RS60181B1 - Terapeutska upotreba morfogenetskih proteina kosti - Google Patents

Description

Opis pronalaska

Polje pronalaska

Predmetni pronalazak se odnosi na polipeptid koji je varijanta morfogenetskog proteina kosti 9 (BMP9) bez osteogene aktivnosti, za upotrebu u lečenju vaskularne bolesti ili respiratorne bolesti. Predmetni pronalazak se takođe odnosi na nove varijante BMP9 i na farmaceutske preparate koji sadrže navedene polipeptide.

Pozadina pronalaska

Vaskularna bolest je patološko stanje velikih i srednjih mišićnih arterija, a pokreće je disfunkcija endotelnih ćelija. Pod dejstvom faktora kao što su patogeni, oksidovane LDL čestice i drugi stimulusi zapaljenja, endotelne ćelije se aktiviraju. To dovodi do promena njihovih svojstava: endotelne ćelije počinju da luče citokine i hemokine i da eksprimiraju adhezivne molekule na svojoj površini. Ovo, zatim, dovodi do pokretanja belih krvnih zrnaca (monocita i limfocita) koji mogu da prođu kroz zid krvnih sudova. Stimulacija sloja glatkih mišićnih ćelija citokinima koje luče endotelne ćelije i pokrenuta bela krvna zrnca dovode do proliferacije ćelija glatkog mišićnog tkiva i njihove migracije ka lumenu krvnog suda. Ovaj proces dovodi do zadebljanja zida krvnog suda, formiranjem plaka koji se sastoji od glatkih mišićnih ćelija koje se množe, makrofaga i različitih vrsta limfocita. Ovaj plak dovodi do ometanja cirkulacije, što opet dovodi do smanjenja količine kiseonika i hranljivih sastojaka koji stižu do ciljnog organa. U poslednjim stadijumima, plak može i da pukne, što dovodi do nastanka krvnih ugrušaka i, posledično, do srčanih i moždanih udara.

Respiratorna bolest je medicinski izraz koji obuhvata patološka stanja koja utiču na organe i tkiva koji omogućavaju razmenu gasova kod viših organizama, a obuhvata stanja gornjeg respiratornog trakta, dušnika, bronhija, bronhiola, alveola, pleure i pleuralne šupljine, kao i nerve i mišiće uključene u disanje. Respiratorne bolesti se kreću od blagih i samoograničavajućih, kao što je obična prehlada, do smrtonosnih kao što su bakterijska pneumonija, embolija pluća i rak pluća.

Plućna arterijska hipertenzija (PAH) je retka vaskularna bolest za koju trenutno nema leka. Nasledna i idiopatska plućna arterijska hipertenzija (PAH) odlikuje se suženjem i obliteracijom prekapilarnih plućnih arterija, kao sekundarnom pojavom nakon proliferacije ćelija glatkog mišićnog tkiva, fibroblasta i endotelnih ćelija i njihove rezistencije na apoptozu (Morrell et al (2009) J Am Coll Cardiol 54, S20-31). Posledično povećanje plućnog vaskularnog otpora dovodi do velikog povećanja plućnog arterijskog pritiska, što dovodi do hipertrofije desne komore i, konačno, do smrti usled otkazivanja desne strane srca (Gaine & Rubin (1998) Lancet 352, 719-725).

Identifikacija mutacija heterozigotne germinacione linije u genu koji kodira receptor za morfogenetski protein kosti tipa II (BMPR-II) 2000. godine (Lane et al, Nat Genet 26, 81-84 (2000); Deng et al (2000) Am J Hum Genet 67, 737-744) dovela je do značajnih uvida u patobiologiju nasledne PAH. Naknadne studije takođe su identifikovale BMPRII mutacije u 15-40% slučajeva idiopatske PAH (Thomson et al (2000) J Med Genet 37, 741-745), kao i smanjenu ekspresiju BMPR-II kao odliku negenetskih PAH kod ljudi (Atkinson et al (2002) Circulation 105, 1672-1678) i u životinjskim modelima (Long et al (2009) Circulation 119, 566-576).

Genetski dokazi takođe snažno ukazuju da su epitelne ćelije ključni tip ćelija za pokretanje PAH. Prethodne studije su pokazale da je uslovna delecija BMPR-II u endotelu dovoljna da bi pokrenula PAH kod određenog dela miševa (Hong et al (2008) Circulation 118, 722-730) i da ponovno uspostavljanje endotelne BMPR-II signalizacije u modelima kod glodara sprečava ili u potpunosti preokreće eksperimentalnu plućnu hipertenziju (Reynolds et al (2012) Eur Respir J 39, 329-343; Reynolds et al (2007) Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 292, L1182-1192; Spiekerkoetter et al (2013) J Clin Invest 123, 3600-3613).

Nešto su novije studije koje su pokazale da selektivno pojačanje endotelnog BMPR-II pomoću BMP9 dovodi do reverzije plućne arterijske hipertenzije (Long et al (2015) Nature Medicine 21, 777-785). Uz to, sada su objavljene mutacije receptora tipa I, ALK-1 (Trembath et al (2001) N Engl J Med 345, 325-334), i dodatnog proteina receptora tipa III, endoglina (Harrison et al (2003) J Med Genet 40, 865-871), kod pacijenata sa PAH, pri čemu se oba ova proteina skoro ekskluzivno eksprimiraju u endotelu. Uprkos ovim dokazima, precizna priroda endotelne disfunkcije u patobiologiji PAH i učešće BMP signalizacije u ovom procesu i dalje su predmeti rasprava. Iako se ustaljena PAH odlikuje preteranom klonskom proliferacijom endotelnih ćelija pluća (Yeager et al (2001) Circ Res 88, E2-E11) kao dela ćelijskih lezija koje dovode do opstrukcije, početak patologije bolesti i kod ljudi (Teichert-Kuliszewska et al (2006) Circ Res 98, 209-217) i u životinjskim modelima bolesti (Wilson et al (1992) Crit Rev Toxicol 22, 307-325; Taraseviciene-Stewart et al (2001) Faseb J 15, 427-438) je doveden u vezu sa paradoksalnim povećanjem apoptoze endotelnih ćelija. Dodatne studije su identifikovale ulogu gubitka endotelnog BMPR-II kod pogoršanja vaskularne propustljivosti i promena u translokaciji leukocita kroz zidove krvnog suda (Burton et al (2011) Blood 117, 333-341; Burton et al (2011) Blood 118, 4750-4758; Kim et al (2013) Arterioscler Thromb Vasc Biol 33, 1350-1359).

Iako su in vitro studije, koje su koristile mišićne ćelije glatkih mišića plućnih arterija (PASMC ćelije), pokazale da povećanje koncentracije liganda za BMP može da prevlada nad gubitkom funkcije koja se dovodi u vezu sa mutacijama u signalnom putu BMP-a (Yang et al (2008) Circ Res 102, 1212-1221), do današnjeg dana, ni jedna studija nije terapeutski primenila BMP ligand in vivo da bi obezbedila dokaz o konceptu takvog pristupa u lečenju PAH. Kompleksnost signalne familije BMP, koja se sastoji od četiri receptora tipa II, pet receptora tipa I i preko 20 BMP liganada (Miyazono et al (2005) Cytokine Growth Factor Rev 16, 251-263) mogla bi da ukaže na razlog nedostatka takvih studija. Identifikacija odgovarajućeg liganda za selektivno ciljanje plućnog endotela predstavlja značajan izazov. Nedavno je pronađeno da BMPR-II gradi signalni kompleks sa ALK-1 i prenosi signal specifično, u odgovor na BMP9 i 10, u ćelijama mikrovaskularnog endotela (David et al (2007) Blood 109, 1953-1961).

WO 2005/113590 opisuje upotrebu BMP10 agonista za tretman srčanih poremećaja. WO 2013/152213 opisuje upotrebu BMP9 i(li) BMP 10 polipeptida za povećanje koncentracija crvenih krvnih zrnaca i(li) hemoglobina kod kičmenjaka. WO 2006/130022 opisuje agonist ili antagonist BMPRII koji je koristan u modulaciji folikulogeneze i stope ovulacije kod ženki sisara. WO 2010/114833 opisuje farmaceutske preparate za lečenje srčanih bolesti koji podrazumevaju morfogenetski protein kosti. WO 94/26893 opisuje BMP-10 proteine, procese za njihovu proizvodnju i njihovu upotrebu u lečenju defekata kosti i hrskavice i kod zarastanja rana i sličnih zarastanja tkiva. WO 95/24474 i WO 96/39431 opisuju humani BMP-10 polipeptid i DNK (RNK) koje kodiraju takav polipeptid a za koje se tvrdi da su korisni u indukciji de novo formiranja kosti. WO 93/00432 i WO 95/33830 opisuju BMP-9 proteine, procese za njihovu proizvodnju i njihovu upotrebu u lečenju defekata kosti i hrskavice i kod zarastanja rana i sličnih zarastanja tkiva, kao i kod rasta i poboljšanja funkcije jetre. WO 2010/115874 opisuje postupke za lečenje plućne arterijske hipertenzije primenom apelina/lekova koji ciljaju APJ. WO 2009/114180 i WO 2014/160203 opisuju niskomolekularne inhibitore BMP signalizacije za koje se tvrdi da su korisni u modulaciji ćelijskog rasta, diferencijacije, proliferacije i apoptoze te da bi zbog toga mogli da budu korisni u lečenju bolesti ili stanja koja se dovode u vezu sa BMP signalizacijom, uključujući zapaljenje, kardiovaskularne bolesti, hematološke bolesti, kancer i poremećaje kostiju, kao i za modulisanje ćelijske diferencijacije i(li) proliferacije. Za niskomolekulske inhibitore se takođe tvrdi da su korisni u smanjenju koncentracije ApoB-100 ili LDL u krvi i u lečenju i(li) prevenciji stečene ili kongenitalne hiperholesterolemije ili hiperlipoproteinemije; bolesti, poremećaja ili sindroma koji se dovode u vezu sa defektima apsorpcije ili metabolizma lipida; ili bolesti, poremećaja ili sindroma izazvanih hiperlipidemijom.

Stoga postoji potreba da se obezbedi delotvorno lečenje vaskularnih i respiratornih bolesti, a posebno plućne arterijske hipertenzije (PAH).

Kratak opis pronalaska

Prvim rešenjem prema predmetnom pronalasku, obezbeđen je polipeptid odabran iz grupe koja se sastoji od varijante morfogenetskog proteina kosti 9 (BMP9) kojoj nedostaje osteogena aktivnosti i forme BMP9 vezane za prodomen (pro.BMP9) za upotrebu u lečenju vaskularne bolesti ili respiratorne bolesti.

Dodatna rešenja i odlike predmetnog pronalaska navedeni su u priloženim patentnim zahtevima, a detaljno su opisani u tekstu koji sledi.

U daljem rešenju prema predmetnom pronalasku, obezbeđena je varijanta BMP9 koja ima aminokiselinsku sekvencu iz sekv. sa ID br.: 5.

U daljem rešenju prema predmetnom pronalasku, obezbeđena je varijanta BMP9 koja ima aminokiselinsku sekvencu iz sekv. sa ID br.: 6.

U daljem rešenju prema predmetnom pronalasku obezbeđen je farmaceutski preparat koji sadrži BMP9 varijante definisane u opisu.

Kratak opis slika

Slika 1. Ekspresioni vektor i sistem za pro.BMP9 i pro.BMP10.

Slika 2. Generisanje neosteogenih varijanti BMP9. A. Šematski crtež sinteze BMP9 i post-translaciona obrada. B-D. Dve varijante BMP9 (D366A i D408A) imaju signalnu aktivnost koja je uporediva sa onom koju ima divlji tip u endotelnim ćelijama, pri indukciji ID1 i ID2 ekspresije (B&C), ali im nedostaje osteogenetska signalna aktivnost u C2C12 ćelijama (D).

Slika 3. Poređenje signalne aktivnosti endotelnih ćelija i C2C12 ćelijske osteogenetske aktivnosti između BMP9 i BMP10. A-C: BMP9 i BMP10 imaju sličnu HMEC-1 signalnu aktivnost. Nakon izgladnjivanja serumom, HMEC-1 ćelije su tretirane sa BMP9 ili BMP10 u naznačenim koncentracijama. 8 časova nakon tretmana, izvršena je ekstrakcija iRNK pa su, pomoću kvantitativnog PCR-a, izvršena merenja ekspresionih nivoa ID1, ID2 ili BMPR-II. β2-mikroglobulin je korišćen kao kontrola, a umnožak promene u odnosu na netretirane uzorke unesen je na grafik. Prikazana je srednja vrednost ± SEM, N=2; D. Slično kao kod BMP9, BMP10 takođe pokazuje zaštitno dejstvo ka hPAEC od apoptoze indukovane TNFα-CHX. Postupci su kao na slikama 3A, N=1; E. BMP9 i BMP10 inhibiraju proliferaciju endotelnih ćelija u uporedivoj meri. HPAEC su tretirane sa BMP9 ili BMP10 (oba nabavljena od R&D Systems) u EBM2/2% FBS u toku 24 časa. Ćelije su inkubirane sa 0,5 μCi/polju<3>H-timidina još 6 časova. Ćelije su potom lizirane, pa je mereno preuzimanje<3>H-timidina na tečnom scintilacionom brojaču. N=1 eksperiment, srednja vrednost ± SEM za četiri polja. F. Za razliku od BMP9, BMP10 nema osteogenu aktivnost koja bi se mogla detektovati, a koja se meri kao aktivnost ALP u C2C12 ćelijama. C2C12 ćelije su tretirane sa BMP9 ili BMP10 u navedenim koncentracijama, tokom 64 časa. Ćelije su lizirane u rastvoru 1% Triton X-100/PBS pa je merena ALP aktivnost u lizatu ćelija pomoću hromogenog supstrata fosfataze, dinatrijumove soli 4-nitrofenil fosfata (Sigma, S0942), pa je rastvorljivi proizvod određivan očitavanjem na 405 nm na čitaču ploča. U svim testovima, i BMP9 i BMP10 su nabavljeni preko R&D Systems. Pro.BMP9 je proizveden u našoj laboratoriji i njegova koncentracija (zrelog liganda) je određena preko ELISA testa, u kome je korišćen BMP9 od R&D Systems kao standard.

Slika 4. Pro.BMP10 generisan u našoj laboratoriji je potpuno aktivan. A. Šematski crtež sinteze BMP10 i post-translacione obrade. B. Kondicionirana podloga za ekspresiju BMP10, blotovana anti-BMP10 antitelom (R&D Systems).

C. Neredukujuća SDS-PAGE prikazuje prečišćenje pro.BMP10 sa kolone za gel filtraciju S200. Identitet prodomena i BMP10 provereni su vestern blotom i mapiranjem peptida na osnovu masene spektrometrije. D&E. Poređenje kapaciteta za signalizaciju pro.BMP10 sa BMP9 i BMP10 (dobavljač R&D Systems) u HMEC-1, praćenjem fosforilacije Smad1/5/8 i ekspresije gena ID1/2/3. Postupci su kao što je prikazano na slici 3A do C. Koncentracije BMP na D su 0,05, 0,1, 1, 5 ng/ml a vreme tretmana je 1 čas. Prikazana je srednja vrednost ± SEM, N = 2.

Slika 5. Pregled skeniranja mutageneze za BMP9 alanin. Dvadeset četiri varijante BMP9 su generisane i testirane i na HMEC-1 ćelijama na indukciju ID1 gena i na C2C12 ćelijama na aktivnost alkalne fosfataze. Svi rezultati su normalizovani na divlji tip (WT) BMP9 i prikazan je prosek od tri eksperimenta. ’-’ označava netretirane ćelije.

Slika 6. Varijante BMP mogu da indukuju ekspresiju BMPR2 gena u hPAEC ćelijama. Slika 7. Varijanta BMP D408A može da spreči ranu apoptozu indukovanu pomoću TNFa/CHX u hPAECs.

Slika 8. BMP9 i BMP10 inhibiraju formaciju cevčica endotelijalnih ćelija izrastanja krvi (BOEC) u matriksu kolagen:fibronektin. (A) Reprezentativne slike BOEC cevčica u kolagenom gelu obojenih DAPI i FITC-ULEX bojama. Grade se mreže ako se one nalaze same u podlozi (2% BBM2 = EBM2 koja sadrži 2% FBS). Dodavanjem sve većih koncentracija BMP9 inhibira se formiranje BOEC mreža. (B) Kvantitativno određivanje parametara BOEC mreža određeno za 3 odvojena eksperimenta koji pokazuju da BMP9 inhibira dužinu i broj cevčica, grananje i formiranje petlji, i to na način koji zavisi od koncentracije. (C) BMP9 i BMP10 - oba liganda inhibiraju formiranje BOEC cevčica.

Detaljan opis pronalaska

Prvim rešenjem prema predmetnom pronalasku, obezbeđen je polipeptid odabran iz grupe koja se sastoji od morfogenetskog proteina kosti 9 (BMP9), varijante kojoj nedostaje osteogena aktivnost i forme BMP9 vezane za prodomen (pro.BMP9) za upotrebu u lečenju vaskularne bolesti ili respiratorne bolesti.

Predmetni pronalazak je usmeren na terapeutsku upotrebu morfogenetskih proteina kosti koji zadržavaju signalnu aktivnost endotelnih ćelija (na primer, kao što se može videti iz indukcije ekspresije gena ID1, ID2 i(li) BMPR-II), ali im nedostaje osteogena aktivnost (na primer, koja se može meriti preko aktivnosti alkalne fosfataze (ALP) u ćelijskoj liniji mioblasta miševa C2C12). Na primer, BMP10 i BMP9 varijante koje su ovde opisane ne samo što zadržavaju aktivnost signalizacije endotelnih ćelija, već su sinergijski oslobođene osteogene aktivnosti. Tako nativne varijante BMP10 i BMP9 koje su ovde opisane predstavljaju poželjnijeg agonistu od nativnog BMP9 za tretman vaskularne bolesti ili respiratorne bolesti, konkretnije PAH, zbog toga što im nedostaje sposobnost da promovišu formiranje koštanog tkiva.

Reference i pozivanja na "BMP10" i "morfogenetski protein kosti 10" odnose se na humani polipeptid koji pripada TGF-β superfamiliji proteina, a koji je kodiran BMP10 genom (koji ima sekvencu koja je prikazana u sekv. sa ID br.: 1) i koji ima sekvencu od 424 aminokiseline prikazane u sekv. sa ID br. 2, gde aminokiselinski ostaci 1 do 21 čine signalni peptid, aminokiselinski ostaci 22 do 316 čine propeptid i aminokiselinski ostaci 317 do 424 čine zreli BMP10.

Reference i pozivanja na varijantu "BMP9" i "varijantu morfogenetskog proteina kosti 9" odnose se na humani polipeptid koji pripada TGF- ® superfamiliji proteina, a koji je kodiran BMP9 genom (koji ima sekvencu koja je prikazana u sekv. sa ID br.: 3) i koji ima sekvencu od 429 aminokiselina prikazanih u sekv. sa ID br. 4, gde aminokiselinski ostaci 1 do 22 čine signalni peptid, aminokiselinski ostaci 23 do 319 čine propeptid i aminokiselinski ostaci 320 do 429 čine zreli BMP9. Da bi se izbegla bilo kakva sumnja, trebalo bi naglasiti da varijanta BMP9 mora da zadrži signalnu aktivnost za endotelne ćelije ali da joj mora nedostajati osteogena aktivnost.

Pozivanja na "varijantu" odnose se na genetsku varijaciju nativnog, nemutiranog ili divljeg tipa sekvence BMP9.

Primeri takvih genetskih varijacija obuhvataju mutacije odabrane iz grupe koja se sastoji od: supstitucija, delecija, insercija i sličnih.

Pozivanja na "nedostaje joj (mu) osteogene aktivnosti" ili "bez osteogene aktivnosti" kada se koriste u predmetnoj prijavi odnose se na varijantu BMP9 koja sadrži jednu ili veći broj mutacija iz sekv. sa ID br.: 4 koje dovode do eliminacije, minimizacije i(li) supresije osteogene aktivnosti (na primer, koja može da se meri pomoću aktivnosti alkalne fosfataze (ALP) u ćelijskoj liniji mioblasta miša C2C12). Poželjne varijante BMP9 su one koje zadržavaju signalizaciju specifičnu za endotelne ćelije (tj. one koje imaju najmanje 0,75 x indukciju ID1 u poređenju sa BMP9 divljeg tipa, mereno pomoću ekspresije ID1 u HMEC-1 ćelijama) i koje imaju nižu vrednost za osteogenu aktivnost (tj. manje od 0,5 x u poređenju sa BMP9 divljeg tipa, mereno pomoću aktivnosti ALP u ćelijskoj liniji mioblasta miša C2C12).

Još poželjnije varijante BMP9 su one koje zadržavaju signalizaciju specifičnu za endotelne ćelije (tj. one koje imaju najmanje 0,75 x indukciju ID1 u poređenju sa BMP9 divljeg tipa, mereno pomoću ekspresije ID1 u HMEC-1 ćelijama) i koje imaju zanemarljivo malu osteogenu aktivnost (tj. manje od 0,1 x u poređenju sa BMP9 divljeg tipa, mereno pomoću aktivnosti ALP u ćelijskoj liniji mioblasta miša C2C12).

Najpoželjnije varijante BMP9 su one koje zadržavaju signalizaciju specifičnu za endotelne ćelije (tj. one koje imaju veću indukciju ID1 u poređenju sa BMP9 divljeg tipa, mereno pomoću ekspresije ID1 u HMEC-1 ćelijama) i koje imaju zanemarljivo malu osteogenu aktivnost (tj. manje od 0,1 x u poređenju sa BMP9 divljeg tipa, mereno pomoću aktivnosti ALP u ćelijskoj liniji mioblasta miša C2C12).

U jednom rešenju, vaskularna bolest je izabrana iz grupe koja se sastoji od: plućne hipertenzije; plućne arterijske hipertenzije; nasledne hemoragične telangiektazije; arteroskleroze; i hepatopulmonalnog sindroma.

U daljem rešenju, vaskularna bolest je izabrana iz grupe koja se sastoji od: plućne hipertenzije; plućne arterijske hipertenzije; nasledne hemoragične telangiektazije; i hepatopulmonalnog sindroma.

U još daljem rešenju, vaskularna bolest je odabrana iz grupe koja se sastoji od plućne arterijske hipertenzije.

U jednom rešenju, respiratorna bolest je izabrana iz grupe koja se sastoji od: opstruktivnih bolesti pluća kao što su hronična opstruktivna bolest pluća (COPD), hronični bronhitis i emfizem; plućnih vaskularnih bolesti kao što su plućni edem i plućna hemoragija; otkazivanja respiratorne funkcije i sindroma respiratornog distresa, kao što su akutna povreda pluća i sindrom akutnog respiratornog distresa; kao i intersticijalnih bolesti pluća, kao što je idiopatska plućna fibroza.

U predmetnom opisu, polipeptid može da bude BMP10. Predmetni pronalazak obezbeđuje BMP10 za upotrebu u lečenju vaskularne bolesti ili respiratorne bolesti. U predmetnom opisu obezbeđeni su podaci koji pokazuju da je BMP10 podjednako snažan kao BMP9 u indukciji ekspresije ID1, ID2 i BMPR-II gena (videti slike 3A do 3C). Štaviše, ovde je pokazano da BMP10 pokazuje istu anti-apoptotsku aktivnost kao i BMP9 u zaštiti hPAEC ćelija od apoptoze indukovane TNFα-CHX (videti sliku 3D). Međutim, ono što je od suštinskog značaja je da BMP10 nije indukovao nikakvu ALP aktivnost, ni pri najvišim ispitanim koncentracijama (videti sliku 3F), za razliku od BMP9.

BMP10 može da sadrži aminokiselinsku sekvencu iz Sekv. sa ID br.: 2.

Polipeptid prema predmetnom pronalasku može da bude BMP10 koji je kodiran nukleotidnom sekvencom iz Sekv. sa ID br.: 1.

Polipeptid prema predmetnom pronalasku može da bude forma BMP10 vezana za prodomen (pro.BMP10). Ovde su obezbeđeni podaci koji pokazuju da je pro.BMP10 kompleks veoma stabilan (videti slike 4B i 4C) i da je verovatno da je on poželjan oblik za tretman vaskularnih i respiratornih bolesti kao što je PAH.

Pro.BMP10 prema predmetnom pronalasku može da sadrži propeptidnu sekvencu koja ima aminokiselinsku sekvencu sa ostacima 22-316 iz Sekv. sa ID br.: 2 nekovalentno vezanu za sekvencu zrelog BMP10 koja ima aminokiselinsku sekvencu sa ostacima 317-424 iz Sekv. sa ID br.: 2.

Pro.BMP10 prema predmetnom pronalasku može da podrazumeva tetramer koji sadrži dve od navedenih propeptidnih sekvenci i dve od navedenih zrelih sekvenci BMP10.

U jednom rešenju, polipeptid je varijanta BMP9 kojoj nedostaje osteogena aktivnost. Tako, prema daljem rešenju predmetnog pronalaska obezbeđena je BMP9 varijanta kojoj nedostaje osteogena aktivnost za upotrebu u lečenju vaskularne bolesti ili respiratorne bolesti.

U daljem rešenju, navedeni polipeptid je varijanta forme BMP9 vezane za prodomen (pro.BMP9).

U daljem rešenju, navedena varijanta pro.BMP9 sadrži varijantu: propeptidne sekvence koja ima aminokiselinsku sekvencu sa ostacima 23-319 iz Sekv. sa ID br.: 4 nekovalentno vezanu za zrelu sekvencu BMP9 koja ima aminokiselinsku sekvencu sa ostacima 320-429 iz Sekv. sa ID br.: 4.

U daljem rešenju, varijanta pro.BMP9 podrazumeva tetramer koji sadrži dve od navedenih propeptidnih sekvenci i dve od navedenih zrelih sekvenci BMP9.

U jednom rešenju, varijanta BMP9 kojoj nedostaje osteogena aktivnost podrazumeva supstitucioni, delecioni ili insercioni mutant aminokiselinske sekvence iz Sekv. sa ID br.: 4.

U daljem rešenju, varijanta BMP9 kojoj nedostaje osteogena aktivnost podrazumeva supstitucioni mutant aminokiselinske sekvence iz Sekv. sa ID br.: 4.

U daljem rešenju, supstitucioni mutant aminokiselinske sekvence iz Sekv. sa ID br.: 4 sadrži jednu ili veći broj (tj. jednostruku, dvostruku, trostruku mutaciju itd.) sledećih supstitucija: H326A, D342A, S343A, W344A, I346A, K349A, F362A, D366A, K372A, I375A, L379A, H381A, L382A, K383A, K390A, S402A, L404A, K406A, D408A, V411A, T413A, L414A, Y416A i Y418A.

U daljem rešenju, varijanta BMP9 kojoj nedostaje osteogena aktivnost odabrana iz grupe koja se sastoji od sledećih varijanti Sekv. sa ID br.: 4: H326A, D342A, S343A, W344A, I346A, K349A, F362A, D366A, K372A, I375A, L379A, H381A, L382A, K383A, K390A, S402A, L404A, K406A, D408A, V411A, T413A, L414A, Y416A i Y418A.

U daljem rešenju, supstitucioni mutant aminokiselinske sekvence iz Sekv. sa ID br.: 4 sadrži jednu ili veći broj (tj. jednostruku, dvostruku, trostruku mutaciju itd.) sledećih supstitucija: H326A, S343A, K349A, F362A, D366A, I375A, L379A, L382A, K390A, S402A, D408A, Y416A i Y418A.

U daljem rešenju, BMP9 varijanta kojoj nedostaje osteogena aktivnost odabrana je iz grupe koja se sastoji od sledećih varijanti Sekv. sa ID br.: 4: H326A, S343A, K349A, F362A,

1

D366A, I375A, L379A, L382A, K390A, S402A, D408A, Y416A i Y418A. U predmetnoj prijavi izneseni su podaci koji pokazuju da ove mutirane sekvence zadržavaju blagotvorna dejstva specifične endotelne signalizacije i imaju značajno smanjenu osteogenu signalizaciju (što se vidi iz najmanje 0,75 x indukcije ID1 i manje od 0,5 x ALP aktivnosti u poređenju sa BMP9 divljeg tipa na slici 5).

U daljem rešenju, supstitucioni mutant aminokiselinske sekvence iz Sekv. sa ID br.: 4 sadrži jednu ili veći broj (tj. jednostruku, dvostruku, trostruku mutaciju itd.) sledećih supstitucija: F362A, D366A, I375A, L379A, S402A, D408A, Y416A i Y418A.

U daljem rešenju, varijanta BMP9 kojoj nedostaje osteogena aktivnost odabrana je iz grupe koja se sastoji od sledećih varijanti BMP9 Sekv. sa ID br.: 4: F362A, D366A, I375A, L379A, S402A, D408A, Y416A i Y418A. U predmetnoj prijavi izneseni su podaci koji pokazuju da ove mutirane sekvence zadržavaju blagotvorna dejstva specifične endotelne signalizacije ali nemaju osteogenu signalizaciju (što se vidi iz najmanje 0,75 x indukcije ID1 i zanemarljive (tj. manje od 0,1 x ) ALP aktivnosti u poređenju sa BMP9 divljeg tipa na slici 5).

U daljem rešenju, supstitucioni mutant aminokiselinske sekvence iz Sekv. sa ID br.: 4 sadrži jednu ili obe (tj. jednostruku ili dvostruku mutaciju) sledećih supstitucija: D366A ili D408A.

U daljem rešenju, varijanta BMP9 kojoj nedostaje osteogena aktivnost odabrana je iz grupe koja se sastoji od sledećih varijanti BMP9 Sekv. sa ID br.: 4: D366A ili D408A. U predmetnoj prijavi izneseni su podaci koji pokazuju da ove mutirane sekvence zadržavaju blagotvorna dejstva BMP9 ali nisu u stanju da pokrenu osteogenu signalizaciju i čime se uklanja potencijalni rizik nastanka koštanog tkiva kod in vivo primene BMP9 (videti rezultate prikazane na slici 2). U predmetnoj prijavi takođe su izneseni podaci koji pokazuju da ove mutirane sekvence imaju pojačanu specifičnu endotelnu signalizaciju ali nemaju osteogenu signalizaciju (što se vidi iz najmanje 1 x indukcije ID1 i zanemarljive (tj. manje od 0,1 x ) ALP aktivnosti u poređenju sa BMP9 divljeg tipa na slici 5).

U daljem rešenju, varijanta BMP9 kojoj nedostaje osteogena aktivnost odabrana je iz grupe koja se sastoji od D408A varijante BMP9 Sekv. sa ID br.: 4. U predmetnoj prijavi izneseni su podaci koji pokazuju da ove mutirane sekvence jesu u stanju da preokrenu ranu apoptozu indukovanu faktorom nekroze tumora α (TNFα) i cikloheksimidom (CHX) u PAEC ćelijama (videti rezultate prikazane na slici 7).

U daljem rešenju, varijanta BMP9 kojoj nedostaje osteogena aktivnost odabrana je iz grupe koja se sastoji od D366A varijante BMP9 koja sadrži aminokiselinsku sekvencu iz Sekv.

sa ID br.: 5 ili D408A varijante BMP9 koja sadrži aminokiselinsku sekvencu iz Sekv. sa ID br.: 6.

Treba imati u vidu da varijante BMP9 koje su ovde opisane predstavljaju prethodno nepoznate polipeptide koji, stoga, predstavljaju novo rešenje prema predmetnom pronalasku. Stoga, prema daljem rešenju predmetnog pronalaska, obezbeđena je varijanta BMP9 koja sadrži aminokiselinsku sekvencu iz sekv. sa ID br.: 5. U daljem rešenju prema predmetnom pronalasku obezbeđena je varijanta BMP9 koja sadrži aminokiselinsku sekvencu iz sekv. sa ID br.: 6.

Iako je moguće da se aktivni polipeptid primenjuje sam, poželjnije je da se on obezbedi u obliku farmaceutskog preparata (tj. formulacije). U jednom rešenju, reč je o sterilnom farmaceutskom preparatu.

Predmetni pronalazak dalje obezbeđuje farmaceutske preparate, kao što je prethodno definisano, kao i postupke za dobijanje farmaceutskih preparata koji podrazumevaju (npr. mešanje) najmanje jednog polipeptida prema predmetnom pronalasku sa jednim ili većim brojem farmaceutski prihvatljivih ekscipijenasa i, opciono, sa drugim terapeutskim ili profilaktičkim sredstvima.

Tako je, prema daljem rešenju predmetnog pronalaska, obezbeđen farmaceutski preparat koji sadrži varijantu BMP9 kojoj nedostaje osteogena aktivnost za upotrebu u lečenju vaskularne bolesti ili respiratorne bolesti.

Prema daljem rešenju predmetnog pronalaska obezbeđen je farmaceutski preparat koji sadrži BMP9 varijante koje su ovde definisane, kao što su D366A BMP varijanta koja sadrži aminokiselinsku sekvencu iz Sekv. sa ID br.: 5 ili D408A varijanta BMP9 koja sadrži aminokiselinsku sekvencu iz Sekv. sa ID br.: 6.

Farmaceutski prihvatljivi ekscipijens(i) mogu da budu izabrani iz grupe koja se sastoji od, na primer, nosilaca (npr. čvrstih, tečnih ili polučvrstih nosilaca), adjuvanasa, razblaživača, punilaca ili sredstava za povećanje zapremine, sredstava za granulisanje, obloga, sredstava za kontrolisanje otpuštanja, vezivnih sredstava, sredstava za dezintegraciju, lubrikanasa, konzervanasa, antioksidanasa, sredstava za puferisanje, sredstava za suspendovanje, zgušnjivača, aroma, zaslađivača, sredstava za maskiranje ukusa, stabilizatora ili bilo kojih drugih ekscipijenasa koji se obično koriste u farmaceutskim preparatima. Primeri ekscipijenasa za različite vrste farmaceutskih preparata detaljnije su navedeni u tekstu koji sledi.

Izraz "farmaceutski prihvatljiv", kada se koristi u predmetnoj prijavi, odnosi se na jedinjenja, materijale, preparate i(li) dozne oblike, koji su, u okviru razumnog medicinskog rasuđivanja, pogodni za upotrebu u kontaktu sa tkivima pacijenta (npr. čoveka) bez preterane toksičnosti, iritacije, alergijskih odgovora ili drugih problema ili komplikacija, u skladu sa razumnim odnosom dobrobiti i rizika. Svaki nosilac i ekspcipijens takođe mora da bude "prihvatljiv" u smislu toga da je kompatibilan sa drugim sastojcima u preparatu.

Farmaceutski preparati koji sadrže polipeptide prema predmetnom pronalasku mogu da budu formulisani u skladu sa poznatim tehnikama, videti, na primer, Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA, SAD.

Farmaceutski preparati mogu da budu u bilo kom obliku koji je pogodan za oralnu, parenteralnu, topijsku, intranazalnu, intrabronhijalnu, podjezičnu, oftalmičku, otičku, rektalnu, intravaginalnu ili transdermalnu primenu. Ukoliko su preparati namenjeni za parenteralnu primenu, mogu da se formulišu za intravensku, intramuskularnu, intraperitonealnu, potkožnu primenu ili za direktno dopremanje u ciljni organ ili tkivo injekcijom, infuzijom ili nekim drugim načinom dopremanja. Dopremanje može biti bolus injekcijom, kratkotrajnom infuzijom ili dugotrajnom infuzijom, i može da bude putem pasivnog dopremanja ili primenom infuzione pumpe ili šprica.

Farmaceutski preparati adaptirani za parenteralnu primenu obuhvataju vodene i nevodene sterilne rastvore za injekcije koji mogu da sadrže antioksidanse, pufere, bakteriostatska sredstva, surastvarače, površinski aktivna sredstva, smeše organskih rastvarača, sredstva za kompleksiranje ciklodekstrina, emulgatore (za formiranje i stabilizaciju emulzija), lipozomske sastojke za formiranje lipozoma, gelirajuće polimere za dobijanje polimernih gelova, zaštitna sredstva za liofilizaciju i kombinaciju sredstava za, između ostalog, stabilizaciju aktivnog sastojka u rastvornom obliku i za dovođenje formulacije do izotoničnosti sa krvlju nameravanog primaoca. Farmaceutski preparati za parenteralnu primenu takođe mogu da budu u obliku vodenih i nevodenih sterilnih suspenzija, koje mogu da sadrže sredstva za suspendovanje i zgušnjavanje (R. G. Strickly, Solubilizing Excipients in oral and injectable formulations, Pharmaceutical Research, Vol 21(2)2004, p 201-230).

Podrazumevaće se da je genska terapija koja se odnosi na varijante BMP9 obuhvaćena obimom zaštite predmetnog pronalaska. Na primer, vektor koji kodira varijantu nukleotidne sekvence BMP9 primenjuje se kod pacijenta, čoveka, čime se dobija endogena ekspresija (kao što je endogena ekspresija u jetri) varijante BMP9 polipeptida za otpuštanje u cirkulaciju. Tako, prema daljem rešenju predmetnog pronalaska, obezbeđen je vektor koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira BMP9 varijantu za upotrebu u lečenju vaskularne bolesti ili respiratorne bolesti. U predmetnoj prijavi, takav vektor može da sadrži nukleotidnu sekvencu iz Sekv. sa ID br.: 1.

1

U jednom rešenju, vektor je virusni vektor. U daljem rešenju, virusni vektor je izabran iz grupe koja se sastoji od: retrovirusa, adenovirusa, lentivirusa, virusa herpes simpleksa, vakcinija virusa i virusa koji se dovodi u vezu sa adenovirusima. U daljem rešenju, navedeni vektor je virus koji se dovodi u vezu sa adenovirusima.

U alternativnom rešenju, navedeni vektor je nevirusni vektor. Upotreba nevirusnih vektora ima nekoliko prednosti u odnosu na upotrebu virusnih vektora, kao što je jednostavnost proizvodnje u velikim razmerama i mala imunogeničnost kod domaćina.

Primeri postupaka nevirusne genske terapije obuhvataju: injekciju gole DNK, elektroporaciju, genske pištolje, sonoporaciju, magnetofekciju i upotrebu oligonukleotida, lipopleksa, dendrimera i neorganskih nano čestica.

Preparati mogu da budu obezbeđeni u pakovanjima sa pojedinačnim dozama ili sa više doza, na primer, u hermetički zatvorenim ampulama, bočicama i fabrički napunjenim špricevima, i mogu se čuvati u liofilizovanom stanju koje zahteva samo dodavanje sterilnog tečnog nosioca, na primer, vode za injekcije, neposredno pre upotrebe.

Farmaceutski preparat može da se dobije liofilizacijom polipeptida prema predmetnom pronalasku. Liofilizacija se odnosi na proceduru liofilizovanja preparata (sušenja smrzavanjem). Tako se izrazi liofilizacija i sušenje smrzavanjem u predmetnoj prijavi koriste kao sinonimi.

Injekcioni rastvori i suspenzije koje se pripremaju neposredno pred upotrebu mogu da se pripreme od sterilnih praškova, granula i tableta.

Farmaceutski preparati prema predmetnom pronalasku za parenteralno ubrizgavanje takođe mogu da sadrže farmaceutski prihvatljive sterilne vodene ili nevodene rastvore, disperzije, suspenzije ili emulzije kao i sterilne praškove za rekonstituciju u sterilne rastvore ili disperzije za ubrizgavanje neposredno pre upotrebe.

Primeri pogodnih vodenih i nevodenih nosilaca, razblaživača, rastvarača ili vehikuluma obuhvataju vodu, etanol, poliole (kao što su glicerol, propilen glikol, polietilen glikol i slični), karboksimetil celulozu i pogodne smeše ovih supstanci, biljna ulja (kao što su suncokretovo ulje, ulje šafrana, kukuruzno ulje ili maslinovo ulje) i organske estre za ubrizgavanje, kao što je etil oleat. Odgovarajuću fluidnost je moguće održati, na primer, upotrebom sredstava za zgušnjavanje ili oblaganje, kao što je lecitin, održavanjem potrebne veličine čestica u slučaju disperzija i upotrebom površinski aktivnih supstanci.

Preparati prema predmetnom pronalasku takođe mogu da sadrže adjuvanse kao što su konzervansi, sredstva za vlaženje, emulgatori i sredstva za dispergovanje. Prevencija dejstva mikroorganizama može se obezbediti uvođenjem različitih antibakterijskih i antifungalnih sredstava, na primer, parabena, hlorbutanola, fenola, sorbinske kiseline i slično. Može da bude poželjno uključiti sredstva za prilagođavanje toničnosti, kao što su šećer, natrijum hlorid i slična. Produžena apsorpcija farmaceutskog proizvoda koji se može primeniti ubrizgavanjem može da se dobije uvođenjem sredstava koje odlažu apsorpciju, kao što su aluminijum monostearat i želatin.

U jednom konkretnom rešenju prema predmetnom pronalasku, farmaceutski preparat je u obliku koji je pogodan za i. v. primenu, na primer, injekcijom ili infuzijom. Za intravensku primenu, rastvor može da se dozira u tom obliku, ili da se ubrizga u kesu za infuziju (koja sadrži farmaceutski prihvatljiv ekscipijens, kao što su 0,9% rastvor soli ili 5% rastvor dekstroze), pre primene.

U još jednom konkretnom rešenju, farmaceutski preparat je u obliku koji je pogodan za potkožnu (s. c., subkutanu) primenu.

Farmaceutski dozni oblici pogodni za oralnu primenu obuhvataju tablete (sa oblogom ili bez), kapsule (meke ili tvrde), kaplete, pilule, lozenge, sirupe, rastvore, praškove, granule, eliksire i suspenzije, sublingvalne tablete, oblande ili flastere, kao što su bukalni flasteri.

Tako preparati u obliku tablete mogu da sadrže pojedinačnu dozu aktivnog polipeptida i inertni razblaživač ili nosilac, kao što su šećer ili šećerni alkoholi, npr. laktoza, saharoza, sorbitol ili manitol; i(li) razblaživači koji nisu izvedeni iz šećera, kao što su natrijum karbonat, kalcijum fosfat, kalcijum karbonat ili celuloza ili njeni derivati, kao što su mikrokristalna celuloza (MCC), metil celuloza, etil celuloza, hidroksipropil metil celuloza i skrobovi kao što je kukuruzni skrob.

Tablete takođe mogu da sadrže takve standardne sastojke kao što su sredstva za vezivanje i granulisanje, kao što su polivinilpirolidon, sredstva za dezintegraciju (npr. unakrsno povezani polimeri koji bubre, kao što je karboksimetil celuloza), lubrikansi (npr. stearati), konzervansi (npr. parabeni), antioksidansi (npr. BHT), puferi (na primer, fosfatni ili citratni puferi i efeverscentna sredstva, kao što su smeše citrata i bikarbonata. Takvi ekscipijensi su dobro poznati i nije potrebno detaljno ih opisivati ovde.

Tablete mogu da budu projektovane ili tako da se lek otpušta odmah nakon dolaska u dodir sa stomačnim tečnostima (tablete sa trenutnim otpuštanjem) ili tako da se otpušta na kontrolisan način (tablete sa kontrolisanim otpuštanjem) u toku dužeg vremenskog perioda ili u određenom delu GI trakta.

Kapsule mogu biti od tvrdog želatina ili od mekog želatina, i mogu da sadrže aktivni sastojak u čvrstom, polučvrstom ili tečnom obliku. Želatinske kapsule mogu da se formiraju od životinjskog želatina ili njegovih ekvivalenata biljnog ili sintetskog porekla.

1

Čvrsti dozni oblici (npr. tablete, kapsule itd) mogu da budu obloženi ili neobloženi. Obloge mogu da deluju ili kao zaštitni film (npr. polimer, vosak ili lak) ili kao mehanizam kontrole otpuštanja lekova, ili u estetske svrhe ili za namene identifikacije. Obloga (npr. polimer tipa Eudragit<TM>) može da bude projektovan tako da otpušta aktivnu komponentu na željenom mestu unutar gastrointestinalnog trakta. Tako obloga može da bude izabrana tako da se razlaže na određenom pH unutar gastrointestinalnog trakta, čime može selektivno da otpusti polipeptid ili u želucu, ili u ileumu, duodenumu, jejunumu ili kolonu.

Umesto, ili uz, oblogu, lek može da bude obezbeđen unutar čvrstog matriksa koji sadrži sredstvo za kontrolu otpuštanja, na primer, sredstvo za odlaganje otpuštanja koje može da se adaptira za oslobađanje polipeptida na kontrolisan način u gastrointestinalnom traktu. Alternativno, lek može da bude obezbeđen sa polimernom oblogom, tj. polimetakrilatnom polimernom oblogom, koja može da se adaptira tako da selektivno otpušta polipeptid pod uslovima različite kiselosti ili alkalnosti u gastrointestinalnom traktu. Alternativno, materijal matriksa ili obloga za odlaganje otpuštanja mogu da budu u obliku polimera koji erodira (npr. polimera anhidrida maleinske kiseline) koji se značajno degradira, na kontinualan način, kako dozni oblik prolazi kroz gastrointestinalni trakt. U još jednom alternativnom rešenju, obloga može da bude projektovana tako da se dezintegriše pod dejstvom mikroorganizama u crevima. Kao dalje alternativno rešenje, aktivni polipeptid može da bude formulisan u sistemu za dopremanje koji obezbeđuje osmotsku kontrolu otpuštanja polipeptida. Osmotsko otpuštanje i drugi preparati sa odloženim ili produženim otpuštanjem (na primer, preparati zasnovani na jonoizmenjivačkim smolama) mogu da se pripreme u skladu sa postupcima koji su dobro poznati stručnjacima u ovoj oblasti.

Polipeptidi prema predmetnom pronalasku mogu da se formulišu sa nosiocem i primenjuju u obliku nanočestica, pri čemu povećana povšina nanočestica pomaže u njihovoj apsorpciji. Uz to, nanočestice nude mogućnost direktnog prodiranja u ćelije. Sistemi za dopremanje lekova nanočesticama opisani su u knjizi "Nanoparticle Technology for Drug Delivery", urednici Ram B Gupta i Uday B. Kompella, Informa Healthcare, ISBN 9781574448573, objavljenoj 13.3. 2006. Nanočestice za dopremanje lekova takođe su opisane u J. Control. Release, 2003, 91 (1-2), 167-172, i u Sinha et al., Mol. Cancer Ther.1. 8., (2006) 5, 1909.

Farmaceutski preparati obično sadrže od oko 1% (m/m) do oko 95% (m/m) aktivnog sastojka i od 99% (m/m) do 5% (m/m) farmaceutski prihvatljivog ekscipijensa ili kombinacije ekscipijenasa.

1

Konkretnije, farmaceutski preparati sadrže od oko 20% (m/m) do oko 90% (m/m) aktivnog sastojka i od 80% (m/m) do 10% (m/m) farmaceutski prihvatljivog ekscipijensa ili kombinacije ekscipijenasa. Farmaceutski preparati sadrže od oko 1% (m/m) do oko 95% (m/m), posebno od oko 20% (m/m) do oko 90% (m/m) aktivnog sastojka. Farmaceutski preparati prema predmetnom pronalasku mogu da budu, na primer, u jediničnim doznim oblicima, kao što su ampule, bočice, supozitorije, fabrički napunjeni špricevi, dražeje, tablete ili kapsule.

Farmaceutski prihvatljiv(i) ekscipijens(i) mogu da budu izabrani prema željenom fizičkom obliku preparata i mogu, na primer, da budu izabrani iz grupe koja se sastoji od razblaživača (npr. čvrstih razblaživača kao što su punioci ili sredstva za povećanje zapremine; i tečnih razblaživača kao što su rastvarači i surastvarači), sredstava za dezintegrisanje, pufera, lubrikanasa, sredstava za unapređenje protoka, sredstava za kontrolu otpuštanja (npr. polimeri ili voskovi koji odlažu ili usporavaju otpuštanje), vezivnih sredstava, sredstava za granulisanje, pigmenata, sredstava za plastificiranje, antioksidanasa, konzervanasa, aroma, sredstava za maskiranje ukusa, sredstava za podešavanje toničnosti i obloga.

Stručnjak u ovoj oblasti će imati stručno znanje da odabere odgovarajuće količine sastojaka za upotrebu u formulacijama. Na primer, tablete i kapsule obično sadrže 0-20% sredstava za dezintegraciju, 0-5% lubrikanasa, 0-5% sredstava za poboljšanje protoka i 0-99% (m/m) punilaca/sredstava za povećanje zapremine (u zavisnosti od doze leka). Takođe mogu da sadrže 0-10% (m/m) polimernih vezivnih sredstava, 0-5% (m/m) antioksidanasa, 0-5% (m/m) pigmenata. Tablete za sporo otpuštanje bi, uz to, sadržale 0-99% (m/m) polimera za kontrolu otpuštanja (npr. za odlaganje otpuštanja) u zavisnosti od doze. Obložene tablete ili kapsule obično sadrže 0-10% (m/m) polimera, 0-3% (m/m) pigmenata i(li) 0-2% (m/m) plastifikatora.

Parenteralni preparati obično sadrže 0-20% (m/m) pufera, 0-50% (m/m) surastvarača i(li) 0-99% (m/m) vode za injekcije (WFI) (u zavisnosti od doze i toga da li su liofilizovani). Preparati za intramuskularne depo injekcije takođe mogu da sadrže 0-99% (m/m) ulja.

Farmaceutski preparati za oralnu primenu mogu da se dobiju kombinovanjem aktivnog sastojka sa čvrstim nosiocima, ukoliko je poželjno, granulisanjem dobijene smeše i preradom smeše, ukoliko je poželjno ili potrebno, nakon dodatka odgovarajućih ekscipijenasa, u tablete, dražeje ili kapsule. Takođe je moguće da se oni inkorporiraju u polimerni ili voskoviti matriks koji omogućava aktivnim sastojcima da difunduju ili da budu opušteni u odmerenim količinama.

1

Polipeptid prema predmetnom pronalasku takođe može da se formuliše u oblike čvrstih disperzija. Čvrste disperzije su homogene i ekstremno fine čvrste faze sa dve ili većim brojem čvrstih supstanci. Čvrsti rastvori (molekularni disperzni sistemi), jedna vrsta čvrste disperzije, dobro su poznati za upotrebu u farmaceutskoj tehnologiji (videti (Chiou & Riegelman, J. Pharm. Sci., 60, 1281-1300 (1971)) i korisni su u povećanju brzina rastvaranja i povećanju biološke dostupnosti lekova koji su inače slabo rastvorljivi u vodi.

Predmetna prijava takođe opisuje čvrste dozne oblike koji sadrže čvrsti rastvor koji je opisan iznad. Čvrsti dozni oblici obuhvataju tablete, kapsule, tablete za žvakanje i disperzibilne ili šumeće tablete. Poznati ekscipijensi mogu da se pomešaju sa čvrstim rastvorom kako bi se dobio željeni dozni oblik. Na primer, kapsula može da sadrži čvrsti rastvor pomešan sa (a) sredstvom za dezintegraciju i lubrikansom ili (b) sredstvom za dezintegraciju, lubrikansom i površinski aktivnom supstancom. Uz to, kapsula može da sadrži sredstvo za povećanje zapremine kao što su laktoza ili mikrokristalna celuloza. Tableta može da sadrži čvrsti rastvor pomešan sa najmanje jednim sredstvom za dezintegrisanje, lubrikansom, površinski aktivnim sredstvom, sredstvom za povećanje zapremine i glidantom. Tableta za žvakanje može da sadrži čvrsti rastvor pomešan sa sredstvom za povećanje zapremine, lubrikansom, i, ukoliko je poželjno, dodatnim zaslađivačem (kao što je veštački zaslađivač) i odgovarajućim aromama. Čvrsti rastvori takođe mogu da se dobiju prskanjem rastvora leka i pogodnog polimera na površinu inertnih nosilaca kao što su šećerne perlice ("non-pareils"). Ove šećerne perlice se potom mogu puniti u kapsule ili komprimovati u tablete.

Farmaceutski preparati mogu da se obezbede pacijentu u "pakovanjima za pacijenta" koji sadrže celokupnu kuru tretmana u jednom pakovanju, obično u blister pakovanju (tabli sa džepovima). Pakovanja za pacijente imaju prednost nad tradicionalnim receptima, za koje farmaceut odeli dozu farmaceutskih sredstava iz rinfuznog pakovanja za datog pacijenta, u tom smislu što pacijent uvek ima pristup informacijama o leku koje se nalaze na listu sadržanom u pakovanju za pacijente, normalno, bez navođenja doze za konkretnog pacijenta. Pokazano je da obezbeđenje informacija o leku poboljšava pridržavanje sa uputstvima lekara.

Preparati za topijsku primenu i nazalno dopremanje obuhvataju meleme, kreme, sprejeve, flastere, gelove, tečne kapi i inserte (na primer, intraokularne inserte). Takvi preparati mogu da se formulišu u skladu sa poznatim postupcima.

Primeri preparata za rektalnu i intravaginalnu primenu obuhvataju pesare i supozitorije koje mogu da budu, na primer, formirane od oblikovanog materijala koji se može oblikovati u kalupu ili od voskastog materijala, a koji sadrži aktivni polipeptid. Rastvori aktivnog polipeptida takođe mogu da se koriste za rektalnu primenu.

1

Preparati za inhalacionu primenu mogu da se obezbede u obliku praškastih preparata za inhalaciju ili tečnosti ili praškastih sprejeva, a mogu se primenjivati u standardnom obliku pomoću uređaja za inhalaciju ili uređaja za dopremanje aerosola.

Takvi uređaji su dobro poznati. Za primenu inhalacijom, praškasti preparati obično sadrže aktivni polipeptid zajedno sa inertnim čvrstim praškastim diluentom, kao što je laktoza.

Polipeptidi prema predmetnom pronalasku obično će biti obezbeđeni u pojedinačnom doznom obliku i, kao takvi, obično će sadržati dovoljno polipeptida da obezbede željeni nivo biološke aktivnosti. Na primer, preparat može da sadrži od 1 nanograma do 2 grama aktivnog sastojka, npr. od 1 nanograma do 2 miligrama aktivnog sastojka. U ovom opsegu, konkretni podopsezi količine polipeptida su 0,1 miligram do 2 grama aktivnog sastojka (uobičajenije je da to bude od 10 miligrama do 1 gram, npr. od 50 miligrama do 500 miligrama) ili 1 mikrogram do 20 miligrama (na primer, 1 mikrogram do 10 miligrama, npr.0,1 miligram do 2 miligrama aktivnog sastojka).

Za oralne preparate, jedinični dozni oblik može da sadrži od 1 miligram do 2 grama, uobičajenije je da to bude 10 miligrama do 1 gram, na primer, 50 miligrama do 1 gram, npr.

100 miligrama do 1 gram aktivnog polipeptida.

Aktivni polipeptid se primenjuje kod pacijenta kome je to potrebno (na primer, pacijenta koji je čovek ili koji je životinja) u količini koja je dovoljna da se postigne željeno terapeutsko dejstvo. Predmetna prijava takođe obezbeđuje postupak tretmana vaskularne bolesti ili respiratorne bolesti koji podrazumeva primenu, kod pacijenta kome je to potrebno, terapeutski delotvorne količine polipeptida izabranog iz grupe koja se sastoji od morfogenetskog proteina kosti 10 (BMP10) ili morfogenetskog proteina kosti 9 (BMP9), i to varijante kojoj nedostaje osteogena aktivnost.

Ispitivanja koja slede ilustruju predmetni pronalazak i opis iznet u predmetnoj prijavi.

Skraćenice

ActR-IIA(B): aktivinski receptor tipa-IIA(B);

ALK1, 2, 3, 6: kinaza nalik aktivinskom receptoru 1, 2, 3, 6;

ALP: alkalna fosfataza;

BMP: morfogenetski protein kosti

BMPR-II: receptor za morfogenetski protein kosti tipa II;

ECD: vanćelijski domen;

1

FBS: fetalni goveđi serum;

HMEC-1: humane ćelije mikrovaskularnog endotela; hPAEC: humane ćelije endotela plućnih arterija;

MSC: mezenhimske matične ćelije;

PAH: plućna arterijska hipertenzija;

pro.BMP9: BMP9 vezan za prodomen;

pro.BMP10: BMP10 vezan za prodomen; i

qPCR: kvantitativni PCR.

Materijal i postupci

Generisanje rekombinantnog humanog pro.BMP9 i pro.BMP10

cDNK pune dužine, koja sadrži otvoreni okvir za čitanje humanog pre-pro-BMP9 klonirana je u ekspresioni vektor pCEP4, između restrikcionih mesta HindIII i XhoI (videti sliku 1). Slično tome, cDNK pune dužine sa humanim pre-pro-BMP10 klonirana je u ekspresioni vektor pCEP4 između HhoI i BamHI restrikcionih mesta (videti sliku 1). Inserti su potvrđeni sekvenciranjem DNK. Pro.BMP9 varijante su dobijene korišćenjem kompleta QuickChange za mutagenezu usmerenu ka određenom mestu (Quick Change Site-Directed Mutagenesis kit, Stratagene) i sve mutacije su proverene sekvenciranjem DNK.

Plazmidi koji sadrže pre-pro-BMP9 (ili pre-pro-BMP10) su ubačeni transfekcijom u HEK-EBNA ćelije pomoću polietilenimina u DMEM podlozi koja sadrži 5% fetalnog goveđeg seruma (FBS). Plazmidi koji eksprimiraju humani furin su sutransficirani kako bi se olakšala obrada pro-BMP9 i pro-BMP10. Ćelije su prebačene na CDCHO podlogu bez seruma narednog dana, pa je kondicionirana podloga prikupljena nakon 3-4 dana. Identiteti pro.BMP9 i pro.BMP10 u kondicioniranoj podlozi su potvrđeni pomoću Vestern blota u kome su korišćena anti-BMP9 (MAB3209, R&D Systems) anti-BMP9 prodomen (AF3879, R&D Systems) ili anti-BMP10 (MAB2926, R&D Systems) antitela, redom.

Da bi se prečistio pro.BMP10, 1,5 litara kondicionirane podloge naneto je na kolonu Q-sefaroze prethodno ekvilibrisanu u 50 nM Tris.HCl puferu pH 7,4, 50 mM NaCl. Vezani proteini su eluirani u NaCl gradijentu (50-2000 mM). Frakcije su analizirane pomoću neredukujuće SDS-PAGE i one koje su sadržane pro.BMP10 su sakupljene i koncentrovane pre nanošenja na kolonu za gel filtraciju S200. Pro.BMP10 sa S200 kolone bio je preko 90% čist a identitet BMP10 prodomena i zrelog BMP10 dalje je potvrđen digestijom u gelu i identifikacijom pomoću masene spektrometrije.

2

Testovi signalizacije pomoću kvantitativne PCR (qPCR) i Smad1/5/8 fosforilacije u endotelnim ćelijama

Za testove signalizacije, koncentracija pro.BMP9 je određena pomoću ELISA, korišćenjem R&D BMP9 kao standarda; a koncentracija pro.BMP10 je kvantitativno određena vestern blotom i pomoću ImageJ uz primenu R&D BMP10 kao standarda.

Nakon izgladnjivanja od seruma, HMEC-1 ćelije su tretirane sa BMP ligandima u naznačenim koncentracijama. 8 časova nakon tretmana, izvršena je ekstrakcija iRNK pa su, pomoću kvantitativnog PCR-a, izvršena merenja ekspresionih nivoa ID1, ID2 ili BMPR-II.

β2-mikroglobulin je korišćen kao kontrola, a umnožak promene u odnosu na netretirane uzorke unesen je na grafik. Prikazana je srednja vrednost ± SEM, N = 2. Za test Smad1/5/8 fosforilacije, HMEC-1 ćelije gajene bez seruma (izgladnjivanje) tretirane su BMP ligandima u naznačenim koncentracijama tokom 1 časa, pa je signalizacija zaustavljena postavljanjem posuda na suvi led. Dodat je pufer za lizu (124 mM Tris.HCl, pH6,8, 2% SDS i 10% glicerol) pa je određena koncentracija proteina u ukupnom lizatu ćelije pomoću DC<TM>proteinskog testa (DC™ protein Assay, Bio-Rad). 25-35 μg ukupnih ćelijskih proteina upotrebljeno je za imunobloting pa je praćena fosforilacija Smad1/5/8 preko anti-pSmad1/5/8 antitela (Cell Signaling, cat No.9516). Kao kontrola nanošenja korišćen je α-tubulin.

Aktivnost alkalne fosfataze (ALP) u ćelijskoj liniji mišjih mioblasta C2C12 C2C12 ćelije su zasejane u gustini od 20,000 ćelija/polju na ploči sa 24 polja u DMEM podlozi sa 10% FBS. Nakon 48 časova, ćelije su zasićene dodavanjem DMEM podloge sa 0,25% FBS u toku 16 časova, a potom su tretirane BMP ligandima u naznačenim koncentracijama tokom 64 časa. Ćelije su lizirane u 1% rastvoru Triton X-100/PBS a ukupna koncentracija proteina u ćelijskom lizatu određena je pomoću DC™ protein Assay (Bio-Rad). Merena je ALP aktivnost u lizatu ćelija pomoću hromogenog supstrata fosfataze, dinatrijumove soli 4-nitrofenil fosfata (Sigma, S0942), pa je rastvorljivi proizvod određivan očitavanjem na 405 nm na čitaču ploča. U svim testovima, i BMP9 i BMP10 su nabavljeni preko R&D Systems.

Rezultati

BMP9 signalizacija i podaci koji podržavaju njihov terapeutski potencijal kod PAH BMP9 i BMP10 su identifikovani kao ligandi orfanskog receptora ALK1 (David et al (2007) Blood 109(5):1953-1961). U endotelnim ćelijama, oni indukuju sličan set gena uključujući ID1, ID1 i BMPRII. BMP9 se sintetiše u jetri (Miller et al (2000) J. Biol. Chem.

275(24):17937-17945; Bidart et al (2012) Cell. Mol. Life Sci.69(2):313-324), u cirkulaciji je u koncentraciji od 2-10 ng/l i jedini je BMP za koji je potvrđeno da cirkuliše u aktivnoj koncentraciji (Herrera & Inman (2009) BMC Cell Biol. 10:20; David et al (2008) Circ. Res.

102(8):914-922). BMP9 je faktor vaskularne inaktivacije, koji inhibira migraciju, proliferaciju EC i angiogenezu in vitro, čime promoviše vaskularnu stabilnost (David et al (2008), supra).

Konstrukcija varijanti BMP9 koje zadržavaju svojstva zaštite endotela, ali nemaju aktivnost formiranja koštanog tkiva

Uprkos potencijalu za lečenje kardiovaskularnih bolesti selektivnom aktivacijom endotelnih receptora, BMP9 takođe može da sprovodi signalizaciju u mezenhimskim matičnim ćelijama (MSC) i C2C12 mioblastima. Među 14 testiranih BMP, pronađeno je da BMP9 ima najveću osteogenu signalizaciju in vitro i aktivnost izgradnje koštanog tkiva in vivo (Kang et al (2004) Gene Ther.11(17):1312-1320; Luther et al (2011) Curr. Gene Ther.11(3):229-240). I ALK1 i ALK2 su potrebne za osteogenu aktivnost BMP9 (Luo et al (2010) J. Biol. Chem.

285(38):29588-29598), ali je priroda interakcije BMP9 sa ALK1 i ALK2 u kontekstu osteogene aktivnosti nepoznata. Iako se ALK2 takođe eksprimira u vaskularnim endotelnim ćelijama (Upton et al (2008) Mol. Pharmacol.73(2):539-552), ALK1 je glavni receptor tipa 1 koji posreduje u BMP9 odgovorima u ovim ćelijama (Upton et al (2009) J. Biol. Chem.

284(23):15794-15804; Scharpfenecker et al (2007) J. Cell Sci.120(Pt 6):964-972). Zahtevi u pogledu receptora tipa II za osteogenu aktivnost BMP9 ispitivani su na MSC. Pokazano je da ekspresija dominantno negativnih mutanata sva tri BMP receptora tipa II - BMPR-II, ActR-IIA i ActR-IIB može da inhibira osteogenu aktivnost koju pokrene BMP9, pri čemu je dominantni negativni ActR-IIB bio najsnažniji inhibitor (Wu et al (2010) Acta biochimica et biophysica Sinica 42(10):699-708).

Pronalazači predmetnog pronalaska su izneli hipotezu da mutiranjem mesta za vezivanje receptora tipa I i tipa II na BMP9, mogu da se generišu varijante BMP9 koje zadržavaju vezivanje ALK1, ali gube vezivanje ALK2. Takve varijante BMP9 će verovatno zadržati zaštitnu funkciju prema endotelu, ali će im nedostajati osteogena aktivnost. Pronalazači predmetnog pronalaska već su identifikovali dve takve BMP9 varijante koje održavaju aktivnost signalizacije za endotelne ćelije, što se dokazuje indukcijom ekspresije ID1 i ID2 gena, ali kojima fali osteogena signalna aktivnost, procenjena pomoću testa alkalne fosfataze u C2C12 ćelijama (slika 2). Verovatno je da ove varijante BMP9 (D366A i D408A) zadržavaju blagotvorna dejstva in vivo, jer imaju normalnu signalizacionu aktivnost u endotelnim ćelijama, ali neće moći da pokrenu osteogenu signalizaciju i stoga se uklanja potencijalni rizik formiranja koštanog tkiva primenom BMP9 in vivo.

BMP9 Mutageneza skeniranjem za alanin

Dvadeset četiri alaninske varijante BMP9 (H326A, D342A, S343A, W344A, I346A, K349A, F362A, D366A, K372A, I375A, L379A, H381A, L382A, K383A, K390A, S402A, L404A, K406A, D408A, V411A, T413A, L414A, Y416A i Y418A) generisane su i testirane i u HMEC-1 ćelijama, na indukciju ID1 gena, i u C2C12 ćelijama, na aktivnost alkalne fosfataze. Rezultati ovog ispitivanja ukratko su predstavljeni na slici 5 gde se može videti da je trinaest varijanti BMP9 (H326A, S343A, K349A, F362A, D366A, I375A, L379A, L382A, K390A, S402A, D408A, Y416A i Y418A) identifikovano kao varijante koje zadržavaju blagotvorno dejstvo signalizacije specifične za endotel i koje imaju značajno smanjenu osteogenu signalizaciju (što se pokazuje i time što pokazuju najmanje 0,75 x indukciju ID1 i manje od 0,5 x ALP aktivnost u poređenju sa BMP9 divljeg tipa). Uz to, rezultati prikazani na slici 5 pokazuju da je osam varijanti BMP9 (F362A, D366A, I375A, L379A, S402A, D408A, Y416A i Y418A) identifikovano kao varijante koje zadržavaju signalizaciju specifičnu za endotel, ali im nedostaje osteogena aktivnost (što se dokazuje time što pokazuju najmanje 0,75 x indukciju ID1 i zanemarljivu (tj. manje od 0,1 x) ALP aktivnost u poređenju sa BMP9 divljeg tipa). Dalje, rezultati predstavljeni na slici 5 pokazuju da dve varijante BMP9 (D366A i D408A) imaju pojačanu specifičnu endotelnu signalizaciju ali nemaju osteogenu signalizaciju (što se vidi iz ID1 koja je više od 1 x, i zanemarljive (tj. manje od 0,1 x) ALP aktivnosti, u poređenju sa BMP9 divljeg tipa).

Validacija BMP9 varijanti u primarnim endotelnim ćelijama

Navedenih osam varijanti BMP9 (F362A, D366A, I375A, L379A, S402A, D408A, Y416A i Y418A) koje su prethodno identifikovane kao varijante koje zadržavaju signalizaciju specifičnu za endotel ali im nedostaje osteogena signalizacija dalje su validirane u primarnim endotelnim ćelijama. Pronađeno je da svi ovi mutanti indukuju ekspresiju BMPR2 gena u humanim ćelijama endotela plućnih arterija (hPAEC, slika 6). Pokazano je da najmanje jedna varijanta, D408A, može da preokrene ranu apoptozu u PAEC ćelijama koja je indukovana faktorom nekroze tumora α (TNFα) i cikloheksimidom (CHX) (slika 7).

2

BMP10 signalizacija u endotelu (ilustrativni primer)

BMP10 je neophodan za razvoj srca (Neuhaus et al (1999) Mech. Dev. 80(2):181-184). BMP10-nulti miševi su soj kod kojeg dolazi do uginuća u embrionalnom stadijumu zbog ozbiljnog oštećenja srčanog razvoja (Chen H et al (2004) Development 131(9):2219-2231). BMP10 reguliše razvoj srčanog ventrikularnog zida preko transkripcionog faktora Tbx20 (Zhang et al (2011) J. Biol. Chem. 286(42):36820-36829) a preterana ekspresija BMP10 u miokardijumu ometa postnatalni hipertrofični srčani rast (Chen et al (2006) J. Biol. Chem.

281(37):27481-27491). Kod odraslih, BMP10 se eksprimira samo u desnoj pretkomori (Chen et al (2004) supra). Pokazano je da BMP10 u cirkulaciji posreduje u arterijskom mirovanju zavisnom od protoka (Laux et al (2013) Development 140(16):3403-3412).

Koncentracije BMP10 u krvi takođe su predmet kontroverze. Iako je protein BMP10 otkriven u humanom serumu preko proteomics-a (Souza et al (2008) Mol. Endocrinol.

22(12):2689-2702) i moguće ga je izmeriti ELISA testom (Ricard et al (2012) Blood 119(25):6162-6171), druge studije koje su koristile testove aktivnosti nisu uspele da detektuju BMP10 u cirkulaciji (Bidart et al (2012) i Herrera & Inman (2009), supra). Međutim, jedna nedavna studija je pokazala aktivnost BMP10 u cirkulaciji (Chen et al (2013) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110(29):11887-11892). Ovako kontroverzni rezultati mogu da se objasne aktivnim/neaktivnim stanjima BMP10 u cirkulaciji, nepotpunom obradom, inhibicijom nekim faktorom u serumu ili različitim testovima na osnovu aktivnosti u objavljenim izveštajima. Prodomen BMP10 mogao bi da igra ulogu u ovom procesu. Na primer, objavljeno je da prodomen BMP10, za razliku od drugih BMP proteina, može da inhibira ekspresiju gena indukovanu dejstvom BMP10 u C2C12 ćelijama (Sengle et al (2011) J. Biol. Chem.

286(7):5087-5099). Uz to, Biacore merenja su pokazala da BMP10 ima veći afinitet za ALK1/BMPR-II od BMP9 (Townson et al (2012) J. Biol. Chem. 287(33):27313-27325) a gubitak BMPR-II proteina tokom nastanka PAH pokazuje jasan uticaj na BMP10 signalizaciju. Ono što je važno jeste da, ni u in vitro ni u in vivo studijama BMP10 ne pokazuje osteogenu aktivnost. Tako nativni BMP10 predstavlja poželjniji agonist od nativnog BMP9 u tretmanu PAH.

Poređenje aktivnosti BMP9 i BMP10

Test signalizacije u zavisnosti od koncentracije u humanim ćelijama mikrovaskularnog endotela (HMEC-1) pokazao je da ima BMP10 podjednako snažno dejstvo kao i BMP9 u indukciji ekspresije ID1, ID2 i BMPR-II gena (slike 3A do 3C). Ono što je važno je da BMP10 pokazuje istu anti-apoptotsku aktivnost kao i BMP9 u zaštiti hPAEC ćelija od apoptoze indukovane TNFα-CHX (slika 3D). Objavljeno je da BMP9 zadržava stabilnost vaskulature supresijom proliferacije endotelnih ćelija (David et al (2008), supra). I BMP9 i BMP10 sprovode represiju sinteze DNK u sličnoj meri, mereno preko preuzimanja<3>H-timidina u hPAEC ćelijama (slika 3E). Alkalna fosfataza (ALP) je ključni enzim u osteogenom putu a ALP aktivnost koju indukuje BMP9 može se detektovati u C2C12 ćelijama pri koncentraciji BMP9 od 5ng/ml BMP9. Međutim, pod identičnim uslovima, BMP10 nije indukovao nikakvu ALP aktivnost ni na najvišim testiranim koncentracijama (20 ng/ml, slika 3F), što su rezultati u skladu sa prethodnim studijama u kojima su korišćeni BMP proteini eksprimirani u adenovirusu u C2C12 ćelijama (Kang et al (2004), supra).

Potencijal za primenu BMP10 i BMP10 vezanog za prodomen za lečenje PAH i drugih kardiovaskularnih bolesti (ilustrativni primer)

BMP proteini se sintetišu kao pre-pro-proteini a prodomen se iseca nakon sekrecije (slika 4A). U prethodnoj studiji pokazano je da prodomen BMP10 može da inhibira aktivnost BMP10 i da je verovatno da BMP10 cirkuliše u neaktivnom obliku. Pronalazači predmetnog pronalaska su generisali veliku količinu BMP10 vezanog za prodomen (pro.BMP10). Nasuprot prethodnim studijama, pronađeno je da prodomen ostaje vezan za BMP10 kada se BMP10 proizvodi iz sisarskih ćelija i da je kompleks pro.BMP10 veoma stabilan (slika 4B i 4C). To ukazuje da je verovatno da je pro.BMP10 oblik koji se nalazi u cirkulaciji. Dalje, pronalazači predmetnog pronalaska su pokazali, koristeći HMEC-1 ćelije (slike 4E i 4D) i hPAEC ćelije, da pro.BMP10 ima slične aktivnosti kao i BMP9 i BMP10 nabavljeni preko komercijalnih izvora (R&D Systems). Kako prodomen štiti hidrofobnu površinu BMP10, i time stabilizuje cirkulatorni oblik BMP10, verovatno je da je pro.BMP10 poželjan oblik za in vivo primenu za lečenje PAH i drugih kardiovaskularnih bolesti.

BMP9 i BMP10 inhibiraju formiranje cevčica od endotelnih ćelija krvnog izrastanja (BOEC)

Endotelne ćelije izrastanja krvi mogu da se izoluju iz periferne krvi većine pojedinaca i predstavljaju veoma proliferativan tip ćelija koje su odlični predstavnici humanih endotelnih ćelija. Pokazano je da, kao i endotelne ćelije, BOEC grade vakuolizovane strukture nalik kapilarima u trodimenzionalnom matriksu kolagen:fibronektin. Rezultati ove analize prikazani su na slici 8, a pokazuju ne samo anti-angiogenu ulogu BMP9 i BMP10, već i pokazuju da BMP9, osim što je antiproliferativan za endotelne ćelije, štiti endotelne ćelije od apoptoze i

2

štiti endotelne ćelije od povećane permeabilnosti. Inhibicija putem BMP9 je očigledna čak i u niskim koncentracijama.

2

2

2

2

1

2

4

4

Claims (14)

Patentni zahtevi

1. Polipeptid izabran iz grupe koja se sastoji od varijante morfogenetskog proteina kosti 9 (BMP9) kojoj nedostaje osteogena aktivnost i varijante BMP9 kojoj nedostaje osteogena aktivnost u obliku vezanom za prodomen (pro.BMP9) za upotrebu u lečenju vaskularne bolesti ili respiratorne bolesti.

2. Polipeptid za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što je navedena vaskularna bolest izabrana iz grupe koja se sastoji od: plućne hipertenzije; plućne arterijske hipertenzije; nasledne hemoragične telangiektazije; arteroskleroze; i hepatopulmonalnog sindroma.

3. Polipeptid za upotrebu prema patentnom zahtevu 1 ili patentnom zahtevu 2, naznačen time što podrazumeva lečenje vaskularne bolesti izabrane iz grupe koja se sastoji od plućne arterijske hipertenzije.

4. Polipeptid za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što je navedena respiratorna bolest izabrana iz grupe koja se sastoji od: opstruktivnih bolesti pluća kao što su hronična opstruktivna bolest pluća (COPD), hronični bronhitis i emfizem; plućnih vaskularnih bolesti kao što su plućni edem i plućna hemoragija; otkazivanja respiratorne funkcije i sindroma respiratornog distresa, kao što su akutna povreda pluća i sindrom akutnog respiratornog distresa; kao i intersticijalnih bolesti pluća, kao što je idiopatska plućna fibroza.

5. Polipeptid za upotrebu prema bilo kom patentnom zahtevu od 1 do 4, naznačen time što je navedeni polipeptid varijanta BMP9.

6. Polipeptid za upotrebu prema bilo kom patentnom zahtevu od 1 do 4, naznačen time što je navedeni polipeptid varijanta pro.BMP9.

7. Polipeptid za upotrebu prema patentnom zahtevu 6, naznačen time što navedena varijanta pro.BMP9 sadrži varijantu: propeptidne sekvence koja ima aminokiselinsku sekvencu sa ostacima 23-319 iz Sekv. sa ID br.: 4 nekovalentno vezanu za sekvencu zrelog BMP9 koja ima aminokiselinsku sekvencu sa ostacima 320-429 iz Sekv. sa ID br.: 4.

8. Polipeptid za upotrebu prema patentnom zahtevu 7, naznačen time što navedena varijanta pro.BMP9 sadrži tetramer, koji sadrži dve navedene propeptidne sekvence i dve navedene sekvence zrelog BMP9.

9. Polipeptid za upotrebu prema bilo kom prethodnom patentnom zahtevu, naznačen time što navedena varijanta BMP9 ili varijanta pro.BMP9 sadrže supstitucioni, delecioni ili insercioni mutant aminokiselinske sekvence iz Sekv. sa ID br.: 4, na primer, supstitucioni mutant aminokiselinske sekvence iz Sekv. sa ID br.: 4.

10. Polipeptid za upotrebu prema patentnom zahtevu 9, naznačen time što navedeni supstitucioni mutant aminokiselinske sekvence iz Sekv. sa ID br.: 4 sadrži jednu ili veći broj, kao što je jedna ili dve, sledećih supstitucija: F362A, D366A, I375A, L379A, S402A, D408A, Y416A i Y418A.

11. Varijanta BMP9 naznačena time što sadrži aminokiselinsku sekvencu iz Sekv. sa ID br.:

5 ili aminokiselinsku sekvencu iz Sekv. sa ID br.: 6.

12. Farmaceutski preparat naznačen time što sadrži varijantu BMP9 iz patentnog zahteva 11.

4

13. Vektor naznačen time što sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira varijantu BMP9 kojoj nedostaje osteogena aktivnost ili varijantu pro.BMP9 kojoj nedostaje osteogena aktivnost za upotrebu u lečenju vaskularne bolesti ili respiratorne bolesti.

14. Vektor za upotrebu prema patentnom zahtevu 13, naznačen time što je navedeni vektor virusni vektor, kao što su virusni vektori izabrani iz grupe koja se sastoji od: retrovirusa, adenovirusa, lentivirusa, herpes simpleksa, vakcinije i virusa koji se dovodi se u vezu sa adenovirusom, a posebno virus koji se dovodi se u vezu sa adenovirusom.