6.

Nuestros resultados indican que L. reuteri V3401 y B. breve BT820 incorporan fluoresterol en sus células. Las muestras bacterianas de las cepas mencionadas, tratadas de la misma forma que se describió anteriormente, se analizaron mediante citometría de flujo y se obtuvieron resultados similares. Esta técnica permite distinguir entre la fluorescencia asociada a células bacterianas y la fluorescencia correspondiente a micelas residuales de fluoresterol, por lo que es una técnica más precisa. Nuevamente, ambas cepas bacterianas pudieron absorber fluoresterol (figura 7).

Para confirmar los resultados obtenidos en ensayos previos, se analizaron mediante microscopía láser confocal muestras de L. reuteri V3401 y B. breve BT820, inactivadas por calor e incubadas con micelas de fluoresterol. Los resultados mostraron que L. reuteri V3401 y B. breve BT820 tenían su estructura celular teñida con fluoresterol. Las imágenes confirman que ambas cepas son capaces de captar fluoresterol y pueden competir con los enterocitos HT-29 en los ensayos celulares, por lo que se reduce el fluoresterol disponible para la absorción por parte de las células humanas.

Ejemplo 4: Lactobacillus reuteri V3401 se puede cultivar en condiciones de crecimiento específicas para aumentar su capacidad de reducir la absorción de fluoresterol por parte de los enterocitos humanos

En el procedimiento de optimización de las condiciones de crecimiento de L. reuteri V3401 se ensayaron varios medios de crecimiento y variables físico-químicas, con el fin de incrementar la concentración bacteriana. Las muestras de L. reuteri V3401 cuyos resultados se han mostrado se obtuvieron con un medio de cultivo denominado medio A con un pH ajustado a 6. Los resultados de los experimentos de optimización permitieron diseñar un procedimiento de producción más eficiente (figura 8A) que utiliza un medio denominado medio B con un valor de pH de 5. Sin embargo, después de la inactivación por calor de las muestras bacterianas, obtenidas con el procedimiento de crecimiento, L. reuteri V3401 no pudo reducir la absorción de fluoresterol de los cultivos de enterocitos HT-29, al mismo nivel que las muestras obtenidas en el medio A a pH 6 (figura 8B).

Para determinar el factor responsable de este cambio de actividad en L. reuteri V3401, se estudió el efecto de la composición de los medios de cultivo y el pH de crecimiento. Se ensayaron muestras bacterianas, inactivadas por calor, obtenidas en distintas condiciones de crecimiento en enterocitos HT-29 y se determinó su capacidad para reducir la absorción de fluoresterol. Los resultados de estos experimentos de control se resumen en la figura 9.

Nuestros resultados parecían indicar que el pH extracelular podría ser el factor clave en el procedimiento de activación de la capacidad de L. reuteri V3401 para reducir la absorción de fluoresterol en enterocitos humanos. Para confirmar esta hipótesis se cultivó L. reuteri V3401 en medio B a distintos valores de pH extracelular. De nuevo, una vez que se obtuvieron las suspensiones bacterianas y se inactivaron por calor, se evaluó su capacidad para reducir la absorción de fluoresterol en los enterocitos HT-29. Los resultados de este experimento demostraron que los valores de pH de crecimiento iguales o superiores a 6 aumentan la capacidad de L. reuteri V3401 para inhibir la captación de fluoresterol en enterocitos humanos HT-29 (figura 10).

Se realizó un nuevo ensayo con el fin de saber si el pH extracelular podría activar L. reuteri V3401 en un corto período de tiempo. Para eso, el microorganismo se cultivó en medio B a pH 5 durante 14 h. A continuación, el pH extracelular se cambió a 6 durante 24 h. Se recogieron muestras bacterianas en distintos intervalos de tiempo, se inactivaron por calor y se probó su actividad biológica en cultivos de enterocitos HT-29. Como se muestra en la figura 11, L. reuteri V3401 cultivado en las condiciones descritas no pudo reducir la absorción de fluoresterol en HT-29. Estos datos parecen indicar que el procedimiento de activación de L. reuteri V3401 requiere que la incubación a pH 6 se realice durante la fase de crecimiento activo.

Ejemplo 5: Caracterización del procedimiento de activación

Para estudiar los acontecimientos moleculares responsables de la activación de L. reuteri V3401 cuando se cultiva a pH 6 frente a pH 5, se realizó un ensayo de hibridación sustractiva utilizando bibliotecas de ADNc aisladas de L. reuteri V3401 cultivado en medio A a pH 6 (muestra de prueba) y de la misma cepa cultivada en medio B a pH 5 (muestra de mutación conductora). Este experimento fue diseñado para identificar aquellos genes sobreexpresados en la primera condición de crecimiento.

Los resultados de este experimento permitieron identificar varios genes con mayor nivel de expresión en el medio A a pH 6. Uno de estos genes era un gen codificante de una enzima lítica (identificación basada en similitud de secuencia) que podría estar involucrado en un procedimiento de modificación de la pared celular de L. reuteri V3401, de manera que aumentan su afinidad y/o permeabilidad hacia micelas de fluoresterol. La sobreexpresión de este gen en el medio A a pH 6 se confirmó mediante qPCR usando cebadores específicos (Tabla 1) y gadph como control para la normalización de los datos de expresión génica (figura 12).

Por otro lado, se identificó una banda de proteína electroforética a nivel bioquímico en geles de SDS-PAGE seminativos (zimogramas). Los extractos de proteínas se purificaron a partir L. reuteri V3401, se cultivaron en medio B a distinto pH y se resolvieron en Micrococcus luteus que contenían geles SDS-PAGE. Después de la tinción con azul de metileno, se pudo detectar una enzima lítica en aquellas muestras obtenidas de L. reuteri V3401 cultivadas a valores de pH más altos (figura 13).

No se puede concluir que la enzima lítica identificada bioquímicamente esté codificada por el gen identificado en los ensayos de hibridación sustractiva, aunque existe una correlación entre la expresión de dicho gen y la actividad enzimática detectada en los cimogramas.

Estos resultados parecen indicar que el cultivo de L. reuteri V3401 en medio A o medio B a pH 6, induce la actividad de una enzima lítica que podría estar implicada en la permeabilización de la envoltura bacteriana. Para estudiar la integridad de la pared celular, las muestras de L. reuteri V3401 cultivado en medio A a pH 6 y en medio B a pH 5 se analizaron mediante microscopía electrónica de transmisión (figura 14). Las imágenes obtenidas muestran bacterias con envoltura celular difusa en muestras de L. reuteri V3401 cultivadas en medio A a pH 6 (figura 14 A y B) y esto podría explicarse por hidrólisis parcial de la pared celular. Por el contrario, las muestras de L. reuteri V3401 cultivado en medio B a pH 5 (figura 14C y D) muestra más bacterias electrodensas con forma definida.

Ejemplo 6: Especificidad del mecanismo de activación

Se analizó la influencia del medio de cultivo en la actividad de captación de fluoresterol en otras cepas bacterianas, para intentar averiguar cómo de específico podría ser el efecto observado en L. reuteri V3401. Primero, se analizó la actividad de varias especies bacterianas cultivadas en medio A a pH 6 y en medio B a pH 5 con el ensayo de enterocitos H-T29 (figura 15).

Los resultados mostraron que ninguna de las bacterias analizadas redujo la absorción de fluoresterol en los enterocitos HT-29, independientemente del medio de crecimiento empleado.

Como se mencionó anteriormente, la activación de L. reuteri V3401 parece estar mediada, al menos en parte, por un aumento en la expresión de una enzima lítica. Además, en nuestros experimentos de hibridación sustractiva se identificó un gen que codifica una enzima lítica y está presente en otras cepas de L. reuteri cuyo genoma está publicado en la literatura científica. Se decidió estudiar si el gen estaba presente en otras cepas de L. reuteri disponibles en nuestra empresa, utilizando cebadores específicos (Tabla 1) para realizar un experimento de PCR utilizando ADN genómico de las cepas mencionadas de L. reuteri. Los resultados indican que este gen está presente en L. reuteri LR20 pero no en LR35. Estas cepas no mostraron capacidad para reducir la absorción de fluoresterol en nuestro ensayo de enterocitos. Se decidió ver si el gen de la enzima lítica presente en L. reuteri LR20 se expresaba activamente. La expresión génica se cuantificó mediante qPCR y la enzima se detectó mediante zimogramas, utilizando muestras de ARN y extractos de proteínas purificados de biomasa cultivada en medio A a pH 6 y medio B a pH 5.

Estos resultados muestran que, a diferencia de L. reuteri V3401, en L. reuteri LR20 el gen de la enzima lítica no cambia su nivel de expresión en función del medio de cultivo, donde es inferior a los cuantificados en L. reuteri V3401 (figura 16).

En resumen, estos datos parecen indicar que, aunque el gen que codifica la enzima lítica está presente en otras cepas de L. reuteri, el mecanismo de activación que mejora la captación de fluoresterol de L. reuteri V3401, mediante la inducción de la enzima lítica, es específico de la cepa.

Ejemplo 7: Activación de otras cepas bacterianas

Como se mencionó anteriormente, las condiciones de crecimiento óptimas que permiten la absorción de fluoresterol por L. reuteri V3401, parecen ser específicas de la cepa. Parte del mecanismo molecular de este procedimiento se basa en la activación de una enzima lítica que probablemente digiere la pared celular y aumenta la permeabilidad celular. Se ensayó la activación de otras bacterias por esta enzima y se ensayó su capacidad de absorción de fluoresterol.

Se obtuvo extracto de proteína de L. reuteri V3401 mediante el cultivo de este microorganismo en medio A a pH 6 y se incubó con las siguientes cepas bacterianas: L. reuteri LR35, L. plantarum LP18 y B. breve BT820. Después de la incubación, las suspensiones bacterianas de estos microorganismos se inactivaron por calor y se ensayaron en el ensayo de absorción de fluoresterol HT-29 (figura 17). Los resultados mostraron que ni L. reuteri L R35 ni L. plantarum LP18 reducen la absorción de fluoresterol en células de enterocitos; sin tratar o incubados con el extracto de proteína. Por el contrario, B. breve BT820 confirmó su capacidad de reducción del fluoresterol, detectada en ensayos anteriormente, actividad que fue mayor en muestras de bacterias incubadas con extracto de proteína de L. reuteri V3401 (figura 17).

La captación de fluoresterol por suspensiones bacterianas confirmó los resultados observados en las células HT-29. Ni L. reuteri LR35 ni L. plantarum LP18 mostraron capacidad de absorción de fluoresterol. Ambas cepas se probaron con y sin incubación de extracto de proteína de L. reuteri V3401. Por el contrario, B. breve BT820 mostró valores de fluorescencia por célula más altos en las muestras incubadas con extracto de proteína de L. reuteri V3401, con respecto a las muestras bacterianas no tratadas (figura18).

Ejemplo 8: Actividad in vivo en un modelo animal de hipercolesterolemia

Se decidió probar si el efecto de L. reuteri V3401 y B. breve BT820 in vitro sobre la absorción de fluoresterol en enterocitos humanos podía demostrarse in vivo. Para ello, se llevó a cabo un ensayo utilizando un modelo animal para la hipercolesterolemia. El ensayo consistió en seis grupos (n=10) de ratas hembras Wistar, que pesan aproximadamente 200 g, alimentadas con una dieta alta en colesterol que contiene 1 % (w/w) de colesterol. Las muestras bacterianas se administraron (2109 bacterias por animal y día) en el agua de bebida (Cuadro 5).

Tabla 5. Grupos de animales dietas analizadas en el ensa o in vivo.

Se recolectaron muestras de sangre de la vena de la cola cada 7-10 días para determinar el colesterol sérico. Después de 57 días, el grupo de control hipercolesterolémico (grupo B) mostró valores de colesterol sérico significativamente más altos en comparación con el grupo alimentado con dieta estándar (grupo de control A). En este momento, las ratas fueron sacrificadas y se midieron el colesterol total sérico (TCH), el colesterol unido a lipoproteínas de alta densidad (HDL-C), el colesterol unido a lipoproteínas de baja densidad (LDL-C), los triglicéridos, los fosfolípidos y la glucosa.

Los resultados mostraron valores de TCH más bajos en los cuatro grupos de animales que consumieron muestras de probióticos (figura 19). La suplementación de la dieta con cualquiera de las cuatro muestras fue eficaz para reducir el colesterol sérico en comparación con aquellos alimentados con la misma dieta alta en colesterol (grupo de control B).

Además, las ratas alimentadas con la dieta alta en colesterol y las muestras de probióticos (grupos C-F) mostraron niveles de HDL-C similares a los del grupo control (grupo A), en contraste con el control hipercolesterolémico (grupo B), que mostró niveles significativamente reducidos de HDL- C (figura 20A). La relación LDL-C/HDL-C se utiliza para predecir el riesgo cardiovascular. Se considera más útil que los valores absolutos de colesterol sérico y/o LDL-C. Cuando se utilizaron los valores de LDL-C (figura 20B) para calcular esta relación (figura 20C), se confirmó que la ingesta dietética de probióticos reducía la relación LDL-C/HDL-C a valores similares al grupo de salud (grupo A).

Otros parámetros estudiados fueron los niveles plasmáticos de triglicéridos y fosfolípidos. Los animales de control alimentados con colesterol alto (grupo B) mostraron valores más altos que el grupo de control (grupo A), en contraste con las ratas alimentadas con la dieta alta en colesterol y muestras de probióticos (grupos C-F) que mostraron niveles similares de triglicéridos a los del grupo control de salud A. Sin embargo, estas diferencias no fueron estadísticamente significativas (figura 21A). Además, no se encontraron diferencias entre los niveles de fosfolípidos plasmáticos obtenidos a partir de los 6 grupos experimentales (figura 21B).

También se observaron diferencias entre los datos del grupo de animales en un parámetro no lipídico. El nivel promedio de glucosa en plasma de las ratas alimentadas con colesterol alto (grupo B) fue más alto que el del grupo de control de salud

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una cepa probiótica seleccionada de entre Lactobacillus reuteri V3401 con número de acceso CECT 8605 y Bifidobacterium breve BT820 con número de acceso CECT 8606.

2. La cepa probiótica según la reivindicación 1, donde dicha cepa probiótica está en forma de células viables o células inviables.

3. Un cultivo biológicamente puro, o una composición, o un producto farmacéutico, o un alimento o un producto nutricional que comprenda una cepa probiótica según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, o una fracción de una cepa probiótica enriquecida en la membrana celular o la pared celular según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2.

4. Un procedimiento para obtener una cepa probiótica seleccionada de entre Lactobacillus reuteri V3401 con número de acceso CECT 8605 y Bifidobacterium breve BT820 con número de acceso CECT 8606 con mayor capacidad de absorción de colesterol, que comprende una etapa de inactivación de células de dicha cepa probiótica o una etapa de cultivo de células de dicha cepa probiótica a un pH comprendido entre 6 y 9 durante su fase de crecimiento activo.

5. El procedimiento según la reivindicación 4, donde la inactivación se selecciona de entre el grupo que consiste en inactivación térmica, inactivación por microondas, inactivación por presión, inactivación ácida, inactivación básica, inactivación por etanol e inactivación por peróxido.

6. El procedimiento según la reivindicación 5, donde la inactivación es una inactivación térmica.

7. El procedimiento según la reivindicación 4, donde el pH es 6.

8. Un procedimiento para obtener un microorganismo con capacidad de absorción de colesterol aumentada que comprende poner en contacto un microorganismo que tiene capacidad de absorción de colesterol con una composición que comprende una actividad de peptidoglicano hidrolasa, donde la composición que comprende una actividad de peptidoglicano hidrolasa es el contenido de proteína de una célula de la cepa CECT 8605 L. reuteri V3401 y donde el microorganismo que tiene capacidad de absorción de colesterol es la cepa CECT 8606 B. breve BT820.

9. El procedimiento según la reivindicación 8, donde dicho peptidoglicano hidrolasa se selecciona de entre el grupo que consiste en una N-acetilmuramil-L-alanina amidasa, una carboxipeptidasa, una endopeptidasa o una glicosidasa.

10. Una cepa probiótica según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 o un alimento o producto nutricional según la reivindicación 3 para su uso como medicamento.

11. Una cepa probiótica según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 o un alimento o producto nutricional según la reivindicación 3 para su uso en el tratamiento y/o prevención de una enfermedad o afección seleccionada de entre el grupo que consiste en dislipidemia, resistencia a la insulina y síndrome metabólico.

12. La cepa probiótica, o el alimento o producto nutricional para su uso según la reivindicación 11, donde la dislipidemia es hipercolesterolemia.