RS60366B1 - Sastavljanje dnk posredovano nukleazom - Google Patents

Description

Opis

U VIDU TEKSTUALNOG DOKUMENTA PUTEM EFS MREŽE

[0001] Zvanična kopija liste sekvenci podneta je elektronski, putem EFS mreže, u vidu ASCII formatirane liste sekvenci sa nazivom dokumenta 461002SEQLIST.TXT, kreiranog 23. juna 2015, veličine 66 KB, i arhivirana je istovremeno sa opisom. Lista sekvenci sadržana u ovom ASCII formatiranom dokumentu predstavlja deo opisa i u njega je uključena u celini kao referenca.

OSNOV PRONALASKA

[0002] Istorijski posmatrano, preklapajući nastavak može se koristiti kao način da se veći dvolančani molekuli DNK, posebno geni, sintetišu iz preklapajućih sintetskih oligonukleotida. Međutim, ovim metodima nije bilo moguće postići brzo i efikasno kombinovanje velikih molekula DNK. Pored toga, za mesto specifično kombinovanje velikih nukleinskih kiselina, uz korišćenje preklapajućih sekvenci, često je ograničena raspoloživošću preklapajućih sekvenci na željenoj poziciji u nukleinskim kiselinama koje treba da se kombinuju. Inženjerisani nukleazni enzimi dizajnirani tako da ciljaju specifične DNK sekvence privukli su pažnju kao moćna sredstva za genetičke manipulacije koje omogućavaju deleciju (uklanjanje), zamenu i popravku ciljnog gena, kao i inserciju (umetanje) egzogenih sekvenci. Međutim, mana postojećih tehnologija je ograničena preciznost koja može dovesti do nepredvidljivih sporednih efekata i reakcija u više koraka, koje zahtevaju dodatni utrošak vremena.

[0003] U US 2010/035768 A1 razmatraju se metodi in vitro spajanja i kombinatornog sastavljanja molekula nukleinskih kiselina.

[0004] Gibson et al. ("Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases", Nature Methods, Nature Publishing Group, GB, vol. 6, br. 5, strane 343-345) opisuju izotermički metod koji se odvija u jednoj reakciji, za sastavljanje većeg broja preklapajućih DNK molekula, usklađenim dejstvom 5’ egzonukleaze, DNK polimeraze i DNK ligaze.

KRATAK OPIS

[0005] U prvom aspektu pronalaska, obezbeđen je in vitro metod sastavljanja najmanje dve dvolančane nukleinske kiseline, koji uključuje: (a) dovođenje u kontakt prve nukleinske kiseline sa najmanje jednim nukleaznim sredstvom da bi se dobila prva digestirana nukleinska kiselina kojoj je uklonjen završni deo; (b) dovođenje u kontakt prve digestirane nukleinske kiseline sa drugom nukleinskom kiselinom, pomoću dvolančanog spojnog oligonukleotida (joiner oligo), i egzonukleazom, pri čemu je spojni oligonukleotid predstavljen linearnom dvolančanom DNK od oko 50 bp do oko 400 bp i uključuje: (i) prvu komplementarnu sekvencu koja je komplementarna sa prvom digestiranom nukleinskom kiselinom; (ii) spejser; i (iii) drugu komplementarnu sekvencu koja je komplementarna sa drugom nukleinskom kiselinom, gde spejser uključuje sekvencu identičnu sa završnim delom, pri čemu između prve komplementarne sekvence i sekvence identične sa završnim delom nema nukleinskokiselinskih baza i između druge komplementarne sekvence i sekvence identične sa završnim delom nema nukleinsko-kiselinskih baza, i pri čemu egzonukleaza izlaže prvu i drugu komplementarnu sekvencu; i (c) sastavljanje spojnog oligonukleotida sa prvom digestiranom nukleinskom kiselinom i drugom nukleinskom kiselinom, pri čemu se sastavljanjem rekonstituiše završni deo. U nekim od tih metoda korak (c) uključuje još i: (i) sparvivanje prve komplementarne sekvence spojnog oligonukleotida sa prvom digestiranom nukleinskom kiselinom i druge komplementarne sekvence spojnog oligonukleotida sa drugom nukleinskom kiselinom; i (ii) vezivanje spojnog oligonukleotida sa prvom digestiranom nukleinskom kiselinom i drugom nukleinskom kiselinom.

[0006] U nekim od metoda, korak (a) uključuje još i (i) dovođenje u kontakt druge nukleinske kiseline sa drugim nukleaznim sredstvom i egzonukleazom, pri čemu drugo nukleazno sredstvo seče drugu nukleinsku kiselinu na drugom ciljnom mestu kako bi se proizvela druga digestirana nukleinska kiselina koja uključuje nukleotidnu sekvencu komplementarna sa drugom komplementarnom sekvencom spojnog oligonukleotida, gde se prva digestirana nukleinska kiselina sastavlja sa drugom digestiranom nukleinskom kiselinom; ili (ii) dovođenje u kontakt druge nukleinske kiseline sa restrikcionim enzimom i egzonukleazom, pri čemu restrikcioni enzim seče drugu nukleinsku kiselinu kako bi se proizvela druga digestirana nukleinska kiselina koja uključuje nukleotidnu sekvencu komplementarnu sa drugom komplementarnom sekvencom u spojnom oligonukleotidu, pri čemu se prva nukleinska kiselina sastavlja sa drugom digestiranom nukleinskom kiselinom.

[0007] U nekim od metoda, najmanje jedno nukleazno sredstvo uključuje Cas protein i vodičku RNK (guide RNA, gRNK) (gRNK-Cas kompleks). Na primer, Cas protein može biti Cas9 protein. Cas9 protein može uključivati RuvC domen i HNH domen, od kojih najmanje jedan nema endonukleaznu aktivnost. U nekim primerima izvođenja, gRNK uključuje nukleinsko-kiselinsku sekvencu koja kodira CRISPR RNK (clustered regularly interspaced short palindromic repeats RNA, kratki palindromski ponovci pravilno raspoređeni u grupama-RNK, crRNK) i transaktivirajuću CRISPR RNK (tracrRNK). U nekim od metoda, nukleazno sredstvo uključuje zinc finger-nukleazu ili efektorsku nukleazu sličnu transkripcionom aktivatoru (transcription activator-like effector nuclease, TALEN).

[0008] U nekim od metoda, prva, druga ili obe nukleinske kiseline su iz bakterijskog veštačkog (arteficijalnog) hromozoma. Bakterijski veštački hromozom može sadržati humanu DNK, glodarsku DNK, sintetsku DNK, ili njihovu kombinaciju. Bakterijski veštački hromozom može sadržati humanu sekvencu.

[0009] Objava obezbeđuje i metod sklapanja najmanje dve nukleinske kiseline, koji uključuje: (a) dovođenje u kontakt prve nukleinske kiseline sa prvim nukleaznim sredstvom kako bi se proizvela prva digestirana nukleinska kiselina, pri čemu prvo nukleazno sredstvo stvara usek na prvom lancu prve nukleinske kiseline, na prvom ciljnom mestu, i drugo nukleazno sredstvo stvara usek na drugom lancu prve nukleinske kiseline, na drugom ciljnom mestu, da bi se proizvela prva digestirana nukleinska kiselina koja sadrži 5’ ili 3’ prepusnu sekvencu na jednom od svojih krajeva; (b) sparivanje prve digestirane nukleinske kiseline i druge nukleinske kiseline koja sadrži sekvencu komplementarnu sa 5’ ili 3’ prepusnom sekvencom; i (c) povezivanje prve digestirane nukleinske kiseline i druge nukleinske kiseline. U nekim od metoda, korak (b) uključuje još i produžavanje 3' kraja prvog lanca uz korišćenje drugog lanca kao templata i produžavanje 3' kraja drugog lanca na osnovu korišćenja prvog lanca kao templata. U nekim od metoda, prvo ciljno mesto je od drugog ciljnog mesta udaljeno najmanje 4 bp.

[0010] U nekim od metoda, najmanje jedno od prvog ili drugog nukleaznog sredstva sadrži Cas9 protein i vodičku RNK (gRNK) (gRNK-Cas kompleks) koji ciljaju prvo ili drugo ciljno mesto. gRNK može uključivati sekvencu nukleinske kiseline koja kodira CRISPR RNK (crRNK) i transaktivirajuću CRISPR RNK (tracrRNK). U nekim od metoda, najmanje jedno od prvog ciljnog mesta i drugog ciljnog mesta bočno je ograničeno sekvencom protospejser susednog motiva (protospacer adjacent motif, PAM). Cas9 protein nože uključivati RuvC domen i HNH domen, od kojih jedan ne poseduje endonukleaznu aktivnost.

[0011] U nekim od metoda, druga nukleinska kiselina ne uključuje sekvencu komplementarnu sa 5’ ili 3’prepusnom sekvencom prve digestirane nukleinske kiseline, i korak (a) uključuje još i dovođenje u kontakt prve digestirane nukleinske kiseline i druge digestirane nukleinske kiseline sa spojnim oligonukleotidom, pri čemu spojni oligonukleotid uključuje: (i) prvu sekvencu komplementarnu sa 5’ ili 3’ prepusnom sekvencom prve digestirane nukleinske kiseline; i (ii) drugu sekvencu komplementarnu sa 5’ ili 3’ prepusnom sekvencom druge digestirane nukleinske kiseline. U nekim metodima, prva, druga, ili obe nukleinske kiseline izvedene su iz bakterijskog veštačkog hromozoma. Bakterijski veštački hromozom može uključivati humanu DNK, glodarsku DNK, sintetsku DNK, ili njihovu kombinaciju. Bakterijski veštački hromozom može sadržati humanu polinukleotidnu sekvencu. U nekim metodima, druga nukleinska kiselina uključuje bakterijski veštački hromozom.

[0012] U skladu sa drugim aspektom, obezbeđen je in vitro metod bešavnog sastavljanja dveju ili više dvolančanih nukleinskih kiselina, koji uključuje: (a) dovođenje u kontakt prve nukleinske kiseline sa prvim nukleaznim sredstvom da bi se dobila prva digestirana nukleinska kiselina kojoj je uklonjen završni deo; (b) dovođenje u kontakt druge nukleinske kiseline sa drugim nukleaznim sredstvom da bi se dobila druga digestirana nukleinska kiselina; (c) dovođenje u kontakt prve digestirane nukleinske kiseline i druge digestirane nukleinske kiseline sa dvolančanim spojnim oligonukleotidom i egzonukleazom, pri čemu je spojni oligonukleotid predstavljen linearnom dvolančanom DNK od oko 50 bp do oko 400 bp i uključuje: (i) prvu komplementarnu sekvencu koja je komplementarna sa prvom digestiranom nukleinskom kiselinom; (ii) spejser; i (iii) drugu komplementarnu sekvencu koja je komplementarna sa drugom nukleinskom kiselinom; pri čemu spejser uključuje sekvencu identičnu sa završnim delom, pri čemu između prve komplementarne sekvence i sekvence identične sa završnim delom nema nukleinsko-kiselinskih baza, i između druge komplementarne sekvence i sekvence identične sa završnim delom nema nukleinskokiselinskih baza i gde egzonukleaza izlaže prvu i drugu komplementarnu sekvencu; i (d) sastavljanje spojnog oligonukleotida sa prvom digestiranom nukleinskom kiselinom i drugom digestiranom nukleinskom kiselinom, pri čemu se sastavljanjem rekonstituiše završni deo. U nekim takvim metodima, sastavljanje u koraku (d) uključuje: (i) sparivanje prve komplementarne sekvence spojnog oligonukleotida sa prvom digestiranom nukleinskom kiselinom i druge komplementarne sekvence spojnog oligonukleotida sa drugom digestiranom nukleinskom kiselinom; i (ii) povezivanje spojnog oligonukleotida sa prvom digestiranom nukleinskom kiselinom i drugom nukleinskom kiselinom.

[0013] U nekim metodima, prva komplementarna sekvenca i druga komplementarna sekvenca spojnog oligonukleotida uključuju između 15 i 120 komplementarnih baza. U nekim metodima, spejser spojnog oligonukleotida uključuje nekomplementarne nukleinske kiseline. U nekim primerima izvođenja, prva digestirana nukleinska kiselina se bešavno sastavlja sa drugom nukleinskom kiselinom.

[0014] U nekim metodima, nukleazno sredstvo je dizajnirano tako da seče fragment od najmanje 20 bp sa kraja prve nukleinske kiseline, na kojem će doći do bešavnog sastavljanja, pri čemu spejser spojnog oligonukleotida uključuje sekvencu identičnu sa pomenutim fragmentom od najmanje 20 bp, pri čemu između prve komplementarne sekvence i fragmenta od najmanje 20 bp nema nukleinsko-kiselinskih baza, i između druge komplementarne sekvence i fragmenta od najmanje 20 bp nema nukleinsko-kiselinskih baza, tako da se sastavljanjem pomenute prve nukleinske kiseline sa pomenutim spojnim oligonukleotidom i pomenutom drugom nukleinskom kiselinom rekonstituiše fragment od najmanje 20 bp i bešavno sastavljaju prva i druga nukleinska kiselina. U nekim metodima, isti metod se izvodi sa fragmentom od najmanje 20 bp iz druge nukleinske kiseline kao spejserskom sekvencom. U nekim metodima, spejser uključuje od oko 20 bp do oko 120 bp. U nekim metodima, druga nukleinska kiselina se dovodi u kontakt sa drugim nukleaznim sredstvom i egzonukleazom, pri čemu drugo nukleazno sredstvo seče drugu nukleinsku kiselinu da bi se proizvela druga digestirana nukleinska kiselina koja uključuje nukleotidnu sekvencu komplementarnu sa drugom komplementarnom sekvencom spojnog oligonukleotida, pri čemu se prva digestirana nukleinska kiselina sastavlja sa drugom digestiranom nukleinskom kiselinom. U nekim metodima, druga nukleinska kiselina se dovodi u kontakt sa restrikcionim enzimom ili meganukleazom i egzonukleazom, pri čemu restrikcioni enzim ili meganukleaza seče drugu nukleinsku kiselinu da bi se proizvela druga digestirana nukleinska kiselina koja uključuje nukleotidnu sekvencu komplementarnu sa drugom komplementarnom sekvencom u spojnom oligonukleotidu, pri čemu se prva digestirana nukleinska kiselina sastavlja sa drugom digestiranom nukleinskom kiselinom. U nekim metodima, 3’ kraj prve i/ili druge digestirane nukleinske kiseline produžava se u koraku (b). Spojni oligonukleotid može da se sastavi sa pomenutom prvom nukleinskom kiselinom i pomenutom drugom nukleinskom kiselinom u istoj reakciji ili sekvencijalno. U nekim metodima, prva, druga ili obe nukleinske kiseline izvedene su iz bakterijskog veštačkog hromozoma, imaju najmanje 10 kb, i/ili sadrže humanu DNK, glodarsku DNK, sintetsku DNK, ili njihovu kombinaciju.

[0015] U nekim od metoda, najmanje jedno nukleazno sredstvo ili drugo nukleazno sredstvo uključuje Cas protein i vodičku RNK (gRNK) (gRNK-Cas kompleks). Na primer, Cas protein može biti Cas9 protein. Cas9 protein može uključivati RuvC domen i HNH domen, od kojih najmanje jedan nema endonukleaznu aktivnost. U nekim primerima izvođenja, gRNK uključuje sekvencu nukleinske kiseline koja kodira CRISPR RNK (crRNK) i transaktivirajuću CRISPR RNK (tracrRNK). U nekim od metoda, najmanje jedno nukleazno sredstvo i/ili drugo nukleazno sredstvo uključuje zinc finger-nukleazu ili efektorsku nukleazu sličnu transkripcionom aktivatoru (TALEN).

[0016] U nekim primerima izvođenja, spojni oligonukleotid uključuje gBlock. U nekim takvim metodima, gBlock ne uključuje selekcionu kasetu.

[0017] Metodi dodatno obezbeđuju sastavljanje dveju ili više nukleinskih kiselina, koje uključuje: (a) dovođenje u kontakt prve nukleinske kiseline sa najmanje jednim nukleaznim sredstvom da bi se dobila prva digestirana nukleinska kiselina; (b) dovođenje u kontakt druge nukleinske kiseline sa drugim nukleaznim sredstvom da bi se dobila druga digestirana nukleinska kiselina; (c) dovođenje u kontakt prve digestirane nukleinske kiseline i druge digestirane nukleinske kiseline sa spojnim oligonukleotidom i egzonukleazom, pri čemu spojni oligonukleotid uključuje: (i) prvu komplementarnu sekvencu koja je komplementarna sa prvom digestiranom nukleinskom kiselinom; (ii) spejser; i (iii) drugu komplementarnu sekvencu koja je komplementarna sa drugom digestiranom nukleinskom kiselinom; pri čemu egzonukleaza izlaže prvu i drugu komplementarnu sekvencu; i (d) sastavljanje spojnog oligonukleotida sa prvom digestiranom nukleinskom kiselinom i drugom nukleinskom kiselinom.

[0018] U ovom tekstu obezbeđeni su metodi sastavljanja nukleinskih kiselina koje imaju preklapajuće sekvence. Takvi metodi uključuju metod sastavljanja najmanje dva nukleinskokiselinska fragmenta, koji uključuje (a) dovođenje u kontakt prve i druge nukleinske kiseline koje sadrže preklapajuće sekvence, sa najmanje jednim gRNK-Cas kompleksom i egzonukleazom, čime se dobijaju dva fragmenta digestirane nukleinske kiseline koji sadrže komplementarne sekvence na jednom od svojih krajeva; (b) sastavljanje dva nukleinskokiselinska fragmenta dobijena u koraku (a). U nekim metodima, najmanje jedan gRNK-Cas kompleks seče prvu nukleinsku kiselinu na prvom ciljnom mestu da bi se proizvela prva digestirana nukleinska kiselina koja uključuje završne sekvence komplementarnosti između prve digestirane nukleinske kiseline i druge nukleinske kiseline. U određenim metodima, korak (b) uključuje još i: (i) sparivanje izloženih komplementarnih sekvenci; (ii) produžavanje 3’ krajeva sparenih komplementarnih sekvenci; i (iii) povezivanja prve i druge nukleinske kiseline. U nekim metodima, korak (a) uključuje još i dovođenje u kontakt druge nukleinske kiseline sa drugim gRNK-Cas kompleksom, pri čemu druga nukleinska kiselina ne sadrži preklapajuću završnu sekvencu, i drugi gRNK-Cas kompleks seče drugu nukleinsku kiselinu da bi se proizvela druga digestirana nukleinska kiselina koja uključuje sekvence preklapajućeg kraja između prve digestirane nukleinske kiseline i druge digestirane nukleinske kiseline. Na primer, gRNK-Cas kompleks uključuje Cas9 protein. Cas9 protein može uključivati RuvC domen i HNH domen, od kojih najmanje jedan nema endonukleaznu aktivnost. U nekim metodima, dužina preklapajuće sekvence u opsegu je od 20 bp do 200 bp. Metod iz bilo kojeg od patentnih zahteva 1-7, pri čemu su prva, druga, ili obe nukleinske kiseline iz bakterijskog veštačkog hromozoma. U nekim metodima, bakterijski veštački hromozom uključuje humanu DNK, glodarsku DNK, sintetsku DNK, ili njihovu kombinaciju. Bakterijski veštački hromozom može uključivati humanu sekvencu.

[0019] Dati metodi uključuju i metod sastavljanja dva ili više fragmenata nukleinske kiseline, koji uključuje: (a) izlaganje prve i druge nukleinske kiseline najmanje jednom gRNK-Cas kompleksu da bi se dobile prva i druga digestirana nukleinska kiselina koje sadrže 5’ ili 3’ prepusnu sekvencu na jednom od svojih krajeva; (b) sastavljanje dva nukleinsko-kiselinska fragmenta dobijena u koraku (a). U nekim metodima, korak sastavljanja (b) uključuje: (i) sparivanje 5’ i 3’ prepusnih sekvenci; i (ii) povezivanje prve digestirane nukleinske kiseline i druge digestirane nukleinske kiseline. U nekim metodima, 5’ i/ili 3’ prepusne sekvence sadrže najmanje 4 komplementarne baze. U nekim metodima, korak (b) uključuje još i produžavanje 3’ kraja prve i druge digestirane nukleinske kiseline. U nekim metodima, druga nukleinska kiselina ne sadrži sekvencu komplementarnu sa 5’ ili 3’ prepusnom sekvencom prve digestirane nukleinske kiseline, i korak (a) uključuje još i dovođenje u kontakt prve digestirane nukleinske kiseline i druge digestirane nukleinske kiseline sa spojnim oligonukleotidom, pri čemu spojni oligonukleotid uključuje: (i) prvu sekvencu komplementarnu sa 5’ ili 3’ prepusnom sekvencom prve digestirane nukleinske kiseline; i (ii) drugu sekvencu komplementarnu sa 5’ ili 3’ prepusnom sekvencom druge digestirane nukleinske kiseline. U nekim metodima, kompleks gRNK-Cas protein sadrži Cas9 protein koji uključuje RuvC domen i HNH domen, od kojih jedan nema endonukleaznu aktivnost. U nekim metodima gRNK-Cas kompleks obezbeđen je zasebno, kao crRNK, tracrRNK, i Cas protein. U nekim metodima, prva i druga nukleinska kiselina uključuju sekvencu protospejser susednog motiva (PAM). U nekim metodima, prva, druga, ili obe nukleinske kiseline izvedene su iz bakterijskog veštačkog hromozoma. U nekim metodima, bakterijski veštački hromozom uključuje humanu DNK, glodarsku DNK, sintetsku DNK, ili njihovu kombinaciju. Na primer, bakterijski veštački hromozom može uključivati humanu polinukleotidnu sekvencu.

[0020] Metodi obezbeđuju još i sastavljanje dveju ili više nukleinskih kiselina, koje uključuje: (a) dovođenje u kontakt prve nukleinske kiseline sa najmanje jednim gRNK-Cas kompleksom da se dobije prva digestirana nukleinska kiselina; i (b) dovođenje u kontakt prve digestirane nukleinske kiseline sa drugom nukleinskom kiselinom, spojnim oligonukleotidom, i egzonukleazom, pri čemu spojni oligonukleotid uključuje: (i) prvu komplementarnu sekvencu koja je komplementarna sa prvom digestiranom nukleinskom kiselinom; (ii) spejser; i (iii) drugu komplementarnu sekvencu koja je komplementarna sa drugom nukleinskom kiselinom; pri čemu egzonukleaza izlaže prvu i drugu komplementarnu sekvencu; i (c) sastavljanje spojnog oligonukleotida sa sa prvom digestiranom nukleinskom kiselinom i drugom nukleinskom kiselinom. U nekim metodima korak sastavljanja (c) uključuje (i) sparivanje prve komplementarne sekvence spojnog oligonukleotida sa prvom digestiranom nukleinskom kiselinom i druge komplementarne sekvence spojnog oligonukleotida sa drugom nukleinskom kiselinom; i (ii) povezivanje spojnog oligonukleotida sa prvom digestiranom nukleinskom kiselinom i drugom nukleinskom kiselinom. U nekim metodima prva komplementarna sekvenca i druga komplementarna sekvenca spojnog oligonukleotida uključuju između 15 i 120 komplementarnih baza. U nekim metodima, spejser spojnog oligonukleotida uključuje nekomplementarne nukleinske kiseline.

[0021] Korišćenjem spojnog oligonukleotida, prva digestirana nukleinska kiselina može da se bešavno sastavi sa drugom nukleinskom kiselinom. U nekim metodima, gRNK-Cas kompleks je dizajniran tako da seče fragment od najmanje 20 bp sa kraja prve nukleinske kiseline na kojem će doći do bešavnog sastavljanja, gde spejser spojnog oligonukleotida uključuje sekvencu identičnu sa pomenutim fragmentom od najmanje 20 bp, pri čemu između prve komplementarne sekvence i fragmenta od najmanje 20 bp nema nukleinsko-kiselinskih baza, i između druge komplementarne sekvence i fragmenta od najmanje 20 bp nema nukleinskokiselinskih baza, tako da se sastavljanjem pomenute prve nukleinske kiseline sa pomenutim spojnim oligonukleotidom i pomenutom drugom nukleinskom kiselinom rekonstituiše fragment od najmanje 20 bp i bešavno sastavljaju prva i druga nukleinska kiselina. U nekim metodima, isti metod se izvodi sa fragmentom od najmanje 20 bp iz druge nukleinske kiseline kao spejserskom sekvencom. U nekim metodima, spejser uključuje od oko 20 bp do oko 120 bp. U nekim metodima, druga nukleinska kiselina se dovodi u kontakt sa drugim gRNK-Cas kompleksom i egzonukleazom, pri čemu drugi gRNK-Cas kompleks seče drugu nukleinsku kiselinu da se dobije druga digestirana nukleinska kiselina koja uključuje nukleotidnu sekvencu komplementarnu sa drugom komplementarnom sekvencom spojnog oligonukleotida, pri čemu je prva digestirana nukleinska kiselina sastavljena sa drugom digestiranom nukleinskom kiselinom. U nekim metodima, druga nukleinska kiselina se dovodi u kontakt sa restrikcionim enzimom ili meganukleazom i egzonukleazom, pri čemu restrikcioni enzim ili meganukleaza seče drugu nukleinsku kiselinu da bi se dobila druga digestirana nukleinska kiselina koja uključuje nukleotidnu sekvencu komplementarnu sa drugom komplementarnom sekvencom u spojnom oligonukleotidu, pri čemu je prva digestirana nukleinska kiselina sastavljena sa drugom digestiranom nukleinskom kiselinom. U nekim metodima, 3’ kraj prve i/ili druge digestirane nukleinske kiseline produžava se u koraku (b). Spojni oligonukleotid može da se sastavi sa pomenutom prvom nukleinskom kiselinom i pomenutom drugom nukleinskom kiselinom u istoj reakciji ili sekvencijalno. U nekim metodima, gRNK-Cas kompleks uključuje Cas9 protein. U nekim metodima, prva, druga, ili obe nukleinske kiseline izvedene su iz bakterijskog veštačkog hromozoma, imaju najmanje 10 kb, i/ili uključuju humanu DNK, glodarsku DNK, sintetsku DNK, ili njihovu kombinaciju.

KRATAK OPIS CRTEŽA

[0022]

SL. 1 prikazuje sastavljanje BAC sa PCR proizvodom koji ima preklope dizajnirane tako da budu specifični za BAC. Preklopi od 50 bp dodati su u HYG kasetu pomoću PCR.

SL. 2 prikazuje sastavljanje dva BAC koji imaju preklapajuće sekvence korišćenjem dva Cas9 ciljna mesta na svakom BAC. Za proces sastavljanja u kojem se koristi metod objavljen u ovom tekstu potrebna su 2 dana.

SL. 3 prikazuje sastavljanje dva BAC sa preklapajućim sekvencama korišćenjem tradicionalnih metoda. Za proces sastavljanja u kojem se koriste tradicionalni metodi potrebne su 4 nedelje.

SL. 4 prikazuje klonirajuće efikasnosti metoda Cas9/izotermičkog sastavljanja i vreme potrebno za korake kloniranja BAC.

SL. 5 prikazuje konstruisanje velikog ciljajućeg vektora (large targeting vector, LTVEC) uz korišćenje CRISPR/Cas9 sistema i izotermičkog sastavljanja. DNK fragmenti isečeni pomoću CRISPR/Cas9 bili su bešavno sastavljeni korišćenjem jednog ili više spojnih oligonukleotida i izotermičkog sastavljanja.

SL. 6 prikazuje strategiju za korišćenje linkera (spojnih oligonukleotida) za bešavno sastavljanje nukleinskih kiselina posle sečenja korišćenjem Cas9. gRNK/Cas9 kompleks dizajniran je tako da seče ciljno mesto locirano 5’ ushodno od oblasti od interesa (strelica) da se dobije prvi Cas9-digestirani DNK fragment (5’ DNK). Uklonjeni deo 5’ DNK (koso šrafirani pravougaonik) zatim se koristi kao spejser između 5’ i 3’ preklapajućih sekvenci u spojnom oligonukleotidu. Tri komponente se

1

sastavljaju u reakciji izotermičkog sastavljanja: (a) prvi Cas9-digestirani DNK fragment (5’ DNK); (b) spojni oligonukleotid; i (c) drugi DNK fragment (3’ DNK). Spojni oligonukleotid uključuje, od 5’ do 3’: (1) sekvencu preklapajuću sa 5’ DNK, (2) spejser koji sadrži uklonjeni deo prvog digestiranog fragmenta, i (3) sekvencu preklapajuću sa 3’ DNK. Uklonjeni deo 5’DNK rekonstituiše se tokom koraka sastavljanja.

SL. 7 prikazuje konstruisanje DNK vektora uz korišćenje CRISPR/Cas9 sistema i izotermičkog sastavljanja.

SL. 8 prikazuje konstruisanje velikog ciljajućeg vektora uz korišćenje CRISPR/Cas9 sistema i izotermičkog sastavljanja.

SL. 9 prikazuje konstruisanje ciljajućeg vekotra za zamenu dela BAC vektora kasetom uz korišćenje izotermičkog sastavljanja i dva linkera (spojni oligonukleotidi). Rezultati različitih odnosa mBAC prema fragmentima ili linkerima prikazani su na tablama #1, #2, #3, i #4.

SL. 10 prikazuje sekvencionu potvrdu bešavnog sastavljanja na oba spoja, u reakciji sastavljanja mBAC (BAC ID: RP23-399M19) i kasete, uz korišćenje dva linkera. SL. 11 prikazuje sastavljanje dva mBAC uz korišćenje Cas9 i izotermičkog sastavljanja. Sastavljanje bMQ50f19 vektora i kasete koja uključuje gen za rezistenciju na higromicin i ubikvitinski promotor, bilo je bešavno.

SL. 12 prikazuje sekvencionu potvrdu bešavnog sastavljanja na linkeru 1, i sekvencionu potvrdu sastavljanja koje namerno nije bilo bešavno na linkeru 2 i linkeru 3.

SL. 13 prikazuje insertovanje velikih humanih genskih fragmenata u mBAC uz korišćenje četiri linkera i izotermičkog sastavljanja. Cas9 seče hGenski fragment A iz hBAC1, hGenski fragment B iz hBAC2, i mBAC da bi se uklonili mGenski fragmenti. SL. 14 prikazuje insertovanje humane sekvence u BAC vektor uz korišćenje Cas9 i izotermičkog sastavljanja.

SL. 15 prikazuje insertovanje gBlock koji uključuje meganukleazno mesto uz korišćenje Cas9 i izotermičkog sastavljanja. SL. 15A prikazuje insertovanje gBlock koji sadrži PI-SceI mesto; i SL. 15B prikazuje insertovanje gBlock koji sadrži MauBI mesto.

SL. 16 ilustruje primer direktne humanizacije ciljajućeg vektora uz korišćenje tri spojna oligonukleotida, Cas9, i izotermičkog sastavljanja.

SL. 17 ilustruje primer indirektne humanizacije ciljajućeg vektora uz korišćenje donora sa ushodnim i nishodnim spojnim oligonukleotidima, Cas9, i izotermičkog sastavljanja.

SL. 18 ilustruje primer uvođenja tačkaste mutacije uz korišćenje Cas9 i izotermičkog sastavljanja.

SL. 19 ilustruje primer BAC skraćivanja pomoću Cas9 i izotermičkog sastavljanja. U ovom primeru, skraćivanjem se uklanja Ori sekvenca. Ori sekvenca se ponovo insertuje u vektor uz korišćenje dva spojna oligonukleotida i izotermičkog sastavljanja.

DETALJAN OPIS

I. Definicije

[0023] Izrazi "protein", "polipeptid", i "peptid", upotrebljeni naizmenično u ovom tekstu, obuhvataju polimerne oblike amino-kiselina bilo koje dužine, uključujući kodirane i nekodirane amino-kiseline i hemijski ili biohemijski modifikovane ili derivatizovane aminokiseline. Izrazi uključuju i modifikovane polimere kao što su polipeptidi sa modifikovanim peptidnim osovinama.

[0024] Izrazi "nukleinska kiselina " i "polinukleotid", upotrebljeni naizmenično u ovom tekstu, obuhvataju polimerne oblike nukleotida bilo koje dužine, uključujući ribonukleotide, deoksiribonukleotide, ili analoge ili modifikovane verzije istih. Oni uključuju jednolančanu, dvolančanu i višelančanu DNK ili RNK, genomsku DNK, cDNK, DNK-RNK hibride, i polimere koji sadrže purinske baze, pirimidinske baze, ili druge prirodne, hemijski modifikovane, biohemijski modifikovane, neprirodne, ili derivatizovane nukleotidne baze.

[0025] "Kodon-optimizacija" uopšteno uključuje proces modifikovanja sekvence nukleinske kiseline u smislu poboljšanja ekspresije u određenim ćelijama-domaćinima, zamenom najmanje jednog kodona nativne sekvence kodonom koji se češće ili najčešće koristi u genima ćelije-domaćina, uz zadržavanje nativne aminokiselinske sekvence. Na primer, nukleinska kiselina koja kodira Cas protein može biti modifikovana tako da se zamenski kodoni češće koriste u datoj prokariotskoj ili eukariotskoj ćeliji, uključujući bakterijsku ćeliju, ćeliju kvasca, humanu ćeliju, nehumanu ćeliju, sisarsku ćeliju, ćeliju glodara, ćeliju miša, ćeliju pacova, ćeliju hrčka, ili bilo koju drugu ćeliju-domaćina, u poređenju sa prirodnom sekvencom nukleinske kiseline. Tabele za upotrebu kodona dostupne su, na primer, u "Codon Usage Database". Ove tabele mogu se prilagoditi na više načina. Vidi Nakamura et al. (2000) Nucleic Acids Research 28:292. Na raspolaganju su i kompjuterski algoritmi za optimizaciju kodona određene sekvence, za ekspresiju u određenom domaćinu (vidi npr., Gene Forge).

[0026] Izraz "operabilna veza" ili biti "operabilno povezan" uključuje jukstapoziciju dveju ili više komponenti (npr., promotora i drugog elementa sekvence) tako da obe komponente funkcionišu normalno i dopuštaju mogućnost da najmanje jedna od komponenti može da posreduje u funkciji koja se ispoljava nad najmanje jednom od ostalih komponenti. Na primer, promotor može biti operabilno povezan sa kodirajućom sekvencom ako promotor kontroliše nivo transkripcije kodirajuće sekvence u odgovoru na prisustvo ili odsustvo jednog ili više transkripcionih regulatornih faktora.

[0027] "Komplementarnost" nukleinskih kiselina znači da nukleotidna sekvenca u jednom lancu nukleinske kiseline, zbog orijentacije svojih nukleobaznih grupa, formira vodonične veze sa drugom sekvencom naspramnog lanca nukleinske kiseline. Komplementarne baze u DNK su tipično A sa T i C sa G. U RNK, to su tipično C sa G i U sa A. Komplementarnost može biti savršena ili suštinska/zadovoljavajuća. Savršena komplementarnost između dveju nukleinskih kiselina znači da dve nukleinske kiseline mogu formirati dvostruki lanac u kojem je svaka baza u dvostrukom lancu vezana sa komplementarnom bazom Watson-Crickovim sparivanjem. "Suštinska" ili "zadovoljavajuća" komplementarnost znači da sekvenca u jednom lancu nije potpuno i/ili savršeno komplementarna sa sekvencom u naspramnom lancu, ali da se zapaža zadovoljavajuće sparivanje između baza dva lanca da bi se formirao stabilan hibridni kompleks u datim uslovima hibridizacije (npr., koncentracija soli i temperatura). Takvi uslovi mogu da se predvide korišćenjem sekvenci i standardnih matematičkih izračunavanja za predviđanje Tm hibridizovanih lanaca, ili empirijskim određivanjem Tm korišćenjem rutinskih metoda. Tm podrazumeva temperaturu na kojoj denaturisanost populacije hibridizacionih kompleksa formiranih između dva lanca nukleinskih kiselina iznosi 50%. Na temperaturi ispod Tm, formiranje hibridizacionog kompleksa je favorizovano, dok je na temperaturi iznad Tm, favorizovano topljenje ili razdvajanje lanaca u hibridizacionom kompleksu. Tm je moguće proceniti za nukleinsku kiselinu sa poznatim sadržajem G+C u vodenom rastvoru 1 M NaCl, korišćenjem, npr., Tm=81.5+0.41(% G+C), mada druga poznata izračunavanja Tm uzimaju u obzir strukturne karakteristike nukleinske kiseline.

[0028] "Uslov hibridizacije" uključuje kumulativno okruženje u kojem se jedan lanac nukleinske kiseline vezuje sa drugim lancem nukleinske kiseline interakcijama između komplementranih lanaca i vodoničnim vezama, da bi se proizveo hibridizacioni kompleks. Takvi uslovi uključuju hemijske komponente i njihove koncentracije (npr., soli, helirajuća sredstva, formamid) vodenog ili organskog rastvora koji sadrži nukleinske kiseline, i

1

temperaturu mešavine. Drugi faktori, kao što je dužina vremena inkubacije ili dimenzije reakcione komore mogu doprineti okruženju. Vidi, npr., Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. sup.nd ed., pp. 1.90-1.91, 9.47-9.51, 1 1.47-11.57 (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989).

[0029] Hibridizacija zahteva da dve nukleinske kiseline sadrže komplementarne sekvence, mada je moguće i pogrešno sparivanje baza. Uslovi pogodni za hibridizaciju dveju nukleinskih kiselina zavise od dužine nukleinskih kiselina i stepena komplementarnosti, što su varijable dobro poznate u struci. Što je veći stepen komplementarnosti dveju nukleotidnih sekvenci, veća je vrednost temperature topljenja (melting temperature, Tm) hibrida nukleinskih kiselina koji imaju te sekvence. Za hibridizacije nukleinskih kiselina sa kratkim nizovima komplementarnosti (npr. komplementarnost duž 35 ili manje, 30 ili manje, 25 ili manje, 22 ili manje, 20 ili manje, ili 18 ili manje nukleotida), pozicija pogrešnih sparivanja postaje važna (vidi Sambrook et al., gore, 11.7-11.8). Tipično, dužina nukleinske kiseline koja se može hibridizovati iznosi najmanje oko 10 nukleotida. Ilustrativne minimalne dužine nukleinske kiseline koja se može hibridizovati uključuju najmanje oko 15 nukleotida, najmanje oko 20 nukleotida, najmanje oko 22 nukleotida, najmanje oko 25 nukleotida, i najmanje oko 30 nukleotida. Pored toga, temperatura i koncentracija soli rastvora za ispiranje može se podesiti po potrebi u skladu sa faktorima kao što su dužina regiona komplementarnosti i stepen komplementarnosti.

[0030] Sekvenca polinukleotida ne mora biti 100% komplementarna sa sekvencom svoje ciljne nukleinske kiseline da bi moglo doći do specifične hibridizacije. Pored toga, polinukleotid može da se hibridizuje preko jednog ili više segmenata tako da umetnuti ili susedni segmenti nisu uključeni u hibridizacioni događaj (npr., struktura petlje ili struktura ukosnice). Polinukleotid (npr., gRNK) može sadržati najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 99%, ili 100% sekvencione kompelmentarnosti sa ciljnim regionom u okviru sekvence ciljne nukleinske kiseline ka kojoj su usmereni. Na primer, gRNK u kojoj je 18 od 20 nukleotida komplementarno sa ciljnim regionom, i koja bi se prema tome specifično hibridizovala, pokazivala bi komplementarnost od 90%. U ovom primeru, preostali nekomplementarni nukleotidi mogu biti u grupi ili raspoređeni naizmenično sa komplementarnim nukleotidima i ne moraju biti kontinuirani jedan sa drugim ili sa komplementarnim nukleotidima.

[0031] Procenat komplementarnosti između određenih nizova sekvenci unutar nukleinskih kiselina može se odrediti rutinski korišćenjem BLAST programa (basic local alignment search tools, istraživački alati za osnovno lokalno poravnavanje) i PowerBLAST programa poznatih u struci (Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410; Zhang and Madden (1997) Genome Res. 7:649-656) ili korišćenjem Gap programa (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 za Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wis.), uz upotrebu zadatih parametara, koji koristi algoritam Smitha i Watermana (Adv. Appl. Math., 1981, 2, 482-489).

[0032] U metodima i kompozicijama datim u ovom tekstu koristi se veliki broj različitih komponenti. Iz opisa se vidi da neke komponente mogu imati aktivne varijante i fragmente. Takve komponente uključuju, na primer, Cas proteine, CRISPR RNK, tracrRNK, i vodičke RNK. Biološka aktivnost svake od ovih komponenti opisana je na drugim mestima u ovom tekstu.

[0033] "Identičnost sekvence" ili "identičnost" u kontekstu dveju polinukleotidnih ili polipeptidnih sekvenci, odnosi se na rezidue u dvema sekvencama koje su iste kada se poravnaju za maksimalno podudaranje duž određenog prozora poređenja. Kada se procenat sekvencione identičnosti koristi u vezi sa proteinima, prepoznaje se da se pozicije rezidua koje nisu identične često razlikuju po konzervativnim aminokiselinskim supstitucijama, pri čemu su aminokiselinske rezidue supstituisane drugim aminokiselinskim reziduama sa sličnim hemijskim osobinama (npr., naelektrisanje ili hidrofobnost) i, prema tome, ne menjaju funkcionalne osobine molekula. Kada se sekvence razlikuju po konzervativnim supstitucijama, procenat identičnosti sekvence može da se podesi naviše kako bi se korigovala konzervativna priroda supstitucije. Za sekvence koje se razlikuju po takvim konzervativnim supstitucijama kaže se da imaju "sekvencionu sličnost" ili "sličnost". Načini dobijanja ovakvog podešavanja dobro su poznati stručnjacima u oblasti. Tipično, ovo uključuje ocenjivanje konzervativne supstitucije kao delimičnog, a ne potpunog nepodudaranja, čime se povećava procenat sekvencione identičnosti. Tako na primer, kada je identičnoj aminokiselini data ocena 1, a nekonzervativnoj supstituciji je data ocena nula, konzervativnoj supstituciji se daje ocena između nula i 1. Ocenjivanje konzervativnih supstitucija izračunava se, npr., kako je primenjeno u programu PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, California).

[0034] "Procenat sekvencione identičnosti" uključuje vrednost određenu upoređivanjem dveju optimalno poravnatih sekvenci duž prozora poređenja, pri čemu deo polinukleotidne sekvence u prozoru poređenja može sadržati adicije ili delecije (tj., procepe) u poređenju sa referentnom sekvencom (koja ne sadrži adicije ili delecije), za optimalno poravnavanje dveju sekvenci. Procenat se izračunava određivanjem broja pozicija na kojima se nalaze identične nukleinskokiselinske baze ili aminokiselinske rezidue u obe sekvence, da se dobije broj podudarnih

1

pozicija, deljenjem broja poklopljenih pozicija ukupnim brojem pozicija u prozoru poređenja, i množenjem rezultata sa 100, da bi se dobio procenat sekvencione identičnosti.

[0035] Ukoliko nije drugačije navedeno, vrednosti sekvencione identičnosti/sličnosti uključuju vrednost dobijenu upotrebom GAP Version 10, uz korišćenje sledećih parametara: % identičnosti i % sličnosti za nukleotidnu sekvencu, uz korišćenje težine procepa od 50 i težine za dužinu od 3, i nwsgapdna.cmp matriksa za ocenjivanje; % identičnosti i % sličnosti za aminokiselinsku sekvencu uz korišćenje težine procepa od 8, težine za dužinu od 2, i BLOSUM62 matriksa za ocenjivanje; ili bilo kojeg njemu ekvivalentnog programa. "Ekvivalentni program" uključuje svaki program upoređivanja sekvenci koji, za bilo koje dve sekvence koje su u pitanju, generiše poravnavanje koje ima identična poklapanja nukleotida ili amnikoiselinskih rezidua i identičan procenat sekvencione identičnosti kada se vrši upoređivanje sa odgovarajućim poravnavanjem dobijenim pomoću GAP Version 10.

[0036] Kompozicije ili metodi koji "sadrže" ili "uključuju" jedan ili više navedenih elemenata mogu uljučivati i druge elemente koji nisu specifično navedeni. Na primer, kompozicija koja "sadrži" ili "uključuje" protein, može sadržati protein sam ili u kombinaciji sa drugim sastojcima.

[0037] Označavanje opsega vrednosti podrazumeva sve cele brojeve unutar opsega ili koji definišu opseg, i sve podopsege definisane celim brojevima unutar opsega.

[0038] Ukoliko kontekst ne kazuje drugačije, izraz "oko" obuhvata vrednosti unutar standardne granice greške merenja (npr., SEM) navedene vrednosti.

[0039] Izrazi koji se koriste u jednini uključuju i te izraze u množini, osim ako kontekst jasno ne kazuje drugačije. Na primer, izraz "Cas protein" ili "najmanje jedan Cas protein" može uključivati množinu Cas proteina, uključujući njihove mešavine.

II. Opšte

[0040] Tradicionalni metodi sastavljanja nukleinskih kiselina koriste dugotrajne korake konvencionalne enzimske digestije restrikcionim enzimima, kloniranje nukleinskih kiselina, i povezivanje nukleinskih kiselina (vidi, SL. 3 i SL. 4 za ilustraciju tradicionalnih metoda i njihovog vremenskog toka). Ovi metodi postaju teži kada se vrši međusobno sastavljanje velikih fragmenata ili vektora. U metodima datim u ovom tekstu koristi se prilagodljiva ciljna specifičnost nukleaza (npr., vodičke RNK i Cas9 nukleaze) za konvertovanje nukleinskih kiselina u oblik pogodan za upotrebu u brzim reakcijama sastavljanja.

[0041] U ovom tekstu dati su metodi sastavljanja najmanje dve nukleinske kiseline korišćenjem nukleaznih sredstava usmerenih ka specifičnim ciljnim mestima, na primer

1

vodičkom RNK (gRNK) (npr., Cas protein usmeren ka specifičnim ciljnim mestima vodičkom RNK (gRNK)). Specifično usmerena nukleazna sredstva, na primer, Cas-proteini usmereni vodičkom RNK, dopuštaju brzo i efikasno kombinovanje nukleinskih kiselina odabirom i obradom završnih sekvenci nastalih njihovom endonukleaznom aktivnošću. U metodima datim u ovom tekstu kombinuju se prvi polinukleotid sa nukleaznim sredstvom (npr., gRNK-Cas kompleks) specifičnim za željeno ciljno mesto i egzonukleaza. Ciljno mesto može da se odabere tako da kada nukleaza seče nukleinsku kiselinu, krajevi nastali kao rezultat sečenja imaju regione komplementarne sa krajevima druge nukleinske kiseline (npr., preklapajući krajevi). Ovi komplementarni krajevi tada mogu da se sastave da bi se dobila jedna sastavljena nukleinska kiselina. Pošto je nukleazno sredstvo (npr., gRNK-Cas kompleks) specifično za pojedinačno ciljno mesto, predmetni metod dopušta modifikaciju nukleinskih kiselina na precizan, za mesto specifičan način. U predmetnom metodu koristi se i specifičnost nukleaznog sredstva, na primer, gRNK-Cas kompleksa, korišćenjem brzih i efikasnih metoda sastavljanja posebno dizajniranih za kombinovanje preklapajućih nukleinsko-kiselinskih krajeva nastalih sečenjem nukleazom ili dizajniranih i sintetisanih za reakciju sastavljanja. Na primer, biranjem nukleaznog sredstva (npr., gRNK-Cas kompleks) specifičnog za ciljno mesto tako da se, posle sečenja, proizvedu završne sekvence komplementarne sa onima iz druge nukleinske kiseline, izotermičko sastavljanje može da se upotrebi za sastavljanje dobijene digestirane nukleinske kiseline. Prema tome, biranjem nukleinskih kiselina i nukleaznih sredstava (npr., gRNK-Cas kompleksi) koja rezultuju preklapajućim završnim sekvencama, nukleinske kiseline mogu da se sastave brzim kombinatornim metodima kako bi se na brz i efikasan način proizvela finalno sastavljena nukleinska kiselina. Alternativno, nukleinske kiseline koje nemaju komplementarne krajeve mogu da se sastave spojnim oligonukleotidima dizajniranim tako da imaju komplementarne krajeve sa svakom nukleinskom kiselinom. Korišćenjem spojnih oligonukleotida, dve ili više nukleinskih kiselina može se bešavno sastaviti, čime se smanjuju nepotrebne sekvence u rezultujućoj sastavljenoj nukleinskoj kiselini.

III. Nukleazno sredstvo

[0042] U predmetnim metodima koristi se nukleazno sredstvo za specifično usmereno sečenje polinukleotida. Specifično, endonukleazno sečenje polinukleotida na identifikovanom ciljnom mestu proizvodi digestirani polinukleotid sa krajevima koji onda mogu da se spoje sa drugim polinukleotidom kako bi se dva ili više polinukleotida sastavila na način specifičan za mesto.

1

[0043] "Nukleazno sredstvo" uključuje molekule koji poseduju aktivnost sečenja DNK. Posebni primeri nukleaznih sredstava za upotrebu u metodima objavljenim u ovom tekstu uključuju RNK-vođeni CRISPR-Cas9 sistem, zinc finger-proteine, meganukleaze, TAL domene, TALEN, sastavljanje bazirano na kvascu, rekombinaze, leucinske patent-zatvarače, CRISPR/Cas, endonukleaze, i druga nukleazna sredstva poznata stručnjacima u oblasti. Nukleazna sredstva mogu da se odaberu ili dizajniraju u odnosu na specifičnost sečenja na datom ciljnom mestu. Na primer, nukleazna sredstva mogu da se odaberu u odnosu na sečenje na ciljnom mestu koje stvara preklapajuće krajeve između sečenog polinukleotida i drugog polinukleotida. Nukleazna sredstva koja imaju i proteinski i RNK element kao u CRISPR-Cas9 mogu se dopuniti sredstvima koja su već kompleksovana kao nukleazno sredstvo, ili se mogu dopuniti proteinskim i RNK elementom zasebno, u tom slučaju oni se kompleksuju da bi se formiralo nukleazno sredstvo u reakcionim mešavinama opisanim u ovom tekstu.

[0044] Izraz "mesto prepoznavanja za nukleazno sredstvo" uključuje DNK sekvencu u kojoj je usek ili dvolančani prekid uveden nukleaznim sredstvom. Mesto prepoznavanja za nukleazno sredstvo može biti endogeno (ili nativno) za ćeliju ili mesto prepoznavanja može biti egzogeno za ćeliju. U specifičnim primerima izvođenja, mesto prepoznavanja je egzogeno za ćeliju i, prema tome, ne sreće se prirodno u genomu ćelije. U drugim primerima izvođenja, mesto prepoznavanja je egzogeno za ćeliju i za polinukleotide od interesa koji se žele pozicionirati na ciljnom mestu. U drugim primerima izvođenja, egzogeno ili endogeno mesto prepoznavanja prisutno je samo jednom u genomu ćelije-domaćina. U specifičnim primerima izvođenja, identifikovano je endogeno ili nativno mesto koje se sreće samo jednom u genomu. Takvo mesto se može upotrebiti za dizajniranje nukleaznih sredstava koja će proizvesti usek ili dvolančani prekid na endogenom mestu prepoznavanja.

[0045] Dužina mesta prepoznavanja može varirati, i uključuje, na primer, mesta prepoznavanja koja su duga oko 30-36 bp za zinc finger-nukleazni (ZFN) par (tj., oko 15-18 bp za svaku ZFN), oko 36 bp za efektorsku nukleazu sličnu transkripcionom aktivatoru (TALEN), ili oko 20 bp za CRISPR/Cas9 vodičku RNK.

[0046] Isto tako, dati su i primeri aktivnih varijanti i fragmenata mesta prepoznavanja. Takve aktivne varijante mogu uključivati najmanje 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više sekvencione identičnosti sa datim mestom prepoznavanja, pri čemu aktivne varijante zadržavaju biološku aktivnost i, dakle, mogu da budu prepoznate i isečene nukleaznim sredstvom na sekvenciono specifičan način. Testovi za merenje dvolančanih prekida mesta prepoznavanja nukleaznim sredstvom poznati su u struci

1

(npr., TaqMan® qPCR test, Frendewey D. et al., Methods in Enzymology, 2010, 476:295-307).

[0047] U specifičnim primerima izvođenja, mesto prepoznavanja nalazi se unutar polinukleotida koji kodira selekcioni marker. Taj položaj može da se nalazi unutar kodirajućeg regiona selekcionog markera ili unutar regulatornih regiona, što utiče na ekspresiju selekcionog markera. Prema tome, mesto prepoznavanja za nukleazno sredstvo može se nalaziti u intronu selekcionog markera, promotoru, enhenseru, regulatornom regionu, ili bilo kojem regionu koji nije protein-kodirajući region polinukleotida koji kodira selekcioni marker. U specifičnim primerima izvođenja, usek ili dvolančani prekid na mestu prepoznavanja ometa aktivnost selekcionog markera. Metodi testiranja prisustva ili odsustva funkcionalnog selekcionog markera su poznati.

[0048] Svako nukleazno sredstvo koje indukuje usek ili dvolančani prekid u željenom mestu prepoznavanja može se koristiti u metodima i kompozicijama objavljenim u ovom tekstu. Prirodno ili nativno nukleazno sredstvo može da se koristi dokle god nukleazno sredstvo indukuje usek ili dvolančani prekid u željenom mestu prepoznavanja. Alternativno, može se koristiti modifikovano ili inženjerisano nukleazno sredstvo. "Inženjerisano nukleazno sredstvo" uključuje nukleazu koja je inženjerisana (modifikovana ili derivatizovana) na osnovu svog nativnog oblika da specifično prepozna i indukuje usek ili dvolančani prekid u željenom mestu prepoznavanja. Prema tome, inženjerisano nukleazno sredstvo može biti derivatizovano iz nativnog, prirodnog nukleaznog sredstva ili može biti veštački napravljeno ili sintetisano. Modifikacija nukleaznog sredstva može se sastojati u promeni samo jedne amino-kiseline u proteinskom isecajućem sredstvu ili samo jednog nukleotida u nukleinskokiselinskom isecajućem sredstvu. U nekim primerima izvođenja, inženjerisana nukleaza indukuje usek ili dvolančani prekid u mestu prepoznavanja, pri čemu mesto prepoznavanja nije sekvenca koju bi prepoznalo nativno (neinženjerisano ili nemodifikovano) nukleazno sredstvo. Produkovanje useka ili dvolančanog prekida u mestu prepoznavanja ili drugoj DNK može se označiti u ovom tekstu kao "sečenje" ili "isecanje" mesta prepoznavanja ili druge DNK.

[0049] Ćelija ove prekide može da popravi na jedan od dva načina: spajanjem nehomologih krajeva i popravkom usmerenom homologijom (homologa rekombinacija). U spajanju nehomologih krajeva (non-homologous end joining, NHEJ), dvolančani prekidi se popravljaju direktnim povezivanjem prekinutih krajeva jednog za drugi. Prema tome, nema novog nukleinsko-kiselinskog materijala koji se insertuje u mesto, mada neki nukleinsko-kiselinski materijal može da se izgubi, što rezultuje delecijom. U homologijom usmerenoj popravci,

1

donorski polinukleotid sa homologijom prema ciljnoj DNK sekvenci može da se koristi kao templat za popravku isečene ciljne DNK sekvence, što rezultuje transferom genetičke informacije od donorskog polinukleotida ka ciljnoj DNK. Prema tome, novi nukleinskokiselinski materijal može da bude insertovan/kopiran u mesto. Modifikacije ciljne DNK zbog NHEJ i/ili homologijom usmerene popravke mogu se upotrebiti za ispravku gena, zamenu gena, obeležavanje gena (tagging), insertovanje transgena, deleciju nukleotida, prekid gena, gensku mutaciju, itd.

[0050] U jednom primeru izvođenja, nukleazno sredstvo je efektorska nukleaza slična transkripcionom aktivatoru (TALEN). TAL efektorske nukleaze predstavljaju klasu sekvenciono-specifičnih nukleaza koje se mogu koristiti za pravljenje dvolančanih prekida na specifičnim ciljnim sekvencama u genomu prokariotskog ili eukariotskog organizma. TAL efektorske nukleaze stvorene su spajanjem nativnog ili inženjerisanog efektora sličnog transkripcionom aktivatoru (TAL), ili njegovog funkcionalnog dela, sa katalitičkim domenom endonukleaze, kao na primer, FokI. Jedinstveni, modularni TAL efektorski DNK-vezujući domen omogućava dizajniranje proteina sa potencijalnom specifičnošću prepoznavanja bilo koje date DNK. Prema tome, DNK-vezujući domeni TAL efektorskih nukleaza mogu se inženjerisati tako da prepoznaju specifična ciljna mesta na DNK i prema tome, koristiti se za pravljenje dvolančanih prekida na željenim ciljnim sekvencama. Vidi, WO 2010/079430; Morbitzer et al. (2010) PNAS 10.1073/pnas.1013133107; Scholze & Boch (2010) Virulence 1:428-432; Christian et al. Genetics (2010) 186:757-761; Li et al. (2010) Nuc. Acids Res. (2010) doi:10.1093/nar/gkq704; i Miller et al. (2011) Nature Biotechnology 29:143-148.

[0051] Primeri pogodnih TAL nukleaza, i metodi pripremanja pogodnih TAL nukleaza, objavljeni su npr. u US patentnim prijavama br. 2011/0239315 A1, 2011/0269234 A1, 2011/0145940 A1, 2003/0232410 A1, 2005/0208489 A1, 2005/0026157 A1, 2005/0064474 A1, 2006/0188987 A1, i 2006/0063231 A1. U različitim primerima izvođenja, TAL efektorske nukleaze inženjerisane su tako da vrše sečenje na mestu ili u blizini ciljne sekvence nukleinske kiseline u npr., genomskom lokusu od interesa, pri čemu je ciljna sekvenca nukleinske kiseline na mestu ili blizu sekvence koja će se modifikovati ciljajućim vektorom. TAL nukleaze pogodne za upotrebu u različitim metodima i kompozicijama datim u ovom tesktu uključuju one koje su specifično sizajnirane za vezivanje na mestu ili u blizini ciljnih nukleinsko-kiselinskih sekvenci koje će se modifikovati ciljajućim vektorima, kako je opisano u ovom tesktu.

[0052] U jednom primeru izvođenja, svaki TALEN monomer uključuje 33-35 TAL ponovaka koji prepoznaju jedan bazni par preko dve hipervarijabilne rezidue. U jednom primeru

2

izvođenja, nukleazno sredstvo je himerni protein koji uključuje DNK-vezujući domen baziran na TAL ponovcima, operabilno povezan sa nezavisnom nukleazom. U jednom primeru izvođenja, nezavisna nukleaza je FokI endonukleaza. U jednom primeru izvođenja, nukleazno sredstvo uključuje prvi DNK-vezujući domen baziran na TAL ponovcima i drugi DNK-vezujući domen baziran na TAL ponovcima, pri čemu je svaki od prvog i drugog DNK-vezujućeg domena baziranog na TAL ponovcima operabilno povezan sa FokI endonukleaznom subjedinicom, gde prvi i drugi DNK-vezujući domeni bazirani na TAL ponovcima prepoznaju dve kontinuirane DNK sekvence u svakom lancu ciljne DNK sekvence, razdvojene spejserskom sekvencom različite dužine (12-20 bp), i pri čemu se FokI nukleazne subjedinice dimerizuju da bi se stvorila aktivna nukleaza koja pravi dvolančane prekide u ciljnoj sekvenci.

[0053] Nukleazno sredstvo koje se koristi u različitim metodima i kompozicijama objavljenim u ovom tekstu može uključivati još i zinc-finger nukleazu (ZFN). U jednom primeru izvođenja, svaki monomer ZFN uključuje 3 ili više zinc finger-baziranih DNK-vezujućih domena, pri čemu se svaki zinc finger-bazirani DNK-vezujući domen vezuje za mesto od 3 bp. U drugim primerima izvođenja, ZFN je himerni protein koji uključuje zinc finger-bazirani DNK-vezujući domen operabilno vezan za nezavisnu nukleazu. U jednom primeru izvođenja, nezavisna endonukleaza je FokI endonukleaza. U jednom primeru izvođenja, nukleazno sredstvo uključuje prvi ZFN i drugi ZFN, pri čemu je svaki od prvog ZFN i drugog ZFN operabilno povezan sa FokI nukleaznom subjedinicom, gde prvi i drugi ZFN prepoznaju dve kontinuirane ciljne DNK sekvence u svakom lancu ciljne DNK sekvence, razdvojene spejserom od oko 5-7 bp, i pri čemu se FokI nukleazne subjedinice dimerizuju da se dobije aktivna nukleaza koja pravi dvolančani prekid. Vidi, na primer, US20060246567; US20080182332; US20020081614; US20030021776; WO/2002/057308A2; US20130123484; US20100291048; WO/2011/017293A2; i Gaj et al. (2013) Trends in Biotechnology, 31(7):397-405.

[0054] U jednom primeru izvođenja metoda datih u ovom tekstu, nukleazno sredstvo uključuje (a) himerni protein koji sadrži zinc finger-bazirani DNK-vezujući domen fuzionisan sa FokI endonukleazom; ili (b) himerni protein koji uključuje efektorsku nukleazu sličnu transkripcionom aktivatoru (TALEN) fuzionisanu sa FokI endonukleazom.

[0055] U još jednom primeru izvođenja, nukleazno sredstvo je meganukleaza. Meganukleaze su klasifikovane u četiri familije na osnovu konzerviranog sekvencionog motiva, familije su LAGLIDADG (SEQ ID NO: 16), GIY-YIG, H-NH, i His-Cys boks familije. Ovi motivi učestvuju u koordinisanju metalnih jona i hidrolizi fosfodiestraskih veza. HEaze su upadljive po svojim dugim mestima prepoznavanja i po tome što tolerišu izvesne polimorfizme sekvenci u svojim DNK supstratima. Poznati su domeni, struktura i funkcija meganukleaza, vidi na primer, Guhan and Muniyappa (2003) Crit Rev Biochem Mol Biol 38:199-248; Lucas et al., (2001) Nucleic Acids Res 29:960-9; Jurica and Stoddard, (1999) Cell MolLife Sci 55:1304-26; Stoddard, (2006) Q Rev Biophys 38:49-95; i Moure et al., (2002) Nat Struct Biol 9:764. U nekim primerima, koristi se prirodna varijanta, i/ili inženjerijski derivatizovana meganukleaza. Metodi modifikovanja kinetike, interakcije kofaktora, ekspresija, optimalni uslovi i/ili specifičnost mesta prepoznavanja, i skrining aktivnosti, su poznati, vidi na primer, Epinat et al., (2003) Nucleic Acids Res 31:2952-62; Chevalier et al., (2002) Mol Cell 10:895-905; Gimble et al., (2003) MolBiol 334:993-1008; Seligman et al., (2002) Nucleic Acids Res 30:3870-9; Sussman et al., (2004) J Mol Biol 342:31-41; Rosen et al., (2006) Nucleic Acids Res 34:4791-800; Chames et al., (2005) Nucleic Acids Res 33:e178; Smith et al., (2006) Nucleic Acids Res 34:e149; Gruen et al., (2002) Nucleic Acids Res 30:e29; Chen and Zhao, (2005) Nucleic Acids Res 33:e154; WO2005105989; WO2003078619; WO2006097854; WO2006097853; WO2006097784; i WO2004031346.

[0056] U ovom tekstu može se koristiti bilo koja meganukleaza, uključujući, ali ne ograničavajući se na I-SceI, I-SceII, I-SceIII, I-SceIV, I-SceV, I-SceVI, I-SceVII, I-CeuI, I-CeuAIIP, I-CreI, I-CrepsbIP, I-CrepsbIIP, I-CrepsbIIIP, I-CrepsbIVP, I-TliI, I-PpoI, PI-PspI, FScel, F-SceII, F-SuvI, F-TevI, F-TevII, I-AmaI, I-AniI, I-ChuI, I-CmoeI, I-CpaI, I-CpaII, I-CsmI, I-CvuI, I-CvuAIP, I-DdiI, IDdiII, I-DirI, I-DmoI, I-HmuI, I-HmuII, I-HsNIP, I-LlaI, I-MsoI, I-NaaI, I-NanI, I-NcIIP, I-NgrIP, I-NitI, I-NjaI, I-Nsp236IP, IPakI, I-PboIP, I-PcuIP, I-PcuAI, I-PcuVI, I-PgrIP, I-PobIP, I-PorI, I-PorIIP, I-PbpIP, I-SpBetaIP, I-ScaI, I-SexIP, I-SneIP, I-SpomI, I-SpomCP, I-SpomIP, I-SpomIIP, I-SquIP, I-Ssp6803I, I-SthPhiJP, I-SthPhiST3P, I-SthPhiSTe3bP, I-TdeIP, ITevI, I-TevII, I-TevIII, I-UarAP, I-UarHGPAIP, I-UarHGPA13P, I-VinIP, I-ZbiIP, PI-MtuI, PI-MtuHIP PI-MtuHIIP, PI-PfuI, PI-PfuII, PI-PkoI, PI-PkoII, PI-Rma43812IP, PI-SpBetaIP, PI-SceI, PI-Tful, PI-TfuII, PI-ThyI, PI-TliI, PI-TliII, ili bilo koju njihovu aktivnu varijantu ili fragment.

[0057] U jednom primeru izvođenja, meganukleaza prepoznaje dvolančane DNK sekvence od 12 do 40 baznih parova. U jednom primeru izvođenja, meganukleaza prepoznaje jednu savršeno podudarnu ciljnu sekvencu u genomu. U jednom primeru izvođenja, meganukleaza je homing nukleaza. U jednom primeru izvođenja, homing nukleaza je homing nukleaza iz LAGLIDADG (SEQ ID NO: 16) familije. U jednom primeru izvođenja, homing nukleaza iz LAGLIDADG (SEQ ID NO: 16) familije se bira između I-Scel, I-Crel, i I-Dmol.

[0058] Nukleazna sredstva mogu obuhvatati još i restrikcione endonukleaze (restrikcione enzime), koje uključuju endonukleoaze tipa I, tipa II, tipa III, i tipa IV. Restrikcione endonukleaze tipa I i tipa III prepoznaju specifična mesta prepoznavanja, ali tipično seku na poziciji koja se razlikuje od mesta vezivanja nukleaze, što može biti stotinama baznih parova udaljeno od mesta sečenja (mesto prepoznavanja). U sistemima tipa II restrikciona aktivnost je nezavisna od bilo kakve metilazne aktivnosti, i do sečenja tipično dolazi na specifičnim mestima unutar ili u blizini mesta vezivanja. Većina enzima tipa II seče palindromske sekvence, međutim, enzimi tipa IIa prepoznaju nepalindromska mesta prepoznavanja i vrše sečenje izvan mesta prepoznavanja, enzimi tipa IIb seku sekvence dva puta, pri čemu su oba mesta izvan mesta prepoznavanja, a enzimi tipa IIs prepoznaju asimetrično mesto prepoznavanja i seku na jednoj strani i na definisanoj udaljenosti od oko 1-20 nukleotida od mesta prepoznavanja. Restrikcioni enzimi tipa IV ciljaju metilisanu DNK. Restrikcioni enzimi su dodatno opisani i klasifikovani, na primer u REBASE bazi podataka (web-stranica rebase.neb.com; Roberts et al., (2003) Nucleic Acids Res 31:418-20), Roberts et al., (2003) Nucleic Acids Res 31:1805-12, i Belfort et al., (2002) u Mobile DNA II, pp. 761-783, Eds. Craigie et al., (ASM Press, Washington, DC). U specifičnim primerima izvođenja, kao nukleazna sredstva mogu se izabrati najmanje dva endonukleazna enzima, pri čemu enzimi stvaraju kompatibilne ili komplementarne "lepljive" krajeve (sticky ends).

[0059] Nukleazno sredstvo upotrebljeno u različitim metodima i kompozicijama može uključivati i CRISPR/Cas sistem. U takvim sistemima može se koristiti Cas9 nukleaza koja je u nekim slučajevima kodon-optimizovana za željeni tip ćelije u kojoj treba da se eksprimira. U sistemu se koristi još i fuzinisani crRNK-tracrRNK konstrukt koji funkcioniše sa kodonoptimizovanim Cas9. Ova pojedinačna RNK često se označava kao vodička RNK ili gRNK. U okviru gRNK, crRNK deo identifikovan je kao ’ciljna sekvenca’ za dato mesto prepoznavanja, a tracrRNK se često označava kao ’skafold’. Pokazano je da ovaj sistem funkcioniše u različitim eukariotskim i prokariotskim ćelijama. Ukratko, kratki DNK fragment koji sadrži ciljnu sekvencu insertuje se u ekspresioni plazmid vodičke RNK. gRNK ekspresioni plazmid uključuje ciljnu sekvencu (u nekim primerima izvođenja oko 20 nukleotida), oblik tracrRNK sekvence (skafold) kao i odgovarajući promotor aktivan u ćeliji i neophodne elemente za pravilnu obradu u eukariotskim ćelijama. Mnogi od sistema počivaju na uobičajenim, komplementarnim oligonukleotidima koji se sparuju da bi formirali dvolančanu DNK i zatim kloniraju u gRNK ekspresioni plazmid. gRNK ekspresiona kaseta i Cas9 ekspresiona kaseta se zatim uvedu u ćeliju. Vidi, na primer, Mali P et al. (2013) Science 16. februar 2013; 339 (6121):823-6; Jinek M et al. Science 17. avgust 2012;337(6096):816-

2

21; Hwang WY et al. Nat Biotechnol mart 2013;31(3):227-9; Jiang W et al. Nat Biotechnol mart 2013;31(3):233-9; i Cong L et al. Science 15. februar 2013;339(6121):819-23.

[0060] U metodima i kompozicijama objavljenim u ovom tekstu mogu se koristiti kratki palindromski ponovci pravilno raspoređeni u grupama (CRISPR)/CRISPR-pridruženi (Cas) sistemi ili komponente tih sistema, za modifikovanje genoma u ćeliji. CRISPR/Cas sistemi obuhvataju transkripte i druge elemente koji su uključeni u ekspresiju ili koji usmeravaju aktivnost Cas gena. CRISPR/Cas sistem može biti sistem tipa I, tipa II, ili tipa III. U metodima i kompozicijama objavljenim u ovom tekstu upotrebljavaju se CRISPR/Cas sistemi korišćenjem CRISPR kompleksa (koji uključuju vodičku RNK (gRNK) kompleksovanu sa Cas proteinom) za sečenje nukleinskih kiselina specifično za mesto.

[0061] Neki CRISPR/Cas sistemi upotrebljeni u metodima objavljenim u ovom tekstu se ne sreću u prirodi. Sistemi koji se "ne sreću u prirodi" podrazumevaju sve ono što ukazuje na ljudski uticaj, na primer izmenu ili mutaciju jedne ili više komponenti sistema u odnosu na stanje u kojem se nalazi u prirodi, dovođenje u stanje u kojem suštinski ne sadrži najmanje jednu komponentu sa kojom je inače udružen u prirodi, ili da je udružen sa najmanje jednom komponentom sa kojom inače nije udružen u prirodi. Na primer, u nekim CRISPR/Cas sistemima koriste se CRISPR kompleksi koji se ne sreću u prirodi, koji uključuju gRNK i Cas protein, koji se prirodno ne sreću zajedno.

[0062] Aktivne varijante i fragmenti nukleaznih sredstava (tj. inženjerisano nukleazno sredstvo) takođe su obezbeđeni. Takve aktivne varijante mogu imati najmanje 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više sekvencione identičnosti sa nativnim nukleaznim sredstvom, pri čemu aktivne varijante zadržavaju sposobnost sečenja na željenom mestu prepoznavanja i, prema tome, zadržavaju aktivnost indukovanja useka ili dvolančanog prekida. Na primer, svako od nukleaznih sredstava opisanih u ovom tekstu može se modifikovati u odnosu na nativnu endonukleaznu sekvencu i dizajnirati tako da prepozna i indukuje usek ili dvolančani prekid na mestu prepoznavanja koje se ne prepoznaje nativnim nukleaznim sredstvom. Prema tome, u nekim primerima izvođenja, inženjerisana nukleaza ima specifičnost da indukuje usek ili dvolančani prekid na mestu prepoznavanja različitom od mesta prepoznavanja odgovarajućeg nativnog nukleaznog sredstva. Testovi za određivanje aktivnosti indukovanja useka ili dvolančanih prekida poznati su i obično mere ukupnu aktivnost i specifičnost endonukleaze na DNK supstratima koji sadrže mesto prepoznavanja.

IV. CRISPR/Cas sistemi (gRNK-Cas kompleks)

[0063] U datim metodima može se koristiti CRISPR/Cas sistem (npr., gRNK-Cas kompleks) za sečenje nukleinskih kiselina specifično za mesto. Konkretno, Cas sečenje nukleinskih kiselina usmereno pomoću gRNK na identifikovanom ciljnom mestu proizvodi digestiranu nukleinsku kiselinu sa krajevima koji onda mogu da se spoje sa drugom nukleinskom kiselinom da bi se sastavile dve ili više nukleinskih kiselina na način specifičan za mesto.

[0064] "gRNK-Cas kompleks" uključuje kompleks Cas proteina sa gRNK. gRNK može biti dizajnirana ili selektovana da usmeri Cas sečenje ka ciljnom mestu koje stvara preklapajuće krajeve između isečene nukleinske kiseline i druge nukleinske kiseline. gRNK-Cas kompleks može da se dopuni sredstvima koja su već kompleksovana, ili može da se dopuni proteinskim i RNK elementima zasebno, u tom slučaju se oni kompleksuju da bi formirali gRNK-Cas kompleks u metodima i reakcionim mešavinama opisanim u ovom tekstu.

A. Cas RNK-vođene endonukleaze

[0065] Cas proteini uopšteno uključuju najmanje jedan RNK-prepoznavajući ili vezujući domen. Takvi domeni mogu interagovati sa vodičkim RNK (gRNK, opisane detaljnije u nastavku ovog teksta). Cas proteini mogu uključivati i nukleazne domene (npr., DNazni ili RNazni domeni), DNK-vezujuće domene, helikazne domene, domene protein-protein interakcije, dimerizacione domene i druge domene. Nukleazni domen poseduje katalitičku aktivnost za sečenje nukleinske kiseline. Sečenje uključuje prekidanje kovalentnih veza u molekulu nukleinske kiseline. Sečenje može proizvesti tupe krajeve ili lepljive krajeve, i može biti jednlančano ili dvolančano.

[0066] Primeri Cas proteina uključuju Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas5e (CasD), Cas6, Cas6e, Cas6f, Cas7, Cas8a1 , Cas8a2, Cas8b, Cas8c, Cas9 (Csn1 ili Csx12), Cas10, Cas10d, CasF, CasG, CasH, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1 (CasA), Cse2 (CasB), Cse3 (CasE), Cse4 (CasC), Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1 , Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1,

Csf2, Csf3, Csf4, i Cu1966, i njihove homole ili modifikovane verzije.

[0067] U metodima i kompozicijama objavljenim u ovom tekstu, može se upotrebiti svaki Cas protein koji indukuje usek ili dvolančani prekid u željenom mestu prepoznavanja. Može se koristiti prirodni ili nativni Cas protein dokle god Cas protein indukuje dvolančani prekid na mestu prepoznavanja. Alternativno, može se koristiti modifikovani ili inženjerisani Cas protein. "Inženjerisani Cas protein" uključuje Cas protein koji je inženjerisan (modifikovan ili izveden) iz svog nativnog oblika da specifično prepozna i indukuje usek ili dvolančani prekid

2

na željenom mestu prepoznavanja. Prema tome, inženjerisani Cas protein može biti izveden iz nativnog, prirodnog Cas proteina ili može biti veštački stvoren ili sintetisan.

[0068] U određenim primerima izvođenja, Cas protein je Cas9. Cas9 proteini tipično imaju četiri zajednička ključna motiva sa konzerviranom arhitekturom. Motivi 1, 2, i 4 su motivi slični RuvC, a motiv 3 je HNH motiv. Nukleazna aktivnost Cas9 seče ciljnu DNK da proizvede dvolančane prekide. Ove prekide ćelija može da popravi na jedan od dva načina: spajanjem nehomologih krajeva i popravkom usmerenom homologijom (homologom rekombinacijom). U spajanju nehomologih krajeva (NHEJ), dvolančani prekidi se popravljaju direktnim povezivanjem prekinutih krajeva jednog sa drugim. Prema tome, nema insertovanja novog nukleinsko-kiselinskog materijala na mestu, mada neki nukleinsko-kiselinski materijal može da se izgubi, što rezultuje delecijom. U popravci usmerenoj homologijom, donorski polinukleotid sa homologijom prema sečenoj ciljnoj DNK sekvenci može da se koristi kao templat za popravku isečene cilje DNK sekvence, što rezultuje transferom genetičke informacije iz donorskog polinukleotida ka ciljnoj DNK. Prema tome, novi nukleinskokiselinski materijal može biti insertovan/kopiran u mesto. Modifikacije ciljne DNK zbog NHEJ i/ili homologijom usmerene popravke mogu se koristiti za ispravku gena, zamenu gena, obeležavanje gena, insertovanje transgena, deleciju nukleotida, prekid gena, gensku mutaciju, itd.

[0069] Cas proteini mogu biti iz CRISPR/Cas sistema tipa II. Na primer, Cas protein može biti Cas9 protein ili može biti izveden iz Cas9 proteina. Cas9 proteini tipično imaju četiri zajednička ključna motiva sa konzerviranom arhitekturom. Motivi 1, 2, i 4 su motivi slični RuvC, a motiv 3 je HNH motiv. Cas9 protein može biti iz, na primer, Streptococcus pyogenes, Streptococcus thermophilus, Streptococcus sp., Staphylococcus aureus, Nocardiopsis dassonvillei, Streptomyces pristinaespiralis, Streptomyces viridochromogenes, Streptomyces viridochromogenes, Streptosporangium roseum, Streptosporangium roseum, AlicyclobacHlus acidocaldarius, Bacillus pseudomycoides, Bacillus selenitireducens, Exiguobacterium sibiricum, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus salivarius, Microscilla marina, Burkholderiales bacterium, Polaromonas naphthalenivorans, Polaromonas sp., Crocosphaera watsonii, Cyanothece sp., Microcystis aeruginosa, Synechococcus sp., Acetohalobium arabaticum, Ammonifex degensii, Caldicelulosiruptor becscii, Candidatus Desulforudis, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Finegoldia magna, Natranaerobius thermophilus, Pelotomaculum thermopropionicum, Acidithiobacillus caldus, Acidithiobacillus ferrooxidans, Allochromatium vinosum, Marinobacter sp., Nitrosococcus halophilus, Nitrosococcus watsoni, Pseudoalteromonas haloplanktis, Ktedonobacter

2

racemifer, Methanohalobium evestigatum, Anabaena variabilis, Nodularia spumigena, Nostoc sp., Arthrospira maxima, Arthrospira platensis, Arthrospira sp., Lyngbya sp., Microcoleus chthonoplastes, Oscillatoria sp., Petrotoga mobilis, Thermosipho africanus, ili Acaryochloris marina. Dodatni primeri članova Cas9 familije opisani su u WO 2014/131833. Cas9 protein iz S. pyogenes ili izveden iz njega, poželjan je enzim. Cas9 protein iz S. pyogenes je označen SwissProt pristupnim brojem Q99ZW2.

[0070] Cas proteini mogu biti proteini divljeg tipa (tj., oni koji se sreću u prirodi), modifikovani Cas proteini (tj., varijante Cas proteina), ili fragmenti Cas proteina divljeg tipa ili modifikovanog Cas proteina. Cas proteini mogu biti i aktivne varijante ili fragmenti divljeg tipa ili modifikovanih Cas proteina. Aktivne varijante ili fragmenti mogu uključivati najmanje 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više sekvencione identičnosti sa divljim tipom ili modifikovanim Cas proteinom ili njegovim delom, pri čemu aktivne varijante zadržavaju sposobnost da sečenja na željenom mestu i time zadržavaju aktivnost indukovanja useka ili dvolančanih prekida. Testovi za aktivnost indukovanja useka ili dvolančanih prekida poznati su i obično mere ukupnu aktivnost i specifičnost Cas proteina na DNK supstratima koji sadrže mesto sečenja.

[0071] Cas proteini mogu biti modifikovani tako da povećaju ili smanje afinitet vezivanja sa nukleinskom kiselinom, specifičnost vezivanja sa nukleinskom kiselinom, i/ili enzimsku aktivnost. Cas proteini takođe mogu da se modifikuju tako da promene svaku drugu aktivnost ili osobinu proteina, kao što je stabilnost. Na primer, jedan ili više nukleaznih domena Cas proteina mogu se modifikovani, ukloniti ili inaktivirati, ili Cas protein može da se skrati da bi se uklonili domeni koji nisu suštinski važni za funkciju proteina ili za optimizovanje (npr., pojačanje ili smanjenje) aktivnosti Cas proteina.

[0072] Neki Cas proteini uključuju najmanje dva nukleazna domena, kao što su DNazni domeni. Na primer, Cas9 protein može uključiti RuvC-sličan nukleazni domen i HNH-sličan nukleazni domen. Svaki od RuvC i HNH domena može seći različiti lanac dvolančane DNK da bi se napravio dvolančani prekid u DNK. Vidi, npr., Jinek et al. (2012) Science 337:816-821.

[0073] Jedan ili oba nukleazna domena mogu se ukloniti ili mutirati tako da više ne budu funkcionalni ili da imaju smanjenu nukleaznu aktivnost. Ukoliko je jedan od nukleaznih domena uklonjen ili mutiran, rezultujući Cas protein (npr., Cas9) može se označiti kao nikaza i može stvoriti jednolančani prekid na CRISPR RNK-prepoznavajućoj sekvenci unutar dvolančane DNK, ali ne i dvolančani prekid (tj., može seći komplementarni lanac ili nekomplementarni lanac, ali ne oba). Ako su oba nukleazna domena uklonjena ili mutirana,

2

rezultujući Cas protein (npr., Cas9) imaće smanjenu sposobnost sečenja oba lanca dvolančane DNK. Primer mutacije koja konvertuje Cas9 u nikazu je D10A (aspartat u alanin na poziciji 10 Cas9) mutacija u RuvC domenu Cas9 iz S. pyogenes. Slično tome, H939A (histidin u alanin na aminokiselinskoj poziciji 839) ili H840A (histidin u alanin na aminokiselinskoj poziciji 840) u HNH domenu Cas9 iz S. pyogenes mogu konvertovati Cas9 u nikazu. Drugi primeri mutacija koje konvertuju Cas9 u nikazu uključuju odgovarajuće mutacije u Cas9 iz S. thermophilus. Vidi, npr., Sapranauskas et al. (2011) Nucleic Acids Research 39:9275-9282 i WO 2013/141680. Takve mutacije mogu se napraviti korišćenjem metoda kao što je usmerena mutageneza, PCR-posredovana mutageneza, ili totalna genska sinteza. Primeri drugih mutacija koje stvaraju nikaze mogu se naći, na primer, u WO/2013/176772A1 i WO/2013/142578A1.

[0074] Cas proteini mogu biti i fuzioni proteini. Na primer, Cas protein može da se fuzioniše sa domenom sečenja, domenom epigenetske modifikacije, domenom transkripcione aktivacije, ili domenom represije transkripcije. Vidi WO 2014/089290. Cas proteini mogu da se fuzionišu i sa heterologim polipeptidom koji obezbeđuje povećanu ili smanjenu stabilnost. Fuzionisani domen ili heterologi polipeptid mogu biti locirani na N-terminusu, C-terminusu, ili i unutrašnjosti Cas proteina.

[0075] Cas protein može da se fuzioniše sa heterologim polipeptidom koji obezbeđuje subćelijsku lokalizaciju. Takvi heterologi peptidi uključuju, na primer, signal nukleusne lokalizacije (nuclear localization signal, NLS) kao što je SV40 NLS za ciljanje u nukleus, signal mitohondrijalne lokalizacije za ciljanje u mitohondrije, signal za zadržavanje u ER, i slično. Vidi, npr., Lange et al. (2007) J. Biol. Chem. 282:5101-5105. Takvi subćelijski lokalizacioni signali mogu da se nalaze na N-terminusu, C-terminusu, ili bilo gde unutar Cas proteina. NLS može uključivati niz baznih amino-kiselina, i može biti monopartitna sekvenca ili bipartitna sekvenca.

[0076] Cas proteini mogu biti vezani i sa domenom za ulazak u ćeliju. Na primer, domen za ulazak u ćeliju može biti izveden iz HIV-1 TAT proteina, TLM motiva za ulazak u ćeliju humanog virusa hepatitisa B, MPG, Pep-1, VP22, peptida za ulazak u ćeliju iz Herpes simplex virusa, ili poliargininske peptidne sekvence. Vidi, na primer, WO 2014/089290. Domen za ulazak u ćeliju može biti lociran na N-terminusu, C-terminusu, ili bilo gde unutar Cas proteina.

[0077] Cas proteini mogu uključivati i heterologi polipeptid radi lakšeg praćenja ili prečišćavanja, na primer fluorescentni protein, obeleživač za prečišćavanje, ili epitopski obeleživač. Primeri fluorescentnih proteina uključuju proteine zelene fluorescencije (npr.,

2

GFP, GFP-2, tagGFP, turboGFP, eGFP, Emerald, Azami Green, Monomeric Azami Green, CopGFP, AceGFP, ZsGreenl), proteine žute fluorescencije (npr., YFP, eYFP, Citrine, Venus, YPet, PhiYFP, ZsYellowl), proteine plave fluorescencije (npr. eBFP, eBFP2, Azurite, mKalamal, GFPuv, Sapphire, T-sapphire), proteine modroplave fluorescencije (npr. eCFP, Cerulean, CyPet, AmCyanl, Midoriishi-Cyan), proteine crvene fluorescencije (mKate, mKate2, mPlum, DsRed monomer, mCherry, mRFPl, DsRed-Express, DsRed2, DsRed-Monomer, HcRed-Tandem, HcRedl, AsRed2, eqFP61 1, mRaspberry, mStrawberry, Jred), proteine narandžaste fluorescencije (mOrange, mKO, Kusabira-Orange, Monomeric Kusabira-Orange, mTangerine, tdTomato), i svaki drugi pogodan fluorescentni protein. Primeri obeleživača uključuju glutation-S-transferazu (glutathione-S-transferase, GST), hitinvezujući protein (chitin binding protein, CBP), maltoza-vezujući protein, tioredoksin (thioredoxin, TRX), poli(NANP), obeleživač tandem-afinitetnog prečišćavanja (tandem affinity purification, TAP), myc, AcV5, AU1, AU5, E, ECS, E2, FLAG, hemaglutinin (hemagglutinin, HA), nus, Softag 1, Softag 3, Strep, SBP, Glu-Glu, HSV, KT3, S, S1 , T7, V5, VSV-G, histidin (histidine, His), biotin-karboksil nosački protein (biotin carboxyl carrier protein, BCCP), i kalmodulin.

[0078] U nekim primerima izvođenja, Cas protein može biti modifikovan tako da rezultujuća nukleazna aktivnost bude izmenjena. Određene mutacije u Cas mogu da smanje sposobnost nukleaze da seče i komplementarni i nekomplementarni lanac ciljne DNK. Na primer, Cas proteini mogu biti mutirani na poznatim pozicijama tako da nukleazna aktivnost bude ograničena na sečenje ili komplementarnog lanca ili nekomplementarnog lanca. Konkretno, Cas9 sa D10A (aspartat u alanin na aminokiselinskoj poziciji 10 Cas9) mutacijom može da seče komplementrani lanac ciljne DNK, ali ima smanjenu sposobnost sečenja nekomplementarnog lanca ciljne DNK. U nekim primerima izvođenja, Cas9 sa H840A (histidin u alanin na aminokiselinskoj poziciji 840) mutacijom može da seče nekomplementarni lanac ciljne DNK, ali ima smanjenu sposobnost da seče komplementrani lanac ciljne DNK. Nukleazna aktivnost Cas9 koji ima ili D10A ili H840A mutaciju rezultovala bi jednolančanim prekidom (single strand break, SSB) umesto DSB. Da bi se postigao isti efekat (tj. inaktivirao jedan ili drugi nukleazni deo) mogu se mutirati druge rezidue. Kao neograničavajući primeri, rezidue D10, G12, G17, E762, H840, N854, N863, H982, H983, A984, D986, i/ili A987 (tj., supstituisane). Pored toga, pogodne mogu biti supstituisane amino-kiseline različite od alanina. U nekim primerima izvođenja kada nukleaza ima smanjenu aktivnost (npr., kada Cas9 protein ima D10, G12, G17, E762, H840, N854, N863, H982, H983, A984, D986, i/ili A987 mutaciju, kao D10A, G12A, G17A, E762A,

2

H840A, N854A, N863A, H982A, H983A, A984A, i/ili D986A), nukleaza i dalje može da se veže za ciljnu DNK na način specifičan za mesto jer je i dalje vođena do ciljne DNK sekvence pomoću gRNK), dokle god zadržava sposobnost da interaguje sa gRNK.

[0079] U nekim primerima izvođenja, Cas je izmenjen tako da nukleaza ne seče ni komplementarni ni nekomplementarni lanac ciljne DNK. Na primer, Cas9 sa mutacijama D10A i H840A ima smanjenu sposobnost da seče komplementarni i nekomplementarni lanac ciljne DNK. Druge rezidue mogu biti mutirane tako da se postigne isti efekat (tj., inaktivira jedan ili drugi deo nukleaze). Kao neograničavajući primeri, rezidue D10, G12, G17, E762, H840, N854, N863, H982, H983, A984, D986, i/ili mogu da se supstituišu kako bi se suštinski eliminisala nukleazna aktivnost. Pored toga, pogodne mogu biti mutacije različite od supstitucija alanina.

[0080] Izrazi "ciljno mesto" ili "ciljna sekvenca" mogu se koristiti naizmenično i uključuju sekvence nukleinske kiseline prisutne u ciljnoj DNK, za koje će se vezati DNK-ciljajući segment gRNK, ukoliko postoje zadovoljavajući uslovi za vezivanje. Na primer, ciljno mesto (ili ciljna sekvenca) unutar ciljne DNK ciljano je (ili je vezano ili hibridizovano ili komplementarno sa) Cas proteinom ili gRNK. Pogodni uslovi za vezivanje DNK/RNK uključuju fiziološke uslove normalno prisutne u ćeliji. Drugi pogodni uslovi za vezivanje DNK/RNK (npr., uslovi u sistemu bez ćelija) poznati su u struci (vidi, npr., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed. (Sambrook et al., Harbor Laboratory Press 2001)). Lanac ciljne DNK koji je komplementaran i koji se hibridizuje sa Cas proteinom ili gRNK označava se kao "komplementarni lanac", a lanac ciljne DNK koji je komplementaran sa "komplementarnim lancem" (i, dakle, nije komplementaran sa Cas proteinom ili gRNK) označava se kao "nekomplementarni lanac" ili "templatni lanac".

[0081] Cas protein može da seče nukleinsku kiselinu na mestu unutar ciljne sekvence ili izvan ciljne sekvence. "Mesto sečenja" uključuje poziciju na nukleinskoj kiselini na kojoj Cas protein dovodi do jednolančanog prekida ili dvolančanog prekida. Ako Cas protein proizvodi dvolančani prekid, mesto sečenja može biti na istoj poziciji na oba lanca nukleinske kiseline (proizvodeći tupe krajeve) ili može biti na različitim mestima na svakom lancu (proizvodeći lepljive ili kohezivne krajeve). Lepljivi krajevi mogu da se proizvedu i korišćenjem dva Cas proteina koji proizvode jednolančani prekid na mestima sečenja na svakom lancu. Sečenje na specifičnom mestu ciljne DNK putem Cas9 može se desiti na lokacijama koje su određene (i) komplementarnošću sparivanja baza vodičke RNK i ciljne DNK; i (ii) kratkim motivom, označenim kao protospejser susedni motiv (PAM), u ciljnoj DNK. Na primer, mesto sečenja Cas9 može biti oko 1 do oko 10 ili oko 2 do oko 5 baznih parova (npr., 3 bazna para) ushodno od PAM sekvence. U nekim primerima izvođenja (npr., kada se koristi Cas9 iz S. pyogenes, ili srodni Cas9), PAM sekvenca nekomplementarnog lanca može da bude 5’-XGG-3’, gde je X bilo koji DNK nukleotid i X je neposredno 3’ od ciljne sekvence nekomplementarnog lanca ciljne DNK. Kao takva, PAM sekvenca komplementarnog lanca bila bi 5’-CCY-3’, gde je Y bilo koji DNK nukleotid i Y je neposredno 5’ od ciljne sekvence komplementarnog lanca ciljne DNK. U nekim primerima izvođenja, X i Y mogu biti komplementarni i X-Y bazni par može biti bilo koji bazni par (npr., X=C i Y=G; X=G i Y=C; X=A i Y=T, X=T i Y=A).

[0082] Cas proteini mogu biti obezbeđeni u bilo kom obliku. Na primer, Cas protein može biti obezbeđen u vidu proteina, kao što je Cas protein kompleksovan sa gRNK. Alternativno, Cas protein može biti obezbeđen u vidu nukleinske kiseline koja kodira Cas protein, kao što je RNK (npr., informaciona RNK (iRNK)) ili DNK. Opciono, nukleinska kiselina koja kodira Cas protein može biti kodon-optimizovana u pogledu efikasne translacije u protein u određenoj ćeliji ili organizmu. Na primer, nukleinska kiselina koja kodira Cas protein može biti modifikovana da sadrži kodone koji imaju višu frekvenciju upotrebe u bakterijskoj ćeliji, ćeliji kvasca, ćeliji čoveka, nehumanoj ćeliji, sisarskoj ćeliji, ćeliji glodara, ćeliji miša, ćeliji pacova, ili bilo kojoj ćeliji-domaćinu od interesa, u poređenju sa prirodnom polinukleotidnom sekvencom. Kada se nukleinska kiselina koja kodira Cas protein uvede u ćeliju, Cas protein može da se eksprimira u ćeliji prolazno, uslovno ili konstitutivno.

[0083] Nukleinske kiseline koje kodiraju Cas proteine mogu stabilno da se integrišu u genom ćelije i operabilno povežu sa promotorom aktivnim u ćeliji. Alternativno, nukleinske kiseline koje kodiraju Cas proteine mogu da se operabilno povežu sa promotorom u ekspresionom konstruktu. Ekspresioni konstrukti uključuju sve nukleinsko-kiselinske konstrukte sposobne da usmeravaju ekspresiju gena ili druge nukleinsko-kiselinske sekvence od interesa (npr., Cas gen) i koji mogu preneti takvu nukleinsko-kiselinsku sekvencu od interesa u ciljnu ćeliju. Na primer, nukleinska kiselina koja kodira Cas protein može biti u ciljajućem vektoru koji uključuje nukleinsko-kiselinski insert i/ili vektoru koji uključuje DNK koja kodira gRNK, ili može biti vektor ili plazmid koji je odvojen od ciljajućeg vektora koji uključuje nukleinskokiselinski insert i/ili odvojen od vektora koji uključuje DNK koja kodira gRNK. Promotori koji mogu da se koriste u ekspresionom konstruktu uključuju, na primer, promotore aktivne u pluripotentnim ćelijama pacova, eukariota, sisara, nehumanih sisara, čoveka, glodara, miša, ili hrčka. Takvi promotori mogu biti, na primer, uslovni promotori, inducibilni promotori, konstitutivni promotori, ili tkivno-specifični promotori. Primeri drugih promotora opisani su na drugom mestu u ovom tekstu.

1

B. Vodičke RNK (gRNK)

[0084] "Vodička RNK" ili "gRNK" uključuje RNK molekul koji se vezuje za Cas protein i usmerava Cas protein ka specifičnom mestu u okviru ciljne DNK. Vodičke RNK (gRNK) mogu uključivati dva segmenta, "DNK-ciljajući segment" i "protein-vezujući segment". "Segment" uključuje segment, deo ili region molekula, na primer, kontinuirani niz nukleotida u RNK. Neke gRNK uključuju dva odvojena RNK molekula: "aktivatorsku-RNK" i "ciljajuću-RNK". Druge gRNK predstavljene su pojedinačnim molekulom RNK (jedan RNK polinukleotid), koji može da se nazove i "jednomolekulska gRNK", "jednovodička RNK" ili "sgRNK". Vidi, npr., WO/2013/176772A1, WO/2014/065596A1, WO/2014/089290A1, WO/2014/093622A2, WO/2014/099750A2, WO/2013142578A1, i WO 2014/131833A1. Izrazi "vodička RNK" i "gRNK" uključuju i dvomolekulske gRNK i jednomolekulske gRNK.

[0085] Primer dvomolekulske gRNK uključuje crRNK-sličan ("CRISPR RNK" ili "ciljajući-RNK" ili "crRNK" ili "crRNK ponovak") molekul i odgovarajući tracrRNK-sličan ("transdejstvujući CRISPR RNK" ili "aktivatorski-RNK" ili "tracrRNK" ili "skafold") molekul. crRNK uključuje i DNK-ciljajući segment (jednolančani) gRNK i niz nukleotida koji formiraju jednu polovinu dsRNK dvostrukog lanca protein-vezujućeg segmenta gRNK. Odgovarajuća tracrRNK (aktivatorska-RNK) uključuje niz nukleotida koji formiraju drugu polovinu dsRNK dvostrukog lanca protein-vezujućeg segmenta gRNK. Niz nukleotida crRNK komplementaran je i hibridizuje se sa nizom nukleotida tracrRNK da se formira dsRNK lanac protein-vezujućeg domena gRNK. Prema tome, može se reći da svaka crRNK ima odgovarajuću tracrRNK. crRNK dodatno obezbeđuje jednolančani DNK-ciljajući segment. Prema tome, gRNK uključuje sekvencu koja se hibridizuje sa ciljnom sekvencom, i tracrRNK.

[0086] crRNK i odgovarajuća tracrRNK (kao odgovarajući par) hibridizuju se da formiraju gRNK. crRNK dodatno obezbeđuje jednolančani DNK-ciljajući segment koji se hibridizuje sa CRISPR RNK sekvencom prepoznavanja. Ako se koristi za modifikovanje unutar ćelije, tačna sekvenca date crRNK ili tracrRNK molekula može da se dizajnira tako da bude specifična za vrstu u kojoj će se RNK molekuli koristiti. Vidi, na primer, Mali P et al. (2013) Science 15. februar 2013;339(6121):823-6; Jinek M et al. Science 17. avgust 2012;337(6096):816-21; Hwang WY et al. Nat Biotechnol mart 2013;31(3):227-9; Jiang W et al. Nat Biotechnol mart 2013;31(3):233-9; i Cong L et al. Science 15. februar 2013;339(6121):819-23.

2

[0087] DNK-ciljajući segment (crRNK) date gRNK uključuje nukleotidnu sekvencu komplementarnu sa sekvencom u ciljnoj DNK. DNK-ciljajući segment gRNK interaguje sa ciljnom DNK na sekvenciono-specifičan način putem hibridizacije (tj., sparivanja baza). Prema tome, nukleotidna sekvenca DNK-ciljajućeg segmenta može varirati i određuje lokaciju unutar ciljne DNK gde će gRNK i ciljna DNK interagovati. DNK-ciljajući segment predmetne gRNK može se modifikovati tako da se hibridizuje sa bilo kojom željenom sekvencom u okviru ciljne DNK. Prirodne crRNK razlikuju se u zavisnosti od Cas9 sistema i organizma, ali često sadrže ciljajući segment dužine između 21 i 72 nukleotida, koji bočno ograničavaju dva direktna ponovka (direct repeats, DR) duga između 21 i 46 nukleotida (vidi, npr., WO2014/131833). U slučaju S. pyogenes, DR su dugi 36 nukleotida i ciljajući segment je dug 30 nukleotida. 3’-locirani DR je komplementaran i hibridizuje se sa odgovarajućom tracrRNK, koja se onda vezuje sa Cas9 proteinom.

[0088] DNK-ciljajući segment može biti dug od oko 12 nukleotida do oko 100 nukleotida. Na primer, DNK-ciljajući segment može biti dug od oko 12 nukleotida (nt) do oko 80 nt, od oko 12 nt do oko 50 nt, od oko 12 nt do oko 40 nt, od oko 12 nt do oko 30 nt, od oko 12 nt do oko 25 nt, od oko 12 nt do oko 20 nt, ili od oko 12 nt do oko 19 nt. Alternativno, DNK-ciljajući segment može biti dug od oko 19 nt do oko 20 nt, od oko 19 nt do oko 25 nt, od oko 19 nt do oko 30 nt, od oko 19 nt do oko 35 nt, od oko 19 nt do oko 40 nt, od oko 19 nt do oko 45 nt, od oko 19 nt do oko 50 nt, od oko 19 nt do oko 60 nt, od oko 19 nt do oko 70 nt, od oko 19 nt do oko 80 nt, od oko 19 nt do oko 90 nt, od oko 19 nt do oko 100 nt, od oko 20 nt do oko 25 nt, od oko 20 nt do oko 30 nt, od oko 20 nt do oko 35 nt, od oko 20 nt do oko 40 nt, od oko 20 nt do oko 45 nt, od oko 20 nt do oko 50 nt, od oko 20 nt do oko 60 nt, od oko 20 nt do oko 70 nt, od oko 20 nt do oko 80 nt, od oko 20 nt do oko 90 nt, ili od oko 20 nt do oko 100 nt.

[0089] Nukleotidna sekvenca DNK-ciljajućeg segmenta koja je komplementarna sa nukleotidnom sekvencom (CRISPR RNK sekvenca prepoznavanja) ciljne DNK može biti duga najmanje oko 12 nt. Na primer, DNK-ciljajuća sekvenca (npr., sekvenca unutar DNK-ciljajućeg segmenta komplementarna sa CRISPR RNK sekvencom prepoznavanja u okviru ciljne DNK) može biti duga najmanje oko 12 nt, najmanje oko 15 nt, najmanje oko 18 nt, najmanje oko 19 nt, najmanje oko 20 nt, najmanje oko 25 nt, najmanje oko 30 nt, najmanje oko 35 nt, ili najmanje oko 40 nt. Alternativno, DNK-ciljajuća sekvenca DNK-ciljajućeg segmenta komplementarna sa ciljnom sekvencom ciljne DNK može biti duga od oko 12 nukleotida (nt) do oko 80 nt, od oko 12 nt do oko 50 nt, od oko 12 nt do oko 45 nt, od oko 12 nt do oko 40 nt, od oko 12 nt do oko 35 nt, od oko 12 nt do oko 30 nt, od oko 12 nt do oko 25 nt, od oko 12 nt do oko 20 nt, od oko 12 nt do oko 19 nt, od oko 19 nt do oko 20 nt, od oko 19 nt do oko 25 nt, od oko 19 nt do oko 30 nt, od oko 19 nt do oko 35 nt, od oko 19 nt do oko 40 nt, od oko 19 nt do oko 45 nt, od oko 19 nt do oko 50 nt, od oko 19 nt do oko 60 nt, od oko 20 nt do oko 25 nt, od oko 20 nt do oko 30 nt, od oko 20 nt do oko 35 nt, od oko 20 nt do oko 40 nt, od oko 20 nt do oko 45 nt, od oko 20 nt do oko 50 nt, ili od oko 20 nt do oko 60 nt. Nukleotidna sekvenca (DNK-ciljajuća sekvenca) DNK-ciljajućeg segmenta komplementarna sa nukleotidnom sekvencom (ciljnom sekvencom) ciljne DNK može biti duga najmanje oko 12 nt. U nekim slučajevima, DNK-ciljajuća sekvenca može biti duga najmanje oko 20 nt.

[0090] TracrRNK mogu biti u bilo kojoj formi (npr., tracrRNK pune dužine ili aktivne parcijalne tracrRNK) i različitih dužina. One mogu uključivati primarne transkripte ili obrađene oblike. Na primer, tracrRNK (kao deo jednovodičke RNK ili kao zasebni molekul kao deo dvomolekulske gRNK) može uključivati ili sastojati se od cele ili dela sekvence tracrRNK divljeg tipa (npr., oko ili više od oko 20, 26, 32, 45, 48, 54, 63, 67, 85, ili više nukleotida sekvence tracrRNK divljeg tipa). Primeri sekvenci tracrRNK divljeg tipa iz S. pyogenes uključuju verzije od 171 nukleotida, 89 nukleotida, 75 nukleotida, i 65 nukleotida. Vidi, na primer, Deltcheva et al. (2011) Nature 471:602-607; WO 2014/093661. Primeri tracrRNK u okviru jednovodičkih RNK (sgRNK) uključuju tracrRNK segmente nađene unutar 48, 54, 67, i 85 verzija sgRNK, gde "+n" označava da je do n nukleotida tracrRNK divljeg tipa uključeno u sgRNK. Vidi US 8,697,359.

[0091] Procenat komplementarnosti između DNK-ciljajuće sekvence i CRISPR RNK sekvence prepoznavanja u okviru ciljne DNK može iznositi najmanje 60% (npr., najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99%, ili 100%). Procenat komplementarnosti između DNK-ciljajuće sekvence i CRISPR RNK sekvence prepoznavanja u okviru ciljne DNK je 100% duž sedam kontinuiranih 5’-nukleotida ciljne sekvence komplementarnog lanca ciljne DNK. U određenim primerima izvođenja, Procenat komplementarnosti između DNK-ciljajuće sekvence i CRISPR RNK sekvence prepoznavanja u okviru ciljne DNK može biti najmanje 60% duž oko 20 kontinuiranih nukleotida. Kao primer, procenat komplementarnosti između DNK-ciljajuće sekvence i CRISPR RNK sekvence prepoznavanja u okviru ciljne DNK je 100% duž četrnaest kontinuiranih nukleotida na krajnjem 5’-kraju CRISPR RNK sekvence prepoznavanja unutar kompelmentarnog lanca ciljne DNK i samo 0% duž preostalog dela. U tom slučaju, može se smatrati da je DNK-ciljajuća sekvenca duga 14 nukleotida. Kao drugi primer, procenat komplementarnosti između DNK-ciljajuće sekvence i CRISPR RNK sekvence prepoznavanja u okviru ciljne DNK je 100% duž sedam kontinuiranih nukleotida na krajnjem 5’-kraju CRISPR RNK sekvence prepoznavanja unutar

4

komplementarnog lanca ciljne DNK i samo 0% duž preostalog dela. U tom slučaju, može se smatrati da je DNK-ciljajuća sekvenca duga 7 nukleotida.

[0092] Komplementarnost nukleinskih kiselina znači da je nukleotidna sekvenca u jednom lancu nukleinske kiseline, zbog orijentacije svojih nukleobaznih grupa, vodoničnim vezama povezana sa drugom sekvencom naspramnog lanca nukleinske kiseline. Komplementarne baze su, tipično, u DNK: A sa T i C sa G, a u RNK: C sa G, i U sa A. Komplementarnost može biti savršena ili suštinska/dovoljna. Savršena komplementarnost između dve nukleinske kiseline znači da dve nukleinske kiseline mogu da formiraju dvostruki lanac u kojem je svaka baza dvostrukog lanca vezana za komplementarnu bazu Watson-Crickovim sparivanjem. "Suštinska" ili "dovoljna" komplementarnost znači da sekvenca u jednom lancu nije potpuno i/ili savršeno komplementarna sa sekvencom naspramnog lanca, ali da se između baza na dva lanca uspostavlja dovoljno veza da bi se formirao stabilan hibridni kompleks u setu uslova hibridizacije (npr., koncentracija soli i temperatura). Takvi uslovi mogu da se predvide korišćenjem sekvenci i standardnih matematičkih izračunavanja za predviđanje Tm hibridizovanih lanaca, ili empirijskim određivanjem Tm korišćenjem rutinskih metoda. Tm označava temperaturu na kojoj je 50% populacije hibridizacionih kompleksa formiranih između dva lanca nukleinske kiseline denaturisano. Na temperaturi ispod Tm, favorizovano je formiranje hibridizacionog kompleksa, dok je na temperaturi iznad Tm, favorizovano topljenje ili razdvajanje lanaca u hibridizacionom kompleksu. Za nukleinsku kiselinu koja ima poznati sadržaj G+C u vodenom rastvoru 1 M NaCl, Tm može da se proceni korišćenjem, npr., Tm=81.5+0.41(% G+C), mada drugi poznati načini izračunavanja Tm uzimaju u obzir strukturne karakteristike nukleinske kiseline.

[0093] Izraz "uslovi hibridizacije" označava kumulativno okruženje u kojem se jedan lanac nukleinske kiseline vezuje sa drugim lancem nukleinske kiseline interakcijama komplementarnih lanaca i vodoničnim vezama za uspostavljanje hibridizacionog kompleksa. Takvi uslovi uključuju hemijske komponente i njihove koncentracije (npr., soli, helirajuća sredstva, formamid) u vodenom ili organskom rastvoru koji sadrži nukleinske kiseline, i temperaturu mešavine. Drugi faktori, kao što su dužina vremena inkubiranja ili dimenzije reakcione komore, takođe mogu doprineti okruženju (npr., Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2.sup.nd ed., pp. 1.90-1.91, 9.47-9.51, 1 1.47-11.57 (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989)).

[0094] Hibridizacija zahteva da dve nukleinske kiseline sadrže komplementarne sekvence, mada su moguća i nepodudaranja između baza. Uslovi pogodni za hibridizovanje dveju nukleinskih kiselina zavise od dužine nukleinskih kiselina i stepena komplementarnosti, varijabli koje su dobro poznate u struci. Što je veći stepen komplementarnosti između dveju sekvenci nukleinske kiseline, veća je vrednost temperature topljenja (Tm) za hibride nukleinskih kiselina koje imaju te sekvence. Za hibridizaciju između nukleinskih kiselina sa kratkim nizovima komplementarnosti (npr. komplementarnost duž 35 ili manje, 30 ili manje, 25 ili manje, 22 ili manje, ili manje, ili 18 ili manje nukleotida), pozicija nepoklapanja postaje važna (vidi Sambrook et al., gore, 11.7-11.8). Tipično, dužina nukleinske kiseline koja može da se hibridizuje iznosi najmanje oko 10 nukleotida. Ilustrativne minimalne dužine nukleinske kiseline koja može da se hibridizuje su: najmanje oko 15 nukleotida; najmanje oko 20 nukleotida; najmanje oko 22 nukleotida; najmanje oko 25 nukleotida; i najmanje oko 30 nukleotida). Pored toga, temperatura i koncentracija soli rastvora za ispiranje mogu se po potrebi podesiti u skladu sa faktorima kao što su dužina regiona komplementarnosti i stepen komplementarnosti.

[0095] Sekvenca nukleotida ne mora biti 100% komplementarna sa sekvencom njene ciljne nukleinske kiseline da bi moglo doći do specifične hibridizacije. Štaviše, polinukleotid može da se hibridizuje duž jednog ili više segmenata tako da umetnuti ili susedni segmenti ne budu uključeni u hibridizaciju (npr., struktura petlje ili struktura ukosnice). Polinukleotid (npr., gRNK) može imati najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 99%, ili 100% sekvencione komplementarnosti sa ciljnim regionom u okviru ciljne sekvence nukleinske kiseline koju cilja. Na primer, gRNK u kojoj je 18 od 20 nukleotida gRNK komplementarno sa ciljnim regionom, i koja se, dakle, specifično hibridizuje, imala bi komplementarnost od 90 procenata. U ovom primeru, preostali nekomplementarni nukleotidi mogu biti grupisani ili umetnuti između komplementarnih nukleotida i ne moraju biti kontinuirani jedan sa drugim ili sa komplementarnim nukleotidima. Procenat komplementarnosti između određenih nizova nukleinsko-kiselinskih sekvenci u nukleinskim kiselinama može se odrediti rutinski korišćenjem BLAST programa (basic local alignment search tools, osnovni alati za ispitivanje poravnavanja) i PowerBLAST programa, poznatih u struci (Altschul et al., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403-410; Zhang and Madden, Genome Res., 1997, 7, 649-656) ili korišćenjem Gap programa (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wis.), uz upotrebu zadatih parametara, koji koristi algoritam Smitha i Watermana (Adv. Appl. Math., 1981, 2, 482-489).

[0096] Protein-vezujući segment predmetne gRNK interaguje sa Cas proteinom. Predmetna gRNK usmerava vezani polipeptid ka specifičnoj nukleotidnoj sekvenci u okviru ciljne DNK putem DNK-ciljajućeg segmenta. Protein-vezujući segment predmetne gRNK može uključivati dva niza nukleotida koji su komplementarni jedan sa drugim. Komplementarni nukleotidi protein-vezujućeg segmenta hibridizuju se da formiraju dvolančanu RNK (dsRNK). Protein-vezujući segment predmetne gRNK interaguje sa Cas proteinom, i gRNK usmerava vezani Cas protein ka specifičnoj nukleotidnoj sekvenci u okviru ciljne DNK putem DNK-ciljajućeg segmenta.

[0097] U određenim primerima izvođenja, gRNK opisana u ovom tekstu uključuje dva odvojena molekula RNK. Svaki od dva molekula RNK sadrži niz nukleotida koji su komplementarni jedan sa drugim tako da se komplementarni nukleotidi iz dva RNK molekula hibridizuju da bi formirali dvolančanu RNK (npr., ukosnica) protein-vezujućeg segmenta. Predmetna gRNK može uključivati bilo koji odgovarajući crRNK i tracrRNK par. U metodima opisanim u ovom tekstu, gRNK može da se koristi kao kompleks (npr. gRNK-Cas kompleks) crRNK i tracrRNK ili crRNK i odgovarajuća tracrRNK mogu da se dostave zasebno. Na primer, ako se više gRNK koristi za reakciju sečenja, pojedinačne crRNK specifične za svako ciljno mesto mogu da se dostave odvojeno od standardne tracrRNK koja može da se kompleksuje sa svakom crRNK. U takvom metodu, crRNK mogu da se kompleksuju sa standardnom tracrRNK sa ciljem usmeravanja Cas proteina ka ciljnom mestu.

[0098] Vodičke RNK mogu sadržati modifikacije ili sekvence koje obezbeđuju dodatne poželjne osobine (npr., modifikovanu ili regulisanu stabilnost; subćelijsko usmeravanje; praćenje uz fluorescentni obeleživač; mesto vezivanja za protein ili proteinski kompleks; i slično). Neograničavajući primeri takvih modifikacija uključuju, na primer, 5’ cap (npr., 7-metilguanilat cap (m7G)); 3’ poliadenilisani rep (tj., 3’ poli(A) rep); riboswitch sekvencu (npr., da se omogući regulisana stabilnost i/ili regulisana mogućnost pristupa proteinima i/ili proteinskim kompleksima); sekvencu kontrole stabilnosti; sekvencu koja formira dsRNK (tj., ukosnicu)); modifikaciju ili sekvencu koja upućuje RNK ka mestu unutar ćelije (npr., nukleus, mitohondrija, hloroplasts, i slično); modifikaciju ili sekvencu koja obezbeđuje praćenje (npr., direktnom konjugacijom sa fluorescentnim molekulom, konjugacijom sa komponentom koja olakšava detektovanje fluorescencije, sekvencu koja omogućava detektovanje fluorescencije, i tako dalje); modifikaciju ili sekvencu koja obezbeđuje mesto vezivanja za proteine (npr., proteine koji deluju na DNK, uključujući aktivatore transkripcije, represore transkripcije, DNK metiltransferaze, DNK demetilaze, histon acetiltransferaze, histon deacetilaze, i slično); i njihove kombinacije.

[0099] Vodičke RNK mogu biti obezbeđene u bilo kojoj formi. Na primer, gRNK može biti obezbeđena u obliku RNK, u vidu dva molekula (odvojena crRNK i tracrRNK) ili u vidu jednog molekula (sgRNK), i opciono u obliku kompleksa sa Cas proteinom. gRNK može biti obezbeđena u obliku DNK koja kodira RNK. DNK koja kodira gRNK može kodirati jedan molekul RNK (sgRNK) ili odvojene molekule RNK (npr., odvojenu crRNK i tracrRNK). U drugom slučaju, DNK koja kodira gRNK može biti obezbeđena u vidu odvojenih DNK molekula koji kodiraju crRNK, odnosno tracrRNK.

[0100] DNK koje kodiraju gRNK mogu biti stabilno integrisane u genom ćelije i operabilno povezane sa promotorom aktivnim u ćeliji. Alternativno, DNK koje kodiraju gRNK mogu biti operabilno povezane sa promotorom u ekspresionom konstruktu. Na primer, DNK koja kodira gRNK može biti u ciljajućem vektoru koji uključuje nukleinsko-kiselinski insert i/ili vektoru koji uključuje nukleinsku kiselinu koja kodira Cas protein, ili može biti u vektoru ili plazmidu koji je odvojen od ciljajućeg vektora koji uključuje nukleinsko-kiselinski insert i/ili odvojena od vektora koji uključuje nukleinsku kiselinu koja kodira Cas protein. Takvi promotori mogu biti aktivni, na primer, u pluripotentnim ćelijama pacova, eukariota, sisara, nehumanog sisara, čoveka, glodara, miša ili hrčka. Takvi promotori mogu biti, na primer, uslovni promotori, inducibilni promotori, konstitutivni promotori, ili tkivno-specifični promotori. U nekim slučajevima, promotor je promotor RNK polimeraze III, na primer humani U6 promotor, U6 promotor polimeraze III pacova ili mišji U6 promotor polimeraze III. Primeri drugih promotora opisani su na drugom mestu u ovom tekstu. Kada se DNK koja kodira gRNK uvede u ćeliju, gRNK može prolazno, uslovno ili konstitutivno da se eksprimira u ćeliji.

[0101] Alternativno, gRNK se mogu pripremiti različitim drugim metodima. Na primer, gRNK se mogu pripremiti in vitro transkripcijom uz korišćenje, na primer, T7 RNK polimeraze (vidi, na primer, WO 2014/089290 i WO 2014/065596). Vodičke RNK mogu biti predstavljene sintetski proizvedenim molekulom pripremljenim hemijskom sintezom.

C. CRISPR RNK sekvence prepoznavanja

[0102] Izraz "CRISPR RNK sekvenca prepoznavanja" uključuje sekvence nukleinske kiseline prisutne u ciljnoj DNK za koje će se DNK-ciljajući segment gRNK vezati, uz uslov da postoje dovoljni uslovi za vezivanje. Na primer, CRISPR RNK sekvence prepoznavanja uključuju sekvence za koje je vodička RNK dizajnirana da bude komplementarna, gde hibridizacija između CRISPR RNK sekvence prepoznavanja i DNK-ciljajuće sekvence pokreće formiranje CRISPR kompleksa. Puna komplementarnost nije neophodna, pod uslovom da postoji dovoljna komplementarnost da dovede do hibridizacije i pokrene formiranje CRISPR kompleksa. CRISPR RNK sekvence prepoznavanja uključuju i mesta sečenja za Cas proteine, opisana detaljnije u nastavku. CRISPR RNK sekvenca prepoznavanja može uključivati bilo koji polinukleotid koji može biti smeštenm na primer, u nukleusu ili citoplazmi ćelije ili u organeli ćelije, na primer u mitohondriji ili hloroplastu.

[0103] CRISPR RNK sekvenca prepoznavanja unutar ciljne DNK može da bude ciljana (tj., da bude vezana, ili hibridizovana ili komplementarna sa) Cas proteinom ili gRNK. Pogodni uslovi za vezivanje DNK/RNK uključuju fiziološke uslove normalno prisutne u ćeliji. Drugi pogodni uslovi za vezivanje DNK/RNK (npr., uslovi u sistemu bez ćelija) poznati su u struci (vidi, npr., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed. (Sambrook et al., Harbor Laboratory Press 2001)). Lanac ciljne DNK koji je komplementaran i hibridizuje se sa Cas proteinom ili gRNK može se nazvati "komplementarni lanac", a lanac ciljne DNK koji je komplementaran sa "komplementarnim lancem" (i, dakle, nije komplementaran sa Cas proteinom ili gRNK) može se nazvati "nekomplementarni lanac" ili "templatni lanac".

[0104] Cas protein može da seče nukleinsku kiselinu na mestu unutar ili izvan sekvence nukleinske kiseline prisutne u ciljnoj DNK za koju će se vezati DNK-ciljajući segment gRNK. "Mesto sečenja" uključuje poziciju nukleinske kiseline na kojoj Cas protein proizvodi jednolančani prekid ili dvolančani prekid. Na primer, formiranje CRISPR kompleksa (koji uključuje gRNK hibridizovanu sa CRISPR RNK sekvencom prepoznavanja i kompleksovanu sa Cas proteinom) može rezultovati sečenjem jednog ili oba lanca na mestu ili blizu (npr., unutar 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 50, ili više baznih parova od) sekvence nukleinske kiseline prisutne u ciljnoj DNK za koju će se DNK-ciljajući segment gRNK vezati. Ako je mesto sečenja izvan sekvence nukleinske kiseline za koju će se DNK-ciljajući segment gRNK vezati, i dalje se smatra da se mesto sečenja nalazi unutar "CRISPR RNK sekvence prepoznavanja". Mesto sečenja može biti samo na jednom lancu ili na oba lanca nukleinske kiseline. Mesta sečenja mogu biti na istoj poziciji na oba lanca nukleinske kiseline (proizvodeći tupe krajeve) ili mogu biti na različitim mestima na svakom lancu (proizvodeći lepljive krajeve). Lepljivi krajevi mogu se proizvesti, na primer, korišćenjem dva Cas proteina, od kojih svaki proizvodi jednolančani prekid na različitom mestu sečenja na svakom lancu, čime se proizvodi dvolančani prekid. Na primer, prva nikaza može da napravi jednolančani prekid na prvom lancu dvolančane DNK (dsDNK), i druga nikaza može da napravi jednolančani prekid na drugom lancu dsDNK tako da se naprave prepusne sekvence. U nekim slučajevima, CRISPR RNK sekvenca prepoznavanja nikaze na prvom lancu odvojena je od CRISPR RNK sekvence prepoznavanja nikaze na drugom lancu sa najmanje 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 75, 100, 250, 500, ili 1000 baznih parova.

[0105] Za mesto specifično sečenje ciljne DNK putem Cas9 može se desiti na lokacijama određenim i (i) komplementarnošću sparivanja baza gRNK i ciljne DNK i (ii) kratkim motivom, nazvanim protospejser susedni motiv (PAM), u ciljnoj DNK. PAM može bočno ograničiti CRISPR RNK sekvencu prepoznavanja. Opciono, CRISPR RNK sekvenca prepoznavanja može biti bočno ograničena sa PAM. Na primer, mesto sečenja putem Cas9 može biti oko 1 do oko 10 ili oko 2 do oko 5 baznih parova (npr., 3 bazna para) ushodno ili nishodno od PAM sekvence. U nekim slučajevima (npr., kada se koristi Cas9 iz S. pyogenes ili blisko srodan Cas9), PAM sekvenca nekomplementarnog lanca može biti 5’-N1GG-3’, pri čemu je N1bilo koji DNK nukleotid i neposredno je 3’ od CRISPR RNK sekvence prepoznavanja nekomplementarnog lanca ciljne DNK. Kao takva, PAM sekvenca komplementarnog lanca bila bi 5’-CC N2-3’, gde je N2bilo koji DNK nukleotid i neposredno je 5’ od CRISPR RNK sekvence prepoznavanja komplementarnog lanca ciljne DNK. U nekim takvim slučajevima, N1i N2mogu biti komplementarni i N1- N2bazni par može biti bilo koji bazni par (npr., N1=C i N2=G; N1=G i N2=C; N1=A i N2=T, N1=T, i N2=A).

[0106] Primeri CRISPR RNK sekvenci prepoznavanja uključuju DNK sekvencu komplementarnu sa DNK-ciljajućim segmentom gRNK, ili takvu DNK sekvenca u dodatku PAM sekvence. Na primer, ciljni motiv može biti DNK sekvenca od 20 nukleotida koja neposredno prethodi NGG motivu koji prepoznaje Cas protein, na primer GN19NGG (SEQ ID NO: 8) ili N20NGG (SEQ ID NO: 24) (vidi, na primer, WO 2014/165825). Guanin na 5’ kraju može olakšati transkripciju RNK polimerazom u ćelijama. Drugi primeri CRISPR RNK sekvenci prepoznavanja mogu uključivati dva guaninska nukleotida na 5’ kraju (npr., GGN20NGG; SEQ ID NO: 25) za olakšanje efikasnosti transkripcije T7 polimerazom in vitro. Vidi, na primer, WO 2014/065596. Druge CRISPR RNK sekvence prepoznavanja mogu imati 4-22 nukleotida dužine SEQ ID NO: 8, 24, i 25, uključujući 5’ G ili GG i 3’ GG ili NGG. I druge CRISPR RNK sekvence prepoznavanja mogu imati između 14 i 20 nukleotida dužine SEQ ID NO: 8, 24, i 25.

[0107] CRISPR RNK sekvenca prepoznavanja može biti bilo koja sekvenca nukleinske kiseline endogena ili egzogena za ćeliju. CRISPR RNK sekvenca prepoznavanja može biti sekvenca koja kodira genski proizvod (npr., protein) ili nekodirajuća sekvenca (npr., regulatorna sekvenca) ili može uključiti oba.

[0108] U jednom primeru izvođenja, Cas protein je Cas protein tipa I. U jednom primeru izvođenja, Cas protein je Cas protein tipa II. U jednom primeru izvođenja, Cas protein tipa II je Cas9. U jednom primeru izvođenja, prva sekvenca nukleinske kiseline kodira humani kodon-optimizovani Cas protein.

[0109] U jednom primeru izvođenja, gRNK uključuje sekvencu nukleinske kiseline koja kodira crRNK i tracrRNK. U specifičnim primerima izvođenja, Cas protein je Cas9. U nekim

4

primerima izvođenja, gRNK uključuje (a) himernu RNK nukleinsko-kiselinske sekvence 5’-GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUU GAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU-3’ (SEQ ID NO: 1); ili, (b) himernu RNK nukleinsko-kiselinske sekvence 5’-GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAA GGCUAGUCCG-3’ (SEQ ID NO: 2). U sledećem primeru izvođenja, crRNK uključuje 5’-GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAU-3’ (SEQ ID NO: 3); 5’-GUUUUAGAG CUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAG (SEQ ID NO: 4); ili 5’-GAGUCCGAGCAGAA GAAGAAGUUUUA-3’ (SEQ ID NO: 5). U drugim primerima izvođenja, tracrRNK uključuje 5’-AAGGCUAGUCCG-3’ (SEQ ID NO: 6) ili 5’-AAGGCUAGUCCGUUAUCAAC UUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU-3’ (SEQ ID NO: 7).

V. Sastavljanje polinukleotida

[0110] Metodima objavljenim u ovom tekstu mogu se sastaviti najmanje dve nukleinske kiseline pod uslovima efikasnim za spajanje DNK molekula da se formira suštinski intaktni ili bešavni dvolančani DNK molekul. Svaka nukleinska kiselina od interesa, koja ima preklapajuće sekvence može se sastaviti prema metodima objavljenim u ovom tekstu. Na primer, može se sastaviti svaki DNK molekul od interesa, koji ima preklapajuće sekvence, uključujući DNK koje se prirodno sreću, klonirane DNK molekule, sintetski stvorene DNK itd. Spojeni DNK molekuli mogu, po želji, biti klonirani (npr., insertovani) u vektor korišćenjem metoda pronalaska. Sastavljanje dveju nukleinskih kiselina uključuje bilo koji metod spajanja lanaca dveju nukleinskih kiselina. Na primer, sastavljanje uključuje spajanje digestiranih nukleinskih kiselina tako što se lanci iz svake nukleinske kiseline sparuju sa onim drugim i produžavanje, gde svaki lanac služi kao templat za produžavanje onog drugog.

[0111] U nekim primerima izvođenja, nukleinske kiseline se spajaju sa spojnim oligonukleotidom tako što se svaka nukleinska kiselina sastavlja sa spojnim oligonukleotidom umesto da se sastavljaju direktno. Sastavljanje sa spojnim oligonukleotidom može pozicionirati nukleinsko-kiselinske baze nukleinskih kiselina koje su sastavljene a koje nisu deo nukleinskih kiselina koje treba da se sastave, nego su deo spojnog oligonukleotida. Prema tome, nukleinske kiseline mogu biti uspešno sastavljene čak i ako višak baza ostane između nukleinskih kiselina. Alternativno, spojni oligonukleotid može da se koristi za bešavno sastavljanje, pri čemu nema viška baza koje ostaju između nukleinskih kiselina koje treba da se sastave.

[0112] U nekim primerima izvođenja, nukleinske kiseline se mogu pripremiti za sastavljanje sečenjem Cas proteinom, restrikcionim enzimom (restrikcionom endonukleazom) (npr., bilo koja od različitih restrikcionih endonukleaza datih na drugom mestu u ovom tekstu), meganukleazom (npr., bilo koja od različitih meganukleaza datih na drugom mestu u ovom tekstu), ili bilo kojom njihovom kombinacijom. Na primer, jedna od nukleinskih kiselina koja se sastavlja može da se seče Cas proteinom i druga nukleinska kiselina koja se sastavlja može da se seče Cas proteinom, restrikcionim enzimom, meganukleazom ili bilo kojom njihovom kombinacijom. Posle sečenja nukleazom, digestirana nukleinska kiselina može da se sastavi direktno sa drugom digestiranom nukleinskom kiselinom koja ima preklapajuće završne sekvence ili da se sastavi sa nukleinskom kiselinom koja nije bila digestirana, ali ima preklapajuće završne sekvence. Digestirana nukleinska kiselina može da se sastavi sa drugom nukleinskom kiselinom i korišćenjem spojnog oligonukleotida.

[0113] U primerima izvođenja u kojima se koristi nukleazno sredstvo (npr., Cas protein) za proizvodnju preklapajućih završnih sekvenci između dva molekula nukleinske kiseline, mogu se koristiti brzi kombinatorni metodi sastavljanja digestiranih nukleinskih kiselina. Na primer, prva i druga nukleinska kiselina sa preklapajućim krajevima mogu da se kombinuju sa ligazom, egzonukleazom, DNK polimerazom, i nukleotidima i inkubiraju na konstantnoj temperaturi, na primer na 50 °C. Specifično, T5 egzonukleaza može da se koristi za uklanjanje nukleotida sa 5’ krajeva dsDNK proizvodeći komplementarne prepuste. Komplementarni jednolančani DNK prepusti mogu zatim da se sparuju, DNK polimeraza se koristi za popunjavanje procepa, i Taq DNK ligaza se koristi za spajanje dobijenih prekida na 50 °C. Prema tome, dve nukleinske kiseline koje imaju zajedničke preklapajuće završne sekvence mogu da se u jednostepenoj izotermičkoj reakciji spoje u kovalentno povezani molekul. Vidi, na primer, Gibson, et al. (2009) Nature Methods 6(5): 343-345. U nekim primerima izvođenja, proteinaza K ili prečišćavanje fenolom/hloroformom/izoamilalkoholom (phenol/chloroform/isoamylalcohol, PCI) koristi se za uklanjanje nukleaznog sredstva (npr., Cas protein) iz reakcione mešavine. U nekim primerima izvođenja, nukleazno sredstvo (npr., Cas protein) može da se ukloni iz reakcione mešavine prečišćavanjem zasnovanim na koloni od silika gela.

[0114] U određenim primerima izvođenja, metodima objavljenim u ovom tekstu sastavlja se vektor sa linearnim polinukleotidom. U drugim primerima izvođenja, metodima objavljenim u ovom tekstu sklapaju se najmanje dva vektora, na primer dva BAC vektora. Izraz "BAC vektor" uključuje bilo koji bakterijski veštački hromozom. U specifičnim primerima izvođenja, BAC je modifikovan tako da sadrži region sa nukleotidnom sekvencom koja se preklapa sa nukleotidnom sekvencom regiona linearne nukleinske kiseline ili drugog vektora, na primer drugog BAC.

[0115] Prva i druga jednolančana nukleinska kiselina imaju preklapajuće krajeve kada se respektivni krajevi komplementarni jedan sa drugim. Prva i druga dvolančana nukleinska kiselina imaju preklapajuće krajeve kada je 5’ kraj lanca prve nukleinske kiseline komplementaran sa 3’ krajem lanca druge nukleinske kiseline i obrnuto. Na primer, za dvolančane preklapajuće završne sekvence, lanci jedne nukleinske kiseline mogu imati najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99%, ili 100% identičnosti sa odgovarajućim lancem druge nukleinske kiseline. U metodima objavljenim u ovom tekstu, 5’ kraj lanca dsDNK molekula koji će se sastaviti, deli preklapajuće završne sekvence sa 3’ krajem lanca drugog dsDNK molekula. Izraz "preklapajuće završne sekvence" uključuje oba lanca dsDNK molekula. Prema tome, jedan lanac iz preklapajućeg regiona može da se specifično hibridizuje sa svojim komplementarnim lancem kada komplementarni regioni preklapajućih sekvenci postoje u jednolančanim prepustima sa 5’ i 3’ kraja dva polinukleotida koja treba sastaviti. U nekim primerima izvođenja, egzonukleaza se koristi za uklanjanje nukleotida sa 5’ ili 3’ kraja da bi se napravile preklapajuće završne sekvence. U nekim primerima izvođenja, preklapajući region prve i/ili druge nukleinske kiseline ne postoji na 5’ ili 3’ kraju do posle digestije Cas proteinom. Znači, preklapajući region može biti unutrašnji region koji se posledično konvertuje u preklapajuću završnu sekvencu posle digestije nukleinske kiseline/nukleinskih kiselina koje sadrže unutrašnji preklapajući region, Cas proteinom. Cas protein može seći na ciljnom mestu (npr., mestu sečenja) unutar preklapajućeg regiona ili izvan preklapajućeg regiona.

[0116] Dužina preklapajućeg regiona poželjno je dovoljna tako da se region sreće samo jednom unutar bilo koje nukleinske kiseline koja se sklapa. Na taj način, sprečava se sparivanje drugih polinukleotida sa završnim sekvencama i sastavljanje može da bude specifično za ciljne nukleinske kiseline. Dužina preklapajućeg regiona može da varira od najmanje oko 10 baznih parova (bp) do oko 300 bp ili više. Uopšteno, poželjno je da dužina preklopa bude manja ili jednaka sa približnom veličinom polinukleotida sa kojim će se kombinovati, ali ne manja od oko 10 bp i ne veća od oko 1000 bp. Za spajanje 2 ili 3 polinukleotida, preklop od oko 20-30 bp može biti dovoljan. Za više od 10 fragmenata, poželjan preklop je oko 80 bp do oko 300 bp. U jednom primeru izvođenja, preklapajući region ima dužinu koja mu omogućava da se brzo napravi sintetskim metodima, npr., oko 40 bp. U specifičnim primerima izvođenja, dužina preklapajućeg regiona može biti oko 20-200 bp. Preklopi mogu biti dugi oko 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300,

4

350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 ili 1000 bp. U nekim primerima izvođenja, dužina preklapajućeg regiona je od 20 do 200 bp. U specifičnim primerima izvođenja metoda objavljenih u ovom tekstu mogu da se sastave najmanje dva polinukleotida, gde je preklapajući region na najmanje jednom od polinukleotida napravljen dovođenjem u kontakt sa nukleaznim sredstvom (npr., gRNK-Cas kompleksom). Na primer, endonukleazna digestija prvog polinukleotida može stvoriti sekvence koje se preklapaju sa završnim sekvencama drugog polinukleotida, pri čemu se zatim sastavljaju preklapajuće završne sekvence.

[0117] U metodima objavljenim u ovom tekstu, preklapajuće sekvence mogu biti dovedene u kontakt sa egzonukleazom da bi se izložile komplementarne sekvence (npr., komplementarne jednolančane sekvence) preklapajućih sekvenci. Digestija egzonukleazom obavlja se pod uslovima koji su efikasni za uklanjanje ("chew back", "žvakanje") dovoljnog broja nukleotida da se omogući specifično sparivanje izloženih jednolančanih regiona komplementarnosti. Uopšteno, deo regiona preklopa ili ceo region preklopa se "sažvaće", ostavljajući prepuste koji uključuju deo regiona preklopa ili ceo region preklopa. U nekim metodima, egzonukleazna digestija može da se izvrši polimerazom u odsustvu dNTP (npr., T5 DNK polimeraza) dok u drugim metodima, egzonukleazna digestija može da se izvrši egzonukleazom kojoj nedostaje polimerazna aktivnost (npr., egzonukleaza III), u prisustvu dNTP.

[0118] U metodima objavljenim u ovom tekstu, može se koristiti bilo koja od različitih 5’ ka 3’, dvolančano-specifičnih egzodeoksiribonukleaza da se "sažvaću" krajevi nukleinskih kiselina. Izraz "5’ egzonukleaza" se ponekad koristi u ovom tekstu da se označi 5’ ka 3’ egzodeoksiribonukleaza. "Neobradiva" egzonukleaza, kako se koristi u ovom tekstu, je egzonukleaza koja degradira ograničen broj (npr., samo nekoliko) nukleotida tokom svakog vezivanja sa DNK. Digestija 5’ egzonukleazom daje 3’ jednolančane prepuste u DNK molekulima. Među drugim osobinama poželjnim za 5’ egzonukleazu su to što nema 3’ egzonukleaznu aktivnost, generiše 5’ fosfatne krajeve, i inicira degradaciju i sa 5’-fosforilisanog i sa nefosforilisanog kraja. Poželjno je i to da enzim može da otpočne digestiju sa 5’ kraja molekula, bilo da je to tupi kraj, ili da ima mali 5’ ili 3’ udubljeni kraj. Koje su pogodne egzonukleaze, biće jasno stručnjaku u oblasti. One uključuju, npr., egzonukleazu faga T5 (proizvod gena D15 faga T5), egzonukleazu faga lambda, RecE profaga Rac, egzonukleazu VIII iz E. coli, egzonukleazu faga (proizvod gena 6 faga T7), ili bilo koju od različitih 5’ egzonukleaza koje su uključene u reakcije homologe rekombinacije. U jednom primeru izvođenja, egzonukleaza je T5 egzonukleaza ili lambda egzonukleaza. U drugom primeru izvođenja, egzonukleaza je T5 egzonukleaza. U sledećem primeru izvođenja, egzonukleaza nije egzonukleaza faga T7. Metodi pripremanja i korišćenja egzonukleaza i drugih enzima koji se upotrebljavaju u metodima pronalaska su konvencionalni; i mnogi su dostupni iz komercijalnih izvora, kao na primer USB Corporation, 26111 Miles Road, Cleveland, Ohio 44128, ili New England Biolabs, Inc. (NEB), 240 County Road, Ipswich, Mass. 01938-2723.

[0119] Posebno, u primerima izvođenja u kojima je region preklopa veoma dug, može biti potrebno da se "sažvaće" samo deo regiona (npr., više od polovine regiona preklopa), uz uslov da tako nastali jednolančani prepusti budu zadovoljavajuće dužine i sadržaja baza za specifično sparivanje pod uslovima reakcije. Izraz "specifično sparivanje" uključuje situacije u kojima će se određeni par jednolančaih prepusta sparivati preferencijalno (ili isključivo) jedan sa drugim, umesto sa drugim jednolančanim prepustima (npr., nekomplementarnim prepustima) prisutnim u reakcionoj mešavini. "Preferencijalno" znači da će se najmanje oko 95% prepusta spariti sa komplementarnim prepustom. Stručnjak u oblasti će lako odrediti optimalnu dužinu za postizanje specifičnog sparivanja sekvence od interesa pod datim skupom reakcionih uslova. Obično, homologi regioni preklopa (jednolančani prepusti ili njihovi komplementi) sadrže identične sekvence. Međutim, mogu se upotrebiti delimično identične sekvence, uz uslov da jednolančani prepusti mogu specifično da se spare pod uslovima reakcija.

[0120] U određenim primerima izvođenja, nukleazno sredstvo (npr., Cas protein) može da napravi jednolančane prekide (tj., "useke", "nicks") na ciljnom mestu bez sečenja oba lanca dsDNK. "Nikaza" uključuje nukleazno sredstvo (npr., Cas protein) koje pravi useke u dsDNK. Na ovaj način, dva odvojena nukleazna sredstva (npr., Cas proteini) (npr., nikaze) specifična za ciljno mesto na svakom lancu dsDNK mogu napraviti prepusne sekvence komplementarne sa prepusnim sekvencama na drugoj nukleinskoj kiselini, ili odvojenom regionu na istoj nukleinskoj kiselini. Prepusni krajevi napravljeni dovođenjem u kontakt nukleinske kiseline sa dve nikaze specifične za ciljna mesta na oba lanca dsDNK mogu biti 5’ ili 3’ prepusni krajevi. Na primer, prva nikaza može da napravi jednolančani prekid na prvom lancu dsDNK, dok druga nikaza može da napravi jednolančani prekid na drugom lancu dsDNK tako da se naprave prepusne sekvence. Ciljna mesta svake nikaze koja stvara jednolančani prekid mogu se odabrati tako da napravljene prepusne završne sekvence budu komplementarne sa prepusnim završnim sekvencama na drugoj nukleinskoj kiselini. Prema tome, komplementarni prepusni krajevi prve i druge nukleinske kiseline mogu da se spare metodima objavljenim u ovom tekstu. U nekim primerima izvođenja, ciljno mesto nikaze na

4

prvom lancu različito je od ciljnog mesta nikaze na drugom lancu. Različita ciljna mesta na različitim lancima dsDNK za rezultat imaju jednolančane prekide razdvojene sa najmanje 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 75, 100, 250, 500, ili 1000 baznih parova.

[0121] U određenim primerima izvođenja, druga nukleinska kiselina se takođe dovodi u kontakt sa prvom nikazom koja pravi usek na prvom ciljnom mestu na drugoj nukleinskoj kiselini i nikazom koja pravi usek na drugom ciljnom mestu na molekulu druge nukleinske kiseline. Prepusne završne sekvence napravljene usecima na dva različita mesta na drugoj nukleinskoj kiselini mogu biti komplementarne sa prepusnim završnim sekvencama napravljenim usecima na dva različita mesta na prvoj nukleinskoj kiselini tako da se komplementarne prepusne završne sekvence sparuju.

[0122] U nekim primerima izvođenja, nukleinsko-kiselinska sekvenca gena od interesa pruža se duž dva ili više BAC. U takvim slučajevima, korišćenjem metoda datih u ovom tekstu, specifično dizajnirana nukleazna sredstva mogu da seku dva ili više BAC na željenim mestima i dobijeni fragmenti nukleinske kiseline se spajaju da formiraju sekvencu gena od interesa.

[0123] U nekim primerima izvođenja, prepusni završeci napravljeni usecima na različitim ciljnim mestima na oba lanca prve nukleinske kiseline nisu komplementarni sa prepusnim završecima napravljenim usecima na različitim ciljnim mestima na oba lanca druge nukleinske kiseline. U drugim primerima izvođenja, nukleinske kiseline koje treba da se spoje nemaju komplementarne krajeve tako da je potrebna zasebna nukleinska kiselina da bi se spojili nekomplementarni krajevi. Spojni oligonukleotid može da se upotrebi za spajanje nekomplementarnih krajeva dveju nukleinskih kiselina. Spojni oligonukleotid sadrži komplementarne ručice koje uključuju polinukleotid ili nukleinsku kiselinu sa sekvencom komplementarnom sa krajevima različitog polinukleotida ili nukleinske kiseline. U nekim primerima izvođenja, spojni oligonukleotide ima ručicu komplementarnu sa prvom nukleinskom kiselinom na 5’ kraju, centralni deo (spejser), i ručicu koja je komplementarna sa drugom nukleinskom kiselinom na 3’ kraju. Prema tome, nukleinske kiseline koje imaju završne sekvence koje nisu komplementarne jedna sa drugom mogu da se spoje sparivanjem svake nukleinske kiseline sa istim spojnim oligonukleotidom, posle tretmana egzonukleazom. U specifičnim primerima izvođenja, spojni oligonukleotid ima prvu ručicu komplementarnu sa 5’ ili 3’ završnom sekvencom prve digestirane nukleinske kiseline i drugu ručicu komplementarnu sa 5’ ili 3’ sekvencom druge digestirane nukleinske kiseline. Spojni oligonukleotid može da spoji nekomplementarne završne sekvence koje su tupe ili imaju 5’ ili 3’ prepusnu sekvencu.

4

[0124] Dužina sekvenci komplementarne ručice spojnog oligonukleotida trebalo bi da bude dovoljna da se spari sa nukleinskim kiselinama koje će se spojiti posle tretmana egzonukleazom. Na primer, dužina sekvenci komplementarne ručice spojnog oligonukleotida može iznositi najmanje oko 10, 20, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150 bp ili više. U specifičnim primerima izvođenja, komplementarna ručica je duga 15-120 bp, 20-100 bp, 30-90 bp, 30-60 bp, ili 20-80 bp. U jednom specifičnom primeru izvođenja, dužina sekvenci komplementarne ručice spojnog oligonukleotida je 40 bp. Svaka komplementarna ručica spojnog oligonukleotida može biti različite dužine. Spejser iz spojnog oligonukleotida, između završnih sekvenci komplementarnih sa nukleinskim kiselinama koje treba da se sastave, može biti dug najmanje oko 20 bp, 30 bp, 35 bp, 40 bp, 45 bp, 50 bp, 55 bp, 60 bp, 65 bp, 70 bp, 75 bp, 80 bp, 90 bp, 100 bp, 250 bp, 500 bp, 750 bp, 1000 bp, 2000 bp, 3000 bp, 4000 bp, 5000 bp, 8000 bp, 10 kb, 15 kb, 20 kb, ili više. Na primer, spejser iz spojnog oligonukleotida može uključivati BAC vektor ili LTVEC. U nekim primerima izvođenja, spejser iz spojnog oligonukleotida može biti dizajniran tako da sadrži sekvence specifične za detekciju ili sekvence pogodne za PCR kako bi se potvrdilo uspešno spajanje. U nekim primerima izvođenja, spejser iz spojnog oligonukleotida može biti dizajniran tako da uvede jedno ili više mesta za restrikcione enzime. U nekim primerima izvođenja, spejser iz spojnog oligonukleotida može biti dizajniran tako da uvede gen za rezistenciju na lek ili reporterski gen. U drugim primerima izvođenja, spejser može sadržati najmanje 20 bp iz završnog dela nukleinske kiseline koja će se spojiti, sa ciljem bešavnog spajanja nukleinskih kiselina. Na primer, za bešavno spajanje spejser treba da bude dug oko 45 bp.

[0125] U nekim primerima izvođenja, molarni odnos nukleinske kiseline prema spojnom oligonukleotidu/oligonukleotidima može iznositi od oko 1:1 do oko 1:200. U nekim primerima izvođenja, molarni odnos nukleinske kiseline prema spojnom oligonukleotidu/oligonukleotidima je oko 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19, 1:20, 1:30, 1:40, 1:50, 1:60, 1:70, 1:80, 1:90, 1:100, 1:120, 1:140, 1:160, 1:180, ili 1:200. U specifičnim primerima izvođenja, molarni odnos nukleinske kiseline prema spojnom oligonukleotidu/oligonukleotidima može iznositi od oko 1:6 do oko 1:20. U jednom primeru izvođenja, molarni odnos je oko 1:6. U drugom primeru izvođenja, molarni odnos je oko 1:20.

[0126] U specifičnim primerima izvođenja, spojni oligonukleotid se koristi za bešavno spajanje najmanje dve nukleinske kiseline. "Bešavno" spajanje odnosi se na spajanje dveju nukleinskih kiselina gde nema umetnutih nukleinsko-kiselinskih baza između susednih krajeva nukleinskih kiselina koje će se spojiti. Na primer, bešavno spojene nukleinske kiseline

4

nemaju nuklelinsko-kiselinske baze koje nisu deo nukleinskih kiselina koje se spajaju. Da bi se bešavno spojile dve nukleinske kiseline, spejser iz spojnog oligonukleotida trebalo bi da uključuje sekvencu nukleinske kiseline koja je identična sa završnim delom prve ili druge nukleinske kiseline koja treba da bude spojena. Ovaj završni deo trebalo bi da bude uklonjen sa nukleinske kiseline pre spajanja sa spojnim oligonukleotidom. Na primer, završni deo može da se seče nukleaznim sredstvom (npr., gRNK-Cas kompleks) na najmanje 20 bp od završetka nukleinske kiseline, na primer najmanje 40 bp ili najmanje 45 bp od završetka nukleinske kiseline. Alternativno, završni deo može da se seče nukleaznim sredstvom (npr., gRNK-Cas kompleks) najmanje 2, najmanje 4, najmanje 6, najmanje 8, najmanje 10, najmanje 12, najmanje 15, najmanje 20, najmanje 25, najmanje 30, najmanje 35, najmanje 37, najmanje 40, najmanje 42, najmanje 45, najmanje 48, najmanje 50, najmanje 55, najmanje 60, najmanje 65, najmanje 70, najmanje 80, najmanje 100, najmanje 110, najmanje 120, najmanje 130, najmanje 140, najmanje 150 bp od završetka nukleinske kiseline koja će biti spojena.

[0127] U jednom primeru izvođenja, spojni oligonukleotid može uključivati od 5’ kraja do 3’ kraja: preklop od oko 15-120 bp sa 5’ nukleinskom kiselinom, oko 20-50 bp 3’ završnog regiona 5’ nukleinske kiseline, i preklop od oko 15-120 bp sa 3’ nukleinskom kiselinom. U jednom primeru izvođenja, spojni oligonukleotid može uključivati od 5’ kraja do 3’ kraja: preklop od oko 15-120 bp sa 5’ nukleinskom kiselinom, oko 20-50 bp 5’ završnog regiona 3’ nukleinske kiseline, i preklop od oko 15-120 bp sa 3’ nukleinskom kiselinom. Dakle, kada se spojni oligonukleotid spoji sa prvom i drugom nukleinskom kiselinom, spejser iz spojnog oligonukleotida rekonstituiše deo koji je uklonjen iz nukleinske kiseline pre spajanja. Vidi, SL. 5 i SL.6. Izraz "rekonstituiše" uključuje zamenu završnog dela nukleinske kiseline koji je isečen sa ciljem obezbeđivanja potpuno sastavljene nukleinske kiseline kada se sastavi sa spojnim oligonukleotidom. Na primer, rekonstituisanjem isečene nukleinske kiseline zamenjuje se isečeni deo nukleinske kiseline nukleinskom kiselinom uključenom u spejser spojnog oligonukleotida, koja ima identičnu sekvencu kao isečeni deo.

[0128] Spojni oligonukleotid može biti sastavljen sa molekulom prve i druge nukleinske kiseline istovremeno ili sekvencijalno. Kada je sastavljanje istovremeno, spojni oligonukleotid može biti doveden u kontakt sa prvom i drugom nukleinskom kiselinom u istoj reakcionoj mešavini tako da dobijena sastavljena nukleinska kiselina uključuje prvu nukleinsku kiselinu, spojni oligonukleotid, i drugu nukleinsku kiselinu. Kada je sastavljanje sekvencijalno, spojni oligonukleotid se dovodi u kontakt sa prvom nukleinskom kiselinom u reakciji sastavljanja u kojoj se proizvodi sastavljena nukleinska kiselina koja sadrži prvu nukleinsku kiselinu sastavljenu sa spojnim oligonukleotidom, ali ne i drugu nukleinsku

4

kiselinu. Tako sastavljena nukleinska kiselina zatim može da se dovede u kontakt sa drugom nukleinskom kiselinom u zasebnoj reakciji sastavljanja u kojoj se proizvodi sastavljena nukleinska kiselina koja uključuje prvu nukleinsku kiselinu, spojni oligonukleotid, i drugu nukleinsku kiselinu. U drugim primerima izvođenja, spojni oligonukleotid se dovodi u kontakt sa drugom nukleinskom kiselinom u reakciji sastavljanja kojom se proizvodi spojena nukleinska kiselina koja uključuje drugu nukleinsku kiselinu sastavljenu sa spojnim oligonukleotidom, ali ne i prvu nukleinsku kiselinu. Tako sastavljena nukleinska kiselina zatim može da se dovede u kontakt sa prvom nukleinskom kiselinom u zasebnoj reakciji sastavljanja, koja proizvodi sastavljenu nukleinsku kiselinu koja uključuje prvu nukleinsku kiselinu, spojni oligonukleotid, i drugu nukleinsku kiselinu.

[0129] U metodima ovog teksta može se upotrebiti bilo koji broj spojnih oligonukleotida, da bi se sastavili molekuli nukleinske kiseline. Na primer, 1 spojni oligonukleotid može da se upotrebi za sastavljanje 2 molekula nukleinske kiseline, 2 spojna oligonukleotida mogu da se upotrebe za sastavljanje 3 molekula nukleinske kiseline, 3 spojna oligonukleotida mogu da se upotrebe za sastavljanje 4 molekula nukleinske kiseline, 4 spojna oligonukleotida mogu da se upotrebe za sastavljanje 5 molekula nukleinske kiseline, ili 5 spojnih oligonukleotida može da se upotrebi za sastavljanje 6 molekula nukleinske kiseline. Broj spojnih oligonukleotida može da bude 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više, u zavisnosti od broja molekula nukleinske kiseline koji treba da budu sastavljeni.

[0130] U nekim primerima izvođenja, spojni oligonukleotid uključuje gBlock DNK. "gBlock" je linearni dvolančani DNK fragment. gBlock može biti dug od oko 50 bp do oko 2000 bp. gBlock može biti dug od oko 50 bp do oko 100 bp, od oko 100 bp do oko 200 bp, od oko 200 bp do oko 300 bp, od oko 300 bp do oko 400 bp, od oko 400 bp do oko 500 bp, od oko 500 bp do oko 600 bp, od oko 600 bp do oko 800 bp, od oko 800 bp do oko 1000 bp, od oko 1000 bp do oko 1250 bp, od oko 1250 bp do oko 1500 bp, od oko 1500 bp do oko 1750 bp, ili od oko 1750 bp do oko 2000 bp.

[0131] Skrining spajanja dve ili više nukleinskih kiselina sa gBlock može da se vrši, na primer, pomoću PCR testova opisanih na drugom mestu u ovom tekstu (npr., Primer 10). U nekim slučajevima, gBlock ne uključuje selekcionu kasetu. Takav metod dopušta brzo spajanje dva ili više molekula nukleinske kiseline čiji skrining može da se vrši jednostavnim PCR testom. gBlock može uključivati svaku sekvencu nukleinske kiseline od interesa. U nekim slučajevima, gBlock može uključivati ciljno mesto za nukleazno sredstvo ili ciljno mesto za neku od različitih meganukleaza ili restrikcionih enzima datih u ovom tekstu. U drugim primerima izvođenja, gBlock može uključivati selekcionu kasetu. U nekim primerima

4

izvođenja, gBlock uključuje DNK sekvencu od interesa. U jednom primeru izvođenja, gBlock uključuje humanu DNK sekvencu.

[0132] Nukleinske kiseline koje će biti sastavljene ili neki od različitih spojnih oligonukleotida mogu uključivati i selekcionu kasetu ili reporterski gen. Selekciona kaseta može uključivati sekvencu nukleinske kiseline koja kodira selekcioni marker, pri čemu je sekvenca nukleinske kiseline operabilno povezana sa promotorom. Promotor može biti aktivan u prokariotskoj ćeliji od interesa i/ili aktivan u eukariotskoj ćeliji od interesa. Takvi promotori mogu biti inducibilni promotor, promotor koji je endogen za reporterski gen ili ćeliju, promotor koji je heterolog za reporterski gen ili ćeliju, promotor specifičan za ćeliju, promotor specifičan za tkivo ili promotor specifičan za stadijum razvića. U jednom primeru izvođenja, selekcioni marker se bira između neomicin fosfotransferaze (neomycin phosphotransferase, neor), higromicin B fosfotransferaze (hygromycin B phosphotransferase, hygr), puromicin-N-acetiltransferaze (puromycin-N-acetyltransferase, purof), blasticidin S deaminaze (blasticidin S deaminase, bsrr), ksantin/guanin fosforibozil transferaze (xanthine/guanine phosphoribosyl transferase, gpt), i timidin kinaze herpes simpleks virusa (herpes simplex virus thymidine kinase, HSV-k), i njihove kombinacije. Selekcioni marker ciljajućeg vektora može biti bočno ograničen ushodno i nishodno, homologim ručicama ili se nalaziti 5’ ili 3’ od homologih ručica.

[0133] U jednom primeru izvođenja, nukleinske kiseline koje treba da budu sastavljene ili neki od različitih spojnih oligonukleotida uključuju reporterski gen operabilno povezan sa promotorom, pri čemu reporterski gen kodira reporterski protein odabran iz grupe koju čine LacZ, mPlum, mCherry, tdTomato, Strawberry, J-Red, DsRed, mOrange, mKO, mCitrine, Venus, YPet, pojačani žuti fluorescentni protein (enhanced yellow fluorescent protein, EYFP), Emerald, pojačani zeleni fluorescentni protein (enhanced green fluorescent protein, EGFP), CyPet, modroplavi fluorescentni protein (cyan fluorescent protein, CFP), Cerulean, T-Sapphire, luciferaza, alkalna fosfataza i njihova kombinacija. Takvi reporterski geni mogu biti operabilno povezani sa promotorom aktivnim u ćeliji. Takvi promotori mogu biti inducibilni promotor, promotor koji je endogen za reporterski gen ili ćeliju, promotor koji je heterolog za reporterski gen ili ćeliju, promotor specifičan za ćeliju, promotor specifičan za tkivo ili promotor specifičan za stadijum razvića.

[0134] Posle sparivanja jednolančane DNK (npr., prepusti proizvedeni delovanjem egzonukleaze kada su DNK molekuli koji treba da budu spojeni dsDNK ili prepust i proizvedeni stvaranjem useka na različitim ciljnim mestima na svakom lancu), jednolančani procepi nastali delovanjem egzonukleaze popunjavaju se pogodnom DNK polimerazom koja ne izmešta lanac, i tako formirani useci se zatvaraju ligazom. "DNK polimeraza koja ne izmešta lanac", kako se koristi u ovom tekstu, je DNK polimeraza koja završava sintezu DNK kada naiđe na DNK lanac koji leži na njenom putu dok kopira dsDNK molekul, ili koja razgrađuje DNK lance na koje nailazi dok uporedo popunjava tako nastale procepe, čime stvara "pokretni usek" (translacija usecima).

[0135] U nekim primerima izvođenja, preklapajuće završne sekvence imaju dovoljnu komplementarnost preklapajućih regiona za sparivanje jednolančanih komplementarnih krajeva svakog polinukleotida. Posle sparivanja jednog lanca prvog polinukleotida sa komplementarnim lancem drugog polinukleotida, 3’ kraj prvog polinukleotida može da se produži na osnovu templata drugog polinukleotidnog lanca i 3’ kraj drugog polinukleotidnog lanca može da se produži na osnovu templata prvog polinukleotidnog lanca. Produžavanjem komplementarnog 3' kraja svakog polinukleotida, polinukleotidi mogu da se sastave. Posle sastavljanja, useci između produženog 3' kraja lanca iz jednog fragmenta i susednog 5' kraja lanca iz drugog fragmenta mogu da se zatvore ligacijom. Preciznije, hidroksilna grupa produženog 3' kraja prvog polinukleotida sa fosfatnom grupom 5' kraja drugog polinukleotida i povezivanje hidroksilne grupe produženog 3' kraja drugog polinukleotida sa fosfatnom grupom 5' kraja prvog polinukleotida.

[0136] Reakcija povezivanja može se izvesti bilo kojom od različitih pogodnih termostabilnih DNK ligaza. Među pogodnim ligazama su, na primer, Taq ligaza, ampligaza termostabilna DNK ligaza (Epicentre Biotechnologies), termostabilne ligaze objavljene u U.S. pat. br.

6,576,453, termostabilna Tfi DNK ligaza, Bioneer, Inc.

[0137] Pogodna količina sredstva za nagomilavanje molekula, kao što je PEG, u reakcionoj mešavini dopušta, pojačava, ili olakšava nagomilavanje molekula. Bez želje za ograničavanjem bilo kojim određenim mehanizmom, sugeriše se da sredstvo za nagomilavanje molekula, koje omogućava nagomilavanje molekula i vezuje se i povezuje vodu u rastvoru, omogućava da komponente rastvora dođu u bliži kontakt jedna sa drugom. Na primer, DNK molekuli koji će se rekombinovati mogu se više približiti; što olakšava sparivanje jednolančanih prepusta. Isto tako, sugerisano je da enzimi mogu doći u bliskiji kontakt sa svojim DNK supstratima i mogu se stabilisati uklanjanjem molekula vode. Različita pogodna sredstva za nagomilavanje molekula poznata su stručnjaku u oblasti. Ona uključuju različite dobro poznate makromolekule, kao što su polimeri, npr., polietilen glikol (polyethylene glycol, PEG); fikol, na primer fikol 70; dekstran, kao dekstran 70; ili slično. Mnogo diskusije u ovoj patentnoj prijavi odnosi se na PEG. Međutim, pažnja se takođe odnosi na druga pogodna sredstva za nagomilavanje molekula. Iskusan stručnjak će znati

1

kako da primeni rutinske promene metoda sa ciljem prilagođavanja korišćenju drugih sredstava za nagomilavanje molekula.

[0138] Pogodna količina sredstva za nagomilavanje molekula, na primer PEG, u reakcionoj mešavini omogućava na primer, pojačavanje ili olakšavanje nagomilavanje molekula. Na primer, sredstvo za nagomilavanje molekula može pomoći da molekuli DNK koji će se rekombinovati mogu da dođu na veću blizinu; ovim se dakle olakšava sparivanje jednolančanih prepusta. Isto tako, sugerisano je da enzimi mogu doći u bliskiji kontakt sa svojim DNK supstratima i mogu biti stabilisani uklanjanjem molekula vode. Različita pogodna sredstva za nagomilavanje molekula poznata su stručnjaku u oblasti. Ona uključuju različite dobro poznate makromolekule, kao što su polimeri, npr., polietilen glikol (PEG); fikol, na primer fikol 70; dekstran, kao dekstran 70; ili slično. Uopšteno, kada se koristi PEG, optimalna je koncentracija od oko 5% (težina/zapremini). Međutim, količina PEG može biti u opsegu npr., od oko 3 do oko 7%. Može se koristiti svaka pogodna veličina PEG, npr., u opsegu od oko PEG-200 (npr., PEG-4000, PEG-6000, ili PEG-8000) do oko PEG-20000, ili čak više. U Primerima u ovom tekstu, koristi se PEG-8000. Sredstvo za nagomilavanje molekula može, pored toga što pojačava reakciju sparivanja, povećati povezivanje.

[0139] Komponente reakcije (kao što su soli, puferi, pogodan izvor energije (kao ATP ili NAD), pH reakcione mešavine, itd.) koje su prisutne u reakcionoj mešavini za sastavljanje ne moraju biti optimalne za pojedinačne enzime (egzonukleaza, polimeraza, i ligaza); umesto toga, one služe kao kompromis efikasan za čitav skup reakcija. Na primer, jedan pogodan puferski sistem koji su identifikovali pronalazači, ponekad označen u ovom tekstu kao ISO (ISOtermički) pufer tipično uključuje 0.1 M Tris-Cl pH 7.5; 10 mM MgCl2, 0.2 mM svakog od dGTP, dATP, dTTP i dCTP, 10 mM DTT, 5% PEG-8000, i 1 mM NAD.

[0140] U metodima objavljenim u ovom tekstu, najmanje dve nukleinske kiseline su dovedene u kontakt sa Cas proteinom i drugim enzimima pod uslovima koji su efikasni za sastavljanje nukleinskih kiselina kako bi se formirao sastavljeni dvolančani DNK molekul u kojem je zadržana jedna kopija preklapajućeg regiona. Opisani metodi mogu se upotrebiti za spajanje bilo kojih DNK molekula od interesa, uključujući DNK koje se sreću u prirodi, klonirane DNK molekule, sintetski stvorene DNK, itd. Spojeni DNK molekuli mogu, po želji, da se kloniraju u vektor (npr., korišćenjem metoda pronalaska). U nekim primerima izvođenja, nukleinske kiseline koje će se sastaviti su kodon-optimizovane za introdukovanje i eksprimiranje u ćeliji od interesa (npr., ćeliji glodara, ćeliji miša, ćeliji pacova, ćeliji čoveka, ćeliji sisara, ćeliji mikroba, ćeliji pacova, itd...).

2

[0141] DNK molekuli bilo koje dužine mogu se spojiti metodima objavljenim u ovom tekstu. Na primer, nukleinske kiseline sa oko 100 bp do oko 750 ili 1000, ili više, mogu se spojiti. Broj nukleinskih kiselina koje mogu biti sastavljene, u jednom ili nekoliko stupnjeva sastavljanja u skladu sa metodima opisanim u ovom tekstu, može iznositi najmanje oko 2, 3, 4, 6, 8, 10, 15, 20, 25, 50, 100, 200, 500, 1000, 5000, ili 10000 DNK molekula, na primer u opsegu od oko 2 do oko 30 nukleinskih kiselina. Broj stupnjeva sastavljanja može iznositi 2, 4, 6, 8, 10, ili više. Broj molekula sastavljenih u jednom stupnju može biti u opsegu od oko 2 do oko 10 molekula. Metodi pronalaska mogu se upotrebiti za spajanje DNK molekula ili kaseta od kojih svaka ima početnu veličinu od najmanje ili ne više od oko 40 bp, 60 bp, 80 bp, 100 bp, 500 bp, 1 kb, 3 kb, 5 kb, 6 kb, 10 kb, 18 kb, 20 kb, 25 kb, 32 kb, 50 kb, 65 kb, 75 kb, 150 kb, 300 kb, 500 kb, 600 kb, 1 Mb, ili veću. Sastavljeni završni proizvodi mogu imati veličinu od najmanje oko 500 bp, 1 kb, 3 kb, 5 kb, 6 kb, 10 kb, 18 kb, 20 kb, 25 kb, 32 kb, 50 kb, 65 kb, 75 kb, 150 kb, 300 kb, 500 kb, 600 kb, 1Mb, ili veću, na primer u opsegu od 30 kb do 1 Mb.

[0142] U nekim primerima izvođenja, sastavljene nukleinske kiseline formiraju prsten i/ili postaju povezane u vektor da bi formirale prsten. Donja veličinska granica za dsDNK da bi postala cirkularna je oko 200 baznih parova. Prema tome, ukupna dužina spojenih fragmenata (uključujući, u nekim slučajevima, dužinu vektora) iznosi najmanje oko 200 bp. Praktično nema gornje granice veličine, i spojene DNK od nekoliko stotina kilobaznih parova, ili veće, mogu se napraviti metodima objavljenim u ovom tekstu. Spojene nukleinske kiseline mogu biti u vidu cirkularnog ili linearnog molekula.

[0143] Metodi opisani u ovom tekstu mogu se upotrebiti za sastavljanje linearnog fragmenta sa drugim linearnim fragmentom, linearnog fragmenta sa cirkularnim molekulom nukleinske kiseline, cirkularnog molekula nukleinske kiseline sa drugim cirkularnim molekulom nukleinske kiseline, ili bilo koja kombinacija linearnih i cirkularnih nukleinskih kiselina. "Vektor" uključuje svaki cirkularni molekul nukleinske kiseline. U određenim primerima izvođenja, vektor sastavljen metodima objavljenim u ovom tekstu je bakterijski veštački hromozom (BAC). Vektor (npr., BAC) može uključivati humanu DNK, glodarsku DNK, sintetsku DNK, ili bilo koju njihovu kombinaciju. Na primer, BAC može uključivati humanu polinukleotidnu sekvencu. Kada se spaja mešavina DNK molekula, poželjno je da DNK budu prisutne u približno ekvimolarnim količinama.

[0144] Nukleinska kiselina upotrebljena za sastavljanje metodima objavljenim u ovom tekstu može biti predstavljena velikim ciljajućim vektorom. Izraz "veliki ciljajući vektor" ili "LTVEC" obuhvata vektore koji sadrže homologe ručice koje odgovaraju i izvedene su iz sekvenci nukleinske kiseline koje su upotrebljene za homologo ciljanje u ćelijama i/ili sadrže insert nukleinskih kiselina koji uključuje sekvence nukleinskih kiselina namenjene usmeravanju homologe rekombinacije u ćelijama. Na primer, LTVEC čini mogućom modifikaciju velikih lokusa koji se zbog svojih veličinskih ograničenja ne mogu prilagoditi tradicionalnim ciljajućim vektorima zasnovanim na plazmidu. U specifičnim primerima izvođenja, homologe ručice i/ili insert nukleinske kiseline iz LTVEC uključuje genomsku sekvencu eukariotske ćelije. Veličina LTVEC je prevelika da bi skrining ciljajućih događaja bio moguć konvencionalnim testovima, npr., metodom southern blotting i long-range (npr., 1 kb-5 kb) PCR. Primeri LTVEC, uključuju, ali se ne ograničavaju na vektore izvedene iz bakterijskog veštačkog hromozoma (BAC), veštačkog hromozoma čoveka ili veštačkog hromozoma kvasca (yeast artificial chromosome, YAC). Neograničavajući primeri LTVEC i metoda njihovog pravljenja opisani su npr., u US pat. br. 6,586,251, 6,596,541, 7,105,348, i WO 2002/036789 (PCT/US01/45375), i US 2013/0137101.

[0145] U nekim primerima izvođenja, u vektore mogu da se insertuju kasete koje kasnije mogu da se uklone. Različiti oblici kaseta mogu da se konstruišu da bi se omogućila delecija u specifičnim tipovima ćelija ili tkiva, na specifičnim stupnjevima razvića, ili posle indukcije. Takve kasete mogu koristiti rekombinazni sistem u kojem je kaseta sa obe strane ograničena rekombinaznim mestima prepoznavanja i može se ukloniti korišćenjem rekombinaze eksprimirane u željenom tipu ćelije, eksprimirane na željenom stupnju razvića, ili eksprimirane ili aktivirane posle indukcije. Te kasete se dodatno mogu konstruisati tako da sadrže oblast parova različitih rekombinaznih mesta prepoznavanja postavljenih tako da mogu da se stvore nulti, uslovni ili kombinovani uslovni/nulti aleli, kako je opisano u US 2011/0104799. Regulacija rekombinaznih gena može se kontrolisati na različite načine, na primer operabilnim povezivanjem rekombinaznog gena sa ćelijski specifičnim, tkivno specifičnim, ili razvojno regulisanim promotorom (ili drugim regulatornim elementom), ili operabilnim povezivanjem sa rekombinaznim genom na 3’-UTR koji uključuje mesto prepoznavanja za miRNK koja se transkribuje samo u određenim tipovima ćelija, određenim tipovima tkiva ili određenim razvojnim stupnjevima. Rekombinaza može da se reguliše i, na primer, korišćenjem fuzionog proteina koji stavlja rekombinazu pod kontrolu efektora ili metabolita (npr., CreERT2, čija je aktivnost pozitivno kontrolisana tamoksifenom), ili stavljanjem rekombinaznog gena pod kontrolu inducibilnog promotora (npr., onog čija je aktivnost kontrolisana doksiciklinom i TetR ili varijantama TetR). Primeri različitih formi kaseta i načina regulisanja rekombinaznih gena dati su, na primer, u US 8,518,392; US 8,354,389; i US 8,697,851.

4

[0146] Vektori upotrebljeni za sastavljanje kako je objavljeno u ovom tekstu (npr., LTVEC) mogu biti bilo koje dužine, uključujući, ali ne ograničavajući se na od oko 20 kb do oko 400 kb, od oko 20 kb do oko 30 kb, od oko 30 kb do 40 kb, od oko 40 kb do oko 50 kb, od oko 50 kb do oko 75 kb, od oko 75 kb do oko 100 kb, od oko 100 kb do 125 kb, od oko 125 kb do oko 150 kb, od oko 150 kb do oko 175 kb, oko 175 kb do oko 200 kb, od oko 200 kb do oko 225 kb, od oko 225 kb do oko 250 kb, od oko 250 kb do oko 275 kb ili od oko 275 kb do oko 300 kb, od oko 200 kb do oko 300 kb, od oko 300 kb do oko 350 kb, od oko 350 kb do oko 400 kb, od oko 350 kb do oko 550 kb. U jednom primeru izvođenja, LTVEC je od oko 100 kb.

[0147] Metodi sastavljanja nukleinskih kiselina dati u ovom tekstu mogu biti dizajnirani tako da omoguće deleciju od oko 5 kb do oko 10 kb, od oko 10 kb do oko 20 kb, od oko 20 kb do oko 40 kb, od oko 40 kb do oko 60 kb, od oko 60 kb do oko 80 kb, od oko 80 kb do oko 100 kb, od oko 100 kb do oko 150 kb, ili od oko 150 kb do oko 200 kb, od oko 200 kb do oko 300 kb, od oko 300 kb do oko 400 kb, od oko 400 kb do oko 500 kb, od oko 500 kb do oko 1 Mb, od oko 1 Mb do oko 1.5 Mb, od oko 1.5 Mb do oko 2 Mb, od oko 2 Mb do oko 2.5 Mb, ili od oko 2.5 Mb do oko 3 Mb.

[0148] U drugim slučajevima, metodi obezbeđeni u ovom tekstu dizajirani su tako da omoguće insertovanje sekvence egzogene nukleinske kiseline u opsegu od oko 5 kb do oko 10 kb, od oko 10 kb do oko 20 kb, od oko 20 kb do oko 40 kb, od oko 40 kb do oko 60 kb, od oko 60 kb do oko 80 kb, od oko 80 kb do oko 100 kb, od oko 100 kb do oko 150 kb, od oko 150 kb do oko 200 kb, od oko 200 kb do oko 250 kb, od oko 250 kb do oko 300 kb, od oko 300 kb do oko 350 kb, ili od oko 350 kb do oko 400 kb. U jednom primeru izvođenja, insertovani polinukleotid je dug oko 130 kb ili oko 155kb.

[0149] Linearne nukleinske kiseline mogu da se sastave jedna sa drugom ili sa vektorima korišćenjem metoda objavljenih u ovom tekstu. Linearni molekul može biti vektor koji je bio digestiran endonukleazom (npr., Cas protein) ili bilo koja sintetska, veštačka ili prirodna linearna nukleinska kiselina. U određenim primerima izvođenja, linearna nukleinska kiselina napravljena je tako se završne sekvence preklapaju sa regionom druge nukleinske kiseline. Preklapajuće završne sekvence linearne nukleinske kiseline mogu se uvesti bilo kojim metodom poznatim u struci za stvaranje prilagođenih sekvenci nukleinske kiseline. Na primer, završne sekvence mogu biti deo sintetski proizvedenog molekula, mogu biti uvedene pomoću PCR, ili tradicionalnim tehnikama kloniranja.

PRIMERI

[0150] Primeri koji slede izneti su da bi se prosečno obučenom stručnjaku u oblasti obezbedila potpuna objava i opis kako da napravi i upotrebi predmetni pronalazak, i nisu namenjeni ograničavanju obima onoga što pronalazači smatraju svojim pronalaskom, niti treba da prikažu da su eksperimenti u nastavku svi ili jedini izvedeni eksperimenti. Učinjeni su napori kako bi se osigurala tačnost upotrebljenih brojeva (npr. količine, temperatura, itd.), ali treba računati na neke eksperimernatlne greške i odstupanja. Ako nije naznačeno drugačije, delovi su težinski delovi, molekulska težina je prosečna molekulska težina, temperatura je u Celzijusovim stepenima, i pritisak je atmosferski ili oko atmosferskog.

Primer 1: Digestija BAC korišćenjem CAS9 praćena sastavljanjem sa selekcionom kasetom

[0151] Veštačka crRNK i veštačka tracrRNK dizajnirane su tako da ciljaju specifičnu sekvencu u MAID 6177 (116 kb LTVEC) za spajanje sa PCR proizvodom od 3 kb (UB-HYG). PCR proizvod sadrži preklope od 50 bp sa vektorom. Prvo rastvoriti crRNK i tracrRNK do 100 uM u Duplex puferu (30 mM HEPES, pH 7.5, 100 mM kalijum acetat). Sa ciljem sparivanja RNK, dodati 10 ul 100 uM crRNK i 10 ul 100 uM tracrRNK u 80 ul pufera za sparivanje. Zagrejati RNK na 90 °C u temp. bloku zatim skloniti blok iz grejača i ohladiti na radnoj površini. Finalna koncentracija RNK je oko 10 uM.

[0152] Da bi se izvela digestija BAC, koristi se čista maxiprep BAC DNK i BAC se digestira prema sledećoj mešavini.

1 ×

BAC DNK (500 ng) X ul

BSA (100 ×)<0.5 ul>

RNK 2 ul (1 ul svakog tracr:crRNK hibrida) Cas9 (4.5 mg/ml) 1 ul

10 × pufer<1.5 ul>

H2O do 15 ul

Digestirati 1 sat na 37°, zatim desalinisati 30 min. Finalni reakcioni pufer sadrži: 20 mM Tris 7.5; 100-150 mM NaCl; 10 mM MgCl2; 1 mM DTT; 0.1 mM EDTA; 100 ug/ml BSA; za finalnu zapreminu od 15 ul.

[0153] Sa ciljem spajanja BAC i inserta, digestirati plazmid ili izvesti PCR da se napravi insert. Za reakcije PCR, pustiti mali alikvot na gel i tražiti jedan proizvod, ako proizvod ima jednu traku, onda uraditi PCR prečišćavanje umesto ekstrakcije na gelu. Poželjan odnos BAC:insert je 1:1-1:6. Obično 50 ng prečišćenog inserta bude dovoljno. Može se koristiti sledeća reakciona mešavina:

BAC za digestiju 4 ul

Insert 1 ul

Mešavina za 15 ul

spajanje

[0154] Dodati DNK i mešavinu na ledu ili direktno u mašinu za PCR na 50 °C. Inkubirati na 50 °C 1 sat. Dodati 0.5 uL proteinaze K (20 mg/ml) i inkubirati na 50°C 1 sat. Desalinisati 30 min i elektroporisati 8 ul reakcije u DH10B ćelije. 10 ul BAC digestata može da se pusti na pulse-field gel da se proveri efikasnost digestije. Upotrebiti vodu bez RNaze i pufere.

[0155] Reakcija sastavljanja odvija se na sledeći način: Izotermički pufer: 3 mL 1M Tris-HCl (pH 7.5); 150 ul 2M MgCl2; 60 ul 100 mM svaki: dGTP, dATP, dTTP, dCTP; 300 ul 1M DTT; 1.5 g PEG 8000; 300 ul 100 mM NAD. Izotermički pufer se skladišti u alikvotima od 320 ul na -20 °C. Master mešavina se priprema na sledeći način: 320 ul izotermičkog pufera; 0.64 ul T5 egzonukleaze (koncentracija stok-rastvora = 10 U/ul); 20 ul Phusion DNK polimeraze (koncentracija stok-rastvora = 2 U/ul); 160 ul Taq DNK ligaze (koncentracija stok-rastvora = 40 U/ul); 699.36 ul H2O; pomešati, i alikvotirati u 15 ul ili 30 ul i uskladištiti na -20 °C. Upotrebiti 15 ul master mešavine (MM) u ukupnoj zapremini reakcije od 20 ul.

[0156] tracr RNK sekvenca upotrebljena u primeru je:

CAAAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUC (SEQ ID NO: 9). Ova CRISPR RNK (crRNK) sadrži: (1) oko 20 nukleotida RNK komplementarnih sa ciljnom sekvencom i (2) sekvecu repa (GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG (SEQ ID NO: 10)) koja će se spariti sa tracrRNK.

[0157] Ovi koraci prikazani su na SL.1.

Primer 2: Spajanje dva preklapajuća BAC: Humanizovani HLA-DQ Humanizovani HLA-DR u mišjem MHC II lokusu (H2-A/H2-E)

[0158] Veštačka crRNK i veštačka tracrRNK dizajnirane su da ciljaju specifične sekvence u humanizovanom HLA-DQ BAC za sastavljanje sa humanizovanim HLA-DR BAC. Vektori su sadržali međusobne preklope od ∼70 bp napravljene sečenjem korišćenjem Cas9 na dva mesta na svakom vektoru (vidi, SL. 2). Rastvoriti crRNK i tracrRNK do 100 uM u Hybe puferu. Za sparivanje RNK, dodati 10 ul 100 uM crRNK i 10 ul 100 uM tracrRNK u 80 ul pufera za sparivanje. Staviti RNK u blok za grejanje na 90 °C zatim skloniti blok iz grejača i ohladiti na radnoj površini. Finalna koncentracija RNK je oko 10 uM.

[0159] Da bi se digestirao BAC, može se koristiti čista maxiprep BAC DNK. Svaki BAC može da se digestira pojedinačno prema sledećoj mešavini:

BAC DNK 2.5 ug X ul

BSA (100 ×)<0.5 ul>

RNK 4 ul (2 ul svakog tracr:crRNK hibrida) Cas9 (4.5 mg/ml) 1 ul

10 × pufer<5 ul>

H2O do 50 ul

BAC vektore treba digestirati na 37° C 1 sat i zatim inaktivirati grejanjem 20 min na 65 °C. Desalinisati 30 min. Digestirana DNK se prečisti ekstrahovanjem pomoću fenola/hloroforma/izoamilalkohola (PCI) i zatim resuspenduje u 35 ul TE pufera.

[0160] Za sastavljanje vektora, upotrebiti 2.5 uL BAC za reakciju spajanja, kako sledi:

Digestirani BAC 5 ul (ukupno)

Mešavina za 15 ul

spajanje

[0161] Dodati DNK i mešavinu na ledu ili direktno u mašinu za PCR na 50 °C. Inkubirati na 50 °C 1 sat. Desalinisati 30 min i elektroporacijom uneti 8 ul sastavljene DNK u DH10B ćelije. Upotrebiti vodu koja ne sadrži RNazu i pufere.

[0162] tracr RNK sekvenca upotrebljena u primeru je:

CAAAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUC (SEQ ID NO: 9). Ova CRISPR RNK (crRNK) sadrži: (1) oko 20 nukleotida RNK komplementarnih sa ciljnom sekvencom i (2) sekvencu repa (GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG (SEQ ID NO: 10)) koja će se spariti sa tracrRNK.

[0163] Ovi koraci su prikazani na SL.2.

Primer 3: Spajanje 2 Cas9-isečena fragmenta iz 2 različita plazmida uz korišćenje linkera

[0164] Da bi se konstruisao ciljajući vekotr, pMJ8502x se seče korišćenjem 2 identične crRNK da se dobiju fragment od 400 bp i Amp osovina od 2283 bp (SL. 7). Qiagen kolone koriste se za prečišćavanje cele reakcije. R6KZenUbiNeo se zatim seče korišćenjem 2 različite crRNK da se razdvoji u Neo-rezistencija deo (1086 bp) i osovinu (5390 bp). Qiagen kolone koriste se za prečišćavanje cele reakcije (SL. 7). Reakcija sečenja: 1170 ng DNK, 30 ul pufera, 4 ul sparene RNK (konc. 100 uM), 1.7 ul Cas9 (konc. 0.89 ng/ul), H2O do 60 ul. Mešavina se inkubira na 37 °C 1 sat i prečisti na Qiagen koloni pre eluiranja u 30 ul pufera za eluiranje.

[0165] Isečeni fragmenti se zatim spajaju sa dva linkera što rezultuje bešavnim spajanjem prema sledećoj reakcionoj mešavini: 0.5 ul linkera 1 (5 ng), 0.5 ul linkera 2 (5 ng), 2 ul Neo dela (∼60 ng), 2 ul Amp dela (∼60ng), 15 ul Master mešavine za sastavljanje. Mešavina se inkubira na 50 °C 1 sat i zatim se reakcija dijalizira u odnosu na H2O. 10 ul reakcije se elektroporiše u elektrokompetentne Pir ćelije, pre zasejavanja na Carb/Kan ploče. PCR preko spoja pokazuje da je 6/8 odabranih kolonija bilo ispravno i to je potvrđeno sekvenciranjem.

Primer 4: Zamena dela BAC kasetom, korišćenjem linkera

[0166] Da bi se konstruisao knock out mišji ciljajući vektor, 40 kb BAC ciljajućeg vektora zameni se selekcionom kasetom bočno ograničenom rekombinacionim mestima prepoznavanja (SL.8) 2 linkera se dizajniraju da se ukloni region od interesa iz mBAC i da se insertuje selekciona kaseta, jedan za 5’ i jedan za 3’. Linkeri su imali preklope od 40 bp sa mBAC i preklope od 40 bp sa selekcionom kasetom. Prvo, 39.5 kb ciljajućeg vektora od 206 kb (mBAC) seče se prema sledećoj reakciji: 500 ul reakcije (postići dodavanjem H2O): dodati 1 ul Cas9 (konc.0.89 ug/ul), 2 ul svakog RNK dupleksa (konc.50 uM), 250 ul pufera, 220 ul (12.5 ng) BAC maxi prep, i inkubirati na 37 °C 1 sat. Digestirana DNK se prečisti pomoću ekstrakcije fenolom/hloroformom/izoamilalkoholom (PCI) i zatim resuspenduje u 55 ul TE pufera. Posle prečišćavanja mBAC isečaka korišćenjem PCI, sastavljanje se obavlja na 50 °C 1 h, i 10 ul reakcije se elektroporiše u DH10B ćelije (SL. 9). Sekvenciranje preko spojeva potvrđuje ispravnost sastavljanja (SL. 10). Linker 1 (spojni oligonukleotid 1) je bez šava od mBAC sekvence do kasetne sekvence (SEQ ID NO: 12). Linker 2 (spojni oligonukleotid 2) je bez šava od kasetne sekvence do mBAC sekvence (SEQ ID NO: 13).

Primer 5: Sastavljanje dva BAC vektora korišćenjem linkera (spojnih oligonukleotida)

[0167] "Prišivanje" 2 mBAC korišćenjem Cas9/izotermičkog spajanja upotrebljeno je da se napravi ciljajući vektor koji sadrži ručice homologe sa mišjim genomskim regionom i restrikciona mesta za insertovanje humanog gena BAC-povezivanjem. Ovaj ciljajući vektor koristi se u BAC-povezivanju da bi se napravio humanizovani ciljajući vektor. mBAC se iseče prema sledećoj reakciji: 12.5 ug DNK, 2 ul svake sparene RNK (konc. 50 uM), 10 ul Cas9 (konc. 0.89 ug/ul), 250 ul pufera, H2O do 500 ul. Mešavina se inkubira na 37 °C jedan sat; prečisti pomoću ekstrakcije fenolom/hloroformom/izoamilalkoholom (PCI) i resuspenduje u 20 ul TE. Dva mišja BAC se zatim sastave linkerima (SL.11) prema sledećoj reakciji: 6 ul (2 ug) bMQ-208A16 isečka, 5.6 ul (2 ug) bMQ-50F19 isečka, 0.25 ul svakog linkera (konc. 50 uM), 4.3 ul (100 ng) selekcione kasete (Ubi-Hyg), 12 ul master mix za sastavljanje, visoke koncentracije, 11.35 ul H2O. Reakciona mešavina se inkubira na 50 °C 1 sat i dijalizira u odnosu na H2O na 30 °C. 10 ul ili 30 ul dijalizirane reakcije koristi se za transformisanje DH10B čelija. Sangerovo sekvenciranje potvrđuje sve spojeve. Illumina sekvenciranje ponovo potvrđuje sve spojeve (SL. 12 i SEQ ID NO: 17). Linker 1 je bez šava od mBAC do kasete (SEQ ID NO: 14). Linker 2 nije bez šava od kasete do mBAC. On inkorporiše humanu spejsersku sekvencu, kako je prema dizajnu projekta. Linker 3 nije bez šava od mB2 do mB3. On inkorporiše jedinstvenu sekvencu koja se koristi za PCR verifikaciju. Ovo područje se uklanja kada se vrši linearizacija za ES elektroporaciju (SEQ ID NO: 15).

[0168] SL. 13 ilustruje primer korišćenja 4 spojna oligonukleotida (linkera) za insertovanje velikih humanih genskih fragmenata u mBAC korišćenjem četiri linkera i izotermičkog sastavljanja.

Primer 6: Reagensi i reakcione mešavine za sečenje i sastavljanje

[0169] Crispr RNK (crRNK) (naručena kao ssRNK) sadrži: (1) 20 nukleotida RNK koja je komplementarna sa ciljnim područjem za sečenje; (2) i rep koji će se spariti sa tracrRNK: <20 nt crisprRNK>GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG (SEQ ID NO: 10).

[0170] TracrRNK (naručena kao ssRNK):

[0171] Sva RNK se resuspenduje do 100 uM u H2O. 2.5 ul svake od crRNK i tracrRNK kombinuje se sa 5 ul pufera za sparivanje (finalne koncentracije: 10 mM Tris pH 7.5-8.0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA). Mešavina se zatim inkubira na 95 °C 5 minuta i sporo hladi do sobne temperature tokom 1 sata. 2X pufer za Cas9-sečenje sadrži 40 mM HEPES pH7.5 (finalno = 20 mM); 300 mM KCl (finalno = 150 mM); 1 mM DTT (finalno = 0.5 mM); 0.2 mM EDTA (finalno = 0.1 mM); 20 mM MgC12(finalno = 10 mM).

[0172] Reakcija Cas9-sečenja u velikom obimu: Dodati redom na sobnoj temperaturi: H2O do 500 ul, 250 ul 2x pufer za sečenje, 12.5 ug DNK, 2 ul svake RNK (koncentracija 50 uM), 10 ul Cas9 (koncentracija 0.89 mg/ml), i inkubirati na 37 °C 1 sat.

[0173] Ova reakcija može da se skalira po potrebi, na primer: H2O do 50 ul, 25 ul pufera, 125 ng DNK, 2 ul svake RNK (koncentracija 5 uM), 1 ul Cas9 (koncentracija 0.89 mg/ml), i inkubirati na 37 °C 1 sat.

[0174] Reakcija sastavljanja izvodi se na sledeći način: Izotermički pufer: 3 mL 1M Tris-HCl (pH 7.5); 150 ul 2M MgCl2; 60 ul 100 mM svakog: dGTP, dATP, dTTP, dCTP; 300 ul 1M DTT; 1.5 g PEG 8000; 300 ul 100 mM NAD. Izotermički pufer se skladišti u alikvotima od 320 ul na -20 °C. Master mešavina se priprema na sledeći način: 320 ul izotermičkog pufera; 0.64 ul T5 egzonukleaze (konc. stoka = 10 U/ul); 20 ul Phusion DNK polimeraze (konc. stoka = 2 U/ul); 160 ul Taq DNK ligaze (konc. stoka = 40 U/ul); 699.36 ul H2O; pomešati, alikvotirati po 15 ul ili 30 ul i uskladištiti na -20°C. Upotrebiti 15 ul master mešavine (MM) u ukupnoj zapremini reakcije od 20 ul.

[0175] Alternativno, visoka koncentracija master mešavine (GA MM HC) može da se napravi na sledeći način: 320 ul izotermičkog pufera; 0.64 ul T5 egzonukleaze (konc. stoka = 10 U/ul); 20 ul Phusion DNK polimeraze (konc. stoka = 2 U/ul); 160 ul Taq DNK ligaze (konc. stoka = 40 U/ul); pomešati i alikvotirati po 6 ul ili 12 ul i uskladištiti na -20 °C. Upotrebiti 6 ul master mešavine u ukupnoj zapremini reakcije od 20 ul.

[0176] Za sve reakcije sastavljanja, treba da se odredi koncentracija DNK (npr., korišćenjem Nano Drop) i koristi se molarni odnos 1:6 (vektor prema insertu/insertima). Za standardnu koncentraciju, koristi se 15 ul master mešavine za sastavljanje. DNK i voda dodaju se do finalne zapremine od 20 ul, u epruvetu za PCR od 200 ul. Reakcija se izvodi u uređaju za termocikliranje na 50 °C 1 sat. Reakciona mešavina zatim može da se uskladišti na -20 °C. Za visoku koncentraciju, koristi se 6 ul master mešavine za sastavljanje visoke koncentracije. DNK i voda dodaju se do finalne zapremine od 20 ul u epruvetu za PCR od 200 ul. Reakcija se izvodi u uređaju za termocikliranje na 50 °C 1 sat. Reakciona mešavina zatim može da se uskladišti na -20 °C. Posle završetka reakcije, 10 ul se diajlizira u odnosu na vodu 30 min i elektroporiše u odgovarajuće elektrokompetentne ćelije (npr., DH10B ili Pir+ ćelije).

[0177] Cas9/Izotermička reakcija spajanja: Za Cas9 digestiju 2.5 ug svake DNK (npr., BAC DNK), 4 ul svake 10 uM vodičke/tracr RNK, i 5 ul Cas9 proteina (0.89 mg/ml) digestiraju se 2 sata na 37°C. Reakcija se inaktivira toplotom na 65 °C 20 min, ekstrahuje fenolomhloroformom (npr., da se ukloni Cas9 protein), ispere jednom promenom 70% etanola, DNK se resuspenduje u 35 ul vode. Izotermičko sastavljanje se izvodi mešanjem 5 ul DNK sa 15 ul

1

master mešavine (MM) kako je opisano na drugom mestu u ovom tekstu i inkubira na 50 °C 1 sat. Reakcija se desaliniše 30 min i 8 ul reakcije se elektroporiše u ćelije.

Primer 7: Cas9/Izotermičko sastavljanje za insertovanje humane sekvence u BAC vektor

[0178] Da bi se konstruisao humanizovani ciljajući vektor, MAID 6236 se iseče gRNK-Cas kompleksom dajući isečene fragmente sa preklapajućim sekvencama. VI568 se takođe iseče gRNK-Cas kompleksom da se naprave sekvence koje se preklapaju sa fragmentom MAID6236. Cas9/Izotermičko spajanje izvodi se kako je opisano ranije u ovom tekstu, što za rezultat ima inserciju humanizovanog lokusa u vektor (VI599). Ovaj proces je prikazan na SL. 14.

Primer 8: Cas9/Izotermičko spajanje korišćenjem gBlock bez selekcije

[0179] Cas9 digestija i spajanje mogu se izvesti bez selekcije, na primer, korišćenjem gBlock DNK fragmenata. Da bi se testirala mogućnost dodavanja dvolančane DNK u lokus bez selekcione kasete, gBlock DNK fragmenti se sintetišu i insertuju u konstrukt. Kako je prikazano na SL.15A i B, Cas9/gRNK je dizajniran tako da cilja dva mesta unutar TCR beta lokusa za deleciju fragmenta od 4.4 kb. gBlock je dizjaniran tako da uvede meganukleazno mesto prepoznavanja u konstrukt. gBlock može da se insertuje u konstrukt bez korišćenja selekcionog markera. SL. 15A prikazuje insertovanje PISceI gBlock i SL. 15B prikazuje insertovanje MauBI gBlock.

[0180] Uspešna insercija svakog od gBlock u finalni konstrukt potvrđena je PCR pregledanjem spojeva uz korišćenje prajmera navedenih u Tabeli 1. Protokol za pregledanje spojeva je sledeći: PCR reakcija je sadržala: 1 μL DNK, 0.5 μL prajmera 1, 0.5 μL prajmera 2, 1 μL DMSO, 4 μL dNTP, 2.5 μL 10x pufera, 0.5 μL Ex-Taq, i 15 μL vode. Reakcija se izvodi u uređaju za termocikliranje na 95 °C 3 minuta, 95 °C 30 sekundi, 55 °C 30 sekundi, 25 ciklusa, što je praćeno sa 72°C 30 sekundi, i 72 °C 5 minuta. Spojenost sekvenci potvrđena je sekvencioniranjem.

Tabela 1: Prajmeri za pregledanje spojeva MAID1715 sa PI-SceI gBlock ili MauBI gBlock

2

Primer 9: Cas9/Izotermičko sastavljanje za insertovanje humane sekvence u BAC vektor uz korišćenje spojnih oligonukleotida

[0181] SL. 16 prikazuje primer direktne humanizacije korišćenjem Cas9/izotermičkog spajanja i spojnih oligonukleotida. Humani fragment i mišja delecija odvoje se pomoću Cas9 (svaki BAC koristi 2 crispr RNK). Humani fragment i mišja osovina povezuju se u Gibsonovoj reakciji spajanja sa 3 linkera (spojni oligonukleotidi) i selekcionom kasetom.

[0182] SL. 17 prikazuje primer indirektne humanizacije korišćenjem Cas9/izotermičkog spajanja i spojnih oligonukleotida za spajanje u veliki ciljajući vektor (LTVEC). Humani fragment na hBAC odseca se pomoću Cas9 uz korišćenje 2 crispr RNK. Donor uključuje ushodne i nishodne spojne oligonukleotide i selekcionu kasetu. Posle sečenja hBAC pomoću Cas9, fragment se "zadržava" Gisbonovim sastavljanjem uz korišćenje sintetskog donora sa inkorporisanim komplementarnim prepustima. Konstruisanje ciljajućeg vektora se završava Gibsonovim sastavljanjem ili BHR.

Primer 10: Uvođenje tačkaste mutacije Cas9/Iso-termičkim spajanjem

[0183] SL. 18 prikazuje primer korišćenja Cas9/Izotermičkog sastavljanja za uvođenje tačkaste mutacije. Donor se napravi tradicionalnim kloniranjem. Selekciona kaseta se insertuje u sintetski DNK fragment koji sadrži linkerske preklope i tačkastu mutaciju. mBAC se seče pomoću Cas9, sekvenca se uklanja iz mBAC i mBAC se Gibsonovim sastavljanjem spaja sa donorom što rezultuje konstruktom (LTVEC) koji uključuje tačkastu mutaciju i selekcionu kasetu.

Primer 11: Skraćivanje BAC Cas9/Izotermičkim sastavljanjem

[0184] SL. 19 prikazuje primer skraćivanja BAC korišćenjem metoda Cas9/Izotermičkog sastavljanja. Oblast koju treba ukloniti iz LTVEC odvaja se korišćenjem Cas9. U ovom primeru, skraćivanjem BAC uklanja se Ori sekvenca. Ori se zamenjuje u Gibsonovoj reakciji sastavljanja korišćenjem 2 linkera (spojni oligonukleotidi).

Primer 12: Drugi metodi digestije BAC pomoću CAS9 praćeni sastavljanjem

[0185] Drugi metodi mogu se koristiti u metodima obezbeđenim u ovom tekstu, uključujući sledeće: Sintetska ili in vitro-transkribovane tracrRNK i crRNK se prethodno spare pre reakcije zagrevanjem na 95 °C i sporim hlađenjem do sobne temperature. Nativna ili linearizovana plazmidna DNK (300 ng (oko 8 nM)) inkubira se 60 min na 37 °C sa prečišćenim Cas9 proteinom (50-500 nM) i tracrRNK:crRNK dupleksom (50-500 nM, 1:1) u puferu za Cas9-sečenje plazmida (20 mM HEPES pH 7.5, 150 mM KCl, 0.5 mM DTT, 0.1 mM EDTA) sa ili bez 10 mM MgCl2. Reakcija se zaustavlja pomoću 5 × pufera za nanošenje DNK, koji sadrži 250 mM EDTA, razdvaja elektroforezom na 0.8 ili 1% agaroznomm gelu i vizuelizuje bojenjem etidijum bromidom. Za testove sečenja mutanta pomoću Cas9, reakcije se prekidaju korišćenjem 5 × SDS pufera za nanošenje (30% glicerol, 1.2% SDS, 250 mM EDTA) pre nanošenja na agarozni gel.

[0186] Veštačka crRNK i veštačka tracrRNK dizajniraju se tako da ciljaju specifične sekvence u MAID 6177 (116 kb LTVEC) za spajanje sa PCR proizvodom od 3 kb (UB-HYG). PCR proizvod sadrži preklope od 50 bp sa vektorom. Koristi se izotermičko spajanje

4

bazirano na upotrebi izolovane termonestabilne 5’ ka 3’ egzonukleaze kojoj nedostaje 3’ egzonukleazna aktivnost, na sledeći način. Postavi se reakcija koja sadrži sledeće: 100 fmol svakog dsDNK supstrata, 16 μl 5 × ISO pufera, 16 μl T5 egzonukleaze (0.2 U/μl, Epicentre), 8.0 μl Taq DNK ligaze (40 U/μl, NEB), 1.0 μl Phusion™ DNK polimeraze (2 U/μl, NEB), i vodu do 80 μl. 5 × ISO (ISOtermički) pufer bio je 25% PEG-8000, 500 mM Tris-Cl, 50 mM MgC12, 50 mM DTT, 5 mM NAD, i 1000 μM svakog dNTP (pH 7.5).

[0187] Ovim se dobija finalna koncentracija od 1.25 fmol/μl svake dsDNK (ili 45 fmol/μl svake ssDNK) koja treba da se spoji, 5% PEG-8000, 100 mM Tris-Cl pH 7.5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 200 MM svakog dNTP, 1 mM NAD, 0.02 U/μl T5 eegzonukleaze, 4 U/μl Taq DNK ligaze, i 0.03 U/μl PHUSION DNK polimeraze.

[0188] U metodima se koristi 1.64 μl (0.2 U/μl) T5 egzonukleaze za supstrate koji vrše preklapanje 20-80 bp, i za supstrate koji imaju veće preklope (npr., 200 bp), koristi se 1.6 μl (1 U/μl) T5 egzonukleaze. T5 egzonukleaza se koristi kao rastvor 1:50 (u puferu za skladištenje T5 egzonukleaze) koncentrisanog enzimskog stok rastvora T5 egzonukleaze od 10 U/μl (Epicentre). Reakcija se zatim inkubira na 50°C 15 minuta.

Primer 13: Drugi metodi spajanja dva preklapajuća BAC

[0189] U metodima datim u ovom tekstu mogu se koristiti drugi metodi uključujući sledeće: Sintetska ili in vitro-transkribovane tracrRNK i crRNK se prethodno spare pre reakcije zagrevanjem na 95 °C i sporim hlađenjem do sobne temperature. Nativna ili linearizovana plazmidna DNK (300 ng (oko 8 nM)) inkubira se 60 min na 37 °C sa prečišćenim Cas9 proteinom (50-500 nM) i tracrRNK:crRNK dupleksom (50-500 nM, 1:1) u puferu za Cas9-sečenje plazmida (20 mM HEPES pH 7.5, 150 mM KCl, 0.5 mM DTT, 0.1 mM EDTA) sa ili bez 10 mM MgCl2. Reakcija se zaustavlja pomoću 5 × pufera za nanošenje DNK koji sadrži 250 mM EDTA, razdvaja elektroforezom na 0.8 ili 1% agaroznom gelu i vizuelizuje bojenjem etidijum bromidom. Za testove sečenja mutanta pomoću Cas9, reakcije se prekidaju korišćenjem 5 × SDS pufera za nanošenje (30% glicerol, 1.2% SDS, 250 mM EDTA) pre nanošenja na agarozni gel.

[0190] Veštačka crRNK i veštačka tracrRNK dizajniraju se tako da ciljaju specifične sekvence u humanizovanom HLA-DQ BAC za spajanje sa humanizovanim HLA-DR BAC. Vektori sadrže međusobne preklope od ∼70 bp napravljene sečenjem pomoću Cas9 na dva mesta na svakom vektoru (vidi, SL. 2). Koristi se izotermičko spajanje u jednom koraku na bazi upotrebe izolovane termonestabilne 5’ ka 3’ egzonukleaze kojoj nedostaje 3’ egzonukleazna aktivnost, na sledeći način. Postavi se reakcija koja sadrži približno sledeće: 100 fmol svakog dsDNK supstrata, 16 μl 5 × ISO pufera, 16 μl T5 egzonukleaze (0.2 U/μl, Epicentre), 8.0 μl Taq DNK ligaze (40 U/μl, NEB), 1.0 μl Phusion™ DNK polimeraze (2 U/μl, NEB), i vodu do 80 μl.5 × ISO (Izotermički) pufer je bio 25% PEG-8000, 500 mM Tris-Cl, 50 mM MgC12, 50 mM DTT, 5 mM NAD, i 1000 μM svakog dNTP (pH 7.5).

[0191] Ovim se dobija finalna koncentracija od 1.25 fmol/μl svake dsDNK (ili 45 fmol/μl svake ssDNK) koja treba da se spoji, 5% PEG-8000, 100 mM Tris-Cl pH 7.5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 200 MM svakog dNTP, 1 mM NAD, 0.02 U/μl T5 eegzonukleaze, 4 U/μl Taq DNK ligaze, i 0.03 U/μl PHUSION DNK polimeraze.

[0192] U metodima se koristi 1.64 μl, 0.2 U/μl, T5 egzonukleaze za supstrate koji vrše preklapanje sa 20-80 bp, i za supstrate koji imaju veće preklope (npr., 200 bp), koristi se 1.6 μl, 1 U/μl, T5 egzonukleaze. T5 egzonukleaza se koristi kao rastvor 1:50 (u puferu za skladištenje T5 egzonukleaze) koncentrisanog enzimskog stok rastvora T5 egzonukleaze od 10 U/μl (Epicentre). Reakcija se zatim inkubira na 50°C 15 minuta.

Primer 14: Drugi metodi spajanja inserta sa BAC vektorom

[0193] U metodima obezbeđenim u ovom tekstu mogu se koristiti drugi metodi uključujući sledeće: Rastvoriti crRNK i tracrRNK do 100 uM u Hybe puferu (10 × pufer: 20 mM Tris 7.5, 100-150 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT, 0.1 mM EDTA, 100 ug/ml BSA). Za sparivanje RNK, dodati10 ul 100 uM crRNK i 10 ul 100 uM tracrRNK u 80 ul pufera za sparivanje. Grejati RNK u temp. bloku na 90 °C zatim ukloniti blok iz grejača i ohladiti na radnoj površini. Finalna koncentracija RNK je oko 10 uM.

[0194] Sa ciljem digestije BAC, koristi se čista maxiprep BAC DNK i BAC digestira prema sledećoj mešavini.

1 ×

BAC DNK (500 ng) X ul

BSA 0.5 ul

RNK 2 ul (1 ul svakog tracr:crRNK hibrida) Cas9 (4.5 mg/ml) 1 ul

10 × pufer<1.5 ul>

H2O do 15 ul

Digestirati 1 sat na 37° zatim desalinisati 30 min.

[0195] Sa ciljem sastavljanja BAC i inserta, digestirati plazmid ili izvesti PCR da bi se napravio insert. Za PCR reakcije, pustiti mali alikvot na gel i potražiti čisti proizvod, ako proizvod nije čist uraditi PCR čišćenje umesto ekstrakcije na gelu. Poželjan molarni odnos BAC:insert je 1:1-1:6. Obično će biti dovoljno 50 ng prečišćenog inserta. Može se koristiti sledeća reakciona mešavina:

BAC digestat 4 ul

Insert 1 ul

Mešavina za 15 ul

spajanje

[0196] Dodati DNK i mešavinu na ledu ili direktno u PCR mašinu na 50 °C. Inkubirati na 50°C 1 sat. Dodati 0.5 uL Proteinaze K (20 mg/ml) i inkubirati na 50°C 1 sat. Desalinisati 30 min i elektroporisati 8 ul reakcije u DH10B ćelije. 10 ul BAC digestata može da se pusti na pulse-field gel da se proveri efikasnost digestije. Upotrebiti vodu bez RNaze i pufere. Finalni reakcioni pufer sadrži: 20 mM Tris 7.5; 100-150 mM NaCl; 10 mM MgC12; 1 mM DTT; 0.1 mM EDTA; 100 ug/ml BSA; za finalnu zapreminu od 15 ul.

[0197] tracr RNK sekvenca upotrebljena u primeru je:

CAAAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUC (SEQ ID NO: 9). Ova CRISPR RNK (crRNK) sadrži: (1) oko 20 nukleotida RNK komplementarnih sa ciljnom sekvencom i (2) sekvencu repa (GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG (SEQ ID NO: 10)) koja će se spariti sa tracrRNK.

1

2

4

�

�

�

Claims (15)

PATENTNI ZAHTEVI

1. In vitro metod bešavnog sastavljanja dveju ili više dvolančanih nukleinskih kiselina, naznačen time, što uključuje:

(a) dovođenje u kontakt prve nukleinske kiseline sa najmanje jednim nukleaznim sredstvom da bi se dobila prva digestirana nukleinska kiselina kojoj je uklonjen završni deo;

(b) dovođenje u kontakt prve digestirane nukleinske kiseline sa drugom nukleinskom kiselinom, dvolančanim spojnim oligonukleotidom, i egzonukleazom, pri čemu je spojni oligonukleotid predstavljen linearnom dvolančanom DNK od oko 50 bp do oko 400 bp i uključuje:

(i) prvu komplementarnu sekvencu koja je komplementarna sa prvom digestiranom nukleinskom kiselinom;

(ii) spejser; i

(iii) drugu komplementarnu sekvencu koja je komplementarna sa drugom nukleinskom kiselinom

gde spejser uključuje sekvencu identičnu sa završnim delom,

pri čemu između prve komplementarne sekvence i sekvence identične sa završnim delom nema nukleinsko-kiselinskih baza, i između druge komplementarne sekvence i sekvence identične sa završnim delom nema nukleinsko-kiselinskih baza, i

pri čemu egzonukleaza izlaže prvu i drugu komplementarnu sekvencu; i (c) sastavljanje spojnog oligonukleotida sa prvom digestiranom nukleinskom kiselinom i drugom nukleinskom kiselinom, pri čemu se sastavljanjem rekonstituiše završni deo.

2. Metod iz patentnog zahteva 1, naznačen time, što sastavljanje u koraku (c) uključuje:

(i) sparivanje prve komplementarne sekvence spojnog oligonukleotida sa prvom digestiranom nukleinskom kiselinom i druge komplementarne sekvence spojnog oligonukleotida sa drugom nukleinskom kiselinom; i

(ii) povezivanje spojnog oligonukleotida sa prvom digestiranom nukleinskom kiselinom i drugom nukleinskom kiselinom.

3. Metod iz patentnog zahteva 1 ili 2, naznačen time, što korak (a) uključuje još i:

(i) dovođenje u kontakt druge nukleinske kiseline sa drugim nukleaznim sredstvom i egzonukleazom, pri čemu drugo nukleazno sredstvo seče drugu nukleinsku kiselinu na drugom ciljnom mestu da se proizvede druga digestirana nukleinska kiselina koja sadrži nukleotidnu sekvencu komplementarnu sa drugom komplementarnom sekvencom spojnog oligonukleotida, pri čemu se prva digestirana nukleinska kiselina sastavlja sa drugom digestiranom nukleinskom kiselinom; ili

(ii) dovođenje u kontakt druge nukleinske kiseline sa restrikcionim enzimom i egzonukleazom, pri čemu restrikcioni enzim seče drugu nukleinsku kiselinu da bi se proizvela druga digestirana nukleinska kiselina koja uključuje nukleotidnu sekvencu komplementarnu sa drugom komplementarnom sekvencom u spojnom oligonukleotidu, pri čemu se prva digestirana nukleinska kiselina sastavlja sa drugom digestiranom nukleinskom kiselinom.

4. Metod iz bilo kojeg od prethodnih patentnih zahteva, naznačen time, što korak (b) uključuje još i produžavanje 3’ kraja prve digestirane nukleinske kiseline.

5. Metod iz bilo kojeg od prethodnih patentnih zahteva, naznačen time, što je spojni oligonukleotid sastavlja sa prvom digestiranom nukleinskom kiselinom i drugom nukleinskom kiselinom u istoj reakciji ili sekvencijalno.

6. Metod iz bilo kojeg od prethodnih patentnih zahteva, naznačen time, što najmanje jedno nukleazno sredstvo uključuje Cas protein i vodičku RNK (gRNK) (gRNK-Cas ompleks), zinc finger nukleazu, ili efektorsku nukleazu sličnu transkripcionom aktivatoru (TALEN).

7. In vitro metod bešavnog sastavljanja dveju ili više dvolančanih nukleinskih kiselina, naznačen time, što uključuje:

(a) dovođenje u kontakt prve nukleinske kiseline sa prvim nukleaznim sredstvom da bi nastala prva digestirana nukleinska kiselina sa uklonjenim završnim delom;

(b) dovođenje u kontakt druge nukleinske kiseline sa drugim nukleaznim sredstvom da bi nastala druga digestirana nukleinska kiselina;

(c) dovođenje u kontakt prve digestirane nukleinske kiseline i druge digestirane nukleinske kiseline sa dvolančanim spojnim oligonukleotidom i egzonukleazom, pri čemu je spojni oligonukleotid predstavljen linearnom dvolančanom DNK dugom od oko 50 bp do oko 400 bp i uključuje:

(i) prvu komplementarnu sekvencu koja je komplementarna sa prvom digestiranom nukleinskom kiselinim;

(ii) spejser; i

(iii) drugu komplementarnu sekvencu koja je komplementarna sa drugom digestiranom nukleinskom kiselinom,

pri čemu spejser uključuje sekvencu koja je identična sa završnim delom, pri čemu između prve komplementarne sekvence i sekvence koja je identična sa završnim delom nema nukleinsko-kiselinskih baza, i između druge komplementarne sekvence i sekvence koja je identična sa završnim delom nema nukleinsko-kiselinskih baza, i

pri čemu egzonukleaza izlaže prvu i drugu komplementarnu sekvencu; i

(d) sastavljanje spojnog oligonukleotida sa prvom digestiranom nukleinskom kiselinom i drugom digestiranom nukleinskom kiselinom, pri čemu se sastavljanjem rekonstituiše završni deo.

8. Metod iz patentnog zahteva 7, naznačen time, što sastavljanje u koraku (d) uključuje:

(i) sparivanje prve komplementarne sekvence spojnog oligonukleotida sa prvom digestiranom nukleinskom kiselinom i druge komplementarne sekvence spojnog oligonukleotida sa drugom digestiranom nukleinskom kiselinom; i (ii) povezivanje spojnog oligonukleotida sa prvom digestiranom nukleinskom kiselinom i drugom digestiranom nukleinskom kiselinom.

9. Metod iz patentnog zahteva 7 ili 8, naznačen time, što korak (c) uključuje još i produžavanje 3’ kraja prve digestirane nukleinske kiseline i/ili druge digestirane nukleinske kiseline.

10. Metod iz bilo kojeg od patentnih zahteva 7-9, naznačen time, što se spojni oligonukleotid sastavlja sa prvom digestiranom nukleinskom kiselinom i drugom digestiranom nukleinskom kiselinom u istoj reakciji ili sekvencijalno.

11. Metod iz bilo kojeg od patentnih zahteva 7-10, naznačen time, što prvo nukleazno sredstvo i/ili drugo nukleazno sredstvo uključuje Cas protein i vodičku RNK (gRNK) (gRNK-Cas kompleks), zinc finger nukleazu, ili efektorsku nukleazu sličnu transkripcionom aktivatoru (TALEN).

12. Metod iz bilo kojeg od prethodnih patentnih zahteva, naznačen time, što:

(I) prva komplementarna sekvenca spojnog oligonukleotida ima između 15 i 120 komplementarnih baza i druga komplementarna sekvenca spojnog oligonukleotida ima između 15 i 120 komplementarnih baza; i/ili

(II) završni deo ima najmanje 20 bp; i/ili

(III) spejser ima od oko 20 bp do oko 120 bp.

13. Metod iz bilo kojeg od prethodnih patentnih zahteva, naznačen time, što:

(I) prva nukleinska kiselina, druga nukleinska kiselina, ili obe nukleinske kiseline uključuju bakterijski veštački hromozom; i/ili

(II) prva nukleinska kiselina, druga nukleinska kiselina, ili obe nukleinske kiseline uključuju humanu DNK, glodarsku DNK, sintetsku DNK, ili njihovu kombinaciju; i/ili

(III) prva nukleinska kiselina, druga nukleinska kiselina, ili obe nukleinske kiseline imaju najmanje10 kb; i/ili

(IV) prva nukleinska kiselina, druga nukleinska kiselina, ili obe nukleinske kiseline imaju najmanje10 kb, uključuju bakterijski veštački hromozom, i uključuju humanu DNK, glodarsku DNK, sintetsku DNK, ili njihovu kombinaciju.

14. Metod iz bilo kojeg od prethodnih patentnih zahteva, naznačen time, što se sastavljaju najmanje tri nukleinske kiseline.

15. Metod iz bilo kojeg od prethodnih patentnih zahteva, naznačen time, što:

(I) spojni oligonukleotid ima od oko 100 bp do oko 300 bp; i/ili

(II) prva komplementarna sekvenca spojnog oligonukleotida ima između 20 i 80 komplementarnih baza i druga komplementarna sekvenca spojnog oligonukleotida ima između 20 i 80 komplementarnih baza.