[go: up one dir, main page]

RS60270B1 - Neutralizacija antitela do gp120 i njihova upotreba - Google Patents

Neutralizacija antitela do gp120 i njihova upotreba

Info

Publication number
RS60270B1
RS60270B1 RS20200525A RSP20200525A RS60270B1 RS 60270 B1 RS60270 B1 RS 60270B1 RS 20200525 A RS20200525 A RS 20200525A RS P20200525 A RSP20200525 A RS P20200525A RS 60270 B1 RS60270 B1 RS 60270B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
antibody
hiv
antigen
seq
binding fragment
Prior art date
Application number
RS20200525A
Other languages
English (en)
Inventor
Mark Connors
Jinghe Huang
Byong Ha Kang
John Mascola
Elise Ishida
Tongqing Zhou
Peter Kwong
Anqi Zheng
Original Assignee
The United States Of America As Represented By The Secretary Department Of Health And Human Services
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by The United States Of America As Represented By The Secretary Department Of Health And Human Services filed Critical The United States Of America As Represented By The Secretary Department Of Health And Human Services
Publication of RS60270B1 publication Critical patent/RS60270B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
    • C07K16/1036—Retroviridae, e.g. leukemia viruses
    • C07K16/1045—Lentiviridae, e.g. HIV, FIV, SIV
    • C07K16/1063—Lentiviridae, e.g. HIV, FIV, SIV env, e.g. gp41, gp110/120, gp160, V3, PND, CD4 binding site
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/468—Immunoglobulins having two or more different antigen binding sites, e.g. multifunctional antibodies
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • G01N33/56988—HIV or HTLV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/08—RNA viruses
    • G01N2333/15—Retroviridae, e.g. bovine leukaemia virus, feline leukaemia virus, feline leukaemia virus, human T-cell leukaemia-lymphoma virus
    • G01N2333/155—Lentiviridae, e.g. visna-maedi virus, equine infectious virus, FIV, SIV
    • G01N2333/16—HIV-1, HIV-2
    • G01N2333/162—HIV-1, HIV-2 env, e.g. gp160, gp110/120, gp41, V3, peptid T, DC4-Binding site
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/26—Infectious diseases, e.g. generalised sepsis

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Description

Opis
OBLAST PRONALASKA
[0001] Ovaj pronalak se odnosi na monoklonska antitela i antigen vezujuće fragmenete koji se specifično vezuju sa gp120 i njihovu upotrebu, na primer, u postupcima lečenja subjekta sa HIV-1 infekcijom.
[0002] Human Immunodeficiency Virus type 1 (HIV-1) infekcija i rezultujući sindrom stečene imunodeficijencije (AIDS), ostaju pretnja za globalno javno zdravlje, uprkos velikim naporima da se razviju anti-HIV-1 terapeutski agensi.
[0003] Virus sa omotačem, HIV-1 se skriva od humoralnog prepoznavanja pomoću širokog spektra zaštitnih mehanizama. Glavni protein HIV-1 omotača (HIV-1 Env) je glikoprotein od oko 160 kD (gp160). Tokom infekcije, proteaze ćelije domaćina cepaju gp160 na gp120 i gp41. gp41 je integralni membranski protein, dok gp120 štrči iz zrelog virusa. Zajedno gp120 i gp41 čine HIV-1 šiljak omotača, koji je je meta za neutrališuća antitela. Identifikovana su široko neutrališuća antitela koja se vezuju za HIV-1 Env, uključujuć i antitelo VRC01, koje se specifično vezuje za CD4 mesto vezivanja od gp120 i može da neutrališe visok procenat sojeva HIV-1. Međutim, postoji potreba da se razviju dodatna neutrališuća antitela za HIV-1 sa različitim profilima prepoznavanja i neutralizacije za komercijalnu proizvodnju.
[0004] Xueling et al., 2010 otkriva tri monoklonska antitela VRC01, VRC02 i VRC03 usmerena na CD4-mesto vezivanja proteina gp120 HIV-1 iz seruma osoba inficiranih sa HIV-1. Pokazano je da je VRC01 i VRC02, par somatskih varijanti istog klona, neutralisao preko 90% cirkulišućih HIV-1 izolata.
[0005] WO 2012/154312 opisuje monoklonska neutrališuća antitela koja se specifično vezuju za CD4 mesto vezivanja proteina gp120 HIV-1. Takođe je opisana identifikacija ovih antitela i njihova upotreba. Takođe su obezbeđene metode za pojačavanje aktivnosti vezivanja i neutralisanja svakog od ovih antitela korišćenjem proba scaffold epitopa.
REZIME
[0006] Pronalazak je definisan patentnim zahtevima.
[0007] Predmetni pronalazak obezbeđuje izolovano monoklonsko antitelo, koje obuhvata:
varijabilni region teškog lanca (VH) koji sadrži regione koji određuju komplementarnost teškog lanca (HCDR)1, HCDR2, i HCDR3 koji sadrže aminokiselinske sekvence navedene kao SEK ID BR: 7, 8 i 9, respektivno, i varijabilni region lakog lanca (VL) koji sadrži regione koji određuju komplementarnost (LCDR)1, LCDR2, LCDR3 koji sadrže aminokiselinske sekvence navedene kao SEK ID BR: 10, 11 i 12, respektivno (N6 CDR);
VH koji sadrži HCDR1, HCDR2, i HCDR3 koji sadrže aminokiselinske sekvence navedene kao SEK ID BR: 13, 14, i 15, respektivno, i VL koji sadrži LCDR1, LCDR2, i LCDR3, koji sadrže amino kiselinske sekvence navedene kao SEK ID BR: 16, 17, i 18, respektivno (N17 CDR); ili
VH koji sadrži HCDR1, HCDR2, HCDR3 koji sadrže aminokiselinske sekvence navedene kao SEK ID BR: 7, 8 i 9, respektivno, i VL koji sadrži LCDR1, LCDR2, i LCDR3, koji sadrže aminokiselinske sekvence navedene kao SEK ID BR: 10, 17 i 18, respektivno (F8 CDR); i
gde se antitelo specifično vezuje za HIV-1 gp120 i neutrališe HIV-1 infekciju.
[0008] Ovde su obezbeđena izolovana monoklonska antitela i njihovi antigen vezujući fragmenti koji se specifično vezuju za CD4 mesto vezivanja na gp120 i neutrališu HIV-1. Kako je ovde otkriveno, novo antitelo nazvano "N6" je neutralisalo 98% pseudovirusa u panelu sa 181 pseudovirusa koji predstavlja širok spektar HIV-1 sojeva sa IC50< 50 µg/ml, i 96% pseudovirusa sa IC50< 1 µg/ml. Medijan IC50neutralisanih virusa je bio 0.038 µg/ml, među najpotentnijim do sada opisanim. Zatim, N6 je uspešno neutralisao 16 od 20 pseudovirusa u panelu koji su rezistentni na neutralizaciju pomoću VRC01, kanoničkog antitela koje široko neutrališe CD4 mesto vezivanja. Prema tome, realizacije pronalaska uključuju antitela ili antigen vezujuće fragmente sa specifičnošću vezivanja antitela N6, kao i njihove varijante.
[0009] Antitelo ili antigen-vezujući fragment sadrži varijabilni region teškog lanca (VH) koji sadrži HCDR1, HCDR2, i HCDR3 od VHnavedene kao SEK ID BR: 1 (N6 VH) i/ili varijabilni region lakog lanca (VL) koji sadrži LCDR1, LCDR2, i LCDR3 od VLnavedene kao SEK ID BR: 2 (N6 VL). Antitelo ili antigen-vezujući fragment sadrži VHkoji sadrži HCDR1, HCDR2, i HCDR3 od VHnavedene kao SEK ID BR: 3 (N17 VH) i/ili VLkoji sadrži LCDR1, LCDR2, i LCDR3 od VLnavedene kao SEK ID BR: 4 (N17 VH). Antitelo ili antigenvezujući fragment sadrže VHkoji sadrži HCDR1, HCDR2, i HCDR3 od VHnavedene kao SEK ID BR: 5 (F8 VH) i/ili VLkoji sadrži LCDR1, LCDR2, i LCDR3 od VLnavedene kao SEK ID BR: 6 (F8 VH). Opisana antitela i antigen-vezujući fragmenti mogu specifično da se vezuju za gp120 i neutrališu HIV-1
[0010] Antitelo ili antigen-vezujući fragment sadrži VHi VLsadrži amino kiselinske sekvence navedene kao SEK ID BR: 1 i 2, respektivno. Antitelo ili antigen-vezujući fragment sadrži VHi VLkoji sadrži amino kiselinske sekvence navedene kao SEK ID BR: 3 i 4, respektivno. Antitelo ili antigen-vezujući fragment sadrži VHi VLkoji sadrži amino kiselinske sekvence navedene kao SEK ID BR: 5 i 6 respektivno.
[0011] Takođe su otkrivene kompozicije koje uključuju antitela i antigen-vezujuće fragmente, nukleinske kiseline koje kodiraju antitela i antigen-vezujuće fragmente, ekspresione vektore koji sadrže nukleinske kiseline, i izolovane ćelije domaćini koje sadrže nukleinske kiseline. U nekoliko realizacija, molekul nukleinske kiseline koji kodira otkriveno antitelo ili antigen vezujući fragment može biti kDNK molekul koji kodira antitelo ili antigen-vezujući fragment. Molekul nukleinske kiseline može biti bicistronski ekspresioni konstrukt koji kodira VHi VLantitela ili antigen-vezujući fragment.
[0012] Otkrivena antitela i antigen vezujući fragmenti potencijalno neutrališu HIV-1 u prihvaćenom in vitro modelu HIV-1 infekcije. Prema tome, opisana antitela i antigen vezujući fragmenti za upotrebu u postupku za lečenje ili inhibiciju HIV-1 infekcije kod subjekta, koji obuhvata administraciju terapeutski efikasne količine jednog ili više opisanih antitela, antigenvezujućih fragmenata, molekula nukleinske kiseline, vektora, ili kompozicija, subjektu, kao što je subjekt sa rizikom ili koji ima HIV-1 infekciju su otkrivena.
[0013] Ovde opisana antitela, antigen vezujući fragmenti, molekuli nukleinske kiseline, vektori i kompozicije se mogu koristiti za različite dodatne svrhe, kao što je otkrivanje HIV-1 infekcije ili dijagnostika HIV-1 infekcije kod subjekta ili detektovanje HIV-1 u uzorku.
[0014] Prethodno navedeno i ostale karakteristike i prednosti ovog pronalaska biće jasnije iz sledećeg detaljnog opisa nekoliko izvođenja koje sledi uz pozivanje na prateće slike.
KRATAK OPIS SLIKA
[0015]
SI. 1A-1F prikazuju skup tabela i poravnavanje sekvenci koje ilustruju sekvence i aktivnost neutralizacije antitela N6 i nekoliko njegovih varijanti. (SI. 1A) Fingerprints neutralizacije koji obuhvataju deset različitih specifičnosti epitopa su korišć eni za ispitivanje serumske specifičnosti pacijenta Z258 inficiranog HIV-om. Serumi pacijenata 45 i 127/C, od koga su izolovana VRC01 i VRC01-slična antitela, su korišćeni kao kontrola. Vrednosti predviđaju frakciju neutralizacije seruma koja može biti pripisana specifičnosti svakog antitela. Snažni VRC01-slični signali su uočeni u serumima (vrednosti >0.3). Panel od 21 HIV-1 sojeva je korišćen u analizi neutralizacije i za izračunavanje širine seruma. (SI. 1B) Amino kiselinske sekvence varijabilnih regiona u N6, njegove varijante N17 i F8 i srodna antitela VRC01 i VRC27. Boldirane rezidue predstavljaju supstitucije embrionske sekvence. Za identifikaciju specifičnih rezidua u teškim i lakim lancima N6, se koristi Kabat numeracija. Prikazane sekvence uključuju IGHV1-2*02 (SEK ID BR: 77), N6 VH(SEK ID BR: 1), N17 VH(SEK ID BR: 3), F8 VH(SEK ID BR: 5, VRC01 VH(SEK ID BR: 73), VRC27 VH(SEK ID BR: 75), IGHV1-2*02 (SEK ID BR: 78), N6 VL(SEK ID BR: 2), N17 VL(SEK ID BR: 4), F8 VL(SEK ID BR: 6), VRC01 VL(SEK ID BR: 74) i VRC27 VL(SEK ID BR: 76). (Sl.1C) Germinativni geni varijabilnih regiona teškog i lakog lanca u N6. (Sl.1D) Potentnost i širina neutralisanja antitela protiv panela od 181-izolata Env-pseudovirusa. Podaci pokazuju broj testiranih virusa, procenat neutralisanih virusa, geometrijsku srednju vrednost i medijan IC50za viruse neutralisane sa IC50<50 µg/ml. (Sl. 1E) Krive širinapotentnost neutralizacije antitela protiv 181-pseudovirusnog panela. Puna linija prikazuje medijan IC50svih virusa, uključujuć i one sa IC50>50 µg/ml, kojima je dodeljena vrednost 50. Isprekidana linija prikazuje medijan IC50samo senzitivnih virusa. Brojevi na vrhu tačkastih površina predstavljaju procenat virusa rezistentnih na neutralizaciju. (Sl. IF) Neutralizacione karakteristike N6 antitela, kao i nekoliko N6 varijanti za panel od 20 pseudovirusa HIV-1 koji predstavljaju različite vrste sojeva HIV-1 rezistentnih na VRC01. Varijante uključuju varijantu 1 (N6 VH+ F8 VL), varijantu 2 (N6 VH+ N17 VL), varijantu 3 (N17 VH+ F8 VL), varijantu 4 (N17 VH+ N6 VL), varijantu 5 (F8 VH+ N6 VL) i varijantu 6 (F8 VH+ N17 VL).
Sl. 2 je tabela koja prikazuje profil neutralizacije N6, VRC01, 3BNC117 i VRC07-523-LS protiv 20 VRC01-rezistentnih pseudovirusa. Vrednosti su prikazane u µg/ml.
SI. 3A-3C su skup grafika i tabela koje prikazuju svojstva autoreaktivnosti N6. (Sl. 3A) Reaktivnost N6 sa HEP-2 epitelnim ćelijama. VRC07-G54W, VRC07-523-LS i 4E10 su korišćeni kao pozitivne kontrole. VRC01-LS je korišćen kao negativna kontrola. Koncentracija antitela je 25 µg/ml. Sve slike su prikazane pri uvećanju od 400x. (Sl. 3B) ELISA vezivanje N6 za kardiolipin. Kontrole su kao na Sl. 3A. (Sl. 3C) Reaktivnost N6 sa autoantigenima je detektovana pomoću Luminex testa. 4E10 je korišćen kao pozitivna kontrola. Synagis, anti-RSV monoklonsko antitelo, je korišćeno kao negativna kontrola. SSA, Sjogren sindrom antigen A; SSB, Sjogren sindrom antigen B; Sm, Smith antigen; RNP, ribonukleoprotein; Scl 70, skleroderma 70; Jol, antigen; CentrB, centromera B.
SI. 4A-4E predstavljaju skup grafika i tabela koji ilustruju specifičnost vezivanja N6 sa gp120. (Sl. 4A) ELISA vezivanje N6 sa gp120<YU2>u kompeticiji sa CD4Ig-biotinom, VRC01-biotinom i VRC-PG04-biotinom. B12, VRC01 i CD4-Ig su korišćeni kao pozitivne kontrole, a 2G12 je korišćeno kao negativna kontrola. (Sl. 4B) ELISA vezivanje N6 sa gp120<Bal>RSC3 i njihovi nokaut mutanti CD4 mesta vezivanja gp120<BaL>D368R i RSC3 Δ371I P363N. (SI. 4C) N6 i N6 Varijanta-1 se vezuju za foldon GPL40 (solubilni, trimerni gp140 povezan sa domenom foldona) i gp120, ali ne sa gp41 i MPER peptidom. (SI. 4D) Vezivanje N6 sa mutantima za skeniranja alanina u kontekstu monomernog gp120<JRCSF>pomoću ELISA. Numerisanje amino kiselina mutanata se zasniva na HIV-1 HXB2 sekvenci. Afiniteti vezivanja zarobljenih gp120 su mereni na osnovu koncentracije antitela na polovini maksimalnog vezivanja.
2G12 je korišćeno kao kontrola za merenje količine zarobljenog gp120 da se standardizuje uticaj svake mutacije na vezivanje antitela. (Sl. 4E) Neutralizacija panela gp120<JRCSF>alanin mutant pseudovirusa. Količnik promene neutralizacije je izračunat kao odnos IC50JRCSF mutanta/IC50JRCSF WT.
Sl. 5A-5E su skup tabela koje daju rezultate koji ilustruju mehanizam neutralizacije N6. (Sl.5A) Virusi rezistentni na N6 i profil neutralizacije autolognih virusa Z258. Prikazane su aminokiselinske sekvence petlje D, CD4 BLP i β23-V5 regiona iz N6 i VRC01-senzitivnih virusa HXB2, JRCSF i 93TH057, nekoliko N6-senzitivnih virusa ali VRC01-rezistentnih virusa, i N6- i VRC01-rezistentnih virusa. Varijacije sekvence gp120 koje pokazuju N6-rezistentni virusi i autologni virusi Z258 u poređenju sa referentnim sekvencama su boldirane. Numeracija sekvenci je zasnovana na HXB2. (Slike 5B-5C) Neutralizacija N6-rezistentnih virusa pomoću N6 i Z258 autolognih virusa i njihovih mutanta sa reverznim mutacijama petlje D, CD4 BLP i β23-V5 regiona. Antitela za CD4Ig i CD4 mesta vezivanja, VRC01, 3BNC117, VRC-PG04, 12A21 i VRC27 su korišć ena kao pozitivne kontrole, a 2G12 je korišć eno kao negativna kontrola. Prikazane su varijacije sekvence za gp120 koje pokazuju N6-rezistentni virusi i Z258 autologni virusi u poređenju sa referentnim sekvencama. (Slike 5D-5E) Neutralizacija N6 do N6-rezistentnih virusa i Z258 autolognih virusa sa reverznim mutacijama u D petlji. Reverzne mutacije u D petlji su boldirane i podvučene.
Sl. 6A-6F su set tabela koje prikazuju IC50i IC80vrednosti testova neutralizacije pseudovirusa za varijante skeniranja alanina za N6 (Sl. 6A-6B), za VRC27 (Sl. 6C-6D), i za VRC01 (Sl. 6E-6F) protiv šest VRC01-senzitivnih virusa. Vrednosti neutralizacije su prikazane u µg/ml. Količnik promene se definiše kao IC50mutant antitela/IC50antitela WT.
Sl.7 je tabela koja prikazuje IC50vrednosti iz testova neutralizacije pseudovirusa pomoću alanin varijanti N6 protiv šest VRC01-rezistentnih virusa i dva VRC01-sezitivna virusa. Vrednosti neutralizacije su prikazane u µg/ml. Median IC50se izračunava na bazi VRC01-rezistentnih virusa. Vrednosti neutralizacije su prikazane u µg/ml. Količnik promene se definiše kao odnos IC50mutant antitela/IC50antitelo WT.
Sl. 8A-8C je set tabela koji ilustruje neutralizaciju HIV-1 i vezivanje od antitela N6 i njegovih varijanti. (Sl. 8A) Neutralizacija unakrsno-komplementiranih antitela, uključujući teške i lake lance antitela N6, VRC01, VRC27 i 12A21. Količnik promene neutralizacije je izračunat kao odnos IC50originalnog antitela/IC50kombinacije antitela. Median IC50se bazira na svim ispitanim virusima, uključujući i rezistentne viruse, kojima je dodeljena vrednost 50. (Sl. 8B-8C) Neutralizacija pomoću mutant antitela sa supstitucijama različitih kontaktnih rezidua u N6 sa onima iz VRC01, VRC27 ili N6 varijante N17. N6 i VRC01 su korišćeni kao kontrole. Median IC50je izračunat na bazi svih VRC01-rezistentnih virusa. Za one kojima je IC50> 50, dodeljena je vrednost 50. Količnik promene neutralizacije je izračunat kao odnos IC50mutant antitela/IC50antitela WT.
Sl. 9 prikazuje set dijagrama koji ilustruje trodimenzionalnu strukturu antitela N6 u kompleksu sa gp120, i da N6 predstavlja VRC01 klasu antitela sa CDR H2 koji interaguje sa CD4-vezujućom petljom na HIV-1 gp120 i prepoznavajući motiv (eng. signature) LCDR3 od 5 amino kiselina.
Sl. 10 i 11 prikazuju da kada je superponiran na HIV-1 gp120, laki lanac iz N6 podrazumeva drugačiju orijentaciju u odnosu na druga antitela klase VRC01 i ova orijentacija omogućava da laki lanac N6 izbegne potencijalne sudare sa V5 i D petljom HIV-1 gp120.
Sl. 11 prikazuje da kao i ostale VRC01 klase antitela, N6 takođe koristi fleksibilni GxG motiv u LCDR1 da izbegne sudare sa D petljom.
Sl.12A i 12B su set dijagrama koji ilustruju da HCDR2 i LCDR3 u N6 doprinose toleranciji varijacije gp120 V5 uočene za N6. Sl.13 prikazuje da N6 LCDR3 Gln96 angažuje Petlju V5, indirektno da smeste varijacije u V5, i prikazuje da VRC01 LCDR3 Gln96 angažuje petlju V5 sa vodoničnom vezom i da je senzitivan na glomazniji bočni lanac u V5.
Sl.14, 15A i 15B su skup dijagrama i tabela koji ilustruju razvoj N6 unutar VRC27-linije porekla u donoru Z258. (Sl.14) Grafički prikazi Identitet-divergencija teških i lakih lanaca iz uzoraka donora Z258 u 2012, 2014 i 2015. Sekvence su prikazane kao funkcija identiteta sekvence sa N6 (na vrhu) i VRC27 (na dnu) i divergencije sekvence iz teških lanaca IGHV1-2*02 (levo) ili lakih lanaca IGKV1-33*01 (desno) gena germinativne linije V. (SI. 15A) Upareno filogenetsko stablo N6 linije porekla. Filogenetsko stablo teškog lanca je bazirano na identitetu sekvence u CDR H3 sa onom iz N6, VRC27 F8 ili N17. Filogenetsko stablo lakog lanca je bazirano na čitanjima koja potiču od IGKV1-33*01 i prepoznavajućeg motiva CDRL3 od 5 amino kiselina VRC01-klase antitela. (Sl. 15B) Aminokiselinske sekvence varijabilnog regiona NGS pretpostavljenih intermedijera upoređene sa N6. Rezidue u svetlije sivoj boji predstavljaju supstitucije iz I1 sekvenci teških i lakih lanaca. Kabat numeracija se koristi za identifikaciju specifičnih rezidua teških i lakih lanaca u N6. Prikazane sekvence uključuju IGHV1-2*02 (SEK ID BR: 77), I1 VH(SEK ID BR: 79), I2 VH(SEK ID BR: 80), I3 VH(SEK ID BR: 81), I4 VH(SEK ID BR: 82), N6 VH(SEK ID BR: 1), I5 VH(SEK ID BR: 83), VRC27 VH(SEK ID BR: 75), IGHV1-2*02 (SEK ID BR: 78), I1 VL(SEK ID BR: 84), I2 VL(SEK ID BR: 85), I3 VL(SEK ID BR: 86), I4 VL(SEK ID BR: 87), I5 VL(SEK ID BR: 88), I6 VL(SEK ID BR: 89), N6 VL(SEK ID BR: 2), I7 VL(SEK ID BR: 90), I8 VL(SEK ID BR: 91), I9 VL(SEK ID BR: 92), I10 VL(SEK ID BR: 93), i VRC27 VL(SEK ID BR: 76) .
Sl. 16 i 17 su tabele neutralizacije VRC01-rezistentnih pseudovirusa pomoću raznih kombinacija N6-sličnih teških i lakih lanaca dobijenih pomoću NGS sekvenciranja iz vremenskih tačaka 2014. i 2015. (Sl. 16, varijanta sekvenci prikazanih na Slici. 18) ili inputirani prekursori od N6 (Sl. 17, varijanta sekvenci prikazanih na Sl.15B).
Sl.18 prikazuje poravnanje sekvenci varijante N6 teškog i lakog lanca.
SEKVENCE
[0016] Nukleinske i amino kiselinske sekvence navedene u pratećoj listi sekvenci su prikazane korišćenjem standardnih slovnih skraćenica za baze nukleotida, i troslovnog koda za amino kiseline, kako je definisano u 37 C.F.R. 1.822. Prikazan je samo jedan lanac svake sekvence nukleinske kiseline, ali se podrazumeva da bilo koje pozivanje na prikazani lanac uključuje i komplementarni lanac. Lista sekvenci se podnosi kao ASCII tekstualna datoteka u obliku datoteke pod nazivom "Sequence.txt" (~100 kb), koja je izrađena 17. Marta 2016. godine. U pratećoj listi sekvenci:
SEK ID BR: 7-18 su amino kiselinske kabat sekvence CDR-a antitela N6, N17 i F8.
SEK ID BR: 19-24 su konsenzus aminokiselinske sekvence kabat CDR-a antitela N6, N17 i F8. SEK ID BR: 25-34 su amino kiselinske sekvence koje se odnose na himerne antigen receptore.
SEK ID BR: 35 je amino kiselinska sekvenca HIV-1 Env iz HXB2 soja HIV-1.
DETALJAN OPIS
I. Kratak pregled termina
[0017] Ukoliko nije drugačije navedeno, tehnički termini se koriste u skladu sa njihovom konvencionalnom upotrebom. Definicije uobičajenih termina u molekularnoj biologiji se mogu naći u Benjamin Lewin, Genes X, koju su objavili Jones & Bartlett Publishers, 2009; i Meyers et al. (eds.), The Encyclopedia of Cell Biology and Molecular Medicine, objavljenu od Wiley-VCH u 16 tomova, 2008; i drugim sličnim izvorima.
[0018] Kako se ovde koristi, oblici jednine "jedan" i "neki", se odnose i na jedninu i množinu, osim ako kontekst jasno ne navodi drugačije. Na primer, izraz "antigen" uključuje jednu ili množinu antigena i može se smatrati ekvivalentnim izrazu "najmanje jedan antigen." Kako je ovde korišćen, termin "obuhvata" znači "uključuje". Dalje treba razumeti da su bilo koja i sve veličine baze ili veličine amino kiseline, i sve vrednosti molekulske težine ili molekulske mase, date za nukleinske kiseline ili polipeptide približne, i predvidene za opisne svrhe, osim ako nije drugačije naznačeno. Iako se mogu koristiti mnoge metode i materijali slični ili ekvivalentni ovde opisanim, ovde su opisani posebni pogodni postupci i materijali. U slučaju spora, za kontrolu će biti korišćena predmetna specifikacija, uključujući i objašnjenja pojmova. Pored toga, materijali, postupci i primeri su samo ilustrativni i nije namera da oni budu ograničavajući. Da bi se olakšao pregled različitih aspekata, data su sledeća objašnjenja termina:
Administracija: Uvođenje kompozicije u subjekta izabranim putem. Administracija može biti lokalna ili sistemska. Na primer, ako je izabrani put intravenozni, kompozicija se administrira uvođenjem kompozicije u venu subjekta. Primeri puteva administracije uključuju, ali nisu ograničeni na, oralni, injekciju (kao što subkutana, intramuskularna, intradermalna, intraperitonealna i intravenska), sublingvalni, rektalni, transdermalni (npr. topikalni), intranazalni, vaginalni i inhalacioni put.
[0019] Supstitucija Amino kiseline: Zamena jedne aminokiseline u proteinu sa drugačijom amino kiselinom.
[0020] Anti-retrovirusni agens: Agens koji specifično inhibira replikaciju retrovirusa ili inficiranje ćelija. Neograničavajući primeri antiretrovirusnih lekova obuhvataju inhibitore ulaza (npr. enfuvirtid), antagoniste CCR5 receptora (npr. aplavirok, vikrivirok, maravirok), inhibitore reverzne transkriptaze (npr. lamivudin, zidovudin, abakavir, tenofovir, emtricitabin, efavirenc), inhibitore proteaze (npr. lopivar, ritonavir, raltegravir, darunavir, atazanavir), inhibitore maturacije (npr. alfa interferon, bevirimat i vivekon).
[0021] Anti-retrovirusna terapija (ART): Lečenje HIV-1 infekcije uključuju administraciju najmanje jednog anti-retrovirusnog agensa (npr, jedan, dva, tri ili četiri anti-retrovirusna agensa) HIV-1 inficiranom pojedincu. Jedan primer ART režima obuhvata lečenje kombinacijom tenofovir, emtricitabin i efavirenc. U nekim primerima, ART uključuje visoko Aktivne Anti-Retroviralne Terapije (HAART). Jedan primer HAART režima obuhvata lečenje kombinacijom tenofovir, emtricitabin i efavirenc.
[0022] Antitelo: Imunoglobulin, antigen-vezujući fragment ili njihov derivat, koji se specifično vezuje i prepoznaje analit (antigen), kao što je HIV-1 gp120. Termin "antitelo" se ovde koristi u najširem smislu i obuhvata različite strukture antitela, uključujući, ali ne ograničavajući se na monoklonska antitela, poliklonska antitela, multispecifična antitela (npr. bispecifična antitela), i fragmente antitela, dokle god pokazuju željenu aktivnost vezivanja antigena.
[0023] Neograničavajući primeri antitela uključuju, na primer, intaktne imunoglobuline i njihove varijante i fragmente poznate u struci koji zadržavaju afinitet vezivanja za antigen. Primeri fragmenata antitela uključuju ali nisu ograničeni na Fv, Fab, Fab’, Fab’-SH, F(ab’)2; dijatela; linearna antitela; molekule jednolančana antitela (npr. scFv); i multispecifična antitela formirana od fragmenata antitela. Fragmenti antitela uključuju antigen-vezujuće fragmente bilo proizvedene modifikacijom celih antitela ili onih sintetisanih de novo korišćenjem metodologija rekombinantne DNK (vidi, npr. Kontermann and Dubel (Ed), Antibody Engineering, Tomovi 1-2, 2. izdanje, Springer Press, 2010).
[0024] Jednolančano antitelo (scFv) je molekul proizveden genetskim inženjeringom koji sadrži VHi VLdomene jednog ili više antitela povezane pogodnim polipeptidnim linkerom kao genetski fuzionisan jednolančani molekul (videti, na primer, Bird et al., Science, 242: 423-426, 1988; Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 85:5879-5883, 1988; Ahmad et al., Clin. Dev. Immunol., 2012, doi: 10.1155/2012/980250; Marbry, IDrugs, 13:543-549, 2010). Intramolekulska orijentacija VH-domena i VL-domena u scFv, obično nije odlučujuća za scFv. Tako, može biti korišćen scFv sa oba moguća rasporeda (VH-domen-linker domen-VL-domen; VL-domen-linker domen-VH-domen).
[0025] U dsFv VHi VLsu mutirani da se uvede disulfidna veza za stabilizaciju asocijacije lanaca. Takođe su uključena dijatela su, koja su bivalentna, bispecifična antitela u kojima su VHi VLdomeni eksprimirani na pojedinačnom lancu polipeptida, ali korišćenjem linkera koji je suviše kratak da se omogući sparivanje između dva domena na istom lancu, prisiljavajući domene da se spare sa komplementarnim domenima drugog lanca i stvore dva mesta vezivanja antigena (vidi, npr., Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 90:6444-6448, 1993; Poljak et al., Structure, 2:1121-1123, 1994).
[0026] Antitela takođe obuhvataju forme dobijene genetskim inženjeringom poput himernih antitela (kao što su humanizovana mišja antitela) i Heterokonjugovana antitela (kao što su bispecifična antitela). Vidi takođe, Pierce Catalog and Handbook, 1994-1995 (Pierce Chemical Co., Rockford, IL); Kuby, J., Immunology, 3rd Ed., W.H. Freeman & Co., New York, 1997.
[0027] "Antitelo koje se vezuje za isti epitop" kao referentno antitelo se odnosi na antitelo koje blokira vezivanje referentnog antitela za njegov antigen u testu kompeticije za 50% ili više, i obrnuto, referentnom antitelu blokira vezivanje antitela za njegov antigen u testu kompeticije za 50% ili više. Poznati su testovi kompeticije antitela, i ovde je obezbeđen primer testa kompeticije.
[0028] Antitelo može imati jedno ili više mesta vezivanja. Ako postoji više od jednog mesta vezivanja, mesta vezivanja mogu biti identična među sobom ili mogu biti različita. Na primer, imunoglobulin koji se prirodno javlja ima dva identična mesta vezivanja, jednolančano antitelo ili Fab fragment ima jedno mesto vezivanja, dok bispecifično ili bifunkcionalno antitelo ima dva različita mesta vezivanja.
[0029] Tipično, imunoglobulin ima teške (H) lance i lake (L) lance međusobno povezane disulfidnim vezama. Geni Imunoglobulina uključuju kapa, lambda, alfa, gama, delta, epsilon i mu gene konstantnog regiona, kao i mnoštvo gena varijabilnih domena imunoglobulina. Postoje dva tipa lakih lanaca, lambda (λ) i kapa (κ). Postoji pet glavnih klasa teških lanaca (ili izotipova) koji određuju funkcionalnu aktivnost molekula antitela: IgM, IgD, IgG, IgA i IgE.
[0030] Svaki teški i laki lanac sadrži konstantni region (ili konstantni domen) i varijabilni region (ili varijabilni domen, vidi, npr. Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., str. 91 (2007)). U nekoliko realizacija, VHi VLse kombinuju da specifično vežu antigen. U dodatnim realizacijama je potreban samo VH. Na primer, prirodna kamelid antitela koja se sastoje samo od teškog lanca su funkcionalna i stabilna u odsustvu lakog lanca (vidi, npr. Hamers-Casterman et al., Nature, 363:446-448, 1993; Sheriff et al., Nat. Struct. Biol., 3:733-736, 1996). Svako od opisanih antitela može uključivati heterologni konstantni domen. Na primer, antitelo može da uključuje konstantni domen koji se razlikuje od nativnog konstantnog domena, kao što je konstantni domen koji uključuje jednu ili više modifikacija (kao što su "LS" mutacije) kako bi produžilo poluživot.
[0031] Pozivanje na "VH" ili "VH" se odnose na varijabilni region teškog lanca antitela, uključujući i antigen vezujući fragment, kao što je Fv, scFv, dsFv ili Fab. Pozivanje na "VL" ili "VL" se odnosi na varijabilni domen lakog lanca antitela, uključujući i Fv, scFv, dsFv ili Fab.
[0032] VHi VLsadrže "okvirni" region prekinut sa tri hipervarijabilna regiona, takozvana "regiona koji određuju komplementarnost" ili "CDR" (vidi, npr. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, 1991). Sekvence okvirnih regiona različitih lakih ili teških lanaca su relativno očuvane (konzervisane) u okviru vrste. Okvirni region antitela, tj kombinovani okvirni regioni konstitutivnih lakih i teških lanaca, služe za pozicioniranje i poravnavanje CDR u trodimenzionalnom prostoru.
[0033] CDR-i su prvenstveno odgovorni za vezivanje za epitop antigena. Granice aminokiselinske sekvence datog CDR se mogu lako odrediti korišćenjem bilo koje od brojnih poznatih šema, uključujući one koje su opisali Kabat i sar. ("Sequences of Proteins of Immunological Interest," 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991; "Kabat" numbering scheme), Al-Lazikani et al., (JMB 273,927-948, 1997; "Chothia" numbering scheme), i Lefranc et al. ("IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains," Dev. Comp. Immunol., 27:55-77, 2003; "IMGT" numbering scheme). CDR-i svakog lanca se obično nazivaju CDR1, CDR2 i CDR3 (od N-kraja ka C-kraju), i obično se identifikuju i pomoću lanca u kome je lociran određeni CDR. Dakle, VHCDR3 je CDR3 iz VHantitela u kome se nalazi, dok VLCDR1 je CDR1 iz VLantitela u kome se nalazi. CDR-i lakog lanca se ponekad nazivaju i LCDR1, LCDR2 i LCDR3. CDR-i teškog lanca se ponekad nazivaju HCDR1, HCDR2 i HCDR3.
[0034] "Monoklonsko antitelo" je antitelo dobijeno iz populacije suštinski homogenih antitela, odnosno, individualnih antitela koja obuhvataju populaciju su identična i/ili se vezuju za isti epitop, osim moguć ih varijanti antitela, na primer, koja sadrže mutacije koje se prirodno javljaju ili koje nastaju tokom proizvodnje preparata monoklonskog antitela, takve varijante su obično prisutne u manjim količinama. Za razliku od preparata za poliklonska antitela, koji obično sadrže različita antitela usmerena protiv različitih determinanti (epitopa), svako monoklonsko antitelo preparata monoklonskog antitela je usmereno protiv jedne determinante na antigenu. Prema tome, modifikator "monoklonsko" označava karakter antitela kao dobijenog iz suštinski homogene populacije antitela, i ne treba ga tumačiti da zahteva proizvodnju antitela bilo kojom posebnom metodom. Na primer, monoklonska antitela mogu da se dobiju različitim tehnikama, uključujući, ali ne ograničavajući se na metodu hibridoma, metode rekombinantne DNK, metode ispoljavanja faga, i metode koje koriste transgene životinje koje sadrže deo ili ceo lokus humanog imunoglobulina, takve metode i druge primere metoda za pravljenje monoklonskih antitela koje su ovde opisane. U nekim primerima monoklonska antitela su izolovana iz subjekta. Monoklonska antitela mogu imati konzervativne aminokiselinske supstitucije koje suštinski ne utiču na vezivanje antigena ili druge funkcije imunoglobulina. (Vidi, na primer, Harlow i Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Publications, New York (2013).)
[0035] "Humanizovano" antitelo ili antigen vezujući fragment uključuje humani okvirni region i jedan ili više CDR-a iz nehumanog (kao što je mišje, pacovsko, ili sintetičko) antitela ili antigen vezujućeg fragmenta. Ne-humano antitelo ili antigen vezujući fragment koji obezbeđuje CDR-e se naziva "donor," a humano antitelo ili antigen vezujući fragment koji obezbeđuje okvirni region se naziva "akceptor." U jednoj realizaciji, svi CDR-i su iz donorskog immunoglobulina u humanizovanom imunoglobulinu. Konstantni regioni ne moraju da budu prisutni, ali ako jesu, oni mogu biti suštinski identični sa konstantnim regionima humanih imunoglobulina, kao što je najmanje oko 85-90%, kao što je oko 95% ili više identični. Prema tome, svi delovi humanizovanog antitela ili antigen vezujućeg fragmenta, osim verovatno CDR-a, su suštinski identični sa odgovarajućim delovima sekvenci prirodnih humanih antitela.
[0036] "Himerno antitelo" je antitelo koje uključuje sekvence dobijene od dva različita antitela, koja su tipično od različitih vrsta. U nekim primerima, himerno antitelo uključuje jedan ili više CDR-a i/ili okvirne regione iz jednog humanog antitela i CDR-e i/ili okvirne regione iz drugog humanog antitela.
[0037] "Potpuno humano antitelo" ili "humano antitelo" je antitelo koje uključuje sekvence iz (ili izvedene iz) humanog genoma i ne uključuje sekvencu drugih vrsta. U nekim realizacijama, humano antitelo uključuje CDR-e, okvirne regione i (ako postoji) Fc region iz (ili dobijen iz) humanog genoma. Humana antitela se mogu identifikovati i izolovati korišć enjem tehnologija za stvaranje antitela zasnovanih na sekvencama dobijenim iz ljudskog genoma, na primer pomo ć u ispoljavanja faga ili korišć enjem transgeničnih životinja (vidi, npr, Barbas et al. Phage display: A Laboratory Manuel. 1st Ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2004. Print.; Lonberg, Nat. Biotech., 23: 1117-1125, 2005; Lonenberg, Curr. Opin. Immunol., 20:450-459, 2008)
[0038] Antitelo ili antigen vezujući fragment koji neutrališe HIV-1: Antitelo ili antigen vezujući fragment koji se specifično vezuje za HIV-1 Env (na primer, koji vezuje gp120) tako da inhibira biološku funkciju povezanu sa HIV-1 Env (kao što je vezivanje za njegov ciljni receptor). U nekoliko realizacija, antitelo ili antigen vezujući fragment koji neutrališe HIV-1 smanjuje infektivni titar HIV-1.
[0039] Široko neutrališuć a antitela za HIV-1 se razlikuju od ostalih antitela za HIV-1 po tome što neutrališu visok procenat mnogih tipova HIV-1 u cirkulaciji. U nekim realizacijama, široko neutrališuć a antitela na HIV-1 se razlikuju od ostalih antitela za HIV-1 po tome što neutrališu visok procenat (kao što je najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99%) mnogih tipova HIV-1 u cirkulaciji. Neograničavajuć i primeri HIV-1 široko neutrališuju ć ih antitela uključuju N6, 2G12, PGT122, VRC01 i 35022.
[0040] Samo-reaktivnost ili autoreaktivnost antitela: Svojstvo antitela, pri čemu antitelo reaguje sa sopstvenim-epitopima, odnosno sa epitopima proteina i/ili lipida koje proizvodi subjekt. Antitelo koje nema samoreaktivnost se suštinski ne vezuje za epitope ili lipide prisutne na membranić elije subjekta. Metode za utvrđivanje da li antitelo reaguje sa sopstvenim epitopima su poznate prosečnom stručnjaku. U jednom primeru, sopstvena reaktivnost antitela se procenjuje korišć enjem obojenja ć elije HEp-2, testom vezivanja kardiolipina ili testom anti-nuklearnog antigena (ANA). Anti-ANA test može, na primer, da uključuje test anti-ANA LUMINEX® ili test bojenja ANA ć elija. U nekoliko realizacija ovog otkri ć a, otkriveno antitelo nije samoreaktivno (ili autoreaktivno), ili je minimalno samo-reaktivno. U jednom neograničavajuć em primeru, otkriveno antitelo nema sopstvenu reaktivnost iznad nivoa šuma, na primer, mereno upotrebom testa anti-ANA LUMINEKS® ili testa bojenja ANAć elija.
[0041] Biološki uzorak: Uzorak dobijen od subjekta. Biološki uzorci uključuju sve kliničke uzorke korisne za otkrivanje bolesti ili infekcije (na primer, HIV-1 infekcija) kod subjekata, uključujuć i, ali ne ograničavaju ć i se na ć elije, tkiva i telesne tečnosti, kao što su krv, derivati i frakcije krvi (kao što je serum), cerebrospinalni fluid; kao i biopsirano ili hirurški uklonjeno tkivo, na primer tkiva koja su nefiksirana, zamrznuta ili fiksirana u formalinu ili parafinu. U posebnom primeru, biološki uzorak se dobija od subjekta koji ima ili je pod sumnjom za HIV-1 infekciju.
[0042] Bispecifično antitelo: Rekombinantni molekul sastavljen od dva različita antigen vezujuća domena koji se posle toga vezuju za dva različita epitopa antigena. Bispecifična antitela uključuju hemijski ili genetski povezane molekule dva antigen vezujuća domena. Antigen vezujući domeni se mogu povezati pomoću linkera. Antigen vezujući domeni mogu biti monoklonska antitela, antigen vezujući fragmenti (npr. Fab, scFv) ili njihove kombinacije. Bispecifično antitelo može obuhvatati jedan ili više konstantnih domena, ali ne uključuje nužno i konstantni domen.
[0043] CD3 (Klaster diferencijacije 3 T-ć elijski Koreceptor ): Specifičan proteinski kompleks koji uključuje najmanje četiri polipeptidna lanca, koji su nekovalentno povezani sa T-ć elijskim receptorima na površini T- ć elija. Četiri polipeptidna lanca uključuju dva CD3-epsilon lanca, CD3-delta lanac i CD3-gama lanac. CD3 je prisutan i na pomoć nim T ć elijama i na citotoksičnim Tć elijama.
[0044] CD4: Klaster diferencijacije faktor 4 polipeptid; T-ć elijski površinski protein koji posreduje u interakciji sa molekulom MHC klase II. CD4 takođe služi kao primarno mesto receptora za HIV-1 na T-ć elijama tokom HIV-1 infekcije. Poznato je da se CD4 vezuje za gp120 iz HIV-1. Poznata sekvenca CD4 prekursora ima hidrofobni signalni peptid, ekstracelularni region od oko 370 aminokiselina, visoko hidrofobni deo sa značajnim identitetom sa domena koji se proteže kroz membranu u beta-lancu MHC klase II, i visoko naelektrisanu intracelularnu sekvencu od 40 rezidua (Maddon, Cell 42:93, 1985).
[0045] Himerni Antigen Receptor (CAR): Inženjerisani T ć elijski receptor koji ima ekstracelularni ciljani domen dobijen od antitela (poput scFv) spojenog sa jednim ili više intracelularnih signalnih domena T ć elijskog receptora. " T-ć elijski himerni antigen receptor" je T ć elija koja eksprimira CAR, i ima antigensku specifičnost određenu pomoću ciljnog domena CAR-a izvedenog od antitela. Metode izrade CAR su dostupne (vidi Park, et al., Trends Biotechnol., 29: 550-557, 2011; Grupp et al., N Engl J Med., 368: 1509-1518, 2013; Han et al., J. Hematol Oncol., 6:47, 2013; PCT Pubs. WO2012/079000, WO2013/059593; i U.S. Pub.2012/0213783.)
[0046] Dovoljni uslovi za formiranje imunskog kompleksa: Uslovi koji omoguć avaju da se antitelo ili antigen vezujući fragment veže za svoj kognatni epitop u detektabilno već em stepenu nego, i/ili za suštinsko isključenje, vezivanja za praktično sve ostale epitope. Uslovi dovoljni za formiranje imunskog kompleksa zavise od formata reakcije vezivanja i obično su oni koji se koriste u protokolima imunološkog ispitivanja ili onim stanjima koja se susre ć u in vivo. Za opis formata i uslova imunoloških analiza Pogledajte Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, 2. izd. Cold Spring Harbor Publications, New York (2013). Uslovi korišć eni u metodama su "fiziološki uslovi" koji uključuju pozivanje na uslove (npr. temperaturu, osmolarnost, pH) koji su tipični za živog sisara ili ć eliju sisara. Iako je prepoznato da su neki organi izloženi ekstremnim uslovima, okruženje u organizmu i unutarć elijsko okruženje obično leži oko pH 7 (npr. od pH 6.0 do pH 8.0, tačnije pH 6.5 do 7.5), sadrži vodu kao preovlađujuć i rastvarač i egzistira na temperaturi iznad 0 °C i ispod 50 °C. Osmolarnost je u granicama koje podržavaju vijabilnost i proliferaciju ć elija.
[0047] Formiranje imunog kompleksa se može otkriti konvencionalnim metodama poznatim stručnjacima, na primer imunohistohemijom, imunoprecipitacijom, protočnom citometrijom, imunofluorescentnom mikroskopijom, ELISA, imunoblotingom (na primer, Western blot), magnetnom rezonancom, CT skeniranjem, Rendgenskom i afinitetnom hromatografijom. Imunološka svojstva vezivanja izabranih antitela se mogu kvantifikovati korišć enjem metoda dobro poznatih u tehnici.
[0048] Konjugat: Kompleks od dva povezana molekula, na primer, povezana kovalentnom vezom. U jednoj realizaciji ovog otkrić a, antitelo je povezano sa efektorskim molekulom; na primer, antitelo koje se specifično veže za HIV-1 Env kovalentno povezan sa efektorskim molekulom. Veza može biti hemijskim ili rekombinantnim sredstvima. U jednoj realizaciji ovog otkrić a, veza je hemijska, gde reakcija između antitela i efektorskog molekula stvara kovalentnu vezu formiranu između dva molekula da se formira jedan molekul. Između antitela i efektorskog molekula opciono može biti umetnut peptidni linker (kratka peptidna sekvenca). Pošto se konjugati mogu pripremiti od dva molekula sa odvojenim funkcionalnostima, kao što su antitelo i efektorski molekul, oni se takođe ponekad nazivaju "himerni molekuli".
[0049] Konzervativne varijante: „Konzervativne“ supstitucije aminokiselina su one supstitucije koje suštinski ne utiču ili smanjuju funkciju proteina, kao što je sposobnost proteina da interaguje sa ciljanim proteinom. Na primer, u nekim realizacijama otkrić a, antitelo specifično za HIV može da sadrži do 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili do 10 konzervativnih supstitucija u poređenju sa sekvencom referentnog antitela i da zadrži specifičnu aktivnost vezivanja za antigen HIV-1 i/ili aktivnost neutralizacije HIV-1. Izraz konzervativna varijanta takođe uključuje upotrebu supstituisane aminokiseline umesto nesupstituisane matične aminokiseline.
[0050] Pored toga, prosečan stručnjak ć e prepoznati da pojedinačne supstitucije, delecije ili adicije koje menjaju, dodaju ili brišu jednu aminokiselinu ili mali procenat aminokiselina (na primer manje od 5%, u nekim realizacijama otkrić a manje od 1%) u kodiranoj sekvenci su konzervativne varijacije gde promene dovode do supstitucije aminokiseline hemijski sličnom aminokiselinom.
[0051] Konzervativne tablice aminokiselinskih supstitucija koje pružaju funkcionalno slične aminokiseline su dobro poznate prosečnim stručnjacima. Sledeć ih šest grupa su primeri aminokiselina koje se smatraju konzervativnim supstitucijama međusobno:
1) Alanin (A), Serin (S), Treonin (T);
2) Aspartanska kiselina (D), Glutaminska kiselina (E);
3) Asparagin (N), Glutamin (Q);
4) Arginin (R), Lizin (K);
5) Izoleucin (I), Leucin (L), Metionin (M), Valin (V); i
6) Fenilalanin (F), Tirozin (Y), Triptofan (W).
[0052] Nekonzervativne supstitucije su one koje smanjuju aktivnost ili funkciju HIV-specifičnog antitela, kao što je sposobnost specifičnog vezivanja sa gp120. Na primer, ako je aminokiselinska rezidua neophodna za funkciju proteina, čak i konzervativna supstitucija može da poremeti tu aktivnost. Prema tome, konzervativna supstitucija ne menja osnovnu funkciju proteina od interesa.
[0053] Kontaktiranje: Postavljanje u direktno fizičko udruživanje; Uključuje i u čvrstom i u tečnom obliku, što se može odvijati in vivo ili in vitro. Kontaktiranje uključuje kontakt između jednog molekula i drugog molekula, na primer aminokiseline na površini jednog polipeptida, poput antigena, koji kontaktira drugi polipeptid, kao što je antitelo. Kontaktiranje može takođe da uključi kontaktiranje ć elije, na primer, stavljanjem antitela u direktnu fizičku povezanost sa ć elijom.
[0054] Kontrola: Referentni standard. U nekim realizacijama, kontrola je negativna kontrola, kao što je uzorak dobijen od zdravog pacijenta koji nije zaražen sa HIV-1. U drugim realizacijama, kontrola je pozitivna kontrola, poput uzorka tkiva dobijenog od pacijenta kome je dijagnostikovana HIV-1 infekcija. U još nekim realizacijama, kontrola je istorijska kontrola ili standardna referentna vrednost ili opseg vrednosti (kao što je prethodno testirani kontrolni uzorak, kao što je grupa pacijenata sa HIV-1 sa poznatom prognozom ili ishodom, ili grupa uzoraka koji predstavljaju baznu liniju ili normalne vrednosti).
[0055] Razlika između ispitnog uzorka i kontrole može biti poveć anje ili smanjenje. Razlika može biti kvalitativna razlika ili kvantitativna razlika, na primer statistički značajna razlika. U nekim primerima, razlika je poveć anje ili smanjenje, u odnosu na kontrolu, od najmanje oko 5%, kao što je najmanje oko 10%, najmanje oko 20%, najmanje oko 30%, najmanje oko 40%, najmanje oko 50%, najmanje oko 60%, najmanje oko 70%, najmanje oko 80%, najmanje oko 90%, najmanje oko 100%, najmanje oko 150%, najmanje oko 200%, najmanje oko 250%, najmanje oko 300%, najmanje oko 350%, najmanje oko 400%, ili najmanje oko 500%.
[0056] Degenerisana varijanta: U kontekstu ovog otkrić a, "degenerisana varijanta" se odnosi na polinukleotid koji kodira protein (na primer, antitelo koje specifično vezuje gp120 ili njegov varijabilni region) koji uključuje sekvencu koja je degenerisana kao rezultat genetskog koda. Postoji dvadeset prirodnih aminokiselina od kojih je već ina specificirana sa više od jednog kodona. Zbog toga su sve degenerisane nukleotidne sekvence uključene sve dok je aminokiselinska sekvenca antitela koja vezuje gp120 kodirana nukleotidnom sekvencom nepromenjena.
[0057] Detektabilni marker: Detektabilni molekul (takođe poznat kao obeleživač) koji je direktno ili indirektno konjugovan na drugi molekul, kao što je antitelo, kako bi se olakšala detekcija drugog molekula. Na primer, detektabilni marker može biti sposoban da se otkrije pomoć u ELISA, spektrofotometrije, protočne citometrije, mikroskopije ili dijagnostičkih tehnika (kao što su CT skeniranje, MRI, ultrazvuk, fiberoptičko ispitivanje i laparoskopsko ispitivanje). Specifični, neograničavajuć i primeri detektabilnih markera uključuju fluorofore, hemiluminiscentne agense, enzimske veze, radioaktivne izotope i teške metale ili jedinjenja (npr. super paramagnetni nanokristali gvožđe-oksida za detekciju pomoć u MRI). U jednom primeru, " obeleženo antitelo" se odnosi na inkorporaciju drugog molekula u antitelo. Na primer, obeleživač je detektabilni marker, poput inkorporirane radio-obeležene aminokiseline ili za polipeptid vezanih biotinil grupa koje mogu biti detektovane obeleženim avidinom (na primer, streptavidin koji sadrži fluorescentni marker ili enzimatska aktivnost koja može biti detektovana optičkim ili kolorimetrijskim metodama). U struci su poznate razne metode obeležavanja polipeptida i glikoproteina koje se mogu koristiti. Primeri obeležavanja polipeptida uključuju, ali nisu ograničeni na, slede ć e: radioizotope ili radionuklide (poput<35>S ili<131>I), fluorescentne obeleživače (poput fluorescein izotiocijanata (FITC), rodamina, lantanidnog fosfora), enzimske obeleživače (kao što je peroksidaza rena, beta-galaktozidaza, luciferaza, alkalna fosfataza), hemiluminiscentne markere, biotinil grupe, predeterminisane polipeptidne epitope prepoznate od strane sekundarnog reportera (kao što su parovi sekvenci leucinskog patent zatvarača, mesta vezivanja za sekundarna antitela, domeni vezivanja metala, tagovi epitopa) ili magnetne agense, kao što su gadolinijum helati. U nekim realizacijama ovog otkri ć a, obeleživači su pričvršć eni pomoću spejsera različite dužine da bi se smanjila potencijalne sterne smetnje. Metode za upotrebu detektabilnih markera i rukovođenje pri izboru detektabilnih markera, pogodnih za različite svrhe su razmatrani na primer u Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4. izd., Cold Spring Harbor, New York, 2012) i Ausubel et al. (In Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, kroz dodatak 104, 2013).
[0058] Detektovanje: Identifikovanje postojanja, prisustva ili neke činjenice. Opšte metode otkrivanja su poznate iskusnom stručnjaku i mogu se dopuniti ovde opisanim protokolima i reagensima. Na primer, ovde su uključene metode detekcije ć elije koja eksprimira gp120 u subjektu.
[0059] Efektorski molekul: Molekul koji treba da ima ili da proizvede željeni efekat; na primer, željeni efekat na ć eliju na koju molekul efektora cilja. Efektorski molekuli mogu da uključuju, na primer, polipeptide i male molekule. U jednom neograničavajuć em primeru, efektorski molekul je toksin. Iskusan stručnjak ć e razumeti da neki efektorski molekuli mogu da imaju ili proizvode više od jednog željenog efekta.
[0060] Epitop: Antigenska determinanta. To su određene hemijske grupe ili peptidne sekvence na molekulu koje su antigene, tj. koje izazivaju specifičan imuni odgovor. Antitelo specifično vezuje određeni antigeni epitop za polipeptid. U nekim primerima, otkriveno antitelo se specifično vezuje za epitop na gp120.
[0061] Ekspresija: Transkripcija ili translacija sekvence nukleinske kiseline. Na primer, kodirajuć a sekvenca nukleinskih kiselina (kao što je gen) može biti eksprimirana kada se njena DNK transkribuje u RNK ili RNK fragment, koji se u nekim primerima prerađuju u iRNK. Kodirajuć a sekvenca nukleinske kiseline (kao što je gen) takođe može biti eksprimirana kada se njena iRNK translira u aminokiselinsku sekvencu, kao što je protein ili fragment proteina. U posebnom primeru, heterologni gen se eksprimira kada se transkribuje u RNK. U drugom primeru, heterologni gen se eksprimira kada se njegova RNK translira u aminokiselinsku sekvencu. Regulacija ekspresije može uključivati kontrolu transkripcije, translacije, transporta i prerade RNK, degradacije intermedijarnih molekula kao što je iRNK, ili pomoću aktivacije, inaktivacije, kompartmentalizacije ili degradacije specifičnih proteinskih molekula nakon što se oni proizvedu.
[0062] Sekvence za Kontrolu Ekspresije: Sekvence nukleinske kiselinske koje regulišu ekspresiju heterologne sekvence nukleinske kiseline sa kojom su operativno vezane. Sekvence za kontrolu ekspresije su operativno povezane sa sekvencom nukleinske kiseline kada ekspresione kontrolne sekvence kontrolišu i regulišu transkripciju i, prema potrebi, translacije sekvence nukleinske kiseline. Prema tome, sekvence za kontrolu ekspresije mogu uključivati odgovarajuć e promotere, pojačivače, terminatore transkripcije, start kodon (ATG) ispred gena koji kodira protein, splajsing signal za introne, održavanje ispravnog okvira čitanja tog gena kako bi se omoguć io pravilna translacija iRNK, i zaustavne kodone. Izraz "kontrolne sekvence" treba da obuhvati, najmanje, komponente čije prisustvo može uticati na ekspresiju, a može takođe da obuhvati i dodatne komponente čije prisustvo je korisno, na primer, vode ć e sekvence i fuzione partnerske sekvence. Sekvence za kontrolu ekspresije mogu uključivati promoter.
[0063] Promoter je minimalna sekvenca dovoljna za usmeravanje transkripcije. Takođe su obuhvać eni oni promoterski elementi koji su dovoljni da omoguć e od promotera zavisnu ekspresiju gena koja može biti kontrolisana za specifičan tip ć elija, tkivnuspecifičnost ili može biti indukovana spoljnim signalima ili agensima; takvi elementi mogu biti locirani u 5' ili 3' regionima gena. Uključeni su i konstitutivni i inducibilni promoteri (vidi, npr., Bitter et al., Methods in Enzimology 153:516-544, 1987). Na primer, kod kloniranja u bakterijskim sistemima mogu se koristiti inducibilni promoteri, kao što je pL lambda bakteriofaga, plac, ptrp, ptac (ptrp-lac hibridni promoter) i slično. U jednoj realizaciji ovog otkrić a, kod kloniranja u ć elijskim sistemima sisara, se mogu koristiti promoteri izvedeni iz genoma ć elija sisara (poput metalotionein promotera) ili iz virusa sisara (kao što je retrovirusno dugo terminalno ponavljanje; kasni promoter adenovirusa; promoter virusa vakcinije 7.5K). Za obezbeđivanje transkripcije sekvenci nukleinskih kiselina se takođe mogu koristiti promoteri dobijeni tehnikama rekombinantne DNK ili tehnikama sinteze.
[0064] Polinukleotid može biti umetnut u ekspresioni vektor koji sadrži sekvencu promotera koja olakšava efikasnu transkripciju umetnute genske sekvence domać ina. Ekspresioni vektor obično sadrži poreklo replikacije, promoter, kao i specifične sekvence nukleinskih kiselina koje omoguć avaju fenotipsku selekciju transformisanih ć elija.
[0065] Ekspresioni vektor: Vektor koji sadrži rekombinantni polinukleotid koji sadrži sekvence za kontrolu ekspresije operativno povezane sa nukleotidnom sekvencom koja treba da se eksprimira. Ekspresioni vektor sadrži dovoljno cis-delujuć ih elemenata za ekspresiju; drugi elementi za ekspresiju mogu biti obezbeđeni od ć elije doma ć ina ili u in vitro sistemu ekspresije. Ekspresioni vektori uključuju sve one koji su poznati u struci, kao što su kozmidi, plazmidi (npr. goli ili sadržani u lipozomima) i virusi (npr. lentivirusi, retrovirusi, adenovirusi i adeno-povezani virusi) koji sadrže rekombinantni polinukleotid.
[0066] Fc polipeptid: polipeptid, uključujući konstantni region antitela, isključuju ć i prvi domen imunoglobulinskog konstantnog regiona. Fc region se generalno odnosi na poslednja dva domena konstantnog regiona imunoglobulina IgA, IgD, i IgG, i najmanje poslednja tri domena konstantnog regiona imunoglobulina IgE i IgM. Fc region takođe može uključivati deo ili ceo fleksibilni zglobni N-terminal za ove domene. Za IgA i IgM, Fc region može ali ne mora uključivati repni deo, i može ali ne mora biti vezan pomoću J lanca. Za IgG, Fc region uključuje imunoglobulinske domene Cgamma2 i Cgamma3 (Cγ2 i Cγ3) i donji deo zgloba između Cgamma1 (Cγ1) i Cγ2. Iako granice Fc regiona mogu da variraju, Fc region humanog IgG teškog lanca je obično definisan tako da uključuje rezidue C226 ili P230 za svoj karboksilni-terminus, pri čemu je numeracija prema EU indeksu kao i u Kabat-u. Za IgA, Fc region uključuje imunoglobulinske domene Calfa2 i Calfa3 (Cα2 i Cα3) i donje delove zgloba između Calfa1 (Cα1) i Cα2.
[0067] Protein Envelope HIV-1 (Env): proteinski omotač (eng. envelope) HIV-1 se inicijalno sintetiše kao prekursor protein veličine 845-870 aminokiselina, označen sa gpl60. Pojedinačni gpl60 polipeptidi formiraju homotrimer i prolaze glikozilaciju u Goldžijevom aparatu, kao i obradu radi uklanjanja signalnog peptida i cepanje pomoću ć elijske proteaze približno između pozicija 511/512 da bi se generisali odvojeni gp120 i gp41 polipeptidni lanci, koji ostaju povezani kao gp120/gp41 protomeri unutar homotrimera. Ektodomen (to jest, ekstracelularni deo) HIV-1 Env trimera prolazi kroz nekoliko strukturnih reorganizacija od prefuzione zrele (otcepljene) zatvorene konformacije koja izbegava prepoznavanje od antitela, kroz intermedijarne konformacije koje se vezuju za receptore CD4 i koreceptore (CCR5 ili CXCR4), do postfuzione konformacije.
[0068] Numeracija korišć ena u otkrivenim proteinima HIV-1 Env i njihovim fragmentima je u odnosu na šemu numeracije HXB2 kako je navedeno u Numeracija položaja HIV-a u odnosu na HXB2CG Bette Korber et al., Human Retroviruses and AIDS 1998: A Compilation and Analysis of Nucleic Acid and Amino Acid Sequences. Korber et al., Eds. Theoretical Biology and Biophysics Group, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, NM.
[0069] HIV-1 gp120: polipeptid koji je deo HIV-1 Env proteina. Zreli gp120 uključuje približno HIV-1 Env rezidue 31-511, sadrži već inu spoljnih, površinski izloženih, domena HIV-1 Env trimera, i gp120 je taj koji se vezuje i za ć elijske CD4 receptore i za ć elijske hemokinske receptore (kao što je CCR5). Zreli polipeptid gp120 je ekstracelularni polipeptid koji interaguje sa gp41 ektodomenom da se formira HIV-1 Env protomer koji trimerizuje za formiranje trimera HIV-1 Env.
[0070] HIV-1 gp140: Rekombinantni HIV-1 Env. polipeptid koji uključuje gp120 i gp41 ektodomene, ali ne i gp41 transmembranske ili citosolne domene. Polipeptidi HIV-1 gp140 mogu da trimerizuju da formiraju solubilni ektodomen trimer HIV-1 Env.
[0071] HIV-1 gp41: polipeptid koji je deo HIV-1 Env proteina. Zreli gp41 uključuje otprilike HIV-1 Env rezidue 512-860 i uključuje citosolni-, transmembranski- i ekto-domen. Gp41 ektodomen (koji uključuje približno HIV-1 Env rezidue 512-644) može da interaguje sa gp120 za formiranje HIV-1 Env protomera koji trimerizuje za formiranje HIV-1 Env trimera.
[0072] Humani imunodeficijentni virus tipa 1 (HIV-1): Retrovirus koji izaziva imunosupresiju kod ljudi (HIV-1 bolest) i dovodi do kompleksa bolesti poznatog kao sindrom stečene imunodeficijencije (AIDS). "Bolest HIV-1" se odnosi na prepoznatljivu konstelaciju znakova i simptoma (uključujuć i razvoj oportunističkih infekcija) kod osoba koje su zaražene virusom HIV-1, kako je utvrđeno u studijama antitela ili Western blot studijama. Laboratorijski nalazi povezani sa ovom bolešć u uključuju progresivan pad T ć elija. Srodni virusi koji se koriste kao životinjski modeli uključuju virus simijske imunodeficijencije (SIV) i virus imunodeficijencije mačaka (FIV). Tretman HIV-1 sa HAART-om je bio efikasan u smanjenju optereć enja virusom i ublažavanju efekata HIV-1 infekcije kod zaraženih osoba.
[0073] Sistem numeracije HXB2: Referentni sistem numeracije za sekvence HIV-1 proteina i nukleinskih kiselina, pomoću sekvenci HIV-1 HXB2 sojeva kao referenci za sve ostale sekvence HIV-1 sojeva. Prosečnom stručnjaku je poznat sistem numeracije HXB2, i ovaj sistem je izložen u "Numbering Positions in HIV Relative to HXB2CG", Bette Korber et al., Human Retroviruses and AIDS 1998: A Compilation and Analysis of Nucleic Acid and Amino Acid Sequences. Korber B, Kuiken CL, Foley B, Hahn B, McCutchan F, Mellors JW, and Sodroski J, Eds. Grupa za teorijsku biologiju i biofiziku, Nacionalna laboratorija u Los Alamosu, Los Alamos, NM. HXB2 je takođe poznat kao: HXBc2, za HXB klon 2; HXB2R, u bazi podataka o HIV-u u Los Alamosu, sa R za revidiran, pošto je blago revidiran u odnosu na originalnu sekvencu HXB2; i HXB2CG u GENBANK<TM>, za HXB2 kompletan genom. Numeracija korišćena u gp120 polipeptidima koji su ovde opisani je u odnosu na šemu numeracije HXB2. Za referencu, aminokiselinska sekvenca HIV-1 Env HXB2 je navedena ispod:
[0074] IgA: polipeptid koji pripada klasi antitela koja su u značajnoj meri kodirana prepoznatim imunoglobulinskim alfa genom. Kod ljudi, ova klasa ili izotip obuhvata IgA 1 i IgA2. IgA antitela mogu postojati kao monomeri, polimeri (koji se nazivaju pIgA) pretežno dimernog oblika i sekretorni IgA. Konstantni lanac IgA divljeg tipa sadrži 18-aminokiselinsku ekstenziju na svom C-kraju zvanom repni deo (tp). Polimerni IgA izlučuju plazma ć elije sa 15-kDa peptidom koji se naziva J lanac, koji povezuje dva monomera IgA kroz sačuvanu cisteinsku reziduu u repnom delu.
[0075] IgG: polipeptid koji pripada klasi ili izotipu antitela koja su u značajnoj meri kodirana od strane prepoznatog imunoglobulinskog gama gena. Kod ljudi, ova klasa sadrži IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4. Kod miševa, ova klasa sadrži IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3.
[0076] Imuni kompleks: Vezivanje antitela ili antigen vezujućeg fragmenta (kao što je scFv) za solubillni antigen formira imuni kompleks. Formiranje imunog kompleksa se može otkriti konvencionalnim metodama poznatim stručnjacima, na primer imunohistohemijom, imunoprecipitacijom, protočnom citometrijom, imunofluorescentnom mikroskopijom, ELISA, imunoblotingom (na primer, Western blot), magnetnom rezonancom, CT skeniranjem, X-zračenjem i afinitetnom hromatografijom. Imunološka svojstva vezivanja izabranih antitela mogu biti kvantifikovana korišć enjem metoda dobro poznatih u tehnici.
[0077] Izolovano: Biološka komponenta (kao što je nukleinska kiselina, peptid, protein ili proteinski kompleks, na primer antitelo) koja je suštinski izdvojena, proizvedena odvojeno od drugih bioloških sastojaka ili prečišć ena od njih u ć eliji organizma u kojoj se komponenta prirodno javlja, što znači, ostale hromozomske i ekstrahromozomske DNK i RNK i proteini. Prema tome, izolovane nukleinske kiseline, peptidi i proteini uključuju nukleinske kiseline i proteine prečišć ene standardnim metodama prečišć avanja. Izraz takođe obuhvata nukleinske kiseline, peptide i proteine pripremljene rekombinantnom ekspresijom uć eliji doma ć inu, kao i hemijski sintetizovane nukleinske kiseline. Izolovana nukleinska kiselina, peptid ili protein, na primer antitelo, može imati čistoć u od najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 96% , najmanje 97%, najmanje 98%, ili najmanje 99%.
[0078] Linker: Dvofunkcionalni molekul koji se može koristiti za povezivanje dva molekula u jedan povezani molekul, na primer, za povezivanje efektorskog molekula sa antitelom. U nekim realizacijama otkrić a, obezbeđeni konjugati uključuju linker između efektorskog molekula ili detektorskog markera i antitela. U nekim slučajevima, linker je peptid u antigen vezujućem fragmentu (kao što je Fv fragment) koji služi za indirektno povezivanje VHi VL. Neograničavajuć i primeri peptidnih linkera uključuju glicinske linkere i glicin-serinske linkere.
[0079] Izrazi "konjugovanje", "spajanje", "vezivanje" ili "povezivanje" se mogu odnositi na spajanje dva molekula u jedan povezani molekul; na primer, povezivanje dva polipeptida u jedan povezani polipeptid ili kovalentno vezivanje efektorskih molekula ili detektabilnog marker radionuklida ili drugog molekula za polipeptid, kao što je scFv. U specifičnom kontekstu, pojmovi uključuju pozivanje na pridruživanje liganda, kao što je deo antitela, efektorskom molekulu. Povezivanje može biti pomoću hemijskih ili rekombinantnih sredstava. Termin "Hemijska sredstva" se odnosi na reakciju između dela antitela i efektorskog molekula tako da postoji kovalentna veza formirana između dva molekula da se formira jedan molekul.
[0080] Nukleinska kiselina: Polimer sastavljen od nukleotidnih jedinica (ribonukleotida, deoksiribonukleotida, srodnih strukturnih varijanti koje se prirodno javljaju i njihovih sintetskih analoga koji se prirodno ne javljaju) povezanih preko fosfodiestarskih veza, srodnih strukturnih varijanti koje se prirodno javljaju i njihovih sintetskih analoga koji se prirodno ne javljaju. Prema tome, termin uključuje nukleotidne polimere u kojima nukleotidi i veze između njih uključuju sintetske analoge koji se prirodno ne javljaju, kao što su, na primer ali bez ograničavanja, fosforotioati, fosforamidati, metil fosfonati, hiral-metil fosfonati, 2-O-metil ribonukleotidi, peptidne-nukleinske kiseline (PNA) i slično. Takvi polinukleotidi se mogu sintetizovati, na primer, korišć enjem automatizovanog sintetizatora DNK. Izraz "oligonukleotid" se obično odnosi na kratke polinukleotide, uglavnom ne već e od oko 50 nukleotida. Podrazumeva se da kada je nukleotidna sekvenca predstavljena DNK sekvencom (tj. A, T, G, C), to takođe uključuje RNK sekvencu (tj. A, U, G, C) u kojoj "U" zamenjuje "T."
[0081] Konvencionalna notacija se ovde koristi za opisivanje nukleotidnih sekvenci: levi kraj jednolančane nukleotidne sekvence je 5-kraj; smer na levo dvolančane nukleotidne sekvence se naziva 5’-smer. Smer dodavanja nukleotida od 5’ ka 3’ u nascentnim RNK transkriptazama se naziva smer transkripcije. DNK lanac koji ima istu sekvencu kao i iRNK se naziva "kodirajuć i lanac"; sekvence na lancu DNK koje imaju istu sekvencu kao i iRNK prepisanu iz te DNK i koja se nalazi od 5’ do 5’ kraja RNK transkripta se nazivaju "uzvodne sekvence;" sekvence na lancu DNK koje imaju istu sekvencu kao RNK i koje su od 3’ do 3' kraja kodirajuć eg RNK transkripta se nazivaju "nizvodne sekvence".
[0082] "kDNK" se odnosi na DNK koja je komplementarna ili identična sa iRNK, bilo u jednolančanom ili dvolančanom obliku.
[0083] "Kodiranje" se odnosi na svojstvo specifičnih nukleotidnih sekvenci u polinukleotidu, kao što su gen, kDNK ili iRNK, da služe kao obrasci za sintezu drugih polimera i makromolekula u biološkim procesima koji imaju ili definisanu sekvencu nukleotida (tj. rRNK, tRNK i iRNK) ili definisanu aminokiselinsku sekvencu i biološka svojstva koja iz toga proizilaze. Tako, gen kodira protein ako transkripcija i transformacija iRNK proizvedena od strane tog gena proizvodi protein u ć eliji ili drugom biološkom sistemu. Oba, i kodirajuć i lanac, čija nukleotidna sekvenca je identična iRNK sekvenci i obično je data u listama sekvenci, i nekodirajuć i lanac, koji se koristi kao matrica (kalup) za transkripciju, gena ili kDNK mogu biti označeni kao kodirajući protein ili drugi produkt tog gena ili kDNK. Ako nije drugačije naznačeno, "nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu" uključuje sve nukleotidne sekvence koje su međusobno degenerisane verzije i koje kodiraju istu aminokiselinsku sekvencu. Nukleotidne sekvence koje kodiraju proteine i RNK mogu uključivati i introne.
[0084] Nukleotidi mogu biti ribonukleotidi, deoksiribonukleotidi ili modifikovani oblici bilo kojeg nukleotida. Termin uključuje jednolančane i dvolančane oblike DNK.
[0085] Operativno povezan: Prva sekvenca nukleinske kiseline je operativno povezana sa drugom sekvencom nukleinske kiseline kada je prva sekvenca nukleinske kiseline postavljena u funkcionalni odnos sa drugom sekvencom nukleinske kiseline. Na primer, promoter, kao što je CMV promoter, operativno je povezan sa kodirajuć om sekvencom ako promoter utiče na transkripciju ili ekspresiju kodirajuć e sekvence. Generalno, operativno povezane DNK sekvence su susedne i, kada je potrebno da se spoje dva regiona koji kodiraju proteine, one su u istom okviru čitanja.
[0086] Farmaceutski prihvatljivi nosači: Farmaceutski prihvatljivi nosači za upotrebu su konvencionalni. Remington's Pharmaceutical Science, 22. izd., Pharmaceutical Press, London, UK (2012), opisuje kompozicije i formulacije pogodne za farmaceutsku isporuku otkrivenih sredstava.
[0087] Generalno, priroda nosača će zavisiti od određenog načina administracije koji se koristi. Na primer, parenteralne formulacije obično uključuju injektabilne fluide koji uključuju farmaceutski i fiziološki prihvatljive fluide kao što su voda, fiziološki slani rastvor, balansirani slani rastvori, vodeni rastvor dekstroze, glicerol ili slično kao nosač. Za čvrste kompozicije (na primer, prah, pilule, tablete ili kapsule), uobičajeni neotrovni čvrsti nosači mogu da uključuju, na primer, manitol, laktozu, skrob ili magnezijum stearat farmaceutske čistoće. Pored biološki neutralnih nosača, farmaceutske kompozicije koje se administriraju mogu sadržati manje količine neotrovnih pomoć nih materija, poput agensa za vlaženje ili emulgatora, dodatih konzervansa (kao što su ne-prirodni konzervansi), pH puferskih agensa i slično, npr. natrijum acetat ili sorbitan monolaurat. U posebnim primerima, farmaceutski prihvatljiv nosač je sterilan i pogodan za parenteralnu administraciju subjektu, na primer, injekcijom. U nekim realizacijama, aktivno sredstvo i farmaceutski prihvatljiv nosač su obezbeđeni u jediničnom doznom obliku kao što je pilula ili u odabranoj količini u vialu. Jedinični dozni oblici mogu uključivati jednu dozu ili više doza (na primer, u bočici iz koje se određene doze agensa mogu selektivno odmeriti).
[0088] Polipeptid: Polimer u kome su monomeri aminokiselinske rezidue koje su spojene zajedno amidnim vezama. Kada su aminokiseline alfa-aminokiseline, može se koristiti ili L-optički izomer ili D-optički izomer, a poželjni su L-izomeri. Termini "polipeptid" ili "protein" kako se ovde koriste su namijenjeni da obuhvate bilo koju aminokiselinsku sekvencu i uključe modifikovane sekvence poput glikoproteina. Polipeptid uključuje i proteine koji se prirodno javljaju, kao i one koji se proizvode rekombinantno ili sintetički. Polipeptid ima amino-terminalni (N-terminalni) kraj i karboksi-terminalni kraj. U nekim realizacijama, polipeptid je otkriveno antitelo ili njegov fragment.
[0089] Modifikacije polipeptida: polipeptidi mogu biti modifikovani različitim hemijskim tehnikama da bi se dobili derivati koji imaju uglavnom istu aktivnost i konformaciju kao nemodifikovani peptidi, i opciono koji imaju druga poželjna svojstva. Na primer, grupe karboksilnih kiselina proteina, bez obzira da li su karboksilni terminal ili bočni lanac, mogu biti obezbeđene u obliku soli farmaceutski prihvatljivog katjona ili esterifikovane da se formira C1-C16estar ili pretvorene u amid formule NR1R2gde su R1i R2svaki nezavisno H ili C1-C16alkil, ili su kombinovani da formiraju heterociklični prsten, kao što je 5- ili 6-člani prsten. Amino grupe peptida, bilo da su amino-terminalni ili bočni lanac, mogu biti u obliku farmaceutski prihvatljive kisele adicione soli, poput HCl, HBr, sirć etne, benzojeve, toluen sulfonske, maleinske, vinske i druge organske soli, ili mogu biti modifikovane u C1-C16alkil ili dialkil amino ili dalje konvertovane u amide.
[0090] Hidroksilne grupe peptidnih bočnih lanaca mogu biti konvertovane u C1-C16alkoksi ili u C1-C16estar korišćenjem dobro poznatih tehnika. Fenilni i fenolni prstenovi peptidnih bočnih lanaca mogu biti supstituisani sa jednim ili više atoma halogena, kao što su F, Cl, Br ili J, ili sa C1-C16alkilom, C1-C16alkoksi, karboksilnim kiselinama i njihovim estrima, ili amidima takvih karboksilnih kiselina. Metilen grupe peptidnih bočnih lanaca mogu biti proširene do homolognih C2-C4alkilena. Tioli mogu biti zaštićeni bilo kojom od niza dobro poznatih zaštitnih grupa, kao što su acetamidne grupe.
[0091] Rekombinantna: Rekombinantna nukleinska kiselina je ona koja ima sekvencu koja se prirodno ne javlja ili ima sekvencu koja je napravljena veštačkim kombinovanjem dva inače razdvojena segmenta sekvence. Ova veštačka kombinacija se može postić i hemijskom sintezom ili, češ ć e, veštačkom manipulacijom izolovanim segmentima nukleinskih kiselina, na primer, tehnikama genetskog inženjeringa. Rekombinantni protein je onaj koji ima sekvencu koja se prirodno ne javlja ili ima sekvencu koju čini veštačka kombinacija dva inače razdvojena segmenta sekvence. U nekoliko realizacija, rekombinantni protein je kodiran heterolognom (na primer, rekombinantnom) nukleinskom kiselinom koja je uvedena u ć eliju doma ć ina, kao što je bakterijska ili eukariotska ć elija. Nukleinska kiselina može biti uvedena, na primer, na ekspresionom vektoru koji ima signale koji mogu da eksprimiraju protein kodiran uvedenom nukleinskom kiselinom ili nukleinska kiselina može biti integrisana u hromozomć elije doma ć ina.
[0092] Identitet sekvence: Sličnost između aminokiselinskih sekvenci se izražava u pogledu sličnosti između sekvenci, koja se inače naziva identitetom sekvence. Identitet sekvence se često meri u procentualnom identitetu (ili sličnosti ili homolognosti); što je već i procenat, dve sekvence su sličnije. Homolozi ili varijante polipeptida ć e imati relativno visok stepen identiteta sekvenci kada se poravnaju korišćenjem standardnih metoda.
[0093] Metode poravnavanja sekvenci za poređenje su dobro poznate u tehnici. Različiti programi i algoritmi poravnanja su opisani u: Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482, 1981; Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970; Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444, 1988; Higgins and Sharp, Gene 73:237, 1988; Higgins and Sharp, CABIOS 5:151, 1989; Corpet et al., Nucleic Acids Research 16:10881, 1988; i Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444, 1988. Altschul et al., Nature Genet. 6:119, 1994, predstavljeno je detaljno razmatranje metoda poravnavanja sekvenci i izračunavanja homologije.
[0094] NCBI NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul et al., J. Mol. Biol.215:403, 1990) je dostupan iz nekoliko izvora, uključujuć i Nacionalni centar za informacije o biotehnologiji (NCBI, Bethesda, dr. Med. ) i na Internetu, za upotrebu u vezi sa programima za analizu sekvenci blastp, blastn, blastx, tblastn i tblastx. Opis kako odrediti identitet sekvenci pomoć u ovog programa je dostupan na web stranici NCBI na Internetu.
[0095] Homologe i varijante VLili VHantitela koje specifično vezuju polipeptid obično karakteriše posedovanje najmanje oko 75%, na primer najmanje oko 80%, 85%, 90%, 91%, 92 %, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identiteta sekvence računato za poravnanje na celoj dužini aminokiselinskih sekvenci od interesa. Proteini sa još već om sličnoš ć u sa referentnim sekvencama ć e pokazati poveć an procenat identiteta prilikom procene ovom metodom, kao što je najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98%, ili najmanje 99% identiteta sekvence. Kad se za identitet sekvence poredi manje od cele sekvence, homolozi i varijante obično poseduju najmanje 80% identiteta sekvence na kratkim prozorima od 10-20 aminokiselina, i mogu da poseduju identitet sekvence od najmanje 85% ili najmanje 90% ili 95% zavisno od njihove sličnosti sa referentnom sekvencom. Metode za određivanje identiteta sekvence preko tako kratkih prozora su dostupne na web stranici NCBI na Internetu. Stručnjak u ovoj oblasti ć e razumeti da su ovi opsezi identiteta sekvenci navedeni samo kao smernice; sasvim je mogu ć e da se mogu dobiti snažni značajni homolozi koji padaju izvan predviđenih raspona.
[0096] Termini koji se koriste za opisivanje odnosa sekvenci između dve ili više nukleotidnih sekvenci ili aminokiselinskih sekvenci uključuju "referentna sekvenca", "izabrana od", prozor za poređenje", "identične", "procenat identiteta sekvenci", "suštinski identične", "komplementarne" i "suštinski komplementarne".
[0097] Za poređenje sekvenci nukleinskih kiselina, obično se jedna sekvenca uzima za referentnu sekvencu sa kojom se porede sekvence koje se ispituju. Kada se koristi algoritam za poređenje sekvenci, ispitne i referentne sekvence se unose u računar, određuju se koordinate pod-sekvenci, po potrebi, i podešavaju programski parametri algoritama sekvenci. Koriste se podrazumevani (uobičajeni) programski parametri. Postupci poravnanja sekvenci za poređenje su dobro poznati u tehnici. Optimalno poravnanje sekvenci za poređenje se može izvesti, npr., pomoću algoritma lokalne homologije, Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482, 1981, pomoću algoritma homologije poravnanja Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970, metodom pretraživanja sličnosti Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988, kompjuterizovanim implementacijama ovih algoritama (GAP, BESTFIT, FASTA i TFASTA u softverskom paketu Visconsin Genetics, Genetic Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), ili ručnim poravnanjem i vizuelnim pregledom (videti npr. Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th ed, Cold Spring Harbor, New York, 2012) and Ausubel et al. (In Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, through supplement 104, 2013). Jedan primer korisnog algoritma je PILEUP. PILEUP koristi pojednostavljenje metode progresivnog poravnanja Feng & Doolittle, J. Mol., Evol. 35:351-360, 1987. Metoda koja se koristi je slična metodi koju su opisali Higgins & Sharp, CABIOS 5:151-153, 1989. Upotrebom PILEUP-a, referentna sekvenca se upoređuje sa drugim ispitnim sekvencama za određivanje procentnog odnosa identiteta sekvence korišćenjem sledeć ih parametara: default gap weight (3.00), default gap length weight (0.10), and weighted end gaps. PILEUP može biti dobijen iz GCG softverskog paketa za analizu sekvenci, npr., verzija 7.0 (Devereaux et al., Nuc. Acids Res. 12:387-395, 1984.
[0098] Sledeć i primer algoritama koji su pogodni za određivanje procenta identičnosti sekvenci i sličnosti sekvenci su BLAST i BLAST 2.0 algoritam, koji su opisani u Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990 i Altschul et al., Nucleic Acids Res.
25:3389-3402, 1977. Softver za izvođenje BLAST analiza javno je dostupan preko Nacionalnog centra za informacije o biotehnologiji (www.ncbi.nlm.nih.gov). BLASTN program (za nukleotidne sekvence) koristi kao podrazumevanu dužinu reči (W) od 11, poravnanje (B) od 50, očekivanje (E) od 10, M=5, N=-4, i poređenje oba lanca. Program BLASTP (za aminokiselinske sekvence) koristi kao podrazumevanu dužinu reči (W) od 3 i očekivanje (E) od 10 i BLOSUM62 matriks za ocenjivanje (videti Henikoff & Henikoff, Proc. Natl., Acad. Sci. USA 89:10915, 1989). Oligonukleotid je linearna polinukleotidna sekvenca dužine do oko 100 nukleotida.
[0099] Specifično vezuje: Kada se odnosi na antitelo ili fragment koji se vezuje za antigen, odnosi se na reakciju vezivanja koja određuje prisustvo ciljanog proteina, peptida ili polisaharida u prisustvu heterogene populacije proteina i drugih bioloških lekova. Prema tome, pod određenim uslovima, antitelo se prvenstveno vezuje za određeni ciljni protein, peptid ili polisaharid (kao što je antigen prisutan na površini patogena, na primer HIV-1 Env) i ne vezuje se u značajnoj količini za ostale proteine ili polisaharide prisutne u uzorku ili subjektu. Specifično vezivanje se može odrediti metodama poznatim u stanju tehnike. U odnosu na kompleks antitelo-antigen, specifično vezivanje antigena i antitela ima Kdmanju od oko 10<-7>molova, kao što je manje od oko 10<-8>molova, 10<-9>, ili čak manju od oko 10<- 10>molova.
[0100] Kdse odnosi na konstantu disocijacije za datu interakciju, kao što je interakcija polipeptidnog liganda ili interakcija antigen antitelo. Na primer, za bimolekularnu interakciju antitela ili antigen vezujućeg fragmenta i antigena to je koncentracija pojedinačnih komponenti bimolekularne interakcije podeljena sa koncentracijom kompleksa.
[0101] Antitela koja su ovde otkrivena specifično se vezuju za definisanu metu (ili više meta, u slučaju bispecifičnog antitela). Prema tome, antitelo koje se specifično veže za epitop na gp120 je antitelo koje se uglavnom vezuje za gp120, uključujuć i ć elije ili tkivo koji eksprimiraju gp120, supstrat za koji je gp120 vezan, ili gp120 u biološkom uzorku. Naravno, prepoznato je da može doć i do određenog stepena nespecifične interakcije između antitela ili konjugata, koji uključuje antitelo (kao što je antitelo koje specifično vezuje gpl20 ili konjugat koji uključuje takvo antitelo) i neciljane mete (kao što je ć elija koja ne eksprimira gp120). Tipično vezivanje rezultira u mnogo jačoj vezi između antitela i proteina ili ć elija koja nose antigen nego između antitela i proteina ili ć elija kojima nedostaje antigen. Specifično vezivanje obično rezultira ve ć im od 2 puta, kao što je već e od 5 puta, ve ć e od 10 puta ili ve ć e od 100 puta pove ć anjem količine vezanog antitela (u jedinici vremena) sa proteinom koji uključuje epitop ili ć eliju ili tkivo koji eksprimiraju ciljni epitop u odnosu na protein ili ć eliju ili tkivo kojima nedostaje ovaj epitop. Specifično vezivanje za protein u takvim uslovima zahteva antitelo koje je odabrano zbog njegove specifičnosti za određeni protein. Različiti formati imunotestova su pogodni za izbor antitela ili drugih liganda, posebno imunoreaktivnih sa određenim proteinom. Na primer, imuno-testovi ELISA u čvrstoj fazi se rutinski koriste za izbor monoklonskih antitela posebno imunoreaktivnih sa proteinom. Za opis formata i stanja imunoanalize koji se mogu koristiti za određivanje specifične imunoreaktivnosti pogledajte Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Publications, New York (2013).
[0102] Subjekt: Živi višeć elijski organizmi kičmenjaci, kategorija koja uključuje humane i ne-humane sisare. U jednom primeru, subjekt je čovek. U posebnom primeru, subjekt je novorođenče. U dodatnom primeru, izabran je subjekt kome je potrebno da inhibira HIV-1 infekciju. Na primer, osoba je ili neinficirana i u riziku od infekcije HIV-1 ili je inficirana i potrebno je lečenje.
[0103] Terapeutski efikasna količina: Količina agensa, kao što je otkriveno gp120 specifično antitelo ili antigen vezujući fragment, koja je dovoljna za sprečavanje, lečenje (uključujuć i profilaksu), smanjenje i/ili ublažavanje simptoma ili osnovnih uzroka poremeć aja ili bolesti, kao što je HIV-1 infekcija. U nekim realizacijama, terapeutski efikasna količina je dovoljna da smanji ili eliminiše simptom HIV-1 infekcije, poput AIDS-a. Na primer, to može biti količina koja je potrebna da se inhibira ili spreči replikacija HIV-1 ili da se merljivo izmene spoljni simptomi HIV-1 infekcije. U idealnom slučaju, terapeutski efikasna količina pruža terapeutski efekat bez izazivanja značajnog citotoksičnog efekta kod subjekta.
[0104] U nekim realizacijama, primena terapeutski efikasne količine otkrivenog antitela ili antigen vezujućeg fragmenta koji se veže za gp120 može da smanji ili inhibira infekciju HIV-1 (na primer, mereno infekcijom ć elija, brojem ili procentom subjekata zaraženih HIV-1 ili poveć anjem vremena preživljavanja zaraženih osoba) za željeni iznos, na primer najmanje 10%, najmanje 20%, najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98%, ili čak najmanje 100% (eliminacija ili sprečavanje otkrivene HIV-1 infekcije), u odnosu na odgovarajuću kontrolu.
[0105] Nekoliko ovde opisanih preparata se administrira u terapeutski efikasnim količinama. Terapeutski efikasna količina antitela ili antigen vezujućeg fragmenta koji specifično vezuje gp120 koja se administrira subjektu ć e varirati u zavisnosti od niza faktora povezanih sa tim subjektom, na primer od opšteg zdravstvenog stanja i/ili težine subjekta. Terapeutski efikasna količina se može odrediti variranjem doze i merenjem dobijenog terapijskog odgovora, kao što je, na primer, smanjenje titra virusa. Terapeutski efikasne količine takođe se mogu odrediti različitim in vitro, in vivo ili in situ imunološkim analizama.
[0106] Terapeutski efikasna količina obuhvata frakcionu dozu koja u kombinaciji sa prethodnim ili sledeć im davanjima doprinosi postizanju terapijskog odgovora. Na primer, terapeutski efikasna količina agensa se može primeniti u jednoj dozi, ili u nekoliko doza, na primer dnevno, tokom tretmana koji traje nekoliko dana ili nedelja. Međutim, terapeutski efikasna količina može zavisiti od subjekta koji se leči, težine i vrste stanja koje se leči i načina primene. Jedinični dozni oblik agensa može biti upakovan u terapijsku količinu ili u višestruke terapijske količine, na primer, u bočicu (npr., sa probojnim poklopcem) ili u špric koja ima sterilne komponente.
[0107] Transformisana: Transformisana ć elija je ć elija u koju je tehnikama molekularne biologije uveden molekul nukleinske kiseline. Kako se ovde koristi, termin transformacija obuhvata sve tehnike pomoć u kojih se molekul nukleinske kiseline može uvesti u takvu ć eliju, uključuju ć i transfekciju virusnim vektorima, transformaciju plazmidnim vektorima i uvođenje DNK elektroporacijom, lipofekcijom i akceleracijom genskim pištoljem.
[0108] Lečenje ili sprečavanje bolesti: Inhibicija potpunog razvoja bolesti ili stanja, npr. kod subjekta koji je u riziku ili ima HIV-1 infekciju. "Lečenje" se odnosi na terapijsku intervenciju koja poboljšava znak ili simptom bolesti ili patološkog stanja nakon što se ona počela razvijati. Izraz "ublažavanje", koji se odnosi na bolest ili patološko stanje, odnosi se na bilo koji vidljiv blagotvorni efekat lečenja. Blagotvorni efekat može biti dokazan, na primer, odloženom pojavom kliničkih simptoma bolesti kod podložnog subjekta, smanjenjem težine nekih ili svih kliničkih simptoma bolesti, sporijim napredovanjem bolesti, smanjenjem virusnog optereć enja, poboljšanjem opšteg zdravlja ili dobrobiti subjekta ili drugih parametara dobro poznatih u struci, koji su specifični za određenu bolest. "Profilaktički" tretman je tretman kojem se podvrgava subjekt koji ne pokazuje znakove bolesti u cilju smanjenja rizika od razvoja patologije.
[0109] Vektor: Rekombinantni DNK vektori su vektori koji imaju rekombinantnu DNK. Vektor može da sadrži sekvence nukleinske kiseline koje mu omoguć avaju da se replicira u ć eliji doma ć inu, kao što je početak replikacije. Vektor može takođe da sadrži jedan ili više marker gena koji se mogu odabrati i ostale genetske elemente poznate u stanju tehnike. Virusni vektori su vektori rekombinantnih nukleinskih kiselina koji imaju bar neke sekvence nukleinske kiseline izvedene iz jednog ili više virusa. U nekim rešenjima obezbeđen je virusni vektor koji sadrži jedan ili više molekula nukleinske kiseline koji kodiraju otkriveno antitelo ili antigen vezujući fragment koji se specifično vezuje za HIV-1 gp120 i neutrališe HIV-1. U nekim rešenjima, virusni vektor može biti vektor adeno-asocirani virus (AAV). Virusni vektor sa nedostatkom replikacije je vektor koji zahteva komplementaciju jednog ili više regiona virusnog genoma potrebnih za replikaciju zbog nedostatka bar jedne bitne funkcije gena za replikaciju. Na primer, takve da se virusni vektor ne razmnožava u tipičnim ć elijama doma ć inima, posebno u onima kod humanog pacoijenta koji može da se zarazi virusnim vektorom tokom terapijske metode.
[0110] VRC01 klasa antitela, teški lanac ili laki lanac: Klasa antitela koja vezuju CD4 mesto vezivanja na gp120 i mogu da neutrališu HIV-1, kao i njihovi teški i laki lanci. Prototipični član VRC01-klase antitela - VRC01 - može da neutrališe preko 90% cirkulišućih HIV-1 izolata sa prosečnom 50% koncentracijom inhibicije (IC50) od ∼ 0,3 µg/ml. Uprkos ukupnim razlikama sekvenci između antitela VRC01-klase, kokristalne strukture antitelo-gp120 su otkrile da je prepoznavanje gp120 od strane VRC01-klase konzistentno u okviru klase. Zaista, trodimenzionalna analiza strukture HIV-1 gp120 iz različitih HIV-1 klada u kompleksima sa različitim antitelima klase VRC01 od više donora pokazuje da antitela VRC01-klase dele upečatljivu sličnost u fizičkoj strukturi i otkrila je nekoliko karakteristika antitela koje doprinose vezivanju sa gp120 i neutralisanju HIV-1. Suštinska strukturna i ontogenetska karakteristika antitela klase VRC01 omoguć ava prepoznavanje članova ove klase ispitivanjem sekvence antitela.
[0111] Na primer, VHantitela VRC01-klase ima poreklo germinativne linije linije VH1-2, u kojoj je kodirajuć a sekvenca VHVRC01-klase od 20-35% (kao što je 25-30%) divergentna od odgovaraju ć e sekvence gena germinativne linije. VHVRC01-klase uključuje triptofan reziduu u kabat poziciji 50 (VHTrp50), asparagin reziduu u kabat poziciji 58 (VHAsn 58), i arginin reziduu u kabat poziciji 71 (VHArg 71). Ove rezidue formiraju specifične interakcije sa aminokiselinama na gp120 koje doprinose specifičnosti i svojstvima neutralizacije VRC01-klase. Kada se antitelo VRC01-klase veže sa gp120, VHTrp50formira vodoničnu vezu sa gp120 Asn280, VHAsp58formira vodonične veze sa gp120 Arg456i Gly458, VHArg71formira sone mostove sa gp120 Asp368i VHTrp100B formira vodoničnu vezu sa gp120 Asn279.
[0112] Zatim, VLVRC01-klase antitela ima poreklo germinativne linije IGKV1-33, IGKV3-11, IGKV3-15, IGKV3-20, IGLV2-14, u kojima je kodirajuć a sekvenca VLklase VRC01 od 15-35 % (kao što je 25-30%) divergentna od odgovarajuć e sekvence gena germinativne linije. VLVRC01-klase uključuje ili LCDR1 (kabat pozicioniranje) sa delecijom 2-6 aminokiselina, ili LCDR1 sa reziduama glicina na kabat pozicijama 28 i 30. Delecija ili prisustvo rezidua glicina daje fleksibilnost koja omoguć ava LCDR1 da izbegne strukturalnu smetnju sa D petljom na gp120 kada se antitelo vezuje za mesto vezivanja CD4. Dalje, VLVRC01-klase uključuje LCDR3 koji ima dužinu od pet aminokiselina (prema kabat pozicioniranju) i uključuje hidrofobnu reziduu (poput leucina ili tirozina) na kabat poziciji 91, deleciju kabat pozicija 92-95 i glutamat ili glutamin reziduu na kabat poziciji 96. Hidrofobna rezidua na poziciji 91 se pakuje naspram kičme D petlje na gp120, a rezidua glutamata ili glutamina u kabat poziciji 96 je u interakciji sa očuvanim elektropozitivnim regionom na bazi V5 domena na gp120.
[0113] Neograničavajuć i primeri antitela koja spadaju u VRC01-klasu uključuju antitela VRC01, VRC03, VRC07, VRC07-523, VRC13, 3BCN117, 12A12, 12A21, VRC-PG04, NIH45-46, VRC23, VRC-CH30, VRC-CH31 i VRC-PG20. Opis, karakterizacija i produkcija ovih antitela, kao i antitela klase VRC01 su dostupni i poznati prosečnim stručnjacima (videti npr. Diskin et al., Science, 334(6060):1289-93, 2011; Kwong and Mascola, Immunity, 37, 412-425, 2012; Li et al., J. Virol., 85, 8954-8967, 2011; Rudicell et al., J. Virol., 88, 12669-12682, 2012; Scheid et al., Science, 333(6049):1633-1637, 2011; West et al., PNAS, 109:E2083-2090, 2012; Wu et al., Science, 329(5993):856-861, 2010; Wu et al., Science, 333(6049):1593-1602, 2011; Zhou et al., Immunity, 39:245-258, 2013; Georgiev et al., Science, 340:751-756, 2013; Zhu et al., PNAS, 110, E4088-E4097, 2013; i WIPO Pub. Nos. WO 2012/158948, WO2011038290, WO2012154312, WO2013142324, i WO2013016468).
II. Opis Nekoliko Realizacija
[0114] Obezbedjena su izolovana monoklonska antitela i antigen vezujući fragmenti koji specifično vezuju epitop na gp120. Antitela i antigen vezujući fragmenti mogu biti potpuno humani. U nekoliko realizacija, antitela i antigen vezujućih fragmenata se mogu koristiti za neutralisanje HIV-1. Ovde su takođe otkrivene kompozicije koje uključuju antitela i antigen vezujuće fragmente i farmaceutski prihvatljiv nosač. Takođe su obezbeđene nukleinske kiseline koje kodiraju antitela ili antigen vezujuće fragmente, ekspresioni vektori (kao što su adeno-asocirani virusni (AAV) virusni vektori) koji uključuju ove nukleinske kiseline.
[0115] Antitela, fragmenti koji vezuju antigen, molekuli nukleinske kiseline, ć elije doma ć ini i kompozicije se mogu koristiti u istraživačke, dijagnostičke i terapeutske svrhe. Na primer, monoklonska antitela i antigen vezujući fragmenti se mogu koristiti za upotrebu u dijagnostici ili lečenju subjekta sa HIV-1 infekcijom, ili za profilaktičku primenu u cilju sprečavanja infekcije HIV-1 kod subjekta. U nekim realizacijama, antitela se mogu koristiti za određivanje titra HIV-1 kod subjekta.
A. Antitela i antigen vezujući fragmenti
[0116] Ovo otkrić e pruža nova antitela N6, N17, ili F8 i njihove varijante (uključuju ć i antigen vezujuće fragmente). Studije mapiranja epitopa i studije kompetitivnog vezivanja pokazuju da otkrivena antitela i antigen vezujući fragmenti specifično vezuju HIV-1 Env na epitopu koji se preklapa sa CD4 mestom vezivanja na gp120.
[0117] Otkrivena antitela i antigen vezujući fragmenti su iznenađujuć e efikasni za neutralizaciju HIV-1. Na primer, kao što je diskutovano u Primeru 1, antitelo N6 je neutralisalo 98% HIV-1 pseudovirusa u standardizovanom testu neutralizacije sa IC50manjim od 50 µg/ml i 96% pseudovirusa sa IC50vrednosti manjom od 1 µg/ml. Zatim, antitelo N6 je neutralisalo brojne virusne sojeve HIV-1 otporne na antitelo VRC01.
[0118] U nekim realizacijama, antitela i antigen vezujući fragmenti uključuju VHi VLi specifično se vezuju za gp120 i neutrališu HIV-1. U nekoliko realizacija, antitela i antigen vezujući fragmenti uključuju VHkoji sadrži region koji određuje komplementarnost teškog lanca (HCDR) 1, HCDR2 i HCDR3, i laki lanac koji sadrži region koji određuje komplementarnost lakog lanca (LCDR)1, LCDR2, i LCDR3 i specifično se vezuju za gp120 i neutrališu HIV-1. U nekim realizacijama, antitelo ili antigen vezujući fragmenti uključuju VHkoji sadrži jedan ili više (tj. jedan, dva ili sva tri) HCDR iz jednog od antitela N6, N17 ili F8. U nekim realizacijama, antitelo ili antigen vezujući fragment uključuje VLkoji sadrži jedan ili više (tj. jedan, dva ili sva tri) LCDR iz jednog od antitela N6, N17, ili F8. U nekoliko realizacija, antitelo ili antigen vezujući fragment uključuje VHi VLkoji uključuju HCDR1, HCDR2 i HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3, iz jednog od antitela N6, N17, ili F8, i specifično se vezuje za gp120 i neutrališe HIV-1.
[0119] Diskusija o monoklonskim antitelima u daljem tekstu se odnosi na monoklonska antitela koja uključuju VHi VLkoji uključuju CDR-e u odnosu na Kabat šemu numeracije (osim ako kontekst ne ukazuje drugačije). Prosečan stručnjak u ovoj oblasti razumeć e da se za određivanje položaja CDR-a mogu koristiti različite sisteme numeracije CDR-a (poput Kabat, Chothia ili IMGT sheme numeracije). Sekvenca aminokiselina i položaji CDR-a teških i lakih lanaca N6, N17 ili F8 antitela prema Kabatovoj šemi su prikazani u Tabeli 1.
Tabela 1. Kabat CDR sekvence N6 i vari ante antitela.
N6
[0120]U nekim realizacijama, antitelo ili antigen vezujući fragment može biti na bazi ili dobijen iz antitela N6, i može se specifično vezivati za gp120 i neutralisati HIV-1. Na primer, antitelo ili antigen vezujući fragment mogu da sadrže VHi VLkoji sadrže HCDRl, HCDR2 i HCDR3, i LCDR1, LCDR2 i LCDR3, (npr., prema IMGT ili kabatu) antitela N6, i mogu se specifično vezivati za gp120 i neutralisati HIV-1.
[0121] U nekim realizacijama, antitelo ili antigen vezujući fragment može da sadrži VHkoji sadrži HCDRl, HCDR2 i HCDR3 iz VHantitela N6 kao što je navedeno u Tabeli 1, i može se specifično vezivati za gp120 i neutralisati HIV-1. U nekim realizacijama, antitelo ili antigen vezujući fragment može da sadrži VLkoji sadrži LCDR1, LCDR2 i LCDR3 iz VLantitela N6 kako je navedeno u Tabeli 1, i može se specifično vezivati za gp120 i neutralisati HIV-1. U nekim realizacijama, antitelo ili antigen vezujući fragment može da sadrži VHi VLkoji sadrže HCDRl, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3 iz VHi VLantitela N6 kako je navedeno u Tabeli 1, i može se specifično vezivati za gp120 i neutralisati HIV-1.
[0122] U nekim realizacijama, antitelo ili antigen vezujući fragment uključuje najmanje jedan CDR (kao što je HCDR3) sa sekvencom koja ima najmanje 90% (kao što je najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97% , najmanje 98%, najmanje 99%, ili čak 100%) identiteta sekvence sa bilo kojim od CDR-a teškog ili lakog lanca N6 VHili VLkao što je prikazano u Tabeli 1, i može se specifično vezivati za gp120 i neutralisati HIV-1. U nekim realizacijama ovog otkrić a, antitelo ili antigen vezujući fragment uključuje VHkoji sadrži HCDRl, HCDR2 i HCDR3 koji sadrže aminokiselinske sekvence najmanje 90% (kao što je najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97 %, najmanje 98% ili najmanje 99%) identične sa aminokiselinama 31-35, 50-66 i 99-111 respektivno, sekvence SEK ID BR: 1, i može se specifično vezivati za gp120 i neutralisati HIV-1. U nekim realizacijama otkrić a, antitelo ili antigen vezujući fragment uključuje VLkoji sadrži LCDR1, LCDR2 i LCDR3 koji sadrže aminokiselinske sekvence najmanje 90% (kao što je najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97 %, najmanje 98% ili najmanje 99%) identične aminokiselinama 24-34, 50-56 i 89-93, respektivno, sekvence SEK ID BR: 2, i mogu se specifično vezivati za gp120 i neutralisati HIV-1. U dodatnim realizacijama ovog otkrić a, antitelo ili antigen vezujući fragment uključuje VHkoji sadrži HCDRl, HCDR2 i HCDR3 koji sadrže sekvence amino kiselina najmanje 90% (kao što je najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97 %, najmanje 98% ili najmanje 99%) identičnih aminokiselinama 31-35, 50-66 i 99-111, respektivno, od sekvence SEK ID BR: 1, i VLkoji sadrži LCDR1, LCDR2 i LCDR3 koji sadrže aminokiselinske sekvence najmanje 90% (kao što je najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, ili najmanje 99%) identične aminokiselinama 24-34, 50-56, i 89-93, SEK ID BR: 2, respektivno, i može se specifično vezivati za gp120 i neutralisati HIV-1.
[0123] U nekim realizacijama, antitelo ili antigen vezujući fragment uključuje VHkoji sadrži aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% (kao što je najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, ili na najmanje 99%) identičnu sa aminokiselinskom sekvencom navedenom kao SEK ID BR: 1, i može se specifično vezivati za gp120 i neutralisati HIV-1. U više realizacija, antitelo ili antigen vezujući fragment uključuje VLkoji sadrži aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% (kao što je najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, ili najmanje 99%) identičnu sa aminokiselinskom sekvencom navedenom kao SEK ID BR: 2, i može se specifično vezivati za gp120 i neutralisati HIV-1.
[0124] U dodatnim realizacijama, antitelo ili antigen vezujući fragment uključuje VHkoji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu kao jedna od SEK ID BR: 1, i može se specifično vezivati za gp120 i neutralisati HIV-1. U dodatnim realizacijama, antitelo ili antigen vezujući fragment uključuje VLkoji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu kao SEK ID BR: 2 i može se specifično vezivati za gp120 i neutralisati HIV-1. U nekim realizacijama, antitelo ili antigen vezujući fragment uključuje VHi VLkoji sadrže aminokiselinske sekvence navedene kao SEK ID BR: 1 i 2, i mogu se specifično vezivati za gp120 i neutralisati HIV-1.
N17
[0125] U nekim realizacijama, antitelo ili antigen vezujući fragment može biti baziran na ili izveden iz antitela N17 i može se specifično vezivati za gp120 i neutralisati HIV-1. Na primer, antitelo ili antigen vezujući fragment može da sadrži VHi VLkoji sadrže HCDRl, HCDR2 i HCDR3, i LCDR1, LCDR2 i LCDR3, (na primer, prema IMGT ili kabatu) antitela N17, i može se specifično vezivati za gp120 i neutralisati HIV-1.
[0126] U nekim realizacijama, antitelo ili antigen vezujući fragment može da sadrži VHkoji sadrži HCDRl, HCDR2 i HCDR3 iz VHantitela N17 kako je navedeno u Tabeli 1, i može se specifično vezivati za gp120 i neutralisati HIV-1. U nekim realizacijama, antitelo ili antigen vezujući fragment može da sadrži VLkoji sadrži LCDR1, LCDR2 i LCDR3 iz VLantitela N17 kako je navedeno u Tabeli 1, i može se specifično vezivati za gp120 i neutralisati HIV-1. U nekim realizacijama, antitelo ili antigen vezujući fragment može da sadrži VHi VLkoji sadrže HCDRl, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3 iz VHi VLantitela N17 kako je navedeno u Tabeli 1, i može se specifično vezivati za gp120 i neutralisati HIV-1.
[0127] U nekim realizacijama, antitelo ili antigen vezujući fragment uključuje najmanje jedan CDR (kao što je HCDR3) sa sekvencom koja ima najmanje 90% (kao što je najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99%, ili čak 100%) identiteta sekvence sa bilo kojim od CDR-a teškog ili lakog lanca od N17 VHili VLkako je prikazano u Tabeli 1, i može se specifično vezivati za gp120 i neutralisati HIV-1. U nekim realizacijama ovog otkrić a, antitelo ili antigen vezujući fragment uključuje VHkoji sadrži HCDRl, HCDR2 i HCDR3 koji sadrže aminokiselinske sekvence najmanje 90% (kao što je najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98% ili najmanje 99%) identične sa aminokiselinama 31-35, 50-66 i 99-111, respektivno, sekvence SEK ID BR: 3, i može se specifično vezivati za gp120 i neutralisati HIV-1. U nekim realizacijama otkrić a, antitelo ili antigen vezujući fragment uključuje VLkoji sadrži LCDR1, LCDR2 i LCDR3 koji sadrže aminokiselinske sekvence najmanje 90% (kao što je najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97 %, najmanje 98% ili najmanje 99%) identične sa aminokiselinama 24-34, 50-56 i 89-93, respektivno, sekvence SEK ID BR: 4, i može se specifično vezivati za gp120 i neutralisati HIV-1.
U dodatnim rešenjima ovog otkrić a, antitelo ili antigen vezujući fragment uključuje VHkoji sadrži HCDRl, HCDR2 i HCDR3 koji sadrži aminokiselinske sekvence najmanje 90% (kao što je najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97 %, najmanje 98% ili najmanje 99%) identičnih sa aminokiselinama 31-35, 50-66 i 99-111, sekvence SEK ID BR: 3, i VLkoji sadrži LCDR1, LCDR2 i LCDR3 koji sadrže aminokiselinske sekvence najmanje 90% (kao što je najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, ili najmanje 99%) identične sa aminokiselinama 24-34, 50-56, i 89-93, SEK ID BR: 4, respektivno, i mogu se specifično vezivati za gp120 i neutralisati HIV-1.
[0128] U nekim realizacijama ovog otkrić a, antitelo ili antigen vezujući fragment uključuje VHkoji sadrži aminokiselinske sekvence najmanje 90% (kao što je najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, ili najmanje 99%) identične sa aminokiselinskom sekvencom navedenom kao SEK ID BR: 3, i mogu se specifično vezivati za gp120 i neutralisati HIV-1. U više realizacija, antitelo ili antigen vezujući fragment uključuje VLkoji sadrži aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% (kao što je najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, ili najmanje 99% ) identičnu sa aminokiselinskom sekvencom navedenom kao SEK ID BR: 4 i može se specifično vezivati za gp120 i neutralisati HIV-1. U dodatnim realizacijama, antitelo ili antigen vezujući fragment uključuje VHi VLkoji nezavisno sadrže aminokiselinske sekvence najmanje 90% (kao što je najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, ili na najmanje 99%) identične sa aminokiselinskim sekvencama navedenim u SEK ID BR: 3 i 4, respektivno, i može se specifično vezivati za gp120 i neutralisati HIV-1.
[0129] U dodatnim realizacijama, antitelo ili antigen vezujući fragment uključuje VHkoji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu kao jednu iz SEK ID BR: 3, i može se specifično vezivati za gp120 i neutralisati HIV-1. U više realizacija, antitelo ili antigen vezujući fragment uključuje VLkoji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu kao SEK ID BR: 4 i može se specifično vezivati za gp120 i neutralisati HIV-1. U još nekim realizacijama, antitelo ili antigen vezujući fragment uključuje VHi VLkoji sadrže aminokiselinske sekvence kao SEK ID BR: 3 i 4, i može se specifično vezivati za gp120 i neutralisati HIV-1.
F8
[0130] U nekim realizacijama, antitelo ili antigen vezujući fragment može biti na bazi ili izveden od F8, i može se specifično vezivati za gp120 i neutralisati HIV-1. Na primer, antitelo ili antigen vezujući fragment može da sadrži VHi VLkoji sadrže HCDRl, HCDR2 i HCDR3, i LCDR1, LCDR2 i LCDR3, (na primer, prema IMGT ili kabatu), iz antitela F8, i može se specifično vezivati za gp120 i neutralisati HIV-1.
[0131] U nekim realizacijama, antitelo ili antigen vezujući fragment može da sadrži VHkoji sadrži HCDRl, HCDR2 i HCDR3 iz VHantitela F8 kao što je prikazano u Tabeli 1, i može se specifično vezivati za gp120 i neutralisati HIV-1. U nekim realizacijama, antitelo ili antigen vezujući fragment može da sadrži VLkoji sadrži LCDR1, LCDR2 i LCDR3 iz VLantitela F8 kako je navedeno u Tabeli 1, i može se specifično vezivati za gp120 i neutralisati HIV-1. U nekim realizacijama, antitelo ili antigen vezujući fragment može da sadrži VHi VLkoji sadrže HCDRl, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3 iz VHi VLantitela F8 kako je navedeno u Tabeli 1, i može se specifično vezivati za gp120 i neutralisati HIV-1.
[0132] U nekim realizacijama, antitelo ili antigen vezujući fragment uključuje najmanje jedan CDR (kao što je HCDR3) sa sekvencom koja ima najmanje 90% (kao što je najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99%, ili čak 100%) identiteta sekvence sa CDR-om teškog ili lakog lanca iz VHili VLantitela F8 kako je prikazano u Tabeli 1, i može se specifično vezivati za gp120 i neutralisati HIV-1. U nekim realizacijama ovog otkrić a, antitelo ili antigen vezujući fragment uključuje VHkoji sadrži HCDRl, HCDR2 i HCDR3 koji sadrže aminokiselinske sekvence najmanje 90% (kao što je najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97 %, najmanje 98% ili najmanje 99%) identične sa aminokiselinama 31-35, 50-66 i 99-111, respektivno, sekvence SEK ID BR: 5, i može se specifično vezivati za gp120 i neutralisati HIV-1. U nekim realizacijama otkrić a, antitelo ili antigen vezujući fragment uključuje VLkoji sadrži LCDR1, LCDR2 i LCDR3 koji sadrže aminokiselinske sekvence najmanje 90% (kao što je najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97 %, najmanje 98%, ili bar 99%) identične sa aminokiselinama 24-34, 50-56, i 89-93, respektivno, sekvence SEK ID BR: 6, i specifično se može vezivati za gp120 i neutralisati HIV-1. U dodatnim rešenjima otkrić a, antitelo ili antigen vezujući fragment uključuje VHkoji sadrži HCDRl, HCDR2 i HCDR3 koji sadrže aminokiselinske sekvence najmanje 90% (kao što je najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97 %, najmanje 98% ili najmanje 99%) identične sa aminokiselinama 31-35, 50-66 i 99-111, respektivno od SEK ID BR: 5, i VLkoji sadrži LCDR1, LCDR2 i LCDR3 koji sadrže aminokiselinske sekvence najmanje 90% (kao što je najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, ili najmanje 99%) identične sa aminokiselinama 24-34, 50-56, i 89-93, respektivno, sekvence SEK ID BR: 6, i može se specifično vezivati za gp120 i neutralisati HIV-1.
[0133] U nekim realizacijama, antitelo ili antigen vezujući fragment uključuje VHkoji sadrži aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% (kao što je najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, ili na najmanje 99%) identičnu sa aminokiselinskom sekvencom navedenom kao SEK ID BR: 5, i može se specifično vezivati za gp120 i neutralisati HIV-1. U više izvođenja, antitelo ili antigen vezujući fragment uključuje VLkoji sadrži aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% (kao što je najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, ili najmanje 99% ) identičnu sa aminokiselinskom sekvencom navedenom kao SEK ID BR: 6 i može se specifično vezivati za gp120 i neutralisati HIV-1. U dodatnim realizacijama, antitelo ili antigen vezujući fragment uključuje VHi VLkoji nezavisno sadrže aminokiselinske sekvence najmanje 90% (kao što je najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, ili na najmanje 99%) identične sa aminokiselinskim sekvencama navedenim u SEK ID BR: 5 i 6, respektivno, i može se specifično vezivati za gp120 i neutralisati HIV-1.
[0134] U dodatnim realizacijama, antitelo ili antigen vezujući fragment uključuje VHkoji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu kao jednu od SEK ID BR: 5, i može se specifično vezivati za gp120 i neutralisati HIV-1. U više izvođenja, antitelo ili antigen vezujući fragment uključuje VLkoji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu kao SEK ID BR: 6 i može se specifično vezivati za gp120 i neutralisati HIV-1. U nekim realizacijama, antitelo ili antigen vezujući fragment uključuje VHi VLkoji sadrže aminokiselinske sekvence navedene kao SEK ID BR: 5 i 6, i može se specifično vezivati za gp120 i neutralisati HIV-1.
Dodatne N6 varijante
[0135] Dodatne varijante N6 VHi VLsu identifikovane studijama sekvenciranja sledeć e generacije. Sekvence teških i lakih lanaca ovih varijanti su prikazane na Sl. 18 i uključuju VHsekvence 2_2014_00173626_H i 2_2014_00173626_Hmut i VLsekvence 1_2015_00106641_L, 1_2015_00065970_L, 1_2014_00019094_L i 1_2015_00217585_L. U nekoliko realizacija, VHi VLsekvence ili CDR sekvence ovih antitela mogu da se „mešaju i kombinuju“ tako da formiraju antitelo koje se specifično vezuje za gp120 i neutrališe HIV.
[0136] U nekim realizacijama ovog otkrić a, antitelo ili antigen vezujući fragment može sadržati VHkoji sadrži HCDRl, HCDR2 i HCDR3 iz 2_2014_00173626_H (SEK ID BR: 112) VHkako je prikazano na Sl. 18, i LCDR1, LCDR2 i LCDR3 iz 1_2015_00106641_L (SEK ID BR: 104) VLkako je prikazano na Sl. 18, i može se specifično vezivati za gp120 i neutralisati HIV-1. U nekim realizacijama ovog otkrić a, antitelo ili antigen vezujući fragment može da sadrži VHkoji sadrži HCDRl, HCDR2 i HCDR3 iz 2_2014_00173626_H (SEK ID BR: 112) VHkako je prikazano na Sl. 18, i LCDR1, LCDR2 i LCDR3 iz V_1_2015_00065970_L (SEK ID BR: 106) VLkako je prikazano na Sl. 18, i može se specifično vezivati za gp120 i neutralisati HIV-1. U nekim rešenjima ovog otkrić a, antitelo ili antigen vezujući fragment može da sadrži VHkoji sadrži HCDRl, HCDR2 i HCDR3 iz 2_2014_00173626_H (SEK ID BR: 112) VHkako je prikazano na Sl. 18, i LCDR1, LCDR2 i LCDR31_2014_00019094_L (SEK ID BR: 108) VLkako je prikazano na Sl. 18, i može se specifično vezivati za gp120 i neutralisati HIV-1. U nekim realizacijama ovog otkrić a, antitelo ili antigen vezujući fragment može da sadrži VHkoji sadrži HCDRl, HCDR2 i HCDR3 2_2014_00173626_H (SEK ID BR: 112) VHkako je prikazano na Sl. 18, i LCDR1, LCDR2 i LCDR3 iz 1_2015_00217585_L (SEK ID BR: 110) VLkako je prikazano na Sl. 18, i može se specifično vezivati za gp120 i neutralisati HIV-1.
[0137] U nekim realizacijama ovog otkrić a, antitelo ili antigen vezujući fragment može da sadrži 2_2014_00173626_H (SEK ID BR: 112) VHkako je prikazano na Sl. 18, i 1_2015_00106641_L (SEK ID BR: 104) VLkako je prikazano na Sl. 18, a može se specifično vezivati za gp120 i neutralisati HIV-1. U nekim realizacijama ovog otkrić a, antitelo ili antigen vezujući fragment može da sadrži 2_2014_00173626_H (SEK ID BR: 112) VHkako je prikazano na Slici 18, i 1_2015_00065970_L (SEK ID BR: 106) VLkako je prikazano na Sl. 18, i može se specifično vezivati za gp120 i neutralisati HIV-1. U nekim realizacijama ovog otkrić a, antitelo ili antigen vezujući fragment može da sadrži 2_2014_00173626_H (SEK ID BR: 112) VHkako je prikazano na Sl. 18 i 1_2014_00019094_L (SEK ID BR: 108) VLkako je prikazano na Sl.18, i može se specifično vezivati za gp120 i neutralisati HIV-1. U nekim realizacijama ovog otkrić a, antitelo ili antigen vezujući fragment može da sadrži 2_2014_00173626_H (SEK ID BR: 112) VHkako je prikazano na Sl. 18, i 1_2015_00217585_L (SEK ID BR: 110) VLkako je prikazano na Sl. 18, i može se specifično vezivati za gp120 i neutralisati HIV-1.
[0138] U nekim realizacijama ovog otkrić a, antitelo ili antigen vezujući fragment može sadržati VHkoji sadrži aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% (kao što je najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98 %, ili barem 99%) identičnu sa sekvencom VH2_2014_00173626_H (SEK ID BR: 112) kako je prikazano na Sl. 18, i VLkoji sadrži aminokiselinsku sekvencu od najmanje 90% (kao što je najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, ili najmanje 99%) identična sekvenci of_2015_00106641_L ( SEK ID BR: 104) VLkako je prikazano na Sl.18, a može se specifično vezivati za gp120 i neutralisati HIV-1. U nekim realizacijama ovog otkrić a, antitelo ili antigen vezujući fragment može da sadrži VHkoji sadrži aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% (kao što je najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, ili najmanje 99%) identičnu sa sekvencom 2_2014_00173626_H (SEK ID BR: 112) VHkako je prikazano na Sl. 18, i VLkoji sadrži aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% (kao što je najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, ili najmanje 99%) identičnu sa sekvencom 1_2015_00065970_L (SEK ID BR: 106) VLkako je prikazano na Sl.18, i može se specifično vezivati za gp120 i neutralisati HIV-1. U nekim realizacijama ovog otkrić a, antitelo ili antigen vezujući fragment može da sadrži VHkoji sadrži aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% (kao što je najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, ili najmanje 99%) identičnu sa sekvencom 2_H_2014_00173626_H (SEK ID BR: 112) VHkako je prikazano na Sl. 18, i VLkoji sadrži aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% (kao što je najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, ili najmanje 99%) identičnu sa sekvencom 1_2014_00019094_L (SEK ID BR: 108) VLkako je prikazano na Sl. 18, i može se specifično vezivati za gp120 i neutralisati HIV-1. U nekim realizacijama ovog otkrić a, antitelo ili antigen vezujući fragment može sadržati VHkoji sadrži aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% (kao što je najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, ili najmanje 99%) identičnu sa sekvencom 2_H_2014_00173626_H (SEK ID BR: 112) VHkako je prikazano na Sl. 18, i VLkoji sadrži aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% (kao što je najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, ili najmanje 99%) identičnu sa sekvencom 1_2015_00217585_L (SEK ID BR: 110) VLkako je prikazano na Sl.18, i može se specifično vezivati za gp120 i neutralisati HIV-1.
[0139] U nekim realizacijama ovog otkrić a, antitelo ili antigen vezujući fragment može sadržati VHkoji sadrži HCDRl, HCDR2 i HCDR3 od 2_2014_00173626_Hmut (SEK ID BR: 114) VHkako je prikazano na Sl. 18, i LCDR1, LCDR2 i LCDR3 od V_1_2015_00106641_L (SEK ID BR: 104) VLkako je prikazano na Sl.18, i može se specifično vezivati za gp120 i neutralisati HIV-1. U nekim realizacijama ovog otkrić a, antitelo ili antigen vezujući fragment može sadržati VHkoji sadrži HCDRl, HCDR2 i HCDR3 2_2014_00173626_Hmut (SEK ID BR: 114) VHkako je prikazano na Sl.18, i LCDR1, LCDR2 i LCDR31_2015_00065970_L (SEK ID BR: 106) VLkako je prikazano na Sl. 18, i može se specifično vezivati za gp120 i neutralisati HIV-1. U nekim realizacijama ovog otkrić a, antitelo ili antigen vezujući fragment može sadržati VHkoji sadrži HCDRl, HCDR2 i HCDR3 od 2_2014_00173626_Hmut (SEK ID BR: 114) VHkako je prikazano na Sl. 18, i LCDR1, LCDR2 i LCDR3 od 1_2014_00019094_L (SEK ID BR: 108) VLkako je prikazano na Sl. 18, i može se specifično vezivati za gp120 i neutralisati HIV-1. U nekim realizacijama ovog otkrić a, antitelo ili antigen vezujući fragment može sadržati VHkoji sadrži HCDRl, HCDR2 i HCDR3 od 2_2014_00173626_Hmut (SEK ID BR: 114) VHkako je prikazano na Sl. 18, i LCDR1, LCDR2 i LCDR3 od 1_2015_00217585_L (SEK ID BR: 110) VLkako je prikazano na Sl. 18, i može se specifično vezivati za gp120 i neutralisati HIV-1.
[0140] U nekim realizacijama ovog otkrić a, antitelo ili antigen vezujući fragment može da sadrži 2_2014_00173626_Hmut (SEK ID BR: 114) VHkako je prikazano na Sl. 18, i 1_2015_00106641_L (SEK ID BR: 104) VLkako je prikazano na Sl. 18, i može se specifično vezivati za gp120 i neutralisati HIV-1. U nekim realizacijama ovog otkrić a, antitelo ili antigen vezujući fragment može da sadrži 2_2014_00173626_Hmut (SEK ID BR: 114) VHkako je prikazano na Sl.18 i 1_2015_00065970_L (SEK ID BR: 106) VLkako je prikazano na Sl. 18, i može se specifično vezivati za gp120 i neutralisati HIV-1. U nekim realizacijama ovog otkrić a, antitelo ili antigen vezujući fragment može da sadrži 2_2014_00173626_Hmut (SEK ID BR: 114) VHkako je prikazano na Sl. 18 i 1_2014_00019094_L (SEK ID BR: 108) VLkako je prikazano na Sl.18, i može se specifično vezivati za gp120 i neutralisati HIV-1. U nekim realizacijama ovog otkrić a, antitelo ili antigen vezujući fragment može sadržati 2_2014_00173626_Hmut (SEK ID BR: 114) VHkako je prikazano na Sl. 18, i 1_2015_00217585_L (SEK ID BR: 110) VLkako je prikazano na Sl. 18, i može se specifično vezivati za gp120 i neutralisati HIV-1.
[0141] U nekim realizacijama ovog otkrić a, antitelo ili antigen vezujući fragment može sadržati VHkoji sadrži aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% (kao što je najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98 %, ili najmanje 99%) identičnu sa sekvencom VH2_2014_00173626_Hmut (SEK ID BR: 114) kako je prikazano na Sl. 18, i VLkoji sadrži aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% (kao što je najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, ili najmanje 99%) identičnu sa sekvencom 1_2015_00106641_L (SEK ID BR: 104) VLkako je prikazano na Sl.18, i može se specifično vezivati za gp120 i neutralisati HIV-1. U nekim realizacijama ovog otkrić a, antitelo ili antigen vezujući fragment može da sadrži VHkoji sadrži aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% (kao što je najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, ili najmanje 99%) identičnu sa sekvencom 2_2014_00173626_Hmut (SEK ID BR: 114) VHkako je prikazano na Sl.18, i VLkoji sadrži aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% (kao što je najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98% ili najmanje 99%) identičnu sa sekvencom 1_2015_00065970_L (SEK ID BR: 106) VLkako je prikazano na Sl.18, i može se specifično vezivati za gp120 i neutralisati HIV-1. U nekim realizacijama ovog otkrić a, antitelo ili antigen vezujući fragment može da sadrži VHkoji sadrži aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% (kao što je najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, ili najmanje 99%) identičnu sa sekvencom 2_2014_00173626_Hmut (SEK ID BR: 114) VHkako je prikazano na Sl.18, i VLkoji sadrži aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% (kao što je najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, ili najmanje 99%) identičnu sa sekvencom 1_2014_00019094_L (SEK ID BR: 108) VLkako je prikazano na Sl.18, i može se specifično vezivati za gp120 i neutralisati HIV-1. U nekim rešenjima ovog otkrić a, antitelo ili antigen vezujući fragment može da sadrži VHkoji sadrži aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% (kao što je najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, ili najmanje 99%) identičnu sa sekvencom 2_2014_00173626_Hmut (SEK ID BR: 114) VHkako je prikazano na Sl. 18, i VLkoji sadrži aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% (kao što je najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, ili najmanje 99%) identičnu sa sekvencom 1_2015_00217585_L (SEK ID BR: 110) VLkako je prikazano na Sl.18, i može se specifično vezivati za gp120 i neutralisati HIV-1.
1. Dodatni Opis Antitela i Antigen Vezujućih Fragmenata
[0142] Antitela N6, N17 ili F8 su klonalne varijante jedni drugih i uključuju slične CDR teškog i lakog lanca koji potiču od istih germinativnih gena teškog i lakog lanca. Shodno tome, CDR sekvence ovih antitela se mogu koristiti za generisanje konsenzus sekvenci CDR za rod antitela i antigen vezujućih fragmenata koji se specifično vezuju za gp120 i neutrališu HIV-1. U nekim realizacijama ovog otkrić a, antitelo ili antigen vezujući fragment uključuje VHkoji sadrži HCDR1, HCDR2 i/ili HCDR3 koji uključuju aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 19 (AHILX1, gde X1je F ili Y), SEK ID BR: 20 (WIKPQYGAVNFGGGFRX1, gde X1je D ili G), i/ili SEK ID BR: 21 (ARDRSYX1DSSVALDAW, gde X1je G ili D). U nekim realizacijama ovog otkrić a, antitelo ili antigen vezujući fragment uključuje VL kojiuključuje LCDR1, LCDR2 i/ili LCDR3, koji sadrže aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 22 (QTSQGVGX1DLH, gde X1je G ili S), SEK ID BR: 23 (HX1SSVED, gde X1je A ili T), i/ili SEK ID BR: 24 (QVLX1X2F, gde X1je E ili Q, i X2je S ili F), respektivno. U nekim realizacijama ovog otkrić a, antitelo ili antigen vezujući fragment uključuje VHkoji sadrži HCDRl, HCDR2 i/ili HCDR3 koji sadrže aminokiselinsku sekvencu od SEK ID BR: 19, SEK ID BR: 20 i SEK ID BR: 21, respektivno, i dalje uključuje VLkoji sadrži LCDR1, LCDR2 i/ili LCDR3 koji sadrže aminokiselinsku sekvencu od SEK ID BR: 22, SEK ID BR: 23 i SEK ID BR: 24, respektivno.
[0143] U nekim realizacijama ovog otkrić a, VHi VLsegmenti otkrivenih antitela mogu da se „mešaju i kombinuju“, da se različiti parovi VLi VHsegmenata kombinujui i provere za vezivanje sa gp120 da se izaberu kombinacije parova VLi VHod interesa.
[0144] U još jednoj realizaciji ovog otkrić a, antitelo ili antigen vezujući fragment uključuje HCDR1 sa jednom od aminokiselinskih sekvenci SEK ID BR: 7, 13 ili 19, HCDR2 sa jednom od aminokiselinskih sekvenci SEK ID BR: 8, 14 ili 20, i HCDR3 sa jednom od aminokiselinskih sekvenci SEK ID BR: 9, 15 ili 21. U još jednoj realizaciji ovog otkrić a, antitelo ili antigen vezujući fragment uključuje LCDR1 sa jednom od aminokiselinskih sekvenci SEK ID BR: 10, 16 ili 22, LCDR2 sa jednom od aminokiselinskih sekvenci SEK ID BR: 11, 17 ili 23, i LCDR3 sa jednom od aminokiselinskih sekvenci SEK ID BR: 12, 18 ili 24. U više realizacija ovog otkrić a, antitelo ili antigen vezujući fragment uključuje HCDR1 sa jednom od aminokiselinskih sekvenci SEK ID BR: 7, 13 ili 19, HCDR2 sa jednom od aminokiselinskih sekvenci SEK ID BR: 8, 14 ili 20, HCDR3 sa jednom od aminokiselinskih sekvenci SEK ID BR: 9, 15 ili 21, LCDR1 sa jednom od aminokiselinskih sekvenci SEK ID BR: 10, 16, ili 22, LCDR2 sa jednom od aminokiselinskih sekvenci SEK ID BR: 11, 17 ili 23 i LCDR3 sa jednom od aminokiselinskih sekvenci SEK ID BR: 12, 18 ili 23.
[0145] U nekim realizacijama ovog otkrić a, antitelo ili fragment antitela uključuje najmanje jedan CDR sa sekvencom koja ima najmanje 95% identičnosti sa jednom od SEK ID BR: 7-18, pri čemu se antitelo specifično vezuje za gp120 i neutrališe HIV-1 infekciju. U dodatnim realizacijama ovog otkrić a, antitelo ili antigen vezujući fragment uključuje VHkoji sadrži HCDR1, HCDR2 i HCDR3 koji uključuju aminokiselinske sekvence najmanje 90% (kao što je najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97 %, najmanje 98% ili najmanje 99%) identične sa aminokiselinama 31-35, 50-66 i/ili 99-111, respektivno, jedne od sekvenci SEK ID BR: 1, 3, ili 5. U nekim realizacijama ovog otkrić a, antitelo ili antigen vezujući fragment uključuje VLkoji sadrži LCDR1, LCDR2 i LCDR3 koji uključuju aminokiselinske sekvence najmanje 90% (kao što je najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98% ili najmanje 99%) identične sa aminokiselinama 24-34, 50-56, i/ili 89-93, jedne od SEK ID BR: 2, 4, ili 6.
[0146] Ovde prikazane strukturalne studije ilustruju nekoliko karakteristika interakcije antitela N6 sa gp120, uključujuć i (1) reziduu tirozina na kabat poziciji 54 u VHantitela N6 (lociranu u HCDR2), (2) tri rezidue glicina na kabat pozicijama 61-63 u VHantitela N6 (takođe lociranu u HCDR2), (3) reziduu glicina na kabat pozicijama 28 u N6 u VL( lociranu u LCDR1), (4) GXG motiv na kabat pozicijama 28-30 u VLantitela N6 (takođe lociranu u LCDR1) i (5) 5 rezidua LCDR3. Kako je prikazano na Sl. 1, ove karakteristike su očuvane u antitelima N6, N17, ili F8. U nekim realizacijama, otkrivena antitela koja uključuju CDR antitela N6, N17 ili F8 (ili njihove varijante) mogu da sadrže i jednu ili više gore navedenih karakteristika (1) - (5) (kao što su karakteristike (1) i (2); (1) i (3); (1) i (4); (1) i (5); (2) i (3); (2) i (4); (2) i (5) (3) i (4); (3) i (5); (4) i (5); (1), (2) i (3); (1), (2) i (4) (1), (2) i (5); (1), (3) i (4); (1), (3) i (5); (1), (4) i (5); (2), (3) i (4); (2), (3) i (5); (2), (4) i (5); (3), (4), i (5); (1), (2), (3) i (4); (1), (2), (3) i (5); (1), (3), (4) , i (5); (2), (3), (4) i (5) ili (1), (2), (3), (4) i (5)) i specifično se vezuju za gp120 i neutrališu HIV-1.
[0147] Zatim, zbog sličnosti antitela N6, N17 ili F8 sa određenim poznatim antitelima klase VRC01, gore navedene navedene karakteristike (1) - (5) (kao što su karakteristike (1) i (2); (1) i (3); (1) i (4); (1) i (5); (2) i (3); (2) i (4); (2) i (5); (3 ) i (4); (3) i (5); (4) i (5); (1), (2) i (3); (1), (2) i (4); (1 ), (2) i (5); (1), (3) i (4); (1), (3) i (5); (1), (4) i (5); (2), (3) i (4); (2), (3) i (5); (2), (4) i (5); (3), (4) i (5) ); (1), (2), (3) i (4); (1), (2), (3) i (5); (1), (3), (4) i (5); (2), (3), (4) i (5) ili (1), (2), (3), (4) i (5)) mogu biti uključena u antitela klase VRC01 da se pove ć a širina i potentnost sa kojima se ova antitela specifično vezuju za gp120 i neutrališu HIV-1. Neograničavajuć i primeri antitela klase VRC01 koja se mogu modifikovati tako da uključe jednu ili više karakteristika (1) - (5) uključuju antitela VRC01, VRC03, VRC07, VRC07-523, 3BCN117, 12A12, 12A21, VRC-PG04, NIH45-46, VRC18, VRC23, VRC27, VRC-CH30, VRC-CH31, VRC-PG04 i VRC-PG20.
[0148] Antitelo ili antigen vezujući fragment može biti humano antitelo ili njegov fragment. Takođe su obezbeđena himerna antitela. Antitelo ili antigen vezujući fragment može da obuhvata bilo koji pogodan okvirni region, kao što je (ali ne ograničavajući se na) humani okvirni region. Humani okvirni regioni i mutacije koje se mogu napraviti u okvirnim regionima humanih antitela su poznati u struci (videti, npr., U.S. Patent br. 5,585,089). Alternativno, heterologni okvirni region, kao što je, ali ne ograničavajući se samo na njih, okvirni region miša ili majmuna, može biti uključen u teški ili laki lanac antitela. (Vidi, na primer, Jones et al., Nature 321:522, 1986; Riechmann et al., Nature 332: 323, 1988; Verhoeyen et al., Science 239:1534, 1988; Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.89: 4285, 1992; Sandhu, Crit. Rev. Biotech.12: 437, 1992; i Singer et al., J. Immunol.150:2844, 1993.)
[0149] Antitelo može biti bilo kojeg izotipa. Antitelo može biti, na primer, IgM ili IgG antitelo, kao što je IgG1, IgG2, IgG3ili IgG4. Klasa antitela koje se specifično vezuje za gp120 može biti zamenjena drugom. U jednom aspektu, molekul nukleinske kiseline koji kodira VLili VHje izolovan korišć enjem metoda dobro poznatih u struci, tako da ne uključuje nijednu sekvencu nukleinskih kiselina koja kodira konstantni region lakog ili teškog lanca, respektivno. Molekul nukleinske kiseline koji kodira VLili VHje tada operativno povezan sa sekvencom nukleinske kiseline koja kodira CLili CHiz različitih klasa molekula imunoglobulina. To se može postić i upotrebom vektora ili molekula nukleinske kiseline koji sadrži CLili CHlanac, kao što je poznato u struci. Na primer, antitelo koje se specifično vezuje za gp120, koji je prvobitno bio IgG, može biti klasa zamenjena sa IgM. Promena klase se može koristiti za konverziju jedne IgG podklase u drugu, kao što je iz IgG1u IgG2, IgG3ili IgG4.
[0150] U nekim primerima, otkrivena antitela su oligomeri antitela, poput dimera, trimera, tetramera, pentamera, heksamera, septamera, oktomera i tako dalje.
(a) Afinitet vezivanja
[0151] U nekoliko realizacija, antitelo ili antigen vezujući fragment može specifično da vezuje gp120 sa afinitetom (npr., mereno pomoću Kd) ne već im od 1.0 x 10<-8>M, ne već im od 5.0 x 10<-8>M, ne već im od 1.0 x 10<-9>M, ne već im od 5.0 x 10<-9>M, ne već im od 1.0 x 10<-10>M, ne već im od 5.0 x 10<-10>M, ili ne već im od 1.0 x 10<-11>M. Kdse može meriti, na primer, testom vezivanja radioaktivno obeleženog antigena (RIA) izvedenim sa Fab verzijom antitela od interesa i njegovim antigenom korišćenjem poznate metode. U jednom testu, afinitet vezivanja Fab-a sa antigenom se meri ekvilibrisanjem Fab-a sa minimalnom koncentracijom (<125>J)-obeleženog antigena u prisustvu serija titracija neobeleženog antigena, a zatim zarobljavanjem vezanog antigena na ploči obloženoj sa anti-Fab antitelom (vidi, npr., Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)). Da bi uspostavili uslove za ispitivanje, MICROTITER® ploče sa više bunarčića (Thermo Scientific) preko no ć i su obložene sa 5 µg/ml anti-Fab antitela za zarobljavanje (Cappel Labs) u 50 mM natrijum-karbonata (pH 9.6), a potom blokirane sa 2% (m/v) goveđeg serumskog albumina u PBS tokom dva do pet sati na sobnoj temperaturi (približno 23 °C). U ne-adsorbentnoj ploči (Nunc # 269620), 100 µM ili 26 pM [<125>J]-antigena je mešan sa serijskim razblaženjima Fab-a od interesa (npr., u skladu sa procenom anti-VEGF antitela, Fab-12, u Presta et al., Cancer Res. 57:4593-4599 (1997)). Fab od interesa je zatim inkubiran preko noć i; međutim, inkubacija može da traje duže vreme (npr. oko 65 sati) da se obezbedi postizanje ekvilibrijuma. Nakon toga, smeše su prenete na ploču za izdvajanje radi inkubacije na sobnoj temperaturi (npr. tokom jednog sata). Rastvor je zatim uklonjen i ploča isprana osam puta sa 0.1% polisorbatom 20 (TWEEN-20<TM>) u PBS. Kad su se ploče osušile, dodat je scintilant, 150 µl/bunarčiću (MICROSCINT-20<TM>; Packard) i ploče su merene na TOPCOUNT<TM>gama brojaču (Packard) tokom deset minuta. Koncentracije svakog Fab-a koje daju manje ili jednako 20% od maksimalnog vezivanja su izabrane za primenu u testovima kompetitivnog vezivanja.
[0152] U drugom ispitivanju, Kdse može meriti korišć enjem testova rezonancije površinskih plazmona koriš ć enjem BIACORE®-2000 ili BIACORE®-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, N.J.) na 25 °C sa imobilizovanim antigen CM5 čipovima sa ∼ 10 jedinica odgovora (RU). Ukratko, karboksimetilirani dekstran biosenzor čipovi (CM5, BIACORE®, Inc.) su aktivirani sa N-etil-N'- (3-dimetilaminopropil)-karbodiimid hidrohloridom (EDC) i N-hidroksisukcinimidom (NHS) prema uputstvima dobavljača. Antigen je razblažen sa 10 mM natrijum acetata, pH 4.8, do 5 µg/ml (∼0.2 µM) pre injekcije pri brzini protoka od 5 l/minut da se postigne približno 10 jedinica odgovora (RU) vezanog proteina. Nakon injektiranja antigena, injektiran je 1 M etanolamin koji blokira grupe koje nisu izreagovale. Za kinetička merenja, injektirana su dvostruka serijska razblaženja Fab (0.78 nM od 500 nM) u PBS sa 0.05% polisorbata 20 (TWEEN-20<TM>) površinski aktivnog sredstva (PBST) na 25 °C pri protoku od približno 25 l/min. Stepen asocijacije (kon) i stepen disocijacije (koff) se izračunavaju pomoću jednostavnog jedan-na-jedan Langmuir modela vezivanja (BIACORE® Evaluation Software verzija 3.2) istovremenim fitovanjem senzograma asocijacije i disocijacije. Ravnotežna konstanta disocijacije (Kd) izračunava se kao odnos koff/kon. Vidi, npr., Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999). Ako stepen asocijacije premaši 106 M<-1>s<-1>prema testu rezonancije površinskih plazmona, onda se brzina može odrediti upotrebom fluorescentne kvenčing tehnike koja meri porast ili opadanje intenziteta fluorescentne emisije (pobuda = 295 nm emisija = 340 nm, širina trake 16 nm ) na 25 °C 20 nM anti-antigen antitela (Fab oblik) u PBS, pH 7.2, u prisustvu rastućih koncentracija antigena mereno spektrometrom, kao što je spektrofotometar sa prekidom protoka (Aviv Instruments) ili SLM-AMINCO<TM>spektrofotometar serije 8000 (ThermoSpectronic) sa mešanjem kivete.
(b) Neutralizacija
[0153] U nekim realizacijama, antitelo ili antigen vezujući fragment se takođe mogu razlikovati prema širini neutralizacije. U nekim realizacijama, antitelo ili antigen vezujući fragment može da neutrališe najmanje 70% (kao što je najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, ili najmanje 95%) HIV-1 izolata uključenih u standardizovani panel HIV-1 pseudovirusa (uključujuć i npr. gp120 iz Klade A izolata KER2018, RVO20.2, K168.a2, Q769.d22 i Q769.h5, Klade B izolata JRFL.JB, BaL.01, YU2.DG, PVO.04, TRO.11, CAAN.A2, TRJO.58, THRO.18, BG1168.1, i 6101.1, i Klade C izolata ZA012.29, DU156.12, DU422.01, ZM106.9 i ZM55.28a) sa IC50manjim od 50 µg/ml. Primeri testova neutralizacije pseudovirusa i paneli HIV-1 pseudovirusa su opisani, na primer, u Li et al., J Virol 79, 10108-10125. U nekim realizacijama, otkriveno antitelo ili antigen vezujući fragment se specifično vezuje za CD4 mesto vezivanja gp120 i može da neutrališe najmanje 50% HIV-1 izolata navedenih na Sl. 2B (naime, 6540.v4.cl, 620345.c1, T278-50, 6322.V4.C1, DU422.01, X2088.c9, 6545.V4.C1, 242-14, T250-4, 7165.18, BL01.DG, HO86.8, 6471.V1.C16, 6631.V3.C10, TVI.29, TZA125.17, CAP210.E8, DU172.17) sa inhibitornom koncentracijom (IC50)<50 µg/ml. Prosečnom stručnjaku su poznate metode za merenje širine i potentnosti neutralizacije, na primer, takvi postupci uključuju jedno-kružnu infekciju TZM-bl ć elija sa HIV-1 Env-pseudovirusima (videti, npr., Li et al., J Virol 79, 10108-10125; videti takođe, PCT Pub. br. WO2011/038290).
[0154] Dodatne metode za ispitivanje aktivnosti neutralizacije uključuju test infekcije u jednom ciklusu kao što je opisao Martin sa sar. (2003) Nature Biotechnology 21:71-76. U ovom testu, nivo virusne aktivnosti se meri pomoć u selektabilnog markera čija aktivnost odražava količinu vijabilnog virusa u uzorku, i određuje se IC50. U drugim testovima, akutna infekcija se može nadgledati u ć elijskoj liniji PM1 ili u primarnim ć elijama (normalni PBMC). U ovom testu, nivo virusne aktivnosti se može pratiti određivanjem koncentracija p24 pomoć u ELISA testa. Vidi, na primer, Martin et al. (2003) Nature Biotechnology 21:71-76.
(c) Multispecifična antitela
[0155] U nekim realizacijama, antitelo ili antigen vezujući fragment je uključen u multispecifično antitelo, kao što je bispecifično antitelo. Takva multispecifična antitela se mogu proizvesti poznatim postupcima, kao što je umrežavanje dva ili više antitela, antigen vezujućih fragmenata (poput scFv) iste ili različitih vrsta. Primeri metoda pravljenja multispecifičnih antitela uključuju one opisane u PCT Pub. Br. WO2013/163427. Pogodni umreživači uključuju one koji su heterobifunkcionalni, koji imaju dve izrazito reaktivne grupe razdvojene odgovarajuć im spejserom (kao što je m-maleimidobenzoil-N-hidroksisukcinimid estar) ili homobifunkcionalni (kao što je disukcinimidil suberat). Takvi linkeri se mogu nabaviti kod kompanije Pierce Chemical Company, Rockford, Ill.
[0156] U nekim realizacijama, antitelo ili antigen vezujući fragment je uključen u bispecifično antitelo koje se specifično vezuje za gp120 a zatim se specifično vezuje za CD3. Poznati su primeri CD3 domena vezivanja koji mogu biti uključeni u bispecifično antitelo ili antigen vezujući fragment i oni uključuju one koji su otkriveni u PCT Pub. Br. WO2013/163427.
[0157] Poznate su različite vrste multi-specifičnih antitela. Bispecifična antitela sa jednim lancem mogu biti kodirana jednim molekulom nukleinske kiseline. Primeri bispecifičnih jednolančanih antitela, kao i postupci konstruisanja takvih antitela su poznati u struci (videti, npr., U.S. Patente br. 8,076,459, 8,017,748, 8,007,796, 7,919,089, 7,820,166, 7,635,472, 7,575,923, 7,435,549, 7,332,168, 7,3237,235,641, 7,229,760, 7,112,324, 6,723,538). Dodatni primeri bispecifičnih jednolančanih antitela se mogu nać i u PCT aplikaciji br. WO 99/54440; Mack, J. Immunol., 158: 3965-3970, 1997; Mack, PNAS, 92: 7021-7025, 1995; Kufer, Cancer Immunol. Immunother., 45:193-197, 1997; Loffler, Blood, 95:2098-2103, 2000; i Bruhl, J. Immunol., 166:2420-2426, 2001. Proizvodnja bispecifičnih molekula Fab-scFv ("bi-tela") je opisana, npr. u Schoonjans et al. (J. Immunol. 165:7050-57, 2000) i Willems et al. (J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci.786:161-76, 2003). Za bi-tela, scFv molekul može biti fuzionisan sa jednim od VL-CL (L) ili VH-CH1 lanaca, npr., da bi se stvorilo bitelo, jedan scFv je fuzionisan sa C-terminusom Fab lanca.
(d) Fragmenti
[0158] Ovim otkrić em su obuhva ć eni antigen vezujući fragmenti, kao što su Fab, F(ab')2i Fv koji uključuju teški lanac i VLi specifično vezuju gp120. Ovi fragmenti antitela zadržavaju sposobnost selektivnog vezivanja sa antigenom i oni su "antigen vezujući" fragmenti. Neograničavajuć i primeri takvih fragmenata uključuju:
(1) Fab, fragment koji sadrži monovalentni antigen vezujući fragment molekula antitela, može biti proizveden digestiranjem celog antitela sa papain enzimom da bi se dobio intakni laki lanac i deo jednog teškog lanca;
(2) Fab', fragment molekula antitela se može dobiti tretiranjem celog antitela pepsinom, nakon čega sledi redukcija, da se dobije intakni laki lanac i deo teškog lanca; dobijaju se dva Fab` fragmenta po molekulu antitela;
(3) (Fab')2, fragment antitela koji se može dobiti tretiranjem celog antitela pepsin enzimom bez naknadne redukcije; F(ab')2je dimer dva Fab fragmenta koje vezuju dve disulfidne veze;
(4) Fv, genetski konstruisan fragment koji sadrži VHi VLeksprimirane kao dva lanca; i
(5) Jednolančano antitelo (kao što je scFv), definisano kao genetski inženjerisan molekul koji sadrži VHi VLpovezane odgovarajuć im polipeptidnim linkerom kao genetski fuzionisan jednolančani molekul (videti, na primer, Ahmad et al., Clin. Dev. Immunol., 2012, doi: 10.1155/2012/980250; Marbry, IDrugs, 13:543-549, 2010). Intramolekularna orijentacija VHdomena i VLdomena u scFv, nije presudna za obezbeđena antitela (npr., za obezbeđena multispecifična antitela). Prema tome, mogu se koristiti scFvs sa oba moguć a rasporeda (VH-domen-linker domen-VL-domen; VL-domen-linker domen-VH-domen).
(6) Dimer jednolančanog antitela (scFV2), definisan kao dimer scFV. Ono se takođe naziva "miniantitelo".
[0159] Postupci pravljenja ovih fragmenata su poznati u tehnici (videti, na primer, Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 2013).
[0160] U nekim realizacijama, antigen vezujući fragment može biti FVantitelo, koje je obično oko 25 kDa i sadrži kompletno mesto vezivanja antigena sa tri CDR-a po svakom teškom lancu i svakom lakom lancu. Da bi proizveli FVantitela, VHi VLmogu biti eksprimirani od dva pojedinačna konstrukta nukleinske kiseline u ć eliji doma ć inu. Ako se VHi VLeksprimiraju odvojeno, lanci FVantitela se obično drže zajedno pomoću nekovalentnih interakcija. Međutim, ovi lanci imaju tendenciju ka disocijaciji nakon razblaživanja, tako da su razvijene metode za unakrsno povezivanje lanaca pomoću glutaraldehida, međumolekulskih disulfidniih ili peptidnih linkera. Prema tome, u jednom primeru, Fv može biti disulfidno stabilizovani Fv (dsFv), u kojem su VHi VLhemijski povezani disulfidnim vezama. U dodatnom primeru, Fv fragmenti uključuju VHi VLlance povezane peptidnim linkerom. Ovi jednolančani antigen vezujući proteini (scFv) mogu biti pripremljeni konstruisanjem molekula nukleinske kiseline koji kodira VHi VLdomene povezane oligonukleotidom. Molekul nukleinske kiseline se ubacuje u ekspresioni vektor, koji se zatim uvodi u ć eliju doma ć ina, kao što je ć elija sisara. Rekombinantne ć elije doma ć ina sintetišu pojedinačni polipeptidni lanac sa linker peptidom koji premošć uje dva V domena. Metode za proizvodnju scFv su poznati u struci (videti Vhitlov et al., Methods: a Companion to Methods in Enzimology, Vol. 2, strana 97, 1991; Bird et al., Science 242:423, 1988; US Patent No.
4,946,778; Pack et al., Bio/Technology 11:1271, 1993; Ahmad et al., Clin. Dev. Immunol., 2012, doi:10.1155/2012/980250; Marbry, IDrugs, 13:543-549, 2010). Takođe se razmatraju i dimeri jednolančanih antitela (scFV2).
[0161] Antigen vezujući fragmenti mogu biti pripremljeni proteolitičkom hidrolizom antitela ili ekspresijom DNK kodirajućeg fragmenta u ć eliji doma ć inu (kao što je ć elija E. coli). Antigen vezujući fragmenti se takođe mogu dobiti digestijom celih antitela pepsinom ili papainom pomoću konvencionalnih metoda. Na primer, antigen vezujući fragmenti se mogu proizvesti enzimskim cepanjem antitela sa pepsinom da se dobije 5S fragment označen sa F(ab')2. Ovaj fragment može dalje biti otcepljen pomoću tiol redukcionog agensa i, po izboru, blokirajuće grupe za sulfhidrilne grupe nastale raskidanjem disulfidnih veza, da se dobiju 3.5S Fab' monovalentni fragmenti. Alternativno, enzimsko cepanje pomoć u pepsina direktno stvara dva monovalentna Fab' fragmenta i Fc fragment (vidi U.S. Patent br. 4,036,945 i U.S. patent br.4,331,647 i reference sadržane u njima; Nisonhoff et al., Arch. Biochem. Biophys. 89:230, 1960; Porter, Biochem. J. 73:119, 1959; Edelman et al., Methods in Enzimology, Vol. 1, strana 422, Academic Press, 1967, i Coligan et al. u odeljcima 2.8.1-2.8.10 i 2.10.1-2.10.4).
[0162] Takođe se mogu koristiti i ostale metode cepanja antitela, poput separacije teških lanaca radi formiranja monovalentnih fragmenata lakog-teškog lanca, dalje cepanje fragmenata ili druge enzimske, hemijske ili genetske tehnike, sve dok fragmenti vezuju antigen koji prepoznaje intakno antitelo.
[0163] Antigen vezujući pojedinačni VHdomeni zvani i domeni antitela (dAb) su takođe identifikovani iz biblioteke mišjih VHgena amplifikovnaih iz genomske DNK imunizovanih miševa (Ward et al. Nature 341:544-546, 1989). Takođe su opisani humani polipeptidi sa pojedinačnim varijabilnim domenom imunoglobulina koji mogu da vezuju antigen sa visokim afinitetom (vidi, na primer, PCT publikacije br. WO 2005/035572 i WO 2003/002609). Ovde otkriveni CDR-i takođe mogu biti uključeni u dAb.
[0164] U nekim realizacijama, jedan ili više regiona koji određuju komplementarnost teškog i/ili lakog lanca (CDR) iz otkrivenog antitela (kao što su antitela N6, N17 ili F8) su eksprimirani na površini drugog proteina, kao što je scaffold protein. Ekspresija domena antitela na površini scaffold proteina je poznata u struci (videti npr. Liu et al., J. Virology 85(17):8467-8476, 2011). Takva ekspresija stvara himerni protein koji zadržava vezivanje za gp120. U nekim specifičnim rešenjima ovog otkrić a, jedan ili više CDR-a teškog lanca se graftuje na scaffold protein, kao što je jedan ili više CDR1, CDR2 i/ili CDR3 teškog lanca. Jedan ili više CDR takođe mogu biti uključeni u dijatelo ili drugu vrstu jednolančanog molekula antitela.
(e) Dodatna antitela koja se vezuju za N6, N17 ili F8 epitope na gp120.
[0165] Takođe su uključena antitela koja se vezuju za isti epitop na gp120 za koji se vezuje antitelo N6, N17 ili F8. Antitela koja se vezuju za takav epitop mogu biti identifikovana na osnovu njihove sposobnosti kross-kompeticije (na primer, da na statistički značajan način kompetitivno inhibiraju vezivanje) sa antitelima N6, N17, ili F8 koja su ovde obezbeđena u testovima vezivanja gp120 (poput onih opisanih u Primerima). Antitelo se „takmiči“ za vezivanje kada konkurentsko antitelo inhibira vezivanje antitela N6, N17, ili F8 sa gp120 za više od 50%, u prisustvu koncentracija konkurentskog antitela već ih od 10<6>x Kdkonkurentskog antitela. U određenoj realizaciji, antitelo koje se vezuje za isti epitop na gp120 kao i antitela N6, N17, ili F8 je humano monoklonsko antitelo. Takva humana monoklonska antitela mogu biti pripremljena i izolovana kao što je ovde opisano.
[0166] Humana antitela koja se vezuju za isti epitop na gp120 za koji se veže antitelo N6, N17 ili F8 mogu biti proizvedena korišćenjem različitih tehnika poznatih u struci. Humana antitela su uglavnom opisana u van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) i Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008). Takva antitela mogu biti pripremljena, na primer, administriranjem imunogena transgeničnoj životinji koja je modifikovana tako da proizvodi intaktna humana antitela ili intaktna antitela sa humanim varijabilnim regionima kao odgovor na antigenski izazov. Takve životinje obično sadrže ceo ili deo humanog imunoglobulinskog lokusa koji zamenjuje endogene imunoglobulinske lokuse ili su prisutni ekstrahromozomski ili su nasumično integrisani u životinjske hromozome. Kod takvih transgeničnih miševa, ovi endogeni lokusi imunoglobulina su uglavnom inaktivirani. Za pregled metoda za dobijanje humanih antitela od transgeničnih životinja, vidi Lonberg, Nat. Biotech.
23:1117-1125 (2005). Vidi takođe, npr. U.S. Patente br. 6,075,181 i 6,150,584 koji opisuju XENOMOUSE<TM>tehnologiju; U.S. Pat. Br. 5,770,429 koji opisuje HUMAB® tehnologiju; U.S. Pat. Br. 7,041,870 koji opisuje K-M MOUSE® tehnologiju i U.S. Patent Application Publication No. US 2007/0061900, koja opisuje tehnologiju VELOCIMOUSE®). Humani varijabilni regioni iz intaktnih antitela generisani od takvih životinja mogu dalje biti modifikovani, npr., kombinovanjem sa različitim humanim konstantnim regionima.
[0167] Humana antitela koja se vezuju za isti epitop na gp120 za koji se vezuje antitelo N6, N17 ili F8 takođe mogu biti proizvedeni pomoću metoda na bazi hibridoma. Opisani su ć elijske linije humanog mijeloma i mišje-humanog heteromijeloma za proizvodnju humanih monoklonskih antitela. (Videti, na primer, Kozbor J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, str. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); i Boerner et al., J. Immunol., 147:86 (1991).) Humana antitela generisana pomoć u tehnologije humanih B- ć elijskih hibridoma takođe su opisana u Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103: 3557-3562 (2006). Dodatne metode uključuju one opisane, na primer, u U.S. Pat. No.
7,1889,826 (koji opisuje proizvodnju monoklonskih humanih IgM antitela iz hibridoma ć elijskih linija) i Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006) (koji opisuje humane-humane hibridome). Humana tehnologija hibridoma (tehnologija Trioma) takođe je opisana u Vollmers i Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) i Vollmers i Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3): 185-91 (2005). Humana antitela takođe mogu biti generisana izolovanjem sekvenci varijabilnih domena FVklona izabranih iz biblioteka humano-izvedenih faga. Takve sekvence varijabilnih domena se zatim mogu kombinovati sa željenim humanim konstantnim domenom.
[0168] Antitela i antigen vezujući fragmenti koji se specifično vezuju za isti epitop na gp120 kao i N6, N17, ili F8 takođe mogu biti izolovani pomoću skrininga kombinatorijalnih biblioteka za antitela sa željenim karakteristikama vezivanja. Na primer, u struci su poznati razni postupci za generisanje biblioteka faga i za skrining takvih biblioteka za antitelima koja imaju željene karakteristike vezivanja. Takvi postupci su razmatrani, na primer, u Hoogenboom et al. u Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, N. J., 2001) i dalje opisani, npr, u McCafferti et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Marks and Bradbury, in Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, N.J., 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol.338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); i Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132 (2004).
[0169] U određenim metodama ispoljavanja faga, kolekcije VHi VLgena su odvojeno klonirane lančanom reakcijom polimeraze (PCR) i rekombinovane nasumično u biblioteke faga, koje mogu biti pregledane za antigen vezujući fag kao što je opisano u Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994). Fagi obično ispoljavaju fragmente antitela, bilo kao jednolančane Fv (scFv) fragmente ili kao Fab fragmente. Biblioteke od imunizovanih izvora obezbeđuju antitela visokog afiniteta na imunogen bez potrebe za stvaranjem hibridoma. Alternativno, naivna kolekcija može biti klonirana (npr. od čoveka) da se dobije pojedinačni izvor antitela za širok spektar ne-sopstvenih a takođe i sopstvenih-antigena bez bilo kakve imunizacije kako je opisano u Griffiths et al., EMBO J, 12:725-734 (1993). Konačno, naivne biblioteke takođe mogu biti napravljene sintetičkim kloniranjem neuređenih segmenata V-gena iz matičnih ć elija i koriš ć enjem PCR prajmera koji sadrže nasumičnu sekvencu za kodiranje visoko varijabilnih CDR3 regiona i postizanje preuređenja in vitro, kako su opisali Hoogenboom i Winter, J. Mol. Biol., 227:381-388 (1992). Patentne publikacije koje opisuju biblioteke humanih fag antitela uključuju, na primer, U.S. Pat. No.
5,750,373, i U.S. Patent Publication Nos. 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936, i 2009/0002360.
(f) Dodatni opis varijanti antitela
[0170] U nekim realizacijama ovog otkrić a, razmatrane su varijante aminokiselinskih sekvenci antitela koja su ovde data. Na primer, može biti poželjno da se poboljša afinitet vezivanja i/ili druga biološka svojstva antitela. Varijante aminokiselinskih sekvenci antitela mogu biti pripremljene uvođenjem odgovarajuć ih izmena u nukleotidnu sekvencu koja kodira antitelo, ili sintezom peptida. Takve modifikacije uključuju, na primer, delecije iz i/ili insercije u i/ili supstitucije rezidua unutar amino kiselinskih sekvenci antitela. Bilo koja kombinacija delecije, insercije i supstitucije može biti napravljena da se dođe do konačnog konstrukta, pod uslovom da krajnji konstrukt poseduje željene karakteristike, npr., vezivanje antigena.
[0171] U nekim realizacijama ovog otkrić a, obezbeđene se varijante antitela koje imaju jednu ili više supstitucija aminokiselina. Mesta od interesa za supstitucionu mutagenezu uključuju CDR-e i okvirne regione. Aminokiselinske supstitucije mogu biti uvedene u antitelo od interesa i produkti pregledani za željenu aktivnost, npr. zadržano/poboljšano vezivanje antigena, poveć ana širina ili potentnost neutralisanja HIV-1, smanjena imunogenost ili poboljšan ADCC ili CDC.
[0172] Varijante obično zadržavaju aminokiselinske rezidue neophodne za pravilno savijanje i stabilizovanje između VHi VLregiona, i zadržać e karakteristike naelektrisanja rezidua kako bi se sačuvao nizak pl i niska toksičnost molekula. U nekim realizacijama ovog otkrić a, supstitucije aminokiselina se mogu izvršiti u VHi VLregionima da bi se poveć ao prinos.
[0173] U nekim realizacijama ovog otkrić a, VHantitela može da sadrži do 10 (kao što je do 1, do 2, do 3, do 4, do 5, do 6, do 7, do 7 , do 8 ili do 9) supstitucija aminokiselina (kao što su konzervativne supstitucije aminokiselina) u odnosu na VHaminokiselinsku sekvencu koja je navedena kao jedna od SEK ID BR: 1, 3 ili 5, i može se specifično vezivati za gp120 i neutralisati HIV-1. U nekim realizacijama ovog otkrić a, VLantitela može da sadrži do 10 (kao što je do 1, do 2, do 3, do 4, do 5, do 6, do 7, do 7, do 78, ili do 9) supstitucija aminokiselina (kao što su konzervativne supstitucije aminokiselina) u odnosu na VLaminokiselinsku sekvencu koja je navedena kao jedna od SEK ID BR: 2, 4 ili 6, i može se specifično vezivati za gp120 i neutralisati HIV-1.
[0174] U nekim realizacijama otkrić a, antitelo ili antigen vezujući fragment može da sadrži do 10 (kao što su do 1, do 2, do 3, do 4, do 5, do 6, do 6, do 67, do 8 ili do 9) aminokiselinskih supstitucija (kao što su konzervativne aminokiselinske supstitucije) u okvirnom regionu VHantitela ili okvirnom regionu VLantitela u poređenju sa poznatim okvirnim regionom, ili u poređenju sa okvirnim regionima antitela N6, N17 ili F8, i može se specifično vezivati za gp120 i neutralisati HIV-1.
[0175] U nekim realizacijama ovog otkrić a, antitelo ili antigen vezujući fragment može da sadrži do 10 aminokiselinskih supstitucija (kao što su konzervativne aminokiselinske supstitucije) u HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3, u poređenju sa odgovarajuć im nativnim sekvencama CDR jednog od N6, N17 ili F8 antitela (npr. kao što je prikazano u Tabeli 1), i može se specifično vezivati za gp120 i neutralisati HIV-1.
[0176] U nekim realizacijama ovog otkrić a, aminokiselinske sekvence u HCDRl, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3 antitela ili antigen vezujućeg fragmenta mogu, u celini, zajedno da sadrže do 10 aminokiselinskih supstitucija (kao što je do 8, do 6, do 5, do 4, ili do 2 aminokiselinske supstitucije) u poređenju sa odgovarajuć im CDR sekvencama antitela N6 koje sadrže VHi VLnavedene kao SEK ID BR: 1, odnosno 2, i mogu se specifično vezivati za gp120 i neutralisati HIV-1. U nekim takvim rešenjima ovog otkrić a, antitelo ili antigen vezujući fragment može da sadrži ne više od jedne aminokiselinske supstitucije u svakom CDR-u u poređenju sa odgovarajuć im CDR sekvencama antitela N6 koje sadrži VHi VLnavedene kao SEK ID BR: 1 i 2, respektivno, i može se specifično vezivati za gp120 i neutralisati HIV-1. U nekim realizacijama ovog otkrić a, aminokiselinske supstitucije mogu biti konzervativne aminokiselinske supstitucije.
[0177] U nekim realizacijama ovog otkrić a, aminokiselinske sekvence HCDRl, HCDR2, HCDR3, LCDRl, LCDR2 i LCDR3 antitela ili antigen vezujućeg fragmenta mogu, u celini, zajedno da sadrže do 10 aminokiselinskih supstitucija (kao što je do 8, do 6, do 5, do 4, ili do 2 aminokiselinske supstitucije) u poređenju sa odgovarajuć im CDR sekvencama antitela koje sadrže VHi VLnavedene kao SEK ID BR: 114, odnosno 104, i može se specifično vezivati za gp120 i neutralisati HIV-1. U nekim takvim rešenjima ovog otkrić a, antitelo ili antigen vezujući fragment može da sadrži ne više od jedne aminokiselinske supstitucije u svakom CDR-u u poređenju sa odgovarajuć im CDR sekvencama antitela N6 koje sadrže VHi VLnavedene kao SEK ID BR: 114 i 104, respektivno, i može se specifično vezivati za gp120 i neutralisati HIV-1. U nekim realizacijama ovog otkrić a, aminokiselinke supstitucije mogu biti konzervativne aminokiselinke supstitucije.
[0178] U nekim realizacijama ovog otkrić a, aminokiselinske sekvence HCDRl, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3 antitela ili antigen vezujućeg fragmenta mogu, u agregatu, zajedno da sadrže do 10 aminokiselinskih supstitucija (kao što je do 8, do 6, do 5, do 4, ili do 2 aminokiselinske supstitucije) u poređenju sa odgovarajuć im CDR sekvencama antitela koje sadrži VHi VLnavedene kao SEK ID BR: 114, 106, i mogu se specifično vezivati za gp120 i neutralisati HIV-1. U nekim takvim realizacijama ovog otkrić a, antitelo ili antigen vezujući fragment može da sadrži ne više od jedne aminokiselinske supstitucije u svakom CDR-u u poređenju sa odgovarajuć im CDR sekvencama antitela N6 koje sadrži VHi VLnavedene kao SEK ID BR: 114 i 106, respektivno, i može se specifično vezivati za gp120 i neutralisati HIV-1. U nekim realizacijama ovog otkrić a, aminokiselinske supstitucije mogu biti konzervativne aminokiselinske supstitucije.
[0179] U nekim realizacijama ovog otkrić a, aminokiselinske sekvence HCDRl, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3 antitela ili antigen vezujućeg fragmenta mogu, u agregatu, zajedno da sadrže do 10 aminokiselinskih supstitucija (kao što je do 8, do 6, do 5, do 4, ili do 2 aminokiselinske supstitucije) u poređenju sa odgovarajuć im CDR sekvencama antitela koje sadrži VHi VLnavedene kao SEK ID BR: 114, 106, i specifično se mogu vezivati za gp120 i neutralisati HIV-1. U nekim takvim realizacijama otkrić a, antitelo ili antigen vezujući fragment može da sadrži ne više od jedne aminokiselinske supstitucije u svakom CDR-u u poređenju sa odgovarajuć im CDR sekvencama antitela N6 koje sadrži VHi VLkao SEK ID BR: 114 i 108, respektivno, i može se specifično vezivati za gp120 i neutralisati HIV-1. U nekim realizacijama ovog otkrić a amino-kiselinske supstitucije mogu biti konzervativne aminokiselinske supstitucije.
[0180] U nekim realizacijama ovog otkrić a, aminokiselinske sekvence HCDRl, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3 antitela ili antigen vezujućeg fragmenta mogu, u agregatu, zajedno da sadrže do 10 aminokiselinskih supstitucija (kao što su do 8, do 6, do 5, do 4, ili do 2 aminokiselinske supstitucije) u poređenju sa odgovarajuć im CDR sekvencama antitela koje sadrži VHi VLnavedene kao SEK ID BR: 114, 106, i specifično se mogu vezivati za gp120 i neutralisati HIV-1. U nekim takvim rešenjima otkrić a, antitelo ili antigen vezujući fragment može da sadrži ne više od jedne aminokiselinske supstitucije u svakom CDR-u u poređenju sa odgovarajuć im CDR sekvencama N6 antitela koje sadrži VHi VLnavedene kao SEK ID BR: 114 i 110, respektivno, i može se specifično vezivati za gp120 i neutralisati HIV-1. U nekim realizacijama ovog otkrić a, aminokiselinske supstitucije mogu biti konzervativne aminokiselinske supstitucije.
[0181] U određenim realizacijama otkrića, supstitucije, insercije ili delecije se mogu javiti unutar jednog ili više CDR-a sve dok takve promene ne smanje u značajnoj meri sposobnost antitela da vezuje antigen. Na primer, konzervativne supstitucije (npr. konzervativne supstitucije kao što je ovde dato) koje ne smanjuju u suštini afinitet vezivanja se mogu izvršiti u CDR-ima. U određenim aspektima varijante VHi VLkoji su navedene gore, svaki CDR je ili nepromenjen ili sadrži ne više od jedne, dve ili tri aminokiselinske supstitucije.
[0182] Da bi se poveć ao afinitet vezivanja antitela, VLi VHsegmenti mogu biti nasumično mutirani, kao što je unutar HCDR3 regiona ili LCDR3 regiona, u procesu analognom somatskom procesu mutacije in vivo odgovornom za sazrevanje afiniteta antitela tokom prirodnog imunog odgovora. Prema tome, maturacija afiniteta in vitro se može postić i amplifikacijom VHi VLregiona korišćenjem PCR prajmera komplementarnih sa HCDR3 ili LCDR3 respektivno. U ovom procesu, prajmeri su „zašiljeni“ nasumičnom smešom četiri nukleotidne baze na određenim pozicijama tako da rezultujuć i PCR produkti kodiraju VHi VLsegmente u koje su uvedene nasumične mutacije u VHi/ili VLCDR3 regione. Ovi nasumično mutirani VHi VLsegmenti mogu biti testirani da se odredi afinitet vezivanja za gp120. U posebnim primerima, VHaminokiselinska sekvenca je jedna od SEK ID BR: 1, 3 ili 5. U ostalim primerima, VLamino kiselinska sekvenca je jedna od SEK ID BR: 2, 4 ili 6. Metode in vitro maturacije afiniteta su poznate (vidi npr. Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)), i Hoogenboom et al. u Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O’Brien et al., ed., Human Press, Totowa, N.J., (2001).)
[0183] U određenim realizacijama ovog otkrić a, antitelo ili antigen vezujući fragment se menja da bi se pove ć ao ili smanjio stepen do kojeg je antitelo ili antigen vezujući fragment glikozilovan. Adicija ili delecija mesta glikozilacije može biti konvencionalno izvršena menjanjem aminokiselinske sekvence tako da se stvori ili ukloni jedno ili više mesta glikozilacije.
[0184] Kada antitelo sadrži Fc region, ugljeni hidrati vezani za njega mogu biti zamenjeni. Nativna (prirodna) antitela proizvedena od ć elija sisara obično sadrže razgranat, biantenarni oligo saharid koji je generalno N-vezom povezan sa Asn297 iz CH2domena u Fc regionu. Vidi, npr., Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997). Oligosaharid može da sadrži različite ugljene hidrate, npr. manozu, N-acetil glukozamin (GlcNAc), galaktozu i sijalnu kiselinu, kao i fukozu vezanu za GlcNAc u "stablu" biantenarne oligosaharidne strukture. U nekim realizacijama ovog otkrić a mogu biti napravljene modifikacije oligosaharida u antitelu da bi se stvorile varijante antitela sa određenim poboljšanim svojstvima.
[0185] U jednoj realizaciji ovog otkrić a, obezbeđene su varijante antitela koja imaju strukturu ugljenog hidrata kojoj nedostaje fukoza vezana (direktno ili indirektno) za Fc region. Na primer, količina fukoze u takvom antitelu može biti od 1% do 80%, od 1% do 65%, od 5% do 65% ili od 20% do 40%. Količina fukoze se određuje izračunavanjem prosečne količine fukoze u lancu šeć era u Asn297, u odnosu na zbir svih glikostruktura vezanih za Asn 297 (npr. kompleksne, hibridne i manozom bogate strukture) merene MALDI-TOF masenom spektrometrijom, kao što je opisano npr. u WO 2008/077546. Asn297 se odnosi na asparagin reziduu lociranu na poziciji oko 297 u Fc regionu; međutim, Asn297 se takođe može nalaziti oko ±3 aminokiseline uzvodno ili nizvodno od položaja 297, tj. između položaja 294 i 300, zbog manjih varijacija sekvenci u antitelima. Takve varijante fukozilacije mogu poboljšati ADCC funkciju. Vidi, npr., US Patent Publication Br. US 2003/0157108 (Presta, L.); US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Primeri publikacija koje se odnose na „defukozilovane“ ili „fukozno-deficijentne“ varijante antitela uključuju: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004). Primeri ć elijskih linija koje mogu da proizvode defukozilovana antitela uključuju Lec 13 CHO ć elije deficijentne u fukozilaciji proteina (Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); US Pat Appl No US 2003/0157108 A1, Presta, L; i WO 2004/056312 A1, Adams et al., Posebno u Primeru 11), i nokautć elijske linije, kao što su gen alfa-1,6-fukoziltransferaze, FUT8, nokaut CHO ć elije (vidi npr. Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87:614 (2004); Kanda, I. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006) i WO2003/085107).
[0186] Varijante antitela se dalje obezbeđuju bisekcijom oligosaharida, npr., u kojima je biantenarni oligosaharid vezan za Fc region antitela bisekciran sa GlcNAc. Takve varijante antitela mogu imati smanjenu fukozilaciju i/ili poboljšanu ADCC funkciju. Primeri varijanti takvih antitela su opisani, npr., u WO 2003/011878 (Jean-Mairet et al.); U.S. Pat. No. 6,602,684 (Umana et al.); i US 2005/0123546 (Umana et al.). Takođe su obezbeđene varijante antitela sa najmanje jednom reziduom galaktoze u oligosaharidu vezanom za Fc region. Takve varijante antitela mogu da imaju poboljšanu CDC funkciju. Takve varijante antitela su opisane, npr., u WO 1997/30087 (Patel et al.); WO 1998/58964 (Raju, S.); i WO 1999/22764 (Raju, S.).
[0187] U nekoliko realizacija ovog otkrić a, konstantni region antitela uključuje jednu ili više aminokiselinskih supstitucija da se optimizira poluživot antitela in vivo. Serumski poluživot IgG Ab-a regulišu neonatalni Fc receptori (FcRn). Prema tome, u nekoliko realizacija ovog otkrić a, antitelo sadrži aminokiselinsku supstituciju koja pove ć ava vezivanje za FcRn. Stručnjacima je poznato nekoliko takvih supstitucija, kao što su supstitucije u IgG konstantnim regionima T250K i M428L (vidi, npr. Hinton et al., J Immunol., 176:346-356, 2006); M428L i N434S ("LS" mutacija, vidi, npr., Zalevsky, et al., Nature Biotechnology, 28:157-159, 2010); N434A (vidi, npr., Petkova et al., Int. Immunol., 18:1759-1769, 2006); T307A, E380A, i N434A (vidi, npr., Petkova et al., Int. Immunol., 18:1759-1769, 2006); i M252Y, S254T, i T256E (vidi, npr., Dall’Acqua et al., J. Biol. Chem., 281:23514-23524, 2006). Otkrivena antitela i antigen vezujući fragmenti mogu biti vezani sa Fc polipeptidom uključujući bilo koju od gore navedenih supstitucija, npr. Fc polipipeptid može uključivati supstitucije M428L i N434S.
[0188] U nekim realizacijama ovog otkri ć a, konstantni region antitela uključuje jednu od više aminokiselinskih supstitucija za optimizaciju od antitela zavisne ć elijski posredovane citotoksičnosti (ADCC). ADCC je posredovana prvenstveno kroz set usko povezanih Fcγ receptora. U nekim realizacijama ovog otkrić a, antitelo uključuje jednu ili više aminokiselinskih supstitucija koje poveć avaju vezivanje za FcyRIIIa. Prosečnom stručnjaku je poznato nekoliko takvih supstitucija, kao što su supstitucije u IgG konstantnim regionima S239D i I332E (videti npr., Lazar et al., Proc. Natl., Acad. Sci. USA, 103:4005-4010, 2006); i S239D, A330L i I332E (vidi, npr., Lazar et al., Proc. Natl., Acad. Sci. U.S.A., 103:4005-4010, 2006).
[0189] Takođe su uključene kombinacije gornjih supstitucija za generisanje konstantnog regiona IgG sa poveć anim vezivanjem za FcRn i FciRIIIa. Kombinacije poveć avaju poluživot antitela i ADCC. Na primer, takva kombinacija uključuje antitela sa sledeć om aminokiselinskom supstitucijom u Fc regionu: (1) S239D/I332E i T250Q/M428L; (2) S239D/I332E i M428L/N434S; (3) S239D/I332E i N434A; (4) S239D/I332E i T307A/E380A/N434A; (5) S239D/I332E i M252Y/ S254T/T256E; (6) S239D/A330L/I332E i 250Q/M428L; (7) S239D/A330L/I332E i M428L/ N434S; (8) S239D/A330L/I332E i N434A; (9) S239D/A330L/I332E i T307A/ E380A/ N434A; ili (10) S239D/A330L/I332E i M252Y/S254T/T256E. U nekim primerima, antitela, ili njihov antigen vezujući fragment, su modifikovani tako da su direktno citotoksični za inficirane ć elije, ili koriste prirodne odbrane kao što je komplement, ć elijska citotoksičnost zavisna od antitela (ADCC), ili fagocitoza pomoću makrofaga.
[0190] U nekim realizacijama ovog otkrić a, antitelo koje je ovde dato može biti dalje modifikovano tako da sadrži dodatne neproteinske delove koji su poznati u struci i lako su dostupni. Grupe pogodne za derivatizaciju antitela uključuju, ali nisu ograničene na vodo-rastvorne polimere. Neograničavajuć i primeri vodo-rastvornih polimera uključuju, ali nisu ograničeni na polietilen glikol (PEG), kopolimere etilen glikola/propilen glikola, karboksimetilcelulozu, dekstran, polivinil alkohol, polivinil pirolidon, poli-1,3-dioksolan, poli-1,3,6-trioksan, kopolimer etilen/maleinskog anhidrida, poliamino kiseline (ili homopolimeri ili slučajni kopolimeri), i dekstran ili poli(n-vinil pirolidon) polietilen glikol, homopolimere propropilen glikola, kopolimere prolipropilen oksida/ etilen oksida, polioksietilirane poliole (npr. glicerol), polivinil alkohole i njihove smeše. Polietilen glikol propionaldehidid može imati prednost u proizvodnji zbog stabilnosti u vodi. Polimer može biti bilo koje molekulske težine, i može biti razgranat ili nerazgranat. Broj polimera vezanih za antitelo može varirati, a ako je vezano više od jednog polimera, to mogu biti isti ili različiti molekuli. Generalno, broj i/ili vrsta polimera koji se koriste za derivatizaciju mogu biti određeni na osnovu razmatranja koja uključuju, ali nisu ograničena na, posebna svojstva ili funkcije antitela koje treba poboljšati, da li ć e se derivat antitela koristiti u terapiji pod definisanim uslovima itd.
[0191] Antitelo ili antigen vezujući fragment mogu biti derivatizovani ili povezani sa drugim molekulom (kao što je drugi peptid ili protein). Generalno, antitelo ili antigen vezujući fragment se derivatizuje tako da derivatizacija ili obeležavanje ne utiče negativno na vezivanje za gp120. Na primer, antitelo ili antigen vezujući fragment mogu biti funkcionalno povezani (hemijskim povezivanjem, genetskom fuzijom, nekovalentnom asocijacijom ili na neki drugi način) sa jednim ili više drugih molekularnih entiteta, kao što je drugo antitelo (na primer, bi-specifično antitelo ili dijatelo), detektabilni marker, efektorski molekul ili protein ili peptid koji mogu posredovati u povezivanju antitela ili dela antitela sa drugim molekulom (kao što je region streptavidinskog jezgra ili polihistidin tag).
B. Konjugati
[0192] Antitela i fragmenti koji se vezuju za antigen koji se specifično vezuju za epitop na gp120 mogu biti konjugovani sa agensom, kao što je efektorski molekul ili detektabilni marker, koristeć i bilo koji broj sredstava poznatih stručnjacima u ovoj oblasti. Mogu se koristiti i sredstva za kovalentno i nekovalentno vezivanje. Stručnjak u ovoj oblasti ć e razumeti da se mogu koristiti različiti efektorski molekuli i detektabilni markeri, uključujuć i (ali ne ograničavaju ć i se na) toksine i radioaktivne agense kao što su<125>I,<32>P,<14>C,<3>H i<35>S i drugi obeleživači, ciljni delovi molekula i ligandi itd. Izbor određenog efektorskog molekula ili detektabilnog markera zavisi od određenog ciljnog molekula ilić elije i željenog biološkog efekta.
[0193] Izbor određenog efektorskog molekula ili detektabilnog markera zavisi od određenog ciljnog molekula ili ć elije i željenog biološkog efekta. Tako, na primer, efektorski molekul može biti citotoksin koji se koristi da prouzrokuje smrt određene ciljne ć elije (kao što je ć elija zaražena HIV-1). U drugim realizacijama otkri ć a, efektorski molekul može biti citokin, kao što je IL-15; mogu se koristiti konjugati uključujuć i citokin, npr. za lokalnu stimulaciju imunih ć elija.
[0194] Procedura za vezivanje efektorskog molekula ili detektabilnog markera za antitelo ili antigen vezujući fragment varira u zavisnosti od hemijske strukture efektora. Polipeptidi obično sadrže razne funkcionalne grupe; kao što su karboksilna kiselina (COOH), slobodne aminske (-NH2) ili sulfhidrilne (-SH) grupe, koje su dostupne za reakciju sa pogodnom funkcionalnom grupom na polipeptidu da bi se postiglo vezivanje efektorskog molekula ili detektabilnog markera. Alternativno, antitelo ili antigen vezujući fragment se derivatizuje da se izlože ili dodaju reaktivne funkcionalne grupe. Derivatizacija može da uključuje vezivanje bilo kojeg od više poznatih linker molekula, kao što su oni dostupni kod Pierce Chemical Company, Rockford, IL. Linker može biti bilo koji molekul koji se koristi za spajanje antitela ili antigen vezujućeg fragmenta u efektorski molekul ili detektabilni marker. Linker je sposoban da formira kovalentne veze i sa antitelom ili antigen vezujućim fragmentom i sa efektorskim molekulom ili detektabilnim markerom. Pogodni linkeri su dobro poznati stručnjacima u ovoj oblasti i uključuju, ali nisu ograničeni na, ugljenične linkere sa ravnim ili razgranatim lancem, heterociklične ugljenične linkere ili peptidne linkere. Ako su antitelo ili antigen vezujući fragment i efektorski molekul ili detektabilni marker polipeptidi, linkeri se mogu spojiti sa konstituentnim aminokiselinama preko njihovih bočnih grupa (kao što je preko disulfidne veze na cistein) ili na alfa ugljenične amino i karboksilne grupe terminalnih aminokiselina.
[0195] S obzirom na veliki broj metoda koje su prijavljene za vezivanje raznih radiodijagnostičkih jedinjenja, radioterapeutskih jedinjenja, obeleživača (kao što su enzimi ili fluorescentni molekuli), toksina i drugih agensa za antitela, stručnjak će moći da odredi pogodnu metodu za vezivanje datog agensa za antitelo ili antigen vezujući fragment ili za drugi polipeptid. Na primer, antitelo ili antigen vezujući fragment može biti konjugovan sa efektorskim molekulima kao što su lekovi male molekulske težine, kao što su Monometil Auristatin E (MMAE), Monometil Auristatin F (MMAF), majtanzin, derivati majtanzina, uključujuć i derivat majtanzina poznat kao DM1 (takođe poznat kao mertanzin), ili druga sredstva za proizvodnju konjugata leka i antitela (ADC). U nekoliko realizacija ovog otkrić a su dati konjugati antitela ili antigen vezujućeg fragmenta i jednog ili više malih molekula toksina, kao što je kaliheamicin, majtanzinoid, dolastatin, auristatin, trihotecen i CC1065, i derivati ovih toksina koji imaju aktivnost toksina.
[0196] Antitelo ili antigen vezujući fragment mogu biti konjugovani sa detektabilnim markerom; na primer, marker koji se može detektovati pomoć u ELISA testa, spektrofotometrijom, protočnom citometrijom, mikroskopijom ili dijagnostičkim tehnikama snimanja (poput kompjuterizovane tomografije (CT), kompjuterizovane aksijalne tomografije (CAT), magnetno rezonantnog imidžinga (MRI), imidžinga pomoću nuklearne magnetne rezonance (NMRI), magnetno rezonantne tomografije (MTR), ultrazvuka, fiberoptičkog pregleda i laparoskopskog pregleda). Specifični, neograničavajuć i primeri detektabilnih markera uključuju fluorofore, hemiluminiscentne agense, enzimski spojevi, radioaktivne izotope i teške metale ili jedinjenja (na primer super paramagnetni nanokristali gvožđe-oksida za detekciju pomoć u MRI). Na primer, korisni detektabilni markeri uključuju fluorescentna jedinjenja, uključujuć i fluorescein, fluorescein izotiocijanat, rodamin, 5-dimetilamin-1-naftalensulfonil hlorid, fikoeritrin, lantanidne fosfore i slično. Takođe se koriste bioluminescentni markeri, poput luciferaze, Zelenog fluorescentnog proteina (GFP), Žutog fluorescentnog proteina (IFP). Antitelo ili antigen vezujući fragment se takođe mogu konjugovati sa enzimima koji su korisni za detekciju, kao što je peroksidaza hrena, β-galaktosidaza, luciferaza, alkalna fosfataza, glukozna oksidaza i slično. Kada je antitelo ili antigen vezujući fragment konjugovan sa detektabilnim enzimom, to se može otkriti dodavanjem dodatnih reagensa koji enzim koristi za proizvodnju reakcionog produkta koji se može razaznati. Na primer, kada je prisutan agens hren peroksidaza, dodavanje vodonik peroksida i diaminobenzidina dovodi do obojenog produkta reakcije, koji se vizuelno može otkriti. Antitelo ili antigen vezujući fragment takođe se mogu konjugovati sa biotinom i detektovati indirektnim merenjima vezivanja avidina ili streptavidina. Treba napomenuti da sam avidin može biti konjugovan sa enzimom ili fluorescentnim obeleživačem.
[0197] Antitelo ili antigen vezujući fragment mogu biti konjugovani sa paramagnetnim agensom, kao što je gadolinijum. Paramagnetna sredstva poput superparamagnetnog gvožđe-oksida se takođe koriste kao obeleživači. Antitela takođe mogu biti konjugovana sa lantanidima (kao što su europijum i disprozijum) i manganom. Antitelo ili antigen vezujući fragment takođe mogu biti obeleženi unapred određenim epitopima polipeptida prepoznatim od strane sekundarnog reportera (poput parova sekvenci leucinskog patent zatvarača, vezujućih mesta za sekundarna antitela, domena za vezivanje metala, tagova epitopa).
[0198] Antitelo ili antigen vezujući fragment takođe mogu biti konjugovani sa radio-obeleženom aminokiselinom. Radioaktivni obeleživači se mogu koristiti u dijagnostičke i u terapijske svrhe. Na primer, radio-obeleživač se može koristiti za detekciju gp120 i ć elija koje eksprimiraju gp120 pomo ć u x-zraka, emisionog spektra ili drugih dijagnostičkih tehnika. Primeri obeleživača za polipeptide uključuju, ali nisu ograničeni na, slede ć e radioizotope ili radionukleotide:<3>H,<14>C,<15>N,<35>S,<90>J,<99>Tc,<111>In,<125>J,<131>J.
[0199] Sredstva za otkrivanje takvih detektabilnih markera su dobro poznata stručnjacima u ovoj oblasti. Tako, na primer, radio-obeleživači mogu biti detektovani pomoć u fotografskog filma ili scintilacionih brojača, fluorescentni markeri mogu biti detektovani pomoć u fotodektora da se detekctuje emitovana iluminacija. Enzimski obeleživači se obično detektuju snabdevanjem enzima supstratom i detektovanjem produkta reakcije nastalog dejstvom enzima na supstrat, a kolorimetrijski obeleživači se detektuju jednostavnom vizualizacijom obojenog obeleživača.
[0200] Prosečan broj efektorskih molekula ili detektabilnih markerskih grupa po antitelu ili antigen vezujućem fragmentu u konjugatu može da se kreć e, na primer, od 1 do 20 grupa po antitelu ili antigen vezujućem fragmentu. U nekim realizacijama ovog otkrić a, prosečan broj efektorskih molekula ili detektabilnih marker grupa po antitelu ili antigen vezujućem fragmentu u konjugatu su u rasponu od oko 1 do oko 2, od oko 1 do oko 3, od oko 1 do oko 8; od oko 2 do oko 6; od oko 3 do oko 5; ili od oko 3 do oko 4. Optereć enje (npr. efektorski molekul/antitelo) konjugata se može kontrolisati na različite načine, na primer: (i) ograničavanjem molarnog viška efektorskog linker-molekula intermedijera ili linker reagensa u odnosu na antitelo, (ii) ograničavanje vremena ili temperature reakcije konjugacije, (iii) parcijalni ili ograničavajuć i reduktivni uslovi za modifikaciju cistein tiola, (iv) inženjering aminokiselinskih sekvenci antitela rekombinantnim tehnikama tako da se modifikuje broj i položaj cisteinskih ostataka radi kontrole broja ili položaja linker-efektor molekula.
C. Himerni Antigen Receptori (CAR)
[0201] Ovde su takođe otkriveni himerni antigenski receptori (CAR) koji su veštački izgrađeni himerni proteini koji uključuju ekstracelularni antigen vezujući domen (npr. jednolančani varijabilni fragment (scFv)) koji se specifično vezuje za gp120, povezan sa transmembranskim domenom, povezan sa jedan ili više intracelularnih T-ć elijskih signalnih domena. Karakteristike otkrivenih CAR uključuju njihovu sposobnost preusmeravanja specifičnosti i reaktivnosti T-ć elija prema ć elijama koje eksprimiraju gp120 na način koji nije MHC-ograničen. Prepoznavanje gp120 koje nije MHC-ograničeno daje T ć elijama koje eksprimiraju otkriveni CAR sposobnost da prepoznaju antigen nezavisno od prerade antigena.
[0202] Intracelularni T ć elijski signalni domeni mogu da sadrže, na primer, signalni domen T ć elijskog receptora, T ć elijski kostimulatorni signalni domen ili oboje. Signalni domen T ć elijskih receptora se odnosi na deo CAR koji sadrži intracelularni domen T ć elijskog receptora, kao što je intracelularni deo CD3 zeta proteina. Kostimulatorni signalni domen se odnosi na deo CAR koji sadrži intracelularni domen kostimulatornog molekula, koji je molekul površine ć elije različit od antigenskog receptora ili njihovi ligandi koji su potrebni za efikasan odgovor limfocita na antigen.
1. Ekstracelularni Region
[0203] Nekoliko realizacija obezbeđuje CAR koji sadrži antigen vezujući domen koji koji se specifično vezuje za gp120 kao što je ovde opisano (vidi, npr. odeljak II.A). Na primer, antigen vezujući domen može biti scFv koji uključuje VHi VLbilo kojeg od antitela ili njegovih antigen vezujućih fragmenata opisanih u odeljku II.A.
[0204] U nekim realizacijama, antigen vezujući domen može da uključuje VHi VLkoji sadrže HCDRl, HCDR2 i HCDR3, i LCDR1, LCDR2 i LCDR3 od VHi VL, respektivno, jednog od antitela N6, N17, ili F8 (npr. kako je prikazano u Tabeli 1).
[0205] U nekim realizacijama, antigen vezujući domen uključuje VHi VLkoji sadrže aminokiselinske sekvence navedene kao SEK ID BR: 1 i 2, respektivno; SEK ID BR: 3 i 4, respektivno; odnosno SEK ID BR: 5 i 6, respektivno. U nekoliko realizacija, antigen vezujući domen može biti scFv. U nekim realizacijama otkrić a, scFv uključuje VHi VLspojene peptidnim linkerom, kao što je linker koji uključuje aminokiselinsku sekvencu navedenu kao GGGGSGGGGSGGGGS (SEK ID BR: 25).
[0206] CAR može da uključuje sekvencu signalnog peptida, npr. N-terminal za antigen vezujući domen. Sekvenca signalnog peptida može da sadrži bilo koju pogodnu sekvencu signalnog peptida. U jednoj realizaciji, sekvenca signalnog peptida je receptorska sekvenca humanog granulocit-makrofagnog faktora stimulacije kolonija (GM-CSF), kao što je aminokiselinska sekvenca koja uključuje ili se sastoji od LLVTSLLLCELPHPAFLLIPDT SEK ID BR: 26. Iako sekvenca signalnog peptida može da olakša ekspresiju CAR na površini ć elije, prisustvo signalne peptidne sekvence u eksprimiranim CAR nije neophodno da bi CAR mogli da funkcionišu. Nakon ekspresije CAR na površini ć elije, sekvenca signalnog peptida može biti odsečena od CAR. Shodno tome, u nekim rešenjima, CAR nemaju sekvencu signalnih peptida.
[0207] Između antigen vezujućeg domena i transmembranskog domena CAR, može postojati spejser domen, koji uključuje polipeptidnu sekvencu. Domen spejsera može da sadrži do 300 aminokiselina, poželjno 10 do 100 aminokiselina, a najpoželjnije 25 do 50 aminokiselina. U nekim realizacijama ovog otkrić a, spejser domen može da uključuje imunoglobulinski domen, kao što je sekvenca humanog imunoglobulina. U jednoj realizaciji ovog otkri ć a, imunoglobulinski domen sadrži sekvencu (CH2CH3) domena imunoglobulina CH2 i CH3 imunoglobulina G (IgGl). S tim u vezi, domen spejsera može da obuhvata imunoglobulinski domen koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence koja je navedena kao SEK ID BR: 27:
[0208] Bez da se vezujemo za određenu teoriju, veruje se da domen CH2CH3 proširuje antigen vezujući domen CAR-a dalje od membranać elija koje eksprimiraju CAR i može tačnije oponašati veličinu i strukturu domena nativnog TCR.
2. Transmembranski domen
[0209] U odnosu na transmembranski domen, CAR može biti konstruisan tako da sadrži transmembranski domen koji je fuzionisan sa ekstracelularnim CAR domenom. U jednoj realizaciji se koristi transmembranski domen koji je prirodno povezan sa jednim od domena u CAR.
[0210] Transmembranski domen može biti dobijen bilo iz prirodnog ili iz sintetičkog izvora. Kada je izvor prirodni, domen može biti dobijen iz bilo kog membranski-vezanog ili transmembranskog proteina. Primeri transmembranskih domena za upotrebu u otkrivenim CAR mogu da uključuju najmanje transmembranske regione alfa, beta ili zeta lanca T-ć elijskih receptora, CD28, CD3 epsilon, CD45, CD4, CD5, CDS, CD9, CD 16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154. Alternativno, transmembranski domen može biti sintetički, u kom slučaju ć e sadržati pretežno hidrofobne rezidue kao što su leucin i valin. U nekoliko realizacija, triplet fenilalanina, triptofana i valina će se nać i na svakom kraju sintetičkog transmembranskog domena.
[0211] Opciono, kratak oligo- ili poli-peptidni linker, poželjno dužine između 2 i 10 aminokiselina, može formirati vezu između transmembranskog domena i intracelularnog T ć elijskog signalnog domena i/ili T ć elijskog kostimulatornog domena CAR-a. Primer linker sekvence uključuje jedan ili više glicin-serin dubleta.
[0212] U nekim realizacijama, transmembranski domen sadrži transmembranski domen T ć elijskih receptora, kao što je CD8 transmembranski domen. Prema tome, CAR može da sadrži transmembranski domen CD8 koji uključuje ili se sastoji od SEK ID BR: 28: TTTPAPRPPTPAP-TIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC. U drugoj realizaciji transmembranski domen sadrži transmembranski domen Tć elijskog kostimulatornog molekula, kao što je CD137 ili CD28. Prema tome, CAR može da sadrži transmembranski domen CD28 koji uključuje ili se sastoji od SEK ID BR: 29: IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHL-CPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVR
3. Intracelularni region
[0213] Intracelularni region CAR-a uključuje jedan ili više intracelularnih T ć elijs kih signalnih domena odgovornih za aktiviranje bar jedne od normalnih efektorskih funkcija T ć elije u kojoj je CAR eksprimiran ili je u njoj smešten. Ovde su dati primeri T ć elijskih signalnih domena i poznati su prosečnim stručnjacima.
[0214] Iako ceo intracelularni T ć elijski signalni domen može biti upotrebljen u CAR, u mnogim slučajevima nije neophodno koristiti ceo lanac. Taj intracelularni T ć elijski skra ć eni deo signalnog domena može da se koristi umesto intaknog lanca sve dotle dok on prenosi odgovarajuć i signal efektorske funkcije T ć elija.
[0215] Primeri intracelularnih T ć elijskih signalnih domena koji se koriste u CAR uključuju citoplazmatske sekvence T ć elijskog receptora (TCR) i kostimulatorne molekule koji deluju zajedno da iniciraju transdukciju signala nakon zauzimanja receptora od antigena, kao i bilo koji derivat ili varijantu ovih sekvenci i bilo koju sintetičku sekvencu koja ima istu funkcionalnu sposobnost.
[0216] Signalni domeni T ć elijskih receptora regulišu primarnu aktivaciju T- ć elijskog receptorskog kompleksa bilo na stimulativni način, bilo na inhibitorni način. Otkriveni CAR mogu da uključuju primarne citoplazmatske signalne sekvence koje deluju na stimulativan način, koje mogu sadržati signalne motive koji su poznati kao motivi aktiviranja zasnovani na tirozin imunoreceptoru ili ITAMs. Primeri ITAM-a koji sadrže primarne citoplazmatske signalne sekvence koje mogu biti uključene u otkriveni CAR uključuju one iz proteina CD3 zeta, FcR gama, FcR beta, CD3 gama, CD3 delta, CD3 epsilon, CDS, CD22, CD79a, CD79b i CD66d. U nekoliko realizacija, citoplazmatski signalni molekul u CAR uključuje intracelularni T ć elijski signalni domen iz CD3 zeta.
[0217] Intracelularni region CAR-a može da uključuje ITAM koji sadrži primarni citoplazmatski signalni domen (kao što je CD3-zeta) sam ili u kombinaciji sa bilo kojim drugim željenim citoplazmatskim domenima korisnim u kontekstu CAR. Na primer, citoplazmatski domen CAR-a može da sadrži deo CD3 zeta lanca i intracelularni kostimulatorni signalni domen. Kostimulatorni signalni domen se odnosi na deo CAR-a koji sadrži intracelularni domen kostimulatornog molekula. Kostimulatorni molekul je ć elijski površinski molekul različit od antigenskih receptora ili njihovih liganda koji su potrebni za efikasan odgovor limfocita na antigen. Primeri takvih molekula uključuju CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40 (CD134), CD30, CD40, PD-1, ICOS, antigen 1 povezan sa funkcijom limfocita (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C i B7-H3. Dodatni primer signalnog domena koji može biti uključen u otkrivene CAR je signalni domen člana 18 superfamilije receptora faktora nekroze tumora (TNFRSF18; takođe poznat kao glukokortikoidom-indukovani TNFR-srodni protein, GITR).
[0218] U nekim realizacijama, CAR može da uključuje signalni domen CD3 zeta, signalni domen CD8 , signalni domen CD28, signalni domen CD137 ili kombinaciju dva ili više njih. U jednom aspektu, citoplazmatski domen uključuje signalni domen od CD3-zeta i signalni domen od CD28. U drugoj realizaciji, citoplazmatski domen uključuje signalni domen od CD3 zeta i signalni domen od CD137. U još jednom aspektu, citoplazmatski domen uključuje signalni domen od CD3-zeta i signalni domen od CD28 i CD137. Redosled jednog ili više signalnih domena T ć elija na CAR može da varira prema potrebi osobe sa uobičajenim veštinama u ovoj oblasti.
Obezbeđeni su primeri aminokiselinskih sekvenci za takve Tć elijske signalne domene. Na primer, CD3 zeta signalni domen može da obuhvata ili se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene kao SEK ID BR: 30 (RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEM-GGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDAL-HMQALPPR), signalni domen CD8 može da sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene kao SEK ID BR: 31 (FVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAG-GAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNR), signalni domen CD28 može da sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene kao SEK ID BR: 32 (SKRSRLLHSDY-MNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS), signalni domen CD137 može da sadrži ili se sastoji od aminokiselinskih sekvenci navedenih kao SEK ID BR: 33 (KRGRKKLLYIFKQPFMR-PVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL) ili SEK ID BR: 34 (RFSVVKRGRKKLLYIFKQPFMR-PVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL).
[0219] Citoplazmatske signalne sekvence unutar citoplazmatskog signalnog dela CAR iz ovog pronalaska mogu biti povezane međusobno u nasumičnom ili određenom redosledu. Opciono, kratak polipeptidni linker, poželjno dužine između 2 i 10 aminokiselina može da formira vezu. Dublet glicin-serin daje naročito pogodan linker. Zatim, između signalnog domena i transmembranskog domena CAR, može postojati spejser domen, koji uključuje polipeptidnu sekvencu. Spejser domen može da sadrži do 300 aminokiselina, poželjno 10 do 100 aminokiselina, a najpoželjnije 25 do 50 aminokiselina.
4. Dodatni Opis CAR-a
[0220] Takođe su obezbeđeni ovde opisani funkcionalni delovi CAR-a. Kada se koristi u vezi sa CAR izraz "funkcionalni deo" se odnosi na bilo koji deo ili fragment CAR-a, koji deo ili fragment zadržava biološku aktivnost CAR-a čiji je deo (matični CAR). Funkcionalni delovi obuhvataju, na primer, one delove CAR-a koji zadržavaju sposobnost prepoznavanja ciljnih ć elija ili otkrivanja, lečenja ili sprečavanja bolesti, u sličnom obimu, istom obimu ili u ve ć em obimu, kao matični CAR. U vezi matičnog CAR-a, funkcionalni deo može da sadrži, na primer, oko 10%, 25%, 30%, 50%, 68%, 80%, 90%, 95% ili više, matičnog CAR-a.
[0221] CAR ili njegov funkcionalni deo, može da uključuje dodatne aminokiseline na amino ili karboksi kraju ili na oba kraja, koje dodatne aminokiseline nisu pronađene u aminokiselinskoj sekvenci matičnog CAR-a. Poželjno je da dodatne aminokiseline ne ometaju biološku funkciju CAR-a ili funkcionalni deo, npr. da prepoznaju ciljne ć elije, otkriju rak, leče ili sprečavaju rak, itd. Još poželjnije, da dodatne aminokiseline pove ć avaju biološku aktivnost u poređenju sa biološkom aktivnosti matičnog CAR-a.
[0222] Takođe su obezbeđene funkcionalne varijante ovde opisanih CAR-a, koje imaju suštinski ili značajan identitet sekvenci ili sličnost sa matičnim CAR, koja funkcionalna varijanta zadržava biološku aktivnost CAR-a čija je varijanta. Funkcionalne varijante obuhvataju, na primer, ovde opisane varijante CAR-a (matični CAR) koje zadržavaju sposobnost prepoznavanja ciljnih ć elija u sličnom obimu, istom obimu ili u ve ć em obimu kao matični CAR. U odnosu na matični CAR, funkcionalna varijanta može, na primer, biti najmanje oko 30%, oko 50%, oko 75%, oko 80%, oko 85%, oko 90%, oko 91%, oko 92%, oko 93%, oko 94%, oko 95%, oko 96%), oko 97%, oko 98%, oko 99% ili više identična u aminokiselinskoj sekvenci sa matičnim CAR.
[0223] Funkcionalna varijanta može, na primer, da sadrži aminokiselinsku sekvencu matičnog CAR-a sa najmanje jednom konzervativnom aminokiselinskom supstitucijom. Alternativno ili dodatno, funkcionalne varijante mogu da sadrže aminokiselinsku sekvencu matičnog CAR-a sa najmanje jednom aminokiselinskom supstitucijom koja nije konzervativna. U ovom slučaju, poželjno je da konzervativna aminokiselinska supstitucija ne ometa ili ne inhibira biološku aktivnost funkcionalne varijante. Nekonzervativna aminokiselinska supstitucija može pojačati biološku aktivnost funkcionalne varijante, tako da se biološka aktivnost funkcionalne varijante poveć a u poređenju sa matičnim CAR.
[0224] CAR (uključujuć i funkcionalne delove i funkcionalne varijante) mogu biti bilo koje dužine, tj. mogu sadržati bilo koji broj aminokiselina, pod uslovom da CAR (ili njihovi funkcionalni delovi ili funkcionalne varijante) zadrže svoju biološku aktivnost, npr. sposobnost specifičnog vezivanja za antigen, otkrivanje obolelih ć elija kod sisara, lečenje ili sprečavanje bolesti kod sisara, itd. Na primer, CAR može da bude dužine od 50 do oko 5000 aminokiselina, kao što je 50, 70, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 ili više aminokiselina.
[0225] CAR (uključujuć i funkcionalne delove i funkcionalne varijante iz ovog pronalaska) mogu da sadrže sintetičke aminokiseline umesto jedne ili više aminokiselina koje se prirodno javljaju. Takve sintetičke aminokiseline su poznate u struci i uključuju, na primer, aminocikloheksan karboksilnu kiselinu, norleucin, a-amino n-dekanoičnu kiselinu, homoserin, S-acetilaminometil-cistein, trans-3- i trans-4-hidroksiprolin, 4-aminofenilalanin, 4-nitrofenilalanin, 4-hlorofenil-alanin, 4-karboksi-fenilalanin, β-fenilserin β-hidroksifenilalanin, fenilglicin, α-naftilalalanin, cikloheksil-alanin, cikloheksilglicin, indolin-2-karboksilnu kiselinu, 1,2,3,4-tetrahidroizohinolin-3-karboksilnu kiselinu, aminomalonsku kiselinu, monoamid aminomalonske kiseline, N'-benzil-N'-metil-lizin, N', N'-dibenzil-lizin, 6-hidroksilizin, ornitin, α-aminociklopentan karboksilnu kiselinu, α-aminocikloheksan karboksilnu kiselinu, oc-aminocikloheptan karboksilnu kiselinu, -(2-amino-2-norbornan)-karboksilnu kiselinu, γdiamino-buternu kiselinu, α,β-diaminopropionsku kiselinu, homofenilalanin i α-terc-butilglicin.
[0226] CAR (uključujuć i funkcionalne delove i funkcionalne varijante) mogu biti glikozilirani, amidovani, karboksilovani, fosforilisani, esterifikovani, N-acilovani, ciklizovani preko npr. disulfidnog mosta, ili pretvoreni u kisele adicione soli i/ili opciono dimerizovani ili polimerizovani, ili konjugovani.
[0227] Metode generisanja himernih antigenskih receptora, T ć elija koje uključuju takve receptore, i njihova upotreba (npr. za lečenje raka) su poznate u struci i ovde su dalje opisane (videti, na primer, Brentjens et al., 2010, Molecular Therapy, 18:4, 666-668; Morgan et al., 2010, Molecular Therapy, objavljeno na mreži 23. Februara 2010, stranice 1-9; Till et al., 2008, Blood, 1 12:2261 -2271; Park et al., Trends Biotechnol., 29:550-557, 2011; Grupp et al., N Engl J Med., 368:1509-1518, 2013; Han et al., J. Hematol Oncol., 6:47, 2013; PCT Pub. WO2012/079000, WO2013/126726; i U.S. Pub. 2012/0213783.). Na primer, molekul nukleinske kiseline koji kodira otkriveni himerni receptor za vezivanje antigena može biti uključen u ekspresioni vektor (kao što je lentiviralni vektor) za ekspresiju u ć eliji doma ć inu, kao što je T ć elija, da se napravi otkriveni CAR. U nekim realizacijama ovog otkrić a, metode upotrebe himernog antigenskog receptora uključuju izolovanje T ć elija od subjekta, transformisanje T ć elija ekspresionim vektorom (kao što je lentiviralni vektor) koji kodira himerni antigenski receptor i administriranje, genetskim inženjeringom dobijenih T ć elija koje eksprimiraju himerni antigenski receptor, subjektu za lečenje npr. za lečenje tumora kod subjekta.
D. Polinukleotidi i Ekspresija
[0228] Obezbedjeni su molekuli nukleinskih kiselina (na primer, molekuli kDNK) koji kodiraju aminokiselinske sekvence antitela, antigen vezujuće fragmente, CAR i konjugate koji specifično vezuju gp120. Nukleinske kiseline koje kodiraju ove molekule mogu lako da budu proizvedene od strane stručnjaka, pomoću ovde obezbeđenih aminokiselinskih sekvenci (kao što su CDR sekvence i VHi VLsekvence), sekvenci dostupnih u tehnici (kao što su sekvence okvirnih ili konstantnih regiona), i genetskog koda. U nekoliko realizacija, molekuli nukleinske kiseline mogu da kodiraju VH, VL, ili oba i VHi VL(na primer u bicistronskom ekspresionom vektoru) otkrivenog antitela ili antigen vezujućeg fragmenta. U nekoliko realizacija, molekuli nukleinske kiseline mogu biti eksprimirani uć eliji doma ć inu (kao što je ć elija sisara) da se dobije otkriveno antitelo ili antigen vezujući fragment.
[0229] Stručna osoba može lako da upotrebi genetski kod za konstrukciju različitih funkcionalno ekvivalentnih nukleinskih kiselina, poput nukleinskih kiselina koje se razlikuju u sekvenci, ali koje kodiraju istu sekvencu antitela, ili kodiraju konjugovani ili fuzioni protein uključujuć i i VLi/ili VHsekvencu nukleinske kiseline.
[0230] U neograničavajuć em primeru, izolovani molekul nukleinske kiseline kodira VHotkrivenog antitela ili antigen vezujućeg fragmenta i uključuje sekvencu nukleinske kiseline koja je navedena kao bilo koja od SEK ID BR: 36, 38 ili 40. U neograničavajuć em primeru, izolovani molekul nukleinske kiseline kodira VLotkrivenog antitela ili antigen vezujućeg fragmenta i uključuje sekvencu nukleinske kiseline koja je navedena kao bilo koja od SEK ID BR: 37, 39 ili 41. U neograničavajuć em primeru, izolovani molekul nukleinske kiseline kodira VHi VLotkrivenog antitela ili antigen vezujućeg fragmenta i uključuje sekvence nukleinske kiseline navedene kao bilo koja od SEK ID BR: 36 i 37, 38 i 39, respektivno, ili 40 i 41, respektivno. U neograničavajuć em primeru, izolovani molekul nukleinske kiseline kodira VHi VLotkrivenog antitela ili antigen vezujućeg fragmenta i uključuje sekvence nukleinske kiseline navedene kao bilo koja od SEK ID BR: 113 i 105, respektivno 113 i 107 respektivno 113, respektivno 109, respektivno 113, respektivno 111, respektivno 114, i 105, respektivno, 114, respektivno, 107, respektivno, 114, respektivno, 109, respektivno, 114, respektivno, 111, respektivno.
[0231] Sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju antitela, antigen vezujuće fragmente, CAR i konjugate koji specifično vezuju gp120 mogu biti pripremljene bilo kojom pogodnom metodom, uključujuć i, na primer, kloniranje odgovaraju ć ih sekvenci ili pomoću direktne hemijske sinteze pomoću metoda kao što je fosfotriestarska metoda Narang et al., Meth. Enzymol. 68:90-99, 1979; fosfodiestarska metoda Brown et al., Meth. Enzymol. 68:109-151, 1979; dietilfosforamiditna metoda Beaucage et al., Tetra. Lett. 22:1859-1862, 1981; metoda fosforamidit triestra u čvrstoj fazi opisanu od Beaucage & Caruthers, Tetra. Letts.
22(20):1859-1862, 1981, na primer, korišćenjem automatizovanog sintesajzera kao što je opisano u, npr. Needham-VanDevanter et al., Nucl. Acids Res. 12:6159-6168, 1984; i, the solid support method iz U.S. Patent No. 4,458,066. Hemijskom sintezom nastaje jednolančani oligonukleotid. On se može konvertovati u dvolančanu DNK hibridizacijom sa komplementarnom sekvencom ili polimerizacijom sa DNK polimerazom koristeć i jednostruki lanac kao matricu.
[0232] Primeri nukleinskih kiselina mogu biti pripremljeni tehnikama kloniranja. Poznati su primeri odgovarajuć ih tehnika kloniranja i sekvenciranja i uputstva dovoljna da stručne osobe usmeravaju kroz mnoge vežbe kloniranja (vidi, npr., Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th ed, Cold Spring Harbor, New York, 2012) and Ausubel et al. (In Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, kroz dodatak 104, 2013). Informacije o proizvodima od proizvođača bioloških reagenasa i eksperimentalne opreme takođe pružaju korisne informacije. Takvi proizvođači uključuju SIGMA Chemical Company (Saint Louis, MO), R&D Systems (Minneapolis, MN), Pharmacia Amersham (Piscataway, NJ), CLONTECH Laboratories, Inc. (Palo Alto, CA), Chem Genes Corp., Aldrich Chemical Company (Milwaukee, WI), Glen Research, Inc., GIBCO BRL Life Technologies, Inc. (Gaithersburg, MD), Fluka Chemica-Biochemika Analytika (Fluka Chemie AG, Buchs, Switzerland), Invitrogen (Carlsbad, CA), i Applied Biosystems (Foster City, CA), kao i mnoge druge komercijalne izvore poznate stručnjacima.
[0233] Nukleinske kiseline takođe mogu biti pripremljene metodama amplifikacije. Metode amplifikacije uključuju lančanu reakciju polimeraze (PCR), lančanu reakciju ligaze (LCR), sistem amplifikacije na bazi transkripcije (TAS), samoodrživi sistem replikacije sekvenci (3SR). Veliki broj različitih metoda kloniranja, ć elija doma ć ina i in vitro metodologija amplifikacije su dobro poznate stručnjacima.
[0234] U nekim realizacijama, molekul nukleinske kiseline kodira CAR kao što je ovde dato za ekspresiju u T ć eliji da bi se stvorio T ć elijski himerni receptor antigena. Molekul nukleinske kiseline koji kodira himerni antigen vezujući receptor može biti uključen u vektor (kao što je lentiviralni vektor) za ekspresiju u ć eliji doma ć inu, kao što je T ć elija. Primeri ć elija uključuju T ć eliju, prirodnu ć eliju ubicu (NK), citotoksični T limfocit (CTL) i regulatornu T ć eliju. Metode generisanja molekula nukleinske kiseline koji kodiraju himerne receptore antigena i T ć elije, koje uključuju takve receptore su poznate u struci (vidi, npr., Brentjens et al., 2010, Molecular Therapy, 18:4, 666-668; Morgan et al., 2010, Molecular Therapy, objavljeno na mreži 23. Februara 2010, stranice 1-9; Till et al., 2008, Blood, 112:2261-2271; Park et al., Trends Biotechnol., 29:550-557, 2011; Grupp et al., N Engl J Med., 368:1509-1518, 2013; Han et al., J. Hematol Oncol., 6:47, 2013; PCT Pub. WO2012/079000, WO2013/126726; i U.S. Pub.2012/0213783.)
[0235] Molekuli nukleinske kiseline mogu biti eksprimirani u rekombinantno inženjerisanoj ć eliji kao što su ćelije bakterija, biljka, kvasca, insekata i sisara. Antitela, antigen vezujući fragmenti i konjugati mogu biti eksprimirani kao pojedinačni VHi/ili VLlanac (povezan sa efektorskim molekulom ili detektabilnim markerom po potrebi), ili mogu biti eksprimirani kao fuzioni protein. Metode ekspresije i prečišć avanja antitela i antigen vezujućih fragmenata su poznati i opisani su dalje u tekstu (vidi, npr., Al-Rubeai (ed), Antibody Expression and Production, Springer Press, 2011). Imunoadhezin takođe može biti eksprimiran. Prema tome u nekim primerima su obezbeđene nukleinske kiseline koje kodiraju VHi VLi imunoadhezin. Sekvence nukleinske kiselinske opciono mogu da kodiraju lider sekvencu.
[0236] Da bi se napravio scFv, VH- i VL-kodirajuć i DNK fragmenti mogu biti operativno povezani sa drugim fragmentom koji kodira fleksibilni linker, npr., koji kodira aminokiselinsku sekvencu (Gli4-Ser)3, tako da VHi VLsekvence mogu biti eksprimirane kao neprekidni jednolančani protein, sa VLi VHdomenima spojenim fleksibilnim linkerom (vidi, npr., Bird et al., Science 242:423-426, 1988; Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883, 1988; McCafferty et al., Nature 348:552-554, 1990; Kontermann and Dubel (Ed), Antibody Engineering, Vols. 1-2, 2nd Ed., Springer Press, 2010; Harlow i Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 2013,). Opciono, mesto cepanja može da bude uključeno u linker, kao što je mesto cepanja furina.
[0237] Nukleinska kiselina koja kodira VHi/ili VLopciono može da kodira Fc domen (imunoadhezin). Fc domen može biti IgA, IgM ili IgG Fc domen. Fc domen može biti optimizovani Fc domen, kao što je opisano u U.S. Objavljenoj Patentnoj Prijavi Br.
2010/093979. U jednom primeru, imunoadhezin je IgG1Fc.
[0238] Antitelo sa jednim lancem može biti monovalentno, ako se koriste samo pojedinačni VHi VL, bivalentno, ako se koriste dva VHi VL, ili polivalentno, ako se koristi više od dva VHi VL. Mogu se stvoriti bispecifična ili polivalentna antitela koja se specifično vezuju za gp120 i drugi antigen, kao što je, ali ne ograničavajući se na CD3. Kodirani VHi VLopciono mogu uključivati mesto cepanja furina između VHi VLdomena.
[0239] Oni koji poznaju ovu oblast poznaju brojne sisteme ekspresije koji su dostupni za ekspresiju proteina, uključujuć i E. coli, druge bakterijske domać ine, kvasce i razne više- ć elijske eukariote, kao što su COS, CHO, HeLa i mijeloma ć elije.
[0240] Jedna ili više DNK sekvenci koje kodiraju antitela, antigen vezujuće fragmente, CAR ili konjugate mogu biti eksprimirane in vitro pomoću transfera DNK u odgovarajuć u ć eliju doma ć ina. Ć elija može biti prokariotska ili eukariotska. Termin takođe uključuje bilo koje potomke predmetne ć elije doma ć ina. Podrazumeva se da svi potomci možda nisu identični sa roditeljskom ć elijom jer može do ć i do mutacija koje se događaju tokom replikacije. Metode stabilnog transfera, što podrazumeva da se strana DNK kontinuirano održava u doma ć inu, su poznate u struci. Hibridome koje eksprimiraju antitela od interesa su takođe obuhvać ene ovim otkri ć em.
[0241] Ekspresija nukleinskih kiselina koje kodiraju ovde opisanih antitela i antigen vezujućih fragmenata, može biti postignuta operativnim povezivanjem DNK ili kDNK sa promoterom (koji je ili konstitutivan ili inducibilan), a zatim inkorporiranjem u ekspresionu kasetu. Promoter može biti bilo koji promoter od interesa, uključujuć i citomegalovirus promoter i humani T ć elijski promoter limfotrofnog virusa (HTLV)-1. U konstrukt je opciono uključen pojačivač, kao što je citomegalovirus enhancer. Kasete mogu biti pogodne za replikaciju i integraciju bilo u prokariote ili u eukariote. Tipične ekspresione kasete sadrže specifične sekvence korisne za regulaciju ekspresije DNK koja kodira protein. Na primer, ekspresione kasete mogu da sadrže odgovarajuć e promotere, pojačivače, terminatore transkripcije i translacije, inicijacione sekvence, start kodon (tj. ATG) ispred gena koji kodira protein, splajsing signal za introne, sekvence za održavanje ispravnog okvira čitanja tog gena kako bi se omoguć ila pravilna translacija iRNK i zaustavne kodone. Vektor može da kodira selektabilni marker, kao što je marker koji kodira rezistentnost na lek (na primer, rezistentnost na ampicilin ili tetraciklin).
[0242] Da bi se ostvarila visok nivo ekspresije, kloniranog gena, poželjno je da se izrade ekspresione kasete koje sadrže kao minimum snažan promoter za usmeravanje transkripcije, mesto vezivanja ribozoma za inicijaciju translacije (unutrašnje sekvence vezivanja ribozoma) i terminator transkripcije/translacije. Za E. coli, on može da uključuje promoter kao što je T7, trp, lac ili lambda promoter, mesto vezivanja ribozoma i poželjno signal prekida transkripcije. Za eukariotske ć elije, kontrolne sekvence mogu da sadrže promoter i/ili pojačivač izveden iz, npr. imunoglobulinskog gena, HTLV, SV40 ili citomegalovirusa i poliadenilacione sekvence, i mogu dalje da uključuju splajs sekvence donora i/ili akceptora (npr. CMV i/ili HTLV splajs sekvence akceptora i donora). Kasete mogu biti transferisane u izabranu ć eliju doma ć ina dobro poznatim metodama kao što su transformacija ili elektroporacija za E. coli, i tretman kalcijum fosfatom, elektroporacija ili lipofekcija za ć elije sisara. Ć elije transformisane kasetama mogu biti odabrane prema rezistenciji na antibiotike koje nose geni sadržani u kasetama, kao što su amp, gpt, neo i hyg geni.
[0243] Kada je domać in eukariot, mogu biti korišćene metode transfekcije DNK kao što su koprecipitati kalcijum-fosfata, konvencionalne mehaničke procedure kao što su mikroinjekcija, elektroporacija, insercija plazmida smeštenih u lipozome ili virusni vektori. Eukariotske ć elije takođe mogu biti kotransformisane polinukleotidnim sekvencama koje kodiraju antitelo, obeleženo antitelo ili antigen vezujući fragment i drugi strani molekul DNK koji kodira selektabilni fenotip, kao što je gen herpes-simpleks timidin kinaze. Druga metoda je upotreba eukariotskog viralnog vektora, poput simijan virusa 40 (SV40) ili goveđeg papiloma virusa, za tranzijentno infektiranje ili transformisanje eukariotskih ć elija i eksprimiranje proteina (vidi na primer, Viral Expression Vectors, Springer press, Muzyczka ed., 2011). Stručnjak u ovoj oblasti može lako da koristi sisteme ekspresije kao što su plazmidi i vektori koji se koriste za proizvodnju proteina u ć elijama uključuju ć i i ć elije viših eukariota, kao što su COS, CHO, HeLa i mijeloma ć elijske linije.
[0244] U svrhu proizvodnje rekombinantnog CAR, ć elija doma ć in može biti ć elija sisara. Ć elija doma ć in može biti ljudska ć elija. U nekim realizacijama, ć elija doma ć in može biti limfocit periferne krvi (PBL) ili mononuklearna ć elija periferne krvi (PBMC), ili T ć elija. T ć elija može biti bilo koja T ć elija, poput kultivisane T ć elije, npr. primarna T ć elija ili T ć elija iz kultivisane T ć elijske linije, npr. Jurkat, SupTl, itd., Ili T ć elija dobijena od sisara. Ako se dobija od sisara, T ć elija se može dobiti iz mnogih izvora, uključujuć i, ali ne ograničavaju ć i se na krv, koštanu srž, limfni čvor, timus ili druga tkiva ili tečnosti. T ć elije takođe mogu biti obogaćene ili prečišćene. T ć elija može biti ljudska T ć elija. T ć elija može biti T ć elija izolovana od čoveka. T ć elija može biti bilo koja vrstaa T ć elija i može biti bilo koje faze razvoja, uključuju ć i, ali ne ograničavajući se, na CD4<+>/CD8<+>dvostruko pozitivne T ć elije, CD4<+>pomoć ne T ć elije, npr. Th1i Th2ć elije, CD8<+>T ć elije (npr. citotoksične T ć elije), tumor-infiltrirajuće ć elije, memorijske T ć elije, naivne T ć elije i slično. T ć elija može biti CD8<+>Tć elija ili CD4<+>Tć elija.
[0245] Takođe je obezbeđena populacija ć elija koja sadrži najmanje jednu ovde opisanu ć eliju doma ć ina. Populacija ć elija može biti heterogena populacija koja sadrži ć eliju doma ć ina koja sadrži bilo koji od opisanih rekombinantnih ekspresionih vektora, pored najmanje jedne druge ć elije, npr. ćelije doma ć ina (npr. T ć elije), koja ne sadrži nijedan od rekombinantnih ekspresionih vektora ili ć elije koja nije T ć elija, npr. B ć elija, makrofag, neutrofil, eritrocit, hepatocit, endotelna ć elija, epitelna ć elija, miši ć na ć elija, moždana ć elija, itd. Alternativno, populacija ć elija može biti suštinski homogena populacija, u kojoj populacija sadrži uglavnom ć elije doma ć ine (npr. koja se uglavnom sastoji od) koje sadrže rekombinantni ekspresioni vektor. Populacija takođe može biti klonska populacija ć elija, u kojoj su sve ć elije populacije klonovi jedne ć elije doma ć ina koja sadrži rekombinantni ekspresioni vektor, tako da sve ć elije populacije sadrže rekombinantni ekspresioni vektor. U jednoj realizaciji ovog pronalaska, populacija ć elija je klonalna populacija koja sadrži ć elije doma ć ina koje sadrže rekombinantni ekspresioni vektor kako je ovde opisano
[0246] Moguć e su modifikacije nukleinske kiseline koja kodira ovde opisani polipeptid bez umanjivanja njegove biološke aktivnosti. Neke modifikacije se mogu načiniti kako bi se olakšalo kloniranje, ekspresija ili inkorporacija ciljanog molekula u fuzioni protein. Takve modifikacije su dobro poznate stručnjacima u ovoj oblasti i uključuju, na primer, terminacione kodone, metionin koji je dodat na amino kraju da bi se obezbedilo mesto inicijacije, dodatne aminokiseline postavljene na bilo koji kraj da bi se napravila prikladno smeštena mesta restrikcije, ili dodatne aminokiseline (poput poli His) kao pomoć u koracima prečišć avanja. Pored rekombinantnih metoda, imunokonjugati, efektorske grupe i antitela iz ovog otkri ć a takođe mogu biti konstruisana u celini ili delom korišćenjem standardne sinteze peptida dobro poznate u struci.
[0247] Kada su eksprimirani, antitela, antigen vezujući fragmenti i konjugati mogu biti prečišćeni prema standardnim procedurama, uključujuć i taloženje amonijum sulfata, afinitetne kolone, kolonsku hromatografiju i slično (videti, generalno, Simpson ed., Basic methods in Protein Purification and Analysis: A laboratory Manual, Cold Harbor Press, 2008). Antitela, antigen vezujući fragmenti i konjugati ne moraju biti 100% čisti. Kada su prečišć eni, delimično ili do željene homogenosti, ako su za terapeutsku upotrebu, polipeptidi bi trebali da budu suštinski bez endotoksina.
[0248] Metode za ekspresiju antitela, antigen vezujućih fragmenata i konjugata i/ili ponovno sasvijanje u odgovarajuć i aktivni oblik, iz ć elija sisara i bakterija kao što je E. coli, opisani su i dobro poznati i primenljivi na ovde otkrivena antitela. Pogledajte, npr. Harlow i Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 2013, Simpson ed., Basic methods in Protein Purification and Analysis: A laboratory Manual, Cold Harbor Press, 2008, and Ward et al., Nature 341:544, 1989.
[0249] Pored rekombinantnih metoda, antitela, fragmenti koji vezuju antigen i/ili konjugati takođe mogu biti konstruisani u celini ili delimično pomoću standardne sinteze peptida. Sinteza polipeptida u čvrstoj fazi se može postić i dodavanjem C-terminalne aminokiseline iz sekvence na nesolubilni nosač nakon čega sledi sekvencijalno dodavanje preostalih aminokiselina sekvence. Tehnike sinteze u čvrstoj fazi su opisane u Barani & Merrifield, The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology. Vol. 2: Special Methods in Peptide Synthesis, Part A. pp. 3-284; Merrifield et al., J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2156, 1963, and Stewart et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed., Pierce Chem. Co., Rockford, Ill., 1984. Proteini već e dužine se mogu sintetizovati kondenzacijom amino i karboksilnih terminusa krać ih fragmenata. Metode formiranja peptidnih veza aktivacijom karboksilnog terminalnog kraja (kao što je upotreba reagensa za vezivanje -N,N'-diciklo-heksil-karbodimida) su dobro poznate u stanju tehnike.
E. Metode i Kompozicije
1. Terapeutske metode
[0250] Predmetni pronalazak obezbeđuje terapeutski efikasnu količinu antitela, antigen vezujućeg fragmenta, molekule nukleinske kiseline, ekspresionog vektora, ć elije doma ć ina ili otkrivene farmaceutske kompozicije za upotrebu u postupku prevencije ili lečenja HIV-1 infekcije kod subjekta, koji obuhvata administriranje subjektu terapeutski efikasne količine antitela, antigen vezujućeg fragmenta, molekula nukleinske kiseline, ekspresionih vektora, ć elije doma ć ina ili farmaceutske kompozicije, čime se sprečava ili leči HIV-1 infekcija.
[0251] Ovde su otkrivene metode za prevenciju ili lečenje HIV-1 infekcije. Prevencija može da uključuje inhibiciju infekcije HIV-1. Postupci uključuju kontaktiranje ć elije sa terapeutski efikasnom količinom otkrivenog antitela, antigen vezujućeg fragmenta, konjugata, CAR ili T ć elije koja eksprimira CAR koji specifično vezuje gp120, ili nukleinskom kiselinom koja kodira takvo antitelo, antigen vezujući fragment, konjugat ili CAR. Metoda takođe može da uključuje davanje subjektu terapeutski efikasne količine otkrivenog antitela, antigen vezujućeg fragmenta, konjugata, CAR ili T ć elije koja eksprimira CAR koji specifično vezuje gp120, ili davanje subjektu nukleinske kiseline koja kodira takvo antitelo, antigen vezujući fragment, konjugat ili CAR-a. U nekim primerima, antitelo, antigen vezujući fragment, konjugat, CAR, T ć elija koja eksprimira CAR ili molekul nukleinske kiseline mogu biti korišćeni pre izloženosti (na primer, za prevenciju ili inhibiranje infekcije HIV-1). U nekim primerima, antitelo, antigen vezujući fragment, konjugat, CAR, T ć elija koja eksprimira CAR ili molekul nukleinske kiseline mogu biti korišćeni u profilaksi nakon izloženosti. U nekim primerima, antitelo, antigen vezujući fragment, konjugat ili molekul nukleinske kiseline mogu biti korišćeni za eliminaciju ili smanjenje rezervoara virusa HIV-1 kod subjekta. Na primer, terapeutski efikasna količina antitela, antigen vezujućeg fragmenta, konjugata, CAR, T ć elija koja eksprimira CAR ili molekula nukleinske kiseline se može administirati subjektu sa HIV-1, kao što je subjekt koji se leči antivirusnom terapijom. U nekim primerima, antitelo, antigen vezujući fragment, konjugat ili molekul nukleinske kiseline se modifikuje tako da je direktno citotoksičan za inficirane ć elije (npr. konjugacijom sa toksinom), ili koristi prirodne odbrane, kao što je komplement, ć elijska od antitelazavisna citotoksičnost (ADCC), ili fagocitoza pomoću makrofaga.
[0252] HIV-1 infekcija ne mora biti potpuno eliminisana da bi metoda bila efikasna. Na primer, metoda može smanjiti infekciju HIV-1 za željeni iznos, na primer najmanje 10%, najmanje 20%, najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, na najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili čak najmanje 100% (eliminacija detektabilnih ć elija inficiranih sa HIV-1) u poređenju sa HIV-1 infekcijom u odsustvu lečenja. U nekim realizacijama ovog otkrić a, ć elija se takođe kontaktira sa terapeutski efikasnom količinom dodatnog agensa, kao što je antiviralni agens. Ć elija može biti in vivo ili in vitro. Metode mogu uključivati davanje jednog ili više dodatnih agensa poznatih u stanju tehnike. U dodatnim realizacijama otkrića, replikacija HIV-1 se može smanjiti ili inhibirati sličnim postupcima. Replikacija HIV-1 ne mora biti potpuno eliminisana da bi metoda bila efikasna. Na primer, metoda može smanjiti replikaciju HIV-1 u željenom iznosu, na primer najmanje 10%, najmanje 20%, najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, na najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98%, ili čak najmanje 100% (eliminacija detektabilnog HIV-1), u poređenju sa replikacijom HIV-1 u odsustvu tretmana.
[0253] U jednoj realizaciji ovog otkrić a, primena otkrivenog antitela, antigen vezujućeg fragmenta, konjugata, CAR, T ć elije koja eksprimira CAR ili molekula nukleinske kiseline dovodi do smanjenja u uspostavljanju HIV-1 infekcije i/ili smanjenja kasnijeg napredovanja bolesti HIV-1 kod subjekta. Smanjenje uspostavljanja HIV-1 infekcije i/ili smanjenje kasnijeg napredovanja HIV-1 obuhvata bilo koje statistički značajno smanjenje aktivnosti HIV-1. U nekim realizacijama, antitela i antigen vezujući fragmenti za upotrebu u metodama lečenja subjekta sa HIV-1 infekcijom su otkriveni. Ovi postupci uključuju administriranje subjektu terapeutski efikasne količine otkrivenog antitela, antigen vezujućeg fragmenta, konjugata, CAR, T ć elije koja eksprimira CAR ili molekul nukleinske kiseline, čime se sprečava ili leči HIV-1 infekcija.
[0254] Studije su pokazale da se stopa transmisije HIV-1 sa majke na novorođenče znatno smanjuje kada se zidovudin administrira ženama zaraženim HIV-om tokom trudnoć e i porođaja, a potomcima nakon rođenja (Connor et al., 1994, Pediatr InfectDisJ 14:536-541). Nekoliko studija transmisije virusa HIV-1 sa majke na novorođenče je pokazalo korelaciju između virusnog optereć enja majke pri porođaju i rizika od prenosa HIV-a na dete. Ovo otkri ć e obezbeđuje antitela, antigen vezujuće fragmente, konjugate, CAR, Tć eliju koja eksprimira CAR i molekul nukleinske kiseline koji se koriste u smanjenju prenosa HIV-a sa majke na novorođenče. Tako se u nekim primerima terapeutski efikasna količina antitela specifičnog za gp120 ili njegov antigen vezujući fragment ili nukleinska kiselina koja kodira takva antitela ili fragmenti koji se vežu za antitelo antitela daje u cilju sprečavanja transmisije HIV-1 ili smanjenja rizika od transmisije virusa HIV-1 sa majke na novorođenče. U nekim primerima, terapeutski efikasna količina antitela ili antigen vezujućeg fragmenta ili nukleinske kiseline koja kodira takva antitela ili antigen vezujući fragment, administrira se majci i/ili detetu pri porođaju. U drugim primerima, terapeutski efikasna količina antitela, antigen vezujućeg fragmenta ili nukleinske kiseline koja kodira antitelo ili antigen vezujući fragment se administrira majci i/ili detetu pre dojenja da bi se sprečila transmisija virusa na novorođenče ili smanjio rizik od transmisije virusa na novorođenče. U nekim rešenjima, i terapeutski efikasna količina antitela, antigen vezujućeg fragmenta ili nukleinske kiseline koja kodira antitelo ili antigen vezujući fragment i terapeutski efikasna količina drugog sredstva, poput zidovudina, se administrira majci i/ili detetu.
[0255] Za bilo koju primenu, antitelo, antigen vezujući fragment, konjugat, CAR, T ć elija koja eksprimira CAR ili molekul nukleinske kiseline se mogu kombinovati sa anti-retrovirusnom terapijom. Antiretrovirusni lekovi se generalno klasifikuju prema fazi životnog ciklusa retrovirusa koji lek inhibira. Otkrivena antitela mogu biti administrirana zajedno sa analozima inhibitora nukleozidne reverzne transkriptaze (kao što su zidovudin, didanozin, zalcitabin, stavudin, lamivudin, abakavir, emtricitabin, entekavir i apricitabin), inhibitorima nukleozidne reverzne transkriptaze (kao što je tenofovir i adefovir), inhibitori nenukleozidne reverzne transkriptaze (kao što su efavirenc, nevirapin, delavirdin, etravirin i rilpivirin), inhibitori proteaze (kao što su sakvinavir, ritonavir, indinavir, nelfinavir, amprenavir, lopinavir, fosamprenavir, atazanavir, tipranavir i darunavir), inhibitori ulaska ili fuzije (kao što su maravirok i enfuvirtid), inhibitori maturacije (kao što su bevirimat i vivekon), ili inhibitori širokog spektra, kao što su prirodni antivirali. U nekim primerima, otkriveno antitelo ili njegov aktivni fragment ili nukleinske kiseline koje ga kodiraju, administriraju se u kombinaciji sa IL-15, ili konjuguju sa IL-15.
[0256] Studije su pokazale da kokteli HIV-1 neutrališućih antitela koji ciljaju različite epitope na gp120 mogu lečiti makakije hronično zaražene sa SHIV (Shingai et al., Nature, 503, 277-280, 2013; i Barouch et al., Nature, 503, 224-228, 2013). Shodno tome, u nekim primerima subjektu se administrira jedno ili više dodatnih antitela koja vezuju HIV-1 Env (npr. koja se vezuju za gp120 ili gp41) i koja mogu da neutrališu HIV-1. Dodatna antitela mogu biti administrirana pre, tokom ili posle primene novih antitela koja su ovde otkrivena (npr., antitela N6, N17, ili F8). U nekim realizacijama otkrić a, dodatno antitelo može biti antitelo koje se specifično vezuje za epitop na HIV-1 Env, kao što je CD4 mesto vezivanja (npr., antitelo B12, 3BNC117, VRC01 ili VRC07), membranski-proksimalni spoljni region (npr. antitelo 10E8), V1/V2 domen (npr. PG9 antitelo, CAP256-VRC26) ili V3 petlja (npr. 10-1074, PGT 121 ili PGT128 antitelo) ili ona koja vezuju i gp120 i gp41 subjedinice (npr. 35022, PGT151 ili 8ANC195). Antitela koja se specifično vezuju za ove regione i neutrališu HIV-1 infekciju su poznata prosečnim stručnjacima. Neograničavajuć i primeri se mogu na ć i na primer u PCT Pub. No. WO 2011/038290, WO/2013/086533, WO/ 2013/090644, WO/2012/158948.
[0257] U nekim primerima, subjektu se administrira DNK koja kodira antitelo ili njegove antigen vezujuće fragmente, da se obezbedi in vivo proizvodnja antitela, na primer korišć enjem ć elijske mašinerije subjekta. Imunizacija konstruktima nukleinskih kiselina je dobro poznata u struci i naučena je, na primer, u U.S. Patent No. 5,643,578, i U.S. Patent No. 5,593,972 i U.S. Patent No. 5,817,637. U.S. Patent No. 5,880,103 opisuje nekoliko postupaka isporuke kodirajućih nukleinskih kiselina u organizam. Jedan pristup dministraciji nukleinskih kiselina je direktna administracija sa plazmidnom DNK, kao što je sa ekspresionim plazmidom sisara. Nukleotidna sekvenca koja kodira otkriveno antitelo ili njegovi antigen vezujući fragmenti se mogu staviti pod kontrolu promotera da se poveć a ekspresija. Metode uključuju lipozomalnu isporuku nukleinskih kiselina. Takvi postupci mogu da se primenjuju u proizvodnji antitela ili njegovih antigen vezujućih fragmenata, od strane prosečnog stručnjaka. U nekim realizacijama ovog otkrić a, otkriveno antitelo ili antigen vezujući fragment se eksprimira u subjektu korišćenjem vektora pVRC8400 (opisano u Barouch et al., J. Virol, 79, 8828-8834, 2005).
[0258] Molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju otkrivena antitela (kao što je N6 antitelo) ili antigen vezujuće fragmente mogu biti uključeni u virusni vektor, na primer za ekspresiju antitela ili antigen vezujućeg fragmenta u ć eliji doma ć inu ili subjektu (kao što je subjekt sa ili u riziku od infekcije HIV-1). Konstruisan je veliki broj virusnih vektora koji se mogu koristiti za ekspresiju otkrivenih antitela ili antigen vezujućih fragmenata, kao što su retrovirusni vektor, adenovirusni vektor ili adenoasocirani virusni vektor (AAV). U nekoliko primera, virusni vektor može biti kompetentan za replikaciju. Na primer, virusni vektor može imati mutaciju u virusnom genomu koja ne inhibira replikaciju virusa u ć elijama doma ć ina. Virusni vektor takođe može biti uslovno kompetentan za replikaciju. U drugim primerima, virusni vektor je deficijentan za replikaciju u ć elijama domać ina.
[0259] U nekoliko realizacija, subjektu (kao što je čovek sa ili u riziku od infekcije HIV-1) može se administrirati terapeutski efikasna količina viralnog vektora adeno-asociranog virusa (AAV) koja uključuje jedan ili više molekula nukleinske kiseline koji kodiraju otkriveno antitelo ili antigen vezujući fragment (kao što je antitelo N6). AAV virusni vektor se dizajnira za ekspresiju molekula nukleinske kiseline koji kodira otkriveno antitelo ili antigen vezujući fragment, i administriranje terapeutski efikasne količine AAV virusnog vektora subjektu dovodi do ekspresije terapeutski efikasne količine antitela ili antigen vezujućeg fragmenta u subjektu. Neograničavajuć i primeri AAV virusnih vektora koji se mogu koristiti za ekspresiju otkrivenog antitela ili antigen vezujućeg fragmenta u subjektu uključuju one date u Johnson et al. ("Vector-mediated gene transfer engenders longlived neutralizing activity and protection against SIV infection in monkeys," Nat. Med., 15(8):901-906, 2009) i Gardner et al. ("AAV-expressed eCD4-Ig provides durable protection from multiple SHIV challenges," Nature, 519(7541): 87-91, 2015).
[0260] U jednom aspektu, nukleinska kiselina koja kodira otkriveno antitelo ili njegove antigen vezujuće fragmente se uvodi direktno u ć elije. Na primer, nukleinska kiselina se može naneti na zlatne mikrosfere standardnim metodama i uneti u kožu pomoć u uređaja kao što je Bio-Rad’s HELIOS<TM>Genski pištolj. Nukleinske kiseline mogu biti „gole“, koje se sastoje od plazmida pod kontrolom snažnog promotera.
[0261] DNK se obično ubrizgava u mišić , mada se takođe može ubrizgati direktno na druga mesta. Doze za injekciju su obično oko 0.5 µg/kg do oko 50 µg/kg, a obično su oko 0.005 µg/kg do oko 5 µg/kg (vidi, npr., U.S. Patent No.5,589,466).
2. Doze
[0262] Terapeutski efikasna količina gp120 specifičnog antitela, antigen vezujućeg fragmenta, konjugata, CAR, T ć elije koja eksprimira CAR ili molekula nukleinske kiseline koji kodira takve molekule zavisi od težine bolesti i/ili infekcije i opšteg stanja zdravlja pacijenta. Terapeutski efikasna količina je ona koja obezbeđuje ili subjektivno ublažavanje simptoma (i) ili objektivno prepoznatljivo poboljšanje koje primećuje lekar ili drugi kvalifikovani posmatrač. Antitelo specifično za gp120, antigen vezujući fragment, konjugat, CAR, T ć elija koja eksprimira CAR ili molekul nukleinske kiseline koji kodira takve molekule se može primeniti zajedno sa drugim terapeutskim agensom, istovremeno ili sekvencijalno.
[0263] Pojedinačne ili višestruke administracije kompozicije koja uključuje otkriveno gp120-specifično antitelo, antigen vezujući fragment, konjugat, CAR, Tć eliju koja eksprimira CAR ili molekul nukleinske kiseline koji kodira takve molekule, može se administrirati u zavisnosti od doziranja i frekventnosti koje pacijent zahteva i toleriše. Kompozicije koje uključuju gp120-specifično antitelo, antigen vezujući fragment, konjugat, CAR, Tć eliju koja eksprimira CAR ili molekul nukleinske kiseline koji kodira takve molekule, treba da obezbede dovoljnu količinu najmanje jednog od antitela specifičnog za gp120, antigen vezujućeg fragmenta, konjugata, CAR, Tć elije koja eksprimira CAR ili molekula nukleinske kiseline koja kodira takve molekule za efikasno lečenje pacijenta. Doza se može administrirati jednom, ali se može primenjivati periodično dok se ne postigne bilo koji terapijski rezultat ili dok neželjeni efekti ne nalože prekid terapije. U jednom primeru, doza antitela ili antigen vezujućeg fragmenta se daje infuzijom trideset minuta svakog drugog dana. U ovom primeru se može primeniti od jedne do oko deset doza, kao što su tri ili šest doza koje se mogu administrirati svaki drugi dan. U sledeć em primeru, kontinuirana infuzija se daje otprilike pet do oko deset dana. Subjekt se može tretirati u redovnim intervalima, kao što su mesečni, sve dok se ne postigne željeni terapeutski rezultat. Generalno, doza je dovoljna za lečenje ili ublažavanje simptoma ili znakova bolesti bez stvaranja neprihvatljive toksičnosti za pacijenta.
[0264] Podaci dobijeni iz testova ć elijske kulture i studija na životinjama se mogu koristiti za formulisanje raspona doza za upotrebu kod ljudi. Doziranje obično leži u rasponu cirkulišućih koncentracija koje uključuju ED50, sa malom ili minimalnom toksičnošć u. Doziranje može da varira u ovom opsegu u zavisnosti od korišćenog doznog oblika i načina administracije. Terapeutski efikasna doza može da se odredi testovimać elijske kulture i studijama na životinjama.
[0265] U nekim realizacijama, antitelo ili antigen vezujući fragment koji specifično vezuje gp120, ili njegov konjugat, ili molekul nukleinske kiseline ili vektor koji kodira takav molekul, ili kompozicija koja uključuje takve molekule, daje se u dozi u rasponu od oko 5 ili 10 nmol/kg do oko 300 nmol/kg, ili od oko 20 nmol/kg do oko 200 nmol/kg, ili u dozi od oko 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 , 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 125, 130, 140, 150, 160, 170, 175, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 350, 400, 450, 500, 750, 1000, 1250, 1500, 1750 ili 2000 nmol/kg, ili u dozi od oko 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 ili 1000 µg/kg, odnosno oko 1.25, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5 ili 10 mg/kg, ili druga doza koju lekar smatra odgovarajuć om. U nekim realizacijama, antitelo ili antigen vezujući fragment mogu biti administrirani subjektu u dozi od oko 0.5 do oko 40 mg/kg, kao što je oko 1 do oko 30, oko 1 do oko 20, oko 1 do oko 15, oko 1 do oko 10, oko 1 do oko 5, oko 1 do oko 3, oko 0.5 do oko 40 mg/kg, kao što je oko 0.5 do oko 30, oko 0.5 do oko 20, oko 0.5 do oko 15, oko 0.5 do oko 10, oko 0.5 do oko 5, oko 0.5 do oko 3, oko 3 do oko 7, oko 8 do oko 12, oko 15 do oko 25, oko 18 do oko 22, oko 28 do oko 32, oko 10 do oko 20, oko 5 do oko 15, ili oko 20 do oko 40 mg/kg. Ovde opisane doze mogu biti administrirane u skladu sa ovde opisanom dozom/učestalošć u administracije, uključuju ć i ali bez ograničenja dnevno, 2 ili 3 puta nedeljno, nedeljno, svake 2 nedelje, svake 3 nedelje, mesečno, svaki drugi mesec, itd.
[0266] U nekim realizacijama, otkriveno terapeutsko sredstvo se može primenjivati intravenski, subkutano ili na drugi način, dnevno ili više puta nedeljno tokom nekog perioda vremena, nakon čega sledi period bez lečenja, a zatim se ciklus ponavlja. U nekim realizacijama, početni period lečenja (npr. administracija terapeutskog agensa dnevno ili više puta nedeljno) je 3 dana, 1 nedelja, 2 nedelje, 3 nedelje, 4 nedelje, 5 nedelja, 6 nedelja, 7 nedelja, 8 nedelja, 9 nedelja, 10 nedelja, 11 nedelja ili 12 nedelja. U sličnoj realizaciji, period bez lečenja traje 3 dana, 1 nedelju, 2 nedelje, 3 nedelje ili 4 nedelje. U nekim realizacijama, režim doziranja terapeutskog sredstva je svakodnevno tokom 3 dana, a zatim slede 3 dana prekida; ili dnevno ili više puta nedeljno tokom 1 nedelje, a zatim slede 3 dana ili jedna nedelja prekida; ili dnevno ili više puta nedeljno u trajanju od 2 nedelje, a zatim 1 ili 2 nedelje prekida; ili svakodnevno ili više puta nedeljno u trajanju od 3 nedelje, a zatim 1, 2 ili 3 nedelje prekida; ili svakodnevno ili više puta nedeljno tokom 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ili 12 nedelja, a zatim 1, 2, 3 ili 4 nedelje prekida.
3. Načini Administracije
[0267] Antitelo specifično za gp120, antigen vezujući fragment, konjugat, CAR, T ć elija koja eksprimira CAR, ili molekul nukleinske kiseline koji kodira takve molekule, ili kompozicija koja uključuje takve molekule, kao i dodatna sredstva, mogu biti administrirani subjektima na razne načine, uključujuć i lokalnu i sistemsku primenu, kao što je, npr. injekcijom supkutano, intravenski, intraarterijalno, intraperitonealno, intramuskularno, intradermalno ili intratekalno. U jednoj realizaciji, terapeutsko sredstvo se daje jednom subkutanom, intravenskom, intraarterijskom, intraperitonealnom, intramuskularnom, intradermalnom ili intratekalnom injekcijom jednom dnevno. Terapeutski agens takođe može biti administriran direktnom injekcijom na ili blizu mesta bolesti.
[0268] Antitelo specifično za gp120, antigen vezujući fragment, konjugat ili molekul nukleinske kiseline koji kodira takve molekule ili kompozicija koja uključuje takve molekule takođe mogu biti administrirani oralno u obliku mikrosfera, mikrokapsula, lipozoma (nenaelektrisani ili naelektrisani (npr. katjonski)), polimerne mikročestice (npr. poliamidi, polilaktid, poliglikolid, poli(laktid-glikolid)), mikroemulzije i slično.
[0269] Drugi metod administracije je pomoću osmotske pumpe (npr. Alzet pumpa) ili mini pumpom (npr. Alzet miniosmotska pumpa) koja omoguć ava kontrolisano, kontinuirano i/ili sa sporim oslobađanjem terapeutskog sredstva ili farmaceutske kompozicije tokom unapred određenog perioda. Osmotska pumpa ili mini pumpa mogu biti implantirani subkutano, ili u blizini ciljanog mesta.
[0270] Stručnjaku ć e biti očigledno da gpl20-specifično antitelo, antigen vezujući fragment, konjugat ili molekul nukleinske kiseline koji kodira takve molekule ili kompozicija koja uključuje takve molekule takođe mogu biti administrirani na druge načine. Određivanje najefikasnijeg načina administracije je u okviru veštine stručnjaka. Antitelo specifično za gp120, antigen vezujući fragment, konjugat ili molekul nukleinske kiseline koji kodira takve molekule ili kompozicija koja uključuje takve molekule može biti administrirana u obliku farmaceutskih formulacija pogodnih za npr. oralnu (uključujuć i bukalnu i sublingvalnu), rektalnu, nazalnu, lokalnu, pulmonalnu, vaginalnu ili parenteralnu (uključujuć i intramuskularnu, intraarterijsku, intratekalnu, subkutanu i intravensku) administraciju, ili u obliku pogodnom za administraciju inhalacijom ili insuflacijom. U zavisnosti od predviđenog načina administracije, farmaceutske formulacije mogu biti u obliku čvrstih, polučvrstih ili tečnih doznih oblika, kao što su tablete, čepić i, tablete, kapsule, praškovi, tečnosti, suspenzije, emulzije, kreme, masti, losioni, i slično. Formulacije mogu biti obezbeđene u jediničnom doznom obliku pogodnom za jednokratnu primenu precizne doze. Formulacije sadrže efikasnu količinu terapeutskog sredstva i jedan ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijenata, nosača i/ili diluenata, i opciono jedan ili više drugih biološki aktivnih agensa.
4. Kompozicije
[0271] Omoguć eni su preparati koji uključuju jedno ili više gp120-specifičnih antitela, antigen vezujući fragment, konjugat, CAR, T ć eliju koja eksprimira CAR ili molekul nukleinske kiseline koji kodira takve molekule, koji su ovde otkriveni u nosaču. Kompozicije su korisne, na primer, na primer za lečenje ili detekciju HIV-1 infekcije. Kompozicije mogu biti pripremljene u jediničnim doznim oblicima za administraciju subjektu. Količinu i vreme administracije određuje ordinirajući lekar za postizanje željene svrhe. Antitelo specifično za gp120, antigen vezujući fragment, konjugat, CAR, Tć elija koja eksprimira CAR ili molekul nukleinske kiseline koji kodira takve molekule može biti formulisan za sistemsku ili lokalnu administraciju. U jednom primeru, antitelo specifično za gp120, antigen vezujući fragment, konjugat, CAR, T ć elija koja eksprimira CAR, ili molekul nukleinske kiseline koji kodira takve molekule, formulisan je za parenteralnu administraciju, kao što je intravenska administracija.
[0272] U nekim realizacijama otkrić a, kompozicije sadrže antitelo, antigen vezujući fragment ili njegov konjugat čistoće najmanje 70% (kao što je najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98% ili najmanje 99%. U nekim realizacijama otkrića, kompozicije sadrže manje od 10% (kao što je manje od 5%, manje od 4%, manje od 3%, manje od 2%, manje od 1%, manje od 0.5%, ili manje) makromolekulskih kontaminanata, kao što su drugi sisarski (npr. humani) proteini.
[0273] Kompozicije za administraciju mogu da sadrže rastvor gp120-specifičnog antitela, antigen vezujući fragment, konjugat, CAR, T ć eliju koja eksprimira CAR ili molekul nukleinske kiseline koji kodira takve molekule, rastvoren u farmaceutski prihvatljivom nosaču, kao što je vodeni nosač. Mogu se koristiti razni vodeni nosači, na primer, puferovani fiziološki rastvor i slično. Ovi rastvori su sterilni i obično ne sadrže nepoželjne materije. Ove kompozicije se mogu sterilisati konvencionalnim, dobro poznatim tehnikama sterilizacije. Kompozicije mogu da sadrže farmaceutski prihvatljive pomoć ne materije kada je to potrebno za približavanje fiziološkim uslovima, kao što su agensi za podešavanje pH i puferi, sredstva za podešavanje toksičnosti i slično, na primer, natrijum acetat, natrijum hlorid, kalijum hlorid, kalcijum hlorid, natrijum laktat i slično. Koncentracija antitela u ovim formulacijama može varirati u širokoj meri i bić e odabrana prvenstveno na osnovu zapremina tečnosti, viskoziteta, telesne težine i slično, u skladu sa odabranim načinom administracije i potrebama subjekta.
[0274] Tipična kompozicija za intravensku primenu uključuje oko 0.01 do oko 30 mg/kg antitela ili antigena vezujućeg fragmenta ili konjugata po subjektu i danu (ili odgovarajuć u dozu konjugata, koji uključuje antitelo ili antigen vezujući fragment). Stvarne metode za pripremu kompozicija će biti poznati ili očigledni stručnjacima i bić e detaljnije opisani u publikacijama kao što su Remington's Pharmaceutical Science, 22. izd., Pharmaceutical Press, London, UK (2012). U nekim realizacijama, kompozicija može biti tečna formulacija koja uključuje jedno ili više antitela, antigen vezujuće fragmente (kao što je antitelo ili antigen vezujući fragment koji se specifično vezuje za gp120), u opsegu koncentracija od oko 0.1 mg/ml do oko 20 mg/ml, ili od oko 0.5 mg/ml do oko 20 mg/ml, ili od oko 1 mg/ml do oko 20 mg/ml, ili od oko 0.1 mg/ml do oko 10 mg/ml, ili od oko 0.5 mg/ml do oko 10 mg/ml, ili od oko 1 mg/ml do oko 10 mg/ml.
[0275] Antitela, ili njihov antigen vezujući fragment, ili konjugat ili nukleinska kiselina koja kodira takve molekule, mogu biti obezbeđeni u liofilizovanom obliku i rehidrirani sterilnom vodom pre administracije, ali se daju i u sterilnim rastvorima poznate koncentracije. Rastvor antitela, ili antigen vezujući fragment ili nukleinska kiselina koja kodira takva antitela ili antigen vezujuće fragmente, zatim može biti dodat u infuzionu kesu koja sadrži 0.9% natrijum hlorid, USP, i obično se administrira u dozi od 0.5 do 15 mg/kg telesne težine. U struci postoji značajno iskustvo u primeni lekova sa antitelima, koji su u SAD na tržištu od odobrenja za RITUKSAN® od 1997. Antitela, antigen vezujući fragmenti, konjugati ili nukleinska kiselina koja kodira takve molekule, mogu biti administrirani sporom infuzijom, radije nego brzom intravenskom ili bolus injekcijomom. U jednom primeru se administrira već a udarna doza, uz slede ć e doze održavanja koje se administriraju sa nižim nivoima. Na primer, početna udarna doza od 4 mg/kg se može administrirati infuzijom u periodu od oko 90 minuta, a zatim slede nedeljne doze održavanja u trajanju od 4 do 8 nedelja od 2 mg/kg infuzije tokom 30 minuta, ako je prethodna doza bila dobro tolerisana.
[0276] Parenteralne formulacije sa kontrolisanim oslobađanjem mogu biti izradjene kao implantati, uljne injekcije ili kao sistemi partikulata. Za širi pregled sistema za isporučivanje proteina pogledajte: Banga, A. J., Therapeutic Peptides and Proteins: Formulation, Processing, and Delivery Systems, Technomic Publishing Company, Inc., Lancaster, PA, (1995). Sistemi partikulata uključuju mikrosfere, mikročestice, mikrokapsule, nanokapsule, nanosfere i nanočestice. Mikrokapsule sadrže terapeutski protein, kao što je citotoksin ili lek, kao centralno jezgro. U mikrosferama je terapeutik dispergovan po celoj čestici. Čestice, mikrosfere i mikrokapsule manje od oko 1 µm se obično nazivaju nanočestice, nanosfere i nanokapsule, respektivno. Kapilare imaju prečnik od približno 5 µm tako da se samo nanočestice administriraju intravenski. Mikročestice su obično prečnika oko 100 µm i administriraju se subkutano ili intramuskularno. Pogledajte, na primer, Kreuter, J., Colloidal Drug Delivery Systems, J. Kreuter, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, NY, pp. 219-342 (1994); i Tice & Tabibi, Treatise on Controlled Drug Delivery, A. Kydonieus, ed., Marcel Dekker, Inc. New York, NY, pp.315-339, (1992).
[0277] Polimeri se mogu koristiti za jon-kontrolisano oslobađanje ovde opisanih kompozicija antitela. U struci su poznate različite razgradive i nerazgradive polimerne matrice za upotrebu u kontrolisanom davanju lekova (Langer, Accounts Chem. Res.
26:537-542, 1993). Na primer, blok kopolimer, polaksamer 407, postoji kao viskozna, ali pokretna tečnost na niskim temperaturama, ali formira polučvrsti gel na telesnoj temperaturi. Pokazano je da je efikasno sredstvo za formulaciju i kontinuiranu isporuku rekombinantnog interleukina-2 i ureaze (Johnston et al., Pharm. Res. 9:425-434, 1992; i Pec et al., J. Parent, Sci. Sci. Tech. 44(2):58-65, 1990). Alternativno, hidroksiapatit je korišć en kao mikro-nosač za kontrolisano oslobađanje proteina (Ijntema et al., Int. J. Pharm. 112: 215-224, 1994). U još jednom aspektu, lipozomi se koriste za kontrolisano oslobađanje kao i za targetiranje lekom pomoću lipid-kapsuliranog leka (Betageri et al., Liposome Drugs Delivery Systems, Technomic Publishing Co., Inc., Lancaster, PA (1993)). Poznati su brojni dodatni sistemi za kontrolisanu isporuku terapeutskih proteina (vidi U.S. Patent No. 5,055,303; U.S. Patent No. 5,188,837; U.S. Patent No. 4,235,871; U.S. Patent No. 4,501,728; U.S. Patent No. 4,837,028; U.S. Patent No. 4,957,735; U.S. Patent No. 5,019,369; U.S. Patent No. 5,055,303; U.S. Patent No.
5,514,670; U.S. Patent No. 5,413,797; U.S. Patent No. 5,268,164; U.S. Patent No. 5,004,697; U.S. Patent No. 4,902,505; U.S. Patent No.5,506,206; U.S. Patent No.5,271,961; U.S. Patent No.5,254,342 i U.S. Patent No.5,534,496).
5. Metode otkrivanja i dijagnoza
[0278] Predmetni pronalazak obezbeđuje metodu za otkrivanje infekcije HIV-1 kod subjekta, koja sadrži:
kontaktiranje biološkog uzorka od subjekta sa gore otkrivenim antitelom ili antigen vezujućim fragmentom, pod uslovima dovoljnim da se formira imuni kompleks; i
otkrivanje prisustva imunog kompleksa u uzorku, pri čemu prisustvo imunog kompleksa u uzorku ukazuje da subjekt ima HIV-1 infekciju.
[0279] Takođe su obezbeđene metode za detekciju ekspresije gp120 in vitro ili in vivo. U jednom primeru, ekspresija gp120 je otkrivena u biološkom uzorku i može se koristiti za detekciju HIV-1 infekcije na osnovu prisustva HIV-1 u uzorku. Uzorak može biti bilo koji uzorak, uključujuć i, ali ne ograničavaju ć i se na, tkivo iz biopsija, obdukcija i patoloških uzoraka. Biološki uzorci takođe uključuju sekcije tkiva, na primer, zamrznute sekcije uzete za histološke svrhe. Biološki uzorci zatim uključuju telesne tečnosti, kao što su krv, serum, plazma, ispljuvak, kičmena tečnost ili urin. Postupak detekcije može uključivati kontaktiranje ć elije ili uzorka ili davanje subjektu, antitela ili antigen vezujućeg fragmenta koji se specifično vezuje za gp120, ili njegovog konjugata (npr. konjugata koji uključuje detektabilni marker) pod uslovima dovoljnim da se formira imunološki kompleks i detekcija imunog kompleksa (npr. detekcijom detektabilnog markera konjugovanog sa antitelom ili antigen vezujućim fragmentom.
[0280] U nekoliko realizacija su data, ovde otkrivena, antitela ili antigen vezujući fragmenti za upotrebu u postupku detekcije AIDS-a i/ili HIV-1 infekcije kod subjekta. Otkrić e pruža metod za otkrivanje HIV-1 u biološkom uzorku, pri čemu metoda uključuje kontakt biološkog uzorka subjekta sa otkrivenim antitelom ili antigen vezujućim fragmentom pod uslovima dovoljnim za formiranje imunog kompleksa i detektovanje imunog kompleksa, za detektovanje gp120 u biološkom uzorku. U jednom primeru, detekcija gp120 u uzorku potvrđuje dijagnozu AIDS-a i/ili HIV-1 infekciju kod subjekta.
[0281] U nekim realizacijama otkrić a, otkrivena antitela ili njihovi antigen vezujući fragmenti se koriste za testiranje vakcina. Na primer da se testira da li sastav vakcine koja uključuje gp120 podrazumeva konformaciju koja uključuje epitop N6, N17 ili F8. Ovde je ovde data metoda za testiranje vakcine, pri čemu metoda uključuje kontaktiranje uzorka koji sadrži vakcinu, kao što je gp120 imunogen, sa otkrivenim antitelom ili fragmentom koji vezuje antigen pod uslovima dovoljnim za formiranje imunog kompleksa i detekciju imunskog kompleksa, za otkrivanje vakcine sa HIV-1 imunogenom koja sadrži N6, N17, ili F8 epitop u uzorku. U jednom primeru, detekcija imunog kompleksa u uzorku pokazuje da komponenta vakcine, kao što je HIV-1 Env imunogen, pretpostavlja konformaciju koja može da vezuje antitelo ili antigen vezujući fragment.
[0282] U jednoj realizaciji ovog otkrić a, antitelo ili antigen vezujući fragment su direktno obeleženi detektabilnim markerom. U drugoj realizaciji ovog otkrić a, antitelo koje vezuje HIV-1 Env (prvo antitelo) nije obeleženo, a drugo antitelo ili drugi molekul koji može da veže antitelo za koje se veže prvo antitelo se koristi za detekciju. Kao što je dobro poznato onima koji poznaju ovo područje, bira se drugo antitelo koje može specifično da veže specifične vrste i klase prvog antitela. Na primer, ako je prvo antitelo humani IgG, onda sekundarno antitelo može biti anti-humani-IgG. Ostali molekuli koji se mogu vezati za antitela uključuju, bez ograničenja, protein A i protein G, koji su oba komercijalno dostupni.
[0283] Pogodni obeleživači za antitelo, antigen vezujući fragment ili sekundarno antitelo su gore opisane i uključuju različite enzime, zaštitne grupe, fluorescentne materijale, luminescentne materijale, magnetne agense i radioaktivne materijale. Neograničavajuć i primeri pogodnih enzima uključuju peroksidazu rena, alkalnu fosfatazu, beta-galaktozidazu ili acetilholinesterazu. Neograničavajuć i primeri pogodnih kompleksa protetskih grupa uključuju streptavidin/biotin i avidin/biotin. Neograničavajuć i primeri pogodnih fluorescentnih materijala uključuju umbelliferon, fluorescein, fluoresceinski izotiocijanat, rodamin, dihlorotriazinilamin fluorescein, danzil hlorid ili fikoeritrin. Neograničavajuć i primer luminiscentnog materijala je luminol; neograničavajuć i primer magnetnog agensa je gadolinijum, a neograničavaju ć i primeri radioaktivnih obeleživača uključuju<125>I,<131>I,<35>S ili<3>H.
F. Setovi
[0284] Predmetni pronalazak obezbedjuje set koji sadrži kontejner koji sadrži antitelo, antigen vezujući fragment, molekul nukleinske kiseline, ekspresioni vektor,ć eliju doma ć ina ili gore opisanu farmaceutsku kompoziciju i uputstva za upotrebu seta.
[0285] Takođe su obezbeđeni setovi. Na primer, setovi za lečenje subjekta sa HIV-1 infekcijom, ili za detekciju gp120 u uzorku ili subjektu. Setovi obično uključuju ovde opisano gp120-specifično antitelo, antigen vezujući fragment, konjugat, CAR, T ć eliju koja eksprimira CAR, ili molekul nukleinske kiseline koji kodira takve molekule, ili kompozicije koje uključuju takve molekule. Više od jednog od otkrivenih gp120-specifičnih antitela, antigen vezujućeg fragmenta, konjugata, CAR, T ć elije koje eksprimiraju CAR, ili molekula nukleinske kiseline koji kodira takve molekule, ili kompozicija koja uključuje takve molekule može biti uključena u set.
[0286] U jednoj realizaciji, set je dijagnostički set i uključuje imuno test. Iako se detalji imunoeseja mogu razlikovati u zavisnosti od određenog formata, metoda detekcije gp120 u biološkom uzorku uglavnom uključuje korake kontaktiranja biološkog uzorka sa antitelom koje specifično reaguje, pod uslovima dovoljnim da se formira imuni kompleks sa gp120. Antitelu je omogućeno da se pod imunološki reaktivnim uslovima specifično veže za formiranje imunog kompleksa, a prisustvo imunog kompleksa (vezano antitelo) se detektuje direktno ili indirektno.
[0287] Set može da sadrži kontejner i etiketu ili umetak pakovanja leka koji se nalazi na kontrejneru ili je sa njim povezan. Pogodni kontejneri uključuju, na primer, boce, bočice, špriceve, itd. Kontejneri mogu biti formirani od raznih materijala kao što su staklo ili plastika. Kontejner obično sadrži smešu koja sadrži jedno ili više otkrivenih antitela, antigen vezujuće fragmente, konjugate, molekule nukleinske kiseline ili kompozicije. U nekoliko realizacija, kontejner može imati sterilni pristupni otvor (na primer, kontejner može biti kesa za intravenski rastvor ili vijal sa čepom koji se može probiti hipodermičkom injekcijskom iglom). Etiketa ili umetak pakovanja leka ukazuje da se kompozicija koristi za lečenje određenog stanja.
[0288] Etiketa ili umetak pakovanja leka obično dalje sadrže uputstvo za upotrebu antitela, fragmenata koji vezuju antigen, konjugata, molekula nukleinske kiseline ili kompozicija koje su uključene u set. Umetak pakovanja leka obično sadrži uputstva koja se obično uključuju u komercijalna pakovanja terapijskih proizvoda koja sadrže informacije o indikacijama, upotrebi, doziranju, primeni, kontraindikacijama i/ili upozorenja u vezi sa upotrebom takvih terapijskih proizvoda. Uputstva mogu biti napisana u elektronskom obliku (kao što je disketa ili kompakt disk) ili vizuelno (kao što je video datoteka). Setovi takođe mogu da sadrže dodatne komponente kako bi se olakšala aplikacija za koju je set dizajniran. Prema tome, set može još da sadrži sredstva za detektovanje obeleživača (kao što su enzimski supstrati za enzimske obeleživače, setovi filtera za detekciju fluorescentnih obeleživača, odgovaraju ć e sekundarne obeleživače kao što je sekundarno antitelo ili slično). Setovi mogu dodatno da sadrže pufere i druge reagense koji se rutinski koriste za izvođenje određene metode. Takvi setovi i odgovarajuć i sadržaji su dobro poznati stručnjacima u ovoj oblasti.
III. PRIMERI
[0289] Sledeć i primeri su dati da ilustruju posebne karakteristike određenih realizacija, ali obim zahteva ne treba da bude ograničen na one karakteristike koje su date kao primeri. Svi primeri koji spadaju van obima zahteva su dati samo u komparativne svrhe.
PRIMER 1
Široka i potentna neutralizacija HIV-1 humanim antitelom koje vezuje CD4 mesto vezivanja
[0290] Ovaj primer ilustruje izolaciju i karakterizaciju antitela N6 i nekoliko njegovih varijanti. Antitelo N6 je široko i izuzetno potentno gp120-specifično mAb, koje se vezuje za CD4 mesto vezivanja HIV-1 Env na gp120. N6 je neutralisalo 98% pseudovirusa u panelu sa 181 pseudovirusa koji predstavlja širok spektar sojeva HIV-1 sa IC50<50 µg/ml. Medijan IC50neutralisanih virusa je bio 0.038 µg/ml, među najpotentnijim od do sada opisanih. Zatim, N6 je uspešno neutralisao 16 od 20 pseudovirusa u panelu pseudovirusa rezistentnih na neutralizaciju pomo ć u VRC01, kanoničkog antitela koje široko neutrališe CD4 mesto vezivanja.
Uvod
[0291] Među antitelima koja najšire neutrališu HIV-1 su članovi grupe koja vezuje CD4 mesto vezivanja. Nekoliko takvih antitela je izolovano od pacijenata, od kojih je već ina opsežno okarakterisana u pogledu strukture i funkcije. Ve ć ina od ovih antitela imaju jako slične karakteristike s obzirom na njihovu VH upotrebu i način vezivanja, i zbog toga su označena kao „VRC01-klasa“. Iako su ova antitela među najširim, neka antitela manje širine za druge zone na Env su 10 do 20 puta potentnija, kao što su ona koji ciljaju glikan N332 ili V1V2. Pored toga, otprilike 12% izolata je rezistentno na VRC01-klasu antitela.
[0292] Ovaj primer obezbeđuje novo monoklonsko antitelo za CD4 mesto vezivanja, nazvano N6, koje postiže i potentnost i izuzetnu širinu. N6 je pripadnik VRC01 klase, a ipak vrlo potentno neutrališe veliku već inu izolata rezistentnih na VRC01. Podaci o neutralizaciji, strukturi i mutagenezi ukazuju na to da su ove aktivnosti posredovane kroz nove interakcije između više domena N6 i HIV-1 Env. Ovaj mehanizam uključuje izbegavanje sternih smetnji koje su glavni mehanizam rezistencije na antitela klase VRC01. Pored toga, on uključuje jedinstvenu i kritičnu interakciju između CDRH3 u N6 i izuzetno očuvanog dela petlje D u HIV-1 Env. Potentnost i širina N6 i njegov nedostatak autoreaktivnosti ga čine jako poželjnim antitelom za upotrebu u profilaksi ili terapiji.
REZULTATI
Izdvajanje i svojstva neutralisanja N6
[0293] Da bi se razumele specifičnosti koje stoje u osnovi široko i potentno neutrališuć eg seruma pacijenta Z258, izvedena su ispitivanja. Serum ovog pacijenta je bio potentan i širok na osnovu neutralizacije 20 pseudovirusa HIV-1 Env (Sl. 1A). Potentnost, širina i obrazac neutralizacije su bili slični onom kod pacijenta 45, od koga je klonirano dobro poznato CD4 mesto vezivanja antitela VRC01. Pored toga, na osnovu fingerprinta neutralizacije (Georgiev et al., Science, 340, 751-756, 2013) (Sl.
1A), serum ovog pacijenta je sugerisao da je antitelo za CD4 mesto vezivanja bilo dominantno specifično. Da bi se odredile specifičnosti koje posreduju HIV-specifičnu neutralizaciju kod ovog pacijenta, primenjena je tehnika za izolovanje monoklonskih antitela od interesa iz B ć elija periferne krvi bez prethodnog poznavanja ciljne specifičnosti (Huang et al., Nat. Protoc., 8, 1907 -1915., 2013.). IgM-, IgA-, IgD<->memorijske B ćelije periferne krvi pacijenta Z258 su sortirane i ekspandirane. Supernatanti mikrokultura B-ć elija su zatim pregledani za aktivnost neutralisanja, a IgG geni iz bunarčića sa aktivnoš ć u neutralisanja su klonirani i ponovo eksprimirani. Pronađene su tri varijante klonalnih familija antitela sa aktivnošć u neutralisanja, među kojima je antitelo nazvano N6 (izolovano kao IgG1 mAb) bilo najpotentnije i najšire (Sl.1B). Identifikovana antitela i odgovarajuć i identifikatori sekvence su kako sledi:
Konzistentno sa mnogim drugim HIV specifičnim široko neutrališuć im monoklonskim antitelima, N6 je bilo visoko somatski mutirano, i u teškom (31%) i u lakom lancu (25%). Sekvenca antitela N6 takođe je sadržavala karakteristike koje su bile konzistentne sa antitelom klase VRC01 (Zhou et al., Science, 329, 811-817, 2010), kao što je teški lanac izveden iz gena germinativne linije VH1-2*02 i laki lanac CDR3 (LCDR3) koji se sastoji od 5 aminokiselina (Sl. 1B i Sl. 1C). Iako potiču iz istog pretka Bć elije, N6 se prilično razlikovao od VRC27 i razlikovao se na nivou aminokiseline teškog lanca za 38%.
[0294] Da bi uporedili širinu i potentnost neutralizacije N6 sa drugim široko neutrališuć im anti-HIV-1 antitelima, N6 je testiran na panelu sa 181 pseudovirusa paralelno sa VRC01, 3BNC117, VRC27, PG9, PGDM1400, PGT121, 10-1074, 10E8, 4E10 i 35O22. Kao što je prikazano na Sl. 1D i 1E, N6 je neutralizovalo 98% od 181 pseudovirusa pri IC50< 50 µg/ml. Iako se širina mnogih antitela naglo smanjuje pri manje od 1 µg/ml, na ovom nivou N6 još uvek neutrališe 96% ispitivanih izolata. Medijan IC50je bio 0.038 µg/ml, što je među najpotentnijim do sada opisanim.
[0295] Pored toga, antitela sa umreženim komplementima koja uključuju teški i laki lanac antitela N6, F8 su generisana i testirana za neutralizaciju HIV-1 (Sl. 1F). Himerna antitela uključuju varijantu 1 (N6 VH+ F8 VL), varijantu 2 (N6 VH+ N17 VL), varijantu 3 (N17 VH+ F8 VL), varijantu 4 (N17 VH+ N6 VL), varijantu 5 (F8 VH+ N6 VL) i varijantu 6 (F8 VH+ N17 VL). Kao što je prikazano u Sl.1F, sva testirana himerna antitela su neutralisala HIV-1 u testu pseudovirusa.
[0296] Upečatljiv rezultat je bilo to što je N6 neutralizovalo mnoge izolate koji su bili visoko rezistentni na VRC01. Kada je ispitivana aktivnost na 20-virusnom panelu sastavljenom od izolata rezistentnih na VRC01 i upoređena sa aktivnostima drugih članova VRC01-klase (VRC01, VRC07-523-LS i 3BNC117), N6 je neutralisalo 16 od 20 izolata (Sl. 2). Možda je još značajnije to što te izolate jako potentno neutrališe. Ovo sugeriše da N6 možda ima novi način prepoznavanja koji deluje preko različitih Envs-a, što mu omoguć ava da izbegne rezistentnost uobičajenu za ostale članove antitela klase VRC01.
[0297] Autoreaktivnost ili polireaktivnost je svojstvo nekoliko HIV-specifičnih antitela koja može da ograniči njihovu upotrebu u terapiji ili profilaksi. Međutim, N6 nije vezalo epitelne ć elije Hep-2 (Sl. 3A), niti je vezalo kardiolipin (Sl. 3B) ili panel autoantigena (Sl. 3C), što sugeriše da autoreaktivnost možda neć e ograničiti potencijalnu upotrebu N6 u profilaksi, lečenju i prevenciji HIV-1.
[0298] Da bi se razumela specifičnost vezivanja N6, pomoć u ELISA testa je ispitana njegova sposobnost kompeticije sa drugim antitelima ili vezivanja gp120 mutanta. Konzistentno sa VRC01-klasom antitela, N6 se takmičilo sa biotiniliranim CD4Ig i antitelima za CD4 mesto vezivanja za vezivanje sa gp120 (Sl. 4A). Za testove kompetitivnog vezivanja, kao što su b12, VRC01 i CD-Ig (za koje se zna da se vezuju za CD4 mesto vezivanja na gp120), N6 i Varijanta 1 (N6 teški lanac u kombinaciji sa F8 kappa lancem) su se takmičili za vezivanje za gp120 (Sl. 4A). Kao što je prikazano na Sl. 4B, vezivanje antitela N6 i Varijante 1 (N6 teški lanac u kombinaciji sa F8 kappa lancem) sa BaL gp120, RSC3 i RSC3A371I P363N je bilo slično onome za mesto vezivanja CD4 antitela VR401 i b12. Međutim, za razliku od VRC01 i b12, N6 i Varijanta 1 (teški lanac N6 u kombinaciji sa F8 kappa lancem) su održavali vezivanje sa BaL gp120 D368R. Zanimljivo je primetiti da se mutant D368R koristi za izdvajanje (eng. gate out) antitela koja ne vezuju CD4 mesto vezivanja u strategijama sortiranja zasnovanim na probama. Zbog toga je verovatno N6 eliminisano iz analize u prethodnim naporima za usavršavanje antitela za CD4 mesto vezivanja. Da bi se dodatno potvrdilo da se antitela N6 i Varijanta 1 (N6 teški lanac u kombinaciji sa F8 kappa lancem) vezuju za CD4 mesto vezivanja, vezivanje N6 sa gp120 je testirano ELISA testom (Sl. 4C). Kao što je prikazano na Sl. 4C, N6 i N6 Varijanta-1 su se specifično vezali za trimerni gp140 (gp140 foldon) i monomerni gp120, ali se nisu vezali za gp120 V3 domen, gp41 ili MPER peptid.
Specifičnost vezivanja N6
[0299] Da bi se preciznije mapirao epitop N6 na HIV-1 gp120, pomoću ELISA testa je ispitano vezivanje N6 sa mutantima za skeniranje alanina u kontekstu monomera gp120<JRCSF>. Na osnovu prethodnih strukturalnih analiza i virusne mutageneze, poznato je da pripadnici VRC01 klase antitela kontaktiraju gp120 u tri glavne zone; petlje D, petlje vezivanja CD4 (CD4 BLP) i regionu β23-V5. Mutacije na reziduama u petlji D, CD4 BLP ili β23-V5 regionu JRCSF su rezultirale smanjenjem N6-posredovanog vezivanja gp120 (Sl. 4D), što je u skladu sa ostalim antitelima za mesto vezivanja CD4. Sve u svemu, razlike vezivanja između antitela N6 i drugih antitela klase VRC01 nisu primeć ene u ovom kontekstu. Međutim, konformacija monomernog gp120 testirana u ELISA formatu možda ne odražava tačno interakciju između N6 i intaktnog funkcionalnog trimera. Da bi se ova interakcija bolje procenila, koriš ć en je panel JRCSF Env mutanata pseudovirusa za skeniranje alanina, za ispitivanje potentnosti neutralisanja N6 u poređenju sa drugim antitelima za CD4 mesto vezivanja i 2G12 kao a negativna kontrola. Kao što je prikazano u Sl. 4E, pojedinačna mutacija u petlji D od JRCSF, poput D279A ili K282A, je dovela do rezistencije na neutralizaciju pomoću već ine mAb za CD4 mesto vezivanja, što je konzistentno sa prethodnim rezultatima (Li et al., J. Virol., 85, 8954-8967, 2011; Linch et al., J. Virol., 89, 4201-4213, 2015). Za razliku od toga, pojedinačne mutacije u petlji D, CD4 BLP ili β23-V5 regionu JRCSF nisu pokazale rezistentnost na neutralizaciju pomoću N6. Ovi rezultati, pored vezivanja sa gore opisanim RSC mutantima (Sl.4B), sugerišu da se N6 može vezivati za CD4 mesto vezivanja kroz novi način prepoznavanja.
N6 epitop
[0300] U prethodnom radu resistentnost na antitela klase VRC01 je obično posredovana mutacijama u poznatim kontaktnim zonama u petlji D, CD4 BLP ili β23-V5 od gp120 (Lynch et al., J Virol 89, 4201-4213, 2015). Od 181 testiranog virusa, samo 4 su bila visoko rezistentna na N6 sa IC50> 50 µg/ml, a 2 su bila manje senzitivna na N6 sa IC50> 5 µg/ml (Sl. 5A). Svaki od rezistentnih virusa ima mutacije u petlji D (rezidue 276-283), CD4 BLP (rezidue 362-374) i β23-V5 regionu (rezidue 458-469) u odnosu na referentne sekvence virusa HXB2, JFCSF i 93TH057. Međutim, sekvence N6-senzitivnih virusa i rezistentnih virusa unutar panela 20 VRC01-rezistentnih virusa nemaju jasnu matricu (Sl. 5A). Pored toga, napravili smo Env klonove pune dužine od plazme virusa pacijenta Z258, od koga je izolovan N6. U prethodnom radu je primeć eno da su autologni virusi obično rezistentni na istovremeni serološki odgovor i mogu da daju informacije o mehanizmima rezistencije<46,50-55>. U skladu sa prethodnim zapažanjima, jedanaest pseudovirusa koji eksprimiraju ove autologne Env-e takođe je bilo otporno na N6 posredovanu neutralizaciju (Sl. 5A). Analiza autolognih Env sekvenci je otkrila da njihove sekvence takođe imaju mutacije u petlji D, CD4 BLP i β23-V5 regionu u odnosu na sekvence referentnog virusa (Sl. 5A). Da bi se utvrdio relativni doprinos ovih mutacija rezistenciji na N6, petlja D, CD4 BLP i β23-V5 regioni iz T278-50, BL01 i TV1.29 su reverzno mutirani, i autologni virus Z258.2012.SGA5 pseudovirusa, na senzitivnu virusnu sekvencu HIV<JRCSF>(Sl. 5B-5C). Zamena β23-V5 sekvencama iz HIV<JRCSF>je poveć ala senzitivnost na N6 za 3-5 puta kod dva pesudovirusa, T278-50 i TV1.29, ali ne i kod BL01 i Z258.2012.SGA5. Zamena CD4 BLP sekvencama iz HIV<JRCSF>nije dovela do poveć anja senzitivnosti na N6. Tek kada su sekvence HIV<JRCSF>uvedene u D petlju, svi pseudovirusi su postali vrlo senzitivni na neutralizaciju sa N6. Za razliku od N6, reverzne mutacije u D petlji, CD4 BLP i β23-V5 regionu su bile potrebne za punu senzitivnost antitela za CD4 mesto vezivanja, VRC01, 3BNC117, VRC-PG04, 12A12 i VRC27. Vezivanje N6 za reverzne mutante od T278-50, BL01, TV1.29 i autolognog virusa Z258.2012.SGA5 je takođe testirano pomoću ELISA testa. Slično tome, reverzne mutacije na reziduama u D petlji su rezultirale u snažnom N6-posredovanom vezivanju gp120, dok su za vezivanje antitela za CD4 mesto vezivanja potrebne reverzne mutacije u D petlji, CD4 BLP i β23-V5 regionu. Da bi se potvrdilo da su mutacije u D petlji ključne za rezistentnost na N6, sekvence D petlje, CD4 BLP ili β23-V5 regiona JRCSF su umetnute u sekvencu autolognog virusa Z258.2012,SGA5. Supstitucija sekvence D petlje JRCSF sa D petljom iz sekvence Z258.2012.SGA5 dramatično je smanjila senzitivnost neutralisanja N6 za 11 puta, dok je zamena CD4 BLP i β23-V5 pokazala trostruku razliku, odnosno nije pokazala značajnu razliku. Da bismo istražili koje rezidue u petlji D mogu igrati važnu ulogu u izbegavanju N6, zamenili smo svaku reziduu koja se razlikovala u rezistentnim virusima sa odgovarajuć om reziduom HIV<JRCSF>. Reverzne mutacije pozicijaa 281, 282 i 283 su pokazale malo ili nikakvo poveć anje senzitivnosti na N6. Tek kada je očuvana rezidua Asp iz HIV<JRCSF>uvedena na poziciju 279, već ina pseudovirusa je postala osetljiva na neutralizaciju sa N6 (Sl. 5D-5E). Verovatno je rezistencija ovih virusa na N6 posredovana od glomaznog bočnog lanca rezidua na poziciji 279 u TV1.29, BL01 i autolognog virusa Z258 koji uzrokuje direktno sudaranje sa CDRH3 iz N6. Ovi rezultati sugerišu da rezistencija na neutralizaciju sa N6 zahteva mutacije u petlji D. Međutim, za razliku od drugih antitela za CD4 mesto vezivanja, N6 toleriše mutacije izbegavanja (eng. escape mutations) u CD4 BLP i β23-V5 regionu, uključujuć i one koje mogu izazvati sterne smetnje sa CDRH2 i CDRL3 drugih antitela klase VRC01.
N6 Paratop
[0301] Da bi se razumeo paratop u N6, napravljen je panel N6 mutanata za skeniranje alanina koji su ispitivali potentnost neutralizacije šest VRC01-senzitivnih virusa, pomoću N6. VRC01 i VRC27 i njihovi mutanti za skeniranje alanina su takođe korišć eni kao kontrole. Nekoliko promena je dovelo do više od pet puta manjeg prosečnog potencijala neutral izacije za VRC01 i VRC27 (Sl.6C-6F). Mutacije alanina Trp100bVRC01i Trp100cVRC27unutar CDRH3 su imale velike uticaje verovatno zbog poremeć aja interakcija sa Asp279gp120. Pored toga, nekoliko rezidua u Trp47, Trp50, Asn58 i Arg71 teškog lanca VRC27 i Gly28 i Ile91 lakog lanca VRC27 su takođe imale velike efekte (Sl. 6E-6F). Izuzetno, nije primeć en takav uticaj kod alaninskih tačkastih mutacija u N6 (Sl. 6A-6B). Tako je N6 bio u stanju da toleriše pojedinačne mutacije duž teških i lakih lanaca, verovatno zato što je bilo dovoljno energije koja se širila kroz preostale kontakte za posredovanje u vezivanju.
[0302] Ispitana je i potentnost neutralizacije N6 mutanata za skeniranje alanina za šest VRC01-rezistentnih virusa, koji sadrže mutacije u petlji D, CD4 BLP i V5 petlji. Rezidue u Ile33, Trp47, Trp50, Arg71 i Trp 100c teškog lanca N6 i IIe91 lakog lanca N6 su takođe imali velike uticaje na smanjenje potentnosti neutralizacije (Sl. 7). Pošto se gornje rezidue takođe javljaju u VRC27 antitelu, ovo nije dovoljno da se objasni zašto N6 ima superiornu aktivnost neutralizacije u odnosu na VRC27.
[0303] Zatim su ispitivani regioni teškog ili lakog lanca N6 koji igraju suštinsku ulogu u njegovoj širini neutralizacije i potentnosti. Prvo, teški i laki lanci N6 su zamenjeni sa drugim neutrališućim antitelima CD4 mesta vezivanja VRC01, VRC27 i 12A21, i ispitane su njihove aktivnosti neutralisanja protiv šest VRC01 rezistentnih i dva VRC01-senzitivna pseudovirusa. Kao što je prikazano na Sl.8A, kombinacija teškog lanca N6 i lakog lanca VRC01, VRC27 ili 12A21 poveć ava potentnost i širinu antitela u odnosu na VRC01, VRC27 ili 12A21, respektivno. Međutim, kombinacija lakog lanca N6 i teškog lanca VRC01, VRC27 ili 12A21 nije pokazala promenu u širini. Ovaj rezultat je potencijalno konzistentan sa strukturnim podacima koji sugerišu da je sposobnost N6 da vezuje VRC01-rezistentne viruse, iako posredovana kroz orijentaciju lakog lanca, prevashodno posredovana konformacijom usvojenom od teškog lanca.
[0304] U N6, Tyr54HCi GlyGlyGly60-62HCunutar CDRH2, i CDRH3 su ključna područja interakcije sa gp120 na osnovu analiza kristalne strukture. Međutim, zamena ovih rezidua u odgovarajuć im regionima VRC01) nije pove ć ala njegovu širinu ili potentnost (Sl. 8B). CDRH3 iz N6 je takođe supstituisan u druga antitela klase VRC01, kao što su VRC07 i VRC08 i nije uočeno poveć anje njihove širine ili potentnosti (Sl. 8B). Ovo sugeriše da ove karakteristike pojedinačno ne daju pove ć anu aktivnost ostalim članovima VRC01 klase protiv rezistentnih virusa.
[0305] Sledilo je ispitivanje da li se aktivnost N6 protiv rezistentnih virusa smanjuje mutiranjem FR i CDR-a iz N6 u one drugih članova VRC01-klase (Sl. 8B i BC). Supstitucija Tyr54N6sa Gly54VRC01i GlyGlyGly60-62N6sa odgovarajuć im reziduama AlaArgPro60-62VRC01u CDRH2 je svaka dovela do 32 i 14 puta manje neutralizacije. Međutim, najveć i pad aktivnosti protiv ovih virusa je uzrokovan zamenama N6 CDRH1, CDRH2 i CDRH3 i okvirnog regiona (FR) FRH3 s onima iz VRC01, što je dovelo do smanjenja aktivnost neutralizacije od 2857, 2857, 304 i 60 puta, respektivno. Takođe je CDRH3 iz N6 zamenjen sa onim iz VRC01-sličnih antitela, kao što su VRC07 i VRC08. Uočeno je smanjenje aktivnosti neutralisanja od 2757 i 2857 puta, respektivno. Pored toga, ova antitela su izgubila aktivnosti neutralisanja protiv već ine VRC01-rezistentnih virusa. To nije zbog velikog poreme ć aja funkcije supstitucijama s obzirom da je neutralisanja senzitivnih izolata bilo nepromenjeno. Supstitucije N6 lakog lanca CDRL1 i FRL3 sa onima iz VRC01 su takođe dramatično smanjile aktivnosti neutralisanja antitela za 2857 puta. Supstitucije CDRL3 i FRL1 imale su skromniji uticaj.
[0306] Da bi se dalje razumeli domeni u N6 odgovorni za njegovu širinu i potentnost, svaki region u N6 je bio supstituisan onim iz genetski i strukturno sličnih, ali manje širokih i potentnih antitela iz iste VRC01 klase. VRC27 je klonalni srodnik izolovan od istog davaoca, sa samo pet rezidua u CDRH3 koje se razlikuju od N6. Međutim, aktivnost neutralizacije VRC27 je manja od aktivnosti VRC01 sa medijanom IC50od 0.217 µg/ml, širinom 78% i nije neutralisao VRC01-rezistentne viruse. Supstitucija CDRH3 iz N6 sa onim iz VRC27 (N6 VRC27 CDRH3) je uzrokovala smanjenje neutralizacije VRC01-rezistentnih virusa od 10 puta (Sl. 8). Ovo bi se moglo očekivati imajuć i u vidu da su CDRH3 ova dva antitela prilično slični. Međutim, supstitucija CDRH2 i CDRH1 iz N6 sa onim iz VRC27 je dovela do 78 i 10 puta manje neutralizacije. Supstitucija ArgAsp64-65N6sa odgovarajuć im reziduama GlnGly64-65VRC27u CDRH2 je dala smanjenje neutralizacije za 108 puta. Pomalo iznenađujuć e supstitucija FRH1, 2 i 3 je izazvala 21-, 11- i 30-tostruko smanjenje neutralizacije (Sl.8).
[0307] N17 je druga klonalna varijanta blisko povezana sa N6, ali sa manjom aktivnošć u protiv VRC01-rezistentnih virusa. Teški lanac N17 ima iste CDRH1, CDRH2, CDRH3 i FRH2 kao N6, ali se razlikuje u nekoliko rezidua unutar FRH1 i FRH3. Njegov laki lanac se takođe razlikuje od N6 u svakom FR i CDR-u. Kao što je prikazano na Sl. 8, supstitucija FRH1 i FRH3 kod N6 odgovarajuć im reziduama iz N17 je uzrokovala 5- i 7-struko smanjenje potentnosti. Nije uočena promena potentnosti sa supstitucijama u svim FRL i CDRL. Ovi rezultati sugerišu da pored N6 CDRH1, CDRH2 i CDRH3, takođe i FRH1 i FRH3 doprinose potentnosti N6 protiv VRC01-rezistentnih virusa.
[0308] Ukupno uzevši, zamene teškog i lakog lanca, strukturne analize i mutageneza sugerišu da je vezivanje sa N6 posredovano višestrukim kontaktima rasutim po CDR i FR teških lanaca. N6 održava svoje najkritičnije kontakte u okviru petlje D kroz interakcije sa teškim i lakim lancem. Međutim, N6 je u stanju da toleriše mutacije unutar CD4BLP i β23-V5 regiona koje uvode rezidue sa glomaznim bočnim lancima koji imaju sterne smetnje sa drugim antitelima klase VRC01.
Ovo svojstvo daje jedinstvena orijentacija lakog lanca koju diktira ukupna konformacija teškog lanca. To svojstvo rezultira izvanrednom sposobnošć u N6 da izbegne glavne mehanizme rezistencije na VRC01 klasu antitela.
[0309] Aminokiselinske sekvence modifikovanih gore opisanih varijabilnih regiona teških i lakih lanaca antitela su date kako sledi:
Kristalna struktura N6 u kompleksu sa gp120
[0310] Da bi se definisali strukturalni mehanizmi pomoć u kojih N6 može da posreduje takvu potentnost i širinu, izvedena je strukturna analiza antigen vezujućeg fragmenta N6 (Fab) u kompleksu sa proteinima HIV gp120 iz sojeva sa različitom senzitivnosti za antitela klase VRC01 (vidi Sl. 9-13). Oni uključuju clade AE 93TH057, soj senzitivan na već inu antitela klase VRC01; DU172, soj rezistentan na VRC01, ali senzitivan na nekoliko drugih antitela klase VRC01, uključujuć i N6; i X2088, soj senzitivan samo na N6.
[0311] Analiza struktura je otkrila da N6 ima nekoliko karakteristika zajedničkih sa drugim članovima VRC01 klase antitela. One uključuju kontakte između CDRH3 i petlje D, mada su ti kontakti mnogo obimniji od onih kod VRC01. N6 je takođe imao kontakte između CDRH2 i CD4 BLP, sone mostove između Arg71HCi Asp368gp120. N6 je takođe imao “pocket-filling” Tyr54HC, koji oponaša interakciju Phe43CD4sa gp120, što je karakteristika koja je takođe nađena kod nekih od antitela klase VRC01, kao što su VRC27 (takođe izolovano od pacijenta Z258), VRC-PG20 i 12A21, koje sadrži Phe54 ili VRC03 koje ima Trp54. Laki lanac je izveden od IGKV1-33, slično kao kod nekih drugih antitela kao što je 12A21. Kao i neka druga antitela klase VRC01, N6 takođe sadrži fleksibilni GlyXGly motiv (aa 28-30) unutar CDRL1 koji mu omogu ć ava da izbegne sterne smetnje sa petljom D. Iako CDRH3 u N6 ima drugačiju konformaciju od VRC01, CDR H3 Trp100c (Kabat numeracija) ima sličan položaj kao VRC01 Trp100b koji interaguje sa Asp279gp120.
[0312] Takođe je nađeno da N6 ima nekoliko strukturnih karakteristika koje su se razlikovale od ostalih antitela klase VRC01. Na primer, teški lanac N6 sadrži poliglicin 60-62 koji njie nađen ni u jednom drugom izolovanom antitelu na mestu vezivanja CD4. Takođe laki lanac N6 ima jedinstvenu orijentaciju po tome što je bio rotiran tako da je CDRL3 dalje od β23-V5 u poređenju sa VRC01. Adicija rezidua sa velikim bočnim lancima u ovaj domen je prethodno opisani mehanizam rezistencije na antitela klase VRC01. Već a udaljenost između CDRL3 i ove oblasti može da dozvoli N6 da bolje podnese takve promene u V5 u poređenju sa drugim antitelima klase VRC01. U skladu sa ovom interpretacijom, struktura kokristala N6-X2088.c9gp120je otkrila da je rotacija lakog lanca N6 smestila dodatne rezidue između alfa 2 heliksa i CD4BLP od ove Env koji štrče u smeru lakog lanca i verovatno se sudaraju sa drugim antitelima ovog tipa. Važno je napomenuti da jedinstvena orijentacija lakog lanca N6 nije posledica posebnih karakteristika lakog lanca ili spoja teškog i lakog lanca, imajuć i u vidu da se oni preklapaju sa onima iz VRC27. Umesto toga, ostaje moguć nost da su način vezivanja ili orijentacija teškog lanca N6 omogu ć ili ovu rotaciju lakog lanca. Sve u svemu, N6 ima jedinstvenu orijentaciju lakog lanca u poređenju sa ostalim antitelima klase VRC01, u tome što omoguć ava lakom lancu da izbegne potencijalne sudare sa β23-V5 i D petljom.
Razvojni put N6
[0313] Da bi se razumelo kako je N6 razvio tako izuzetnu potentnost i širinu u poređenju sa drugim antitelima klase VRC01, izvršeno je sekvenciranje “next-generation sequencing” (NGS) memorijskih B ćelija periferne krvi od donora Z258 u tri vremenske tačke (2012, 2014 i 2015 ) radi identifikacije dodatnih članova linije porekla. Ukratko, kDNK receptora za Bć elije je pripremljena iz svake vremenske tačke i sekvencionirana korišćenjem Illumina MiSeq, sa prosečnom dubinom sekvenciranja od ∼ 40x. Linijom porekla povezani transkripti teškog lanca su identifikovani na osnovu identiteta sekvence u CDRH3 sa onima u N6, VRC27, F8 ili N17. Srodni transkripti lakog lanca identifikovani su kao čitanja koja potiču od IGKV1-33 i koriste potpis pet aminokiselinskih CDRL3 VRC01-klase (Zhou et al. Immunity 39, 245-258, 2013). Nakon uklanjanja duplikata i transkripata koji sadrže zaustavne kodone ili spojeve izvan okvira, preostala čitanja su grupisana kako bi se uzela u obzir greška sekvenciranja. Konačno, klastrirane sekvence su ručno korigovane da se dobiju konačni setovi članova linije porekla teškog i lakog lanca za svaku vremensku tačku.
[0314] Kurirani transkripti teških i lakih lanaca pokazali su visoke nivoe somatske hipermutacije (> 20%), sa više transkripata sličnijih VRC27 nego N6 (Sl.14). Ipak, transkripti teških lanaca koji pokazuju manje somatske mutacije (23%) nego N6 ili VRC27, su uočene u vremenskim tačkama 2012. i 2014. godine. Slično tome, uočeneni su i neki transkripti lakog lanca sa∼ 20% somatske hipermutacije, u poređenju sa ∼ 25% za laki lanac N6 i VRC27. Veći broj sa linijom porekla povezanih transkripta je uočen iz vremenske tačke 2012, nego iz 2014. ili 2015., verovatno zbog toga što je za NGS eksperiment korišć eno više B ć elija. Transkripti lakog lanca slični N6 su uočeni u sve tri vremenske tačke (Slika 14), ali u podacima iz 2012. ili 2015. nisu primeć eni transkripti teških lanaca sa velikom sličnošć u sa N6. Iako je velika ve ć ina kuriranih sekvenci teških lanaca usko povezana sa VRC27 u filogenetskom stablu (Slika 15), to verovatno ne odražava biološku ekspanziju klade VRC27 u odnosu na kladu N6. Ova raznolikost je umesto toga veštački generisana niskim kvalitetom sekvenci u preklapanju između direktnog i reverznog MiSeq čitanja-a.
[0315] Da bi se istražila filogenetska struktura linije porekla, konstruisana su stabla maksimalne verovatnoć e za teški i laki lanac (Sl. 15). Filogenetska stabla su dosledno pokazala da su N6 i VRC27 formirali dve visoko divergentne grupe. Ipak, pored upotrebe istih genetskih elemenata, obe grupe imaju slične spojeve teškog i lakog lanca, kao i deljenje mutacija 15 i 14 u teškim i lakim lancima respektivno, što potvrđuje da predstavljaju dve klade (grane) jedne klonske linije porekla.
[0316] Filogenetsko stablo je dalje pokazalo da su se dve klade odvojile rano u razvoju linije porekla. Iako 3 transkripta iz vremenske tačke iz 2014. padaju između grana N6 i VRC27 (Sl. 15), analiza nije pronašla dovoljan broj sekvenci ranih članova linije porekla da bi se definisala tačka u kojoj su se dve klade odvojile. Čini se da su se motiv teškog lanca GlyGlyGly60-62N6i motiv RD63-64N6pojavili nakon dve i tri klade respektivno. U lakom lancu, motiv GlyXGly u CDRL1 se pojavio pre divergencije dve klade, dok se Gln96 u CDRL3 pojavio kasno u razvoju klade N6.
[0317] Uparili smo filogenetsko stablo za liniju porekla N6 i klonirali transkripte teških i lakih lanaca Z258 povezane sa N6. Dva teška lanca su dobijena iz 2015. a četiri laka lanca su dobijena iz 2014. i 2015. Pronašli smo tri od osam antitela za uparivanje koja imaju sličnu potentnost kao N6 (Sl. 16). Zanimljivo je da su sva tri antitela mogla da neutrališu N6-rezistentni virus TV1.29, što sugeriše da je pacijent Z258 razvio antitela sa već om širinom tokom ovog vremenskog perioda.
DISKUSIJA
[0318] Ovi rezultati imaju nekoliko važnih implikacija na napore za stimulisanje široko neutrališuć eg odgovora antitela i napora da se bNAb iskoriste u profilaksi ili terapiji. Od onih antitela koja se razmatraju za klinički razvoj postojao je opšti trend da su ili izuzetno široka (poput 10E8 ili VRC01) ili izuzetno potentna i manje široka (PGT121, PGDM1400). Međutim, otkrić e antitela N6 pokazuje da ovo novo antitelo klase VRC01 može posredovati i izvanrednu širinu i potentnost, čak i protiv izolata koji su tradicionalno rezistentni na antitela ove klase. Analiza sekvenci rezistentnih izolata, mutageneza i strukturni podaci potvrđuju da N6 ima brojne karakteristike i kontakte koji su karakteristični za klasu VRC01. Međutim, ono je u moguć nosti da postigne svoju širinu i potentnost znatno iznad ostalih antitela klase VRC01 kroz složenu kombinaciju promena u više domena i u teškim i u lakim lancima.
[0319] Porast potentnosti, u poređenju sa ostalim antitelima klase VRC01, u velikoj meri je posredovan kroz seriju kontakata između teškog lanca i gp120. Razmena teških i lakih lanaca N6 sa onima iz drugih antitela klase VRC01 ukazala je da je aktivnost N6 u velikoj meri posredovana interakcijama teških lanaca. Ovo se prevashodno dešava kroz kontakte na CDRH2, CDRH3 i Tyr54N6Teški. Iako zamena bilo koje od ovih sekvenci u drugo antitelo klase VRC01 nije pokazala poveć anu aktivnost, mutiranje svakog od njih je smanjilo aktivnost N6. Međutim, najdominantnija od tih interakcija se dogodila između CDR H3 iz N6 i petlje D. Ovaj stepen zavisnosti od interakcije CDRH3-petlja D je iznenađujuć i s obzirom da je nađeno da prethodno opisana antitela klase VRC01 koja koriste VH1-2*02 u velikoj meri zavise od CDR H2 interakcija<43>. Možda ova interakcija, zajedno sa onima sa CDRH2 i I54N6, koja u kombinaciji daje N6 njegovu dodatnu potentnost u poređenju sa drugim antitelima klase VRC01.
[0320] Posebno je zanimljivo primetiti da prirodnom selekcijom in vivo, N6 ima svojstva koja su ugrađena u druga antitela da se poveć a potentnost ili širina ili da se smanji mogu ć nost izbegavanja antitela. Iako dosad opisana prirodna antitela, klase VRC01, VH1-2-02-02-izvedena, oponašaju interakciju CD4 sa gp120, velika već ina ne puni hidrofobni džep na gp120 koji obično puni Phe43CD4. Supstitucije hidrofobnih rezidua za Gli54 u antitelima NIH45-46<58>i VRC07<59>su rezultirale velikim poveć anjem potentnosti i izvesnim poveć anjem širine. Antitelo N6, prirodnim odabirom in vivo, ima Tyr54N6koji se vezuje u ovom džepu i doprinosi potentnosti N6. Pored toga, laki lanci i VRC07 i NIH 45-46 su inženjerisani tako da izbegnu sterne smetnje sa β-23 V5 petljom<49,59,60>. Te iste sterne smetnje antitelo N6 izbegava promenama u orijentaciji lakog lanca koje mu dozvoljavaju da toleriše glomazne bočne lance unutar β-23 V5 domena. Međutim, mnoge od ovih inženjerskih promena u antitelima klase VRC01 koje su dovele do poboljšanja potentnosti i širine došle su na uštrb poveć ane autoreaktivnosti (<59>i razmatrano u<61>). Iako se mogu javiti prirodna autooreaktivna antitela, posebno među bNabs<62>; iznenađujuć e nije prime ć ena autoreaktivnost za antitelo N6. Ekspanzija B ć elija koje eksprimiraju klonske srodnike N6 sa jakom autoreaktivnoš ć u je verovatno izabrana in vivo. Ovi podaci pokazuju da razvoj i širine i potentnosti antitela kao što je N6 nije nužno prać eno autoreaktivnošću.
[0321] Antitelo N6 ima nekoliko karakteristika koje ga čine poželjnim kandidatom za upotrebu u profilaksi i terapiji. Nedostatak autoreaktivnosti sugeriše da ć e N6 imati duži poluživot in vivo u poređenju sa drugim antitelama koja su reaktivna u takvim ispitivanjima. Potentnost N6 može dodatno poveć ati trajnost profilaktičke ili terapijske koristi u slučaju pasivne administracije, pošto je manje antitela potrebno da se istraje u postizanju nekog efekta. Ovaj efekat može još da se produži uvođenjem mutacija u N6 koje su u stanju da produže njegov poluživot in vivo. Pored njegove potentnosti, upotreba antitela sa ovom širinom može dramatično da ograniči verovatnoć u transmisije kada se koristi u profilaksi ili izbor mutacija za izbegavanje u postavljanju terapije.
[0322] Retka pojava mutacija za rezistenciju na N6 može sugerisati da takve mutacije dolaze uz visoku cenu za fitnes koja predstavlja prepreku za odabir rezistentnih mutanata. Autologni virus Z258 je sadržao retke promene u sekvenci D petlje na pozicijama 279gp120i 281gp120. Izgleda da rezistentnost na N6 zahteva da ove pozicije D petlje budu mutirane. Promene na tim pozicijama su primeć ene kod pacijenata ili humanizovanih miševa kao odgovor na odabir antitela klase VRC01<50,60>. Autologni virus pacijenta 45, od koga su VRC01 i NIH45-46 klonirani, sadržao je mutacije Asp279Glugp120i Ala281Hisgp120. U ovom slučaju Ala281Hisgp120je povratio fitness virusa u izolatima koji sadrže Asp279Glugp120. U jednom nedavnom naporu da se inženjerišu VRC01-slična antitela da se ograniči virusno izbegavanje, inženjerisano NIH45-46 antitelo je dato kao terapija humanizovanim HIV<YU-2>inficiranim miševima. Ova terapija izabrana za mutant Ala281Thrgp120je rezultirala smanjenom kondicijom virusa (eng. virus fitness), potencijalno kroz uvođenje glikana na Asn279gp120generisanjem sekvona glikozilacije Asn-X-Thr/Ser. Uticaj pojedinih mutacija na konformaciju i replikacioni fitness autolognog virusa Z258 tek treba da se definiše. Međutim, ove promene se dešavaju samo u < 0.01% od 5132 virusa u velikoj bazi podataka (wwwv.hiv.lanl.gov), što sugeriše da su takve mutacije verovatno nepovoljne. Prema tome, pored svoje potentnosti i širine, antitelo N6 može biti posebno efikasno za terapijsku upotrebu zbog troškova za fitnes virusa povezanih sa generisanjem rezistencije na N6.
Eksperimentalne Procedure
[0323] Pacijenti u studiji. Mononuklearne ć elije plazme i periferne krvi (PBMC) su izabrane od HIV-1 virusom zaraženih pacijenata registrovanih u Nacionalnom institutu za zdravstvo prema kliničkom protokolu koji je odobrio Odbor za istraživanja u Nacionalnom institutu za alergijе i zarazne bolesti (NIAID-IRB). Svi učesnici potpisali su informisani pristanak odobren od NIAID-IRB. Kriterijumi za uključivanje u studiju su bili sledeć i: pose dovanje detektabilnog virusnog tereta, stabilan broj CD4 T-ć elija iznad 400 ć elija/ µl, koje su dijagnostikovane sa HIV-1 infekcijom tokom najmanje 4 godine i bez antiretrovirusnog lečenja najmanje 5 godina. Donor Z258 je izabran za sortiranje B ć elija i generisanje antitela, pošto je njegova aktivnost neutralisanja seruma među napotentnijim i najširim u kohorti. U vreme leukafereze, bio je zaražen sa HIV-1 već 21 godinu, sa brojem T4 ć elija CD4 od 733 ć elije/ µl, vrednost HIV-1 RNK u plazmi od 996 kopija/ml i nije bio na antiretrovirusnom tretmanu.
[0324] Bojenje memorijskih B-ć elija, sortiranje i kloniranje antitela . Bojenje i sortiranje pojedinačnih memorijskih B ć elija je izvršeno po nedavno objavljenom detaljnom protokolu (Huang et al., Nat. Protoc., 8, 1907-1915, 2013). Ukratko, ukupno 75.000 CD19<+>IgA-IgD-IgM<->memorijskih B ć elija je sortirano i resuspendovano u medijumu sa IL-2, IL-21 i ozračenim 3T3-msCD40L „feeder“ ć elijama i zasejano u mikrotitarske ploče sa 384 bunarčića sa gustinom od 4 ć elije po bunarčiću. Nakon 13 dana inkubacije, supernatanti iz svakog bunarčića su pregledani za aktivnost neutralizacije pomoću visoko propusnog testa mikroneutralizacije protiv HIV-1MN.3i HIV-1<Bal.26>. Iz pozitivno ocenjenih bunarčića u oba testa neutralizacije i u HIV-1MN.3I u HIV-1<Bal.26>varijabilnog regiona teškog lanca i lakog lanca gena imunoglobulina su amplifikovani pomoću RT-PCR i ponovo eksprimirani kako je prethodno opisano (Tiller et al., J. Immunol. Methods, 329, 112-124, 2008; Georgiev et al., Science, 340: 751-756, 2013). IgG pune dužine je prečišć en koriš ć enjem kolone rekombinantni protein-A (GE Healthcare).
[0325] Generisanje pseudovirusa. HIV-1 Env pseudovirusi su generisani kotransfekcijom 293T ć elija sa Env-deficijentnom kičmom (pSG3DEnv) i drugim plazmidom koji je eksprimirao HIV-1 Env u odnosu 2:1. 72 h nakon transfekcije, supernatanti koji sadrže pseudoviruse su sakupljeni i zamrznuti na -80 °C do dalje upotrebe. JRCSF mutanti su dobijeni izmenom JRCSF Env plazmida sa QuikChange Lightning kompletom za mutagenezu usmerenu na mesto prema protokolu proizvođača (Agilent).
[0326] Testovi neutralizacije. Aktivnost neutralizacije monoklonskih antitela ili seruma je merena korišć enjem jednokružne HIV-1 Env-pseudovirusne infekcije TZM-bl ć elija kako je prethodno opisano (Li et al., J. Virol., 79, 10108-10125, 2005. Toplotno inaktiviran bolesnikov serum ili monoklonsko antitelo (mAb) je bilo serijski razblaženo petostruko sa Dulbecco modifikovanim Eagle medijumom 10% FCS (Gibco), i 10 µl seruma ili je mAb inkubirano sa 40 µl pseudovirusa u ploči sa 96 bunarčića na 37 °C tokom 30 minuta. Zatim su dodate ć elije TZM-bl, i ploče su inkubirane tokom 48 h. Zatim su testovi razvijeni pomoću sistema ispitivanja na bazi luciferaze (Promega, Finnboda Varvsvag, Sweden), a relativne svetlosne jedinice (RLU) su očitane na luminometru (Perkin Elmer).
[0327] Testovi vezivanja. Monomeri HIV<BAL26>gp120, gp120 Resurfaced Stabilized Cores (RSC3) i njihovi CD4 nokaut mutanti gp120D368R i RSC3 Δ371I P363N u 2 µg/ml su naneti na ploče sa 96 bunarčića preko noć i na 4 °C. Ploče su blokirane BLOTTO puferom (PBS, 1% FBS, 5% bezmasno mleko) 1 h na sobnoj temperaturi, a zatim je usledila inkubacija sa antitelom serijski razređenim u puferu za disrupciju (PBS, 5% FBS, 2% BSA, 1% Tween-20) tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Dodato je 1:10000 razblaženje peroksidaze rena (HRP)-kozje anti-humanog IgG antitela tokom 1 sat na sobnoj temperaturi. Ploče su ispirane između svakog koraka sa 0.2% Tween 20 u PBS-u. Ploče su razvijene korišć enjem 3, 3', 5, 5' tetrametil-benzidina (TMB) (Sigma -Aldrich) i očitane na 450 nm.
[0328] Unakrsna kompetitivna ELISA. Unakrsno kompetitivna ELISA je izvedena po prethodno objavljenoj metodi (Wu et al., Science, 329, 856-861, 2010). HIVYU2gp120 u 2 µg/ml je nanet na ploče sa 96 bunarčića preko noć i na 4 °C. Ploče su blokirane sa B3T puferom (PBS, 3.3% FBS, 2% BSA, 0.07% Tween-20, 0.02% timerozal, 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl i 1 mM EDTA) 1 h na 37 °C. 50 µl serijski razblaženih ne-biotinilovanih kompetitorskih antitela je dodato na ploču u B3T puferu, nakon čega je dodato 50 µl biotinilovanog antitela ili CD4-Ig u fiksnoj koncentraciji: 250 ng /ml VRC01-biotina, 5 µg/ml VRC23-biotina, 1 µg/ml VRC-PG04-biotina ili 150 ng/ml CD4-Ig-biotina. Ploče su inkubirane 1 sat na 37 °C. Dodat je HRP-konjugovani streptavidin (BD) razblaženja 1:200 i inkubiran tokom 30 minuta na sobnoj temperaturi. Ploče su ispirane između svakog koraka sa 0.2% Tween-20 u PBS-u. Ploče su razvijene pomoć u TMB i očitane na 450 nm.
[0329] ELISA zarobljavanje virusa. Relativni kapacitet vezivanja monomernih gp120 i N6 je određen pomoću zarobljavanja gp120 enzimskim imunosorbent testom (ELISA), kako je prethodno opisano (Moore et al., J. Virol., 69, 101-109, 1995). 100 µl anti-gp120 D7324 (Aalto Bioreagent, Dublin, Ireland) pri 1 µg/ml u PBS-u je naneto na ploče sa 96 bunarčića tokom noć i na 4 °C. Stokovi JRCSF pseudovirusa koji su tretirani sa Triton X-100 (0.5%) su dodati i inkubirani 2 sata na 37 °C. Ploče su blokirane B3T puferom 1 sat na 37 °C, nakon čega je usledila inkubacija sa antitelom serijski razblaženim u B3T puferu tokom 1 sat na 37 °C. Tokom 1 h na 37 °C je dodata peroksidaza rena (HRP)-konjugovana kozjim anti-humanim IgG antitelom, razblaženje 1:10.000 (Jackson Immuno-Research Laboratories). Ploče su između svakog koraka ispirane sa 0.2% Tween-20 u PBS-u, razvijene pomoću TMB i očitane na 450 nm.
[0330] Testovi autoreaktivnosti. Reaktivnost na HIV-1 negativne ć elije humanih epitelijalnih ćelija (HEp-2) je određena indirektnom imunofluorescencijom na slajdovima korišć enjem Evans Blue kao kontrasta i FITC-konjugovanog kozjeg antihumanog IgG (Zeus Scientific) (Haynes et al., Science, 308, 1906-1908, 2005). Slajdovi su fotografisani na Nikon Optiphot fluorescentnom mikroskopu. Kodachrome slajdovi su uzeti od svakog monoklonskog antitela koje se vezuje za ć elije HEp-2 pri izloženosti od 10 s, i slajdovi su skenirani u digitalni format. Za ispitivanje reaktivnosti monoklonskih antitela na SSA/Ro, SS-B/La, Sm, ribonukleoprotein (RNP), Jo-1, dvolančane DNK, centromera B i histona je korišć en Luminex AtheNA Multi-Lyte ANA test (Wampole Laboratories), prema specifikacijama proizvođača, kako je ranije opisano (Haines et al., Science, 308, 1906-1908, 2005). Analizirane koncentracije monoklonskih antitela su bile 50 µg/ml. 10 µl od svake koncentracije je inkubirano sa luminex fluorescentnim kuglicama i testirano prema specifikacijama proizvođača.
[0331] Ekstrakcija virusne RNK i sinteza kDNK. Ekstrakcija virusne RNK i sinteza kDNK su izvedene kao što je prethodno opisano (Wu et al., J. Virol., 86, 5844-5856, 2012). Ukratko, virusna RNK pacijenta Z258 je ekstrahovana iz 280 µl uzorka seruma iz dve različite vremenske tačke koriš ć enjem QIAamp viral RNA mini kit (Qiagen) i eluirana u 50 µl pufera za eluciju. Sinteza prvog lanca kDNK je izvedena pomoću reverzne transkriptaze SuperScript III (Invitrogen Life Technologies). Konačni volumen reakcije od 100 ul se sastojao od 50 µl virusne RNK, 5 µl smeše deoksinukleozid trifosfata (dNTP) (svaki od 10 mM), 1.25 µl antisens prajmera envB3out (5’-TTGCTACTTGTGATTGCTCCATGT-3’, SEK ID BR: 65) pri 20 µM, 20 µl 5 x pufer prvog lanca, 5 ml 100 µM ditiotreitola, 5 µl RNaseOUT i 5 µl reverzne transkriptaze SuperScript III. RNK, prajmeri i dNTP su zagrevani na 65 °C tokom 5 min, zatim su ohlađeni na ledu tokom 1 min, a zatim je cela reakciona smeša inkubirana na 50 °C tokom 60 min, a zatim na 55 °C tokom dodatnih 60 min. Konačno, reakcija je bila inaktivirana 15 minuta toplotom na 70 °C, a zatim tretirana sa 1 µl RNase H na 37 °C tokom 20 minuta. Dobijena kDNK je odmah upotrebljena za PCR ili zamrznuta na 80 °C da sačeka dalju analizu.
[0332] SGA. Nested PCR HIV-1 env SGA je prethodno opisana (Wu et al., J. Virol., 86, 5844-5856, 2012). Ukratko, kDNK je serijski razblažena i distribuirana u replikatima od 12 PCR reakcija na pločama sa 96 bunarčića ThermoGrid (Denville Scientific) da bi se identifikovalo razblaženje pri kojem PCR-pozitivni bunarčići čine oko 30% od ukupnog broja reakcija. Pri ovom razblaženju, već ina bunarčića sadrži amplikone dobijene iz jednog molekula kDNK. Dodatne PCR amplifikacije su izvedene korišć enjem ovog razblaženja na punim pločama sa 96 bunarčića. PCR amplifikacija je izvedena koriš ć enjem Platinum Taq High Fidelity PCR sistema (Invitrogen Life Technologies). Konačna reakciona zapremina od 20 µl je bila sačinjena od 2 µl 10x pufera, 0.8 µl MgSO4, 0.4 µl dNTP smeše (svaki pri 10 mM), 0.2 µl svakog prajmera pri 20 µM, 0.1 µl Platinum Taq High Fidelity polimeraze, i 1 µl DNK matrice (kalupa). Prajmeri za prvi krug PCR su bili envB5out (5’-TAGAGCCCTGGAAGCATCCAGGAAG-3’, SEK ID BR: 66) i envB3out (5'-TTGCTACTTGT-GATTGCTCCATGT-3', SEK ID BR: 67). Prajmeri za drugi krug PCR su bili envB5in (5 ́-CACC-TTAGGCATCTCCTATGGCAGGAAGAAG-3 ́, SEK ID BR: 68) i envB3in (5-GTCTCGAGATA-CTGCTCCCACCC-3’, SEK ID BR: 69). Parametri cikliranja su bili 94 °C tokom 2 min, nakon čega sledi 35 ciklusa na 94 °C tokom 15 s, 55 °C tokom 30 s, i 68 °C tokom 4 min, i konačna ekstenzija od 68 °C tokom 10 minuta. Proizvod prvog kruga PCR (1 µl) je kasnije korišć en kao matrica (kalup) u drugom krugu PCR pod istim uslovima, ali sa ukupno 45 ciklusa. Amplikoni su pregledani na precast 1% agar gelu (Embi Tec). Svi PCR postupci su izvedeni u PCR clean hood uz korišćenje proceduralnih zaštitnih mera protiv kontaminacije uzoraka.
[0333] DNK sekvenciranje. Amplikoni su direktno sekvencirani pomoću BigDye Terminator chemistry od ACGT, Inc. (Wheeling, IL). Oba DNK lanca su sekvencionirana korišćejem fragmenata koji se delimično preklapaju. Individualni fragmenti sekvenci za svaki amplikon su sakupljeni i editovani pomoć u Sequencher 5.0 (Gene Codes, Ann Arbor, MI). Svi hromatogrami su ispitani za mesta mešovitih baza (dvostruki pikovi), što bi moglo biti dokaz prajminga iz više od jedne matrice ili unošenja PCR greške u ranim ciklusima. Svaka sekvenca sa dokazima o dvostrukim pikovima je bila isključena iz dalje analize.
[0334] Informacije o donoru Z258. Donor Z258 izabran je za sortiranje B ć elija i generisanje antitela, jer je njegova aktivnost neutralisanja seruma jedna od najpotentnijih i najširih u našoj kohorti. U vreme leukafereze, bio je zaražen sa HIV-1 već 21 godinu, sa brojem CD T4 ć elija od 733 ć elije/ µl, vrednost HIV-1 RNK u plazmi od 996 kopija/ml i nije bio na antiretrovirusnom lečenju.
[0335] Kloniranje HIV-1 env gena donora Z258. Za kloniranje su odabrane reprezentativne env sekvence donora Z258. Produkti drugog kruga env PCR koji sadrže rev i env gene pune dužine su amplifikovani korišć enjem Herculase II Fusion DNA Polimerase (Agilent Technologies), prajmera HIV RevS (CACCATGGCAGGAAGAAG, SEK ID BR: 70) i envB3in (5'-GTCTCGAGATACT-GCTCCCACCC-3', SEK ID BR: 71) sa istim uslovima drugog kruga PCR kao što je gore opisano. PCR amplikoni su prečišć eni na gelu i ligirani u ekspresioni vektor pcDNA3.1D (Invitrogen Life Technologies) pod kontrolom promotera T7. Nakon toga je usledila transfekcija u TOP10 Chemically Competent E. coli (Invitrogen Life Technologies), svaki plazmid rev i env ekspresije je bio maxiprepped (Qiagen) i njegova sekvenca je verifikovana. Od ukupno sedam env sekvenci kloniranih od donora Z258, sedam (100%) je bilo funkcionalno u posredovanju ulaska virusa.
[0336] Statistička analiza. Korelacije potencijala neutralizacije između N6 i VRC01, 10E8, PGT121 ili PG9 antitela protiv 181 pseudovirusa su procenjene pomoću Spearman testa.
Next Generation Sequencing (NGS) PBMC memorijskih B ć elija:
[0337] Obrada NGS podataka. 2x300 sirovih čitanja su sklopljena u transkripte sa jednim krajem pomoć u USEARCH<75>. Transkripti sa više od 10 grešaka u sekvenciranju procenjenim pomoć u Usearch-a su bili isključeni. Zatim su transkripti obrađeni pomo ć u našeg sopstvenog bioinformatičkog cevovoda<76>. Ukratko, uklonjeni su transkripti krać i od 300 nukleotida. BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/) je koriš ć en za dodeljivanje V, D i J gena germinativne linije svakom transkriptu sa kastomizovanim parametrima. Sekvence osim V (D) J regiona transkripta su uklonjene, a transkripti koji sadrže kodon pomeranja okvira ili zaustavni kodon su isključeni. Identitet sekvence svakog transkripta na V genu germinativne linije, N6, F8, N17 i VRC27 je izračunat pomoću programa ClustalO 77 i prikazan u 2D toplotnim kartama koje su izrađene pomoć u sistema ggplot2 u R.
[0338] Identifikacija NGS transkripata, povezanih sa linijom porekla N6. Da bismo pronašli transkripte teških lanaca povezane sa linijom porekla, koristili smo ClustalO77 za izračunavanje identiteta sekvence CDR3 svakog transkripta svakog skupa podataka sa onim u N6, F8, N17 i VRC27. Transkripti čiji gen V germinativne linije je dodeljen IGHV1-2, sa identitetom sekvence CDR3 već im od 60% sa N6, F8, N17 ili VRC27 i dužinom CDR3 u opsegu od 10-20 aminokiselina, su selektovani za dalje analize. Da bi se uklonili PCR duplikati i transkripti koji sadrže greške u sekvenciranju, izvedena su dva koraka klasterovanja pomoć u USEARCH. Transkripti su prvo klasterovani sa 100% identitetom sekvence i transkripti su rangirani prema pokrivenosti sekvenciranja. Zatim su transkripti sa visokim pokrivanjem korišć eni kao seme ili centri za drugi korak klasterovanja sa 97% identiteta sekvence. Odabrana je jedna reprezentativna sekvenca iz svakog klastera koja sadrži više od jednog transkripta i zatim je generisan jedinstveni skup podataka za svaku vremensku tačku. Zatim smo iz kuriranog skupa podataka ručno uklonili transkripte koji nisu povezani.
[0339] Da bi pronašli transkripte lakog lanca povezane sa linijom porekla, prvo smo identifikovali transkripte koji sadrže CDR3 potpise (X-X[AFILMYWV, SEK ID BR: 72]-[EQ]-X,) VRC01 klase 57. Zatim su izvedena dva koraka klasterovanja za uklanjanje PCR duplikata i transkripta koji sadrže greške u sekvenciranju (Vidi obradu podataka za teške lance). Konačno, generisan je kurirani jedinstveni skup podataka za lake lance za svaku vremensku tačku, a transkripti koji nisu povezani su ručno uklonjeni.
[0340] Filogenetske analize i interferencija intermedijera. Sa linijom porekla povezani transkripti teških i lakih lanaca su poravnati odvojeno primenom programa Muscle i korigovani ručno. filogenetska stabla maksimalne verovatnoće za teške i lake lance su konstruisana korišć enjem MEGA678. Model GTR+G+I supstitucije, koji je izabran pomo ć u MEGA6 kao najb oljeg ukupnog modela za fitovanje setova podataka sekvenci78, je korišć en za procenu genetske udaljenosti. Korišćeno je pet kategorija prilikom modeliranja stope heterogenosti pomoću Γ raspodele. Filogenetska stabla teških i lakih lanaca su ukorenjena koriš ć enjem IGHV1-2*02 i IGKV1-33*01 respektivno. Ukorenjena filogenetska stabla i poravnate sekvence su unete u MEGA6 za zaključivanje intermedijera pomoć u metode maksimalne verovatnoće 78. J. Virol., 86, 5844-5856, 2012.
Primer 2
Otkrivanje HIV-1 u uzorku ili subjektu pomo ć u gp120-specifičnog antitela
[0341] Ovaj primer opisuje upotrebu HIV-1 monoklonskih neutrališućih antitela specifičnih za gp120, za detekciju HIV-1 u uzorku ili subjektu. Ovaj primer dalje opisuje upotrebu ovih antitela za potvrđivanje dijagnoze HIV-1 infekcije kod subjekta.
[0342] Biološki uzorak, kao što je uzorak krvi, se dobija od pacijenta koji je dijagnostikovan, podvrgnut skriningu za, ili se sumnja da ima HIV-1 infekciju. Uzorak krvi uzet od pacijenta koji nije zaražen se koristi kao kontrola, mada se kao kontrola može koristiti i standardni rezultat. Izvodi se ELISA test da bi se otkrilo prisustvo gp120 u uzorku krvi. Proteini prisutni u uzorcima krvi (uzorak pacijenta i kontrolni uzorak) se imobilizovani na čvrstom nosaču, kao što je ploča sa 96 bunarčića, u skladu sa postupcima dobro poznatim u struci (vidi, na primer, Robinson et al., Lancet 362:1612-1616, 2003). Nakon imobilizacije, HIV-1 monoklonska neutrališuća antitela specifična za gp120 koja su direktno obeležena fluorescentnim markerom se nanose na ploču imobilizovanu proteinom. Ploča se pere u odgovarajuć em puferu, kao što je PBS, da se uklone nevezana antitela i da se minimizira nespecifično vezivanje antitela. Fluorescencija se može otkriti upotrebom čitača fluorometrijskih ploča prema standardnim metodama. Poveć anje intenziteta fluorescencije u uzorku pacijenta, u odnosu na kontrolni uzorak, ukazuje na gp120 antitela specifično vezana za proteine iz uzorka krvi, otkrivajuć i tako prisustvo gp120 proteina u uzorku. Otkrivanje proteina gp120 u uzorku pacijenta ukazuje da pacijent ima HIV-1 infekciju ili potvrđuje dijagnozu infekcije HIV-1 kod subjekta.
Primer 3
Lečenje HIV-1 pomoću monoklonskog antitela specifičnog za gp120
[0343] Ovaj primer opisuje posebnu metodu koja se može koristiti za lečenje HIV-1 infekcije kod humanog subjekta davanjem jednog ili više gp120-specifičnih humanih neutrališuć ih mAbs. Iako su obezbeđene određene metode, doziranje i načini primene, stručnjak u ovoj oblastić e razumeti da mogu biti izvršene varijacije bez suštinskog uticaja na lečenje.
[0344] Na osnovu ovde objavljenog izlaganja, infekcija HIV-1 se može lečiti davanjem terapeutski efikasne količine jednog ili više ovde opisanih neutrališućih mAb, čime se smanjuje ili eliminiše HIV-1 infekcija.
Pregled subjekata
[0345] U posebnim primerima, subjekti se prvo pregledaju da bi se utvrdilo da li imaju HIV-1 infekciju. Primeri metoda koje se mogu koristiti za skrining HIV-1 infekcije uključuju kombinaciju merenja broja CD4+ T ć elija i nivoa virusa HIV-1 u krvi u serumu. Dodatne metode koje koriste ovde opisana gp120-specifična mAb se takođe mogu koristiti za skrining za HIV-1 infekciju.
[0346] U nekim primerima, testiranje na HIV-1 se sastoji od početnog ispitivanja imunosorbenta povezanog sa enzimom (ELISA) radi otkrivanja antitela na HIV-1. Uzorci sa nereaktivnim rezultatom sa inicijalnog ELISA-testa se smatraju HIV-1 negativnim, osim ako nije došlo do novog izlaganja zaraženom partneru ili partneru nepoznatog statusa HIV-1. Uzorci sa reaktivnim ELISA rezultatom ponovo se testiraju u duplikatu. Ako je rezultat bilo kog dupliciranog testa reaktivan, uzorak se prijavljuje kao ponovljeno reaktivan i podvrgava se potvrdnom ispitivanju specifičnijim dopunskim testom (npr., Western blot ili imunofluorescentna analiza (IFA)). Uzorci koji su više puta reaktivni u ELISA i pozitivni u IFA ili reaktivni u Western blot-u, smatraju se HIV pozitivnim i indikativnim za HIV-1 infekciju. Uzorci koji su ponovljeno reaktivni u ELISA testu povremeno daju neodređen Western blot rezultat, koji može biti ili nepotpuni odgovor antitela na HIV-1 kod zaražene osobe, ili nespecifična reakcija kod nezaražene osobe. IFA se može koristiti za potvrđivanje infekcije u ovim nejasnim slučajevima. U nekim slučajevima, drugi uzorak će biti uzet više od mesec dana kasnije i ponovo testiran za subjekte sa neodređenim Western blot rezultatima. U dodatnim primerima, testiranje nukleinskih kiselina (npr., viralna RNK ili proviralna metoda amplifikacije DNK) takođe može pomoć i dijagnozu u određenim situacijama.
[0347] Detekcija HIV-1 u krvi subjekta ukazuje na to da je subjekat zaražen sa HIV-1 i da je kandidat za primanje ovde opisanih terapijskih kompozicija. Osim toga, otkrivanje broja CD4+ T ć elija ispod 350 po mikrolitru, kao što je 200 ć elija po mikrolitru, takođe je indikativno da osoba verovatno ima HIV-1 infekciju.
[0348] Prethodni skrining nije potreban pre administracije ovde prikazanih terapeutskih kompozicija
Pred-tretman subjekata
[0349] U posebnim primerima, pre primene terapeutskog agensa subjekt se tretira sa jednom ili više antiretrovirusnih terapija poznatih onima koji poznaju ovu oblast. Međutim, takav tretman nije uvek potreban, i može ga utvrditi vešt kliničar.
Administracija terapeutskih kompozicija
[0350] Nakon izbora subjekta, terapeutski efikasna doza gp120-specifičnog, ovde opisanog, neutrališućeg mAb (kao što je antitelo N6) se daje subjektu (poput odraslog čoveka ili novorođenčeta koji je bilo u riziku da se zarazi sa HIV-1 ili se zna da je zaražen sa HIV-1). Dodatni agensi, poput antivirusnih agensa, takođe mogu biti administrirani subjektu istovremeno ili pre ili posle primene otkrivenih agensa. Administracija se može postić i bilo kojom metodom poznatom u struci, kao što su oralna administracija, inhalacija, intravenska, intramuskularna, intraperitonealna ili subkutana.
[0351] Količina kompozicije koja je primenjena za prevenciju, smanjenje, inhibiciju i/ili lečenje HIV-1 ili stanja povezanog sa njim zavisi od subjekta koji se leči, težine poremeć aja i načina primene terapijske kompozicije. U idealnom slučaju, terapeutski efikasna količina agensa je količina dovoljna da spreči, smanji i/ili inhibira i/ili leči stanje (npr. HIV-1) kod subjekta bez izazivanja značajnog citotoksičnog efekta kod subjekta. Stručnjak u ovoj oblasti može lako utvrditi efikasnu količinu, na primer korišć enjem rutinskih ispitivanja uspostavljanjem krivih doza-odgovor. Kao takve, ove kompozicije mogu biti formulisane sa inertnim diluentom ili sa farmaceutski prihvatljivim nosačem.
[0352] U jednom specifičnom primeru, antitela se administriraju u dozi od 5 mg po kg svake dve nedelje ili 10 mg po kg svake dve nedelje, zavisno od određenog stadijuma HIV-1. U jednom primeru, antitela se daju kontinuirano. U drugom primeru, antitela ili fragmenti antitela se daju u dozi od 50 µg po kg, koja se daje dva puta nedeljno u trajanju od 2 do 3 nedelje.
[0353] Administracija terapijskih kompozicija se može uzimati dugoročno (na primer tokom perioda od nekoliko meseci ili godina).
Procena
[0354] Nakon primene jedne ili više terapija, subjekti sa HIV-1 mogu biti nadgledani za smanjenje nivoa HIV-1, poveć anje broja CD4+ T ć elija subjekta ili smanjenje jednog ili više kliničkih simptoma povezanih sa HIV-1 bolesti. U posebnim primerima, subjekti se analiziraju jedan ili više puta, počevši 7 dana nakon lečenja. Subjekti se mogu nadgledati pomoć u bilo kojeg postupka poznatog u tehnici. Na primer, biološki uzorci subjekta, uključujuć i krv, mogu biti dobijeni i procenjene promene nivoa HIV-1 ili CD4+ Tć elija.
Dodatni tretmani
[0355] U posebnim primerima, ako su ispitanici stabilni ili imaju mali, mešovit ili delimičan odgovor na lečenje, oni mogu biti ponovo lečeni nakon re-evaluacije sa istim rasporedom i pripremom agensa koje su prethodno primili tokom željene količine vremena, uključujuć i trajanje životnog veka subjekta. Delimični odgovor je smanjenje, kao što je najmanje 10%, najmanje 20%, najmanje 30%, najmanje 40%, najmanje 50%, ili najmanje 70% HIV-1 infekcije, replikacije HIV-1 ili njihova kombinacija. Delimični odgovor takođe može biti poveć anje broja CD4+ T ć elija, kao što je najmanje 350 T ć elija po mikrolitru.
[0356] Bić e očigledno da precizni detalji opisanih metoda ili kompozicija mogu biti promenjeni ili modifikovani bez odstupanja od obima opisanih realizacija. Potražujemo sve takve modifikacije i varijacije koje spadaju u opseg donjih zahteva.

Claims (22)

Patentni zahtevi
1. Izolovano antitelo koje sadrži:
varijabilni region teškog lanca (VH) koji sadrži region koji određuje komplementarnost teškog lanca (HCDR)1, HCDR2 i HCDR3 koji sadrže aminokiselinske sekvence navedene kao SEK ID BR: 7, 8 i 9, respektivno i varijabilni region lakog lanca (VL) koji sadrži region koji određuje komplementarnost lakog lanca (LCDR)1, LCDR2 i LCDR3 koji sadrže aminokiselinske sekvence navedene kao SEK ID BR: 10, 11 i 12, respektivno (N6 CDRs);
VHkoji sadrži HCDRl, HCDR2 i HCDR3 koji sadrži sekvence aminokiselina navedena kao SEK ID BR: 13, 14 i 15, respektivno, i VLkoji sadrži LCDR1, LCDR2 i LCDR3, koji sadrži amino kiselinske sekvence navedene kao SEK ID BR: 16, 17 i 18, respektivno (N17 CDRs); ili
VHkoji sadrži HCDRl, HCDR2 i HCDR3 koji sadrži aminokiselinske sekvence navedene kao SEK ID BR: 7, 8 i 9, respektivno, i VLkoji sadrži LCDR1, LCDR2 i LCDR3, koji sadrže aminokiselinske sekvence navedene kao SEK ID BR: 10, 17 i 18, respektivno (F8 CDRs); i
pri čemu se antitelo specifično vezuje za HIV-1 gp120 i neutrališe HIV-1 infekciju.
2. Izolovano monoklonsko antitelo prema zahtevu 1, koje sadrži varijabilni region teškog lanca (VH) koji sadrži region koji određuje komplementarnost teškog lanca (HCDR)1, HCDR2 i HCDR3 koji sadrže aminokiselinske sekvence navedene kao SEK ID BR: 7, 8, i 9, respektivno, i varijabilni region lakog lanca (VL) koji sadrži region koji određuje komplementarnost lakog lanca (LCDR)1, LCDR2 i LCDR3 koji sadrže aminokiselinske sekvence navedene kao SEK ID BR: 10, 11 i 12, respektivno (N6 CDRs).
3. Izolovano monoklonsko antitelo prema zahtevu 2, pr čemu VHi VLsadrže aminokiselinske sekvence najmanje 90% identične sa SEK ID BR: 1 i 2, respektivno (N6 mAb).
4. Izolovano monoklonsko antitelo prema zahtevu 3, pr čemu VHi VLsadrže aminokiselinske sekvence navedene kao SEK ID BR: 1 i 2, respektivno (N6 mAb).
5. Izolovano monoklonsko antitelo prema bilo kojem od prethodnih zahteva, pri čemu
VHi VLsadrže aminokiselinske sekvence najmanje 90% identične sa SEK ID BR: 3 i 4, respektivno (N17 mAb), ili sa SEK ID BR: 5 i 6 respektivno (F8 mAb).
6. Izolovano monoklonsko antitelo prema zahtevu 5, pri čemu
VHi VLsadrže aminokiselinske sekvence navedene kao SEK ID BR: 3 i 4, respektivno (N17 mAb), ili SEK ID BR: 5 i 6, respektivno (F8 mAb).
7. Izolovano monoklonsko antitelo prema bilo kojem od prethodnih zahteva, pri čemu
VHsadrži arginin ostatak na kabat poziciji 71,
VHsadrži poreklo germinativne linije VH1-2 , koje je od 20-35% divergentno u odnosu na gen germinativne linije; i
VLsadrži poreklo germinativne linije IGKV3-11, IGKV3-20, IGKV1-33 ili IGLV2 koje je od 15-35% divergentno u odnosu na odgovaraju ć i gen germinativne linije.
8. Izolovano monoklonsko antitelo prema bilo kojem od prethodnih zahteva, koje sadrži humani okvirni region
i/ili u kojem antitelo jeste IgG, IgM ili IgA, naročito u kojem antitelo jeste IgG i sadrži teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu kao SEK ID BR: 94,
i/ili sadrži rekombinantni konstantni domen koji sadrži modifikaciju koja poveć ava vezivanje za neonatalni Fc receptor, naročito u kojem rekombinantni konstantni domen je IgG1 konstantni domen koji sadrži mutacije M428L i N434S.
9. Antigen vezujući fragment koji sadrži VHi VLizolovanog monoklonskog antitela prema bilo kojem od zahteva 1-7, pri čemu antigen vezujući fragment jeste Fv, Fab, F(ab ́)2, scFV ili scFV2fragment.
10. Izolovano monoklonsko antitelo ili antigen vezujući fragment prema bilo kojem od prethodnih zahteva, naznačeno time što se antitelo ili antigen vezujući fragment specifično vezuje za CD40 mesto vezivanja na gp120,
i/ili time što antitelo ili antigen vezujući fragment neutrališe najmanje 50% HIV-1 izolata navedenih kao 6540.v4.c1, 620345.c1, T278-50, 6322.V4.C1, DU422.01, X2088.c9, 6545.V4.C1, 242-14, T250-4, 7165.18, BL01.DG, HO86.8, 6471.V1.C16, 6631.V3.C10, TVI.29, TZA125.17, CAP210.E8, DU172.17 sa inhibitornom koncentracijom (IC50) od < 50 μ g/ml.
11. Izolovano bispecifično antitelo koje sadrži izolovano humano monoklonsko antitelo ili antigen vezujući fragment prema bilo kojem od prethodnih zahteva,
naročito u kojem se antitelo specifično vezuje za gp120 i za CD3.
12. Izolovani molekul nukleinske kiseline koji kodira antitelo ili antigen vezujući fragment prema bilo kojem od zahteva od 1 do 11.
13. Izolovani molekul nukleinske kiseline prema zahtevu 12, naznačen time što su VHi VLantitela ili antigen vezujući fragment kodirani pomoću sekvenci nukleinskih kiselina navedenih kao SEK ID BR: 36 i 37, respektivno (N6 mAb), ili njihovih degenerisanih varijanti.
14. Izolovani molekul nukleinske kiseline prema zahtevu 12 ili zahtevu 13, koji kodira himerni antigenski receptor koji sadrži ekstracelularni domen, naznačeno time što ekstracelularni domen sadrži antigen vezujući fragment kodiran pomoću molekula nukleinske kiseline i time što nukleinska kiselina kodira i himerni antigenski receptor.
15. Ekspresioni vektor koji sadrži molekul nukleinske kiseline prema patentnim zahtevima od 12 do 14, posebno kada ekspresioni vektor jeste virusni vektor, naročito kada virusni vektor jeste adeno-asocirani virusni vektor.
16. Izolovanać elija doma ć ina transformisana sa molekulom nukleinske kiseline ili ekspresionim vektorom prema bilo kojem od zahteva od 12 do 15.
17. Farmaceutska kompozicija za upotrebu u lečenju HIV-1 infekcije, obuhvatajući:
terapeutski efikasnu količinu antitela, antigen vezujućeg fragmenta, molekula nukleinske kiseline, ekspresionog vektora ilić elije doma ć ina prema bilo kojem od zahteva od 1 do 16; i
farmaceutski prihvatljiv nosač.
18. Metoda za proizvodnju antitela koje se specifično vezuje za HIV-1 gp120, obuhvatajući:
ekspresiju molekula heterologne nukleinske kiseline koji sadrži molekul nukleinske kiseline prema bilo kojem od zahteva od 12 do 14 uć eliji doma ć inu za proizvodnju antitela,
posebno kada jeć elija doma ć in ć elija doma ć ina koji je sisar,
i/ili dalje obuhvata prečišć avanje antitela koje se specifično vezuje za gp120 HIV-1.
19. Metoda za otkrivanje HIV-1 infekcije kod subjekta, koja obuhvata:
kontaktiranje biološkog uzorka subjekta sa antitelom ili antigen vezujućim fragmentom prema bilo kojem od zahteva od 1 do 11, pod uslovima dovoljnim da se formira imuni kompleks; i
otkrivanje prisustva imunog kompleksa u uzorku, pri čemu prisustvo imunog kompleksa u uzorku ukazuje da subjekt ima HIV-1 infekciju.
20. Terapeutski efikasna količina antitela, antigen vezujućeg fragmenta, molekula nukleinske kiseline, ekspresionog vektora, ć elije doma ć ina ili farmaceutske kompozicije prema bilo kojem od zahteva od 1 do 17, za upotrebu u metodi prevencije ili lečenja HIV-1 infekcije kod subjekta, obuhvatajući administriranje subjektu terapeutski efikasne količine antitela, antigen vezujućeg fragmenta, molekula nukleinske kiseline, ekspresionog vektora,ć elije doma ć ina ili farmaceutske kompozicije prema bilo kojem od zahteva od 1 do 17, čime se prevenira ili leči HIV-1 infekcija.
21. Set koji sadrži kontejner koji sadrži antitelo, antigen vezujući fragment, molekul nukleinske kiseline, ekspresioni vektor, ć eliju doma ć ina, ili farmaceutsku kompoziciju prema bilo kojem od zahteva od 1 do 17 i uputstva za upotrebu seta.
22. Antitelo, antigen vezujući fragment, molekul nukleinske kiseline, ekspresioni vektor, ć elija doma ć in ili farmaceutska kompozicija prema bilo kojem od zahteva od 1 do 17, za upotrebu u inhibiranju ili lečenju HIV-1 infekcije kod subjekta.
RS20200525A 2015-03-20 2016-03-18 Neutralizacija antitela do gp120 i njihova upotreba RS60270B1 (sr)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562136228P 2015-03-20 2015-03-20
US201562250378P 2015-11-03 2015-11-03
PCT/US2016/023145 WO2016154003A1 (en) 2015-03-20 2016-03-18 Neutralizing antibodies to gp120 and their use
EP16716979.6A EP3271389B8 (en) 2015-03-20 2016-03-18 Neutralizing antibodies to gp120 and their use

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS60270B1 true RS60270B1 (sr) 2020-06-30

Family

ID=55755690

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20200525A RS60270B1 (sr) 2015-03-20 2016-03-18 Neutralizacija antitela do gp120 i njihova upotreba

Country Status (18)

Country Link
US (6) US10562960B2 (sr)
EP (3) EP3271389B8 (sr)
CN (1) CN108137676B (sr)
AU (1) AU2016235541B2 (sr)
CA (1) CA2980005A1 (sr)
CY (1) CY1123068T1 (sr)
DK (1) DK3271389T3 (sr)
ES (1) ES2789348T3 (sr)
HR (1) HRP20200583T1 (sr)
HU (1) HUE049081T2 (sr)
LT (1) LT3271389T (sr)
PL (1) PL3271389T3 (sr)
PT (1) PT3271389T (sr)
RS (1) RS60270B1 (sr)
SI (1) SI3271389T1 (sr)
SM (1) SMT202000255T1 (sr)
WO (1) WO2016154003A1 (sr)
ZA (1) ZA201706155B (sr)

Families Citing this family (53)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
HRP20200583T1 (hr) 2015-03-20 2020-07-10 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Protutijela koja neutraliziraju gp120 i njihova upotreba
CA3041310C (en) 2016-10-21 2023-09-05 Altor Bioscience Corporation Multimeric il-15-based molecules
WO2018237148A1 (en) 2017-06-21 2018-12-27 Gilead Sciences, Inc. Multispecific antibodies that target hiv gp120 and cd3
US20200172601A1 (en) 2017-06-22 2020-06-04 University Of Maryland, Baltimore Broadly neutralizing antibodies against hiv
CN107098969B (zh) * 2017-06-28 2018-10-12 武汉波睿达生物科技有限公司 一种治疗hiv感染的嵌合抗原受体的重组基因构建及其应用
WO2019084018A1 (en) * 2017-10-23 2019-05-02 City Of Hope CAR FOR THE TREATMENT OF HIV INFECTION
WO2019165122A1 (en) 2018-02-21 2019-08-29 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Neutralizing antibodies to hiv-1 env and their use
EP3762033A4 (en) * 2018-03-09 2021-12-08 Atreca, Inc. ANTI-HIV ANTIBODIES
CA3100282A1 (en) 2018-06-19 2019-12-26 Nantcell, Inc. Hiv treatment compositions and methods
SG11202012043RA (en) 2018-07-03 2021-01-28 Gilead Sciences Inc Antibodies that target hiv gp120 and methods of use
CN109251246B (zh) * 2018-09-14 2022-01-28 南开大学 Hiv-1广谱中和抗体及其用途
EP3870222A4 (en) * 2018-10-22 2022-07-27 International AIDS Vaccine Initiative ANTI-HIV ANTIBODIES
EP4464380A3 (en) * 2018-12-04 2025-05-07 The Rockefeller University Hiv vaccine immunogens
SI3938047T1 (sl) 2019-03-22 2022-10-28 Gilead Sciences, Inc. Premoščene triciklične karbamoilpiridonske spojine in njihova farmacevtska uporaba
TW202231277A (zh) * 2019-05-21 2022-08-16 美商基利科學股份有限公司 鑑別對使用gp120 v3聚醣導向之抗體的治療敏感之hiv病患的方法
JP7295283B2 (ja) 2019-06-25 2023-06-20 ギリアード サイエンシーズ， インコーポレイテッド Ｆｌｔ３ｌ－ｆｃ融合タンパク質及び使用方法
JP7454645B2 (ja) 2019-07-16 2024-03-22 ギリアード サイエンシーズ， インコーポレイテッド Ｈｉｖワクチン並びにその作製方法及び使用方法
WO2021011891A1 (en) 2019-07-18 2021-01-21 Gilead Sciences, Inc. Long-acting formulations of tenofovir alafenamide
CN117736207A (zh) 2019-12-24 2024-03-22 卡尔那生物科学株式会社 二酰基甘油激酶调节化合物
TWI845826B (zh) 2020-03-20 2024-06-21 美商基利科學股份有限公司 4'-c-經取代-2-鹵基-2'-去氧腺苷核苷之前藥及其製造與使用方法
US20230149319A1 (en) * 2020-04-13 2023-05-18 City Of Hope Cell-receptor targeted exosomes
EP4153181A1 (en) 2020-05-21 2023-03-29 Gilead Sciences, Inc. Pharmaceutical compositions comprising bictegravir
IL299894A (en) * 2020-07-17 2023-03-01 Janssen Biotech Inc Anti-idiotypic antibodies against anti-GPRC5D antibodies
MX2023001507A (es) 2020-08-07 2023-03-06 Gilead Sciences Inc Profarmacos de analogos de nucleotidos de fosfonamida y su uso farmaceutico.
PH12023500005A1 (en) 2020-08-25 2023-08-14 Gilead Sciences Inc Multi-specific antigen binding molecules targeting hiv and methods of use
EP4255472A2 (en) 2020-12-07 2023-10-11 VIIV Healthcare Company Combination therapy
EP4359415A1 (en) 2021-06-23 2024-05-01 Gilead Sciences, Inc. Diacylglyercol kinase modulating compounds
CN117377671A (zh) 2021-06-23 2024-01-09 吉利德科学公司 二酰基甘油激酶调节化合物
CN117480155A (zh) 2021-06-23 2024-01-30 吉利德科学公司 二酰基甘油激酶调节化合物
JP7686091B2 (ja) 2021-06-23 2025-05-30 ギリアード サイエンシーズ， インコーポレイテッド ジアシルグリセロールキナーゼ調節化合物
WO2023102523A1 (en) 2021-12-03 2023-06-08 Gilead Sciences, Inc. Therapeutic compounds for hiv virus infection
CN118355020A (zh) 2021-12-03 2024-07-16 吉利德科学公司 Hiv病毒感染的治疗性化合物
FI4445900T3 (fi) 2021-12-03 2025-08-05 Gilead Sciences Inc Terapeuttisia yhdisteitä hiv-virusinfektiota varten
TWI856796B (zh) 2022-04-06 2024-09-21 美商基利科學股份有限公司 橋聯三環胺甲醯基吡啶酮化合物及其用途
EP4547659A1 (en) 2022-07-01 2025-05-07 Gilead Sciences, Inc. Therapeutic compounds useful for the prophylactic or therapeutic treatment of an hiv virus infection
EP4554628A1 (en) 2022-07-12 2025-05-21 Gilead Sciences, Inc. Hiv immunogenic polypeptides and vaccines and uses thereof
WO2024076915A1 (en) 2022-10-04 2024-04-11 Gilead Sciences, Inc. 4'-thionucleoside analogues and their pharmaceutical use
WO2024182893A1 (en) * 2023-03-07 2024-09-12 Finzi Andres Assays and reagents for the detection of soluble gp120
AU2024259111A1 (en) 2023-04-19 2025-10-16 Gilead Sciences, Inc. Dosing regimen of capsid inhibitor
US20250011352A1 (en) 2023-05-31 2025-01-09 Gilead Sciences, Inc. Solid forms
US20250042926A1 (en) 2023-05-31 2025-02-06 Gilead Sciences, Inc. Therapeutic compounds for hiv
AR132900A1 (es) * 2023-06-09 2025-08-06 Univ Koeln Anticuerpos ampliamente neutralizantes dirigidos al sitio de unión de cd4 en la envoltura del vih
EP4474392A1 (en) * 2023-06-09 2024-12-11 Universität zu Köln Broadly neutralizing antibodies targeting the cd4 binding site on hiv env
WO2025029247A1 (en) 2023-07-28 2025-02-06 Gilead Sciences, Inc. Weekly regimen of lenacapavir for the treatment and prevention of hiv
WO2025042394A1 (en) 2023-08-23 2025-02-27 Gilead Sciences, Inc. Dosing regimen of hiv capsid inhibitor
US20250120989A1 (en) 2023-10-11 2025-04-17 Gilead Sciences, Inc. Bridged tricyclic carbamoylpyridone compounds and uses thereof
US20250127801A1 (en) 2023-10-11 2025-04-24 Gilead Sciences, Inc. Bridged tricyclic carbamoylpyridone compounds and uses thereof
WO2025080863A1 (en) 2023-10-11 2025-04-17 Gilead Sciences, Inc. Bridged tricyclic carbamoylpyridone compounds and uses thereof
WO2025137245A1 (en) 2023-12-22 2025-06-26 Gilead Sciences, Inc. Solid forms of hiv integrase inhibitors
WO2025184609A1 (en) 2024-03-01 2025-09-04 Gilead Sciences, Inc. Antiviral compounds
WO2025184452A1 (en) 2024-03-01 2025-09-04 Gilead Sciences, Inc. Solid forms of hiv integrase inhibitors
WO2025184447A1 (en) 2024-03-01 2025-09-04 Gilead Sciences, Inc. Pharmaceutical compositions comprising hiv integrase inhibitors
WO2025260028A1 (en) 2024-06-14 2025-12-18 Gilead Sciences, Inc. Pharmaceutical compositions comprising hiv integrase inhibitors

Family Cites Families (99)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4036945A (en) 1976-05-03 1977-07-19 The Massachusetts General Hospital Composition and method for determining the size and location of myocardial infarcts
US4235871A (en) 1978-02-24 1980-11-25 Papahadjopoulos Demetrios P Method of encapsulating biologically active materials in lipid vesicles
US4458066A (en) 1980-02-29 1984-07-03 University Patents, Inc. Process for preparing polynucleotides
US4331647A (en) 1980-03-03 1982-05-25 Goldenberg Milton David Tumor localization and therapy with labeled antibody fragments specific to tumor-associated markers
US4501728A (en) 1983-01-06 1985-02-26 Technology Unlimited, Inc. Masking of liposomes from RES recognition
US4957735A (en) 1984-06-12 1990-09-18 The University Of Tennessee Research Corporation Target-sensitive immunoliposomes- preparation and characterization
US5019369A (en) 1984-10-22 1991-05-28 Vestar, Inc. Method of targeting tumors in humans
US4902505A (en) 1986-07-30 1990-02-20 Alkermes Chimeric peptides for neuropeptide delivery through the blood-brain barrier
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US4837028A (en) 1986-12-24 1989-06-06 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5004697A (en) 1987-08-17 1991-04-02 Univ. Of Ca Cationized antibodies for delivery through the blood-brain barrier
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5055303A (en) 1989-01-31 1991-10-08 Kv Pharmaceutical Company Solid controlled release bioadherent emulsions
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
US5271961A (en) 1989-11-06 1993-12-21 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Method for producing protein microspheres
US5188837A (en) 1989-11-13 1993-02-23 Nova Pharmaceutical Corporation Lipsopheres for controlled delivery of substances
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5268164A (en) 1990-04-23 1993-12-07 Alkermes, Inc. Increasing blood-brain barrier permeability with permeabilizer peptides
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
CA2095633C (en) 1990-12-03 2003-02-04 Lisa J. Garrard Enrichment method for variant proteins with altered binding properties
US5254342A (en) 1991-09-30 1993-10-19 University Of Southern California Compositions and methods for enhanced transepithelial and transendothelial transport or active agents
US5643578A (en) 1992-03-23 1997-07-01 University Of Massachusetts Medical Center Immunization by inoculation of DNA transcription unit
CA2129514A1 (en) 1992-03-12 1993-09-16 M. Amin Khan Controlled released acth containing microspheres
US5534496A (en) 1992-07-07 1996-07-09 University Of Southern California Methods and compositions to enhance epithelial drug transport
EP0671926B1 (en) 1992-08-11 2002-11-13 President And Fellows Of Harvard College Immunomodulatory peptides
US5593972A (en) 1993-01-26 1997-01-14 The Wistar Institute Genetic immunization
US5514670A (en) 1993-08-13 1996-05-07 Pharmos Corporation Submicron emulsions for delivery of peptides
GB9603256D0 (en) 1996-02-16 1996-04-17 Wellcome Found Antibodies
WO1997046697A2 (en) 1996-06-03 1997-12-11 United Biomedical, Inc. Antibodies against a complex of cd4 and a chemokine receptor domain, and their use against hiv infections
US20030118985A1 (en) * 1997-05-14 2003-06-26 Hunt Jeffrey C. Mouse monoclonal antibody (5-21-3) to human immunodeficiency virus gp41 protein
JP2002506353A (ja) 1997-06-24 2002-02-26 ジェネンテック・インコーポレーテッド ガラクトシル化糖タンパク質の方法及び組成物
WO1999022764A1 (en) 1997-10-31 1999-05-14 Genentech, Inc. Methods and compositions comprising glycoprotein glycoforms
US7435549B1 (en) 1997-11-17 2008-10-14 Micromet Ag Method of identifying binding site domains that retain the capacity of binding to an epitope
US6610833B1 (en) 1997-11-24 2003-08-26 The Institute For Human Genetics And Biochemistry Monoclonal human natural antibodies
US20030175884A1 (en) 2001-08-03 2003-09-18 Pablo Umana Antibody glycosylation variants having increased antibody-dependent cellular cytotoxicity
DK1071700T3 (da) 1998-04-20 2010-06-07 Glycart Biotechnology Ag Glykosylerings-modifikation af antistoffer til forbedring af antistofafhængig cellulær cytotoksicitet
JP4169478B2 (ja) 1998-04-21 2008-10-22 マイクロメット アーゲー Ｃｄ１９×ｃｄ３特異的ポリペプチドおよびその使用
US6723538B2 (en) 1999-03-11 2004-04-20 Micromet Ag Bispecific antibody and chemokine receptor constructs
AU3672800A (en) 1999-04-09 2000-11-14 Kyowa Hakko Kogyo Co. Ltd. Method for controlling the activity of immunologically functional molecule
EP1229125A4 (en) 1999-10-19 2005-06-01 Kyowa Hakko Kogyo Kk PROCESS FOR PREPARING A POLYPEPTIDE
CA2393869A1 (en) 1999-12-15 2001-06-21 Genetech,Inc. Shotgun scanning, a combinatorial method for mapping functional protein epitopes
IL151872A0 (en) 2000-03-24 2003-04-10 Micromet Ag mRNA AMPLIFICATION
US7332168B2 (en) 2000-08-22 2008-02-19 Micromet Ag Composition for the elimination of autoreactive B-cells
US7064191B2 (en) 2000-10-06 2006-06-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for purifying antibody
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
HU231090B1 (hu) 2000-10-06 2020-07-28 Kyowa Kirin Co., Ltd. Antitest-kompozíciót termelő sejt
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
ES2405944T3 (es) 2000-11-30 2013-06-04 Medarex, Inc. Ácidos nucleicos que codifican las secuencias de inmunoglobulina humana reorganizadas a partir de ratones transcromoscómicos transgénicos zadas
WO2003002609A2 (en) 2001-06-28 2003-01-09 Domantis Limited Dual-specific ligand and its use
ATE430580T1 (de) 2001-10-25 2009-05-15 Genentech Inc Glycoprotein-zusammensetzungen
US20040093621A1 (en) 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
EP1474451A2 (en) 2002-02-13 2004-11-10 Micromet AG De-immunized (poly)peptide constructs
WO2003085102A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cell with depression or deletion of the activity of protein participating in gdp-fucose transport
EP1498485A4 (en) 2002-04-09 2006-09-06 Kyowa Hakko Kogyo Kk MODIFIED GENOME CELLS
EP1498491A4 (en) 2002-04-09 2006-12-13 Kyowa Hakko Kogyo Kk METHOD FOR ENHANCING ACTIVITY OF BINDING ANTIBODY COMPOSITION WITH FC GAMMA IIIA RECEPTOR
JP4832719B2 (ja) 2002-04-09 2011-12-07 協和発酵キリン株式会社 ＦｃγＲＩＩＩａ多型患者に適応する抗体組成物含有医薬
WO2003084569A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Drug containing antibody composition
CA2481837A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Production process for antibody composition
CA2488441C (en) 2002-06-03 2015-01-27 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
US7820166B2 (en) 2002-10-11 2010-10-26 Micromet Ag Potent T cell modulating molecules
CN103833854B (zh) 2002-12-16 2017-12-12 健泰科生物技术公司 免疫球蛋白变体及其用途
US20050079574A1 (en) 2003-01-16 2005-04-14 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
EP1629012B1 (en) 2003-05-31 2018-11-28 Amgen Research (Munich) GmbH Pharmaceutical compositions comprising bispecific anti-cd3, anti-cd19 antibody constructs for the treatment of b-cell related disorders
KR20060015602A (ko) 2003-05-31 2006-02-17 마이크로메트 에이지 ＥｐＣＡＭ 에 대한 이중 특이성 항체를 포함하는약학조성물
DE602004017726D1 (de) 2003-06-30 2008-12-24 Domantis Ltd Pegylierte Single-domain-antikörper (dAb)
CA2542046A1 (en) 2003-10-08 2005-04-21 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Fused protein composition
EP1705251A4 (en) 2003-10-09 2009-10-28 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd PROCESS FOR PRODUCING ANTIBODY COMPOSITION BY RNA INHIBITION OF FUNCTION OF $ G (A) 1,6-FUCOSYLTRANSFERASE
KR20120125634A (ko) 2003-10-16 2012-11-16 마이크로메트 에이지 다중특이적 탈면역화된 ｃｄ3-바인더
BRPI0416262B1 (pt) 2003-11-05 2022-04-12 Roche Glycart Ag Anticorpo anti-cd20 humano tipo ii humanizado, seu método de produção, seus usos, bem como polinucleotídeo isolado, vetor de expressão e composição farmacêutica
JPWO2005053742A1 (ja) 2003-12-04 2007-06-28 協和醗酵工業株式会社 抗体組成物を含有する医薬
US7235641B2 (en) 2003-12-22 2007-06-26 Micromet Ag Bispecific antibodies
US7785903B2 (en) 2004-04-09 2010-08-31 Genentech, Inc. Variable domain library and uses
UA94403C2 (ru) 2005-04-18 2011-05-10 Микромет Аг Человеческое моноклональное антитело, которое нейтрализует gm-csf
WO2007056441A2 (en) 2005-11-07 2007-05-18 Genentech, Inc. Binding polypeptides with diversified and consensus vh/vl hypervariable sequences
WO2007064919A2 (en) 2005-12-02 2007-06-07 Genentech, Inc. Binding polypeptides with restricted diversity sequences
ES2532124T3 (es) 2005-12-16 2015-03-24 Amgen Research (Munich) Gmbh Medios y procedimientos para el tratamiento de enfermedades tumorales
AR060871A1 (es) 2006-05-09 2008-07-16 Genentech Inc Union de polipeptidos con supercontigos optimizados
US20080226635A1 (en) 2006-12-22 2008-09-18 Hans Koll Antibodies against insulin-like growth factor I receptor and uses thereof
CN100592373C (zh) 2007-05-25 2010-02-24 群康科技(深圳)有限公司 液晶显示面板驱动装置及其驱动方法
US8959205B2 (en) 2009-07-31 2015-02-17 Hewlett-Packard Development Company, L.P. Method and system to recognize and inventory applications
WO2011038290A2 (en) 2009-09-25 2011-03-31 The U. S. A., As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Neutralizing antibodies to hiv-1 and their use
US8465743B2 (en) 2009-10-01 2013-06-18 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Anti-vascular endothelial growth factor receptor-2 chimeric antigen receptors and use of same for the treatment of cancer
WO2011046623A2 (en) 2009-10-16 2011-04-21 Duke University Hiv-1 antibodies
EP2618843B1 (en) 2010-09-24 2016-12-07 International Aids Vaccine Initiative Novel hiv-1 broadly neutralizing antibodies
PH12013501201A1 (en) 2010-12-09 2013-07-29 Univ Pennsylvania Use of chimeric antigen receptor-modified t cells to treat cancer
WO2012154312A1 (en) 2011-05-09 2012-11-15 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Neutralizing antibodies to hiv-1 and their use
US9783594B2 (en) 2011-05-17 2017-10-10 The Rockefeller University Human immunodeficiency virus neutralizing antibodies and methods of use thereof
US9890207B2 (en) 2011-07-25 2018-02-13 California Institute Of Technology Highly active agonistic CD4 binding site anti-HIV antibodies (HAADS) comprising modified CDRH2 regions that improve contact with GP120
US9868774B2 (en) 2011-10-20 2018-01-16 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Anti-CD22 chimeric antigen receptors
CA2858716C (en) 2011-12-08 2021-10-12 Peter D. Kwong Neutralizing antibodies to hiv-1 and their use
WO2013090644A2 (en) 2011-12-13 2013-06-20 California Institute Of Technology Anti-hiv antibodies having increased potency and breadth
WO2013126726A1 (en) 2012-02-22 2013-08-29 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Double transgenic t cells comprising a car and a tcr and their methods of use
WO2013142324A1 (en) 2012-03-23 2013-09-26 Usa, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Neutralizing antibodies to hiv-1 and their use
WO2013163427A1 (en) 2012-04-25 2013-10-31 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Antibodies to treat hiv-1 infection
MX361337B (es) 2012-07-13 2018-12-04 Roche Glycart Ag Anticuerpos biespecificos anti-factor de crecimiento endotelial vascular humano (vegf) / anti-angiopoyetina-2 humana (ang-2) y su uso en el tratamiento de enfermedades vasculares oculares.
WO2014043386A1 (en) 2012-09-12 2014-03-20 Duke University Clonal lineage antibodies
WO2015103549A1 (en) 2014-01-03 2015-07-09 The United States Of America, As Represented By The Secretary Department Of Health And Human Services Neutralizing antibodies to hiv-1 env and their use
HRP20200583T1 (hr) 2015-03-20 2020-07-10 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Protutijela koja neutraliziraju gp120 i njihova upotreba

Also Published As

Publication number Publication date
PT3271389T (pt) 2020-05-13
EP3683233A1 (en) 2020-07-22
SI3271389T1 (sl) 2020-09-30
EP3271389A1 (en) 2018-01-24
US10562960B2 (en) 2020-02-18
CA2980005A1 (en) 2016-09-29
WO2016154003A1 (en) 2016-09-29
HRP20200583T1 (hr) 2020-07-10
ES2789348T3 (es) 2020-10-26
CN108137676A (zh) 2018-06-08
CN108137676B (zh) 2022-03-15
AU2016235541A1 (en) 2017-09-28
PL3271389T3 (pl) 2020-08-10
DK3271389T3 (da) 2020-04-27
SMT202000255T1 (it) 2020-07-08
US20200231658A1 (en) 2020-07-23
CY1123068T1 (el) 2020-11-25
US20250179154A1 (en) 2025-06-05
ZA201706155B (en) 2022-05-25
US12202886B2 (en) 2025-01-21
US20250215068A1 (en) 2025-07-03
WO2016154003A8 (en) 2016-10-27
EP4620530A3 (en) 2025-12-24
AU2016235541B2 (en) 2021-04-01
US20180298083A1 (en) 2018-10-18
US20210324053A1 (en) 2021-10-21
US20230060304A1 (en) 2023-03-02
EP3271389B1 (en) 2020-02-12
LT3271389T (lt) 2020-05-25
HUE049081T2 (hu) 2020-09-28
EP3271389B8 (en) 2020-04-22
EP4620530A2 (en) 2025-09-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US12202886B2 (en) Neutralizing antibodies to GP120 and their use
CN104080805B (zh) gp41中和性抗体及其用途
CN108676091B (zh) Hiv-1的中和抗体及其用途
WO2016196975A1 (en) Neutralizing antibodies to hiv-1 env and their use
WO2015103549A1 (en) Neutralizing antibodies to hiv-1 env and their use
EP4011911A1 (en) Neutralizing antibodies to hiv-1 gp41 and their use
US10273288B2 (en) Neutralizing antibodies to Ebola virus glycoprotein and their use
WO2013142324A1 (en) Neutralizing antibodies to hiv-1 and their use
WO2013163427A1 (en) Antibodies to treat hiv-1 infection
EP3755713A1 (en) Neutralizing antibodies to hiv-1 env and their use
US20230272048A1 (en) Hiv-1 antibodies
HK40057872A (en) Neutralizing antibodies to ebola virus glycoprotein and their use